CN1358229A - 来源于谷氨酸棒状杆菌的二氢乳清酸脱氢酶的序列及其在微生物生产嘧啶和/或嘧啶-相关化合物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明包含一种用于从谷氨酸棒状杆菌生物合成嘧啶的基因(pyrD)的核苷酸序列及其用于微生物生产嘧啶的用途。
Description
本发明涉及借助于基因操作的生物通过发酵生产嘧啶的方法。本发明包含来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的二氢乳清酸脱氢酶的序列,及其用于微生物生产嘧啶和/或嘧啶相关化合物的用途。
嘧啶的生物合成途径对于所有活的生物都是非常重要的(R.L.和Quinn,C.L.所著的关于此内容的评论文章是在枯草杆菌(编者:Sonenshein,A.L.,Hoch,J.A.和Losick,R.,American Society forMicrobiology,Washington,D.C.),1993,第343-358页中发表的)。嘧啶核苷酸是嘧啶的衍生物,且,本身是DNA和RNA的活化前体,并用于许多生物合成途径中。在嘧啶核苷的胞苷,尿苷,脱氧胞苷和脱氧胸苷中,嘧啶碱基与戊糖结合,且嘧啶核苷酸是嘧啶核苷的磷酸酯。嘧啶核苷和嘧啶核苷酸及其衍生物还是合成有价值的药物,如,例如,CDP-胆碱,乳清酸或UMP(Kuninaka,A.所著的关于此内容的评论文章是在Biotechnology生物工程学第6卷(编者:Rehm,H.-J.和Reed,G.),VCH,Weinheim,Germany,1996,第561-612页中发表的)的重要起始化合物。
许多,但不是全部微生物均能够从外部供给的嘧啶核苷和嘧啶碱基从头合成它们的嘧啶核苷酸。嘧啶碱基和/或嘧啶核苷通常不存在于细胞中。然而,在某些生长条件下,它们可能过量地形成,然后分泌到培养基中。由于这个原因,微生物可用于发酵生产嘧啶核苷酸和/或相关的化合物。
微生物生物合成嘧啶核苷酸的效率可通过基因操作嘧啶的生物合成途径而达到最佳。就基因操作方法而论,嘧啶生物合成途径的基因转录速度和/或基因拷贝数增加。由于这个原因,胞内酶活性和基因产物的比例增加。酶活性的增加使得在营养培养基中供给的化合物至嘧啶核苷酸和/或相关化合物的转化增加,从而增加合成效率。因而,可显示,例如,二氢乳清酸脱氢酶的活性增加,其催化(S)-二氢乳清酸至乳清酸的氧化-这是嘧啶核苷酸从头生物合成嘧啶的第四阶段-增加产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)中UMP合成的效率(Nudler,A.A.,Garibyan,A.G.和Bourd,G.I.(1991)FEMSMicrobiol.Lett.82:263-266)。
本发明涉及来源于谷氨酸棒状杆菌的,用于嘧啶生物合成途径的二氢乳清酸脱氢酶的新pyrD基因,及其制备嘧啶核苷酸和/或嘧啶相关化合物的用途。
本发明其中一个部分包含pyrD基因产物。SEQ ID NO.2描述了一种多肽序列。该pyrD基因编码具有33953分子量的322个氨基酸的多肽。本发明还涉及,此多肽的功能性衍生物,其可通过将SEQ ID NO:2的序列缺失,插入或置换或缺失,插入和置换的组合,一个或多个氨基酸,优选直到25%的氨基酸,最优选直到15%的氨基酸而得到。术语功能性衍生物是指该衍生物的酶活性与具有SEQ ID NO.2序列的多肽的酶活性处于同一数量级。
本发明的另一部分包含编码上述多肽的多核苷酸序列。该核苷酸序列可以从自谷氨酸棒状杆菌分离的序列(即,SEQ ID NO.1)开始产生,其中这些序列是通过定点诱变而修饰的或,使用遗传密码反向翻译相应的多肽之后,进行化学全合成。
这些多核苷酸序列最适于以用于宿主生物,优选微生物转化的基因构造的形式应用。这些基因构造是由多核苷酸的至少一个拷贝和至少一个调节序列组成的。调节序列包含启动子,终止子,增强子及核糖体结合位点。
用这些基因构造转化的优选宿主生物是棒状杆菌属和芽孢杆菌属(Bacillus),但任一真核微生物也可用于此目的,优选Ashbya,假丝酵母属(Candida),毕赤氏酵母属(Pichia),糖酵母属(Saccharomyces)和汉逊氏酵母属(Hansenula)的酵母菌株。
本发明的另一部分包含通过培养以上述方法转化的宿主生物,随后分离嘧啶来制备嘧啶和嘧啶衍生物。嘧啶衍生物指的是一种具有嘧啶环的化合物,其可以通过用本发明的其中一个多核苷酸转化宿主生物来制备。
培养微生物和从微生物产物中分离嘧啶的方法和过程对于本领域的技术人员来说是熟知的。
下列实施例描述本发明是如何产生的,及其为了增加嘧啶核苷酸和/或相关化合物的生产效率,在微生物基因操作中的应用。
实施例1来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因组文库的构造
来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因组的DNA可以通过J.Altenbuchner和J.Cullum(1984,Mol.Gen.Genet.195:134-138)描述的标准方法而得到。该基因组文库可使用任一克隆载体,例如pBluescript II KS-(Stratagene)或ZAP ExpressTM(Stratagene),通过标准方案(例如:Sambrook,J等(1989)Molecular cloning:alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press)来制备。此外,还可以使用任意大小的片段,优选2-9kb长的Sau3AI片段,其可用消化BamHI引入到克隆载体中。
实施例2基因组文库核酸序列的分析
大肠埃希氏菌的克隆可从实施例1中的基因组文库中选择。大肠埃希氏菌细胞是通过标准方法在适当的培养基(例如,用100mg/l氨苄青霉素补充的LB)中培养的,然后分离质粒DNA。如果将来源于谷氨酸棒状杆菌的DNA的基因组片段克隆到pBluescript II KS-(见实施例1),则可借助于寡核苷酸5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’和5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’来测序。
实施例3所分离核酸序列的计算机分析
可借助于BLASTX算法而将该核苷酸序列进行排列(aneinanderfügen)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。可用此方法发现新的序列,并阐明这些新基因的功能。
实施例4包含二氢乳清酸脱氢酶基因的大肠埃希氏菌的鉴定(EC 1.3.3.1)
分析实施例2中描述的大肠埃希氏菌的克隆,接着像实施例3中所述的,分析由此得到的序列,其揭示了SEQ ID NO.1所述的序列。BLASTX算法的使用(见实施例3)揭示了此序列与来源于各种生物的二氢乳清酸脱氢酶(PyrD;EC 1.3.3.1)的序列相似。其与来源于麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)的二氢乳清酸脱氢酶(SWISSPROT p46727;67%的氨基酸一致)最相似。
实施例5来源于谷氨酸棒状杆菌的二氢乳清酸脱氢酶的基因(pyrD)用于生产嘧啶和/或嘧啶相关化合物的用途
借助于适当的克隆和/或表达系统可将来源于谷氨酸棒状杆菌的二氢乳清酸脱氢酶的基因引入到谷氨酸棒状杆菌中,或引入到任一其它微生物中。还可以生产基因操作的微生物,其与野生型在活性或基因拷贝数上均不同。这些新的,基因操作的菌株可用于生产嘧啶和/或嘧啶相关的化合物。
序列列表(I)一般信息(1)申请人(A)名称: BASF-LYNX Bioscience AG(B)街: Im Neuenheimer Feld 515(C)市: Heidelberg(D)国家: 德国(E)邮政编码:69120(F)电话: 06221/4546(G)传真: 06221/454770(2)标题:来源于谷氨酸棒状杆菌的二氢乳清酸脱氢酶的序列及其在微生物生产嘧啶和/或嘧啶相关化合物中的用途(3)序列数: 2(4)计算机可读形式的类型:(A)媒体类型: 软盘(B)计算机: IBM PC兼容的(C)操作系统: Windows NT(D)软件: Microsoftword 97 SR-1(I)SEQ ID NO.1的信息:(1)序列特征:(A)长度: 966(B)类型: 核酸(C)链的类型: 双链(D)拓扑结构: 线形(2)分子类型: DNA(3)假拟: 无(4)反义: 无(5)源:(A)生物:Corynebacterium glutamicum谷氨酸棒状杆菌(6)序列描述:SEQ ID NO.1:ATGGAAAAAATCATCGCAGTGCACGATGATTCCCTCTCCCAGGAAGTCTTCGGCGTCACCTTCCCACGACCACTAGGCCTCGCCGCAGGTTTCGACAAAAACGCATCAATGGCTGATGCCTGGGGTGCCGTTGGATTCGGATACGCCGAACTTGGCACCGTCACCGCCTCCCCACAGCCAGGAAACCCCACCCCGCGCCTTTTCCGCCTGCCTGCCGACAAAGCTATCTTGAACCGCATGGGATTCAACAACCTGGGTGCAGCAGAAGTCGCAAAAAACCTGCGCAACCGGAAATCCACCGATGTCATCGGCATCAACATCGGTAAAACCAAAGTGGTTCCCGCTGAACACGCAGTAGATGACTACCGCCGTTCTGCATCTTTGTTAGGTGATCTTGCTGATTACCTGGTTGTCAACGTTTCCTCCCCCAACACTCCGGGTCTCCGCGATCTGCAGGCTGTGGAATCTTTGCGACCAATCCTCGCCGCAGTGCAGGAATCCACCACCGTCCCAGTCTTGGTGAAAATCGCACCAGACCTCTCCGACGAAGACATCGACGCCGTAGCTGACCTGGCAGTTGAGCTCAAACTCGCCGGAATCGTAGCCACCAATACCACCATTTCCCGCGAAGGCCTCAACACTCCTTCAGGTGAAGTCGAAGCCATGGGTGCTGGCGGAATCTCCGGTGCTCCAGTAGCAGCCCGATCTTTGGAGGTACTCAAGCGCCTCTACGCACGGGTAGGCAAAGAGATGGTGTTGATCTCTGTCGGTGGCATCAGCACCCCTGAGCAAGCCTGGGAACGCATCACCTCCGGCGCAACCCTTCTGCAGGGATACACCCCATTCATCTACGGTGGCCCCGATTGGATCAGAGATATCCACCTTGGTATCGCCAAGCAGCTGAAAGCTCACGGTCTGCGCAACATCGCTGACGCTGTGGGCAGCGAATTGGAGTGGAAGAACTAA(I)SEQ ID NO.2的信息:(1)序列特征:(A)长度: 322(B)类型: 氨基酸(C)链的类型: 单链(D)拓扑结构: 线形(2)分子类型: 氨基酸(3)假拟: 无(4)反义: 无(5)源:(B)生物:Corynebacterium glutamicum谷氨酸棒状杆菌(6)序列的描述:SEQ ID NO.2:MEKIIAVHDDSLSQEVFGVTFPRPLGLAAGFDKNASMADAWGAVGFGYAELGTVTASPQPGNPTPRLFRLPADKAILNRMGFNNLGAAEVAKNLRNRKSTDVIGINIGKTKVVPAEHAVDDYRRSASLLGDLADYLVVNVSSPNTPGLRDLQAVESLRPILAAVQESTTVPVLVKIAPDLSDEDIDAVADLAVELKLAGIVATNTTISREGLNTPSGEVEAMGAGGISGAPVAARSLEVLKRLYARVGKEMVLISVGGISTPEQAWERITSGATLLQGYTPFIYGGPDWIRDIHLGIAKQLKAHGLRNIADAVGSELEWKN
Claims (5)
1.一种具有二氢乳氢酸脱氢酶活性的多肽,其选自:
(a)一种具有SEQ ID NO.2中描述的氨基酸序列的多肽,
(b)一种与(a)相比,已经通过一个或多个氨基酸的缺失,插入或置换而被修饰了的多肽。
2.一种编码权利要求1多肽的多核苷酸。
3.一种基因构造,其包含权利要求2的多核苷酸的至少一个拷贝,和至少一个调节序列。
4.一种用权利要求3的基因转化的宿主生物。
5.一种生产嘧啶和嘧啶衍生物的方法,其中先培养权利要求4的宿主生物,随后分离嘧啶或嘧啶衍生物。
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