ES2713548T3 - Procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos - Google Patents

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Frederic Domergue
Astrid Meyer
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Abstract

Procedimiento para la producción de compuestos de fórmula general I**Fórmula** en organismos transgénicos excepto seres humanos y animales con un contenido de al menos el 1 % en peso de estos compuestos referido al contenido de lípidos total del organismo transgénico, caracterizado porque comprende las siguientes etapas de procedimiento: a) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico en el organismo, que codifica una actividad de delta-9- elongasa o de delta-6-desaturasa, y b) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-8- desaturasa o de delta-6-elongasa, y c) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-5- desaturasa, y d) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-5- elongasa, y e) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-4- desaturasa, y en el que se puede usar como sustrato al menos uno de los ésteres de ácidos grasos de CoA de delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa y en el que las variables y los sustituyentes en la fórmula I tienen el siguiente significado: R1 = hidroxilo, coenzima A (tioéster), liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingobase, o un resto de fórmula general II**Fórmula** R2 = hidrógeno, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol o alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado, R3 = hidrógeno, alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado, o R2 o R3, independientemente entre sí, un resto de fórmula general Ia:**Fórmula** n = 2, 3, 4, 5, 6 o 9, m = 2, 3, 4, 5 o 6 y p = 0 o 3.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados en organismos transgenicos
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados en un organismo introduciendo acidos nucleicos en el organismo que codifican polipeptidos con actividad de A5-elongasa y en el que se puede usar al menos uno de los esteres de acidos grasos de CoA de la delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa como sustrato. Ventajosamente, estas secuencias de acidos nucleicos, dado el caso junto con secuencias de acidos nucleicos adicionales que codifican polipeptidos de la biosmtesis del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos, pueden expresarse en el organismo. Son especialmente ventajosas secuencias de acidos nucleicos que codifican una actividad de A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa, A12-desaturasa y/o A6-elongasa. Estas desaturasas y elongasas proceden ventajosamente de Thalassiosira, Euglena u Ostreococcus. Ademas, la invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de aceites y/o triacilgliceridos con un elevado contenido de acidos grasos poliinsaturados de cadena larga.
La presente invencion se refiere ademas en una forma de realizacion preferida a un procedimiento para la produccion de acidos grasos w3 insaturados, asf como a un procedimiento para la produccion de trigliceridos con un elevado contenido de acidos grasos insaturados, especialmente de acidos grasos w3 con mas de tres dobles enlaces. La invencion se refiere a la produccion de un organismo transgenico, preferiblemente de una planta transgenica o de un microorganismo transgenico con elevado contenido de acidos grasos w3 insaturados, aceites o lfpidos con dobles enlaces en w3 debido a la expresion de las elongasas y desaturasas usadas en el procedimiento segun la invencion, ventajosamente junto con w3-desaturasas, por ejemplo, una w3-desaturasa de hongos de la familia Pythiaceae como el genero Phytophtora, por ejemplo, el genero y la especie Phytophtora infestans o una w3-desaturasa de algas como de la familia de Prasinophyceae, por ejemplo, el genero Ostreococcus, especialmente el genero y la especie Ostreococcus tauri o diatomeas como el genero Thalassiosira, especialmente el genero y la especie Thalassiosira pseudonana.
La invencion se refiere ademas a los organismos que contienen las secuencias de acidos nucleicos, vectores que contienen las secuencias de acidos nucleicos y/o las construcciones de acido nucleico, asf como organismos transgenicos que contienen las secuencias de acidos nucleicos, construcciones de acido nucleico y/o vectores previamente mencionados.
Tambien se describen aceites, lfpidos y/o acidos grasos producidos segun el procedimiento segun la invencion y su uso, asf como a trigliceridos con un elevado contenido de acidos grasos insaturados y su uso.
Los acidos grasos y los triacilgliceridos tienen multiples aplicaciones en la industria alimentaria, la nutricion animal, la cosmetica y en el sector farmaceutico. Dependiendo de si se trata de acidos grasos saturados e insaturados libres o de triacilgliceridos con un elevado contenido de acidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para aplicaciones muy distintas. Los acidos grasos poliinsaturados como el acido linoleico y linolenico son esenciales para los mairnferos, ya que no pueden ser producidos por ellos mismos. Por este motivo, los acidos grasos u>3 poliinsaturados y los acidos grasos w6 representan un constituyente importante de la nutricion animal y humana. Los acidos grasos u>3 poliinsaturados de cadena larga como el acido eicosapentaenoico (=EPA, C20:5A5’8’11’14’17) o el acido docosahexaenoico (=DHA, C22:6A4,10,13,1619) son componentes importantes de la nutricion humana debido a sus distintas funciones en la salud, que comprenden aspectos como el desarrollo del cerebro infantil, la funcionalidad del ojo, la smtesis de hormonas y otras sustancias senal, asf como la prevencion de trastornos cardiovasculares, y diabetes (Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA y Yeo YK Pharmacol Res 40:211-225, 1999). Por este motivo existe una necesidad de la produccion de acidos grasos poliinsaturados de cadena larga.
Debido a la composicion actualmente habitual de la nutricion humana, una adicion de acidos grasos u>3 poliinsaturados, que se encuentran preferiblemente en aceites de pescado, es especialmente importante para la nutricion. Asf, por ejemplo, los acidos grasos poliinsaturados como el acido docosahexaenoico (=DHA, C22:6A4,7,10,13,16,19) o el acido eicosapentaenoico (=EPA, C20:5A58,11,14,17) se anaden a los alimentos infantiles para elevar el valor nutricional. A este respecto, al acido graso insaturado DHA se le atribuye un afecto positivo sobre el desarrollo y el mantenimiento de las funciones cerebrales.
A continuacion, los acidos grasos poliinsaturados se designan PUFA o LCPUFA (poly unsaturated fatty acids, PUFA, acidos grasos poliinsaturados; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, acidos grasos poliinsaturados de cadena larga).
Los distintos acidos grasos y trigliceridos se obtienen principalmente de microorganismos como Mortierella o Schizochytrium o a partir de plantas productoras de aceite como soja, colza, algas como Crypthecodinium o Phaeodactylum y otras, obteniendose generalmente en forma de sus triacilgliceridos (=trigliceridos =trigliceroles). Pero tambien pueden obtenerse de animales como, por ejemplo, peces. Los acidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante saponificacion. Los acidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga como DHA, EPA, acido araquidonico (=ARA, C20:4A58,11,14), acido dihomo-Y-linolenico (C20:3A81114) o acido docosapentaenoico (DPA, C22:5A7,10,13,1619) no se sintetizan en plantas oleaginosas como colza, soja, girasol, cartamo. Fuentes naturales habituales para estos acidos grasos son peces como arenque, salmon, sardina, gallineta nordica, anguila, carpa, trucha, rodaballo, caballa, lucioperca o atun o algas.
Dependiendo del fin de aplicacion, se prefieren aceites con acidos grasos saturados o insaturados. As^ por ejemplo, en la nutricion humana se prefieren los lfpidos con acidos grasos insaturados, especialmente acidos grasos poliinsaturados. A este respecto, a los acidos grasos w3 poliinsaturados se les atribuye un efecto positivo sobre el nivel de colesterol en sangre y, por tanto, sobre la posibilidad de la prevencion de una enfermedad cardfaca. Mediante la adicion de estos acidos grasos w3 al alimento puede reducirse claramente el riesgo de una enfermedad cardfaca, de un ataque de apoplejfa o de hipertension. Tambien pueden influirse positivamente por los acidos grasos w3 procesos inflamatorios, especialmente cronicamente inflamatorios, en el marco de las enfermedades inmunologicas como artritis reumatoide. Por este motivo se anaden a los alimentos, especialmente a alimentos dieteticos, o se usan en medicamentos. Los acidos grasos u>6 como el acido araquidonico tienen mas bien un efecto negativo sobre estas enfermedades en el caso de estas enfermedades reumaticas debido a nuestra composicion alimenticia habitual.
Los acidos grasos u>3 y w6 son precursores de hormonas tisulares, los llamados eicosanoides, como las prostaglandinas, que se derivan del acido dihomo-Y-linolenico, del acido araquidonico y del acido eicosapentaenoico, los tromboxanos y los leucotrienos, que se derivan del acido araquidonico y el acido eicosapentaenoico. Los eicosanoides (conocidos como la serie PG2), que se forman a partir de acidos grasos u>6, generalmente promueven reacciones inflamatorias, mientras que los eicosanoides (conocidos como la serie PG3) de acidos grasos w3 tienen poca o ninguna accion promotora de la inflamacion.
Debido a sus propiedades positivas, en el pasado no han faltado intentos por poner a disposicion genes que participan en la smtesis de acidos grasos o trigliceridos para la produccion de aceites en distintos organismos con contenido modificado de acidos grasos insaturados. Asf, en el documento WO 91/13972 y su equivalente de EE.UU. se describe una A9-desaturasa. En el documento WO 93/11245 se reivindica una A15-desaturasa, en el documento WO 94/11516 una A12-desaturasa. Desaturasas adicionales se describen, por ejemplo, en los documentos EP-A-0 550162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0794250, Stukey y col., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada y col., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang y col., Lipids 34, 1999: 649-659. Sin, embargo, hasta la fecha, la caracterizacion bioqmmica de las distintas desaturasas solo se ha realizado insuficientemente, ya que las enzimas, como las protemas unidas a la membrana, son muy diffciles de aislar y de caracterizar (McKeon y col., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang y col., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). Generalmente, la caracterizacion de desaturasas unidas a la membrana se realiza mediante la introduccion en un organismo adecuado, que a continuacion se analiza para la actividad enzimatica mediante el analisis de productos de partida y de productos. Las A6-desaturasas se describen en los documentos WO 93/06712, US 5.614.393, US 5614393, WO 96/21022, WO 00/21557 y WO 99/27111, y tambien se describe la aplicacion para la produccion en organismos transgenicos como en los documentos WO 98/46763, WO 98/46764, WO 9846765. A este respecto tambien se describe y reivindica la expresion de distintas desaturasas, como en los documentos WO 99/64616 o WO 98/46776, y la formacion de acidos grasos poliinsaturados. Con relacion a la efectividad de la expresion de desaturasas y su influencia sobre la formacion de acidos grasos poliinsaturados, debe anadirse que mediante la expresion de una desaturasa individual como se ha descrito anteriormente solo se consiguieron bajos contenidos de acidos grasos insaturados/lfpidos como, por ejemplo, acido Y-linolenico y acido estearidonico. Ademas, generalmente se obtuvo una mezcla de acidos grasos w3 y w6.
Microorganismos especialmente adecuados para la produccion de PUFA son microorganismos como microalgas como Phaeodactylum tricornutum, especies de Porphiridium, especies de Thraustochytrium, especies de Schizochytrium o especies de Crypthecodinium, ciliados, como Stylonychia o Colpidium, hongos, como Mortierella, Entomophthora o Mucor, y/o musgos como Physcomitrella, Ceratodon y Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto y col. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: 269-278). Mediante la seleccion de cepas se han desarrollado varias cepas mutantes de los microorganismos correspondientes que producen una serie de compuestos deseables, incluidos PUFA. La mutacion y seleccion de cepas con produccion mejorada de una molecula determinada como los acidos grasos poliinsaturados es, sin embargo, un procedimiento que requiere mucho tiempo y es diffcil. Por este motivo, siempre que sea posible, se prefieren procedimiento de tecnologfa genetica como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, con ayuda de los microorganismos previamente mencionados solo pueden producirse cantidades limitadas de los acidos grasos poliinsaturados deseados como DPA, EPA o ARA, obteniendose estos generalmente, dependiendo del microorganismo usado, como mezclas de acidos grasos de, por ejemplo, EPA, DPA y ARA.
Para la smtesis de acido araquidonico, acido eicosapentaenoico (EPA) y acido docosahexaenoico (DHA) se tratan distintas vfas de smtesis (Figura 1). Asf, la produccion de EPA o DHA se realiza en bacterias marinas como Vibrio sp. o Shewanella sp. segun la via del policetido (Yu, R. y col. Lipids 35:1061-1064, 2000; Takeyama, H. y col. Microbiology 143:2725-2731, 1997).
Una estrategia alternativa transcurre mediante la actividad variable de desaturasas y elongasas (Zank, T.K. y col. Plant Journal 31:255-268, 2002; Sakuradani, E. y col. Gene 238:445-453, 1999). Una modificacion de la via descrita mediante A6-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa, A4-desaturasa es la via de smtesis de Sprecher (Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta 1486:219-231) en mairnferos. En lugar de la desaturacion de A4, aqrn se realiza una etapa de alargamiento adicional a C24, una desaturacion de A6 adicional y por ultimo una poxidacion en la longitud de cadena C22. No obstante, para la produccion en plantas y microorganismos, la llamada v^a de Sprecher (vease la Figura 1) no es adecuada, ya que no se conocen los mecanismos de regulacion.
Los acidos grasos poliinsaturados pueden clasificarse correspondientemente a su patron de desaturacion en dos grandes clases, en acidos grasos w6 o w3, que tienen actividades metabolica y funcionalmente distintas (Figura 1). Como producto de partida para la via metabolica de u>6 sirve el acido graso acido linoleico (Ci82 *912), mientras que la v^ a de w3 transcurre mediante el acido linolenico (Ci83 a91215). A este respecto, el acido linolenico se forma mediante la actividad de una w3-desaturasa (Tocher y col. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117; Domergue y col. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113).
Los mairnferos y, por tanto tambien el hombre, no disponen de actividad de desaturasa correspondiente (A12- y w3-desaturasa) y deben asimilar estos acidos grasos (acidos grasos esenciales) mediante la alimentacion. Entonces, mediante la secuencia de reacciones de desaturasa y elongasa, a partir de estos precursores se sintetizan los acidos grasos poliinsaturados fisiologicamente importantes acido araquidonico (=ARA, C20:4a5’8’11’14), un acido graso w6 y los dos acidos grasos w3 acido eicosapentaenoico (=EPA, C20:5A5,811,14,17) y docosahexaenoico (=DHA, C22:684,7,10,13,17,19). La aplicacion de acidos grasos w3 muestra a este respecto la accion terapeutica que se ha descrito anteriormente en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet.
88, 100-108), inflamaciones (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345-358) y artritis (Cleland y James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307).
Desde el punto de vista de la fisiologfa de la nutricion, por este motivo es importante conseguir en la smtesis de acidos grasos poliinsaturados un desplazamiento entre la via de smtesis de w6 y la via de smtesis de w3 (vease la Figura 1), de manera que se produzcan mas acidos grasos w3. En la bibliograffa se describieron actividades enzimaticas de distintas w3-desaturasas que desaturan acidos grasos C182 , C224 o C225 (vease la Figura 1). Sin embargo, ninguna de las desaturasas bioqmmicamente descritas convierte un amplio espectro de sustratos de la via de smtesis de w6 en los acidos grasos correspondientes de la via de smtesis de w3.
Por tanto, existe ademas una gran necesidad de una w3-desaturasa que sea adecuada para la produccion de acidos grasos u>3 poliinsaturados. Todas las w3-desaturasas vegetales y cianobacterianas conocidas desaturan acidos grasos C18 con acido linoleico como sustrato, pero ninguna puede desaturar acidos grasos C20 o C22.
Del hongo Saprolegnia dicilina se conoce una w3-desaturasa [Pereira y col. 2004, Biochem. J. 378(Pt 2):665-71] que puede desaturar acidos grasos C20 poliinsaturados. Sin embargo, es ventajoso que esta w3-desaturasa no pueda desaturar PUFA C18 o C22, como los importantes acidos grasos los acidos grasos C182 , C224 o C225 de la via de smtesis de w6. Otra desventaja de esta enzima es que no puede desaturar acidos grasos que esten unidos a fosfolfpidos. Solo se convierten los esteres de acidos grasos de CoA.
El alargamiento de los acidos grasos mediante elongasas en 2 o 4 atomos de C es de importancia crucial para la produccion de PUFA C20 o C22. Este proceso transcurre mediante 4 etapas. La primera etapa es la condensacion de malonil-CoA al acido graso-acil-CoA mediante la cetoacil-CoA-sintasa (KCS, denominada a continuacion en el texto elongasa). Luego sigue una etapa de reduccion (cetoacil-CoA-reductasa, KCR), una etapa de deshidratacion (deshidratasa) y una etapa de reduccion final (enoil-CoA-reductasa). Se postulo que la actividad de la elongasa influye en la especificidad y velocidad del proceso completo (Millar y Kunst, 1997 Plant Journal 12:121-131).
En el pasado se realizaron numerosos experimentos para obtener genes de elongasa. Millar y Kunst, 1997 (Plant Journal 12:121-131) y Millar y col. 1999 (Plant Cell 11:825-838) describen la caracterizacion de elongasas vegetales para la smtesis de acidos grasos monoinsaturados de cadena larga (C221 ) o para la smtesis de acidos grasos de cadena muy larga para la formacion de cera en plantas (C28-C32). Descripciones de la smtesis de acido araquidonico y EPA se encuentran, por ejemplo, en los documentos WO 0159128, WO 0012720, WO 02077213 y WO 0208401. La smtesis de acidos grasos C24 poliinsaturados se describe, por ejemplo, en Tvrdik y col. 2000, JCB 149:707-717 o el documento WO 0244320.
Para la produccion de DHA (C226 n-3) en organismos que no producen naturalmente este acido graso, hasta la fecha no se ha descrito ninguna elongasa espedfica. Hasta la fecha solo se han descrito elongasas que proporcionan acidos grasos C20 o C24. Hasta la fecha todavfa no se ha descrito una actividad de A5-elongasa.
Las plantas superiores contienen acidos grasos poliinsaturados como acido linoleico (C182 ) y acido linolenico (C183 ). ARA, EPA y DHA no se encuentran en absoluto en el aceite de semillas de plantas superiores o solo en trazas (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Vegetales. Technique & Documentation - Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430­ 0009-0). Sin embargo, sena ventajoso producir LCPUFA en plantas superiores, preferiblemente en semillas oleaginosas como colza, lino, girasol y soja, ya que de esta manera pueden obtenerse de forma rentable grandes cantidades de LCPUFA cualitativamente de alta calidad para la industria alimentaria, la nutricion animal y para fines farmaceuticos. Para esto, mediante procedimientos de ingeniena genetica, genes que codifican enzimas de la biosmtesis de LCPUFA deben introducirse ventajosamente en semillas oleaginosas y expresarse. Estos son genes que codifican, por ejemplo, A6-desaturasas, A6-elongasas, A5-desaturasas o A4-desaturasas. Estos genes pueden aislarse ventajosamente de microorganismos y plantas inferiores que producen LCPUFA e incorporarse en las membranas o triacilgliceridos. Asf ya podnan aislarse genes de A6-desaturasa del musgo Physcomitrella patens y genes de A6-elongasa de P. patens y del nematodo C. elegans.
Las primeras plantas transgenicas que contienen y expresan genes que codifican enzimas de la biosmtesis de LCPUFA y producen LCPUFA se describieron por primera vez, por ejemplo, en el documento DE 102 19 203 (Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesattigter Fettsauren in Pflanzen). No obstante, estas plantas producen LCPUFA en cantidades que todav^a deben optimizarse para un procesamiento de los aceites contenidos en las plantas.
Para hacer posible un enriquecimiento del alimento y/o del pienso con estos acidos grasos poliinsaturados existe, por tanto, una gran necesidad de un procedimiento rentable y sencillo para la production de estos acidos grasos poliinsaturados, especialmente en sistemas eucariotas.
Por tanto, el objetivo ha consistido en poner a disposition genes o enzimas adicionales que sean adecuados para la smtesis de LCPUFA, especialmente genes, que presenten una actividad de A5-elongasa, A-5-desaturasa, A-4-desaturasa, A-12-desaturasa o A-6-desaturasa para la produccion de acidos grasos poliinsaturados. Otro objetivo de esta invention era proporcionar genes o enzimas que hicieran posible un desplazamiento de los acidos grasos w6 a los acidos grasos w3. Ademas, existio el objetivo de desarrollar un procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados en un organismo, ventajosamente en un organismo eucariota, preferiblemente en una planta o un microorganismo.
Este objetivo se alcanzo mediante el procedimiento segun la invencion para la produccion de compuestos de formula general I
Figure imgf000005_0001
en organismos transgenicos excepto seres humanos y animales con un contenido de al menos el 1 % en peso de estos compuestos referido al contenido de Kpidos total del organismo transgenico, caracterizado porque comprende las siguientes etapas de procedimiento:
a) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-9-elongasa o de delta-6-desaturasa, y
b) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-8-desaturasa o de delta-6-elongasa, y
c) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-5-desaturasa, y
d) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-5-elongasa, y
e) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-4-desaturasa, y
en el que se puede usar al menos uno de los esteres de acidos grasos de CoA de la delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa como sustrato y en el que las variables y los sustituyentes en la formula I tienen el siguiente significado:
R1 = hidroxilo, coenzima A (tioester), liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingobase, o un resto de formula general II
Figure imgf000005_0002
R2 = hidrogeno, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol o alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado,
R3 = hidrogeno, alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado, o R 2 o R3, independientemente entre si, un resto de formula general Ia:
Figure imgf000006_0001
n = 2, 3, 4, 5, 6 o 9, m = 2, 3, 4, 5 o 6 y p = 0 o 3.
En el presente documento tambien se describe un procedimiento para la produccion de compuestos de formula general I
Figure imgf000006_0002
en organismos transgenicos con un contenido de al menos el 1 % en peso de estos compuestos referido al contenido de Kpidos total del organismo transgenico, caracterizado porque comprende las siguientes etapas de procedimiento:
a) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de A-9-elongasa y/o de A-6-desaturasa, y
b) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de A-8-desaturasa y/o de A-6-elongasa, y
c) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de A-5-desaturasa, y
d) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de A-5-elongasa, y
e) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de A-4-desaturasa, y en el que las variables y los sustituyentes en la formula I tienen el siguiente significado:
R1 = hidroxilo, coenzima A (tioester), liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingobase, o un resto de formula general II
Figure imgf000006_0003
R2 = hidrogeno, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol o alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado,
R3 = hidrogeno, alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado, o R2 o R3, independientemente entre si, un resto de formula general la:
Figure imgf000006_0004
n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 9, m = 2, 3, 4, 5 o 6 y p = 0 o 3.
R1 significa en la formula general I hidroxilo, coenzima A (tioester), liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingobase, o un resto de formula general II
Figure imgf000006_0005
Los restos que se han mencionado anteriormente de R1 estan unidos siempre en forma de sus tioesteres a los compuestos de la formula general I.
R2 significa en la formula general II hidrogeno, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol o alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado.
Como restos alquilo son de mencionar cadenas de alquil C2-C24-carbonilo sustituidas o sin sustituir, saturadas o insaturadas, como etilcarbonilo, n-propilcarbonilo, n-butilcarbonilo, n-pentilcarbonilo, n-hexilcarbonilo, nheptilcarbonilo, n-octilcarbonilo, n-nonilcarbonilo, n-decilcarbonilo, n-undecilcarbonilo, n-dodecilcarbonilo, ntridecilcarbonilo, n-tetradecilcarbonilo, n-pentadecilcarbonilo, n-hexadecilcarbonilo, n-heptadecilcarbonilo, noctadecilcarbonilo, n-nonadecilcarbonilo, n-eicosilcarbonilo, n-docosanilcarbonilo o n-tetracosanilcarbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren restos alquil Cio-C22-carbonilo saturados o insaturados como ndecilcarbonilo, n-undecilcarbonilo, n-dodecilcarbonilo, n-tridecilcarbonilo, n-tetradecilcarbonilo, n-pentadecilcarbonilo, n-hexadecilcarbonilo, n-heptadecilcarbonilo, n-octadecilcarbonilo, n-nonadecilcarbonilo, n-eicosilcarbonilo, ndocosanilcarbonilo o n-tetracosanilcarbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren especialmente restos alquil Cio-C22-carbonilo saturados y/o insaturados como restos alquil Cio-carbonilo, alquil Cn-carbonilo, alquil Ci2-carbonilo, alquil Ci3-carbonilo, alquil Ci4-carbonilo, alquil Ci6-carbonilo, alquil Ci8-carbonilo, alquil C2o-carbonilo o alquil C22-carbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren muy especialmente restos alquil Cia-C22-carbonilo saturados o insaturados como restos alquil Cia-carbonilo, alquil Ci8-carbonilo, alquil C2o-carbonilo o alquil C22-carbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Estos restos ventajosos pueden contener dos, tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces. Los restos especialmente ventajosos con 2o o 22 atomos de carbono en la cadena de acido graso contienen hasta seis dobles enlaces, ventajosamente tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces, con especial preferencia cinco o seis dobles enlaces. Todos los restos mencionados se derivan de los acidos grasos correspondientes.
R3 significa en la formula general II hidrogeno, alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado.
Como restos alquilo son de mencionar cadenas de alquil C2-C24-carbonilo sustituidas o sin sustituir, saturadas o insaturadas, como etilcarbonilo, n-propilcarbonilo, n-butilcarbonilo, n-pentilcarbonilo, n-hexilcarbonilo, nheptilcarbonilo, n-octilcarbonilo, n-nonilcarbonilo, n-decilcarbonilo, n-undecilcarbonilo, n-dodecilcarbonilo, ntridecilcarbonilo, n-tetradecilcarbonilo, n-pentadecilcarbonilo, n-hexadecilcarbonilo, n-heptadecilcarbonilo, noctadecilcarbonilo, n-nonadecilcarbonilo, n-eicosilcarbonilo, n-docosanilcarbonilo o n-tetracosanilcarbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren restos alquil Cio-C22-carbonilo saturados o insaturados como ndecilcarbonilo, n-undecilcarbonilo, n-dodecilcarbonilo, n-tridecilcarbonilo, n-tetradecilcarbonilo, n-pentadecilcarbonilo, n-hexadecilcarbonilo, n-heptadecilcarbonilo, n-octadecilcarbonilo, n-nonadecilcarbonilo, n-eicosilcarbonilo, ndocosanilcarbonilo o n-tetracosanilcarbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren especialmente restos alquil Cio-C22-carbonilo saturados y/o insaturados como restos alquil Cio-carbonilo, alquil Cii-carbonilo, alquil Ci2-carbonilo, alquil Ci3-carbonilo, alquil Ci4-carbonilo, alquil Cia-carbonilo, alquil Ci8-carbonilo, alquil C2o-carbonilo o alquil C22-carbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren muy especialmente restos alquil Cia-C22-carbonilo saturados o insaturados como restos alquil Cia-carbonilo, alquil Ci8-carbonilo, alquil C2o-carbonilo o alquil C22-carbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Estos restos ventajosos pueden contener dos, tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces. Los restos especialmente ventajosos con 2o o 22 atomos de carbono en la cadena de acido graso contienen hasta seis dobles enlaces, ventajosamente tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces, con especial preferencia cinco o seis dobles enlaces. Todos los restos mencionados se derivan de los acidos grasos correspondientes.
Los restos anteriormente mencionados de R1, R2 y R3 pueden estar sustituidos con grupos hidroxilo y/o epoxi y/o pueden contener triples enlaces.
Los acidos grasos poliinsaturados producidos en el procedimiento segun la invencion contienen ventajosamente al menos dos, ventajosamente tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces. Los acidos grasos contienen especialmente ventajosamente cuatro, cinco o seis dobles enlaces. Los acidos grasos producidos en el procedimiento tienen ventajosamente 18, 2o o 22 atomos de C en la cadena de acido graso, los acidos grasos contienen preferiblemente 2o o 22 atomos de carbono en la cadena de acido graso. Ventajosamente, los acidos grasos saturados reaccionan poco o casi no reaccionan con los acidos nucleicos usados en el procedimiento. Por poco debe entenderse que, en comparacion con los acidos grasos poliinsaturados, los acidos grasos saturados reaccionan con menos del 5 % de actividad, ventajosamente menos del 3 %, especialmente ventajosamente con menos del 2 %, de manera muy especialmente preferida con menos del 1; o,5; o,25 o o,125%. Estos acidos grasos producidos pueden producirse como producto unico en el procedimiento o estar presentes en una mezcla de acidos grasos.
En el caso de las secuencias de acidos nucleicos usadas en el procedimiento segun la invencion se trata de secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A9-elongasa, Aa-desaturasa, A8-desaturasa, Aa-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o A4-desaturasa.
Ventajosamente, en el procedimiento segun la invencion se usan secuencias de acidos nucleicos que codifican polipeptidos con actividad de A9-elongasa, Aa-desaturasa, A8-desaturasa, Aa-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o A4-desaturasa, que se seleccionan del grupo constituido por:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183, o
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de las secuencias de aminoacidos representadas en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 184, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de identidad al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 184 y presentan una actividad de A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o de A4-desaturasa.
Los sustituyentes R2 o R3 en las formulas generales I y II significan ventajosamente, independientemente entre sf, alquil C18-C22-carbonilo saturado o insaturado, especialmente significan ventajosamente, independientemente entre sf, alquil C18-, C20- o C22-carbonilo insaturado con al menos dos dobles enlaces.
Una forma de realizacion preferida del procedimiento se caracteriza porque se introduce una secuencia de acido nucleico adicionalmente en el organismo, que codifica polipeptidos con actividad de w3-desaturasa, seleccionada del grupo constituido por:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 105, o b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 106, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 105, que codifican polipeptidos con al menos el 60 % de identidad al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 106 y presentan una actividad de u>3-desaturasa.
En otra forma de realizacion preferida, el procedimiento se caracteriza porque se introduce una secuencia de acido nucleico adicionalmente en el organismo, que codifica polipeptidos con actividad de A12-desaturasa, seleccionada del grupo constituido por:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 109, o b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 110, o c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 109, que codifican polipeptidos con al menos el 60 % de identidad al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 110 y presentan una actividad de A12-desaturasa.
Estas secuencias de A12-desaturasa previamente mencionadas pueden usarse solas o en combinacion con las secuencias de w3-desaturasa con las secuencias de acidos nucleicos usadas en el procedimiento que codifican A9-elongasas, A6-desaturasas, A8-desaturasas, A6-elongasas, A5-desaturasas, A5-elongasas y/o A4-desaturasas.
La Tabla 1 describe las secuencias de acidos nucleicos, el organismo de procedencia y el numero de ID de la secuencia.
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(continuacion)
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(continuacion)
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Los acidos grasos poliinsaturados producidos en el procedimiento estan ventajosamente unidos en Kpidos de membrana y/o triacilgliceridos, pero tambien pueden producirse en los organismos como acidos grasos libres o bien unidos en forma de otros esteres de acidos grasos. A este respecto pueden estar presentes como “productos puros” o bien ventajosamente en forma de mezclas de distintos acidos grasos o mezclas de diferentes gliceridos. Los distintos acidos grasos unidos en los triacilgliceridos pueden derivarse a este respecto de acidos grasos de cadena corta con 4 a 6 atomos de C, acidos grasos de cadena media con 8 a 12 atomos de C o acidos grasos de cadena larga con 14 a 24 atomos de C, se prefieren los acidos grasos de cadena larga, se prefieren especialmente los acidos grasos de cadena larga LCPUFA de acidos grasos C18, C20 y/o C22.
En el procedimiento segun la invencion, los esteres de acidos grasos se producen ventajosamente con moleculas de acidos grasos C18, C20 y/o C22 poliinsaturados con al menos dos dobles enlaces en el ester de acidos grasos, ventajosamente con al menos tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces en el ester de acidos grasos, especialmente ventajosamente de al menos cinco o seis dobles enlaces en el ester de acidos grasos y conducen ventajosamente a la smtesis de acido linoleico (=LA, C18:2*912), acido Y-linolenico (=GLA, C18:3a6912), acido estearidonico (=SDA, C m /6’9’12’15), acido dihomo-Y-linolenico (=DGLA, C20:3*81114), acido u>3-eicosatetraenoico (=ETA, C20:4a581114), acido araquidonico (=ARA, C20:4a5,81114), acido eicosapentaenoico (=EPA, C20:585,8,1114,17), acido w6-docosapentaenoico (C22:584,7,10,13,16), acido w6-docosatetraenoico (C22:48,7,10,1316), acido w3-docosapentaenoico (=DPA, C22:587,10,13,1619), acido docosahexaenoico (=DHA, C22:6M,7,10,1816,19) o sus mezclas, preferiblemente ARA, EPA y/o DHA. De manera muy especialmente preferida se preparan acidos grasos w3 como EPA y/o DHA.
Los esteres de acidos grasos con moleculas de acidos grasos C18, C20 y/o C22 poliinsaturados pueden aislarse de los organismos que se usaron para la produccion de los esteres de acidos grasos, en forma de un aceite o lfpido, por ejemplo, en forma de compuestos como esfingolfpidos, fosfogliceridos, lfpidos, glicolfpidos como glicoesfingolfpidos, fosfoifpidos como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol o difosfatidilglicerol, monoacilgliceridos, diacilgliceridos, triacilgliceridos u otros esteres de acidos grasos como los esteres de acetil-coenzima A, que contienen los acidos grasos poliinsaturados con al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis, preferiblemente cinco o seis, dobles enlaces, ventajosamente se afslan en forma de sus diacilgliceridos, triacilgliceridos y/o en forma de fosfatidilcolina, con especial preferencia en forma de los triacilgliceridos. Ademas de estos esteres, los acidos grasos poliinsaturados tambien estan contenidos en los organismos, ventajosamente las plantas, como acidos grasos libres o unidos en otros compuestos. Los distintos compuestos previamente mencionados (esteres de acidos grasos y acidos grasos libres) generalmente se encuentran en los organismos en una distribucion aproximada del 80 al 90 % en peso de trigliceridos, 2 al 5 % en peso de digliceridos, 5 al 10 % en peso de monogliceridos, 1 al 5 % en peso de acidos grasos libres, 2 al 8 % en peso de fosfolfpidos, completando la suma de los distintos compuestos el 100 % en peso.
En el procedimiento segun la invencion, los LCPUFA producidos con un contenido de al menos el 3 % en peso, ventajosamente de al menos el 5 % en peso, preferiblemente de al menos el 8 % en peso, con especial preferencia de al menos el 10 % en peso, de manera muy especialmente preferida de al menos el 15 % en peso referido a los acidos grasos totales en los organismos transgenicos, se producen ventajosamente en una planta transgenica. A este respecto se convierten ventajosamente acidos grasos C18 y/o C20, que estan presentes en los organismos huesped, a al menos el 10%, ventajosamente a al menos el 20%, especialmente ventajosamente a al menos el 30 %, muy especialmente ventajoso a al menos el 40 %, en los productos correspondientes como DPA o DHA, por mencionar solo dos a modo de ejemplo. Los acidos grasos se producen ventajosamente en forma unida. Con ayuda de los acidos nucleicos usados en el procedimiento segun la invencion, estos acidos grasos insaturados pueden estar en la posicion sn1, sn2 y/o sn3 de los trigliceridos ventajosamente producidos. Como los compuestos de partida acido linoleico (C182) o acido linolenico (C183) transcurren por varias etapas de reaccion en el procedimiento segun la invencion, los productos finales del procedimiento como, por ejemplo acido araquidonico (ARA), acido eicosapentaenoico (EPA), acido w6-docosapentaenoico o DHA, no se obtienen como productos puros absolutos, siempre estan tambien contenidas pequenas trazas de los precursores en el producto final. Si en el organismo de partida o en la planta de partida tambien estan presentes, por ejemplo, tanto acido linoleico como tambien acido linolenico, entonces los productos finales como ARA, EPA o DHA estan presentes como mezclas. Los precursores no deberan ascender ventajosamente a mas del 20 % en peso, preferiblemente a no mas del 15 % en peso, con especial preferencia a no mas del 10 % en peso, de manera muy especialmente preferida a no mas del 5 % en peso referido a la cantidad del producto final respectivo. En una planta transgenica se producen ventajosamente como productos finales solo ARA, EPA o solo DHA en el procedimiento segun la invencion, unidos o como acidos libres. Si los compuestos ARA, EPA y DHA se producen al mismo tiempo, se producen ventajosamente en una relacion de al menos 1:1:2 (EPA:ARA:DHA), ventajosamente de al menos 1:1:3, preferiblemente de 1:1:4, con especial preferencia de 1:1:5.
Los esteres de acidos grasos o mezclas de acidos grasos que se produjeron segun el procedimiento segun la invencion contienen ventajosamente 6 al 15 % de acido palmttico, 1 al 6 % de acido estearico; 7 - 85 % de acido oleico; 0,5 al 8 % de acido vaccenico, 0,1 al 1 % de acido araqmdico, 7 al 25 % de acidos grasos saturados, 8 al 85 % de acidos grasos monoinsaturados y 60 al 85 % de acidos grasos poliinsaturados, respectivamente referidos al 100 % y al contenido de acidos grasos totales de los organismos. Como acidos grasos poliinsaturados ventajosos, en los esteres de acidos grasos o mezclas de acidos grasos estan contenidos preferiblemente al menos el 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 o 1 % referido al contenido de acidos grasos totales de acido araquidonico. Ademas, los esteres de acidos grasos o mezclas de acidos grasos que se produjeron segun el procedimiento segun la invencion contienen ventajosamente acidos grasos seleccionados del grupo de acidos grasos acido erucico (acido 13-docosaenoico), acido esterculico (acido 9,10-metilenoctadec-9-enoico), acido malvalico (acido 8,9-metilenheptadec-8-enoico), acido chaulmoogrico (acido ciclopenten-dodecanoico), acido graso de furano (acido 9,12-epoxi-octadeca-9,11-dienoico), acido vernolico (acido 9,10-epoxi-octadec-12-enoico), acido tarmico (acido 6-octadecinoico), acido 6-nonadecinoico, acido santalbico (acido t11-octadecen-9-inoico), acido 6,9-octadeceninoico, acido pirulico (acido t10-heptadecen-8-inoico), acido crepenmico (acido 9-octadecen-12-inoico), acido 13,14-dihidroorofeico, acido octadecen-13-eno-9,11-diinoico, acido petroselenico (acido cis-6-octadecenoico), acido 9c,12toctadecadienoico, acido calendulico (acido 8t10t12c-octadecatrienoico), acido catalpico (acido 9t11t13coctadecatrienoico), acido eleoestearico (acido 9c11t13t-octadecatrienoico), acido jacarico (acido 8c10t12coctadecatrienoico), acido pumcico (acido 9c11t13c-octadecatrienoico), acido parinarico (acido 9c11t13t15coctadecatetraenoico), acido pinolenico (acido all-cis-5,9,12-octadecatrienoico), acido labalenico (acido 5,6-octadecadienalenico), acido ricinoleico (acido 12-hidroxioleico) y/o acido coriolico (acido 13-hidroxi-9c,11toctadecadienoico). Los acidos grasos previamente mencionados estan presentes en los esteres de acidos grasos o las mezclas de acidos grasos producidos segun el procedimiento segun la invencion generalmente ventajosamente solo en trazas, es decir, estan presentes, referido a los acidos grasos totales, a menos del 30 %, preferiblemente a menos del 25 %, 24 %, 23 %, 22 % o 21 %, con especial preferencia a menos del 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 % o 5 %, de manera muy especialmente preferida a menos del 4 %, 3 %, 2 % o 1 %. En otra forma preferida de la invencion, estos acidos grasos previamente mencionados estan presentes, referido a los acidos grasos totales, a menos del 0,9 %; 0,8 %; 0,7 %; 0,6 %; o 0,5 %, con especial preferencia a menos del 0,4 %; 0,3 %; 0,2 %; 0,1 %. Ventajosamente, los esteres de acidos grasos o las mezclas de acidos grasos producidos segun el procedimiento segun la invencion contienen menos del 0,1 % referido a los acidos grasos totales y/o ningun acido butmco, ningun colesterol, ningun acido clupanodonico (=acido docosapentaenoico, C22:5M’8’12’15’21), asf como ningun acido msico (acido tetracosahexaenoico, C23:6a3,8,12,15,1821).
Debido a las secuencias de acidos nucleicos descritas o a las secuencias de acidos nucleicos usadas en el procedimiento segun la invencion, puede alcanzarse un aumento del rendimiento de acidos grasos poliinsaturados de al menos el 50 %, ventajosamente de al menos el 80 %, especialmente ventajosamente de al menos el 100 %, muy especialmente ventajosamente de al menos el 150% en comparacion con el organismo de partida no transgenico, por ejemplo, una levadura, un alga, un hongo o una planta como Arabidopsis o lino en la comparacion en el analisis de CG, veanse los ejemplos.
Tambien pueden sintetizarse acidos grasos poliinsaturados qmmicamente puros o composiciones de acidos grasos segun los procedimientos previamente descritos. Para esto, los acidos grasos o las composiciones de acidos grasos se afslan del organismo, como los microorganismos o las plantas o el medio de cultivo en el que o sobre el que se cultivaron los organismos, o del organismo y del medio de cultivo, de manera conocida, por ejemplo, mediante extraccion, destilacion, cristalizacion, cromatograffa o combinaciones de estos procedimientos. Estos acidos grasos qmmicamente puros o composiciones de acidos grasos son ventajosos para aplicaciones en el sector de la industria alimentaria, de la industria cosmetica y especialmente de la industria farmaceutica.
Como organismo para la produccion en el procedimiento segun la invencion se consideran fundamentalmente todos los organismos como microorganismos, animales no humanos o plantas.
Como plantas se consideran fundamentalmente todas las plantas que estan en condiciones de sintetizar acidos grasos, como todas las plantas dicotiledoneas o monocotiledoneas, algas o musgos. Ventajosamente, las plantas se seleccionan del grupo de las familias de plantas Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Euglenaceae, Prasinophyceae o plantas de hortaliza o plantas ornamentales como clavelon.
A modo de ejemplo son de mencionar las siguientes plantas seleccionadas del grupo: Adelotheciaceae como los generos Physcomitrella, por ejemplo, el genero y las especies Physcomitrella patens, Anacardiaceae como los generos Pistacia, Mangifera, Anacardium, por ejemplo, el genero y las especies Pistacia vera [pistacho], Mangifer indica [mango] o Anacardium occidentale [anacardo], Asteraceae como los generos Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, por ejemplo, el genero y las especies Calendula officinalis [calendulas de jardm], Carthamus tinctorius [cartamo, safflower], Centaurea cyanus [aciano], Cichorium intybus [husillo], Cynara scolymus [alcachofa], Helianthus annus [girasol], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [lechuga], Tagetes lucida, Tagetes erecta o Tagetes tenuifolia [damasquina], Apiaceae como el genera Daucus, por ejemplo, el genera y la especie Daucus carota [zanahoria], Betulaceae como el genera Corylus, por ejemplo, los generos y las especies Corylus avellana o Corylus colurna [avellano], Boraginaceae como el genero Borago, por ejemplo, el genero y la especie Borago officinalis [borraja], Brassicaceae como los generos Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabidopsis, por ejemplo, los generos y las especies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [colza], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mostaza], Brassica oleracea [remolacha forrajera] o Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae como los generos Anana, Bromelia (pina), por ejemplo, los generos y las especies Anana comosus, Ananas ananas o Bromelia comosa [pina], Caricaceae como el genero Carica como el genero y especie Carica papaya [papaya], Cannabaceae como el genero Cannabis como el genero y especie Cannabis sativa[canamo], Convolvulaceae como los generos Ipomea, Convolvulus, por ejemplo, los generos y las especies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fasfigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba o Convolvulus panduratus [patata dulce, batata], Chenopodiaceae como el genero Beta como los generos y especies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva o Beta vulgaris var. esculenta [remolacha azucarera], Crypthecodiniaceae como el genero Crypthecodinium, por ejemplo, el genero y la especie Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae como el genero Cucurbita, por ejemplo, los generos y las especies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo o Cucurbita moschata [calabaza], Cymbellaceae como los generos Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, por ejemplo, el genero y la especie Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae como los generos Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, por ejemplo, los generos y las especies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpurascens, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus o Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae como el genero Elaeagnus, por ejemplo, el genero y la especie Olea europaea [olivo], Ericaceae como el genero Kalmia, por ejemplo, los generos y las especies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros o Kalmia lucida [laurel de montana], Euglenaceae como los generos Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalaphacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas, Trachelomonas, por ejemplo, el genero y la especie Euglena gracilis; Euphorbiaceae como los generos Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, por ejemplo, los generos y las especies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [mandioca] o Ricinus communis [ricino], Fabaceae como los generos Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, por ejemplo, los generos y las especies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [guisantes], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [arbol de la seda], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [alfalfa] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida o Soja max [haba de soja], Funariaceae como los generos Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, por ejemplo, los generos y las especies Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria filavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria piano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae como los generos Pelargonium, Cocos, Oleum, por ejemplo, los generos y las especies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides u Oleum cocois [coco], Gramineae como el genera Saccharum, por ejemplo, el genera y la especie Saccharum officinarum, Juglandaceae como los generos Juglans, Wallia, por ejemplo, los generos y las especies Juglans regia, Juglans ailantifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra o Wallia nigra [nogal], Lauraceae como los generos Persea, Laurus, por ejemplo, los generos y las especies Laurus nobilis [laurel], Persea americana, Persea gratissima o Persea persea [aguacate], Leguminosae como el genero Arachis, por ejemplo, el genero y la especie Arachis hypogaea [cacahuete], Linaceae como los generos Linum, Adenolinum, por ejemplo, los generos y las especies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense o Linum trigynum [lino], Lythrarieae como el genero Punica, por ejemplo, el genero y la especie Punica granatum [granada], Malvaceae como el genero Gossypium, por ejemplo, los generos y las especies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum o Gossypium thurberi [algodon], Marchantiaceae como el genero Marchantia, por ejemplo, los generos y las especies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae como el genero Musa, por ejemplo, los generos y las especies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [banana], Onagraceae como los generos Camissonia, Oenothera, por ejemplo, los generos y las especies Oenothera biennis o Camissonia brevipes [onagra], Palmae como el genero Elacis, por ejemplo, los generos y la especie Elaeis guineensis [palma aceitera], Papaveraceae como el genero Papaver, por ejemplo, los generos y las especies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [amapola], Pedaliaceae como el genero Sesamum, por ejemplo, el genero y la especie Sesamum indicum [sesamo], Piperaceae como los generos Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, por ejemplo, los generos y las especies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [pimienta de Cayena], Poaceae como los generos Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (mafz), Triticum, por ejemplo, los generos y las especies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cebada], Secale cereale [centeno], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [avena], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [sorgo], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [ ir^z ] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare [trigo], Porphyridiaceae como los generos Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, por ejemplo, el genero y la especie Porphyridium cruentum, Proteaceae como el genero Macadamia, por ejemplo, el genero y la especie Macadamia intergrifolia [macadamia], Prasinophyceae como los generos Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, por ejemplo, los generos y las especies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae como el genero Coffea, por ejemplo, los generos y las especies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora o Coffea liberica [cafe], Scrophulariaceae como el genero Verbascum, por ejemplo, los generos y las especies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum o Verbascum thapsus [candelaria], Solanaceae como los generos Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, por ejemplo, los generos y las especies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimienta], Capsicum annuum [pimiento], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [patata], Solanum melongena [berenjena] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum [tomate], Sterculiaceae como el genero Theobroma, por ejemplo, el genero y la especie Theobroma cacao [cacao] o Theaceae como el genero Camellia, por ejemplo, el genero y la especie Camellia sinensis [te].
Microorganismos ventajosos son, por ejemplo, hongos seleccionados del grupo de las familias Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae o Tuberculariaceae.
A modo de ejemplo son de mencionar los siguientes microorganismos seleccionados del grupo: Choanephoraceae como los generos Blakeslea, Choanephora, por ejemplo, los generos y las especies Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae como el genero Mortierella, por ejemplo, los generos y las especies Mortierella isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana, Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae como los generos Phytium, Phytophthora, por ejemplo, los generos y las especies Pythium debaryanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetaceae como los generos Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Yarrowia, por ejemplo, los generos y las especies Hansenula anomala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipiensis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomycetaceae tal como los generos Schizosaccharomyces, por ejemplo, las especies Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus, Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schizosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae tal como los generos Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, por ejemplo, las especies Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoeboideum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum o Thraustochytrium visurgense.
Microorganismos ventajosos adicionales son, por ejemplo, bacterias seleccionadas del grupo de las familias Bacillaceae, Enterobacteriacae o Rhizobiaceae.
A modo de ejemplo son de mencionar los siguientes microorganismos seleccionados del grupo: Bacillaceae como el genero Bacillus, por ejemplo, los generos y las especies Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Bacillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus psychrosaccharomicus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp. subtilis o Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae como los generos Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella o Serratia, por ejemplo, los generos y las especies Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter genomospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia cancerogena, Erwinia carnegieana, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora subsp. odorifera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nigrifluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia persicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. communior, Escherichia coli-mutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia sp., Escherichia vulneris, Klebsiella aerogenes, Klebsiella edwardsii subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klebsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella trevisanii, Salmonella abony, Salmonella arizonae, Salmonella bongori, Salmonella choleraesuis subsp. arizonae, Salmonella choleraesuis subsp. bongori, Salmonella choleraesuis subsp. cholereasuis, Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subsp. houtenae, Salmonella choleraesuis subsp. indica, Salmonella choleraesuis subsp. salamae, Salmonella daressalaam, Salmonella enterica subsp. houtenae, Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella heidelberg, Salmonella panama, Salmonella senftenberg, Salmonella typhimurium, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Serratia marinorubra, Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp. quinovora, Serratia quinivorans o Serratia rubidaea; Rhizobiaceae como los generos Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium, por ejemplo, los generos y las especies Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium steltulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Cheiatobacter heintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium ciceri, Rhizobium etli, Rhizobium fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium huakuii, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizogenes, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium saheli o Sinorhizobium xinjiangense.
Microorganismos ventajosos adicionales para el procedimiento segun la invencion son, por ejemplo, protistas o diatomeas seleccionados del grupo de las familias Dinophyceae, Turaniellidae u Oxytrichidae como los generos y las especies: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum o Colpidium sp.
En el procedimiento segun la invencion se usan ventajosamente organismos transgenicos como hongos como Mortierella o Thraustochytrium, levaduras como Saccharomyces o Schizosaccharomyces, musgos como Physcomitrella o Ceratodon, animales no humanos como Caenorhabditis, algas como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium o Phaeodactylum o plantas como plantas dicotiledoneas o monocotiledoneas. Se usan de manera especialmente ventajosa en el procedimiento segun la invencion los organismos que pertenecen a los organismos productores de aceite, es decir, los que se usan para la produccion de aceites, como hongos como Mortierella o Thraustochytrium, algas como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium, Phaeodactylum o plantas, especialmente plantas, preferiblemente plantas oleaginosas que contienen grandes cantidades de compuestos lipfdicos, como cacahuete, colza, canola, girasol, cartamo (Carthamus tinctoria), amapola, mostaza, canamo, ricino, olivo, sesamo, Calendula, Punica, onagra, candelaria, cardamo, rosas silvestres, avellano, almendro, macadamia, aguacate, laurel, calabaza, lino, soja, pistacho, borraja, arboles (palma aceitera, coco o nogal) o cultivos como mafz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, algodon, yuca, pimienta, clavelon, plantas solanaceas como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies de Vicia, guisantes, alfalfa o plantas arbusto (cafe, cacao, te), especies de Salix asf como pastos perennes y plantas para forraje. Plantas preferidas segun la invencion son plantas oleaginosas como cacahuete, colza, canola, girasol, cartamo, amapola, mostaza, canamo, ricino, olivo, Calendula, Punica, onagra, calabaza, lino, soja, borraja, arboles (palma aceitera, coco). Particularmente se prefieren plantas ricas en acidos grasos Ci&2 y/o C183 como girasol, cardamo, tabaco, candelaria, sesamo, algodon, calabaza, amapola, onagra, nogal, lino, canamo, cardo o cardamo. Muy particularmente se prefieren plantas como cardamo, girasol, amapola, onagra, nogal, lino o canamo.
Para el procedimiento descrito segun la invencion es ventajoso introducir en el organismo adicionalmente otros acidos nucleicos que codifican enzimas del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos, adicionalmente a los acidos nucleicos introducidos en la etapa de procedimiento (a) a (d), asf como las secuencias de acidos nucleicos dado el caso introducidas, que codifican las w3-desaturasas.
En principio, todos los genes del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos pueden usarse ventajosamente en el procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados en combinacion con la(s) A5-elongasa(s), A6-elongasa(s) y/o w3-desaturasa(s) [en el sentido de esta solicitud el plural debera contener el singular y al reves]. Ventajosamente se usan genes del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos seleccionados del grupo acil-CoA-deshidrogenasa(s), acil-ACP [= protema transportadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), acido graso-acil-transferasa(s), acil-CoA:lisofosfolfpido aciltransferasas, acido graso-sintasa(s), acido graso-hidroxilasa(s), acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), acido graso-desaturasa(s), acido graso-acetilenasa(s), lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, oxido de aleno-sintasas, hidroperoxido-liasas o acido graso-elongasa(s) en combinacion con la A5-elongasa, A6-elongasa y/o w3-desaturasa. Especialmente se usan preferiblemente genes seleccionados del grupo de A4-desaturasas, A5-desaturasas, A6-desaturasas, A8-desaturasas, A9-desaturasas, A12-desaturasas, A6-elongasas o A9-elongasas en combinacion con los genes previamente mencionados para la A5-elongasa, A6-elongasa y/o u>3-desaturasa, pudiendo usarse los genes individuales o varios genes en combinacion.
Las A5-elongasas tienen, en comparacion con las elongasas humanas o elongasas de animales no humanos como las de Oncorhynchus, Xenopus o Ciona, la propiedad ventajosa de que no alargan los acidos grasos C22 a los acidos grasos C24 correspondientes. Ademas, no convierten ventajosamente los acidos grasos con un doble enlace en la posicion A6, como se convierten por las elongasas humanas o las elongasas de animales no humanos. Las A5-elongasas especialmente ventajosas convierten solo preferiblemente acidos grasos C20 insaturados. Estas A5-elongasas ventajosas presentan algunas supuestas helices transmembrana (5-7). Ventajosamente solo convierten acidos grasos C20 con un doble enlace en la posicion A5, prefiriendose acidos grasos w3 C20 (EPA). Ademas, en una forma de realizacion preferida de la invencion, tienen la propiedad de que, ademas de la actividad de A5-elongasa, ventajosamente no presentan actividad de A6-elongasa o solo una actividad relativamente baja. A diferencia de esto, las elongasas humanas o elongasas de animales no humanos presentan una actividad aproximadamente igual en comparacion con acidos grasos con un doble enlace en A6 o A5. Estas elongasas ventajosas se denominan las llamadas elongasas monofuncionales. Las elongasas humanas o las elongasas de animales no humanos se designan, por el contrario, elongasas multifuncionales que, ademas de los sustratos previamente mencionados, tambien convierten acidos grasos C16 y C18 monoinsaturados, por ejemplo, con doble enlace en A9 o A11. En una prueba de alimentacion de levadura, en la que se anadio EPA como sustrato a las levaduras, las elongasas monofuncionales convierten ventajosamente al menos el 15% en peso del EPA anadido al acido docosapentaenoico (=DPA, C22:5A710,13,1619), ventajosamente al menos el 20 % en peso, especialmente ventajosamente al menos el 25 % en peso. Si como sustrato se anade acido Y-linolenico (=GLA, C183A6912), entonces este no se alarga ventajosamente en absoluto. Igualmente, C18 3A5912 tampoco se alarga. En otra forma de realizacion ventajosa se convierte menos del 60 % en peso del GLA anadido en acido dihomo-Y-linolenico (C20 3A81114), ventajosamente menos del 55 % en peso, preferiblemente menos del 50 % en peso, especialmente ventajosamente menos del 45 % en peso, muy especialmente ventajosamente menos del 40 % en peso. En otra forma de realizacion muy preferida, la actividad de A5-elongasa descrita en el presente documento no convierte GLA.
Las Figuras 27 y 28 describen las especificidades por sustrato medidas de las distintas elongasas. En la Figura 27 se describen las especificidades de las elongasas multifuncionales de Xenopus laevis (Figura 27A), Ciona intestinalis (Figura 27B) y Oncorhynchus mykiss (Figura 27C). Todas estas elongasas convierten un amplio espectro de sustratos. Esto puede conducir en el procedimiento segun la invencion a productos secundarios que deben convertirse mediante otras actividades enzimaticas. Por este motivo, estas enzimas son menos preferidas en el procedimiento segun la invencion. Las elongasas monofuncionales preferidas y su especificidad por sustrato se describen en la Figura 28. La Figura 28A muestra la especificidad de la A5-elongasa de Ostreococcus tauri. Esta convierte solo acidos grasos con un doble enlace en la posicion A5. Ventajosamente solo se convierten acidos grasos C20. La A5-elongasa de Thalassiosira pseudonana (Figura 28C) presenta una especificidad por sustrato similarmente alta. Tanto la A6-elongasa de Ostreococcus tauri (Figura 28B) como tambien la de Thalassiosira pseudonana (Figura 28D) convierten ventajosamente solo acidos grasos con un doble enlace en la posicion A6. Ventajosamente solo se convierten acidos grasos C18. Las A5-elongasas de Arabidopsis thaliana y Euglena gracilis tambien destacan por su especificidad.
Las A6-elongasas ventajosas tambien destacan por una alta especificidad, es decir, preferiblemente alargan acidos grasos C18. Ventajosamente convierten acidos grasos con un doble enlace en la posicion A6. Las A6-elongasas especialmente ventajosas convierten ventajosamente acidos grasos C18 con tres o cuatro dobles enlaces en la molecula, debiendo contener estos un doble enlace en la posicion A6. Ademas, en una forma de realizacion prferente de la invencion tienen la propiedad de que, ademas de la actividad de A6-elongasa, ventajosamente no presentan actividad de A5-elongasa o solo una relativamente baja. A diferencia de esto, las elongasas humanas o elongasas de animales no humanos presentan una actividad aproximadamente igual en comparacion con los acidos grasos con un doble enlace en A6 o A5. Estas elongasas ventajosas se denominan las llamadas elongasas monofuncionales. Las elongasas humanas o las elongasas de animales no humanos se designan, por el contrario, elongasas multifuncionales que, ademas de los sustratos previamente mencionados, tambien convierten acidos grasos C16 y C18 monoinsaturados, por ejemplo, con doble enlace en A9 o A11. En una prueba de alimentacion de levadura, en la que se anadio EPA como sustrato a las levaduras, las elongasas monofuncionales convierten ventajosamente al menos el 10 % en peso del acido a-linolenico anadido (=ALA, C18 3A91215) o al menos el 40 % en peso del acido Y-linolenico anadido (=GLA, C183A6912), ventajosamente al menos el 20 % en peso o el 50 % en peso, de forma particularmente ventajosa al menos el 25% en peso o el 60% en peso. Tambien se alarga de forma especialmente ventajosa C18:4A 69 ,1215 (acido estearidonico). El SDA se convierte a este respecto a al menos el 40 % en peso, ventajosamente a al menos el 50 % en peso, especialmente ventajosamente a al menos el 60 % en peso, muy especialmente ventajosamente a al menos el 70 % en peso. Las A6-elongasas especialmente ventajosas no muestran actividad o solo una muy baja (menos del 0,1 % en peso de conversion) en comparacion con los siguientes sustratos: C18:1A6, C1 A9 C1 C20:2 C20:3 A11,14,17 C20:3 C20:4 C20: A5,8,11,14,17 o
Las Figuras 29 y 30, asf como la Tabla 18, describen las especificidades por sustrato medidas de las distintas elongasas.
La u>3-desaturasa tiene, en comparacion con las w3-desaturasas conocidas, la propiedad ventajosa de que puede desaturar un amplio espectro de acidos grasos w6, preferiblemente se desaturan acidos grasos C20 y C22 como los acidos grasos C20:2, C20:3, C20:4, C22:4 o C22:5. Pero tambien se desaturan ventajosamente acidos grasos C18 mas cortos como los acidos grasos C182 o Cm3. Debido a estas propiedades de la w3-desaturasa es posible ventajosamente desplazar el espectro de acidos grasos dentro de un organismo, ventajosamente de una planta o un hongo, de los acidos grasos w6 a los acidos grasos w3. Preferiblemente se desaturan acidos grasos C20 por la w3-desaturasa. Dentro del organismo, estos acidos grasos del conjunto de acidos grasos presentes se convierten a al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o el 30 % en los acidos grasos w3 correspondientes. A diferencia de los acidos grasos C18, la w3-desaturasa presenta una actividad mas baja de un factor de 10, es decir, solo se convierten aproximadamente del 1,5 al 3% de los acidos grasos presentes en el conjunto de acidos grasos en los acidos grasos u>3 correspondientes. El sustrato preferido de la u>3-desaturasa son los acidos grasos u>6 unidos en los fosfoKpidos. La Figura 19 muestra claramente como ejemplo de la desaturacion del acido dihomo-Y-linolenico [C204a8,11,14] que la u>3-desaturasa en la desaturacion ventajosamente no diferencia entre acidos grasos unidos en la posicion sn1 o sn2. Se desaturan tanto los acidos grasos unidos en la posicion sn1 como sn2 en los fosfoUpidos. Ademas, es ventajoso que la w3-desaturasa convierta una amplia paleta de fosfoKpidos como fosfatidilcolina (=PC), fosfatidilinositol (=PIS) o fosfatidiletanolamina (=PE). Finalmente tambien pueden encontrarse productos de desaturacion en los lfpidos neutros (=NL), es decir, en los trigliceridos.
Las A4-desaturasas, A5-desaturasas y A6-desaturasas descritas en el presente documento tienen, en comparacion con las A4-desaturasas, A5-desaturasas y A6-desaturasas conocidas, la ventaja de que pueden convertir los acidos grasos unidos a fosfolfpidos o esteres de acidos grasos de CoA, ventajosamente los esteres de acidos grasos de CoA.
Las A12-desaturasas usadas en el procedimiento segun la invencion convierten ventajosamente el acido oleico (Ci8:iA9) en acido linoleico (Ci8:2A912) o Ci8:2A69 en Ci8:3A6912 (=GLA). Las A12-desaturasas usadas convierten ventajosamente acidos grasos unidos a fosfolfpidos o esteres de acidos grasos de CoA, ventajosamente esteres de acidos grasos de CoA.
Debido a la actividad enzimatica de los acidos nucleicos usados en el procedimiento segun la invencion, que codifican polipeptidos con actividad de A5-elongasa, A6-elongasa y/o u>3-desaturasa, ventajosamente en combinacion con secuencias de acidos nucleicos, que codifican polipeptidos del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos como otros polipeptidos con actividad de A4-, A5-, A6-, A8-, A12-desaturasa o A5-, A6-o A9-elongasa, en el procedimiento segun la invencion pueden producirse los mas variados acidos grasos poliinsaturados. Dependiendo de la seleccion de los organismos usados para el procedimiento segun la invencion, como las plantas ventajosas, pueden producirse mezclas de distintos acidos grasos poliinsaturados o acidos grasos poliinsaturados individuales como EPA o ARA en forma libre o unida. Dependiendo de que composicion de acido graso predomine en la planta de partida (acidos grasos Ci82 o C183 ), asf se forman acidos grasos que se derivan de acidos grasos C182 , como GLA, DGLA o ARA o, que se derivan de acidos grasos Ci83 , como SDA, ETA o EPA. Si en las plantas usadas para el procedimiento solo existe como acido graso insaturado acido linoleico (=LA, Ci82 A1912), entonces como productos del procedimiento solo pueden formarse GLA, DGLA y ARA, que pueden estar presentes como acidos grasos libres o unidos. Si en las plantas usadas en el procedimiento solo esta como acido graso insaturado acido a-linolenico (=ALA, Ci83 A91215), por ejemplo como en el lino, entonces como productos del procedimiento solo pueden formarse SDA, ETA, EPA y/o DHA, que pueden estar presentes como acidos grasos libres o unidos como se ha descrito arriba. Mediante la modificacion de la actividad de la enzima A5-elongasa que participa en la smtesis, ventajosamente en combinacion con la A4-, A5-, A6-, A12-desaturasa y/o A6-elongasa, o la A4-, A5-, A8-, A12-desaturasa, y/o A9-elongasa, pueden producirse espedficamente solo productos individuales en los organismos previamente mencionados, ventajosamente en las plantas previamente mencionadas. Debido a la actividad de A6-desaturasa y A6-elongasa se forman, por ejemplo, GLA y DGLA o SDA y ETA, dependiendo de las plantas de partida y el acido graso insaturado. Preferiblemente se forman DGLA o ETA o sus mezclas. Si la A5-desaturasa, la A5-elongasa y la A4-desaturasa se introducen adicionalmente en los organismos, ventajosamente en las plantas, entonces se forman adicionalmente ARA, EPA y/o DHA. Esto tambien se aplica para organismos en los que se introdujo previamente la A8-desaturasa y la A9-elongasa. Ventajosamente solo se sintetizan ARA, EPA o DHA o sus mezclas, en funcion del acido graso existente en el organismo o en la planta, que sirve de sustancia de partida para la smtesis. Como se trata de cadenas de biosmtesis, los productos finales respectivos no estan presentes como sustancias puras en los organismos. Tambien estan siempre contenidas en el producto final bajas cantidades de compuestos precursores. Estas pequenas cantidades ascienden a menos del 20 % en peso, ventajosamente a menos del 15% en peso, especialmente ventajosamente a menos del 10% en peso, muy especialmente ventajosamente a menos del 5, 4, 3, 2 o 1 % en peso referido al producto final DGLA, ETA o sus mezclas o ARA, EPA, DHA o sus mezclas, ventajosamente EPA o DHA o sus mezclas.
La protema codificada por el acido nucleico muestra una alta especificidad por los dos precursores, los acidos grasos Ci8:4A691215 y C20:5A5,811,1417 para la smtesis de DHA (precursores y smtesis de DHA vease la Figura 1). La protema codificada por SEQ NO: 53 tiene, por tanto, una especificidad por acidos grasos en A6 y A5 con adicionalmente un doble enlace en w3 (Figura 2). La A5-elongasa tiene una actividad de ceto-acil-CoA-sintasa, que alarga ventajosamente 2 atomos de carbono los restos de acidos grasos de esteres de acil-CoA.
Mediante los genes de A5-elongasa, la A5-desaturasa de Phaeodacilum, asf como la A4-desaturasa de Euglena, podna detectar la smtesis de DHA en levadura (Saccharomyces cerevisiae) (Figura 3).
Ademas de la produccion directamente en el organismo de acidos grasos de partida para la A5-elongasa, la A6-elongasa y/o w3-desaturas, los acidos grasos tambien pueden alimentarse desde fuera. Por motivos de coste se prefiere la produccion en el organismo. Sustratos preferidos de la u>3-desaturasa son el acido linoleico (Ci82 A912), el acido Y-linolenico (Ci8:3A6912), el acido eicosadienoico (C20:2A1114), el acido dihomo-Y-linolenico (C20:3A81114), el acido araquidonico (C20:4A581114), el acido docosatetraenoico (C22:4A7101316) y el acido docosapentaenoico (C22:5A4,710,1315).
Para aumentar el rendimiento en el procedimiento descrito para la produccion de aceites y/o trigliceridos con un contenido ventajosamente elevado de acidos grasos poliinsaturados es ventajoso aumentar la cantidad de producto de partida para la smtesis de acidos grasos, esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la introduccion de un acido nucleico en el organismo que codifica un polipeptido con actividad de Al2-desaturasa. Esto es especialmente ventajoso en organismos productores de aceite, como de la familia de Brassicaceae como el genero Brassica, por ejemplo, colza; de la familia de Elaeagnaceae como el genero Elaeagnus, por ejemplo, el genero y la especie Olea europaea o de la familia Fabaceae como el genero Glycine, por ejemplo, el genero y la especie Glycine max, que presentan un alto contenido de acido oleico. Como estos organismos solo presentan un bajo contenido de acido linoleico (Mikoklajczak y col., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678 - 681), es ventajoso el uso de las A12-desaturasas mencionadas para la produccion del producto de partida acido linoleico.
Los acidos nucleicos usados en el procedimiento segun la invencion proceden ventajosamente de plantas como algas, por ejemplo, algas de la familia de las Prasinophyceae como de los generos Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnococcus, Pyramimonas, Scherffelia o Tetraselmis como los generos y las especies Heteromastix longifillis, Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephroselmis rotunda, Ostreococcus tauri, Ostreococcus sp. Prasinocladus ascus, Prasinocladus lubricus, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amylifera, Pyramimonas disomata, Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, Pyramimonas parkeae, Pyramimonas spinifera, Pyramimonas sp., Tetraselmis apiculata, Tetraselmis carteriaformis, Tetraselmis chui, Tetraselmis convolutae, Tetraselmis desikacharyi, Tetraselmis gracilis, Tetraselmis hazeni, Tetraselmis impellucida, Tetraselmis inconspicua, Tetraselmis levis, Tetraselmis maculata, Tetraselmis marina, Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordiformis, Tetraselmis suecica, Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Tetraselmis verrucosa fo. rubens o Tetraselmis sp. o de algas de la familia Euglenaceae como de los generos Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas o Trachelomonas como los generos y la especie Euglena acus, Euglena geniculata, Euglena gracilis, Euglena mixocylindracea, Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonas cylindrica o Trachelomonas volvocina. Los acidos nucleicos usados proceden ventajosamente de algas de los generos Euglena, Mantoniella u Ostreococcus
Otras plantas ventajosas son algas como Isochrysis o Crypthecodinium, algas/diatomeas como Thalassiosira o Phaeodactylum, musgos como Physcomitrella o Ceratodon o plantas superiores como las Primulaceae como Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens u Osteospermum hyoseroides, microorganismos como hongos como Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor o Mortierella, bacterias como Shewanella, levaduras o animales como nematodos como Caenorhabditis, insectos, ranas, cohombros de mar o peces. Las secuencias de acidos nucleicos aisladas descritas en el presente documento proceden ventajosamente de un animal del orden de los vertebrados. Las secuencias de acidos nucleicos proceden preferiblemente de la clase de los Vertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae u Oncorhynchus o Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus o Evertebrata como Protochordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae como Amaroucium constellatum, Botryllus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgula citrina, Molgula manhattensis, Perophora viridis o Styela partita. Los acidos nucleicos proceden de forma especialmente ventajosa de hongos, animales o de plantas como algas o musgos, preferiblemente del orden de los Salmoniformes como de la familia de los Salmonidae como el genero Salmo, por ejemplo, de los generos y las especies Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta o Salmo trutta fario, de algas como los generos Mantoniella u Ostreococcus o de las diatomeas como los generos Thalassiosira o Phaeodactylum o de algas como Crypthecodinium.
En el procedimiento segun la invencion ventajosamente las secuencias de acidos nucleicos previamente mencionadas o sus derivados u homologos que codifican polipeptidos que todavfa poseen la actividad enzimatica de las protemas codificadas por las secuencias de acidos nucleicos. Estas secuencias se clonan en construcciones de expresion individualmente o en combinacion con las secuencias de acidos nucleicos que codifican A12-desaturasa, A4-desaturasa, A5-desaturasa, A6-desaturasa, A5-elongasa, A6-elongasa y/o w3-desaturasa y se usan para la introduccion y para la expresion en organismos. Debido a su construccion, estas construcciones de expresion hacen posible una smtesis optima ventajosa de los acidos grasos poliinsaturados producidos en el procedimiento segun la invencion.
En una forma de realizacion preferida, el procedimiento comprende ademas la etapa de obtener una celula o un organismo completo que contiene las secuencias de acidos nucleicos usadas en el procedimiento, transformandose la celula y/o el organismo con una secuencia de acido nucleico descrita en el presente documento, que codifica la A-12-desaturasa, A-4-desaturasa, A-5-desaturasa, A-6-desaturasa, A-5-elongasa, A-6-elongasa y/o w3-desaturasa, una construccion genica o un vector como se describe a continuacion, solo o en combinacion con secuencias de acidos nucleicos adicionales que codifican protemas del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos. En otra forma de realizacion preferida, este procedimiento comprende ademas la etapa de obtener aceites, lfpidos o acidos grasos libres del organismo o del cultivo. En el caso del cultivo puede tratarse, por ejemplo, de un cultivo de fermentacion, por ejemplo, en el caso del cultivo de microorganismos como, por ejemplo, Mortierella, Thalassiosira, Mantoniella, Ostreococcus, Saccharomyces o Thraustochytrium o de un invernadero o cultivo de campo de una planta. La celula asf producida o el organismo asf producido es ventajosamente una celula de un organismo productor de aceite como una planta oleaginosa como, por ejemplo, cacahuete, colza, canola, lino, canamo, cacahuete, soja, cartamo, canamo, girasol o borraja.
Por cultivo debe entenderse, por ejemplo, el cultivo en caso de celulas, tejido u organos de la planta o en un medio nutritivo o la planta completa sobre o en un sustrato, por ejemplo, en hidrocultivo, en tierra de macetas o en suelo arado.
“Transgenico” o “recombinante” significa en el sentido de la invencion, por ejemplo, en lo referente a una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion (=construccion genica) o un vector que contiene la secuencia de acido nucleico descrita en el presente documento o un organismo transformado con las secuencias de acidos nucleicos, casete de expresion o vector, todas aquellas construcciones realizadas mediante procedimientos de ingeniena genetica, en las que o
a) la secuencia de acido nucleico descrita en el presente documento o
b) una secuencia de control genetica unida funcionalmente con la secuencia de acido nucleico, por ejemplo, un promotor, o
c) (a) y (b)
no se encuentran en su entorno genetico natural o se modificaron por procedimientos de ingeniena genetica, pudiendo ser la modificacion a modo de ejemplo una sustitucion, adicion, delecion, inversion o insercion de uno o varios restos de nucleotidos. Entorno genetico natural se entiende que significa el locus genomico o cromosomico natural en el organismo original o la presencia en una biblioteca genomica. En el caso de una biblioteca genomica, el entorno genetico natural de la secuencia de acido nucleico se obtiene preferiblemente al menos todavfa parcialmente. El entorno flanquea la secuencia de acido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferiblemente al menos 500 pb, con especial preferencia al menos 1000 pb, de manera muy especialmente preferida al menos 5000 pb. Un casete de expresion natural que existe de forma natural, por ejemplo, la combinacion que existe de forma natural del promotor natural de las secuencias de acidos nucleicos descritas en el presente documento con los genes correspondientes de A-12-desaturasa, A-4-desaturasa, A-5-desaturasa, A-6-desaturasa, A-8-desaturasa, u>3-desaturasa, A-9-elongasa, A-6-elongasa y/o A-5-elongasa, se convierte en un casete de expresion transgenico cuando este se modifica por procedimientos sinteticos (“artificiales”) no naturales como, por ejemplo, una mutagenizacion. Procedimientos correspondientes se describen, por ejemplo, en los documentos Us 5.565.350 o WO 00/15815.
Por organismo transgenico o planta transgenica en el sentido de la invencion debe entenderse, como se ha mencionado previamente, que los acidos nucleicos usados en el procedimiento no estan en su sitio natural en el genoma de un organismo, a este respecto los acidos nucleicos pueden expresarse homologa u heterologamente. Transgen significa, pero tambien como se ha mencionado, que los acidos nucleicos estan en su sitio natural en el genoma de un organismo que sin embargo cambio la secuencia en comparacion con la secuencia natural y/o que cambiaron las secuencias de regulacion de las secuencias naturales. Se prefiere entender por transgen la expresion de los acidos nucleicos en un sitio no natural en el genoma, es decir, existe una expresion homologa, o preferiblemente heterologa, de los acidos nucleicos. Organismos transgenicos preferidos son hongos como Mortierella o Phytophtora, musgos como Physcomitrella, algas como Mantoniella, Euglena, Crypthecodinium u Ostreococcus, diatomeas como Thalassiosira o Phaeodactylum, o plantas como las plantas oleaginosas.
Como organismos u organismos huesped para los acidos nucleicos usados en el procedimiento segun la invencion, el casete de expresion o el vector son fundamentalmente ventajosamente adecuados todos los organismos que sean capaces de sintetizar acidos grasos, especialmente acidos grasos insaturados, o son adecuados para la expresion de genes recombinantes. A modo de ejemplo son de mencionar plantas como Arabidopsis, Asteraceae como Calendula o plantas de cultivo como soja, cacahuete, ricino, girasol, mafz, algodon, lino, colza, coco, palma aceitera, cartamo (Carthamus tinctorius) o grano de cacao, microorganismos como hongos, por ejemplo, el genero Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia, Phytophtora o Pythium, bacterias como el genero Escherichia o Shewanella, levaduras como el genero Saccharomyces, cianobacterias, ciliados, algas como Mantoniella, Euglena, Thalassiosira u Ostreococcus, o protozoos como dinoflagelados como Crypthecodinium. Se prefieren organismos que pueden sintetizar naturalmente aceites en mayores cantidades como hongos como Mortierella alpina, Pythium insidiosum, Phytophtora infestans o plantas como soja, colza, coco, palma aceitera, cartamo, lino, canamo, ricino, Calendula, cacahuete, grano de cacao o girasol, o levaduras como Saccharomyces cerevisiae, se prefieren especialmente soja, lino, colza, cartamo, girasol, Calendula, Mortierella o Saccharomyces cerevisiae. Fundamentalmente tambien son adecuados como organismos huesped, ademas de los organismos transgenicos previamente mencionados, animales transgenicos, ventajosamente animales no humanos, por ejemplo, C. elegans, Ciona intestinalis o Xenopus laevis.
Celulas huesped utiles se mencionan ademas en: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Cepas de expresion que pueden usarse, por ejemplo, aquellas que presentan una actividad de proteasa mas baja, se describen en: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
A estas pertenecen celulas de plantas y determinados tejidos, organos y partes de plantas en todas sus formas de aparicion como anteras, fibras, pelos de la rafz, tallos, embriones, callos, cotiledones, pedolos, material recolectado, tejido vegetal, tejido reproductivo y cultivos celulares que se derivan de la propia planta transgenica y/o pueden usarse ademas para producir las plantas transgenicas.
Plantas transgenicas que contienen los acidos grasos poliinsaturados sintetizados en el procedimiento segun la invencion pueden comercializarse directamente ventajosamente sin que los aceites, lfpidos o acidos grasos sintetizados deban aislarse. Por plantas en el procedimiento segun la invencion se entiende plantas enteras, asf como todas las partes de la planta, organos de la planta o partes de la planta como hoja, tallo de la hoja, semillas, rafz, tuberculos, anteras, fibras, pelos de la rafz, tallo, embrion, callos, cotiledones, pedolos, material recolectado, tejido vegetal, tejido reproductivo, cultivos celulares que se deriven de las plantas transgenicas y/o puedan usarse ademas para producir las plantas transgenicas. Las semillas comprenden a este respecto todas las partes de semilla como las vainas de las semillas, celulas de la epidermis y de la semilla, endospermo o tejidos de embriones. Pero los compuestos producidos en el procedimiento segun la invencion tambien pueden aislarse de los organismos, ventajosamente plantas en forma de sus aceites, grasa, lfpidos y/o acidos grasos libres. Los acidos grasos poliinsaturados producidos por este procedimiento pueden recolectarse mediante cosecha de los organismos, o bien del cultivo en el que crecen, o bien del campo. Esto puede realizarse mediante prensado o extraccion de las partes de la planta, preferentemente de las semillas de la planta. A este respecto, los aceites, grasas, lfpidos y/o acidos grasos libres pueden obtenerse mediante el llamado golpeado fno o prensado en fno, sin aplicar calor al prensar. Para permitir que las partes de la planta, especialmente las semillas, se abran mas facilmente, primero se trituran, se someten a vapor o se tuestan. Las semillas asf tratadas previamente pueden prensarse a continuacion o extraerse con disolvente como hexano caliente. A continuacion se retira de nuevo el solvente. En el caso de microorganismos estos se extraen despues de la cosecha, por ejemplo directamente sin mas etapas de trabajo o bien se extraen despues de la descomposicion mediante diferentes procedimientos conocidos para el experto. De esta manera pueden aislarse mas del 96 % de los compuestos producidos en el procedimiento. A continuacion, los productos asf obtenidos se procesan adicionalmente, es decir, se refinan. A este respecto, inicialmente se eliminan, por ejemplo, los mudlagos vegetales y la materia suspendida. La llamada eliminacion de los mudlagos puede realizarse enzimaticamente o, por ejemplo, qmmicamente/ffsicamente mediante la adicion de acido como acido fosforico. A continuacion, los acidos grasos libres se eliminan mediante tratamiento con una base, por ejemplo, hidroxido de sodio. Para la eliminacion de la lejfa que queda en el producto, el producto obtenido se lava cuidadosamente con agua y se seca. Para eliminar los colorantes todavfa contenidos en el producto, los productos se someten a un blanqueamiento con, por ejemplo, arcilla blanqueadora o con carbon activo. Al final, el producto se desodoriza ademas, por ejemplo con vapor de agua.
Los PUFA o LCPUFA producidos por este procedimiento son preferiblemente las moleculas de acidos grasos C18, C20 o C22, ventajosamente las moleculas de acidos grasos C20 o C22, con al menos dos dobles enlaces en la molecula de acido graso, preferiblemente tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces. Estas moleculas de acido graso C18, C20 o C22 pueden aislarse del organismo en forma de un aceite, lfpido o un acido graso libre. Organismos adecuados son, por ejemplo, los previamente mencionados. Organismos preferidos son plantas transgenicas.
Una forma de realizacion de la invencion son, por este motivo, aceites, lfpidos o acidos grasos o fracciones de los mismos que se ha producido por el procedimiento anteriormente descrito, en especial aceite, lfpido o una composicion de acidos grasos que comprende PUFA y se deriva de plantas transgenicas.
Estos aceites, lfpidos o acidos grasos contienen, como se ha descrito anteriormente, ventajosamente 6 al 15% de acido palmttico, 1 al 6 % de acido estearico; 7 - 85 % de acido oleico; 0,5 al 8 % de acido vaccenico, 0,1 al 1 % de acido araqrndico, 7 al 25 % de acidos grasos saturados, 8 al 85 % de acidos grasos monoinsaturados y 60 al 85 % de acidos grasos poliinsaturados, respectivamente referidos al 100 % y al contenido de acidos grasos totales de los organismos. Como acidos grasos poliinsaturados ventajoso, en los esteres de acidos grasos o mezclas de acidos grasos estan contenidos preferiblemente al menos el 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 o 1 % referido al contenido de acidos grasos totales de acido araquidonico. Ademas, los esteres de acidos grasos o mezclas de acidos grasos que se produjeron segun el procedimiento segun la invencion contienen ventajosamente acidos grasos seleccionados del grupo de acidos grasos acido erucico (acido 13-docosaenoico), acido esterculico (acido 9.10- metilenoctadec-9-enoico), acido malvalico (acido 8,9-metilenheptadec-8-enoico), acido chaulmoogrico (acido ciclopenten-dodecanoico), acido graso de furano (acido 9,12-epoxi-octadeca-9,11-dienoico), acido vernolico (acido 9.10- epoxi-octadec-12-enoico), acido tannico (acido 6-octadecinoico), acido 6-nonadecinoico, acido santalbico (acido t11-octadecen-9-inoico), acido 6,9-octadeceninoico, acido pirulico (acido t10-heptadecen-8-inoico), acido crepenmico (acido 9-octadecen-12-inoico), acido 13,14-dihidroorofeico, acido octadecen-13-eno-9,11-diinoico, acido petroselenico (acido cis-6-octadecenoico), acido 9c,12t-octadecadienoico, acido calendulico (acido 8t10t12coctadecatrienoico), acido catalpico (acido 9t11t13c-octadecatrienoico), acido eleoestearico (acido 9c11t13toctadecatrienoico), acido jacarico (acido 8c10t12c-octadecatrienoico), acido pumcico (acido 9c11t13coctadecatrienoico), acido parinarico (acido 9c11t13t15c-octadecatetraenoico), acido pinolenico (acido all-cis-5,9,12-octadecatrienoico), acido labalenico (acido 5,6-octadecadienalenico), acido ricinoleico (acido 12-hidroxioleico) y/o acido coriolico (acido 13-hidroxi-9c,11t-octadecadienoico). Los acidos grasos previamente mencionados estan presentes en los esteres de acidos grasos o las mezclas de acidos grasos producidos segun el procedimiento segun la invencion generalmente ventajosamente solo en trazas, es decir, estan presentes, referido a los acidos grasos totales, a menos del 30 %, preferiblemente a menos del 25 %, 24 %, 23 %, 22 % o 21 %, con especial preferencia a menos del 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 % o 5 %, de manera muy especialmente preferida a menos del 4 %, 3 %, 2% o 1 %. Estos acidos grasos previamente mencionados pueden estar presentes, referido a los acidos grasos totales, a menos del 0,9 %; 0,8 %; 0,7 %; 0,6 %; o 0,5 %, con especial preferencia a menos del 0,4 %; 0,3 %; 0,2 %; 0,1 %. Ventajosamente, los esteres de acidos grasos o las mezclas de acidos grasos producidos segun el procedimiento segun la invencion contienen menos del 0,1 % referido a los acidos grasos totales y/o ningun acido butmco, ningun colesterol, ningun acido clupanodonico (=acido docosapentaenoico, C22:5a4,8,12,1521), as ^como ningun acido msico (acido tetracosahexaenoico, C23:6a38,12,15,1821).
Los aceites, Kpidos o acidos grasos contienen ventajosamente al menos el 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o el 5 %, ventajosamente al menos el 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o el 10 %, especialmente ventajosamente al menos el 11 %, 12 %, 13 %, 14 % o el 15 % de ARA o al menos el 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o el 5 %, ventajosamente al menos el 6 %, o el 7 %, especialmente ventajosamente al menos el 8 %, 9 % o el 10 % de EPA y/o DHA, referido al contenido de acidos grasos totales del organismo de produccion, ventajosamente de una planta, especialmente ventajosamente de una planta oleaginosa como soja, colza, coco, palma aceitera, cartamo, lino, canamo, ricino, Calendula, cacahuete, grano de cacao, girasol o las otras plantas oleaginosas mono o dicotiledoneas anteriormente mencionadas.
En el presente documento se describe tambien el uso del aceite, del lfpido, de los acidos grasos y/o la composicion de acidos grasos en piensos, alimentos, cosmeticos o farmacos. Los aceites, lfpidos, acidos grasos o mezclas de acidos grasos pueden usarse en la forma conocida para el experto para mezclar con otros aceites, lfpidos, acidos grasos o mezclas de acidos grasos de origen animal como, por ejemplo, aceites de pescado. Estos aceites, lfpidos, acidos grasos o mezclas de acidos grasos que estan constituidos por constituyentes vegetales y animales tambien pueden usarse para la produccion de piensos, alimentos, cosmeticos o farmacos.
Por el termino “aceite”, “lfpido” o “grasa” se entiende una mezcla de acidos grasos que contiene acido(s) graso(s) insaturado(s), saturado(s), preferiblemente esterificado(s). Se prefiere que el aceite, lfpido o grasa tenga una alta proporcion de acido(s) graso(s) poliinsaturado(s) libre(s) o ventajosamente esterificado(s), especialmente acido linoleico, acido Y-linolenico, acido dihomo-Y-linolenico, acido araquidonico, acido a-linolenico, acido estearidonico, acido eicosatetraenoico, acido eicosapentaenoico, acido docosapentaenoico o acido docosahexaenoico. Preferiblemente, la proporcion de acidos grasos esterificados insaturados es de aproximadamente el 30 %, todavfa es mas preferida una proporcion del 50 %, incluso todavfa es mas preferida una proporcion del 60 %, 70 %, 80 % o mas. Para la determinacion, por ejemplo, la proporcion de acido graso puede determinarse, por ejemplo, por cromatograffa de gases despues de la conversion de los acidos grasos en los esteres metflicos mediante transesterificacion. El aceite, lfpido o grasa puede contener otros acidos grasos saturados o insaturados distintos, por ejemplo, acido calendulico, acido palmttico, palmitoleico, estearico, oleico, etc. La proporcion de los distintos acidos grasos en el aceite o grasa puede variar, especialmente dependiendo del organismo de partida.
En el caso de los acidos grasos poliinsaturados producidos en el procedimiento que contienen ventajosamente al menos dos dobles enlaces se trata, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, de esfingolfpidos, fosfogliceridos, lfpidos, glicolfpidos, fosfolfpidos, monoacilglicerina, diacilglicerina, triacilglicerina u otros esteres de acidos grasos.
A partir de los acidos grasos poliinsaturados asf producidos en el procedimiento segun la invencion con ventajosamente al menos cinco o seis dobles enlaces, los acidos grasos poliinsaturados contenidos pueden liberarse, por ejemplo, mediante un tratamiento con alcali, por ejemplo, hidrolisis acuosa con KOH o NaOH o acida, ventajosamente en presencia de un alcohol como metanol o etanol o mediante una escision enzimatica y aislarse mediante, por ejemplo, separacion de fases y acidificacion posterior mediante, por ejemplo, H2SO4. La liberacion de los acidos grasos tambien puede realizarse directamente sin el procesamiento anteriormente descrito.
Despues de la introduccion en un organismo, ventajosamente una celula de planta o planta, los acidos nucleicos usados en el procedimiento pueden encontrarse o bien en un plasmido separado o bien estar integrados ventajosamente en el genoma de la celula huesped. En el caso de integracion en el genoma, la integracion puede ser aleatoria o realizarse por recombinacion de tal forma que el gen nativo se sustituya por la copia introducida, por lo que se modula la produccion del compuesto deseado por la celula, o por el uso de un gen en trans, de manera que el gen este funcionalmente unido con una unidad de expresion funcional que contiene al menos una secuencia que garantiza la expresion de un gen y al menos una secuencia que garantiza la poliadenilacion de un gen funcionalmente transcrito. Los acidos nucleicos se introducen ventajosamente en las plantas mediante casetes de multiexpresion o construcciones para la expresion multiparalela en los organismos, ventajosamente para la expresion espedfica en semilla multiparalela de genes.
Los musgos y las algas son los unicos sistemas de plantas conocidos que producen cantidades considerables de acidos grasos poliinsaturados, como acido araquidonico (ARA) y/o acido eicosapentaenoico (EPA) y/o acido docosahexaenoico (DHA). Los musgos contienen PUFA en los lfpidos de membrana mientras que las algas, organismos emparentados con las altas y algunos hongos tambien acumulan cantidades significativas de PUFA en la fraccion de triacilglicerol. Por tanto, las moleculas de acido nucleico que se afslan de aquellas cepas que tambien acumulan PUFA en la fraccion de triacilglicerol son adecuadas de forma especialmente ventajosa para el procedimiento segun la invencion y, por tanto, para la modificacion de los sistemas de produccion de lfpidos y PUFA en un huesped, especialmente plantas, como plantas oleaginosas, por ejemplo, colza, canola, lino, canamo, soja, girasol, borraja. Por este motivo pueden usarse ventajosamente en el procedimiento segun la invencion.
Como sustratos de los acidos nucleicos usados en el procedimiento segun la invencion que codifican polipeptidos con actividad de A12-desaturasa, A-5-desaturasa, A-4-desaturasa, A-6-desaturasa, A-8-desaturasa, A-9-elongasa, A-5-elongasa, A-6-elongasa y/o w-3-desaturasa y/o los otros acidos nucleicos usados como los acidos nucleicos que codifican polipeptidos del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos seleccionados del grupo acil-CoA-deshidrogenasa(s), acil-ACP [= protema transportadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), acido grasoacil-transferasa(s), acil-CoA:lisofosfolfpido aciltransferasa(s), acido graso-sintasa(s), acido graso-hidroxilasa(s), acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), acido graso-desaturasa(s), acido graso-acetilenasa(s), lipoxigenasa(s), triacilglicerol-lipasa(s), oxido de aleno-sintasa(s), hidroperoxido-liasa(s) o acido graso-elongasa(s), son ventajosamente adecuados los acidos grasos C16, C18 o C20. Los acidos grasos convertidos como sustrato en el procedimiento se convierten preferiblemente en forma de sus esteres de acil-CoA y/o sus esteres de fosfoKpido. Para la produccion de los PUFA de cadena larga descritos en el presente documento, los acidos grasos C18 poliinsaturados deben desaturarse inicialmente mediante la actividad enzimatica de una desaturasa y a continuacion alargarse al menos dos atomos de carbono mediante una elongasa. Despues de una ronda de alargamiento, esta actividad enzimatica conduce a acidos grasos C20, y despues de dos rondas de alargamiento a acidos grasos C22. La actividad de las desaturasas y elongasas usadas en el procedimiento segun la invencion conduce preferiblemente a acidos grasos C18, C20 y/o C22 ventajosamente con al menos dos dobles enlaces en la molecula de acido graso, preferiblemente con tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces, con especial preferencia a acidos grasos C20 y/o C22 con al menos dos dobles enlaces en la molecula de acido graso, preferiblemente con tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces, de manera muy especialmente preferida con cinco o seis dobles enlaces en la molecula. Despues de que haya tenido lugar una primera desaturacion y el alargamiento, pueden realizarse otras etapas de desaturacion y de alargamiento como, por ejemplo, una desaturacion tal en la posicion A5 y A4. Como productos del procedimiento segun la invencion se prefieren especialmente acido dihomo-Y-linolenico, acido araquidonico, acido eicosapentaenoico, acido docosapentaenoico y/o acido docosahexaenoico. Los acidos grasos C20 con al menos dos dobles enlaces en el acido graso pueden alargarse mediante la actividad enzimatica descrita en el presente documento en forma del acido graso libre o en forma de los esteres, como fosfolfpidos, glicolfpidos, esfingolfpidos, fosfogliceridos, monoacilglicerina, diacilglicerina o triacilglicerina.
El sitio de biosmtesis preferido de los acidos grasos, aceites, lfpidos o grasas en las plantas ventajosamente usadas es, por ejemplo, en general las semillas o las capas celulares de la semilla, de manera que sea util una expresion espedfica de semilla de los acidos nucleicos usados en el procedimiento. Sin embargo, es logico que la biosmtesis de acidos grasos, aceites o lfpidos no deba limitarse al tejido de semilla, sino que tambien puede realizarse de forma espedfica de tejido en todas las otras partes de la planta, por ejemplo, en las celulas de la epidermis o en los tuberculos.
Si microorganismos como levaduras como Saccharomyces o Schizosaccharomyces, hongos como Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor o Thraustochytrium, algas como Isochrysis, Mantoniella, Euglena, Ostreococcus, Phaeodactylum o Crypthecodinium se usan como organismos en el procedimiento segun la invencion, entonces estos organismos se cultivan ventajosamente de forma fermentativa.
Mediante el uso de los acidos nucleicos segun la invencion que codifican una A5-elongasa, los acidos grasos poliinsaturados producidos en el procedimiento pueden elevarse al menos el 5 %, preferiblemente al menos el 10 %, con especial preferencia al menos el 20 %, de manera muy especialmente preferida al menos el 50 %, en comparacion con los no mutantes de los organismos que no contienen los acidos nucleicos recombinantemente. En principio, los acidos grasos poliinsaturados producidos mediante el procedimiento segun la invencion en los organismos usados en el procedimiento pueden aumentarse de dos formas. Puede aumentarse ventajosamente el conjunto de acidos grasos libres poliinsaturados y/o la proporcion de acidos grasos poliinsaturados esterificados producidos mediante el procedimiento. El conjunto de acidos grasos poliinsaturados esterificados en los organismos transgenicos aumenta ventajosamente mediante el procedimiento segun la invencion.
Si se usan microorganismos como organismos en el procedimiento segun la invencion, entonces se hacen crecer o se cultivan de forma conocida para el experto, dependiendo del organismo huesped. Los microorganismos se hacen crecer generalmente en un medio lfquido que contiene una fuente de carbono principalmente en forma de azucares, una fuente de nitrogeno principalmente en forma de fuentes de nitrogeno organicas como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, oligoelementos como sales de hierro, manganeso, magnesio y dado el caso vitaminas, a temperaturas entre 0 °C y 100 °C, preferiblemente entre 10 °C y 60 °C, con gasificacion con oxfgeno. A este respecto, el pH del lfquido nutritivo puede mantenerse a un valor fijo, es decir, regularse durante el cultivo o no. El cultivo puede realizarse de forma discontinua, semicontinua o continua. Los nutrientes pueden disponerse al principio de la fermentacion o alimentarse posteriormente semicontinuamente o continuamente. Los acidos grasos poliinsaturados producidos pueden aislarse a partir de los organismos segun el procedimiento conocido para el experto como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, mediante extraccion, destilacion, cristalizacion, dado el caso precipitacion con sales y/o cromatograffa. Para esto, los organismos pueden descomponerse ventajosamente de antemano.
El procedimiento segun la invencion se realiza ventajosamente, cuando en el caso de los organismos huesped se trata de microorganismos, a una temperatura entre 0 °C y 95 °C, preferiblemente entre 10 °C y 85 °C, con especial preferencia entre 15 °C y 75 °C, de manera muy especialmente preferida entre 15 °C y 45 °C.
El valor de pH se mantiene a este respecto ventajosamente entre pH 4 y 12, preferiblemente entre pH 6 y 9, con especial preferencia entre pH 7 y 8.
El procedimiento segun la invencion puede operarse de forma discontinua, semicontinua o continua. Un resumen de procedimientos de cultivo conocidos puede encontrarse en el libro de texto de Chmiel (BioprozeUtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo que va a usarse cumple de forma adecuada los requisitos de las cepas respectivas. Descripciones de medios de cultivo de distintos microorganismos estan contenidas en el manual “Manual of Methods fur General Bacteriology” de la American Society fur Bacteriology (Washington D. C., EE.UU., 1981).
Estos medios que pueden utilizarse segun la invencion comprenden habitualmente, como se ha descrito anteriormente, una o varias fuentes de carbono, fuentes de nitrogeno, sales inorganicas, vitaminas y/u oligoelementos.
Fuentes de carbono preferidas son azucares, como mono-, di- o polisacaridos. Fuentes de carbono muy buenas son, por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidon o celulosa. Tambien pueden anadirse a los medios azucares mediante compuestos complejos, como molasas, u otros productos secundarios del refino del azucar. Tambien puede ser ventajoso anadir mezclas de distintas fuentes de carbono. Otras fuentes de carbono posibles son aceites y grasas como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y/o grasas de coco, acidos grasos como, por ejemplo, acido palmftico, acido estearico y/o acido linoleico, alcoholes y/o polialcoholes como, por ejemplo, glicerina, metanol y/o etanol y/o acidos organicos como, por ejemplo, acido acetico y/o acido lactico.
Las fuentes de nitrogeno son habitualmente compuestos de nitrogeno o materiales organicos o inorganicos que contienen estos compuestos. Fuentes de nitrogeno a modo de ejemplo comprenden amoniaco en forma lfquida o gaseosa o sales de amonio, como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoacidos o fuentes de nitrogeno complejas, como extracto soluble de mafz, harina de soja, protema de soja, extracto de levadura, extracto de pescado y otros. Las fuentes de nitrogeno pueden usarse por separado o como mezcla.
Los compuestos de sales inorganicas que pueden estar contenidos en los medios comprenden las sales de cloruro, fosforo o sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, cinc, cobre y hierro.
Como fuente de azufre para la produccion de los productos de qmmica fina que contienen azufre, especialmente de metionina, pueden usarse compuestos que contienen azufre inorganicos como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, pero tambien compuestos de azufre organicos, como mercaptanos y tioles.
Como fuente de fosforo puede usarse acido fosforico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes.
Pueden anadirse al medio formadores de quelatos para mantener los iones metalicos en disolucion. Formadores de quelatos especialmente adecuados comprenden dihidroxifenoles, como catecol o protocatecuato, o acidos organicos, como acido dtrico.
Los medios de fermentacion utilizados segun la invencion para el cultivo de microorganismos tambien contienen normalmente otros factores de crecimiento, como vitaminas o promotores del crecimiento, a los que pertenecen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, acido folico, acido nicotmico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales proceden frecuentemente de componentes de medios complejos, como extracto de levadura, molasas, extracto soluble de mafz y similares. Al medio de cultivo pueden anadfrsele ademas precursores adecuados. La composicion exacta de los compuestos del medio depende mucho del experimento respectivo y se decide individualmente para cada caso espedfico. Informacion sobre la optimizacion de medios puede obtenerse del libro de texto “Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 019963577 3). Los medios de crecimiento pueden obtenerse de proveedores comerciales, como Standard 1 (Merck) o BHI (Brain heart infusion, DIFCO) y similares.
Todos los componentes del medio se esterilizan o bien por calor (20 min a 1,5 bar y 121 °C) o por esterilizacion por filtracion. Los componentes pueden esterilizarse o bien juntos o en caso necesario separados. Todos los componentes del medio pueden anadirse al principio del cultivo o anadirse opcionalmente continuamente o por lotes. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente entre 15 °C y 45 °C, preferiblemente en 25 °C y 40 °C, y puede mantenerse constante o cambiarse durante el experimento. El valor de pH del medio debera encontrarse en el intervalo de 5 a 8,5, preferiblemente aproximadamente 7,0. El valor de pH para el cultivo puede controlarse durante el cultivo mediante la adicion de compuestos basicos como hidroxido sodico, hidroxido de potasio, amoniaco o agua amoniacal, o compuestos acidos como acido fosforico o acido sulfurico. Para controlar el desarrollo de espuma pueden utilizarse antiespumantes como, por ejemplo, poliglicolester de acido graso. Para mantener la estabilidad de los plasmidos, al medio pueden anadfrsele sustancias de accion selectiva adecuadas como, por ejemplo, antibioticos. Para mantener condiciones aerobias en el cultivo se introducen oxfgeno o mezclas de gases que contienen oxfgeno como, por ejemplo, aire ambiental. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente en 20 °C y 45 °C y preferiblemente en 25 °C y 40 °C. El cultivo continua hasta que se haya obtenido un maximo del producto deseado. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas a 160 horas.
Los caldos de fermentacion asf obtenidos que contienen especialmente acidos grasos poliinsaturados tienen normalmente una masa seca del 7,5 al 25 % en peso.
El caldo de fermentacion puede procesarse a continuacion. Dependiendo del requisito, la biomasa puede eliminarse completamente o parcialmente del caldo de fermentacion mediante procedimientos de separacion como, por ejemplo, centrifugacion, filtracion, decantacion o una combinacion de estos procedimientos o dejarse completamente en el. Ventajosamente, la biomasa se procesa despues de la separacion.
Pero el caldo de fermentacion tambien puede espesarse o concentrarse sin separacion celular con procedimientos conocidos como, por ejemplo, con ayuda de un rotavapor, evaporador de pelfcula, evaporador de pelfcula descendente, mediante osmosis inversa, o mediante nanofiltracion. Este caldo de fermentacion concentrado puede procesarse finalmente para obtener los acidos grasos en el contenidos.
Los acidos grasos obtenidos en el procedimiento tambien son adecuados como material de partida para la smtesis qmmica de otros productos de valor. Pueden usarse, por ejemplo, en combinacion entre sf o solos, para la produccion de farmacos, alimentos, piensos o cosmeticos.
Otro objeto descrito en el presente documento son secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con A5-elongasa, convirtiendo las A5-elongasas codificadas por las secuencias de acidos nucleicos acidos grasos C20 con al menos cuatro dobles enlaces en la molecula de acido graso; que se incorporan finalmente ventajosamente en diacilgliceridos y/o triacilgliceridos.
Son secuencias de acidos nucleicos aisladas ventajosas las secuencias de acidos nucleicos que codifican polipeptidos con actividad de A5-elongasa y que contienen una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de una secuencia de aminoacidos con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 o SEQ ID NO: 142.
Otras secuencias de acidos nucleicos aisladas ventajosas son secuencias de acidos nucleicos que codifican polipeptidos con actividad de A5-elongasa y que contienen una combinacion de las secuencias de aminoacidos seleccionadas del grupo:
a) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140; o
b) SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 142; o
c) SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 142. Las secuencias descritas en las secuencias SEQ ID NO: 115 (NXXXHXXMYXYYX), SEQ ID NO: 116 (HHXXXXWAWW), SEQ ID NO: 139 (LHXXHH), SEQ ID NO: 140 (TXXQXXQF), SEQ ID NO: 141 (DTXFMV) y SEQ ID NO: 142 (TQAQXXQF) describen regiones conservadas de las distintas elongasas. La Tabla 2 describe el significado de los aminoacidos marcados con X contenidos en las secuencias de acidos nucleicos mencionadas (Columna 3). Tambien pueden extraerse de la tabla los aminoacidos preferidos en las distintas posiciones (Columna 3). La columna 1 describe la SEQ ID NO, la columna 2 la posicion en la secuencia.
Tabla 2: Significado de los aminoacidos marcados con X en las secuencias consenso.
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continuacion
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Las A5-elongasas especialmente ventajosas contienen al menos una de las secuencias SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 141 y/o SEQ ID NO: 142.
Secuencias de acidos nucleicos aisladas especialmente ventajosas son secuencias seleccionadas del grupo: a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 133,
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132 o SEQ ID NO: 134, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 133, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 133 y presentan una actividad de A5-elongasa.
Tambien se describen secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A6-elongasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 183,
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 112 o SEQ ID NO: 184, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 183, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 112 o SEQ ID NO: 184 y presentan una actividad de A6-elongasa.
Tambien se describen secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de w3-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 105, b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 106, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 105, que codifican polipeptidos con al menos el 60 % de identidad al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 106 y presentan una actividad de u>3-desaturasa.
Se describen tambien secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A6-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 89 o en la SEQ ID NO: 97, b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 97, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98 y presentan una actividad de A6-desaturasa.
Se describen tambien secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A5-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 99 o en la SEQ ID NO: 101,
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100 o en la SEQ ID NO: 102, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 99 o en la SEQ ID NO: 101, que codifican polipeptidos con al menos el 40% de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 92, SEQ ID nO: 94, SEQ ID NO: 100 o en la SEQ ID NO: 102 y presentan una actividad de A5-desaturasa.
Se describen tambien secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A4-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 95 o en la SEQ ID NO: 103, b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 104, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 103, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 104 y presentan una actividad de A4-desaturasa.
Tambien se describen secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A12-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 107 o en la SEQ ID NO: 109,
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 110, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 109, que codifican polipeptidos con al menos el 50 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 108 o SEQ
ID NO: 110 y presentan una actividad de A12-desaturasa.
En el presente documento tambien estan descritas las secuencias de acidos nucleicos SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:
45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ
ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO:
137 o SEQ ID NO: 183, estando unido el acido nucleico funcionalmente con una o varias senales de regulacion.
Adicionalmente, otros genes de la biosmtesis del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos seleccionados del grupo acil-CoA-deshidrogenasa(s), acil-ACP [= protema transportadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), acido graso-acil-transferasa(s), acil-CoA:lisofosfolfpido-aciltransferasa(s), acido graso-sintasa(s), acido graso-hidroxilasa(s), acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), acido graso-desaturasa(s), acido graso-acetilenasas, lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, oxido de aleno-sintasas, hidroperoxido-liasas o acido graso-elongasa(s), pueden estar contenidos en la construccion genica. Ventajosamente estan contenidos adicionalmente genes de la biosmtesis del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos seleccionados del grupo de A4-desaturasa, A5-desaturasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A9-desaturasa, A12-desaturasa, A6-elongasa, A9-elongasa o u>3-desaturasa.
Ventajosamente, todas las secuencias de acidos nucleicos usadas en el procedimiento segun la invencion proceden de un organismo eucariota como una planta, un microorganismo o un animal. Las secuencias de acidos nucleicos proceden preferiblemente del genero Salmoniformes, Xenopus o Ciona, algas como Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena u Ostreococcus, hongos como el genero Phytophtora o de diatomeas como los generos Thalassiosira o Phaeodactylum.
Las secuencias de acidos nucleicos usadas en el procedimiento con secuencias que codifican protemas con actividad de w3-desaturasa, A4-desaturasa, A5-desaturasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A9-desaturasa, A12-desaturasa, A5-elongasa, A6-elongasa o A9-elongasa se introducen ventajosamente solos o preferiblemente en combinacion en un casete de expresion (=construccion de acido nucleico) que hace posible la expresion de los acidos nucleicos en un organismo, ventajosamente una planta o un microorganismo. En la construccion de acido nucleico puede estar contenida mas de una secuencia de acido nucleico de una actividad enzimatica como, por ejemplo, una A12-desaturasa, A4-desaturasa, A5-desaturasa, A6-desaturasa, A5-elongasa, A6-elongasa y/o w3-desaturasa.
Para la introduccion, los acidos nucleicos usados en el procedimiento se someten ventajosamente a una amplificacion y ligacion de manera conocida. Preferiblemente se procede segun el protocolo de la Pfu-ADN polimerasa o de una mezcla de Pfu/Taq-ADN polimerasa. Los cebadores se eligen segun la secuencia que vaya a amplificarse. De manera apropiada, los cebadores deberan elegirse de forma que el amplificado comprenda la secuencia codogenica entera desde el codon de iniciacion hasta el de parada. A continuacion de la amplificacion, el amplificado se analiza de manera apropiada. Por ejemplo, despues de la separacion por electroforesis en gel puede realizarse el analisis en lo referente a la calidad y cantidad. A continuacion, el amplificado puede purificarse segun un protocolo estandar (por ejemplo, Qiagen). Una almuota del amplificado purificado esta entonces a disposicion para la posterior clonacion. Vectores de clonacion adecuados son en general conocidos para el experto. A estos pertenecen especialmente vectores que son replicables en sistemas microbianos, es decir, sobre todo vectores que garantizan una clonacion eficaz en levaduras u hongos y hacen posible la transformacion estable de plantas. Son de mencionar especialmente distintos sistemas de vector binarios y co-integrados adecuados para la transformacion mediada por T-ADN. Los sistemas de vector de este tipo se caracterizan generalmente porque contienen al menos los genes vir necesarios para la transformacion mediada por Agrobacterium, asf como las secuencias delimitantes de T-ADN (lfmite T-ADN). Estos sistemas de vector tambien comprenden preferiblemente otras regiones reguladoras en cis como promotores y terminadores y/o marcadores de seleccion, con los que pueden identificarse organismos correspondientemente transformados. Mientras que en los sistemas de vector co-integrados estan dispuestos genes vir y secuencias de T-ADN en el mismo vector, los sistemas binarios se basan por lo menos en dos vectores, uno de los cuales lleva genes vir, pero ningun T-ADN, y un segundo lleva T-ADN, pero ningun gen vir. De esta manera, los ultimos vectores son relativamente pequenos, faciles de manipular y de replicar tanto en E. coli como tambien en Agrobacterium. A estos vectores binarios pertenecen vectores de las series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen.
Segun la invencion se usan preferiblemente Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV y pCAMBIA. Una vision general sobre los vectores binarios y su uso se da en Hellens y col., Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Para la produccion de vectores, los vectores pueden linealizarse inicialmente con endonucleasa(s) de restriccion y luego modificarse enzimaticamente de forma adecuada. A continuacion se purifica el vector y se utiliza una almuota para la clonacion.
En la clonacion, el amplificado enzimaticamente cortado y dado el caso purificado se clona con fragmentos de vector similarmente producidos utilizando ligasa. A este respecto, una construccion de acido nucleico o construccion de vector o plasmido determinada puede presentar una o tambien varias secciones genicas codogenicas.
Preferiblemente, las secciones genicas codogenicas estan enlazadas funcionalmente en estas construcciones con secuencias reguladoras. A las secuencias reguladoras pertenecen especialmente secuencias vegetales como los promotores y terminadores anteriormente descritos. Las construcciones pueden propagarse establemente de manera ventajosa en microorganismos, especialmente Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens, bajo condiciones selectivas y hacer posible una transferencia de ADN heterologo en plantas o microorganismos.
Mediante el uso ventajoso de los vectores de clonacion, los acidos nucleicos usados en el procedimiento, los acidos nucleicos descritos y las construcciones de acido nucleico pueden introducirse en organismos como microorganismos o ventajosamente plantas y asf usarse en la transformacion de plantas, como aquellos que se han publicado y citado en: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Capftulo 6/7, pag. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128­ 143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)). Los acidos nucleicos usados en el procedimiento, los acidos nucleicos descritos y las construcciones de acido nucleico y/o vectores pueden usarse, por tanto, para la modificacion por ingeniena genetica de un amplio espectro de organismos, ventajosamente en plantas, de manera que estos sean productores mejores y/o mas eficaces de PUFA.
Hay una serie de mecanismos mediante los cuales es posible un cambio de la protema A-12-desaturasa, A-5-elongasa, A-6-elongasa, A-5-desaturasa, A-4-desaturasa, A-6-desaturasa, y/o w3-desaturasa, asf como de las otras protemas usadas en el procedimiento como las protemas A12-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa o A4-desaturasa, de manera que el rendimiento, produccion y/o eficiencia de la produccion de los acidos grasos ventajosamente poliinsaturados en una planta pueda influirse directamente preferiblemente en una planta oleaginosa o un microorganismo debido a esta protema modificada. El numero o la actividad de protemas o genes A12-desaturasa, w3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o A4-desaturasa puede elevarse, de manera que se produzcan mayores cantidades de productos genicos y, por tanto, por ultimo lugar mayores cantidades de los compuestos de formula general I. Tambien es posible una smtesis de novo en un organismo que carece de la actividad y capacidad para la biosmtesis de los compuestos antes de la introduccion del/de los gen/genes correspondiente/s. Se aplica analogamente a la combinacion con otras desaturasas o elongasas u otras enzimas del metabolismo de los acidos grados y de los lfpidos. A este respecto tambien puede ser ventajoso el uso de distintas secuencias divergentes, es decir, secuencias distintas al nivel de secuencia de ADN o el uso de promotores para la expresion genica que hace posible otra expresion genica temporal, por ejemplo, en funcion del grado de maduracion de una semilla o tejido que almacena aceite.
Mediante la introduccion de un gen A12-desaturasa, w3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa y/o A4-desaturasa en un organismo solo o en combinacion con otros genes en una celula puede elevarse no solo el flujo de biosmtesis hacia el producto final, sino tambien elevarse la composicion de triacilglicerina correspondiente o lograrse de novo. Igualmente, puede aumentarse el numero o la actividad de otros genes que en la importacion de nutrientes que son necesarios para la biosmtesis de uno o varios acidos grasos, aceites, lfpidos polares y/o neutros, de manera que se aumente la concentracion de estos precursores, cofactores o compuestos intermedios dentro de las celulas o dentro del compartimento de almacenamiento, por lo que se aumenta adicionalmente la capacidad de las celulas para la produccion de PUFA, como se describe a continuacion. Mediante la optimizacion de la actividad o el aumento del numero de uno o varios genes A12-desaturasa, w3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o A4-desaturasa, que participan en la biosmtesis de estos compuestos, o mediante la destruccion de la actividad de uno o varios genes que participan en la degradacion de estos compuestos, puede ser posible aumentar el rendimiento, la produccion y/o la eficiencia de la produccion de moleculas de acidos grasos y de lfpidos de organismos y ventajosamente de plantas.
Las moleculas de acido nucleico aisladas usadas en el procedimiento segun la invencion codifican protemas o partes de estas, conteniendo las protemas o la protema individual o partes de estas una secuencia de aminoacidos que es suficientemente homologa a una secuencia de aminoacidos que esta representada en las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 184, de manera que las protemas o partes de las mismas todavfa presentan una actividad de A12-desaturasa, w3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o A4-desaturasa. Preferiblemente, las protemas o partes de las mismas, que son codificadas por la molecula de acido nucleico/las moleculas de acido nucleico, tienen todavfa su actividad enzimatica esencial y la capacidad de participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la smtesis de membranas celulares o corpusculos lipfdicos en organismos, ventajosamente en plantas, o en el transporte de moleculas a traves de estas membranas. Las protemas codificadas por las moleculas de acido nucleico son ventajosamente al menos aproximadamente el 50 %,
preferiblemente al menos aproximadamente el 60 % y mas preferiblemente al menos aproximadamente el 70 %,
80 % o el 90 % y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %,
92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas identicas a las secuencias de aminoacidos representadas
en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14,
SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID N SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID N SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID N SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID N SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID N SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO:
102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ
ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO:
184. Por homologfa u homologo debe entenderse, en el sentido de la invencion, identidad o identico.
La homologfa se calculo a lo largo de la region entera de la secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos. Para la
comparacion de distintas secuencias estan a disposicion del experto una serie de programas que se basan en
distintos algoritmos. A este respecto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman proporcionan
resultados especialmente fiables. Para las comparaciones de secuencias se uso el programa PileUp (J. Mol.
Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins y col., CABIOS, 51989: 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman
y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)] que estan
contenidos en el paquete informatico GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA
53711 (1991)]. Los valores de homologfa de secuencia especificados en porcentaje anteriormente se determinaron
con el programa GAP a lo largo de la region entera de la secuencia con los siguientes ajustes: Gap Weight: 50,
Length Weight: 3, Average Match: 10,000 y Average Mismatch: 0,000. A menos que se especifique otra cosa, estos
ajustes se usaron siempre como ajustes estandar para comparaciones de secuencias.
Por actividad enzimatica esencial de la A-12-desaturasa, u>-3-desaturasa, A-9-elongasa, A-6-desaturasa, A-8-desaturasa, A-6-elongasa, A-5-desaturasa, A-5-elongasa o A-4-desaturasa usada en el procedimiento segun la
invencion debe entenderse que, en comparacion con las protemas/enzimas codificadas por la secuencia con la SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID
NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID
NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID
NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID
NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID
NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID
NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ
ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO:
117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183 y
sus derivados,
presentan en comparacion incluso al menos una actividad enzimatica de al menos el 10 %, preferiblemente el 20 %,
con especial preferencia el 30 % y muy especialmente el 40 % y, por tanto, pueden participar en el metabolismo de
compuestos necesarios para la smtesis de acidos grasos, esteres de acidos grasos como diacilgliceridos y/o
triacilgliceridos en un organismo, ventajosamente una planta o celula de planta, o en el transporte de moleculas a
traves de membranas, significando cadenas de carbono C-is, C20 o C22 en la molecula de acido graso con dobles
enlaces en al menos dos, ventajosamente tres, cuatro, cinco o seis sitios.
Los acidos nucleicos que pueden utilizarse ventajosamente en el procedimiento proceden de bacterias, hongos,
diatomeas, animales como Caenorhabditis u Oncorhynchus, o plantas como algas o musgos como los generos
Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus,
Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, especialmente de los
generos y las especies Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis, Thalassiosira pseudonana,
Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora
infestans, Fusarium graminearum, Crypthecodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita
farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum,
Caenorhabditis elegans o especialmente ventajosamente de Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira
pseudonana o Crypthecodinium cohnii.
Alternativamente, en el procedimiento segun la invencion pueden usarse secuencias de nucleotidos que codifican
una A12-desaturasa, u>3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o A4-desaturasa y que se hibridan con una secuencia de nucleotidos, como se representa en la SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:
29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:
43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO:
61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO:
75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:
89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183, ventajosamente bajo condiciones rigurosas.
Las secuencias de acidos nucleicos usados en el procedimiento se introducen ventajosamente en un casete de expresion que hace posible la expresion de acidos nucleicos en organismos como microorganismos o plantas.
A este respecto, las secuencias de acidos nucleicos que codifican la A12-desaturasa, w3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o A4-desaturasa, se enlazan funcionalmente con una o varias senales de regulacion de manera ventajosa para elevar la expresion genica. Estas secuencias reguladoras deberan hacer posible la expresion espedfica de los genes y la expresion de protemas. Esto puede significar, por ejemplo, dependiendo del organismo huesped, que el gen solo se expresa y/o expresa en exceso despues de la induccion, o que se expresa y/o expresa en exceso inmediatamente. Por ejemplo, en el caso de estas secuencias reguladoras se trata de secuencias a las que se unen inductores o represores y asf regulan la expresion de acido nucleico. Ademas de estas nuevas secuencias de regulacion o en lugar de estas secuencias, la regulacion natural de estas secuencias puede incluso estar presente antes de los propios genes estructurales y dado el caso estar geneticamente modificada, de manera que se desconecte la regulacion natural y se eleve la expresion de los genes. Pero el casete de expresion (=construccion de expresion =construccion genica) tambien puede estar construido de forma mas sencilla, es decir, no se insertaron senales de regulacion adicionales antes de la secuencia de acido nucleico o sus derivados y no se elimino el promotor natural con su regulacion. En su lugar, la secuencia de regulacion natural se muto de forma que ya no se realizara la regulacion y/o se aumentara la expresion genica. Estos promotores modificados tambien pueden introducirse en forma de secuencias parciales (=promotor con partes de las secuencias de acidos nucleicos) solas antes del gen natural para aumentar la actividad. La construccion genica tambien puede ademas contener de manera ventajosa una o varias de las llamadas “secuencias promotoras” enlazadas funcionalmente con el promotor que hacen posible una elevada expresion de la secuencia de acido nucleico. Tambien en los extremos 3' de las secuencias de ADN pueden insertarse secuencias ventajosas adicionales, como otros elementos reguladores o terminadores. Los genes A12-desaturasa, w3-desaturasa, A4-desaturasa, A5-desaturasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A5-elongasa, A6-elongasa y/o A9-elongasa pueden estar contenidos en una o varias copias en el casete de expresion (=construccion genica). Ventajosamente solo existe respectivamente una copia de los genes en el casete de expresion. Esta construccion genica o las construcciones genicas pueden expresarse juntas en el organismo huesped. A este respecto, la construccion genica o las construcciones genicas pueden estar insertadas en uno o varios vectores y estar presentes libres en la celula o bien estar insertadas en el genoma. Es ventajoso para la insercion de otros genes en el genoma del huesped cuando los genes que van a expresarse estan presentes juntos en una construccion genica.
A este respecto, como se ha descrito arriba, las secuencias reguladoras o factores pueden influir preferiblemente positivamente en la expresion genica de los genes introducidos y de esta manera aumentarla. Asf, puede tener lugar un refuerzo de los elementos reguladores de manera ventajosa al nivel de la transcripcion, usandose senales de transcripcion fuertes como “promotores” y/o “potenciadores”. Pero, ademas tambien es posible un refuerzo de la traduccion, mejorandose, por ejemplo, la estabilidad del ARNm.
Tambien se describen una o varias construcciones genicas que contienen una o varias secuencias que estan definidas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183 o sus derivados y codifican polipeptidos segun SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 184. A este respecto, las protemas A12-desaturasa, w3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa o A4-desaturasa mencionadas conducen ventajosamente a una desaturacion o alargamiento de los acidos grasos, presentando el sustrato ventajosamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces y presentando ventajosamente 18, 20 o 22 atomos de carbono en la molecula de acido graso. Lo mismo se aplica para sus homologos, derivados o analogos que estan unidos funcionalmente con una o varias senales de regulacion, de manera ventajosa para aumentar la expresion genica.
Secuencias de regulacion ventajosas para el nuevo procedimiento estan presentes, por ejemplo, en promotores, como el promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, A-PR o A-PL y se usan de manera ventajosa en bacterias Gram-negativas. Otras secuencias de regulacion ventajosas estan presentes, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de levadura u hongos ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores de planta CaMV/35S [Franck y col., Cell 21 (1980) 285­ 294], PRP1 [Ward y col., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o en el promotor de ubiquitina o faseolina. En este contexto tambien estan ventajosamente promotores inducibles, como los promotores descritos en el documento EP-A-0388186 (inducibles por bencilsulfonamida), Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz y col., inducibles por tetraciclina), el documento EP-A-0 335 528 (inducibles por acido absdsico) o el documento WO 93/21334 (inducibles por etanol o ciclohexenol). Otros promotores de planta adecuados son el promotor de FBPasa citosolica o el promotor de ST-LSI de la patata (Stockhaus y col., EMBO J. 8, 1989, 2445), el promotor de la fosforribosilpirofosfatoamidotransferasa de Glycine max (numero de acceso de Genbank U87999) o el promotor no espedfico descrito en el documento EP-A-0 249 676. Promotores especialmente ventajosos son promotores que hacen posible la expresion en tejidos que participan en la biosmtesis de acidos grasos. Son muy especialmente ventajosos los promotores espedficos de semilla, como el promotor USP segun la realizacion, pero tambien otros promotores como el promotor LeB4, DC3, faseolina o napina. Otros promotores especialmente ventajosos son promotores espedficos de semilla que pueden usarse para plantas monocotiledoneas o dicotiledoneas y se describen en el documento US 5.608.152 (promotor de napina de colza), el documento WO 98/45461 (promotor de oleosina de Arabidopsis), el documento US 5.504.200 (promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris), el documento WO 91/13980 (promotor Bce4 de Brassica), por Baeumlein y col., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (promotor LeB4 de una leguminosa), siendo adecuados estos promotores para dicotiledoneas. Los siguientes promotores son adecuados, por ejemplo, para monocotiledoneas promotor Ipt-2 o Ipt-1 de cebada (documentos WO 95/15389 y WO 95/23230), promotor de hordema de cebada y otros promotores adecuados descritos en el documento WO 99/16890.
En principio es posible usar todos los promotores naturales con sus secuencias de regulacion, como las anteriormente mencionadas, para el nuevo procedimiento. Tambien es posible y ventajoso usar promotores sinteticos adicionalmente o solos, especialmente cuando median en una expresion espedfica de semilla como se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/16890.
Para lograr un contenido especialmente alto de PUFA, sobre todo en plantas transgenicas, los genes de la biosmtesis de PUFA deberan expresarse ventajosamente en semillas oleaginosas de forma espedfica de semilla. Para esto pueden usarse promotores espedficos de semilla, o aquellos promotores que son activos en el embrion y/o en el endospermo. Los promotores espedficos de semilla pueden aislarse fundamentalmente tanto de plantas dicotiledoneas como tambien de monocotiledoneas. A continuacion se citan promotores preferidos ventajosos: USP (=protema de semilla desconocida) y vicilina (Vicia faba) [Baumlein y col., Mol. Gen Genet., 1991, 225(3)], napina (colza) [documento US 5.608.152], protema transportadora de acilo (colza) [documentos US 5.315.001 y WO 92/18634], oleosina (Arabidopsis thaliana) [documentos WO 98/45461 y WO 93/20216], faseolina (Phaseolus vulgaris) [documento US 5.504.200], Bce4 [documento WO 91/13980], B4 de leguminosas (promotor LegB4) [Baumlein y col., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 y Ipt1 (cebada) [documentos WO 95/15389 y WO 95/23230], promotores espedficos de semilla de arroz, mafz y trigo [documento Wo 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 y aleurama [documento uS 5.677.474], Bce4 (colza) [documento Us 5.530.149], glicinina (soja) [documento e P 571 741], fosfoenolpiruvatocarboxilasa (soja) [documento JP 06/62870], ADR12-2 (soja) [documento WO 98/08962], isocitratoliasa (colza) [documento US 5.689.040] o a-amilasa (cebada) [documento Ep 781849].
La expresion genica en plantas tambien puede facilitarse mediante un promotor qmmicamente inducible (vease una vision general en Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Los promotores qmmicamente inducibles son adecuados especialmente cuando se desee que la expresion genica se realice de forma espedfica del tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por acido salidlico (documento WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y col. (1992) Plant J. 2, 397-404) y un promotor inducible por etanol.
Para garantizar una integracion estable de los genes de la biosmtesis en las plantas transgenicas a traves de varias generaciones, cada uno de los acidos nucleicos usados en el procedimiento, que codifican la A12-desaturasa, m3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa y/o A4-desaturasa, deberan expresarse bajo el control de un promotor propio, preferiblemente de uno diferente, ya que motivos de secuencia repetitivos pueden conducir a inestabilidad del T-ADN o a eventos de recombinacion. A este respecto, el casete de expresion esta ventajosamente construido de forma que a un promotor le sigue un sitio de escision adecuado para la insercion del acido nucleico que va a expresarse, ventajosamente en un policonector, a continuacion dado el caso se encuentra un terminador detras del policonector. Esta secuencia se repite varias veces, preferiblemente tres, cuatro o cinco veces, de manera que hasta cinco genes puedan combinarse en una construccion y asf puedan introducirse para la expresion en las plantas transgenicas. La secuencia se repite ventajosamente hasta tres veces. Las secuencias de acidos nucleicos se insertan para la expresion mediante el sitio de escision adecuado, por ejemplo, en el policonector detras del promotor. Ventajosamente, cada secuencia de acido nucleico tiene su propio promotor y dado el caso su propio terminador. Construcciones ventajosas de este tipo se dan a conocer, por ejemplo, en los documentos DE 10102337 o DE 10102338. Pero tambien es posible insertar varias secuencias de acidos nucleicos detras de un promotor y dado el caso antes de un terminador. A este respecto, el sitio de insercion o la serie de acidos nucleicos insertados en el casete de expresion no es de importancia decisiva, es decir, una secuencia de acido nucleico puede estar insertada en un primer o ultimo sitio en el casete, sin que de esta manera se influya esencialmente en la expresion. En el casete de expresion pueden usarse ventajosamente diferentes promotores como, por ejemplo, el promotor USP, LegB4 o DC3 y diferentes terminadores. Pero tambien es posible usar solo un tipo de promotor en el casete. Sin embargo, esto puede conducir a eventos de recombinacion no deseados.
Como se ha descrito anteriormente, la transcripcion de los genes introducidos debera interrumpirse ventajosamente por terminadores adecuados en los extremos 3' de los genes de la biosmtesis introducidos (detras del codon de parada). Aqrn puede usarse, por ejemplo, el terminador OCS1. Al igual que para los promotores, aqrn deberan entonces usarse diferentes secuencias de terminador para cada gen.
La construccion genica tambien puede comprender, como se ha descrito anteriormente, otros genes que deberan introducirse en los organismos. Es posible y ventajoso introducir en los organismos huesped, y expresar en ellos, genes de regulacion, como genes para inductores, represores o enzimas que, debido a su actividad enzimatica, cooperan en la regulacion de uno o varios genes de una via de biosmtesis. Estos genes pueden ser de origen heterologo u homologo. Ademas, en la construccion de acido nucleico o construccion genica pueden estar contenidos ventajosamente otros genes de la biosmtesis del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos o bien estos genes pueden estar presentes en otra o varias otras construcciones de acido nucleico. Como genes de la biosmtesis del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos se usan ventajosamente un gen seleccionado del grupo acil-CoA-deshidrogenasa(s), acil-ACP [=protema transportadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), acido graso-acil-transferasa(s), acil-CoA:lisofosfolfpido-aciltransferasa(s), acido graso-sintasa(s), acido graso-hidroxilasa(s), acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), acido graso-desaturasa(s), acido graso-acetilenasa(s), lipoxigenasa(s), triacilglicerol-lipasa(s), oxido de aleno-sintasa(s), hidroperoxido-liasa(s) o acido graso-elongasa(s) o sus combinaciones. Secuencias de acidos nucleicos especialmente ventajosas son genes de la biosmtesis del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos seleccionados del grupo de acil-CoA:lisofosfolfpido-aciltransferasa, u>3-desaturasa, A4-desaturasa, A5-desaturasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A9-desaturasa, A12-desaturasa, A5-elongasa, A6-elongasa y/o A9-elongasa.
A este respecto, los acidos nucleicos o genes previamente mencionados pueden clonarse en casetes de expresion, como los previamente mencionados, en combinacion con otras elongasas y desaturasas, y utilizarse para la transformacion de plantas con ayuda de Agrobacterium.
A este respecto, las secuencias reguladoras o factores pueden, como se ha descrito anteriormente, influir positivamente preferiblemente en la expresion genica de los genes introducidos y asf aumentarla. Asf puede realizarse de manera ventajosa un refuerzo de los elementos reguladores al nivel de la transcripcion, usandose senales de transcripcion fuertes como promotores y/o potenciadores. Pero ademas tambien es posible un refuerzo de la traduccion, mejorandose, por ejemplo, la estabilidad del ARNm. Los casetes de expresion pueden usarse fundamentalmente directamente para la introduccion en las plantas o bien introducirse en un vector.
Estos vectores ventajosos, preferiblemente vectores de expresion, contienen los acidos nucleicos usados en el procedimiento, que codifican las A12-desaturasas, w3-desaturasas, A9-elongasas, A6-desaturasas, A8-desaturasas, A6-elongasas, A5-desaturasas, A5-elongasas o A4-desaturasas, o una construccion de acido nucleico que el acido nucleico usado solo o en combinacion con otros genes de la biosmtesis del metabolismo de los acidos grasos o de los lfpidos como las acil-CoA:lisofosfolfpido-aciltransferasas, u>3-desaturasas, A4-desaturasas, A5-desaturasas, A6-desaturasas, A8-desaturasas, A9-desaturasas, A12-desaturasas, w3-desaturasas, A5-elongasas, A6-elongasas y/o A9-elongasas. Como se usa aqrn, el termino “vector” se refiere a una molecula de acido nucleico que puede transportar otro acido nucleico al que esta unido. Un tipo de vector es un “plasmido”, que representa un bucle de ADN bicatenario circular, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores pueden replicarse autonomamente en una celula huesped en la que estan introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos con origen de replicacion bacteriano). Otros vectores se integran ventajosamente en el genoma de una celula huesped durante la introduccion en la celula huesped y de esta manera se replican junto con el genoma del huesped. Ademas, determinados vectores pueden controlar la expresion de genes con los que estan funcionalmente unidos. Estos vectores se denominan aqrn “vectores de expresion”. Habitualmente, los vectores de expresion que son adecuados para las tecnicas de recombinacion de ADN tienen la forma de plasmidos. En la presente descripcion pueden usarse indistintamente “plasmido” y “vector”, ya que el plasmido es la forma de vector mas frecuentemente usada. Sin embargo, la invencion debera comprender estas otras formas de vectores de expresion, como vectores virales, que desempenan funciones similares. Ademas, el termino vector tambien debera comprender otros vectores que son conocidos para el experto, como fagos, virus, como SV40, CMV, TMV, transposones, elementos IS, fasmidos, fagemidos, cosmidos, ADN lineal o circular.
Los vectores de expresion recombinantes usados ventajosamente en el procedimiento comprenden los acidos nucleicos descritos mas adelante o la construccion genica anteriormente descrita en una forma que es adecuada para la expresion de los acidos nucleicos usados en una celula huesped, lo que significa que los vectores de expresion recombinantes comprenden una o varias secuencias de regulacion, seleccionadas basandose en las celulas huesped que van a usarse para la expresion, que estan funcionalmente unidas con la secuencia de acido nucleico que va a expresarse. En un vector de expresion recombinante, “funcionalmente unido” significa que la secuencia de nucleotidos de interes esta unida a la(s) secuencia(s) de regulacion de tal forma que es posible la expresion de la secuencia de nucleotidos y estan unidas entre sf de manera que ambas secuencias cumplen la funcion predicha atribuida a la secuencia (por ejemplo, en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula huesped, cuando el vector se introduce en la celula huesped). El termino “secuencia de regulacion” debera comprender promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion). Estas secuencias de regulacion se describen, por ejemplo, en Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), o vease: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, Ed.: Glick y Thompson, Capitulo 7, 89­ 108, incluidas las referencias en ellos. Las secuencias de regulacion comprenden aquellas que controlan la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celulas huesped, y aquellas que controlan la expresion directa de las secuencia de nucleotidos solo en determinadas celulas huesped bajo determinadas condiciones. El experto sabe que el diseno del vector de expresion puede depender de factores, como la seleccion de la celula huesped que va a transformarse, el grado de expresion de la protema deseada, etc.
Los vectores de expresion recombinantes usados pueden estar disenados para la expresion de A12-desaturasas, w3-desaturasas, A9-elongasas, A6-desaturasas, A8-desaturasas, A6-elongasas, A5-desaturasas, A5-elongasas y/o A4-desaturasas en celulas procariotas o eucariotas. Esto es ventajoso, ya que frecuentemente se realizan etapas intermedias de la construccion de vectores en microorganismos por motivos de simplicidad. Por ejemplo, pueden expresarse los genes A12-desaturasa, w3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa y/o A4-desaturasa en celulas bacterianas, celulas de insecto (usando vectores de expresion en baculovirus), celulas de levadura y otras celulas fungicas (veanse Romanos, M.A., y col. (1992) “Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., y col. (1991) “Heterologous gene expression in filamentous fungi”, en: More genes Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Ed., S. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., y col., ed., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore y col., 1999, Marine Biotechnology,1, 3:239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella y Stylonychia, especialmente el genero Stylonychia lemnae, con vectores despues de un procedimiento de transformacion, como se describe en el documento WO 98/01572, asf como preferiblemente en celulas de plantas pluricelulares (veanse Schmidt, R. y Willmitzer, L. (1988) “High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotiledon explants” Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Capttulo 6/7, pag. 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, ed.: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (y referencias citadas en ellos)). Celulas huesped adecuadas se tratan ademas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). El vector de expresion recombinante puede alternativamente, por ejemplo, transcribirse y traducirse in vitro usando secuencias de regulacion de promotores T7 y T7-polimerasas.
La expresion de protemas en procariotas se realiza principalmente con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que controlan la expresion de protemas de fusion o no de fusion. Vectores de expresion de fusion tfpicos son, entre otros, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), en los que la glutation-S-transferasa (GST), protema de union a maltosa E o protema A se fusiona con la protema diana recombinante.
Ejemplos de vectores de expresion en E. coli no de fusion inducibles adecuados son, entre otros, pTrc (Amann y col. (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier y col., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresion de genes diana del vector pTrc se basa en la transcripcion mediante ARN polimerasa del huesped de un promotor de fusion fnbrido trp-lac. La expresion de genes diana del vector pET 11d se basa en la transcripcion de un promotor de fusion T7-gn10-lac que esta mediada por una ARN polimerasa viral expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se proporciona por las cepas huesped BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) de un profago A residente que aloja un gen T7 gn1 bajo el control de la transcripcion del promotor lacUV 5.
El experto conoce otros vectores adecuados en organismos procariotas, estos vectores son, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, la serie pBR, como pBR322, la serie pUC, como pUC18 o pUC19, la serie M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-IN113-B1, Agt11 o pBdCl, en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAj667.
En otra forma de realizacion, el vector de expresion es un vector de expresion en levadura. Ejemplos de vectores para la expresion en la levadura S. cerevisiae comprenden pYe-Desaturasec1 (Baldari y col. (1987) Embo J. 6:229­ 234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz y col. (1987) Gene 54:113-123), asf como pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y procedimientos para la construccion de vectores que son adecuados para el uso en otros hongos, como los hongos filamentosos, comprenden aquellos que se han descrito exhaustivamente en: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy y col., ed., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, o en: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, ed., S.
396-428: Academic Press: San Diego]. Otros vectores de levadura adecuados son, por ejemplo, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23.
Alternativamente, las A12-desaturasas, m3-desaturasas, A9-elongasas, A6-desaturasas, A8-desaturasas, A6-elongasas, A5-desaturasas, A5-elongasas y/o A4-desaturasas pueden expresarse en celulas de insecto usando vectores de expresion de baculovirus. Los vectores de baculovirus que estan disponibles para la expresion de protemas en celulas de insecto cultivadas (por ejemplo, celulas Sf9) comprenden la serie pac (Smith y col. (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).
Los vectores anteriormente mencionados ofrecen no solo una pequena vision general de posibles vectores adecuados. El experto conoce otros plasmidos y se describen, por ejemplo, en: Cloning Vectors (ed. Pouwels, P.H., y col., Elsevier, Amsterdam-Nueva York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018). Otros sistemas de expresion adecuados para celulas procariotas y eucariotas, veanse en los Capftulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
En otra forma de realizacion del procedimiento, las A12-desaturasas, m3-desaturasas, A9-elongasas, A6-desaturasas, A8-desaturasas, A6-elongasas, A5-desaturasas, A5-elongasas y/o A4-desaturasas pueden expresarse en celulas de plantas unicelulares (como algas), vease Falciatore y col., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 y referencias citadas en su interior, y celulas de planta de plantas superiores (por ejemplo, espermatofitos, como cultivos). Ejemplos de vectores de expresion en plantas comprenden aquellos que se describen detalladamente en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., y Masterson, R. (1992) “New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; y Bevan, M.W. (1984) “Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, ed.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Un casete de expresion en plantas contiene preferiblemente secuencias de regulacion que pueden controlar la expresion genica en celulas de planta y estan unidas funcionalmente de manera que cada secuencia pueda cumplir su funcion, como terminacion de la transcripcion, por ejemplo, senales de poliadenilacion. Senales de poliadenilacion preferidas son aquellas que proceden de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, como el gen 3 conocido como octopinsintasa del plasmido Ti pTiACH5 (Gielen y col., EMBO J. 3 (1984) 835 y siguientes) o equivalentes funcionales de los mismos, pero tambien son adecuados todos los otros terminadores funcionalmente activos en plantas.
Como la expresion genica de plantas no esta muy frecuentemente limitada al nivel de la transcripcion, un casete de expresion en plantas contiene preferiblemente otras secuencias funcionalmente unidas, como potenciadores de la traduccion, por ejemplo, la secuencia de conduccion por exceso que contiene la secuencia conductora no traducida en 5' del virus del mosaico del tabaco que aumenta la relacion protema/ARN (Gallie y col., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).
La expresion genica de plantas debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida funcionalmente con un promotor adecuado que realiza la expresion genica en el momento adecuado, de forma espedfica de celula o de tejido. Promotores utiles son promotores constitutivos (Benfey y col., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), como aquellos que proceden de virus de planta, como CAMV 35S (Franck y col., Cell 21 (1980) 285-294), CaMv 19S (veanse tambien los documentos US 5352605 y WO 84/02913) o promotores de planta, como el de la subunidad pequena de Rubisco descrito en el documento US 4.962.028.
Otras secuencias preferidas para su uso para el enlace funcional en los casetes de expresion genica en plantas son secuencias que eligen diana que son necesarias para controlar el producto genico en su compartimento celular correspondiente (vease una vision general en Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 y referencias allf citadas), por ejemplo, en las vacuolas, el nucleo celular, todos los tipos de plastidos, como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, las mitocondrias, el retfculo endoplasmico, elaioplastos, peroxisomas y otros compartimentos de las celulas de plantas.
La expresion de genes de planta tambien puede facilitarse, como se ha descrito anteriormente, mediante un promotor qmmicamente inducible (vease una vision general en Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Los promotores qmmicamente inducibles son especialmente adecuados cuando se desea que la expresion genica se realice de forma espedfica del tiempo. Ejemplos de aquellos promotores son un promotor inducible por acido salidlico (documento WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y col. (1992) Plant J. 2, 397-404) y un promotor inducible por etanol.
Tambien son promotores adecuados los promotores que reaccionan a condiciones de estres biotico o abiotico, por ejemplo, el promotor del gen PRP1 inducido por patogenos (Ward y col., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), el promotor hsp80 inducido por calor del tomate (documento US 5.187.267), el promotor de alfa-amilasa inducido por el fno de la patata (documento WO 96/12814) o el promotor pinll inducible por heridas (documento EP-A-0375091). Se prefieren especialmente aquellos promotores que provocan la expresion genica en tejidos y organos en los que tiene lugar la biosmtesis de acidos grasos, Kpidos y aceite, en celulas de semilla, como las celulas del endospermo y del embrion que se esta desarrollando. Promotores adecuados son el promotor del gen de napina de la colza (documento US 5.608.152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein y col., Mol Gen Genet, 1991,225 (3):459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (documento WO 98/45461), el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (documento US 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (documento WO 91/13980) o el promotor B4 de leguminosa (LeB4; Baeumlein y col., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9), asf como promotores que provocan la expresion espedfica de semilla en plantas monocotiledoneas, como mafz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Promotores adecuados a tener en cuenta son el promotor del gen lpt2 o Ipt1 de la cebada (documentos WO 95/15389 y WO 95/23230) o los descritos en el documento WO 99/16890 (promotores del gen hordema de la cebada, gen glutelina del arroz, gen orizina del arroz, gen prolamina del arroz, gen gliadina del trigo, gen glutelina del trigo, gen zema del mafz, gen glutelina de la avena, gen karisina del sorgo, gen secalina del centeno).
Especialmente puede desearse la expresion multiparalela de las A12-desaturasas, w3-desaturasas, A9-elongasas, A6-desaturasas, A8-desaturasas, A6-elongasas, A5-desaturasas, A5-elongasas y/o A4-desaturasas usadas en el procedimiento. La introduccion de aquellos casetes de expresion puede realizarse mediante una transformacion simultanea de varias construcciones de expresion individuales o preferiblemente mediante la combinacion de varios casetes de expresion en una construccion. Tambien pueden transformarse varios vectores con respectivamente varios casetes de expresion y transferirse a la celula huesped.
Tambien son especialmente adecuados promotores que provocan la expresion espedfica de plastido, ya que los plastidos son el compartimento en el que se sintetizan los precursores, asf como algunos productos finales de la biosmtesis de los lfpidos. Promotores adecuados, como el promotor de la ARN polimerasa viral, se describen en los documentos WO 95/16783 y WO 97/06250, y el promotor clpP de Arabidopsis, descrito en el documento WO 99/46394.
El ADN de vector puede introducirse en celulas procariotas o eucariotas mediante tecnicas de transformacion o transfeccion convencionales. Los terminos transformacion” y “transfeccion”, conjugacion y traduccion, como se usan aqrn, deberan comprender multiples procedimientos conocidos en el estado de la tecnica para introducir acido nucleico extrano (por ejemplo, ADN) en una celula huesped, incluidos coprecipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofeccion, competencia natural, transferencia qmmicamente mediada, electroporacion o exclusion de partmulas. Procedimientos adecuados para la transformacion o transfeccion de celulas huesped, incluidas celulas de planta, pueden encontrarse en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny , 1989) y otros manuales de laboratorio, como Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, ed.: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Celulas huesped, que en principio son adecuadas para captar el acido nucleico, el producto genico o el vector, son todos los organismos procariotas o eucariotas. Los organismos huesped usados de manera ventajosa son microorganismos, como hongos o levaduras, o celulas de planta, preferiblemente plantas o partes de las mismas. Se usan preferiblemente hongos, levaduras o plantas, con especial preferencia plantas, de manera muy especialmente preferida plantas, como plantas oleaginosas, que contienen grandes cantidades de compuestos lipfdicos, como colza, onagra, canamo, cardamo, cacahuete, canola, lino, soja, cardo, girasol, borraja, o plantas, como mafz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, algodon, yuca, pimienta, clavelon, plantas solanaceas, como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies de Vicia, guisantes, alfalfa, plantas arbusto (cafe, cacao, te), especies de Salix, arboles (palma aceitera, coco), asf como pastos perennes y plantas para forraje. Plantas especialmente preferidas segun la invencion son plantas oleaginosas, como soja, cacahuete, colza, canola, lino, canamo, onagra, girasol, cardo, arboles (palma aceitera, coco).
Otro objeto desvelado es, como se ha descrito anteriormente, una secuencia de acido nucleico aislada con una secuencia, que codifica polipeptidos con actividad de A5-elongasa, convirtiendo la elongasa codificada por las secuencias de acidos nucleicos los acidos grasos C16 y C18 con un doble enlace y ventajosamente los acidos grasos C18 poliinsaturados con un doble enlace en A6 y los acidos grasos C20 poliinsaturados con un doble enlace en A5. Los acidos grasos C22 no se alargan.
Las secuencias de acidos nucleicos aisladas ventajosas son secuencias de acidos nucleicos que codifican polipeptidos con actividad de A5-elongasa y que contienen una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de una secuencia de aminoacidos con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 o SEQ ID NO: 142.
Otras secuencias de acidos nucleicos aisladas ventajosas son secuencias de acidos nucleicos que codifican polipeptidos con actividad de A5-elongasa y que contienen una combinacion de las secuencias de aminoacidos seleccionadas del grupo:
a) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140; o
b) SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 142; o
c) SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 142. Las secuencias de acidos nucleicos preferidas que codifican polipeptidos con actividad de A5-elongasa contienen ventajosamente las secuencias de aminoacidos previamente mencionadas. Estas se describen mas detalladamente en la Tabla 2.
Secuencias de acidos nucleicos aisladas especialmente ventajosas son secuencias seleccionadas del grupo: a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 133,
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132 o SEQ ID NO: 134, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 133, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132 o SEQ ID NO: 134 y presentan una actividad de A5-elongasa.
En el presente documento se describen ademas secuencias de acidos nucleicos que codifican A6-elongasas w3-desaturasas, A6-desaturasas, A5-desaturasas, A4-desaturasas o A12-desaturasas.
Otras secuencias de acidos nucleicos aisladas ventajosas son secuencias seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 183,
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 112 o SEQ ID NO: 184, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 183, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 112 o SEQ ID NO: 184 y presentan una actividad de A6-elongasa.
Secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de u>3-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 105, b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 106, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 105, que presentan polipeptidos con al menos el 60 % de identidad al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 106 y presentan una actividad de u>3-desaturasa.
Secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A6-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 89 o en la SEQ ID NO: 97, b) secuencisa de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 97, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98 y presentan una actividad de A6-desaturasa.
Secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A5-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 99 o en la SEQ ID NO: 101,
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100 o en la SEQ ID NO: 102, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 99 o en la SEQ ID NO: 101, que codifican polipeptidos con al menos el 40% de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 92, SEQ ID nO: 94, SEQ ID NO: 100 o en la SEQ ID NO: 102 y presentan una actividad de A5-desaturasa.
Secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A4-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 95 o en la SEQ ID NO: 103, b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 104, o
c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 103, que codifican polipeptidos con al menos el 40 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 104 y presentan una actividad de A6-desaturasa.
Secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican polipeptidos con actividad de A12-desaturasa, seleccionadas del grupo:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 107 o en la SEQ ID NO: 109,
b) secuencias de acidos nucleicos que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, pueden derivarse de la secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 110, o c) derivados de la secuencia de aminoacidos representada SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 109, que codifican polipeptidos con al menos el 50 % de homologfa al nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 110 y presentan una actividad de A12-desaturasa.
Los acidos nucleicos anteriormente mencionados proceden de organismos, como animales no humanos, ciliados, hongos, plantas como algas o dinoflagelados que pueden sintetizar PUFA.
Las secuencias de acidos nucleicos aisladas anteriormente mencionadas proceden ventajosamente del genero Salmoniformes, Xenopus o Ciona, los generos de diatomeas Thalassiosira o Crypthecodinium, o de la familia de los Prasinophyceae como el genero Ostreococcus o de la familia Euglenaceae como el genero Euglena o Pytiaceae como el genero Phytophtora.
Otro objeto descrito en el presente documento es una secuencia de acido nucleico aislada que codifica polipeptidos con actividad de u>3-desaturasa, convirtiendo las w3-desaturasas codificadas por las secuencias de acidos nucleicos los acidos grasos C18, C20 y C22 con dos, tres, cuatro o cinco dobles enlaces y ventajosamente los acidos grasos C18 poliinsaturados con dos o tres dobles enlaces y los acidos grasos C20 poliinsaturados con dos, tres o cuatro dobles enlaces. Tambien se desaturan acidos grasos C22 con cuatro o cinco dobles enlaces.
A los objetos descritos en el presente documento pertenece tambien, como se ha descrito anteriormente, una secuencia de acido nucleico aislada que codifica polipeptidos con A12-desaturasa, A4-desaturasas, A5-desaturasas y A6-desaturasas, convirtiendo las A12-desaturasas, A4-desaturasas, A5-desaturasas o A6-desaturasas codificadas por estas secuencias de acidos nucleicos los acidos grasos C18, C20 y C22 con uno, dos, tres, cuatro o cinco dobles enlaces y ventajosamente los acidos grasos C18 poliinsaturados con uno, dos o tres dobles enlaces como C-i8:1A9, C18:2A 912 o C-i8:3 A91215, los acidos grasos C20 poliinsaturados con tres o cuatro dobles enlaces como C20:3A8,1114 o C20:4A8,11,1417 o los acidos grasos C22 poliinsaturados con cuatro o cinco dobles enlaces como C22:4A710,1316 o C22:5A7,10,13,1619. Ventajosamente, los acidos grasos se desaturan en los fosfolfpidos o esteres de acidos grasos de CoA, ventajosamente en los esteres de acidos grasos de CoA.
El termino “acido nucleico (molecula)”, como se usa aqrn, comprende en una forma de realizacion ventajosa ademas las secuencia sin traducir dispuesta en los extremos 3' y 5' de la region genica codificante: al menos 500, preferiblemente 200, con especial preferencia 100 nucleotidos de la secuencia en la direccion 5' del extremo 5' de la region codificante y al menos 100, preferiblemente 50, con especial preferencia 20 nucleotidos de la secuencia en la direccion 3' del extremo 3' de la region genica codificante. Una molecula de acido nucleico “aislada” se separa de otras moleculas de acido nucleico que estan presentes en la fuente natural del acido nucleico. Un acido nucleico “aislado” no tiene preferiblemente secuencias que flanqueen naturalmente el acido nucleico en el ADN genomico del organismo del que procede el acido nucleico (por ejemplo, secuencias que se encuentran en los extremos 5' y 3' del acido nucleico). En distintas formas de realizacion, la molecula de A-l2-desaturasa, u>-3-desaturasa, A-9-elongasa, A-6-desaturasa, A-8-desaturasa, A-6-elongasa, A-5-desaturasa, A-5-elongasa o A-4-desaturasa aislada puede contener, por ejemplo, menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleotidos que flanquean naturalmente la molecula de acido nucleico en el ADN genomico de la celula de la que procede el acido nucleico.
Las moleculas de acido nucleico usadas en el procedimiento, por ejemplo, una molecula de acido nucleico con una secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183 o de una parte de la misma, pueden aislarse usando tecnicas convencionales de biologfa molecular y la informacion de secuencias aqu proporcionada. Tambien puede identificarse al nivel de ADN o aminoacidos con ayuda de algoritmos de comparacion, por ejemplo, una secuencia homologa o regiones de secuencia conservada homologa. Estas pueden usarse como sondas de hibridacion, asf como usando tecnicas de hibridacion convencionales (como se describe, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) para aislar otras secuencias de acidos nucleicos utiles en el procedimiento. Ademas, puede aislarse una molecula de acido nucleico, que comprende una secuencia completa de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183 o una parte de la misma, por reaccion en cadena de la polimerasa, usandose cebadores de oligonucleotido que se basan en esta secuencia o partes de la misma (por ejemplo, una molecula de acido nucleico, que comprende la secuencia completa o una parte de la misma, puede aislarse por reaccion en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleotido que se han generado basandose en esta misma secuencia). Por ejemplo, puede aislarse ARNm de celulas (por ejemplo, mediante el procedimiento de extraccion con tiocianato de guanidinio de Chirgwin y col. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) y produciendose ADNc mediante transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa del MLV de Moloney, que puede obtenerse de Gibco/BRL, Bethesda, MD, o transcriptasa inversa del AMV que puede obtenerse de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Pueden generarse cebadores de oligonucleotido sinteticos para la amplificacion mediante reaccion en cadena de la polimerasa basandose en una de las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183 o con ayuda de las secuencias de aminoacidos representadas en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 184. Un acido nucleico segun la invencion puede amplificarse usando ADNc o alternativamente ADN genomico como molde y cebadores de oligonucleotido adecuados segun tecnicas de amplificacion por PCR convencionales. El acido nucleico asf amplificado puede clonarse en un vector adecuado y caracterizarse mediante analisis de secuencias de ADN. Los oligonucleotidos que se corresponden con
una secuencia de nucleotidos de desaturasa pueden producirse mediante procedimientos de smtesis convencionales, por ejemplo, con un sintetizador de ADN automatico.
Homologos de las secuencias de acidos nucleicos de A-12-desaturasa, u>-3-desaturasa, A-9-elongasa, A-6-desaturasa, A-8-desaturasa, A-6-elongasa, A-5-desaturasa, A-5-elongasa o A-4-desaturasa usadas con la secuencia
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ
ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ
ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ
ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ
ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ
ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ
ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101,
SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID
NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183 significa, por ejemplo, variantes alelicas con al menos aproximadamente el 50 o el 60 %, preferiblemente al menos aproximadamente el 60 o el 70 %, mas preferiblemente al menos aproximadamente el 70 o el 80 %, 90 % o 95 % y todavfa mas preferiblemente al menos aproximadamente el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,
94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de identidad u homologfa con una secuencia de nucleotidos mostrada
en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO:
101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113,
SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID
NO: 183 o sus homologos, derivados o analogos o partes de los mismos. Ademas, las moleculas de acido nucleico aisladas de una secuencia de nucleotidos, que se hibridan con una de las secuencias de nucleotidos mostradas en
la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ
ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ
ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ
ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ
ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ
ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ
ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101,
SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID
NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183 o una parte de las mismas, se hibridan, por ejemplo, bajo condiciones rigurosas. A este respecto, por una parte
segun la invencion debe entenderse que se usan al menos 25 pares de bases (=pb), 50 pb, 75 pb, 100 pb, 125 pb o
150 pb, preferiblemente al menos 175 pb, 200 pb, 225 pb, 250 pb, 275 pb o 300 pb, con especial preferencia 350 pb,
400 pb, 450 pb, 500 pb o mas pares de bases para la hibridacion. Tambien puede usarse ventajosamente la secuencia entera. Las variantes alelicas comprenden especialmente variantes funcionales que pueden obtenerse mediante delecion, insercion o sustitucion de nucleotidos de/en la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1, SEQ
ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID
NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID
NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID
NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID
NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID
NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID
NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ
ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO:
119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183, pero siendo la intencion que se retenga de manera ventajosa la actividad enzimatica de las protemas sintetizadas resultantes para
la insercion de uno o varios genes. Protemas que todavfa poseen la actividad enzimatica de A-12-desaturasa, u>-3-desaturasa, A-9-elongasa, A-6-desaturasa, A-8-desaturasa, A-6-elongasa, A-5-desaturasa, A-5-elongasa o A-4-desaturasa, es decir, su actividad no se ha reducido esencialmente, significa protemas con al menos el 10%, preferiblemente el 20 %, con especial preferencia el 30 %, de manera muy especialmente preferida el 40 % de la actividad enzimatica original, en comparacion con la protema codificada por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183. La homologfa se calculo a lo largo de la region entera de la secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos. Para la comparacion de distintas secuencias estan a disposicion del experto una serie de programas que se basan en distintos algoritmos. A este respecto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman proporcionan resultados especialmente fiables. Para las comparaciones de secuencias se uso el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins y col., CABIOS, 51989: 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)] que estan contenidos en el paquete informatico Gc G [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Los valores de homologfa de secuencia especificados en porcentaje anteriormente se determinaron con el programa GAP a lo largo de la region entera de la secuencia con los siguientes ajustes: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10,000 y Average Mismatch: 0,000. A menos que se especifique otra cosa, estos se usaron siempre como ajustes estandar para comparaciones de secuencias.
Homologos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183 tambien significa, por ejemplo, homologos bacterianos, de hongos y de planta, secuencias acortadas, ARN o ARN monocatenario de la secuencia de ADN codificante o no codificante.
Homologos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 or SEQ ID NO: 183 tambien significa derivados como, por ejemplo, variantes de promotor. Los promotores en la direccion 5' de las secuencias de nucleotidos especificadas pueden modificarse mediante uno o varios cambios de nucleotidos, mediante insercion (inserciones) y/o delecion (deleciones), sin que sin embargo se altere la funcionalidad o actividad de los promotores. Ademas, es posible que la actividad de los promotores se eleve mediante modificacion de su secuencia o que se sustituya completamente por promotores mas activos, incluso de organismos heterologos.
Los acidos nucleicos previamente mencionados y las moleculas de protema con actividad de A12-desaturasa, w3-desaturasa, A9-elongasa, A6-desaturasa, A8-desaturasa, A6-elongasa, A5-desaturasa, A5-elongasa y/o A4-desaturasa que participan en el metabolismo de lfpidos y acidos grasos, cofactores de PUFA y enzimas o en el transporte de compuestos lipofilos a traves de la membranas se usan en el procedimiento segun la invencion para la modulacion de la produccion de PUFA en organismos transgenicos, ventajosamente en plantas, como mafz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, judfa de soja, cacahuete, algodon, especies de Linum como lino de aceite o de fibra, especies de Brassica como colza, canola y nabina, pimienta, girasol, borraja, onagra y clavelon, plantas solanaceas como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies de Vicia, guisantes, yuca, alfalfa, plantas de arbustos (cafe, cacao, te), especies de Salix, arboles (palma aceitera, coco) y pastos perennes y plantas para forraje, o directamente (por ejemplo, cuando la expresion en exceso u optimizacion de una protema de biosmtesis de acidos grasos tiene una influencia directa sobre el rendimiento, la produccion y/o la eficiencia de la produccion del acido graso a partir de organismos modificados) y/o pueden tener un efecto indirecto, que no obstante conduce a un aumento del rendimiento, produccion y/o eficiencia de la produccion de los PUFA o una reduccion de compuestos no deseados (por ejemplo, cuando la modulacion del metabolismo de los lfpidos y acidos grasos, cofactores y enzimas conduce a cambios del rendimiento, produccion y/o eficiencia de la produccion o de la composicion de los compuestos deseados dentro de las celulas, lo que a su vez puede influir en la produccion de uno o varios acidos grasos).
La combinacion de distintas moleculas precursoras y enzimas de biosmtesis conduce a la produccion de distintas moleculas de acidos grasos, lo que tiene un efecto decisivo sobre la composicion de los lfpidos. Ya que los acidos grasos poliinsaturados (= PUFA) no solo se incorporan sencillamente en triacilglicerina, sino tambien en lfpidos de la membrana.
Para la produccion de PUFA, por ejemplo, acido estearidonico, acido eicosapentaenoico y acido docosahexaenoico, son especialmente adecuados Brasicaceae, Boraginaceen, Primulaceen o Linaceen. Es especialmente adecuado el lino (Linum usitatissimum) para la produccion de PUFA con las secuencias de acidos nucleicos ventajosas para el procedimiento segun la invencion, ventajosamente, como se describe, en combinacion con otras desaturasas y elongasas.
La smtesis de lfpidos puede clasificarse en dos secciones: la smtesis de acidos grasos y su union a sn-glicerina-3-fosfato, asf como la adicion o modificacion de un grupo de cabeza polar. Lfpidos habituales que se usan en las membranas comprenden fosfolfpidos, glicolfpidos, esfingoUpidos y fosfogliceridos. La smtesis de acidos grasos empieza con la conversion de la acetil-CoA en malonil-CoA por la acetil-CoA-carboxilasa o en acetil-ACP por la acetiltransacilasa. Despues de una reaccion de condensacion, estas dos moleculas de producto forman juntas acetoacetil-ACP, que se convierte mediante una serie de reacciones de condensacion, reduccion y deshidratacion, de manera que se obtiene una molecula de acido graso saturado con la longitud de cadena deseada. La produccion de los acidos grasos insaturados a partir de estas moleculas se cataliza por desaturasas espedficas, y concretamente o aerobicamente mediante oxfgeno molecular o anaerobicamente (en lo referente a la smtesis de acidos grasos en microorganismos veanse F.C. Neidhardt y col. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S. 612-636 y referencias citadas en su interior; Lengeler y col. (ed.) (1999) Biology of procaryotes. Thieme: Stuttgart, Nueva York, y las referencias citadas en su interior, asf como Magnuson, K., y col. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 y las referencias contenidas). Los acidos grasos unidos a fosfolfpidos asf producidos deben convertirse de nuevo a continuacion en el conjunto de esteres de CoA de acidos grasos para los alargamientos adicionales de los fosfolfpidos. Esto lo hacen posible las acil-CoA:lisofosfolfpido-aciltransferasas. Ademas, estas enzimas pueden transferir los acidos grasos alargados de nuevo de los esteres de CoA a los fosfolfpidos. Esta secuencia de reaccion puede, dado el caso, transcurrir varias veces.
Precursores para la biosmtesis de PUFA son, por ejemplo, acido oleico, acido linoleico y linolenico. Estos acidos grasos de carbono C18 deben alagarse a C20 y C22 para obtener los acidos grasos de tipo cadena eicosa y docosa. Con ayuda de las desaturasas usadas en el procedimiento, como las A12-, u>3-, A4-, A5-, A6- y A8-desaturasas y/o las A5-, A6-, A9-elongasas, pueden producirse acido araquidonico, acido eicosapentaenoico, acido docosapentaenoico o acido docosahexaenoico, ventajosamente acido eicosapentaenoico y/o acido docosahexaenoico, y usarse a continuacion para distintos fines en aplicaciones para alimentos, piensos, cosmeticos o farmacos. Con las enzimas mencionadas pueden producirse acidos grasos C20 y/o C22 con al menos dos, ventajosamente al menos tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces en la molecula de acido graso, preferiblemente acidos grasos C20 o C22 con ventajosamente cuatro, cinco o seis dobles enlaces en la molecula de acido graso. La desaturacion puede realizarse antes o despues del alargamiento del acido graso correspondiente. Por tanto, los productos de las actividades de desaturasa y de la posible desaturacion y alargamiento adicionales conducen a PUFA preferidos con mayor grado de desaturacion, incluido otro alargamiento de acidos grasos C20 a C22, a acidos grasos como acido Y-linolenico, acido dihomo-Y-linolenico, acido araquidonico, acido estearidonico, acido eicosatetraenoico o acido eicosapentaenoico. Los sustratos de las desaturasas y elongasas usadas en el procedimiento segun la invencion son acidos grasos C16, C18 o C20 como, por ejemplo, acido linoleico, acido ylinolenico, acido a-linolenico, acido dihomo-Y-linolenico, acido eicosatetraenoico o acido estearidonico. Sustratos preferidos son acido linoleico, acido Y-linolenico y/o acido a-linolenico, acido dihomo-Y-linolenico o acido araquidonico, acido eicosatetraenoico o acido eicosapentaenoico. Los acidos grasos C20 o C22 sintetizados con al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces en el acido graso se forman en el procedimiento segun la invencion en forma del acido graso libre o en forma de sus esteres, por ejemplo, en forma de sus gliceridos.
Por el termino “glicerido” se entiende una glicerina esterificada con uno, dos o tres restos de acido carboxflico (mono-, di- o triglicerido). Por “glicerido” se entiende tambien una mezcla de distintos gliceridos. El glicerido o la mezcla de gliceridos pueden contener aditivos adicionales, por ejemplo, acidos grasos libres, antioxidantes, protemas, hidratos de carbono, vitaminas y/u otras sustancias.
Por un “glicerido”, en el sentido del procedimiento segun la invencion, se entiende ademas derivados de glicerina. A estos tambien pertenecen, ademas de los gliceridos de acidos grasos anteriormente descritos, glicerofosfolfpidos y gliceroglicolfpidos. Preferiblemente aqrn son de mencionar a modo de ejemplo los glicerofosfolfpidos como lecitina (fosfatidilcolina), cardiolipina, fosfatidilglicerina, fosfatidilserina y alquilacilglicerofosfolfpidos.
Ademas, los acidos grasos deben transportarse a continuacion a distintos sitios de modificacion e incorporarse en el lfpido de almacenamiento de triacilglicerina. Otra etapa importante en la smtesis de los lfpidos es la transferencia de acidos grasos a los grupos de cabeza polares, por ejemplo, mediante glicerina-acido graso-aciltransferasa (vease Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166).
Veanse publicaciones sobre la biosmtesis de acidos grasos de plantas, desaturacion, el metabolismo de los lfpidos y el transporte de membrana de compuestos que contienen grasas, la beta-oxidacion, modificacion de acidos grasos y cofactores, almacenamiento y ensamblaje de triacilglicerina, incluidas las referencias en ellas, en los siguientes artmulos: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, ed.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge y Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin y Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, ed.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Guhnemann-Schafer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau y col., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne y col., 1993, en: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, ed.: Murata y Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1):1-16.
Los PUFA producidos en el procedimiento comprenden un grupo de moleculas que los animales superiores ya no pueden sintetizar y, por tanto, deben asimilar o los animales superiores ya no pueden ellos mismos producirlas suficientemente y, por tanto, deben asimilarlas adicionalmente, aunque se sintetizan facilmente por otros organismos, como bacterias, por ejemplo, los gatos ya no pueden sintetizar acido araquidonico.
Por “fosfolfpidos”, en el sentido de la invencion, debe entenderse fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina y/o fosfatidilinositol, de manera ventajosa fosfatidilcolina. Los terminos produccion o productividad son conocidos en la tecnica y contienen la concentracion del producto de fermentacion (compuestos de formula I) que se forma en un periodo de tiempo determinado y un volumen de fermentacion determinado (por ejemplo, kg de producto por hora por litro). Tambien comprende la productividad dentro de una celula de planta o una planta, es decir, el contenido de los acidos grasos deseados producidos en el procedimiento referido al contenido de todos los acidos grasos en estas celulas o plantas. El termino eficiencia de la produccion comprende el tiempo que se necesita para lograr una cantidad de produccion determinada (por ejemplo, cuanto necesita la celula para el establecimiento de un determinado caudal de un producto de smtesis). El termino rendimiento o rendimiento de producto/carbono se conoce en la tecnica y comprende la eficiencia de la conversion de la fuente de carbono en el producto (es decir, el producto de smtesis). Esto se expresa habitualmente, por ejemplo, como kg de producto por kg de fuente de carbono. Al aumentar el rendimiento o la produccion de compuesto aumenta la cantidad de moleculas obtenidas o de las moleculas obtenidas adecuadas de este compuesto en una cantidad de cultivo determinado durante un periodo de tiempo establecido. Los terminos biosmtesis o via de biosmtesis son conocidos en la tecnica y comprenden la smtesis de un compuesto, preferiblemente de un compuesto organico, por una celula a partir de compuestos intermedios, por ejemplo, en un proceso de varias etapas y fuertemente regulado. Los terminos degradacion o via de degradacion son conocidos en la tecnica y comprenden la escision de un compuesto, preferiblemente de un compuesto organico, por una celula en productos de degradacion (en terminos mas generales, moleculas mas pequenas o menos complejas), por ejemplo, en un proceso de varias etapas y fuertemente regulado. El termino metabolismo se conoce en la tecnica y comprende la totalidad de las reacciones qmmicas que tienen lugar en un organismo. El metabolismo de un compuesto determinado (por ejemplo, el metabolismo de un acido graso) comprende entonces la totalidad de las vfas de biosmtesis, modificacion y de degradacion de este compuesto en la celula que estan relacionadas con este compuesto.
En otra forma de realizacion, los derivados de la molecula de acido nucleico ventajosa para el procedimiento segun la invencion descrita en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ
ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105,
SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID
NO: 183 codifican protemas con al menos el 40%, ventajosamente aproximadamente el 50 o el 60%, preferiblemente al menos aproximadamente el 60 o el 70 %, y mas preferiblemente al menos aproximadamente el
70 o el 80 %, 80 al 90 %, 90 al 95 % y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 %,
99 % o mas de homologfa (= identidad) con una secuencia de aminoacidos completa de SEQ ID NO: 44, SEQ ID
NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 6 NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 8 NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 9 NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112,
SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134 o SEQ ID NO: 184. La homologfa se calculo a lo largo de la region entera de la secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos. Para la comparacion de secuencias se uso el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins y col., CABIOS, 51989: 151-153) o los programas
Gap y BestFit [Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482­
489 (1981)] que estan contenidos en el paquete informatico GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Los valores de homologfa de secuencia especificados en porcentaje anteriormente se determinaron con el programa BestFit a lo largo de la region entera de la secuencia con los siguientes ajustes: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10,000 y Average Mismatch: 0,000. A menos que se especifique otra cosa, estos se usaron siempre como ajustes estandar para comparaciones de secuencias.
Tambien se describen moleculas de acido nucleico que se diferencian de una de las secuencias de nucleotidos (y partes de las mismas) mostradas en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID
NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ
ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO:
133 o SEQ ID NO: 183 debido a la degeneracion del codigo genetico y, por tanto, codifican la misma A12-desaturasa, w3-desaturasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa, A6-elongasa o A5-elongasa que aquella que se codifica por las secuencias de nucleotidos mostradas en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO:
101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131,
SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 183.
Ademas de las A12-desaturasas, w3-desaturasas, A5-elongasas, A6-desaturasas, A5-desaturasas, A4-desaturasas
o A6-elongasas mostradas en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59,
SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77,
SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91,
SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO:
105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 183, el
experto aprecia que dentro de una poblacion pueden existir polimorfismos de secuencias de ADN que conducen a
cambios en las secuencias de aminoacidos de A12-desaturasa, u>3-desaturasa, A5-elongasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa y/o A6-elongasa. Estos polimorfismos geneticos en el gen A12-desaturasa, w3-desaturasa, A5-elongasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa y/o A6-elongasa pueden existir entre
individuos dentro de una poblacion debido a la variacion natural. Estas variantes naturales causan normalmente una
varianza del 1 al 5% en la secuencia de nucleotidos del gen A12-desaturasa, w3-desaturasa, A5-elongasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa y/o A6-elongasa. Todas y cada una de estas variaciones de nucleotidos
y los polimorfismos de aminoacidos resultantes de estas en la A12-desaturasa, u>3-desaturasa, A5-elongasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa y/o A6-elongasa, que son el resultado de variacion natural y no modifican
la actividad funcional, deberan estar contenidas en el alcance de la invencion.
Las moleculas de acido nucleico ventajosas para el procedimiento segun la invencion pueden aislarse basandose en
su homologfa con los acidos nucleicos de A12-desaturasa, w3-desaturasa, A5-elongasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa y/o A6-elongasa aqrn dados a conocer usando las secuencias o una parte de las mismas
como sondas de hibridacion segun tecnicas de hibridacion convencionales bajo condiciones de hibridacion
rigurosas. A este respecto, por ejemplo, pueden usarse moleculas de acido nucleico aisladas que tienen al menos
15 nucleotidos de longitud y se hibridan bajo condiciones rigurosas con las moleculas de acido nucleico que
comprenden una secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49,
SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75,
SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89,
SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO:
103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 o
SEQ ID NO: 183. Tambien pueden usarse acidos nucleicos de al menos 25, 50, 100, 250 o mas nucleotidos. El
termino “se hibrida bajo condiciones rigurosas”, como aqrn se usa, debera describir condiciones de hibridacion y de
lavado bajo las cuales las secuencias de nucleotidos que son homologas al menos el 60 % entre sf permanecen
habitualmente hibridadas entre sf Las condiciones son preferiblemente de tal forma que secuencias que son
homologas al menos aproximadamente el 65 %, mas preferiblemente al menos aproximadamente el 70 %, y todavfa
mas preferiblemente al menos aproximadamente el 75 % o mas entre sf, permanezcan habitualmente hibridadas
entre sf El experto conoce estas condiciones rigurosas y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitante preferido de condiciones de
hibridacion rigurosas son hibridaciones en 6 x cloruro sodico/citrato sodico (cloruro sodico/citrato sodico = SSC) a
aproximadamente 45 °C, seguido de una o varias etapas de lavado en 0,2 x SSC, 0,1 % de SDS a 50 a 65 °C. El
experto sabe que estas condiciones de hibridacion se diferencian dependiendo del tipo de acido nucleico y, por
ejemplo, cuando estan presentes disolventes organicos, con respecto a la temperatura y la concentracion de
tampon. Por ejemplo, bajo “condiciones de hibridacion estandar”, la temperatura se diferencia, dependiendo del tipo
de acido nucleico, entre 42 °C y 58 °C en tapon acuoso con una concentracion de 0,1 a 5 x SSC (pH 7,2). En caso
de que este presente disolvente organico en el tampon anteriormente mencionado, por ejemplo, 50 % de formamida,
la temperatura bajo las condiciones estandar es aproximadamente 42 °C. Las condiciones de hibridacion para
hnbridos de ADN:ADN son preferiblemente, por ejemplo, 0,1 x SSC y 20 °C y 45 °C, preferiblemente entre 30 °C y
45 °C. Las condiciones de hibridacion para fnbridos de ADN:ARN son preferiblemente, por ejemplo, 0,1 x SSC y
30 °C y 55 °C, preferiblemente entre 45 °C y 55 °C. Las temperaturas de hibridacion previamente mencionadas se
determinan, por ejemplo, para un acido nucleico con aproximadamente 100 pb (= pares de bases) de longitud y un
contenido de G C del 50 % en ausencia de formamida. El experto sabe como puede determinar las condiciones de
hibridacion requeridas mediante libros de texto, como el anteriormente mencionado o a partir de los siguientes libros
de texto Sambrook y col., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames y Higgins (ed.) 1985,
“Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed.) 1991,
“Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Para determinar la homologfa en porcentaje (=identidad) de dos secuencias de aminoacidos (por ejemplo, una de las
secuencias de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62,
SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID
NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134 o SEQ ID NO: 184) o de dos acidos
nucleicos (por ejemplo, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID
NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 183), las secuencias se escriben una debajo de la otra con el fin de una comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una protema o de un acido nucleico para generar un alineamiento optimo con la otra protema o el otro acido nucleico). Entonces se comparan los restos de aminoacidos o nucleotidos en las posiciones de aminoacido o posiciones de nucleotido correspondientes. Si una posicion en una secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o el mismo nucleotido que la posicion correspondiente en la otra secuencia, entonces las moleculas son homologas en esta posicion (es decir, “homologfa” de aminoacido o de acido nucleico, como aqrn se usa, se corresponde con “identidad” de aminoacido o de acido nucleico). La homologfa en porcentaje entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas que son comunes a las secuencias (es decir, % de homologfa = numero de posiciones identicas/numero total de posiciones x 100). Los terminos homologfa e identidad deben, por tanto, considerarse sinonimos. Los programas o algoritmos usados se han descrito anteriormente.
Una molecula de acido nucleico aislada que codifica una A12-desaturasa, w3-desaturasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa, A5-elongasa y/o A6-elongasa que es homologa a una secuencia de protemas de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134 o SEQ ID NO: 184 puede generarse mediante la introduccion de una o varias sustituciones, adiciones o deleciones de nucleotidos en una secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 183, de manera que se introduzcan una o varias sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos en la protema codificada. Pueden introducirse mutaciones en una de las secuencias de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, Se Q ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 183 mediante tecnicas convencionales, como mutagenesis espedfica de sitio y mutagenesis mediada por PCR. Preferiblemente se producen sustituciones conservativas de aminoacidos en uno o varios de los restos de aminoacidos no esenciales predichos. En una “sustitucion conservativa de aminoacidos”, el resto de aminoacido se cambia por un resto de aminoacido con una cadena lateral similar. En la tecnica se han definido familias de restos de aminoacidos con cadenas laterales similares. Estas familias comprenden aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Un resto de aminoacido no esencial predicho en una A12-desaturasa, w3-desaturasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa, A5-elongasa o A6-elongasa se intercambia, por tanto, preferiblemente con otro resto de aminoacido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra forma de realizacion, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o una parte de la secuencia codificante de A12-desaturasa, w3-desaturasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa, A5-elongasa o A6-elongasa, por ejemplo, mediante mutagenesis por saturacion, y los mutantes resultantes pueden cribarse segun la actividad de A12-desaturasa, w3-desaturasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa, A5-elongasa o A6-elongasa aqrn descrita para identificar mutantes que han retenido la actividad de A12-desaturasa, w3-desaturasa, A6-desaturasa, A5-desaturasa, A4-desaturasa, A5-elongasa o A6-elongasa. Despues de la mutagenesis de una de las secuencias SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 183, la protema codificada puede expresarse recombinantemente y la actividad de la protema puede determinarse, por ejemplo, usando las pruebas aqrn descritas.
Otros objetos de la invencion son organismos no humanos transgenicos que contienen los acidos nucleicos descritos en el presente documento SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 183 o una construccion genica o un vector que contiene estas secuencias de acidos nucleicos. En el caso del organismo no humano se trata ventajosamente de un microorganismo, un animal no humano o una planta, con especial preferencia de una planta.
Esta invencion se ilustra a continuacion por los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes. El contenido de todas las citas bibliograficas, solicitudes de patente, patentes y solicitudes publicadas de patente citadas en la presente solicitud de patente queda contenido en el presente documento por referencia.
Ejemplos
Ejemplo 1: Procedimientos de clonacion generales:
Se realizaron procedimientos de clonacion como, por ejemplo, escisiones por restriccion, electroforesis en gel de agarosa, purificacion de fragmentos de ADN, transferencia de acidos nucleicos sobre membranas de nitrocelulosa y nailon, enlace de fragmentos de ADN, transformacion de celulas de Escherichia coli, cultivo de bacterias y el analisis de secuencias de ADN recombinante como se describe en Sambrook y col. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
Ejemplo 2: Analisis de secuencias de ADN recombinante:
La secuenciacion de las moleculas de ADN recombinante se realizo con un secuenciador de ADN de fluorescencia laser de la empresa ABI segun el procedimiento de Sanger (Sanger y col. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). Los fragmentos resultantes de una reaccion en cadena de la polimerasa se secuenciaron y se verificaron para evitar errores de la polimerasa en las construcciones a expresar.
Ejemplo 3: Clonacion de genes de Oncorhynchus mykiss
Mediante busqueda de regiones conservadas en las secuencias de protemas correspondientemente a los genes de elongasa citados en la solicitud se identificaron dos secuencias con motivos correspondientes en la base de datos de secuencias de Genbank.
Figure imgf000046_0001
Se aislo ARN total de Oncorhynchus mykiss con ayuda del kit RNAeasy de la empresa Qiagen (Valencia, CA, EE.UU.). A partir del ARN total se aislo poli-A+ ARN (ARNm) con ayuda de oligo-dT-celulosa (Sambrook y col., 1989). El ARN se transcribio de forma inversa con el kit Reverse Transcription System de Promega y el ADNc sintetizado se clono en el vector lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene). Correspondientemente a las instrucciones del fabricante, el ADNc se desempaqueto dando el ADN de plasmido. Entonces se uso el banco de plasmidos de ADNc para la PCR para la clonacion de plasmidos de expresion.
Ejemplo 4: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Para la clonacion de dos secuencias para la expresion heterologa en levaduras se usaron los siguientes oligonucleotidos para la reaccion de PCR:
Figure imgf000046_0002
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1,25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 j l de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
El producto de PCR se incubo durante 2 h a 37 °C con las enzimas de restriccion HindIII y BamHI. El vector de expresion en levadura pYES3 (Invitrogen) se incubo de forma similar. A continuacion se separo el producto de PCR de 812 pb o 905 pb de tamano, asf como el vector, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN tuvo lugar mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligaron el vector y el ADNc de elongasa. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados pYES3-OmELO2 y pYES3-OmELO3 se verificaron mediante secuenciacion y se transformaron mediante electroporacion (1500 V) en la cepa de Saccharomyces INVScl (Invitrogen). Para el control se transformo en paralelo pYES3. A continuacion se sembraron las levaduras en medio mmimo completo sin triptofano con 2 % de glucosa. Las celulas que fueron capaces de crecer en el medio sin triptofano contienen, por tanto, los plasmidos correspondientes pYES3, pYES3-OmELO2 (SEQ ID NO: 51) y pYES3-OmELO3 (SEQ ID NO: 53). Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron dos transformantes para la expresion funcional adicional.
Ejemplo 5: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especifica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genero un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron en los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante con el siguiente par de cebadores:
PSUN-OmELO2
Directo: 5'-GCGGCCGCataatggcttcaacatggcaa (SEQ ID NO: 175)
Inverso: 3'-GCGGCCGCttatgtcttcttgctcttcctgtt (SEQ ID NO: 176)
pSUN-OmELO3
Directo: 5'-GCGGCCGCataatggagacttttaat (SEQ ID NO: 177)
Inverso: 3'-GCGGCCGCtcagtcccccctcactttcc (SEQ ID NO: 178)
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1,25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 j l de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incubaron durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incubo de forma similar. A continuacion se separaron los productos de PCR, asf como el vector de 7624 pb de tamano, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN tuvo lugar mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligaron el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados pSUN-OmELO2 y pSUN-OmELO3 se verificaron mediante secuenciacion. pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen de octopinsintasa del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1-684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales. (Secuencia de cebador: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3', SEQ ID NO: 174). El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
Ejemplo 6: Extraccion de lipidos de levaduras y semillas:
Puede determinarse el efecto de la modificacion genetica en plantas, hongos, algas, ciliados o en la produccion de un compuesto deseado (como de un acido graso) cultivando los microorganismos modificados o las plantas modificadas en condiciones adecuadas (como las anteriormente descritas) y analizando el medio y/o los componentes celulares para la elevada produccion de producto deseado (es decir, de ftpidos o de un acido graso). Estas tecnicas de analisis son conocidas para el experto y comprenden espectroscopfa, cromatograffa en capa fina, procedimientos de tincion de distintos tipo, procedimientos enzimaticos y microbiologicos, asf como cromatograffa analftica, como cromatograffa de ftquidos de alta resolucion (vease, por ejemplo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 y S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., y col., (1987) “Applications of HPLC in Biochemistry” en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm y col. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Capftulo III: “Product recovery and purification”, S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., y col. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., y Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., y Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, en: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Capftulo 11, pag.
1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Ademas de los procedimientos anteriormente mencionados, se extraen ftpidos de planta a partir de material de planta como se describe por Cahoon y col. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22):12935-12940, y Browse y col. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145. El analisis cualitativo y cuantitativo de los ftpidos y acidos grasos se describe en Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Liquid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr.
1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); “Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) con el tftulo: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Ademas de la medicion del producto final de la fermentacion tambien es posible analizar otros componentes de la via metabolica que se usan para la produccion del compuesto deseado, como productos intermedios y secundarios, para determinar la eficiencia total de la produccion del compuesto. Los procedimientos de analisis comprenden mediciones de las cantidades de nutrientes en el medio (por ejemplo, azucares, hidrocarburos, fuentes de nitrogeno, fosfato y otros iones), mediciones de la composicion de biomasa y del crecimiento, analisis de la produccion de metabolitos habituales de las vfas de biosmtesis y mediciones de gases que se generan durante la fermentacion. Procedimientos convencionales para estas mediciones se describen en Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes y P.F. Stanbury, ed., IRL Press, S. 103-129; 131-163 y 165-192 (ISBN: 0199635773) y las referencias alft especificadas.
Un ejemplo es el analisis de acidos grasos (abreviaturas: FAME, ester mefflico de acidos grasos; CG-EM, cromatograffa de gases-ftquidos-espectrometffa de masas; TAG, triacilglicerina; CCF, cromatograffa en capa fina). La deteccion inequvoca de la presencia de productos de acidos grasos puede obtenerse mediante el analisis de organismos recombinantes segun procedimientos de analisis estandar: CG, CG-EM o CCF, como se ha descrito repetidamente por Christie y las referencias en su interior (1997, en: Advances on lipid methodology, cuarta ed.: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren, ftpidos 33:343­ 353).
El material que va a analizarse puede romperse mediante tratamiento ultrasonico, molienda en molino de vidrio, nitrogeno ftquido y molienda o mediante otros procedimientos aplicables. El material debe centrifugarse despues de la rotura. El sedimento se resuspende en agua dest., se calienta 10 min a 100 °C, se enfffa sobre hielo y se centrifuga de nuevo, seguido de extraccion en acido sulfurico 0,5 M en metanol con 2 % de dimetoxipropano durante 1 h a 90 °C, lo que conduce a compuestos de aceite y de ftpidos hidrolizados que dan los ftpidos transmetilados. Estos esteres mefflicos de acidos grasos se extraen en eter de petroleo y finalmente se someten a un analisis de CG usando una columna capilar (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0,32 mm) en un gradiente de temperatura entre 170 °C y 240 °C durante 20 min y 5 min a 240 °C. La identidad de los esteres mefflicos de acidos grasos obtenidos debe definirse usando patrones que pueden obtenerse de fuentes comerciales (es decir, Sigma).
El material de planta se homogeneiza inicialmente mecanicamente mediante morteros para hacerlo mas accesible a la extraccion.
A continuacion se calienta 10 min a 100 °C y despues de enfriarse se sedimenta de nuevo sobre hielo. El sedimento celular se hidroliza con acido sulfurico metanolico 1 M y 2 % de dimetoxipropano 1 h a 90 °C y se transmetilan los Ifpidos. Los esteres metilicos de acidos grasos resultantes (FAME) se extraen en eter de petroleo. Los FAME extrafdos se analizan mediante cromatograffa de gases-Kquidos con una columna capilar (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) y un gradiente de temperatura de 170 °C a 240 °C en 20 min y 5 min a 240 °C. La identidad de los esteres metilicos de acidos grasos se confirma por comparacion con los patrones de FAME correspondientes (Sigma). La identidad y la posicion del doble enlace puede analizarse a continuacion mediante derivatizacion qmmica adecuada de mezclas de FAME, por ejemplo, dando derivados de 4,4-dimetoxioxazolina (Christie, 1998) mediante CG-EM.
Las levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 4 con los plasmidos pYES3, pYES3-OmELO2 y pYES3-OmELO3 se analizaron de la siguiente manera: se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 10 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres metilicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 |jl de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 jm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento).
La identificacion de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma).
La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys.
388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 7: Caracterizacion funcional de OmELO2 y OmELO3
OmELO2 no muestra actividad de elongasa, mientras que para OmELO3 pudo detectarse una clara actividad con distintos sustratos. La especificidad por sustrato de OmElo3 pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Figura 2). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Todas las levaduras transgenicas muestran la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de OmElo3. Esto significa que el gen OmElo3 pudo expresarse funcionalmente.
La Figura 2 muestra que OmElo3 presenta una especificidad por sustrato, que conduce con alta especificidad al alargamiento de acidos grasos en A5 y A6 con un doble enlace en w3. Ademas, tambien pudieron alargarse acidos grasos ro6 (C-ia y C20) con menor especificidad. El acido estearidonico (C184 ro3) y el acido eicosapentaenoico (C205 w3) representan los mejores sustratos para OmElo3 (hasta el 66 % de alargamiento).
Ejemplo 8: Reconstitucion de la smtesis de DHA en levadura
La reconstitucion de la biosmtesis de DHA (C22 6 ro3) se realizo a partir de EPA (C205 ro3) o acido estearidonico (C18 4 w3) mediante la coexpresion de OmElo3 con la A4-desaturasa de Euglena gracilis o la A5-desaturasa de Phaeodactylum tricornutum y la A4-desaturasa de Euglena gracilis. Para esto se construyeron ademas los vectores de expresion pYes2-EgD4 y pESCLeu-PtD5. La cepa de levadura anteriormente mencionada que ya esta transformada con pYes3-OmElo3 (SEQ ID NO: 55) se transformo mas adelante con pYes2-EgD4 o al mismo tiempo con pYes2-EgD4 y pESCLeu-PtD5. La seleccion de las levaduras transformadas se realizo en placas de agar con medio mmimo completo con 2 % de glucosa, pero sin triptofano y uracilo en caso de la cepa de pYes3-OmELO/pYes2-EgD4 y sin triptofano, uracilo y leucina en caso de la cepa de pYes3-OmELO/pYes2-EgD4+pESCLeu-PtD5. La expresion se indujo como se ha especificado arriba mediante la adicion de 2 % (p/v) de galactosa. Los cultivos se incubaron durante otras 120 h a 15 °C.
La Figura 3 muestra el perfil de acidos grasos de levaduras transgenicas que se alimentaron con C205 ro3. En la levadura de control (A) que se transformo con el vector pYes3-OmElo3 y el vector vacfo pYes2, C205 ro3 se alargo muy eficazmente dando C22 5 ro3 (65 % de alargamiento). La introduccion adicional de EgA4-desaturasa condujo a la reaccion de C225 ro3 a C226 ro3 (DHA). La composicion de acidos grasos de las levaduras transgenicas se describe en la Figura 5. Despues de la co-expresion de OmElo3 y EgD4 pudo detectase hasta el 3 % de DHA en las levaduras.
En otro experimento de co-expresion se expresaron OmElo3, EgD4 y una A5-desaturasa de P. tricornutum (PtD5) juntos. Las levaduras transgenicas se alimentaron con acido estearidonico (C184 ro3) y se analizaron (Figura 4). La composicion de acidos grasos de estas levaduras se presenta en la Figura 5. Mediante OmElo3, el acido graso alimentado C184 ro3 se alargo a C204 ro3 (60 % de alargamiento). El ultimo se desaturo mediante PtD5 dando C205 w3. La actividad de PtD5 ascendio al 15 %. C205 w3 pudo ademas alargarse mediante OmElo3 dando C225W3. A continuacion, el C225 u>3 recientemente sintetizado se desaturo dando C226 w3 (DHA). En estos experimentos pudo alcanzarse hasta el 0,7 % de DHA.
De estos experimentos se deduce que las secuencias usadas en esta invencion OmElo3, EgD4 y PtD5 son adecuadas para la produccion de DHA en celulas eucariotas.
Ejemplo 9: Generacion de plantas transgenicas
a) Generacion de plantas de colza transgenicas (modificado segun Moloney y col., 1992, Plant Cell Reports, 8:238­ 242)
Para la generacion de plantas de colza transgenicas pueden utilizarse vectores binarios en Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 o Escherichia coli (Deblaere y col., 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Para la transformacion de plantas de colza (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemania) se utiliza una dilucion 1:50 de un cultivo durante la noche de una colonia de Agrobacterium positivamente transformada en medio de Murashige-Skoog (Murashige y Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) con 3% de sacarosa (medio 3MS). Los pedolos o los hipocotiledones de plantas de colza esteriles recien germinadas (en cada caso aproximadamente 1 cm2) se incuban en una placa de Petri con una dilucion de Agrobacterium 1:50 durante 5-10 minutos. Sigue una co-incubacion de 3 dfas en la oscuridad a 25 °C en medio 3MS con 0,8 % de Bacto-Agar. El cultivo continua despues de 3 dfas con 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y continua en ritmo semanal sobre medio MS con 500 mg/l de Claforan (cefotaxima-sodio), 50 mg/l de kanamicina, bencilaminopurina 20 microM (BAP) y 1,6 g/l de glucosa. Los brotes que crecen se transfieren a medio MS con 2 % de sacarosa, 250 mg/l de Claforan y 0,8 % de Bacto-Agar. Si despues de tres semanas no se formaron rafces, entonces se anade como hormona de crecimiento al medio acido 2-indolbutmco para el enraizado.
Los brotes regenerados se obtienen sobre medio 2MS con kanamicina y Claforan, despues del enraizado se transfieren a tierra y despues del cultivo durante dos semanas se cultivan en una camara climatica o en invernadero, se dejan florecer, se recogen semillas maduras y se analizan para la expresion de elongasa como actividad de A5-elongasa o de A6-elongasa o actividad de w3-desaturasa mediante analisis de lfpidos. Asf pueden identificarse lmeas con elevados contenidos de acidos grasos C20 y C22 poliinsaturados.
b) Produccion de plantas de lino transgenicas
La produccion de plantas de lino transgenicas puede generarse, por ejemplo, segun el procedimiento de Bell y col., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465, mediante bombardeo de partfculas. Generalmente se uso una transformacion mediada por Agrobacterium, por ejemplo, segun Mlynarova y col. (1994), Plant Cell Report 13: 282­ 285 para la transformacion de lino.
Ejemplo 10: Clonacion de genes A5-elongasa de Thraustochytrium aureum ATCC34304 y Thraustochytrium ssp.
Mediante comparacion de distintas secuencias de protemas de elongasa encontradas en esta solicitud pudieron definirse regiones conservadas de acidos nucleicos (caja de histidina: His-Val-X-His-His, caja de tirosina: Met-Tyr-X-Tyr-Tyr). Con ayuda de estas secuencias se cribo una base de datos EST de T. aureum ATCC34304 y Thraustochytrium ssp. Para otras A5-elongasas pudieron encontrarse las siguientes secuencias nuevas:
Figure imgf000050_0001
Se aislo ARN total de T. aureum ATCC34304 y Thraustochytrium ssp. con ayuda del kit RNAeasy de la empresa Qiagen (Valencia, CA, EE.UU.). A partir del ARN total se aislo ARNm con ayuda del sistema de aislamiento polyATract (Promega). El ARNm se transcribio de forma inversa con el kit Marathon cDNA Amplification (BD Biosciences) y se ligaron los adaptadores correspondientemente a las instruccion del fabricante. Entonces se uso el banco de ADNc para la PCR para la clonacion de plasmidos de expresion mediante 5'- y 3'-RACE (amplificacion rapida de extremos de ADNc).
Ejemplo 11: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Para la clonacion de la secuencia para la expresion heterologa en levaduras se usaron los siguientes oligonucleotidos para la reaccion de PCR:
Cebador Secuencia de oligonucleotidos
5' f* BioTaurELO1 5' gacataatgacgagcaacatgag (SEQ ID NO: 170)
3' r* BioTaurELO1 5' cggcttaggccgacttggccttggg (SEQ ID NO: 171)
5'f*TL16y2 5' agacataatggacgtcgtcgagcagcaatg (SEQ ID NO: 172) 3'r*TL16y2 5' ttagatggtcttctgcttcttgggcgcc (SEQ ID NO: 173)
* f: directo, r: inverso
Composicion de la mezcla de PCR (50 |jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5,00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCl225 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1,25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 j l de pfu-polimerasa
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR BioTaurELO1 (vease SEQ ID NO: 65) y TL16y2 (vease SEQ ID NO: 83) se incubaron durante 30 min a 21 °C con el vector de expresion en levadura pYES2.1-TOPO (Invitrogen) segun instrucciones del fabricante. A este respecto, el producto de PCR se liga en el vector mediante un nucleotido protuberante T y la actividad de una topoisomerasa (Invitrogen). Despues de la incubacion se realizo entonces la transformacion de celulas DH5a de E. coli. Se identificaron los clones correspondientes mediante PCR, se aislo el ADN de plasmido mediante el kit Qiagen DNAeasy y se verifico mediante secuenciacion. La secuencia correcta se transformo entonces mediante electroporacion (1500 V) en la cepa de Saccharomyces INVSc1 (Invitrogen). Para el control, el vector vacfo pYES2.1 se transformo en paralelo. A continuacion se sembraron las levaduras en medio mmimo completo sin uracilo con 2 % de glucosa. Las celulas que fueron capaces de crecer en el medio sin uracilo contienen, por tanto, los plasmidos correspondientes pYES2.1, pYES2.1-BioTaurELO1 y pYES2.1-TL16y2. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron dos transformantes para la expresion funcional adicional.
Ejemplo 12: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especifica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genero un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron en los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante con el siguiente par de cebadores:
PSUN-BioTaurELO1
Directo: 5'-GCGGCCGCataatgacgagcaacatgagc (SEQ ID NO: 166)
Inverso: 3'-GCGGCCGCttaggccgacttggccttggg (SEQ ID NO: 167)
PSUN-TL16y2
Directo: 5'-GCGGCCGCACCatggacgtcgtcgagcagcaatg (SEQ ID NO: 168)
Inverso: 5'-GCGGCCGCttagatggtcttctgcttcttgggcgcc (s Eq ID NO: 169)
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1,25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 |jl de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incubaron durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incubo de forma similar. A continuacion se separaron los productos de PCR, asf como el vector de 7624 pb de tamano, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN tuvo lugar mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligaron el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados pSUN-BioTaurELO1 y pSUN-TL16y2 se verificaron mediante secuenciacion. pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen de octopinsintasa del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1-684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales. (Secuencia de cebador: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3', SEQ ID NO: 165). El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
La extraccion de lfpidos de levaduras y semillas se realizo de forma identica al Ejemplo 6.
Ejemplo 13: Caracterizacion funcional de BioTaurELOl y TL16rL2
La especificidad por sustrato de BioTaurELO1 pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Figura 6). La Figura 6 muestra los experimentos de alimentacion para determinar la funcionalidad y la especificidad por sustrato con cepas de levadura que contienen o el vector pYES2.1 (Control) o el vector pYES2.1-BioTau-rELO1 (= BioTaur) con la A5-elongasa. En ambas mezclas se anadieron acido Y-linolenico 200 uM y acido eicosapentaenoico al medio de incubacion de levadura y se incubaron 24 h. Despues de la extraccion de los acidos grasos de las levaduras, estos se transmetilaron y se separaron por cromatograffa de gases. Los productos de alargamiento formados a partir de los dos acidos grasos alimentados estan marcados por flechas.
Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Todas las levaduras transgenicas muestran la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de BioTaurELO1. Esto significa que el gen BioTaurELO1 pudo expresarse funcionalmente.
La Figura 6 muestra que BioTaurELO1 presenta una especificidad por sustrato que conduce con alta especificidad al alargamiento de acidos grasos en A5 y A6 con un doble enlace en w3. Ademas, tambien pudieron alargarse acidos grasos w6 (C-is y C20). Se convirtieron acido Y-linolenico (C183 u>6) con el 65,28 %, acido estearidonico (C18 4 u>3) con el 65,66 % y acido eicosapentaenoico (C20 5 w3) con el 22,01 % de conversion. Las especificidades por sustrato de los distintos experimentos de alimentacion estan representadas en la Tabla 3 (vease al final de la descripcion). La velocidad de conversion de GLA en la alimentacion de GLA y EPA ascendio al 65,28 %. La velocidad de conversion de EPA en la misma alimentacion de GLA y EPA ascendio al 9,99 %. Si solo se alimento EPA, entonces la velocidad de conversion de EPA ascendio al 22,01 %. Tambien se convirtio acido araquidonico (= ARA) en la alimentacion. La velocidad de conversion ascendio al 14,47 %. Tambien se convirtio acido estearidonico (= SDA). En este caso, la velocidad de conversion ascendio al 65,66 %.
La funcionalidad y la especificidad por sustrato de TL16y2 pudieron determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos. La Tabla 4 muestra los experimentos de alimentacion. Los experimentos de alimentacion se realizaron de igual manera que se ha descrito para BioTaurELO1. Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de TL16y2 (Figura 11). Esto significa que el gen TL16y2 pudo expresarse funcionalmente.
Tabla 4: Expresion de TL16y2 en levadura.
Figure imgf000053_0001
Los resultados descritos en la Tabla 4 muestran las siguientes conversiones en porcentaje para TL16y2 en comparacion con el control: a) % de conversion de EPA (250 uM): 8 %, b) % de conversion de EPA (50 uM): 41 %, c) % de conversion de ARA: 20,3 %, d) % de conversion de SDA: 79, 4 % y e) % de conversion de GLA: 74,9 %. TL16y2 muestra, por tanto, actividad de A5-, A6- y A8-elongasa. A este respecto, la actividad para acidos grasos C18 con doble enlace en A6 es la mas alta. Los acidos grasos C20 con un doble enlace en A5 o A8 se alargan entonces en funcion de la concentracion de acidos grasos alimentados.
Ejemplo 14: Clonacion de genes de Ostreococcus tauri
Mediante busqueda de regiones conservadas en las secuencias de protemas con ayuda de los genes elongasa citados en la solicitud con actividad de A5-elongasa o actividad de A6-elongasa pudieron identificarse dos secuencias con motivos correspondientes en una base de datos de secuencias de Ostreococcus tauri (secuencias genomicas).
Se trata a este respecto de las siguientes secuencias:
Figure imgf000053_0002
OtElol presenta la mayor similitud con una elongasa de Danio rerio (GenBank AAN77156; aproximadamente el 26 % de identidad), mientras que OtElo2 presenta la mayor similitud para la Elo de Physcomitrella (PSE) [aproximadamente el 36 % de identidad] (Los alineamientos se realizaron con el algoritmo tBLASTn (Altschul y col., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403 -410).
La clonacion se realizo del siguiente modo:
Se separaron por centrifugacion 40 ml de un cultivo de Ostreococcus tauri en la fase estacionaria y se resuspendieron en 100 |jl de agua bidest y se guardaron a -20 °C. Basandose en el procedimiento de PCR se amplificaron los ADN genomicos correspondientes. Los pares de cebadores correspondientes se seleccionaron de forma que llevaran la secuencia consenso de levadura para la traduccion altamente eficaz (Kozak, Cell 1986, 44:283-292), ademas del codon de iniciacion. La amplificacion de ADN de OtElo se realizo respectivamente con 1 j l de celulas descongeladas, dNTP 200 jM, 2,5 U de Tag-polimerasa y 100 pmol de cada uno de los cebadores en un volumen total de 50 jl. Las condiciones para la PCR fueron del siguiente modo: Primera desnaturalizacion a 95 °C durante 4 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, asf como una ultima etapa de extension a 72 °C durante 10 minutos.
Ejemplo 15: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Para la caracterizacion de la funcion de las elongasas de Ostreococcus tauri se clonaron los marcos de lectura abiertos del ADN respectivo en la direccion 3' del promotor GAL1 inducible por galactosa de pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), obteniendose pOTE1 y pOTE2.
La cepa 334 de Saccharomyces cerevisiae se transformo mediante electroporacion (1500 V) con el vector pOTEI o pOTE2. Como control se uso una levadura que se transformo con el vector vado pYES2. La seleccion de las levaduras transformadas se realizo en placas de agar con medio mmimo completo (CMdum) con 2 % de glucosa, pero sin uracilo. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron tres transformantes para la expresion funcional adicional.
Para la expresion de elongasas de Ot se inocularon inicialmente precultivos de respectivamente 5 ml de medio lfquido CMdum con 2% (p/v) de rafinosa pero sin uracilo con los transformantes seleccionados y se incubaron 2 dfas a 30 °C, 200 rpm. Entonces se inocularon 5 ml de medio lfquido CMdum (sin uracilo) con 2 % de rafinosa y 300 |jM de distintos acidos grasos a una DO600 de 0,05.
La expresion se indujo mediante la adicion de 2 % (p/v) de galactosa. Los cultivos se incubaron durante 96 h adicionales a 20 °C.
Ejemplo 16: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especifica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genero un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron mediante PCR en los extremos 5' y 3' de las secuencias codificantes. Las secuencias de cebadores correspondientes se derivaron de las regiones 5' y 3' de OtElol y OtElo2.
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1,25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 j l de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incubaron durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incubo de forma similar. A continuacion se separaron los productos de PCR, asf como el vector, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN se realizo mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligaron el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados pSUN-OtELO1 y pSUN-OtELO2 se verificaron mediante secuenciacion.
pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen de Ostreococcus del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1 a 684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales. (Secuencia de cebador: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3', SEQ ID NO: 164).
El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
Ejemplo 17: Expresion de OtELOl y OtELO2 en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 15 con los plasmidos pYES3, pYES3-OtELO1 y pYES3-OtELO2 se analizaron de la siguiente manera:
Se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3 100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres medicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 |jl de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 jm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento). La identificacion de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 18: Caracterizacion funcional de OtELOl y OtELO2:
La especificidad por sustrato de OtElo1 pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Tab. 5). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de OtElo1. Esto significa que el gen OtElo1 pudo expresarse funcionalmente.
La Tabla 4 muestra que OtElo1 presenta una estrecha especificidad por sustrato. OtElo1 solo pudo alargar los acidos grasos C20 acido eicosapentaenoico (Figura 7) y acido araquidonico (Figura 8), pero preferiblemente el acido eicosapentaenoico u>3 desaturado.
Tabla 5:
Figure imgf000055_0001
La Tabla 5 muestra la especificidad por sustrato de la elongasa OtElo1 para acidos grasos C20 poliinsaturados con un doble enlace en la posicion A5 en comparacion con distintos acidos grasos.
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pOTE1 se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC. Cada valor describe el valor medio (n=3) ± desviacion estandar.
La especificidad por sustrato de OtElo2 (SEQ ID NO: 81) pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Tab. 6). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de OtElo2. Esto significa que el gen OtElo2 pudo expresarse funcionalmente.
Tabla 6:
Figure imgf000056_0002
La Tabla 6 muestra la especificidad por sustrato de la elongasa OtElo2 en comparacion con distintos acidos grasos. Las levaduras que se ha^an transformado con el vector pOTE2 se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC. Cada valor describe el valor medio (n=3) ± desviacion estandar.
La actividad enzimatica que se especifica en la Tabla 6 muestra claramente que OTELO2 es una A6-elongasa. Ejemplo 19: Clonacion de genes de Thalassiosira pseudonana
Mediante busqueda de regiones conservadas en las secuencias de protemas con ayuda de los genes elongasa citados en la solicitud con actividad de A5-elongasa o actividad de A6-elongasa pudieron identificarse dos secuencias con motivos correspondientes en un banco de datos de secuencias de Thalassiosira pseudonana (secuencias genomicas). A este respecto se trata de las siguientes secuencias:
Figure imgf000056_0001
Se cultivo un cultivo de 2 l de T. pseudonana en medio f/2 (Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. En Culture of Marine Invertebrate Animals (Eds. Smith, W.L. y Chanley, M.H.), Plenum Press, Nueva York, pp 29-60) durante 14 d (= dfas) con una intensidad de la luz de 80 E/cm2 Despues de la centrifugacion de las celulas se aislo ARN con ayuda del kit RNAeasy de la empresa Quiagen (Valencia, CA, EE.UU.) segun indicaciones del fabricante. El ARNm se transcribio de forma inversa con el kit Marathon cDNA Amplification (BD Biosciences) y se ligo con adaptadores correspondientemente a las indicaciones del fabricante. Entonces se uso el banco de ADNc para la PCR para la clonacion de plasmidos de expresion mediante 5'- y 3'­ RACE (amplificacion rapida de extremos de ADNc).
Ejemplo 20: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Los pares de cebadores correspondientes se seleccionaron de forma que llevaran la secuencia consenso de levadura para la traduccion altamente eficaz (Kozak, Cell 1986, 44:283-292), ademas del codon de iniciacion. La amplificacion de ADN de TpElo se realizo respectivamente con 1 |jl de ADNc, dNTP 200 |jM, 2,5 U de polimerasa Advantage y 100 pmol de cada uno de los cebadores en un volumen total de 50 jl. Las condiciones para la PCR fueron del siguiente modo: Primera desnaturalizacion a 95 °C durante 4 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, asf como una ultima etapa de extension a 72 °C durante 10 minutos.
Para la clonacion de la secuencia para la expresion heterologa en levaduras se usaron los siguientes oligonucleotidos para la reaccion de PCR:
Figure imgf000057_0001
Los productos de PCR se incubaron durante 30 min a 21 °C con el vector de expresion en levadura - pYES2.1-TOPO (Invitrogen) segun indicaciones del fabricante. A este respecto, el producto de PCR se liga en el vector mediante un nucleotido protuberante T y la actividad de una topoisomerasa (Invitrogen). Despues de la incubacion se realizo entonces la transformacion de celulas DH5a de E. coli. Se identificaron los clones correspondientes mediante PCR, se aislo el ADN de plasmido mediante el kit Qiagen DNAeasy y se verifico mediante secuenciacion. La secuencia correcta se transformo entonces mediante electroporacion (1500 V) en la cepa de Saccharomyces INVSc1 (Invitrogen). Para el control, el vector vado pYES2.1 se transformo en paralelo. A continuacion se sembraron las levaduras en medio mmimo completo sin uracilo con 2 % de glucosa. Las celulas que fueron capaces de crecer en el medio sin uracilo contienen, por tanto, los plasmidos correspondientes pYES2.1, pYES2.1-TpELO1, pYES2.1-TpELO2 y pYES2.1-TpELO3. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron dos transformantes para la expresion funcional adicional.
Ejemplo 21: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion espedfica de semilla en plantas
Para la transformacion de plantas se genera un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron en los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante con el siguiente par de cebadores:
PSUN-TPELO1
Directo: 5'-GCGGCCGCaccatgtgctcaccaccgccgtc (SEQ ID NO: 152)
Inverso: 3'-GCGGCCGCctacatggcaccagtaac (SEQ ID NO: 153)
PSUN-TPELO2
Directo: 5'-GCGGCCGCaccatgtgctcatcaccgccgtc (SEQ ID NO: 154)
Inverso: 3'-GCGGCCGCctacatggcaccagtaac (SeQ ID NO: 155)
PSUN-TPELO3
Directo: 5'-GCGGCCGCaccatggacgcctacaacgctgc (SEQ ID NO: 156)
Inverso: 3'-GCGGCCGCctaagcactcttcttcttt (SEQ ID NO: 157)
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1,25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 j l de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incuban durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incuba de forma similar. A continuacion se separan los productos de PCR, asf como el vector de 7624 pb de tamano, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortan los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN se realiza mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligan el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados pSUN-TPELOl, pSUN-TPELO2 y pSUN-TPELO3 se verifican mediante secuenciacion.
pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen de octopinsintasa del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1-684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales. (Secuencia de cebador: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3'; SEQ ID NO: 151).
El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
La extraccion de lfpidos de levaduras y semillas se realizo de forma identica al Ejemplo 6.
Ejemplo 22: Expresion de TpEL01, TpELO2 y TpELO3 en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 4 con los plasmidos pYES2, pYES2-TpELO1, pYES2-TpELO2 y pYES2-TpELO3 se analizaron de la siguiente manera:
Se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3 100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres metflicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 |jl de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 jm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento). La identificacion de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 23: Caracterizacion funcional de TpELOl y TpELO3
La especificidad por sustrato de TpElo1 pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Fig. 9). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de TpElo1. Esto significa que el gen TpElo1 pudo expresarse funcionalmente.
La Tabla 7 muestra que TpElo1 presenta una estrecha especificidad por sustrato. TpElo1 solo pudo alargar los acidos grasos C20 acido eicosapentaenoico y acido araquidonico, pero preferiblemente el acido eicosapentaenoico w3 desaturado.
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pYES2-TpELO1 se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
Tabla 7: Expresion de TpELOl en levadura. En las columnas 1 y 3 se describen las reacciones de control para las columnas 2 (alimentada con C20:4a5,8,11,14250 pM) y 4 (alimentada C20:5a5,8,11,14,17250 pM).
Figure imgf000059_0002
La especificidad por sustrato de TpElo3 pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Fig. 10). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de TpElo3. Esto significa que el gen TpElo3 pudo expresarse funcionalmente.
La Tabla 8 muestra que TpElo3 presenta una estrecha especificidad por sustrato. TpElo3 solo pudo alargar los acidos grasos C18 acido Y-linolenico y acido estearidonico, pero preferiblemente el acido estearidonico w3 desaturado.
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pYES2-TpELO3 se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metilicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
Tabla 8: Expresion de TpELO3 en levadura. La columna 1 muestra el perfil de acidos grasos de levadura sin alimentacion. La columna 2 muestra la reaccion de control. En las columnas 3 a 6 se alimentaron acido Y-linolenico, acido estearidonico, acido araquidonico y acido eicosapentaenoico (250 pM de cada acido graso).
Figure imgf000059_0001
Ejemplo 24: Clonacion de un plasmido de expresion para la expresion heterologa de Pi-omega3Des en levaduras
Se clono el clon Pi-omega3Des para la expresion heterologa en levaduras mediante PCR con cebadores espedficos de Pi-omega3Des correspondientes en el vector de expresion en levadura pYES3. A este respecto se amplifico exclusivamente el marco de lectura abierto del gen de la protema codificante de Pi-omega3Des y se proveyo de dos sitios de escision para la clonacion en el vector de expresion pYES3:
Cebador directo: 5'-TAAGCTTACATGGCGACGAAGGAGG (SEQ ID NO: 149)
Cebador inverso: 5'-TGGATCCACTTACGTGGACTTGGT (SEQ ID NO: 150)
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1.25 j l de cada cebador (10 pmol/jl de 5'-ATG, asf como del codon de parada de 3')
0,50 j l de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
El producto de PCR se incubo durante 2 h a 37 °C con las enzimas de restriccion Hindlll y BamHI. El vector de expresion en levadura pYES3 (Invitrogen) se incubo de forma similar. A continuacion se separo el producto de PCR de 1104 pb de tamano, asf como el vector, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN tuvo lugar mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligaron el vector y ADNc de desaturasa. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. El plasmido formado pYES3-Pi-omega3Des se verifico mediante secuenciacion y se transformo mediante electroporacion (1500 V) en la cepa de Saccharomyces INVSc1 (Invitrogen). Para el control se transformo en paralelo pYES3. A continuacion se sembraron las levaduras en medio mmimo completo sin triptofano con 2 % de glucosa. Las celulas que fueron capaces de crecer en el medio sin triptofano contienen, por tanto, los plasmidos correspondientes pYES3, pYES3-Pi-omega3Des. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron dos transformantes para la expresion funcional adicional.
Ejemplo 25: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especfica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genero un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron en los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante con el siguiente par de cebadores:
PSUN-Pi-omega3Des
Inverso: 3-GCGGCCGCTTACGTGGACTTGGTC (SEQ ID NO: 147)
Directo: 5'-GCGGCCGCatGGCGACGAAGGAGG (SEQ ID NO: 148)
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1.25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 j l de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incubaron durante 4 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incubo de forma similar. A continuacion se separaron los productos de PCR, asf como el vector de 7624 pb de tamano, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN tuvo lugar mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligaron el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. El plasmido formado pSUN-Pi-omega3Des se verifico mediante secuenciacion.
Ejemplo 26: Expresion de Pi-omega3Des en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 24 con el plasmido pYES3 o pYES3-Pi-omega3Des se analizaron de la siguiente manera:
Se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3 100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres metflicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 |jl de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 jm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento). La identificacion de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 27: Caracterizacion funcional de Pi-omega3Des
La especificidad por sustrato de Pi-omega3Des pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Figura 12 a 18). Los sustratos alimentados estan presentes en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas, por lo que la captacion de estos acidos grasos en las levaduras esta demostrada. Las levaduras transgenicas muestran la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de Piomega3Des. Esto significa que el gen Pi-omega3Des pudo expresarse funcionalmente.
La Figura 12 describe la desaturacion de acido linoleico (acido graso u>6 C182) a acido a-linolenico (acido graso u>3 C183 ) mediante Pi-omega3Des. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas que se habfan transformado con el vector vacte pYES2 (Figura 12 A) o el vector pYes3-Piomega3Des (Figura 12 B). Las levaduras se cultivaron en medio mmimo en presencia del acido graso C18 2*912 (300 jM). A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
En la Figura 13 se describe la desaturacion de acido Y-linolenico (acido graso w6 C183) a acido estearidonico (acido graso u>3 C184) mediante Pi-omega3Des. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas que se habfan transformado con el vector vacte pYES2 (Figura 13 A) o el vector pYes3-Pi-omega3Des (Figura 13 B). Las levaduras se cultivaron en medio mmimo en presencia del acido graso Y-C183a6912 (300 jM). A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC. La Figura 14 describe la desaturacion del acido graso u>6 C202 al acido graso u>3 C203 mediante Pi-omega3Des. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas que se habfan transformado con el vector vacte pYES2 (Figura 14 A) o el vector pYes3-Pi-omega3Des (Figura 14 B). Las levaduras se cultivaron en medio mmimo en presencia del acido graso C202a11,14 (300 jM). A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
La Figura 15 describe la desaturacion del acido graso w6 C203 al acido graso w3 C204 mediante Pi-omega3Des. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas que se habfan transformado con el vector vacte pYES2 (Figura 15 A) o el vector pYes3-Pi-omega3Des (Figura 15 B). Las levaduras se cultivaron en medio mmimo en presencia de acido graso C203A8,11,14 (300 jM). A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
En la Figura 16 se muestra la desaturacion de acido araquidonico (acido graso w6 C20:4) a acido eicosapentaenoico (acido graso u>3 C20:5) mediante Pi-omega3Des.
La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas que se habfan transformado con el vector vacte pYES2 (Figura 16 A) o el vector pYes3-Pi-omega3Des (Figura 16 B). Las levaduras se cultivaron en medio mmimo en presencia del acido graso C20:4a5’8’11’14 (300 jM). A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
La Figura 17 describe la desaturacion del acido docosatetraenoico (acido graso w6 C224 ) al acido docosapentaenoico (acido graso u>3 C225 ) mediante Pi-omega3Des. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas que se habfan transformado con el vector vacte pYES2 (Figura 17 A) o el vector pYes3-Pi-omega3Des (Figura 17 B). Las levaduras se cultivaron en medio mmimo en presencia de acido graso C22:4a7,10,13,16 (300 j M). A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
La especificidad por sustrato de Pi-omega3Des en comparacion con distintos acidos grasos puede extraerse de la Figura 18. Las levaduras que se habfan transformado con el vector pYes3-Pi-omega3Des se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metilicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC. Cada valor describe un valor medio de tres mediciones. Las tasas de conversion (% de desaturacion) se calcularon con la formula:
[producto]/[producto]+[sustrato]*100.
Como puede describirse en el Ejemplo 9, Pi-omega3Des tambien puede usarse para la generacion de plantas transgenicas. A partir de las semillas de estas plantas puede entonces tener lugar la extraccion de lfpidos como se describe en el Ejemplo 6.
Ejemplo 28: Clonacion de genes de desaturasa de Ostreococcus tauri
Mediante busqueda de regiones conservadas en las secuencias de protemas con ayuda de motivos conservados (cajas de His, Domergue y col. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113) pudieron identificarse cinco secuencias con motivos correspondientes en una base de datos de secuencias de Ostreococcus tauri (secuencias genomicas). A este respecto se trata de las siguientes secuencias:
Figure imgf000062_0001
Los alineamientos para encontrar homologfas de los genes individuales se realizaron con el algoritmo tBLASTn (Altschul y col., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403 - 410).
La clonacion se realizo del siguiente modo:
Se separaron por centrifugacion 40 ml de un cultivo de Ostreococcus tauri en la fase estacionaria y se resuspendieron en 100 j l de agua bidest y se guardaron a -20 °C. Basandose en el procedimiento de PCR se amplificaron los ADN genomicos correspondientes. Los pares de cebadores correspondientes se seleccionaron de forma que llevaran la secuencia consenso de levadura para la traduccion altamente eficaz (Kozak, Cell 1986, 44:283-292), ademas del codon de iniciacion. La amplificacion de ADN de OtDes se realizo respectivamente con 1 j l de celulas descongeladas, dNTP 200 j M, 2,5 U de Tag-polimerasa y 100 pmol de cada uno de los cebadores en un volumen total de 50 jl. Las condiciones para la PCR fueron del siguiente modo: Primera desnaturalizacion a 95 °C durante 4 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, asf como una ultima etapa de extension a 72 °C durante 10 minutos.
Se utilizaron los siguientes cebadores para la PCR:
OtDes6.1 Directo: 5'ggtaccacataatgtgcgtggagacggaaaataacg3' (SEQ ID NO: 145)
OtDes6.1 Inverso: 5'ctcgagttacgccgtctttccggagtgttggcc3' (SEQ ID NO: 146)
Ejemplo 29: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Para la caracterizacion de la funcion de la desaturasa OtDes6.1 (= A6-desaturasa) de Ostreococcus tauri se clono el marco de lectura abierto del ADN en la direccion 3' del promotor GAL1 inducible por galactosa de pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), obteniendose el clon pYES2.1-OtDes6.1 correspondiente. De forma correspondiente pueden clonarse genes de desaturasa adicionales de Ostreococcus.
La cepa 334 de Saccharomyces cerevisiae se transformo mediante electroporacion (1500 V) con el vector pYES2.1-OtDes6.1. Como control se uso una levadura que se transformo con el vector vacm pYES2. La seleccion de las levaduras transformadas se realizo en placas de agar con medio mmimo completo (CMdum) con 2 % de glucosa, pero sin uracilo. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron tres transformantes para la expresion funcional adicional.
Para la expresion de OtDes6.1 desaturasa se inocularon inicialmente precultivos de respectivamente 5 ml de medio lfquido CMdum con 2 % (p/v) de rafinosa pero sin uracilo con los transformantes seleccionados y se incubaron 2 dfas a 30 °C, 200 rpm. Entonces se inocularon 5 ml de medio Kquido CMdum (sin uracilo) con 2 % de rafinosa y 300 |jM de distintos acidos grasos a una DO600 de 0,05. La expresion se indujo mediante la adicion de 2 % (p/v) de galactosa. Los cultivos se incubaron durante 96 h adicionales a 20 °C.
Ejemplo 30: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especifica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genera un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron mediante PCR en los extremos 5' y 3' de las secuencias codificantes. Las secuencias de cebadores correspondientes se derivan de las regiones 5' y 3' de desaturasas.
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5,00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1,25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 j l de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incuban durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incuba de forma similar. A continuacion se separan los productos de PCR, asf como el vector, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN se realiza mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligan el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados se verifican mediante secuenciacion.
pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen de Ostreococcus del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1 a 684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales. (Secuencia de cebador: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3', SEQ ID NO: 144).
El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
Ejemplo 31: Expresion de OtDes6.1 en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 4 con los plasmidos pYES2 y pYES2-OtDes6.2 se analizaron de la siguiente manera:
Se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3 100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres metflicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 j l de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 jm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento). La identificacion de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 32: Caracterizacion funcional de desaturasas de Ostreococcus
La especificidad por sustrato de desaturasas puede determinarse despues de la expresion en levadura (veanse los ejemplos Clonacion de genes de desaturasa, expresion en levadura) por alimentacion mediante distintas levaduras. Descripciones de la determinacion de actividades individuales se encuentran en los documentos WO 93/11245 para A15-desaturasas, WO 94/11516 para A12-desaturasas, WO 93/06712, US 5.614.393, US 5614393, WO 96/21022, WO 0021557 y WO 99/27111 para A6-desaturasas, Qiu y col. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 para A4-desaturasas, Hong y col. 2002, Lipids 37,863-868 para A5-desaturasas.
La Tabla 9 describe la especificidad por sustrato de la desaturasa OtDes6.1 en comparacion con distintos acidos grasos. La especificidad por sustrato de OtDes6.1 pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos. Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de OtDes6.2 (Fig. 20). Esto significa que el gen OtDes6.1 pudo expresarse funcionalmente.
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pYES2-OtDes6.1 se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metilicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC. Cada valor describe el valor medio (n=3) ± desviacion estandar. La actividad se corresponde con la tasa de conversion calculada segun [sustrato/(sustrato+producto)*100].
La Tabla 9 muestra que OtDes6.1 presenta una especificidad por sustrato para acido linoleico y linolenico (C- ^ 2 y C183 ), ya que con estos acidos grasos se alcanzan las mayores actividades. La actividad para acido oleico (C-^-i) y acido palmitoleico (Cm-i) es, por el contrario, claramente menor. La relacion preferida de acido linoleico y linolenico muestra la adecuacion de esta desaturasa para la produccion de acidos grasos poliinsaturados.
Figure imgf000064_0002
La Figura 20 muestra la conversion de acido linoleico mediante OtDes6.1. El analisis de FAME se realizo mediante cromatograffa de gases. El sustrato alimentado (C182) se convierte en Y-C183. Tanto el producto de partida como tambien el producto formado estan marcados por flechas.
En la Figura 21 se describe la conversion de acido linoleico (=LA) y acido a-linolenico (=ALA) en presencia de OtDes6.1 en acido Y-linolenico (=GLA) o acido estearidonico (=STA) (Figura 21 A y C). Ademas, la Figura 21 muestra la conversion de acido linoleico (=LA) y acido a-linolenico (=ALA) en presencia de la A6-desaturasa OtDes6.1 junto con la A6-elongasa PSE1 de Physcomitrella patens (Zank y col. 2002, Plant J. 31:255-268) y la A5-desaturasa PtD5 de Phaeodactylum tricornutum (Domergue y col. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113) en acido dihomo-Y-linolenico (=DHGLA) y acido araquidonico (=ARA, Figura 21 B) o en acido dihomoestearidonico (=DHSTA) o acido eicosapentaenoico (=EPA, Figura 21 D). La Figura 21 muestra claramente que los productos de reaccion GLA y STA de la A6-desaturasa OtDes6.1 en presencia de la A6-elongasa PSE1 se extienden casi cuantitativamente dando DHGLA o DHSTA. La posterior desaturacion por la A5-desaturasa PtD5 se realiza tambien sin problemas dando ARA o EPA. Se desaturan aproximadamente del 25 al 30 % del producto de extension (Figura 21 B y D).
La siguiente Tabla 10 describe una vision general de las desaturasas de Ostreococcus clonadas:
Figure imgf000064_0001
continuacion
Figure imgf000065_0001
Ejemplo 33: Clonacion de genes de desaturasa de Thalassiosira pseudonana
Mediante busqueda de regiones conservadas en las secuencias de protemas con ayuda de motivos conservados (cajas de His, vease Motivos) pudieron identificarse seis secuencias con motivos correspondientes en un banco de datos de secuencias de Thalassiosira pseudonana (secuencias genomicas). A este respecto se trata de las siguientes secuencias:
Figure imgf000065_0002
La clonacion se realizo del siguiente modo:
Se separaron por centrifugacion 40 ml de un cultivo de Thalassiosira pseudonana en la fase estacionaria y se resuspendieron en 100 |jl de agua bidest y se guardaron a -20 °C. Basandose en el procedimiento de PCR se amplificaron los ADN genomicos correspondientes. Los pares de cebadores correspondientes se seleccionaron de forma que llevaran la secuencia consenso de levadura para la traduccion altamente eficaz (Kozak, Cell 1986, 44:283-292), ademas del codon de iniciacion. La amplificacion de ADN de TpDes se realizo respectivamente con 1 j l de celulas descongeladas, dNTP 200 jM, 2,5 U de Taq-polimerasa y 100 pmol de cada uno de los cebadores en un volumen total de 50 jl. Las condiciones para la PCR fueron del siguiente modo: Primera desnaturalizacion a 95 °C durante 4 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, asf como una ultima etapa de extension a 72 °C durante 10 minutos.
Ejemplo 34: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Para la caracterizacion de la funcion de las desaturasas de Thalassiosira pseudonana se clona el marco de lectura abierto del ADN respectivo en la direccion 3' del promotor GAL1 inducible por galactosa de pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), obteniendose el clon pYES2.1 correspondiente.
La cepa 334 de Saccharomyces cerevisiae se transforma mediante electroporacion (1500 V) con los vectores pYES2.1-Tp-desaturasas. Como control se usa una levadura que se transforma con el vector vacfo pYES2. La seleccion de las levaduras transformadas se realiza en placas de agar con medio mmimo completo (CMdum) con 2 % de glucosa, pero sin uracilo. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron tres transformantes para la expresion funcional adicional.
Para la expresion de desaturasas de Tp se inocularon inicialmente precultivos de respectivamente 5 ml de medio lfquido CMdum con 2 % (p/v) de rafinosa pero sin uracilo con los transformantes seleccionados y se incubaron 2 dfas a 30 °C, 200 rpm. Luego se inoculan 5 ml de medio lfquido CMdum (sin uracilo) con 2 % de rafinosa y 300 jM de distintos acidos grasos con los precultivos a una DO600 de 0,05. La expresion se induce mediante la adicion de 2 % (p/v) de galactosa. Los cultivos se incuban durante 96 h adicional a 20 °C.
Ejemplo 35: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especfica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genera un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron mediante PCR en los extremos 5' y 3' de las secuencias codificantes. Las secuencias de cebadores correspondientes se derivan de las regiones 5' y 3' de desaturasas.
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5,00 Ml de dNTP 2 mM
1,25 Ml de cada cebador (10 pmol/Ml)
0,50 Ml de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incuban durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incuba de forma similar. A continuacion se separan los productos de PCR, asf como el vector, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN se realiza mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligan el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados se verifican mediante secuenciacion.
pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen OCS del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1 a 684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales. (Secuencia de cebador: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3'; SEQ ID NO: 143)
El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
Ejemplo 36: Expresion de Tp-desaturasas en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 4 con los plasmidos pYES2 y pYES2-Tp-desaturasas se analizan de la siguiente manera:
Se recolectan las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavan con NaHCO3 100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se producen esteres metilicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incuban con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion der FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavan en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secan las fases de PE con Na2SO4 , se evaporan bajo argon y se recogen en 100 Ml de PE. Las muestras se separan en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 Mm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC son del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento).
La identificacion de las senales se realiza mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 37: Caracterizacion funcional de desaturasas de Thalassiosira pseudonana
La especificidad por sustrato de desaturasas puede determinarse despues de la expresion en levadura (veanse los ejemplos Clonacion de genes de desaturasa, expresion en levadura) por alimentacion mediante distintas levaduras. Descripciones de la determinacion de actividades individuales se encuentran en los documentos WO 93/11245 para A15-desaturasas, WO 94/11516 para A12-desaturasas, WO 93/06712, US 5.614.393, US5614393, WO 96/21022, WO 0021557 y WO 99/27111 para A6-desaturasas, Qiu y col. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 para A4-desaturasas, Hong y col. 2002, Lipids 37,863-868 para A5-desaturasas.
La actividad de las desaturasas individuales se calcula a partir de la tasa de conversion segun la formula [sustrato/(sustrato+producto)*100].
Las siguientes Tablas 11 y 12 describen una vision general de las desaturasas de Thalassiosira pseudonana clonadas.
Tabla 11: Longitud y rasgos caractensticos de las desaturasas de Thalassiosira clonadas.
Figure imgf000067_0001
Tabla 12: Longitud, exones, homologfa e identidades de las desaturasas clonadas.
Figure imgf000067_0002
Los genes A12-desaturasa de Ostreococcus y Thalassiosira pueden clonarse analogamente a los ejemplos previamente mencionados.
Ejemplo 38: Clonacion de genes de elongasa de Xenopus laevis y Ciona intestinalis
Mediante busqueda de regiones conservadas (veanse las secuencias consenso, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 116) en las secuencias de protemas en bancos de datos genicos (Genbank) con ayuda de los genes elongasa citados en la solicitud con actividad de A5-elongasa o actividad de A6-elongasa pudieron identificarse y aislarse secuencias de elongasa adicionales de otros organismos. A partir de X. laevis o de C. intestinalis pudieron identificarse respectivamente secuencias adicionales con motivos correspondientes. A este respecto se trata de las siguientes secuencias:
Figure imgf000067_0003
Se obtuvo el clon de ADNc de X. laevis del NIH (Instituto Nacional de Salud) [Genetic and genomic tools for Xenopus research: The NIH Xenopus initiative, Dev. Dyn. 225 (4), 384-391 (2002)].
Se obtuvo el clon de ADNc de C. intestinalis de la Universidad de Kioto [Satou, Y., Yamada, L., Mochizuki, Y., Takatori, N., Kawashima, T., Sasaki, A., Hamaguchi, M., Awazu, S., Yagi, K., Sasakura, Y., Nakayama, A., Ishikawa, H., Inaba, K. y Satoh, N. “A cDNA resource from the basal chordate Ciona intestinalis” JOURNAL Genesis 33 (4), 153-154 (2002)].
Ejemplo 39: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
La amplificacion de ADN de elongasa se realizo respectivamente con 1 |jl de ADNc, dNTP 200 |jM, 2,5 U de polimerasa Advantage y 100 pmol de cada uno de los cebadores en un volumen total de 50 jl. Las condiciones para la PCR fueron del siguiente modo: Primera desnaturalizacion a 95 °C durante 4 minutes, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, asf como una ultima etapa de extension a 72 °C durante 10 minutos.
Para la clonacion de la secuencia para la expresion heterologa en levaduras se usaron los siguientes oligonucleotidos para la reaccion de PCR:
Figure imgf000068_0001
Los productos de PCR se incubaron durante 30 min a 21 °C con el vector de expresion en levadura - pYES2.1-TOPO (Invitrogen) segun indicaciones del fabricante. A este respecto, el producto de PCR se liga en el vector mediante un nucleotido protuberante T y la actividad de una topoisomerasa (Invitrogen) segun indicaciones del fabricante. Despues de la incubacion se realizo entonces la transformacion de celulas DH5a de E. coli. Se identificaron clones correspondientes mediante PCR, se aislo el ADN de plasmido mediante el kit Qiagen DNAeasy y se verifico mediante secuenciacion. La secuencia correcta se transformo entonces mediante electroporacion (1500 V) en la cepa de Saccharomyces INVSc1 (Invitrogen). Para el control, el vector vacte pYES2.1 se transformo en paralelo. A continuacion se sembraron las levaduras en medio mmimo completo sin uracilo con 2 % de glucosa. Las celulas que fueron capaces de crecer en el medio sin uracilo contienen, por tanto, los plasmidos correspondientes pYES2.1, pYES2.1-ELO(XI) y pYES2.1-ELO(Ci). Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron dos transformantes para la expresion funcional adicional.
Ejemplo 40: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especifica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genera un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron en los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante con el siguiente par de cebadores:
pSUN-ELO(XI)
Directo: 5'-GCGGCCGCACCATGGCCTTCAAGGAGCTCACATC (SEQ ID NO: 125)
Inverso: 3'-GCGGCCGCCTTCAATGGTTTTTGCTTTTCAATGCACCG (SEQ ID NO: 126)
pSUN-ELO(Ci)
Directo: 5'-GCGGCCGCACCATGGACGTACTTCATCGT (SEQ ID NO: 127)
Inverso: 3'-GCGGCCGCTTTAATCGGTTTTACCATT (SEQ ID NO: 128)
Composicion de la mezcla de PCR (50 pl):
5.00 pl de ADNc de molde
5.00 pl de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 pl de dNTP 2 mM
1,25 pl de cada cebador (10 pmol/pl)
0,50 pl de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incubaron durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incubo de forma similar. A continuacion se separaron los productos de PCR, asf como el vector de 7624 pb de tamano, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN se realizo mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligaron el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados pSUN-ELO(XI) y pSUN-ELO(Ci) se verificaron mediante secuenciacion.
pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP [Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994]. pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen de octopinsintasa del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1-684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales.
Secuencia de cebador: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3' (SEQ ID NO: 129).
El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
La extraccion de lfpidos de levaduras y semillas se realizo de forma identica al Ejemplo 6.
Ejemplo 41: Expresion de ELO(XI) y ELO(Ci) en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 4 con los plasmidos pYES2, pYES2-ELO(XI) y pYES2-ELO(Ci) se analizaron de la siguiente manera:
Se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3 100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres metflicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 |jl de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 jm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento). La identificacion de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8): 761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 42: Caracterizacion funcional de ELO(XI) y ELO(Ci)
La especificidad por sustrato de ELO(XI) pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Figura 22). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de ELO(XI). Esto significa que el gen ELO(XI) pudo expresarse funcionalmente.
La Tabla 13 muestra que ELO(XI) presenta una amplia especificidad por sustrato. Se alargan tanto acidos grasos C18 como tambien C20, observandose una preferencia de acidos grasos desaturados en A5 y A6.
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pYES2-ELO(XI) se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
Tabla 13: Expresion de ELO(XI) en levadura. Se describe la tasa de conversion de distintos productos de partida (alimentados respectivamente a 250 jM).
Figure imgf000069_0001
continuacion
Figure imgf000070_0002
La especificidad por sustrato de ELO(Ci) pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Figura 23). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de ELO(Ci). Esto significa que el gen ELO(Ci) pudo expresarse funcionalmente.
Tabla 14: Expresion de ELO(Ci) en levadura. Se describe la tasa de conversion de distintos productos de partida (alimentados respectivamente a 250 pM).
Figure imgf000070_0001
La Tabla 14 muestra que ELO(Ci) presenta una amplia especificidad por sustrato. Se alargan tanto acidos grasos Ci8 como tambien C20, observandose una preferencia de acidos grasos desaturados en A5 y A6.
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pYES2-ELO(Ci) se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metilicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
Ejemplo 43: Clonacion de genes de Ostreococcus tauri
Mediante busqueda de regiones conservadas en las secuencias de protemas con ayuda de los genes de elongasa descritos en el presente documento con actividad de A5-elongasa o actividad de A6-elongasa pudieron identificarse en cada caso dos secuencias con motivos correspondientes en una base de datos de secuencias de Ostreococcus tauri (secuencias genomicas). A este respecto se trata de las siguientes secuencias:
Figure imgf000071_0001
OtElol y OtElo1.2 presentan la mayor similitud con una elongasa de Danio rerio (GenBank AAN77156; aproximadamente el 26 % de identidad), mientras que OtElo2 y OtElo2.1 presentan la mayor similitud para Elo de Physcomitrella (PSE) [aproximadamente el 36 % de identidad] (Los alineamientos se realizaron con el algoritmo tBLASTn (Altschul y col., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403 - 410).
La clonacion de elongasas se realizo del siguiente modo:
Se separaron por centrifugacion 40 ml de un cultivo de Ostreococcus tauri en la fase estacionaria y se resuspendieron en 100 |jl de agua bidest y se guardaron a -20 °C. Basandose en el procedimiento de PCR se amplificaron los ADN genomicos correspondientes. Los pares de cebadores correspondientes se seleccionaron de forma que llevaran la secuencia consenso de levadura para la traduccion altamente eficaz (Kozak, Cell 1986, 44:283-292), ademas del codon de iniciacion. La amplificacion de ADN de OtElo se realizo respectivamente con 1 j l de celulas descongeladas, dNTP 200 jM, 2,5 U de Tag-polimerasa y 100 pmol de cada uno de los cebadores en un volumen total de 50 jl. Las condiciones para la PCR fueron del siguiente modo: Primera desnaturalizacion a 95 °C durante 4 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, asf como una ultima etapa de extension a 72 °C durante 10 minutos.
Ejemplo 44: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Para la caracterizacion de la funcion de las elongasas de Ostreococcus tauri se clonaron los marcos de lectura abiertos del ADN respectivo en la direccion 3' del promotor GAL1 inducible por galactosa de pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), obteniendose pOTE1, pOTE1.2, pOTE2 y pOTE2.1.
La cepa 334 de Saccharomyces cerevisiae se transformo mediante electroporacion (1500 V) con el vector pOTE1, pOTE1.2, pOTE2 o pOTE2.1. Como control se uso una levadura que se transformo con el vector vado pYES2. La seleccion de las levaduras transformadas se realizo en placas de agar con medio mmimo completo (CMdum) con 2 % de glucosa, pero sin uracilo. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron tres transformantes para la expresion funcional adicional.
Para la expresion de elongasas de Ot se inocularon inicialmente precultivos de respectivamente 5 ml de medio lfquido CMdum con 2% (p/v) de rafinosa pero sin uracilo con los transformantes seleccionados y se incubaron 2 dfas a 30 °C, 200 rpm. Entonces se inocularon 5 ml de medio lfquido CMdum (sin uracilo) con 2 % de rafinosa y 300 jM de distintos acidos grasos a una DO600 de 0,05. La expresion se indujo mediante la adicion de 2 % (p/v) de galactosa. Los cultivos se incubaron durante 96 h adicionales a 20 °C.
Ejemplo 45: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especfica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genero un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron mediante PCR en los extremos 5' y 3' de las secuencias codificantes. Las secuencias de cebadores correspondientes se derivaron de las regiones 5' y 3' de OtElo1, OtElo1.2, OtElo2 y OtElo2.1.
Composicion de la mezcla de PCR (50 jl):
5.00 j l de ADNc de molde
5.00 j l de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 j l de dNTP 2 mM
1,25 j l de cada cebador (10 pmol/jl)
0,50 j l de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incuban durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incuba de forma similar. A continuacion se separaron los productos de PCR, asf como el vector, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN se realizo mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligaron el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. Los plasmidos formados pSUN-OtELO1, pSUN-OtELO1.2, pSUN-OtELO2 y pSUN-OtELo2.2 se verificaron mediante secuenciacion.
pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP [Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994]. pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen de Ostreococcus del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1 a 684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales.
Secuencia de cebador:
5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3'). (SEQ ID NO: 130)
El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
Ejemplo 46: Expresion de OtElol, OtElo1.2, OtElo2 y OtELO2.2 en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 15 con los plasmidos pYES3, pYES3-OtELO1, pYES3-OtELO1.2, pYES3-OtELO2 y pYES3-OtELO2.2 se analizaron de la siguiente manera:
Se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3 100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres metflicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 |jl de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 jm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento). La identificacion de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 47: Caracterizacion funcional de OtElol, OtElo1.2, OtElo2 y OtElo2.1
La especificidad por sustrato de OtElo1 pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Tabla 15). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de OtElo1. Esto significa que el gen OtElo1 pudo expresarse funcionalmente.
La Tabla 15 muestra que OtElo1 u OtElo1.2 presentan una estrecha especificidad por sustrato. OtElo1 u OtElo1.2 solo pudieron alargar los acidos grasos C20 acido eicosapentaenoico (Figura 24A, 24B) y acido araquidonico (Figura 25A, 25B), pero preferiblemente el acido eicosapentaenoico u>3 desaturado.
La Tabla 15 muestra la especificidad por sustrato de la elongasa OtElo1 y OtElo1.2 para acidos grasos C20 poliinsaturados con un doble enlace en la posicion A5 en comparacion con distintos acidos grasos.
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pOTE1 o pOTE1.2 se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metflicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
La especificidad por sustrato de OtElo2 (SEQ ID NO: 81), OtElo2.1 (SEQ ID NO: 111) pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Tab. 16). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de OtElo2. Esto significa que los genes OtElo2 y OtElo2.1 pudieron expresarse funcionalmente.
Tabla 15:
Figure imgf000073_0001
La Tabla 16 muestra la especificidad por sustrato de la elongasa OtElo2 y OtElo2.1 en comparacion con distintos acidos grasos. OtElo2.1 muestra una actividad claramente mayor.
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pOTE2 o pOTE2.1 se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metilicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC.
La actividad enzimatica, que se describe en la Tabla 16, muestra claramente que OtElo2 u OtElo2.1 es una A6-elongasa.
Tabla 16:
Figure imgf000073_0002
La Figura 24 A - D muestra el alargamiento de acido eicosapentaenoico mediante OtElol (B) u OtElo1.2 (D). Los controles (A, C) no muestran el producto de alargamiento (C225 w3).
La Figura 25 A - D muestra el alargamiento de acido araquidonico mediante OtElol (B) u OtElol .2 (D). Los controles (A, C) no muestran el producto de alargamiento (C224 w6).
Ejemplo 48: Clonacion de genes de elongasa de Euglena gracilis y Arabidopsis thaliana
Mediante busqueda de regiones conservadas en las secuencias de protemas con ayuda de los genes elongasa citados en la solicitud con actividad de A5-elongasa o actividad de A6-elongasa pudieron identificarse secuencias de Arabidopsis thaliana o Euglena gracilis con motivos correspondientes en bandos de datos de secuencias (Genbank, Euglena EST Bank). A este respecto se trata de las siguientes secuencias:
Figure imgf000074_0001
La clonacion de elongasas de Euglena gracilis se realizo del siguiente modo:
Se obtuvo la cepa 1224-5/25 de Euglena gracilis de la Sammlung fur Algenkulturen Gottingen (SAG). Para el aislamiento, la cepa se cultivo en medio II (Calvayrac R y Douce R, FEBS Letters 7:259-262, 1970) durante 4 dfas a 23 °C con un intervalo de luz/oscuridad de 8 h/16 h (35 mol s'1 itt 2 de intensidad de la luz).
Se aislo ARN total de un cultivo de Euglena de cuatro dfas con ayuda del kit RNAeasy de la empresa Qiagen (Valencia, CA, EE.UU.). A partir del ARN total se aislo poli-A+ ARN (ARNm) con ayuda de oligo-dT-celulosa (Sambrook y col., 1989). El ARN se transcribio de forma inversa con el kit Reverse Transcription System de Promega y el ADNc sintetizado se clono en el vector lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene). Correspondientemente a las instrucciones del fabricante, el ADNc se desempaqueto dando el ADN de plasmido y los clones se secuenciaron para secuenciacion aleatoria. A partir del ARN total se aislo ARNm con ayuda del sistema de aislamiento PolyATract (Promega). El ARNm se transcribio de forma inversa con el kit Marathon cDNA Amplification (BD Biosciences) y se ligo con los adaptadores correspondientemente a las instrucciones del fabricante. Entonces se uso el banco de ADNc para la PCR para la clonacion de plasmidos de expresion mediante 5'- y 3'-RACE (amplificacion rapida de extremos de ADNc).
La clonacion de elongasas de Arabidopsis thaliana se realizo del siguiente modo:
A partir del ADN genomico, cebadores para los dos genes se derivaron correspondientemente en los extremos 5' y 3' del marco de lectura abierto.
Para aislar el ARN total de A. thaliana se procedio segun Chrigwin y col., (1979). Hojas de plantas de 21 dfas de edad se trituraron con mortero en nitrogeno lfquido, se mezclaron con tampon de rotura y se incubaron durante 15 min a 37 °C. Despues de la centrifugacion (10 min, 4 °C, 12000 x g), el ARN en el sobrenadante precipito con 0,02 volumenes de acetato de sodio 3 M a pH 5,0 y 0,75 volumenes de etanol a -20 °C durante 5 h. Entonces, el ARN se recogio despues de otra etapa de centrifugacion en 1 ml de TES por g de material de partida, se extrajo una vez con un volumen de fenol-cloroformo y una vez con un volumen de cloroformo y el ARN precipito con LiCl 2,5 M. Despues de la centrifugacion posterior y el lavado con etanol al 80 %, el ARN se resuspendio en agua. El ADNc se sintetizo correspondientemente a Sambrook y col. 1989 y se realizo la RT-PCR con los cebadores derivados. Los productos de PCR se clonaron en el vector pYES2.1-TOPO (Invitrogen) segun indicaciones del fabricante.
Ejemplo 49: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Para la caracterizacion de la funcion de las elongasas de A. thalina se clonaron los marcos de lectura abiertos del ADN respectivo en la direccion 3' del promotor GAL1 inducible por galactosa de pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), obteniendose pAt60 y pAt70.
La cepa 334 de Saccharomyces cerevisiae se transformo mediante electroporacion (1500 V) con el vector pAt60 o pAt70. Como control se uso una levadura que se transformo con el vector vacfo pYES2.1. La seleccion de las levaduras transformadas se realizo en placas de agar con medio mmimo completo (CMdum) con 2 % de glucosa, pero sin uracilo. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron tres transformantes para la expresion funcional adicional.
Para la expresion de elongasas de At se inocularon inicialmente precultivos de respectivamente 5 ml de medio lfquido CMdum con 2% (p/v) de rafinosa pero sin uracilo con los transformantes seleccionados y se incubaron 2 dfas a 30 °C, 200 rpm.
Entonces se inocularon 5 ml de medio Kquido CMdum (sin uracilo) con 2 % de rafinosa y 300 ^M de distintos acidos grasos a una DO600 de 0,05. La expresion se indujo mediante la adicion de 2 % (p/v) de galactosa. Los cultivos se incubaron durante 96 h adicionales a 20 °C.
Ejemplo 50: Expresion de pAt60 y pAt70 en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 5 con los plasmidos pYES2.1, pAt60 o pAt70 se analizaron de la siguiente manera:
Se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugation (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres metflicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraction de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la elimination de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuation se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 ^l de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 ^m, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionization de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento).
La identification de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retention con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologia se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 51: Caracterizacion funcional de pAt60 y pAt70
La especificidad por sustrato de las elongasas At3g06460 o At3g06470 pudo determinarse despues de la expresion y alimentation de distintos acidos grasos (Tabla 17, Figura 26). Los sustratos alimentados pueden detectarse en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaction de genes At3g06460 o At3g06470. Esto significa que estos genes pudieron expresarse funcionalmente.
Tabla 17: Alargamiento de EPA mediante las elongasas At3g06460 o At3g06470. Medicion de los extractos de levadura despues de la alimentacion con EPA 250 uM.
Figure imgf000075_0002
La Figura 26 describe el alargamiento de C20:5 n-3 mediante las elongasas At3g06470.
Ejemplo 52: Clonacion de una elongasa de Phaeodactylum tricornutum
A partir de regiones conservadas en las secuencias de protemas con ayuda de los genes elongasa citados en la solicitud con actividad de A6-elongasa se produjeron cebadores degenerados y con estos se cribo un banco de ADNc de Phaeodactylum. Se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores:
Figure imgf000075_0001
Las bases nucleotidicas entre parentesis significan que esta presente una mezcla de oligonucleotidos con respectivamente la una o la otra base nucleotidica.
Preparation del banco de ADNc de Phaeodactylum:
Se cultivo un cultivo de 2 l de P. tricornutum UTEX 646 en medio f/2 (Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. En Culture of Marine Invertebrate Animals (Eds. Smith, W.L. y Chanley, M.H.), Plenum Press, Nueva York, pp 29-60) durante 14 d (= dias) con una intensidad de la luz de 35 E/cm2. Celulas congeladas se trituraron despues de la centrifugacion en presencia de nitrogeno Kquido dando un polvo fino y se resuspendieron con 2 ml de tampon de homogeneizacion (sorbitol 0,33 M, NaCI 0,3 M, EDTA 10 mM, EGTA 10 mM, 2 % de SDS, 2 % de mercaptoetanol en Tris-CI 0,2 M a pH 8,5). Despues de la adicion de 4 ml de fenol y 2 ml de cloroformo se agito vigorosamente 15 min a 40-50 °C. A continuacion se centrifugo (10 min x 10000 g) y la fase acuosa se extrajo escalonadamente con cloroformo. Entonces los acidos nucleicos se precipitaron mediante la adicion de 1/20 de volumen de disolucion 4 M de hidrogenocarbonato de sodio y se centrifugaron. El sedimento se recogio en Tris-borato 80 mM a pH 7,0 y EDTA 1 mM y el ARN se precipito con cloruro de litio 8 M. Despues de la centrifugacion y el lavado con etanol al 70 %, el sedimento de ARN se recogio con agua libre de Rnasa. Se aislo poli(A)-ARN con Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) segun indicaciones del fabricante y se realizo la smtesis de ADNc de la primera cadena con MLV-Rtase de Roche (Mannheim). La smtesis de la segunda cadena se realizo entonces mediante ADN polimerasa I y fragmento de Klenow, seguido de una digestion con Rnasa H. El ADNc se trato con ADN polimerasa T4 y a continuacion se unieron adaptadores de EcoRI/Xhol (Pharmacia, Friburgo) mediante T4 ligasa. Despues de la digestion con Xhol, fosforilacion y separacion en gel, los fragmentos de mas de 300 pb se ligaron en los fagos lambda ZAP Express (Stratagene, Amsterdam, Los Pafses Bajos) correspondientemente a las instrucciones del fabricante. Despues de la escision en masa del banco de ADNc y la recuperacion de plasmido, el banco de plasmidos se transformo en celulas DH10B de E. coli y se utilizo para el cribado por PCR.
Mediante los cebadores degenerados anteriormente mencionados pudo regenerarse el fragmento de PCR con el numero de secuencia SEQ ID NO: 187.
Este fragmento se marco con digoxigenina (Roche, Mannheim) y se uso como sonda para el cribado del banco de fagos.
Con ayuda de la secuencia SEQ ID NO: 187 pudo obtenerse la secuencia genica SEQ ID NO: 183, que representa la molecula de ARN de longitud completa de la A6-elongasa de Phaeodactylum.
Ejemplo 53: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion heterologa en levaduras
Los pares de cebadores correspondientes se seleccionaron de forma que llevaran la secuencia consenso de levadura para la traduccion altamente eficaz (Kozak, Cell 1986, 44:283-292), ademas del codon de iniciacion. La amplificacion de ADN de PtELO6 se realizo respectivamente con 1 |jl de ADNc, dNTP 200 |jM, 2,5 U de polimerasa Advantage y 100 pmol de cada uno de los cebadores en un volumen total de 50 jl. Las condiciones para la PCR fueron del siguiente modo: Primera desnaturalizacion a 95 °C durante 4 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, asf como una ultima etapa de extension a 72 °C durante 10 minutos.
Para la clonacion de la secuencia para la expresion heterologa en levaduras se usaron los siguientes oligonucleotidos para la reaccion de PCR:
Figure imgf000076_0001
Los productos de PCR se incubaron durante 30 min a 21 °C con el vector de expresion en levadura - pYES2.1-TOPO (Invitrogen) segun indicaciones del fabricante. A este respecto, el producto de PCR (vease SEQ ID NO: 192) se ligo en el vector mediante un nucleotido protuberante T y la actividad de una topoisomerasa (Invitrogen). Despues de la incubacion se realizo entonces la transformacion de celulas DH5a de E. coli. Se identificaron clones correspondientes mediante PCR, se aislo el ADN de plasmido mediante el kit Qiagen DNAeasy y se verifico mediante secuenciacion. La secuencia correcta se transformo entonces mediante electroporacion (1500 V) en la cepa de Saccharomyces INVSc1 (Invitrogen). Para el control, el vector vacm pYES2.1 se transformo en paralelo. A continuacion se sembraron las levaduras en medio mmimo completo sin uracilo con 2 % de glucosa. Las celulas que fueron capaces de crecer en el medio sin uracilo contienen, por tanto, los plasmidos correspondientes pYES2.1 y pYES2.1-PtELO6. Despues de la seleccion, en cada caso se seleccionaron dos transformantes para la expresion funcional adicional.
Ejemplo 54: Clonacion de plasmidos de expresion para la expresion especfica de semilla en plantas Para la transformacion de plantas se genera un vector de transformacion adicional basado en pSUN-USP. Para esto, los sitios de escision Notl se introdujeron en los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante con el siguiente par de cebadores:
PSUN-PtELO6
Directo: 5'-GCGGCCGCACCATGATGGTACCTTCAAGTTA (SEQ ID NO: 190)
Inverso: 3'-GAAGACAGCTTAATAGGCGGCCGC (SEQ ID NO: 191)
Composicion de la mezcla de PCR (50 pl):
5.00 pl de ADNc de molde
5,00 pl de 10x tampon (polimerasa Advantage) MgCh 25 mM
5.00 pl de dNTP 2 mM
1,25 pl de cada cebador (10 pmol/pl)
0,50 pl de polimerasa Advantage
Se utilizo la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de la reaccion de PCR:
Temperatura de adicion: 1 min 55 °C
Temperatura de desnaturalizacion: 1 min 94 °C
Temperatura de extension: 2 min 72 °C
Numero de ciclos: 35
Los productos de PCR se incuban durante 16 h a 37 °C con la enzima de restriccion Notl. El vector de expresion en plantas pSUN300-USP se incuba de forma similar. A continuacion se separan los productos de PCR, asf como el vector de 7624 pb de tamano, mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortaron los fragmentos de ADN correspondientes. La purificacion del ADN se realiza mediante el kit Qiagen Gel Purification segun instrucciones del fabricante. A continuacion se ligan el vector y los productos de PCR. Para esto se uso el kit Rapid Ligation de Roche. El plasmido formado pSUN-PtELO se verifico mediante secuenciacion.
pSUN300 es un derivado del plasmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP se formo a partir de pSUN300, insertandose en pSUN300 el promotor USP como fragmento de EcoRI. La senal de poliadenilacion es la del gen de octopinsintasa del plasmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, acceso de Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP se corresponde con los nucleotidos 1-684 (acceso de Genbank X56240), estando contenido en el promotor una parte de la region no codificante del gen de USP. El fragmento de promotor de 684 pares de bases de tamano se amplifico mediante cebadores estandar de T7 comerciales (Stratagene) y con ayuda de un cebador sintetizado mediante una reaccion de PCR segun procedimientos convencionales. (Secuencia de cebador: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3'; SEQ ID NO: 151).
El fragmento de PCR se corto de nuevo con EcoRI/Sall y se utilizo en el vector pSUN300 con terminador OCS. Se formo el plasmido con el nombre pSUN-USP. La construccion se uso para la transformacion de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco y semillas de lino.
La extraccion de lfpidos de levaduras y semillas se realizo de forma identica al Ejemplo 6.
Ejemplo 55: Expresion de PtElo en levaduras
Levaduras que se transformaron como en el Ejemplo 4 con los plasmidos pYES2 y pYES2-PtELO6 se analizaron de la siguiente manera:
Se recolectaron las celulas de levadura de los cultivos principales mediante centrifugacion (100 x g, 5 min, 20 °C) y se lavaron con NaHCO3 100 mM, pH 8,0, para eliminar el medio residual y los acidos grasos. A partir de los sedimentos celulares de levadura se produjeron esteres metflicos de acidos grasos (FAME) mediante metanolisis acida. Para esto, los sedimentos celulares se incubaron con 2 ml de acido sulfurico metanolico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. La extraccion de los FAME se realizo extrayendo dos veces con eter de petroleo (PE). Para la eliminacion de acidos grasos no derivatizados, las fases organicas se lavaron en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, y 2 ml de agua dest. A continuacion se secaron las fases de PE con Na2SO4, se evaporaron bajo argon y se recogieron en 100 pl de PE. Las muestras se separaron en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent) en un cromatografo de gases 6850 de Hewlett-Packard con detector de ionizacion de llama. Las condiciones para el analisis de GLC fueron del siguiente modo: Se programo la temperatura del horno de 50 °C a 250 °C con una tasa de 5 °C/min y finalmente 10 min a 250 °C (mantenimiento). La identificacion de las senales se realizo mediante comparacion de los tiempos de retencion con patrones de acidos grasos correspondientes (Sigma). La metodologfa se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova y col., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y col., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y col., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 56: Caracterizacion funcional de PtELO6
En la Figura 29 se describe la conversion de Ci8:3a 6912 y Ci8:4a691215. Los sustratos se alargan en cada caso dos atomos de carbono, se forman respectivamente los acidos grasos C20:3*81114 o C20:4a8111417. La especificidad por sustrato de PtELO6 pudo determinarse despues de la expresion y alimentacion de distintos acidos grasos (Fig. 30). Los sustratos alimentados pueden detectarse en grandes cantidades en todas las levaduras transgenicas. Las levaduras transgenicas mostraron la smtesis de nuevos acidos grasos, los productos de la reaccion de PtElo6. Esto significa que el gen PtELO6 pudo expresarse funcionalmente.
La Tabla 18 muestra que PtElo6 presenta una estrecha especificidad por sustrato. PtELO6 solo pudo alargar los acidos grasos C18 acido linoleico, acido linolenico, acido Y-linolenico y acido estearidonico, pero preferiblemente el acido estearidonico w3 desaturado (vease tambien la Figura 30). Experimento de alimentacion: Se anadieron acidos grasos (grasa) respectivamente a 250 pM. Los acidos grasos subrayados se formaron nuevos.
Tabla 18: Especificidad por sustrato de PtElo6
Figure imgf000078_0001
Se alimentaron los siguientes acidos grasos, pero no se convirtieron:
• 18:1A6, 18:1A9, 18:1A11
• 20:2a11’1420:3a11,14,1720:3*8,11,1420:4a5,8,11,1420:5a5,8,11,14,17
• 22^7,^3,16
Las levaduras que se habfan transformado con el vector pYES2-PtELO6 se cultivaron en medio mmimo en presencia de los acidos grasos especificados. La smtesis de los esteres metilicos de acidos grasos se realizo mediante metanolisis acida de celulas intactas. A continuacion se analizaron los FAME mediante GLC. Asf se determinaron los resultados que se representan en las Figuras 29 y 30, asf como en la Tabla 16.
Figure imgf000079_0001

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la production de compuestos de formula general I
Figure imgf000293_0001
en organismos transgenicos excepto seres humanos y animales con un contenido de al menos el 1 % en peso de estos compuestos referido al contenido de Kpidos total del organismo transgenico, caracterizado porque comprende las siguientes etapas de procedimiento:
a) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo, que codifica una actividad de delta-9-elongasa o de delta-6-desaturasa, y
b) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-8-desaturasa o de delta-6-elongasa, y
c) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-5-desaturasa, y
d) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-5-elongasa, y
e) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico en el organismo que codifica una actividad de delta-4-desaturasa, y
en el que se puede usar como sustrato al menos uno de los esteres de acidos grasos de CoA de delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa
y en el que las variables y los sustituyentes en la formula I tienen el siguiente significado:
R1 = hidroxilo, coenzima A (tioester), liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingobase, o un resto de formula general II
Figure imgf000293_0002
R2 = hidrogeno, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol o alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado,
R3 = hidrogeno, alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado, o R2 o R3, independientemente entre si, un resto de formula general Ia:
Figure imgf000293_0003
n = 2, 3, 4, 5, 6 o 9, m = 2, 3, 4, 5 o 6 y p = 0 o 3.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el organismo transgenico es una planta monocotiledonea o dicotiledonea.
3. Procedimiento para la produccion de compuestos de formula general I
Figure imgf000293_0004
en el que las variables y los sustituyentes en la formula I tienen el significado indicado en la reivindicacion 1, en semillas de una planta monocotiledonea o dicotiledonea con un contenido de al menos el 1 % en peso de estos compuestos referido al contenido de Kpidos total de la semilla, que comprende las etapas
a) facilitar una planta que
i. expresa una actividad de delta-9-elongasa o de delta-6-desaturasa y
ii. expresa una actividad de delta-8-desaturasa o de delta-6-elongasa y
iii. expresa una actividad de delta-5-desaturasa y
iv. expresa una actividad de delta-5-elongasa y
v. expresa una actividad de delta-4-desaturasa,
en el que se puede usar como sustrato al menos uno de los esteres de acidos grasos de CoA de delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa y
b) dejar crecer la planta.
4. Procedimiento para la production de compuestos de formula general I
Figure imgf000294_0001
en el que las variables y los sustituyentes en la formula I tienen el significado indicado en la revindication 1, que comprende la extraction de los compuestos de las semillas de una planta monocotiledonea o dicotiledonea con un contenido de al menos el 1 % en peso de estos compuestos referido al contenido de lipidos total de la semilla, en donde la planta
i. expresa una actividad de delta-9-elongasa o de delta-6-desaturasa y
ii. expresa una actividad de delta-8-desaturasa o de delta-6-elongasa y
iii. expresa una actividad de delta-5-desaturasa y
iv. expresa una actividad de delta-5-elongasa y
v. expresa una actividad de delta-4-desaturasa,
en el que se puede usar como sustrato al menos uno de los esteres de acidos grasos de CoA de delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa.
5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las secuencias de acidos nucleicos que codifican polipeptidos con actividad de delta-6-elongasa, delta-5-desaturasa o delta-4-desaturasa estan seleccionadas del grupo compuesto por:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 97, o
b) una secuencia de acido nucleico que codifica una de las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98, o
c) una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido con una identidad de al menos el 40 % a nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98, y presentando el polipeptido una actividad de delta-6-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-4-desaturasa.
6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los sustituyentes R2 o R3 rsignifican, independientemente entre si, alquil-Ci8-C22-carbonilo saturado o insaturado.
7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los sustituyentes R2 o R3 significan, independientemente entre si, alquil-C18, -C20- o -C22-carbonilo insaturado con al menos dos dobles enlaces.
8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el organismo transgenico es una planta transgenica seleccionada del grupo compuesto por alfalfa, berenjena, aguacate, algodon, borraja, Calendula, canola, cardo, guisante, cacahuete, plantas para forraje, cebada, hierbas, avena, canamo, avellana, cafe, cacao, patata, coco, calabaza, lino, laurel, macadamia, maiz, almendra, mandioca, amapola, onagra, oliva, palma oleifera, pimienta, pistacho, Punica, colza, arroz, ricino, centeno, cartamo, mostaza, sesamo, soja, girasol, tabaco, clavelon, te, tomate, triticale, nogal y trigo.
9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los compuestos de formula general I se afslan del organismo en forma de sus aceites, lfpidos o acidos grasos libres.
10. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los compuestos de formula general I se afslan en una concentracion de al menos el 5 % en peso con respecto al contenido lipfdico total del organismo transgenico.
11. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto de formula general I es acido araquidonico, acido eicosapentaenoico y/o acido docosahexaenoico.
12. Planta monocotiledonea o dicotiledonea, en donde la planta
i. expresa una actividad de delta-9-elongasa o de delta-6-desaturasa y
ii. expresa una actividad de delta-8-desaturasa o de delta-6-elongasa y
iii. expresa una actividad de delta-5-desaturasa y
iv. expresa una actividad de delta-5-elongasa y
v. expresa una actividad de delta-4-desaturasa, y
en donde se puede usar como sustrato al menos uno de los esteres de acidos grasos de CoA de delta-4-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa y la planta produce acido araquidonico, acido eicosapentaenoico y/o acido docosahexaenoico.
13. Planta segun la reivindicacion 12, estando codificada la actividad de delta-6-elongasa, delta-5-desaturasa o delta-4-desaturasa por una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo compuesto por:
a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 97, o
b) una secuencia de acido nucleico que codifica una de las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98, o
c) una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido con una identidad de al menos el 40 % a nivel de aminoacidos con la SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98, y presentando el polipeptido una actividad de delta-6-desaturasa, delta-5-desaturasa o delta-4-desaturasa.
14. Planta segun las reivindicaciones 12 o 13, siendo la planta una planta oleaginosa.
15. Planta segun una de las reivindicaciones 12 a 13, estando seleccionada la planta del grupo compuesto por alfalfa, berenjena, aguacate, algodon, borraja, Calendula, canola, cardo, guisante, cacahuete, plantas para forraje, cebada, hierbas, avena, canamo, avellana, cafe, cacao, patata, coco, calabaza, lino, laurel, macadamia, mafz, almendra, mandioca, amapola, onagra, olivo, palma oleffera, pimienta, pistacho, Punica, colza, arroz, ricino, centeno, cartamo, mostaza, sesamo, soja, girasol, tabaco, clavelon, te, tomate, triticale, nogal y trigo.
16. Planta segun una de las reivindicaciones 12 a 15, produciendo la planta acido araquidonico, acido eicosapentaenoico y/o acido docosahexaenoico.
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