CN103243038A - 表达疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶突变体的酵母工程菌株 - Google Patents

表达疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶突变体的酵母工程菌株 Download PDF

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Abstract

本研究利用定向进化的方法对疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶LGY进行分子改造。采用易错PCR方法，建立了含有14755个转化子的突变体库。以高活力为筛选压力，通过三丁酸甘油酯平板透明圈法、G418平板、小量发酵筛选和大量发酵测酶活，最后筛选出一株正向突变菌株，对此工程菌进行发酵，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等步骤纯化了突变蛋白并测定酶活，结果其酶活是野生菌株所产酶活力的2.3倍。对此突变基因进行测得的序列，并与野生基因比较，有3个碱基位点发生变化，其中两个位点引起氨基酸的变化，它们是G96V，A192V。将这株定点突变工程菌株最终命名为GS-LGYM。

Description

表达疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶突变体的酵母工程菌株
（一）技术领域
本发明涉及生物工程，具体地说，是以疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyceslanuginosus）脂肪酶LGY工程菌GS-LGY为出发菌株，通过定向进化方法筛选到一株表达酶活提高的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-LGYM。
（二）背景技术
脂肪酶（lipase,EC 3.1.1.3），全称三酰甘油酰基水解酶，广泛存在于生物体内。脂肪酶底物是甘油酯类，水解位点是甘油和12个碳原子以上不溶性长链脂肪酸所形成的酯键，能够分解生物产生的各类天然油和脂肪。作为一种界面酶，脂肪酶的水解反应只发生在油-水界面上，即水溶性的酶在水不溶的底物和水的界面上催化反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产，其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。
疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus），它分布广泛，生长上限较高，产生的脂肪酶具有较高的工业价值。T.lanuginosus脂肪酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表达产物同样具有原始菌株T.lanuginosus脂肪酶的优良特性。
定向进化具体应用到酯酶和脂肪酶的改造上的成功的方法和策略，以及近些年来，所取得了重要研究进展。定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得的巨大成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面。
（三）发明内容
以表达疏绵状嗜热丝孢菌（T.lanuginosus）脂肪酶LGY的毕赤酵母工程菌GS-LGY为出发菌株，利用定向进化的方法对其进行分子改造。并通过高通量筛选方法最后筛选出一株正向突变菌株GS-LGYM，对此工程菌进行发酵，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等步骤纯化了突变蛋白并测定酶活，结果其酶活是野生菌株所产酶活力的2.3倍。对此突变基因进行测序，并与野生基因比较得出，GS-LGYM中脂肪酶基因较原始的脂肪酶基因lgy有三个碱基发生改变，分别是第287为由G变为T（密码子由GGG变为GTG），第575位由T变为C（密码子由GAT变为GCA），第741位由T变为C（密码子由CGT变为CGC）。其中前两个碱基的变化引起了氨基酸的变化，分别是第96位氨基酸由甘氨酸（Gly,G）变为缬氨酸（Val,V），第192位氨基酸由丙氨酸（Ala,A）变为缬氨酸（Val,V）。第741位碱基虽然改变，但是编码的氨基酸都是天冬氨酸（Asp,D）未发生改变。
（四）附图说明：
图1：易错PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
泳道M：Marker-DL2000
其他泳道：cDNA(ORF)
图2：平板透明圈法筛选酵母转化子
图3：含G418的YPD平板筛选酵母转化子
图4：GS-LGYM表达脂肪酶的SDS-PAGE
泳道M:低分子量蛋白Marker
泳道1-7：酵母工程菌Pichia pastoris GS-LGYM的诱导7天的表达情况
图5：GS-LGY与GS-LGYM酶液的酶活力比较
图6：GS-LGY与GS-LGYM脂肪酶氨基酸序列比对
（五）具体实施方式：
实施例1：疏绵状嗜热丝孢菌（T.lanuginosus）脂肪酶LGY突变体库的构建
（1）易错PCR及条件摸索：
采用易错PCR法对目的基因进行改造。引物为：
上游引物LGY-5’：5’-TTGCTACGTAAGTCCTATTCGTCGAGAG-3’（SnaBI）
下游引物LGY-3’：5’-GGCCTAGGCTAAAGACATGTCCCAATT-3’（AvrII）
易错PCR反应体系摸索：50μL体系中含1×TaqDNA聚合酶缓冲液、0.2mmol/L dATP和dGTP，1.0mmol/L dCTP和dTTP，10μmol/L上下游引物、4-7mmol/LMg2+、0-5mmol/L MnCl2模板DNA从质粒扩增获得。
PCR反应体系：
Figure BDA00003259848900031
PCR反应条件：
Figure BDA00003259848900041
易错PCR测序结果分析当Mg2+浓度为6.0mM，Mn2+浓度分别为0.2mM时错配碱基数为3-5个，是较合适的突变频率。测序后选择的易错PCR体系为：
易错PCR反应体系：50μL体系中含1×Taq DNA聚合酶缓冲液、0.2mmoL/LdATP和dGTP，1.0mmoL/L dCTP和dTTP，6mmoL/L MgCl2、0.2mmoL/L MnCl2、10μmoL/L上下游引物，模板DNA从质粒扩增获得。
（2）构建突变体库：
将得到的易错PCR产物用SnaBⅠ和AvrⅡ进行双酶切。回收双酶切产物，并与同样双酶切的酵母表达质粒pPIC9K进行连接，转化大肠杆菌DH5α，转化的DH5α经含Amp的LB培养基平板抗性筛选，将平板中加入1mL含Amp液体LB培养基，用涂布器涂板，收集所有菌落。将菌落经37℃摇培过夜后提取质粒，所提质粒是含有各种突变片段的混合重组质粒。重组质粒进行双酶切鉴定，转入毕赤酵母GS115菌株中，在MD平板上培养。
实验例2：酵母转化子的平板筛选
本研究选用三丁酸甘油酯琼脂平板透明圈法对酵母转化子进行筛选。将MD平板上的转化子接种到三丁酸甘油酯琼脂平板和YPD平板相同位置上，保存生长完毕的YPD平板。丁酸甘油酯琼脂平板28℃培养72h后（每天在盖上添加100μL甲醇后倒置），根据菌落周围透明圈的大小来筛选高产菌株。
将上一步挑出的透明圈较大的转化子接种到较高浓度G418（3.00mg/mL，4.00mg/mL）的YPD平板，筛选出透明圈大但拷贝数较低的转化子，注意防止气泡产生。
实验例3：小量发酵筛选:
将选出的转化子接种于含400μL BMGY培养基的1.5mL离心管中，28℃振荡培养（200rpm）24h。室温下以3000g离心5min回收酵母细胞。弃去上清，将细胞重悬于300μL体积的BMMY培养基中。置摇床中，28℃继续培养并开始诱导表达。诱导表达起始后，每隔24h补加100%甲醇至终浓度为1%以维持诱导。诱导开始后72h，离心取上清液进行酶活检测。
实验例4：酵母转化子的复筛
将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，28℃200rpm/min摇床培养24h（OD600达2－6），离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD600值为1.0，28℃200rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为0.5%，每24h取样，室温10,000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。
实验例5：脂肪酶活力测定
采用脂肪酶酶活测定选用pNPP比色法（Kordel,1991）。
绘制标准曲线：
取十支试管，依次编号：CK，1，2，3，4，5，6，7，8，9，按照下表顺序，依次加入相应试剂。以pNP的绝对量（μmol数）为横坐标，OD410nm值为纵坐标，绘制标准曲线。
浓度标准曲线反应体系
The reaction mixture used to draw the standard curve of the absorbanceat410nm VS the concentration of the pNP
Figure BDA00003259848900061
注：表中pNP浓度为1mmol/l，CaCl2浓度为1mol/l。
脂肪酶酶活力单位定义为:在一定条件下，每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪活力单位(U)。
实验例6：突变体序列测定
以最终确定酶活提高的突变体酵母基因组为模板，以LGY-5’、LGY-3’为引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收825bp左右的条带，与pMD18-T载体连接转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证后选择阳性克隆送去测序，由北京博尚生物技术有限公司完测序，并把此突变转化子命名为GS-LGYM。
实验例7：脂肪酶LGY突变工程菌的保藏
脂肪酶LGY突变工程菌的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年5月10日；酵母工程菌株编号为：CGMCCNo.7580；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴氏毕赤酵母Pichia pastoris。
Figure IDA00003259849900011
Figure IDA00003259849900021
Figure IDA00003259849900031

Claims (1)

1.一种酶活提高的疏绵状嗜热丝胞菌Thermomyces lanuginosus脂肪酶LGY突变毕赤酵母工程菌株，其特征是该菌为一种毕赤酵母，以野生工程菌GS-LGY为出发菌，采用定向进化和高通量筛选方法，获得一株是野生菌株所产脂肪酶酶活力的2.3倍的突变菌株。测序与野生基因比较，有3个碱基位点发生变化，其中两个位点引起氨基酸的变化，它们是G96V，A192V。最终将此突变工程菌株命名为GS-LGYM。
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