CN114574459B - 一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用 - Google Patents
一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114574459B CN114574459B CN202210226587.2A CN202210226587A CN114574459B CN 114574459 B CN114574459 B CN 114574459B CN 202210226587 A CN202210226587 A CN 202210226587A CN 114574459 B CN114574459 B CN 114574459B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- branching enzyme
- glycogen branching
- starch
- mutant
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 title claims abstract description 106
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 title abstract description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 49
- 229920000294 Resistant starch Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 235000021254 resistant starch Nutrition 0.000 claims abstract description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 17
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 16
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 5
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 abstract description 68
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 abstract description 61
- 239000008107 starch Substances 0.000 abstract description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 18
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 35
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 9
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 8
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 8
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 7
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 7
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 7
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 6
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- -1 D-amino acids) Chemical class 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- OTWIOROMZLNAQC-XIRDDKMYSA-N Trp-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OTWIOROMZLNAQC-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 description 2
- XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LTSBJNNXPBBNDT-HGNGGELXSA-N Ala-His-Gln Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O LTSBJNNXPBBNDT-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- HUUOZYZWNCXTFK-INTQDDNPSA-N Ala-His-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N HUUOZYZWNCXTFK-INTQDDNPSA-N 0.000 description 1
- HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N Ala-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 1
- XRUJOVRWNMBAAA-NHCYSSNCSA-N Ala-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 XRUJOVRWNMBAAA-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- XAXHGSOBFPIRFG-LSJOCFKGSA-N Ala-Pro-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O XAXHGSOBFPIRFG-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OMCKWYSDUQBYCN-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OMCKWYSDUQBYCN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CWRBRVZBMVJENN-UVBJJODRSA-N Ala-Trp-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N CWRBRVZBMVJENN-UVBJJODRSA-N 0.000 description 1
- XPBVBZPVNFIHOA-UVBJJODRSA-N Ala-Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 XPBVBZPVNFIHOA-UVBJJODRSA-N 0.000 description 1
- PGNNQOJOEGFAOR-KWQFWETISA-N Ala-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=C(O)C=C1 PGNNQOJOEGFAOR-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- XAXMJQUMRJAFCH-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=C(O)C=C1 XAXMJQUMRJAFCH-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- JTKLCCFLSLCCST-SZMVWBNQSA-N Arg-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 JTKLCCFLSLCCST-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MSILNNHVVMMTHZ-UWVGGRQHSA-N Arg-His-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CN=CN1 MSILNNHVVMMTHZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CVXXSWQORBZAAA-SRVKXCTJSA-N Arg-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N CVXXSWQORBZAAA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OMKZPCPZEFMBIT-SRVKXCTJSA-N Arg-Met-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OMKZPCPZEFMBIT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JRVABKHPWDRUJF-UBHSHLNASA-N Asn-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JRVABKHPWDRUJF-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- XLHLPYFMXGOASD-CIUDSAMLSA-N Asn-His-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XLHLPYFMXGOASD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IKLAUGBIDCDFOY-SRVKXCTJSA-N Asn-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IKLAUGBIDCDFOY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N Asp-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N Asp-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HJZLUGQGJWXJCJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HJZLUGQGJWXJCJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GGRSYTUJHAZTFN-IHRRRGAJSA-N Asp-Pro-Tyr Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O GGRSYTUJHAZTFN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DINOVZWPTMGSRF-QXEWZRGKSA-N Asp-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DINOVZWPTMGSRF-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- LTARLVHGOGBRHN-AAEUAGOBSA-N Asp-Trp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(O)=O LTARLVHGOGBRHN-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CZIVKMOEXPILDK-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CZIVKMOEXPILDK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BPAUXFVCSYQDQX-JRQIVUDYSA-N Asp-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O BPAUXFVCSYQDQX-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATFSDBMHRCDLBV-BPUTZDHNSA-N Cys-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ATFSDBMHRCDLBV-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KWUSGAIFNHQCBY-DCAQKATOSA-N Gln-Arg-Arg Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O KWUSGAIFNHQCBY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XEYMBRRKIFYQMF-GUBZILKMSA-N Gln-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XEYMBRRKIFYQMF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N Gln-Leu-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N Glu-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ZALGPUWUVHOGAE-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZALGPUWUVHOGAE-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N Gly-Ala-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- OGCIHJPYKVSMTE-YUMQZZPRSA-N Gly-Arg-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OGCIHJPYKVSMTE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUTAPPOITCCWTH-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FUTAPPOITCCWTH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VOCMRCVMAPSSAL-IUCAKERBSA-N Gly-Gln-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)CN VOCMRCVMAPSSAL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N Gly-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- YFGONBOFGGWKKY-VHSXEESVSA-N Gly-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)CN)C(=O)O YFGONBOFGGWKKY-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N Gly-Pro-Glu Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- DUAWRXXTOQOECJ-JSGCOSHPSA-N Gly-Tyr-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DUAWRXXTOQOECJ-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- ZVXMEWXHFBYJPI-LSJOCFKGSA-N Gly-Val-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZVXMEWXHFBYJPI-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N Gly-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- MWAJSVTZZOUOBU-IHRRRGAJSA-N His-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MWAJSVTZZOUOBU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N His-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YOSQCYUFZGPIPC-PBCZWWQYSA-N His-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YOSQCYUFZGPIPC-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- DGYNAJNQMBFYIF-SZMVWBNQSA-N His-Glu-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 DGYNAJNQMBFYIF-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- KAFZDWMZKGQDEE-SRVKXCTJSA-N His-His-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N KAFZDWMZKGQDEE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JBSLJUPMTYLLFH-MELADBBJSA-N His-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N)C(=O)O JBSLJUPMTYLLFH-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- CTEMYIWDSVICKS-WDSOQIARSA-N His-Met-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N CTEMYIWDSVICKS-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N His-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- FRDFAWHTPDKRHG-ULQDDVLXSA-N His-Tyr-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CN=CN1 FRDFAWHTPDKRHG-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N His-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- GVNNAHIRSDRIII-AJNGGQMLSA-N Ile-Lys-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N GVNNAHIRSDRIII-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- RCMNUBZKIIJCOI-ZPFDUUQYSA-N Ile-Met-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RCMNUBZKIIJCOI-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N Ile-Phe-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)NCC(O)=O UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- MDVZJYGNAGLPGJ-KKUMJFAQSA-N Leu-Asn-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MDVZJYGNAGLPGJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PJYSOYLLTJKZHC-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PJYSOYLLTJKZHC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GBDMISNMNXVTNV-XIRDDKMYSA-N Leu-Asp-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O GBDMISNMNXVTNV-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N Leu-Asp-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N Leu-His-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XBCWOTOCBXXJDG-BZSNNMDCSA-N Leu-His-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XBCWOTOCBXXJDG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N Leu-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- LQUIENKUVKPNIC-ULQDDVLXSA-N Leu-Met-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LQUIENKUVKPNIC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- FYPWFNKQVVEELI-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 FYPWFNKQVVEELI-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- CNWDWAMPKVYJJB-NUTKFTJISA-N Leu-Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 CNWDWAMPKVYJJB-NUTKFTJISA-N 0.000 description 1
- SUYRAPCRSCCPAK-VFAJRCTISA-N Leu-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SUYRAPCRSCCPAK-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N Leu-Tyr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N Leu-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQMIRLVJXQNTRJ-SDDRHHMPSA-N Lys-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O MQMIRLVJXQNTRJ-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- KVNLHIXLLZBAFQ-RWMBFGLXSA-N Lys-Met-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KVNLHIXLLZBAFQ-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BVRNWWHJYNPJDG-XIRDDKMYSA-N Lys-Trp-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N BVRNWWHJYNPJDG-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- JQEBITVYKUCBMC-SRVKXCTJSA-N Met-Arg-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JQEBITVYKUCBMC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OGAZPKJHHZPYFK-GARJFASQSA-N Met-Glu-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OGAZPKJHHZPYFK-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- WWWGMQHQSAUXBU-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Asn Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WWWGMQHQSAUXBU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MHQXIBRPDKXDGZ-ZFWWWQNUSA-N Met-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 MHQXIBRPDKXDGZ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- MNGBICITWAPGAS-BPUTZDHNSA-N Met-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O MNGBICITWAPGAS-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710118186 Neomycin resistance protein Proteins 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N Phe-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- HCTXJGRYAACKOB-SRVKXCTJSA-N Phe-Asn-Asp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HCTXJGRYAACKOB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KIAWKQJTSGRCSA-AVGNSLFASA-N Phe-Asn-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KIAWKQJTSGRCSA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- UAMFZRNCIFFMLE-FHWLQOOXSA-N Phe-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N UAMFZRNCIFFMLE-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- RFEXGCASCQGGHZ-STQMWFEESA-N Phe-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RFEXGCASCQGGHZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- VADLTGVIOIOKGM-BZSNNMDCSA-N Phe-His-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CN=CN1 VADLTGVIOIOKGM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KZRQONDKKJCAOL-DKIMLUQUSA-N Phe-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KZRQONDKKJCAOL-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- KNYPNEYICHHLQL-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KNYPNEYICHHLQL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- UXQFHEKRGHYJRA-STQMWFEESA-N Phe-Met-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O UXQFHEKRGHYJRA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N Phe-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N Phe-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BAONJAHBAUDJKA-BZSNNMDCSA-N Phe-Tyr-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BAONJAHBAUDJKA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- QUUCAHIYARMNBL-FHWLQOOXSA-N Phe-Tyr-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N QUUCAHIYARMNBL-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PZSCUPVOJGKHEP-CIUDSAMLSA-N Pro-Gln-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PZSCUPVOJGKHEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LHALYDBUDCWMDY-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O LHALYDBUDCWMDY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HAEGAELAYWSUNC-WPRPVWTQSA-N Pro-Gly-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HAEGAELAYWSUNC-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- XNJVJEHDZPDPQL-BZSNNMDCSA-N Pro-Trp-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O XNJVJEHDZPDPQL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- SHTKRJHDMNSKRM-ULQDDVLXSA-N Pro-Tyr-His Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O SHTKRJHDMNSKRM-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- QDDJNKWPTJHROJ-UFYCRDLUSA-N Pro-Tyr-Tyr Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=C(O)C=C1 QDDJNKWPTJHROJ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N Ser-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- HBTCFCHYALPXME-HTFCKZLJSA-N Ser-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HBTCFCHYALPXME-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- MQQBBLVOUUJKLH-HJPIBITLSA-N Ser-Ile-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MQQBBLVOUUJKLH-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- GZGFSPWOMUKKCV-NAKRPEOUSA-N Ser-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO GZGFSPWOMUKKCV-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- BCAVNDNYOGTQMQ-AAEUAGOBSA-N Ser-Trp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(O)=O BCAVNDNYOGTQMQ-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- XTWXRUWACCXBMU-XIRDDKMYSA-N Ser-Trp-His Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N XTWXRUWACCXBMU-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N Ser-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NFMPFBCXABPALN-OWLDWWDNSA-N Thr-Ala-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O NFMPFBCXABPALN-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 1
- VFEHSAJCWWHDBH-RHYQMDGZSA-N Thr-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VFEHSAJCWWHDBH-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N Thr-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N Thr-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- NYQIZWROIMIQSL-VEVYYDQMSA-N Thr-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NYQIZWROIMIQSL-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- YGCDFAJJCRVQKU-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O YGCDFAJJCRVQKU-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- UMFLBPIPAJMNIM-LYARXQMPSA-N Thr-Trp-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=CC=C3)C(=O)O)N)O UMFLBPIPAJMNIM-LYARXQMPSA-N 0.000 description 1
- BPGDJSUFQKWUBK-KJEVXHAQSA-N Thr-Val-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BPGDJSUFQKWUBK-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 240000000359 Triticum dicoccon Species 0.000 description 1
- KZIQDVNORJKTMO-WDSOQIARSA-N Trp-Arg-His Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O)N KZIQDVNORJKTMO-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- PTAWAMWPRFTACW-SZMVWBNQSA-N Trp-Gln-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PTAWAMWPRFTACW-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- RXEQOXHCHQJMSO-IHPCNDPISA-N Trp-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RXEQOXHCHQJMSO-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- HLDFBNPSURDYEN-VHWLVUOQSA-N Trp-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N HLDFBNPSURDYEN-VHWLVUOQSA-N 0.000 description 1
- RQKMZXSRILVOQZ-GMVOTWDCSA-N Trp-Tyr-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N RQKMZXSRILVOQZ-GMVOTWDCSA-N 0.000 description 1
- OOEUVMFKKZYSRX-LEWSCRJBSA-N Tyr-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N OOEUVMFKKZYSRX-LEWSCRJBSA-N 0.000 description 1
- KDGFPPHLXCEQRN-STECZYCISA-N Tyr-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KDGFPPHLXCEQRN-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- SGFIXFAHVWJKTD-KJEVXHAQSA-N Tyr-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SGFIXFAHVWJKTD-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KEHKBBUYZWAMHL-DZKIICNBSA-N Tyr-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KEHKBBUYZWAMHL-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- LHTGRUZSZOIAKM-SOUVJXGZSA-N Tyr-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O LHTGRUZSZOIAKM-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N Tyr-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- HVPPEXXUDXAPOM-MGHWNKPDSA-N Tyr-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HVPPEXXUDXAPOM-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N Tyr-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- NVJCMGGZHOJNBU-UFYCRDLUSA-N Tyr-Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N NVJCMGGZHOJNBU-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- UUYCNAXCCDNULB-QXEWZRGKSA-N Val-Arg-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UUYCNAXCCDNULB-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- BVWPHWLFGRCECJ-JSGCOSHPSA-N Val-Gly-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N BVWPHWLFGRCECJ-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- RYQUMYBMOJYYDK-NHCYSSNCSA-N Val-Pro-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RYQUMYBMOJYYDK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SSKKGOWRPNIVDW-AVGNSLFASA-N Val-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N SSKKGOWRPNIVDW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003028 elevating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000010855 food raising agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010030617 leucyl-phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 108010005652 splenotritin Proteins 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/107—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01018—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18), i.e. glucan branching enzyme
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用。本发明基于SEQID NO:1所示序列的糖原分支酶，通过蛋白结构模拟、定点饱和突变以及Rosetta辅助理性设计潜在影响活性的氨基酸位点。采用了定点饱和突变策略构建突变体库并经测序验证，筛选得到催化活性提高的突变体，进而通过组合突变的方式对这些突变位点进行组合突变，获得催化活性进一步提高的糖原分支酶突变体，并将这些突变体用于制备高支化淀粉和抗性淀粉。具有极大的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用。
背景技术
糖原分支酶(EC 2.4.1.18)是一种能够在淀粉链上引入α-1,6糖苷键的酶，广泛存在于微生物和动物中，是糖原合成过程中的关键酶之一。糖原分支酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷键的断裂并通过转苷活性在受体分子上以α-1,6糖苷键连接新的分支，最终形成高支化淀粉。高支化淀粉在多个领域有广泛用途，例如，食品领域中作为增稠剂、膨松剂和抗老化剂，还具有调节血糖、降低血脂、促进矿物质吸收、保护肠道等生理功能；在医药领域可以作为药物载体和生物膜材料等；还具有改善胶黏剂、纸张韧性和糖果咀嚼性等功能。另外，通过该种转糖基反应，糖原分支酶能够增加淀粉分支的分支度，提高淀粉的抗消化性和慢消化性，增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能，可用于生产具有良好应用价值的淀粉衍生物。
糖原分支酶是生产高支化淀粉的唯一酶，但该酶的表达量低和活性差，极大地限制了其在工业中的应用，因此，提高糖原分支酶的表达量和催化效率对于高支化淀粉的合成具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种催化活性提高的糖原分支酶突变体。本发明基于SEQID NO:1所示序列的糖原分支酶，通过蛋白结构模拟、定点饱和突变以及Rosetta辅助理性设计潜在影响活性的氨基酸位点。采用了定点饱和突变策略构建突变体库并经测序验证，筛选得到催化活性提高的突变体，进而通过组合突变的方式对这些突变位点进行组合突变，获得催化活性进一步提高的糖原分支酶突变体，并将这些突变体用于制备高支化淀粉和抗性淀粉。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在第一方面，本发明提供一种糖原分支酶突变体，所述糖原分支酶突变体选自如下任一种：
(a)其氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位；
或
(b)所述糖原分支酶突变体与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；
或
(c)所述糖原分支酶突变体由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述糖原分支酶突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同。
在具体的实施方式中，所述糖原分支酶突变体的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点突变为以下所示的氨基酸残基：
187位:Met、Cys；
239位:Gly、Met；
243位:Met、Thr、Asp；
334位:Lys；
344位:Arg；
377位:Asp、Trp、Met；
380位:Asp、Trp、Met；
385位:Asn、Glu、Cys；
420位:Ser、Val、Leu；
421位:Phe；
428位:Tyr、Glu、Asp；
429位:Met、Thr、Asn；
431位:Trp；
436位:Arg、Gln、Met；
463位:Met、Cys。
在具体的实施方式中，所述糖原分支酶突变体的氨基酸序列在187位为Met，或者在239位为Gly，或者在243位为T，或者在377位为Met，或者在380位为Asp，或者在385位为Glu，或者在420位为Ser，或者在421位为Phe，或者在429位为Asn，或者在431位为Trp，或着在436位为Arg，或者在463位Met。
根据本发明的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位中任意两个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含上述两个位点的突变，并且至少其中一个突变位点为：377位为Met或420位为Ser。在又一实施方案中，所述突变体为如下表中M35、M40、M44、M46、M54、M60、M61、M62、M63、M67、M70、M72、M73、M75、M87、M88中任一种：
根据本发明的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位中任意三个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含上述三个位点的突变，并且至少其中两个突变位点为377位为Met和420位为Ser；在又一实施方案中，所述突变体为如下表中M90、M91、M93、M95、M97、M98、M99、M102、M104、M106、M107、M108、M109中任一种：
根据本发明的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位中任意四个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含上述四个位点的突变，并且至少其中三个突变位点为377位为Met、380位为Met和420位为Ser；在又一实施方案中，所述突变体为如下表中M111、M112、M113、M114、M115、M116、M117、M118、M120、M121、M122、M123、M124、M125、M126、M127、M128中任一种：
根据本发明的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位中任意五个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含上述五个位点的突变，并且至少其中四个突变位点为239位为Met、377位为Met、380位为Met和420位为Ser；在又一实施方案中，所述突变体为如下表中M129、M130、M131、M132、M133、M134、M135、M136、M137、M138、M139、M140、M141、M142、M143、M144中任一种：
根据本发明的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位中任意六个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含上述六个位点的突变，并且至少其中五个突变位点为239位为Met、334位为Lys、377位为Met、380位为Met和420位为Ser；在又一实施方案中，所述突变体为如下表中M145、M146、M147、M148、M149、M150、M151、M152、M153、M154、M155、M156、M157、M158、M159中任一种：
在第二方面，本发明提供一种编码第一方面所述的糖原分支酶突变体的多核苷酸。
在第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含本发明第二方面所述的多核苷酸。
在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述的表达载体或者其基因组中整合有本发明第二方面所述的糖原分支酶突变体的多核苷酸。
在优选的实施方式中，所述宿主细胞是细菌；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；最优选地，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在第五方面，本发明提供一种催化合成高支化淀粉和抗性淀粉的方法，所述方法包括：以直链淀粉和/或支链淀粉为底物，将本发明第一方面所述的糖原分支酶突变体或者本发明第四方面所述的宿主细胞用于制备高支化淀粉和抗性淀粉。
在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的糖原分支酶突变体或者本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞在制备高支化淀粉和抗性淀粉中的应用。
本发明的有益效果：
本发明得到一系列催化活性显著提高的糖原分支酶突变体，在60℃下对直链淀粉和支链淀粉的催化效率较野生型提高了2-5倍。应用该酶突变体能够高效的制备高支化淀粉和抗性淀粉，高支化淀粉中α-1,6糖苷键含量达到10-18％，抗性淀粉含量达到30-50％。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
定义与说明：
慢消化淀粉是指模拟胃肠道内环境中，依据淀粉被α-淀粉酶水解的时间分类，在20-120min水解的淀粉。
抗性淀粉是指模拟胃肠道内环境中，加入淀粉酶120min后仍不能被降解为葡萄糖的淀粉。
糖原分支酶(EC 2.4.1.18)是一种能够在淀粉链上引入α-1,6糖苷键的酶，广泛存在于微生物和动物中，是糖原合成过程中的关键酶之一。糖原分支酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷键的断裂并通过转苷活性在受体分子上以α-1,6糖苷键连接新的分支，最终形成高支化淀粉。
本领域技术人员知晓，如果要对某种酶进行突变，以便获得活性改善的突变体，关键之处在于发现突变后可以改善活性的位点。在本发明中，对氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型糖原分支酶的特定位点进行突变，得到了活性显著提高的糖原分支酶突变体。
在具体的实施方式中，本发明人在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的以下一个或多个位点进行突变得到的糖原分支酶可以显著提高高支化淀粉和抗性淀粉的含量：187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、463位。
在本文中，所用的术语“糖原分支酶”或“本发明的糖原分支酶”或“本发明的糖原分支酶突变体”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均是指从氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型糖原分支酶出发，在上述一个或多个位点进行突变得到的具有以直链淀粉和支链淀粉为底物制备高支化淀粉和抗性淀粉并且高支化淀粉中α-1,6糖苷键含量及抗性淀粉含量显著提高的糖原分支酶。
鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白“本发明的糖原分支酶”还应包括其变异形式，所述变异形式具有与“本发明的糖原分支酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与本发明实施例中的糖原分支酶的氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-10个，更佳地1-6个，再佳地1-3个、最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为30个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个或3个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的6-His标签通常不会改变所得蛋白质的功能。
本领域技术人员还应理解，本文所述的“本发明的糖原分支酶”的变异形式并不包括经过突变回复成野生型糖原分支酶的情况；换言之，本发明的糖原分支酶的变异形式是在本发明实施例所得的糖原分支酶的基础上作进一步突变得到的，但对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的187位、239位、243位、334位、344位、377位、380位、385位、420位、421位、428位、429位、431位、436位、和/或463位的氨基酸残基与本发明实施例所得的糖原分支酶的氨基酸序列中的相同。
本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，如果在本发明实施例所得的糖原分支酶的氨基酸序列的一端加上6-His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的187位就可能是第193位。
在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是95％以上，优选95％-98％，最优选99％以上。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“本发明的糖原分支酶”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“本发明的糖原分支酶”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“本发明的糖原分支酶”的活性片段。通常，该片段具有“本发明的糖原分支酶”的氨基酸序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还提供“糖原分支酶”的类似物。这些类似物与天然“本发明的糖原分支酶”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化，修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
在本发明中，“糖原分支酶”的保守性变异多肽指与本发明实施例中的糖原分支酶的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，但所述保守性变异多肽依然具有与本发明实施例中的糖原分支酶相同或相似的活性，即以直链淀粉和支链淀粉为底物制备高支化淀粉和抗性淀粉并且高支化淀粉中α-1,6糖苷键含量及抗性淀粉含量显著提高。
在本发明中，氨基酸的缩写如下表所示：
鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，如下示例性所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体：可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
有鉴于此，在具体的实施方式中，本发明的糖原分支酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点具有以下所示的氨基酸残基：
187位:Met、Cys；
239位:Gly、Met；
243位:Met、Thr、Asp；
334位:Lys；
344位:Arg；
377位:Asp、Trp、Met；
380位:Asp、Trp、Met；
385位：Asn、Glu、Cys；
420位：Ser、Val、Leu；
421位：Phe；
428位：Tyr、Glu、Asp；
429位：Met、Thr、Asn；
431位：Trp；
436位：Arg、Gln、Met；
463位：Met、Cys。
在优选的实施方式中，本发明的糖原分支酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点具有以下所示的氨基酸残基：在239位为Gly，或者在243位位Thr，或者在377位为Met，或者在380位为Asp，或者在385位为Glu，或者在420位为Ser，或者在421位为Phe，或者在429位为Asn，或者在431位为Trp，或者在463位Met。
本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本领域技术人员明白，本发明的“糖原分支酶”还包括“糖原分支酶”的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“糖原分支酶”相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
鉴于本领域现有技术和本发明的教导，本领域技术人员不难获得本发明糖原分支酶的活性片段。例如，在本文中，“糖原分支酶”的生物活性片段是指“糖原分支酶”的片段，但其仍然能保持全长“糖原分支酶”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“糖原分支酶”的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“糖原分支酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还可以明白，可以将本发明的糖原分支酶制成固定化酶等其它利用形式。
在本发明的糖原分支酶的基础上，本发明还提供了编码本发明“糖原分支酶”的多核苷酸序列或其简并的变异体。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码本发明实施例中的糖原分支酶的核苷酸序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码本发明权利要求中的糖原分支酶，但与本发明实施例中的糖原分支酶的编码核苷酸序列有差别的核酸序列。
本发明中，“糖原分支酶”的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体或基因组。
术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员可采用熟知的方法能用于构建含“糖原分支酶”编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本文所述的宿主细胞包括包含上述表达载体或基因组上整合了本发明“糖原分支酶”的编码序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞或菌株能够高效表达具有高催化性能的新型糖原分支酶，从而提高高支化淀粉中α-1,6糖苷键含量及抗性淀粉含量。
本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。在具体的实施方式中，所述菌株包括但不限于：大肠杆菌(E.Coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在优选的实施方式中，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 1A751)。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在上面的方法中的重组多肽可以组成型表达或条件表达，例如当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高压匀浆、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员会理解，本发明的糖原分支酶及其编码序列、表达载体、宿主细胞可用于制备高支化淀粉和抗性淀粉。
在此基础上，本发明还提供了利用本发明的糖原分支酶、表达载体或宿主细胞以直链淀粉和支链淀粉为底物，制备高支化淀粉和抗性淀粉的方法。例如，在具体的实施方式中，可通过培养包含本发明表达载体或其基因组上整合有本发明的糖原分支酶的编码序列的宿主细胞或者利用本发明的糖原分支酶以直链淀粉和支链淀粉为底物，制备高支化淀粉和抗性淀粉。
本文所用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本文所用的“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
本文所用的“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
本文所用的选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
本文所用的术语“野生型的”、“天然存在的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文所用的术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
本文所用的术语“自然状态”是指微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1：大肠杆菌原核表达体系的构建
1.基因合成糖原分支酶(RpGBE)(苏州金唯智生物科技有限公司)，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并重组到pUC57载体上。
2.以上述合成的基因为模板，设计引物P1和P2进行PCR扩增，并回收PCR扩增产物，引物序列如下所示。
P1：CCATATGTCATGGCTTACAGAAGAAGATATTCGC
P2：CGGATCCTCATGATTCAGGTTCAAGAATAAGAAT
3.将步骤2中得到的PCR产物，采用限制性内切酶NdeI和BamHI进行双酶切，并回收酶切产物。
4.利用限制性内切酶NdeI和BamHI对pET28a进行双酶切，切胶回收酶切产物。
5.将步骤3和步骤4中的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，并将产物转化E.coliDH5α。
6.通过菌落PCR筛选和测序验证后，获得阳性重组质粒pET28a-RpGBE。
7.将阳性质粒pET28a-RpGBE转化E.coli BL21(DE3)，得到原核表达菌株E.coliBL21 pET28a-RpGBE，作为后续定向进化原代菌株。
实施例2.糖原分支酶的表达及活性评价
1.原代菌E.coli BL21 pET28a-RpGBE及其突变体接种于5mL LB培养基中，37℃过夜培养，获得活化的种子液，将种子液以1％接种量转接至LB培养基中，至OD600＝0.6-0.8，添加0.01mM IPTG进行诱导表达，离心收集菌体，用10mM PB(pH 7.0)缓冲液对菌体进行悬浮，并用高压均质机进行破碎，20000g离心20min获得上清，采用Ni柱亲和层析的方法进行纯化，并进一步用30kDa超滤管进行脱盐浓缩，获得纯化的野生型和突变体蛋白。
2.糖原分支酶酶活测定体系如下：1.25mg/mL直链或支链土豆淀粉，10mM PB缓冲液(pH7.0)，0.5μg/mL纯化蛋白(野生型/突变体)，60℃反应10min，反应结束后立即置于沸水中10min终止反应，利用碘量法进行测定0min和10min吸光度。酶活的定义：1min吸光度降低0.01所需的酶量为1U。
实施例3.活性提高定点饱和突变体库的构建
1.以重组质粒pET28a-RpGBE为模板，以带有突变位点的一对引物，用高保真酶进行全质粒PCR扩增，获得指定突变位点的重组质粒。扩增产物用DpnI限制性内切酶在37℃下反应2h，降解初始模板。将消化产物转化至E.coli BL21，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养，每个位点筛选100个克隆。
2.将获得的100个克隆在96孔板中进行培养，通过实施例2所示的酶活测定筛选出阳性克隆，并对突变体进行测序，获得对应位置的突变体氨基酸种类。活性提高的突变位点及相对活性如表1所示，野生型相对活性为1。
表1活性提高的突变体的突变位点及相对活性
/>
注：表中“WT”表示野生型，“M1,M2……M34”表示突变体,
本发明提供了能够提升糖原分支酶活性的突变位点和/或突变体，经筛选发现，位点239、243、377、380、385、420、421、429、431、463突变之后对酶催化活性的影响较大。突变体M3、M6、M12、M13、M17、M19、M22、M28、M29、M33相对活性为野生型的1.5、1.5、1.8、1.7、1.7、1.8、1.6、1.7、1.8、1.6、1.5倍。
实施例4.活性提高位点的组合突变
将上述相对活性显著提高的突变体M12(377位)和M19(420位)分别与其他在单点饱和突变中相对活性提升的位点进行逐轮组合突变，并测定活性，计算相较于野生型提升的倍数。表2中列举出相对活性提高显著的组合突变体的活性及突变情况，野生型活性为1。活性测定方法如实施例2中所述一致。
表2催化活性提高的组合突变体
/>
/>
/>
注：表中“WT”表示野生型，“M1,M2……M34”表示突变体。
本发明提供了能够提升糖原分支酶催化活性的组合突变位点和/或突变体，经筛选发现选自187、239、243、334、344、377、380、385、420、421、428、429、431、436、463中的一个或多个位置上的突变位点和/或突变体的组合，其中，如表2中所示，上述组合最佳糖原分支酶突变体催化活性达到野生型的5倍。
实施例5糖原分支酶的高效表达和制备
将上述获得的单点和/或多点组合的突变体基因进行PCR扩增，构建到pWB980质粒中，然后在枯草芽孢杆菌(B.subtilis 1A751)中进行高密度发酵表达。具体方法如下：
1.将上述获得的单点和/或多点组合的突变体基因进行PCR扩增，设计两对引物P3/P4和P5/P6，其序列如下所示：
P3:GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGTCATGGCTTACAGAAGAAGATA
P4:TTGATGTTCATGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGTGATTCAGGTTCAAGAATAAG
P5:TATCTTCTTCTGTAAGCCATGACATCGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTAC
P6:CTTATTCTTGAACCTGAATCACATCATCATCATCATCATTGAGGATCCATGAACATCAA
利用P3/P4引物以上述获得的单点和/或多点组合的突变体基因为模板对突变体进行基因扩增；利用P5/P6引物以pWB980质粒为模板对pWB980载体进行扩增；将上述获得的PCR产物利用DpnI在37℃下处理2h，降解PCR模板，将DpnI处理的基因片和载体片段利用PCR进行连接，获得基因和载体的融合片段，将融合片段转化枯草芽孢杆菌，挑选阳性克隆，并测序验证，此获得的B.subtilis pWB980-RpGBE(野生型或突变体)为发酵菌株。
2.将上述获得的发酵菌株在发酵罐中以连续添加碳源的发酵方法，对野生型或突变体进行高效表达，糖原分支酶产量达到1g/L–2g/L。
实施例6利用糖原分支酶突变体以淀粉为底物制备高支化淀粉
将上述获得的野生型、单点或组合的突变体以土豆淀粉、玉米淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉为底物制备高支化淀粉，制备方法如下：
1.分别将5g土豆淀粉、玉米淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉悬浮在50mL5mMPB缓冲液(pH7.0)，沸水中水浴30min，放在60℃水浴中保温，此目的是将淀粉进行液化并达到反应温度要求。
2.将上述糖原分支酶野生型或突变体以500U-2000U/g底物的量与液化的淀粉进行混合在60℃下，搅拌反应12小时，加热煮沸10min终止反应，得到反应液。利用核磁共振(NMR)的方法检测高支化淀粉中α-1,6糖苷键的含量，检测结果如表3所示。
由表3可知，上述糖原分支酶野生型和突变型都能催化土豆淀粉、玉米淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉合成高支化淀粉，对照组为未经糖原分支酶处理的淀粉，高支化淀粉中α-1,6糖苷键含量都在10％以上。
表3高支化淀粉中α-1,6糖苷键含量
| 土豆淀粉 | 玉米淀粉 | 大米淀粉 | 木薯淀粉 | 小麦淀粉 | |
| 对照组 | 2.4％ | 3.3％ | 3.7％ | 2.9％ | 3.6％ |
| 野生型 | 10.2％ | 10.6％ | 9.8％ | 10.7％ | 10.1％ |
| M6 | 11.8％ | 12.1％ | 11.6％ | 12.3％ | 11.7％ |
| M40 | 12.2％ | 13.4％ | 12.9％ | 12.6％ | 12.1％ |
| M99 | 13.4％ | 13.8％ | 13.2％ | 12.9％ | 12.7％ |
| M146 | 14.1％ | 14.8％ | 13.6％ | 13.2％ | 12.8％ |
| M156 | 14.2％ | 14.6％ | 13.8％ | 12.9％ | 12.8％ |
实施例7利用糖原分支酶突变体以淀粉为底物制备抗消化淀粉
将上述获得的野生型、单点或组合的突变体以土豆淀粉、玉米淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉为底物进行制备抗消化淀粉，制备方法如下：
1.分别将5g土豆淀粉、玉米淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉悬浮在50mL5mMPB缓冲液(pH7.0)，沸水中水浴30min，放在60℃水浴中保温，此目的是将淀粉进行液化并达到反应温度要求。
2.将上述糖原分支酶野生型或突变体以500U-2000U/g底物的量与液化的淀粉进行混合，以不加酶的为对照，在60℃下，搅拌反应12小时，加热煮沸10min终止反应，得到反应液。检测反应液中慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)的含量，检测结果如表4所示。
3.慢消化淀粉和抗性淀粉含量的测定方法：20g/L的糖原分支酶修饰的淀粉同时用α淀粉酶(1600U/g底物)和淀粉葡萄糖苷酶(120U/g底物)在37℃下进行水解，分别在20min和120min时利用GOD-POD试剂盒检测溶液中游离的葡萄糖含量，根据葡萄糖含量计算慢消化淀粉和抗性淀粉含量，计算方法如下：
RDS％＝(G20-G0)×0.9×100；
SDS％＝(G120-G20)×0.9×100；
RS％＝100％-RDS％-SDS％；
其中RDS为快消化淀粉；SDS为慢消化淀粉；RS为抗消化淀粉；G0为水解0min时溶液中游离葡萄糖与总底物的质量比；G20为水解20min时溶液中游离葡萄糖与总底物质量比；G120为水解120min时溶液中游离葡萄糖浓度与总底物质量比。
由表4可知，上述糖原分支酶野生型和突变型都能有效提高土豆淀粉、玉米淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉中抗消化淀粉的含量，其中对木薯淀粉中抗性淀粉含量达到46％，具有极大的工业应用前景。
表4高支化淀粉中抗性淀粉含量
/>
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 620
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp Ile Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr
1 5 10 15
Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Glu Glu Gly
20 25 30
Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Ala Val Ser Val Leu
35 40 45
Gly Ala Phe Asn Asn Trp Asp Pro Glu Ala His Gln Leu Glu Arg Tyr
50 55 60
Gly Ala Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Leu Pro Gly His
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Tyr Arg Ile Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr
85 90 95
Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu
100 105 110
Gly Leu Ala Ser Ile Ile Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Trp His Asp Asp
115 120 125
Ala Trp Met Gln Arg Arg Lys Gly Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val
130 135 140
Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg His Lys Gln Pro Gly
145 150 155 160
Val Ser Phe Ser Tyr Arg Glu Ile Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val
165 170 175
Gln Asp Leu Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Ile Met Glu His
180 185 190
Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro
195 200 205
Thr Phe Arg Tyr Gly Thr Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr
210 215 220
Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His
225 230 235 240
Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Tyr Phe Asp Gly Thr Thr Leu
245 250 255
Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Arg Met Arg His His Pro Asp Trp Gly Thr
260 265 270
Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser
275 280 285
Asn Ala Leu Phe Trp Leu Asp Tyr Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val
290 295 300
Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp
305 310 315 320
Thr Pro Asn Ile Phe Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Phe
325 330 335
Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Ile
340 345 350
Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr
355 360 365
Tyr Asn Asn Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met
370 375 380
His Asp Thr Leu Asp Tyr Met Arg Arg Asp Pro Val His Arg Lys Tyr
385 390 395 400
His His Asp Thr Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu His
405 410 415
Tyr Ile Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Gly Ser
420 425 430
Leu Trp Thr Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu
435 440 445
Arg Leu Leu Tyr Gly His Met Trp Gly His Pro Gly Lys Lys Leu Leu
450 455 460
Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln His His Glu Trp Asn His Asp Thr
465 470 475 480
Gln Leu Glu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Gly Ile Gln
485 490 495
Ala Trp Val Arg Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Thr His Pro Ala Leu
500 505 510
Trp His Asp Gly Pro Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Phe Asn Asp Arg
515 520 525
Asp Gln Ser Val Ile Cys Tyr Leu Arg Lys His Thr Asp Arg Leu Leu
530 535 540
Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val
545 550 555 560
Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp Arg Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
565 570 575
Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala
580 585 590
Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu
595 600 605
Pro Pro Leu Ala Ile Leu Ile Leu Glu Pro Glu Ser
610 615 620
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatatgtca tggcttacag aagaagatat tcgc 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggatcctca tgattcaggt tcaagaataa gaat 34
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtacataaaa aaggagacat gaacgatgtc atggcttaca gaagaagata 50
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgatgttca tggatcctca atgatgatga tgatgatgtg attcaggttc aagaataag 59
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatcttcttc tgtaagccat gacatcgttc atgtctcctt ttttatgtac 50
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttattcttg aacctgaatc acatcatcat catcatcatt gaggatccat gaacatcaa 59
Claims (13)
1.一种糖原分支酶突变体，其特征在于，所述糖原分支酶突变体由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，在第377位氨基酸突变为Met。
2.一种糖原分支酶突变体，其特征在于，所述糖原分支酶突变体由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，为如下表中M35、M40、M44、M46、M54、M60中任一种：
3.一种糖原分支酶突变体，其特征在于，所述糖原分支酶突变体由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，为如下表中M90、M91、M93、M95、M97、M98、M99、M102、M104、M106、M107、M108、M109中任一种：
4.一种糖原分支酶突变体，其特征在于，所述糖原分支酶突变体由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，为如下表中M111、M112、M113、M114、M115、M116、M117、M118、M120、M121、M122、M123、M124、M125、M126、M127、M128中任一种：
5.一种糖原分支酶突变体，其特征在于，所述糖原分支酶突变体由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，为如下表中M129、M130、M131、M132、M133、M134、M135、M136、M137、M138、M139、M140、M141、M142、M143、M144中任一种：
6.一种糖原分支酶突变体，其特征在于，所述糖原分支酶突变体由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，为如下表中M145、M146、M147、M148、M149、M150、M151、M152、M153、M154、M155、M156、M157、M158、M159中任一种：
7.一种编码权利要求1-6任一项所述的糖原分支酶突变体的多核苷酸。
8.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求8所述的表达载体或者其基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，所述宿主细胞是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、或枯草芽孢杆菌。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
12.一种催化合成高支化淀粉和抗性淀粉的方法，其特征在于，所述方法包括：以直链淀粉和/或支链淀粉为底物，将权利要求1-6任一项所述的糖原分支酶突变体或者权利要求9-11任一项所述的宿主细胞用于制备高支化淀粉和抗性淀粉。
13.权利要求1-6任一项所述的糖原分支酶突变体或者权利要求8所述的表达载体或者权利要求9-11任一项所述的宿主细胞在制备高支化淀粉和抗性淀粉中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210226587.2A CN114574459B (zh) | 2022-03-09 | 2022-03-09 | 一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210226587.2A CN114574459B (zh) | 2022-03-09 | 2022-03-09 | 一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114574459A CN114574459A (zh) | 2022-06-03 |
| CN114574459B true CN114574459B (zh) | 2024-04-16 |
Family
ID=81779408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210226587.2A Active CN114574459B (zh) | 2022-03-09 | 2022-03-09 | 一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114574459B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104884614A (zh) * | 2012-12-21 | 2015-09-02 | 丹尼斯科美国公司 | α-淀粉酶变体 |
| CN110684751A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-01-14 | 江南大学 | 一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体 |
| CN112391365A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-23 | 江南大学 | 一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用 |
| KR102288395B1 (ko) * | 2021-01-15 | 2021-08-10 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 1,4-알파-글루칸-분지 효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 |
-
2022
- 2022-03-09 CN CN202210226587.2A patent/CN114574459B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104884614A (zh) * | 2012-12-21 | 2015-09-02 | 丹尼斯科美国公司 | α-淀粉酶变体 |
| CN110684751A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-01-14 | 江南大学 | 一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体 |
| CN112391365A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-23 | 江南大学 | 一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用 |
| KR102288395B1 (ko) * | 2021-01-15 | 2021-08-10 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 1,4-알파-글루칸-분지 효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| genbank.1,4-alpha-glucan branching protein GlgB [Rhodothermus profundi]，NCBI Reference Sequence: WP_072713944.1.《genbank》.2019,第1页. * |
| Xiaofeng Ban et al..Bacterial 1,4-α-glucan branching enzymes: characteristics, preparation and commercial applications.《CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY》.2020,第1-18页. * |
| Yiting Liu et al..Met349 Mutations Enhance the Activity of 1,4-α-Glucan Branching Enzyme from Geobacillus thermoglucosidans STB02.《J. Agric. Food Chem.》.2017,第65卷第5674-5680页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114574459A (zh) | 2022-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102016033B (zh) | β-淀粉酶、编码其的基因和其制造方法 | |
| CN104388411B (zh) | 一种琼胶酶及其基因和应用 | |
| CN112852782A (zh) | 一种低温适应性改良的低温外切菊粉酶突变体MutDL121EK5及应用 | |
| CN113151211B (zh) | 一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用 | |
| CN111394292A (zh) | 一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN105713883B (zh) | 一种l-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用 | |
| CN109182304B (zh) | 一种α-淀粉酶基因及其应用 | |
| CN114395541B (zh) | 一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOx1-MUT、其编码基因和应用 | |
| CN113234699A (zh) | α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用 | |
| CN106801046B (zh) | 热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用 | |
| CN113462678B (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶突变体 | |
| CN114507658A (zh) | 酶共表达系统及其在合成唾液酸的应用 | |
| CN113046337B (zh) | 一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用 | |
| CN114574459B (zh) | 一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用 | |
| CN111944790B (zh) | 中性蛋白酶基因、中性蛋白酶及其制备方法和应用 | |
| EP3824072A1 (en) | Materials and methods for creating strains of saccharomyces cerevisiae that exhibit an increased ability to ferment oligosaccharides | |
| CN114349831B (zh) | aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法 | |
| CN113647591B (zh) | 蜂王浆酶解物及其制备方法与应用 | |
| CN116478973A (zh) | 梅片树倍半萜合酶CbTPS6及其相关生物材料与应用 | |
| CN109438563B (zh) | 一种烟草kup7蛋白及其编码基因与应用 | |
| KR102232837B1 (ko) | 글루코실글리세롤 생산 활성을 가지는 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 글루코실글리세롤 제조방법 | |
| CN113736762A (zh) | 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用 | |
| CN109207446A (zh) | 葡萄糖氧化酶突变体 | |
| US20100199385A1 (en) | Methods and materials for increasing starch biosynthesis in plants | |
| KR101722842B1 (ko) | 돌연변이 프롤린 라세미화 효소의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |