NO20181488A1 - Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer. - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer. Download PDF

Info

Publication number
NO20181488A1
NO20181488A1 NO20181488A NO20181488A NO20181488A1 NO 20181488 A1 NO20181488 A1 NO 20181488A1 NO 20181488 A NO20181488 A NO 20181488A NO 20181488 A NO20181488 A NO 20181488A NO 20181488 A1 NO20181488 A1 NO 20181488A1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
seq
desaturase
nucleic acid
fatty acids
acid
Prior art date
Application number
NO20181488A
Other languages
English (en)
Other versions
NO345029B1 (no
Inventor
Ernst Heinz
Petra Sperling
Petra Cirpus
Frederic Domergue
Thorsten Zank
Jörg Bauer
Ziao Qiu
Patricia Vrinten
Astrid Meyer
Jelena Kirsch
Amine Abbadi
Original Assignee
Basf Plant Science Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34120175&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO20181488(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO20181488A1 publication Critical patent/NO20181488A1/no
Application filed by Basf Plant Science Gmbh filed Critical Basf Plant Science Gmbh
Publication of NO345029B1 publication Critical patent/NO345029B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A23D9/007—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils characterised by ingredients other than fatty acid triglycerides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A23D9/02—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils characterised by the production or working-up
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0093—Oxidoreductases (1.) acting on CH or CH2 groups (1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6431—Linoleic acids [18:2[n-6]]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01199—Very-long-chain 3-oxoacyl-CoA synthase (2.3.1.199)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for produksjon av flerumettede fettsyrer i en organisme ved innføring i organismen, nukleinsyrer som koder for polypeptider med Δ5-elongase-aktivitet. Fordelaktig kan disse nukleinsyresekvenser uttrykkes i organismen, hvis det passer sammen med ytterligere nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider av biosyntese av fettsyre- eller lipid-metabolisme. Spesielt fordelaktig er nukleinsyresekvenser som koder for en Δ6-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase- og/eller Δ6-elongase-aktivitet. Disse desaturaser og elongaser er fordelaktig avledet fra Thalassiosira, Euglena eller Ostreococcus. Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av oljer og/eller triacylglycerider med et forhøyet innhold av langkjedede flerumettede fettsyrer. I en foretrukket utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse videre en metode for fremstilling av umettede ω3-fettsyrer og en metode for fremstilling av triglycerider med et forhøyet innhold av umettede fettsyrer, spesielt ω3-fettsyrer med mer enn tre dobbeltbindinger. Oppfinnelsen angår dannelse av en transgen organisme, fortrinnsvis en transgen plante eller en transgen mikroorganisme, med et forhøyet innhold av umettet ω3-fettsyrer, oljer eller lipider med ω3-dobbeltbindinger som resultat av ekspresjon av elongaser og desaturaser anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, fordelaktig sammen med ω3-desaturaser, for eksempel en ω3-desaturase fra sopper av familien Pythiaceae så som slekten Phytophthora, for eksempel slekten og arten Phytophthora infestans eller en ω3-desaturase fra alger så som familien Prasinophyceae, for eksempel slekten Ostreococcus, spesifikt slekten og arten Ostreococcus tauri eller diatoméer så som slekten Thalassiosira, spesifikt slekten og arten Thalassiosira pseudonana. Oppfinnelsen angår videre nukleinsyresekvenser, nukleinsyrekonstruksjoner, vektorer og organismer omfattende nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen, vektorer omfattende nukleinsyresekvensene og/eller nukleinsyrekontruksjonene og transgene organismer omfattende de ovennevnte nukleinsyresekvenser, nukleinsyrekonstruksjoner og/eller vektorer. En ytterligere del av oppfinnelsen angår oljer, lipider og/eller fettsyrer produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og anvendelse av dem. Oppfinnelsen angår videre umettede fettsyrer og triglycerider med et forhøyet innhold av umettede fettsyrer og anvendelse av dem.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i en organisme ved innføring i organismen, av nukleinsyrer som koder for polypeptider med Δ5-elongase-aktivitet. Disse nukleinsyresekvenser, hvis det passer sammen med ytterligere nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider av biosyntese av fettsyre- eller lipid-metabolisme, kan fordelaktig uttrykkes i organismen. Spesielt fordelaktige er nukleinsyresekvenser som koder for en Δ6-desaturase-, en Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase-, Δ12-desaturase- og/eller Δ6-elongase-aktivitet.
Disse desaturaser og elongaser er fordelaktig avledet fra Thalassiosira, Euglena eller Ostreococcus. Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av oljer og/eller triacylglycerider med et forhøyet innhold av langkjedede flerumettede fettsyrer.
I en foretrukket utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse videre en metode for fremstilling av umettede ω3-fettsyrer og en metode for fremstilling av triglycerider med et forhøyet innhold av umettede fettsyrer, spesielt ω3-fettsyrer med mer enn tre dobbeltbindinger. Oppfinnelsen angår dannelse av en transgen organisme, fortrinnsvis en transgen plante eller en transgen mikroorganisme, med et forhøyet innhold av umettede ω3-fettsyrer, oljer eller lipider med ω3-dobbeltbindinger som resultat av ekspresjon av elongasene og desaturasene anvendt ved metoden ifølge oppfinnelsen, fordelaktig sammen med ω3-desaturaser, for eksempel en ω3-desaturase fra sopper av familien Pythiaceae så som slekten Phytophthora, for eksempel slekten og arten Phytophthora infestans eller en ω3-desaturase fra alger så som familien av Prasinophyceae, for eksempel slekten Ostreococcus, spesifikt slekten og arten Ostreococcus tauri eller diatoméer så som slekten Thalassiosira, spesifikt slekten og arten Thalassiosira pseudonana.
Oppfinnelsen angår videre nukleinsyresekvenser, nukleinsyrekonstruksjoner, vektorer og organismer omfattende nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen, vektorer omfattende nukleinsyresekvensene og/eller nukleinsyrekontruksjonene og transgene organismer omfattende de ovennevnte nukleinsyresekvenser, nukleinsyrekonstruksjoner og/eller vektorer.
En ytterligere del av oppfinnelsen angår oljer, lipider og/eller fettsyrer produsert ved prosessen ifølge oppfinnelsen og anvendelse av dem. Oppfinnelsen angår videre umettede fettsyrer og triglycerider med et forhøyet innhold av umettede fettsyrer og anvendelse av dem.
Fettsyrer og triacylglycerider har en rekke anvendelser i matindustrien, i dyreernæring, i kosmetikk og i den farmakologiske sektor. Avhengig av hvorvidt de er frie mettede eller umettede fettsyrer eller ellers triacylglycerider med et forhøyet innhold av mettede eller umettede fettsyrer, er de egnet for meget forskjellige anvendelser. Flerumettede fettsyrer så som linolsyre og linolensyre er essensielle for pattedyr, siden de ikke kan produsere de sistnevnte. Flerumettede ω3-fettsyrer og ω6-fettsyrer er derfor en viktig bestanddel i dyre- og menneske-ernæring.
Flerumettede langkjedede ω3-fettsyrer så som eikosapentaensyre (= EPA, C20:5<Δ5,8,11,14,17>) eller dokosaheksaensyre (= DHA, C22:6<Δ4,7,10,13,16,19>) er viktige komponenter i human ernæring på grunn av deres forskjellige roller i helseaspekter, omfattende utvikling av barnets hjerne, funksjonaliteten til øynene, syntese av hormoner og andre signalsubstanser og forhindring av kardiovaskulære lidelser, kreft og diabetes (Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA og Yeo YK Pharmacol Res 40:211-225, 1999). Av denne grunn er det etterspørsel etter produksjon av flerumettede langkjedede fettsyrer.
På grunn av dagens sammensetning av human mat, er en tilsetning av flerumettede ω3-fettsyrer, som fortrinnsvis er funnet i fiskeoljer, til maten spesielt viktig. Således blir for eksempel flerumettede fettsyrer så som dokosaheksaensyre (= DHA, C22:6<Δ4,7,10,13,16,19>) eller eikosapentaensyre (= EPA, C20:5<Δ5,8,11,14,17>) satt til småbarnformuleringer for å forbedre næringsverdien. Den umettede fettsyre DHA er angitt å ha en positiv effekt på utvikling og opprettholdelse av hjernefunksjoner.
Nedenfor er flerumettede fettsyrer referert til som PUFA, PUFA’er, LCPUFA eller LCPUFA’er (polyumettede fettsyrer, PUFA, langkjedede polyumettede fettsyrer, LCPUFA).
De forskjellige fettsyrer og triglycerider blir hovedsakelig oppnådd fra mikroorganismer så som Mortierella og Schizochytrium eller fra olje-produserende planter så som soyabønne, raps, alger så som Crypthecodinium eller Phaeodactylum og andre, hvor de blir oppnådd, som regel i form av deres triacylglycerider (= triglycerider = triglyceroler). Imidlertid kan de også oppnås fra dyr, så som for eksempel fisk. De frie fettsyrer blir fordelaktig fremstilt ved hydrolyse. Meget langkjedede flerumettede fettsyrer så som DHA, EPA, arakidonsyre (= ARA, C20:4<Δ5,8,11,14>), dihomo-γ-linolensyre (C20:3<Δ8,11,14>) eller dokosapentaensyre (DPA, C22:5<Δ7,10,13,16,19>) blir ikke syntetisert i oljeavlinger så som raps, soyabønne, solsikke eller fargetistel. Konvensjonelle naturlige kilder for disse fettsyrer er fisk så som sild, laks, sardin, rød saltvannsfisk (redfish), ål, karpe, ørret, kveite, makrell, gjørs eller tunfisk eller alger.
Avhengig av den tilsiktede anvendelse, er oljer med mettede eller umettede fettsyrer foretrukket. I human ernæring er for eksempel lipider med umettede fettsyrer, spesifikt flerumettede fettsyrer, foretrukket. De flerumettede ω3-fettsyrer er angitt å ha en positiv effekt på kolesterol-nivået i blodet og således på muligheten for forhindring av hjertesykdom. Risiko for hjertesykdom, slag eller hypertensjon kan reduseres markert ved tilsetning av disse ω3-fettsyrer til maten. ω3-fettsyrer har også en positiv effekt på inflammatoriske, spesifikt på kroniske inflammatoriske, prosesser sammen med immunologiske sykdommer så som revmatoid artritt. De blir derfor satt til matvarer, spesifikt til dietetiske matvarer eller blir anvendt i medikamenter. ω6-fettsyrer så som arakidonsyre har tendens til å ha en negativ effekt på disse lidelser i forbindelse med disse revmatiske sykdommer på grunn av vårt vanlige diettære inntak.
ω3- og ω6-fettsyrer er forløpere for vevhormoner, kjent som eikosanoider, så som prostaglandiner, som er avledet fra dihomo-γ-linolensyre, arakidonsyre og eikosapentaensyre og for tromboksaner og leukotriener, som er avledet fra arakidonsyre og eikosapentaensyre. Eikosanoider (kjent som PG2-serie) som blir dannet fra ω6-fettsyrer fremmer generelt inflammatoriske reaksjoner, mens eikosanoider (kjent som PG3-serie) fra ω3-fettsyrer har liten eller ingen proinflammatorisk effekt.
På grunn av de positive karakteristika til de flerumettede fettsyrer er det ingen mangel på forsøk tidligere på å gjøre tilgjengelig gener som er involvert i syntesen av disse fettsyrer eller triglycerider for fremstilling av oljer i forskjellige organismer med et modifisert innhold av umettede fettsyrer. Således beskriver WO 91/13972 og dens US-ekvivalent en Δ9-desaturase. WO 93/11245 krever en Δ15-desaturase og
WO 94/11516 en Δ12-desaturase. Ytterligere desaturaser er for eksempel beskrevet i EP-A-0550162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 eller Huang et al., Lipida 34, 1999: 649-659. Imidlertid er den biokjemiske karakterisering av de forskjellige desaturaser utilstrekkelig hittil siden enzymene, som er membran-bundede proteiner, presenterer store vanskeligheter ved isolering og karakterisering (McKeon et al., Methods in Enzymol.71, 1981:
12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). Som regel blir membran-bundede desaturaser karakterisert ved å bli innført i en egnet organisme som deretter blir analysert for enzymaktivitet ved å analysere utgangsmaterialene og produktene. Δ6-desaturaser er beskrevet i WO 93/06712, US 5,614,393, US5614393, WO 96/21022, WO 00/21557 og WO 99/27111 og anvendelse for fremstilling av fettsyrer i transgene organismer er beskrevet i WO 98/46763, WO 98/46764 og WO 98/46765. I denne sammenheng er ekspresjon av forskjellige desaturaser og dannelse av flerumettede fettsyrer også beskrevet og krevet i WO 99/64616 eller WO 98/46776. Når det gjelder ekspresjons-effektiviteten av desaturaser og deres effekt på dannelse av flerumettede fettsyrer, skal det bemerkes at ekspresjon av en enkel desaturase som beskrevet hittil bare har resultert i lavt innhold av umettede fettsyrer/lipider så som for eksempel γ-linolensyre og stearidonsyre. Videre ble en blanding av ω3- og ω6-fettsyrer som regel oppnådd.
Spesielt egnede mikroorganismer for fremstilling av PUFA er mikroalger så som Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-arter, Thraustochytrium-arter, Schizochytrium-arter eller Crypthecodinium-arter, ciliater så som Stylonychia eller Colpidium, sopper så som Mortierella, Entomophthora eller Mucor og/eller moser så som Physcomitrella, Ceratodon og Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: 269-278). Stammeseleksjon har resultert i utvikling av flere mutante stammer av de aktuelle mikroorganismene som produserer en serie av ønskelige forbindelser omfattende PUFA. Imidlertid er mutasjon og seleksjon av stammer med en forbedret produksjon av et spesielt molekyl, så som de flerumettede fettsyrer en tidkrevende og vanskelig prosess. Av denne grunn er rekombinante metoder som beskrevet ovenfor foretrukket når mulig.
Imidlertid kan bare begrensede mengder av de ønskede flerumettede fettsyrer så som DPA, EPA eller ARA produseres ved hjelp av de ovennevnte mikroorganismer og, avhengig av mikroorganismen anvendt, blir disse generelt oppnådd som fettsyreblandinger av for eksempel EPA, DPA og ARA.
En rekke syntesebaner er beskrevet for syntese av arakidonsyre, eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA) (figur 1). Således blir EPA eller DHA produsert i marine bakterier så som Vibrio sp. eller Shewanella sp. via polyketid-banen (Yu, R. et al. Lipids 35:1061-1064, 2000; Takeyama, H. et al. Microbiology 143:2725-2731, 1997).
En alternativ strategi er den alternerende aktivitet til desaturaser og elongaser (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31:255-268, 2002; Sakuradani, E. et al. Gene 238:445-453, 1999). En modifikasjon av den ovenfor beskrevne bane av Δ6-desaturase, Δ6-elongase, Δ5-desaturase, Δ5-elongase og Δ4-desaturase er Sprecher-banen (Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta 1486:219-231) i pattedyr. Istedenfor Δ4-desaturering blir et ytterligere forlengelsestrinn utført her, hvilket gir C24, fulgt av en ytterligere Δ6-desaturering og til slutt β-oksydasjon, hvilket gir C22kjedelengde. Således er den som er kjent som Sprecher-banen (se figur 1) imidlertid ikke egnet for produksjon i planter og mikroorganismer siden de regulatoriske mekanismer ikke er kjent.
Avhengig av deres desatureringsmønster kan de flerumettede fettsyrer deles opp i to store klasser, dvs. ω6- eller ω3-fettsyrer, som avviker med hensyn til deres metabolske og funksjonelle aktiviteter (fig.1).
Utgangsmaterialet for ω6-metabolsk bane er fettsyren linolsyre (18:2<Δ9,12>) mens ω3-banen forløper via linolensyre (18:3<Δ9,12,15>). Linolensyre blir dannet ved aktiviteten til en ω3-desaturase (Tocher et al.1998, Prog. Lipid Res.37, 73-117; Domergue et al.
2002, Eur. J. Biochem.269, 4105-4113).
Pattedyr og således også mennesker, har ingen tilsvarende desaturase-aktivitet (Δ12- og ω3-desaturase) og må ta opp disse fettsyrer (essensielle fettsyrer) via maten. Ved å starte med disse forløpere blir de fysiologisk viktige flerumettede fettsyrer arakidonsyre (= ARA, 20:4<Δ5,8,11,14>), en ω6-fettsyre og de to ω3-fettsyrer eikosapentaensyre (= EPA, 20:5<Δ5,8,11,14,17>) og dokosaheksaensyre (DHA, 22:6<Δ4,7,10,13,17,19>) syntetisert via sekvensen av desaturase- og elongase-reaksjoner. Anvendelsen av ω3-fettsyrer viser den terapeutiske aktiviteten beskrevet ovenfor ved behandling av kardiovaskulære sykdommer (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet.
88, 100-108), Entzündungen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc.61, 345-358) og Arthritis (Cleland og James 2000, J. Rheumatol.27, 2305-2307).
Når det gjelder fysiologien i ernæring er det derfor viktig, ved syntetisering av flerumettede fettsyrer, å oppnå et skift mellom ω6-syntesebane og ω3-syntetesebane (se figur 1) slik at mer ω3-fettsyrer blir produsert. De enzymatiske aktiviteter av en rekke ω3-desaturaser som desaturerer C18:2-, C22:4- eller C22:5-fettsyrer er beskrevet i litteraturen (se figur 1). Imidlertid omdanner ingen av desaturasene som er beskrevet når det gjelder biokjemi, et bredt substrat-spekter i ω6-syntesebanen til de tilsvarende fettsyrer i ω3-syntesebanen.
Det er derfor fortsatt høy etterspørsel etter en ω3-desaturase som er egnet for produksjon av ω3-flerumettede fettsyrer. Alle kjente plante- og cyanobakterielle ω3-desaturaser desaturerer C18-fettsyrer med linolsyre som substrat, men kan ikke desaturere noen C20- eller C22-fettsyrer.
Soppen Saprolegnia dicilina er kjent å ha en ω3-desaturase [Pereira et al. 2004, Biochem. J.378 (Pt 2):665-71] som kan desaturere C20-flerumettede fettsyrer. Imidlertid er ulempen at denne ω3-desaturase ikke kan desaturere noen C18- eller C22-PUFA så som de viktige fettsyrer C18:2-, C22:4- eller C22:5-fettsyrer i ω6-syntesebanen. En ytterligere ulempe med dette enzym er at det ikke kan desaturere noen fettsyrer som er bundet til fosfolipider. Bare CoA-fettsyreestere blir omdannet.
Forlengelse av fettsyrer, med elongaser, med 2 eller 4 C-atomer er av vesentlig betydning for produksjon av henholdsvis C20- og C22-PUFA. Denne prosessen forløper via 4 trinn. Det første trinn er kondensering av malonyl-CoA med fettsyre-acyl-CoA av ketoacyl-CoA-syntase (KCS, nedenfor referert til som elongase). Dette blir fulgt av et reduksjonstrinn (ketoacyl-CoA-reduktase, KCR), et dehydratiseringstrinn (dehydratase) og et endelig reduksjonstrinn (enoyl-CoA-reduktase). Det har vært postulert at elongase-aktiviteten påvirker spesifisiteten og hastigheten av hele prosessen (Millar og Kunst, 1997 Plant Journal 12:121-131).
Det har tidligere vært et stort antall forsøk på å oppnå elongase-gener. Millar og Kunst, 1997 (Plant Journal 12:121-131) og Millar et al.1999, (Plant Cell 11:825-838) beskriver karakterisering av plante-elongaser for syntese av monoumettede langkjedede fettsyrer (C22:1) og for syntese av meget langkjedede fettsyrer for dannelse av vokser i planter (C28-C32). Beskrivelser angående syntese av arakidonsyre og EPA finnes for eksempel i WO 0159128, WO 0012720, WO 02077213 og WO 0208401. Syntese av flerumettede C24-fettsyrer er beskrevet i for eksempel Tvrdik et al. 2000, JCB 149:707-717 eller WO 0244320.
Ingen spesifikk elongase er hittil beskrevet for fremstilling av DHA (C22:6 n-3) i organismer som ikke naturlig produserer denne fettsyre. Bare elongaser som gir C20-eller C24-fettsyrer er beskrevet hittil. En Δ5-elongase-aktivitet er hittil ikke beskrevet.
Høyere planter omfatter flerumettede fettsyrer så som linolsyre (C18:2) og linolensyre (C18:3). ARA, EPA og DHA er ikke i det hele tatt funnet i kimolje i høyere planter eller bare i ubetydelige mengder (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales [Ny oppslagsbok om vegetabilske oljer]. Technique & Documentation -Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Imidlertid ville produksjon av LCPUFA i høyere planter, fortrinnsvis i oljeavlinger så som raps, linfrø, solsikke og soyabønner, være fordelaktig siden store mengder av høy-kvalitet LCPUFA for matindustrien, dyreernæring og farmasøytiske formål kan oppnås økonomisk. For dette formål er det fordelaktig for å innføre i oljeavlinger, gener som koder for enzymer for LCPUFA biosyntese via rekombinante metoder og uttrykke dem deri. Disse gener koder for eksempel for Δ6-desaturaser, Δ6-elongaser, Δ5-desaturaser eller Δ4-desaturaser. Disse gener kan fordelaktig isoleres fra mikroorganismer og lavere planter som produserer LCPUFA og innføres i membranene eller triacylglyceridene. Således er det allerede mulig å isolere Δ6-desaturase-gener fra mosen Physcomitrella patens og Δ6-elongase-gener fra P. patens og fra nematoden C. elegans.
De første transgene planter som omfatter og uttrykker gener som koder for LCPUFA biosyntese-enzymer og som, som en konsekvens, produserer LCPUFA ble beskrevet for første gang i for eksempel DE-A-10219203 (fremgangsmåte for produksjon av flerumettede fettsyrer i planter). Imidlertid produserer disse planter LCPUFA i mengder som krever ytterligere optimalisering for prosessering av oljene som er til stede i plantene.
For å muliggjøre styrking av mat og/eller fôr med disse flerumettede fettsyrer, er det derfor et stort behov for en enkel, billig fremgangsmåte for produksjon av disse flerumettede fettsyrer, spesifikt i eukaryote systemer.
Det var derfor et mål å tilveiebringe ytterligere gener eller enzymer som er egnet for syntese av LCPUFA, spesifikt gener med Δ5-elongase-, Δ5-desaturase-,
Δ4-desaturase-, Δ12-desaturase- eller Δ6-desaturase-aktivitet, for produksjon av flerumettede fettsyrer. Et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse var tilveiebringelse av gener eller enzymer som muliggjør et skift fra ω6-fettsyrer til ω3-fettsyrer. Et annet mål var å utvikle en fremgangsmåte for produksjon av flerumettede fettsyrer i en organisme, fordelaktig i en eukaryot organisme, fortrinnsvis i en plante eller en mikroorganisme. Dette mål ble oppnådd ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av forbindelser med formel I
i transgene organismer med et innhold på minst 1 vekt% av disse forbindelser basert på det totale lipid-innhold i den transgene organisme, som omfatter de følgende prosesstrinn:
a) innføring i organismen av minst én nukleinsyresekvens som koder for en Δ9-elongase- og/eller en Δ6-desaturase-aktivitet og
b) innføring i organismen av minst én nukleinsyresekvens som koder for en Δ8-desaturase- og/eller en Δ6-elongase-aktivitet og
c) innføring i organismen av minst én nukleinsyresekvens som koder for en Δ5-desaturase-aktivitet og
d) innføring i organismen av minst én nukleinsyresekvens som koder for en Δ5-elongase-aktivitet og
e) innføring i organismen av minst én nukleinsyresekvens som koder for en Δ4-desaturase-aktivitet og
hvor variablene og substituentene i formel I har de følgende betydninger:
R<1>= hydroksyl, koenzym A (tioester), lysofosfatidylcholin, lysofosfatidyletanolamin, lysofosfatidylglycerol, lysodifosfatidylglycerol, lysofosfatidylserin, lysofosfatidylinositol, sfingobase eller en rest med formel II
hvor
R<2>= hydrogen, lysofosfatidyl cholin, lysofosfatidyletanolamin, lysofosfatidylglycerol, lysodifosfatidylglycerol, lysofosfatidylserin, lysofosfatidylinositol eller mettet eller umettet C2-C24-alkylkarbonyl,
R<3>= hydrogen, mettet eller umettet C2-C24-alkylkarbonyl eller R<2>og R<3>uavhengig av hverandre er en rest med formel Ia:
hvor
n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 9, m = 2, 3, 4, 5 eller 6 og p = 0 eller 3.
R<1>i formel I er hydroksyl, koenzym A (tioester), lysofosfatidylcholin, lysofosfatidyletanolamin, lysofosfatidylglycerol, lysodifosfatidylglycerol, lysofosfatidylserin, lysofosfatidylinositol, sfingobase eller en rest med formel II
De ovennevnte rester i R<1>er alltid bundet til forbindelsene med formel I i form av deres tioestere.
R<2>i formel II er hydrogen, lysofosfatidylcholin, lysofosfatidyletanolamin, lysofosfatidylglycerol, lysodifosfatidylglycerol, lysofosfatidylserin, lysofosfatidylinositol eller mettet eller umettet C2-C24-alkylkarbonyl.
Alkylrester som kan nevnes er substituerte eller usubstituerte, mettede eller umettede C2-C24-alkylkarbonyl-kjeder så som etylkarbonyl, n-propylkarbonyl, n-butylkarbonyl, n-pentylkarbonyl, n-heksylkarbonyl, n-heptylkarbonyl, n-oktylkarbonyl, n-nonylkarbonyl, n-decylkarbonyl, n-undecylkarbonyl, n-dodecylkarbonyl, n-tridecylkarbonyl, n-tetradecylkarbonyl, n-pentadecylkarbonyl, n-heksadecylkarbonyl, n-heptadecylkarbonyl, n-oktadecylkarbonyl-, n-nonadecylkarbonyl, n-eikosylkarbonyl, n-dokosanylkarbonyl- eller n-tetrakosanylkarbonyl, som omfatter én eller flere dobbeltbindinger. Mettede eller umettede C10-C22-alkylkarbonylrester så som n-decylkarbonyl, n-undecylkarbonyl, n-dodecylkarbonyl, n-tridecylkarbonyl, n-tetradecylkarbonyl, n-pentadecylkarbonyl, n-heksadecylkarbonyl, n-heptadecylkarbonyl, n-oktadecylkarbonyl, n-nonadecylkarbonyl, n-eikosylkarbonyl, n-dokosanylkarbonyl eller n-tetrakcosanylkarbonyl, som omfatter én eller flere dobbeltbindinger er foretrukket. Spesielt foretrukket er mettede og/eller umettede C10-C22-alkylkarbonylrester så som C10-alkylkarbonyl, C11-alkylkarbonyl, C12-alkylkarbonyl, C13-alkylkarbonyl, C14-alkylkarbonyl, C16-alkylkarbonyl, C18-alkylkarbonyl, C20-alkylkarbonyl eller C22-alkylkarbonylrester som omfatter én eller flere dobbeltbindinger. Meget spesielt foretrukket er mettede eller umettede C16-C22-alkylkarbonylrester så som C16-alkylkarbonyl, C18-alkylkarbonyl, C20-alkylkarbonyl eller C22-alkylkarbonylrester som omfatter én eller flere dobbeltbindinger. Disse fordelaktige rester kan omfatte to, tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger. De spesielt foretrukne rester med 20 eller 22 karbonatomer i fettsyrekjeden omfatter opptil seks dobbeltbindinger, fordelaktig tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger, spesielt fortrinnsvis fem eller seks dobbeltbindinger. Alle de ovennevnte rester er avledet fra de tilsvarende fettsyrer.
R<3>i formel II er hydrogen, mettet eller umettet C2-C24-alkylkarbonyl.
Alkylrester som kan nevnes er substituerte eller usubstituerte, mettede eller umettede C2-C24-alkylkarbonylkjeder, så som etylkarbonyl, n-propylkarbonyl, n-butylkarbonyl-, n-pentylkarbonyl, n-heksylkarbonyl, n-heptylkarbonyl, n-oktylkarbonyl, n-nonylkarbonyl, n-decylkarbonyl, n-undecylkarbonyl, n-dodecylkarbonyl, n-tridecylkarbonyl, n-tetradecylkarbonyl, n-pentadecylkarbonyl, n-heksadecylkarbonyl, n-heptadecylkarbonyl, n-oktadecylkarbonyl-, n-nonadecylkarbonyl, n-eicosylkarbonyl, n-docosanylkarbonyl- eller n-tetracosanylkarbonyl, som omfatter én eller flere dobbeltbindinger. Mettede eller umettede C10-C22-alkylkarbonylrester så som n-decylkarbonyl, n-undecylkarbonyl, n-dodecylkarbonyl, n-tridecylkarbonyl, n-tetradecylkarbonyl, n-pentadecylkarbonyl, n-heksadecylkarbonyl, n-heptadecylkarbonyl, n-oktadecylkarbonyl, n-nonadecylkarbonyl, n-eikosylkarbonyl, n-dokosanylkarbonyl eller n-tetrakosanylkarbonyl, som omfatter én eller flere dobbeltbindinger er foretrukket. Spesielt foretrukket er mettede og/eller umettede C10-C22-alkylkarbonylrester så som C10-alkylkarbonyl, C11-alkylkarbonyl, C12-alkylkarbonyl, C13-alkylkarbonyl,
C14-alkylkarbonyl, C16-alkylkarbonyl, C18-alkylkarbonyl, C20-alkylkarbonyl eller
C22-alkylkarbonylrester som omfatter én eller flere dobbeltbindinger. Meget spesielt foretrukket er mettede eller umettede C16-C22-alkylkarbonylrester så som
C16-alkylkarbonyl, C18-alkylkarbonyl, C20-alkylkarbonyl eller C22-alkylkarbonylrester som omfatter én eller flere dobbeltbindinger. Disse fordelaktige rester kan omfatte to, tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger. De spesielt foretrukne rester med 20 eller 22 karbonatomer i fettsyrekjeden omfatter opptil seks dobbeltbindinger, fordelaktig tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger, spesielt foretrukket fem eller seks dobbeltbindinger. Alle de ovennevnte rester er avledet fra de tilsvarende fettsyrer.
De ovennevnte rester R<1>, R<2>og R<3>kan være substituert med hydroksyl og/eller epoksygrupper og/eller kan omfatte trippelbindinger.
De flerumettede fettsyrer produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter fordelaktig minst to, fordelaktig tre, fire, fem eller seks, dobbeltbindinger. Fettsyrene som er spesielt fordelaktige omfatter fire, fem eller seks dobbeltbindinger. Fettsyrer produsert ved fremgangsmåten har fordelaktig 18, 20 eller 22 C-atomer i fettsyrekjeden; fettsyrene omfatter fortrinnsvis 20 eller 22 karbonatomer i fettsyrekjeden. Mettede fettsyrer blir fordelaktig omsatt i mindre grad eller ikke i det hele tatt av nukleinsyrene anvendt ved fremgangsmåten. I mindre grad skal forstås å bety at de mettede fettsyrer blir omsatt med mindre enn 5% av aktiviteten, fordelaktig mindre enn 3%, spesielt fordelaktig med mindre enn 2%, meget spesielt fortrinnsvis med mindre enn 1, 0,5, 0,25 eller 0,125% av aktiviteten sammenlignet med flerumettede fettsyrer. Disse fettsyrer som er produsert kan produseres ved fremgangsmåten som et enkelt produkt eller være til stede i en fettsyre-blanding.
Nukleinsyresekvensene anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ9-elongase-,
Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- og/eller Δ4-desaturase-aktivitet.
Nukleinsyresekvenser som fordelaktig er anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er de som koder for polypeptider med Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ4-desaturase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV
ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID
NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV
ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID
NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV
ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID
NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183, eller
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensene vist i SEKV ID NR: 2, SEKV ID NR: 4, SEKV ID NR: 6, SEKV ID NR: 8, SEKV ID NR: 10, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 20, SEKV
ID NR: 22, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 28, SEKV ID
NR: 30, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 42, SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV
ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 52, SEKV ID NR: 54, SEKV ID
NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 72, SEKV ID NR: 74, SEKV ID NR: 76, SEKV
ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID
NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96,
SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104,
SEKV ID NR: 112, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 118, SEKV ID NR: 120, SEKV ID NR: 132 eller SEKV ID NR: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 eller SEKV ID NR: 184, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV
ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID
NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV
ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID
NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV
ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID
NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97,
SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183, som koder for polypeptider med minst 40% identitet på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 2, SEKV ID NR: 4, SEKV ID NR: 6, SEKV ID NR: 8, SEKV ID NR: 10, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 14, , SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 34, SEKV
ID NR: 36, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 42, SEKV ID
NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 52, SEKV ID NR: 54, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV
ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 72, SEKV ID
NR: 74, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96, SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104, SEKV ID NR: 112, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 118, SEKV ID NR: 120, SEKV ID NR: 132 eller SEKV ID NR: 134, SEQ ID NO: 136, SEKV ID NR: 138 eller SEKV ID NR: 184 og som har
Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ4-desaturase- aktivitet.
Substituentene R<2>eller R<3>i formlene I og II er fordelaktig og uavhengig av hverandre mettet eller umettet C18-C22-alkylkarbonyl, spesielt fordelaktig er de, uavhengig av hverandre, umettet C18-, C20- eller C22-alkylkarbonyl med minst to dobbeltbindinger.
En foretrukket utførelsesform av metoden er karakterisert ved at en nukleinsyresekvens som koder for polypeptider med ω3-desaturase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 87 eller SEKV ID NR: 105, eller
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 88 eller SEKV ID NR: 106, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 87 eller SEKV ID NR: 105 som koder for polypeptider med minst 60% identitet på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 88 eller SEKV ID NR: 106 og som har ω3-desaturase-aktivitet.
i tillegg er innført i organismen.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten ytterligere innføring i organismen av en nukleinsyresekvens som koder for polypeptider med Δ12-desaturase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 107 eller SEKV ID NR: 109 eller
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 108 eller SEKV ID NR: 110, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 107 eller SEKV ID NR: 109 som koder for polypeptider med minst 60% identitet på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 108 eller SEKV ID NR: 110 og som har Δ12-desaturaseaktivitet.
Disse ovennevnte Δ12-desaturase-sekvenser kan anvendes sammen med nukleinsyresekvensene anvendt ved fremgangsmåten og som koder for Δ9-elongaser, Δ6-desaturaser, Δ8-desaturaser, Δ6-elongaser, Δ5-desaturaser, Δ5-elongaser og/eller Δ4-desaturaser, alene eller i kombinasjon med ω3-desaturase-sekvensene.
Tabell 1 viser nukleinsyresekvensene, opprinnelsesorganismen og sekvens ID-nummer.
De flerumettede fettsyrer produsert ved fremgangsmåten er fordelaktig bundet i membranlipider og/eller triacylglycerider, men kan også forekomme i organismene som frie fettsyrer eller ellers bundet i form av andre fettsyreestere. I denne sammenheng kan de være til stede som “rene produkter“ eller ellers fordelaktig i form av blandinger av forskjellige fettsyrer eller blandinger av forskjellige glycerider. De forskjellige fettsyrer som er bundet i triacylglyceridene kan avledes fra kort-kjedede fettsyrer med 4 til 6 C-atomer, medium-kjedede fettsyrer med 8 til 12 C-atomer eller langkjedede fettsyrer med 14 til 24 C-atomer, foretrukket er langkjedede fettsyrer, mer foretrukket langkjedede flerumettede fettsyrer med 18, 20 og/eller 22 C-atomer.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir fordelaktig fettsyreestere med flerumettede C18-, C20- og/eller C22-fettsyre-molekyler med minst to dobbeltbindinger i fettsyreesteren, fordelaktig med minst tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger i fettsyreesteren, spesielt fordelaktig med minst fem eller seks dobbeltbindinger i fettsyreesteren og fordelaktig fører til syntese av linolsyre (=LA, C18:2<Δ9,12>), γlinolensyre (= GLA, C18:3<Δ6,9,12>), stearidonsyre (= SDA, C18:4<Δ6,9,12,15>), dihomo-γlinolensyre (= DGLA, 20:3<Δ8,11,14>), ω3-eikosatetraensyre (= ETA, C20:4<Δ5,8,11,14>), arakidonsyre (ARA, C20:4<Δ5,8,11,14>), eikosapentaensyre (EPA, C20:5<Δ5,8,11,14,17>), ω6-dokosapentaensyre (C22:5<Δ4,7,10,13,16>), ω6-dokosatetraensyre (C22:4<Δ,7,10,13,16>), ω3-dokosapentaensyre (= DPA, C22:5<Δ7,10,13,16,19>), dokosaheksaensyre (= DHA, C22:6<Δ4,7,10,13,16,19>) eller blandinger av disse, fortrinnsvis ARA, EPA og/eller DHA. ω3-fettsyrer så som EPA og/eller DHA er meget spesielt foretrukket produsert.
Fettsyreestere med flerumettede C18-, C20- og/eller C22-fettsyre-molekyler kan isoleres i form av olje eller lipid, for eksempel i form av forbindelser så som sfingolipider, fosfoglycerider, lipider, glykolipider så som glykosfingolipider, fosfolipider så som fosfatidyletanolamin, fosfatidylcholin, fosfatidylserin, fosfatidylglycerol, fosfatidylinositol eller difosfatidylglycerol, monoacylglycerider, diacylglycerider, triacylglycerider eller andre fettsyreestere så som acetyl-koenzym A-estere som omfatter de flerumettede fettsyrer med minst to, tre, fire, fem eller seks, fortrinnsvis fem eller seks dobbeltbindinger, fra organismene som har vært anvendt for fremstilling av fettsyreesterene; fortrinnsvis er de isolert i form av deres diacylglycerider, triacylglycerider og/eller i form av fosfatidylcholin, spesielt fortrinnsvis i form av triacylglyceridene. I tillegg til disse estere er de flerumettede fettsyrer også til stede i organismene, fordelaktig plantene, som frie fettsyrer eller bundet til andre forbindelser. Som regel er de forskjellige ovennevnte forbindelser (fettsyreestere og fri fettsyrer) til stede i organismene med en omtrentlig fordeling på 80 til 90 vekt% av triglycerider, 2 til 5 vekt% av diglycerider, 5 til 10 vekt% av monoglycerider, 1 til 5 vekt% av frie fettsyrer, 2 til 8 vekt% av fosfolipider, idet totalen for de forskjellige forbindelser utgjør 100 vekt%.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir LCPUFA produsert med et innhold på minst 3 vekt%, fordelaktig minst 5 vekt%, fortrinnsvis minst 8 vekt%, spesielt fortrinnsvis minst 10 vekt%, mest foretrukket minst 15 vekt%, basert på de totale fettsyrer i de transgene organismer, fortrinnsvis i en transgen plante. I denne sammenheng er det fordelaktig å omdanne C18- og/eller C20-fettsyrer som er til stede i vertsorganismene til minst 10%, fortrinnsvis minst 20%, spesielt fortrinnsvis minst 30%, mest foretrukket minst 40%, for å gi de tilsvarende produkter så som DPA eller DHA, for bare å nevne to eksempler. Fettsyrene blir fordelaktig produsert i bundet form. Disse umettede fettsyrer kan, ved hjelp av nukleinsyrene anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, være posisjonert i sn1-, sn2- og/eller sn3-stilling av de fordelaktig produserte triglycerider. Siden en rekke reaksjonstrinn blir utført med utgangsforbindelsene linolsyre (C18:2) og linolensyre (C18:3) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir sluttproduktene ved fremgangsmåten så som for eksempel arakidonsyre (ARA), eikosapentaensyre (EPA) ω6-dokosapentaensyre eller DHA ikke oppnådd som absolutt rene produkter; mindre spor av forløperne er alltid til stede i sluttproduktet. Hvis for eksempel både linolsyre og linolensyre er til stede i utgangsorganismen og utgangsplanten, er sluttproduktene så som ARA, EPA eller DHA til stede som blandinger. Forløperne bør fortrinnsvis ikke være mer enn 20 vekt%, fortrinnsvis ikke til mer enn 15 vekt%, spesielt fortrinnsvis ikke til mer enn 10 vekt%, mest foretrukket ikke mer enn 5 vekt%, basert på mengden av det aktuelle sluttproduktet. Fordelaktig blir bare ARA, EPA eller bare DHA, bundet eller som frie syrer, produsert som sluttprodukter i en transgen plante ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Hvis forbindelsene ARA, EPA og DHA blir produsert samtidig blir de fordelaktig produsert i et forhold på minst 1:1:2 (EPA:ARA:DHA), fordelaktig minst 1:1:3, fortrinnsvis 1:1:4, spesielt fortrinnsvis 1:1:5.
Fettsyreestere eller fettsyre-blandinger produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter fordelaktig 6 til 15% palmitinsyre, 1 til 6% stearinsyre, 7-85% oleinsyre, 0,5 til 8% vaccensyre, 0,1 til 1% av arakinsyre, 7 til 25% av mettede fettsyrer, 8 til 85% av monoumettede fettsyrer og 60 til 85% av flerumettede fettsyrer, i hvert tilfelle basert på 100% og på det totale fettsyreinnhold i organismene. Fordelaktig er flerumettede fettsyrer som er til stede i fettsyreestere eller fettsyreblandinger fortrinnsvis minst 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 eller 1% av arakidonsyre, basert på det totale fettsyreinnhold. Videre omfatter fettsyreestere eller fettsyreblandinger som er produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fordelaktig fettsyrer valgt fra gruppen av fettsyrene erukasyre (13-dokosaensyre), sterculinsyre (9,10-metylenoktadec-9-ensyre), malvalinsyre (8,9-metylenheptadec-8-ensyre), chaulmoogrinsyre (cyklopentendodekansyre), furan-fettsyre (9,12-epoksyoktadeka-9,11-diensyre), vernolsyre (9,10-epoksyoktadec-12-ensyre), taririnsyre (6-oktadecynsyre), 6-nonadecynsyre, santalbinsyre (t11-oktadecen-9-ynsyre), 6,9-oktadecenynsyre, pyrulinsyre (t10-heptadecen-8-ynsyre), crepenyninsyre (9-oktadecen-12-ynsyre), 13,14-dihydroorofeinsyre (”13,14-dihydrooropheic acid”) oktadecen-13-en-9,11-diynsyre, petroselensyre (cis-6-oktadecensyre), 9c,12t-oktadekadiensyre, calendulasyre (8t10t12c-oktadekatriensyre), catalpinsyre (9t11t13coktadekatriensyre), eleostearinsyre (9c11t13t-oktadekatriensyre), jacarinsyre (8c10t12c-oktadekatriensyre), punicinsyre (9c11t13c-oktadekatriensyre), parinarsyre (9c11t13t15c-oktadekatetraensyre), pinolensyre (all-cis-5,9,12-oktadekatriensyre), laballensyre (5,6-oktadekadienallensyre), ricinusoljesyre (12-hydroksyoleinsyre) og/eller coriolsyre (13-hydroksy-9c,11t-oktadekadiensyre). De ovennevnte fettsyrer er som regel fordelaktig bare funnet i spor i fettsyreestere eller fettsyreblandinger produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvilket vil si, basert på de totale fettsyrer, at de forekommer som mindre enn 30%, fortrinnsvis mindre enn 25%, 24%, 23%, 22% eller 21%, spesielt fortrinnsvis mindre enn 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% eller 5%, meget spesielt fortrinnsvis mindre enn 4%, 3%, 2% eller 1%. I en ytterligere foretrukket form ifølge oppfinnelsen forekommer disse ovennevnte fettsyrer som mindre enn 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6% eller 0,5%, spesielt fortrinnsvis mindre enn 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, basert på de totale fettsyrer. Fettsyreestere eller fettsyreblandinger produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter fordelaktig mindre enn 0,1%, basert på de totale fettsyrer og/eller ingen smørsyre, ingen kolesterol, ingen clupanodonsyre (= dokosapentaensyre, C22:5<Δ4,8,12,15,21>) og ingen nisinsyre (tetrakosaheksaensyre, C23:6<Δ3,8,12,15,18,21>).
På grunn av nukleinsyresekvensene eller nukleinsyresekvensene anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan en økning i utbyttet av flerumettede fettsyrer på minst 50%, fordelaktig minst 80%, spesielt fordelaktig minst 100%, meget spesielt fordelaktig minst 150% sammenlignet med den ikke-transgene utgangsorganisme, for eksempel en gjær, en alge, en sopp eller en plante så som arabidopsis eller linfrø, oppnås når fettsyrene blir detektert ved GC-analyse (se eksempler).
Kjemisk rene flerumettede fettsyrer eller fettsyrepreparater kan også syntetiseres ved prosessene beskrevet ovenfor. For dette formål blir fettsyrene eller fettsyrepreparatene isolert fra organismene, så som mikroorganismene eller plantene eller dyrkningsmediet i eller på hvilket organismene blir dyrket eller fra organismen og dyrkningsmediet, på kjent måte, for eksempel via ekstraksjon, destillering, krystallisering, kromatografi eller en kombinasjon av disse metoder. Disse kjemisk rene fettsyrer eller fettsyrepreparater er fordelaktige for anvendelse i matindustri-sektoren, kosmetisk sektor og spesielt den farmakologiske industrisektor.
Egnede organismer for produksjon ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er i prinsippet hvilke som helst organismer så som mikroorganismer, ikke-humane dyr eller planter.
Planter som er egnet er i prinsippet alle de planter som kan syntetisere fettsyrer, så som alle tofrøbladede eller énfrøbladede planter, alger eller moser. Fordelaktige planter er valgt fra gruppen av plantefamiliene Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Euglenaceae, Prasinophyceae eller nytteplanter eller prydplanter så som Tagetes.
Eksempler som kan nevnes er de følgende planter valgt fra gruppen bestående av: Adelotheciaceae så som slektene Physcomitrella, for eksempel slekten og arten Physcomitrella patens, Anacardiaceae så som slektene Pistacia, Mangifera, Anacardium, for eksempel slekten og arten Pistacia vera [pistasje], Mangifer indica [mango] eller Anacardium occidentale [cashew], Asteraceae, så som slektene Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, for eksempel slekten og arten Calendula officinalis [vanlig fløyelsblomst], Carthamus tinctorius [fargetistel], Centaurea cyanus [kornblomst], Cichorium intybus [sikori], Cynara scolymus [artisjokk], Helianthus annus [solsikke], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [salatgrønnsak], Tagetes lucida, Tagetes erecta eller Tagetes tenuifolia [afrikansk eller edelsfløyelsblomst], Apiaceae, så som slekten Daucus, for eksempel slekten og arten Daucus carota [gulrot], Betulaceae, så som slekten Corylus, for eksempel slekten og artene Corylus avellana eller Corylus colurna [hasselnøtt], Boraginaceae, så som slekten Borago, for eksempel slekten og arten Borago officinalis [agurkurt], Brassicaceae, så som slektene Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, for eksempel slekten og artene Brassica napus, Brassica rapa ssp. [raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [sennep], Brassica oleracea [fôrbete] eller Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, så som slektene Anana, Bromelia (ananas), for eksempel slektene og artene Anana comosus, Ananas ananas eller Bromelia comosa [ananas], Caricaceae, så som slekten Carica, så som slekten og arten Carica papaya [papaya], Cannabaceae, så som slekten Cannabis, så som slekten og arten Cannabis sativa [hamp], Convolvulaceae, så som slektene Ipomea, Convolvulus, for eksempel slektene og artene Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba eller Convolvulus panduratus [søtpotet, batate], Chenopodiaceae, så som slekten Beta, så som slektene og artene Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var.
perennis, Beta vulgaris var. conditiva eller Beta vulgaris var. esculenta [sukkerroe], Crypthecodiniaceae, så som slekten Crypthecodinium, for eksempel slekten og arten Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, så som slekten Cucurbita, for eksempel slektene og artene Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo eller Cucurbita moschata [gresskar/squash], Cymbellaceae, så som slektene Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, for eksempel slekten og arten Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, så som slektene Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, for eksempel slektene og artene Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpurascens, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus eller Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae, så som slekten Elaeagnus, for eksempel slekten og arten Olea europaea [oliven], Ericaceae, så som slekten Kalmia, for eksempel slektene og artene Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia mikrophylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros eller Kalmia lucida [fjell-laurbær], Euglenaceae, så som slektene Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalaphacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas, Trachelomonas, for eksempel slekten og arten Euglena gracilis; Euphorbiaceae, så som slektene Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, for eksempel slektene og artene Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [kassava] eller Ricinus communis [ricinusolje-plante], Fabaceae, så som slektene Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, soyabønne, for eksempel slektene og artene Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [ert], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbeck, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa, Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [alfalfa] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida eller Soja max [soyabønne], Funariaceae, så som slektene Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, for eksempel slektene og artene Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae, så som slektene Pelargonium, Cocos, Oleum, for eksempel slektene og artene Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides eller Oleum cocois [kokosnøtt], Gramineae, så som slekten Saccharum, for eksempel slekten og arten Saccharum officinarum, Juglandaceae, så som slektene Juglans, Wallia, for eksempel slektene og artene Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra eller Wallia nigra [valnøtt], Lauraceae, så som slektene Persea, Laurus, for eksempel slektene og artene Laurus nobilis [laurbær], Persea americana, Persea gratissima eller Persea persea [avocado], Leguminosae, så som slekten Arachis, for eksempel slekten og arten Arachis hypogaea [jordnøtt], Linaceae, så som slekten Adenolinum, for eksempel slektene og artene Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense eller Linum trigynum [linfrø], Lythrarieae, så som slekten Punica, for eksempel slekten og arten Punica granatum [granateple], Malvaceae, så som slekten Gossypium, for eksempel slektene og artene Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum eller Gossypium thurberi [bomull], Marchantiaceae, så som slekten Marchantia, for eksempel slektene og artene Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae, så som slekten Musa, for eksempel slektene og artene Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [banan], Onagraceae, så som slektene Camissonia, Oenothera, for eksempel slektene og artene Oenothera biennis eller Camissonia brevipes [nattlys], Palmae, så som slekten Elaeis, for eksempel slekten og arten Elaeis guineensis [oljepalme], Papaveraceae, så som for eksempel slekten Papaver, for eksempel slektene og artene Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [valmue], Pedaliaceae, så som slekten Sesamum, for eksempel slekten og arten Sesamum indicum [sesam], Piperaceae, så som slektene Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, for eksempel slektene og artene Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [kajennepepper], Poaceae, så som slektene Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (mais), Triticum, for eksempel slektene og artene Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [bygg], Secale cereale [rug], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [havre], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aetiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [ris], Zea mays [mais] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum eller Triticum vulgare [hvete], Porphyridiaceae, så som slektene Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, for eksempel slekten og arten Porphyridium cruentum, Proteaceae, så som slekten Macadamia, for eksempel slekten og arten Macadamia intergrifolia [macadamia-nøtt], Prasinophyceae, så som slektene Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, for eksempel slektene og artene Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae, så som slekten Coffea, for eksempel slektene og artene Coffea spp., Coffea arabica, Coffea canephora eller Coffea liberica [kaffe], Scrophulariaceae, så som slekten Verbascum, for eksempel slektene og artene Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum eller Verbascum thapsus [kongslys], Solanaceae, så som slektene Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, for eksempel slektene og artene Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pepper], Capsicum annuum [paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [tobakk], Solanum tuberosum [potet], Solanum melongena [aubergin] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium eller Solanum lycopersicum [tomat], Sterculiaceae, så som slekten Theobroma, for eksempel slekten og arten Theobroma cacao [kakao] eller Theaceae, så som slekten Camellia, for eksempel slekten og arten Camellia sinensis [te].
Fordelaktige mikroorganismer er for eksempel sopper valgt fra gruppen av familiene Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae eller Tuberculariaceae.
Eksempler på mikroorganismer som kan nevnes er de fra gruppene:
Choanephoraceae, så som slektene Blakeslea, Choanephora, for eksempel slektene og artene Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae, så som slekten Mortierella, for eksempel slektene og artene Mortierella isabellina, Mortierella polycephala , Mortierella ramanniana , Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae, så som slektene Phytium, Phytophthora, for eksempel slektene og artene Pythium debaryanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetaceae, så som slektene Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Yarrowia, for eksempel slektene og artene Hansenula anomala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia metanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipiensis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomycetaceae så som slektene Schizosaccharomyces f.eks. artene Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus, Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schizosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae så som slektene Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium f.eks. artene Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoeboideum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum eller Thraustochytrium visurgense.
Ytterligere fordelaktige mikroorganismer er for eksempel bakterier valgt fra gruppen av familier Bacillaceae, Enterobacteriacae eller Rhizobiaceae.
Eksempler som kan nevnes er de følgende mikroorganismer valgt fra gruppen bestående av: Bacillaceae, så som slekten Bacillus, for eksempel slektene og artene Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Bacillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp. subtilis eller Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae så som slektene Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella eller Serratia, for eksempel slektene og artene Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter genomospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia cancerogena, Erwinia carnegieana, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora subsp. odorifera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nigrifluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia persicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. communior, Escherichia coli-mutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia sp., Escherichia vulneris, Klebsiella aerogenes, Klebsiella edwardsii subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klebsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella trevisanii, Salmonella abony, Salmonella arizonae, Salmonella bongori, Salmonella choleraesuis subsp. arizonae, Salmonella choleraesuis subsp. bongori, Salmonella choleraesuis subsp. cholereasuis, Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subsp. houtenae, Salmonella choleraesuis subsp. indica, Salmonella choleraesuis subsp. salamae, Salmonella daressalaam, Salmonella enterica subsp. houtenae, Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella heidelberg, Salmonella panama, Salmonella senftenberg, Salmonella typhimurium, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Serratia marinorubra, Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp. quinovora, Serratia quinivorans eller Serratia rubidaea; Rhizobiaceae, så som slektene Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium, for eksempel slektene og artene Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogener, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxydus, Chelatobacter heintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium ciceri Rhizobium etli, Rhizobium fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium huakuii, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizogener, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium saheli eller Sinorhizobium xinjiangense.
Ytterligere eksempler på fordelaktige mikroorganismer for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er protister eller diatoméer valgt fra gruppen av familier Dinophyceae, Turaniellidae eller Oxytrichidae, så som slektene og artene:
Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum eller Colpidium sp.
De som fordelaktig anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er transgene organismer så som sopper, så som mortierella eller thraustrochytrium, gjær så som Saccharomyces eller Schizosaccharomyces, moser så som Physcomitrella eller Ceratodon, ikke-humane dyr så som Caenorhabditis, alger så som Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium eller Phaeodactylum eller planter så som tofrøbladede eller énfrøbladede planter. Organismer som spesielt fordelaktig blir anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er organismer som tilhører olje-produserende organismer, hvilket vil si som blir anvendt for fremstilling av olje, så som sopper, så som Mortierella eller Thraustochytrium, alger så som Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium, Phaeodactylum eller planter, spesielt planter, fortrinnsvis oljefrø- eller olje-nytteplanter som omfatter store mengder av lipide forbindelser, så som jordnøtt, raps, canola, solsikke, fargetistel (Carthamus tinctoria), valmue, sennep, hamp, ricinusoljeplante, oliven, sesam, ringblomst, punica, nattlys, kongslys, tistel, villroser, hasselnøtt, mandel, macadamia, avocado, laurbær, gresskar/squash, linfrø, soyabønne, pistasje, agurkurt, trær (oljepalme, kokosnøtt eller valnøtt) eller dyrkbare planter så som mais, hvete, rug, havre, rughvete, ris, bygg, bomull, kassava, pepper, Tagetes, Solanaceae-planter så som potet, tobakk, aubergine og tomat, Vicia-arter, erter, alfalfa eller buskplanter (kaffe, kakao, te), Salixarter og flerårige gress og fôrplanter. Foretrukne planter ifølge oppfinnelsen er oljenytteplanter så som jordnøtt, raps, canola, solsikke, fargetistel, valmue, sennep, hamp, ricinusoljeplante, oliven, ringblomst, punica, nattlys, gresskar/squash, linfrø, soyabønne, agurkurt, trær (oljepalme, kokosnøtt). Spesielt foretrukket er planter som har mye C18:2- og/eller C18:3-fettsyrer, så som solsikke, fargetistel, tobakk, kongslys, sesam, bomull, gresskar/squash, valmue, nattlys, valnøtt, linfrø, hamp eller tistel.
Meget spesielt foretrukne planter er planter så som fargetistel, solsikke, valmue, nattlys, valnøtt, linfrø eller hamp.
Det er derfor fordelaktig for den ovenfor beskrevne metode ifølge oppfinnelsen i tillegg å innføre i organismen, ytterligere nukleinsyrer som koder for enzymer av fettsyre- eller lipid-metabolisme, i tillegg til nukleinsyrene innført i prosesstrinn (a) til (d) og til de eventuelt innførte nukleinsyresekvenser som koder for ω3-desaturaser.
I prinsippet kan alle gener av fettsyre- eller lipid-metabolisme anvendes ved fremgangsmåten for fremstilling av flerumettede fettsyrer, fordelaktig i kombinasjon med Δ5-elongase(r), Δ6-elongase(r) og/eller ω3-desaturaser [for formålene ifølge foreliggende oppfinnelse skal flertall forstås å omfatte éntall og vice versa]. Gener av fettsyre- eller lipid-metabolisme valgt fra gruppen bestående av acyl-CoA dehydrogenase(r), acyl-ACP [= acyl-bærer-protein] desaturase(r), acyl-ACP tioesterase(r), fettsyre-acyl-transferase(r), acyl-CoA:lysofosfolipid-acyltransferaser, fettsyre-syntase(r), fettsyre-hydroksylase(r), acetyl-koenzym A karboksylase(r), acylkoenzym A oksydase(r), fettsyre-desaturase(r), fettsyre-acetylenaser, lipoksygenaser, triacylglycerol-lipaser, allenoksyd-syntaser, hydroperoksyd-lyaser eller fettsyreelongase(r) er fordelaktig anvendt i kombinasjon med Δ5-elongase, Δ6-elongase og/eller ω3-desaturase. Gener valgt fra gruppen Δ4-desaturaser, Δ5-desaturaser, Δ6-desaturaser, Δ8-desaturaser, Δ9-desaturaser, Δ12-desaturaser, Δ6-elongaser eller Δ9-elongaser er spesielt fortrinnsvis anvendt i kombinasjon med genene ovenfor for Δ5-elongase, Δ6-elongase og/eller ω3-desaturase, idet det er mulig å anvende individuelle gener eller en rekke gener i kombinasjon.
Sammenlignet med de humane elongaser eller elongaser fra ikke-humane dyr så som de fra Oncorhynchus, Xenopus eller Ciona, har Δ5-elongaser ifølge oppfinnelsen den fordelaktige egenskap at de ikke forlenger C22-fettsyrer til de tilsvarende C24-fettsyrer. Videre omdanner de fordelaktig ikke fettsyrer med en dobbeltbinding i Δ6-stilling, som blir omdannet av de humane elongaser eller elongasene fra ikke-humane dyr. Spesielt fordelaktig omdanner Δ5-elongaser preferensielt bare umettede C20-fettsyrer. Disse fordelaktige Δ5-elongaser har noen antatte transmembran-helikser (5-7). Fordelaktig blir bare C20-fettsyrer med én dobbeltbinding i Δ5-stilling omdannet, med ω3-C20-fettsyrer foretrukket (EPA). I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen, har de videre den egenskap at de fordelaktig ikke har noen eller bare relativt liten, Δ6-elongase-aktivitet, i tillegg til Δ5-elongase-aktiviteten. I motsetning har de humane elongaser eller elongaser fra ikke-humane dyr omtrent samme aktivitet på fettsyrer med en Δ6- eller
Δ5-dobbeltbinding. Disse fordelaktige elongaser er referert til som de som er kjent som monofunksjonelle elongaser. De humane elongaser eller elongasene fra ikke-humane dyr, er i motsetning referert til som multifunksjonelle elongaser som, i tillegg til de ovennevnte substrater også omdanner monoumettet C16- og C18-fettsyrer, for eksempel med en Δ9- eller Δ11-dobbeltbinding. I en gjær-matetest hvor EPA var satt til gjæren for å virke som substrat, omdanner monofunksjonelle elongaser fordelaktig minst 15% av de tilsatte EPA til dokosapentaensyre (DPA, C22:5<Δ7,10,13,16,19>), fordelaktig minst 20 vekt%, spesielt fordelaktig minst 25 vekt%. Hvis γ-linolensyre (= GLA, C18:3<Δ6,9,12>) blir tilsatt som substrat blir denne substans fordelaktig ikke forlenget i det hele tatt.
C18:3<Δ5,9,12>blir likeledes ikke forlenget. I en annen fordelaktig utførelsesform blir mindre enn 60 vekt%, fordelaktig mindre enn 55 vekt%, spesielt fortrinnsvis mindre enn 50 vekt%, spesielt fordelaktig mindre enn 45 vekt%, meget spesielt fordelaktig mindre enn 40 vekt%, av tilsatt GLA omdannet til dihomo- γ-linolensyre (= C20:3<Δ8,11,14>). I en ytterligere, meget spesielt foretrukket utførelsesform av Δ5-elongase-aktivitet ifølge oppfinnelsen, blir GLA ikke omdannet.
Figurer 27 og 28 viser de målte substrat-spesifisiteter av de forskjellige elongaser. Figur 27 viser spesifsitetene av de multifunksjonelle elongaser av Xenopus laevis (Fig.27 A), Ciona intestinalis (Fig.27 B) og Oncorhynchus mykiss (Fig.27 C). Alle disse elongaser omdanner et bredt spektrum av substrater. Ved metoden ifølge oppfinnelsen kan dette gi opphav til biprodukter som må omdannes ved ytterligere enzymatisk aktivitet. Av denne grunn er disse enzymer mindre foretrukket ved metoden ifølge oppfinnelsen. De foretrukne monofunksjonelle elongaser og deres substrat-spesifisitet er vist i Figur 28. Figur 28 A viser spesifisiteten av Ostreococcus tauri Δ5-elongase. Dette enzym omdanner bare fettsyrer med en dobbeltbinding i Δ5-stilling. Fordelaktig blir bare C20-fettsyrer omdannet. En tilsvarende høy substratspesifisitet er vist av Thalassiosira pseudonana Δ5-elongase (Fig.28 C). Både Ostreococcus tauri Δ6-elongase (Fig.28 B) og den til Thalassiosira pseudonana (Fig.28 D) omdanner fordelaktig bare fettsyrer med en dobbeltbinding i Δ6-stilling. Fordelaktig blir bare C18-fettsyrer omdannet. Δ5-elongaser fra Arabidopsis thaliana og Euglena gracilis skiller seg også ut ved deres spesifisitet.
Fordelaktig er Δ6-elongaser ifølge oppfinnelsen likeledes utmerket ved høy spesifisitet, hvilket vil si at C18-fettsyrer blir forlenget ved preferanse. Fordelaktig omdanner de fettsyrer med en dobbeltbinding i Δ6-stilling. Spesielt fordelaktige Δ6-elongaser omdanner fordelaktig C18-fettsyrer med tre eller fire dobbeltbindinger i molekylet, hvilke fettsyrer må omfatte én dobbeltbinding i Δ6-stilling. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen har de videre det karakteristiske trekk at de fordelaktig har ingen eller bare relativt liten, Δ5-elongase-aktivitet, i tillegg til Δ6-elongase-aktivitet. I motsetning har de humane elongaser eller elongaser fra ikkehumane dyr omtrent samme aktivitet på fettsyrer med en Δ6- eller Δ5-dobbeltbinding. Disse fordelaktige elongaser er referert til som de som er kjent som monofunksjonelle elongaser. Som beskrevet ovenfor er de humane elongaser eller elongasene fra ikkehumane dyr i motsetning referert til som multifunksjonelle elongaser som, i tillegg til de ovennevnte substrater, også omdanner monoumettede C16- og C18-fettsyrer, for eksempel med Δ9- eller Δ11-dobbeltbinding. I en gjærmatetest hvor EPA hadde vært satt til gjæren for å virke som substrat omdannet de monofunksjonelle elongaser fordelaktig minst 10 vekt% av den tilsatte α-linolensyre (= ALA, C18:3<Δ9,12,15>) eller minst 40 vekt% av den tilsatte γ-linolensyre (= GLA, C18:3<Δ6,9,12>), fordelaktig minst 20 vekt% eller 50 vekt%, spesielt fordelaktig minst 25 vekt% eller 60 vekt%. Det er spesielt fordelaktig at C18:4<Δ6,9,12,15>(stearidonsyre) også blir forlenget. I denne sammenheng blir SDA omdannet til minst 40 vekt%, fordelaktig til minst 50 vekt%, spesielt fordelaktig til minst 60 vekt%, meget spesielt fordelaktig til minst 70 vekt%. Spesielt fordelaktige Δ6-elongaser viser ingen eller bare meget liten aktivitet (omdannelsesgrad mindre enn 0,1 vekt%) mot de følgende substrater: C18:1<Δ6>, C18:1<Δ9>, C18:1<Δ11>, C20:2<Δ11,14>, C20:3<Δ11,14,17>, C20:3<Δ8,11,14>, C20:4<Δ5,8,11,14>, C20:5<Δ5,8,11,14,17>eller C22:4<Δ7,10,13,16>.
Figurer 29 og 30 og tabell 18 viser de målte substrat-spesifisiteter av de forskjellige elongaser.
I motsetning til den kjente ω3-desaturase, har ω3-desaturase ifølge oppfinnelsen det fordelaktige karakteristiske trekk at den kan desaturere et bredt spekter av ω6-fettsyrer; C20- og C22-fettsyrer så som C20:2-, C20:3-, C20:4-, C22:4- eller C22:5-fettsyrer er desaturert ved preferanse. Imidlertid blir de kortere C18-fettsyrer så som C18:2- eller C18:3-fettsyrer også fordelaktig desaturert. På grunn av disse karakteristika til ω3-desaturase, er det fordelaktig mulig å skifte fettsyrespekter i en organisme, fordelaktig i en plante eller en sopp, fra ω6-fettsyrer mot ω3-fettsyrer.
Fortrinnsvis desaturerer ω3-desaturase ifølge oppfinnelsen C20-fettsyrer. Innen organismen blir disse fettsyrer fra den eksisterende fettsyre-mengde omdannet til minst 10%, 15%, 20%, 25% eller 30% til de tilsvarende ω3-fettsyrer. Aktiviteten til enzymet ω3-desaturase mot C18-fettsyrer er lavere med en faktor på 10, dvs. bare omtrent 1,5 til 3% av fettsyrene til stede i fettsyre-mengden blir omdannet til de tilsvarende
ω3-fettsyrer. Foretrukket substrat for ω3-desaturase ifølge oppfinnelsen er
ω6-fettsyrer som er bundet i fosfolipider. Figur 19 demonstrerer klart med referanse til desaturering av dihomo-γ-linolensyre [C20:4<Δ8,11,14>], at under desatureringsprosessen, skiller ω3-desaturase fordelaktig ikke mellom fettsyrer som er bundet i sn1 stilling eller i sn2 stilling. Både fettsyrer bundet i sn1 stilling og fettsyrer bundet i sn2 stilling i fosfolipidene blir desaturert. Videre er det fordelaktig at ω3-desaturase omdanner et bredt område av fosfolipider, så som fosfatidylcholin (= PC), fosfatidylinositol (= PIS) eller fosfatidyletanolamin (= PE). Endelig kan desatureringsprodukter også finnes i de nøytrale lipider (= NL), hvilket vil si i triglyceridene.
Sammenlignet med de kjente Δ4-desaturaser, Δ5-desaturaser og
Δ6-desaturaser, er fordelen ved Δ4-desaturasene, Δ5-desaturasene og Δ6-desaturasene ifølge oppfinnelsen at de kan omdanne fettsyrer som er bundet til fosfolipider eller CoA-fettsyreestere, fordelaktig CoA-fettsyreestere.
Δ12-desaturasene anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omdanner fordelaktig oleinsyre (C18:1<Δ9>) til linolsyre (C18:2<Δ9,12>) eller C18:2<Δ6,9>til C18:3<Δ6,9,12>(= GLA). Δ12-desaturasene anvendt omdanner fordelaktig fettsyrer som er bundet til fosfolipider eller CoA-fettsyreestere, fordelaktig de som er bundet til CoA-fettsyreestere.
På grunn av den enzymatiske aktivitet til nukleinsyrene anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som koder for polypeptider med Δ5-elongase-, Δ6-elongase- og/eller ω3-desaturase-aktivitet, fordelaktig i kombinasjon med nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider av fettsyre- eller lipid-metabolisme, så som ytterligere polypeptider med Δ4-, Δ5-, Δ6-, Δ8-, Δ12-desaturase- eller Δ5-, Δ6-eller Δ9-elongase-aktivitet, kan et bredt område av flerumettede fettsyrer produseres ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Avhengig av valg av organisme, så som de fordelaktige planter, anvendt for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan blandinger av de forskjellige flerumettede fettsyrer eller individuelle flerumettede fettsyrer, så som EPA eller ARA, produseres i fri eller bundet form. Avhengig av den aktuelle fettsyresammensetning i utgangsplanten (C18:2- eller C18:3-fettsyrer) blir fettsyrer som er avledet fra C18:2-fettsyrer, så som GLA, DGLA eller ARA eller fettsyrer som er avledet fra C18:3-fettsyrer, så som SDA, ETA eller EPA, således oppnådd. Hvis bare linolsyre (= LA, C18:2<Δ9,12>) er til stede som umettet fettsyre i planten anvendt for prosessen, kan prosessen bare gi GLA, DGLA og ARA som produkter, som alle kan være til stede som frie fettsyrer eller i bundet form. Hvis bare α-linolensyre (= ALA, C18:3<Δ9,12,15>) er til stede som umettet fettsyre i planten anvendt for prosessen, hvilket er tilfellet i for eksempel linfrø, kan prosessen bare gi SDA, ETA eller EPA og/eller DHA som produkter, som alle kan være til stede som frie fettsyrer eller i bundet form, som beskrevet ovenfor. På grunn av modifikasjonen av aktiviteten til enzymet Δ5-elongase fordelaktig i kombinasjon med Δ4-, Δ5-, Δ6-, Δ12-desaturase og/eller Δ6-elongase eller Δ4-, Δ5-, Δ8-, Δ12-desaturase og/eller Δ9-elongase som spiller en rolle i syntesen, er det mulig å produsere, på en målrettet måte, bare individuelle produkter i de ovennevnte organismer, fordelaktig i de ovennevnte planter. På grunn av aktiviteten til Δ6-desaturase og Δ6-elongase blir for eksempel GLA og DGLA eller SDA og ETA, dannet, avhengig av utgangsplante og umettet fettsyre. DGLA eller ETA eller blandinger av disse blir preferensielt dannet. Hvis Δ5-desaturase, Δ5-elongase og Δ4-desaturase i tillegg blir innført i organismene, blir fordelaktig i planten, ARA, EPA og/eller DHA i tillegg dannet. Dette gjelder også for organismer i hvilke Δ8-desaturase og Δ9-elongase tidligere var innført. Fordelaktig blir bare ARA, EPA eller DHA eller blandinger av disse syntetisert, avhengig av fettsyren til stede i organismen eller i planten, som virker som utgangssubstans for syntesen. Siden biosyntesekaskader er involvert, er de aktuelle sluttproduktene ikke til stede i ren form i organismene. Små mengder av forløper-forbindelser er alltid til stede i sluttproduktet i tillegg. Disse små mengder utgjør mindre enn 20 vekt%, fordelaktig mindre enn 15 vekt%, spesielt fordelaktig mindre enn 10 vekt%, mest fordelaktig mindre enn 5, 4, 3, 2 eller 1 vekt%, basert på sluttproduktene DGLA, ETA eller blandinger derav eller ARA, EPA, DHA eller blandinger derav, fordelaktig EPA eller DHA eller blandinger derav.
Proteinet kodet for av nukleinsyren ifølge oppfinnelsen demonstrerer høy spesifisitet for de to forløpere C18:4<Δ6,9,12,15>- og C20:5<Δ5,8,11,14,17>-fettsyrer for syntese av DHA (forløpere og syntese av DHA, se figur 1). Således har proteinet kodet for av SEKV NR: 53 spesifisitet for Δ6- og Δ5-fettsyrer med i tillegg én ω3-dobbeltbinding (figur 2). Δ5-elongase har ketoacyl-CoA syntase-aktivitet som fordelaktig forlenger fettsyrerester av acyl-CoA-estere med 2 karbonatomer.
Ved hjelp av Δ5-elongase-genene, Phaeodacylum Δ5-desaturase og Euglena Δ4-desaturase, var det mulig å demonstrere syntese av DHA i gjær (Saccharomyces cerevisiae) (figur 3).
I tillegg til produksjon direkte i organismen av utgangsfettsyrer for Δ5-elongase, Δ6-elongase og/eller ω3-desaturase ifølge oppfinnelsen kan fettsyrene også være tilsatt utenfra. Produksjon i organismen er foretrukket av økonomiske grunner.
Foretrukne substrater for ω3-desaturase er linolsyre (C18:2<Δ9,12>), γ-linolensyre (C18:3<Δ6,9,12>), eikosadiensyre (C20:2<Δ11,14>), dihomo-γ-linolensyre (C20:3<Δ8,11,14>), arakidonsyre (C20:4<Δ5,8,11,14>), dokosatetraensyre (C22:4<Δ7,10,13,16>) og dokosapentaensyre (C22:5<Δ4,7,10,13,15>).
For å øke utbyttet ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for fremstilling av oljer og/eller triglycerider med et fordelaktig forhøyet innhold av flerumettede fettsyrer, er det fordelaktig å øke mengden av utgangsprodukt for syntese av fettsyrer; dette kan oppnås ved for eksempel innføring i organismen, av en nukleinsyre som koder for et polypeptid med Δ12-desaturase. Dette er spesielt fordelaktig i olje-produserende organismer så som de fra familien Brassicaceae, så som slekten Brassica, for eksempel raps; familien Elaeagnaceae, så som slekten Elaeagnus, for eksempel slekten og arten Olea europaea eller familien Fabaceae, så som slekten Glycine, for eksempel slekten og arten Glycine max, som har mye oleinsyre. Siden disse organismer bare har lite linolsyre (Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678 - 681) er anvendelse av de ovennevnte
Δ12-desaturaser for å produsere utgangsmaterialet linolsyre fordelaktig.
Nukleinsyrer anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er fordelaktig avledet fra planter så som alger, for eksempel alger av familien Prasinophyceae så som slektene Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnococcus, Pyramimonas, Scherffelia eller Tetraselmis så som slektene og artene Heteromastix longifillis, Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephroselmis rotunda, Ostreococcus tauri, Ostreococcus sp. Prasinocladus ascus, Prasinocladus lubricus, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amylifera, Pyramimonas disomata, Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, Pyramimonas parkeae, Pyramimonas spinifera, Pyramimonas sp., Tetraselmis apiculata, Tetraselmis carteriaformis, Tetraselmis chui, Tetraselmis convolutae, Tetraselmis desikacharyi, Tetraselmis gracilis, Tetraselmis hazeni, Tetraselmis impellucida, Tetraselmis inconspicua, Tetraselmis levis, Tetraselmis maculata, Tetraselmis marina, Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordiformis, Tetraselmis suecica, Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Tetraselmis verrucosa fo. rubens eller Tetraselmis sp. eller fra alger av familien Euglenaceae så som slektene Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas eller Trachelomonas, så som slektene og artene Euglena acus, Euglena geniculata, Euglena gracilis, Euglena mixocylindracea, Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonas cylindrica eller Trachelomonas volvocina.
Nukleinsyrene anvendt er fordelaktig avledet fra alger av slektene Euglena, Mantoniella eller Ostreococcus.
Ytterligere fordelaktige planter er alger så som Isochrysis eller Crypthecodinium, alger/diatoméer så som Thalassiosira eller Phaeodactylum, moser så som Physcomitrella eller Ceratodon eller høyere planter så som Primulaceae så som Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens eller Osteospermum hyoseroides, mikroorganismer så som sopper, så som Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor eller Mortierella, bakterier så som Shewanella, gjær eller dyr så som nematoder så som Caenorhabditis, insekter, frosk, abalon eller fisk. De isolerte nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen er fordelaktig avledet fra et dyr i gruppen virveldyr. Fortrinnsvis er nukleinsyresekvensene avledet fra klassene Vertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae eller Oncorhynchus eller Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus eller Evertebrata så som Protochordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae så som Amaroucium constellatum, Botryllus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgula citrina, Molgula manhattensis, Perophora viridis eller Styela partita. Nukleinsyrene er spesielt fordelaktig avledet fra sopper, dyr eller fra planter så som alger eller moser, fortrinnsvis fra ordenen Salmoniformes, så som familien Salmonidae, så som slekten Salmo, for eksempel fra slektene og artene Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta eller Salmo trutta fario, fra alger, så som slektene Mantoniella eller Ostreococcus eller fra diatoméer så som slektene Thalassiosira eller Phaeodactylum eller fra alger så som Crypthecodinium.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter fordelaktig de ovennevnte nukleinsyresekvenser eller deres derivater eller homologer som koder for polypeptider som beholder den enzymatiske aktivitet til proteinene kodet for av nukleinsyresekvenser. Disse sekvenser, individuelt eller i kombinasjon med nukleinsyresekvensene som koder for Δ12-desaturase, Δ4-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-elongase, Δ6-elongase og/eller ω3-desaturase, blir klonet inn i ekspresjonskonstruksjoner og anvendt for innføring i og ekspresjon i organismer. På grunn av deres konstruksjon muliggjør disse ekspresjonskonstruksjoner en fordelaktig optimal syntese av de flerumettede fettsyrer produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
I en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten videre trinnet med å oppnå en celle eller en intakt organisme som omfatter nukleinsyresekvensene anvendt ved fremgangsmåten, hvor cellen og/eller organismen blir transformert med en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen som koder for Δ12-desaturase, Δ4-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-elongase, Δ6-elongase og/eller ω3-desaturase, en genkonstruksjon eller en vektor som beskrevet ovenfor, alene eller i kombinasjon med ytterligere nukleinsyresekvenser som koder for proteiner av fettsyre- eller lipidmetabolisme. I en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter denne prosessen videre trinnet med å oppnå oljene, lipidene eller de frie fettsyrer fra organismen eller fra kulturen. Kulturen kan for eksempel være i form av en fermenteringskultur, for eksempel i tilfellet av dyrkning av mikroorganismer, så som for eksempel Mortierella, Thalassiosira, Mantoniella, Ostreococcus, Saccharomyces eller Thraustochytrium eller en drivhus- eller mark-dyrket kultur av en plante. Cellen eller organismen produsert er således fordelaktig en celle av en olje-produserende organisme, så som en oljeplante, så som for eksempel jordnøtt, raps, canola, linfrø, hamp, jordnøtt, soyabønne, fargetistel, hamp, solsikker eller agurkurt.
I tilfellet av planteceller, plantevev eller planteorganer skal “dyrking” forstås å bety for eksempel dyrking på eller i et næringsmedium eller for den intakte plante på eller i et substrat, for eksempel i en hydroponisk kultur, plantekompost eller på dyrkbart land.
For formålene ifølge oppfinnelsen betyr "transgen" eller "rekombinant” med hensyn til for eksempel en nukleinsyresekvens, en ekspresjonskassett (= genkonstruksjon) eller en vektor omfattende nukleinsyresekvensen eller en organisme transformert med nukleinsyresekvensene, ekspresjonskassettene eller vektorene ifølge oppfinnelsen, alle de konstruksjoner fremstilt ved rekombinante metoder hvor enten
a) nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen, eller
b) en genetisk kontrollsekvens som er operabelt bundet til nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen, for eksempel en promoter, eller
c) a) og b)
ikke er lokalisert i deres naturlige genetiske omgivelse eller er modifisert ved rekombinante metoder, idet det er mulig at modifikasjonen er i form av for eksempel en substitusjon, addisjon, delesjon, inversjon eller insersjon av én eller flere nukleotidrester. Naturlig genetisk omgivelse skal forstås å bety det naturlige genomiske eller kromosomale locus i den opprinnelige organisme eller tilstedeværelsen i et genomisk bibliotek. I tilfellet av et genomisk bibliotek, er den naturlige genetiske omgivelse for nukleinsyresekvensen fortrinnsvis beholdt, i det minste delvis. Omgivelsen flankerer nukleinsyresekvensen minst på én side og har en sekvenslengde på minst 50 bp, fortrinnsvis minst 500 bp, spesielt fortrinnsvis minst 1000 bp, mest foretrukket minst 5000 bp. En naturlig forekommende ekspresjonskassett - for eksempel den naturlig forekommende kombinasjon av den naturlige promoter av nukleinsyresekvensene med de tilsvarende Δ12-desaturase-, Δ4-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-elongase- og/eller Δ5-elongase-gener - blir en transgen ekspresjonskassett når denne ekspresjonskassett blir modifisert ved ikke-naturlige, syntetiske ("kunstige") metoder så som for eksempel mutagen behandling. Egnede metoder er beskrevet i for eksempel US 5,565,350 eller WO 00/15815.
En transgen organisme eller transgen plante for formålene ifølge oppfinnelsen skal derfor forstås å bety, som ovenfor, at nukleinsyrene anvendt ved fremgangsmåten ikke er på deres naturlige locus i genomet til en organisme, idet det er mulig for nukleinsyrene å bli uttrykt homologt eller heterologt. Imidlertid, som nevnt betyr transgen også at, mens nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen er i deres naturlige stilling i genomet til en organisme, er sekvensen modifisert med hensyn til den naturlige sekvens og/eller at regulatorsekvensene av de naturlige sekvensene er modifisert. Transgen skal fortrinnsvis forstås å bety ekspresjon av nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen ved et unaturlig locus i genomet, dvs. homolog eller, fortrinnsvis, heterolog ekspresjon av nukleinsyrene finner sted. Foretrukne transgene organismer er sopper så som Mortierella eller Phytophthora, moser så som Physcomitrella, alger så som Mantoniella, Euglena, Crypthecodinium eller Ostreococcus, diatoméer så som Thalassiosira eller Phaeodactylum eller planter så som oljeplanter.
Organismer eller vertsorganismer for nukleinsyrene, ekspresjonskassetten eller vektoren anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er i prinsippet fordelaktig alle organismer som kan syntetisere fettsyrer, spesifikt umettede fettsyrer og/eller som er egnet for ekspresjon av rekombinante gener. Eksempler som kan nevnes er planter så som Arabidopsis, kurvplanter så som ringblomst eller nytteplanter så som soyabønne, jordnøtt, ricinusoljeplante, solsikke, mais, bomull, lin, raps, kokosnøtt, oljepalme, fargetistel (Carthamus tinctorius) eller kakaobønne, mikroorganismer, så som sopper, for eksempel slekten Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia, Phytophthora eller Pythium, bakterier, så som slekten Escherichia eller Shewanella, gjær, så som slekten Saccharomyces, cyanobacteria, ciliater, alger så som Mantoniella, Euglena, Thalassiosira eller Ostreococcus eller protozoer så som dinoflagellater, så som Crypthecodinium. Foretrukne organismer er de som naturlig er i stand til å syntetisere vesentlige mengder av olje, så som sopper, så som Mortierella alpina, Pythium insidiosum, Phytophthora infestans eller planter så som soyabønne, raps, kokosnøtt, oljepalme, fargetistel, lin, hamp, ricinusoljeplante, ringblomst, jordnøtt, kakaobønne eller solsikke eller gjær så som Saccharomyces cerevisiae med soyabønne, lin, raps, fargetistel, solsikke, ringblomst, Mortierella eller Saccharomyces cerevisiae som spesielt foretrukket. I prinsippet er vertsorganismer, i tillegg til de ovennevnte transgene organismer, også transgene dyr, fordelaktig ikke-humane dyr, for eksempel C. elegans, Ciona intestinalis eller Xenopus laevis.
Ytterligere anvendbare vertsceller er detaljert angitt i: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Ekspresjonsstammer som kan anvendes, for eksempel de med en lavere protease-aktivitet, er beskrevet i: Gottesman, S., Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Disse omfatter planteceller og visse vev, organer og deler av planter i alle deres fenotypiske former så som støvknapper, fibere, rothår, stilker, embryoer, kallus, frøblad, bladstilk, høstet materiale, plantevev, reproduktivt vev og cellekulturer som er avledet fra den aktuelle transgene plante og/eller kan anvendes for å oppnå den transgene plante.
Transgene planter som omfatter de flerumettede fettsyrer syntetisert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig markedsføres direkte uten at det er noe behov for at oljene, lipidene eller fettsyrene syntetisert blir isolert. Planter for prosessen ifølge oppfinnelsen skal bety intakte planter og alle plantedeler, planteorganer eller plantedeler så som blad, stamme, frø, rot, knoller, støvknapper, fibere, rothår, stilker, embryoer, kallus, frøblad, bladstilker, høstet materiale, plantevev, reproduktivt vev og cellekulturer som er avledet fra den aktuelle transgene plante og/eller kan anvendes for å oppnå den transgene plante. I denne sammenheng omfatter frø alle deler av frøet så som frøkapper, epidermale celler, frøceller, endosperm eller embryonisk vev. Imidlertid kan forbindelsene produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også isoleres fra organismene, fordelaktig plantene, i form av deres oljer, fett, lipider og/eller frie fettsyrer. Flerumettede fettsyrer produsert ved denne prosessen kan oppnås ved høsting av organismene, enten fra planten hvor de vokser eller fra marken. Dette kan utføres ved pressing eller ekstraksjon av plantedelene, fortrinnsvis plantefrø. I denne sammenheng kan oljer, fett, lipider og/eller frie fettsyrer oppnås ved det som er kjent som kald-banking eller kaldpressing uten anvendelse av varme. For å oppnå lettere nedbrytning av plantedelene, spesifikt frøene, blir de på forhånd pulverisert, dampet eller ristet. Frøene som er forbehandlet på denne måten kan deretter presses eller ekstraheres med løsningsmidler så som varm heksan. Løsningsmidlet blir deretter fjernet. I tilfellet av mikroorganismer blir sistnevnte, etter høsting, for eksempel ekstrahert direkte uten ytterligere prosesseringstrinn eller ellers, etter nedbrytning, ekstrahert via forskjellige metoder kjent for en fagmann. På denne måten kan mer enn 96% av forbindelsene produsert ved fremgangsmåten isoleres. Deretter blir de resulterende produkter prosessert videre, dvs. raffinert. Ved denne prosessen blir substanser så som planteslim og suspendert materiale først fjernet. Det som er kjent som avsliming kan utføres enzymatisk eller, for eksempel kjemisk-fysisk ved tilsetning av syre så som fosforsyre. Deretter fjernes de frie fettsyrer ved behandling med en base, for eksempel natriumhydroksyd-løsning. Det resulterende produkt blir vasket grundig med vann for å fjerne gjenværende alkali i produktet og deretter tørket. For å fjerne gjenværende pigment i produktet, blir produktet underkastet bleking, for eksempel ved anvendelse av filler’s earth eller aktivt trekull. Til slutt blir produktet deodorisert, for eksempel ved anvendelse av damp.
PUFA eller LCPUFA produsert ved denne prosessen er fordelaktig C18-, C20-eller C22-fettsyre-molekyler, fordelaktig C20- eller C22-fettsyre molekyler, med minst to dobbeltbindinger i fettsyremolekylet, fortrinnsvis tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger. Disse C18-, C20- eller C22-fettsyre-molekyler kan isoleres fra organismen i form av en olje, et lipid eller en fri fettsyre. Egnede organismer er for eksempel de nevnt ovenfor. Foretrukne organismer er transgene planter.
Én utførelsesform ifølge oppfinnelsen er derfor oljer, lipider eller fettsyrer eller fraksjoner derav som er produsert ved den ovenfor beskrevne prosess, spesielt fortrinnsvis et olje-, lipid- eller fettsyre-preparat omfattende PUFA og avledet fra transgene planter.
Som beskrevet ovenfor omfatter disse oljer, lipider eller fettsyrer fordelaktig 6 til 15% av palmitinsyre, 1 til 6% av stearinsyre, 7-85% av oleinsyre, 0,5 til 8% av vaccensyre, 0,1 til 1% av arakinsyre, 7 til 25% av mettede fettsyrer, 8 til 85% av monoumettede fettsyrer og 60 til 85% av flerumettede fettsyrer, i hvert tilfelle basert på 100% og på det totale fettsyreinnhold av organismene. Fordelaktig er flerumettede fettsyrer som er til stede i fettsyreestere eller fettsyreblandinger fortrinnsvis minst 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 eller 1% arakidonsyre, basert på det totale fettsyreinnhold. Videre omfatter fettsyreestere eller fettsyreblandinger som er produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fordelaktig fettsyrer valgt fra gruppen av fettsyrene erukasyre (13-dokosaensyre), sterculinsyre (9,10-metylenoktadec-9-ensyre), malvalinsyre (8,9-metylenheptadec-8-ensyre), chaulmoogrinsyre (cyklopentendodekansyre), furan-fettsyre (9,12-epoksyoktadeka-9,11-diensyre), vernolsyre (9,10-epoksyoktadec-12-ensyre), taririnsyre (6-oktadecynsyre), 6-nonadecynsyre, santalbinsyre (t11-oktadecen-9-ynsyre), 6,9-oktadecenynsyre, pyrulinsyre (t10-heptadecen-8-ynsyre), crepenyninsyre (9-oktadecen-12-ynsyre), 13,14-dihydroorofeinsyre, oktadecen-13-en-9,11-diynsyre, petroselensyre (cis-6-oktadecensyre), 9c,12t-oktadekadiensyre, calendulasyre (8t10t12c-oktadekatriensyre), catalpinsyre (9t11t13c-oktadecatriensyre), eleostearinsyre (9c11t13toktadekatriensyre), jacarsyre (8c10t12c-oktadekatriensyre), punicinsyre (9c11t13coktadekatriensyre), parinarsyre (9c11t13t15c-oktadekatetraensyre), pinolensyre (allcis-5,9,12-oktadekatriensyre), laballensyre (5,6-oktadekadienallensyre), ricinusoljesyre (12-hydroksyoleinsyre) og/eller coriolsyre (13-hydroksy-9c,11t-oktadekadiensyre). De ovennevnte fettsyrer er som regel, fortrinnsvis bare funnet i spor i fettsyreestere eller fettsyreblandinger produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvilket vil si at, basert på de totale fettsyrer, de forekommer med mindre enn 30%, fortrinnsvis mindre enn 25%, 24%, 23%, 22% eller 21%, spesielt fortrinnsvis mindre enn 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% eller 5%, meget spesielt fortrinnsvis mindre enn 4%, 3%, 2% eller 1%. I en ytterligere foretrukket form ifølge oppfinnelsen forekommer disse ovennevnte fettsyrer med mindre enn 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6% eller 0,5%, spesielt fortrinnsvis mindre enn 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, basert på de totale fettsyrer. Fettsyreestere eller fettsyreblandinger produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter fordelaktig mindre enn 0,1%, basert på de totale fettsyrer og/eller ingen smørsyre, intet kolesterol, ingen clupanodonsyre (= dokosapentaensyre, C22:5<Δ4,8,12,15,21>) og ingen nisininsyre (tetrakosaheksaensyre, C23:6<Δ3,8,12,15,18,21>).
Oljer, lipider eller fettsyrer ifølge oppfinnelsen omfatter fordelaktig minst 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4% eller 5%, fordelaktig minst 6%, 7%, 8%, 9% eller 10%, spesielt fordelaktig minst 11%, 12%, 13%, 14% eller 15% av ARA eller minst 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4% eller 5%, fordelaktig minst 6% eller 7%, spesielt fordelaktig minst 8%, 9% eller 10% av EPA og/eller DHA, basert på det totale fettsyreinnhold fra produksjonsorganismen, fordelaktig en plante, spesielt fortrinnsvis en oljenytteplante så som soyabønne, raps, kokosnøtt, oljepalme, fargetistel, lin, hamp, ricinusoljeplante, ringblomst, jordnøtt, kakaobønne, solsikke eller de ovennevnte ytterligere én- eller tofrøbladede oljenytteplanter.
En ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen er anvendelse av oljen, lipidet, fettsyrene og/eller fettsyrepreparatet i fôr, matvarer, kosmetikk eller farmasøytiske midler. Oljene, lipidene, fettsyrene eller fettsyreblandingene ifølge oppfinnelsen kan anvendes på en måte kjent for en fagmann for blanding med andre oljer, lipider, fettsyrer eller fettsyreblandinger av animalsk opprinnelse, så som for eksempel fiskeoljer. Disse oljer, lipider, fettsyrer eller fettsyreblandinger, som er sammensatt av vegetabilske og animalske bestanddeler, kan også anvendes for fremstilling av fôr, matvarer, kosmetikk eller farmakologiske midler.
Betegnelsen “olje”, “lipid” eller “fett” skal forstås å bety en fettsyre-blanding omfattende umettet, mettet, fortrinnsvis forestret, fettsyre(r). Oljen, lipidet eller fettet har fortrinnsvis høy andel av flerumettede frie eller, fordelaktig, forestrede fettsyre(r), spesielt linolsyre, γ-linolensyre, dihomo-γ-linolensyre, arakidonsyre, α-linolensyre, stearidonsyre, eikosatetraensyre, eikosapentaensyre, dokosapentaensyre eller dokosaheksaensyre.
Mengden av umettede forestrede fettsyrer utgjør omtrent 30%, et innhold på 50% er mer foretrukket, et innhold på 60%, 70%, 80% eller mer er enda mer foretrukket. For analyse kan fettsyreinnholdet for eksempel bestemmes ved gasskromatografi etter omdannelse av fettsyrene til metylesterene ved omestring. Oljen, lipidet eller fettet kan omfatte forskjellige andre mettede eller umettede fettsyrer, for eksempel calendulasyre, palmitinsyre, palmitoleinsyre, stearinsyre, oleinsyre og lignende. Innholdet av de forskjellige fettsyrer i oljen eller fettet kan variere, spesielt avhengig av utgangsorganismen.
De flerumettede fettsyrer med fordelaktig minst to dobbeltbindinger som blir produsert ved fremgangsmåten er, som beskrevet ovenfor, for eksempel sfingolipider, fosfoglycerider, lipider, glykolipider, fosfolipider, monoacylglycerol, diacylglycerol, triacylglycerol eller andre fettsyreestere. Ved å starte fra de flerumettede fettsyrer med fordelaktig minst fem eller seks dobbeltbindinger, hvilke syrer er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan de flerumettede fettsyrer som er til stede frigjøres for eksempel via behandling med alkali, for eksempel vandig KOH eller NaOH eller syrehydrolyse, fordelaktig i nærvær av en alkohol så som metanol eller etanol eller via enzymatisk spaltning og isoleres ved for eksempel faseseparering og påfølgende surgjøring med for eksempel H2SO4. Fettsyrene kan også frigjøres direkte uten de ovenfor beskrevne prosesseringstrinn.
Etter deres innføring i en organisme, fordelaktig en plantecelle eller plante, kan nukleinsyrene anvendt ved fremgangsmåten enten være til stede på et separat plasmid eller, fordelaktig, integrert i genomet til vertscellen. I tilfellet av integrering i genomet, kan integreringen være tilfeldig eller ellers utføres ved rekombinering slik at det native gen blir erstattet med kopien innført, hvorved produksjonen av den ønskede forbindelse av cellen blir modulert eller ved anvendelse av et gen in trans, slik at genet blir bundet operabelt med en funksjonell ekspresjonsenhet som omfatter minst én sekvens som sikrer ekspresjon av et gen og minst én sekvens som sikrer polyadenylering av et funksjonelt transkribert gen. Nukleinsyrene blir fordelaktig innført i organismene via multiekspresjonskassetter eller konstruksjoner for multiparallell ekspresjon, fordelaktig i plantene for multiparallell frø-spesifikk ekspresjon av gener.
Moser og alger er eneste kjente plantesystemer som produserer vesentlige mengder av flerumettede fettsyrer så som arakidonsyre (ARA) og/eller eikosapentaensyre (EPA) og/eller dokosaheksaensyre (DHA). Moser omfatter PUFA i membranlipider, mens alger, organismer som er relatert til alger og noen få sopper også akkumulerer vesentlige mengder av PUFA i triacylglycerol-fraksjonen. Av denne grunn er nukleinsyremolekyler som blir isolert fra slike stammer som også akkumulerer PUFA i triacylglycerol-fraksjonen spesielt fordelaktige for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og således for modifikasjon av lipid- og PUFA-produksjonssystemet i en vert, spesielt planter så som oljeavlinger, for eksempel raps, canola, linfrø, hamp, soyabønner, solsikker og agurkurt. De kan derfor fordelaktig anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Substrater som fordelaktig er egnet for nukleinsyrene som blir anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og som koder for polypeptider med
Δ12-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ5-elongase-, Δ6-elongase- og/eller ω3-desaturase-aktivitet og/eller de ytterligere nukleinsyrer anvendt, så som nukleinsyrene som koder for polypeptider av fettsyre- eller lipid-metabolisme valgt fra gruppen acyl-CoA dehydrogenase(r), acyl-ACP [= acyl-bærerprotein] desaturase(r), acyl-ACP tioesterase(r), fettsyreacyltransferase(r), acyl-CoA:lysofosfolipid-acyltransferase(r), fettsyre-syntase(r), fettsyre-hydroksylase(r), acetyl-koenzym A karboksylase(r), acyl-koenzym A oksydase(r), fettsyre-desaturase(r), fettsyre-acetylenaser, lipoksygenaser, triacylglycerol-lipaser, allenoksyd-syntaser, hydroperoksyd-lyaser eller fettsyreelongase(r) er fordelaktig C16-, C18- eller C20-fettsyrer. Fettsyrene omdannet som substrater ved fremgangsmåten er fortrinnsvis omdannet i form av deres acyl-CoA-estere og/eller deres fosfolipid-estere.
For å produsere de langkjedede PUFA ifølge oppfinnelsen, må de flerumettede C18-fettsyrer først desatureres av den enzymatiske aktivitet til en desaturase og deretter forlenges med minst to karbonatomer via en elongase. Etter én forlengelsecyklus gir denne enzymaktiviteten C20-fettsyrer og etter to forlengelse-cykler
C22-fettsyrer. Aktiviteten til desaturaser og elongaser anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fører fortrinnsvis til C18-, C20- og/eller C22-fettsyrer, fordelaktig med minst to dobbeltbindinger i fettsyremolekylet, fortrinnsvis med tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger, spesielt fortrinnsvis, til C20- og/eller C22-fettsyrer med minst to dobbeltbindinger i fettsyremolekylet, fortrinnsvis med tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger, meget spesielt fortrinnsvis med fem eller seks dobbeltbindinger i molekylet. Etter at en første desaturering og forlengelse har funnet sted, kan ytterligere desaturerings- og forlengelses-trinn så som for eksempel en desaturering i Δ5- og Δ4-stilling utføres. Produkter av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som er spesielt foretrukket er dihomo-γ-linolensyre, arakidonsyre, eikosapentaensyre, dokosapentaensyre og/eller dokosaheksaensyre. C20-fettsyrer med minst to dobbeltbindinger i fettsyren kan forlenges ved den enzymatiske aktivitet ifølge oppfinnelsen i form av den frie fettsyre eller i form av estrene, så som fosfolipider, glykolipider, sfingolipider, fosfoglycerider, monoacylglycerol, diacylglycerol eller triacylglycerol.
Det foretrukne biosyntese-sted av fettsyrer, oljer, lipider eller fett i plantene som fordelaktig blir anvendt er for eksempel generelt frø eller cellestratum av frøene, slik at frø-spesifikk ekspresjon av nukleinsyrene anvendt ved fremgangsmåten blir fornuftig. Det er imidlertid opplagt at biosyntese av fettsyrer, oljer eller lipider ikke trenger være begrenset til frøvev, men kan også finne sted på en vev-spesifikk måte i alle de andre deler av planten, for eksempel i epidermale celler eller i knollene.
Hvis mikroorganismer så som gjær, så som Saccharomyces eller Schizosaccharomyces, sopper så som Mortierella, Aspergillus, Phytophthora, Entomophthora, Mucor eller Thraustochytrium, alger så som Isochrysis, Mantoniella, Euglena, Ostreococcus, Phaeodactylum eller Crypthecodinium blir anvendt som organismer ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir disse organismer fordelaktig dyrket i fermenteringskulturer.
På grunn av anvendelse av nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen som koder for en Δ5-elongase, kan de flerumettede fettsyrer produsert ved fremgangsmåten økes med minst 5%, fortrinnsvis med minst 10%, spesielt fortrinnsvis med minst 20%, meget spesielt fortrinnsvis med minst 50% sammenlignet med villtypen av organismene som ikke omfatter nukleinsyrene rekombinant.
I prinsippet kan de flerumettede fettsyrer produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i organismene anvendt ved fremgangsmåten, økes på to forskjellige måter. Fordelaktig kan mengden av frie flerumettede fettsyrer og/eller innholdet av de forestrede flerumettede fettsyrer produsert ved fremgangsmåten forstørres.
Fordelaktig blir andelen av forestrede flerumettede fettsyrer i de transgene organismer forstørret ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Hvis mikroorganismer blir anvendt som organismer ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir de dyrket eller kultivert på en måte kjent for en fagmann, avhengig av vertsorganismen. Som regel blir mikroorganismer dyrket i et væske-medium omfattende en karbonkilde, vanligvis i form av sukkere, en nitrogenkilde, vanligvis i form av organiske nitrogenkilder så som gjærekstrakt eller salter så som ammoniumsulfat, sporelementer så som salter av jern, mangan og magnesium og, hvis det passer, vitaminer, ved temperaturer på mellom 0°C og 100°C, fortrinnsvis mellom 10°C og 60°C, mens oksygen tilføres. pH i væskemediet kan enten holdes konstant, hvilket vil si regulert under dyrkningsperioden eller ikke. Kulturene kan dyrkes satsvis, semi-satsvis eller kontinuerlig. Næringsstoffer kan gis ved begynnelsen av fermenteringen eller mates inn semikontinuerlig eller kontinuerlig. De flerumettede fettsyrer produsert kan isoleres fra organismene som beskrevet ovenfor ved prosesser kjent for fagfolk, for eksempel ved ekstraksjon, destillering, krystallisering, hvis det passer utfelling med salt og/eller kromatografi. For dette formål kan organismene fordelaktig være oppbrutt på forhånd.
Hvis vertsorganismene er mikroorganismer blir fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fordelaktig utført ved en temperatur på mellom 0°C og 95°C, fortrinnsvis mellom 10°C og 85°C, spesielt fortrinnsvis mellom 15°C og 75°C, meget spesielt fortrinnsvis mellom 15°C og 45°C.
Ved denne prosessen blir pH-verdien fordelaktig holdt mellom pH 4 og 12, fortrinnsvis mellom pH 6 og 9, spesielt fortrinnsvis mellom pH 7 og 8.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres satsvis, semi-satsvis eller kontinuerlig. En oversikt over kjente dyrkningsmetoder kan finnes i læreboken av Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprosessteknologi 1. Innføring i Bioprosess-teknologi] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) eller i læreboken til Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreaktorer og perifert utstyr] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
Dyrkningsmediet som skal anvendes må hensiktsmessig møte kravene til de aktuelle stammene. Beskrivelser av dyrkningsmedier for forskjellige mikroorganismer kan finnes i læreboken "Manual of Methods for General Bacteriology" av the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981).
Som beskrevet ovenfor kan disse medier som anvendes i henhold til oppfinnelsen, vanligvis omfatte én eller flere karbonkilder, nitrogenkilder, uorganiske salter, vitaminer og/eller sporelementer.
Foretrukne karbonkilder er sukkere, så som mono-, di- eller polysakkarider. Eksempler på meget gode karbonkilder er glukose, fruktose, mannose, galaktose, ribose, sorbose, ribulose, laktose, maltose, sukrose, raffinose, stivelse eller cellulose. Sukkere kan også være tilsatt til mediene via komplekse forbindelser så som molasser eller andre biprodukter fra sukker-raffinering. Tilsetning av blandinger av en rekke karbonkilder kan også være fordelaktig. Andre mulige karbonkilder er oljer og fett så som for eksempel soyaolje, solsikkeolje, jordnøttolje og/eller kokosnøttfett, fettsyrer så som for eksempel palmitinsyre, stearinsyre og/eller linolsyre, alkoholer og/eller polyalkoholer så som for eksempel glycerol, metanol og/eller etanol og/eller organiske syrer så som for eksempel eddiksyre og/eller melkesyre.
Nitrogenkilder er vanligvis organiske eller uorganiske nitrogen-forbindelser eller materialer omfattende disse forbindelser. Eksempler på nitrogenkilder omfatter ammoniakk i flytende eller gassformig form eller ammoniumsalter så som ammoniumsulfat, ammoniumklorid, ammoniumfosfat, ammoniumkarbonat eller ammoniumnitrat, nitrater, urinstoff, aminosyrer eller komplekse nitrogenkilder så som maisstøpevæske, soyamel, soyaprotein, gjær-ekstrakt, kjøttekstrakt og annet.
Nitrogenkildene kan anvendes individuelt eller som en blanding.
Uorganiske saltforbindelser som kan være til stede i mediet omfatter klorid-, fosfor- og sulfat-salter av kalsium, magnesium, natrium, kobolt, molybden, kalium, mangan, sink, kobber og jern.
Uorganiske svovel-inneholdende forbindelser så som for eksempel sulfater, sulfitter, ditionitter, tetrationater, tiosulfater, sulfider eller andre organiske svovelforbindelser så som merkaptaner og tioler kan anvendes som kilder for svovel for fremstilling av svovel-inneholdende fin-kjemikalier, spesielt metionin.
Fosforsyre, kaliumdihydrogenfosfat eller dikaliumhydrogenfosfat eller de tilsvarende natrium-inneholdende salter kan anvendes som kilder for fosfor.
Chelaterende midler kan tilsettes til mediet for å holde metallionene i løsning. Spesielt egnede chelaterende midler omfatter dihydroksyfenoler så som katekol eller protocatechuat og organiske syrer så som sitronsyre.
Fermenteringsmedier anvendt ifølge oppfinnelsen for dyrkning av mikroorganismer omfatter vanligvis også andre vekstfaktorer så som vitaminer eller vekstpromotere, som omfatter for eksempel biotin, riboflavin, tiamin, folinsyre, nikotinsyre, pantotenat og pyridoxin. Vekstfaktorer og salter er ofte avledet fra komplekse media-komponenter så som gjærekstrakt, molasser, maisstøpevæske og lignende. Det er videre mulig å tilsette egnede forløpere til dyrkningsmediet. Den nøyaktige sammensetningen av medie-forbindelser avhenger sterkt av det spesielle forsøk og blir bestemt individuelt for hvert spesifikke tilfelle. Informasjon om optimalisering av media kan finnes i læreboken "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) s.53-73, ISBN 0 199635773). Vekstmedia kan også oppnås fra kommersielle leverandører, for eksempel Standard 1 (Merck) eller BHI (brain heart infusion, DIFCO) og lignende.
Alle medie-komponenter blir sterilisert, enten med varme (20 min ved 1,5 bar og 121°C) eller ved filtersterilisering. Komponentene kan steriliseres enten sammen eller, hvis nødvendig, separat. Alle medie-komponenter kan være til stede ved starten av dyrkningen eller bli tilsatt kontinuerlig eller satsvis, som ønsket.
Kulturtemperaturen er normalt mellom 15°C og 45°C, fortrinnsvis fra 25°C til 40°C og kan holdes konstant eller kan endres under forsøket. pH i mediet bør være i området fra 5 til 8,5, fortrinnsvis rundt 7,0. pH for dyrkning kan kontrolleres under dyrkning ved tilsetning av basiske forbindelser så som natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, ammoniakk og vandig ammoniakk eller sure forbindelser så som fosforsyre eller svovelsyre. Skumming kan kontrolleres ved anvendelse av antiskummemidler så som for eksempel fettsyre-polyglykolestere. For å opprettholde stabiliteten til plasmider er det mulig å tilsette til mediet egnede substanser som har en selektiv effekt, for eksempel antibiotika. Aerobe betingelser blir holdt ved innføring av oksygen eller oksygen-inneholdende gassblandinger så som for eksempel omgivelseluft i kulturen. Temperaturen på kulturen er normalt 20° til 40°C og fortrinnsvis 25°C til 40°C. Dyrkingen blir fortsatt inntil dannelse av det ønskede produkt er på et maksimum. Dette mål blir normalt oppnådd innen 10 til 160 timer.
Fermenteringsvæsker oppnådd på denne måten, spesielt de som inneholder flerumettede fettsyrer, inneholder vanligvis en tørr masse på fra 7,5 til 25 vekt%.
Fermenteringsmediet kan deretter prosesseres videre. Biomassen kan, i henhold til krav, fullstendig eller delvis fjernes fra fermenteringsmediet ved separeringsmetoder så som for eksempel sentrifugering, filtrering, dekantering eller en kombinasjon av disse metoder eller fullstendig etterlates i nevnte medium. Det er fordelaktig å prosessere biomassen etter dens separering.
Imidlertid kan fermenteringsmediet også tyknes eller konsentreres uten separering av cellene, ved anvendelse av kjente metoder så som for eksempel ved hjelp av en rotasjonsinndamper, tynnfilm-inndamper, fallende film- inndamper, ved revers osmose eller ved nanofiltrering. Endelig kan dette konsentrerte fermenteringsmedium prosesseres for å oppnå fettsyrene til stede deri.
Fettsyrene oppnådd ved fremgangsmåten er også egnet som utgangsmaterialer for den kjemiske syntesen av ytterligere produkter av interesse. For eksempel kan de anvendes i kombinasjon med hverandre eller alene for fremstilling av farmasøytiske midler, matvarer, dyrefôr eller kosmetikk.
Oppfinnelsen angår videre isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ5-elongase, hvor Δ5-elongaser kodet for av nukleinsyresekvensene omdanner C20-fettsyrer med minst fire dobbeltbindinger i fettsyremolekylet, som fordelaktig til slutt innføres i diacylglycerider og/eller triacylglycerider.
Fordelaktig er isolerte nukleinsyresekvenser nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ5-elongase-aktivitet og som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen av aminosyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 115, SEKV ID NR: 116, SEKV ID NR: 139, SEKV ID NR: 140, SEKV ID NR: 141 eller SEKV ID NR: 142.
Ytterligere fordelaktige isolerte nukleinsyresekvenser er nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ5-elongase-aktivitet og som omfatter en kombinasjon av aminosyresekvensene valgt fra gruppen bestående av:
a) SEKV ID NR: 115 og SEKV ID NR: 139, SEKV ID NR: 115 og SEKV ID NR: 140 eller SEKV ID NR: 139 og SEKV ID NR: 140; eller
b) SEKV ID NR: 116 og SEKV ID NR: 141, SEKV ID NR: 116 og SEKV ID NR: 142 eller SEKV ID NR: 141 og SEKV ID NR: 142; eller
c) SEKV ID NR: 115, SEKV ID NR: 139 og SEKV ID NR: 140 eller SEKV ID NR: 116, SEKV ID NR: 141 og SEKV ID NR: 142.
Sekvensene vist i sekvensene SEKV ID NR: 115 (NXXXHXXMYXYYX), SEKV ID NR: 116 (HHXXXXWAWW), SEKV ID NR: 139 (LHXXHH), SEKV ID NR: 140 (TXXQXXQF), SEKV ID NR: 141 (DTXFMV) og SEKV ID NR: 142 (TQAQXXQF) utgjør konserverte regioner av de forskjellige elongaser. Tabell 2 viser betydningen av aminosyrene angitt med X, som er til stede i de ovennevnte nukleinsyresekvenser (kolonne 3). De foretrukne aminosyrer i de forskjellige stillinger kan også finnes i tabellen (kolonne 3). Kolonne 1 angir SEKV ID NR, kolonne 2 stillingen i sekvensen.
Tabell 2: Betydning av aminosyren markert X i konsensus-sekvensene.
Spesielt fordelaktige Δ5-elongaser omfatter minst én av sekvensene SEKV ID NR: 116, SEKV ID NR: 141 og/eller SEKV ID NR: 142.
Spesielt fordelaktige isolerte nukleinsyresekvenser er sekvenser valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45,
SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID
NR: 63; SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77,
SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131 eller SEKV ID NR: 133,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosekvensen vist i SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64,
SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID
NR: 80, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 132 eller SEKV ID NR: 134, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63;
SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID
NR: 79, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131 eller SEKV ID NR: 133, som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID
NR: 50, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66,
SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID
NR: 84, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131 eller SEKV ID NR: 133 og som har Δ5-elongase-aktivitet.
Oppfinnelsen angår videre isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ6-elongase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 111 eller SEKV ID NR: 183,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 112 eller SEKV ID NR: 184, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 111 eller SEKV ID NR: 183 som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 112 eller SEKV ID NR: 184 og som har Δ6-elongase- aktivitet.
Oppfinnelsen angår videre isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med ω3-desaturase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 87 eller SEKV ID NR: 105,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 88 eller SEKV ID NR: 106, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 87 eller SEKV ID NR: 105 som har polypeptider med minst 60% identitet på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 88 eller SEKV ID NR: 106 og som har ω3-desaturase- aktivitet.
Oppfinnelsen angår videre isolerte nukleinsyresekvenser som koder for et polypeptid med Δ6-desaturase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 89 eller i SEKV ID NR: 97, eller
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 90 eller SEKV ID NR: 98, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 89 eller SEKV ID NR: 97 som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 90 eller SEKV ID NR: 98 og som har Δ6-desaturase-aktivitet.
Oppfinnelsen angår videre isolerte nukleinsyresekvenser som koder for et polypeptid med Δ5-desaturase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 99 eller i SEKV ID NR: 101,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 100 eller i SEKV ID NR: 102, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 99 eller i SEKV ID NR: 101 som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 100 eller i SEKV ID NR: 102 og som har Δ5-desaturase-aktivitet.
Oppfinnelsen angår videre isolerte nukleinsyresekvenser som koder for et polypeptid med Δ4-desaturase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 95 eller i SEKV ID NR: 103,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 96 eller SEKV ID NR: 104, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 95 eller SEKV ID NR: 103 som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 96 eller SEKV ID NR: 104 og som har Δ4-desaturaseaktivitet.
Oppfinnelsen angår videre isolerte nukleinsyresekvenser som koder for et polypeptid med Δ12-desaturase-aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 107 eller i SEKV ID NR: 109,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 108 eller SEKV ID NR: 110, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 107 eller SEKV ID NR: 109 som koder for polypeptider med minst 50% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 108 eller SEKV ID NR: 110 og som har Δ12-desaturaseaktivitet.
Oppfinnelsen angår videre genkonstruksjoner som omfatter nukleinsyresekvensene SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 ifølge oppfinnelsen, hvor nukleinsyren er bundet operabelt med ett eller flere regulatoriske signaler. I tillegg kan ytterligere biosyntesegener av fettsyre- eller lipid-metabolisme valgt fra gruppen acyl-CoA dehydrogenase(r), acyl-ACP [= acyl-bærerprotein] desaturase(r), acyl-ACP tioesterase(r), fettsyreacyltransferase(r), acyl-CoA:lysofosfolipid-acyltransferase(r), fettsyre- syntase(r), fettsyre-hydroksylase(r), acetyl-koenzym A-karboksylase(r), acyl-koenzym A oksydase(r), fettsyre-desaturase(r), fettsyre-acetylenaser, lipoksygenaser, triacylglycerol-lipaser, allenoksyd-syntaser, hydroperoksyd-lyaser eller fettsyreelongase(r) være til stede i genkonstruksjonen. Fordelaktig er biosyntese-gener for fettsyre- eller lipid-metabolisme valgt fra gruppen Δ4-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ8-desaturase, Δ9-desaturase, Δ12-desaturase, Δ6-elongase, Δ9-elongase eller ω3-desaturase i tillegg til stede.
Alle nukleinsyresekvensene anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er fordelaktig avledet fra en eukaryot organisme så som en plante, en mikroorganisme eller et dyr. Nukleinsyresekvensene er fortrinnsvis avledet fra ordenen Salmoniformes, alger så som Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena eller Ostreococcus, sopper så som slekten Phytophthora eller fra diatoméer så som slektene Thalassiosira eller Phaeodactylum.
Nukleinsyresekvensene anvendt ved fremgangsmåten som koder for proteiner med ω3-desaturase-, Δ4-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ9-desaturase-, Δ12-desaturase-, Δ5-elongase-, Δ6-elongase- eller Δ9-elongase-aktivitet blir fordelaktig innført alene eller, fortrinnsvis, i kombinasjon med en ekspresjonskassett (= nukleinsyrekonstruksjon) som muliggjør ekspresjon av nukleinsyrene i en organisme, fordelaktig en plante eller en mikroorganisme.
Nukleinsyrekonstruksjonen kan omfatte mer enn én nukleinsyresekvens med enzymatisk aktivitet, så som for eksempel Δ12-desaturase, Δ4-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-elongase, Δ6-elongase og/eller ω3-desaturase.
For å innføre nukleinsyrene anvendt ved fremgangsmåten blir sistnevnte fordelaktig amplifisert og ligert på kjent måte. Fortrinnsvis blir en prosedyre som følger protokollen for Pfu DNA polymerase eller Pfu/Taq DNA polymerase-blanding fulgt. Primerene blir valgt ved å ta i betraktning sekvensen som skal amplifiseres. Primerene bør fordelaktig være valgt på en slik måte at amplifikatet omfatter hele den kodogene sekvens fra startkodonet til stoppkodonet. Etter amplifiseringen blir amplifikatet hensiktsmessig analysert. For eksempel kan gel-elektroforetisk separering utføres, som blir fulgt av kvantitativ og kvalitativ analyse. Deretter kan amplifikatet renses ved å følge en standard protokoll (for eksempel Qiagen). En aliquot av det rensede amplifikat er deretter tilgjengelig for de påfølgende kloningstrinn. Egnede kloningsvektorer er generelt kjent for fagfolk. Disse omfatter spesielt vektorer som kan replikeres i mikrobielle systemer, hvilket vil si hovedsakelig vektorer som sikrer effektiv kloning i gjær eller sopper og som muliggjør stabil transformasjon av planter. De som kan nevnes spesielt er forskjellige binære og kointegrerte vektorsystemer som er egnet for T-DNA-mediert transformasjon. Slike vektor systemer er som regel karakterisert ved at de omfatter minst vir-gener nødvendige for den agrobakterie-medierte transformasjon og T-DNA-avgrensende sekvenser (T-DNA border). Disse vektorsystemer omfatter fordelaktig også ytterligere cis-regulatoriske regioner så som promotere og terminator-sekvenser og/eller seleksjonsmarkører, ved hjelp av hvilke hensiktsmessig transformerte organismer kan identifiseres. Mens i tilfellet av kointegrerte vektorsystemer vir-gener og T-DNA-sekvenser er arrangert på samme vektor, er binære systemer basert på minst to vektorer, én som bærer vir-gener, men intet T-DNA, mens den andre bærer T-DNA, men intet vir-gen. På grunn av dette faktum er sistnevnte vektorer relativt små, lette å manipulere og replikere både i E. coli og i Agrobacterium. Disse binære vektorer omfatter vektorer fra seriene pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. I henhold til oppfinnelsen blir Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV og pCAMBIA preferensielt anvendt. En oversikt over de binære vektorer og anvendelse av dem kan finnes i Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. For å preparere vektorene kan vektorene først lineariseres med restriksjonsendonuklease(r) og deretter modifiseres enzymatisk på en egnet måte. Deretter blir vektoren renset og en aliquot blir anvendt for kloningstrinnet. I kloningstrinnet blir det enzymatisk spaltede og, hvis det passer, rensede amplifikat klonet med vektorfragmenter som er fremstilt på lignende måte, ved anvendelse av ligase. I denne sammenheng kan en spesiell nukleinsyrekonstruksjon eller vektor eller plasmidkonstruksjon, ha ett eller ellers mer enn ett kodogent gensegment. De kodogene gensegmenter i disse konstruksjoner er fortrinnsvis bundet operabelt med regulatorsekvenser. Regulatorsekvensene omfatter spesielt plantesekvenser så som de ovenfor beskrevne promotere og terminatorsekvenser. Konstruksjonene kan fordelaktig propageres stabilt i mikroorganismer, spesielt i E. coli og Agrobacterium tumefaciens, under selektive betingelser og muliggjør overføring av heterologt DNA til planter eller mikroorganismer.
Nukleinsyrene anvendt ved fremgangsmåten, de nye nukleinsyrer og nukleinsyrekonstruksjoner, kan innføres i organismer så som mikroorganismer eller fordelaktig planter, fordelaktig ved anvendelse av kloningsvektorer og således anvendes for transformasjon av planter så som de som er publisert og sitert i: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapittel 6/7, s. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plantes; i:
Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung og R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, i: Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung og R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol.42 (1991), 205-225. Således kan nukleinsyrene, de nye nukleinsyrer og nukleinsyrekonstruksjoner og/eller vektorer anvendt ved fremgangsmåten anvendes for rekombinant modifikasjon av et bredt spekter av organismer, fordelaktig planter, slik at sistnevnte blir bedre og/eller mer effektive PUFA-produsenter.
En serie av mekanismer ved hvilke en modifikasjon av Δ12-desaturase-, Δ5-elongase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase-, Δ6-desaturase- og/eller ω3-desaturase-protein og av de ytterligere proteiner anvendt ved fremgangsmåten, så som Δ12-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase- eller Δ4-desaturase-protein er mulig, finnes, slik at utbytte, produksjon og/eller produksjonseffektivitet av fordelaktige flerumettede fettsyrer i en plante, fortrinnsvis i en oljenytteplante eller en mikroorganisme, kan påvirkes direkte på grunn av det modifisert protein. Antall eller aktivitet til Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ4-desaturase-proteiner eller -gener kan økes, slik at større mengder av genproduktene og, til slutt, større mengder av forbindelsene med den generelle formel I blir produsert. En de novo syntese i en organisme som har manglet aktiviteten og evnen til å biosyntetisere forbindelsene før innføring av det (de) tilsvarende gen(er) er også mulig. Dette gjelder analogt med kombinasjonen med ytterligere desaturaser eller elongaser eller ytterligere enzymer av fettsyre- og lipidmetabolisme. Anvendelse av forskjellige divergente sekvenser, dvs. sekvenser som avviker på DNA-sekvensnivå, kan også være fordelaktig i denne sammenheng eller ellers anvendelse av promotere for genekspresjon som muliggjør en forskjellig genekspresjon over tid, for eksempel som en funksjon av graden av modenhet av frø eller oljelagringsvev.
På grunn av innføring av et Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- og/eller Δ4-desaturase-gen i en organisme, alene eller i kombinasjon med andre gener i en celle, er det ikke bare mulig å øke biosyntese-fluks mot sluttproduktet, men også å øke eller skape de novo det tilsvarende triacylglycerol-preparat. Likeledes kan antall eller aktivitet til andre gener som er involvert i import av næringsstoffer som er nødvendige for biosyntese av én eller flere fettsyrer, oljer, polare og/eller nøytrale lipider økes, slik at konsentrasjonen av disse forløpere, kofaktorer eller mellomprodukter i cellene eller i lagringskammeret blir øket, hvorved evnen til cellene til å produsere PUFA som beskrevet nedenfor blir ytterligere forbedret. Ved å optimalisere aktiviteten eller øke antallet av ett eller flere Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ4-desaturase-gener som er involvert i biosyntesen av disse forbindelser eller ved å ødelegge aktiviteten til ett eller flere gener som er involvert i nedbrytning av disse forbindelser, blir forbedret utbytte, produksjon og/eller effektivitet av produksjon av fettsyre- og lipidmolekyler i organismer, fordelaktig i planter, gjort mulig.
De isolerte nukleinsyremolekyler anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen koder for proteiner eller deler av disse, hvor proteinene eller det individuelle protein eller deler derav omfatter en aminosyresekvens med tilstrekkelig homologi med en aminosyresekvens som er vist i sekvensene SEKV ID NR: 2, SEKV ID NR: 4, SEKV ID NR: 6, SEKV ID NR: 8, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 42, SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 52, SEKV ID NR: 54, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 72, SEKV ID NR: 74, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 90, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96, SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104, SEKV ID NR: 106, SEKV ID NR: 108, SEKV ID NR: 110, SEKV ID NR: 112, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 118, SEKV ID NR: 120, SEKV ID NR: 132, SEKV ID NR: 134, SEKV ID NR: 136, SEKV ID NR: 138 eller SEKV ID NR: 184 slik at proteinene eller deler derav beholder en Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ4-desaturase- aktivitet. Proteinene eller deler derav som er kodet for av nukleinsyremolekylene beholder fortrinnsvis deres essensielle enzymatiske aktivitet og evnen til å delta i metabolismen av forbindelser nødvendige for syntese av cellemembraner eller lipidstoffer i organismer, fordelaktig i planter eller i transporten av molekyler gjennom disse membraner. Fordelaktig har proteinene kodet for av nukleinsyremolekylene minst omtrent 50%, fortrinnsvis minst omtrent 60% og mer foretrukket minst omtrent 70%, 80% eller 90% og mest foretrukket minst omtrent 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% eller mer identitet med aminosyresekvensene vist i SEKV ID NR: 2, SEKV ID NR: 4, SEKV ID NR: 6, SEKV ID NR: 8, SEKV ID NR: 10, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 42, SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 52, SEKV ID NR: 54, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 72, SEKV ID NR: 74, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 90, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96, SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104, SEKV ID NR: 106, SEKV ID NR: 108, SEKV ID NR: 110, SEKV ID NR: 112, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 118, SEKV ID NR: 120, SEKV ID NR: 132, SEKV ID NR: 134, SEKV ID NR: 136, SEKV ID NR: 138 eller SEKV ID NR: 184. For formålene ifølge oppfinnelsen skal homologi eller homolog forstås å bety henholdsvis identitet eller identisk.
Homologien ble beregnet over hele aminosyre- eller nukleinsyresekvensregionen. En fagmann har tilgjengelig en rekke programmer som er basert på forskjellige algoritmer for sammenligning av forskjellige sekvenser. Her gir algoritmene til Needleman og Wunsch eller Smith og Waterman spesielt pålitelige resultater. Programmet PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 51989: 151-153) eller programmene Gap og BestFit [Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol.48; 443-453 (1970) og Smith og Waterman (Adv. Appl. Math.2; 482-489 (1981)], som er del av GCG-programvarepakken [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], ble anvendt for sekvensoppstillingen. Sekvenshomologi-verdiene som er angitt ovenfor som en prosentdel ble bestemt over hele sekvensregionen ved anvendelse av programmet GAP og de følgende innstillinger: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 og Average Mismatch: 0,000. Hvis ikke på annen måte spesifisert, ble disse innstillingene alltid anvendt som standard-innstillinger for sekvensoppstillingene.
Essensiell enzymatisk aktivitet til Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ9-elongase, Δ6-desaturase, Δ8-desaturase, Δ6-elongase, Δ5-desaturase, Δ5-elongase eller Δ4-desaturase anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal forstås å bety at de beholder minst en enzymatisk aktivitet på minst 10%, fortrinnsvis 20%, spesielt fortrinnsvis 30% og meget spesielt 40% sammenlignet med proteinene/enzymene kodet for av sekvensen SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 og deres derivater og kan således delta i metabolismen av forbindelser nødvendig for syntese av fettsyrer, fettsyreestere så som diacylglycerider og/eller triacylglycerider i en organisme, fordelaktig en plante eller en plantecelle eller i transporten av molekyler gjennom membraner, hvilket betyr C18-, C20- eller C22-karbonkjeder i fettsyremolekylet med dobbeltbindinger i minst to, fordelaktig tre, fire, fem eller seks stillinger.
Nukleinsyrer som fordelaktig kan anvendes ved fremgangsmåten er avledet fra bakterier, sopper, diatoméer, dyr så som Caenorhabditis eller Oncorhynchus eller planter så som alger eller moser, så som slektene Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, spesifikt fra slektene og artene Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis, Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophthora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans eller spesielt fordelaktig fra Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonona eller Crypthecodinium cohnii.
Alternativt kan nukleinsyresekvenser som koder for Δ12-desaturase, ω3desaturase, Δ9-elongase, Δ6-desaturase, Δ8-desaturase, Δ6-elongase, Δ5-desaturase, Δ5-elongase eller Δ4-desaturase og som fordelaktig hybridiserer under stringente betingelser med en nukleinsyresekvens som vist i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Nukleinsyresekvensene anvendt ved fremgangsmåten blir fordelaktig innført i en ekspresjonskassett som muliggjør ekspresjon av nukleinsyrene i organismer så som mikroorganismer eller planter.
Ved dette blir nukleinsyresekvensene som koder for Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ9-elongase, Δ6-desaturase, Δ8-desaturase, Δ6-elongase, Δ5-desaturase, Δ5-elongase eller Δ4-desaturase bundet operabelt med ett eller flere regulatoriske signaler, fordelaktig for å forbedre genekspresjon. Disse regulatorsekvenser skal muliggjøre spesifikk ekspresjon av genene og proteinene. Avhengig av vertsorganismen kan dette bety, for eksempel at genet blir uttrykt og/eller overuttrykt bare etter at induksjon har funnet sted eller ellers at det blir uttrykt og/eller overuttrykt umiddelbart. For eksempel er disse regulatorsekvenser i form av sekvenser til hvilke induktorer eller repressorer binder, og således kontrollerer ekspresjon av nukleinsyren. I tillegg til disse nye regulatorsekvenser eller istedenfor disse sekvenser, kan naturlige regulatoriske elementer i disse sekvenser fortsatt være til stede før de aktuelle strukturelle gener og, hvis det passer, kan ha vært genetisk modifisert på en slik måte at deres naturlige regulering blir fjernet og ekspresjon av genene blir forbedret. Imidlertid kan ekspresjonskassetten (= ekspresjonskonstruksjon = genkonstruksjon) også være enklere i konstruksjon, hvilket vil si ingen ytterligere regulatoriske signaler er innsatt før nukleinsyresekvensen eller derivater derav og den naturlige promoter sammen med dens regulering blir ikke fjernet. Istedet blir den naturlige regulatorerekvensen mutert på en slik måte at regulering ikke lenger finner sted og/eller genekspresjon er forbedret. Disse modifiserte promotere kan også være posisjonert alene før det naturlige gen i form av del-sekvenser (= promotor med deler av nukleinsyresekvensene anvendt i henhold til oppfinnelsen) for å forbedre aktiviteten. Videre kan genkonstruksjonen fordelaktig også omfatte én eller flere av hva som er kjent som enhancer-sekvenser i operabel binding med promoteren, som muliggjør en forbedret ekspresjon av nukleinsyresekvensen. Ytterligere fordelaktige sekvenser, så som ytterligere regulatoriske elementer eller terminator-sekvenser, kan også innsettes ved 3’-enden av DNA-sekvensene. Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ4-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ5-elongase-, Δ6-elongase- og/eller Δ9-elongase-gener kan være til stede i én eller flere kopier av ekspresjonskassetten (= genkonstruksjonen). Fortrinnsvis er bare én kopi av genene til stede i hver ekspresjonskassett. Denne genkonstruksjon eller genkonstruksjonene kan uttrykkes sammen i vertsorganismen. I denne sammenheng kan genkonstruksjonen(e) være innsatt i én eller flere vektorer og være til stede i cellen i fri form eller ellers være innsatt i genomet. Det er fordelaktig for insersjonen av ytterligere gener i genomet når genene som skal uttrykkes er til stede sammen i én genkonstruksjon.
I denne sammenheng kan regulatorsekvensene eller faktorene, som beskrevet ovenfor, fortrinnsvis ha en positiv effekt på genekspresjon av genene innført, og således forbedre den. Således kan en forbedring av de regulatoriske elementene, fordelaktig på transkripsjonelt nivå, skje ved anvendelse av sterke transkripsjonssignaler så som promotere og/eller enhancere. I tillegg er imidlertid forbedret translasjon også mulig, for eksempel ved å forbedre stabiliteten til mRNA.
En ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen er én eller flere genkonstruksjoner som omfatter én eller flere sekvenser som er definert ved SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 eller derivater derav og som koder for polypeptider som vist i SEKV ID NR: 2, SEKV ID NR: 4, SEKV ID NR: 6, SEKV ID NR: 8, SEKV ID NR: 10, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 42, SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 52, SEKV ID NR: 54, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 72, SEKV ID NR: 74, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 90, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96, SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104, SEKV ID NR: 106, SEKV ID NR: 108, SEKV ID NR: 110, SEKV ID NR: 112, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 118, SEKV ID NR: 120, SEKV ID NR: 132, SEKV ID NR: 134, SEKV ID NR: 136, SEKV ID NR: 138 eller SEKV ID NR: 184. De ovennevnte Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase eller Δ4-desaturase-proteiner fører fordelaktig til desaturering eller forlengelse av fettsyrer, idet substratet fordelaktig har én, to, tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger og fordelaktig 18, 20 eller 22 karbonatomer i fettsyremolekylet. Det samme gjelder for deres homologer, derivater eller analoger, som er bundet operabelt med én eller flere regulatoriske signaler, for fordelaktig å forbedre genekspresjon.
Fordelaktige regulatorsekvenser for den nye prosess er til stede for eksempel i promotere så som cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR eller λ-PL promoter og blir fordelaktig anvendt i Gram-negative bakterier. Ytterligere fordelaktige regulator sekvenser for eksempel til stede i de Gram-positive-promotere amy og SPO2, i gjær- eller fungale promotere ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH eller i plante-promotere CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol.22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos eller i ubiquitin- eller phaseolin-promoter. Fordelaktig i denne sammenheng er også induserbare promotere, så som promoterene beskrevet i EP-A-0388186 (benzensulfonamid-induserbare), Plant J.2, 1992:397-404 (Gatz et al., tetracyklin-induserbare), EP-A-0335528 (abscissinsyre-induserbare) eller WO 93/21334 (etanol- eller cykloheksenol-induserbare). Ytterligere egnede plantepromotere er cytosolisk FBPase promoter eller ST-LSI promoter i potet (Stockhaus et al., EMBO J.8, 1989, 2445), glycin max fosforibosylpyrofosfatamidotransferase-promoter (Genbank aksesjonsnummer U87999) eller den nodespesifikke promoter beskrevet i EP-A-0249676.
Spesielt fordelaktige promotere er promotere som muliggjør ekspresjon i vev som er involvert i biosyntesen av fettsyrer. Meget spesielt fordelaktige er frø-spesifikke promotere, så som USP-promoter som beskrevet, men også andre promotere så som LeB4-, DC3-, phaseolin- eller napin-promoter. Ytterligere spesielt fordelaktige promotere er frø-spesifikke promotere som kan anvendes for énfrøbladede eller tofrøbladede planter og som er beskrevet i US 5,608,152 (raps napin promoter), WO 98/45461 (Arabidopsis oleosin promoter), US 5,504,200 (Phaseolus vulgaris phaseolin promoter), WO 91/13980 (Brassica Bce4-promoter), av Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (LeB4-promoter fra en belgplante), idet disse promotere er egnet for tofrøbladede planter. Eksempler på promotere som er egnet for énfrøbladede planter er bygg lpt-2- eller lpt-1-promoter (WO 95/15389 og
WO 95/23230), bygg hordein-promoter og andre egnede promotere beskrevet i WO 99/16890.
I prinsippet er det mulig å anvende alle naturlige promotere sammen med deres regulatorsekvenser, så som de nevnt ovenfor, for den nye prosess. Det er også mulig og fordelaktig å anvende syntetiske promotere, enten i tillegg eller alene, spesielt når de medierer frø-spesifikk ekspresjon, så som de beskrevet i WO 99/16890.
For å oppnå et spesielt høyt PUFA-innhold, spesielt i transgene planter, bør PUFA-biosyntesegener fordelaktig være uttrykt i oljeavlinger på en frø-spesifikk måte. For dette formål kan frø-spesifikke promotere anvendes eller de promotere som er aktive i embryo og/eller i endospermen. I prinsippet kan frø-spesifikke promotere isoleres både fra tofrøbladede og fra énfrøbladede planter. Foretrukne promotere er listet opp nedenfor: USP (= ukjent frøprotein) og vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et al., Mol. Gen Genet., 1991, 225(3)], napin (raps) [US 5,608,152], acyl-bærer-protein (raps) [US 5,315,001 og WO 92/18634], oleosin (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 og WO 93/20216], phaseolin (Phaseolus vulgaris) [US 5,504,200], Bce4 [WO 91/13980], legumines B4 (LegB4 promoter) [Bäumlein et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 og lpt1 (bygg) [WO 95/15389 og WO95/23230], frø-spesifikke promotere fra ris, mais og hvete [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 og aleurain [US 5,677,474], Bce4 (raps)
[US 5,530,149], glycinin (soyabønne) [EP 571741], fosfoenol-pyruvat-karboksylase (soyabønne) [JP 06/62870], ADR12-2 (soyabønne) [WO 98/08962], isocitrat- lyase (raps) [US 5,689,040] eller α-amylase (bygg) [EP 781849].
Plante-genekspresjon kan også lettes via en kjemisk induserbar promoter (se oversikt i Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Kjemisk induserbare promotere er spesielt egnet når det er ønsket at genekspresjon skal finne sted på en tids-spesifikk måte. Eksempler på slike promotere er en salicylsyreinduserbar promoter (WO 95/19443), en tetracyklin-induserbar promoter (Gatz et al. (1992) Plant J.2, 397-404) og en etanol-induserbar promoter.
For å sikre stabil integrering av biosyntesegener i den transgene plante over en rekke generasjoner, må hver av nukleinsyrene som koder for Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ9-elongase, Δ6-desaturase, Δ8-desaturase, Δ6-elongase,
Δ5-desaturase, Δ5-elongase og/eller Δ4-desaturase og som blir anvendt ved fremgangsmåten, være uttrykt under kontroll av en separat promoter, fortrinnsvis en promoter som skiller seg fra de andre promotere, siden repeterende sekvens-motiver kan føre til ustabilitet av T-DNA eller til rekombineringshendelser. I denne sammenheng blir ekspresjonskassetten fordelaktig konstruert på en slik måte at en promoter blir fulgt av et egnet spaltningssete, fordelaktig i en polylinker, for insersjon av nukleinsyren som skal uttrykkes og, hvis det passer, blir en terminatorsekvens posisjonert bak polylinkeren. Denne sekvensen blir gjentatt mange ganger, fortrinnsvis tre, fire eller fem ganger, slik at opptil fem gener kan kombineres i én konstruksjon og innføres i den transgene plante for å bli uttrykt. Fordelaktig blir sekvensen gjentatt opptil tre ganger. For å uttrykke nukleinsyresekvensene, blir den sistnevnte innsatt bak promoteren via et egnet spaltningssete, for eksempel i polylinkeren. Fordelaktig har hver nukleinsyresekvens dens egen promoter og, hvis det passer, dens egen terminatorsekvens. Slike fordelaktige konstruksjoner er beskrevet i for eksempel DE 10102 337 eller DE 10102338. Imidlertid er det også mulig å innsette en rekke nukleinsyresekvenser bak en promoter og, hvis det passer, foran en terminatorsekvens. Her er insersjonssetet eller sekvensen, av de innsatte nukleinsyrer i ekspresjonskassetten ikke av kritisk betydning, hvilket vil si at en nukleinsyresekvens kan være innsatt i den første eller siste stilling i kasetten uten at dens ekspresjon blir vesentlig påvirket derav. Fordelaktig kan forskjellige promotere så som for eksempel USP-, LegB4- eller DC3-promoter og forskjellige terminatorsekvenser anvendes i ekspresjonskassetten. Imidlertid er det også mulig å anvende bare én type promoter i kasetten. Dette kan imidlertid føre til uønskede rekombinerings-hendelser.
Som beskrevet ovenfor bør transkripsjonen av genene som er innført fordelaktig termineres med egnede terminatorsekvenser ved 3’-enden av biosyntesegenene som er innført (bak stoppkodonet). Et eksempel på en sekvens som kan anvendes i denne sammenheng er OCS 1- terminatorsekvens. Som er tilfellet med promoterene bør forskjellige terminatorsekvenser anvendes for hvert gen.
Som beskrevet ovenfor kan genkonstruksjonen også omfatte ytterligere gener som skal innføres i organismene. Det er mulig og fordelaktig å innføre i vertsorganismene og uttrykke deri, regulatoriske gener så som gener for induktorer, repressorer eller enzymer som, på grunn av deres enzymaktivitet, deltar i regulering av ett eller flere gener i en biosyntese-bane. Disse gener kan være av heterolog eller av homolog opprinnelse. Videre kan ytterligere biosyntesegener for fettsyre- eller lipidmetabolisme fordelaktig være til stede i en nukleinsyrekonstruksjon eller genkonstruksjon; imidlertid kan disse gener også være posisjonert på én eller flere ytterligere nukleinsyrekonstruksjoner. Biosyntesegener for fettsyre- eller lipidmetabolisme som fortrinnsvis er anvendt er et gen valgt fra gruppen bestående av acyl-CoA dehydrogenase(r), acyl-ACP [= acyl-bærer-protein] desaturase(r), acyl-ACP tioesterase(r), fettsyre-acyltransferase(r), acyl-CoA:lysofosfolipid-acyltransferaser, fettsyre-syntase(r), fettsyre-hydroksylase(r), acetyl-koenzym A-karboksylase(r), acylkoenzym A- oksydase(r), fettsyre-desaturase(r), fettsyre-acetylenase(r), lipoksygenase(r), triacylglycerol-lipase(r), allenoksyd-syntase(r), hydroperoksydlyase(r) eller fettsyre-elongase(r) eller kombinasjoner derav. Spesielt fordelaktige nukleinsyresekvenser er biosyntese-gener for fettsyre- eller lipid-metabolisme valgt fra gruppen acyl-CoA:lysofosfolipid-acyltransferase, ω3-desaturase, Δ4-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ8-desaturase, Δ9-desaturase, Δ12-desaturase, Δ5-elongase, Δ6-elongase og/eller Δ9-elongase.
I denne sammenheng kan de ovennevnte nukleinsyrer eller gener klones inn i ekspresjonskassetter, som de nevnt ovenfor, i kombinasjon med andre elongaser og desaturaser og anvendes for transformering av planter ved hjelp av Agrobacterium.
Her kan regulatorsekvensene eller faktorene, som beskrevet ovenfor, fortrinnsvis ha en positiv effekt på og således forbedre, ekspresjonsgener som er innført. Således kan forbedring av de regulatoriske elementene fordelaktig finne sted på transkripsjonelt nivå ved anvendelse av sterke transkripsjons-signaler så som promotere og/eller enhancere. Imidlertid er en forbedret translasjon også mulig, for eksempel ved å forbedre stabiliteten til mRNA. I prinsippet kan ekspresjonskassettene anvendes direkte for innføring i plantene eller ellers være innført i en vektor.
Disse fordelaktige vektorer, fortrinnsvis ekspresjonsvektorer, omfatter nukleinsyrene som koder for Δ12-desaturaser, ω3-desaturaser, Δ9-elongaser, Δ6-desaturaser, Δ8-desaturaser, Δ6-elongaser, Δ5-desaturaser, Δ5-elongaser eller Δ4-desaturaser og som blir anvendt ved fremgangsmåten eller ellers en nukleinsyrekonstruksjon som nukleinsyren anvendte enten alene eller i kombinasjon med ytterligere biosyntesegener for fettsyre- eller lipid-metabolisme så som acyl-CoA:lysofosfolipid-acyltransferaser, ω3-desaturaser, Δ4-desaturaser, Δ5-desaturaser, Δ6-desaturaser, Δ8-desaturaser, Δ9-desaturaser, Δ12-desaturaser, ω3-desaturaser, Δ5-elongaser, Δ6-elongaser og/eller Δ9-elongaser. Som anvendt i foreliggende sammenheng angir betegnelsen “vektor” et nukleinsyremolekyl som kan transportere en annen nukleinsyre til hvilken den er bundet. Én type vektor er et “plasmid”, en sirkulær dobbeltrådet DNA-løkke i hvilken ytterligere DNA-segmenter kan ligeres. En ytterligere type vektor er en viral vektor, idet det er mulig for ytterligere DNA-segmenter å bli ligert inn i det virale genom. Visse vektorer kan replikeres autonomt i en vertscelle i hvilken de er innført (for eksempel bakterielle vektorer med bakterielt replikasjonsorigo). Andre vektorer blir fordelaktig integrert i genomet til en vertscelle når de blir innført i vertscellen og således replikerer sammen med vertsgenomet.
Videre kan visse vektorer styre ekspresjon av gener som de er i operabel binding med. Disse vektorer er referert til i foreliggende kontekst som “ekspresjonsvektorer”.
Vanligvis er ekspresjonsvektorer som er egnet for DNA rekombineringsteknikker i form av plasmider. I foreliggende beskrivelse kan “plasmid” og “vektor” anvendes om hverandre siden plasmidet er formen av vektor som oftest blir anvendt. Imidlertid er oppfinnelsen også ment å dekke andre former for ekspresjonsvektorer, så som virale vektorer, som utøver lignende funksjoner. Videre er betegnelsen “vektor” også ment å omfatte andre vektorer som er kjent for en fagmann, så som fag, virus så som SV40, CMV, TMV, transposoner, IS- elementer, fasmider, fagemider, kosmider, lineær eller sirkulær DNA.
Rekombinante ekspresjonsvektorer fordelaktig anvendt ved fremgangsmåten omfatter nukleinsyrene beskrevet nedenfor eller den ovenfor beskrevne genkonstruksjon i en form som er egnet for å uttrykke nukleinsyrene anvendt i en vertscelle, hvilket betyr at de rekombinante ekspresjonsvektorer omfatter én eller flere regulatorsekvenser, valgt på basis av vertscellene anvendt for ekspresjonen, hvilke regulatorsekvens(er) er bundet operabelt med nukleinsyresekvensen som skal uttrykkes. I en rekombinant ekspresjonsvektor, betyr “bundet operabelt” at nukleotidsekvensen av interesse er bundet til regulatorsekvensen(e) på en slik måte at ekspresjon av nukleotidsekvensen er mulig og de er bundet til hverandre på en slik måte at begge sekvenser utfører den antatte funksjon som er tilskrevet sekvensen (for eksempel i et in vitro transkripsjon/translasjon-system eller i en vertscelle hvis vektoren blir innført i vertscellen). Betegnelsen “regulatorsekvens” skal omfatte promotere, enhancere og andre ekspresjonskontroll-elementer (for eksempel polyadenyleringssignaler). Disse regulatorsekvenser er beskrevet i for eksempel Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) eller se: Gruber og Crosby, i: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, Ed.: Glick og Thompson, Kapittel 7, 89-108, omfattende referansene angitt der. Regulatorsekvenser omfatter de som styrer konstitutiv ekspresjon av en nukleotidsekvens i mange typer av vertsceller og de som styrer den direkte ekspresjon av nukleotidsekvensen bare i spesifikke vertsceller under spesifikke betingelser. En fagmann vet at utformingen av ekspresjonsvektoren kan avhenge av faktorer så som valg av vertscelle som skal transformeres, det ønskede ekspresjonsnivå av proteinet og lignende.
De rekombinante ekspresjonsvektorer anvendt kan utformes for ekspresjon av Δ12-desaturaser, ω3-desaturaser, Δ9-elongaser, Δ6-desaturaser, Δ8-desaturaser, Δ6-elongaser, Δ5-desaturaser, Δ5-elongaser og/eller Δ4-desaturaser i prokaryote eller eukaryote celler. Dette er fordelaktig siden mellomtrinnet med vektorkonstruksjon ofte blir utført i mikroorganismer for enkelhets skyld. For eksempel kan Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- og/eller Δ4-desaturase-gener uttrykkes i bakterieceller, insektceller (ved anvendelse av Baculovirus ekspresjonsvektorer), gjær og andre fungale celler (se Romanos, M.A., et al. (1992) ”Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) ”Heterologous gene expression in filamentous fungi”, i: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Ed., s.396-428: Academic Press: San Diego; og van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) ”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, i: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Ed., s.1-28, Cambridge University Press: Cambridge), alger (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology,1, 3:239-251), ciliater av typene: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella og Stylonychia, spesielt av slekten Stylonychia lemnae, ved anvendelse av vektorer i en transformasjonsmetode som beskrevet i WO 98/01572 og, fortrinnsvis, i celler av flercellede planter (se Schmidt, R. og Willmitzer, L. (1988) ”High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants” Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapittel 6/7, s.71-119 (1993);
F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer i: Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung og R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol.42 (1991), 205-225 (og referanser angitt der)). Egnede vertsceller er videre beskrevet i Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Som et alternativ kan den rekombinante ekspresjonsvektor transkriberes og translateres in vitro, for eksempel ved anvendelse av T7-promoter regulatorsekvenser og T7-polymerase.
I de fleste tilfeller involverer ekspresjon av proteiner i prokaryoter anvendelse av vektorer omfattende konstitutive eller induserbare promotere som styrer ekspresjon av fusjons- eller ikke-fusjonsproteiner. Typiske fusjons-ekspresjonsvektorer er bl.a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. og Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) og pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), hvor henholdsvis glutation S-transferase (GST), maltose-E bindingsprotein og protein A, er kondensert med det rekombinante målprotein.
Eksempler på egnede induserbare ikke-fusjon E. coli ekspresjonsvektorer er bl.a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) og pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Målgen-ekspresjon fra pTrc vektor er basert på transkripsjon fra en hybrid trp-lac fusjons-promoter av vert RNA polymerase. Målgen-ekspresjon fra vektoren pET 11d er basert på transkripsjon av en T7-gn10-lac fusjonspromoter, som blir mediert av en viral RNA polymerase (T7 gn1), som er meduttrykt. Denne virale polymerase er tilveiebragt av vertstammer BL21 (DE3) eller HMS174 (DE3) fra et resident λ-profag som inneholder et T7 gn1-gen under transkripsjonell kontroll av lacUV 5- promoter.
Andre vektorer som er egnet for prokaryote organismer er kjent for fagfolk, disse vektorer er for eksempel i E. coli pLG338, pACYC184, pBR-serien så som pBR322, pUC-serien så som pUC18 eller pUC19, M113mp-serien, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 eller pBdCI, i Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 eller pIJ361, i Bacillus pUB110, pC194 eller pBD214, i Corynebacterium pSA77 eller pAJ667.
I en ytterligere utførelsesform er ekspresjonsvektoren en gjærekspresjonsvektor. Eksempler på vektorer for ekspresjon i gjæren S. cerevisiae omfatter pYeDesaturasec1 (Baldari et al. (1987) Embo J.6:229-234), pMFa (Kurjan og Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) og pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektorer og prosesser for konstruksjon av vektorer som er egnet for anvendelse i andre sopper, så som filamentøse sopper, omfatter de som er beskrevet i detalj i: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) ”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, i: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Ed., s.1-28, Cambridge University Press: Cambridge eller i: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Ed., s.396-428: Academic Press: San Diego]. Ytterligere egnede gjær-vektorer er for eksempel pAG-1, YEp6, YEp13 eller pEMBLYe23.
Som et alternativ kan Δ12-desaturaser, ω3-desaturaser, Δ9-elongaser, Δ6-desaturaser, Δ8-desaturaser, Δ6-elongaser, Δ5-desaturaser, Δ5-elongaser og/eller Δ4-desaturaser uttrykkes i insektceller ved anvendelse av Baculovirus-vektorer.
Baculovirus-ekspresjonsvektorer som er tilgjengelige for ekspresjon av proteiner i dyrkede insektceller (for eksempel Sf9-celler) omfatter pAc-serien (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol..3:2156-2165) og pVL-serien (Lucklow og Summers (1989) Virology 170:31-39).
De ovennevnte vektorer er bare en liten oversikt over egnede vektorer som er mulige. Ytterligere plasmider er kjent for fagfolk og er beskrevet i for eksempel:
Cloning vectors (Ed. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018). For ytterligere egnede ekspresjonssystemer for prokaryote og eukaryote celler, se kapittel 16 og 17 i Sambrook, J., Fritsch, E.F. og Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten kan Δ12-desaturaser, ω3-desaturaser, Δ9-elongaser, Δ6-desaturaser, Δ8-desaturaser, Δ6-elongaser, Δ5-desaturaser, Δ5-elongaser og/eller Δ4-desaturaser uttrykkes i enkel-cellede planteceller (så som alger), se Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 og referanser angitt der og i planteceller fra høyere planter (for eksempel spermatofytter så som dyrkbare avlinger). Eksempler på plante-ekspresjonsvektorer omfatter de som er beskrevet i detalj i: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. og Masterson, R. (1992) ”New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol.20:1195-1197; og Bevan, M.W. (1984) ”Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res.
12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; i: Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung og R. Wu, Academic Press, 1993, s.15-38.
En plante-ekspresjonskassett omfatter fortrinnsvis regulatorsekvenser som kan styre ekspresjon av gener i planteceller og som er bundet operabelt slik at hver sekvens kan oppfylle dens funksjon, så som transkripsjonell terminering, for eksempel polyadenyleringssignaler. Foretrukne polyadenyleringssignaler er de som er avledet fra Agrobacterium tumefaciens T-DNA, så som gen 3 av Ti-plasmidet pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J.3 (1984) 835 et seq.), som er kjent som oktopin-syntase eller funksjonelle ekvivalenter derav, men alle andre terminator-sekvenser som er funksjonelt aktive i planter er også egnet.
Siden plante-genekspresjon meget ofte ikke er begrenset til transkripsjonelt nivå, omfatter en plante-ekspresjonskassett fortrinnsvis andre sekvenser som er bundet operabelt, så som translasjons-enhancere, for eksempel ”overdrive”-sekvensen, som forsterker tobakk mosaikkvirus 5’ - utranslatert ledersekvens, som øker protein/RNA-forholdet (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).
Som beskrevet ovenfor må plante-genekspresjon være bundet operabelt med en egnet promoter som trigger genekspresjon med korrekt timing eller på en celle- eller vev-spesifikk måte. Anvendbare promotere er konstitutive promotere (Benfey et al., EMBO J.8 (1989) 2195-2202), så som de som er avledet fra plantevirus, så som 35S CaMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (se også US 5352605 og WO 84/02913) eller plante-promotere, så som promoteren av Rubisco-subenhet, som er beskrevet i US 4,962,028.
Andre foretrukne sekvenser for anvendelse i operabel binding i plantegenekspresjonskasetter er målrettingssekvenser, som er nødvendige for styring av genproduktet til dets tilsvarende cellekammer (se en oversikt i Kermode, Crit. Rev. Plant Sci.15, 4 (1996) 285-423 og referanser angitt der), for eksempel inn i vakuolen, i kjernen, alle typer av plastider, så som amyloplaster, kloroplaster, kromoplaster, det ekstracellulære rom, mitokondriene, endoplasmatisk reticulum, elaioplaster, peroksisomer og andre kammere i planteceller.
Som beskrevet ovenfor kan plante-genekspresjon også oppnås via en kjemisk induserbar promoter (se oversikt i Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Kjemisk induserbare promotere er spesielt egnet når det er ønsket at gen-ekspresjon finner sted på en tids-spesifikk måte. Eksempler på slike promotere er en salicylsyre-induserbar promoter (WO 95/19443), en tetracyklin-induserbar promoter (Gatz et al. (1992) Plant J.2, 397-404) og en etanol-induserbar promoter.
Promotere som responderer på biotiske eller abiotiske stressbetingelser er også egnet, for eksempel den patogen-fremkalte PRP1 gen promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol.22 (1993) 361-366), den varme-induserbare tomat hsp80 promoter (US 5,187,267), den kulde-induserbare potet alfa-amylase promoter (WO 96/12814) eller den sår-induserbare pinII promoter (EP-A-0375091).
Spesielt foretrukket er de promotere som medfører gen-ekspresjon i vev og organer hvor biosyntesen av fettsyrer, lipider og oljer finner sted, i kimceller, så som celler i endospermen og i det utviklende embryo. Egnede promotere er raps napinpromoter (US 5,608,152), Vicia faba USP-promoter (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67), Arabidopsis oleosin-promoter (WO 98/45461), Phaseolus vulgaris phaseolin-promoter (US 5,504,200), Brassica Bce4-promoter (WO 91/13980) eller legumin B4-promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9) og promotere som medfører frø-spesifikk ekspresjon i énfrøbladede planter så som mais, bygg, hvete, rug, ris og lignende. Egnede spesielle promotere er bygg lpt2 eller lpt1 gen-promoter (WO 95/15389 og WO 95/23230) eller promoterene fra bygg hordeingen, ris glutelin-gen, ris oryzin-gen, ris prolamin-gen, hvete gliadin-gen, hvete glutelingen, mais zein-gen, havre glutelin-gen, durra kasirin-gen eller rug secalin-gen, som er beskrevet i WO 99/16890.
Spesielt kan det være ønsket å oppnå multiparallell ekspresjon av
Δ12-desaturaser, ω3-desaturaser, Δ9-elongaser, Δ6-desaturaser, Δ8-desaturaser, Δ6-elongaser, Δ5-desaturaser, Δ5-elongaser og/eller Δ4-desaturaser anvendt ved fremgangsmåten. Slike ekspresjonskassetter kan innføres ved samtidig transformasjon av en rekke individuelle ekspresjons-konstruksjoner eller, fortrinnsvis, ved å kombinere en rekke ekspresjonskassetter på én konstruksjon. En rekke vektorer kan også transformeres med i hvert tilfelle en rekke ekspresjonskassetter og deretter overføres til vertscellen.
Andre promotere som likeledes er spesielt egnet er de som medfører en plastidspesifikk ekspresjon, siden plastider utgjør kammeret hvor forløperne og noen sluttprodukter av lipid-biosyntese blir syntetisert. Egnede promotere, så som den virale RNA polymerase-promoter, er beskrevet i WO 95/16783 og WO 97/06250 og clpP-promoter fra Arabidopsis, beskrevet i WO 99/46394.
Vektor DNA kan innføres i prokaryote og eukaryote celler ved konvensjonelle transformasjons- eller transfeksjons-teknikker. Betegnelsene “transformasjon” og “transfeksjon”, konjugering og transduksjon, som anvendt i foreliggende kontekst, skal omfatte en rekke metoder kjent i tidligere teknikk for innføring av fremmed nukleinsyre (for eksempel DNA) i en vertscelle, omfattende kalsiumfosfat- eller kalsiumkloridsamutfelling, DEAE-dekstran-mediert transfeksjon, lipofeksjon, naturlig kompetanse, kjemisk mediert overføring, elektroporering eller partikkel-bombardement. Egnede metoder for transformasjon eller transfeksjon av vertsceller, omfattende planteceller, kan finnes i Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) og andre laboratorie-lærebøker så som Methods in Molecular Biology, 1995, Vol.44, Agrobacterium Protocols, Ed.: Gartland og Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Vertsceller som i prinsippet er egnet for å oppta nukleinsyren ifølge oppfinnelsen, genproduktet ifølge oppfinnelsen eller vektoren ifølge oppfinnelsen er alle prokaryote eller eukaryote organismer. Vertsorganismene som fordelaktig blir anvendt er mikroorganismer så som sopper eller gjær eller planteceller, fortrinnsvis planter eller deler derav. Sopper, gjær eller planter blir fortrinnsvis anvendt, spesielt fortrinnsvis planter, meget spesielt fortrinnsvis planter så som oljeavlinger, som har mye lipide forbindelser, så som raps, nattlys, hamp, tistel, jordnøtt, canola, linfrø, soyabønne, fargetistel, solsikke, agurkurt eller planter så som mais, hvete, rug, havre, rughvete, ris, bygg, bomull, kassava, pepper, Tagetes, Solanacea-planter så som potet, tobakk, aubergine og tomat, Vicia-arter, ert, alfalfa, buskplanter (kaffe, kakao, te), Salix- arter, trær (oljepalme, kokosnøtt) og flerårige gress og fôravlinger. Spesielt foretrukne planter ifølge oppfinnelsen er oljeavlinger så som soyabønne, jordnøtt, raps, canola, linfrø, hamp, nattlys, solsikke, fargetistel, trær (oljepalme, kokosnøtt).
Oppfinnelsen angår videre den ovenfor beskrevne isolerte nukleinsyresekvens som koder for polypeptider med Δ5-elongase-aktivitet, hvor elongasen kodet for av nukleinsyresekvensene omdanner C16- og C18-fettsyrer med én dobbeltbinding og fordelaktig flerumettede C18-fettsyrer med én Δ6 dobbeltbinding og flerumettede C20-fettsyrer med én Δ5 dobbeltbinding. C22-fettsyrer blir ikke forlenget.
Fordelaktige isolerte nukleinsyresekvenser er nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ5-elongase-aktivitet og som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen av aminosyresekvenser med sekvensen vist i SEKV ID NR: 115, SEKV ID NR: 116, SEKV ID NR: 139, SEKV ID NR: 140, SEKV ID NR: 141 eller SEKV ID NR: 142.
Ytterligere fordelaktige isolerte nukleinsyresekvenser er nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ5-elongase aktivitet og som omfatter en kombinasjon av aminosyresekvensene valgt fra gruppen bestående av:
a) SEKV ID NR: 115 og SEKV ID NR: 139, SEKV ID NR: 115 og SEKV ID NR: 140 eller SEKV ID NR: 139 og SEKV ID NR: 140; eller
b) SEKV ID NR: 116 og SEKV ID NR: 141, SEKV ID NR: 116 og SEKV ID NR: 142 eller SEKV ID NR: 141 og SEKV ID NR: 142; eller
c) SEKV ID NR: 115, SEKV ID NR: 139 og SEKV ID NR: 140 eller SEKV ID NR: 116, SEKV ID NR: 141 og SEKV ID NR: 142.
Foretrukne nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ5-elongase aktivitet omfatter fordelaktig de ovennevnte aminosyresekvenser. Den sistnevnte er beskrevet mer detaljert i tabell 2.
Spesielt fordelaktige isolerte nukleinsyresekvenser er sekvenser valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45,
SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID
NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77,
SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131 eller SEKV ID NR: 133,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46,
SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID
NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78,
SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 132 eller SEKV ID NR: 134, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63,
SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID
NR: 79, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131 eller SEKV ID NR: 133 som har polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID
NR: 50, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66,
SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID
NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 132 eller SEKV ID NR: 134 og som har Δ5-elongase aktivitet.
Oppfinnelsen angår videre nukleinsyresekvensene som er spesifisert nedenfor og som koder for Δ6-elongaser, ω3-desaturaser, Δ6-desaturaser, Δ5-desaturaser, Δ4-desaturaser eller Δ12-desaturaser.
Ytterligere fordelaktige isolerte nukleinsyresekvenser er sekvenser valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 111 eller SEKV ID NR: 183,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 112 eller SEKV ID NR: 184, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 111 eller SEKV ID NR: 183 som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 112 eller SEKV ID NR: 184 og som har Δ6-elongase aktivitet.
Isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med ω3-desaturaseaktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 87 eller SEKV ID NR: 105,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 88 eller SEKV ID NR: 106, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 87 eller SEKV ID NR: 105 som har polypeptider med minst 60% identitet på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 88 eller SEKV ID NR: 106 og som har ω3-desaturase aktivitet.
Isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ6-desaturaseaktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 89 eller i SEKV ID NR: 97,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 90 eller SEKV ID NR: 98, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 89 eller SEKV ID NR: 97 som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 90 eller SEKV ID NR: 98 og som har Δ6-desaturase-aktivitet.
Isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ5-desaturase aktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 99 eller i SEKV ID NR: 101,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 100 eller i SEKV ID NR: 102, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 99 eller i SEKV ID NR: 101 som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 100 eller i SEKV ID NR: 102 og som har
Δ5-desaturase-aktivitet.
Isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ12-desaturaseaktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 95 eller i SEKV ID NR: 103,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 96 eller i SEKV ID NR: 104, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 95 eller i SEKV ID NR: 103 som koder for polypeptider med minst 40% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 96 eller i SEKV ID NR: 104 og som har Δ6-desaturase aktivitet.
Isolerte nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med Δ12-desaturaseaktivitet, valgt fra gruppen bestående av:
a) en nukleinsyresekvens med sekvensen vist i SEKV ID NR: 107 eller i SEKV ID NR: 109,
b) nukleinsyresekvenser som, som resultat av degenerering av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 108 eller SEKV ID NR: 110, eller
c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 107 eller SEKV ID NR: 109 som koder for polypeptider med minst 50% homologi på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 108 eller SEKV ID NR: 110 og som har Δ12-desaturaseaktivitet.
De ovennevnte nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen er avledet fra organismer så som ikke-humane dyr, ciliater, sopper, planter så som alger eller dinoflagellater som kan syntetisere PUFA.
De isolerte ovennevnte nukleinsyresekvenser er fordelaktig avledet fra ordenen Salmoniformes, Xenopus eller Ciona, diatomé-slekter Thalassiosira eller Crythecodinium eller fra familien av Prasinophyceae, så som slekten Ostreococcus eller familien Euglenaceae, så som slekten Euglena eller Pythiaceae, så som slekten Phytophthora.
Oppfinnelsen angår videre isolerte nukleinsyresekvenser som beskrevet ovenfor som koder for polypeptider med ω3-desaturase-aktivitet, hvor ω3-desaturaser kodet for av nukleinsyresekvensene omdanner C18-, C20- og C22-fettsyrer med to, tre, fire eller fem dobbeltbindinger og fordelaktig flerumettede C18-fettsyrer med to eller tre dobbeltbindinger og flerumettede C20-fettsyrer med to, tre eller fire dobbeltbindinger. C22-fettsyrer med fire eller fem dobbeltbindinger blir også desaturert.
Som beskrevet ovenfor angår oppfinnelsen videre isolert nukleinsyresekvens som koder for polypeptider med Δ12-desaturaser, Δ4-desaturaser, Δ5-desaturaser og Δ6-desaturaser, hvor Δ12-desaturaser, Δ4-desaturaser, Δ5-desaturaser eller Δ6-desaturaser kodet for av disse nukleinsyresekvenser omdanner C18-, C20- og C22-fettsyrer med én, to, tre, fire eller fem dobbeltbindinger og fordelaktig flerumettede C18-fettsyrer med én, to eller tre dobbeltbindinger så som C18:1<Δ9>, C18:2<Δ9,12>eller C18:3
<Δ9,12,15>, flerumettede C20-fettsyrer med tre eller fire dobbeltbindinger så som C20:3Δ8,11,14 eller C20:4<Δ8,11,14,17>eller flerumettede C22-fettsyrer med fire eller fem dobbeltbindinger så som C22:4<Δ7,10,13,16>eller C22:5<Δ7,10,13,16,19>. Fettsyrene er fordelaktig desaturert i fosfolipider eller CoA-fettsyreestere, fordelaktig i CoA-fettsyreestere.
I en fordelaktig utførelsesform omfatter betegnelsen “nukleinsyre (molekyl)” som anvendt i denne kontekst i tillegg den utranslaterte sekvens ved 3’- og 5’-enden av den kodende genregion: minst 500, fortrinnsvis 200, spesielt fortrinnsvis 100 nukleotider av sekvensen oppstrøms for 5’-enden av den kodende region og minst 100, fortrinnsvis 50, spesielt fortrinnsvis 20 nukleotider av sekvensen nedstrøms for 3’-enden av den kodende genregion. Et “isolert” nukleinsyremolekyl er separert fra andre nukleinsyremolekyler som er til stede i den naturlige kilden for nukleinsyren. En “isolert” nukleinsyre har fortrinnsvis ingen sekvenser som naturlig flankerer nukleinsyren i genomisk DNA i organismen fra hvilken nukleinsyren er avledet (for eksempel sekvenser som er lokalisert i 5’- og 3’-ender av nukleinsyren ). I forskjellige utførelsesformer kan det isolerte Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ4-desaturase-molekyl omfatte for eksempel færre enn omtrent 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb eller 0,1 kb av nukleotidsekvenser som naturlig flankerer nukleinsyremolekylet i genomisk DNA i cellen fra hvilken nukleinsyren er avledet.
Nukleinsyremolekylene anvendt ved fremgangsmåten, for eksempel et nukleinsyremolekyl med en nukleotidsekvens SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 eller en del derav kan isoleres ved anvendelse av molekylær-biologiske standard-teknikker og sekvensinformasjonen gitt her. For eksempel kan en homolog sekvens eller homologe, konserverte sekvensregioner også identifiseres på DNA- eller aminosyrenivå ved hjelp av komparative algoritmer. De kan anvendes som hybridiserings-probeog standard hybridiserings-teknikker (så som for eksempel de beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) for å isolere ytterligere nukleinsyresekvenser som kan anvendes ved fremgangsmåten. Videre kan et nukleinsyremolekyl omfattende en fullstendig sekvens med SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 eller en del derav, isoleres ved polymerasekjedereaksjon, hvor oligonukleotidprimere blir anvendt på basis av denne sekvensen eller deler derav (for eksempel et nukleinsyremolekyl omfattende den fullstendige sekvensen eller del derav kan isoleres ved polymerasekjedereaksjon ved anvendelse av oligonukleotid-primere som er dannet basert på denne samme sekvens). For eksempel kan mRNA isoleres fra celler (for eksempel ved hjelp av guanidinium-tiocyanat ekstraksjonsmetoden ifølge Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) og cDNA ved hjelp av revers transkriptase (for eksempel Moloney MLV revers transkriptase, tilgjengelig fra Gibco/BRL, Bethesda, MD eller AMV revers transkriptase, tilgjengelig fra Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL). Syntetiske oligonukleotid-primere for amplifiseringen ved hjelp av polymerasekjedereaksjon kan dannes basert på én av sekvensene vist i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 eller ved hjelp av aminosyresekvensene angitt i SEKV ID NR: 2, SEKV ID NR: 4, SEKV ID NR: 6, SEKV ID NR: 8, SEKV ID NR: 10, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 42, SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 52, SEKV ID NR: 54, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 72, SEKV ID NR: 74, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 90, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96, SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104, SEKV ID NR: 106, SEKV ID NR: 108, SEKV ID NR: 110, SEKV ID NR: 112, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 118, SEKV ID NR: 120, SEKV ID NR: 132, SEKV ID NR: 134, SEKV ID NR: 136, SEKV ID NR: 138 eller SEKV ID NR: 184. En nukleinsyre ifølge oppfinnelsen kan amplifiseres ved standard PCR-amplifiseringsteknikker ved anvendelse av cDNA eller, alternativt, genomisk DNA som templat og egnede oligonukleotid-primere. Nukleinsyren således amplifisert kan klones inn i en egnet vektor og karakteriseres ved hjelp av DNA-sekvensanalyse.
Oligonukleotider som svarer til en desaturase-nukleotidsekvens kan dannes ved standard syntese-metoder, for eksempel ved anvendelse av en automatisk DNA-syntetisator.
Homologer av Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ4-desaturasenukleinsyresekvenser med sekvensen SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 betyr for eksempel alleliske varianter med minst omtrent 50 eller 60%, fortrinnsvis minst omtrent 60 eller 70%, mer foretrukket minst omtrent 70 eller 80%, 90% eller 95% og enda mer foretrukket minst omtrent 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% eller mer identitet eller homologi med en nukleotidsekvens vist i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 eller deres homologer, derivater eller analoger eller deler derav. Videre kan isolerte nukleinsyremolekyler i en nukleotidsekvens som hybridiserer med én av nukleotidsekvensene vist i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 eller med en del derav, for eksempel hybridisert under stringente betingelser. En del derav skal forstås å bety, i henhold til oppfinnelsen, at minst 25 basepar (= bp), 50 bp, 75 bp, 100 bp, 125 bp eller 150 bp, fortrinnsvis minst 175 bp, 200 bp, 225 bp, 250 bp, 275 bp eller 300 bp, spesielt fortrinnsvis 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp eller flere basepar blir anvendt for hybridiseringen. Det er også mulig og fordelaktig å anvende den fullstendige sekvens. Alleliske varianter omfatter spesielt funksjonelle varianter som kan oppnås ved delesjon, insersjon eller substitusjon av nukleotider fra/til sekvensen angitt i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183, idet det imidlertid menes at enzymaktiviteten til de resulterende proteiner som blir syntetisert fordelaktig blir beholdt for insersjonen av ett eller flere gener. Proteiner som beholder den enzymatiske aktivitet til Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ9-elongase, Δ6-desaturase, Δ8-desaturase, Δ6-elongase, Δ5-desaturase, Δ5-elongase eller Δ4-desaturase, dvs. hvis aktivitet i det vesentlige ikke er redusert, betyr proteiner med minst 10%, fortrinnsvis 20%, spesielt fortrinnsvis 30%, meget spesielt fortrinnsvis 40% av den opprinnelige enzymaktivitet sammenlignet med proteinet kodet for av SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183. Homologien ble beregnet over hele aminosyre- eller nukleinsyresekvensregionen. En fagmann har tilgjengelig en rekke programmer som er basert på forskjellige algoritmer for sammenligning av forskjellige sekvenser. Her gir algoritmene til Needleman og Wunsch eller Smith og Waterman spesielt pålitelige resultater. Programmet PileUp (J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 51989: 151-153) eller programmene Gap og BestFit [Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol.48; 443-453 (1970) og Smith og Waterman (Adv. Appl. Math.2; 482-489 (1981)], som er del av GCG-programvarepakken [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] ble anvendt for sekvensoppstillingen. Sekvenshomologi-verdier som er angitt ovenfor som en prosentdel ble bestemt over hele sekvensregionen ved anvendelse av programmet GAP og de følgende innstillinger: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10,000 og Average Mismatch: 0,000. Hvis ikke på annen måte spesifisert ble disse innstillinger alltid anvendt som standard-innstillinger for sekvens-oppstillingene.
Homologer av SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 betyr for eksempel også bakterielle, fungale og plante-homologer, forkortede sekvenser, enkeltrådet DNA eller RNA av den kodende og ikke-kodende DNA-sekvens.
Homologer av SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 3, SEKV ID NR: 5, SEKV ID NR: 7, SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 41, SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 117, SEKV ID NR: 119, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133, SEKV ID NR: 135, SEKV ID NR: 137 eller SEKV ID NR: 183 betyr også derivater så som for eksempel promoter-varianter. Promoterene oppstrøms for nukleotidsekvensene angitt kan modifiseres ved én eller flere nukleotid-utvekslinger, ved insersjon(er) og/eller delesjon(er) imidlertid uten at funksjonaliteten eller aktiviteten til promoterene blir negativt påvirket. Det er videre mulig at modifikasjon av promotersekvensen forbedrer deres aktivitet eller at de blir fullstendig erstattet av mer aktive promotere, omfattende de fra heterologe organismer.
De ovennevnte nukleinsyrer og proteinmolekyler med Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ9-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ8-desaturase-, Δ6-elongase-, Δ5-desaturase-, Δ5-elongase- og/eller Δ4-desaturase-aktivitet som er involvert i metabolismen av lipider og fettsyrer, PUFA-kofaktorer og enzymer eller i transporten av lipofile forbindelser gjennom membraner, blir anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for modulering av produksjon av PUFA i transgene organismer, fordelaktig i planter, så som mais, hvete, rug, havre, rughvete, ris, bygg, soyabønne, jordnøtt, bomull, Linum-arter så som linfrø eller lin, Brassica-arter så som raps, canola og turnips, pepper, solsikke, agurkurt, nattlys og Tagetes, Solanaceae-planter så som potet, tobakk, aubergine og tomat, Vicia-arter, ert, kassava, alfalfa, buskplanter (kaffe, kakao, te), Salix-arter, trær (oljepalme, kokosnøtt) og flerårige gress og fôravlinger, enten direkte (for eksempel når overekspresjonen eller optimalisering av et fettsyrebiosyntese-protein har en direkte effekt på utbytte, produksjon og/eller produksjonseffektivitet av fettsyren fra modifiserte organismer) og/eller kan ha en indirekte effekt som allikevel fører til forbedret utbytte, produksjon og/eller produksjonseffektivitet av PUFA eller en reduksjon av uønskede forbindelser (for eksempel når modulering av metabolismen av lipider og fettsyrer, kofaktorer og enzymer fører til modifikasjoner av utbytte, produksjon og/eller produksjonseffektivitet eller sammensetningen av de ønskede forbindelser i cellene, som igjen kan påvirke produksjon av én eller flere fettsyrer).
Kombinasjonen av forskjellige forløpermolekyler og biosynteseenzymer fører til produksjon av forskjellige fettsyremolekyler, som har en avgjørende effekt på lipidpreparatet, siden flerumettede fettsyrer (= PUFA) ikke bare blir innført i triacylglycerol men også i membran-lipider.
Brassicaceae, Boraginaceae, Primulaceae eller Linaceae er spesielt egnet for fremstilling av PUFA, for eksempel stearidonsyre, eikosapentaensyre og dokosaheksaensyre. Linfrø (Linum usitatissimum) er spesielt fordelaktig egnet for fremstilling av PUFA med nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen, fordelaktig, som beskrevet, i kombinasjon med ytterligere desaturaser og elongaser.
Lipidsyntese kan være delt opp i to seksjoner: syntese av fettsyrer og deres binding til sn-glycerol-3-fosfat og tilsetning eller modifikasjon av en polar hodegruppe. Vanlige lipider som er anvendt i membraner omfatter fosfolipider, glykolipider, sfingolipider og fosfoglycerider. Fettsyresyntese starter med omdannelse av acetyl-CoA til malonyl-CoA av acetyl-CoA-karboksylase eller til acetyl-ACP av acetyltransacylase. Etter kondenseringsreaksjonen danner disse to produktmolekyler sammen acetoacetyl-ACP, som blir omdannet via en serie av kondenserings-, reduksjons- og dehydratiserings-reaksjoner slik at et mettet fettsyremolekyl med den ønskede kjedelengde blir oppnådd. Produksjon av de umettede fettsyrer fra disse molekyler blir katalysert av spesifikke desaturaser, enten aerobt ved hjelp av molekylært oksygen eller anaerobt (angående fettsyresyntese i mikroorganismer, se F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli and Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., s. 612-636 og referanser angitt der; Lengeler et al. (Ed.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York og referansene der og Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 og referansene der). For å gjennomgå det ytterligere forlengelsestrinn, må de resulterende fosfolipid-bundete fettsyrer returneres til fettsyre CoA-ester-poolen. Dette er gjort mulig med acyl-CoA:lysofosfolipid acyltransferaser. Videre kan disse enzymer overføre de forlengede fettsyrer fra CoA-estere tilbake til fosfolipidene. Hvis det passer kan denne reaksjonssekvensen følges gjentatte ganger.
Eksempler på forløpere for biosyntese av PUFA er oleinsyre, linolsyre og linolensyre. C18-karbon fettsyrer må være forlenget til C20 og C22 for å oppnå fettsyrer av eikosa- og dokosa-kjede type. Ved hjelp av desaturasene anvendt ved fremgangsmåten, så som Δ12-, ω3-, Δ4-, Δ5-, Δ6- og Δ8-desaturaser og/eller Δ5-, Δ6-, Δ9-elongaser, kan arakidonsyre, eikosapentaensyre, dokosapentaensyre eller dokosaheksaensyre, fordelaktig eikosapentaensyre og/eller dokosaheksaensyre, produseres og deretter anvendes i forskjellige applikasjoner som gjelder matvarer, fôr, kosmetikk eller farmasøytiske midler. C20- og/eller C22-fettsyrer med minst to, fordelaktig minst tre, fire, fem eller seks, dobbeltbindinger i fettsyremolekylet, fortrinnsvis C20- eller C22-fettsyrer med fordelaktig fire, fem eller seks dobbeltbindinger i fettsyremolekylet, kan fremstilles ved anvendelse av de ovennevnte enzymer.
Desaturering kan skje før eller etter forlengelse av den aktuelle fettsyren. Av denne grunn kan produktene av desaturase-aktiviteter og de ytterligere desaturerings- og forlengelses-trinn som er mulig, resultere i foretrukne PUFA med en høyere grad av desaturering, omfattende en ytterligere forlengelse fra C20- til C22-fettsyrer, til fettsyrer så som γ-linolensyre, dihomo-γ-linolensyre, arakidonsyre, stearidonsyre, eikosatetraensyre eller eikosapentaensyre. Substrater for desaturasene og elongasene anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er C16-, C18- eller C20-fettsyrer så som for eksempel linolsyre, γ-linolensyre, α-linolensyre, dihomo-γ-linolensyre, eikosatetraensyre eller stearidonsyre. Foretrukne substrater er linolsyre, γ-linolensyre og/eller α-linolensyre, dihomo-γ-linolensyre, arakidonsyre, eikosatetraensyre eller eikosapentaensyre. De syntetiserte C20- eller C22-fettsyrer med minst to, tre, fire, fem eller seks dobbeltbindinger i fettsyrene blir oppnådd ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i form av den frie fettsyre eller i form av deres estere, for eksempel i form av deres glycerider.
Betegnelsen “glycerid” skal forstås å bety glycerol forestret med én, to eller tre karboksylrester (mono-, di- eller triglycerid). “Glycerid” skal også forstås å bety en blanding av forskjellige glycerider. Glyceridet eller glyceridblandingen kan omfatte ytterligere tilsetninger, for eksempel frie fettsyrer, antioksydasjonsmidler, proteiner, karbohydrater, vitaminer og/eller andre substanser.
For formålene ifølge oppfinnelsen skal “glycerid” videre forstås å bety glycerolderivater. I tillegg til de ovenfor beskrevne fettsyreglycerider, omfatter disse også glycerofosfolipider og glyceroglykolipider. Foretrukne eksempler som kan nevnes i denne sammenheng er glycerofosfolipider så som lecitin (fosfatidylcholin), kardiolipin, fosfatidylglycerol, fosfatidylserin og alkylacylglycerofosfolipider.
Videre må fettsyrer deretter translokeres til forskjellige modifikasjonsseter og innføres i triacylglycerol-lagringslipid. Et ytterligere viktig trinn i lipidsyntese er overføring av fettsyrer til de polare hodegrupper, for eksempel ved glycerol- fettsyreacyltransferase (se Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166).
For publikasjoner om plante-fettsyrebiosyntese og om desaturering, lipidmetabolisme og membrantransport av lipide forbindelser, om beta-oksydasjon, fettsyremodifikasjon og kofaktorer, triacylglycerol-lagring og triacylglycerolsammensetning, omfattende referansene der, se de følgende artikler: Kinney, 1997, Genetic Engineering, Ed.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge og Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin og Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engineering, Ed.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R.31:397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res.34:267-342; Stymne et al., 1993, i: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Ed.: Murata og Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal.13(1):1-16.
PUFA produsert ved fremgangsmåten omfatter en gruppe molekyler som høyere dyr ikke lenger er i stand til å syntetisere og derfor må tas opp eller som høyere dyr ikke lenger er i stand til å syntetisere selv i tilstrekkelig mengde og derfor må ta opp ytterligere mengder, selv om de lett kan syntetiseres av andre organismer så som bakterier; for eksempel er katter ikke lenger i stand til å syntetisere arakidonsyre.
Fosfolipider for formålene ifølge oppfinnelsen skal forstås å bety fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylglycerol og/eller fosfatidylinositol, fordelaktig fosfatidylcholin. Betegnelsene produksjon eller produktivitet er kjent på området og omfatter konsentrasjon av fermenteringsproduktet (forbindelser med formel I) som blir dannet innen en spesifikk tidsperiode og i et spesifikt fermenteringsvolum (for eksempel kg av produkt pr. time pr. liter). De omfatter også produktiviteten i en plantecelle eller en plante, hvilket vil si innholdet av de ønskede fettsyrer produsert ved prosessen i forhold til innholdet av alle fettsyrer i denne cellen eller planten.
Betegnelsen produksjonseffektivitet omfatter tiden som er nødvendig for å oppnå en spesifikk produksjonsmengde (for eksempel tiden som er nødvendig for cellen til å etablere en viss produksjonshastighet av et finkjemikalium). Betegnelsen utbytte eller produkt/karbon-utbytte er kjent på området og omfatter effektiviteten av omdannelsen av karbonkilden til produktet (dvs. fin-kjemikaliet). Denne blir vanligvis uttrykt for eksempel som kg av produkt pr. kg av karbonkilde. Ved økning av utbyttet eller produksjonen av forbindelsen, blir mengden av molekylene oppnådd av denne forbindelsen eller av de egnede molekyler av denne forbindelsen oppnådd i en spesifikk kultur-mengde over en spesifisert tidsperiode øket. Betegnelsene biosyntese eller biosyntesebane er kjent på området og omfatter syntese av en forbindelse, fortrinnsvis en organisk forbindelse, av en celle fra mellomprodukter, for eksempel i en multi-trinn og sterkt regulert prosess. Betegnelsene katabolisme eller katabolsk bane er kjent på området og omfatter spaltning av en forbindelse, fortrinnsvis en organisk forbindelse, av en celle for å gi katabolitter (i mer generelle betegnelser, mindre eller mindre komplekse molekyler), for eksempel i en multi-trinn og sterkt regulert prosess. Betegnelsen metabolisme er kjent på området og omfatter de totale biokjemiske reaksjoner som finner sted i en organisme. Metabolisme av en viss forbindelse (for eksempel metabolisme av en fettsyre) omfatter således de totale biosyntesebaner, modifikasjonsbaner og katabolske baner av denne forbindelsen i cellen som angår denne forbindelsen.
I en ytterligere utførelsesform, koder derivater av nukleinsyremolekylet ifølge oppfinnelsen representert i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183 for proteiner med minst 40%, fordelaktig omtrent 50 eller 60%, fordelaktig minst omtrent 60 eller 70% og mer foretrukket minst omtrent 70 eller 80%, 80 til 90%, 90 til 95% og mest foretrukket minst omtrent 96%, 97%, 98%, 99% eller mer homologi (= identitet) med en fullstendig aminosyresekvens i SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 90, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96, SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104, SEKV ID NR: 106, SEKV ID NR: 108, SEKV ID NR: 110, SEKV ID NR: 112, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 132, SEKV ID NR: 134 eller SEKV ID NR: 184. Homologien er beregnet over hele aminosyre- eller nukleinsyresekvensregionen. Programmet PileUp (J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 51989: 151-153) eller programmene Gap og BestFit [Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol.48; 443-453 (1970) og Smith og Waterman (Adv. Appl. Math.2; 482-489 (1981)], som er del av GCG- programvarepakken [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], ble anvendt for sekvensoppstillingen. Sekvenshomologi-verdier som er angitt ovenfor som en prosentdel ble bestemt over hele sekvensregionen ved anvendelse av programmet BestFit og de følgende innstillinger: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10,000 og Average Mismatch: 0,000. Hvis ikke på annen måte spesifisert ble disse innstillinger alltid anvendt som standardinnstillinger for sekvensoppstillingene.
Videre omfatter oppfinnelsen nukleinsyremolekyler som skiller seg fra én av nukleotidsekvensene vist i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 111, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183 (og deler derav) på grunn av degenerering av den genetiske kode og som således koder for samme Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ4-desaturase, Δ6-elongase eller Δ5-elongase som de kodet for av nukleotidsekvensene vist i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183.
I tillegg til Δ12-desaturaser, ω3-desaturaser, Δ5-elongaser, Δ6-desaturaser, Δ5-desaturaser, Δ4-desaturaser eller Δ6-elongaser vist i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183 vil en fagmann forstå at DNA-sekvens-polymorfier som fører til endringer i aminosyresekvensene av
Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ5-elongase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ4-desaturase og/eller Δ6-elongase kan eksistere i en populasjon. Disse genetiske polymorfier i Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ5-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase- og/eller Δ6-elongase-gen kan eksistere mellom individer i en populasjon på grunn av naturlig variasjon. Disse naturlige varianter medfører vanligvis en varians på 1 til 5% i nukleotidsekvensen av Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ5-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase- og/eller Δ6-elongase-genet. Hver og alle disse nukleotid-variasjoner og resulterende aminosyre-polymorfier i Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ5-elongase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ4-desaturase og/eller Δ6-elongase som er resultat av naturlig variasjon og ikke modifiserer den funksjonelle aktiviteten skal omfattes av oppfinnelsen.
På grunn av deres homologi med Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ5-elongase-, Δ6-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase- og/eller Δ6-elongasenukleinsyrer beskrevet her, kan nukleinsyremolekyler som er fordelaktige ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen isoleres ved å følge standard hybridiseringsteknikker under stringente hybridiseringsbetingelser, ved anvendelse av sekvensene eller del derav som hybridiserings-probe. I denne sammenheng er det mulig for eksempel å anvende isolerte nukleinsyremolekyler som er minst 15 nukleotider i lengde og som hybridiserer under stringente betingelser med nukleinsyremolekylene som omfatter en nukleotidsekvens i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183. Nukleinsyrer med minst 25, 50, 100, 200 eller flere nukleotider kan også anvendes. “Hybridiserer under stringente betingelser” som anvendt i denne kontekst skal beskrive hybridiserings og vaskingsbetingelser under hvilke nukleotidsekvenser med minst 60% homologi med hverandre vanligvis forblir hybridisert med hverandre. Betingelsene er fortrinnsvis slik at sekvenser med minst omtrent 65%, fortrinnsvis minst omtrent 70% og spesielt fortrinnsvis minst 75% eller mer homologi med hverandre vanligvis forblir hybridisert til hverandre. Disse stringente betingelser er kjent for fagfolk og beskrevet i for eksempel Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Et foretrukket ikke-begrensende eksempel på stringente hybridiseringsbetingelser er hybridiseringer i 6 x natriumklorid/natriumcitrat (= SSC) ved omtrent 45°C, fulgt av ett eller flere vasketrinn i 0,2 x SSC, 0,1% SDS ved 50 til 65°C. En fagmann vet at disse hybridiseringsbetingelser avviker avhengig av typen nukleinsyre og, for eksempel når organiske løsningsmidler er til stede, når det gjelder temperatur og bufferkonsentrasjon. Under “standard hybridiseringsbetingelser” er for eksempel hybridiseringstemperaturen, avhengig av typen nukleinsyre, mellom 42°C og 58°C i vandig buffer med en konsentrasjon på 0,1 til 5 x SSC (pH 7,2). Hvis organiske løsningsmidler, for eksempel 50% formamid, er til stede i den ovennevnte buffer er temperaturen under standard betingelser omtrent 42°C. Hybridiseringsbetingelsene for DNA:DNA-hybrider er for eksempel 0,1 x SSC og 20°C til 45°C, fortrinnsvis 30°C til 45°C. Hybridiseringsbetingelsene for DNA:RNA-hybrider er for eksempel 0,1 x SSC og 30°C til 55°C, fortrinnsvis 45°C til 55°C. De ovennevnte hybridiseringsbetingelser blir bestemt for eksempel for en nukleinsyre med omtrent 100 bp (= basepar) i lengde og med et G C innhold på 50% i fravær av formamid. En fagmann vet hvorledes bestemme de nødvendige hybridiseringsbetingelser på basis av de ovennevnte lærebøker eller lærebøker så som Sambrook et al., ”Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames og Higgins (Ed.) 1985, ”Nukleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, ”Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
For å bestemme prosentdelen av homologi (= identitet) av to aminosyresekvenser (for eksempel én av sekvensene i SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 90, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96, SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104, SEKV ID NR: 106, SEKV ID NR: 108, SEKV ID NR: 110, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 132, SEKV ID NR: 134 eller SEKV ID NR: 184) eller av to nukleinsyrer (for eksempel SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183) er sekvensene skrevet én under den andre for en optimal sammenligning (for eksempel kan gap innføres i sekvensen av et protein eller av en nukleinsyre for å generere en optimal oppstilling med det andre proteinet eller den andre nukleinsyren). Deretter blir aminosyreresten eller nukleotider i de tilsvarende aminosyre-stillinger eller nukleotid-stillinger sammenlignet. Hvis en stilling i en sekvens er okkupert av samme aminosyrerest eller samme nukleotid som den tilsvarende stilling i den andre sekvens, da er molekylene homologe i denne stilling (dvs. aminosyre eller nukleinsyre “homologi” som anvendt i denne kontekst svarer til aminosyre eller nukleinsyre “identitet”). Prosentdelen av homologi mellom de to sekvenser er en funksjon av antallet stillinger som sekvensene har felles (dvs. % homologi = antall identiske stillinger/totalt antall stillinger x 100). Betegnelsene homologi og identitet skal derfor betraktes som synonyme.
Et isolert nukleinsyremolekyl som koder for en Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ4-desaturase, Δ5-elongase og/eller Δ6-elongase som er homolog med en proteinsekvens i SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 76, SEKV ID NR: 78, SEKV ID NR: 80, SEKV ID NR: 82, SEKV ID NR: 84, SEKV ID NR: 86, SEKV ID NR: 88, SEKV ID NR: 90, SEKV ID NR: 92, SEKV ID NR: 94, SEKV ID NR: 96, SEKV ID NR: 98, SEKV ID NR: 100, SEKV ID NR: 102, SEKV ID NR: 104, SEKV ID NR: 106, SEKV ID NR: 108, SEKV ID NR: 110, SEKV ID NR: 114, SEKV ID NR: 132, SEKV ID NR: 134 eller SEKV ID NR: 184 kan dannes ved innføring av én eller flere nukleotidsubstitusjoner, -addisjoner eller -delesjoner i en nukleotidsekvens i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183 slik at én eller flere aminosyre-substitusjoner, -addisjoner eller -delesjoner blir innført i proteinet som er kodet. Mutasjoner i én av sekvensene i SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183 kan innføres ved standard teknikker så som setespesifikk mutagenese og PCR-mediert mutagenese. Det er foretrukket å danne konservative aminosyre-substitusjoner i én eller flere av de antatte ikke-essensielle aminosyrerester. I en “konservativ aminosyre-substitusjon”, blir aminosyreresten erstattet med en aminosyrerest med en lignende sidekjede. Familier av aminosyrerester med lignende sidekjeder er definert på området. Disse familier omfatter aminosyrer med basiske sidekjeder (for eksempel lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (for eksempel asparaginsyre, glutaminsyre), uladede polare sidekjeder (for eksempel glycin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin, cystein), upolare sidekjeder (for eksempel alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin, tryptofan), beta-forgrenede sidekjeder (for eksempel treonin, valin, isoleucin) og aromatiske sidekjeder (for eksempel tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). En forutsagt ikke-essensiell aminosyrerest i en Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ4-desaturase, Δ5-elongase eller Δ6-elongase blir således fortrinnsvis erstattet av en annen aminosyrerest fra samme familie av sidekjeder. I en annen utførelsesform kan mutasjonene alternativt være innført tilfeldig over hele eller del av sekvensen som koder for Δ12-desaturase, ω3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ4-desaturase, Δ5-elongase eller Δ6-elongase for eksempel ved satureringsmutagenese og de resulterende mutanter kan screenes ved rekombinant ekspresjon for den her beskrevne Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ6-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ6-elongase-aktivitet for å identifisere mutanter som har beholdt Δ12-desaturase-, ω3-desaturase-, Δ6-desaturase-, Δ5-desaturase-, Δ4-desaturase-, Δ5-elongase- eller Δ6-elongase-aktivitet. Etter mutagenese av én av sekvensene SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183, kan proteinet som er kodet for uttrykkes rekombinant og aktiviteten til proteinet kan bestemmes, for eksempel ved anvendelse av testene beskrevet i foreliggende tekst.
Oppfinnelsen angår videre transgene ikke-humane organismer som omfatter nukleinsyrene SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 75, SEKV ID NR: 77, SEKV ID NR: 79, SEKV ID NR: 81, SEKV ID NR: 83, SEKV ID NR: 85, SEKV ID NR: 87, SEKV ID NR: 89, SEKV ID NR: 91, SEKV ID NR: 93, SEKV ID NR: 95, SEKV ID NR: 97, SEKV ID NR: 99, SEKV ID NR: 101, SEKV ID NR: 103, SEKV ID NR: 105, SEKV ID NR: 107, SEKV ID NR: 109, SEKV ID NR: 113, SEKV ID NR: 131, SEKV ID NR: 133 eller SEKV ID NR: 183 ifølge oppfinnelsen eller en genkonstruksjon eller en vektor som omfatter disse nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen. Den ikke-humane organisme er fordelaktig en mikroorganisme, et ikke-humant dyr eller en plante, spesielt fortrinnsvis en plante.
Foreliggende oppfinnelse er illustrert mer detaljert ved eksemplene som følger, som ikke skal betraktes som begrensende. Innholdet av alle referansene, patentsøknader, patenter og publiserte patentsøknader sitert i foreliggende patentsøknad er herved inntatt ved referanse.
Eksempler:
Eksempel 1: Generelle kloningsmetoder:
Kloningsmetoder så som for eksempel restriksjonsspaltninger, agarosegelelektroforese, rensning av DNA-fragmenter, overføring av nukleinsyrer til nitrocelluloseog nylon-membraner, binding av DNA-fragmenter, transformasjon av E. coli-celler, bakterielle kulturer og sekvensanalyse av rekombinant DNA ble utført som beskrevet av Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
Eksempel 2: Sekvensanalyse av rekombinant DNA:
Rekombinante DNA-molekyler ble sekvensert med en ABI laser fluorescens DNA-sekvensator ved metoden ifølge Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragmenter oppnådd ved polymerasekjedereaksjon ble sekvensert og verifisert for å unngå polymerase-feil i konstruksjoner som skal uttrykkes.
Eksempel 3: Kloning av Oncorhynchus mykiss gener
Søking etter konserverte regioner i proteinsekvensene svarende til elongase-genene angitt i søknaden identifiserte to sekvenser med tilsvarende motiver i Genbank sekvens-database.
Oncoryhnchus mykiss totalt RNA ble isolert ved hjelp av RNAeasy sett fra Qiagen (Valencia, CA, US). Poly-A+ RNA (mRNA) ble isolert fra det totale RNA ved hjelp av oligo-dT-cellulose (Sambrook et al., 1989). RNA ble underkastet revers transkripsjon ved anvendelse av Reverse Transcription System sett fra Promega og cDNA syntetisert ble klonet inn i vektoren lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene). cDNA ble deretter utpakket i henhold til produsentens instruksjoner for å gi plasmid DNA. cDNA plasmid-bibliotek ble deretter anvendt for PCR for kloning av ekspresjonsplasmider.
Eksempel 4: Kloning av ekspresjonsplasmider for formålet heterolog ekspresjon i gjær
De følgende oligonukleotider ble anvendt for PCR-reaksjonen for kloning av de to sekvenser for heterolog ekspresjon i gjær:
Sammensetning av PCR-blanding (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsetemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktet ble inkubert i 2 timer ved 37°C med restriksjonsenzymene HindIII og BamHI. Gjærekspresjonsvektor pYES3 (Invitrogen) ble inkubert på samme måte. Deretter ble 812 bp PCR-produkt, 905 bp PCR-produkt og vektoren separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensesett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og elongase cDNA ligert. Rapid Ligation sett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider pYES3-OmELO2 og pYES3-OmELO3 ble verifisert ved sekvensering og transformert til Saccharomyces stamme INVSc1 (Invitrogen) ved elektroporering (1500 V). Som en kontroll ble pYES3 transformert parallelt. Deretter ble gjæren platet ut på minimalt ”dropout” tryptofanmedium supplert med 2% glukose. Celler som var i stand til vekst uten tryptofan i mediet omfattet således de tilsvarende plasmider pYES3, pYES3-OmELO2 (SEKV ID NR: 51) og pYES3-OmELO3 (SEKV ID NR: 53). Etter seleksjon ble i hvert tilfelle to transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
Eksempel 5: Kloning av ekspresjonsplasmider for formålet frø-spesifikk ekspresjon i planter
For å transformere planter ble en ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP dannet. For dette formål ble NotI spaltningsseter innført ved 5’- og 3’-ender av den kodende sekvensen, ved anvendelse av det følgende primer par:
PSUN-OmELO2
Forover: 5‘-GCGGCCGCATAATGGCTTCAACATGGCAA (SEKV ID NR: 175) Revers: 3‘-GCGGCCGCTTATGTCTTCTTGCTCTTCCTGTT (SEKV ID NR: 176) PSUN-OMELO3
Forover: 5‘-GCGGCCGCataatggagacttttaat (SEKV ID NR: 177)
Revers: 3‘-GCGGCCGCtcagtcccccctcactttcc (SEKV ID NR: 178)
Sammensetning av PCR-blanding (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert i 16 timer ved 37°C med restriksjonsenzymet NotI.
Plante-ekspresjonsvektor pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og 7624 bp vektor separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensning-sett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider pSUN-OmELO2 og pSUN-OmELO3 ble verifisert ved sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP-promoter som EcoRI-fragment i pSUN300.
Polyadenyleringssignalet er det til octopin-syntase-genet fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs terminator, Genbank Aksesjon V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet.1 (6), 499-511 (1982). USP-promoteren svarer til nukleotider 1-684 (Genbank Aksesjon X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-genet er til stede i promoteren. Promoter-fragmentet som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved hjelp av kommersielt tilgjengelig T7 standard primere (Stratagene) og ved hjelp av en syntetisert primer via en PCR-reaksjon ved å følge standard metoder (primer sekvens: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCT-AGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3’, SEKV ID NR: 174). PCR-fragmentet igjen kuttet med EcoRI/SalI og innført i vektoren pSUN300 med OCS-terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP. Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Eksempel 6: Lipid-ekstraksjon fra gjær og frø
Effekten av genetisk modifikasjon på planter, sopper, alger, ciliater eller på produksjon av en ønsket forbindelse (så som en fettsyre) kan bestemmes ved å dyrke de modifiserte mikroorganismer eller den modifiserte plante under egnede betingelser (så som de beskrevet ovenfor) og analyse av mediet og/eller de cellulære komponenter for forhøyet produksjon av ønsket produkt (dvs. av lipidene eller en fettsyre). Disse analytiske teknikker er kjent for fagfolk og omfatter spektroskopi, tynnskiktskromatografi, forskjellige typer av merkingsmetoder, enzymatiske og mikrobiologiske metoder og analytisk kromatografi så som høyytelse væskekromatografi (se for eksempel Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, s.89-90 og s.443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) “Applications of HPLC in Biochemistry“ i: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Vol.3, Kapittel III:
“Product recovery and purification “, s.469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. og Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. og Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, i: Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3; Kap.11, s. 1-27, VCH: Weinheim; og Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
I tillegg til de ovennevnte prosesser blir plantelipider ekstrahert fra plantemateriale som beskrevet av Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22):12935-12940 og Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145. Kvalitativ og kvantitativ analyse av lipider eller fettsyrer er beskrevet av Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr.1992, IX, 307 s. (Oily Press Lipid Library; 1); “Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) under tittelen: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
I tillegg til måling av sluttproduktet fra fermenteringen er det også mulig å analysere andre komponenter av de metabolske baner som blir anvendt for produksjonen av den ønskede forbindelse, så som mellomprodukter og biprodukter, for å bestemme den totale produksjonseffektivitet av forbindelsen. De analytiske metoder omfatter måling av mengden av næringsstoffer i mediet (for eksempel sukkere, hydrokarboner, nitrogenkilder, fosfat og andre ioner), måling av biomasse-sammensetning og vekst, analysering av produksjon av konvensjonelle metabolitter i biosyntesebaner og måling av gasser som blir dannet under fermenteringen. Standardmetoder for disse målinger er beskrevet i Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes og P.F. Stanbury, Ed., IRL Press, s.103-129; 131-163 og 165-192 (ISBN: 0199635773) og referanser angitt der.
Ett eksempel er analyse av fettsyrer (forkortelser: FAME, fettsyre-metylester; GC-MS, gass-væskekromatografi/massespektrometri; TAG, triacylglycerol; TLC, tynnskiktskromatografi).
Utvetydig deteksjon av tilstedeværelse av fettsyreprodukter kan oppnås ved analysering av rekombinante organismer ved anvendelse av analytiske standardmetoder: GC, GC-MS eller TLC, som beskrevet i mange tilfeller av Christie og referansene der (1997, i: Advances on Lipid Methodology, Fjerde utgave: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren [Gasskromatografi/massespektrometri-metoder], Lipide 33:343-353).
Materialet som skal analyseres kan oppbrytes ved ultralydbehandling, maling i en glassmølle, flytende nitrogen og maling eller via andre anvendbare metoder. Etter oppbryting må materialet sentrifugeres. Sedimentet blir resuspendert i destillert vann, oppvarmet i 10 minutter ved 100°C, avkjølt på is og sentrifugert påny, fulgt av ekstraksjon i én time ved 90°C i 0,5 M svovelsyre i metanol med 2% dimetoksypropan, som fører til hydrolyserte olje- og lipid-forbindelser, som gir transmetylerte lipider. Disse fettsyre-metylestere blir ekstrahert i petroleter og til slutt underkastet GC-analyse ved anvendelse av en kapillarkolonne (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Vax-52 CB, 25 µm, 0,32 mm) ved en temperaturgradient mellom 170°C og 240°C i 20 minutter og 5 minutter ved 240°C. Identiteten til de resulterende fettsyre-metylestere må defineres ved anvendelse av standarder som er tilgjengelige fra kommersielle kilder (dvs.
Sigma).
Plantemateriale blir initielt homogenisert mekanisk ved pulverisering med støter og morter for å gjøre det mer mottagelig for ekstraksjon.
Dette blir fulgt av oppvarmning ved 100°C i 10 minutter og, etter avkjøling på is, ved resedimentering. Cellesedimentet blir hydrolysert i én time ved 90°C med 1 M metanolisk svovelsyre og 2% dimetoksypropan og lipidene blir transmetylert. De resulterende fettsyre-metylestere (FAME) blir ekstrahert i petroleter. De ekstraherte FAME blir analysert ved gass-væskekromatografi ved anvendelse av en kapillarkolonne (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Vax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) og en temperaturgradient fra 170°C til 240°C i 20 minutter og 5 minutter ved 240°C.
Identiteten til fettsyre-metylesterne blir bekreftet ved sammenligning med tilsvarende FAME-standarder (Sigma). Identiteten og stillingen av dobbeltbindingen kan analyseres videre ved egnet kjemisk derivatisering av FAME-blandinger, for eksempel for å gi 4,4-dimetoksyoksazolinderivater (Christie, 1998) ved hjelp av GC-MS.
Gjær som var transformert som beskrevet i Eksempel 4 med plasmidene pYES3, pYES3-OmELO2 og pYES3-OmELO3 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturer ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 10 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Fettsyre-metylestere (FAME) ble fremstilt fra gjærcelle-sedimenter ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimentene inkubert med 2 ml 1N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) dimetoksypropan i 1 time ved 80°C. FAME ble ekstrahert ved ekstraksjon to ganger med petroleter (PE). For å fjerne uderivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene i hvert tilfelle vasket én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-fasene tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gass- kromatograf flammeionisasjons-detektor. Betingelsene for GLC-analyse var som følger: ovnstemperaturen ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 minutter ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma).
Metodologien er beskrevet for eksempel i Napier og Michaelson, 2001, Lipids.
36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.
52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 7: Funksjonell karakterisering av OmELO2 og OmELO3:
Mens OmELO2 ikke viser noen elongase-aktivitet, ble OmELO3 vist å ha en tydelig aktivitet med forskjellige substrater. Substratspesifisiteten til OmElo3 ble bestemt etter ekspresjon og mating av en rekke fettsyrer (figur 2). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all transgen gjær. All transgen gjær viser syntese av nye fettsyrer, produktene fra OmElo3-reaksjon. Dette betyr at funksjonell ekspresjon av genet OmElo3 er mulig.
Figur 2 viser at OmElo3 har en substratspesifisitet som med høy spesifisitet fører til forlengelse av Δ5- og Δ6-fettsyrer med én ω3-dobbeltbinding. Videre ble ω6-fettsyrer (C18 og C20) videre også forlenget med mindre spesifisitet. De beste substrater for OmElo3 (opptil 66% forlengelse) var stearidonsyre (C18:4 ω3) og eikosapentaensyre (C20:5 ω3).
Eksempel 8: Rekonstituering av syntese av DHA i gjær
Rekonstituering av biosyntese av DHA (22:6 ω3) ble utført ved å starte fra EPA (20:5 ω3) eller stearidonsyre (18:4 ω3) ved samekspresjon av OmElo3 sammen med Euglena gracilis Δ4-desaturase eller Phaeodactylum tricornutum Δ5-desaturase og Euglena gracilis Δ4-desaturase. For dette formål ble ekspresjonsvektorene pYes2-EgD4 og pESCLeu-PtD5 i tillegg konstruert. Den ovennevnte gjærstamme som allerede er transformert med pYes3-OtElo3 (SEKV ID NR: 55), ble transformert videre med pYes2-EgD4 eller samtidig med pYes2-EgD4 og pESCLeu-PtD5. Den transformerte gjær ble selektert på komplette minimale ”dropout” tryptofan- og uracilmedium agarplater supplert med 2% glukose i tilfellet av pYes3-OmELO/pYes2-EgD4 stammen og komplett minimalt ”dropout” tryptofan, uracil- og leucin-medium i tilfellet av pYes3-OmELO/pYes2-EgD4+pESCLeu-PtD5 stammen. Ekspresjon ble fremkalt ved tilsetning av 2% (vekt/volum) galaktose som angitt ovenfor. Kulturene ble inkubert i ytterligere 120 timer ved 15°C.
Figur 3 viser fettsyreprofilene til transgen gjær som var matet med 20:5 ω3. I kontrollgjær (A), som var transformert med vektoren pYes3-OmElo3 og den blanke vektor pYes2, ble 20:5 ω3 forlenget meget effektivt, hvilket ga 22:5 ω3 (65% forlengelse). Ytterligere innføring av EgΔ-4-desaturase resulterte i omdannelse av 22:5 ω3 til 22:6 ω3 (DHA). Fettsyresammensetningen i den transgene gjær er vist i Figur 5. Etter koekspresjon av OmElo3 og EgD4 ble opptil 3% av DHA detektert i gjær.
I et ytterligere koekspresjonsforsøk ble OmElo3, EgD4 og P. tricornutum Δ5-desaturase (PtD5) uttrykt sammen. Den transgene gjær ble matet med stearidonsyre (18:4 ω3) og den ble analysert (Figur 4). Fettsyresammensetningen i denne gjær er vist i Figur 5. Fettsyren matet, 18:4 ω3, ble forlenget av OmElo3, hvilket ga 20:4 ω3 (60% forlengelse). Den sistnevnte ble desaturert av PtD5, hvilket ga 20:5 ω3. PtD5-aktivitet var 15%. Videre var det mulig å forlenge 20:5 ω3 med OmElo3, hvilket ga 22:5 ω3. Deretter ble den nysyntetiserte 22:5 ω3 desaturert til 22:6 ω3 (DHA). Opptil 0,7% av DHA ble oppnådd i disse forsøk.
Det kan sees fra disse forsøk at sekvensene OmElo3, EgD4 og PtD5 som blir anvendt ved foreliggende oppfinnelse er egnet for produksjon av DHA i eukaryote celler.
Eksempel 9: Dannelse av transgene planter
a) Dannelse av transgene rapsplanter (modifisert metode til Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)
Binære vektorer i Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 eller Escherichia coli (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res.13, 4777-4788) kan anvendes for generering av transgene rapsplanter. For å transformere rapsplanter (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Tyskland) blir en 1:50 fortynning av en natten over kultur av en positivt transformert agrobakteriekoloni i Murashige-Skoog medium (Murashige og Skoog 1962 Physiol. Plant.15, 473) supplert med 3% sukrose (3MS medium) anvendt. Petioler eller hypokotyler av nyspirede sterile rapsplanter (i hvert tilfelle ca.1 cm<2>) blir inkubert med en 1:50 agrobakteriell fortynning i 5-10 minutter i en Petri-skål. Dette blir fulgt av 3 dagers saminkubering i mørke ved 25°C på 3MS medium supplert med 0,8% Bacto-agar. Kulturene blir deretter dyrket i 3 dager med 16 timer lys/8 timer mørke og dyrkningen blir fortsatt i en ukentlig rytme på MS medium supplert med 500 mg/l Claforan (cefotaxim natrium), 50 mg/l kanamycin, 20 μM benzylaminopurin (BAP), nå supplert med 1,6 g/l glukose. Voksende skudd blir overført til MS-medium supplert med 2% sukrose, 250 mg/l Claforan og 0,8% Bactoagar. Hvis ingen røtter ble utviklet etter tre uker, ble 2-indolsmørsyre satt til mediet som veksthormon for rotdannelse.
Regenererte skudd ble oppnådd på 2MS-medium supplert med kanamycin og Claforan; etter rotdannelse ble de overført til kompost og, etter voksing i to uker i et skap med kontrollert omgivelse eller i drivhus, tillatt å blomstre og modne frø ble høstet og analysert ved lipid-analyse for elongase-ekspresjon, så som Δ5-elongase- eller Δ6-elongase-aktivitet eller ω3-desaturase-aktivitet. På denne måten kan linjer med forhøyet innhold av flerumettede C20- og C22-fettsyrer identifiseres.
b) Dannelse av transgene linfrøplanter
Transgene linfrøplanter kan dannes ved for eksempel metoden ifølge Bell et al., 1999, In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant.35(6):456-465 ved hjelp av partikkelbombardement. Generelt ble linfrø transformert ved en agrobakterie-mediert transformasjon, for eksempel ved metoden ifølge Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285.
Eksempel 10: Kloning av Δ5-elongase-gener fra Thraustochytrium aureum ATCC34304 og Thraustochytrium ssp.
Ved å sammenligne de forskjellige elongase-proteinsekvenser funnet i foreliggende søknad, var det mulig å definere konserverte nukleinsyreregioner (histidin boks:
His-Val-X-His-His, tyrosin-boks: Met-Tyr-X-Tyr-Tyr). En EST database av T. aureum ATCC34304 og Thraustochytrium ssp. ble screenet for ytterligerefurther Δ5-elongaser ved hjelp av disse sekvenser. De følgende nye sekvenser ble funnet:
T. aureum ATCC34304 og Thraustochytrium ssp. total RNA ble isolert ved hjelp av RNAeasy sett fra Qiagen (Valencia, CA, US). mRNA ble isolert fra det totale RNA ved hjelp av PolyATract isoleringsystem (Promega). mRNA ble underkastet revers transkripsjon ved anvendelse av Marathon cDNA amplifiseringssett (BD Biosciences) og adaptere ble ligert i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA-biblioteket ble deretter anvendt for PCR for kloning av ekspresjonsplasmider ved hjelp av 5’- og 3’-RACE (rask amplifisering av cDNA-ender).
Eksempel 11: Kloning av ekspresjonsplasmider for heterolog ekspresjon i gjær
De følgende oligonukleotider ble anvendt for PCR-reaksjonen for kloning av sekvensen for heterolog ekspresjon i gjær:
Sammensetning av PCR-blanding (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsetemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene BioTaurELO1 (se SEKV ID NR: 65) og TL16y2 (se SEKV ID NR: 83) ble inkubert i 30 minutter ved 21°C sammen med gjær-ekspresjonsvektoren pYES2.1-TOPO (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Her ble PCR-produktet ligert inn i vektoren ved hjelp av et T-overheng og aktiviteten til en topoisomerase (Invitrogen). Etter inkuberingen ble E. coli DH5 α celler transformert. Egnede kloner ble identifisert ved PCR, plasmid DNA ble isolert ved hjelp av Qiagen DNAeasy sett og verifisert ved sekvensering. Den korrekte sekvens ble deretter transformert til Saccharomyces stamme INVSc1 (Invitrogen) ved elektroporering (1500 V). Som en kontroll, ble blank vektor pYES2.1 transformert parallelt. Deretter, ble gjæren platet ut på minimalt ”dropout” uracil-medium supplert med 2% glukose. Celler som var i stand til å vokse i mediet uten uracil omfatter således de tilsvarende plasmider pYES2.1, pYES2.1-bioTaurELO1 og pYES2.1-TL16y2. Etter seleksjon ble i hvert tilfelle to transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
Eksempel 12: Kloning av ekspresjonsplasmider for formålet frø-spesifikk ekspresjon i planter
For å transformere planter ble en ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP dannet. For dette formål ble NotI spaltningsseter innført ved 5’- og 3’-ender av den kodende sekvensen, ved anvendelse av de følgende primer-par:
PSUN-bioTaurELO1
Forover: 5‘-GCGGCCGCATAATGACGAGCAACATGAGC (SEKV ID NR: 166) Revers: 3‘-GCGGCCGCTTAGGCCGACTTGGCCTTGGG (SEKV ID NR: 167)
PSUN-TL16y2
Forover: 5’-GCGGCCGCACCATGGACGTCGTCGAGCAGCAATG (SEKV ID NR: 168) Revers: 5’-GCGGCCGCTTAGATGGTCTTCTGCTTCTTGGGCGCC (SEKV ID NR: 169)
Sammensetning av PCR-blandingen (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert i 16 timer ved 37°C med restriksjonsenzym NotI. Planteekspresjonsvektor pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og 7624 bp vektor separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensnings-sett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Rapid Ligation sett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider pSUN-bioTaurELO1 og pSUN-TL16y2 ble verifisert ved sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP-promoter som EcoRI-fragment i pSUN300.
Polyadenyleringssignal er det til octopin-syntase-gen fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs terminator, Genbank aksesjon V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet.1 (6), 499-511 (1982). USP-promoteren svarer til nukleotider 1-684 (Genbank Accession X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-genet er til stede i promoteren. Promoterfragmentet som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved hjelp av kommersielt tilgjengelig T7 standard primere (Stratagene) og ved hjelp av en syntetisert primer via en PCR-reaksjon ved å følge standard metoder (primersekvens: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCT-AGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3’, SEKV ID NR: 165). PCR-fragmentet ble kuttet igjen med EcoRI/SalI og innført i vektoren pSUN300 med OCS terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP. Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Lipid-ekstraksjon fra gjær og frø ble utført som beskrevet i Eksempel 6
Eksempel 13: Funksjonell karakterisering av BioTaurELO1 og TL16y2:
Substratspesifisiteten til BioTaurELO1 ble bestemt etter ekspresjon og mating av forskjellige fettsyrer (figur 6). Figur 6 viser matingsforsøk for å bestemme funksjonaliteten og substrat-spesifisiteten med gjærstammer som omfatter enten vektoren pYes2.1 (kontroll) eller vektoren pYes2.1-bioTaurELO1 (= BioTaur) med Δ5-elongase. I begge porsjoner ble 200 µM γ-linolensyre og eikosapentaensyre satt til gjær-inkuberingsmedium og inkubering ble utført i 24 timer. Etter at fettsyrene var ekstrahert fra gjæren, ble de transmetylert og separert ved gasskromatografi.
Forlengelseprodukter oppnådd fra de to fettsyrer som var matet er identifisert ved piler.
Substratene matet kan detekteres i store mengder i all transgen gjær. All transgen gjær viser syntese av nye fettsyrer, produktene av BioTaurELO1-reaksjon. Dette betyr at funksjonell ekspresjon av genet BioTaurELO1 er mulig.
Figur 6 viser at BioTaurELO1 viser en substrat-spesifisitet som med høy spesifisitet fører til forlengelse av Δ5- og Δ6-fettsyrer med én ω3-dobbeltbinding. ω6-fettsyrer (C18 og C20) ble også ytterligere forlenget. γ-linolensyre (C18:3 ω6) ble omdannet i en grad på 65,28%, stearidonsyre (C18:4 ω3) i en grad på 65,66% og eikosapentaensyre (C20:5 ω3) i en grad på 22,01%. Substrat-spesifisiteter ved de forskjellige matingsforsøk er vist i tabell 3 (se slutten av beskrivelsen).
Omdannelsesgraden av GLA når GLA og EPA ble matet var 65,28%.
Omdannelsesgraden av EPA når samme mengder av GLA og EPA ble matet var 9,99%. Hvis bare EPA ble matet var EPA-omdannelsesgraden 22,01%. Arakidonsyre (= ARA) ble også omdannet når matet. Omdannelsesgraden var 14,47%.
Stearidonsyre (= SDA) ble også omdannet. I dette tilfellet var omdannelsesgraden 65,66%.
Funksjonaliteten og substratspesifisiteten av TL16y2 ble bestemt etter ekspresjon og mating av forskjellige fettsyrer. Tabell 4 viser matingsforsøk. Matingsforsøkene ble utført på samme måte som beskrevet for BioTaurELO1. Substratene matet kan detekteres i store mengder i all transgen gjær. All transgen gjær viste syntese av nye fettsyrer, produktene av TL16y2 reaksjonen (Fig.11). Dette betyr at funksjonell ekspresjon av genet TL16y2 er mulig.
Tabell 4: Ekspresjon av TL16y2 i gjær.
Resultatene for TL16y2 sammenlignet med kontrollen, som er vist i Tabell 4, viser de følgende omdannelsesgrader i prosent: a) % omdannelsesgrad av EPA (250 µM): 8%, b) % omdannelsesgrad av EPA (50 µM): 41%, c) % omdannelsesgrad av ARA: 20,3%, d) % omdannelsesgrad av SDA: 79,4% og e) % omdannelsesgrad av GLA: 74,9%.
Således viser TL16y2 Δ5-, Δ6- og Δ8-elongase-aktivitet. Blant disse er aktiviteten for C18-fettsyrer med Δ6-dobbeltbinding den høyeste. Avhengig av konsentrasjonen av
fettsyrer matet, blir dette fulgt av forlengelse av C20-fettsyrer med én Δ5- eller Δ8-dobbeltbinding.
Eksempel 14: Kloning av gener fra Ostreococcus tauri
Ved søking for konserverte regioner i proteinsekvensene ved hjelp av elongasegenene listet opp i søknaden med Δ5-elongase-aktivitet eller Δ6-elongase-aktivitet, var det mulig å identifisere to sekvenser med tilsvarende motiver i en Ostreococcus tauri sekvens-database (genomiske sekvenser). Sekvensene er de følgende
OtElo1 har den høyeste similaritet med en Danio rerio elongase (GenBank AAN77156; ca. 26% identitet), mens OtElo2 har den største similaritet med Physcomitrella Elo (PSE) [ca.36% identitet] (oppstillinger ble utført ved anvendelse av tBLASTn algoritme (Altschul et al., J. Mol. Biol.1990, 215: 403 - 410).
Kloningsprosedyren ble utført som følger:
40 ml av en Ostreococcus tauri kultur i den stasjonære fasen ble spunnet ned og pelleten ble resuspendert i 100 µl dobbelt-destillert vann og lagret ved -20°C. Det relevante genomiske DNA ble amplifisert basert på PCR-metoden. Det tilsvarende primer-par ble valgt på en slik måte at det inneholdt gjær-konsensussekvens for meget effektiv translasjon (Kozak, Cell 1986, 44:283-292) ved siden av startkodonet.
Amplifisering av OtElo-DNA ble utført ved anvendelse av i hvert tilfelle 1 µl opptinte celler, 200 µM dNTP, 2,5 U Taq polymerase og 100 pmol av hver primer i et totalt volum på 50 µl. Betingelsene for PCR var som følger: først denaturering ved 95°C i 5 minutter, fulgt av 30 cykler ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter og et endelig forlengelsestrinn ved 72°C i 10 minutter.
Eksempel 15: Kloning av ekspresjonsplasmider for heterolog ekspresjon i gjær
For å karakterisere funksjonen av Ostreococcus tauri elongaser, ble de åpne leserammene av de aktuelle DNA klonet nedstrøms for den galaktose-induserbare GAL1 promoter av pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), hvilket ga opphav til pOTE1 og pOTE2.
Saccharomyces cerevisiae stamme 334 ble transformert med henholdsvis vektoren pOTE1 eller pOTE2, ved elektroporering (1500 V). Gjær som var transformert med blank vektor pYES2 ble anvendt som kontroll. Den transformerte gjær ble selektert på fullstendig minimalt ”dropout” uracil medium (CMdum) agarplater supplert med 2% glukose. Etter seleksjonen ble i hvert tilfelle tre transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
For å uttrykke Ot elongaser ble forkulturer bestående av i hvert tilfelle 5 ml CMdum ”dropout” uracil væskemedium supplert med 2% (vekt/volum) raffinose initielt inokulert med de valgte transformanter og inkubert i 2 dager ved 30°C og 200 rpm. Deretter ble 5 ml CMdum (”dropout” uracil) væskemedium supplert med 2% raffinose og 300 µM av forskjellige fettsyrer inokulert med forkulturer til en OD600på 0,05. Ekspresjon ble fremkalt ved tilsetning av 2% (vekt/volum) av galaktose. Kulturene ble inkubert i ytterligere 96 timer ved 20°C.
Eksempel 16 Kloning av ekspresjonsplasmider for frø-spesifikk ekspresjon i planter
For å transformere planter ble en ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP dannet. For dette formål ble NotI spaltningsseter innsatt ved 5’- og 3’-enden av de kodende sekvensene, ved anvendelse av PCR. De tilsvarende primer-sekvenser ble avledet fra 5’- og 3’- regioner av OtElo1 og OtElo2.
Sammensetning av PCR-blanding (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10x buffer (Advantage polymerase)+ 25mM MgCl2
5,00 μl 2mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 min 55°C
Denatureringstemperatur: 1 min 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 min 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert med restriksjonsenzymet NotI i 16 timer ved 37°C.
Plante-ekspresjonsvektor pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktet og vektoren separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen Gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Raid Ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider pSUN-OtELO1 og pSUN-OtELO2 ble verifisert ved sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994). The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP-promoter i pSUN300 i form av et EcoRI-fragment.
Polyadenyleringssignalet er ved Ostreococcus-genet fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs-Terminator, Genbank Aksesjon V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmide encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet.1 (6), 499-511 (1982). USP-promoter svarer til nukleotider 1 til 684 (Genbank Aksesjon X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-genet er til stede i promoteren. Promoter-fragmentet som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved en PCR-reaksjon og standard metoder ved hjelp av en syntetisert primer og ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig T7 standard primer (Stratagene). Primer-sekvens: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGG-CCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3’, SEKV ID NR: 164). PCR-fragment ble kuttet igjen med EcoRI/SalI og innsatt i vektoren pSUN300 med OCS-terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP.
Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Eksempel 17: Ekspresjon av OtELO1 og OtELO2 i gjær
Gjær som var transformert med plasmidene pYES3, pYES3-OtELO1 og pYES3-OtELO2 som beskrevet i Eksempel 15 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturer ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Ved å starte med gjærcelle-sedimenter, ble fettsyre-metylestere (FAME) fremstilt ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimentene inkubert i én time ved 80°C sammen med 2 ml 1 N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) av dimetoksypropan. FAME ble ekstrahert to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene vasket i hvert tilfelle én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-faser tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gass-kromatograf utstyrt med flamme-ionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analysen var som følger: ovnstemperaturen ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 min ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre- standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet i for eksempel Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 18: Funksjonell karakterisering av OtELO1 og OtELO2:
Substratspesifisiteten til OtElo1 ble bestemt etter ekspresjon og etter mating av forskjellige fettsyrer (Tab.5). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra OtElo1-reaksjonen. Dette betyr at genet OtElo1 ble uttrykt funksjonelt.
Tabell 4 viser at OtElo1 har en liten grad av substratspesifisitet. OtElo1 var bare i stand til å forlenge C20-fettsyrene eikosapentaensyre (Figur 7) og arakidonsyre (Figur 8), men preferensielt ω3-desaturert eikosapentaensyre.
Tabell 5:
Tabell 5 viser substratspesifisiteten til elongasen OtElo1 for C20-flerumettede fettsyrer med en dobbeltbinding i Δ5-stilling sammenlignet med forskjellige fettsyrer.
Gjæren som var transformert med vektoren pOTE1 ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert ved GLC. Hver verdi representerer gjennomsnitt (n=3) ± standard avvik.
Substratspesifisiteten til OtElo2 (SEKV ID NR: 81) ble bestemt etter ekspresjon og etter mating av forskjellige fettsyrer (Tab.6). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra OtElo2-reaksjonen. Dette betyr at genet OtElo2 ble uttrykt funksjonelt.
Tabell 6:
Tabell 6 viser substratspesifisiteten til elongasen OtElo2 med hensyn til forskjellige fettsyrer.
Gjæren som var transformert med vektoren pOTE2 ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert ved GLC. Hver verdi representerer gjennomsnittet (n=3) ± standard avvik.
Den enzymatiske aktivitet vist i Tabell 3 demonstrerer klart at OtElo2 er en
Δ6-elongase.
Eksempel 19: Kloning av gener fra Thalassiosira pseudonana
Ved søking for konserverte regioner i proteinsekvensene ved hjelp av elongasegenene med Δ5-elongase-aktivitet eller Δ6-elongase-aktivitet, som er angitt i søknaden, er det mulig å identifisere to sekvenser med tilsvarende motiver i en Thalassiosira pseudonana sekvensdatabase (genomiske sekvenser). Sekvensene var de følgende:
En 2 l kultur av T. pseudonana ble dyrket i f/2-medium (Guillard, R.R.L.1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. I Culture of Marine Invertebrate Animals (Eds. Smith, W.L. og Chanley, M.H.), Plenum Press, New York, s.29-60) i 14 dager med en lysintensitet på 80 E/cm<2>. Etter sentrifugering av cellene ble RNA isolert ved hjelp av RNAeasy sett fra Qiagen (Valencia, CA, US) ved å følge produsentens instruksjoner. mRNA ble underkastet revers transkripsjon med Marathon cDNA amplifiseringssett (BD Biosciences) og adaptere ble ligert i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA-biblioteket ble deretter anvendt for PCR for kloning av ekspresjonsplasmider ved hjelp av 5’- og 3’-RACE (rask amplifisering av cDNA-ender).
Eksempel 20: Kloning av ekspresjonsplasmider for formålet heterolog ekspresjon i gjær
Det aktuelle primer-par ble valgt på en slik måte at de bar gjær-konsensussekvensen for meget effektiv translasjon (Kozak, Cell 1986, 44:283-292) ved siden av startkodonet. Amplifisering av TpElo DNA ble utført i hvert tilfelle med 1 µl cDNA, 200 µM dNTP, 2,5 U Advantage polymerase og 100 pmol av hver primer i et totalt volum på 50 µl. PCR-betingelsene var som følger: først denaturering ved 95°C i 5 minutter, fulgt av 30 cykler ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter og et siste forlengelsestrinn ved 72°C i 10 minutter.
De følgende oligonukleotider for PCR-reaksjonen ble anvendt for kloning av sekvensen for heterolog ekspresjon i gjær:
*F = forover primer, R = revers primer
PCR-produktene ble inkubert i 30 minutter ved 21°C med gjær-ekspresjonsvektor pYES2.1-TOPO (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner. PCR-produktet ble ligert inn i vektoren ved hjelp av et T-overheng og aktiviteten til en topoisomerase (Invitrogen). Etter inkuberingen ble E. coli DH5 α-celler transformert. Egnede kloner ble identifisert ved PCR, plasmid DNA ble isolert ved hjelp av Qiagen DNAeasy sett og verifisert ved sekvensering. Den korrekte sekvens ble deretter transformert til Saccharomyces stamme INVSc1 (Invitrogen) ved elektroporering (1500 V). Som en kontroll ble blank vektor pYES2.1 transformert parallelt. Deretter ble gjæren platet ut på minimalt ”dropout” uracil medium supplert med 2% glukose. Celler som var i stand til å vokse i mediet uten uracil omfatter således de tilsvarende plasmider pYES2.1, pYES2.1-TpELO1, pYES2.1-ELO2 og pYES2.1-TpELO3. Etter seleksjonen ble i hvert tilfelle to transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
Eksempel 21: Kloning av ekspresjonsplasmider for formålet frø-spesifikk ekspresjon i planter
For å transformere planter blir en ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP dannet. For dette formål blir NotI spaltningsseter innført ved 5’- og 3’-ender av den kodende sekvensen, ved anvendelse av det følgende primer-par:
PSUN-TPELO1
Forover: 5‘-GCGGCCGCACCATGTGCTCACCACCGCCGTC (SEKV ID NR: 152) Revers: 3‘-GCGGCCGCCTACATGGCACCAGTAAC (SEKV ID NR: 153)
PSUN-TPELO2
Forover: 5‘-GCGGCCGCACCATGTGCTCATCACCGCCGTC (SEKV ID NR: 154) Revers: 3‘-GCGGCCGCCTACATGGCACCAGTAAC (SEKV ID NR: 155)
PSUN-TPELO3
Forover: 5‘-GCGGCCGCaccatggacgcctacaacgctgc (SEKV ID NR: 156)
Revers: 3‘-GCGGCCGCCTAAGCACTCTTCTTCTTT (SEKV ID NR: 157)
Sammensetning av PCR-blanding (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert i 16 timer ved 37°C med restriksjonsenzymet NotI.
Plante-ekspresjonsvektoren pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og 7624 bp vektor separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider pSUN-TPELO1, pSUN-TPELO2 og pSUN-TPELO3 ble verifisert ved sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP-promoter som EcoRI-fragment i pSUN300.
Polyadenyleringssignalet er ved octopin-syntase-gen fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs-terminator, Genbank aksesjon V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet.1 (6), 499-511 (1982). USP-promoteren svarer til nukleotider 1-684 (Genbank aksesjon X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-genet er til stede i promoteren. Promoter-fragmentet som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige T7 standard primere (Stratagene) og ved hjelp av en syntetisert primer via en PCR-reaksjon ved å følge standard metoder.
(Primer-sekvens: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGA-TCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3’; SEKV ID NR: 151).
PCR-fragmentet ble kuttet igjen med EcoRI/SalI og innført i vektoren pSUN300 med OCS-terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP.
Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Lipid-ekstraksjon fra gjær og frø ble utført som beskrevet i Eksempel 6
Eksempel 22: Ekspresjon av TpELO1, TpELO2 og TpELO3 i gjær
Gjær som var transformert med plasmidene pYES2, pYES2-TpELO1, pYES2-TpELO2 og pYES2-TpELO3 som beskrevet i Eksempel 4 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hoved-kulturene ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Ved å starte med gjærcelle-sedimentene, ble fettsyre-metylestere (FAME) fremstilt ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimentene inkubert i 1 time ved 80°C sammen med 2 ml 1 N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) av dimetoksypropan. FAME ble ekstrahert to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene vasket i hvert tilfelle én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-fasene tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gasskromatograf utstyrt med flamme-ionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analyse var som følger: ovnstemperaturen ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 min ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet i for eksempel Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 23: Funksjonell karakterisering av TpELO1 og TPELO3:
Substratspesifisiteten til TpElo1 ble bestemt etter ekspresjon og etter mating av forskjellige fettsyrer (Fig.9). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra TpElo1-reaksjon. Dette betyr at genet TpElo1 ble uttrykt funksjonelt.
Tabell 7 viser at TpElo1 har en smal grad av substrat-spesifisitet. TpElo1 var bare i stand til å forlenge C20-fettsyrene eikosapentaensyre og arakidonsyre, men preferensielt ω3-desaturert eikosapentaensyre.
Gjæren som var transformert med vektoren pYES2-TpELO1 ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Deretter ble fettsyre-metylesterene syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert ved GLC.
Tabell 7: Ekspresjon av TpELO1 i gjær. Kolonner 1 og 3 viser kontrollreaksjoner for kolonner 2 (matet 250 µM 20:4 Δ5,8,11,14) og 4 (matet 250 µM 20:5 Δ5,8,11,14,17).
Substratspesifisiteten til TpElo3 ble bestemt etter ekspresjon og etter mating av forskjellige fettsyrer (Fig.10). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra TpElo3-reaksjonen. Dette betyr at genet TpElo3 ble uttrykt funksjonelt.
Tabell 8 viser at TpElo3 har smal substrat-spesifisitet. TpElo3 var bare i stand til å forlenge C18-fettsyrer γ-linolensyre og stearidonsyre, men preferensielt ω3-desaturert stearidonsyre.
Gjæren som var transformert med vektoren pYES2-TpELO3 ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Deretter ble fettsyre-metylesterene syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert ved GLC.
Tabell 8: Ekspresjon av TpELO3 i gjær. Kolonne 1 viser fettsyreprofilen av gjær uten mating. Kolonne 2 viser kontrollreaksjonen. I kolonner 3 til 6 var γ-linolensyre, stearidonsyre, arakidonsyre og eikosapentaensyre matet (250 µM av hver fettsyre).
Eksempel 24: Kloning av ekspresjonsplasmid for heterolog ekspresjon av
Pi-omega3Des i gjær
For heterolog ekspresjon i gjær ble Pi-omega3Des-klon klonet inn i gjærekspresjonsvektoren pYES3 via PCR med egnede Pi-omega3Des-spesifikke primere. Bare den åpne leserammen av genet, som kodet for Pi-omega3Des-protein ble amplifisert; det ble gitt to spaltningsseter for kloning inn i ekspresjonsvektoren pYES3:
Forover primer: 5’-TAAGCTTACATGGCGACGAAGGAGG (SEKV ID NR: 149) Revers primer: 5’-TGGATCCACTTACGTGGACTTGGT (SEKV ID NR: 150)
Sammensetning av PCR-blandingen (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl av 5’-ATG og av 3’-stopp-primer)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktet ble inkubert i 2 timer ved 37°C med restriksjonsenzymene HindIII og BamHI. Gjær-ekspresjonsvektoren pYES3 (Invitrogen) ble inkubert på samme måte. Deretter ble 1104 bp PCR-produkt og vektoren separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og desaturase cDNA ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. Det resulterende plasmid pYES3-Pi-omega3Des ble verifisert ved sekvensering og transformert inn i Saccharomyces stamme INVSc1 (Invitrogen) ved elektroporering (1500 V). Som en kontroll ble pYES3 transformert parallelt. Deretter ble gjæren platet ut på minimalt ”dropout” tryptofan medium supplert med 2% glukose. Celler som var i stand til vekst uten tryptofan i mediet omfattet således de tilsvarende plasmider pYES3, pYES3-Pi-omega3Des. Etter seleksjonen, ble i hvert tilfelle to transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
Eksempel 25: Kloning av ekspresjonsplasmider for formålet frø-spesifikk ekspresjon i planter
For å transformere planter ble en ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP dannet. For dette formål ble NotI spaltningsseter innført ved 5’- og 3’-ender av den kodende sekvensen, ved anvendelse av det følgende primer-par:
PSUN-Pi-omega3Des
Revers: 3‘-GCGGCCGCTTACGTGGACTTGGTC (SEKV ID NR: 147)
Forover: 5‘-GCGGCCGCatGGCGACGAAGGAGG (SEKV ID NR: 148)
Sammensetning av PCR-blandingen (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert i 4 timer ved 37°C med restriksjonsenzymet NotI. Planteekspresjonsvektoren pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og 7624 bp vektoren separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCRprodukter ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. Det resulterende plasmid pSUN-Piomega3Des ble verifisert ved sekvensering.
Eksempel 26: Ekspresjon av Pi-omega3Des i gjær
Gjær som var transformert med plasmidet pYES3 eller pYES3-Pi-omega3Des som beskrevet i Eksempel 24 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturen ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Fettsyre-metylestere (FAME) ble fremstilt fra gjærcelle-sedimenter ved sur metanolyse. For dette formål ble celle-sedimenter inkubert med 2 ml 1N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) dimetoksypropan i 1 time ved 80°C. FAME ble ekstrahert ved ekstrahering to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer, ble de organiske fasene i hvert tilfelle vasket én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-faser tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gasskromatograf utstyrt med flamme-ionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analyse var som følger: ovnstemperatur ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 minutter ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet i for eksempel i Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 27: Funksjonell karakterisering av Pi-omega3Des:
Substratspesifisiteten til Pi-omega3Des ble bestemt etter ekspresjon og etter mating av forskjellige fettsyrer (Figur 12 til 18). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær, hvilket viser opptak av disse fettsyrer i gjæren. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra Pi-omega3Des-reaksjonen. Dette betyr at genet Pi-omega3Des ble uttrykt funksjonelt.
Figur 12 viser desaturering av linolsyre (18:2 ω-6-fettsyre) til�-linolensyre (18:3 ω-3-fettsyre) med Pi-omega3Des. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler som var transformert med blank vektor pYES2 (Figur 12 A) eller vektoren pYes3-Pi-omega3Des (Figur 12 B) for sur metanolyse. Gjæren ble dyrket i minimalt medium i nærvær av C18:2Δ9,12-fettsyre (300 µM). Deretter ble FAME analysert via GLC.
Figur 13 viser desaturering av γ-linolensyre (18:3 ω-6-fettsyre) til stearidonsyre (18:4 ω-3-fettsyre) med Pi-omega3Des.
Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler som var transformert med blank vektor pYES2 (Figur 13 A) eller vektoren pYes3-Pi-omega3Des (Figur 13 B) for sur metanolyse. Gjæren ble dyrket i minimalt medium i nærvær av γ-C18:3Δ6,9,12-fettsyre (300 µM). Deretter ble FAME analysert via GLC.
Figur 14 viser desaturering av C20:2-ω-6-fettsyre til C20:3-ω-3-fettsyre med
Pi-omega3Des. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler som var transformert med blank vektor pYES2 (Figur 14 A) eller vektoren pYes3-Piomega3Des (Figur 14 B) for sur metanolyse. Gjæren ble dyrket i minimalt medium i nærvær av C20:2Δ11,14-fettsyre (300 µM). Deretter ble FAME analysert via GLC.
Figur 15 viser desaturering av C20:3-ω-6-fettsyre til C20:4-ω-3-fettsyre med
Pi-omega3Des. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler som var transformert med blank vektor pYES2 (Figur 15 A) eller vektoren pYes3-Piomega3Des (Figur 15 B) for sur metanolyse. Gjæren ble dyrket i minimalt medium i nærvær av C20:3Δ8,11,14-fettsyre (300 µM). Deretter ble FAME analysert via GLC.
Figur 16 viser desaturering av arakidonsyre (C20:4-ω-6-fettsyre) til eikosapentaensyre (C20:5-ω-3-fettsyre) med Pi-omega3Des.
Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler som var transformert med blank vektor pYES2 (Figur 16 A) eller vektoren pYes3-Pi-omega3Des (Figur 16 B) for sur metanolyse. Gjæren ble dyrket i minimalt medium i nærvær av C20:4Δ5,8,11,14-fettsyre (300 µM). Deretter ble FAME analysert via GLC.
Figur 17 viser desaturering av dokosatetraensyre (C22:4-ω-6-fettsyre) til dokosapentaensyre (C22:5-ω-3-fettsyre) med Pi-omega3Des. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler som var transformert med blank vektor pYES2 (Figur 17 A) eller vektoren pYes3-Pi-omega3Des (Figur 17 B) for sur metanolyse. Gjæren ble dyrket i minimalt medium i nærvær av C22:4Δ7,10,13,16-fettsyre (300 µM). Deretter ble FAME analysert via GLC.
Substratspesifisiteten til Pi-omega3Des mot forskjellige fettsyrer kan sees fra Figur 18. Gjæren som var transformert med vektoren pYes3-Pi-omega3Des ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert via GLC. Hver verdi representerer et gjennomsnitt av tre målinger. Omdannelsesgraden (% desaturering) ble beregnet ved anvendelse av formelen:
[produkt]/[produkt]+[substrat]*100.
Som beskrevet i Eksempel 9 kan Pi-omega3Des også anvendes for generering av transgene planter. Lipidene kan deretter ekstraheres fra frøene til disse planter som beskrevet i Eksempel 6.
Eksempel 28: Kloning av desaturase-gener fra Ostreococcus tauri
Søking etter konserverte regioner i proteinsekvensene ved hjelp av konserverte motiver (His boxes, Domergue et al.2002, Eur. J. Biochem.269, 4105-4113) tillot identifikasjon av fem sekvenser med tilsvarende motiver i en Ostreococcus tauri sekvensdatabase (genomiske sekvenser). Sekvensene er de følgende:
Oppstillinger for å finne homologier av de individuelle gener ble utført ved anvendelse av tBLASTn algoritmen (Altschul et al., J. Mol. Biol.1990, 215: 403-410).
Kloning ble utført som følger:
40 ml av en Ostreococcus tauri kultur i den stasjonære fasen ble spunnet ned og pelleten ble resuspendert i 100 µl dobbelt-destillert vann og lagret ved -20°C. De relevante genomiske DNA ble amplifisert basert på PCR-metoden. Det tilsvarende primer-par ble valgt på en slik måte at de inneholdt gjær-konsensussekvens for meget effektiv translasjon (Kozak, Cell 1986, 44:283-292) ved siden av startkodonet.
Amplifisering av OtDes-DNA ble utført ved anvendelse av i hvert tilfelle 1 µl opptinte celler, 200 µM dNTP, 2,5 U Taq polymerase og 100 pmol av hver primer i et totalt volum på 50 µl. Betingelsene for PCR var som følger: først denaturering ved 95°C i 5 minutter, fulgt av 30 cykler ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter og et endelig forlengelsestrinn ved 72°C i 10 minutter.
De følgende primere ble anvendt for PCR:
OtDes6,1 Forover: 5’ggtaccacataatgtgcgtggagacggaaaataacg3’ (SEKV ID NR: 145)
OtDes6,1 Revers: 5’ctcgagttacgccgtctttccggagtgttggcc3’ (SEKV ID NR: 146)
Eksempel 29: Kloning av ekspresjonsplasmider for heterolog ekspresjon i gjær
For å karakterisere funksjonen av desaturasen OtDes6.1 (= Δ6-desaturase) fra Ostreococcus tauri ble den åpne leseramme til DNA oppstrøms for den galaktoseinduserbare GAL1-promoter av pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen) klonet, hvilket ga opphav til det tilsvarende pYES2.1-OtDes6.1 klon. På lignende måte kan ytterligere Ostreococcus desaturerte gener klones.
Saccharomyces cerevisiae stamme 334 ble transformert med vektoren
pYES2.1-OtDes6.1 ved elektroporering (1500 V). Gjær som var transformert med blank vektor pYES2 ble anvendt som kontroll. Den transformerte gjær ble selektert på fullstendig minimalt ”dropout” uracil-medium (CMdum) agarplater supplert med 2% glukose. Etter seleksjonen ble i hvert tilfelle tre transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
For å uttrykke OtDes6.1 desaturase ble forkulturer bestående av i hvert tilfelle 5 ml CMdum ”dropout” uracil væskemedium supplert med 2% (vekt/volum) raffinose initielt inokulert med de valgte transformanter og inkubert i 2 dager ved 30°C og 200 rpm.
Deretter ble 5 ml CMdum (”dropout” uracil) væskemedium supplert med 2% raffinose og 300 µM forskjellige fettsyrer inokulert med forkulturene til en OD600på 0,05.
Ekspresjon ble fremkalt ved tilsetning av 2% (vekt/volum) galaktose. Kulturene ble inkubert i ytterligere 96 timer ved 20°C.
Eksempel 30: Kloning av ekspresjonsplasmider for frø-spesifikk ekspresjon i planter
En ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP blir dannet for transformasjon av planter. For dette formål blir NotI spaltningsseter innført i 5’- og 3’-ender av de kodende sekvensene, ved anvendelse av PCR. De tilsvarende primersekvenser er avledet fra 5’- og 3-regioner av desaturasene.
Sammensetning av PCR-blanding (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10x buffer (Advantage polymerase)+ 25mM MgCl2
5,00 μl 2mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 min 55°C
Denatureringstemperatur: 1 min 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 min 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert med restriksjonsenzymet NotI i 16 timer ved 37°C.
Plante-ekspresjonsvektoren pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og vektoren separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen Gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider ble verifisert ved sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz,P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP-promoter i pSUN300 i form av et EcoRI-fragment.
Polyadenyleringssignalet er det til Ostreococcus-gen fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs-Terminator, Genbank aksesjon V00088) (De Greve,H., Dhaese,P., Seurinck,J., Lemmers,M., Van Montagu,M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet.1 (6), 499-511 (1982)). USP-promoteren svarer til nukleotider 1 til 684 (Genbank aksesjon X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-genet er til stede i promoteren. Promoter-fragmentet som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved en PCR-reaksjon og standard metoder ved hjelp av en syntetisert primer og ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig T7 standard primer (Stratagene). (Primersekvens: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’, SEKV ID NR: 144).
PCR-fragment ble kuttet igjen med EcoRI/SalI og innsatt i vektoren pSUN300 med OCS-terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP.
Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Eksempel 31: Ekspresjon av OtDes6.1 i gjær
Gjær som var transformert med plasmidene pYES2 og pYES2-OtDes6.2 som beskrevet i Eksempel 4 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturene ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Ved å starte med gjærcelle-sedimenter, ble fettsyre-metylestere (FAME) fremstilt ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimenter inkubert i én time ved 80°C sammen med 2 ml 1N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) av dimetoksypropan. FAME ble ekstrahert to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene vasket i hvert tilfelle én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-faser tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gasskromatograf utstyrt med flamme-ionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analyse var som følger: ovnstemperatur ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 min ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet for eksempel i Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 32: Funksjonell karakterisering av Ostreococcus desaturaser:
Substratspesifisiteten til desaturaser kan bestemmes etter ekspresjon i gjær (se Eksempler kloning av desaturase-gener, gjærekspresjon) ved mating, ved anvendelse av forskjellig gjær. Beskrivelser for bestemmelse av de individuelle aktiviteter kan finnes i WO 93/11245 for Δ15-desaturaser, WO 94/11516 for Δ12-desaturaser, WO 93/06712, US 5,614,393, US 5614393, WO 96/21022, WO 0021557 og
WO 99/27111 for Δ6-desaturaser, Qiu et al.2001, J. Biol. Chem.276, 31561-31566 for Δ4-desaturaser, Hong et al.2002, Lipids 37,863-868 for Δ5-desaturaser.
Tabell 9 viser substratspesifisiteten til desaturasen OtDes6,1 med hensyn til forskjellige fettsyrer. Substratspesifisiteten til OtDes6.1 ble bestemt etter ekspresjon og etter mating med forskjellige fettsyrer. Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra OtDes6.1 reaksjon (Fig.20). Dette betyr at genet OtDes6.1 ble uttrykt funksjonelt.
Gjæren som var transformert med vektoren pYES2-OtDes6.1 ble dyrket i minimalt medium i nærvær av de angitte fettsyrer. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert via GLC. Hver verdi representerer gjennomsnittet (n=3) ± standard avvik. Aktiviteten svarer til omdannelsesgraden beregnet ved anvendelse av formelen
[substrat/(substrat+produkt)*100].
Tabell 9 viser at OtDes6.1 har substratspesifisitet for linolsyre og linolensyre (18:2 og 18:3), siden disse fettsyrer resulterer i de høyeste aktiviteter. I motsetning er aktiviteten for oleinsyre (18:1) og palmitoleinsyre (16:1) markert mindre uttalt. Den foretrukne omdannelse av linolsyre og linolensyre demonstrerer egnetheten av denne desaturase for fremstilling av flerumettede fettsyrer.
Figur 20 viser omdannelse av linolsyre av OtDes6.1. FAME ble analysert via gasskromatografi. Substratet matet (C18:2) blir omdannet til γ-C18:3. Både utgangsmateriale og produkt dannet er angitt med piler.
Figur 21 viser omdannelse av linolsyre (= LA) og α-linolensyre (= ALA) i nærvær av OtDes6.1, for å gi henholdsvis γ-linolensyre (= GLA) og stearidonsyre (= STA), (Figurer 21 A og C). Videre viser Figur 21 omdannelse av linolsyre (= LA) og α-linolensyre (= ALA) i nærvær av Δ6-desaturasen OtDes6.1 sammen med
Δ6-elongasen PSE1 fra Physcomitrella patens (Zank et al.2002, Plant J.31:255-268) og Δ5-desaturasen PtD5 fra Phaeodactylum tricornutum (Domergue et al.2002, Eur. J. Biochem.269, 4105-4113), for å gi dihomo-γ-linolensyre (= DHGLA) og arakidonsyre (= ARA, Figur 21 B) og for å gi henholdsvis dihomostearidonsyre (= DHSTA) og eikosapentaensyre (= EPA, Figur 21 D). Figur 21 viser klart at reaksjonsproduktene GLA og STA av Δ6-desaturasen OtDes6.1 i nærvær av Δ6-elongasen PSE1 er forlenget nesten kvantitativt for å gi henholdsvis DHGLA og DHSTA. Den påfølgende desaturering med Δ5-desaturasen PtD5 for å gi henholdsvis ARA og EPA, er også problem-fri. Omtrent 25-30% av elongaseproduktet er desaturert (Figurer 21 B og D).
Tabell 10 nedenfor gir en oversikt over Ostreococcus desaturaser som er klonet:
Eksempel: 33 Kloning av desaturase-gener fra Thalassiosira pseudonana
Søking etter konserverte regioner i proteinsekvensene ved hjelp av konserverte motiver (His-bokser, se motiver) tillot identifikasjon av seks sekvenser med tilsvarende motiver i en Thalassiosira pseudonana sekvensdatabase (genomiske sekvenser). Sekvensene er de følgende:
Kloning ble utført som følger:
40 ml av en Thalassiosira pseudonana kultur i den stasjonære fasen ble spunnet ned og pelleten ble resuspendert i 100 µl av dobbelt-destillert vann og lagret ved -20°C. Relevant genomisk DNA ble amplifisert basert på PCR-metoden. Det tilsvarende primer-par ble valgt på en slik måte at de inneholdt gjær konsensussekvens for meget effektiv translasjon (Kozak, Cell 1986, 44:283-292) ved siden av startkodonet.
Amplifisering av TpDes-DNA ble utført ved anvendelse av i hvert tilfelle 1 µl av opptinte celler, 200 µM dNTP, 2,5 U Taq polymerase og 100 pmol av hver primer i et totalt volum på 50 µl. Betingelsene for PCR var som følger: først denaturering ved 95°C i 5 minutter, fulgt av 30 cykler ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter og et endelig forlengelsestrinn ved 72°C i 10 minutter.
Eksempel: 34 Kloning av ekspresjonsplasmider for heterolog ekspresjon i gjær:
For å karakterisere funksjonen av Thalassiosira pseudonana desaturaser blir den åpne leseramme til det aktuelle DNA klonet nedstrøms for den galaktose-induserbare GAL1-promoter av pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), hvilket gir opphav til de tilsvarende pYES2.1 kloner.
Saccharomyces cerevisiae stamme 334 blir transformert med vektorene pYES2.1-TpDesaturasen ved elektroporering (1500 V). Gjær som er transformert med blank vektor pYES2 blir anvendt for kontrollformål. Den transformerte gjær blir selektert på fullstendig minimalt medium (CMdum) agarplater supplert med 2% glukose, men som mangler uracil. Etter seleksjonen blir i hvert tilfelle tre transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
For å uttrykke Tp-desaturaser blir prekulturer av i hvert tilfelle 5 ml CMdum væskemedium supplert med 2% (vekt/volum) raffinose, men som mangler uracil, først inokulert med transformantene valgt og inkubert i 2 dager ved 30°C, 200 rpm.
Deretter blir 5 ml CMdum væskemedium (uten uracil) supplert med 2% raffinose og 300 µM av forskjellige fettsyrer inokulert med forkulturer til OD600på 0,05. Ekspresjon blir indusert ved tilsetning av 2% (vekt/volum) galaktose. Kulturene blir inkubert i ytterligere 96 timer ved 20°C.
Eksempel 35: Kloning av ekspresjonsplasmider for frø-spesifikk ekspresjon i planter
En ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP blir dannet for transformasjon av planter. For dette formål blir NotI-spaltningsseter innført ved 5’- og 3’-ender av de kodende sekvensene, ved anvendelse av PCR. De tilsvarende primersekvenser er avledet fra 5’- og 3-regioner av desaturasene.
Sammensetning av PCR-blandingen (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10x buffer (Advantage polymerase)+ 25mM MgCl2
5,00 μl 2mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 min 55°C
Denatureringstemperatur: 1 min 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 min 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert med restriksjonsenzymet NotI i 16 timer ved 37°C.
Planteekspresjonsvektoren pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og vektoren separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider ble verifisert ved sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz,P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP-promoter i pSUN300 i form av et EcoRI-fragment.
Polyadenyleringssignalet er OCS-gen fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs-Terminator, Genbank aksesjon V00088) (De Greve,H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl.
Genet.1 (6), 499-511 (1982)). USP-promoteren svarer til nukleotider 1 til 684 (Genbank aksesjon X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-genet er til stede i promoteren. Promoter-fragment som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved en PCR-reaksjon og standard metoder ved hjelp av en syntetisert primer og ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig T7 standard primer (Stratagene). (Primer-sekvens: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’; SEKV ID NR: 143).
PCR-fragmentet ble kuttet igjen med EcoRI/SalI og innsatt i vektoren pSUN300 med OCS-terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP.
Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Eksempel 36: Ekspresjon av Tp-desaturaser i gjær
Gjær som var transformert med plasmidene pYES2 og pYES2-Tp desaturaser som beskrevet i Eksempel 4 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturene ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Ved å starte med gjærcelle-sedimenter ble fettsyre-metylestere (FAME) fremstilt ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimenter inkubert i én time ved 80°C sammen med 2 ml 1N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) av dimetoksypropan. FAME ble ekstrahert to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene vasket i hvert tilfelle én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-faser tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl av PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gasskromatograf utstyrt med flamme-ionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analyse var som følger: ovnstemperaturen ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 min ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet i for eksempel Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 37: Funksjonell karakterisering av Thalassiosira pseudonana desaturaser:
Substratspesifisiteten til desaturaser kan bestemmes etter ekspresjon i gjær (se Eksempler kloning av desaturase-gener, gjærekspresjon) ved mating, ved anvendelse av forskjellig gjær. Beskrivelser for bestemmelse av de individuelle aktiviteter kan finnes i WO 93/11245 for Δ15-desaturaser, WO 94/11516 for Δ12-desaturaser, WO 93/06712, US 5,614,393, US 5614393, WO 96/21022, WO 0021557 og
WO 99/27111 for Δ6-desaturaser, Qiu et al.2001, J. Biol. Chem.276, 31561-31566 for Δ4-desaturaser, Hong et al.2002, Lipids 37,863-868 for Δ5-desaturaser.
Aktiviteten til de individuelle desaturaser blir beregnet fra omdannelsesgraden ved anvendelse av formelen [substrat/(substrat+produkt)*100].
Tabeller 11 og 12 som følger gir en oversikt over de klonede Thalassiosira pseudonana desaturaser
Tabell 11: Lengde og karakteristika av de klonede Thalassiosira desaturaser.
Tabell 12: Lengde, exoner, homologi og identiteter av de klonede desaturaser.
Δ 12-desaturase-genene fra Ostreococcus og Thalassiosira kan også klones analogt med de ovennevnte eksempler.
Eksempel 38 Kloning av elongase-gener fra Xenopus laevis og Ciona intestinalis
Ved søking for konserverte regioner (se konsensussekvenser, SEKV ID NR: 115 og SEKV ID NR: 116) i proteinsekvenser av gendatabaser (Genbank) ved hjelp av elongase-genene med Δ 5-elongase-aktivitet eller Δ 6-elongase-aktivitet som er angitt i foreliggende søknad var det mulig å identifisere og isolere ytterligere elongasesekvenser fra andre organismer. Ved anvendelse av egnede motiver var det mulig å identifisere ytterligere sekvenser fra i hvert tilfelle henholdsvis X. laevis og C. intestinalis. Sekvensene var de følgende:
X. laevis cDNA-klon ble oppnådd fra NIH (National Institute of Health) [Genetic and genomic tools for Xenopus research: The NIH Xenopus initiative, Dev. Dyn.225 (4), 384-391 (2002)].
C. intestinalis cDNA-klon ble oppnådd fra the University of Kyoto [Satou,Y., Yamada,L., Mochizuki,Y., Takatori,N., Kawashima,T., Sasaki,A., Hamaguchi,M., Awazu,S., Yagi,K., Sasakura,Y., Nakayama,A., Ishikawa,H., Inaba,K. og Satoh,N. “A cDNA resource from the basal chordate Ciona intestinalis” JOURNAL Genesis 33 (4), 153-154 (2002)].
Eksempel 39: Kloning av ekspresjonsplasmider for heterolog ekspresjon i gjær
Elongase DNA ble amplifisert med i hvert tilfelle 1 µl cDNA, 200 µM dNTPs, 2,5 U Advantage polymerase og 100 pmol av hver primer i et totalt volum på 50 µl. PCR-betingelser var som følger: først denaturering ved 95°C i 5 minutter, fulgt av 30 cykler ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter og et siste forlengelsestrinn ved 72°C i 10 minutter.
De følgende oligonukleotider ble anvendt for PCR-reaksjonen for kloning av sekvensen for heterolog ekspresjon i gjær:
*F = forover primer, R = revers primer
PCR-produktene ble inkubert i 30 minutter ved 21°C med gjær-ekspresjonsvektor pYES2.1-TOPO (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner. PCR-produktet ble ligert inn i vektoren ved hjelp av et T-overheng og aktiviteten til en topoisomerase (Invitrogen). Etter inkuberingen blir E. coli DH5 α-celler transformert. Egnede kloner ble identifisert ved PCR, plasmid DNA ble isolert ved hjelp av Qiagen DNAeasy sett og verifisert ved sekvensering. Den korrekte sekvens ble deretter transformert til Saccharomyces stamme INVSc1 (Invitrogen) ved elektroporering (1500 V). Som en kontroll ble blank vektor pYES2.1 transformert parallelt. Deretter ble gjæren platet på minimalt ”dropout” uracil-medium supplert med 2% glukose. Celler som var i stand til å vokse i mediet uten uracil omfatter således de tilsvarende plasmider pYES2.1, pYES2.1-ELO(Xl) og pYES2.1-ELO(Ci). Etter seleksjonen ble i hvert tilfelle to transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
Eksempel 40: Kloning av ekspresjonsplasmider for formålet frø-spesifikk ekspresjon i planter
For å transformere planter ble en ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP dannet. For dette formål ble NotI-spaltningsseter innført ved 5’- og 3’-ender av den kodende sekvensen, ved anvendelse av det følgende primer-par: pSUN-ELO(Xl)
Forover: 5‘-GCGGCCGCACCATGGCCTTCAAGGAGCTCACATC
(SEKV ID NR: 125) Revers: 3‘-GCGGCCGCCTTCAATGGTTTTTGCTTTTCAATGCACCG
(SEKV ID NR: 126)
pSUN-ELO(Ci)
Forover: 5‘-GCGGCCGCACCATGGACGTACTTCATCGT
(SEKV ID NR: 127) Revers: 3‘-GCGGCCGCTTTAATCGGTTTTACCATT
(SEKV ID NR: 128)
Sammensetning av PCR-blandingen (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl pr. primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert i 16 timer ved 37°C med restriksjonsenzymet NotI.
Plante-ekspresjonsvektoren pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og 7624 bp vektor separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider pSUN-ELO(Xl) og pSUN-ELO(Ci) ble verifisert ved sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP promoter som EcoRI-fragment i pSUN300.
Polyadenyleringssignalet er det av oktopin-syntase-genet fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs terminator, Genbank aksesjon V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet.1 (6), 499-511 (1982). USP-promoteren svarer til nukleotider 1-684 (Genbank aksesjon X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-genet er til stede i promoteren. Promoter-fragmentet som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige T7 standard primere (Stratagene) og ved hjelp av en syntetisert primer via en PCR-reaksjon ved å følge standard metoder
Primer-sekvens: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’ (SEKV ID NR: 129).
PCR-fragmentet ble kuttet igjen med EcoRI/SalI og innført i vektoren pSUN300 med OCS-terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP.
Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Lipid-ekstraksjon fra gjær og frø var som beskrevet i Eksempel 6.
Eksempel 41: Ekspresjon av ELO(Xl) og ELO(Ci) i gjær
Gjær som var transformert med plasmidene pYES2, pYES2-ELO(Xl) og pYES2-ELO(Ci) som beskrevet i Eksempel 4 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturene ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Ved å starte med gjærcelle-sedimenter ble fettsyre-metylestere (FAME) fremstilt ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimentene inkubert i én time ved 80°C sammen med 2 ml 1N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) av dimetoksypropan. FAME ble ekstrahert to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene i hvert tilfelle vasket én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-fasene tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl av PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gasskromatograf utstyrt med flamme-ionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analyse var som følger: ovnstemperaturen ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 min ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet i for eksempel Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 42: Funksjonell karakterisering av ELO(XI) og ELO(Ci):
Substratspesifisiteten til ELO(XI) ble bestemt etter ekspresjon og etter mating med forskjellige fettsyrer (Fig.22). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra ELO(XI)-reaksjon. Dette betyr at genet ELO(XI) ble uttrykt funksjonelt.
Tabell 13 viser at ELO(XI) har en bred substratspesifisitet. Både C18- og C20-fettsyrer er forlenget, idet preferanse for Δ5- og Δ6-desaturerte fettsyrer ble observert.
Gjæren som var transformert med vektoren pYES2-ELO(Xl) ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert via GLC.
Tabell 13: Ekspresjon av ELO(Xl) i gjær. Omdannelsesgrad av forskjellige utgangsmaterialer (matet i hvert tilfelle med 250 µM) er vist.
Substratspesifisiteten til ELO(Ci) ble bestemt etter ekspresjon og etter mating med forskjellige fettsyrer (Fig.23). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene av ELO(Ci)-reaksjon. Dette betyr at genet ELO(Ci) ble uttrykt funksjonelt
Tabell 14: Ekspresjon av ELO(Ci) i gjær. Omdannelsesgrad av forskjellige utgangsmaterialer (matet i hvert tilfelle med 250 µM) er vist.
Tabell 14 viser at ELO(Ci) har en bred substratspesifisitet. Både C18- og C20-fettsyrer er forlenget, idet preferanse for Δ5- og Δ6-desaturerte fettsyrer er observert.
Gjæren som var transformert med vektoren pYES2-ELO(Ci) ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert via GLC.
Eksempel 43: Kloning av gener fra Ostreococcus tauri
Ved søking etter konserverte regioner i proteinsekvensene ved hjelp av elongasegenene med Δ5-elongase-aktivitet eller Δ6-elongase-aktivitet, som er beskrevet her, var det mulig å identifisere i hvert tilfelle to sekvenser med tilsvarende motiver i en Ostreococcus tauri sekvensdatabase (genomiske sekvenser). Sekvensene var de følgende:
OtElo1 og OtElo1.2 viser den høyeste grad av similaritet til en forlengelse fra Danio rerio (GenBank AAN77156; ca.26% identitet), mens OtElo2 og OtElo2.1 viser den høyeste similaritet med Physcomitrella Elo (PSE) [ca.36% identitet] (oppstillinger ble utført ved anvendelse av tBLASTn algoritme (Altschul et al., J. Mol. Biol.1990, 215: 403 − 410).
Elongasene ble klonet som følger:
40 ml av en Ostreococcus tauri kultur i den stasjonære fasen ble spunnet ned, resuspendert i 100 µl dobbelt-destillert vann og lagret ved -20°C. Basert på PCR-metoden ble de respektive genomiske DNA amplifisert. De respektive primer-par ble valgt på en slik måte at de bar gjær-konsensussekvensen for meget effektiv translasjon (Kozak, Cell 1986, 44:283-292) i nabostilling til startkodonet. OtElo DNA ble amplifisert i hvert tilfelle ved anvendelse av 1 µl opptinte celler, 200 µM dNTP, 2,5 U Taq polymerase og 100 pmol av hver primer i et totalt volum på 50 µl. PCR-betingelser var som følger: først denaturering ved 95°C i 5 minutter, fulgt av 30 cykler ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter og et siste elongeringstrinn ved 72°C i 10 minutter.
Eksempel 44: Kloning av ekspresjonsplasmider for heterolog ekspresjon i gjær:
For å karakterisere funksjonen av Ostreococcus tauri elongaser blir den åpne leserammen til det aktuelle DNA klonet nedstrøms for den galaktose-induserbare GAL1 promoter av pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), hvilket gir opphav til de tilsvarende pOTE1, pOTE1.2, pOTE2 og pOTE2.1 kloner.
Saccharomyces cerevisiae stamme 334 blir transformert med henholdsvis vektorene pOTE1, pOTE1.2, pOT22 og pOTE2.1, ved elektroporering (1500 V). En gjær som blir transformert med blank vektor pYES2 blir anvendt for kontrollformål. Den transformerte gjær blir selektert på fullstendig minimalt medium (CMdum) agarplater supplert med 2% glukose, men som mangler uracil. Etter seleksjonen ble i hvert tilfelle tre transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
For å uttrykke Ot-elongaser blir prekulturer av i hvert tilfelle 5 ml CMdum væskemedium supplert med 2% (vekt/volum) raffinose, men som mangler uracil, først inokulert med transformantene valgt og inkubert i 2 dager ved 30°C, 200 rpm.
Deretter blir 5 ml CMdum væskemedium (uten uracil) supplert med 2% av raffinose og 300 µM av forskjellige fettsyrer inokulert med forkultur til OD600på 0,05. Ekspresjon blir fremkalt ved tilsetning av 2% (vekt/volum) galaktose. Kulturene blir inkubert i ytterligere 96 timer ved 20°C.
Eksempel 45: Kloning av ekspresjonsplasmider for frø-spesifikk ekspresjon i planter
En ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP er dannet for transformasjon av planter. For dette formål blir NotI spaltningsseter innført ved 5’- og 3’-ender av de kodende sekvensene, ved anvendelse av PCR. De tilsvarende primersekvenser blir avledet fra 5’- og 3-regioner av OtElo1, OtElo1.2, OtElo2 og OtElo2.1.
Sammensetning av PCR-blanding (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10x buffer (Advantage polymerase)+ 25mM MgCl2
5,00 μl 2mM dNTP
1,25 μl av hver primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 min 55°C
Denatureringstemperatur: 1 min 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 min 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert med restriksjonsenzymet NotI i 16 timer ved 37°C. Plante-ekspresjonsvektor pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og vektoren separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. De resulterende plasmider ble verifisert ved pSUN-OtElIO1, pSUN-OtELO1.2, pSUN-OtELO2 og pSUN-OtELO2.2 sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz,P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP-promoter i pSUN300 i form av et EcoRI-fragment.
Polyadenyleringssignal er det av Ostreococcus-genet fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs-Terminator, Genbank aksesjon V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet.1 (6), 499-511 (1982). USP-promoter svarer til nukleotider 1 til 684 (Genbank aksesjon X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-gen er til stede i promoteren. Promoter-fragment som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved en PCR-reaksjon og standard metoder ved hjelp av en syntetisert primer og ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig T7 standard primer (Stratagene).
(Primer sekvens:
5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’). (SEKV ID NR: 130)
PCR-fragmentet ble kuttet igjen med EcoRI/SalI og innsatt i vektoren pSUN300 med OCS-terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP.
Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Eksempel 46: Ekspresjon av OtElo1, OtElo1.2, OtElo2 og OtELO2.2 i gjær
Gjær som var transformert med plasmidene pYES3, pYES3-OtELO1, pYES3-OtELO1.2, pYES3-OtELO2 og pYES3-OtELO2.2 som beskrevet i Eksempel 15 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturene ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Ved å starte med gjærcelle-sedimenter ble fettsyre-metylesterene (FAME) fremstilt ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimenter inkubert i én time ved 80°C sammen med 2 ml 1N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) av dimetoksypropan. FAME ble ekstrahert to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene vasket i hvert tilfelle én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-faser tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl av PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gasskromatograf utstyrt med flamme-ionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analyse var som følger: ovnstemperatur ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 min ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet i for eksempel Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 47: Funksjonell karakterisering av OtElo1, OtElo1.2, OtElo2 og OtElo2.1:
Substratspesifisiteten til OtElo1 ble bestemt etter ekspresjon og etter mating av forskjellige fettsyrer (Tab.15). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra OtElo1-reaksjon. Dette betyr at genet OtElo1 ble uttrykt funksjonelt.
Tabell 15 viser at OtElo1 og OtElo1.2 har en smal substratspesifisitet. OtElo1 og OtElo1.2 var bare i stand til å forlenge C20-fettsyrene eikosapentaensyre (Figur 24A, 24B) og arakidonsyre (Figur 25A, 25B), men preferensielt eikosapentaensyre, som er ω-3-desaturert.
Tabell 15 viser substratspesifisiteten til elongasen OtElo1 og OtElo1.2 for C20-flerumettede fettsyrer med en dobbeltbinding i Δ5-stilling sammenlignet med forskjellige fettsyrer.
Gjæren som var transformert med henholdsvis vektoren pOTE1 og pOTE1.2, ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert via GLC.
Substratspesifisiteten til OtElo1 (SEKV ID NR: 81) OtElo2.1 (SEKV ID NR: 111) ble bestemt etter ekspresjon og etter mating av forskjellige fettsyrer (Tab.16). Substratene matet kan detekteres i store mengder i all den transgene gjær. Den transgene gjær avslørte syntese av nye fettsyrer, produktene fra OtElo2-reaksjonen. Dette betyr at genene OtElo2 og OtElo2.1 ble uttrykt funksjonelt.
Tabell 15:
Tabell 16 viser substratspesifisiteten til elongasen OtElo2 og OtElo2.1 for forskjellige fettsyrer. Aktiviteten til OtElo2.1 er markert høyere.
Gjæren som var transformert med henholdsvis vektoren pOTE2 og pOTE2.1 ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert ved GLC.
Den enzymatiske aktivitet som er vist i Tabell 16 demonstrerer klart at OtElo2 eller OtElo2.1 er en Δ6-elongase.
Tabell 16:
Figur 24 A - D viser forlengelsen av eikosapentaensyre av henholdsvis OtElo1 (B) og OtElo1.2 (D). Kontrollene (A, C) viser ikke forlengelsesprodukt (22:5 ω3).
Figur 25 A - D viser forlengelse av arakidonsyre av henholdsvis OtElo1 (B) og OtElo1.2 (D). Kontrollene (A, C) viser ikke forlengelsesprodukt (22:4 ω6).
Eksempel 48: Kloning av elongase gener fra Euglena gracilis og Arabidopsis thaliana
Ved søking etter konserverte regioner i proteinsekvensene ved hjelp av elongasegenene med Δ5-elongase-aktivitet eller Δ6-elongase-aktivitet, som er angitt i søknaden var det mulig å identifisere sekvenser fra henholdsvis Arabidopsis thaliana og Euglena gracilis, med tilsvarende motiver i sekvensdatabaser (Genbank, Euglena EST bibliotek). Sekvensene er de følgende:
Euglena gracilis elongaser ble klonet som følger:
Euglena gracilis stamme 1224-5/25 ble oppnådd fra Sammlung für Algenkulturen Göttingen [Göttingen-samling av algekulturer] (SAG). For isolering ble stammen dyrket i medium II (Calvayrac R og Douce R, FEBS Letters 7:259-262, 1970) i 4 dager ved 23<o>C med et lys/mørke intervall på 8 timer/16 timer (lysintensitet 35 mol s-1 m-2).
Totalt RNA fra en fire dager gammel Euglena-kultur ble isolert ved hjelp av RNAeasy sett fra Qiagen (Valencia, CA, US). Poly-A+ RNA (mRNA) ble isolert fra det totale RNA ved hjelp av oligo-dt-cellulose (Sambrook et al., 1989). RNA ble underkastet revers transkripsjon ved anvendelse av Revers Transkripsjon System sett fra Promega og syntetisert cDNA ble klonet inn i vektoren lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene). cDNA ble utpakket i henhold til produsentens instruksjoner for å gi plasmid DNA og kloner ble del-sekvensert for random sekvensering. mRNA ble isolert fra det totale RNA ved hjelp av PolyATract isoleringsystem (Promega). mRNA ble underkastet revers transkripsjon ved anvendelse av Marathon cDNA amplifiseringssett (BD Biosciences) og adaptere ble ligert i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA-biblioteket ble deretter anvendt for PCR for kloning av ekspresjonsplasmider ved hjelp av 5’ og 3’-RACE (rask amplifisering av cDNA-ender).
Arabidopsis thaliana elongaser ble klonet som følger:
Ved å starte fra genomisk DNA ble primere for de to gener i hvert tilfelle avledet ved 5’-og 3’-enden av den åpne leserammen.
Metoden ifølge Chrigwin et al., (1979) ble anvendt for å isolere total RNA fra
A. Thaliana. Blader fra 21 dager gamle planter ble pulverisert med støter og morter i flytende nitrogen, behandlet med disruptiv buffer og inkubert i 15 minutter ved 37°C. Etter sentrifugering (10 min, 4°C, 12000 × g) ble RNA i supernatanten utfelt med 0,02 volum av 3 M natriumacetat pH 5,0 og 0,75 volum av etanol ved -20°C i 5 timer. Deretter ble, etter et ytterligere sentrifugeringstrinn, RNA tatt opp i 1 ml TES pr. g utgangsmateriale, ekstrahert én gang med ett volum av fenol/kloroform og én gang med ett volum av kloroform og RNA ble utfelt med 2,5 M LiCl. Etter påfølgende sentrifugering og vasking med 80% etanol, ble RNA resuspendert i vann. cDNA ble syntetisert som beskrevet av Sambrook et al.1989 og RT-PCR ble utført med de avledede primere. PCR-produktene ble klonet inn i vektoren pYES2.1-TOPO (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner.
Eksempel 49: Kloning av ekspresjonsplasmider for heterolog ekspresjon i gjær:
For å karakterisere funksjonen av A. thaliana desaturaser blir den åpne leseramme til det aktuelle DNA klonet nedstrøms for den galaktose-induserbare GAL1-promoter i pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), hvilket gir opphav til de tilsvarende pAt60 og pAt70 kloner.
Saccharomyces cerevisiae stamme 334 blir omdannet med henholdsvis vektorene pAt60 og pAt70 ved elektroporering (1500 V). Gjær som er transformert med blank vektor pYES2.1 blir anvendt for kontrollformål. Den transformerte gjær blir selektert på fullstendig minimalt medium (CMdum) agarplater supplert med 2% glukose, men som mangler uracil. Etter seleksjonen blir i hvert tilfelle tre transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
For å uttrykke At-elongaser ble prekulturer av i hvert tilfelle 5 ml CMdum væskemedium supplert med 2% (vekt/volum) raffinose, men uten uracil, inokulert med de valgte transformanter og inkubert i 2 timer ved 30°C, 200 rpm.
5 ml CMdum væskemedium (uten uracil) supplert med 2% av raffinose og 300 µM av forskjellige fettsyrer ble deretter inokulert med forkulturer til en OD600på 0,05.
Ekspresjon ble fremkalt ved tilsetning av 2% (vekt/volum) galaktose. Kulturene ble inkubert i ytterligere 96 timer ved 20°C.
Eksempel 50: Ekspresjon av pAt60 og pAt70 i gjær
Gjær som var transformert med henholdsvis plasmidene pYES2.1, pAt60 og pAt70, som beskrevet i Eksempel 5 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturene ble høstet ved sentrifugering (100 x g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Ved å starte med gjærcelle-sedimenter ble fettsyre-metylestere (FAME) fremstilt ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimenter inkubert i én time ved 80°C sammen med 2 ml 1N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) av dimetoksypropan. FAME ble ekstrahert to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene vasket i hvert tilfelle én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-faser tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl av PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gasskromatograf utstyrt med flamme-ionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analyse var som følger: ovnstemperaturen ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 min ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet i for eksempel Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 51: Funksjonell karakterisering av pAt60 og pAt70
Substratspesifisiteten til henholdsvis elongasene At3g06460 og At3g06470 ble bestemt, fulgt av ekspresjon og mating av forskjellige fettsyrer (Tab.17, Fig.26).
Substratene matet kan detekteres i all den transgene gjær. Den transgene gjær viste syntese av nye fettsyrer, produktene fra henholdsvis genene At3g06460 og At3g06470. Dette betyr at disse gener ble uttrykt funksjonelt.
Tabell 17: Forlengelse av EPA av henholdsvis elongasene At3g06460 og At3g06470. Analyse av gjærekstrakter etter mating med 250 uM EPA.
Figur 26 viser forlengelsen av 20:5n-3 av elongasen At3g06470.
Eksempel 52: Kloning av en elongase fra Phaeodactylum tricornutum
Ved å starte fra konserverte regioner i proteinsekvensene ved hjelp av elongasegenene med Δ6-elongase-aktivitet angitt i søknaden, ble degenererte primere dannet og disse primere ble anvendt for screening av et Phaeodactylum cDNA-bibliotek ved hjelp av PCR. De følgende primersekvenser ble anvendt:
Nukleotid-baser i parentes betyr at en blanding av oligonukleotider med i hvert tilfelle den ene eller den andre nukleotid-base til stede.
Fremstilling av Phaeodactylum cDNA-bibliotek:
En 2 l kultur av P. tricornutum UTEX 646 ble dyrket i f/2-medium (Guillard, R.R.L.1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. I Culture of Marine Invertebrate Animals (Ed. Smith, W.L. og Chanley, M.H.), Plenum Press, New York, s. 29-60) i 14 dager med en lysintensitet på 35 E/cm<2>. Etter sentrifugering ble frosne celler malt til et fint pulver i nærvær av flytende nitrogen og resuspendert i 2 ml homogeniseringsbuffer (0,33 M sorbitol 0,3 M, NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 2% SDS, 2% merkaptoetanol i 0,2 M Tris-Cl pH 8,5). Etter tilsetning av 4 ml fenol og 2 ml kloroform ble blandingen ristet kraftig i 15 minutter ved 45-50°C. Den ble deretter sentrifugert (10 min × 10000 g) og den vandige fasen ble ekstrahert trinnvis ved anvendelse av kloroform. Nukleinsyrer ble deretter utfelt ved tilsetning av 1/20 volum av 4 M natriumhydrogenkarbonat-løsning og sentrifugert. Pelleten ble tatt opp i 80 mM Tris-borat pH 7,0 og 1 mM EDTA og RNA ble utfelt med 8 M litiumklorid. Etter sentrifugering og vasking med 70% etanol, ble RNA-pellet tatt opp i RNase-fritt vann. Poly(A)-RNA ble isolert med Dynabeads (Dynal, Oslo, Norge) ved å følge produsentens instruksjoner og første-tråd cDNA-syntese ble utført ved anvendelse av MLV-Rtase fra Roche (Mannheim). Den andre-tråd syntese ble deretter utført ved hjelp av DNA polymerase I og Klenow fragment, fulgt av RNase H fordøyelse. cDNA ble behandlet med T4 DNA polymerase og EcoRI/XhoI adaptere (Pharmacia, Freiburg) ble deretter tilknyttet ved hjelp av T4 ligase. Etter XhoI-fordøyelse, fosforylering og gelseparering, ble fragmenter større enn 300 bp ligert inn i fag lambda ZAP Express ved å følge produsentens instruksjoner (Stratagene, Amsterdam, Nederland). Etter masseeksisjon av cDNA-biblioteket og plasmidgjenvinning ble plasmidbiblioteket transformert i E. coli DH10B-celler og anvendt for PCR-screening.
Ved anvendelse av de ovennevnte degenererte primere, var det mulig å danne PCR-fragmentet med SEKV ID NR: 187.
Dette fragmentet ble merket med digoxigenin (Roche, Mannheim) og anvendt som probe for screening av fag-biblioteket.
Ved anvendelse av sekvensen SEKV ID NR: 187 ble det mulig å oppnå gensekvensen SEKV ID NR: 183, som utgjør full-lengde RNA-molekylet av Phaeodactylum
Δ6-elongase:
Eksempel 53: Kloning av ekspresjonsplasmider for heterolog ekspresjon i gjær
Det aktuelle primer-par ble valgt på en slik måte at de bar gjær konsensussekvens for meget effektiv translasjon (Kozak, Cell 1986, 44:283-292) ved siden av startkodonet.
PtELO6 DNA ble amplifisert med i hvert tilfelle 1 µl av cDNA, 200 µM dNTPs, 2,5 U av Advantage polymerase og 100 pmol av hver primer i et totalt volum på 50 µl. PCR-betingelsene var som følger: først denaturering ved 95°C i 5 minutter, fulgt av 30 cykler ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter og et siste elongeringstrinn ved 72°C i 10 minutter.
De følgende oligonukleotider ble anvendt for PCR-reaksjonen for kloning av sekvensen for heterolog ekspresjon i gjær:
*F=forover primer, R=revers primer
PCR-produktene ble inkubert i 30 minutter ved 21°C med gjær-ekspresjonsvektor pYES2.1-TOPO (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner. PCR-produktet (se SEKV ID NR: 192) ble ligert inn i vektoren ved hjelp av et T-overheng og aktiviteten til en topoisomerase (Invitrogen). Etter inkuberingen ble E. coli DH5 α celler transformert. Egnede kloner ble identifisert ved PCR, plasmid DNA ble isolert ved hjelp av Qiagen DNAeasy sett og verifisert ved sekvensering. Den korrekte sekvens ble deretter transformert til Saccharomyces stamme INVSc1 (Invitrogen) ved elektroporering (1500 V). Som en kontroll ble blank vektor pYES2.1 transformert parallelt. Deretter ble gjæren platet ut på minimal ”dropout” uracil-medium supplert med 2% glukose. Celler som var i stand til å vokse i mediet uten uracil omfatter således de tilsvarende plasmider pYES2.1 og pYES2.1-PtELO6. Etter seleksjonen ble i hvert tilfelle to transformanter valgt for ytterligere funksjonell ekspresjon.
Eksempel 54: Kloning av ekspresjonsplasmider for formålet frø-spesifikk ekspresjon i planter
For å transformere planter ble en ytterligere transformasjonsvektor basert på pSUN-USP dannet. For dette formål ble NotI spaltningsseter innført ved 5’- og 3’-ender av den kodende sekvensen, ved anvendelse av det følgende primer-par:
PSUN-PtELO6
Forover: 5‘-GCGGCCGCACCATGATGGTACCTTCAAGTTA (SEKV ID NR: 190) Revers: 3‘-GAAGACAGCTTAATAGGCGGCCGC (SEKV ID NR: 191)
Sammensetning av PCR-blanding (50 μl):
5,00 μl templat cDNA
5,00 μl 10 x buffer (Advantage polymerase)+ 25 mM MgCl2
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl pr. primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage polymerase
Advantage polymerase fra Clontech ble anvendt.
PCR-reaksjonsbetingelser:
Hybridiseringstemperatur: 1 minutt ved 55°C
Denatureringstemperatur: 1 minutt ved 94°C
Forlengelsestemperatur: 2 minutter ved 72°C
Antall cykler: 35
PCR-produktene ble inkubert i 16 timer ved 37°C med restriksjonsenzymet NotI. Plante-ekspresjonsvektor pSUN300-USP ble inkubert på samme måte. Deretter ble PCR-produktene og 7624 bp vektoren separert ved agarosegelelektroforese og de tilsvarende DNA-fragmenter ble tatt ut. DNA ble renset ved hjelp av Qiagen gelrensningssett ved å følge produsentens instruksjoner. Deretter ble vektor og PCR-produkter ligert. Rapid ligeringssett fra Roche ble anvendt for dette formål. Det resulterende plasmid pSUN-PtELO ble verifisert ved sekvensering.
pSUN300 er et derivat av plasmid pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP stammet fra pSUN300, ved insersjon av en USP-promoter som EcoRI-fragment i pSUN300.
Polyadenyleringssignalet er det av octopin-syntase-gen fra A. tumefaciens Ti plasmid (ocs-terminator, Genbank aksesjon V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. og Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet.1 (6), 499-511 (1982). USP-promoteren svarer til nukleotider 1-684 (Genbank aksesjon X56240), hvor del av den ikke-kodende region av USP-genet er til stede i promoteren. Promoterfragmentet som er 684 basepar i størrelse ble amplifisert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige T7 standard primere (Stratagene) og ved hjelp av en syntetisert primer via en PCR-reaksjon ved å følge standard metoder.
(Primer-sekvens: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’; SEKV ID NR: 151).
PCR-fragmentet ble kuttet igjen med EcoRI/SalI og innført i vektoren pSUN300 med OCS-terminator. Dette ga opphav til plasmidet med navnet pSUN-USP.
Konstruksjonen ble anvendt for transformasjon av Arabidopsis thaliana, raps, tobakk og linfrø.
Lipid-ekstraksjon fra gjær og frø var som beskrevet i Eksempel 6.
Eksempel 55: Ekspresjon av PtElo i gjær
Gjær som var transformert med plasmidene pYES2 og pYES2-PtELO6 som beskrevet i Eksempel 4 ble analysert som følger:
Gjærcellene fra hovedkulturene ble høstet ved sentrifugering (100 × g, 5 min, 20°C) og vasket med 100 mM NaHCO3, pH 8,0 for å fjerne gjenværende medium og fettsyrer. Ved å starte med gjærcelle-sedimentene ble fettsyre-metylesterene (FAME) fremstilt ved sur metanolyse. For dette formål ble cellesedimentene inkubert i én time ved 80°C sammen med 2 ml 1N metanolisk svovelsyre og 2% (volum/volum) dimetoksypropan.
FAME ble ekstrahert to ganger med petroleter (PE). For å fjerne ikke-derivatiserte fettsyrer ble de organiske fasene i hvert tilfelle vasket én gang med 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 og 2 ml destillert vann. Deretter ble PE-faser tørket med Na2SO4, inndampet under argon og tatt opp i 100 µl PE. Prøvene ble separert på en DB-23 kapillarkolonne (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) i en Hewlett-Packard 6850 gasskromatograf utstyrt med flammeionisasjonsdetektor. Betingelsene for GLC-analysen var som følger: ovnstemperatur ble programmert fra 50°C til 250°C med en hastighet på 5°C/min og til slutt 10 min ved 250°C (hold).
Signalene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstidene med tilsvarende fettsyre-standarder (Sigma). Metodologien er beskrevet i for eksempel Napier og Michaelson, 2001, Lipids.36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem.
Biophys.388(2):293-298 og Michaelson et al., 1998, FEBS Letters.439(3):215-218.
Eksempel 56: Funksjonell karakterisering av PtELO6:
Figur 29 viser omdannelse av C18:3<Δ6,9,12>og C18:4<Δ6,9,12,15>. Substratene blir forlenget med i hvert tilfelle to karbonatomer; henholdsvis fettsyrene C20:3<Δ8,11,14>og C20:4<Δ8,11,14,17>blir dannet. Substratspesifisiteten til PtELO6 ble bestemt etter ekspresjon og mating av forskjellige fettsyrer (Fig.30). Store mengder av substratene matet kan detekteres i all den transgene gjær. Den transgene gjær viser syntese av nye fettsyrer, produktene fra PtElo6-reaksjonen. Dette betyr at genet PtELO6 er uttrykt funksjonelt.
Tabell 18 viser at PtElo6 har en smal substrat-spesifisitet. PtELO6 var bare i stand til å forlenge C18-fettsyrene linolsyre, linolensyre, γ-linolensyre og stearidonsyre, men preferensielt stearidonsyre, som er ω3-desaturert (se også Figur 30).
Matingsforsøk: fettsyrer (med fet trykk) ble tilsatt med i hvert tilfelle 250 μm. Dannelse av de underliggende fettsyrer er ny.
Tabell 18: Substrat-spesifisitet av PtElo6
De følgende fettsyrer ble matet, men ikke omdannet:
● 18:1<Δ6>, 18:1<Δ9>, 18:1<Δ11>
● 20:2<Δ11,14>, 20:3<Δ11,14,17>, 20:3<Δ8,11,14>, 20:4<Δ5,8,11,14>, 20:5<Δ5,8,11,14,17>
● 22:4<Δ7,10,13,16>
Gjæren som var transformert med vektoren pYES2-PtELO6 ble dyrket i minimalt medium i nærvær av fettsyrene angitt. Fettsyre-metylesterene ble syntetisert ved å underkaste intakte celler for sur metanolyse. Deretter ble FAME analysert ved GLC. På denne måten ble resultatene som vist i Figurer 29 og 30 og i Tabell 16 oppnådd.
Ekvivalenter:
Mange ekvivalenter av de spesifikke utførelsesformer ifølge oppfinnelsen beskrevet her kan identifiseres eller finnes av en fagmann enkelt ved hjelp av rutinemessige forsøk. Disse ekvivalenter skal være innenfor omfanget av patentkravene.
n: ele
form av lse nde
anve d tve ne
ereg b le rb
ade sgr lse nne da m 0. t. O
10 ate t]* m e duk
ren ro [p t]+ ttsy fe tra bs av d /[su gra kt] du lses ne [pro
dan d]= m gra O
ses nel l3:
dan bel Ta [om

Claims (12)

  1. Patentkrav 1. Isolert nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid med Δ6-desaturaseaktivitet, som har a) en nukleinsyre med sekvensen vist i SEKV ID NR: 89, b) en nukleinsyre som, som resultatet av degenereringen av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 90, eller c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 89 som koder for polypeptider med minst 60% identitet på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 90 og som har Δ6-desaturaseaktivitet.
  2. 2. Aminosyresekvens som er kodet for av den isolerte nukleinsyre med en sekvens ifølge krav 1.
  3. 3. Genkonstruksjon omfattende den isolerte nukleinsyre ifølge krav 1 eller 2, hvor nukleinsyren er bundet operabelt med én eller flere regulatoriske signaler.
  4. 4. Genkonstruksjonen ifølge krav 3, hvor nukleinsyrekonstruksjonen omfatter ytterligere biosyntesegener fra fettsyre- eller lipidmetabolisme valgt fra gruppen acyl-CoA dehydrogenase(r), acyl-ACP [= acyl-bærer-protein] desaturase(r), acyl–ACP tioesterase(r), fettsyre-acyltransferase(r), acyl-CoA:lysofosfolipidacyltransferase(r), fettsyre-syntase(r), fettsyre-hydroksylase(r), acetyl-coenzym A-karboksylase(r), acyl–coenzym A-oksidase(r), fettsyre-desaturase(r), fettsyre-acetylenaser, lipoksygenaser, triacylglycerol-lipaser, allenoksid-syntaser, hydroperoksid-lyaser eller fettsyre-elongase(r).
  5. 5. Genkonstruksjonen ifølge krav 3 eller 4, hvor nukleinsyrekonstruksjonen omfatter ytterligere biosyntese-gener fra fettsyre- eller lipidmetabolisme valgt fra gruppen Δ4-desaturase, Δ5desaturase, Δ6-desaturase, Δ8-desaturase, Δ9-desaturase, Δ12-desaturase, Δ6-elongase eller Δ9-elongase.
  6. 6. Vektor omfattende en nukleinsyre ifølge krav 1 eller 2 eller en genkonstruksjon ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 5.
  7. 7. Transgen mikroorganisme eller transgen plante, omfattende minst én nukleinsyre ifølge krav 1, en genkonstruksjon ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 5 eller en vektor ifølge krav 6.
  8. 8. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I
    i transgene ikke-human organismer med et innhold på minst 1 vekt% av disse forbindelser basert på det totale lipidinnhold av den transgene ikke-humane organisme, som omfatter de følgende prosess trinn: a) innføring i organismen an minst én nukleinsyre med en sekvens som koder for en Δ6-desaturaseaktivitet og b) innføring i organismen an minst én nukleinsyre med en sekvens som koder for en Δ6-elongaseaktivitet og c) innføring i organismen an minst én nukleinsyre med en sekvens som koder for en Δ5-desaturaseaktivitet og d) innføring i organismen an minst én nukleinsyre med en sekvens som koder for en Δ5-elongaseaktivitet og e) innføring i organismen an minst én nukleinsyre med en sekvens som koder for en Δ4-desaturaseaktivitet og hvor variablene og substituentene i formel I har de følgende betydninger: R<1>= hydroksyl, coenzym A (tioester), lysofosfatidylcholin, lysofosfatidyletanolamin, lysofosfatidylglycerol, lysodifosfatidylglycerol, lysofosfatidylserin, lysofosfatidylinositol, sphingo-base eller en rest med formel II
    hvor R<2>= hydrogen, lysofosfatidylcholin, lysofosfatidyletanolamin, lysofosfatidylglycerol, lysodifosfatidylglycerol, lysofosfatidylserin, lysofosfatidylinositol eller mettet eller umettet C2-C24-alkylkarbonyl, R<3>= hydrogen, mettet eller umettet C2-C24-alkylkarbonyl eller R<2>og R<3>uavhengig av hverandre er en rest med formel Ia:
    hvor n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 9, m = 2, 3, 4, 5 eller 6 og p = 0 eller 3, hvor nukleinsyren med en sekvens som koder for polypeptidet med Δ6-desaturaseaktivitet, er valgt fra gruppen bestående av: a) en nukleinsyre med sekvensen vist i SEKV ID NR: 89, eller b) nukleinsyrer som, som resultatet av degenereringen av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 90, eller c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 89 som koder for polypeptider med minst 60% identitet på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 90 og som har Δ6-desaturaseaktivitet.
  9. 9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor en nukleinsyre med en sekvens som koder for polypeptider med ω3-desaturaseaktivitet, valgt fra gruppen bestående av: a) en nukleinsyre med sekvensen vist i SEKV ID NR: 87 eller SEKV ID NR: 105, eller b) nukleinsyrer som, som resultatet av degenereringen av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 88 eller SEKV ID NR: 106, eller c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 87 eller SEKV ID NR: 105 som koder for polypeptider med minst 60% identitet på aminosyrenivå med SEKV ID NR: 88 eller SEKV ID NR: 106 og som har ω3-desaturaseaktivitet, i tillegg er innført i organismen.
  10. 10. Fremgangsmåte ifølge krav 8 eller 9, hvor en nukleinsyre med en sekvens som koder for polypeptider med Δ12-desaturaseaktivitet, valgt fra gruppen bestående av: a) en nukleinsyre med sekvensen vist i SEKV ID NR: 107 eller SEKV ID NR: 109, eller b) nukleinsyrer som, som resultatet av degenereringen av den genetiske kode, kan avledes fra aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR: 108 eller SEKV ID NR: 110, eller c) derivater av nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR: 107 eller SEKV ID NR: 109 som koder for polypeptider med minst 60% identitet på aminosyrenivået med SEKV ID NR: 108 eller SEKV ID NR: 110 og som har Δ12-desaturaseaktivitet i tillegg er innført i organismen.
  11. 11. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 8 til 10, hvor den transgene ikke-humane organisme er en transgen mikroorganisme eller en transgen plante.
  12. 12. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 8 til 11, hvor forbindelsene med den generelle formel I blir isolert fra organismen i form av deres oljer, lipider eller fri fettsyrer.
NO20181488A 2003-08-01 2018-11-21 Isolert nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid med 6-desaturaseaktivitet, genkonstrukjon omfattende den isolerte nukleinsyre, vektor omfattende nukleinsyren eller genkonstruksjonen, transgen oljefrøplante omfattende samme samt fremgangsmåte for fremstilling av slike forbindelser. NO345029B1 (no)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10335992 2003-08-01
DE10344557 2003-09-24
DE10347869 2003-10-10
DE10359593 2003-12-18
DE102004009457 2004-02-27
DE102004012370 2004-03-13
DE102004024014 2004-05-14
PCT/EP2004/007957 WO2005012316A2 (de) 2003-08-01 2004-07-16 Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20181488A1 true NO20181488A1 (no) 2006-02-24
NO345029B1 NO345029B1 (no) 2020-08-24

Family

ID=34120175

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20210501A NO347177B1 (no) 2003-08-01 2004-07-16 Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer
NO20060316A NO344677B1 (no) 2003-08-01 2006-01-20 Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer, samt enfrøbladet eller tofrøbladet plante.
NO20181489A NO345030B1 (no) 2003-08-01 2018-11-21 Isolert nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid med Δ6-elongase- aktivitet, genkonstruksjon omfattende samme isolerte nukleinsyre, vektor omfattende samme isolerte nukleinsyre, transgen oljefrøplante omfattende samme samt fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser i transgene oljefrøplanter.
NO20181488A NO345029B1 (no) 2003-08-01 2018-11-21 Isolert nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid med 6-desaturaseaktivitet, genkonstrukjon omfattende den isolerte nukleinsyre, vektor omfattende nukleinsyren eller genkonstruksjonen, transgen oljefrøplante omfattende samme samt fremgangsmåte for fremstilling av slike forbindelser.
NO20200156A NO345659B1 (no) 2003-08-01 2020-02-06 Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer samt enfrøbladet eller tofrøbladet plante uttrykkende tilsvarende aktivitet.

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20210501A NO347177B1 (no) 2003-08-01 2004-07-16 Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer
NO20060316A NO344677B1 (no) 2003-08-01 2006-01-20 Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer, samt enfrøbladet eller tofrøbladet plante.
NO20181489A NO345030B1 (no) 2003-08-01 2018-11-21 Isolert nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid med Δ6-elongase- aktivitet, genkonstruksjon omfattende samme isolerte nukleinsyre, vektor omfattende samme isolerte nukleinsyre, transgen oljefrøplante omfattende samme samt fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser i transgene oljefrøplanter.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20200156A NO345659B1 (no) 2003-08-01 2020-02-06 Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer samt enfrøbladet eller tofrøbladet plante uttrykkende tilsvarende aktivitet.

Country Status (13)

Country Link
US (3) US9433228B2 (no)
EP (12) EP2166068B1 (no)
JP (6) JP5031366B2 (no)
CN (1) CN1860211B (no)
BR (1) BRPI0413073A (no)
CA (3) CA2998666C (no)
DK (1) DK1654344T3 (no)
ES (3) ES2590077T3 (no)
IL (1) IL172847A (no)
MX (5) MX347962B (no)
NO (5) NO347177B1 (no)
PT (2) PT2172536T (no)
WO (1) WO2005012316A2 (no)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX347962B (es) * 2003-08-01 2017-05-19 Basf Plant Science Gmbh * Metodo para la produccion de acidos grasos poli-insaturados en organismos transgenicos.
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
DK1656449T3 (da) * 2003-08-21 2009-06-02 Monsanto Technology Llc Fedtsyredesaturaser fra primula
CA2556336C (en) * 2004-02-17 2015-09-08 The University Of York Desaturase enzymes
ES2421440T3 (es) * 2004-02-27 2013-09-02 Basf Plant Science Gmbh Método para preparar ácidos grasos poliinsaturados en plantas transgénicas
AU2005217080B2 (en) 2004-02-27 2011-02-24 Basf Plant Science Gmbh Method for producing unsaturated omega-3 fatty acids in transgenic organisms
AU2005217079C1 (en) * 2004-02-27 2016-02-04 Basf Plant Science Gmbh Method for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic plants
AU2005235081B2 (en) 2004-04-16 2011-06-16 Monsanto Technology Llc Expression of fatty acid desaturases in corn
CA2563875C (en) 2004-04-22 2015-06-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
ES2529572T3 (es) 2004-04-22 2015-02-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga por células recombinantes
US7256033B2 (en) 2004-06-25 2007-08-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
JP4587451B2 (ja) 2004-08-20 2010-11-24 サントリーホールディングス株式会社 ω３脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにそれらの利用
US7588931B2 (en) * 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
DE102004063326A1 (de) * 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
CN101321872B (zh) * 2005-05-23 2012-09-05 阿凯迪亚生物科学公司 高γ-亚麻酸红花
DE102005038036A1 (de) * 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
JP5123861B2 (ja) 2005-11-23 2013-01-23 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー Δ９エロンガーゼおよびそれらの多価不飽和脂肪酸製造における使用
US7723574B2 (en) 2005-11-24 2010-05-25 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of Δ5-unsaturated fatty acids in transgenic organisms
JP4803584B2 (ja) * 2006-02-08 2011-10-26 独立行政法人産業技術総合研究所 脂質生産性の高い形質転換微生物
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US7465793B2 (en) * 2006-04-20 2008-12-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Synthetic Δ17 desaturase derived from Phytophthora ramourum and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7695950B2 (en) * 2006-05-17 2010-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7678560B2 (en) * 2006-05-17 2010-03-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ 5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
WO2008022963A2 (en) * 2006-08-24 2008-02-28 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
AU2013202498B2 (en) * 2006-08-24 2015-04-30 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel Pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
CN101578363A (zh) 2006-08-29 2009-11-11 联邦科学技术研究组织 脂肪酸的合成
US8710299B2 (en) * 2006-10-06 2014-04-29 Basf Plant Science Gmbh Processes for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
AU2013273704C1 (en) * 2006-10-06 2023-03-16 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US20110016581A1 (en) 2006-10-23 2011-01-20 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
WO2008073275A2 (en) 2006-12-07 2008-06-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mutant delta-8 desaturase genes engineered by targeted mutagensis and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7709239B2 (en) 2006-12-07 2010-05-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mutant Δ8 desaturase genes engineered by targeted mutagenesis and their use in making polyunsaturated fatty acids
CA2673940C (en) * 2007-01-03 2015-11-03 Monsanto Technology Llc Food compositions incorporating additional long chain fatty acids
BRPI0806354A2 (pt) * 2007-02-12 2011-09-06 Du Pont plantas oleaginosas transgências, sementes, óleos, produtos alimentìcios ou análogos a alimento, produtos alimentìcios medicinais ou análogos alimentìcios medicinais, produtos farmacêuticos, bebidas fórmulas para bebês, suplementos nutricionais, rações para animais domésticos, alimentos para aquacultura, rações animais, produtos de sementes inteiras, produtos de óleos misturados, produtos, subprodutos e subprodutos parcialmente processados
RS20090413A (en) * 2007-04-03 2010-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Multizymes and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8119860B2 (en) * 2007-04-16 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
CN101827934B (zh) 2007-07-13 2014-02-26 帝斯曼营养品股份公司 D4去饱和酶和d5延伸酶
CA2695112A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Basf Plant Science Gmbh Elongases and processes for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US20090110800A1 (en) * 2007-10-24 2009-04-30 Wilkes Richard S Food compositions incorporating additional long chain fatty acids
JP2011519552A (ja) * 2008-04-25 2011-07-14 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー 植物種子油
ES2334744B1 (es) * 2008-07-11 2011-04-06 Zurko Research S.L. Procedimiento enzimatico para la obtencion del acido docosahexaenoicoomega-3 y del acido docosapentaenoico omega-6, a partir de aceites vegetales, y sus productos.
AU2009286755B2 (en) * 2008-08-26 2015-10-22 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
CN102197047B (zh) * 2008-09-19 2014-07-09 纳幕尔杜邦公司 突变的δ5去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
US8809559B2 (en) 2008-11-18 2014-08-19 Commonwelath Scientific And Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
AU2015224521B2 (en) * 2008-11-18 2017-09-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
WO2010101220A1 (ja) * 2009-03-04 2010-09-10 国立大学法人九州大学 新規酵素及びそれをコードするｄｎａ
CA2760326A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
DE112010002353T5 (de) 2009-06-08 2012-08-09 Basf Plant Science Company Gmbh Neue fettsäure-elongations-komponenten und anwenduingen davon
DE112010002967T5 (de) 2009-07-17 2012-10-11 Basf Plant Science Company Gmbh Neue Fettsäuredesaturasen und -elongasen und Anwendungen davon
CN102597245A (zh) 2009-08-31 2012-07-18 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱和脂肪酸合成的调节性核酸分子
KR20130026411A (en) 2009-09-24 2013-03-13 Univ Kyushu Nat Univ Corp Method for transforming stramenopile
EP2504427B1 (en) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturase and uses thereof
US9347049B2 (en) 2009-11-24 2016-05-24 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid elongase and uses thereof
NO2585603T3 (no) 2010-06-25 2018-05-19
BR112013004356A2 (pt) 2010-08-26 2017-06-27 Du Pont polinucleotídeo isolado, polipeptídeo mutante, constructo recombinante, célula transformada, método para produção de um ácido graxo poli-insaturado, óleo microbiano e célula hospedeira microbiana recombinante.
CN103249834B (zh) 2010-08-26 2016-10-26 纳幕尔杜邦公司 生产高水平二十碳五烯酸的重组微生物宿主细胞
WO2012052468A2 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses therof
CN102191257A (zh) * 2011-04-04 2011-09-21 山东农业大学 马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆及其应用
EP2836599B1 (en) 2012-04-12 2019-11-06 Rothamsted Research Limited Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
PL2861059T3 (pl) 2012-06-15 2017-10-31 Commw Scient Ind Res Org Wytwarzanie długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w komórkach roślinnych
WO2014020533A2 (en) * 2012-08-03 2014-02-06 Basf Plant Science Company Gmbh Novel enzymes, enzyme components and uses thereof
GB201217524D0 (en) * 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
US9309523B2 (en) 2012-12-05 2016-04-12 Exxonmobil Research And Engineering Company Nannochloropsis kozak consensus sequence
CN103173445B (zh) * 2013-04-15 2014-07-30 南京江辉生物科技有限公司 一种欧米伽3的合成基因、含有合成基因的大肠菌及其构建方法
JP2014212732A (ja) * 2013-04-25 2014-11-17 旭硝子株式会社 リシノール酸産生酵母
US10731169B2 (en) 2013-07-05 2020-08-04 Basf Plant Science Company Gmbh Gene expression or activity enhancing elements
KR102535223B1 (ko) 2013-12-18 2023-05-30 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질
AU2014369229A1 (en) 2013-12-18 2016-06-09 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
CN105219789B (zh) 2014-06-27 2023-04-07 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质
CA2967708A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Basf Plant Science Company Gmbh Materials and methods for pufa production, and pufa-containing compositions
US10513718B2 (en) 2017-06-06 2019-12-24 City University Of Hong Kong Method of producing polyunsaturated fatty acid
CN110373436B (zh) * 2018-12-11 2022-09-23 山东理工大学 一种产双高-γ-亚麻酸卷枝毛霉细胞工厂的构建方法及发酵技术
US20220127630A1 (en) 2019-02-14 2022-04-28 Cargill, Incorporated Brassica Plants Producing Elevated Levels of Polyunsaturated Fatty Acids
CN110334869A (zh) * 2019-08-15 2019-10-15 重庆大学 一种基于动态群优化算法的红树林生态健康预测训练方法
AU2021373697A1 (en) 2020-11-04 2023-06-08 Basf Plant Science Company Gmbh Harvest management
AU2022246152A1 (en) 2021-03-25 2023-10-05 Basf Plant Science Company Gmbh Fertilizer management
WO2023196923A1 (en) * 2022-04-07 2023-10-12 Checkerspot, Inc. Ricinoleate oil production and uses thereof

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
JPH0714349B2 (ja) 1983-01-17 1995-02-22 モンサント カンパニ− 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
DK162399C (da) 1986-01-28 1992-03-23 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5110728A (en) 1986-07-31 1992-05-05 Calgene, Inc. Acyl carrier protein - DNA sequence and synthesis
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
CA1341467C (en) 1988-07-29 2004-12-07 John C. Rogers Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
DE3843628A1 (de) 1988-12-21 1990-07-05 Inst Genbiologische Forschung Wundinduzierbare und kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation
HU218717B (hu) 1989-03-17 2000-11-28 E. I. Du Pont De Nemours And Co. Nukleinsav-termelést fokozó növényi eredetű génfragmentek és eljárás előállításukra
ATE241007T1 (de) 1990-03-16 2003-06-15 Calgene Llc Dnas, die für pflanzliche desaturasen kodieren und deren anwendungen
ATE205530T1 (de) 1990-03-16 2001-09-15 Calgene Llc Neue sequenzen vorzugsweise exprimiert während der frühen keimentwicklung und darauf bezogene methoden
US5187267A (en) 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
WO1993020216A1 (en) 1991-02-22 1993-10-14 University Technologies International, Inc. Oil-body protein cis-elements as regulatory signals
AU669478B2 (en) 1991-04-09 1996-06-13 Unilever Plc Plant promoter involved in controlling lipid biosynthesis in seeds
PH31293A (en) 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
AU675923B2 (en) 1991-12-04 1997-02-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fatty acid desaturase genes from plants
CA2084348A1 (en) 1991-12-31 1993-07-01 David F. Hildebrand Fatty acid alteration by a d9 desaturase in transgenic plant tissue
DE4208050A1 (de) 1992-03-13 1993-09-23 Bayer Ag Azolylmethyl-fluorcyclopropyl-derivate
CA2092069A1 (en) 1992-03-27 1993-09-28 Asako Iida An expression plasmid for seeds
EP0637339B1 (en) 1992-04-13 2001-10-31 Syngenta Limited Dna constructs and plants incorporating them
JPH0662870A (ja) 1992-08-18 1994-03-08 Mitsui Giyousai Shokubutsu Bio Kenkyusho:Kk 大豆ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び５’非翻訳領域
WO1994011516A1 (en) 1992-11-17 1994-05-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US7205457B1 (en) 1993-02-05 2007-04-17 Monsanto Technology Llc Altered linolenic and linoleic acid content in plants
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
AU691550B2 (en) 1993-12-09 1998-05-21 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
ES2222462T3 (es) 1993-12-28 2005-02-01 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Gen que codifica acido graso-desaturasa, vector que contiene dicho gen, planta que contiene dicho gen transferido a ella y procedimiento para crear dicha planta.
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US6310194B1 (en) 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
GB9421286D0 (en) 1994-10-21 1994-12-07 Danisco Promoter
US5689040A (en) 1995-02-23 1997-11-18 The Regents Of The University Of California Plant promoter sequences useful for gene expression in seeds and seedlings
JP4424756B2 (ja) 1995-07-05 2010-03-03 サッポロビール株式会社 組織特異的プロモーターを用いたトランスジェニック植物およびその作出方法
CA2225652C (en) 1995-08-10 2007-11-20 Pal Maliga Nuclear-encoded transcription system in plastids of higher plants
ATE520302T1 (de) 1995-12-14 2011-09-15 Cargill Inc Pflanzen mit mutierten sequenzen, welche einen veränderten fettsäuregehalt vermitteln
EP0794250A1 (en) 1996-03-04 1997-09-10 Soremartec S.A. Isolation and sequencing of the hazel FAd2-N gene
DE19626564A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Hoechst Ag Genetische Transformation von Ciliatenzellen durch Microcarrier-Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln
US5981841A (en) 1996-08-30 1999-11-09 Monsanto Company Early seed 5' regulatory sequence
US6194167B1 (en) 1997-02-18 2001-02-27 Washington State University Research Foundation ω-3 fatty acid desaturase
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
NZ337459A (en) 1997-04-11 2000-07-28 Abbott Lab Nucleic acid construct in plants and dietary supplement
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
JP3923144B2 (ja) * 1997-07-31 2007-05-30 大日本印刷株式会社 ホログラム作成方法
WO1999016890A2 (en) 1997-09-30 1999-04-08 The Regents Of The University Of California Production of proteins in plant seeds
GB9724783D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
JP4378452B2 (ja) * 1998-02-09 2009-12-09 豊博 小林 ホログラム構成物
TR200002503T2 (tr) 1998-03-11 2000-12-21 Novartis Ag Yeni bitki plastid promotör sekansı
WO1999064614A2 (en) 1998-06-12 1999-12-16 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
AU4564399A (en) 1998-06-12 1999-12-30 Abbott Laboratories Polyunsaturated fatty acids in plants
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US20030163845A1 (en) 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
EP1121150A4 (en) 1998-10-09 2003-06-04 Merck & Co Inc DELAT 6 FATTY ACID DESATURASE
WO2000034439A1 (en) 1998-12-07 2000-06-15 Washington State University Research Foundation Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids
CA2365096A1 (en) * 1999-03-18 2000-09-21 The University Of Bristol Polyunsaturated fatty acid (pufa) elongase from caenorhabditis elegans
HUP0300081A3 (en) 2000-02-09 2005-11-28 Basf Ag Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids
JP3425622B2 (ja) * 2000-03-30 2003-07-14 独立行政法人産業技術総合研究所 ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
US20020045232A1 (en) 2000-05-09 2002-04-18 Xiao Qiu Production of conjugated linoleic and linolenic acids in plants
EP1322752B2 (en) 2000-09-28 2015-02-11 Bioriginal Food & Science Corp. Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, fatty acid desaturase family members and uses thereof
AU2002221404B2 (en) 2000-11-29 2008-01-03 Xenon Genetics Inc Human elongase genes and uses thereof
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
DE10102338A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
AU2002309482B2 (en) * 2001-01-25 2007-08-30 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
US7238851B2 (en) 2001-03-12 2007-07-03 The General Hospital Corporation Non-human transgenic mammals expressing an n-3 desaturase gene
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
US7045683B2 (en) 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
AU2002309856B2 (en) * 2001-05-14 2008-10-23 Dsm Ip Assets B.V. Production and use of a polar lipid-rich fraction containing omega-3 and/or omega-6 highly unsaturated fatty acids from microbes, genetically modified plant seeds and marine organisms
US7211656B2 (en) 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
AU2003258496A1 (en) 2002-07-03 2004-01-23 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of conjugated polyunsaturated fatty acids comprising at least two double bonds in plants
EP1576166B1 (en) 2002-12-19 2014-10-15 University Of Bristol Novel method for the production of polyunsaturated fatty acids
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
BRPI0407138A (pt) 2003-02-27 2006-01-10 Basf Plant Science Gmbh Sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácido, construção de gene, vetor, organismo transgênico não humano, processo para produzir ácidos graxos poliinsaturados, óleo, lipìdeo, ou um ácido graxo poliinsaturado ou uma fração dos mesmos, composições de óleo, de lipìdeos, ou de ácido graxo, e, uso do óleo, lipìdeos ou ácidos graxos ou de composições de óleo, de lipìdeos ou de ácido graxo
CA2520795C (en) 2003-03-31 2015-06-23 University Of Bristol Novel plant acyltransferases specific for long-chained, multiply unsaturated fatty acids
JP4732333B2 (ja) 2003-04-08 2011-07-27 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ−４−デサチュラーゼを発現する植物およびＰＵＦＡ含有油
MX347962B (es) 2003-08-01 2017-05-19 Basf Plant Science Gmbh * Metodo para la produccion de acidos grasos poli-insaturados en organismos transgenicos.
AU2005217079C1 (en) 2004-02-27 2016-02-04 Basf Plant Science Gmbh Method for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic plants
ES2421440T3 (es) 2004-02-27 2013-09-02 Basf Plant Science Gmbh Método para preparar ácidos grasos poliinsaturados en plantas transgénicas
AU2005217080B2 (en) 2004-02-27 2011-02-24 Basf Plant Science Gmbh Method for producing unsaturated omega-3 fatty acids in transgenic organisms
CA2563875C (en) 2004-04-22 2015-06-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
DE102004060340A1 (de) 2004-07-16 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
KR200414237Y1 (ko) * 2006-02-06 2006-04-17 주식회사 스토리오브 카메라의 보케 효과용 외부 필터
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
JP2011519552A (ja) 2008-04-25 2011-07-14 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー 植物種子油
BRPI0911892A8 (pt) 2008-04-30 2018-06-26 Rothamsted Res Ltd polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, polipeptídeo e organismo não humano, transgênico, e uso dos mesmos, processo de geração de um polipeptídio com atividade de desaturase ou elongase, anticorpo e processo para a produção de uma composição de óleo, lipídio ou ácido graxo
US8809559B2 (en) 2008-11-18 2014-08-19 Commonwelath Scientific And Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
DE112010002353T5 (de) 2009-06-08 2012-08-09 Basf Plant Science Company Gmbh Neue fettsäure-elongations-komponenten und anwenduingen davon
DE112010002967T5 (de) 2009-07-17 2012-10-11 Basf Plant Science Company Gmbh Neue Fettsäuredesaturasen und -elongasen und Anwendungen davon
KR102400332B1 (ko) 2013-09-25 2022-05-20 바스프 에스이 정제 화학약품의 개선된 생산을 위한 재조합 미생물
MY193287A (en) 2013-12-13 2022-09-30 Basf Se Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals
JP6672162B2 (ja) 2014-03-19 2020-03-25 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 発酵のための炭水化物の制限的供給を伴うグリセロールの使用
CN105219789B (zh) 2014-06-27 2023-04-07 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质
CA2978228A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 Basf Se Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals
BR112017025923A2 (pt) 2015-06-04 2018-08-14 Basf Se molécula de ácido nucleico recombinante, molécula de aminoácido recombinante, construto de expressão recombinante, vetor recombinante, micro-organismo recombinante, composição, métodos para produção de um micro-organismo recombinante e para cultivo e crescimento de um micro-organismo geneticamente modificado, uso de uma molécula de ácido nucleico recombinante, e, processo para produção fermentativa de um composto.
CN107690478B (zh) 2015-06-12 2023-02-03 巴斯夫欧洲公司 用于改善丙氨酸生产的重组微生物
JP6502442B2 (ja) * 2017-09-01 2019-04-17 株式会社長英 カメラ用フィルタ
JP2019105703A (ja) * 2017-12-12 2019-06-27 有限会社 高度技術研究所 位相差画像検査装置及び位相差画像検査方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEAUDOIN FREDERIC ET AL., "Heterologous reconstitution in yeast of the polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathway", Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, vol. 97, nr. 12, 2000, side 6421-6426, Dated: 01.01.0001 *
DREXLER HJÖRDIS ET AL., "Metabolic engineering of fatty acids for breeding of new oilseed crops: strategies, problems and first results", Journal of Plant Physiology, vol. 160, nr. 7, 2003, side 779-802, Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
NO20181489A1 (no) 2006-02-24
EP2166089A2 (de) 2010-03-24
JP5985464B2 (ja) 2016-09-06
CA3037924A1 (en) 2005-02-10
CA2533613A1 (en) 2005-02-10
EP2166071A2 (de) 2010-03-24
NO345030B1 (no) 2020-08-24
JP2020089368A (ja) 2020-06-11
EP2166090A2 (de) 2010-03-24
EP2169052A2 (de) 2010-03-31
US20170016015A1 (en) 2017-01-19
CA2533613C (en) 2020-03-10
EP2172536A3 (de) 2010-06-30
CN1860211A (zh) 2006-11-08
EP2166070A3 (de) 2010-06-02
CA2998666A1 (en) 2005-02-10
US9433228B2 (en) 2016-09-06
EP2166069A3 (de) 2010-06-02
ES2713548T3 (es) 2019-05-22
EP2166068A3 (de) 2010-06-02
ES2583205T3 (es) 2016-09-19
EP2166069B1 (de) 2016-06-08
JP2014128269A (ja) 2014-07-10
JP2018198598A (ja) 2018-12-20
EP2172536B1 (de) 2016-05-04
EP2166090A3 (de) 2010-06-02
EP2166068A2 (de) 2010-03-24
NO347177B1 (no) 2023-06-19
JP2007500504A (ja) 2007-01-18
JP2016220683A (ja) 2016-12-28
MX342029B (es) 2016-09-12
NO345029B1 (no) 2020-08-24
US20190323024A1 (en) 2019-10-24
EP2169053A3 (de) 2010-06-02
US20080155705A1 (en) 2008-06-26
IL172847A (en) 2012-03-29
JP2011087578A (ja) 2011-05-06
PT2166069T (pt) 2016-09-13
IL172847A0 (en) 2006-06-11
WO2005012316A3 (de) 2005-10-06
NO345659B1 (no) 2021-06-07
MX342500B (es) 2016-10-03
NO20200156A1 (no) 2006-02-24
EP2169053A2 (de) 2010-03-31
CN1860211B (zh) 2010-08-04
EP2166071A3 (de) 2010-06-02
EP2166089B1 (de) 2015-07-01
EP2166067A2 (de) 2010-03-24
EP2166090B1 (de) 2015-07-01
JP5031366B2 (ja) 2012-09-19
MX353906B (es) 2018-02-02
EP2169052A3 (de) 2010-06-09
US11180769B2 (en) 2021-11-23
BRPI0413073A (pt) 2006-10-03
MXPA06001042A (es) 2007-10-18
EP2166089A3 (de) 2010-06-02
ES2590077T3 (es) 2016-11-18
EP2166069B2 (de) 2024-01-24
JP6744362B2 (ja) 2020-08-19
EP2166068B1 (de) 2016-01-06
JP7011674B2 (ja) 2022-02-10
EP2166067A3 (de) 2010-06-09
EP2169052B1 (de) 2016-01-06
EP1654344B1 (de) 2018-10-17
EP1654344A2 (de) 2006-05-10
WO2005012316A2 (de) 2005-02-10
EP3395945A1 (de) 2018-10-31
EP2166070A2 (de) 2010-03-24
MX347962B (es) 2017-05-19
JP6404268B2 (ja) 2018-10-10
EP2169053B1 (de) 2015-09-09
NO20210501A1 (no) 2006-02-24
NO344677B1 (no) 2020-03-02
NO20060316L (no) 2006-02-24
EP2166070B1 (de) 2015-09-16
PT2172536T (pt) 2016-08-17
EP2166071B1 (de) 2016-01-06
EP2166069A2 (de) 2010-03-24
EP2172536A2 (de) 2010-04-07
CA2998666C (en) 2022-04-12
EP2166067B1 (de) 2015-07-01
DK1654344T3 (en) 2019-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11180769B2 (en) Method for the production of multiple-unsaturated fatty acids in transgenic organisms
US9624477B2 (en) Method for producing unsaturated omega-3-fatty acids in transgenic organisms
US7842852B2 (en) Method for increasing the content of polyunsaturated long-chained fatty acids in transgenic organisms
US20080076166A1 (en) Method For Producing Polyunsaturated Fatty Acids In Transgenic Organisms
CA2723072A1 (en) Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
CA2744930A1 (en) Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US11952581B2 (en) Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms