WO2010101220A1 - 新規酵素及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

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WO2010101220A1
WO2010101220A1 PCT/JP2010/053557 JP2010053557W WO2010101220A1 WO 2010101220 A1 WO2010101220 A1 WO 2010101220A1 JP 2010053557 W JP2010053557 W JP 2010053557W WO 2010101220 A1 WO2010101220 A1 WO 2010101220A1
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WO
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activity
longase
enzyme
seq
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/053557
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
圭史 坂口
淳一朗 小原
信 伊東
裕司 沖田
Original Assignee
国立大学法人九州大学
日本水産株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a novel enzyme and DNA encoding the same. Specifically, the present invention relates to a novel enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity, and DNA encoding the same.
  • Polyunsaturated ⁇ 3-fatty acids and ⁇ 6-fatty acids are important components in animal and human nutrition.
  • Polyunsaturated long-chain ⁇ 3-fatty acids such as eicosapentaenoic acid (EPA) or docosahexaenoic acid (DHA,) are used in childhood brain development, eye function, synthesis of hormones and other signaling substances and cardiovascular disorders, cancer Because they play various roles in health aspects, including prevention of diabetes (see Non-Patent Document 1), they are important ingredients in human nutrition. For that reason, the production of polyunsaturated long chain fatty acids is needed.
  • ARA Arachidonic acid
  • Crypthecodinium genus Crypthecodinium
  • DHA produced by dinoflagellate
  • DHA produced by Schizochytrium ravirinchula
  • Non-Patent Document 4 a plurality of attempts to produce these polyunsaturated fatty acids in genetically modified plants have been reported (see Non-Patent Document 4). Specifically, it is an attempt to obtain a gene from an organism that produces polyunsaturated fatty acids and introduce it into oil plants such as rapeseed and soybean for expression.
  • genes derived from various organisms such as Phaeodactylum diatoms and Saprolegnia oocytes are acquired and introduced into plants in addition to the above-mentioned filamentous fungi and Labyrinthula.
  • the production volume is not always as expected. Therefore, in addition to the currently obtained genes, it is desired to obtain new genes having different properties from the conventional ones.
  • Labyrinthula has a property of accumulating a large amount of polyunsaturated fatty acids as described above, and therefore is extremely promising as a resource of genes related to lipid biosynthesis as well as oily microorganisms.
  • This is described in Non-Patent Document 4, ⁇ 4-desaturase derived from Schizochytrium aggregatum , ⁇ 4-desaturase derived from Thraustochytrium sp. ( Thraustochytrium sp.), ⁇ 5-desaturase, ⁇ 6-elongase (C18-elongase), lysosome It is also clear from the fact that genes such as phosphatidate acyltransferase were obtained and introduced into oil plants.
  • Elongase is an important enzyme that extends the chain length of fatty acids.
  • Elongase whose genes have been obtained from Labyrinthura so far, is an enzyme that acts only on polyunsaturated fatty acids of a certain chain length, and reports of Elongases that act on polyunsaturated fatty acids of multiple chain lengths There was no. If such an elongase could be obtained, it would be possible to construct a more efficient fatty acid biosynthetic pathway, and thus the acquisition of such an elongase was particularly desired.
  • JP 63-44891 A Japanese Unexamined Patent Publication No. Sho 63-12290
  • the host is cultured, and an enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity is collected from the culture, ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase It is an object of the present invention to provide a method for producing an enzyme having activity and / or ⁇ 5-longase activity.
  • the gist of the present invention is the contents described in the following (1) to (17).
  • the enzyme according to (2), wherein the microorganism belonging to the genus Thraustochytrium is Thraustochytrium sp. ATCC 26185.
  • A An enzyme having ⁇ 9-longase activity and ⁇ 6-longase activity represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing.
  • B An isoform of an enzyme having ⁇ 9-longase activity and ⁇ 6-longase activity represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • C In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the amino acid sequence, has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and has ⁇ 9-longase activity and ⁇ 6-longase activity enzyme.
  • the DNA according to (5) which is the DNA shown in the following (a), (b), (c), or (d).
  • (7) A vector comprising the DNA of (5) or (6).
  • (8) A host in which the vector of (7) is incorporated.
  • An enzyme having ⁇ 9-longase activity and ⁇ 6-longase activity characterized by culturing the host of (8) and collecting an enzyme having ⁇ 9-longase activity and ⁇ 6-longase activity from the culture. Manufacturing method.
  • A DNA represented by SEQ ID NO: 15 in Sequence Listing.
  • B DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • C encodes an enzyme having a base sequence having 80% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and ⁇ 5-longase activity DNA.
  • D DNA that hybridizes under stringent conditions with the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the Sequence Listing.
  • a vector comprising the DNA of (12) or (13).
  • a host of (15) above is cultured, and an enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and ⁇ 5-longase activity is collected from the culture, ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6
  • a method for producing an enzyme having an elongase activity and a ⁇ 5-elongase activity is obtained by the method described in (16) above.
  • a novel enzyme and a DNA encoding the same are provided. More specifically, an enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity derived from Labyrinthula, and DNA encoding the same are provided. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a vector containing a novel enzyme and a DNA encoding the same, and a host incorporating the vector. The host is cultured, and ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase from the culture.
  • a method for producing an enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity which comprises collecting an enzyme having activity and / or ⁇ 5-longase activity.
  • the electrophoretic diagram of the result of having performed PCR reaction with the primer TfELO2-F1 and TfELO2-R1 with respect to the genomic DNA of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 in Example 4 is shown.
  • the electrophoretic diagram of the result of having performed PCR reaction with the primer FJN-10 F HindIII / FJN-10 R XbaI and elo1 F HindIII / elo1 R XbaI on the cDNA library of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 in Example 5 is shown.
  • Example 5 PCR products obtained by using the oligonucleotide primers FJN-10 F HindIII / FJN- 10 R XbaI (Thraustochytrium sp.ATCC 26185 from ⁇ 6- elongase (TsElo2)) derived from Thraustochytrium sp. FJN-10 ⁇ 6 -Shows a comparison of Elongase sequences.
  • the base sequence of TsElo2 shown in FIG. 3 is shown in SEQ ID NO: 19, and the base sequence of TFD6 is shown in SEQ ID NO: 20, respectively.
  • Example 5 PCR products obtained by using the oligonucleotide primers FJN-10 F HindIII / FJN- 10 R XbaI (Thraustochytrium sp.ATCC 26185 from ⁇ 6- elongase (TsElo2)) derived from Thraustochytrium sp. FJN-10 ⁇ 6 -Shows commonly conserved motif parts when comparing Elongase sequences.
  • the amino acid sequence of TsElo2 shown in FIG. 4 is shown in SEQ ID NO: 21, and the amino acid sequence of TFD6 is shown in SEQ ID NO: 22, respectively.
  • Example 5 PCR products obtained by using the oligonucleotide primers elo1 F HindIII / elo1 R XbaI ( Thraustochytrium sp.ATCC 26185 from ⁇ 6- elongase (TsElo2)) and Thraustochytrium sp. FJN-10 derived ⁇ 6- elongase sequences The figure which compared was shown.
  • the base sequence of TsElo1 shown in FIG. 5 is shown in SEQ ID NO: 23, and the base sequence of TFD5 is shown in SEQ ID NO: 24, respectively.
  • Example 5 PCR products obtained by using the oligonucleotide primers elo1 F HindIII / elo1 R XbaI ( Thraustochytrium sp.ATCC 26185 from ⁇ 6- elongase (TsElo2)) and Thraustochytrium sp. FJN-10 derived ⁇ 6- elongase sequences
  • the motif parts that are conserved in common are shown.
  • the amino acid sequence of TsElo1 shown in FIG. 6 is shown in SEQ ID NO: 25, and the amino acid sequence of TFD5 is shown in SEQ ID NO: 26, respectively.
  • the electrophoretic diagram of the result of having performed PCR reaction with the primer FJN-10 F HindIII / FJN-10 R XbaI and elo1 F HindIII / elo1 R XbaI with respect to the genomic DNA library of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 in Example 5 is shown.
  • the molecular phylogenetic tree of ⁇ 6--longase (TsELO1, TsELO2) derived from Thraustochytrium sp. ATCC 26185 obtained in the present invention in Example 6 is shown.
  • stock which expressed TsELO1 by using budding yeast in Example 7 converted ALA into ETrA is shown.
  • stock which expressed TsELO1 in Example 7 used TsELO1 as the host converted LA into EDA is shown.
  • stock which expressed TsELO1 in Example 7 made saccharomyces cerevisiae convert STA into ETA is shown.
  • stock which expressed TsELO1 in budding yeast in Example 7 converted GLA into DGLA is shown.
  • stock which expressed TsELO1 in budding yeast in Example 7 converted EPA into DPA is shown.
  • stock which expressed TsELO1 in budding yeast in Example 7 converted AA into DTA is shown.
  • stock which expressed TsELO2 in Example 7 made TsELO2 into a host converted ALA into ETrA is shown.
  • stock which expressed TsELO2 in budding yeast in Example 7 converted STA into ETA is shown.
  • stock which expressed TsELO1 in budding yeast in Example 7 converted PA into VA is shown.
  • the present invention relates to an enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity derived from a microorganism belonging to Labyrinthula.
  • the “longase activity” in the present invention means an activity of extending the carbon chain of fatty acid or Fatty acyl-CoA.
  • the microorganisms belonging to Labyrinthula include Labyrinthula, Altornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Labyrinthuloides, Schizochytrium ( Schizochytrium), Thraustochytrium (Thraustochytrium), or Ulkenia (Ulkenia), a uranium tee Oki thorium genus (Aurantiochytrium) can be mentioned a microorganism preferably belongs to the genus Thraustochytrium (Thraustochytrium), particularly preferably Thraustochytrium sp. ATCC 26185 strain.
  • the novel enzyme of the present invention can also be prepared by a conventional method using genetic engineering techniques based on the base sequence information.
  • DNA encoding the enzyme an enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or 16
  • the enzyme of the present invention can be prepared by introducing DNA 15) into a suitable expression system. Among these, preparation by a gene recombination technique that can be prepared in a large amount by a relatively easy operation is preferable.
  • ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity consisting of an amino acid sequence of substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 16 in the sequence listing, and /
  • an enzyme having ⁇ 5-longase activity, or ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 16 in the sequence listing, and / or
  • the enzyme having ⁇ 5-longase activity is based on the information on the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 15 in the sequence listing showing an example of the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 16 in the sequence listing. Those skilled in the art can appropriately prepare or obtain these.
  • microorganisms can be obtained by PCR reaction using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 15 of the sequence listing as a primer, or by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence as a probe.
  • the DNA homolog can be isolated by screening under appropriate conditions.
  • An enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity encoded by the homologous DNA by cloning into the expression vector after cloning the full-length DNA of this homologous DNA Can be manufactured.
  • DNA (oligonucleotide) can be synthesized according to a conventional method using, for example, various commercially available DNA synthesizers.
  • the PCR reaction is performed using a thermal cycler GeneGeAmp PCR System 2400 manufactured by Applied Biosystems, TaqDNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the like. Can be carried out according to the standard method.
  • an enzyme having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity of the present invention can be combined with a marker protein and / or peptide tag to form a fusion protein.
  • the marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein. Specific examples include an enzyme such as alkaline phosphatase and HRP, an Fc region of an antibody, and a fluorescent substance such as GFP.
  • peptide tags known peptide tags such as epitope tags such as HA, FLAG, and Myc, and affinity tags such as GST, maltose-binding protein, biotinylated peptide, oligohistidine, etc. It can be illustrated.
  • Such a fusion protein can be prepared by a conventional method, and has the ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity of the present invention using the affinity between Ni-NTA and His tag. It is useful for purification of the protein and detection of the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention includes DNA represented by SEQ ID NO: 12 or 15 which is a DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 16 in the sequence listing, and DNA containing the base sequence Or an enzyme having a base sequence having 80% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 15 and having ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity And DNA that hybridizes with the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 15 under stringent conditions.
  • the DNA encoding an enzyme involved in ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity of the present invention is one or more unless the function of the encoded enzyme is impaired.
  • Such a DNA encoding an enzyme substantially the same as an enzyme having a function as an enzyme involved in ⁇ 9-longase activity, ⁇ 6-longase activity, and / or ⁇ 5-longase activity is obtained by, for example, site-directed mutagenesis. It can also be obtained by deleting, substituting, inserting or adding an amino acid at a specific site, or modifying the base sequence as an inversion.
  • the modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • DNA encoding substantially the same enzyme can be obtained from microorganisms, strains, mutants and varieties belonging to all Labyrinthulas, especially Thraustochytrium.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added means, for example, an amino acid in which any number of 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added Means an array.
  • base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted or added is, for example, any number of 1 to 5 bases substituted, deleted, inserted or added. Means the base sequence.
  • DNA (mutant DNA) having a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted, or added can be used for chemical synthesis, genetic engineering, mutagenesis, etc. as described above. It can also be made by any method known to those skilled in the art. Specifically, using a method of contacting a mutagen with a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 15 in the sequence listing, a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering method, etc. By introducing mutation into these DNAs, mutant DNAs can be obtained. Site-directed mutagenesis, which is one of genetic engineering methods, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position.
  • amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 16 in the sequence listing means that the homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 16 in the sequence listing is 80 If it is% or more, it is not particularly limited, and means, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • the homology is 50% or more, preferably 70% or more. 65 ° C., 1 ⁇ SSC solution (the composition of a 1-fold concentration SSC solution is the condition under which DNAs having the same DNA are hybridized and DNAs having lower homology are not hybridized with each other, or washing conditions for normal Southern hybridization , 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate), 0.1% SDS, or 0.1 ⁇ SSC, hybridizing at a salt concentration corresponding to 0.1% SDS.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions uses a nucleic acid such as DNA or RNA as a probe, and uses a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. Specifically, using a filter on which colony or plaque-derived DNA or a fragment of the DNA is immobilized, the DNA is high at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl. After hybridization, DNA that can be identified can be raised by washing the filter under conditions of 65 ° C. using an SSC solution of about 0.1 to 2 times.
  • DNA that can hybridize under stringent conditions can include DNA having a certain degree of homology with the base sequence of DNA used as a probe, for example, 80% or more, more preferably 90%. % Or more, more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more of the homologous DNA.
  • the method for obtaining and preparing the DNA of the present invention is not particularly limited, and the nucleotide sequence information shown in SEQ ID NO: 12 or 15 in the sequence listing disclosed in this specification or SEQ ID NO: 13 or 16 in the sequence listing.
  • Genomic DNA can be obtained by a method disclosed in a conventional method (for example, JP-A-60-9489).
  • Oligonucleotides can be synthesized according to a conventional method using various commercially available DNA synthesizers, for example.
  • the PCR reaction is performed using a thermal cycler GeneGeAmp PCR System 2400 manufactured by Applied Biosystems, TaqDNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the like. It can be performed according to conventional methods.
  • the DNA of the present invention can be obtained by modifying the nucleotide sequence so that an amino acid at a specific site is deleted, substituted, inserted, or added by, for example, site-specific mutagenesis.
  • the modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • amino acid sequence of a protein and the base sequence that encodes it are slightly different between species, strains, mutants, and variants, so that DNA encoding substantially the same protein Can be obtained from microorganisms, strains, mutants and varieties belonging to all Labyrinthulas, especially Thraustochytrium.
  • Thraustochytrium sp.ATCC 26185 for use in the agar plate culture present invention (a) Thraustochytrium sp.ATCC 26185 underwent sale from ATCC. The agar plate culture of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 used PDA medium.
  • ATCC 26185 cells were inoculated with a platinum loop or a spreader and allowed to stand at 25 ° C. for about 3 to 4 days, and Thraustochytrium sp. ATCC 26185 colonies appeared. The subculture was carried out by catching the colonies with platinum loops and suspending them in sterile physiological saline, and then applying the suspension using platinum loops or a spreader. It should be noted that, if necessary, the cells were transformed into the liquid culture described later by inoculating the liquid medium with the cells of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 on a flat plate.
  • Liquid culture liquid culture Thraustochytrium sp.ATCC 26185 of (b) Thraustochytrium sp.ATCC 26185 used the GY liquid medium or PD liquid medium. That is, in GY medium, 6.36 g glucose (manufactured by Nacalai Tesque), 2.12 g dry yeast extract (manufactured by Nacalai Tesque), and 3.5 g Sea Life (manufactured by Marine Tech), PD In the medium, 0.96 g of potato dextrose (manufactured by Difco) and 3.5 g of sea life (manufactured by Marine Tech) were added per 100 ml of deionized water, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes.
  • GY medium 6.36 g glucose (manufactured by Nacalai Tesque), 2.12 g dry yeast extract (manufactured by Nacalai Tesque), and 3.5 g Sea Life (manufactured by Marine Tech),
  • Genomic DNA extraction of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 The cells were collected by centrifuging the Thraustochytrium sp. ATCC 26185 culture solution on the third day of culture using 200 ml of GY liquid medium at 3,500 x g for 15 minutes. The obtained cells were suspended in sterilized physiological saline and then centrifuged again to wash the cells, rapidly frozen with liquid nitrogen, and ground in a mortar until powdered. Thereafter, genomic DNA was extracted according to the method described in “Basics of Bio-Experiment Illustrated 2 Gene Analysis p117-128, Shujunsha”, and the amount and purity thereof were measured by OD260 and OD280.
  • 18S rDNA analysis of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 Phylogenetic analysis of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 by 18S rDNA analysis was performed according to the method of Honda et al. (Honda, D., et al. J. Eukaryot. Microbiol. (1999) 46, 637-647). That is, after 18S rDNA was amplified by PCR using the genomic DNA of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 obtained in Example 2 as a template, it was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and the separated DNA fragment was purified with a clean cutter, etc.
  • the DNA fragment was extracted from the agarose gel according to the method described in “Bio-Experiment Illustrated 2 Gene Analysis Basics p63-68, Shujunsha”. Next, TA cloning of the DNA fragment was performed using pGEM TM -T easy Vector System I (Promega) and Sanger et al. (Sanger, F., et al. Proc. Natl. Acad. Sci ( 1977) 74, 5463), and their base sequences were determined. Specifically, using BigDye TM Terminator v3.1 Cyele Sequencing Kit and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), nucleotide sequence determination was performed by the dye terminator method according to the attached manual.
  • 18S rDNA sequence of Thraustochytrium sp.ATCC 26185 is, Thraustochytrium sp FJN-10-derived 18S rDNA sequences of the database described (accession number: AY773276). And show very high identity, from the results of phylogenetic analysis Both were shown to be very closely related.
  • one forward oligonucleotide primer (TfELO2-F1; 5'- TGG GCT CCG TGG TCC TCT ACC TGA GCC TGC -3 ') based on Thraustochytrium sp.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Thraustochytrium sp. ATCC 26185 obtained in Example 2 as a template. As a result, specific amplification products were confirmed (FIG. 1). Therefore, TA cloning was performed after purification of the DNA fragment using an agarose gel, and base sequence analysis thereof was performed.
  • the PCR product using the oligonucleotide primer TfELO2-F1 / TfELO2-R1 combination is 338 bp (SEQ ID NO: 5), and the PCR product using the oligonucleotide primer TfELO2-F1 / TfELO2-R2 combination is 443 bp (sequence table sequence). No. 6), and the overlapping part of both sequences was completely identical.
  • a longer PCR product sequence using the combination of oligonucleotide primers TfELO2-F1 / TfELO2-R2 was compared to the sequence of Thraustochytrium sp.
  • FJN-10-derived ⁇ 6-elongase showing a high identity of 99.5% (441 bp out of 443 bp) It was found to show (match). This indicates that the partial sequence of the putative ⁇ 6-elongase gene derived from Thraustochytrium sp. ATCC 26185 was successfully isolated.
  • FJN-10 F HindIII is a forward oligonucleotide primer and has a restriction enzyme HindIII site (AAGCTT) at the 5 ′ end.
  • Thraustochytrium sp In addition, with reference to the yeast consensus sequence ((A / Y) A (A / U) A AUG UCU; underlined start codon) (Cigan and Donahue, 1987; Romanos et al., 1992), Thraustochytrium sp.
  • FJN- The sequence in the vicinity of the start codon of the 10-derived ⁇ 6-longase sequence is modified.
  • FJN-10 R XbaI is a reverse oligonucleotide primer and has an XbaI site (TCTAGA) at the 5 ′ end.
  • TCTAGA XbaI site
  • elo1 F HindIII is a forward oligonucleotide primer and has a restriction enzyme HindIII site at the 5 ′ end.
  • elo1 R XbaI is a reverse oligonucleotide primer and has an XbaI site at the 5 ′ end.
  • the total RNA and mRNA obtained were successfully extracted from the total RNA by electrophoresis using a formalin-denaturing gel (1% agarose / MOPS buffer), and that the mRNA was purified from the total RNA. It was confirmed that RNA was not degraded by RNase. In order to avoid the degradation of RNA by RNase as much as possible, rubber gloves and masks are worn throughout this experiment, and all the equipment is RNase-free or inactivated by digestion with diethyl pyrocarbonate (Nacalai Tesque).
  • RNA was dissolved a solution obtained by adding RNaseOUT TM (manufactured by Invitrogen), a recombinant RNase inhibitor, to sterilized milliQ water treated with diethylpyrocarbonate was used.
  • RNaseOUT TM manufactured by Invitrogen
  • a SMART TM RACE cDNA Amplification Kit manufactured by clontech
  • PCR was carried out using the two pairs of oligonucleotide primers (FJN-10 F HindIII / FJN-10 R XbaI and elo1 F HindIII / elo1 R XbaI) as a template.
  • FJN-10 F HindIII / FJN-10 R XbaI and elo1 F HindIII / elo1 R XbaI As PCR enzyme, PrimeSTAR TM DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) having high proofreading activity was used to avoid extension errors.
  • the amplified PCR product was separated on a 1% agarose gel, the DNA fragment was cut out and extracted from the agarose gel.
  • the constructed TsELO2 gene expression vector for budding yeast S. cerevisiae was named pYETsELO2.
  • the base sequence of the translation region of the TsELO2 gene held by pYETsELO2 is 816 bp (SEQ ID NO: 12), and its deduced amino acid sequence is 272 amino acid residues (SEQ ID NO: 13).
  • oligonucleotide primer elo1 F HindIII / elo1 R XbaI When oligonucleotide primer elo1 F HindIII / elo1 R XbaI is used, a 842 bp PCR product (SEQ ID NO: 14) cleaved by restriction enzyme HindIII / XbaI is incorporated into pYES2 / CT. confirmed.
  • the nucleotide sequence excluding the oligonucleotide primer part was 99% (772 bp in 774 bp matched), and the predicted amino acid sequence was 99% (257 amino acids). It was confirmed that the amino acid residues showed extremely high identity (FIGS.
  • TsELO1 The constructed TsELO1 gene expression vector for budding yeast S. cerevisiae was named pYETsELO1.
  • the base sequence of the translation region of the TsELO1 gene retained by pYETsELO1 is 831 bp (SEQ ID NO: 15), and its deduced amino acid sequence is 277 amino acid residues (SEQ ID NO: 16).
  • the sequence of the amplified product of 847 bp using the oligonucleotide primer elo1 F HindIII / elo1 R XbaI (SEQ ID NO: 18 in the sequence listing) completely matches the cDNA sequence of TsELO1 described in (a), and the TsELO1 gene is It was shown to be intronless.
  • TsELO1 and TsELO2 are classified into the PUFA-elongases (single-step) group, suggesting that they act on polyunsaturated fatty acids with a fixed chain length (FIG. 8). .
  • TsELO1 and TsELO2 genes using budding yeast as a host and analysis of fatty acid composition of transgenic strains The constructed TsELO1 gene expression vector pYETsELO1, TsELO2 gene expression vector pYETsELO2, and pYES2 / CT were converted into ⁇ Current Protocols in Molecular Biology, Unit 13 (Ausubel et al., 1994) '' and ⁇ Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Gutherie and Fink , 1991) "was introduced into the budding yeast S. cerevisiae by the lithium acetate method, and transformants were selected.
  • the obtained transformants (pYETsELO1-introduced strain, pYETsELO2-introduced strain, and mock-introduced strain) were obtained by the method of Qiu et al. (Qiu, X., et al. J. Biol. Chem. (2001) 276, 31561-6 ), Microbial cell-derived fatty acids were extracted and methyl esterified.
  • ⁇ -linolenic acid ALA, C18: 3 ⁇ 9, 12, 15
  • LA linoleic acid
  • C18: 2 ⁇ 9, 12 ⁇ 6--longase substrate Stearidonic acid (STA, C18: 4 ⁇ 6, 9, 12, 15 ) and ⁇ -linolenic acid (GLA, C18: 3 ⁇ 6, 9, 12 ) were used as substrates for ⁇ 5-elongase as eicosapentaenoic acid (EPA, C20 : 5 ⁇ 5, 8, 11, 14, 17 ) and arachidonic acid (AA, C20: 4 ⁇ 5, 8, 11, 14 ) are added to each final concentration of 0.1 mM, followed by culturing.
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • AA arachidonic acid
  • the pYETsELO2-introduced strain shows ⁇ 9-elongase activity that converts ALA to ETrA, and ⁇ 6-elongase activity that does not exist in the host that converts STA to ETA (C20: 4 ⁇ 8, 11, 14, 17 ).
  • yeast endogenous palmitic acid (PA, C16: 1 ⁇ 9) and vaccenic acid (VA, C18: 1 ⁇ 11) into a ⁇ 9- elongase be active also shows suggested (FIGS. 15-17).
  • TsELO1 is ⁇ 9- / ⁇ 6- / ⁇ 5-elongase and TsELO2 is ⁇ 9- / ⁇ 6-elongase
  • the substrate specificity of TsELO1 and TsELO2 by phylogenetic tree analysis shown in Example 6 is shown.
  • the result is different from the sex prediction.
  • Jiang et al. Reported the gene cloning of Thraustochytrium sp. FJN-10 and ⁇ 5-elongase named TFD6 and TFD5 and their expression in the budding yeast S. cerevisiae (Jiang, X. , et al.
  • TFD6 has ⁇ 6-elongase activity to convert GLA to DGLA and that TFD5 has ⁇ 5-elongase activity to convert EPA to ⁇ -3 DPA.
  • the present invention is the first finding that a product of TsELO2 and TsELO1 genes derived from a Thraustochytrium sp. ATCC 26185 exhibits a plurality of elongase activities.
  • Examples of precursors for the biosynthesis of highly unsaturated fatty acids include the C 18 -carbon fatty acids oleic acid, linoleic acid and linolenic acid. These C 18 -carbon fatty acids need to be extended to C 20 and C 22 in order to obtain eicosa and docosa chain type fatty acids.
  • the enzyme having fatty acid elongase activity of the present invention and means for mass-producing the enzyme can be provided.
  • C 18- , C 20 -or C 22 -fatty acids having at least two double chain bonds in the fatty acid molecule are expected to be produced in their free fatty acid form or their ester form such as glycerides.

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Abstract

【課題】　Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素、及びそれをコードするＤＮＡの提供。 【解決手段】　ラビリンチュラ類を由来とする、Δ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性、又はΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。ラビリンチュラ類がスラウストキトリウム属（Thraustochytrium）に属する微生物、好ましくはThraustochytrium sp. ATCC 26185である。配列表配列番号１３又は１６のアミノ酸配列で示される該酵素をコードするＤＮＡ（配列表配列番号１２または１５で示されるＤＮＡ）を好適な発現系に導入することにより該酵素を調製することができる。

Description

新規酵素及びそれをコードするＤＮＡ
　本発明は、新規酵素及びそれをコードするＤＮＡに関する。詳しくは、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する新規酵素、及びそれをコードするDNAに関する。
　多不飽和ω3-脂肪酸およびω6-脂肪酸は動物およびヒトの栄養において重要な成分である。エイコサペンタエン酸（ EPA）またはドコサヘキサエン酸（ DHA,）のような多不飽和長鎖ω3-脂肪酸は、小児の脳の発達、眼の機能、ホルモンおよび他のシグナル物質の合成ならびに心血管障害、癌および糖尿病の予防を含め健康の態様において種々の役割を果たすため（非特許文献１参照）、それらはヒトの栄養において重要な成分である。そのような理由で、多不飽和長鎖脂肪酸の製造が必要とされている。
　これら多不飽和長鎖脂肪酸、特にEPAやDHAはイワシやマグロ等の魚類に豊富に含まれていることが知られ、これらの魚類から抽出・濃縮された製品が健康食品や医薬品として広く利用されている。また微生物が著量の脂質を蓄積する例も知られており、モルティエレラ属（Mortierella）糸状菌が産生するアラキドン酸（ARA）（特許文献１、２参照）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）渦鞭毛藻が産生するDHA（非特許文献２参照）、シゾキトリウム属（Schizochytrium）ラビリンチュラが産生するDHA（非特許文献３参照）が例示される。
　また、遺伝子組換え植物でこれらの多不飽和脂肪酸を生産する試みも複数報告されている（非特許文献４参照）。具体的には、多不飽和脂肪酸を生産する生物から遺伝子を取得し、ナタネや大豆などの油糧植物に導入し発現させる試みである。遺伝資源として上述の糸状菌やラビリンチュラに加え、フェオダクチラム属（Phaeodactylum）珪藻、サプロレグニア属（Saprolegnia）卵菌等、種々の生物に由来する遺伝子が取得され植物に導入されている。しかし、必ずしも期待したとおりの生産量が得られないケースが多い。したがい、現在得られている遺伝子に加え、従来と異なる性質を有する新たな遺伝子の取得が望まれている。
　ラビリンチュラ類は上述のとおり多不飽和脂肪酸を著量蓄積する性質を有することから、油糧微生物としてはもちろんのこと、脂質生合成に関連する遺伝子の資源としても極めて有望である。このことは、非特許文献４にシゾキトリウム・アグリガータム（Schizochytrium aggregatum）由来Δ4-デサチュラーゼ、スラウストキトリウム sp.（Thraustochytrium sp.）由来Δ4-デサチュラーゼ、Δ5-デサチュラーゼ、Δ6-エロンゲース（C18-エロンゲース）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ等の遺伝子が取得され、油糧植物に導入されたと記載されていることからも明らかである。これら酵素の中で、エロンゲースは脂肪酸の鎖長を伸長する重要な酵素である。しかしながら、これまでにラビリンチュラから遺伝子が取得されたエロンゲースはいずれも決まった鎖長の多不飽和脂肪酸のみに作用する酵素であり、複数の鎖長の多不飽和脂肪酸に作用するエロンゲースの報告は無かった。もしこのようなエロンゲースを得ることができれば、より効率的な脂肪酸生合成経路を構築することが可能と考えられるため、このようなエロンゲースの取得が特に望まれていた。
特開昭63－44891号公報 特開昭63－12290号公報
Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LAおよびYeo YK Pharmacol Res 40:211-225, 1999 ツヴィ・コーエン（Zvi Cohen）ら編，「シングル　セル　オイルズ(Single Cell Oils)」，（米国），エイオーシーエス・プレス（AOCS Press），2005年，p. 86-98 ツヴィ・コーエン（Zvi Cohen）ら編，「シングル　セル　オイルズ(Single Cell Oils)」，（米国），エイオーシーエス・プレス（AOCS Press），2005年，p. 36-52 Robert, SS Mar Biotechnol 8:103-109, 2006
　本発明は、新規な酵素及びそれをコードするＤＮＡを提供することを課題とする。より詳しくは、ラビリンチュラ類を由来とする、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素、及びそれをコードするＤＮＡを提供することを課題とする。
また、本発明は、新規な酵素及びそれをコードするＤＮＡを含むベクター、そのベクターを組み込んだ宿主を提供することを課題とする。さらにまた、その宿主を培養し、その培養物からΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素を採取することを特徴とする、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素を製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上述の状況に鑑み鋭意研究の結果、ラビリンチュラ類に新規な酵素を見出し、本発明を完成させるに至った。
　従って本発明は、以下の（１）～（１７）記載の内容を要旨とする。
（１）　ラビリンチュラ類に属する微生物を由来とする、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。
（２）ラビリンチュラ類に属する微生物がスラウストキトリウム属（Thraustochytrium）に属する微生物である、前記（１）記載の酵素。
（３）　スラウストキトリウム属に属する微生物がThraustochytrium sp. ATCC 26185である、前記（２）記載の酵素。
（４）　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示される酵素。
（ａ）配列表配列番号１３のアミノ酸配列で示される、Δ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素。
（ｂ）配列表配列番号１３のアミノ酸配列で示されるΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素のアイソフォーム。
（ｃ）配列表配列番号１３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素。
（ｄ）配列表配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素。
（５）　前記（４）記載の酵素をコードするＤＮＡ。
（６）　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）に示されるＤＮＡである（５）記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表配列番号１２で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列表配列番号１２で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列表配列番号１２で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列表配列番号１２で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（７）　前記（５）又は（６）のＤＮＡを含むベクター。
（８）　前記（７）のベクターを組み込んだ宿主。
（９）　前記（８）の宿主を培養し、その培養物からΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素を採取することを特徴とする、Δ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素の製造方法。
（１０）　前記（９）記載の方法で得られた遺伝子組換酵素。
（１１）　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示される酵素。
（ａ）配列表配列番号１６のアミノ酸配列で示される、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。
（ｂ）配列表配列番号１６のアミノ酸配列で示されるΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素のアイソフォーム。
（ｃ）配列表配列番号１６で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。
（ｄ）配列表配列番号１６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。
（１２）　前記（１１）記載の酵素をコードするＤＮＡ。
（１３）　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）に示されるＤＮＡである（１２）記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表配列番号１５で示されるＤＮＡ。
（ｂ）配列表配列番号１５で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列表配列番号１５で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列表配列番号１５で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１４）　前記（１２）又は（１３）のＤＮＡを含むベクター。
（１５）　前記（１４）のベクターを組み込んだ宿主。
（１６）　前記（１５）の宿主を培養し、その培養物からΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素を採取することを特徴とする、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素の製造方法。
（１７）　前記（１６）記載の方法で得られた遺伝子組換酵素。
　本発明により、新規な酵素及びそれをコードするＤＮＡが提供される。より詳しくは、ラビリンチュラ類を由来とする、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素、及びそれをコードするＤＮＡが提供される。
　さらに、本発明により、新規な酵素及びそれをコードするＤＮＡを含むベクター、そのベクターを組み込んだ宿主を提供することができ、その宿主を培養し、その培養物からΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素を採取することを特徴とする、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素を製造する方法が提供される。
実施例４における、Thraustochytrium sp.ATCC 26185のゲノムDNAに対しプライマーTfELO2-F1及びTfELO2-R1でPCR反応を行った結果の電気泳動図を示す。 実施例５における、Thraustochytrium sp.ATCC 26185のcDNAライブラリーに対しプライマーFJN-10 F HindIII/ FJN-10 R XbaI及びelo1 F HindIII/elo1 R XbaIでPCR反応を行った結果の電気泳動図を示す。 実施例５における、オリゴヌクレオチドプライマーFJN-10 F HindIII/ FJN-10 R XbaIを用いて得られたPCR産物（Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来Δ6-エロンゲース(TsElo2)）とThraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列を比較した図を示す。図３に示されるTsElo2の塩基配列を配列番号１９に、TFD6の塩基配列を配列番号２０に、それぞれ示した。 実施例５における、オリゴヌクレオチドプライマーFJN-10 F HindIII/ FJN-10 R XbaIを用いて得られたPCR産物（Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来Δ6-エロンゲース(TsElo2)）とThraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列を比較した時の、共通して保存されるモチーフ部分を示す。　図４に示されるTsElo2のアミノ酸配列を配列番号２１に、TFD6のアミノ酸配列を配列番号２２に、それぞれ示した。 実施例５における、オリゴヌクレオチドプライマーelo1 F HindIII/ elo1 R XbaIを用いて得られたPCR産物（Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来Δ6-エロンゲース(TsElo2)）とThraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列を比較した図を示す。　 図５に示されるTsElo1の塩基配列を配列番号２３に、TFD5の塩基配列を配列番号２４に、それぞれ示した。 実施例５における、オリゴヌクレオチドプライマーelo1 F HindIII/ elo1 R XbaIを用いて得られたPCR産物（Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来Δ6-エロンゲース(TsElo2)）とThraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列を比較した時の、共通して保存されるモチーフ部分を示す。　 図６に示されるTsElo1のアミノ酸配列を配列番号２５に、TFD5のアミノ酸配列を配列番号２６に、それぞれ示した。 実施例５における、Thraustochytrium sp.ATCC 26185のゲノムDNAライブラリーに対しプライマーFJN-10 F HindIII/ FJN-10 R XbaI及びelo1 F HindIII/elo1 R XbaIでPCR反応を行った結果の電気泳動図を示す。 実施例６における、本発明で得られたThraustochytrium sp.ATCC 26185由来Δ6-－エロンゲース（TsELO1、TsELO2）の分子系統樹を示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO1を発現させた株がALAをETrAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO1を発現させた株がLAをEDAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO1を発現させた株がSTAをETAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO1を発現させた株がGLAをDGLAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO1を発現させた株がEPAをDPAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO1を発現させた株がAAをDTAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO2を発現させた株がALAをETrAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO2を発現させた株がSTAをETAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。 実施例７における、出芽酵母を宿主としてTsELO1を発現させた株がPAをVAに変換したことを示すガスクロマトグラフィーのチャートを示す。
　本発明は、ラビリンチュラ類に属する微生物由来のΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素に関する。
　本発明における「エロンゲース活性」とは、脂肪酸又はＦａｔｔｙ ａｃｙｌ－ＣｏＡの炭素鎖を伸長させる活性を意味する。
　[ラビリンチュラ類]
　ラビリンチュラ類に属する微生物としては、ラビリンチュラ属(Labyrinthula)、アルトルニア属(Althornia)、アプラノキトリウム属（Aplanochytrium）、イァポノキトリウム属(Japonochytrium)、ラビリンチュロイデス属（Labyrinthuloides）、シゾキトリウム属(Schizochytrium)、ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、またはウルケニア属(Ulkenia)、アウランティオキトリウム属(Aurantiochytrium)が挙げられる
、好ましくはスラウストキトリウム属（Thraustochytrium）に属する微生物であり、特に好ましくはThraustochytrium sp. ATCC 26185株が挙げられる。
　本発明の新規な酵素は、その塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することもできる。該酵素（配列表配列番号１３又は１６のアミノ酸配列で示される、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。）をコードするＤＮＡ（配列表配列番号１２または１５で示されるＤＮＡ）を好適な発現系に導入することにより本発明の酵素を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
　さらに、配列表の配列番号１３または１６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加とされたアミノ酸配列からなるΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素、又は、配列表の配列番号１３または１６に示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素は、配列表の配列番号１３または１６に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示した配列表の配列番号１２または１５に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。
　例えば、配列表の配列番号１２または１５に示される塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるＰＣＲ反応によって、あるいは該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、微生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素を製造することができる。
　ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行うことができる。
　さらに、上記本発明の、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ－ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明の、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素の精製や、本発明のタンパク質の検出等に有用である。
　また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号１３または１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡである配列表配列番号１２または１５で示されるＤＮＡや、該塩基配列を含むＤＮＡや、配列表配列番号１２または１５で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素をコードするＤＮＡや、配列表配列番号１２または１５で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを挙げることができる。
　このように、本発明の、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性に関与する酵素をコードするＤＮＡは、コードされる酵素の機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性に関与する酵素をコードするものであってもよい。
　このようなΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性に関与する酵素としての機能を有する酵素と実質的に同一の酵素をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一の酵素をコードするＤＮＡは、ラビリンチュラ類全般、中でもスラウストキトリウム属（Thraustochytrium）に属する微生物、株、変異体、変種から得ることが可能である。
　上記「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
また、上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列」とは、例えば１～５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を意味する。
　例えば、これら１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、上記のように、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列表の配列番号１２または１５に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤を接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989）やカレントプロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1～38,John Wiley & Sons (1987-1997)）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（酵素）を得ることができる。
　上記「配列表の配列番号１３又は１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号１３または１６に示されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であることを意味する。
　上記「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０％以上、好ましくは７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
　また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍程度のＳＳＣ溶液を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
　ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
　本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列表の配列番号１２又は１５に示される塩基配列情報又は配列表の配列番号１３または１６に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
　本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。なお、ゲノムＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０－９４８９号公報）に開示された方法により取得できる。
　オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）などを使用して常法に従って行なうことができる。
　本発明のＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されるように塩基配列を改変することによって取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
　また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、ラビリンチュラ類全般、中でもスラウストキトリウム属（Thraustochytrium）に属する微生物、株、変異体、変種から得ることが可能である。
　以下に本発明の詳細を実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
　[Thraustochytrium sp.ATCC 26185の培養及び株の保持]
(a) Thraustochytrium sp.ATCC 26185の寒天平板培養
　本発明で使用する菌株Thraustochytrium sp.ATCC 26185は、ATCCより分譲を受けた。
　Thraustochytrium sp.ATCC 26185の寒天平板培養は、PDA培地を使用した。即ち、脱イオン水100 mlあたり0.78 gの ポテトデキストロース寒天培地 (日水製薬社製)、1.75 gのシーライフ (マリンテック社製)、および1.21 gの寒天末 (ナカライテスク社製) を加え、121℃で20分間オートクレーブ滅菌を行った。十分に冷却後に、バクテリアのコンタミネーションを防ぐためにアンピシリン酸ナトリウム (ナカライテスク社製) を終濃度が100 μg/mlになるように添加し、直径15 cmのシャーレに15 mlずつ分注し平らな所に静置して固化させた。これにThraustochytrium sp.ATCC 26185菌体を白金耳、もしくはスプレッダーを用いて接種し、25℃で3ないし4日間程度静置培養することで、Thraustochytrium sp.ATCC 26185のコロニーが出現した。その継代培養に関しては、コロニーを白金耳で釣菌して滅菌生理食塩水に懸濁後、その懸濁液を白金耳、もしくはスプレッダーを用いて塗布することで行った。尚、必要に応じて平板上のThraustochytrium sp.ATCC 26185の菌体を液体培地に接種することで、後述の液体培養への転換を行った。
(b) Thraustochytrium sp.ATCC 26185の液体培養
　Thraustochytrium sp.ATCC 26185の液体培養は、GY液体培地もしくはPD液体培地を使用した。すなわち、GY培地においては脱イオン水100 mlあたり6.36 gのグルコース (ナカライテスク社製)、2.12 gの乾燥酵母エキス (ナカライテスク社製)、および3.5 gのシーライフ (マリンテック社製)、PD培地においては脱イオン水100 mlあたり0.96 gのポテトデキストロース (Difco社製)、および3.5 gのシーライフ (マリンテック社製) を加え、121℃で20分間オートクレーブ滅菌を行った。十分に冷却後に、バクテリアのコンタミネーションを防ぐために終濃度が100 μg/mlとなるようにアンピシリン酸ナトリウム (ナカライテスク社製) を添加した。これにThraustochytrium sp.ATCC 26185菌体を接種し、三角フラスコを用いて、25℃、150 rpmの回転数で攪拌しながら懸濁培養を行った。その継代培養に関しては、増殖が確認された細胞培養液を、新しいGYおよびPD培地に対して、3日目毎に1/100容添加することで行った。尚、必要に応じて細胞培養液をPDA培地に塗布することで、上述の寒天平板培養への転換を行った。
(c) Thraustochytrium sp.ATCC 26185の保持・保存法
　株の保持・保存に関しては、前述の平板培養、および液体培養による継代培養の他に、グリセロールストック作製による凍結保存を行った。すなわち、GY液体培地を用いた培養3日目の細胞懸濁液に対して、終濃度が15% (v/v) のグリセロール (ナカライテスク社製) を添加し、-80℃のディープフリーザー中にて保存した。この方法で作製したThraustochytrium sp.ATCC 26185のグリセロールストックは、長期間保存した後においても、PDA培地に塗布した際に問題なく増殖が見られた。
　[Thraustochytrium sp.ATCC 26185のゲノムDNA抽出]
　200 mlのGY液体培地を用いた培養3日目のThraustochytrium sp.ATCC 26185培養液を、3,500 x gで15分間遠心することでその菌体を回収した。得た菌体を滅菌生理食塩水に懸濁後に再遠心操作を行うことで菌体を洗浄し、液体窒素で急速凍結して乳鉢中で粉末状になるまで擂り潰した。その後、「バイオ実験イラストレイテッド ２遺伝子解析の基礎 p117-128、秀潤社」記載の方法に従ってゲノムDNAを抽出し、O.D.260およびO.D.280によって、その量と純度を測定した。
　[Thraustochytrium sp.ATCC 26185の18S rDNA解析]
　18S rDNA解析によるThraustochytrium sp.ATCC 26185の系統解析は、Hondaら (Honda, D., et al. J. Eukaryot. Microbiol. (1999) 46, 637-647) の方法に準じて行った。すなわち、実施例２で得られたThraustochytrium sp.ATCC 26185のゲノムDNAを鋳型としたPCRによって18S rDNAを増幅したのちに1%アガロースゲルによる電気泳動に供し、分離した該DNA断片を清浄なカッター等で切り出し、「バイオ実験イラストレイテッド ２遺伝子解析の基礎 p63-68、秀潤社」記載の方法に従ってアガロースゲルからDNA断片を抽出した。次に、pGEMTM-T easy Vector System I (Promega社製) を使用して該DNA断片のTAクローニングを行い、Sangerらの方法 (Sanger, F., et al. Proc. Natl. Acad. Sci (1977) 74, 5463) によってそれらの塩基配列を決定した。具体的には、BigDyeTM Terminator v3.1Cyele Sequencing Kitおよび3130ジェネティックアナライザ (Applied Biosystems社製) を使用し、添付マニュアルに従ったダイターミネーター法による塩基配列決定を行った。得られたThraustochytrium sp.ATCC 26185の18S rDNA配列 （配列表配列番号１) を基にしたThraustochytrium sp.ATCC 26185と他のラビリンチュラ類との系統関係は、BLAST検索による相同性の比較、およびCLUSTAL Wプログラム (Thompson, J.D., et al. Nucleic Acids Res. (1994) 22, 4673-4680) を使用した近隣結合法 (Saitou, N., et al. Mol. Biol. Evol. (1987) 4, 406-425) による分子系統樹作製によって行った。
　その結果、Thraustochytrium sp.ATCC 26185の18S rDNA配列は、データベース記載のThraustochytrium sp. FJN-10由来の18S rDNA配列 (アクセッション番号：AY773276) と非常に高い同一性を示し、系統解析の結果からも、両者は非常に近縁性が高いことが示された。
　[Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来エロンゲース部分配列の単離]
　データベース上には、Thraustochytrium sp. FJN-10由来のΔ6-エロンゲース (アクセッション番号：DQ299828)、およびΔ5-エロンゲース (アクセッション番号：DQ299827) が記載されている。そこで、実施例３においてThraustochytrium sp. FJN-10と近縁性が高いと同定されたThraustochytrium sp.ATCC 26185においては、両遺伝子と相同性の高いホモログ遺伝子が存在すると予測し、以降の実験を行った。
　まず、Thraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列を元に、1つの正方向オリゴヌクレオチドプライマー (TfELO2-F1；5’- TGG GCT CCG TGG TCC TCT ACC TGA GCC TGC -3’) （配列表配列番号２) 、および2つの逆方向オリゴヌクレオチドプライマー (TfELO2-R1；5’- CCA AAA GGT CGT GGC GTG GTG TAA GAC GTG -3’ （配列表配列番号３) およびTfELO2-R2；5’- CGG GAA TGG GCG GAA GTA GTG CGC GTA CAT -3’ （配列表配列番号４)を作製した。尚、オリゴヌクレオチドの合成は、DNA合成機 (Applied Biosystems社製) を用いて行った。
　これら２対のオリゴヌクレオチドプライマー (TfELO2-F1/TfELO2-R1およびTfELO2-F1/TfELO2-R2) を用いて、実施例２で得られたThraustochytrium sp.ATCC 26185のゲノムDNAを鋳型としたPCRを行ったところ、それぞれ特異的な増幅産物が確認された（図１）。そこで次に、アガロースゲルを用いた該DNA断片の精製後にTAクローニングを行い、それらの塩基配列解析を行った。その結果、オリゴヌクレオチドプライマーTfELO2-F1/TfELO2-R1組み合わせによるPCR産物は338 bp （配列表配列番号５)、オリゴヌクレオチドプライマーTfELO2-F1/TfELO2-R2の組み合わせによるPCR産物は443 bp （配列表配列番号６)であり、両配列の重複部分は完全に一致していた。オリゴヌクレオチドプライマーTfELO2-F1/TfELO2-R2の組み合わせを用いたより長いPCR産物の配列をThraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列と比較したところ、99.5%と高い同一性 (443 bp中441 bp一致) を示すことが分かった。このことから、Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来推定Δ6-エロンゲース遺伝子の部分配列の単離に成功したことが示された。
　[Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来の2種のエロンゲース配列の単離]
　実施例３および４の結果から、Thraustochytrium sp.ATCC 26185にはThraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-およびΔ5-エロンゲースとほぼ同一の配列を有する2つのホモログ遺伝子が存在することが強く示唆された。そこで次に、cDNAライブラリーを鋳型としたPCRによる2つのエロンゲース遺伝子cDNA配列の単離、およびゲノムDNAを鋳型としたPCRによるゲノムDNA配列の単離を行った。
　まず、Thraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列を元に、1対のオリゴヌクレオチドプライマーを作製した (FJN-10 F HindIII；5’- ATA AGC TTC ATA ATG TCT GAG CCG CTC GAC AGG TAC AGG G -3’ （配列表配列番号７) およびFJN-10 R XbaI；5’- ATC TAG ATG CCT TCT TGG TTT TTG CGG GCG CGA G -3’ （配列表配列番号８) )。FJN-10 F HindIIIは正方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端に制限酵素HindIII部位 (AAGCTT) を有する。また、酵母のコンセンサス配列 ( (A/Y) A (A/U) A AUG UCU；下線部開始コドン) (Cigan and Donahue, 1987; Romanos et al., 1992) を参考に、Thraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列の開始コドン近傍の配列を改変している。FJN-10 R XbaIは逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端にXbaI部位 (TCTAGA) を有する。
　また同様に、Thraustochytrium sp. FJN-10由来Δ5-エロンゲースの配列を元に、1対のオリゴヌクレオチドプライマーを作製した (elo1 F HindIII；5’- ATA AGC TTC ATA ATG TCT GTC GTC GAG CAG CAA TGG CG -3’ （配列表配列番号９) およびelo1 R XbaI；5’- ATC TAG AGA TGG TCT TCT GCT TCT TGG GCG CCT TG -3’ （配列表配列番号１０) )。elo1 F HindIIIは正方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端に制限酵素HindIII部位を有する。また、酵母のコンセンサス配列を参考に、Thraustochytrium sp. FJN-10由来Δ5-エロンゲースの配列の開始コドン近傍の配列を改変している。elo1 R XbaIは逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端にXbaI部位を有する。
　以上2対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行うことにより、Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来の2つのエロンゲース遺伝子の翻訳領域の増幅が期待されるのみならず、得た増幅産物を出芽酵母S.cerevisiae用発現ベクターpYES2/CT (invitrogen社製) のHindIII/XbaIサイトを利用して組み込むことで、引き続き出芽酵母S.cerevisiaeを宿主とした発現実験を速やかに行うことが可能となる。
 (a) cDNAライブラリーを鋳型としたPCRによる単離
　GY液体培地を用いた培養3日目のThraustochytrium sp.ATCC 26185培養液を、3,500 x gで15分間遠心することでその菌体を回収した。得た菌体を滅菌生理食塩水に懸濁後に再遠心操作を行うことで菌体を洗浄し、液体窒素で急速凍結して乳鉢中で粉末状になるまで擂り潰した。得た細胞破砕液中からセパゾールRNA I Super (ナカライテスク社製) を使用して全RNAを抽出した。引き続き、OligotexTM-dT30<Super> mRNA Purification Kit (タカラバイオ社製) を使用し、添付のマニュアルに従い全 RNAからmRNAの精製を行った。得られた全RNAおよびmRNAは、ホルマリン変性ゲル (1%アガロース/MOPSバッファ―) を用いた電気泳動によって全RNAの抽出が成功していること、全RNAからmRNAが精製されていること、およびRNAがRNaseによる分解を受けていないことを確認した。また、RNaseによるRNAの分解を極力避けるために、本実験操作を通じてゴム手袋やマスク等を着用し、器具は全てRNaseフリーのもの、もしくはジエチルピロカーボネート (ナカライテスク社製) 処理によってRNaseを失活したものを用いた。またRNAを溶解する際は、ジエチルピロカーボネート処理した滅菌ミリQ水に、組換え型RNaseインヒビターであるRNaseOUTTM (invitrogen社製) を添加した溶液を用いた。
　次に、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (clontech社製) を使用し、添付のマニュアルに従って5’末端に合成アダプターを付加したcDNAライブラリーを作製した。それを鋳型として、前述した2対のオリゴヌクレオチドプライマー (FJN-10 F HindIII/ FJN-10 R XbaIおよびelo1 F HindIII/elo1 R XbaI) を用いたPCRを行ったところ、それぞれにおいて特異的な増幅産物が確認された（図２）。尚、PCR酵素は伸長ミスを避けるために校正活性の高いPrimeSTARTM DNA polymerase (タカラバイオ社製) を使用した。増幅したPCR産物を1%アガロースゲルにて分離後、該DNA断片を切り出しアガロースゲルから抽出した。さらに、制限酵素HindIIIおよびXbaIで処理した後に再度アガロースゲルを用いた精製を行い、制限酵素HindIIIおよびXbaI処理により直鎖化した出芽酵母用発現ベクターpYES2/CT (invitrogen) に、DNA Ligation Kit <Mighty Mix> (タカラバイオ社製)を使用して連結することで環状化ベクターを構築した。得られたベクターに関して複数クローンの塩基配列を解析し、伸長ミスによる変異が導入されていないこと、およびその配列の確認を行った。
　その結果、オリゴヌクレオチドプライマーFJN-10 F HindIII/ FJN-10 R XbaIを用いた場合おいては、制限酵素HindIII/XbaIによって切断を受けた827 bpのPCR産物 （配列表配列番号１１) がpYES2/CTに組み込まれていることが確認された。また、Thraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースの配列と比較した場合、オリゴヌクレオチドプライマー部分を除いて塩基配列で99% (758 bp中756 bpが一致)、推定アミノ酸配列で99% (239アミノ酸残基中238アミノ酸残基が一致) と、極めて高い同一性を示すことか確認された (図３及び４)。また、エロンゲースに共通して保存されるモチーフ (HXXHH) が保存されていることが分かった (図４)。
　以上の結果から、Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来推定エロンゲース遺伝子のcDNA配列の単離に成功したことが示され、これをTsELO2と命名した。また構築した出芽酵母S. cerevisiae用のTsELO2遺伝子発現ベクターをpYETsELO2と命名した。尚、pYETsELO2が保持するTsELO2遺伝子の翻訳領域の塩基配列は816 bp （配列表配列番号１２) であり、その推定アミノ酸配列は 272アミノ酸残基である （配列表配列番号１３)。
　オリゴヌクレオチドプライマーelo1 F HindIII/ elo1 R XbaIを用いた場合においては、制限酵素HindIII/XbaIによって切断を受けた842 bpのPCR産物 （配列表配列番号１４) がpYES2/CTに組み込まれていることが確認された。また、Thraustochytrium sp. FJN-10由来Δ5-エロンゲースの配列と比較した場合、オリゴヌクレオチドプライマー部分を除いた塩基配列で99% (774 bp中772 bpが一致)、推定アミノ酸配列で99% (257アミノ酸残基中255アミノ酸残基が一致) と、極めて高い同一性を示すことか確認された (図５及び６)。また、エロンゲースに共通して保存されるモチーフ (HXXHH) が保存されていることが分かった (図６)。以上の結果から、Thraustochytrium sp.ATCC 26185由来推定エロンゲース遺伝子のcDNA配列の単離に成功したことが示され、これをTsELO1と命名した。また、構築した出芽酵母S. cerevisiae用のTsELO1遺伝子発現ベクターをpYETsELO1と命名した。尚、pYETsELO1が保持するTsELO1遺伝子の翻訳領域の塩基配列は831 bp （配列表配列番号１５) であり、その推定アミノ酸配列は 277アミノ酸残基である （配列表配列番号１６)。
(b) ゲノムDNAを鋳型としたPCRによる単離
　実施例２で得られたThraustochytrium sp.ATCC 26185のゲノムDNAを鋳型として、前述した2対のオリゴヌクレオチドプライマー (FJN-10 F HindIII/ FJN-10 R XbaIおよびelo1 F HindIII/elo1 R XbaI) を用いたPCRを行うことによって、TsELO2およびTsELO1遺伝子のゲノムDNA配列の増幅をおこなった。尚、PCR酵素はLA taq Hot Start Version (タカラバイオ社製) を使用した。その結果、それぞれにおいて特異的な増幅産物が確認された (図７)。引き続き、アガロースゲルを用いた分離精製後にTAクローニングを行い、それらの塩基配列を決定したところ、オリゴヌクレオチドプライマーFJN-10 F HindIII/ FJN-10 R XbaIを用いた832 bpの増幅産物の配列 （配列表配列番号１７) は、(a) 記載のTsELO2のcDNA配列と完全に一致した。以上の結果は、TsELO2遺伝子がイントロンレスであることを示している。
　同様に、オリゴヌクレオチドプライマーelo1 F HindIII/ elo1 R XbaIを用いた847 bpの増幅産物の配列 （配列表配列番号１８) は、(a) 記載のTsELO1のcDNA配列と完全に一致し、TsELO1遺伝子がイントロンレスであることが示された。
　[TsELO1およびTsELO2遺伝子の系統樹解析]　
種々のエロンゲースは、基質特異性により1. SFA/MUFA elongases (飽和脂肪酸、もしくは単価不飽和脂肪酸に作用) 2. PUFA-elongases (single-step) (決まった鎖長の多価不飽和脂肪酸に作用) および3. PUFA elongases (multi-step) (様々な鎖長の多価不飽和脂肪酸に作用) の3つのグループに大別される。Meyerら(Meyer, A., et al. J. Lipid Res. (2004) 45, 1899-1909) が行ったエロンゲースの系統解析によると、その基質特異性と系統関係がよく一致することが分かっている。
　そこでMeyerらの方法に準じて、TsELO1、TsELO2、および他生物由来の種々のエロンゲース遺伝子の系統解析を行った。具体的には、CLUSTAL Wプログラム (Thompson, J.D., et al. Nucleic Acids Res. (1994) 22, 4673-4680) を使用した近隣結合法 (Saitou, N., et al. Mol. Biol. Evol. (1987) 4, 406-425) による分子系統樹を作製した。その結果、TsELO1およびTsELO2は、PUFA-elongases (single-step)のグループに分類されることが明らかになり、決まった鎖長の多価不飽和脂肪酸に作用することが示唆された (図８)。
　[出芽酵母を宿主としたTsELO1およびTsELO2遺伝子の発現及び遺伝子導入株の脂肪酸組成の解析]
　構築したTsELO1遺伝子発現ベクターpYETsELO1、TsELO2遺伝子発現ベクターpYETsELO2、およびpYES2/CTを「Current Protocols in Molecular Biology, Unit 13 (Ausubel et al., 1994)」および「Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Gutherie and Fink, 1991)」記載の方法に従い、酢酸リチウム法によって出芽酵母S. cerevisiaeに導入し形質転換体の選別を行った。次に、得た形質転換体 (pYETsELO1導入株、pYETsELO2導入株、およびmock導入株) をQiuらの方法 (Qiu, X., et al. J. Biol. Chem. (2001) 276, 31561-6) に準じて培養し、菌体由来脂肪酸の抽出とメチルエステル化を行った。ただし、培地にはΔ9-エロンゲースの基質として、α-リノレン酸（ALA 、C18:3Δ9, 12, 15) およびリノール酸（LA 、C18:2Δ9, 12)、Δ6--エロンゲースの基質として、ステアリドン酸（STA 、C18:4Δ6, 9, 12, 15) およびγ-リノレン酸（GLA、C18:3Δ6, 9, 12) を、Δ5--エロンゲースの基質として、エイコサペンタエン酸（EPA、C20:5Δ5, 8, 11, 14, 17) およびアラキドン酸（AA、C20:4Δ5, 8, 11, 14) を、それぞれ終濃度で0.1 mM添加した上で培養を行っている。引き続き、Abeらの方法 (Abe, E., et al. J. Biochem (2006) 142, 31561-31566 ) に従い、メチルエステル化脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析を行った。尚、ガスクロマトグラフィー分析は、キャピラリーカラムHR-SS-10 (30 m x 0.25 mm) (信和化工社製)、ガスクロマトグラフGC-2014 (島津製作所社製) を使用した。
　この結果、pYETsELO1導入株においては、ALAをエイコサトリエン酸 (EtrA、C20:3Δ11, 14)、およびLAをエイコサジエン酸 (EDA、C20:3Δ11, 14)に変換する宿主 (mock導入株) にはないΔ9-エロンゲースのみならず、STAをエイコサテトラエン酸（ETA 、C20:4Δ8, 11, 14, 17) 、およびGLAをジホモ-γ-リノレン酸（DGLA、C20:3Δ8, 11, 14) に変換するΔ6-エロンゲース活性、EPAをω-3 ドコサペンタエン酸（DPA 、C22:5Δ7, 10, 13, 16, 19) 、およびAAをドコサテトラエン酸（DTA、C22:4Δ7, 10, 13, 16) に変換するΔ5-エロンゲース活性をも示すことが分かった(図９～１４)。またpYETsELO2導入株においては、ALAをETrAに変換するΔ9-エロンゲース活性、STAをETA(C20:4Δ8, 11, 14, 17) に変換する宿主にはないΔ6-エロンゲース活性を示す一方で、出芽酵母内在性のパルミチン酸（PA 、C16:1Δ9) をバクセン酸（VA、C18:1Δ11) に変換するΔ9-エロンゲース活性をも示すことが示唆された (図１５～１７)。
　以上の結果をまとめると、TsELO1はΔ9-/Δ6-/Δ5-エロンゲース、TsELO2はΔ9-/Δ6-エロンゲースであることが示され、実施例６で示した系統樹解析によるTsELO1およびTsELO2の基質特異性予想とは異なる結果である。近年、Jiangらは、TFD6およびTFD5と命名したThraustochytrium sp. FJN-10由来Δ6-エロンゲースおよびΔ5-エロンゲースに関して、その遺伝子クローニングと出芽酵母S. cerevisiaeを宿主とした発現を報告した (Jiang, X., et al. Wei Sheng Wu Xue Bao. (2008) 48, 176-183)。しかしJiangらは、TFD6がGLAをDGLAに変換するΔ6-エロンゲース活性を有すること、およびTFD5がEPAをω-3 DPAに変換するΔ5-エロンゲース活性を有することのみを示しており、そのホモログ遺伝子であるThraustochytrium sp. ATCC 26185由来TsELO2およびTsELO1遺伝子の産物が、複数のエロンゲース活性を示す知見は本発明が初である。
　高度不飽和脂肪酸の生合成のための前駆体の例として、Ｃ１８－ 炭素脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸が挙げられる。これらのＣ１８－ 炭素脂肪酸はエイコサ及びドコサ鎖型の脂肪酸を得るためにＣ２０及びＣ２２へと伸長される必要がある。本発明の脂肪酸エロンゲース活性を有する酵素および該酵素を大量生産する手段を提供することができる。脂肪酸分子中に少なくとも２つの二重鎖結合を持つＣ１８－、Ｃ２０－又はＣ２２－脂肪酸は、遊離脂肪酸型又はグリセリドなどのそれらのエステル型で製造することが期待される。

Claims (17)

  1. ラビリンチュラ類に属する微生物を由来とする、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及び／又はΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。
  2. ラビリンチュラ類に属する微生物がスラウストキトリウム属（Thraustochytrium）に属する微生物である、請求項１記載の酵素。
  3. スラウストキトリウム属に属する微生物がThraustochytrium sp. ATCC 26185である、請求項２記載の酵素。
  4. 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示される酵素。
    （ａ）配列表配列番号１３のアミノ酸配列で示される、Δ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素。
    （ｂ）配列表配列番号１３のアミノ酸配列で示されるΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素のアイソフォーム。
    （ｃ）配列表配列番号１３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素。
    （ｄ）配列表配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素。
  5. 請求項４記載の酵素をコードするＤＮＡ。
  6. 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）に示されるＤＮＡである請求項５記載のＤＮＡ。
    （ａ）配列表配列番号１２で示されるＤＮＡ。
    （ｂ）配列表配列番号１２で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
    （ｃ）配列表配列番号１２で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素をコードするＤＮＡ。
    （ｄ）配列表配列番号１２で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
  7. 請求項５又は６のＤＮＡを含むベクター。
  8. 請求項７のベクターを組み込んだ宿主。
  9. 請求項８の宿主を培養し、その培養物からΔ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素を採取することを特徴とする、Δ9-エロンゲース活性及びΔ6-エロンゲース活性を有する酵素の製造方法。
  10. 請求項９記載の方法で得られた遺伝子組換酵素。
  11. 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示される酵素。
    （ａ）配列表配列番号１６のアミノ酸配列で示される、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。
    （ｂ）配列表配列番号１６のアミノ酸配列で示されるΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素のアイソフォーム。
    （ｃ）配列表配列番号１６で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。
    （ｄ）配列表配列番号１６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素。
  12. 請求項１１記載の酵素をコードするＤＮＡ。
  13. 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）に示されるＤＮＡである請求項１２記載のＤＮＡ。
    （ａ）配列表配列番号１５で示されるＤＮＡ。
    （ｂ）配列表配列番号１５で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
    （ｃ）配列表配列番号１５で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素をコードするＤＮＡ。
    （ｄ）配列表配列番号１５で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
  14. 請求項１２又は１３のＤＮＡを含むベクター。
  15. 請求項１４のベクターを組み込んだ宿主。
  16. 請求項１５の宿主を培養し、その培養物からΔ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素を採取することを特徴とする、Δ9-エロンゲース活性、Δ6-エロンゲース活性、及びΔ5-エロンゲース活性を有する酵素の製造方法。
  17. 請求項１６記載の方法で得られた遺伝子組換酵素。
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