CN101134967B - 透明颤菌血红蛋白突变体及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种突变的透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因序列及其编码的透明颤菌血红蛋白突变体，以及该基因转化异源宿主所得到的转化子及其在发酵中的应用。该基因由438个核苷酸组成，编码了一段由146个氨基酸组成的蛋白，该基因所表达的蛋白在环境溶氧不足的情况下能够提高宿主细胞的生物量，因此可用于发酵工业中促进宿主细胞生长，提高目的产物的产量，降低生产成本。

Description

透明颤菌血红蛋白突变体及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白突变体及其基因，含有该基因的表达载体，以及该基因转化异源宿主细胞所得的转化体及其在发酵工业中的应用。

背景技术

透明颤菌(Vitreoscilla)是一种专性好氧的丝状革兰氏阴性细菌，可在池沼或腐烂的蔬菜中分离到。作为专性好氧菌，透明颤菌之所以能在贫氧的环境中生存，是因为其能够合成透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，简称为VHb，编码基因称为vgb或vhb，Genbank编号M30794)的缘故。将此蛋白在异源微生物、植物乃至动物细胞中进行表达，发现其具有在限氧条件下促进宿主细胞生长、提高抗生素、酶或其他经济产物产量、降低生产成本、增强植物抗涝能力、加速微生物对环境污染物分解等作用。通过对其作用机理的研究，发现VHb在限氧条件下能够促进溶氧从环境中向细胞内的传递，从而缓解细胞生长过程中供氧不足的矛盾。VHb的天然启动子包括P1和P2两个部分，该启动子受溶氧浓度诱导，当溶氧降至5％大气饱和度以下时可强力启动下游基因表达(Khosla C，et al.J Bacteriol，1989，171(11)：5995-6004)。目前，VHb已应用于发酵、重组蛋白表达、转基因动植物、环保等诸多领域，取得了显著成效(胡之璧.中西医结合学报，2005，3(5)：337-341)。然而VHb是一种仅存在于透明颤菌体内的原核蛋白，当其基因被转入异源细胞时，在转录、翻译以及发挥作用的过程中都面临着识别、加工、利用、分解等一系列问题，在很多情况下，异源表达的VHb或许有效，但却并不一定最佳。因此，有必要对VHb进行适当改造，使之能够适应不同的宿主或具有更好的特性，从而能够更好地发挥效应；而且，对比改造前后的VHb，也将有助于更深入地了解这种蛋白。近年来，对VHb的改造已经展开，主要包括定点突变(Kim Y，et al.J Ind Microbiol Biotechnol，2005，32(4)：148-54)、易错PCR(error-prone PCR)(Andersson CI，et al.Biotechnol Bioeng，2000，70(4)：446-55)、根据宿主密码子偏向性进行全合成(吴巧雯，等.中国农业科学，2004，37(10)：1439-1443)等方法，获得了一些活性提高或更适应宿主的“新”VHb。然而，若想继续获得理想的VHb，则需要在更大量的突变基因中进行筛选，因此，创造更大的突变率是改造VHb的一个有效途径。

DNA改组(DNA shuffling)是近年来兴起的一项蛋白质工程新技术，它模拟达尔文进化的方式，通过将单个基因或不同来源的基因家族打碎后进行重组，使亲本的不同信息快速交换和累积，再辅以高效快速的筛选方法，就能在短时间内获得性状、活性发生有益改变的新基因，因而是一种“有性”基因突变(Cohen J.Science，2001，293(5528)：237)。相比于“无性”基因突变，DNA改组具有突变频率大、正向突变率高、跨越物种界限、亲本性状快速富集等优点，因而得到了广泛应用。利用该技术改造的酶或蛋白具有活力和稳定性显著提高、能够耐酸、碱、热等特点，促进了工业、农业和医药业的发展(Coco WM，et al.Nat Biotechnol，2001，19(4)：354-9).通常，DNA改组的材料来源于含有几个同源基因的基因家族，对于单基因为出发材料，则可通过易错PCR的方法先获得一些突变基因，再以此作为基因家族进行改组，即采用无性进化技术和有性进化技术相结合的方式(Xu HF，et al.Prog BiochemBiophys，2002，29：518-522)。

综上所述，如果采用易错PCR与DNA改组的方法改造VHb，就有可能获得更大的突变率，从而有可能获得宿主适应性更好或者活性更强的蛋白。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是上述课题，为提高透明颤菌血红蛋白(VHb)在限氧条件下促进异源宿主细胞生长的能力，采用易错PCR结合DNA改组的方法改造VHb，通过初筛与复筛相结合的方法筛选符合条件的蛋白，从而提供一种活性更高的VHb突变体及其编码基因，即突变的vgb基因。

本发明首先构建能够克隆和表达突变基因，并通过调节环境中的溶氧浓度来筛选高活性突变基因的表达和筛选载体pYG857。

其次，通过提高PCR体系中的Mg²⁺和Mn²⁺浓度向透明颤菌血红蛋白基因(vgb)中引入突变，将突变基因克隆至表达载体pYG857并转化大肠杆菌E.coli DH5α，通过比较限氧条件下菌体沉淀的颜色异同，获得明显发生突变的vgb，与未突变的原始基因一道作为DNA改组的出发基因家族。

然后将上述出发基因家族，用DNase I消化成50bp左右的碎片，再经无引物和有引物PCR进行重建。将改组基因克隆至表达载体pYG857并转化大肠杆菌E.coli DH5α，通过比较限氧条件下菌体沉淀的红色深浅，得到红色明显深于对照的转化体。再将这些转化体进行摇瓶培养，通过比较其在限氧条件下的生长曲线并结合限氧和极端限氧条件下的菌体湿重，筛选得到突变蛋白VHb’042506，它能够使宿主的菌体湿重在限氧和极端限氧条件下较原基因转化体分别提高31.25％和58.75％。

最后将突变基因进行测序得到本发明突变的透明颤菌血红蛋白基因(vgb’)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，与原始vgb进行比对，共发生11处碱基突变，致氨基酸突变4处，结果如下表1所示：

表1

当然，如本领域技术人员所知，本发明vgb’基因还可以是编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它核苷酸序列；而本发明的透明颤菌血红蛋白(VHb)突变体不仅限是具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将该序列中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同活性的由该序列衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。

CO差光谱实验结果证明该突变基因所表达的蛋白(VHb’)具有透明颤菌血红蛋白(VHb)所特有的吸收峰，也即具有透明颤菌血红蛋白的活性，且VHb’的活性较VHb更佳。

因此，本发明还提供包括上述vgb’基因的核苷酸序列的表达载体。所述表达载体是先将vgb及其启动子的基因序列用常规方法连接于各种载体上构建克隆和表达载体，然后将vgb’基因的核苷酸序列替换vgb后构建而成。所述载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)，pQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen)，但不是仅限于这些载体。

较佳的是将用PCR扩增到的vgb及其启动子的基因产物先后和克隆载体pUC18连接，形成克隆和表达载体pYG857。pYG857和vgb’基因分别用限制性内切酶消化，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成vgb’基因的表达载体(质粒)pYG857’。

本发明还提供含有上述vgb’基因的转化体及制备该转化体的方法。所述方法包括将上述表达载体转化宿主细胞。本发明的宿主细胞优选为大肠杆菌E.coli DH5α细胞。

在本发明一较佳实施例中，该转化体为大肠杆菌E.coli DH5α：pYG857’042506。

所述的转化体可同现有大肠杆菌一样，应用在细胞发酵方面，如表达药用重组蛋白(刘新宇，等.天津医药，2006，34(1)：29-32)、高分子材料(Choi J，Lee SY.Bioproc Eng，1997，17：335-342)等。由于本发明基因所表达的蛋白在环境溶氧不足的情况下能够提高宿主细胞的生物量，因此用于发酵工业中可促进大肠杆菌宿主细胞生长，提高目的产物的产量，降低生产成本。

附图说明

图1显示了克隆、表达和筛选质粒pYG857和pYG857’的构建过程。

图2显示了易错pCR的电泳结果；其中，1为易错PCR结果，2为标记，3为vgb的PCR结果。

图3显示了DNA改组中碎片化的电泳结果；其中，1为DL2000标记，2为消化14分钟(min)结果，3为消化16min结果，4为消化18min结果，5为消化20min结果。

图4显示了DNA改组中基因重建的电泳结果；其中，1为有引物PCR结果，2为无引物PCR结果，3为DL2000标记。

图5显示了突变基因转化体DH5α：pYG857’042506和原始基因转化体DH5α：pYG857在限氧条件下的生长曲线。

图6显示了突变基因转化体DH5α：pYG857’042506和原始基因转化体DH5α：pYG857在限氧(1)和极端限氧条件下(2)的菌体湿重。

图7显示了突变基因转化体DH5α：pYG857’042506和原始基因转化体DH5α：pYG857的CO差光谱。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

下列实施例中的材料为：

所使用的工具酶和DNA分子量Marker均购自Takara公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，使用方法参考商品说明书。

下面的质粒和大肠杆菌株用于DNA文库构建和基因克隆：

pUC18(Stratagene公司)，

大肠杆菌E.coli DH5a(Hanahan D.J.Mol.Biol.，1983，166，557-580)。

透明颤菌(Vitreoscilla filiformis ATCC编号43191)。

实施例1克隆和表达载体的构建

利用Invitrogen公司的Vector NTI 10软件，根据文献Dikshit KL，WebsterDA.Gene，1988，70：377-386报道的1.4kb的vgb及其启动子序列设计引物VH1和VH2：

VH1：5’-GCTCTAGATTATTCAACCGCTTGAGCGT-3’(SEQ ID No.3)Xba I

VH2：5’-CGGAATTCTATGTTAGACCAGCAAACCA-3’(SEQ ID No.4)EcoR I

以透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)ATCC 43191基因组为模板，以VH1和VH2为引物扩增vgb结构基因，反应条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃40s，循环30次后，72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、回收500bp附近的片段，经EcoR I和Xba I双酶切后连入经同样双酶切的pUC18，得到pUC18vgb。

同样根据该1.4kb序列设计引物Pvgb1和Pvgb2：

Pvgb1：

5’-CGGAATTCTTCCTTAAGTTCATTATTATGG-3’(SEQ ID No.5)EcoR I

Pvgb2：

5’-AAAAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCAT-3’(SEQ ID No.6)Sca I

以上述透明颤菌基因组为模板，以Pvgb 1和Pvgb2为引物扩增vgb启动子部分，反应条件为94℃5min，94℃30s，54℃30s，72℃2min，循环30次后，72℃延伸5min。电泳回收1.8kb的片段，经EcoR I和Sca I酶切后连入经同样双酶切的pUC18vgb，得到克隆和表达载体pYG857(图1)。

载体pYG857上的vgb结构基因位于受氧调控的启动子之下且可被突变的vgb替换，当转化至大肠杆菌后，使培养环境处于贫氧状态，便可使vgb基因表达。其表达的蛋白VHb能够使菌体颜色呈现出红色或其他颜色，且红色的深浅与蛋白活性成正相关；此外高活性的VHb蛋白能够促进环境中的氧向宿主细胞内的传递，提高宿主细胞的生物量，因此此载体可用于突变vgb基因的克隆、表达和筛选。

实施例2利用易错PCR获得vgb基因改组材料

以pYG857模板，VH1和VH2为引物扩增vgb，向PCR体系中添加MgCl₂和MnCl₂，使Mg²⁺和Mn²⁺的终浓度分别为7.5mmol/L和0.5mmol/L，PCR反应条件和产物处理如实施例1中所述。将易错PCR产物电泳回收(图2)，并用EcoR I和Xba I双酶切，将酶切产物连入经同样酶切的pYG857，得到突变基因载体pYG857EP，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，于37℃培养过夜。

从转化平板上随机挑取转化子单菌落，接入装有5ml LB液体培养基的15ml试管中，加入抗生素，用橡胶帽封住试管口，于37℃，230r/min培养约16hr，将菌液倒入1.5ml Eppendorf小管，10000r/min离心1min，以未突变基因的转化子(即将pYG857转化E.coli DH5α感受态细胞制得)DH5α：pYG857为对照，观察经突变操作的基因转化子沉淀的颜色，挑取4个分别呈现出青灰、黄绿、淡红和深咖啡色的菌体提取质粒，PCR扩增质粒上的突变vgb基因，与未突变的vgb一道作为DNA改组的出发基因。

实施例3vgb基因的DNA改组

(1)DNA碎片化反应

以pYG857和经易错PCR筛得的4个pYG857EP为模板，用实施例1所述条件扩增出原始基因vgb和突变基因vgb’，电泳回收目的片段，溶于适当体积的ddH₂O中。在20μl体系中，加入5种回收产物各约0.5μg和0.5UDNase I，于25℃反应14-20min，90℃灭酶活10min。产物用琼脂糖凝胶电泳检测碎片化程度。从图3可以看出，当消化反应进行18min左右时，能够得到较为理想的50bp大小碎片。切下碎片集中于50bp附近的凝胶块，用小片段DNA快速回收试剂盒回收。

(2)无引物PCR

直接取小片段回收产物40μl，于50μl体系中，不加入引物，进行PCR反应，反应条件为：94℃变性1min，94℃30s，47℃30s，72℃30s，循环50次，72℃延伸5min，产物在电泳图上呈现出弥散状(图4)。

(3)有引物PCR

取无引物PCR产物5μL为模板，加入引物VH1和VH2，于20μl体系中进行PCR反应，反应条件为94℃变性1min，94℃30s，57℃30s，72℃40s，循环15次，72℃延伸5min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在450bp附近形成单一条带(图4)，表明突变基因vgb’得到重构。回收450bp附近的片段，回收产物后用EcoR I和XbaI双酶切，将酶切产物连入经同样酶切的pYG857，得到突变基因载体pYG857’(构建过程参见图1所示)，转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，于37℃培养过夜，得到突变体文库。

实施例4从改组基因转化子中筛选突变体

(1)改组产物初筛

从转化平板上随机挑取转化子单菌落，接入装有5ml LB液体培养基的15ml试管中，加入抗生素，用橡胶帽封住试管口，于37℃，230r/min培养约16hr，将菌液倒入1.5ml Eppendorf小管，10000r/min离心1min，以未突变基因的转化子为对照，观察经突变操作的基因转化子沉淀的颜色，挑取红色明显深于对照的转化子进行复筛。

(2)改组产物复筛

含有未突变基因的对照菌DH5α：pYG857及经初筛得到的深红色转化子接入含抗生素的2ml TB液体培养基中，于37℃，230r/min培养10hr，以1‰(v/v)转接至装有100ml TB液体培养基的250ml摇瓶中，加入氨苄青霉素，于37℃，150r/min培养，在不同时间测600nm处光吸收，绘制生长曲线，发现其中编号为DH5α：pYG857’042506的候选菌株在培养12小时后OD₆₀₀与对照DH5α：pYG857相比有所增加(图5)。

将该候选菌株试管培养液以1‰转接至装有100ml TB液体培养基的250ml摇瓶中，加入氨苄青霉素，用纱布或小气球封住摇瓶口(分别对应限氧和极端限氧培养条件)，于37℃，150r/min培养20hr，将菌液置预先称重的250ml离心管中，于10000r/min离心2min，倾去上清后再于5000r/min离心1min，吸净残余液体后精密称量菌体湿重。测得该菌体平均湿重在限氧和极端限氧条件下分别为10.206g/L和6.374g/L，而相应的对照菌株分别为7.817g/L和4.015g/L，前者比后者分别提高了31.25％和58.75％，均具有显著差异(图6)，表明将此突变基因vgb’042506在异源宿主细胞中表达，在限氧条件下能够显著促进宿主细胞的生长。

实施例5基因测序及序列比对

将作为对照的DH5α：pYG857和筛选得到的突变体克隆DH5α：pYG857’042506送华大基因上海鼎安生物科技有限公司测序，测序结果输入Vector NTI软件，比较突变前后的基因碱基序列和蛋白质氨基酸序列的差异。

结果显示，出发基因vgb与Genbank发表的vgb碱基序列完全一致，突变基因vgb’042506碱基序列与Genbank发表的vgb相比发生11处突变，突变率为2.49％；经翻译得到的氨基酸序列发生4处突变，突变率为2.74％。突变体DH5α：pYG857’042506的DNA碱基及蛋白质氨基酸序列改变情况如上表1所示，即碱基变化为：第21位由A(腺嘌呤)替代T(胸腺嘧啶)，第45、65、66、169位C(胞嘧啶)替代T，第167、173及345位T替代C，第194位G(鸟嘌呤)替代C，第195位C取代G，第390位G取代A；相应地，氨基酸变化为：第22位由丙氨酸(A，Ala)取代缬氨酸(V，Val)，第56、58位由缬氨酸取代丙氨酸，第65位由甘氨酸(G，Gly)取代丙氨酸。

实施例6CO差光谱实验

将限氧条件下培养的pYG857和pYG857’转化子的菌液离心，洗涤，根据菌体沉淀的湿重用适当体积磷酸盐缓冲液重悬，使各转化子的菌体浓度尽量一致。重悬液经超声破碎(10s超声，5s暂停，600w强度，共进行15min)后离心(12000rpm，30min)，取上清。向上清液中加入过量连二亚硫酸钠使VHb充分还原，取一份做参比，剩下的通入CO 5min，再于黑暗处络合5min，然后于400-470nm范围内扫描光吸收值。

从菌体蛋白上清液颜色上看，突变体DH5α：pYG857’042506红色要深于对照DH5α：pYG857，映证了它们的菌体沉淀在颜色上的差异。扫描图谱显示：突变蛋白VHb’042506和出发蛋白VHb在420nm和436nm附近都呈现出明显的特征性吸收波峰和波谷，表明突变蛋白具有血红蛋白活性。而波峰和波谷与对照相比都显突出，表明本发明的突变蛋白具有更强的活性(图7)。

序列表

<110>上海医药工业研究院

<120>透明颤菌血红蛋白突变体及其基因和应用

<130>061708C

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>438

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>采用易错PCR结合DNA改组的方法改造vgb基因制得的突变基因

vgb′

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(438)

<400>1

atg tta gac cag caa acc ata aac atc atc aaa gcc act gtt ccc gta    48

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1               5                   10                  15

ttg aag gag cat ggc gcc acc att acc acg act ttt tat aaa aac ttg    96

Leu Lys Glu His Gly Ala Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

            20                  25                  30

ttt gcc aaa cac cct gaa gta cgt cct ttg ttt gat atg ggt cgc caa    144

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

        35                  40                  45

gaa tct ttg gag cag cct aag gtt ctg gtg atg acg gta ttg gcg gca    192

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Val Leu Val Met Thr Val Leu Ala Ala

    50                  55                  60

ggc caa aac att gaa aat ttg cca gct att ttg cct gcg gtc aaa aaa    240

Gly Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65                  70                  75                  80

att gca gtc aaa cat tgt caa gca ggc gtg gca gca gcg cat tat ccg    288

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

                85                  90                  95

att gtc ggt caa gaa ttg ttg ggt gcg att aaa gaa gta ttg ggc gat    336

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

            100                 105                 110

gcc gca act gat gac att ttg gac gcg tgg ggc aag gct tat ggc gtg    384

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

        115                 120                 125

att gcg gat gtg ttt att caa gtg gaa gca gat ttg tac gct caa gcg    432

Ile Ala Asp Val PheIle Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

    130                 135                 140

gtt gaa                                                            438

Val Glu

145

<210>2

<211>146

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1               5                   10                  15

Leu Lys Glu His Gly Ala Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

            20                  25                  30

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

        35                  40                  45

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Val Leu Val Met Thr Val Leu Ala Ala

    50                  55                  60

Gly Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65                  70                  75                  80

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

                85                  90                  95

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

            100                 105                 110

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

        115                 120                 125

Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

   130                 135                 140

Val Glu

145

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物VH1

<400>3

gctctagatt attcaaccgc ttgagcgt    28

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物VH2

<400>4

cggaattcta tgttagacca gcaaacca    28

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Pvgb1

<400>5

cggaattctt ccttaagttc attattatgg    30

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Pvgb2

<400>6

aaaagtactc accagtcaca gaaaagcat                            29

Claims (7)

1.一种突变的透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因，是下列核苷酸序列之一：

1)如序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列；

2)编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白突变体，是由序列表中SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.包括权利要求1所述的突变的透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因的核苷酸序列的表达载体。

4.含有如权利要求1所述基因的转化体。

5.一种制备如权利要求4所述的转化体的方法，其包括将权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于该宿主细胞为大肠杆菌E.coliDH5α细胞。

7.如权利要求4所述的转化体在细胞发酵中的应用。

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