CN103045559A

CN103045559A - 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN103045559A
Application number: CN2012104078330A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 黎小军; 郑仁朝; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2032-10-23
Also published as: CN103045559B

Abstract

本发明提供了一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码序列及其应用。所述一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由序列如SEQ ID No.1的肽段经点突变获得，所述的点突变为下列之一或其中两种以上：（1）第88位的S突变为T；（2）第99位的A突变为N；（3）第116位的V突变为D。本发明提供的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体较亲本活力大幅提高，即使使用该酶的粗提物或者工程菌全细胞，反应也会以较高的速率进行；此外，本发明的突变体可以在常温和相对较高的温度例如40~60℃下用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，从而进一步合成普瑞巴林。

Description

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

（二）背景技术

普瑞巴林（Pregabalin，简称PGB），化学名为(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸（Ⅰ），是γ-氨基丁酸的3位异丁基取代物（Angew.Chem.Int.Ed.2008,47:3500-3504）。普瑞巴林属钙离子通道调节剂，通过调节钙通道减少钙离子进入神经末梢，减少谷氨酸和去甲肾上腺素等兴奋性神经递质的过度释放（Curr.Opin.Pharmacol.2006,6:108-113.），对癫痫、神经病理性疼痛有良好的疗效。与传统药物相比，普瑞巴林的剂量更低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强。自上市以来，普瑞巴林全球销售额快速增长，成为全球畅销药市场的“重磅炸弹”，市场前景十分广阔。

(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸（Ⅱ）是制备普瑞巴林的关键手性中间体，经加热脱羧、碱性水解和加氢还原即可合成普瑞巴林（Ⅰ）。美国Pfizer公司利用Novozymes公司固定化脂肪酶选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸盐，底物浓度可达3.0M，转化率42~48%（Org.Process Res.Dev.2008,12:392-398；US2005/0283023）。

（三）发明内容

本发明的目的在于提供热稳定且高活性的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由克隆自Thermomyceslanuginosus DSM10635基因编码的序列如下的肽段经点突变获得：

1 RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF61 EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGSRS VENWIANLAADLTEISDICS GCEGHVGFVT121 SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYNIDVFSYGAPR181 VGNRAFAEFL TAQTGGTLYRITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI241 TvvEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLWYFGPISECD（下划线部分为突变可能发生的位点）；所述的点突变为下列之一或其中两种以上：（1）第88位的S突变为T；（2）第99位的A突变为N；（3）第116位的V突变为D。

本申请发明人进行了大量深入的实验，通过对来源为疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）DSM10635脂肪酶基因（SEQ ID No.1）进行克隆表达，利用PCR技术以含有脂肪酶基因的表达载体为模板进行定点突变，扩增后转化宿主细胞，诱导表达后利用显色法进行筛选，从而获得了一系列耐热并具有高催化活性的脂肪酶突变体。这些突变体能以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，在常温和较高的温度下能高效手性生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。上述突变体以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物其具有的活性比亲本（SEQ ID No.2）高出至少8.6倍的催化活性，且选择性和热稳定性不变。

这些突变体具有高的催化活性。例如，在本发明获得的一系列突变体中，一个具有单点突变的突变体S88T的比活力较亲本提高8.6倍，且其选择性不变，在55℃条件下处理1h活力不下降；一个具有双突变的突变体S88T/A99N的比活力较亲本提高27.1倍，且其选择性不变，在55℃条件下处理1h活力不下降；一个具有三突变的突变体S88T/A99N/V116D的比活力较亲本提高57.4倍，且其选择性不变，在55℃条件下处理1h活力不下降。

所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下（下划线部分为突变位点）：

1RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF61EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVT121SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR181VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI241TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLWYFGPI SECD（SEQ ID No.3）。

1RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF61EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNADLTEISDICS GCEGHVGFVT121SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR181VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI241TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLWYFGPI SECD（SEQ ID No.5）。

1RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF61EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVT121SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYNIDVFSYGAPR181VGNRAFAEFL TAQTGGTLYRITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI241TvvEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLWYFGPISECD（SEQ ID No.7）。

本发明还涉及编码所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体的基因。

为了获得本发明的突变体，可以利用本领域已知的技术，先构建含有亲本脂肪酶基因的表达质粒，然后设定定点突变的位点，再设计并合成适当的引物，以所述的含亲本脂肪酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增全长突变基因的质粒。

通过将该含有全长突变的质粒转化到适当的宿主细胞，经培养、诱导表达、筛选出具有高脂肪酶活性的阳性突变子。最后从阳性突变子中抽提出质粒DNA，进行DNA测序分析，以确定引物的突变。在本发明脂肪酶突变体的制备方法中，可以采用任何适当的载体。例如，适当的载体包括但不限于原核表达载体pET28、pET20、pGEX4T1、pTrC99A和pBV220；包括但不限于真核表达载体pPIC9K、pPICZα、pYD1和pYES2/GS；包括但不限于克隆载体pUC18/19和pBluscript-SK。

在本发明制备的脂肪酶突变体的方法中，所获得的脂肪酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可以采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。

本发明制备脂肪酶突变体的方法中，所述载体的宿主细胞为原核生物或真核生物。所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。所述真核细胞包括但不限于毕赤巴斯德酵母、酿酒酵母和黑曲霉。

本申请文本中所用的术语“亲本”系指来自于Thermomyceslanuginosus DSM10635的脂肪酶，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如序列2所示。本发明中亲本基因的核苷酸序列与公布的Thermomyces lanuginosus HSAUP₀₃80006脂肪酶的基因序列（J.MOL.CATAL.B-ENZYM.69:127–132，2011）相比有一个核苷酸的差异，即与基因库（GenBank EU004197）的核苷酸相比，本发明中的亲本基因第267位核苷酸序列为C，相应的第89位氨基酸序列为精氨酸（Arg），GenBankEU004197的核苷酸序列为T，相应的第89位氨基酸序列为精氨酸（Arg）。

本申请文本中所用的术语“脂肪酶突变体”是指这样一种以序列表中序列2表示氨基酸序列为参考序列，存在选自第88位、第99位、第116位的一个或者两个或者三个突变，并以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物其具有的活性比亲本高出至少8.6倍、最高提高57.4倍的催化活性的酶。因此，在本专利申请中，所述脂肪酶突变体的变体，包括对序列2所示氨基酸序列中除第88位、第99位、第116位的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。

本发明还涉及所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。所述水解在25~60℃（优选40℃）、pH6~8.5（优选7.5）下进行。

所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的脂肪酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体较亲本活力大幅提高，即使使用该酶的粗提物或者工程菌全细胞，反应也会以较高的速率进行；此外，本发明的突变体可以在相对较高的温度例如40~60℃下用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，从而进一步合成普瑞巴林。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：亲本基因的扩增及pET28-lip的构建

根据GenBank EU004196基因序列设计引物P1和引物P2（见表1），采用RT-PCR的方法从T.lanuginosus DSM10635菌（购自GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ））中分离脂肪酶基因。采用TRIzol法提取T.lanuginosus DSM10635总RNA，使用TaKaRa公司RT-PCR试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应体系及条件均参照试剂盒的使用说明。以cDNA第一链为模板，在引物P1、引物P2作用下，利用PCR方法扩增脂肪酶cDNA序列。PCR反应体系各组分加入量（总体积50μL）：10×Pfu DNA Polymerase Buffer5μL，10mM dNTP mixture（dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM）0.5μL，浓度为50μM的引物1、引物2各0.5μL，cDNA1μL，Pfu DNA Polymerase1μL，无核酸水41.5μL。采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃5min，然后进入温度循环94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。PCR产物约0.85kb。该PCR产物经限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ酶切与经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET28b（Novagen company）连接，构建了含有脂肪酶基因的表达重组质粒pET28-lip，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)。经DNA测序证实，确定该被克隆的亲本脂肪酶的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID No.1，相应的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No.2。

实施例2：脂肪酶位点88的定点饱和突变

定点突变技术参考（Current Protocols in Protein Science26.6.1-26.6.10,2011；Anal.Biochem.2008,375:376-378）的描述，阳性突变子的高通量筛选技术参考（Bioorganic&Medicinal Chemistry，1999，7:2183-2188）的描述。具体过程如下：

为了将亲本氨基酸序列中的第88位点的Ser(S)进行饱和突变，设计引物S88R和S88F（见表1），以质粒pET28-lip为模板，进行全质粒扩增。PCR扩增体系为：5×PS Buffer10μl，dNTP（2.5mM each）4μl，突变引物S88-R和S88-F各0.5μl，质粒pET28-lip0.5μl，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μl，补水至50μl。PCR条件为98℃预变性2min，25个循环：98℃10s，65℃10s，72℃6min，最后72℃10min。经0.9%琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μl，加入1μl DpnⅠ，37℃酶切2h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coliBL21(DE3)，涂布含卡那霉素（50mg/L）的LB平板。挑取单菌落在LB培养基中培养至OD₆₀₀约为0.6，加入0.1mM IPTG，28℃诱导10h。以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以溴百里香酚蓝为指示剂，以突变前的工程菌细胞为参照，在96孔板上初筛活力提高的阳性克隆，筛选出的阳性克隆再经活力测定验证。从阳性克隆中抽提质粒pET28-lip，经DNA测序确定引入的点突变，活力最高的几个阳性克隆DNA测序显示88位的Ser突变成了Thr（S88T）。突变体S88T的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No.3，其中一种编码基因序列见序列表中的SEQ ID No.4。

实施例3：对脂肪酶突变体S88T位点99的定点饱和突变

定点突变技术参考（Current Protocols in Protein Science26.6.1-26.6.10,2011；Anal.Biochem.375:376-378,2008）的描述，阳性突变子的高通量筛选技术参考（Bioorganic&Medicinal Chemistry，1999，7:2183-2188）的描述。具体过程如下：

为了将脂肪酶突变体S88T氨基酸序列中的第99位点的Ala(A)进行饱和突变，设计引物A99F和A99R（见表1），以质粒pET28-S88T为模板（见实施例2），进行全质粒扩增。PCR扩增体系为：5×PS Buffer10μl，dNTP(2.5mM each)4μl，突变引物A99-F和A99-R各0.5μl，质粒pET28-S88T0.5μl，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μl，补水至50μl。PCR条件为98℃预变性2min，25个循环：98℃10s，65℃10s，72℃6min，最后72℃10min。经0.9%琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μl，加入1μl DpnⅠ，37℃酶切2h质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素（50mg/L）的LB平板。挑取单菌落在LB培养基中培养至OD₆₀₀约为0.6，加入0.1mM IPTG，28℃诱导10h。以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以溴百里香酚蓝为指示剂，以含pET28-S88T的突变体细胞为参照，在96孔板上初筛活力提高的阳性克隆，筛选出的阳性克隆再经活力测定证实。从阳性克隆中抽提质粒，经DNA测序确定引入的点突变，活力最高的几个阳性克隆DNA测序显示99位的Ala突变成了Asn（A99N）。突变体S88T/A99N的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No.5，其中一种编码基因序列见序列表中的SEQ ID No.6。

实施例4：对脂肪酶突变体S88T/A99N位点116的定点突变

为了将脂肪酶突变体S88T/A99N氨基酸序列中的第116位点的Val(V)进行定点突变，设计引物V116F和V116R（见表1），以质粒pET28-S88T/A99N为模板（见实施例2），进行全质粒扩增。PCR扩增体系为：5×PS Buffer10μl，dNTP(2.5mM each)4μl，突变引物V116-F和V116-R各0.5μl，质粒pET28-S88T/A99N0.5μl，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μl，补水至50μl。PCR条件为98℃预变性2min，25个循环：98℃10s，65℃10s，72℃6min，最后72℃10min。经0.9%琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μl，加入1μl DpnⅠ，37℃酶切2h质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素（50mg/L）的LB平板。挑取单菌落在LB培养基中培养至OD₆₀₀约为0.6，加入0.1mM IPTG，28℃诱导10h。以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以溴百里香酚蓝为指示剂，以含pET28-S88T/A99N的突变体细胞为参照，在96孔板上初筛活力提高的阳性克隆，筛选出的阳性再经活力测定证实。从阳性克隆中抽提质粒，经DNA测序确定引入的点突变，活力最高的几个阳性克隆DNA测序显示116位的Val突变成了Asp（V116D）。突变体S88T/A99N/V116D的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No.7，其中一种编码基因序列见序列表中的SEQ ID No.8。

扩增亲本脂肪酶与实施例2、实施例3、实施例4所述脂肪酶突变体所用的引物如下表1所列：

表1：引物

实施例5：亲本脂肪酶和脂肪酶突变体工程菌诱导表达

将E.coli BL21(DE3)/pET28-lip（见实施例1）、E.coli BL21(DE3)/pET28-S88T（见实施例2）、E.coli BL21(DE3)/pET28-S88T/A99N（实施例3）和E.coli BL21(DE3)/pET28-S88T/A99N/V116D（实施例4）分别接种到用含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养12h，再以1%接种量（v/v）接种到新鲜的含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.1~0.5mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），诱导培养4-12h后，4℃、5000rpm离心10min，收集含有重组脂肪酶的菌体细胞，可用于酶活测定、酶的提取和生物催化制备（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。

实施例6：亲本脂肪酶和脂肪酶突变体的提取与纯化

实施例5中得到的亲本脂肪酶或脂肪酶突变体细胞，悬浮于100mMTris-HCl（pH8.0）缓冲溶液中，超声波破碎裂解细胞，离心（4℃，12000g，10min）收集上清液为粗提蛋白。粗提蛋白经55℃热处理60min，离心（4℃，12000g，15min）去沉淀物，即为部分纯化的脂肪酶，可用于酶活测定和制备（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。

实施例7：亲本脂肪酶和脂肪酶突变体的活性测定

实施例5中获得的亲本脂肪酶或脂肪酶突变体细胞或实施例6提取的亲本脂肪酶和脂肪酶突变体分别测定活性。反应体系组成：100mM2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，150mM Ca(OAc)₂，100mMTris-HCl(pH7.5)，40℃、150r/min反应1h，取样200μl，并加50μl1M的HCl终止反应，乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠处理后气相测定转化率和产物的对映体过量值（e.e.）。采用外标定量法来测定转化液中2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯、（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的含量。各成分的量用气相色谱岛津GC-14C测定，色谱柱类型：G-TA毛细管柱；色谱条件：柱温135℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦流量为100mL/min；分流比为30:1。酶活单位（U）定义为：在40℃、pH7.5条件下，在1min内催化2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成1μmol(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸所需要的酶量定义为1U。下表2显示脂肪酶突变体与亲本脂肪酶的比活性之差异。

表2：脂肪酶突变体与亲本脂肪酶比活性的比较

实施例8：脂肪酶突变体全细胞在（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

转化体系组成及转化操作如下：底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯添加量为0.5M，脂肪酶突变体湿细胞（见实施例5）添加量为5%（W/V），150mM醋酸钙，反应温度控制在40℃通过反应过程中滴加碱的方式控制反应液的pH值7.5，期间用气相色谱检测，直至反应终点；反应结束后（转化率45.3%，e.e.>99%），离心或者过滤除去大肠杆菌细胞，减压蒸馏至1/3体积，然后采用甲苯萃取除去(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，再减压蒸馏去除残留甲苯，得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸（e.e.>99%）。气相检测条件见实施例7。

实施例9：脂肪酶突变体全细胞在（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

转化体系组成及转化操作如下：底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯添加量为2.0M，脂肪酶突变体湿细胞（见实施例5）添加量为10%（W/V），150mM醋酸钙，反应温度控制在40℃通过反应过程中滴加碱的方式控制反应液的pH值7.5，期间用气相色谱检测，直至反应终点；反应结束后（转化率46.8%，e.e.>99%），离心或者过滤除去大肠杆菌细胞，减压蒸馏至1/3体积，然后采用甲苯萃取除去(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，再减压蒸馏去除残留甲苯，得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸（e.e.>99%）。气相检测条件见实施例7。

实施例10：纯化后的脂肪酶突变体在（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

转化体系组成、转化操作、转化后的处理方式同实施例8，不同的是所用催化剂为实施例6提纯的脂肪酶突变体，转化率为44.6%，e.e.>99%。

本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变菌在本发明的范围之内。

Claims

1.一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由序列如下的肽段经点突变获得：RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGSRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVT SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLWYFGPI SECD；所述的点突变为下列之一或其中两种以上：（1）第88位的S突变为T；（2）第99位的A突变为N；（3）第116位的V突变为D。

2.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下：RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVT SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLWYFGPI SECD。

3.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下：RPVRRAVPQD LLDQFELFSQYSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNADLTEISDICS GCEGHVGFVT SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGHSLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYRITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTDGNNQGNIPDI PSHLWYFGPI SECD。

4.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下：RPVRRAVPQD LLDQFELFSQYSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTGLLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYNIDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDWGYSHSSPEYWVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLWYFGPISECD 。

5.编码如权利要求1所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体的基因。

6.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。