CN1604960A - 表达系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于在宿主细胞中生产靶蛋白的表达系统,包含编码T7RNA聚合酶的同源整合基因和编码靶蛋白的非整合基因。
Description
本发明涉及一种在用于生产靶蛋白的表达系统中有用的新宿主细胞。
可以获得许多表达系统用于在细菌宿主细胞中生产靶蛋白的目的。这些系统中的许多系统来自象大肠杆菌的乳糖(lac)和色氨酸(trp)操纵子那样天然存在的内源调节系统。也有几个利用象λ噬菌体λ启动子(PL)系统那样噬菌体表达调节网络组分的系统。
然而,在实验室水平用于在大肠杆菌中重组靶蛋白表达的最广泛和最常规使用的系统之一是T7噬菌体表达系统。该表达系统可以从Novagen股份有限公司(Madison WI)买到,并且被描述在美国专利No.4,952,496中。该表达系统包含含有已整合噬菌体溶原体的宿主细胞。接着用在噬菌体启动子的控制下的非整合基因转化宿主细胞,其中非整合基因编码选择的靶蛋白。
λDE3溶原体是具有在lacUV5启动子控制下T7RNA聚合酶克隆的重组噬菌体。通过用λDE3噬菌体溶菌产物、辅助噬菌体溶菌产物和选择噬菌体溶菌产物共感染宿主细胞制备λDE3溶原体。共感染的结果是产生具有被结合到宿主细胞染色体的λDE3噬菌体的宿主细胞。尽管λDE3噬菌体在λ整合位点被整合到宿主染色体中,但是λDE3噬菌体在其溶解的能力上是缺陷的。因而,DE3溶原体应当是稳定的,不应随后溶解细胞产生感染噬菌体。一旦诱导表达系统,宿主细胞就从DE3溶原体中制造T7RNA聚合酶。T7RNA聚合酶接着结合非整合靶基因的噬菌体启动子并且启动靶蛋白的合成。
T7表达系统提供许多使其十分适合表达靶蛋白的好处。例如,靶基因的T7或T7lac启动子是噬菌体独有的并且不被宿主细胞RNA聚合酶识别的噬菌体启动子。因而,仅仅当存在T7RNA聚合酶时才能启动靶蛋白的表达。这有助于减少先于诱导的靶蛋白表达的潜力。因为一些靶蛋白对于宿主细胞的生长具有有害的影响,因而减少靶蛋白生产的最大量,因此不期望先于诱导的靶蛋白的表达。
另一个使T7表达系统适合表达靶蛋白的的实例是已经改变了T7启动子以包含乳糖操纵子(lac0)。lac0是乳糖操纵子阻遏物的结合位点。乳糖操纵子阻遏物结合lac0,防止T7RNA聚合酶结合T7lac启动子,因此有效地抑制靶蛋白的表达。一旦向宿主细胞中添加诱导剂,抑制就可被逆转。诱导剂将乳糖阻遏物从lac0上去除,并且允许T7RNA聚合酶结合到T7lac启动子上并且启动靶蛋白的表达。lac0的包围使靶蛋白表达的启动几乎严格10倍。这也助于减少先于诱导的靶蛋白表达的潜力,因为一些靶蛋白对宿主细胞的生长具有有害的影响,因而减少靶蛋白生产的最大量。乳糖阻遏物是从称作lacI的内源宿主细胞基因中产生的。然而,具有lacI基因的宿主菌株不能产生足够多的乳糖阻遏物来有效地抑制靶蛋白表达的。因而,为了获得靶蛋白的适当调节,宿主菌株也应当含有额外的lacI基因或者使用包含lacIQ1启动子的过量表达的宿主细胞。
表达系统极为有利的特性很可能是T7RNA聚合酶比宿主细胞RNA聚合酶更持续合成几乎12倍。T7RNA聚合酶的高持续合成能力能够导致超过细胞总蛋白60%的蛋白作为靶蛋白,使该系统成为可得到的效率最高的表达系统之一。
然而,本发明的根据是发现如在一些情况下靶蛋白被大量产生,在发酵液中能够检测到感染的噬菌体。这暗示DE3噬菌体已经恢复了其溶解的能力。在发酵期间达到的高细胞密度可能是通过低水平的重组或导致溶原体删除的非常规重组(逆转)产生了可感染的噬菌体。然而,调节剂(regulatory agencies)阻止含有靶蛋白的发酵液向前加工成具有可检测到噬菌体颗粒水平的药品而被使用。
根据这个问题,本发明提供改进的T7表达系统。在本发明中,使用不同的整合机制将7RNA聚合酶基因整合到宿主细胞的染色体中。本发明通过同源重组而不是用缺陷噬菌体感染宿主细胞的方式将T7RNA聚合酶基因拷贝整合到宿主细胞染色体的非必需位点。宿主细胞进而包括编码选择的靶蛋白的非整合基因。编码T7RNA聚合酶的整合基因是在宿主细胞的内源调节系统的控制下,而编码靶蛋白的非整合基因是在噬菌体调节系统的控制下。当宿主细胞被诱导时,宿主细胞RNA聚合酶能够结合到宿主细胞启动子上并且启动T7RNA聚合酶的合成。新合成的T7RNA聚合酶结合到T7或T7lac启动子上并且启动靶蛋白的合成。结果得到含有靶蛋白的无噬菌体的发酵液。
本发明提供包含被整合到宿主染色体中在lac启动子控制下的同源重组T7RNA聚合酶基因的宿主细胞。没有使用噬菌体溶原体将T7RNA聚合酶整合到宿主细胞染色体中,结果没有掺入额外的噬菌体DNA。同源重组能够在任何选择的非必需基因中发生,而噬菌体溶原仅仅在被感染过程驱动的位点上整合。启动子会是野生型的lac启动子或者是象lacUV5那样被修饰的lac启动子。
宿主细胞进一步可包含编码靶蛋白的非整合基因,其中非整合基因是在T7或T7lac启动子的控制下。优选地T7启动子是T7lac。优选地靶蛋白是甲状旁腺激素(PTH)(1-84)或其活性片段,包括N-端片段1-34、1-31、1-28,或其类似物或衍生物。在另一个实施例中,靶蛋白是胰高血糖素样肽-1(GLP-1),或其类似物或衍生物。
本发明进一步提供用于生产包括靶蛋白的无噬菌体发酵液的表达系统,其中该表达系统包含在宿主细胞染色体上非必需基因中具有同源整合T7RNA聚合酶基因的宿主细胞和编码靶蛋白的非整合基因。
本发明进一步提供制备包含同源整合T7RNA聚合酶基因的宿主细胞的过程。T7RNA聚合酶基因被整合到宿主染色体的任何非必需基因中,优选地,宿主染色体的半乳糖操纵子。T7RNA聚合酶基因能被整合到选自pHMM209、pHMM220、pHMM223和pHMM228的质粒的半乳糖操纵子中。
本发明进一步提供制备靶蛋白的方法,其包括在包含同源整合T7RNA聚合酶基因的宿主细胞中表达靶蛋白,其中靶蛋白是无噬菌体的。优选地,靶蛋白是甲状旁腺激素(PTH)(1-84)或其活性片段,包括N-端片段1-34、1-31、1-28,或其类似物或衍生物。在另一个实施例中,靶蛋白是胰高血糖素样肽-1(GLP-1),或其类似物或衍生物。
图1显示来自整合质粒pHMM228的T7RNA聚合酶同源重组到宿主染色体的图解描述。
为了本发明的目的,如公开的和这里要求的,下面定义下列普通分子生物学术语和缩写。除非另有所指,在本说明书中使用的术语和缩写具有其通常的含义。氨基酸缩写如在37C.F.R.§1.822(b)(2)(1994)提出的。
这里使用的“碱基对”(“base pair”或“bp”)指DNA。当缩写A、C、G和T在DNA分子中存在时,分别相当于(脱氧)腺苷、(脱氧)胞苷、(脱氧)鸟苷和胸苷的5’-单磷酸形式。在双链DNA中,碱基对可能涉及A和T或C和G的配对关系。“千碱基”(“Kilo-base”和“kb”)指一千(1000)个碱基对。
“质粒”指包含核酸的染色体外遗传因子。质粒通常通过小写字母“p”后面跟着字母和/或数字来命名。在这里起始质粒是可以买到、不受限制的公开得到,或者根据公开的过程能够从可获得的质粒构建获得。另外,与那些已描述的质粒相等的质粒在现有技术中是已知的,并且对普通技术人员将是显而易见的。质粒包含能够或已经被加入一个或更多额外DNA片段的DNA分子。一些质粒是温度敏感的,而其它质粒则不是。这意味着在允许的温度,一些质粒进行自我复制,在非允许的温度,一些质粒不进行自我复制。
这里使用的“表达质粒”指任何已经结合了控制插入的DNA转录的启动子的非温度敏感质粒。T7表达质粒包括控制编码靶蛋白的靶基因表达的T7或T7lac启动子。T7表达质粒对于普通技术人员来说是非常熟知的。T7表达质粒是可以从Novagen股份有限公司(Madison,WI)买到,包括但不限于pET系列表述质粒。
这里使用的“整合质粒”指任何已经结合了控制插入的DNA转录的启动子的温度敏感质粒。另外,整合质粒将特定的DNA片段插入到细胞的染色体中。整合质粒是来自pMAK700和pMAK705。质粒pMAK700和pMAK705如Hamilton等在J.Bacteriol.171:4617-4622,(1989)中描述的方法制备,其在这里全文引入作为参考。本发明的整合质粒pHMM228、pHMM209、pHMM220和pHMM223将在下面详细描述。这些整合质粒包含控制编码T7RNA聚合酶的T7RNA聚合酶基因表达的lac启动子。
“转化”指将质粒引入到生物体中使质粒作为染色体外遗传因子或通过染色体的整合能够复制。在现有技术中转化细菌和真核宿主的方法是公知的,在J.Sambrook等,分子克隆:实验室指南(1989)中概括了这些方法中的许多方法。当在宿主细胞内发生这种质粒操作的任何迹象时,通常认为是成功的转化。例如,当用允许抵抗的质粒转染宿主细胞时,敏感宿主细胞将抵抗选择剂。
“允许温度”是转化到宿主细胞后质粒能够不依赖细胞的复制而进行自我复制的温度。在本发明中被定义的允许温度是典型地低于44℃的温度,通常在大约20℃和40℃之间,优选地在大约25℃和40℃之间,更优选地在大约25℃和35℃之间,最优选地大约30℃。
“非允许温度”是转化到宿主细胞后质粒不能够不依赖细胞的复制而进行自我复制的温度。在本发明中被定义的非允许温度是典型地高于40℃的温度,通常在大约40℃和大约50℃之间,优选地大约44℃。
“转录”指在DNA的核苷酸序列中所包含的信息通过RNA聚合酶被转移到互补RNA序列的过程。例如大肠杆菌RNA聚合酶将T7RNA聚合酶基因转移到接着被翻译成T7RNA聚合酶的互补RNA序列。同样地,例如,T7RNA聚合酶将靶基因转移到接着被转录成靶蛋白的互补RNA序列。
这里使用的“翻译”指信使RNA(mRNA)的遗传信息被用于指定和指导多肽链合成的过程。
“分离的氨基酸序列”指任何氨基酸序列,不管是构建的还是合成的,其在位置上完全不同于自然存在的序列。
“分离的DNA化合物”指任何DNA序列,不管是构建的还是合成的,在位置上完全不同于其在基因组DNA中的天然位置。
“启动子”指结合RNA聚合酶并且指导DNA向RNA转录的DNA序列。这里使用的启动子的实例是lac、lacUV5、T7、T7lac、lacIQ1。
“PCR”指众所周知的使用温度稳定DNA聚合酶的多聚酶链式反应。
“引物”指其功能是在PCR中作为酶促延长或合成延长起始底物的核苷酸片段。
“亲代细胞”指缺乏溶原体并且在体外能够自我复制的细胞。亲代细胞也应当具有可测定的并且应当是大约2kb长的宿主细胞染色体的DNA序列。这些序列进而应当在细胞的非必需区。优选地,亲代细胞是细菌。优选地,亲代细胞包含半乳糖操纵子或其片段的DNA序列。优选地,亲代细胞是大肠杆菌E.coli。优选的大肠杆菌亲代细胞可以从几个供应商,例如Novagen股份有限公司(Madison WI)中买到,包括但不限于BL21、AD494、BLR、HMS174、Origami和Tuner。
在本发明中“宿主细胞”指包含在lac启动子控制下同源整合T7RNA聚合酶基因的亲代细胞。启动子可是野生型lac启动子或象lacUV5那样经过修饰的lac启动子。宿主细胞进一步可包含在T7启动子控制下的非整合基因。启动子会是野生型T7启动子或象T7lac那样经过修饰的T7启动子。非整合基因编码选择的靶蛋白。一旦诱导宿主细胞,就产生T7RNA聚合酶。T7RNA聚合酶接着用于在无噬菌体的发酵液中生产靶蛋白。
“无噬菌体”指当用发酵液培养时在细菌的菌苔上没有可见的噬菌斑。在现有技术中用于检验噬菌体污染的分析是公知的。
“同源整合基因”指通过同源重组的方法被整合到宿主细胞染色体上的基因。同源重组的方法在宿主细胞染色体上的DNA序列和转化后存在于细胞内的整合质粒上携带的互补序列之间进行。优选地,同源重组的方法根据Hamilton等在New method for generatingdeletions and gene replacements in Escherichia coli.J.Bacteriol.171:4617-4622,1989中的教导进行,其被引入这里作为参考。
这里使用的“互补”指在双链核酸中通过氢键联系的碱基对(嘌呤和嘧啶)。下列碱基对是互补的:鸟嘌呤和胞嘧啶;腺嘌呤和胸腺嘧啶;以及腺嘌呤和尿嘧啶。
根据本发明通过同源重组整合的基因是T7RNA聚合酶基因。T7RNA聚合酶基因是从T7噬菌体中获得并且是在异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导型lacUV5启动子的控制下。该基因能够从质粒pAR1219、美国典型培养物保藏中心(ATCC)39563、美国专利No.4,952,496中获得。pAR1219中的BamHI片段含有包含在IPTG诱导型lacUV5启动子控制下的T7RNA聚合酶基因的T7表达盒,和在其天然启动子控制下的lacI基因。
T7RNA聚合酶基因编码在现有技术中公知的并且在美国专利No.4,952,496中详细描述的T7RNA聚合酶,其在这里被引入作为参考。当宿主细胞被诱导时,宿主细胞RNA聚合酶能够结合到lacUV5启动子上并且启动T7RNA聚合酶的合成。
“非整合基因”指没有被整合到宿主细胞染色体中,但在表达质粒中携带的基因。表达质粒是通过常规的和惯用的转化方法被引入到宿主细胞中,并且在允许的温度在宿主细胞内自主复制。因而,质粒能够在缺乏宿主细胞复制时在宿主细胞中自我复制。在表达质粒中携带的非整合基因编码感兴趣的靶蛋白。非整合基因是在异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导型T7或T7lac启动子的控制下。从整合基因中新合成的T7RNA聚合酶能够结合到T7或T7lac启动子上,并且启动靶蛋白的合成。
“靶蛋白”指能够在宿主细胞中合成的蛋白。优选地靶蛋白与宿主细胞蛋白是异源的。蛋白的实例包括但不限于降钙素、促红细胞生成素(EPO)、IX因子、VIII因子、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、趋化因子、生长激素释放激素(GRF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、生长激素、胰岛素、瘦激素、干扰素、白细胞介素、促黄体素释放激素(LHRH)、促卵泡素(FSH)、生长抑素、加压素、糊精、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、甲状旁腺激素(PTH)、exendin-3、exendin-4和α-1抗胰蛋白酶。本发明的靶蛋白任选地可以是前体蛋白或原蛋白(pro-protein)。前体蛋白或原蛋白的实例包括但不限于胰岛素原和GLP-1(1-37)。
整合构建物:
通过同源重组构建允许将重组的靶基因整合到期望宿主细胞染色体中的有用质粒。这种整合能够通过使用经过修饰的pMAK构建物来完成。优选地起始pMAK构建物是pMAK700和pMAK705。更优选地起始pMAK构建物是pMAK705。pMAK构建物包含温度敏感的复制起点。这允许构建物在象30℃允许的温度进行复制,但是构建物在象44℃非允许的温度将不进行复制。pMAK构建物也包含氯霉素抗性(Cmr)基因。因而,含有包含Cmr基因的质粒的宿主细胞将抵抗氯霉素,并且将在存在氯霉素的允许温度时进行复制。
通过将与在宿主细胞染色体上发现的核酸序列同源的核酸序列插入到pAMK构建物中修饰pMAK构建物。被用在宿主细胞染色体上发现的同源核酸序列插入的pMAK构建物在本发明中被称为pHMM构建物。pHMM构建物的同源序列包含半乳糖操纵子(galETK)的不同片段。在现有技术中半乳糖操纵子是公知的。pHMM构建物和宿主细胞的同源序列足够长以致于能够相互杂交并且进行重组。当在象宿主细胞的环境中存在来自整合构建物的互补链时,杂交通常依赖变性染色体DNA再退火的能力。优选地同源序列长于约1kb。更优选地,同源序列在约1kb和约10kb之间。甚至更优选地,同源序列在约1kb和约4kb之间。最优选地,同源序列是约2kb。因为重组事件能够破坏序列使得序列会成为无用的,因此宿主细胞的同源序列会是任何对宿主细胞非必需的序列。例如,如果同源序列是在基因中负责细胞壁的合成,那么在宿主细胞这个序列中与整合质粒的重组将破坏包含细胞壁蛋白的合成并且导致不能生活的宿主细胞。
pHMM构建物进一步会通过将T7RNA聚合酶基因和lacUV5启动子插入到pHMM构建物中而被修饰。在lacUV5启动子控制下的T7RNA聚合酶基因能够从质粒pAR1219、美国典型培养物保藏中心(ATCC)39563、美国专利No.4,952,496中获得。
优选地,通过将T7RNA聚合酶基因和lacUV5启动子克隆到pHMM构建物中删除pMAK质粒的原始lac启动子。lac启动子的复制会导致形成第二结构的潜力,这将出现序列决定和干扰同源重组可能性的问题。
任选地,pHMM构建物能够通过将lacI基因插入到pHMM构建物而被进一步修饰。除了T7RNA聚合酶基因和lacUV5启动子,pAR1219质粒进一步包含含有在其天然启动子控制下的lacI基因的DNA片段。在表达系统中lacI基因的拷贝能提供帮助控制T7RNA聚合酶和靶蛋白表达的乳糖阻遏物的额外表达。
任选地,来自T7表达盒(expression cassette)的lacI基因被lacIQ1启动子驱动。在现有技术中lacIQ1启动子是公知的。lacIQ1启动子被修饰用以过度表达lacI基因。结果是lacI阻遏物的产量是被其天然启动子驱动的lacI基因的约100倍。
另外,pHMM构建物进一步包含第二抗性基因。优选地第二抗性基因是卡那霉素(Kmr)。因此,含有包含Kmr基因质粒的宿主细胞将抵抗卡那霉素并且在卡那霉素存在时将进行复制。优选地,第二抗性基因的方向与T7RNA聚合酶的方向相反。卡那霉素抗性基因提供另外一种独特地鉴定宿主细胞的方法。卡那霉素抗性基因能够从质粒pACYC177中获得。pACYC177可以从“Stratagene Cloning Systems”目录(1993)(Stratagene,La Jolla,Calif.)中获得。来自pACYC177的卡那霉素抗性基因包括Tn903转座反向重复序列(IR)。由于通过这些反向重复序列的存在导致转座而产生的潜在的不稳定性,因此优选包含卡那霉素抗性基因但不是包含反向重复序列的盒。
整合
整合构建物能够根据常规的方法被转化到期望的宿主菌株中,并且单个菌落在允许的温度下在存在选择剂,例如Cm或Km的液体生长基中过夜生长。将产生的过夜培养物在存在选择剂的液体生长基中稀释,并且在非允许的温度,例如44℃培养,直到对数期。接着将培养物铺到含有选择剂的琼脂平板上,在非允许的温度过夜培养以筛选形成的共合体。形成共合体在同源重组中是起始步骤,并且当整合构建物整合到宿主染色体中时发生。因为整合质粒不能在非允许的温度和含有选择剂的培养物中自我复制,因此在这些条件下存活的宿主细胞将仅仅是那些将整合构建物整合到宿主细胞染色体上的宿主细胞。将产生的培养物铺到含有选择剂的琼脂平板上,在非允许的温度过夜培养以筛选共合体。
挑出共合体菌落,转移到液体生长基中,在共合体分离的允许温度过夜培养。分离为发生第二次重组事件提供了一种方法,其中整合质粒被从染色体上删除并在宿主细胞中被改造。被删除和在宿主细胞中被改造的整合质粒是原始整合质粒的全部或是仍然被整合到宿主细胞染色体中减去T7RNA聚合酶的原始整合质粒。第二次重组事件的目的是删除整合质粒中包含来自宿主细胞染色体复制起始点的部分,但是留下整合到宿主细胞染色体中的T7RNA聚合酶。这个过程的图示显示在图1中。在整合质粒进一步包括其它基因,例如lacI或Km的情况中,第二次重组事件的目的是删除整合质粒中含有来自宿主细胞染色体复制起始点的部分,但是留下整合到宿主细胞染色体中的T7RNA聚合酶和其它基因,例如lacI或Km。因为整合的复制起始点对宿主细胞是有害的,因此希望去除整合质粒的复制起始点。这种通过用选择剂传代培养和在允许的温度维持的删除过程任选地可能持续几天。优选地传代培养和维持少于三天,更优选地传代培养和维持持续两天。
接着将培养物稀释到含有无选择剂液体生长培养基的预热瓶中,在非允许的温度通过将不太期望的质粒序列从宿主细胞的染色体上删除以启动整合体的自愈。将培养物被铺在含有选择剂的琼脂平板上并且在允许的温度生长。用技术人员熟知的方法,例如PCR和Southern印迹法筛选存在整合事件的菌落。将含有整合体的菌落用于接种液体基质培养物中,随后在非允许的温度连续生长几天以促进自愈。接着将培养物铺到琼脂平板上,在允许的温度过夜培养。随后将单个菌落铺在任选地含有两种选择剂,例如Cm和Km的琼脂平板上。进一步将单个菌落铺到仅仅含有第二种选择剂,例如Km的琼脂平板上。具有整合序列的期望克隆对Cm敏感和对Km抵抗。
在另一个实施例中,整合质粒优选地被整合到宿主细胞的半乳糖操纵子中。更优选地,整合质粒被整合到宿主细胞的galE基因座中。进行了多次整合到galK基因座的尝试,然而没有成功地获得理想的整合。
靶蛋白
在本发明的表达系统中使用的编码重组靶蛋白的非整合基因是通过分子生物学领域中普通技术人员可用的方法获得的。基本步骤是:
a)分离天然的DNA序列或者构建合成的或半合成的DNA序列,其中DNA序列包含编码感兴趣靶蛋白的靶基因,
b)以适合表达靶蛋白的方式将DNA序列克隆到可获得的T7表达质粒中,
c)用包含感兴趣靶基因的T7表达质粒转化前面描述过的本发明的表达宿主,
d)在非诱导状态培养经过转化的表达宿主一段时间,接着在诱导状态培养一段时间,和
e)回收和纯化靶蛋白。
优选地,靶蛋白是甲状旁腺激素(PTH)。更优选地,甲状旁腺激素是人甲状旁腺激素。在现有技术中,甲状旁腺激素是已知具有84个氨基酸的蛋白并且在美国专利No.5,496,801中被描述。在现有技术中甲状旁腺激素的N-端片段也是公知的,包括但不限于1-34,1-31和1-28。而且,PTH和PTH片段的类似物和衍生物也被考虑。PTH片段、类似物和衍生物的实例被描述在WO99/29337、US20020132973、美国专利Nos.5,556,940;6,472,505;和6,417,333。
在另一个实施例中,靶蛋白是胰高血糖素样肽-1(GLP-1),或其类似物或衍生物。在现有技术中,GLP-1类似物和衍生物的实例是公知的,并且被描述在WO01/98331,和美国专利Nos.6,268,343;5,977,071;5,545,618;5,705,483;6,133,235。GLP-1类似物也包括如在WO99/07404,WO99/25727,WO99/25728,WO99/43708,WO00/66629和US2001/0047084A1中描述的Exendin-3和Exendin-4激动剂。
修饰:
分离的靶蛋白用作治疗蛋白。任选地靶蛋白能够在宿主细胞外被进一步修饰以赋予靶蛋白用作治疗蛋白的额外的物理特性。修饰包括但不限于酶促或化学裂解、酰化作用、结晶、盐加成,等等。
制剂:
液体生长培养基是TB培养基(T Broth)
TB培养基=(每升)10g胰蛋白胨,5g酵母提取物,10g氯化钠,pH7.5。
T琼脂平板=向TB培养基中加15g/L琼脂。
SM缓冲液=(每100ml 10X溶液)20ml 1M Tris-盐酸(pH7.4),20ml 5M氯化钠,10ml 1M硫酸镁
氯霉素(Cm)(25μg/ml)溶于乙醇
卡那霉素(Kam)(15-50μg/ml)溶于水
萘啶酮酸(20μg/ml)溶于氢氧化钠
链霉素(50μg/ml)溶于水
整合质粒pHMM209:
整合质粒pHMM209是pMAK705的衍生物。在pHMM209构建中,起始步骤是将寡核苷酸接头(adapter),BamHI到ClaI,克隆到pMAK705主链(backbone)上。这个接头含有StruI位点,其在产生的构建物中是唯一的。将galK侧翼作为SalI到XbaI的插入片段克隆到pMAK705主链上产生pHMM主链。pHMM主链在galK侧翼中包含唯一的BamHI和ClaI位点。接着将来自pAR1219,包含在其天然启动子序列表达下的lacI基因和在lacUV5启动子调节下的T7RNA聚合酶基因的T7表达盒作为BamHI片段克隆到pHMM主链上。T7表达盒的方向与galETK操纵子的方向相反,以防止从galE上游序列的转录连读。下一步,将卡那霉素抗性基因作为来自pACYC177的StuI片段克隆到先前被克隆到pMAK705主链的接头的StuI位点。卡那霉素基因的方向与T7表达盒的方向相反。产生的整合质粒是pHMM209。
整合质粒pHMM220:
整合质粒pHMM220是pMAK705的衍生物。在pHMM220的构建中,起始步骤是将寡核苷酸接头,BamHI到ClaI,克隆到pMAK705主链上。这个接头含有StruI位点,其在产生的构建物中是唯一的。将galK侧翼作为SalI到XbaI的插入片段克隆到pMAK705主链上产生pHMM主链。pHMM主链在galK侧翼中包含唯一的BamHI和ClaI位点。接着将包含在其天然启动子序列表达下的lacI基因和在lacUV5启动子调节下的T7RNA聚合酶基因的T7表达盒作为来自pAR1219的BamHI片段克隆到pHMM主链上。T7表达盒的方向与galETK操纵子的方向相反,以防止从galE上游序列的转录连读。下一步,通过PCR获得作为StuI片段的卡那霉素抗性基因。在pACYC177模板卡那霉素基因中存在的反向重复序列的内部设计用于扩增抗性基因的PCR引物。PCR引物在其尾部含有StuI限制酶切位点,并且在扩增反应中使用。将产生的大约1kb的PCR产物直接克隆到PCR克隆质粒中,通过直接铺到含有卡那霉素的T琼脂平板上筛选推定的克隆。将产生的卡那霉素抗性基因作为StuI片段亚克隆到先前被克隆到pMAK705主链上的接头的StruI位点。卡那霉素基因的方向与T7表达盒的方向相反。产生的整合质粒是pHMM220。
整合质粒pHMM223:
象pHMM220一样构建整合质粒pHMM223。下一步,因为lacI基因具有整合到宿主染色体lacI基因座的潜力,因此除去pHMM22中T7表达盒的lacI基因。通过用BglI酶消化质粒,将lacI基因从pHMM220中删除。将合成的DNA接头克隆到BglI位点重新组成在BglI酶消化过程中被删除的lacUV5启动子。将产生的克隆测序,发现含有带有两个核苷酸改变例外的期望lacUV5序列。这些改变是在T7表达盒5’非翻译区,对T7RNA聚合酶的表达不是关键的。下一步,消除pHMM220中存在的lacI启动子。这是通过插入完全取代lacI启动子序列的PstI到AseI的接头来完成。
pHMM220的BglI删除也除去了下游galK侧翼。为了重新组成这个区域以及结合无反向重复序列的卡那霉素抗性基因,将BamHI到XbaI片段亚克隆到整合质粒的BglII到XbaI位点。这样产生了称为pHMM223的整合质粒,其含有无lacI基因拷贝和lacI的T7表达盒启动子、无反向重复序列的卡那霉素抗性基因、以及完整的galK侧翼。pHMM223被用于试图整合到染色体的galK基因座中。
整合质粒pHMM228:
整合质粒pHMM228是pMAK705的衍生物。在pHMM228的构建中,起始步骤是将寡核苷酸接头,PstI到EagI,克隆到pMAK705主链中。这个接头含有唯一的SalI和XbaI位点。将大约2kb的galE基因作为XbaI插入片段克隆到pMAK705主链中产生pHMM主链。pHMM主链包含基因中唯一的BamHI和ClaI位点。接着将包含在其天然启动子序列表达下的lacI基因和在lacUV5启动子调节下的T7RNA聚合酶基因的T7表达盒作为来自pAR1219的BamHI片段克隆到pHMM主链上。T7表达盒的方向与galETK操纵子的方向相反,以防止从galE上游序列开始的转录连读。下一步,通过PCR获得作为StuI片段的卡那霉素抗性基因。在pACYC177模板卡那霉素基因中存在的反向重复序列的内部设计用于扩增抗性基因的PCR引物。PCR引物在其尾部含有StuI限制酶切位点,并且在扩增反应中使用。将产生的大约1kb的PCR产物直接克隆到PCR克隆质粒中,并且通过直接铺到含有卡那霉素的T琼脂平板上筛选推定的克隆。将产生的卡那霉素抗性基因作为StuI片段亚克隆到先前被克隆到pMAK705主链上的接头的StruI位点。卡那霉素基因的方向与T7表达盒的方向相反。最后,按照获得pHMM223描述的那样基本上除去T7表达盒的lacI基因。通过使用BglI酶消化质粒删除lacI基因。将合成的DNA接头克隆到BglI位点重新组成在BglI酶消化过程中被删除的lacUV5启动子。下一步,通过插入完全替代lacI启动子序列的PstI到AseI的接头消除lacI启动子。BglI的删除也除去了下游galE侧翼。为了重新组成这个区域和结合无反向重复序列的卡那霉素抗性基因,将BamHI到XbaI片段亚克隆到整合质粒的BglII到XbaI位点。这样产生了称为pHMM228的整合质粒,其含有无lacI基因拷贝和lacI启动子的T7表达盒、无反向重复序列的卡那霉素抗性基因、以及完整的galK侧翼。pHMM228被用于试图整合到染色体的galE基因座中。
pHMM209的整合/筛选
将整合质粒pHMM209转化到包含半乳糖操纵子的大肠杆菌亲代细胞系中,平铺到含有氯霉素的T琼脂平板上,并且在30℃过夜培养。挑出菌落,转移到含有氯霉素的TB培养基中,在30℃过夜生长。在存在氯霉素的TB培养基中稀释产生的过夜培养物,在44℃培养直到培养物达到对数期。接着将培养物铺到包含氯霉素的T琼脂平板上,在44℃过夜培养以诱导形成共合体。挑出共合体菌落,转移到250ml含有氯霉素的TB培养基中,在30℃过夜培养用于删除和分离。通过用含有氯霉素的TB培养基在1∶500稀释传代培养和在30℃孵育培养瓶,将这种培养物再维持两天。在第四天,将培养物传代培养到44℃预热的TB培养基瓶中。使这种培养物在44℃连续三天生长和传代培养以促进pHMM209质粒的自愈。接着将暂时经过整合、删除和自愈的培养物铺到含有卡那霉素的T琼脂平板上,在30℃过夜培养。随后将单个菌落铺到含有Cm和Km的T琼脂平板上,接着铺到含有Km的T琼脂平板上,接着铺到T琼脂平板上。阳性整合体应当是Cms和Kmr。
检验了近1000个单个菌落,仅仅形成了一个整合体。这个整合体被称为RQ209。进一步分析表明RQ209株具有通过添加IPTG而被诱导的功能T7RNA聚合酶。然而,当在RQ209株菌上进行PCR作图时,发现T7RNA聚合酶没有特异性地整合到染色体的galK或lacI区。
pHMM228的整合/筛选
基本上按照上面在pHMM209的整合/筛选中描述的方法进行整合实验。下面的表格显示了形成的共合体的数量。
表1:pHMM228的共合体
平板计数 | |||||||
10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | |
30℃铺平板 | ND | ND | ND | TNTC | 73 | 8 | 1 |
44℃铺平板 | TNTC | TNTC | TNTC | 153 | 11 | 0 | ND |
TNTC:数不胜数
ND:没有测定
随后使在44℃平板上生长的菌落于44℃在TB培养基中生长。除了一种培养物是从代表约二分之一整个平板的菌落中收集的外,长出了九个单个分离菌。将这10个培养物在氯霉素选择下,44℃过夜振(315rpm)荡培养。第二天通过离心从每个培养物中收获100μl样品用于随后的PCR分析。另外,预热到44℃的平板被用于为来自这些培养物的单个分离菌划线,在44℃过夜培养。PCR和限制性内切酶图析结果显示几乎所有10种液体培养物都含有与预期的整合事件一致的扩增产物。
通过在44℃重新铺平板筛选单个克隆。使#2单个分离菌在30℃含有氯霉素的TB培养基中过夜生长以促进pHMM228的删除。过夜生长后,收集100μl细胞样品,用作PCR反应的模板。选择来自galE侧翼外侧的引物使得扩增仅仅是pHMM228被删除的形式。因此如果删除事件重新产生了pHMM228,那么将能预料到大约7kb的PCR产物。然而,如果由于第二次交换事件在染色体上留下T7RNA聚合酶所导致的删除,那么将能预料到大约1.5kb的PCR产物。如所预料的,观察到了删除产物的混合物。随后将删除的培养物划线培养以获得用于筛选是否存在1.5kb PCR产物的单个分离菌。
接着使三个分离菌在无选择剂的TB培养基中44℃过夜生长以促进经过删除的pHMM228的自愈。在44℃过夜生长后,将单个菌落从划线的T琼脂平板中分离,将来自三个原始分离菌各自的72个单个菌落铺到加上Cm的T平板、加上Km的T平板和T平板上以检测那些已经成功治愈删除pHMM228的菌落。下表详细列举了这些实验的结果。
表2:自愈效率
分离菌 | 被分析个体的总数 | Cmr | Kmr | 自愈率(%) |
#1 | 72 | 24 | 72 | 66.7 |
#6 | 72 | 37 | 72 | 48.6 |
#15 | 72 | 14 | 56 | 56.9 |
随后从#1分离菌中选出对卡那霉素敏感被称为RQ228的单个个体,划线纯化两次并且核实表型。下表显示了表型分析的结果。
表3:表型结果
表型平板 | 铺板的结果 |
M9 | 没生长 |
M9+半乳糖 | 没生长 |
M9+乳糖 | 生长 |
M9+葡萄糖 | 生长 |
L+Cm | 没生长 |
L+链霉素 | 生长 |
L+Km | 生长 |
L+萘啶酮酸 | 没生长 |
L | 生长 |
接着选出已经确定表型的RQ228菌株的菌落,过夜生长得到10ml培养物用于当地保藏和长期保藏以及用于制备感受态细胞。在整合完整性PCR作图中使用这种相同的菌落。
T7活性和调节分析:
除了核实表型特征和整合事件的完整外,也检查RQ228菌株表达功能性T7RNA聚合酶的能力以及这和表达被调节的能力。按照下面描述的方法检查RQ228拯救缺陷型T7试验噬菌体的能力。
T7RNA聚合酶分析:
为了检测RQ209菌株或RQ228菌株是否拥有功能T7RNA聚合酶使用T7RNA聚合酶活性分析。使RQ209菌株或RQ228菌株在补加0.2%麦芽糖和10mM硫酸镁的TB培养基中在大约37℃过夜生长。将过夜生长的培养物在再次补加0.2%麦芽糖和10mM硫酸镁的TB培养基中稀释回OD600=0.05,振荡生长到OD600=0.5,并且将每个细菌培养物的100μl培养物加到100μl T7试验噬菌体10-6SM缓冲液中。将样品用手指轻轻涡旋混匀,在37℃培养20分钟以允许噬菌体吸附。接着向样品中加入3ml 0.4%T顶层琼脂糖(补加0.2%麦芽糖和10mM硫酸镁),涡旋混允并倒在预热的T琼脂平板上。每个样品制成两份以便一份被铺到T琼脂平板上,另一份被铺到含有400μM IPTG的T琼脂平板上。T7试验噬菌体能够附着到细胞上,但是能够复制和溶解仅仅那些被其感染具有可获得功能T7RNA聚合酶的细胞。由于T7RNA聚合酶表达是在lacUV5启动子的控制下,因此表达应当仅仅在存在诱导剂IPTG时发生。在含有IPTG的平板上有噬菌斑以及在无IPTG平板上没有噬菌斑构成了T7RNA聚合酶可控表达的阳性指征。
整合完整性的最终PCR确定:
分析RQ228菌株以确定整合事件的完整性/特异性。进行PCR扩增以检查galE-靶向整合事件的功能和确定全部整合盒的大小。
使用RQ228的甲状旁腺激素PTH的表达:
使用常规方法将包含编码甲状旁腺激素PTH基因的表达质粒转化到RQ228或DE3宿主细胞中。使两个菌株在37℃含有四环素的TB培养基中生长,通过添加IPTG到10μM进行诱导。将培养物继续培养6小时。培养物的样品显示两个宿主细胞都表达甲状旁腺激素。然而,仅仅在RQ228宿主细胞中生产的PTH是无噬菌体的,而在DE3宿主细胞中生产的PTH在发酵液中有可以检测到水平的噬菌体污染。
使大肠杆菌在补加0.2%麦芽糖和10mM硫酸镁的TB培养基中37℃过夜生长以达到饱和。将过夜生长的培养物在再次补加0.2%麦芽糖和10mM硫酸镁的TB培养基中稀释回OD600=0.05,振荡生长到OD600=0.5,将100μl大肠杆菌培养物加到100μl发酵液中。将样品用手指轻轻涡旋混匀,在37℃培养20分钟以允许噬菌体吸附。向样品中加入3ml 0.4%T顶层琼脂糖(补加0.2%麦芽糖和10mM硫酸镁),涡旋混允并倒在预热的T琼脂平板上。将平板在37℃培养12小时。无噬菌体的发酵液将不产生可见的噬菌斑。
Claims (25)
1.包含在lac启动子控制下的同源整合的T7RNA聚合酶基因的宿主细胞。
2.权利要求1的宿主细胞,其中不使用噬菌体溶原体将T7RNA聚合酶整合到宿主细胞染色体中。
3.权利要求2的宿主细胞,其中lac启动子是lacUV5启动子。
4.权利要求2或3的宿主细胞,其中T7RNA聚合酶基因被整合到宿主染色体的半乳糖操纵子中。
5.权利要求4的宿主细胞,其中T7RNA聚合酶基因被整合到来自选自pHMM209、pHMM22、pHMM223和pHMM228的整合质粒的半乳糖操纵子中。
6.权利要求2-5中任一权利要求的宿主细胞,其中宿主细胞进一步包含编码在T7lac启动子控制下的靶蛋白的非整合基因。
7.权利要求6的宿主细胞,其中靶蛋白是甲状旁腺激素(PTH)。
8.权利要求7的宿主细胞,其中PTH是1-84的N-端片段。
9.权利要求8的宿主细胞,其中N-端片段是1-34。
10.权利要求6的宿主细胞,其中靶蛋白是胰高血糖素样肽-1(GLP-1),或GLP-1类似物或衍生物。
11.用于在无噬菌体的发酵液中生产靶蛋白的表达系统,其中表达系统包含在宿主细胞的非必需基因中具有同源整合T7RNA聚合酶基因和编码靶蛋白的非整合基因的宿主细胞,其中非整合基因是在T7lac启动子的控制下。
12.权利要求11的表达系统,其中T7RNA聚合酶基因被整合到宿主染色体的半乳糖操纵子中。
13.权利要求12的表达系统,其中T7RNA聚合酶基因被整合到来自选自pHMM209、pHMM22、pHMM223和pHMM228的整合质粒的半乳糖操纵子中。
14.权利要求13的表达系统,其中靶蛋白是甲状旁腺激素(PTH)。
15.权利要求14的表达系统,其中PTH是1-84的N-端片段。
16.权利要求15的表达系统,其中N-端片段是1-34。
17.权利要求13的表达系统,其中靶蛋白是胰高血糖素样肽-1(GLP-1),或GLP-1类似物或衍生物。
18.制备宿主细胞的方法,包括将在lacUV5启动子控制下的T7RNA聚合酶基因同源整合到宿主的非必需基因中,以使得一旦诱导T7RNA聚合酶基因,发酵液将是无噬菌体的。
19.权利要求18的方法,其中T7RNA聚合酶基因被整合到半乳糖操纵子中。
20.权利要求19的方法,其中T7RNA聚合酶基因被整合到来自选自pHMM209、pHMM22、pHMM223和pHMM228的整合质粒的半乳糖操纵子中。
21.制备靶蛋白的方法,其包括
a.制备宿主细胞,包括将在lacUV5启动子控制下的T7RNA聚合酶基因同源整合到宿主的非必需基因中,
b.用编码靶蛋白的非整合基因转化宿主细胞,其中非整合基因是在T7lac启动子的控制下,
c.诱导宿主细胞产生T7RNA聚合酶,
d.在发酵液中培养宿主细胞充分长的时间以允许T7RNA聚合酶产生靶蛋白,其中发酵液将是无噬菌体的。
22.权利要求21的方法,其中靶蛋白是甲状旁腺激素(PTH)。
23.权利要求22的方法,其中PTH是1-84的N-端片段。
24.权利要求23的方法,其中N-端片段是1-34。
25.权利要求21的方法,其中靶蛋白是胰高血糖素样肽-1(GLP-1),或GLP-1类似物或衍生物。
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