CN101643740B - 鱼腥藻pcc7120脂肪氧合酶基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因，属于食品工业生物技术领域。该基因来源于鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)，通过PCR从基因组DNA中扩增获得，插入表达载体后转化大肠杆菌，诱导表达，表达出的重组酶催化不饱和脂肪酸的氧化，生成共轭双键的脂肪酸氢过氧化衍生物。氢过氧化物作为不稳定的初级酶促产物可进一步发生一系列氧化次级反应，在面粉品质改良中在以下两个方面具有重要应用价值：(1)氧化具有还原性的半胱氨酸，形成二硫键，应用于面粉品质改良，提高面筋强度，替代具有致癌作用的溴酸钾；(2)氧化色素类物质，应用于面粉的漂白，替代过氧化苯甲酰。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因，属于食品工业生物技术领域，专用于鱼腥藻脂肪氧合酶基因的克隆与高效表达。
二、背景技术
溴酸钾作为焙烤工业面包蛋糕粉的品质改良剂，在国外尤其是欧美成功应用有几十年的历史。作为一种慢速氧化剂，改善面团结构和流变性，增强筋力和弹性，使焙烤制品获得满意的结果。我国也较早地将溴酸钾作为面粉品质改良剂，列入GB2760使用卫生标准，限量0.03g/kg。但规定焙烤后不得有残留。早期认为溴酸钾在焙烤后会分解掉，但是八十年代日本和英国，经长期研究发现，溴酸钾在焙烤后有残留物，对动物有致癌毒性。之后，FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会(JECFA)，于1994年撤消了溴酸钾在面粉中使用的ADI值，欧共体也在食品添加剂及其编号名单中，取消了溴酸钾。我国卫生部决定自2005年7月1日起，取消溴酸钾作为面粉处理剂在小麦粉中使用。
目前，国内外最常用的面粉漂白剂是过氧化苯甲酰。其漂白机理是过氧化苯甲酰在空气和酶的作用下水解，放出初生态的氧，从而氧化面粉中的不饱和脂溶性色素，使其失去颜色。科研工作者研究发现，长期过量使用过氧化苯甲酰对人体是有害的。过氧化苯甲酰水解后产生的苯甲酸，进入人体后要在肝脏内进行分解。长期食用加重肝脏负担，严重时肝、肾会出现病理变化，生长和寿命都将受到影响；面粉中残留的未分解的过氧化苯甲酰，在面食加热制作过程中能产生苯自由基，进而会形成苯、苯酚、联苯，这些产物都有毒性，对健康有不良的影响；自由基氧化会加速人体衰老，导致动脉粥样硬化，甚至诱发多种疾病。我国的国家标准中规定面粉中过氧化苯甲酰的最大使用量为0.06g/kg。
因此采用新型酶制剂和其它安全、天然的成分，开发出以酶制剂为主体的新型高效的能替代溴酸钾、过氧化苯甲酰的面粉品质改良剂成为食品加工研究的重点方向之一。
脂肪氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12，简称LOX)，又名亚油酸：氧化还原酶，俗称脂肪氧化酶、脂肪加氧酶、脂肪氧合酶或类胡萝卜素氧化酶。LOX报道始见于1932年，它来源于植物中的大豆；而动物中LOX的报道却是在四十多年后的1975年。广泛存在于哺乳动物、植物中，近年来在微生物中也发现LOX的存在。LOX是一种含非血红素铁的蛋白，酶蛋白由单肽链组成，专一催化包括亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸在内具有顺、顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其相应酯的加氧反应，在亚油酸和亚麻酸上的加氧位置是C9和C13，在花生四烯酸上的加氧位主要是C5、C12和C15，也可在C8、C9和C11位上加氧。生成的具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物(hydroperoxides，HPOD)，再进一步代谢为其它生理活性物质。
LOX在动、植物体内具有重要的意义，参与包括发育、胁迫、抗逆等信号途径。在食品加工过程中也具有重要的应用价值。LOX氧化不饱和脂肪酸生成的HPOD以及次级代谢中形成的H2O2、自由基物质不仅能够催化面筋蛋白中半胱氨酸交联反应形成二硫键(S-S)的形成，改善面筋强度，提高面粉加工性能，同时，能够与色素类物质发生氧化反应，破坏其结构，起到面粉漂白的效果。欧美等发达国家已经出现通过添加高LOX含量的大豆粉，改量面粉加工品质的专利，并应用于实际的生产加过程。
大豆粉由于其成份复杂，酶促反应复杂，作为加添剂不易控制。而以大豆为原料进行分离纯化LOX，成本很高。利用基因工程菌发酵，通过简单的纯化过程，获得高纯度、高活力的重组LOX，制备面粉改良添加剂的观点早已提出。而重组LOX至今未得到应用，其最大的技术瓶颈是基因工程菌发酵获得的LOX活力极低，多数以无活性的包含体形式出现，需要进行复性，使成本极大提高。因此，挖掘能够在微生物宿主中高效表达的LOX基因成为实现重组LOX在面粉品质改良中应用的突破口。
本发明人运用生物信息学的方法，在数据库中已有的基因资源中，寻找到一种能够在大肠杆菌中高效表达LOX基因——鱼腥藻脂肪氧合酶基因，表达的重组脂肪氧合酶全部以可溶性的活性形式出现。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的在于运用生物信息学的方法，通过基因、氨基酸序列分析，从鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)基因组中的双功能酶基因(脂肪氧合酶/丙二烯氧合酶)中分离了编码LOX的功能基因，克隆得到的原核来源的鱼腥藻脂肪氧合酶基因(ana-LOX)实现了在原核细胞中的高效表达。
技术方案
鱼腥藻脂肪氧合酶基因，来自鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC 7120，长1368bp，命名为ana-Lox，核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码一个由455个氨基酸组成的蛋白质。
上述鱼腥藻脂肪氧合酶基因编码的鱼腥藻脂肪氧合酶，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
上述鱼腥藻脂肪氧合酶基因的应用，包括：
(1)鱼腥藻脂肪氧合酶基因的克隆
离心收集鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC 7120菌体，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取鱼腥藻的基因组DNA；
设计两个引物：
上游引物：5’GGAGTGTCTGGTGCC 3’
下游引物：5’CTAAATGTTGATACTCATCAT3’
在50μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，鱼腥藻基因组DNA 10ng，2U Pfu DNA聚合酶；
扩增程序为94℃ 3min；30个循环：94℃ 30s，59℃ 50s，72℃ 40s；72℃ 10min；
琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，滴加40μL 2％X-gal、7μL 20％IPTG，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序；
用计算机软件DNAMAN分析测序结果，得到一个1368bp的ORF，即鱼腥藻脂肪氧合酶基因ana-Lox，编码一个由455个氨基酸组成的蛋白质。
(2)鱼腥藻脂肪氧合酶基因的原核表达载体的构建
根据获得的脂肪氧合酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上SacI识别序列，下游引物加上XhoI识别序列：
上游引物 5′-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3′
下游引物 5′-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3′
按照下列PCR体系加入各成分，扩增LOX基因：
10×Pfu PCR buffer 10μl
10μM上游引物 10μl
10μM下游引物 10μl
2.5mM dNTPs 8μl
鱼腥藻基因组DNA 10ng
d dH2O up to 100μl
PfuDNA聚合酶 5U
PCR程序为94℃ 2min；30个循环：94℃ 45s；58℃ 50s；72℃4min；72℃10min；
用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加SacI、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddH2O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-23a连接，转化大肠杆菌DH5α，从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后测序，获得含有ana-Lox的表达质粒pET-23a-ana-Lox。
(3)鱼腥藻脂肪氧合酶基因的在大肠杆菌中的表达
将含有ana-Lox表达质粒pET-23a-ana-Lox转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50mlLB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1∶40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加终浓度为100μg/ml的IPTG诱导，1.5小时后离心收集菌体，破碎菌体，离心收集上清液，以亚油酸为底测定LOX酶活。
上述鱼腥藻脂肪氧合酶的应用可高效地将亚油酸转变为脂肪酸氢过氧化物。
有益效果
LOX广泛存在于真核生物中，极少有原核来源的报道。本发明在NCBI数据中搜索到原核微生物鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)具有LOX活性，但是其以双功能酶(脂肪氧合酶/丙二烯氧合酶)形式存在。通过基因、氨基酸序列的结构、功能分析，设计引物，克隆得到一段1368bp读码框片段，在该基因两端分别加上SacI和XhoI限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pET-23a连接并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，实现了异源高效表达。
本发明所述的基因是一种原核来源编码脂肪氧合酶的基因，在原核宿主中具有高活性表达优势：
碱基 数目 百分比
A 414 30.3
C 254 21.5
G 406 29.7
T 406 29.7
G+C 660 51.2
本发明提供了一种运用了生物信息学，从已有基因序列的信息基础出发，通过分析核酸、氨基酸序列的结构和功能，从双功能酶基因中克隆得到一种新型、高活性、单一功能LOX基因的方法。
利用本发明成果，快捷的钓取已知基因组中的功能性LOX基因，实现了在大肠杆菌的高活性(816U/毫升细胞液)重组表达，并且表达的重组LOX全部以可溶性形式出现，活性重组LOX的产量达到以往最高报道的50倍以上(14.4U/毫升细胞液)，为微生物发酵生产大量、高活力重组LOX，实现LOX替代在面粉加工过程中对人体有害的化学添加剂成打下坚实基础。
四、附图说明
图1鱼腥藻脂肪氧合酶与其他来源的氨基酸序列比对分析
(星号残基位点为LOX活性中心位点)
图2重组鱼腥藻脂肪氧合酶表达载体构建过程
五、具体实施方式
(一)鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)LOX基因分析
NCBI数据库中，输入脂肪氧合酶(lipoxygenase)，搜索原核微生物得到鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)(中科院水生生物所购买)基因组中存在编码LOX的基因，基因注释为脂肪氧合酶/丙二烯氧合酶，是一个双功能酶蛋白。该基因全长2322个碱基对(bp)，720个氨基酸。
通过与真核、原核来源的脂肪氧合酶氨基酸序列进行比对，发现脂肪氧合酶活性中心保守氨基酸残基位于双功能酶C端部分。
将双功能酶基因3’端1368bp的基因编码的氨基酸序列进行BLASTP分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，发现编码片段属于脂肪氧合酶家族。
在ExPaSy数据库进行功能模块分析(http://pfam.sanger.ac.uk)，得出该片段中含有脂肪氧合酶功能区域。
C端片段与其他来源脂肪氧合酶同源性比对，得出与原核来源脂肪氧合酶同源性最高。
上述分析结果可以初步得到鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)基因组脂肪氧合酶/丙二烯氧合酶双功能基因5’端部分基因具有丙二烯氧合酶，3’端部分基因具有LOX功能。
表1鱼腥藻脂肪氧合酶氨基酸序列与其他来源的序列同源性
(a真核来源基因；b原核来源基因)
(二)鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)脂肪氧合酶基因克隆
离心收集鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)菌体，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取鱼腥藻的基因组DNA。
根据NCBI公布的基因组序列设计出两个引物：
上游引物：5’GGAGTGTCTGGTGCC 3’
下游引物：5’CTAAATGTTGATACTCATCAT3’
在50μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，鱼腥藻基因组DNA 10ng，2U Pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃ 3min；30×(94℃ 30s，59℃50s，72℃ 40s)；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，滴加40μL 2％X-gal、7μL 20％IPTG，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序
用计算机软件DNAMAN分析测序结果，得到一个1368bp的ORF，即鱼腥藻脂肪氧合酶基因(ana-Lox)，编码一个由455个氨基酸组成的蛋白质。
(三)鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)脂肪氧合酶基因原核表达载体的构建
根据获得的脂肪氧合酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上SacI识别序列，下游引物加上XhoI识别序列(下划线部分为限制酶识别序列)：
上游引物 5′-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3′
下游引物 5′-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3′
按照下列PCR体系加入各成分，扩增LOX基因：
10×Pfu PCR buffer 10μl
10μM上游引物 10μl
10μM下游引物 10μl
2.5mM dNTPs 8μl
鱼腥藻基因组DNA 10ng
ddH2O up to 100μl
Pfu DNA聚合酶 5U
PCR程序为94℃ 2min；30×(94℃ 45s；58℃ 50s；72℃ 4min)；72℃ 10min。
用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加SacI、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddH2O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-23a(Novagen)连接，转化大肠杆菌DH5α(Novagen)。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。
(四)鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)脂肪氧合酶基因在大肠杆菌中的表达
将含有ana-Lox表达质粒pET-23a-ana-Lox转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1∶40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导。1.5小时后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，以亚油酸为底测定LOX酶活。酶活测定结果表明，重组LOX活性达到816U/毫升细胞液，达到以往最高报道的50倍以上(14.4U/毫升细胞液)；SDS-PAGE电泳分析表达的重组LOX全部以可溶性形式出现，没有出现无活性的包涵体，这也是以往报道中未出现过的结果(以往报道中，大肠杆菌表达重组LOX多数以包涵体形式出现)。
上述高LOX活性表达结果，为微生物发酵生产大量、高活力重组LOX，实现LOX替代在面粉加工过程中对人体有害的化学添加剂成打下坚实基础。
序列表
<110>南京农业大学
<120>鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因
<130>000
<140>000
<141>2009-08-20
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1368
<212>DNA
<213>鱼腥藻(Anabaena sp.)
<220>
<221>ana-Lox基因
<222>(1)..(1368)
<223>
<400>1
ggagtgtctg gtgccttagt tcattatttt ggctccattg ttcgtgctga acgcactcag 60
tatttgtatg gaagtaagga tgatttgcct ggaaaaccag tttatttccc tctcccagtg 120
actgaaattc cttctaaaag attccttttt ctattagaga aatataattt tcttacagat 180
aattcatacc cttcagacgg tgaacacgac aagattgaag cacttgtatc agccatgcct 240
actacagctt tggatttggc agttggcact actgatccca ccgatatccc tgacagctac 300
tttttagaac gtcggctcaa tgggtacaat ccaggtgcaa ttcgcgaatc ttctggtcaa 360
gaaggctgga cacatgagct tactcacaat ctggcaaaat atgacatcaa gccaggcttg 420
cactttcctg attttgttca atgtcggctt tttgttgata aacaaaatgg tgtcaagctg 480
cattcaataa aaatagatga tcatgaaatt acgccatgcc aagaacaatg gcaatatgct 540
aaacgtactt acctgcaagc cgaattcctt tcacaagagc tgaaacttca tttagcccgt 600
tgtcacttca acattgaaca atatgttatg gctataaaaa gaaggctcgc tcccactcat 660
cctgtgcggg cgtttattaa tcctcatctt gaggggctga tatttatcaa ctcatcagct 720
gttccaaaga ttatcggttc aacaggtttc atccctatcg cctccatgct aacgcaggga 780
tctattgttg atgtaatgaa aaatgaatta agtaaactga gttatatgtg gaatccaatc 840
gctgatttgc cacgtgatat tcccggagac ctttttacac ctgcggcaac agcctattgg 900
gaactactta acaattatgt tgaacagggt ttactacaac catttgaaga tgaacttcgc 960
accgaagtaa atgcgattca ggttgacgaa ctttttgctg aattaaaaga acgaagtctt 1020
tactccggag accaaccacc caaatacgat tcatcagagc ttaaaagtct gttaatgtac 1080
atcatttacc attcaagttt cctgcactca tgggctaact ttaaacaata tgatgatgct 1140
ggaaatccta atcatgtatc aatgggagat tatagtcaat acgaccaaca gacacaggac 1200
aaaatacgct tctctcaacg atctttaaca tgggtacttt catcaattcg atacaactca 1260
gttgcagtat atggatcgga tttactcaaa cagctcattc gggaaaaatc atcaatattg 1320
gaaccaggac ttccattaga ggatctcatg atgagtatca acatttag 1368
<210>2
<211>455
<212>PRT
<213>鱼腥藻(Anabaena sp.)
<220>
<221>鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶
<222>(1)..(455)
<223>
<400>2
Gly Val Ser Gly Ala Leu Val His Tyr Phe Gly Ser Ile Val Arg Ala
1 5 10 15
Glu Arg Thr Gln Tyr Leu Tyr Gly Ser Lys Asp Asp Leu Pro Gly Lys
20 25 30
Pro Val Tyr Phe Pro Leu Pro Val Thr Glu Ile Pro Ser Lys Arg Phe
35 40 45
Leu Phe Leu Leu Glu Lys Tyr Asn Phe Leu Thr Asp Asn Ser Tyr Pro
50 55 60
Ser Asp Gly Glu His Asp Lys Ile Glu Ala Leu Val Ser Ala Met Pro
65 70 75 80
Thr Thr Ala Leu Asp Leu Ala Val Gly Thr Thr Asp Pro Thr Asp Ile
85 90 95
Pro Asp Ser Tyr Phe Leu Glu Arg Arg Leu Asn Gly Tyr Asn Pro Gly
100 105 110
Ala Ile Arg Glu Ser Ser Gly Gln Glu Gly Trp Thr His Glu Leu Thr
115 120 125
His Asn Leu Ala Lys Tyr Asp Ile Lys Pro Gly Leu His Phe Pro Asp
130 135 140
Phe Val Gln Cys Arg Leu Phe Val Asp Lys Gln Asn Gly Val Lys Leu
145 150 155 160
His Ser Ile Lys Ile Asp Asp His Glu Ile Thr Pro Cys Gln Glu Gln
165 170 175
Trp Gln Tyr Ala Lys Arg Thr Tyr Leu Gln Ala Glu Phe Leu Ser Gln
180 185 190
Glu Leu Lys Leu His Leu Ala Arg Cys His Phe Asn Ile Glu Gln Tyr
195 200 205
Val Met Ala Ile Lys Arg Arg Leu Ala Pro Thr His Pro Val Arg Ala
210 215 220
Phe Ile Asn Pro His Leu Glu Gly Leu Ile Phe Ile Asn Ser Ser Ala
225 230 235 240
Val Pro Lys Ile Ile Gly Ser Thr Gly Phe Ile Pro Ile Ala Ser Met
245 250 255
Leu Thr Gln Gly Ser Ile Val Asp Val Met Lys Asn Glu Leu Ser Lys
260 265 270
Leu Ser Tyr Met Trp Asn Pro Ile Ala Asp Leu Pro Arg Asp Ile Pro
275 280 285
Gly Asp Leu Phe Thr Pro Ala Ala Thr Ala Tyr Trp Glu Leu Leu Asn
290 295 300
Asn Tyr Val Glu Gln Gly Leu Leu Gln Pro Phe Glu Asp Glu Leu Arg
305 310 315 320
Thr Glu Val Asn Ala Ile Gln Val Asp Glu Leu Phe Ala Glu Leu Lys
325 330 335
Glu Arg Ser Leu Tyr Ser Gly Asp Gln Pro Pro Lys Tyr Asp Ser Ser
340 345 350
Glu Leu Lys Ser Leu Leu Met Tyr Ile Ile Tyr His Ser Ser Phe Leu
355 360 365
His Ser Trp AlaAsn Phe Lys Gln Tyr Asp Asp Ala Gly Asn Pro Asn
370 375 380
His Val Ser Met Gly Asp Tyr Ser Gln Tyr Asp Gln Gln Thr Gln Asp
385 390 395 400
Lys Ile Arg Phe Ser Gln Arg Ser Leu Thr Trp Val Leu Ser Ser Ile
405 410 415
Arg Tyr Asn Ser Val Ala Val Tyr Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gln Leu
420 425 430
Ile Arg Glu Lys Ser Ser Ile Leu Glu Pro Gly Leu Pro Leu Glu Asp
435 440 445
Leu Met Met Ser Ile Asn Ile
450 455
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>基因克隆引物上游
<222>(1)..(15)
<223>
<400>3
ggagtgtctg gtgcc 15
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>基因克隆引物下游
<222>(1)..(21)
<223>
<400>4
ctaaatgttg atactcatca t 21
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>基因扩增引物上游
<222>(1)..(24)
<223>
<400>5
cgcgagctcg gagtgtctgg tgcc 24
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>基因扩增引物下游
<222>(1)..(20)
<223>
<400>6
ccgctcgagc taaatgttga tactcatcat 30
Claims (1)
1.鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因的应用，该基因来自鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC 7120，长1368bp，命名为ana-Lox，核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码一个由455个氨基酸组成的蛋白质，包括：
(1)鱼腥藻脂肪氧合酶基因的克隆
离心收集鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC 7120菌体，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取鱼腥藻的基因组DNA；
设计两个引物：
上游引物：5’GGAGTGTCTGGTGCC 3’
下游引物：5’CTAAATGTTGATACTCATCAT3’
在50μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，鱼腥藻基因组DNA 10ng，2U Pfu DNA聚合酶；
扩增程序为94℃ 3min；30个循环：94℃ 30s，59℃ 50s，72℃ 40s；72℃ 10min；
琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，滴加40μL 2％X-gal、7μL 20％IPTG，培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序；
用计算机软件DNAMAN分析测序结果，得到一个1368bp的ORF，即鱼腥藻脂肪氧合酶基因ana-Lox，编码一个由455个氨基酸组成的蛋白质。
(2)鱼腥藻脂肪氧合酶基因的原核表达载体的构建
根据获得的脂肪氧合酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上SacI识别序列，下游引物加上XhoI识别序列：
上游引物 5′-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3′
下游引物 5′-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3′
按照下列PCR体系加入各成分，扩增LOX基因：
10×Pfu PCR buffer 10μl
10μM上游引物 10μl
10μM下游引物 10μl
2.5mM dNTPs 8μl
鱼腥藻基因组DNA 10ng
ddH2O up to 100μl
Pfu DNA聚合酶 5U
PCR程序为94℃ 2min；30个循环：94℃ 45s；58℃ 50s；72℃ 4min；72℃10min；
用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加SacI、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddH2O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-23a连接，转化大肠杆菌DH5α，从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后测序，获得含有ana-Lox的表达质粒pET-23a-ana-Lox。
(3)鱼腥藻脂肪氧合酶基因的在大肠杆菌中的表达
将含有ana-Lox表达质粒pET-23a-ana-Lox转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50mlLB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1∶40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加终浓度为100μg/ml的IPTG诱导，1.5小时后离心收集菌体，破碎菌体，离心收集上清液，以亚油酸为底物测定LOX酶活。
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