CN1033837A - 培育重组蛋白质表达细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育重组蛋白质表达细胞的 方法，该方法包括：在培养基中，培育一种由细胞质表 达载体所转化的宿主细胞，该细胞质表达载体中引入 了一种多肽基团，培养基中溶解氧的含量限于不高于 约20％饱和浓度，以得到从中已切掉对应于该表达 多肽中起始密码子的蛋氨酸的多肽。

Description

本发明涉及一种培育重组蛋白质表达细胞的新方法，更确切地说，是涉及培育适合于能选择性地获得在末端没有蛋氨酸残基（下文称为“Met”）的一种有价值多肽的这类重组蛋白质表达细胞的新方法。该蛋氨酸残基是对应于一个转译起始密码子。该方法是通过在培养基中，控制所用的溶解氧含量而实现的。

近年来，在生物化学领域中，尤其是在基因重组技术方面已取得了显著的进展，为制备大量具有生理活性的物质，例如，在过去仅能少量得到的淋巴细胞活素，就已开拓出多种基因工程技术。

以上这些技术包括的一种方法是通过把多肽基因引入大肠杆菌（E.coli）载体并使该大肠杆菌细胞通过复制、转录和转译表达该多肽，以大量生产所想要的有价值的多肽。已知这种方法在目前是最具代表性和最具优越性的方法。

用这种基因工程技术制备有价值多肽时，无论宿主细胞是真核细胞抑或是原核细胞，由于多肽的转译都是在对应于蛋氨酸的起始密码子（ATG）部位起始的，所制得的该多肽的氨基末端（N-末端）是蛋氨酸。已知由生物细胞天然产生这种多肽时，其氨基末端的蛋氨酸是被宿主细胞内的氨基肽酶或类似酶切掉的（J.D.Watson，Molecular    Biology    of    the    Gene（I），3rd    Edition，translated    by    Kin-ichiro    Miura    et    al.，p.375（1977））。

然而，当采用带有一种引入的外源肽〔诸如干扰素-α（IFN-α）、生长激素（GH）或白细胞间素-2（IL-2）〕的载体所转化的细胞时，尤其是探索培育这种细胞来大量制备有价值多肽时，宿主细胞内所存在的酶不能完全显示其活性，结果产生出大量仍保留有N-末端为蛋氨酸的多肽（see    Nature，293，408（1981），etc）。已知带有N-末端为蛋氨酸的多肽（例如，IL-1α和IL-1β），其生物活性低于N-末端没有蛋氨酸的天然多肽，而N-末端没有蛋氨酸的多肽，也许因具有抗原性之故，是不能天然产生的。因此，该多肽用作药物时，很可能要受到各种限制。

最近，有人提出使蛋氨酸氨基肽酶〔A.BEN-BASSAT    et    al.，J.Bact.，169，751-757（1987）;C.G.Miller    et    al.，P.N.A.S.，84，2718（1987）〕，氨基肽酶M〔S.Nakagawa    et    al.，Bio/Technol.，5，824（1987）〕或类似酶对带有N-末端为蛋氨酸的多肽起反应以切去蛋氨酸。尽管如此，这种方法仅对具有特定顺序的多肽适用而不适用于其它各种各样的类似肽，而且所用的酶价格昂贵，因此，这种方法实际应用时，仍需继续加以改进。

本发明的一个目的是提供一种切去N-末端蛋氨酸的方法，不管哪一种多肽，该方法适用于各种有价值的多肽。

本发明的另一个目的是提供一种切去N-末端蛋氨酸的方法，该方法具有容易实施，适于工业生产以及满意的经济效益等优点。

本发明提供了一种培育重组蛋白质表达细胞的方法，该方法包括在培养基中培育用带有其中引入所想要的多肽基因的细胞质表达载体所转化的一种宿主细胞，包括在培养基中限定使用不高于约20%饱和浓度的溶解氧的含量，以获得从多肽中切去了对应于该表达蛋白质中起始密码子的蛋氨酸的多肽。

为实现上述目的，我们已进行了深入的研究，我们发现在培养基中培育重组蛋白质表达细胞时，想要的N-末端没有蛋氨酸的多肽的比例取决于培养基中溶解氧的含量，还发现通过适当地控制溶解氧的含量可从本质上有选择性地获得想要的没有蛋氨酸的多肽，根据这些发现，我们完成了本发明。

根据本发明，关于这类多肽的制备，可通过简单的方法，即将一种由带有引入了多肽的基因的一种细胞质表达载体所转化的宿主细胞，在一含有特定的溶解氧含量的适宜培养基中进行培育，不管采用何种多肽，均可从本质上、有选择性地制得想要的N-末端没有蛋氨酸的多肽。因此，本发明的方法适宜于工业生产，且从经济效益而言，具有无需采用任何昂贵的酶即可实施的优点。

用本发明方法制备的有价值多肽并不专门限于上文所说明的那一种，对具有已知氨基酸顺序或经已知DNA顺序编码的多种多肽也适用。这类多肽的例子有白细胞间素-1（IL-1）、白细胞间素-2（IL-2）、白细胞间素-3（IL-3）、白细胞间素-4（IL-4）、白细胞间素-5（IL-5）、白细胞间素-6（IL-6）、集落刺激因子（M-CSF、GM-CSF、G-CSF等）、肿瘤坏死因子（TNF）、淋巴细胞素素（LT）和类似的淋巴细胞活素等。

有价值的宿主细胞为用于该细胞质表达系统，即其中所用的载体为键连有想要的多肽基因的蛋白质表达系统中已知的各种细胞和即将在下面列出的转译起始密码子。这类宿主细胞的例子有大肠杆菌、枯草杆菌（Bacillus    subtilis）、肺炎双球菌（Diplococcus    pneumoniae）、酵母、放线菌等。

以上这些宿主细胞可用已知方法转化，用于制备转化株的表达载体、编码构成该载体的想要的多肽基因、各种表达该基因的调节子如启动子、编码结合位点和转录终止区的核糖体的顺序、掺入该基因的起点载体等也是已知的。此外，采用有关基因重组技术中的已知方法也可容易地制得上述各种物质。

本发明方法用于表达由大肠杆菌转化的IL-1α和IL-1β及其衍生物是特别方便和有效的。

本发明关于用于由大肠杆菌进行细胞质表达的IL-1系统，下面将会更详细地加以说明，其它操作步骤可基本上相似。

本方法所用的IL-1α或IL-1β基因，可按照已知的天然IL-1α或IL-1β的氨基酸顺序，采用例如亚磷酸三酯法（Nature，310    105（1984））或类似的核酸化学合成法，完全地、一次性地合成，或可用含有该基因的细胞或类似细胞，用常规方法，进行一次性萃取和分离。此外，IL-1基因已被确定，也是有效的。这类基因的例子就是下面对比文献中所列出的那些基因。

＊Nishida    et    al.，B.B.R.C.，143，345（1987）

＊Frutani    et    al.，Nucleic    Acid    Res.，13，5869（1985）

＊European    Patent    Application出版物编号：237967

＊European    Patent    Application出版物编号：237073

表达该基因所用的启动子可以是诸如λP_L，λP_R，trp，lacC，tufB，recA和lpp中任何一种已知的启动子，其中以trp启动子特别有效。

除了上述文献中所列出的那些基因合用外，带有IL-1基因的细胞质表达载体和这类启动子并且对本发明是方便合用的还包括已经公开的那些载体和启动子，例如Kikumoto    et    al.，B.B.R.C.，147，315（1987）。

通过常规方法可将这些质粒引入用作宿主细胞的大肠杆菌中，借以转化大肠杆菌。

用于培育所得到的转化株的培养基，可以是任何一种综合培养基、天然培养基等，这些培养基通常用于培养大肠杆菌和产生想要的多肽。可利用的碳源通常包括例如葡萄糖、果糖、乳糖、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇等。可利用的氮源的例子有：氯化铵、硫酸铵、酪蛋白氨基酸、酵母提取液、多胨、肉提取液、细菌胰蛋白胨、玉米浆等。其他有用的营养素的例子有K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、MgSO₄、维生素B₁、MgCl₂等。具有下列组成的培养基特别适用于培育用带有trp启动子的表达载体的大肠杆菌。

Na₂HPO₄·12H₂O 6g/l

KH₂PO₄3g/l

NaCl    0.5g/l

NH₄Cl 1g/l

细菌酪蛋白氨基酸    10g/l

细菌酵母提取液    0.5g/l

L-半胱氨酸HCl    75mg/l

L-脯氨酸    75mg/l

L-亮氨酸    75mg/l

用4N    NaOH将上述培养基调至pH7.4，随后于121℃高压灭菌30分钟或于123℃蒸汽加热灭菌20分钟。接着，于接种前，立即把分别已灭过菌的下列混合物无菌地加到培养基中。

1M MgSO₄·7H₂O 2ml/l

1M CaCl₂·2H₂O 0.1ml/l

7.5mg/ml硫胺素HCl    1ml/l

40%葡萄糖    18.75ml/l

在适于转化株生长的条件下，即通常最好在pH为5.5-8.5，18-40℃条件下，通气并搅拌培育转化株。

按照本发明，进行上述培育时，要严格掌握培养基中的溶解氧含量，要限定其不高于约饱和浓度的20%，较好为约0-15%，最好为约0-5%。因此，在培育期间，当转化株开始表达该蛋白质，即对数生长期时，尤其在对数生长期的最后阶段，要限制溶解氧浓度。溶解氧浓度例如可通过适当地改变通气条件，搅拌条件来加以控制。其详情将在下面实施例中加以说明。

这样，即可制得从其中切去了对应于该被表达蛋白质中起始密码子的蛋氨酸的想要的有价值的多肽。

用常规方法，例如用酶免疫测定法（EIA）可证实该想要的多肽的产生。

用例如声处理、SDS缓冲液的Laemmeli方法（Laemmeli，U.K.，Nature，227，680（1970））等常规方法分离和纯化所得到的细胞可提取该想要的多肽。

本发明方法能从本质上，有选择性地提供从中切去了蛋氨酸的想要的有价值的多肽。不过，该产品很可能含有有蛋氨酸的多肽，要检验该产品是否为含有蛋氨酸的多肽，例如可用TSK-SP-5PW（7.5×75mm层析柱，为Toyo    Soda    Mfg。有限公司产品）进行凝胶色谱分析并在280nm处测定其组分的吸光度;或通过丹磺酰化作用、肽顺序仪（Applied    Biosystems）等方法来测定N-末端的蛋氨酸含量。

按本发明方法制备的想要的多肽，可利用其理化性质，通过各种常规方法纯化（例如参见：“Biological    Data    BookⅡ，”pp.1175-1259，第1版，第1次印刷，1980年6月23日，Kabushiki    Kaisha    Tokyo    Kagakudojin出版）。有需要在温和的条件下，如通过渗透打击，从宿主中提取多肽，以便保留其高级结构。处理纯化的有效方法包括采用常用蛋白质沉淀剂、超滤作用、分子筛色谱法（凝胶过滤）、液相色谱法、离心、电泳、亲合色谱法，渗析以及上述各方法的结合使用。

具体地说，上述方法可按如下所述进行：

首先，将从细胞提取液中所得到的上清液对想要的多肽部分纯化，部分纯化的处理例如可用诸如丙酮、甲醇、乙醇、丙醇或二甲基甲酰胺（DMF）之类的一种有机溶剂，或诸如乙酸、高氯酸（PCA）或三氯乙酸（TCA）之类的一种酸作为蛋白质沉淀剂;用诸如硫酸铵、硫酸钠或磷酸钠之类的盐作为盐析剂和/或用渗析膜、平板膜、空心纤维膜等进行超滤。这些处理通常与在常规条件下所进行的方法相同。

接着，将如此所获得纯化的粗产品进行凝胶过滤，回收显示出想要多肽的活性组分。合用的凝胶过滤剂并无特别限制，它包括由葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、纤维素等组成的凝胶过滤剂。合用的凝胶过滤剂的实例还有诸如市场上可得到的交联葡聚糖G型、交联葡聚糖LH型、琼脂糖凝胶型、琼脂丙烯型（以上全是琅玛西亚产品）、细纤维（Cellofine）（Chisso公司）凝胶过滤剂P型、凝胶过滤剂A型（A、P型均为Bio-Rad    Lab.产品）、Ultro凝胶-C（LKB产品）、TSK-G型（Toyo    Soda    Mfg.有限公司产品）等。

从显示出想要多肽活性的组分中，可分离出均一的想要的多肽，例如采用羟基磷灰石柱、DEAE离子交换柱色谱法、CM或SP法，聚焦色谱法、逆相高性能液相色谱法等。或其各方法之结合，对组分进行亲合色谱法分析。

用各种已知方法对组分进行聚焦色谱法分析时，适用的分析柱例如有PBE94（pharmacia    Fine    Chemicals）等，适用的起始缓冲剂例如有咪盐酸等，适用的洗脱剂例如有多缓冲液74（Pharmacia    Fine    Chemicals）和盐酸（pH4.0）的混合物等。

例如可用C₄Hi-Pore逆相HPLC柱（Bio-Rad实验室）等进行逆相高性能液相色谱法。可用乙腈、三氟乙酸（TFA）、水等、或上述各溶剂的混合物作为洗脱剂。这样，所分离得到的多肽，其N-末端就没有蛋氨酸。

如此得到的想要多肽与对应于天然产生的多肽具有相同的生理活性，且同样适用于制备与含有天然产生的这种多肽相同的药物制剂。

所配制的这些药物制剂，通常是以药物组合物的形式，它包括有效量的多肽和适用的药物载体。合用的药物载体的例子包括诸如填料、补充剂、结合剂、湿润剂、分散剂、表面活性剂之类的赋形剂和稀释剂。这些药物载体通常用于制备所想要的药物剂型。至于药物组合物的剂型并无特别限制，只要它们含有有效量的按本发明所制备的多肽，例如可以是片剂、粉剂、粒剂、丸剂等固体剂型，但是，通常适用的组合物剂型为注射用的溶液剂、悬浮剂、乳化剂等。另外，这类组合物也可以是干制品，在临用前用与外加适合的载体配成液体。上述药物组合物可用常规方法制备。

按照所制得药物组合物的剂型，该组合物可经一适合的途径给药，例如注射用的组合物可经静脉、肌肉、皮下、皮内、腹膜内或其它途径给药。固体组合物可以口服或肠内给药。组合物中活性成分的含量和组合物的药用剂量，可按照给药方法和剂型、使用目的、患者的病情等加以适当确定，但不能固定不变。通常需要将约1-80%（重量）的活性成分加到药物制剂中，得到按活性成分计算，成人每日剂量约为0.1μg-10mg的制剂。制剂不一定一天只给药一次。每天约药剂量可分为3-4次。

下面各实施例将更详细地说明本发明。

在下面各实施例中，各物质的生理活性可通过下列方法进行测定。

（1）IL-1α活性的测定：

用C3H/HeJ小鼠的胸腺细胞，采用J.J.Oppenhein等人的方法（J.Immunol.，116，1466（1976））测定，以LAF表示其活性。

（2）GIF活性的测定：

将稀释成各种浓度的每份0.1ml试验溶液加入96井微量培养板（Corning有限公司产品）的各个井中。接着，将含有10%FCS（小牛胎血清）和含有人黑素瘤细胞A375的2×10⁴细胞/ml的0.1ml Eagle′s MEM悬浮液加入各井中。用一个CO₂恒温箱（Napco有限公司）温育细胞4天。温育后，将0.05ml的0.05%中性红（Wako Junyaku有限公司）加到各井中，随后于37℃温育两小时。移去上清液后，将0.3ml的磷酸缓冲盐水慢慢地注入各井进行洗涤。移去上洗涤液后，将等量的磷酸一钠和乙醇的混合物0.1ml注入各井，用一微量混合器搅拌平板几分钟。再用一光度计，以在540mμ处的吸光度，测家96井徵量滴定平板（Titer check multiscane，product of Flow Lab.）中进入细胞的染料量，以确定其生长抑制活性。随后鉴别出对对照组细胞生长显示出50%抑制的那个试验组（即该试验组抑制了对照组所测得的1/2吸光度），把该试验组稀释倍数的倒数视为GIF活性单位。因此，例如GIF活性为10单位时，即使该试验溶液再稀释10倍，该溶液仍只有抑制50%细胞生长的活性。

以下各实施例将参照下面附图说明。

图1是用按照实施例2所得到的想要多肽进行液相色谱分析的图示。

实施例1

将人IL-1β细胞质表达载体ptrp    GIF-α（按布达佩斯条约，已于1985年12月12日，按欧洲专利申请公布号237967公开的大肠杆菌×1776/ptrp    GIF-α：保藏号为FERM    BP-949，保藏于日本工业科学和技术厅的发酵研究所（FRI）（地址：日本1-3，Higashi    1-chome，Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki-ken，305，）引入大肠杆菌HB101。由此而得到的转化株也已按布达佩斯条约，于1988年10月7日保藏于FRI，其保藏号为FERM    BP-2089。用一菌环量的上述细胞接种到含下列组分的LB培养基（200ml），于37℃震摇过夜温育细胞，得到预保温的培养物。

LB培养基的组分：

胰蛋白胨（Difco）    10g/l

细菌酵母提取液（Difco）    5g/l

NaCl（Wako    Junyaku有限公司）    10g/l

（pH）    （7.5）

用一特定量的上述预保温培养物接种具有下面给定组分的生产培养基，在下面表1所列出的条件下，随后以一种不同的通气速率将其接种到一个发酵罐内。

生产培养基的组分：

Na₂HPO₄·12H₂O 6g/l

KH₂PO₄3g/l

NaCl    0.5g/l

NH₄Cl 1g/l

细菌酪蛋白氨基酸    10g/l

细菌酵母提取液    0.5g/l

L-半胱氨酸盐酸    75mg/l

L-脯氨酸    75mg/l

L-亮氨酸    75mg/l

用4N    NaOH将上述培养基调至pH7.4，随后于120℃高压灭菌30分钟或于123℃蒸汽加热灭菌20分钟。接着，将分别灭菌过的下列各组分于接种时无菌地加入培养基中。

1M MgSO₄·7H₂O 2ml/l

1M CaCl₂·2H₂O 0.1ml/l

7.5mg/ml硫胺素盐酸    1ml/l

40%葡萄糖    18.75ml/l

表1

恒温箱    发酵罐（Marubishi    MSJ-U3）

培养基    上述生产培养基

培养基用量    20l

培育温度    37℃

通气    0.25vvm    or    0.5vvm

搅拌    200r.p.m.

pH    灭菌后以7.0开始

接种量    预保温的培养物400ml/20升培养基

温育时间    8小时

培育时，要用一个溶解氧计（Marubishi生物工程有限公司）检查培养基的溶解氧浓度。当以0.25vvm速率进行通气时，对数生长期间培养基的溶解氧浓度至少为0%饱和度，即约5%-0%的饱和浓度。当以0.5vvm速率进行通气时，对数生长期间培养基的溶解氧浓度至少为20%饱和浓度，即一般于约25%-20%饱和浓度之间变化。

生产培育完全后，将10ml培养物于10，000×g离心10分钟，随后收集细胞，接着将细胞悬浮于1ml的1M Na₂HPO₄（Wako Junyaku有限公司产品），使其于4℃静置数小时。之后，悬浮液进行声处理。所得细胞碎片于10，000×g离心10分钟，收集上清液。

将500μl 100mM CH₃COONa（pH5.5）加入500μl上清液中，于4℃使混合物静置30分钟，用0.22-μm过滤器（Millipore产品）滤除所生成的沉淀。滤液进行液相色谱法分析（采用Utrochrom GTi（LKB产品）;TSK凝胶SP-TPW7.5×75mm柱;吸附缓冲液50mM CH₃COONa（pH5.5）;用50mM CH₃COONa与0.5M NaCl（pH5.5）进行梯度洗脱，得Met（+）IL-1β和Met（-）IL-1β两组分。Met（+）/Met（-）的比例可由所绘制出的图中所示的面积比计算出，表2示出了该计算结果。

表2

通气速率    Met（+）/Met（-）之比

0.25vvm    0.079

0.5vvm    0.385

表2表明用较低的通气速率，其结果所产生的Met（+）的比例极小，这就使得有可能选择性地生产Met（-）。

实施例2

由载体ptrp    GIF-α-71S所转化的大肠杆菌HB101（HB101/ptrp    GIF-α-71S）;保藏号为FERM    BP-1296，已按布达佩斯条约于1987年2月20日保藏在FRI，并以欧洲专利申请公布号237967公开）对IL-1β衍生物进行细胞质表达。该衍生物即为其中第71位半胱氨酸（Cys）被丝氨酸（Ser）取代的人IL-1β，该人IL-1β是采用Hitachi发酵罐（200升），于0.5vvm通气速率下，按与实施例1相同的方法培育的，随后，按实施例1的方法进行相同处理和相同的液相色谱法程序。对数生长期的培养基的溶解氧浓度约为5%-0%饱和浓度。

图1表示所得到的色谱法分析图。在该图中，用（1）表示Met（+），而用（2）表示Met（-）。

图1显示出本发明方法能选择性地获得Met（-）。

Claims (11)

1、一种培育重组蛋白质表达细胞的方法，该方法包括：在培养基中，培育一种由细胞质表达载体所转化的宿主细胞，该细胞质表达载体中引入了一种多肽基因，培养基中溶解氧的含量限于不高于约20%饱和浓度，以得到从中已切掉对应于该表达多肽中起始密码子的蛋氨酸的多肽。

2、权利要求1所定义的一种方法，其中多肽是淋巴细胞活素。

3、权利要求1所定义的一种方法，其中多肽是白细胞间素-1、白细胞间素-2、白细胞间素-3、白细胞间素-4、白细胞间素-5、白细胞间素-6、集落刺激因子、肿瘤坏死因子或淋巴细胞毒素。

4、权利要求1所定义的一种方法，其中宿主细胞是大肠杆菌（E.coli）、枯草杆菌（Bacillus  subtilis）、肺炎双球菌（Diplococcus  pneumoniae）、酵母或放线菌。

5、权利要求1所定义的一种方法，其中宿主细胞是大肠杆菌。

6、权利要求1所定义的一种方法，其中多肽是白细胞间素-1，宿主细胞是大肠杆菌。

7、权利要求6所定义的一种方法，其中白细胞间素-1是白细胞间素-1α或白细胞间素-1β。

8、权利要求1所定义的一种方法，其中多肽基因的启动子是λP_L、λP_R、trp、lacC、tufB、recA或lpp。

9、权利要求8所定义的一种方法，其中多肽基因的启动子是trp。

10、权利要求1所定义的一种方法，其中培养基中溶解氧的含量约为0%-5%饱和浓度。

11、权利要求1所定义的一种方法，其中培养基中溶解氧的含量是在对数生长期进行控制的。