CN102304490A - 高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株已于2011年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5047。本发明还公开了上述重组菌的构建方法和应用。本发明首次将谷氨酸棒杆菌中的乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF在大肠杆菌中高效共表达。IPTG诱导表达重组大肠杆菌，将破碎后收集的粗酶液经Ni柱纯化后，进行酶反应，OPRTase和ODCase的酶活分别为9U/mg和12U/mg蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌及其构建方法。
背景技术
尿嘧啶核苷酸(Uridine-5’-monophosphate，UMP)作为基础嘧啶核苷酸，具有重要的生理作用，可与其他单体核苷酸配合使用，广泛应用于食品和饲料添加剂、植物生长调节剂等方面。同时，尿苷酸参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸的生物合成，不仅本身可用于治疗肝炎，改善冠心病、风湿性关节炎、白细胞减少症患者的自觉症状等，还是脂核苷酸、糖核苷酸以及低聚核苷酸类似物的合成原料，这些核苷酸衍生物对肿瘤和被感染的病毒细胞可以有效地释放核苷，提高抗病毒效果。其市场需求很大，蕴含有良好的商业潜力。
近几年国内外涌现出很多关于微生物发酵法制备UMP的专利报道，主要的工作都集中在菌种改造方面，主要的方法还是通过传统的诱变方法，筛选出嘧啶类似物(2-硫尿嘧啶(2-TU)、6-氮尿嘧啶(6-AU)、尿嘧啶、氟尿嘧啶)抗性菌株，氨甲酰磷酸类似物抗性(璜氨胍)菌株，或者嘌呤类似物抗性菌株。但由于诱变工作量大、盲目性高，而且所筛选到的突变株的生理状态处于病态或完全失调的情况下，所以产量的进一步提高有一定的局限性。新的策略就是用基因工程技术来改造菌株。利用DNA重组技术，建立一整套克隆载体系统，通过基因分离、鉴定、克隆、转移和表达进行定向培育来制备有价值的菌株。并期望通过克隆增加限速酶基因拷贝数或通过对所克隆基因的定点突变技术来消除反馈调节和代谢旁路调节等多种DNA操作途径，增强基因的表达能力，从而提高产量。
UMP是嘧啶核苷酸合成途径中处于结点位置的重要核苷酸，由它可以进一步合成其他嘧啶核苷酸。工业上所用的生物催化法合成UMP通常是以乳清酸为底物，通过从头合成途径，利用菌体自身产生的5-磷酸核糖焦磷酸(5-PRPP)，经过两步酶反应合成UMP。参与反应的两个酶分别是乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRTase EC 2.4.2.10)和乳清苷酸脱羧酶(ODCase EC 4.1.1.23)。OPRTase是嘧啶核苷酸从头合成途径的第五个酶，也是催化法合成UMP的第一步反应酶。该酶催化乳清酸转移到5-PRPP上，释放一分子焦磷酸(PPi)，形成乳清苷酸(OMP)，再被ODCase催化脱羧形成UMP。因此，利用基因工程手段，克隆高活性的OPRTase基因和ODCase基因，构建OPRTase和ODCase共表达的双酶耦联系统，以乳清酸为原料生产UMP，是UMP高效合成的一条可行途径。此途径具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点，而且清洁无污染，最终实现UMP的高效清洁生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述重组菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株已于2011年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.5047。
上述高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌，它包含乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF的大肠杆菌，所述的乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032，所述的乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
其中，所述的乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因长度为555bp，编码了184个氨基酸和一个终止密码子，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，计算分子量和理论等电点分别为19.43kDa和5.40。
其中，所述的乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，基因长度为837bp，编码了278个氨基酸和一个终止密码子，编码的氨基酸序列如SEQID NO：4所示，计算分子量和理论等电点分别为28.92kDa和4.76。
上述高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌的构建方法，采用PCR方法从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中提取乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF，构建重组表达质粒pET28a-pyrE-pyrF，将重组质粒热击转化大肠杆菌Rosetta，然后进行诱导表达，筛选到一株产酶量最高的菌株CGMCC No.5047。
上述高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌在高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶中的应用。培养上述重组菌，利用IPTG诱导重组质粒中OPRTase基因pyrE和ODCase基因pyrF的表达，收集菌体，超声破碎细胞，得到的上清作为粗酶液，经Ni柱纯化即得乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶。
有益效果：本发明首次将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中的乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF在大肠杆菌Rosetta中的高效共表达。重组工程菌株能够高效表达OPRTase基因pyrE，分泌表达OPRTase；也能够高效表达ODCase基因pyrF，分泌表达ODCase。IPTG诱导表达重组大肠杆菌，将破碎后收集的粗酶液经Ni柱纯化后，进行酶反应，OPRTase和ODCase的酶活分别为9U/mg和12U/mg蛋白。
附图说明
图1为本发明多顺反子质粒的构建过程。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：含pET28a-pyrE和pET28a-pyrF重组大肠杆菌的构建。
1、C.glutamicum ATCC13032OPRTase基因pyrE和ODCase基因pyrF的克隆。
(1)C.glutamicum ATCC13032基因组的提取：
C.glutamicum ATCC13032由本实验室保藏。将C.glutamicum ATCC13032接种于5mLLB培养基中，37℃培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组。
(2)扩增基因pyrE序列和pyrF序列：
C.glutamicum ATCC13032基因pyrE序列为已知序列，根据pyrE的基因序列设计引物：
P1：5’-CGGGATCCATGTCATCTAATTCCATTAAC-3’
P2：5’-GGAATTCTTAGTTGAGTCCAAGATCAGAAAGTC-3’
C.glutamicum ATCC13032基因pyrF序列为已知序列，根据pyrF的基因序列设计引物：
P1：5’-CGGGATCCATGACATTCGGCGAGAAGC-3’
P2：5’-GGAATTCCTATGACCTGGGGAAACCAGGAAAG-3’
pyrE序列扩增的PCR方法：
94℃变性5min，按如下参数循环30次：94℃变性1min，52℃退火30s，72℃延伸30s。最后72℃延伸10min。
pyrF序列扩增的PCR方法：
94℃变性5min，按如下参数循环30次：94℃变性1min，57.6℃退火30s，72℃延伸30s。最后72℃延伸10min。
凝胶电泳分离纯化PCR产物并进行胶回收。将胶回收产物连接到PMD18T-vector，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于氨苄抗性平板。
挑取LB平板上的单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的50mL离心管中，37℃，220rpm下培养8-12小时。利用上海申能博彩有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，并将菌液送南京金斯瑞有限公司测序，测序结果与已报道的基因序列完全匹配，如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。
2、基因pyrE、pyrF表达载体的构建。
根据获得的pyrE、pyrF基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示)设计表达引物，在引物的5’端和3’端分别引入NdeI和BamHI酶切位点，PCR扩增，连接PMD18T-simple，分别构建PMD18T-pyrE和PMD18T-pyrF重组质粒。采用NdeI和BamHI双酶切PMD18T-pyrE、PMD18T-pyrF重组质粒和pET28a质粒，连接酶切产物，获得重组质粒pET28a-pyrE和pET28a-pyrF，转化大肠杆菌DH5a。挑取单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的50mL离心管中，37℃，220rpm下培养8-12小时。提取质粒，经PCR和双酶切筛选获得含有pyrE、pyrF基因的重组表达质粒，并测序确认重组质粒的阅读框均正确。
3、表达C.glutamicum ATCC13032基因pyrE和pyrF的大肠杆菌工程菌株的构建及筛选
将获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta，挑取单菌落，接种5mL含有氯霉素和卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm下培养12小时。提取质粒，以质粒为模板，PCR验证都正确。
实施例2：IPTG诱导表达含pET28a-pyrE和pET28a-pyrF的重组大肠杆菌
挑取重组大肠杆菌Rosetta(pET28a-pyrE、pET28a-pyrF)及含有pET28a空质粒的对照菌大肠杆菌Rosetta(DE3)至含50mg/L卡拉霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。然后按2％接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃，220rpm培养至OD600约为0.8时，加入IPTG至终浓度0.8mM，30℃，220rpm，诱导表达6h后，8000rpm，4℃离心5min，菌泥用50mM Tris-HCl(pH7.0)重悬，超声破碎细胞(功率200W，超声3s，间歇4s，共5min)，8000rpm，4℃离心5min，收集上清液，通过Ni柱纯化得到纯酶液。
OPRTase酶活测定(10ml)：500umol/L乳清酸、200umol/LPRPP、3mol/LMgcl2、50mmol/LTris-Hcl pH8.0，1mlOPRTase纯酶液与底物混合37℃，220rpm反应0/5/10/20/30min后，迅速取样1ml，加入3.5％的高氯酸终止反应，用HPLC检测OA的减少量。
ODcase酶活测定(10ml)：500umol/L乳清酸、200umol/LPRPP、3mol/LMgcl2、50mmol/LTris-Hcl pH8.0，1mlOPRTase纯酶液和1mlODCase纯酶液与底物混合37℃，220rpm反应0/5/10/20/30min后，迅速取样1ml，加入3.5％的高氯酸终止反应，用HPLC检测OA的减少量与UMP的生成量。
对照体系(10ml)：500umol/L乳清酸、200umol/LPRPP、3mol/LMgcl2、50mmol/LTris-Hcl pH8.0，1ml空白对照菌超声破碎后经Ni柱纯化得到的酶液。
经检测UMP的最大生成速率达到0.2mg/ml/min，反应20min后OA的转化率达到90％以上。OPRTase和ODCase的酶活分别为9U/mg和12U/mg蛋白。对照体系中OA无明显变化，且无UMP生成。
酶活检测方法(HPLC)：江苏淮阴汉邦科技有限公司Lichrospher C18[4.6x 250mm，5um]色谱柱；流动相：pH6.6的磷酸三乙胺溶液；柱温：室温；检测波长：260nm；流速：1.0mL·min-1；进样量：20μL。以下相同。
一个单位的OPRTase酶活定义为每分钟转化1umol乳清酸所需的OPRTase的量。一个单位的ODCase酶活定义为每分钟生成1umolUMP所需的ODCase的量。
实施例3：多顺反子质粒pET28a-pyrE-pyrF和pET28a-pyrF-pyrE重组大肠杆菌的构建
通过合理设计多顺反子系统中的调控区域的SD序列(TAAGGAGG)和AS序列(ATATACAT)，将来源于C.glutamicum ATCC13032的OPRTase和ODCase进行共表达，并成功地构建了多顺反子质粒pET28a-pyrE-pyrF和pET28a-pyrF-pyrE，并有效地解决了UMP合成体系中两个酶反应速率的平衡和匹配问题，有利于UMP的高效生成。具体构建方法如下：为了构建pET28a-pyrE-pyrF，以pET28a-pyrF质粒为模板扩增片段SD-AS-pyrF。SD-AS-pyrF的PCR产物由BamH I和Xho I进行双酶切。将酶切纯化后的片段SD-AS-pyrF克隆到pET28a-pyrE质粒的Bam H I/Xho I酶切位点上。得到多顺反子质粒(pET28a-pyrE-pyrF)，将其转化至E.coli Rosetta(DE3)中进行表达，pET28a-pyrF-pyrE质粒的构建方法相同。每条克隆的引物如表1所示。
表1扩增片段的引物列表
| 目标片段 | 序列 |
| BamHI-SD-AS-pyrE | 5’-CGGGATCCTAAGGAGGATATACATATGTCATCTAATTC-3’ |
| pyrE-XhoI | 5’-CTCGAGCGGCCGCTCGAGTTAGTTGAGTCCAAGATCAG-3’ |
| BamHI-SD-AS-pyrF | 5’-CGGGATCCTAAGGAGGATATACATATGACATTCGG-3’ |
| pyrF-XhoI | 5’-CCGCTCGAGCTATGACCTGGGGAAACC-3’ |
实施例4：IPTG诱导表达含pET28a-pyrE-pyrF和pET28a-pyrF-pyrE的重组大肠杆菌。
具体实施方法参照实施例2，结果表明：携带有pET28a-pyrE-pyrF质粒的重组大肠杆菌Rosetta(DE3)中OPRTase和ODCase的酶活分别为8.2U/mg和7.9U/mg蛋白，UMP的最大生成速率为0.15mg/ml/min，较优于携带有pET28a-pyrF-pyrE质粒的重组菌(5.0U/mg和9.6U/mg，0.07mg/ml/min)。因此，我们选择携带有pET28a-pyrE-pyrF质粒的重组大肠杆菌Rosetta(DE3)，有利于进一步催化发酵研究，希望可以达到提高UMP产量的最终目的。
Claims (6)
1.一种高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株已于2011年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5047。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，它包含乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF的大肠杆菌，所述的乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032，所述的乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述的乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述的乳清苷酸脱羧酶基因ODCasepyrF的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.权利要求1所述高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌的构建方法，其特征在于，采用PCR方法从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中提取乳清酸磷酸核糖转移酶基因OPRTase pyrE和乳清苷酸脱羧酶基因ODCase pyrF，构建重组表达质粒pET28a-pyrE-pyrF，将重组质粒热击转化大肠杆菌Rosetta，然后进行诱导表达，筛选到一株产酶量最高的菌株CGMCC No.5047。
6.权利要求1所述高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶的重组菌在高效表达乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清苷酸脱羧酶中的应用。
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