JP2022190048A - 微生物油産生ラビリンチュラ類、微生物油、ならびにそれらの作成方法およびそれらの使用 - Google Patents

微生物油産生ラビリンチュラ類、微生物油、ならびにそれらの作成方法およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】 エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみでＰＵＦＡを生産するラビリンチュラを提供すること。【解決手段】 内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類。パリエティキトリウム属（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のいずれかに属する微生物である。【選択図】 図１

Description

本発明は、ラビリンチュラ類から得られる微生物油、微生物油産生ラビリンチュラ類、ならびに微生物油産生ラビリンチュラ類の使用に関する。
より詳細には、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、その生産に関するものであり、
脂肪酸組成が改変するように遺伝子改変されたラビリンチュラ類、好ましくはエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみでＰＵＦＡを生産するラビリンチュラ類、それらを用いたＰＵＦＡの製造方法およびそれらを用いて製造されたＰＵＦＡを含有する脂質（微生物油）およびそれらの使用に関する。
ラビリンチュラ類（Labyrinthulids）はラビリンチュラ目（Order Labyrinthulales）、ヤブレツボカビ目（Order Thraustochytriales）を含むラビリンチュラ綱（Class Labyrinthulomycetes）に属する真核微生物で、海洋に普遍的に存在することが知られている。また、ヤブレツボカビ目に属する微生物はヤブレツボカビ類（Thraustochytrids）と総称されることもある。
ラビリンチュラ類は、産業的には油糧微生物として注目されており、これらラビリンチュラ類が生産するＤＨＡはＤＨＡ含有脂質の原料や、高ＤＨＡ含有飼料等が製品化されている（非特許文献１）。具体的には、例えば、トラウストキトリウム属、シゾキトリウム属の生育技術（特許文献１）、トロウストチトリアレ類、トロウストチトリアレ類から抽出されるω－３ＨＵＦＡ（高度不飽和脂肪酸）の利用技術（特許文献２）等が挙げられる。
一般に、ＰＵＦＡはエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路（スタンダード経路と呼ばれることもある。）により生合成されることが知られているが、ある種のラビリンチュラ類はこれとは異なる経路、すなわちポリケチド合成酵素（ポリケチドシンターゼ、polyketide synthase、ＰＫＳ）による代謝経路でＰＵＦＡを生産することが明らかにされている（非特許文献２）。以下、本発明ではこの経路をＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路またはＰＫＳ経路と呼ぶ。この経路によって生産されるＰＵＦＡの組成は、そのほとんどがＤＨＡとＤＰＡｎ－6という特徴を有する。
ラビリンチュラ類（特にヤブレツボカビ類）はＰＵＦＡ生合成経路としてＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路のみを有し、他の生物では一般的なエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路を有さないと考える科学者もいる（非特許文献３）。実際、ラビリンチュラ類のＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の遺伝子破壊により当該ラビリンチュラ類は致死性となり、培地中にＰＵＦＡを添加しなければ生育できなくなったとの報告を例示することができる（非特許文献３）。この結果は、当該ラビリンチュラ類の生育にはＰＵＦＡが必須であり、唯一のＰＵＦＡ生合成経路であるＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の遺伝子が破壊されたため、生育のために外因性のＰＵＦＡを要求する性質に変化したことを意味する。
しかしこのような当業者の常識に反して、我々は検討の結果、ＰＵＦＡ生合成経路としてＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路とエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路の双方を有するラビリンチュラ類が存在することを見出した。具体的には特許文献３の明細書や非特許文献５に詳述されている。
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＡＴＣＣ３４３０４を例示すると、この株がエロンガーゼ/デサチュラーゼ経路のエントリー酵素であるΔ１２デサチュラーゼ遺伝子を有することを明らかにした。また、この遺伝子を相同組換えにより破壊した株は、Δ１２デサチュラーゼの基質であるオレイン酸を野生株と比較して顕著に蓄積することや、産物であるリノール酸およびその生合成系の下流に位置するＰＵＦＡの減少が見られることを明らかにした。さらに、この株はエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によってＰＵＦＡを生産することが可能なため、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路遺伝子を破壊しても致死性にならないことも明らかにした。この報告は、ラビリンチュラ類でもＰＵＦＡ生合成経路としてエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路が機能していることを初めて示したもので、非特許文献６でも取り上げられた。
冒頭で、主要な脂肪酸としてＤＨＡを産生するラビリンチュラ類が産業的に広く利用されていることを述べた。これに対し、ＤＨＡ以外の所望のＰＵＦＡを主要な脂肪酸として含有するラビリンチュラ類を作出することは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路とエロンガーゼ/デサチュラーゼ経路の双方を有するラビリンチュラ類の発見およびこれらに対する形質転換技術（特許文献３、非特許文献７）の適用によって初めて可能になった。すなわち、まず相同組換えによる遺伝子破壊によりＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の遺伝子を破壊し、次いでエロンガーゼ/デサチュラーゼ経路を構成する酵素の遺伝子を適宜破壊または過剰発現することにより、ＤＨＡ以外の特定のＰＵＦＡを主要な脂肪酸として含有する株を作出することが可能である。具体的には、特許文献３の実施例１２が例示される。この実施例には、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＡＴＣＣ３４３０４のＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の遺伝子を破壊し、次いでＣ２０エロンガーゼ遺伝子を破壊し、さらにミズカビ Saprolegnia diclina 由来ω３デサチュラーゼ遺伝子を導入することにより、野生株と比較してアラキドン酸が約６倍、ＥＰＡが約１０倍に増加し、かつＤＨＡが約１／１６倍に減少した株の作出に成功したことが記載されている。
特許３１２７１６１号公報 特許３６６９３７２号公報 ＷＯ２０１２／０４３８２６号 米国特許公開ＵＳ２００５／００１４２３１号公報
ツヴィ・コーエン(Zvi Cohen)ら編,「シングル セル オイルズ マイクロバイアル アンド アルガル オイルズ セカンド エディション(Single Cel1 0ils Microbial and Algal Oils 2nd edition)」,(米国),エイオーシーエス・プレス(AOCS Press),2010年,p.88 Metz JG, Roessler P, Faccioti D, et al. Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes. Science 2001;293:290-293 Ratledge C. Omega-3 biotechnology: Errors and omissions, Biotechnology Advances 30 (2012) 1746-1747 Lippmeier J.C. et al., Lipids, 44(7), 621-630(2009) Matsuda T, Sakaguchi K, Hamaguchi R, Kobayashi T, Abe E, Hama Y, Hayashi M, Honda D, Okita Y, Sugimoto S, Okino N, Ito M. The analysis of delta12 fatty acid desaturase function revealed that two distinct pathways are active for the synthesis of polyunsaturated fatty acids in Thraustochytrium aureum ATCC34304. J. Lipid Res. 53(6):1210-1222 (2012) ASBMB today June 2012 p.30 Sakaguchi K. et al., Versatile Transformation System That Is Applicable to both Multiple Transgene Expression and Gene Targeting for Thraustochytrids. Appl. Environ. Microbiol. 78(9):3193-3202 (2012) Yazawa K., Lipids, 31, Supple. 297-300 (1996) 日本農芸化学会会誌, 77, 2, 150-153(2003) 「バイオ実験イラストレイテッド 第２巻 遺伝子解析の基礎」、p63-68、秀潤社、1995年発行 Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 74, 5463 (1977) Cigan and Donahue, 1987; Romanos et al., 1992 Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Unit 13(1994)」 Guthrie C., Fink G. et al., Methods in Enzymology: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Volume 194(1991) Qiu, X., et al. J. Biol. Chem., 276, 31561-6 (2001) Abe E., et al., J. Biochem, 140, 247-253 (2006) 「バイオ実験イラストレイテッド 第２巻 遺伝子解析の基礎」、p117-128、秀潤社、1995年発行 DIG説明書集[日本語版] 8th, Roche Applied Science
本発明は、脂肪酸組成が改変するように遺伝子改変されたラビリンチュラ類、好ましくはエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみでＰＵＦＡを生産するラビリンチュラ類、それらを用いたＰＵＦＡの製造方法およびそれらを用いて製造されたＰＵＦＡを含有する脂質（微生物油）およびそれらの使用を提供することを課題とする。
ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路とエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路の双方を有するラビリンチュラ類を用いて、ＤＨＡ以外の特定のＰＵＦＡを主要な脂肪酸として含有する株を作出するためには、まずＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＤＨＡ生産を何らかの手段で停止あるいは抑制する必要があった。具体的には相同組換えによるＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の遺伝子の破壊の他に、ＵＶ照射や薬剤処理等による突然変異株の取得、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）によるＰＵＦＡ－ＰＫＳ遺伝子の発現抑制等の方法が考えられる。
これらの方法のうち、相同組換えによる遺伝子破壊については先述のとおり、技術的には確立されている。しかし、マーカーとして使用可能な薬剤耐性遺伝子の数は一般に限りがあるので、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の遺伝子の破壊にマーカーを用いると、さらなる遺伝子破壊や遺伝子導入の際に使用できるマーカーの数が減少するという問題があった。このことは、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の遺伝子の破壊の後に実施可能な遺伝子破壊・遺伝子導入の回数の減少を意味するので、より高性能な株を作出する上での障害となる。
また、突然変異やＲＮＡｉによる発現抑制は他生物では実績がある方法だが、ラビリンチュラ類におけるこれらの方法による所望の株の取得可能性は不明である。
本発明は、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類、それらを用いたＰＵＦＡを含有する脂質の製造方法およびそれらを用いて製造したＰＵＦＡを含有する脂質を提供することを目的とするものである。
本発明者らは鋭意検討の結果、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類が存在することを見出し、ラビリンチュラ類から得られる微生物油、微生物油産生ラビリンチュラ類、ならびに、それらの使用方法、および微生物油の使用に係る本発明を完成した。
本発明は、以下の（１）から（１６）に記載の微生物油を要旨とする。
（１）下記（ａ）～（ｇ）からなる群から選ばれる１以上を満たす微生物油であって、微生物が、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有する、下記（Ａ）または（Ｂ）の遺伝子改変されたラビリンチュラ類である、微生物油。
（ａ）ＡＲＡが全脂肪酸組成のうち、１０％以上であり、かつ遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後のＡＲＡのＧＣ面積比率が３倍以上である。
（ｂ）ＤＧＬＡが全脂肪酸組成のうち、１．９％以上であり、かつ遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後のＤＧＬＡのＧＣ面積比率が４倍以上である。
（ｃ）ＥＴＡが全脂肪酸組成のうち、０．３５％以上であり、かつ、遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後のＥＴＡのＧＣ面積比率が７倍以上である。
（ｄ）ＥＰＡが全脂肪酸組成のうち、４％以上であり、かつ遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後のＥＰＡのＧＣ面積比率が７倍以上である。
（ｅ）ｎ－６ＤＰＡが全脂肪酸組成のうち、０．２０％以下である。
（ｆ）ＤＨＡが全脂肪酸組成のうち、０．５０％以下である。
（ｇ）ＤＨＡとｎ－６ＤＰＡの合計が全脂肪酸組成のうち、０．７％以下である。
（Ａ）ＰＫＳ遺伝子、脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子、および／または脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を破壊または／および発現抑制することにより、脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類。（Ｂ）ＰＫＳ遺伝子、脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子、および／または脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を破壊または／および発現抑制することに加えて、さらに遺伝子を導入することにより、脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類。
（２）前記微生物油が、ＧＣ面積でｎ－６ＤＰＡ／ＤＴＡの値が１．５以下を満たす、（１）に記載の微生物油。（３）前記微生物油が、ＧＣ面積でＤＨＡ／ｎ－３ＤＰＡの値が４以下を満たす、（１）または（２）に記載の微生物油。（４）前記微生物油が、ＧＣ面積でＣ２０ＰＵＦＡ／Ｃ２２ＰＵＦＡの値が０．５以上５０以下を満たす、（１）ないし（３）のいずれかに記載の微生物油。（５）前記微生物油が、ＧＣ面積でｎ－６ＰＵＦＡ／ｎ－３ＰＵＦＡの値が１．8以上を満たす、（１）ないし（４）のいずれかに記載の微生物油。
（６）脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子がＣ２０エロンゲース遺伝子である、（１）ないし（５）のいずれかにに記載の微生物油。（７）脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ４デサチュラーゼ遺伝子またはω３デサチュラーゼ遺伝子である、（１）ないし（６）のいずれかに記載の微生物油。（８）導入する遺伝子が、脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子および/または脂肪酸不飽和化酵素遺伝子である、（１）ないし（７）のいずれかに記載の微生物油。
（９）ラビリンチュラ類の遺伝子を破壊または導入する方法が、エレクトロポレーション、遺伝子銃法またはゲノム編集である、（１）ないし（８）のいずれかに記載の微生物油。
（１０）ラビリンチュラ類の遺伝子を発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはＲＮＡ干渉である、（１）ないし（９）のいずれかに記載の微生物油。
（１１）内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類が、下記（Ｃ）または（Ｄ）のラビリンチュラ類である、（１）ないし（１０）のいずれかに記載の微生物油。 （Ｃ）ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であるラビリンチュラ類。 （Ｄ）元来有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを破壊あるいは極めて微弱に発現を抑制したラビリンチュラ類。
（１２）前記（Ｃ）ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であるラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類である、（１１）に記載の微生物油。
（１３）Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍに属し、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍに属するラビリンチュラ類である、（１２）に記載の微生物油。
（１４）Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ３５８、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０５、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍ ＳＥＫ３６４、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２９８またはＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ５７１、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０６であり、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ＡＴＣＣ２８２９である、（１２）に記載の微生物油。
（１５）前記（Ｄ）元来有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを破壊あるいは極めて微弱に発現を抑制したラビリンチュラ類が、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類である、（１１）に記載の微生物油。
（１６）Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍに属するラビリンチュラ類である、（１５）に記載の微生物油。
また、本発明は、以下の（１７）から（２１）に記載の微生物の使用方法を要旨とする。
（１７）微生物油中のＤＨＡ生産量を減少させるための微生物の使用方法であって、微生物が内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類であり、該ラビリンチュラ類を下記（Ａ）または（Ｂ）の脂肪酸組成が改変するように遺伝子改変することにより、遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後の微生物油中のＤＨＡのＧＣ面積比率を１／５倍以下とすることを特徴とする、微生物の使用方法。 （Ａ）ＰＫＳ遺伝子、脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子、および／または脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を破壊または／および発現抑制することにより、脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類。
（Ｂ）ＰＫＳ遺伝子、脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子、および／または脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を破壊または／および発現抑制することに加えて、さらに遺伝子を導入することにより、脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類。
（１８）前記微生物油が下記（ａ）～（ｇ）からなる群から選ばれる１以上を満たす、（１７）に記載の微生物の使用方法。
（ａ）ＡＲＡが全脂肪酸組成のうち、１０％以上であり、かつ遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後のＡＲＡのＧＣ面積比率が３倍以上である。
（ｂ）ＤＧＬＡが全脂肪酸組成のうち、１．９％以上であり、かつ遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後のＤＧＬＡのＧＣ面積比率が４倍以上である。
（ｃ）ＥＴＡが全脂肪酸組成のうち、０．３５％以上であり、かつ、遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後のＥＴＡのＧＣ面積比率が７倍以上である。
（ｄ）ＥＰＡが全脂肪酸組成のうち、４％以上であり、かつ遺伝子改変前に比較して遺伝子改変後のＥＰＡのＧＣ面積比率が７倍以上である。
（ｅ）ｎ－６ＤＰＡが全脂肪酸組成のうち、０．２０％以下である。
（ｆ）ＤＨＡが全脂肪酸組成のうち、０．５０％以下である。
（ｇ）ＤＨＡとｎ－６ＤＰＡの合計が全脂肪酸組成のうち、０．７％以下である。
（１９）導入する遺伝子が、脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子、および/または、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子である、（１７）に記載の微生物の使用方法。
（２０）脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子がＣ２０エロンゲース遺伝子であり、脂肪酸不飽和化酵素が、Δ４デサチュラーゼ遺伝子またはω３デサチュラーゼ遺伝子である、（１７）に記載の微生物の使用方法。
（２１）内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類が、下記（Ｃ）または（Ｄ）のラビリンチュラ類である、（１７）に記載の微生物の使用方法。
（Ｃ）ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であるラビリンチュラ類。 （Ｄ）元来有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを破壊あるいは極めて微弱に発現を抑制したラビリンチュラ類。
また、本発明は、以下の（２２）の食品、飼料、医薬または工業製品、（２３）の遺伝子改変されたラビリンチュラ類を要旨とする。（２２）（１）ないし（１６）のいずれかに記載の微生物油を含む、食品、飼料、医薬または工業製品。（２３）（１）ないし（１６）のいずれかに記載の微生物油を産生する、産生する脂肪酸組成が改変するように遺伝子改変された、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類。
エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路およびこの生合成経路を関わる酵素を示す。（符号の簡単な説明）C16:0：パルミチン酸（Palmitic Acid）、C18:0ステアリン酸（Stearic Acid）、C18:1n-9：オレイン酸（Oleic Acid）、C18:2n-6：リノール酸（LA, Linoleic Acid）、C18:3n-3：α-リノレン酸（ALA, α-Linolenic Acid）、C18:3n-6：γ-リノレン酸（GLA, γ-Linolenic Acid）、C18:4n-3：ステアリドン酸（STA, Stearidonic Acid）、C20:2n-6：エイコサジエン酸（EDA, Eicosadienoic Acid）、C20:3n-3：エイコサトリエン酸（ETrA, Eicosatrienoic Acid）、C20:3n-6：ジホモ-γ-リノレン酸（DGLA, Dihomo-γ-Linolenic Acid）、C20:4n-3：エイコサテトラエン酸（ETA, Eicosatetraenoic acid）、C20:4n-6：アラキドン酸（ARA, Arachidonic Acid）、20:5n-3：エイコサペンタエン酸（EPA, Eicosapentaenoic Acid）、C22:4n-6：ドコサテトラエン酸（DTA, Docosatetraenoic Acid）、C22:5n-3：n-3ドコサペンタエン酸（DPA n-3, Docosapentaenoic Acid）、C22:5n-6：n-6 ドコサペンタエン酸（DPA n-6, Docosapentaenoic Acid）、C22:6n-3：ドコサヘキサエン酸（DHA, Docosahexaenoic Acid）、C16e：C16エロンガーゼ（C16 elongase）、Δ9d：Δ9デサチュラーゼ（Δ9 desaturase）、Δ12d：Δ12デサチュラーゼ（Δ12 desaturase）、Δ15d：Δ15デサチュラーゼ（Δ15 desaturase）、Δ9e：Δ9エロンガーゼ（Δ9 elongase）、Δ6d：Δ6デサチュラーゼ（Δ6 desaturase）、Δ8d：Δ8デサチュラーゼ（Δ8 desaturase）、C18e：C18エロンガーゼ（C18 elongase）、Δ5d：Δ5デサチュラーゼ（Δ5 desaturase）、C20e：C20エロンガーゼ（C20 elongase）、Δ17d：Δ17デサチュラーゼ（Δ17 desaturase）、Δ4d：Δ4デサチュラーゼ（Δ4 desaturase） Δ15デサチュラーゼやΔ17デサチュラーゼはω3デサチュラーゼと呼ばれることがある。 サブクローニングしたpcDNA 3.1 Myc-His vector 由来のSV40 terminator配列を含むプラスミドを表す。 Fusion PCR に使用したプライマーと産物の模式図を表す。最終産物は、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoterと人工合成ネオマイシン耐性遺伝子の融合した配列になる。 作製した人工合成ネオマイシン耐性遺伝子 のBglIIカセットを表す。 Fusion PCR に使用したプライマーと産物の模式図を表す。最終産物は、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoterと pcDNA 3.1/ Hygro由来ハイグロマイシン耐性遺伝子の融合した配列になる。 作製したpcDNA 3.1/ Hygro由来ハイグロマイシン耐性遺伝子のBglIIカセットを表す。 クローニングしたParietichytrium属C20エロンガーゼ配列を含むプラスミドを表す。 図７記載プラスミドのParietichytrium属C20エロンガーゼ配列中にBglIIサイトを挿入したプラスミドを表す。 作製したParietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター(2種)を表す。薬剤耐性マーカーとして、ネオマイシン耐性遺伝子（pRH85）もしくはハイグロマイシン耐性遺伝子（pRH86）を有する。 Parietichytrium sarkarianum SEK364のC20エロンガーゼ遺伝子破壊株同定に用いたPCR用プライマーの位置、および予想される産物を示した模式図を表す。
Parietichytrium sarkarianum SEK364ゲノムDNAを鋳型にしたPCRによるC20エロンガーゼ遺伝子破壊の評価を表す。（符号の説明） ＋/＋：Parietichytrium sarkarianum SEK364 野生型株 ＋/－：Parietichytrium sarkarianum SEK364由来C20エロンガーゼ遺伝子1本目アリル相同組換体 －/－：Parietichytrium sarkarianum SEK364由来C20エロンガーゼ遺伝子破壊株 Parietichytrium sarkarianum SEK364 野生型株およびC20エロンガーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。黒棒と白棒は、それぞれ野生型株と遺伝子破壊株の脂肪酸組成を表している。値は、平均値±標準偏差の値である。 Parietichytrium sarkarianum SEK364 野生型株を100%とした時の、C20エロンガーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸割合を示す。 クローニングしたParietichytrium sp. SEK571 Δ4デサチュラーゼ遺伝子配列および周辺配列を含むプラスミドを表す。 図１４記載プラスミドからParietichytrium sp. SEK571 Δ4デサチュラーゼ遺伝子およびΔ4デサチュラーゼ遺伝子下流600bp配列を欠失させ、BglIIサイトを挿入したプラスミドを表す。 図１５記載プラスミドのBglIIサイトに人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を繋いだプラスミドを表す。 作製したParietichytrium属Δ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクターを表す。薬剤耐性マーカーとして、ネオマイシン耐性遺伝子を有する。 Parietichytrium属ラビリンチュラ類のΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株同定に用いたPCR用プライマーの位置、および予想される産物を示した模式図を表す（プライマーを相同組み換え領域内に設定）。 Parietichytrium sarkarianum SEK364ゲノムDNAを鋳型にしたPCRによるΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊の評価結果を表す。 Parietichytrium sarkarianum SEK364野生株とそのΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成のガスクロマトグラフ分析のチャートを表す。 図２０の部分拡大図を表す。 Parietichytrium sarkarianum SEK364野生株とそのΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。本表は図２０のチャートを数値化したものである。図中の＜は続く数字以下であることを示す。
Parietichytrium sp. SEK358株ゲノムDNAを鋳型にしたPCRによるC20エロンガーゼ遺伝子破壊の評価を表す。 （符号の説明） ＋/＋：Parietichytrium sp. SEK358野生型株－/－：Parietichytrium sp. SEK358株由来C20エロンガーゼ遺伝子破壊株 Parietichytrium sp. SEK358野生型株および、Parietichytrium sp. SEK358株由来C20エロンガーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。 白棒と黒棒は、それぞれ野生型株と遺伝子破壊株の脂肪酸組成を表している。 Parietichytrium sp. SEK358野生型株を100%とした時の、Parietichytrium sp. SEK358株由来C20エロンガーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸割合を示す。Parietichytrium sp. SEK358野生型株において、該当する脂肪酸が検出限界以下の場合は斜線で表記した。 Parietichytrium属ラビリンチュラ類のΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株同定に用いたPCR用プライマーの位置、および予想される産物を示した模式図を表す（プライマーを相同組み換え領域外に設定）。 プライマーを相同組み換え領域内に設定した場合の、Parietichytrium sp. SEK358ゲノムDNAを鋳型にしたPCRによるΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊の評価結果を表す。 プライマーを相同組み換え領域外に設定した場合の、Parietichytrium sp. SEK358ゲノムDNAを鋳型にしたPCRによるΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊の評価結果を表す。 Parietichytrium sp. SEK358野生株とそのΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成のガスクロマトグラフ分析のチャートを表す。 図２９の部分拡大図を表す。 Parietichytrium sp. SEK358野生株とそのΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。本表は図２９のチャートを数値化したものである。図中の＜は続く数字以下であることを示す。 Parietichytrium sp. SEK571株ゲノムDNAを鋳型にしたPCRによるC20エロンガーゼ遺伝子破壊の評価を表す。 （符号の説明）＋/＋：Parietichytrium sp. SEK571野生型株－/－：Parietichytrium sp. SEK571株由来C20エロンガーゼ遺伝子破壊株
Parietichytrium sp. SEK571野生型株および、Parietichytrium sp. SEK571株由来C20エロンガーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。 白棒と黒棒は、それぞれ野生型株と遺伝子破壊株の脂肪酸組成を表している。 Parietichytrium sp. SEK571野生型株を100%とした時の、Parietichytrium sp. SEK571株由来C20エロンガーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸割合を示す。 比較例１－２における、T. aureum ATCC 34304由来エロンガーゼ遺伝子を増幅するRACEの結果を示す。（符号の簡単な説明） １：合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および縮重オリゴヌクレオチドelo-Rを用いた5’-RACE ２：合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および縮重オリゴヌクレオチドelo-Fを用いた3’-RACE ３：elo-Rのみを用いた5’-RACE (negative control) ４：elo-Fのみを用いた3’-RACE (negative control) ５：合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチドのみを用いた5’-RACE (negative control) ６：合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチドのみを用いた3’-RACE (negative control) 比較例１－７における、KONeorを導入した形質転換体の評価を示す。(A) ゲノムDNAを鋳型としたPCRによる形質転換体の評価において、用いたオリゴヌクレオチドプライマー対を示す。（符号の簡単な説明） (1) Neor検出プライマー (SNeoFおよびSNeoR) (2) KO確認１(KO Pro F SmaIおよびKO Term R SmaI) (3) KO確認２(E2 KO ProF EcoRVおよびSNeoR) (4) KO確認３(SNeoFおよびE2 KO Term R EcoRV) (5) TaELO2検出 (E2 HindIIIおよびE2 XbaI)(B) ゲノムDNAを鋳型としたPCRによる形質転換体の評価における、アガロース電気泳動図を示す。（符号の簡単な説明） 1, 5, 9, 13, 17：形質転換体 2, 6, 10, 14, 18：野生株 3, 7, 11, 15, 19：KONeorを鋳型としたもの 4, 8, 12, 16：鋳型なし 尚、レーン番号の上には、用いたオリゴヌクレオチドプライマー対(1)～(5)を記載している。 比較例１－８における、サザンブロッティングによるTaELO2のコピー数の確認の結果を示す。（符号の簡単な説明） 1：ゲノムDNA (2.5 μg), BamHI処理 2： BglII処理 3： EcoRI処理 4： EcoRV処理 5： HindIII処理 6： KpnI処理 7： SmaI処理 8： XbaI処理 9：positive control (1 ngのE2 KO ProF EcoRVおよびE2 KO Term R EcoRVで増幅したPCR産物。TaELO2を含む) 比較例１－９における、TKONeorを導入した形質転換体のサザンブロッティングによる評価を示す。(A) 野生型アリル、もしくはTKONeor導入による変異アリルを検出するサザンブロッティングの模式図を示す。(B) サザンブロッティングの結果を示す。（符号の簡単な説明） 1：T. aureum野生株 (2.5 μgのゲノムDNA) 2, 3：TKONeor導入形質転換体 (2.5 μgのゲノムDNA) 4：positive control (50 ngのE2 KO ProF EcoRVおよびE2 KO Term R EcoRVで増幅したPCR産物。TaELO2を含む) 比較例１－１１における、KOub600Hygrの再導入によって得た形質転換体のゲノムDNAを鋳型にしたPCRによる評価を示す。(A) 用いたオリゴヌクレオチドプライマー対を示す。（符号の簡単な説明） (1) TaELO2 ORF検出 (SNeoFおよびSNeoR) (2) KO確認 (E2 KO Pro F EcoRVおよび ubi-hygro R)(B) KO確認のオリゴヌクレオチドプライマー対(1)を用いたPCRのアガロース電気泳動図を示す。矢印は、特異的産物の増幅が確認され、TaELO2欠損ホモ接合体と推定された形質転換体を示す。(C) TaELO2欠損ホモ接合体と同定された形質転換体における、TaELO2 ORF検出のオリゴヌクレオチドプライマー対(2)を用いたPCRのアガロース電気泳動図を示す。（符号の簡単な説明） 1：KOub600Hygrを鋳型としたもの 2：野生株 比較例１－１１における、KOub600Hygrの再導入によって得た形質転換体のサザンブロッティングによる評価を示す。(A) 野生型アリル、KONeor導入による変異アリル、およびKOub600Hygr導入による変異アリルを検出するサザンブロッティングの模式図を示す。(B) サザンブロッティングの結果を示す。（符号の簡単な説明） 1, 9：野生株 2-8および10-16：TaELO2欠損ホモ接合体 比較例１－１１における、TaELO2を検出するサザンブロッティングの結果を示す。（符号の簡単な説明） 1：野生株 2-5：T TaELO2欠損ホモ接合体 比較例１－１１における、TaELO2 mRNAを検出するRT-PCRのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。（符号の簡単な説明） 1-4：TaELO2欠損ホモ接合体 5：野生株 6-9：TaELO2欠損ホモ接合体、total RNAを鋳型にしたもの (negative control) 10：野生株、total RNAを鋳型にしたもの (negative control) 11：野生株ゲノムDNAを鋳型にしたもの (positive control)
比較例１－１２における、野生株、およびTaELO2欠損ホモ接合体の脂肪酸組成比較の結果を示す。 Fusion PCR に使用したプライマーと産物の模式図を表す。最終産物は、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来18S rDNA、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来EF1α promoter、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子およびThraustochytrium aureum ATCC 34304 由来EF1α terminator の融合した配列になる。 図４２で連結したDNA断片の一部をクローニングしたプラスミドを表す。Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来18S rDNAのEcoRIサイトより3’側の一部配列、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来EF1α promoter、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子、およびThraustochytrium aureum ATCC 34304 由来EF1α terminatorのNcoIサイトより5’側の一部配列を含む。 作製したThraustochytrium aureum ATCC 34304 PKS経路関連遺伝子orfAのターゲティングベクターを表す。薬剤耐性マーカーとして、ネオマイシン耐性遺伝子を有する。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 PKS経路関連遺伝子orfAの上流配列、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoter、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを表す。 作製したThraustochytrium aureum ATCC 34304 PKS経路関連遺伝子orfAのターゲティングベクターを表す。薬剤耐性マーカーとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304のPKS経路関連遺伝子orfA破壊株同定に用いたサザンハイブリダイゼーション解析用プローブの位置、および予想される遺伝子断片のサイズを示した模式図を表す。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304ゲノムDNAを用いたサザンハイブリダイゼーション法によるPKS経路関連遺伝子orfA遺伝子破壊の評価を表す。（符号の簡単な説明） T.au ：Thraustochytrium aureum ATCC 34304 野生型株 ＋/－：Thraustochytrium aureum ATCC 34304由来PKS経路関連遺伝子orfA 1本目アリル相同組換体 －/－：Thraustochytrium aureum ATCC 34304由来PKS経路関連遺伝子orfA遺伝子破壊株 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 野生型株およびPKS経路関連遺伝子orfA遺伝子破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。白棒と黒棒は、それぞれ野生型株と遺伝子破壊株の脂肪酸組成を表している。値は、平均値±標準偏差の値である。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 野生型株を100%とした時の、PKS経路関連遺伝子orfA遺伝子破壊株の脂肪酸割合を示す。
Fusion PCR に使用したプライマーと産物の模式図を表す。最終産物は、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoterと pTracer-CMV/Bsd/lacZ由来ブラスチシジン耐性遺伝子の融合した配列になる。 作製したpTracer-CMV/Bsd/lacZ由来ブラストサイジン耐性遺伝子 BglIIカセットを表す。 Fusion PCR に使用したプライマーと産物の模式図を表す。最終産物は、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoterと Enhanced GFP遺伝子（clontech社製）の融合した配列になる。 Fusion PCR に使用したプライマーと産物の模式図を表す。最終産物は、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoter、 Enhanced GFP遺伝子（clontech社製）およびpcDNA3.1 Zeo(+) 由来ゼオシン耐性遺伝子の融合した配列になる。 作製したEnhanced GFP－ゼオシン耐性融合遺伝子のBglIIカセットを表す。 クローニングしたThraustochytrium aureum ATCC 34304 C20エロンガーゼ配列および周辺配列を含むプラスミドを表す。 図５６記載プラスミドからThraustochytrium aureum ATCC 34304 C20エロンガーゼ配列を完全に欠失させ、BglIIサイトを挿入したプラスミドを表す。 作製したThraustochytrium aureum ATCC 34304 C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター(2種)を表す。薬剤耐性マーカーとして、ブラストサイジン耐性遺伝子（pRH43）もしくはEnhanced GFP－ゼオシン耐性融合遺伝子（pRH54）を有する。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 PKS経路（orfA遺伝子）破壊株の、C20エロンガーゼ遺伝子破壊株同定に用いたサザンハイブリダイゼーション解析用プローブの位置、および予想される遺伝子断片のサイズを示した模式図を表す。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304ゲノムDNAを用いたサザンハイブリダイゼーション法によるC20エロンガーゼ遺伝子破壊の評価を表す。（符号の簡単な説明）T.au ：Thraustochytrium aureum ATCC 34304 野生型株－/－：Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来PKS経路（orfA遺伝子）とC20エロンガーゼ遺伝子の2重破壊株
Thraustochytrium aureum ATCC 34304 野生型株および、PKS経路（orfA遺伝子）とC20エロンガーゼ遺伝子の2重破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。白棒と黒棒は、それぞれ野生型株と遺伝子破壊株の脂肪酸組成を表している。値は、平均値±標準偏差の値である。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 野生型株を100%とした時の、PKS経路（orfA遺伝子）とC20エロンガーゼ遺伝子の2重破壊株の脂肪酸割合を示す。 クローニングしたThraustochytrium aureum ATCC 34304株のΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流1071 bp～Δ4デサチュラーゼ遺伝子内1500 bpの配列を含むプラスミドを表す。 図６３記載プラスミドのΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流60 bpおよびΔ4デサチュラーゼ遺伝子内の開始コドンを含む556 bpの配列 (616 bp、配列番号：205) を欠失させ、かつ、欠失部分にBglII サイトを挿入したプラスミドを表す。 作製したThraustochytrium aureum ATCC 34304株のΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター(2種)を表す。薬剤耐性マーカーとして、ブラスチシジン耐性遺伝子（pTM6）もしくはEnhanced GFP－ゼオシン耐性融合遺伝子（pTM8）を有する。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 PKS経路（orfA遺伝子）破壊株の、Δ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株同定に用いたPCR用プライマーの位置、および予想される産物を示した模式図を表す。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304株ゲノムDNAを鋳型にしたPCRによるΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊の評価を表す。 （符号の簡単な説明）＋/＋：Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来PKS経路（orfA遺伝子）破壊株＋/－：Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来PKS経路（orfA遺伝子）破壊株由来の、Δ4デサチュラーゼ遺伝子1本目アリル相同組換体－/－：Thraustochytrium aureum ATCC 34304 由来PKS経路（orfA遺伝子）とΔ4デサチュラーゼ遺伝子の2重破壊株 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 野生型株および、PKS経路（orfA遺伝子）とΔ4デサチュラーゼ遺伝子の2重破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。 白棒と黒棒は、それぞれ野生型株と遺伝子破壊株の脂肪酸組成を表している。 Thraustochytrium aureum ATCC 34304 野生型株を100%とした時の、PKS経路（orfA遺伝子）とΔ4デサチュラーゼ遺伝子の2重破壊株の脂肪酸割合を示す。
ラビリンチュラ類という微生物において、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生合成経路として新しいパターンを見出したことが本発明の契機である。すなわち、ＰＵＦＡは一般にエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路により生合成されることが知られているが、一部の生物ではこれと別のＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路という経路で生合成するものもある。ラビリンチュラ類では（I）ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路のみで生産するタイプ、（II）エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路＋ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路で生産するタイプが存在するというのが従来の知見であった、今回、（III）エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産するタイプを新たに見出した。要は、ＰＵＦＡ生合成経路の新規の「パターン」を発見した、ということである。
たとえば、（１）内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類。当該発明は上記（III）エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産するタイプのラビリンチュラ類に関する。（III）のタイプのＰＵＦＡ生合成経路を有する野生株を単離し培養し増幅したものや、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路によるＰＵＦＡ生産能が「無いあるいは極めて微弱」であるラビリンチュラ類を包含する。
（２）内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路を有さないことを特徴とする、上記（１）に記載のラビリンチュラ類。当該発明は上記（１）を限定したもので、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路を構成する遺伝子や酵素自体を持っていないラビリンチュラ類のことである。
（３）内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の活性が無いあるいは極めて微弱であることを特徴とする、上記（１）に記載のラビリンチュラ類。当該発明は上記（１）を限定したもので、ゲノム上にＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路を構成する酵素の遺伝子に関する情報はあるが発現していない（したがい活性が無い）、あるいは極めて微弱にしか発現していないパターンのものを規定している。
（４）内因性Δ４ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ遺伝子の破壊によりＤＨＡおよび／またはＤＰＡ ｎ－６生産能を失う、またはＤＨＡおよび／またはＤＰＡ ｎ－６の生産量が顕著に減少することを特徴とする、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のラビリンチュラ類。
エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみでＰＵＦＡを生産する（III）のタイプのラビリンチュラ類は、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路が無いという点でＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路のみで生産する（I）のタイプやエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路＋ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路で生産する（II）のタイプと異なり、当該発明はこの観点に基づいてエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産するタイプのラビリンチュラ類を定義したものである。つまり、上記の内因性Δ４ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ遺伝子破壊は、エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産するタイプかどうかを判別する方法であるということができる。
（５）内因性Ｃ２０ ｅｌｏｎｇａｓｅ遺伝子の破壊によりＤＨＡおよび／またはＤＰＡｎ－６を生産能を失う、またはＤＨＡおよび／またはＤＰＡｎ－６の生産量が顕著に減少することを特徴とする、上記（１）ないし（３）に記載のラビリンチュラ類。
エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産する（III）のタイプのラビリンチュラ類は、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路が無いという点でＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路のみで生産する（I）のタイプやエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路＋ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路で生産する（II）のタイプと異なり、当該発明はこの観点に基づいてエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産するタイプのラビリンチュラ類を定義したものである。つまり、上記の内因性Ｃ２０ ｅｌｏｎｇａｓｅ遺伝子破壊は、エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産するタイプかどうかを判別する方法であるということができる。
（６）ラビリンチュラ類がパリエティキトリウム属（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のいずれかに属する微生物であることを特徴とする、上記（１）ないし（５）に記載のラビリンチュラ類。
Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属やＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類自体は本出願前から知られていたが、これらがＰＵＦＡをエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産する（III）のタイプのラビリンチュラ類であることは知られていなかった。
（７）微生物がＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ３５８（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０５）、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍＳＥＫ３６４（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２９８）、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ５７１（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０６）またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ＡＴＣＣ２８２０９であることを特徴とする、上記（６）に記載のラビリンチュラ類。
（８）上記（１）ないし（７）のいずれかに記載のラビリンチュラ類を培地で培養し、培養物から脂質を採取することを特徴とする、ＰＵＦＡを含有する脂質の製造方法。
（９）上記（１）ないし（７）のいずれかに記載のラビリンチュラ類を宿主として用いて、脂肪酸組成の改変および／または高度に脂肪酸を蓄積させることを目的として形質転換されたラビリンチュラ類を培地で培養し、培養物から採取することを特徴とするＰＵＦＡを含有する脂質の製造方法。
（１０）上記（８）または（９）の方法で生産された、ＰＵＦＡを含有する脂質。
本発明によりエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみでＰＵＦＡを生産するラビリンチュラを提供することができる。
エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路＋ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路で生産する（II）のタイプから突然変異や遺伝子組換えによってエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみで生産する（III）のタイプと同等のラビリンチュラ類を作出することも可能である。このようなものに、例えばトラウストキトリウム属（Thraustochytrium）に属する微生物が挙げられる。これらを使用することにより、（III）のタイプのラビリンチュラ類と同じような高度不飽和脂肪酸を得ることができる。
［微生物］
ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であるラビリンチュラ類とは、エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみでＰＵＦＡを生産するラビリンチュラ類を含む。ＰＵＦＡの生産能が極めて微弱とは、エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路の遺伝子を破壊してＰＵＦＡを生産できなくなり、ＰＵＦＡを培地に添加しないと培養できなくなるラビリンチュラ類をいう。生体内で合成されるＤＨＡのうち、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路を経由して合成されるＤＨＡが1/100以下であるものをいう。内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路でＰＵＦＡを生産できるラビリンチュラ類であれば特に限定されないが、特に好ましくはＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が例示される。その中でも特に好ましくはＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ３５８（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０５）、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍＳＥＫ３６４（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２９８）、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ５７１（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０６）またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ＡＴＣＣ２８２０９の菌株が挙げられる。
Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ３５８は、以下に述べる方法で得た。まず、石垣島・宮良川河口域で採取した表層水１０ｍｌを試験管に入れ、松花粉を添加して室温で放置した。７日後にこれら松花粉を無菌寒天培地（２ｇ グルコース、１ｇ ペプトン、０．５ｇ 酵母エキス、０．２ｇ クロラムフェニコール、１５ｇ 寒天、蒸留水 １００ｍｌ、海水９００ｍｌ）に塗布し、５日後に出現したコロニーを分離し培養することを数回繰り返し、菌体を分離した。この株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０５として平成２３年８月１１日に国際寄託されており、そこから入手可能である。
Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍＳＥＫ３６４は、石垣島・吹通川の河口域で採取した海水サンプルを、上記同様に培養し菌体を分離した。この株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２９８として平成２２年９月２４日に国際寄託されており、そこから入手可能である。
Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ５７１は、西表島・後良川の河口域で採取した海水サンプルを、上記同様に培養し菌体を分離した。この株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０６として平成２３年８月１１日に国際寄託されており、そこから入手可能である。
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ＡＴＣＣ２８２０９はＡＴＣＣに寄託されており、そこから入手可能である。元来有するＰＵＦＡ－ＰＫＳを破壊あるいは極めて微弱に発現を抑制したラビリンチュラ類とは、エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路＋ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路でＰＵＦＡを生産するラビリンチュラ類を含む。ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路のみでＰＵＦＡはＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路の存在が必須であり、破壊されるとＰＵＦＡ要求性となる。ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路を破壊してもＰＵＦＡを産生できるエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路＋ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路でＰＵＦＡを生産するラビリンチュラ類はＰＵＦＡ要求性とはならない点で違いがある。
本発明を利用して、Δ４デサチュラーゼを遺伝子破壊をすることにより、全体としてＰＵＦＡの生産量は維持しながら、ＤＨＡ，n-6ＤＰＡの生産量を劇的に少なくすることができる。
本発明で得られる微生物の持つ性質は、それぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。
［微生物油］
本発明は、本発明の脂肪酸プロファイルを含む微生物油に関する。本発明の微生物は菌体１ｇ中に脂質を15重量％以上、好ましくは30重量％以上、さらに好ましくは50重量％以上、さらにさらに好ましくは70重量％以上の脂質成分が含まれる。前記脂質成分には、30重量％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは70重量％以上の脂肪酸成分が含まれる。前記脂質酸成分は70重量％以上、好ましくは80重量％以上、さらに好ましくは90重量％以上トリグリセリドとして蓄積されている。本発明の微生物油は、少なくとも約３５重量％のトリアシルグリセロール画分を含む「粗油」又は「精製油」である。「粗油」は、微生物のバイオマスから抽出された、さらなる処理がされていない油である。「精製油」は、粗油を標準的な精製、脱色、及び／ 又は脱臭加工により処理して得られた油である。微生物油はまた「完成油」も含み、これは、植物油で希釈されている精製油である。「微生物」には、限定はされないが「微細藻類」、「ラビリンチュラ類」及び本明細書に記載される寄託微生物のいずれかに関連する分類学上の分類が含まれる。本明細書に記載される寄託微生物の微生物油のいずれかに関連して使用されるときの用語「ラビリンチュラ類」、「Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属」、「Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属」、及び「Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属」は、利用可能な系統発生学的情報を含む現在の分類学上の分類に基づいており、本願の出願日より後に分類学上の分類が改訂された場合には、限定することを意図するものではない。 ［脂質］
本発明において、脂質とは、ラビリンチュラ類が生産する脂質であり、主にトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸、ステロール類、カロテノイド類、炭化水素等である。
［脂質］
本発明において、脂質とは、ラビリンチュラ類が生産する脂質であり、主にトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸、ステロール類、カロテノイド類、炭化水素等である。
［高度不飽和脂肪酸］
本発明において、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）とは、炭素数１８以上、二重結合数３以上の脂肪酸であり、より好ましくは炭素数２０以上、二重結合数３以上の脂肪酸である。具体的にはリノール酸（LA,18:2n-6）,α-リノレン酸（ＡＬＡ, １８：３ｎ－３）、γ－リノレン酸（ＧＬＡ, １８：３ｎ－６）、ステアリドン酸（ＳＴＡ, １８：４ｎ－３）、ジホモ-γ-リノレン酸（ＤＧＬＡ, ２０：３ｎ－６）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ, ２０：４ｎ－３）、アラキドン酸（ＡＲＡ, ２０：４ｎ－６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ, ２０：５ｎ－３）、ドコサテトラエン酸（ＤＴＡ，２２：４ｎ－６）、ｎ－３ドコサペンタエン酸（ｎ－３ＤＰＡ, ２２：５ｎ－３）、ｎ－６ドコサペンタエン酸（ｎ－６ＤＰＡ, ２２：５ｎ－６）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ, ２２：６ｎ－３）等が例示される。本明細書において、アラキドンサンはＡＲＡとも表される。全脂肪酸組成とは、微生物を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した場合に検出される脂肪酸、具体的には炭素鎖14から22の脂肪酸の組成のことをいう。本発明においてＧＣ面積とはGCのチャートのピーク面積でをいう。全脂肪酸組成に対する割合は、全脂肪酸組成のピーク面積の合計に対する対象の脂肪酸のピーク面積の割合となり、百分率で表す。この発明でＣ２０ＰＵＦＡ/Ｃ２２ＰＵＦＡとは、炭素鎖２０の高度不飽和脂肪酸のGCピーク面積の合計を炭素鎖２２の高度不飽和脂肪酸のGCピーク面積の合計で割った値をいう。この発明においてn-6ＰＵＦＡ/n-3ＰＵＦＡとは炭素鎖２０以上のω６脂肪酸のGCのチャートのピーク面積を、炭素鎖２０以上のω３脂肪酸のGCのチャートのピーク面積で割った値をいう。
［ＰＵＦＡ生合成経路］
ＰＵＦＡの生合成に関して、２種の異なる経路が知られている。一つはポリケチド合成酵素（ポリケチドシンターゼ、polyketide synthase、ＰＫＳ）によって高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成する経路である。本発明において、この代謝経路をＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路またはＰＫＳ経路という。本発明においてPKS遺伝子とは、ポリケチド合成酵素を構成するタンパク質をコードする遺伝子をいう。ポリケチド合成酵素はアセチルＣｏＡ等のスターター基質にマロニルＣｏＡ等の伸長鎖基質を複数回縮合する反応を触媒する酵素であり、一般に植物や真菌等の二次代謝産物の生合成に関わる酵素として知られているが、ある種の生物においてはＰＵＦＡの生合成にも関与することが報告されている。例えば海洋細菌Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａはこの酵素によりエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を生産する（非特許文献８）。ある種のラビリンチュラ類でもポリケチド合成酵素が同様にＰＵＦＡの生合成に関わることが知られている。
もう一つはパルミチン酸等の脂肪酸から出発し、デサチュラーゼ（脂肪酸不飽和化酵素、ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）による不飽和化、エロンガーゼ（脂肪酸鎖長伸長酵素、ｅｌｏｎｇａｓｅ）による鎖長伸長を繰り返してＥＰＡやＤＨＡ等のＰＵＦＡを生成する経路であり、本発明において、エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路という。この系を構成する酵素としてＣ２０エロンガーゼ、Δ４デサチュラーゼなどの脂肪酸合成関連酵素が例示される。
［ＰＵＦＡ生合成経路の判別方法］
ラビリンチュラ類のＰＵＦＡ生合成経路を判別する方法を以下に述べる。ただしこれは一例に過ぎず、必ずしもこの方法で判別しなければならない訳では無いことは言うまでもない。
先述のようにラビリンチュラ類のＰＵＦＡ生合成経路として２つの経路が知られている。一つはＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路であり、この経路によりＤＨＡとＤＰＡｎ－６が生産される。この経路ではＤＨＡとＤＰＡｎ－６以外のＰＵＦＡはほとんど生産されないという特徴があり、この点はもう一つのＰＵＦＡ生合成経路であるエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路との大きな違いである。
もう一つの経路であるエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路を図１に示す。この経路を構成する酵素のうち、Δ４デサチュラーゼはＤＰＡｎ－３をＤＨＡに変換するのに関わる酵素である。また、この酵素はＤＴＡをＤＰＡｎ－６に変換するのにも関わっている。したがい、この酵素の遺伝子を破壊するとこれらの変換がなされないため、この酵素の基質であるＤＰＡｎ－３やＤＴＡが蓄積し、逆にこの酵素の産物であるＤＨＡやＤＰＡｎ－６が減少する。このΔ４デサチュラーゼ遺伝子を破壊したラビリンチュラ類において、もし産物であるＤＨＡおよび/またはＤＰＡｎ－６が全く検出されないあるいは顕著に減少した場合には、このラビリンチュラ類は内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡ（特にＤＨＡおよび/またはＤＰＡｎ－６）生産能が無いあるいはきわめて微弱であると判断される。
Δ４デサチュラーゼの代わりにＣ２０エロンガーゼを選択し、この酵素の遺伝子を破壊しても良い。すなわち、Ｃ２０エロンガーゼはＥＰＡをＤＰＡｎ－３に変換するのに関わる酵素である。また、この酵素はＡＲＡをＤＴＡに変換するのにも関わっている。したがい、この酵素の遺伝子を破壊するとこれらの変換がなされないため、この酵素の基質であるＥＰＡやＡＲＡが蓄積し、逆にこの酵素の産物であるＤＰＡｎ－３やＤＴＡが減少する。その結果、ＤＰＡｎ－３やＤＴＡを基質とするＤＨＡやＤＰＡｎ－６も減少する。このＣ２０エロンガーゼ遺伝子を破壊したラビリンチュラ類において、もし最終産物であるＤＨＡおよび/またはＤＰＡｎ－６が全く検出されないあるいは顕著に減少した場合には、このラビリンチュラ類は内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡ（特にＤＨＡおよび/またはＤＰＡｎ－６）生産能が無いあるいはきわめて微弱であると判断される。
遺伝子破壊は、対象となる遺伝子の一部または全部に抗生物質耐性遺伝子等で遺伝子産物が活性を生じないように設計されたものを遺伝子銃、エレクトロポレーション、ゲノム編集等の方法により細胞内に導入することにより行う。遺伝子の抑制は、対象となる遺伝子の発現が抑制されるよう設計されたアンチセンス遺伝子、RNAiが発現されるようにした遺伝子を遺伝子銃、エレクトロポレーション、ゲノム編集等の方法により細胞内に導入することにより行う。遺伝子の破壊、抑制は対象の遺伝子の発現が阻害されればよく、これらの方法に制限されない。PKS遺伝子を対象として、破壊、抑制をする場合には、酵素活性を消失または抑制できる限り限定されないが、OrfAを対象とすることが好ましい。
本発明は、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類を提供するものである。
また本発明は、ラビリンチュラ類のエロンガーゼ／デサチュラーゼ経路を構成する酵素の遺伝子を操作してラビリンチュラ類が産生する脂肪酸組成を変化させることを含むものであり、特に、（１）脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子の破壊または／および発現抑制、（２）脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の破壊または／および発現抑制、（３）脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子の導入、（４）脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入、および（５）これらの組合せによってラビリンチュラ類が産生する脂肪酸組成を改変することができる。例えばステアリドン酸（ＳＴＡ）を所望する時には、ステアリドン酸をエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）に変換するのに関わる脂肪酸鎖長伸長酵素の遺伝子、具体的にはＣ１８エロンガーゼ遺伝子を破壊または／および発現抑制すれば良い。また例えばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を所望する時には、エイコサペンタエン酸をドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）に変換するのに関わる脂肪酸鎖長伸長酵素の遺伝子、具体的にはＣ２０エロンガーゼ遺伝子を破壊または／および発現抑制すれば良い。また例えばエイコサペンタエン酸を所望する時には、アラキドン酸（ＡＲＡ）をエイコサペンタエン酸に変換する脂肪酸不飽和化酵素の遺伝子、具体的にはω３デサチュラーゼ遺伝子を導入すれば良い。エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路＋ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路で生産するラビリンチュラ類についても、ＰＵＦＡ－ＰＫＳ系路を破壊及び/または抑制した微生物により（１）脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子の破壊または／および発現抑制、（２）脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の破壊または／および発現抑制、（３）脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子の導入、（４）脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入、および（５）これらの組合せによってラビリンチュラ類が産生する脂肪酸組成を改変することができる。例えばステアリドン酸（ＳＴＡ）を所望する時には、ステアリドン酸をエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）に変換するのに関わる脂肪酸鎖長伸長酵素の遺伝子、具体的にはＣ１８エロンガーゼ遺伝子を破壊または／および発現抑制すれば良い。また例えばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を所望する時には、エイコサペンタエン酸をドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）に変換するのに関わる脂肪酸鎖長伸長酵素の遺伝子、具体的にはＣ２０エロンガーゼ遺伝子を破壊または／および発現抑制すれば良い。また例えばエイコサペンタエン酸を所望する時には、アラキドン酸（ＡＲＡ）をエイコサペンタエン酸に変換する脂肪酸不飽和化酵素の遺伝子、具体的にはω３デサチュラーゼ遺伝子を導入すれば良い。
ラビリンチュラ類の形質転換により、産生する脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類（微生物）が得られる。この脂肪酸生合成関連遺伝子が導入および/または破壊されてなるラビリンチュラ類は、例えば、不飽和脂肪酸の製造に利用することができる。不飽和脂肪酸の製造には、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類や上述の産生脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類を使用すればよく、その他の工程、製造設備・器具等の諸条件については、特に限定されるものではない。不飽和脂肪酸の製造には、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類や上述の改変方法によって産生する脂肪酸組成が改変された微生物を培養する工程を含み、微生物およびその培地を利用して、不飽和脂肪酸を製造する。
上記細胞の培養条件（培地、培養温度、通気状態等）は、細胞の種類や、目的とする不飽和脂肪酸の種類、その量等に応じて適宜設定することができる。なお、本発明での不飽和脂肪酸とは、不飽和脂肪酸を含む物質をも意味し、その含有量、純度、形状、組成、等は特に限定されるものではない。つまり、本発明では、脂肪酸組成が改変された細胞またはその培地自体を、不飽和脂肪酸とみなしてもよい。また、この細胞または培地から不飽和脂肪酸を精製する工程をさらに含んでいてもよい。不飽和脂肪酸を精製する方法としては、不飽和脂肪酸を始めとする脂質（複合脂質を含む）の精製方法として公知である方法を適用することができる。
［ラビリンチュラ類に高度に不飽和脂肪酸を蓄積させる方法］
ラビリンチュラ類に不飽和脂肪酸を蓄積させるには、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路によるＰＵＦＡの生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するラビリンチュラ類やこれらを形質転換したラビリンチュラ類を培養することにより達成される。例えば、通常用いられる固体培地あるいは液体培地等で培養する。この時、用いられる培地としては、例えば炭素源としてグルコース、フルクトース、サッカロース、デンプン、グリセリン等、また窒素源として酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等、また無機塩としてリン酸カリウム等、その他必要な成分を適宜組み合わせた培地であり、ラビリンチュラ類を培養するために通常用いられるものであれば特に限定されないが、特に好ましくは酵母エキス・グルコース培地（ＧＹ培地）が用いられる。培地は調製後、ｐＨを３．０～８．０の範囲内に調整した後、オートクレーブ等により滅菌して用いる。培養は、１０～４０℃、好ましくは１５～３５℃にて、１～１４日間、通気撹拌培養、振とう培養、あるいは静置培養で行えば良い。
産生した不飽和脂肪酸を回収するには、ラビリンチュラ類を培地で生育し、その培地から得た微生物細胞を処理し、細胞内脂質（高度不飽和脂肪酸を含む油脂含有物あるいは高度不飽和脂肪酸）を放出させ、脂質を回収する。すなわち、このようにして培養したラビリンチュラ類を遠心分離等により回収し、必要に応じて乾燥や細胞破砕等の処理を施し、定法に従い適当な有機溶媒や超臨界二酸化炭素、液化ジメチルエーテル等を用いて抽出することにより、ＰＵＦＡを含有する脂質を得ることができる。
本発明において得られる微生物油は、以下のいずれかの条件を満たすものである。本発明において得られる微生物油は、ＡＲＡが全脂肪酸組成のうち、５％以上、７％以上、１０％以上、１５％である。このようにして得られたＡＲＡが高い油脂は乳幼児用の栄養補給用途、成人向けの健康食品用途及び医薬用途に用いることができる。ＡＲＡは全脂肪酸組成の８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下とすることができる。本発明において得られる微生物油は、ＤＧＬＡが全脂肪酸組成のうち、２．５％以上、５％以上、10％以上である。このようにして得られたＤＧＬＡが高い微生物油は抗炎症剤をはじめとする医薬用途に用いることができる。ＤＧＬＡは全脂肪酸組成の８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下とすることができる。本発明において得られる微生物油は、ＥＴＡが全脂肪酸組成のうち、０．３５％以上、０．５％以上、０．７５％以上、1％以上である。このようにして得られたＥＴＡが高い微生物油は関節炎治療をはじめとする医薬用途に用いることができる。ＥＴＡは全脂肪酸組成の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下とすることができる。本発明において得られる微生物油は、ＥＰＡが全脂肪酸組成のうち、4％以上、6％以上、8％以上、10％以上、12％以上である。このようにして得られたＥＰＡが高い微生物油は栄養補給用途及び医薬用途に用いることができる。ＥＰＡは全脂肪酸組成の８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下とすることができる。本発明において得られる微生物油は、n-6ＤＰＡが全脂肪酸組成のうち、０．２０％以下、０．１５％以下、０．１％以下、０．０５％以下である。このようにして得られたn-6ＤＰＡが低い微生物油は他の脂肪酸の機能を阻害しにくい。また、n-6ＤＰＡを精製により除去したい場合には有利である。n-6ＤＰＡは全脂肪酸組成の０．００１％以上、０．００５％以上、０．０１％以上とすることができる。本発明において得られる微生物油は、ＤＨＡが全脂肪酸組成のうち、０．５０％以下、０．３％以下、０．２％以下、0，1％以下である。このようにして得られたＤＨＡが低い微生物油は他の脂肪酸の機能を阻害しにくい。また、ＤＨＡを精製により除去したい場合には有利である。ＤＨＡは全脂肪酸組成の０．００５％以上、０．０１％以上、０．０５％以上とすることができる。本発明において得られる微生物油は、ＤＨＡとn-6ＤＰＡの合計が全脂肪酸組成のうち、０．７％以下、０．８％以下、０．９％以下、１．０％以下である。このようにして得られたＤＨＡとn-6ＤＰＡが低い微生物油は他の脂肪酸の機能を阻害しにくく、酸化に安定である。また、ＤＨＡとn-6ＤＰＡを精製により除去したい場合には有利である。ＤＨＡとn-6ＤＰＡの合計は全脂肪酸組成の０．０５％以上、０．１％以上、０．５％以上とすることができる。これらの各脂肪酸の望ましい濃度は、合計100%を限度としてそれぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。
また別の態様では、本発明により得られる微生物油は、以下のいずれかの条件を満たすものである。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＬＡ/ＤＨＡの値が０．６以上、０．7以上、０．８以上、０．９以上１０以下、9以下、8以下、7以下、６以下である。このようにして得られた、ＬＡ／ＤＨＡの値が高い微生物油は、酸化に安定であり、ＤＨＡによるＬＡの機能が阻害されにくい。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＧＬＡ/ＤＨＡの値が０．３５以上、０．４以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上１０以下、9以下、8以下、7以下である。このようにして得られた、ＧＬＡ／ＤＨＡの値が高い微生物油は、酸化に安定であり、ＤＨＡによるＧＬＡの機能が阻害されにくい。
本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＧＬＡ/ＤＨＡの値が０．３５以上、０．４以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、１０以下、9以下、8以下、7以下6以下である。このようにして得られたＤＧＬＡ／ＤＨＡの値が高い微生物油は、抗炎症作用のある薬物などに利用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＡＲＡ/ＤＨＡの値が０．7以上、0.8以上、0.9以上、1.0以上、５０以下、45以下、40以下、３５以下、３０以下である。このようにして得られたＡＲＡ／ＤＨＡの値が高い微生物油は、乳児用調製乳に使用することができる。ＧＣ面積でＥＰＡ/ＤＨＡの値が０．３５以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、５０以下、45以下、40以下、35以下、３０以下である。通常医薬品等で利用されているＥＰＡはＤＨＡを含むエステル体が主流であるが、このようにして得られたＥＰＡ／ＤＨＡの値の高い微生物油はＥＰＡを高純度で含み、健康食品、医薬等に使用することができる。
これらの各脂肪酸の望ましい比率は、それぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＬＡ/ＥＰＡの値が０．０６以上、0.07以上、0.08以上、０．０９以上、0.12以下、0.1以下、0.08以下0.06以下である。このようにして得られるＬＡ／ＥＰＡの値の低い微生物油は、炎症作用の低い輸液等に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＧＬＡ/ＥＰＡの値が０．０４以上、0.４５以上、0.12以下、0.1以下、0.8以下である。このようにして得られたＧＬＡ／ＥＰＡの値の低い微生物油は、炎症性の低い輸液等に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＴＡ/ＥＰＡの値が0.01以上、0.02以上、0.03以上、0.04以上、0.05以上、０．４以下、0.35以下、0.3以下である。ここで得られるＤＴＡ／ＥＰＡの値が低い微生物油は、ＤＴＡとＥＰＡはＧＣにおいて接近しているため、純度の高いＥＰＡを分離するために有用である。これらの各脂肪酸の比率は、それぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。
本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＴＡ/ＡＲＡの値が0.01以上、0.03以上、0.05以上、0.07以上、0.1以上、、０．４５以下、0.4以下、0.35以下、0.3以下である。ここで得られるＤＴＡ／ＡＲＡの値が低い微生物油は、乳幼児用調製乳に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＴＡ/ＤＧＬＡの値が０．０１以上、0.05以上、0.1以上、0.15以上、0.2以上、１．４５以下、1.4以下、1.3以下、1.2以下、1.1以下である。ここで得られるＤＴＡ／ＤＧＬＡの値が低い微生物油は、抗炎症作用のある医薬品等に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＬＡ/ n-6ＤＰＡの値が0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、20以下、18以下、16以下、14以下、12以下である。ここで得られるＬＡ／n-6ＤＰＡの値が高い微生物油は、食用油に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＧＬＡ/ n-6ＤＰＡの値が0.2以上、0.4以上、0.6以上、0.8以上、10以下、8以下、6以下、4以下である。本発明において得られるＧＬＡ／n-6ＤＰＡの値の高い微生物油は、健康食品やサプリメントに使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＧＬＡ/ n-6ＤＰＡの値が０．３５以上、0.5以上、０．７５以上1.0以上、３０以下、2７以下、25以下、22以下、20以下である。ここで得られるＤＧＬＡ／n-6ＤＰＡの値が高い微生物油は、抗炎症作用のある薬物に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積ＡＲＡ/ n-6ＤＰＡの値が０．7以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下である。ここで得られるＡＲＡ／n-6ＤＰＡの値が高い微生物油は、乳幼児用調製乳に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＥＰＡ/ n-6ＤＰＡの値が0.4以上、0.6以上、0.8以上、1以上、2以上、5以上、７０以下、60以下、50以下、40以下、30以下である。ここで得られるＥＰＡ／n-6ＤＰＡの値が高い微生物油は、健康食品、サプリメント等に使用することができる。これらの各脂肪酸の望ましい比率は、それぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。
本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＧＬＡ/ＬＡの値が１．4以上、2以上、3以上、１０以下、9以下、8以下、7以下である。ここで得られる微生物油は、抗炎症作用のある食品やサプリメントに使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＡＲＡ/ ＬＡの値が５．１以上、7以上、9以上、11以上、２０以下、17以下、15以下、12以下である。ここで得られるARA/ＬＡの値が高い微生物油は、飼料や乳幼児用調製乳に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＥＰＡ/ＬＡの値が5.5以上、7以上、9以上、11以上、13以上、３０以下、25以下、22以下、２０以下である。ここで得られるＥＰＡ／ＬＡの値が高い微生物油は、医薬や健康食品に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＴＡ/ＬＡの値が０．０１以上、0.05以上、0.0７以上、0.1以上、０．4以下、0.35以下、0.33以下、0.3以下、０．28以下である。ここで得られるＤＴＡ／ＬＡの値が低い微生物油は、飼料や食品に使用することができる。これらの各脂肪酸の望ましい比率は、それぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。
本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＧＬＡ/ＧＬＡの値が４．５以上、5以上、6以上、7以上、２０以下、17以下、15以下、12以下である。ここで得られるＤＧＬＡ／ＧＬＡの値が高い微生物油は、抗炎症作用のある医薬品等に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＡＲＡ/ ＧＬＡの値が９以上、10以上、12以上、13以上、14以上、３０以下、28以下、26以下、24以下、22以下である。ここで得られるＡＲＡ／ＧＬＡの値が高い微生物油は、乳幼児用調製乳に使用することができる。これらの各脂肪酸の望ましい比率は、それぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。
本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でn-6ＤＰＡ/ＤＴＡの値が0.001以上、０．０１以上、0.02以上、１．５以下、1.4以下、1.3以下、1.2以下、1.1以下である。ここで得られる微生物油は、動脈硬化を予防する食品等に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＤＨＡ/n-3ＤＰＡの値が0.001以上、０．０１以上、0.02以上、４以下、4.5以下、4以下、3.5以下である。ここで得られる微生物油は、飼料または健康食品に使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でＣ２０ＰＵＦＡ/Ｃ２２ＰＵＦＡの値が０．５以上、０．７以上、1以上、1.2以上、５０以下、45以下、40以下、35以下である。ここで得られるＣ２０ＰＵＦＡ/Ｃ２２ＰＵＦＡの値が大きい微生物油は、健康食品やサプリメントに使用することができる。本発明において得られる微生物油は、ＧＣ面積でn-6ＰＵＦＡ/n-3ＰＵＦＡの値が１．8以上、2以上、2.5以上、3以上、100以下、80以下、70以下、60以下、50以下である。ここで得られるn-6ＰＵＦＡ/n-3ＰＵＦＡの値が高い微生物油は、食用油や飼料に使用することができる。これらの各脂肪酸の望ましい比率は、それぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。
上記のこれらの各脂肪酸の望ましい比率はそれぞれ任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。またこれらの比率と上記の各脂肪酸の望ましい濃度は、濃度が合計100％を限度として、任意に組み合わせることにより、それぞれ所望の性質を組み合わせることができる。
また、本発明の不飽和脂肪酸は、種々の医薬品、食品、飼料、または工業製品も含まれ、その利用分野は特に限定されない。また、本発明の不飽和脂肪酸含有油脂が含まれる食品には、サプリメント等の健康食品や、食品添加物等が含まれる。また、工業製品としては、人以外の生物を対象とした飼料、フィルム、生分解性プラスチック、機能性繊維、潤滑油、洗剤等が挙げられる。
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。また、本明細書において、発明の各態様に関する一実施形態中で説明された各発明特定事項は、任意に組み合わせて新たな実施形態としてもよく、このような新たな実施形態も、本発明の各態様に包含され得るものとして、理解されるべきである。
［ラビリンチュラ類とその培養法・保存法］
（１）本発明で使用する菌株
Parietichytrium sp. SEK358 (FERM BP-11405)、Parietichytrium sarkarianum SEK364 (FERM BP-11298)及びParietichytrium sp. SEK571 (FERM BP-11406)は甲南大学理工学部より分譲を受けた。Thraustochytrium aureum ATCC34304はATCCより分譲を受けた。
（２）培地組成
ｉ．寒天平板培地組成
PDA寒天平板培地
0.78% (w/v) ポテトデキストロース寒天培地 (日水製薬社製)、1.75% (w/v) シーライフ (マリンテック社製) 、1.21% (w/v) 寒天末 (ナカライテスク社製) を混合し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌を行った。十分に冷却後に、バクテリアのコンタミネーションを防ぐために終濃度が100 μg/mlとなるようにアンピシリン酸ナトリウム (ナカライテスク社製) を添加し、シャーレに分注して平らな所に静置して固化させた。
ｉｉ．液体培地組成
GY液体培地
3.18% (w/v) グルコース (ナカライテスク社製)、1.06% (w/v) 乾燥酵母エキス (ナカライテスク社製)、1.75% (w/v) シーライフ (マリンテック社製)を混合し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌後に、100 μg/mlのアンピシリン酸ナトリウム (ナカライテスク社製) を添加した。
PD液体培地
0.48% (w/v) ポテトデキストロース (Difco社製)、1.75% (w/v) シーライフ (マリンテック社製) を混合し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌後に、100 μg/mlのアンピシリン酸ナトリウム (ナカライテスク社製) を添加した。
（３）培養方法
ｉ．寒天平板培養
ラビリンチュラ菌体を白金耳、もしくはスプレッダーを用いて接種し、25℃で静置培養することでコロニーを出現させた。その継代培養に関しては、コロニーを白金耳で釣菌して滅菌生理食塩水に懸濁後、その懸濁液を白金耳、もしくはスプレッダーを用いて塗布することで行った。尚、必要に応じて平板上の菌体を液体培地に接種することで、液体培養への転換を行った。
ｉｉ．液体培養
ラビリンチュラ菌体を接種し、三角フラスコ、もしくは試験管を用いて、25℃、150 rpmの回転数で攪拌しながら懸濁培養を行った。その継代培養に関しては、増殖が確認された対数増殖期～定常期までの培養液を、新しいGYもしくはPD液体培地に対して1/200～1/10容添加することで行った。尚、必要に応じて細胞培養液をPDA寒天平板培地に塗布することで、寒天平板培養への転換を行った。
（４）ラビリンチュラ類の保持・保存法
継代培養に加えて、グリセロールストック作製による凍結保存を行った。すなわち、GY液体培地を用いた対数増殖期～定常期の細胞懸濁液に対して、終濃度が15% (v/v) のグリセロール (ナカライテスク社製) を添加し、-80℃のディープフリーザー中にて保存した。
[Parietichytrium sarkarianum SEK364のC20エロンガーゼ遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定]
［実施例２－１］SV40 terminator配列のサブクローニング
pcDNA 3.1 myc-His vector (invitrogen)を鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社製) によりSV40 terminator配列を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、RHO58はSV40 terminator配列上に設定し、BglIIおよびBamHIリンカー配列を含む。RHO52はSV40 terminator配列上に設定し、BglII配列を含む。 [RHO58: 34mer: 5’- CAG ATC TGG ATC CGC GAA ATG ACC GAC CAA GCG A-3’ (配列番号1)、 RHO52: 24mer: 5’- ACG CAA TTA ATG TGA GAT CTA GCT -3’ (配列番号2) ]。下記の条件で増幅後、pGEM-T easy vector (Promega社製) にクローニングした。[PCR cycles: 98℃ 2 min/ 98℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 1min]。大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製）を用いて配列を確認した。これをpRH27と名付けた。
サブクローニングしたSV40 terminator配列 (342 bp、配列番号3) を含むプラスミド (pRH27) を図２に示す。
［実施例２－２］人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットの作製
Thraustochytrium aureum ATCC 34304株をGY培地で培養し、対数増殖期後期の細胞を4℃、3,500×g、5 min遠心してペレットにし、液体窒素にて凍結後破砕した。細胞破砕液をフェノール抽出後、エタノール沈殿させ、沈殿をTE溶液に溶解した。TE溶液に溶解した核酸を37℃、30 min RNase 処理してRNAを分解し、再度フェノール抽出後、エタノール沈殿させ、沈殿をTE溶液に溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。
これを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）によりubiquitin promoter 配列 (619 bp、配列番号4) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、RHO53はubiquitin promoter 配列上に設定、BglIIリンカー配列を含む。TKO1はubiquitin promoter 配列と人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含む。 [RHO53: 36mer: 5’- CCC AGA TCT GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG -3’ (配列番号5)、TKO1: 58mer: 5’- CGT GAA GGC CGT CCT GTT CAA TCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCT G -3’ (配列番号6) ]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 1min]。
人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）により人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列 (826 bp、配列番号7) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、TKO2はubiquitin promoter 配列と人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含む。RHO57は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含み、BglIIリンカー配列を有する。[TKO2: 54mer: 5’- AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGC CAA CAT GAT TGA ACA GGA CGG CCT TCA CGC TGG -3’ (配列番号8)、RHO57: 26mer: 5’- CAG ATC TCA AAA GAA CTC GTC CAG GA -3’ (配列番号9)]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 1min]。
配列番号4および7を鋳型に、非特許文献９記載の方法に従ってRHO53 (配列番号5) およびRHO57 (配列番号9) を用いFusion PCRを行った。酵素はLA Taq Hot start version（タカラバイオ社製）を使用し、PCR cycles: 94℃ 2min/ 94℃ 20 sec, 55℃ 30 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 1min（ただし55℃から68℃へは1℃/ 10sec とした）の条件で増幅後、BglIIにて消化した。(図３)。
上記のようにしてFusionしたThraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoter－人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列 (1395 bp、配列番号10) を、BglIIにて消化し、これを実施例２－１記載pRH27のBamHIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製）を用いて配列を確認した。これをpRH31と名付けた。
作製した人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセット (pRH31) を図４に示す。
［実施例２－３］ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットの作製
Thraustochytrium aureum ATCC 34304 ゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）によりubiquitin promoter 配列 (617 bp、配列番号11) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、RHO53はubiquitin promoter 配列上に設定、BglIIリンカー配列を含む。KSO8はubiquitin promoter 配列とハイグロマイシン耐性遺伝子配列を含む。 [RHO53: 36mer: 5’- CCC AGA TCT GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG -3’ (実施例２－２記載。配列番号5)、KSO8: 58mer: 5’- TCG CGG TGA GTT CAG GCT TTT TCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCT G -3’ (配列番号12)]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。
pcDNA 3.1/ Hygro(invitrogen社製) を鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）によりハイグロマイシン耐性遺伝子 (1058 bp、配列番号13) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、KSO7はubiquitin promoter 配列とハイグロマイシン耐性遺伝子配列を含む。RHO56はハイグロマイシン耐性遺伝子を含み、BglIIリンカー配列を有する。[KSO7: 56mer: 5’- AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGC CAA CAT GAA AAA GCC TGA ACT CAC CGC GAC GTC TG -3’ (配列番号14)、RHO56: 36mer: 5’- CAG ATC TCT ATT CCT TTG CCC TCG GAC GAG TGC TGG -3’ (配列番号15)]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。
配列番号11および13を鋳型に、非特許文献９記載の方法に従ってRHO53 (実施例２－２記載。配列番号5) およびRHO56 (配列番号15) を用いてFusion PCRを行った。酵素はLA Taq Hot start version（タカラバイオ社製）を使用し、下記の条件で増幅後、BglIIにて消化した。 [PCR cycles: 94℃ 2min/ 94℃ 20 sec, 55℃ 30 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 1min。ただし55℃から68℃へは1℃/ 10sec とした] (図５)。
上記のようにしてFusionしたThraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoter－pcDNA 3.1/ Hygro(invitrogen社製)由来ハイグロマイシン耐性遺伝子 (1625 bp、配列番号16) を、BglIIにて消化し、これを実施例２－１、図２記載pRH27のBamHIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。これをpRH32と名付けた。
作製したハイグロマイシン耐性遺伝子カセット (pRH32) を図６に示す。
［実施例２－４］Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子のクローニング
実施例２－２記載の方法でParietichytrium sarkarianum SEK364のゲノムDNAを抽出し、ゲノムを解読した。
C20エロンガーゼ遺伝子に保存される領域を標的として、正方向 (PsTaELO2 F1；5’- CCT TCG GCG CTC CTC TTA TGT ATG T -3’) (配列番号17)、および逆方向 (PsTaELO2 R2；5’- CAA TGC AAG AGG CGA ACT GGG AGA G-3’) (配列番号18) のオリゴヌクレオチドを合成した。次に、実施例２－２に記載の方法で調製したParietichytrium sarkarianum SEK364ゲノムDNAを鋳型として、オリゴヌクレオチドPsTaELO2 F1およびPsTaELO2 R2を用いたPCRを、LA Taq Hot start version (TaKaRa)を用いて行った [PCR cycles: 98℃ 1 min/98℃ 10 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/72℃ 7 min/4℃ ∞]。得た特異的増幅産物をゲル精製し、ダイレクトシーケンスによってその塩基配列を解析したところ、既知のC20エロンガーゼ遺伝子の配列と有意な相同性を示すことから、Parietichytrium sarkarianum SEK364由来C20エロンガーゼ遺伝子の部分配列であることが示唆された。
続いて、後述する比較例１－２の場合と同様に、3’および5’RACEによるParietichytrium sarkarianum SEK364由来C20エロンガーゼ遺伝子のクローニングを行った。まず、正方向オリゴヌクレオチドプライマー (PsRACE F1；5’- TGG GGC TCT GGA ACC GCT GCT TAC G -3’) (配列番号19) および (PsRACE F2；5’- CTT CCA GCT CTC CCA GTT CGC CTC T -3’) (配列番号20)、逆方向オリゴヌクレオチドプライマー (PsRACE R1；5’- CGG GTT GTT GAT GTT GAG CGA GGT G-3’) (配列番号21) および (PsRACE R2；5’- CCC ACG CCA TCC ACG AGC ACA CCA C-3’) (配列番号22) を設計した。次に、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech社製) によって作製したcDNAライブラリを鋳型に、合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および前述したオリゴヌクレオチドPsRACE F1もしくはPsRACE R1を用いた3’-および5’-RACE [PCR cycles: 94℃ 30 sec 5 cycles/94℃ 30 sec, 70℃ 30 sec, 72℃ 3 min, 5 cycles/94℃ 30 sec, 68℃ 30 sec, 72℃ 3 min, 25 cycles /4℃ ∞] を行った。続いて、得た両RACE産物を鋳型として、合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および前述したオリゴヌクレオチドPsRACE F2もしくはPsRACE R2を用いたnested PCR [PCR cycles: 94℃ 1 min/94℃ 30 sec, 68℃ 30 sec, 72℃ 3 min, 25 cycles/72℃ 10 min /4℃ ∞] を行った。得た特異的産物をゲル精製し、pGEM-T easy Vector (Promega社製) を使用したTAクローン化後に塩基配列を解析した結果、Parietichytrium sarkarianum SEK364由来C20エロンガーゼ遺伝子であることが確認された。
さらに、実施例２－２に記載の方法で抽出したParietichytrium属のゲノムDNAを鋳型にし、LA Taq Hot start version (タカラバイオ社製) によりC20 エロンガーゼ遺伝子配列を含む配列 (957 bp、配列番号23) を増幅した。用いたPCR primerは下記のとおりで、RHO153は開始コドンを含み、リンカー配列としてBamHIサイトを有する。RHO154は終止コドンを含み、リンカー配列としてBamHIサイトを有する。[RHO153: 32 mer: 5’- CCC GGA TCC ATG GCA GCT CGC GTG GAG AAA CA -3’ (配列番号24)、RHO154: 33 mer: 5’- CCC GGA TCC TTA CTG AGC CTT CTT GGA GGT CTC -3’ (配列番号25) ]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。
得られたDNA断片はpGEM-T easy vector にクローニングし、大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。
Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子936 bp (配列番号26) をクローニングした。これをpRH80と名付けた(図７)。アミノ酸配列を配列番号27に示す。
［実施例２－５］Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台プラスミド作製
実施例２－４で作製したpRH80 (図７) を鋳型に、C20 エロンガーゼ遺伝子配列中腹部分にBglIIサイトを挿入する様、逆向きに設定したprimer setを用意し、PrimeSTAR Max DNA Polymerase (タカラバイオ社製) にて増幅した。用いたPCR primer は下記の通りでともにBglIIリンカー配列を有する。 [RHO155: 26 mer: 5’- ACA AAG ATC TCG ACT GGA CCG ACA CC -3’ (配列番号28)、 RHO156: 27 mer: 5’- AGT CGA GAT CTT TGT CAG GAG GTG GAC -3’ (配列番号29)]。[PCR cycles: 98℃ 2 min/ 98℃ 10 sec, 56℃ 15 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 1 min]。上記条件で増幅後、BglIIにて消化したのち、セルフライゲーションした。ライゲーションしたサンプルは大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製）を用いて配列を確認した。これをpRH83と名付けた。BglIIサイトを挿入したC20エロンガーゼ遺伝子配列 935 bpを配列番号30に示す。
作製したParietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台プラスミド (pRH83) を図８に示す。
［実施例２－６］ターゲティングベクターの作製（人工合成ネオマイシン遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子）
実施例２－２記載のpRH31 (図４) をBglIIにて消化し、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例２－５記載pRH83 (図８) のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH85と名付けた。
実施例２－３記載のpRH32 (図６)をBglIIにて消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例２－５記載pRH83 (図８) のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH86と名付けた。
作製した2種のターゲティングベクター(pRH85および86)を図９に示す。
［実施例２－７］C20エロンガーゼ遺伝子ターゲッティングベクター導入
実施例２－６で作製した2種類のターゲティングベクターを鋳型に、RHO153 (実施例２－４記載、配列番号24) およびRHO154 (実施例２－４記載、配列番号25) をprimerとして用いて、PrimeSTAR Max DNA polymerase（タカラバイオ社製）により遺伝子を増幅した。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を0.1×TEに溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。実施例２－６記載pRH85 (図９) を鋳型とした際に得られる導入断片は 2661 bpで、Parietichytrium属 C20エロンガーゼ遺伝子前半－SV40 terminator配列－人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列－ubiquitin promoter配列－Parietichytrium属 C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる (配列番号31)。実施例２－６記載pRH86 (図９) を鋳型とした際に得られる導入断片は 2892 bpで、Parietichytrium属 C20エロンガーゼ遺伝子前半－SV40 terminator配列－ハイグロマイシン耐性遺伝子配列－ubiquitin promoter配列－Parietichytrium属 C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる (配列番号32)。
Parietichytrium sarkarianum SEK364株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD600 = 1～1.5相当分の細胞に対し、0.625μgのDNA断片を遺伝子銃法（マイクロキャリア：0.6 micronの金粒子、target distance：6 cm、chamber vacuum：26 mm Hg、Rupture disk：1,550 PSI）により導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地(2 mg/ml G418 含有もしくは2 mg/ml ハイグロマイシン含有)に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり10から20個の薬剤耐性株を得た。
［実施例２－８］C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定
実施例２－２記載の方法で、Parietichytrium sarkarianum SEK364株、および、C20エロンガーゼ遺伝子ヘテロ相同組換体、C20エロンガーゼ遺伝子ホモ相同組換体（遺伝子破壊株）よりゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、LA Taq Hot start version (タカラバイオ社製) を用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズを図１０に示す。RHO184はC20 エロンガーゼ上流、RHO185は下流、RHO142およびRHO143は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子上、RHO140およびRHO141はハイグロマイシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。[RHO140: 20 mer: 5’- GGT TGA CGG CAA TTT CGA TG -3’ (配列番号33)、RHO141: 22 mer: 5’- CCT CCT ACA TCG AAG CTG AAA G -3’ (配列番号34)、RHO142: 21 mer: 5’- CTT CTC GGG CTT TAT CGA CTG -3’ (配列番号35)、RHO143: 22 mer: 5’- TAA GGT CGG TCT TGA CAA ACA G -3’ (配列番号36)、RHO184: 24 mer: 5’- AGT AGT CCC CGA TTT GGT AGT TGA -3’ (配列番号37)、RHO185: 22 mer: 5’- GGC AGA GAG CAA AAA CAC GAG C-3’ (配列番号38)]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 4 min, 30 cycles/ 68℃ 7min]。
野生型アリル (Wt allele) に増幅がなく、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子アリル (NeoR allele) およびハイグロマイシン耐性遺伝子アリル (HygR allele) に増幅があるC20 エロンガーゼ遺伝子破壊株が得られた (図１１)。
［実施例２－９］C20エロンガーゼ遺伝子破壊による脂肪酸組成の変化
Parietichytrium sarkarianum SEK364野生株やその遺伝子破壊株（C20 エロンガーゼ遺伝子ノックアウト株、C20 -/-）をGY培地で培養した。対数増殖期後期の細胞を4℃、3,000rpm、10 min遠心してペレットにし、0.9％ NaClに懸濁、洗浄した。続いて4℃、3,000rpm、10 min遠心し、ペレットを滅菌水に懸濁、洗浄した。それをさらに3,000rpm、10 min遠心し、上清を除き、凍結乾燥した。
凍結乾燥した細胞に2 mlのmethanolic KOH（7.5% KOH in 95% methanol）を加え、ボルテックス後、超音波で菌体を破砕した（80℃、30 min）。ついで、500 μlの滅菌水を加えてボルテックスした後、2 mlのn-hexaneを加えてボルテックスした。続いて3,000 rpmで10 min遠心し、上層を捨てた。再び2 mlのn-hexaneを加えてボルテックスし、3,000 rpmで10 min遠心して、上層を捨てた。残った下層に1 mlの6N HClを添加してボルテックスした後、2 mLのn-hexaneを加えてボルテックスした。続いて3,000 rpmで10 min遠心し、上層を回収した。再び2 mlのn-hexaneを加えてボルテックスし、3,000 rpmで10 min遠心して、上層を回収した。回収した上層を窒素ガスで濃縮乾固した。濃縮乾固したサンプルに2 mlの3N methanolic HClを添加し、80℃で一晩インキュベートした。
サンプルを室温まで冷まし、1 mlの0.9% NaClを添加した。ついで、2 mlのn-hexaneを加えてボルテックスし、3,000 rpmで10 min遠心し、上層を回収した。再び2 mlのn-hexaneを加えてボルテックスし、3,000 rpmで10 min遠心して、上層を回収した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを少量添加後、ボルテックスし、3,000 rpmで10 min遠心して、上層を回収した。回収した上層を窒素ガスで濃縮乾固し、この濃縮乾固したサンプルを0.5 mlのn-hexaneに溶解し、1 μlをGC解析に供した。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（5℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で測定を行った。
この結果、 Parietichytrium sarkarianum SEK364においてC20エロンガーゼ遺伝子をノックアウトすると、炭素鎖長22以上の脂肪酸が減少し、炭素鎖長20の脂肪酸が増加した。(図１２)。図１３に野生型株を100%ととした時の割合を示す。全脂肪酸組成のうちAＲA25.22%,DGLA8.62%,ETA0.56%,EPA 11.58% ,n-6DPA1.64%,DHA1.28%を示している。GC面積でLA/DHAの値5.8,GLA/ DHAの値1.5,DGLA/ DHAの値6.7,ARA/DHAの値19.7,EPA/DHAの値9.0, LA/EPAの値0.64,GLA/EPAの値0.16,DTA/EPAの値0.06,DTA/ARAの値0.03,DTA/DGLAの値0.08,LA/n-6DPAの値4.5,GLA/n-6DPAの値1.2,DGLA/n-6DPAの値5.3,ARA/n-6DPAの値15.4,EPA/n-6DPAの値7.1,DGLA/LAの値1.2.ARA/LAの値3.4,EPA/LAの値1.6,DTA/LAの値0.09,DGLA/GLAの値4.5,ARA/GLAの値13.2,n-6DPA/DTAの値2.4,DHA/n-3DPAの値4.9,C20PUFA/C22PUFAの値11.94,n-6PUFA/n-3PUFAの値2.67を示している。
これらの結果、アラキドン酸が約10倍、EPAが約8倍,DGLAが約16倍に増加し、またDPAが約1/4、DHAが約1/5に減少した。
このように、PUFA-PKS経路を有さないラビリンチュラ類であるParietichytrium sarkarianum SEK364 を選択することにより、PUFA-PKS経路の遺伝子破壊を行うことなくDHA、DPA n-6以外のPUFAを蓄積する株を作出することができた。この株をEPAおよび/またはARA生産株として利用しても良いし、さらなるエロンガーゼやデサチュラーゼの遺伝子破壊や遺伝子導入により、所望のPUFA生産株を作出することもできる。
[Parietichytrium sarkarianum SEK364のΔ4デサチュラーゼ遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定]
［実施例３－１］Parietichytrium属Δ4デサチュラーゼ遺伝子のクローニング
実施例２－２記載の方法でParietichytrium sp. SEK571のゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型にし、LA Taq Hot Start Version（タカラバイオ社製）によりΔ4デサチュラーゼ遺伝子配列を含む配列（5,003bp、配列番号39）を増幅した。用いたPCR primerは下記のとおりである。[RHO241: 23 mer: 5’- GTT TGA GGA GCG AGG CAT TTC TT -3’ (配列番号40)、RHO242: 23 mer: 5’- AGT GCT CGT ACA ATG ACT GGC GT -3’ (配列番号41) ]。
得られたDNA断片はpGEM-T easy vector にクローニングし、大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。これをpRH112と名付けた（配列番号42）。
Parietichytrium属Δ4デサチュラーゼ遺伝子配列（1,542bp 、配列番号43) を含むプラスミド（pRH112）を図１４に示す。
［実施例３－２］Δ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター作製のための、土台となるプラスミド作製
実施例３－１で作製したpRH112（図１４）を鋳型に、Δ4デサチュラーゼ遺伝子およびΔ4デサチュラーゼ遺伝子下流600bpを欠失させ、かつ欠失部分にBglIIサイトが生じる様に設計したprimer setを用意した。[RHO243: 26 mer: 5’- GGC AAG ATC TAA CTT TCT GAG GCT CT -3’ (配列番号44)、RHO244: 26 mer: 5’- AAG TTA GAT CTT GCC TAT TCC ACG AT -3’ (配列番号45) ]。増幅にはPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を使用した。増幅サンプルをBglIIにて消化したのち、セルフライゲーションした。ライゲーションしたサンプルは大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製）を用いて配列を確認した。これをpRH117と名付けた。
作製したΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター作製のための土台となるプラスミド (pRH117) を図１５に示す。
［実施例３－３］Δ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製
実施例２－２記載のpRH31 (図４) をBglIIにて消化し、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例３－２記載のpRH117 (図１５) のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH124（図１６）と名付けた。このpRH124を鋳型に、PstIを欠失させる様に設定したprimer setを用意した。[RHO261: 26 mer: 5’- GTG CAG ACG CAG AAG AAG ACT GAC AA -3’ (配列番号46)、RHO262: 25 mer: 5’- CTT CTG CGT CTG CAC GAG GAA TCG A -3’ (配列番号47) ]。増幅にはPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を使用した。PCR産物を大腸菌に導入して増幅し、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製）を用いて配列を確認した。これをpRH126（配列番号48）と名付けた。
作製したΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター (pRH126) を図１７に示す。
［実施例３－４］Parietichytrium sarkarianum SEK364へのΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入
実施例３－３で作製したターゲティングベクターpRH126（図１７）を鋳型に、RHO241 (実施例３－１記載、配列番号40) およびRHO242 (実施例３－１記載、配列番号41) をprimerとして用いて、PrimeSTAR Max DNA polymerase（タカラバイオ社製）により遺伝子を増幅した。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を0.1×TEに溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。実施例３－３記載pRH126 (図１７) を鋳型とした際に得られる導入断片は4,562bpとなる。
Parietichytrium sarkarianum SEK364株をGY培地中で1～2日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD600 = 1～2相当分の細胞に対し、0.625μgのDNA断片を遺伝子銃法（マイクロキャリア：0.6 micronの金粒子、target distance：6 cm、chamber vacuum：26 mm Hg、Rupture disk：1,550 PSI）により導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、1 mg/ml G418 含有PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり0から2個の薬剤耐性株を得た。
［実施例３－５］Δ4デサチュラーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換え体の同定
実施例２－２記載の方法で、Parietichytrium sarkarianum SEK364株および、Δ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株よりゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、PrimeSTAR GXL DNA polymerase (タカラバイオ社製)を用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズは図１８（相同領域内）に示した。相同組み換え領域内に設計したプライマーセットで、Parietichytrium sarkarianum SEK364株では3,046 bp、Δ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株では2,605 bpが増幅される。[RHO251: 20 mer: 5’- GTG GTC GAA GTG GAG TAT CT -3’ (配列番号49)、RHO252: 20 mer: 5’- ACT CGC CAT ACA ACT TTA CA -3’ (配列番号50) ]。
その結果、野生型アリル (Wt allele) 由来の増幅がなく、Δ4デサチュラーゼ遺伝子KO型アリル (NeoR allele) 由来の増幅があるΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株株が得られた (図１９ レーン７：Δ4デサチュラーゼKO変異株)。
［実施例３－６］Δ4デサチュラーゼ遺伝子破壊による脂肪酸組成の変化
実施例２－９記載の方法に準じてParietichytrium sarkarianum SEK364株野生株やそのΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。培養には実施例１記載のGY液体培地にビタミン溶液（vitamin B1 200mg, vitamin B2 1mg, vitamin B12 1mgを蒸留水100mLに溶解）を0.1%、微量元素溶液（EDTA disodium salt 30.0g, FeCl3・6H2O 1.45g, H2BO3 34.2g, MnCl2・4H2O 4.3g, ZnCl2 1.335g, CoCl2・6H2O 0.13g, NiSO4・6H2O 0.26g, CuSO4・5H2O 0.01g, Na2MoO4・2H2O 0.025gを蒸留水1Lに溶解）を0.2%となるよう添加した培地を用いた。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（2℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で測定を行った。
分析結果のチャートを図２０、その拡大図を図２１に示す。また、図２０のチャートを数値化したもの図２２の表に示す。この表は、Parietichytrium sarkarianum SEK364野生株とそのΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成の比較を表す。本表は図２０のチャートを数値化したものであり、全脂肪酸組成のうちARA1.59%,DGLA0.98%,ETA0.05%,EPA0.79%,n-6DPA0.00%, DHA 0.00%を示している。GC面積でLA/EPAの値5.09, GLA/EPAの値0.48,DTA/EPAの値7.44,DTA/ARAの値3.73,DTA/DGLAの値6.06,DGLA/LAの値0.24.ARA/LAの値0.39,EPA/LAの値0.20,DTA/LAの値1.46 ,DGLA/GLAの値2.57,ARA/GLAの値4.19,n-6DPA/DTAの値0.00を示している。
この結果、Parietichytrium sarkarianum SEK364株においてΔ4デサチュラーゼ遺伝子を破壊すると、DHAやDPA n-6をほとんど生合成できなくなり、逆にそれらの基質であるDPA n-3やDTAが増加することが明らかになった。
このように、PUFA-PKS経路を有さないラビリンチュラ類であるParietichytrium sarkarianum SEK364 を選択することにより、PUFA-PKS経路の遺伝子破壊を行うことなくDHA、DPA n-6以外のPUFAを蓄積する株を作出することができた。この株をDPA n-3および/またはDTA生産株として利用しても良いし、さらなるエロンガーゼやデサチュラーゼの遺伝子破壊や遺伝子導入により、所望のPUFA生産株を作出することもできる。
[Parietichytrium sp. SEK358のC20エロンガーゼ遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定]
［実施例４－１］Parietichytrium sp. SEK358株へのC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入
実施例２－６記載pRH85（図９）で作製したターゲティングベクターを鋳型に、RHO153 (実施例２－４記載、配列番号24) およびRHO154 (実施例２－４記載、配列番号25) をprimerとして用いて、PrimeSTAR Max DNA polymerase（タカラバイオ社製）により遺伝子を増幅した。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を0.1×TEに溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。実施例２－６記載pRH85 (図９) を鋳型とした際に得られる導入断片は 2661 bpで、Parietichytrium属 C20エロンガーゼ遺伝子前半－SV40 terminator配列－人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列－ubiquitin promoter配列－Parietichytrium属 C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる (実施例２－７記載、配列番号31)。
Parietichytrium sp. SEK358株をGY培地中で3日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD600 = 1～1.5相当分の細胞に対し、0.625μgのDNA断片を遺伝子銃法（マイクロキャリア：0.6 micronの金粒子、target distance：6 cm、chamber vacuum：26 mm Hg、Rupture disk：900 PSI）により導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、0.5 mg/ml G418 含有PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり10から30個の薬剤耐性株を得た。
［実施例４－２］C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定
実施例２－２記載の方法で、Parietichytrium sp. SEK358株、および、C20エロンガーゼ遺伝子破壊株よりゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、MightyAmp DNA polymerase (タカラバイオ社製)を用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズは実施例２－８記載、図１０に示した。
RHO184 (実施例２－８記載。配列番号37) はC20 エロンガーゼ上流、RHO185 (実施例２－８記載。配列番号38) は下流、RHO142 (実施例２－８記載。配列番号：35) およびRHO143 (実施例２－８記載。配列番号：36) は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。 [PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 7min]。
野生型アリル (Wt allele) に増幅がなく、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子アリル (NeoR allele) に増幅があるC20 エロンガーゼ遺伝子破壊株が得られた (図２３)。
［実施例４－３］C20エロンガーゼ遺伝子破壊による脂肪酸組成の変化
実施例２－９記載の方法でParietichytrium sp. SEK358株野生株やその遺伝子破壊株（C20 エロンガーゼ遺伝子ノックアウト株、C20 KO）を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（5℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で行った。 脂肪酸組成の変化を図２４に示す。また、図２５に野生型株を100%ととした時の割合を示す。
全脂肪酸組成のうちARA(ARA)21.35%,DGLA8.64%,ETA2.14%, EPA23.83%, n-6DPA 0.46%,DHA0.94%を示している。GC面積でLA/DHAの値4.6,GLA/ DHAの値2.8, DGLA/ DHAの値9.19,ARA/DHAの値22.7,EPA/DHAの値25.4, LA/EPAの値0.18, GLA/EPAの値0.11,DTA/EPAの値0.01,DTA/ARAの値0.01,DTA/DGLAの値0.03, LA/n-6DPAの値9.3,GLA/n-6DPAの値5.7,DGLA/n-6DPAの値18.8,R/n-6DPAの値46.4,EPA/n-6DPAの値51.8,DGLA/LAの値2.0.ARA/LAの値5.0,EPA/LAの値5.6,DTA/LAの値0.06,DGLA/GLAの値3.3,ARA/GLAの値8.2,n-6DPA/DTAの値1.8, DHA/n-3DPAの値4.1,C20PUFA/C22PUFAの値29.61,n-6PUFA/n-3PUFAの値1.1を示している。
この結果、Parietichytrium sp. SEK358株においてC20エロンガーゼ遺伝子をノックアウトすると、炭素鎖長22以上の脂肪酸が減少し、炭素鎖長20の脂肪酸が増加した。具体的には、アラキドン酸が約7倍、EPAが約11倍に増加し、またDPAが約1/15、DHAが約1/8に減少した。
このように、PUFA-PKS経路を有さないラビリンチュラ類であるParietichytrium sp. SEK358 を選択することにより、PUFA-PKS経路の遺伝子破壊を行うことなくDHA、DPA n-6以外のPUFAを蓄積する株を作出することができた。この株をEPAおよび/またはARA生産株として利用しても良いし、さらなるエロンガーゼやデサチュラーゼの遺伝子破壊や遺伝子導入により、所望のPUFA生産株を作出することもできる。
[Parietichytrium sp. SEK358のΔ4デサチュラーゼ遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定]
［実施例５－１］Parietichytrium sp. SEK358へのΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入
実施例３－３記載pRH126（図１７）で作製したターゲティングベクターを鋳型に、RHO241 (実施例３－１記載、配列番号40) およびRHO242 (実施例３－１記載、配列番号41) をprimerとして用いて、PrimeSTAR Max DNA polymerase（タカラバイオ社製）により遺伝子を増幅した。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を0.1×TEに溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。実施例３－３記載pRH126 (図１７) を鋳型とした際に得られる導入断片は4,562bpとなる。
Parietichytrium sp. SEK358株をGY培地中で1～2日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD600 = 1～2相当分の細胞に対し、0.625μgのDNA断片を遺伝子銃法（マイクロキャリア：0.6 micronの金粒子、target distance：6 cm、chamber vacuum：26 mm Hg、Rupture disk：1,550 PSI）により導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、1 mg/ml G418 含有PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり0から2個の薬剤耐性株を得た。
［実施例５－２］Δ4デサチュラーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換え体の同定
実施例２－２記載の方法で、Parietichytrium sp. SEK358株およびΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株よりゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、PrimeSTAR GXL DNA polymerase (タカラバイオ社製)を用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズは図１８（相同領域内）、図２６（相同領域外）に示した。相同組み換え領域内に設計したプライマーセットで、Parietichytrium sp. SEK358株では3,046 bp、Δ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株では2,605 bpが増幅される。[RHO251: 20 mer: 5’- GTG GTC GAA GTG GAG TAT CT -3’ (配列番号49)、RHO252: 20 mer: 5’- ACT CGC CAT ACA ACT TTA CA -3’ (配列番号50) ]。相同組み換え領域外に設計したプライマーセットで、Parietichytrium sp. SEK358株では5,231 bp、Δ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株では4,790 bpが増幅される。[HGO32: 25 mer: 5’- CGG AGC TCG GAG AAC AAC ATA GAA G -3’ (配列番号51)、HGO33: 23 mer: 5’- GTG CAA CCA GGT GGC AAG ATT GT -3’ (配列番号52) ]。
その結果、野生型アリル (Wt allele) 由来の増幅がなく、Δ4デサチュラーゼ遺伝子KO型アリル (NeoR allele) 由来の増幅があるΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株株が得られた (図２７ レーン４、図２８ レーン４：Δ4デサチュラーゼKO変異株)。
［実施例５－３］Δ4デサチュラーゼ遺伝子破壊による脂肪酸組成の変化
実施例２－９記載の方法に準じてParietichytrium sp. SEK358株野生株やそのΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株（SEK358 delta4 des. KO変異株）を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。培養には実施例１記載のGY液体培地にビタミン溶液（vitamin B1 200mg, vitamin B2 1mg, vitamin B12 1mgを蒸留水100mLに溶解）を0.1%、微量元素溶液（EDTA disodium salt 30.0g, FeCl3・6H2O 1.45g, H2BO3 34.2g, MnCl2・4H2O 4.3g, ZnCl2 1.335g, CoCl2・6H2O 0.13g, NiSO4・6H2O 0.26g, CuSO4・5H2O 0.01g, Na2MoO4・2H2O 0.025gを蒸留水1Lに溶解）を0.2%となるよう添加した培地を用いた。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（2℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で測定を行った。
分析結果のチャートを図２９、その拡大図を図３０に示す。また、図２９のチャートを数値化したものを、図３１の表に示す。この表は、Parietichytrium sp. SEK358野生株とそのΔ4デサチュラーゼ遺伝子破壊株の脂肪酸組成の比較を表しており、全脂肪酸組成のうちARA3.03%,DGLA1.35%,ETA0.03%, EPA1.10%, n-6DPA0.00%,DHA0.00%を示している。GC面積でLA/EPAの値4.2, GLA/EPAの値0.71,DTA/EPAの値7.19,DTA/ARAの値2.60,DTA/DGLAの値5.85,DGLA/LAの値0.29.ARA/LAの値0.66,EPA/LAの値0.24,DTA/LAの値1.71,DGLA/GLAの値1.72,ARA/GLAの値3,87, C20PUFA/C22PUFAの値0.42,n-6PUFA/n-3PUFAの値2.0を示している。を示している。
この結果、Parietichytrium sp. SEK358株においてΔ4デサチュラーゼ遺伝子を破壊すると、DHAやDPA n-6をほとんど生合成できなくなり、逆にそれらの基質であるDPA n-3やDTAが増加することが明らかになった。
このように、PUFA-PKS経路を有さないラビリンチュラ類であるParietichytrium sp. SEK358を選択することにより、PUFA-PKS経路の遺伝子破壊を行うことなくDHA、DPA n-6以外のPUFAを蓄積する株を作出することができた。この株をDPA n-3および/またはDTA生産株として利用しても良いし、さらなるエロンガーゼやデサチュラーゼの遺伝子破壊や遺伝子導入により、所望のPUFA生産株を作出することもできる。
[Parietichytrium sp. SEK571のC20エロンガーゼ遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定]
［実施例６－１］Parietichytrium sp. SEK571株へのC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入
実施例２－６記載pRH85（図９）で作製したターゲティングベクターを鋳型に、RHO153 (実施例２－４記載、配列番号24) およびRHO154 (実施例２－４記載、配列番号25) をprimerとして用いて、PrimeSTAR Max DNA polymerase（タカラバイオ社製）により遺伝子を増幅した。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を0.1×TEに溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。実施例２－６記載pRH85 (図９) を鋳型とした際に得られる導入断片は 2661 bpで、Parietichytrium属 C20エロンガーゼ遺伝子前半－SV40 terminator配列－人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列－ubiquitin promoter配列－Parietichytrium属 C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる(実施例２－７記載、配列番号31)。
Parietichytrium sp. SEK571株をGY培地中で3日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD600 = 1～1.5相当分の細胞に対し、0.625μgのDNA断片を遺伝子銃法（マイクロキャリア：0.6 micronの金粒子、target distance：6 cm、chamber vacuum：26 mmHg、Rupture disk：1550 PSI）により導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、0.5 mg/ml G418 含有PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり5から15個の薬剤耐性株を得た。
［実施例６－２］C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定
実施例２－２記載の方法で、Parietichytrium sp. SEK571株、および、C20エロンガーゼ遺伝子破壊株よりゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、MightyAmp DNA polymerase (タカラバイオ社製)を用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズは実施例２－８記載、図１０に示した。
RHO184 (実施例２－８記載。配列番号37) はC20 エロンガーゼ上流、RHO185 (実施例２－８記載。配列番号38) は下流、RHO142 (実施例２－８記載。配列番号35) およびRHO143 (実施例２－８記載。配列番号36) は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。 [PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 7min]。
野生型アリル (Wt allele) に増幅がなく、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子アリル (NeoR allele) に増幅があるC20 エロンガーゼ遺伝子破壊株が得られた (図３２)。
［実施例６－３］C20エロンガーゼ遺伝子破壊による脂肪酸組成の変化
実施例２－９記載の方法でParietichytrium sp. SEK571株やその遺伝子破壊株（C20エロンガーゼ遺伝子ノックアウト株、C20 KO）を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（5℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で行った。
脂肪酸組成の変化を図３３に示す。また、図３４に野生型株を100%ととした時の割合を示す。
全脂肪酸組成のうちARA13.24%,DGLA1.93%,ETA 1.14%,EPA29.58%, n-6DPA 0.96%,DHA1,17%を示している。GC面積でLA/DHAの値1.5,GLA/ DHAの値0.9, DGLA/ DHAの値1.65,ARA/DHAの値11.3,EPA/DHAの値25.3, LA/EPAの値0.06, GLA/EPAの値0.04,DTA/EPAの値0.01,DTA/ARAの値0.01,DTA/DGLAの値0.08, LA/n-6DPAの値1.8,GLA/n-6DPAの値1.1,DGLA/n-6DPAの値2.0,ARA/n-6DPAの値13.8,EPA/n-6DPAの値30.8,DGLA/LAの値1.1.ARA/LAの値7.8,EPA/LAの値17.4, DTA/LAの値0.09,DGLA/GLAの値1.8,ARA/GLAの値12.4,n-6DPA/DTAの値6.4, DHA/n-3DPAの値4.7,C20PUFA/C22PUFAの値18.1,n-6PUFA/n-3PUFAの値0.51を示している。
この結果、Parietichytrium sp. SEK571株においてC20エロンガーゼ遺伝子をノックアウトすると、炭素鎖長22以上の脂肪酸が減少し、炭素鎖長20の脂肪酸が増加した。具体的には、アラキドン酸が約4倍、EPAが約8倍に増加し、またDPAが約1/12、DHAが約1/12に減少した。
このように、Parietichytrium sp. SEK571 はPUFA-PKS経路によるPUFA生産能が無いあるいは極めて微弱であることが明らかになり、このようなラビリンチュラ類を選択することにより、PUFA-PKS経路の遺伝子破壊を行うことなくDHA、DPA n-6以外のPUFAを蓄積する株を作出することができた。この株をEPAおよび/またはARA生産株として利用しても良いし、さらなるエロンガーゼやデサチュラーゼの遺伝子破壊や遺伝子導入により、所望のPUFA生産株を作出することもできる。
［比較例１］
［Thraustochytrium aureum ATCC34304のC20エロンガーゼ遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定］
［比較例１－１］T. aureum ATCC34304由来total RNAの抽出、およびmRNAの精製
GY 液体培地を用いた培養3日目のT. aureum ATCC 34304培養液を、3,500 x gで15分間遠心することでその菌体を回収した。得た菌体を滅菌生理食塩水に懸濁後に再遠心操作を行うことで菌体を洗浄し、液体窒素で急速凍結して乳鉢中で粉末状になるまで擂り潰した。得た細胞破砕液中からセパゾールRNA I Super (ナカライテスク社製) を使用してtotal RNAを抽出した。引き続き、OligotexTM-dT30<Super> mRNA Purification Kit (タカラバイオ社製) を使用し、添付のマニュアルに従いtotal RNAからmRNAの精製を行った。得たtotal RNAおよびmRNAは適当量のTEに溶解後、ホルマリン変性ゲル (1%アガロース/MOPSバッファ―) を用いた電気泳動を行った。その結果、total RNAの抽出が成功していること、total RNAからmRNAが精製されていること、およびRNAがRNaseによる分解を受けていないことを確認した。また、RNAの分解を極力避けるために、本実験操作を通じてゴム手袋やマスク等を着用し、器具は全てRNaseフリーのもの、もしくはジエチルピロカーボネート (ナカライテスク社製) 処理によってRNaseを失活したものを使用した。またRNAを溶解する際は、ジエチルピロカーボネート処理した滅菌ミリQ水に、組換え型RNaseインヒビターであるRNaseOUTTM (invitrogen社製) を添加した溶液を使用した。
［比較例１－２］RACE法によるT. aureum ATCC34304由来エロンガーゼ遺伝子の単離
エロンガーゼ遺伝子に高度に保存されるヒスチジン・ボックス (His box)を標的として、正方向 (elo-F；5’- TTY YTN CAY GTN TAY CAY CAY -3’) (配列番号53)、および逆方向 (elo-R；5’- GCR TGR TGR TAN ACR TGN ARR AA -3’) (配列番号54) の縮重オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの合成は、DNA合成機 (Applied Biosystems社製) を用いて行った。次に、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (clontech社製) を使用して、添付のマニュアルに従って3’および5’末端に合成アダプターを付加した3’-および5’-RACE cDNAライブラリそれぞれを作製した。それらを鋳型として、合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および前述した縮重オリゴヌクレオチドelo-Fおよびelo-Rを用いた3’-および5’-RACE [PCR cycles: 94℃ 1 min/94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 3 min, 30 cycles/72℃ 10 min/4℃ ∞] を行ったところ、特異的に増幅した3’-および5’-RACE産物のバンドが確認された (図３５)。次に、該当RACE産物全量を1%アガロースゲルによる電気泳動に供し、分離したDNA断片を清浄なカッター等で切り出し、非特許文献１０記載の方法に従ってアガロースゲルからDNA断片を抽出した。次に、pGEM-T easy Vector(Promega社製) を使用して該当DNA断片のTAクローニングを行い、Sangerらの方法 (非特許文献１１) によってそれらの塩基配列を決定した。具体的には、BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitおよび3130ジェネティックアナライザ (Applied Biosystems社製) を使用し、添付マニュアルに従ったダイターミネーター法による塩基配列決定を行った。
その結果、3’-RACE産物においてはelo1 (配列番号55) およびelo2 (配列番号56) と名付けた190 bpおよび210 bpの2種の配列、5’-RACE産物においてはelo3 (配列番号57) と名付けた200 bpの1種の配列の同定に成功した。これらelo1、elo2、およびelo3の配列は、種々のエロンガーゼ遺伝子の配列と有意な相同性を示すことから、T. aureum ATCC 34304由来エロンガーゼ遺伝子の部分配列であることが示唆された。更に、elo1、elo2、およびelo3それぞれに関して再度オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、RACEによるcDNA配列の取得を試みた。以下に作製したオリゴヌクレオチドプライマーを示す。elo1正方向オリゴヌクレオチドプライマー(elo1-F1；5’- TAT GAT CGC CAA GTA CGC CCC -3’) (配列番号58) および逆方向オリゴヌクレオチドプライマー (elo1-R1；5’- GAA CTG CGT CAT CTG CAG CGA -3’) (配列番号59)、elo2正方向オリゴヌクレオチドプライマー(elo2-F1；5’- TCT CGC CCT CGA CCA CCA AC -3’) (配列番号60) および逆方向オリゴヌクレオチドプライマー (elo2-R1；5’- CGG TGA CCG AGT TGA GGT AGC C -3’) (配列番号61)、elo3正方向オリゴヌクレオチドプライマー(elo3-F1；5’- CAA CCC TTT CGG CCT CAA CAA G -3’) (配列番号62) および逆方向オリゴヌクレオチドプライマー (elo3-R1；5’- TTC TTG AGG ATC ATC ATG AAC GTG TC -3’) (配列番号63)。
作製した正方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前述に記載した方法と同様に、RACEおよび該増幅産物の塩基配列解析を行った。その結果、elo1に関しては特異的に増幅した3’-および5’-RACE産物が得られ、それらの重複部分が完全に一致することから、1,139 bpのelo1 cDNA配列 (配列番号64) であることが明らかになった。同様に、elo3に関しても特異的に増幅した3’-および5’-RACE産物が得られ、それらの重複部分が完全に一致することから、1,261 bpのelo3 cDNA配列 (配列番号65) であることが明らかになった。
配列解析の結果、elo1は275アミノ酸残基 (配列番号66) をコードする825 bpの翻訳領域 (配列番号67) から成り、BLAST検索の結果、種々のエロンガーゼ遺伝子と有意な相同性を示すのみならず、公知のT. aureum由来推定Δ5エロンガーゼ遺伝子の配列 (NCBI accession No. CS486301) と完全に一致することが分かった。一方、elo3は317アミノ酸残基 (配列番号：68) をコードする951 bpの翻訳領域 (配列番号：69) から成ることが推定され、BLAST検索の結果、種々のエロンガーゼ遺伝子と有意な相同性を示すことから、T. aureum ATCC 34304由来推定エロンガーゼ遺伝子であることが確認された。尚、両遺伝子の推定アミノ酸配列中には、エロンガーゼ遺伝子に高度に保存されるHis boxが見出された。以上の結果を受けて、elo1およびelo3遺伝子をT. aureum ATCC 34304由来推定エロンガーゼ遺伝子とし、それぞれをTaELO1、TaELO2と命名した。
［比較例１－３］出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeを宿主としたTaELO1およびTaELO2の発現と、遺伝子導入株の脂肪酸組成の解析
TaELO1およびTaELO2を出芽酵母S. cerevisiaeを宿主として発現させるために、それぞれの発現ベクターを構築した。以降にその概略を示す。TaELO1の翻訳領域の配列を元に、1対のオリゴヌクレオチドプライマー (E1 HindIII；5’- ATA AGC TTA AAA TGT CTA GCA ACA TGA GCG CGT GGG GC -3’) (配列番号70) および(E1 XbaI；5’- TGT CTA GAA CGC GCG GAC GGT CGC GAA A -3’) (配列番号71) を作製した。E1 HindIIIは正方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端に制限酵素HindIII部位 (AAGCTT) を有する。また、酵母のコンセンサス配列 ( (A/Y) A (A/U) A AUG UCU；下線部は開始コドン) (非特許文献１２)を参考に、TaELO1の開始コドン近傍の配列を改変している。E1 XbaIは逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端にXbaI部位 (TCTAGA) を有する。
同様に、TaELO2の翻訳領域の配列を元に1対のオリゴヌクレオチドプライマー (E2 HindIII；5’- TAA AGC TTA AAA TGT CTA CGC GCA CCT CGA AGA GCG CTC C -3’) (配列番号72) および(E2 XbaI；5’- CAT CTA GAC TCG GAC TTG GTG GGG GCG CTT G -3’) (配列番号73) を作製した。E2 HindIIIは正方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端に制限酵素HindIII部位を有する。また、酵母のコンセンサス配列を参考に、TaELO2の開始コドン近傍の配列を改変している。E2 XbaIは逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端にXbaI部位を有する。
以上の2種のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて、比較例１－２記載の5’-RACE cDNAライブラリを鋳型にPCRを行い、5’末端に制限酵素HindII、3’末端に制限酵素XbaIサイトを有し、開始コドン近傍が酵母のコンセンサス配列に改変された949 bpのTaELO1翻訳領域 (配列番号74) 、および967 bpのTaELO2翻訳領域 (配列番号75) を増幅した。尚、PCR酵素は伸長ミスを避けるために校正活性の高いPrimeSTAR(登録商標) DNA polymerase (タカラバイオ社製) を使用した [PCR cycles: 98℃ 2 min/98℃ 5 sec, 60℃ 5 sec, 72℃ 1.5 min, 30 cycles/72℃ 7 min/4℃ ∞]。
次に、増幅したPCR産物を1%アガロースゲルにて分離後、該DNA断片を切り出しアガロースゲルから抽出した。さらに、制限酵素HindIIIおよびXbaIで処理した後に再度アガロースゲルを用いた精製を行い、制限酵素HindIIIおよびXbaI処理により直鎖化した出芽酵母用発現ベクターpYES2/CT (invitrogen社製) に、DNA Ligation Kit <Mighty Mix> (タカラバイオ社製)を使用して連結することで環状化ベクターを構築した。また塩基配列を解析することで、pYES2/CTに導入したTaELO1およびTaELO2翻訳領域の配列に、PCR伸長ミスによる変異が導入されていないことを確認した。以上の結果により、TaELO1の発現ベクターpYEELO1、およびTaELO2の発現ベクターpYEELO2の構築に成功した。
構築した2種の発現ベクター、およびpYES2/CTを非特許文献１３および非特許文献１４記載の方法に従い、酢酸リチウム法によって出芽酵母S. cerevisiaeに導入し形質転換体の選別を行った。次に、得た形質転換体 (pYEELO1導入株、pYEELO2導入株、およびmock導入株) をQiuらの方法 (非特許文献１５) に準じて培養し、菌体由来脂肪酸の抽出とメチルエステル化を行った。ただし、培地にはΔ9エロンガーゼの基質としてα-linolenic acid (ALA, C18:3Δ9, 12, 15) およびlinoleic acid (LA, C18:2Δ9, 12) を、Δ6エロンガーゼの基質としてstearidonic acid (STA, C18:4Δ6, 9, 12, 15) およびγ-linolenic acid (GLA, C18:3Δ6, 9, 12) を、Δ5エロンガーゼの基質として、eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5Δ5, 8, 11, 14, 17) および arachidonic acid (AA, C20:4Δ5, 8, 11, 14) を、それぞれ終濃度で0.2 mM添加した上で培養を行っている。引き続き、Abeらの方法（非特許文献１６）に従い、メチルエステル化脂肪酸のガスクロマトグラフィー（GC）解析を行った。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（5℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で行った。
その結果、pYEELO1導入株においては、ステアリドン酸（STA）をエイコサテトラエン酸 (ETA, C20:4Δ8, 11, 14, 17)に、γ－リノレン酸（GLA）をジホモ－γ－リノレン酸(DGLA, C20:3Δ8, 11, 14) にそれぞれ変換する、宿主 (mock導入株) にはないΔ6エロンガーゼ活性を示す一方で、α－リノレン酸（ALA）をエイコサテトリエン酸(ETrA, C20:3Δ11, 14, 17)に、リノール酸（LA）をエイコサジエン酸(EDA, C20:3Δ11, 14) にそれぞれ変換するΔ9エロンガーゼ活性、エイコサペンタエン酸（EPA）をω3ドコサペンタエン酸(ω3DPA, C22:5Δ7, 10, 13, 16, 19)に、アラキドン酸（ARA）をドコサテトラエン酸 (DTA, C22:4Δ7, 10, 13, 16) にそれぞれ変換するΔ5エロンガーゼ（＝C20エロンガーゼ）活性をも示すことが分かった（表１）。
またpYEELO2導入株においては、EPAをω3 DPA (C22:5Δ7, 10, 13, 16, 19)、ARAをDTAに変換する、宿主にはないΔ5エロンガーゼ（＝C20エロンガーゼ）活性を示す一方で、STAをETA、GLAをDGLAに変換する僅かなΔ6エロンガーゼ活性を示すことが分かった (表１)。以上の結果により、TaELO1はΔ6/Δ9/Δ5エロンガーゼであり、TaELO2はΔ5/Δ6エロンガーゼであることが確認された。
Figure 2022190048000002
［比較例１－４］PCRゲノムウォーキング法によるTaELO2 ORF上流および下流領域の取得
TaELO2を破壊するためのターゲッティングベクターにおいて、相同組換え部位となるTaELO2 ORF上流および下流領域の取得を、PCRゲノムウォーキング法によって行った。以下その概要を示す。
GY 液体培地を用いた培養3日目のT. aureum ATCC 34304菌体を液体窒素で急速凍結して乳鉢中で粉末状になるまで擂り潰し、非特許文献１７に記載の方法に従ってゲノムDNAを抽出後に適当量のTEに溶解した。ゲノムDNAの量と純度の検定は、O.D.260およびO.D.280測定によって行った。次に、TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit (タカラバイオ社製) を用いて、添付のプロトコールに従い各種制限酵素で切断したゲノムDNAに、制限酵素サイトを有するカセット配列を付加したゲノムDNAライブラリを構築した。次に、作製したゲノムDNAライブラリを鋳型にして、TaELO2の配列を元に作製した正方向オリゴヌクレオチドプライマーE2 XbaI (比較例１－３記載。配列番号73) およびelo3-F1 (比較例１－２記載。配列番号62) 、もしくは逆方向オリゴヌクレオチドプライマーE2 HindIII (比較例１－３記載。配列番号72) およびelo3-R1 (比較例１－２記載。配列番号63) を使用して、キット付属のカセット配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと共に添付のプロトコールに従ったnested PCRを行った。その結果、1,122 bpのTaELO2 ORF上流配列 (配列番号76) 、および1,204 bpのTaELO2 ORF下流配列 (配列番号77) の取得に成功した。
［比較例１－５］Neorを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターの構築
fusion PCRによってTaELO2 ORF上流配列/人工合成Neor/ TaELO2 ORF下流配列を連結したDNA断片を作製した。使用したオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す。
・KO Pro F SmaI (31 mer: 5’- CTC CCG GGT GGA CCT AGC GCG TGT GTC ACC T-3’) (配列番号78)
・Pro R (25 mer: 5’-GGT CGC GTT TAC AAA GCA GCG CAG C -3’) (配列番号79)
・SNeo F (52 mer; 5’- GCT GCG CTG CTT TGT AAA CGC GAC CAT GAT TGA ACA GGA CGG CCT TCA CGC T -3’) (配列番号80)
・SNeo R (52 mer; 5’-TCG GGA GCC AGC CGG AAA CAG GTT CAA AAG AAC TCG TCC AGG AGG CGG TAG A-3’) (配列番号81)
・Term F (23 mer: 5’- ACC TGT TTC CGG CTG GCT CCC GA -3’) (配列番号：82)
・KO Term R SmaI (27 mer: 5’- ATC CCG GGG CCG AGA ACG GGG TCG CCC -3’) (配列番号83)
これらのオリゴヌクレオチドプライマーのうち、KO Pro F SmaI/ Pro Rは比較例１－４に記載したT. aureum ATCC 34304ゲノムDNAを鋳型にしたTaELO2 ORF上流配列の増幅、SNeo F/SNeo Rは人工合成Neorを鋳型にした人工合成Neorの増幅、Term F/ KO Term R SmaIは比較例１－４に記載したT. aureum ATCC 34304ゲノムDNAを鋳型にしたTaELO2 ORF下流配列の増幅に使用した。尚、PCR反応条件は変性温度を98℃10秒とし、アニーリングおよび伸長反応はプライマーのTmおよび増幅産物の長さによって適宜調節して行った。
その結果、2,696 bp (配列番号84) のTaELO2 ORF上流配列/人工合成Neor/ TaELO2 ORF下流配列の連結に成功し、これをpGEM-T easy Vector（Promega社製）を使用してTAクローン化したものをノックアウトベクターとし、pTKONeorと名付けた。
［比較例１－６］T. aureum ATCC34304へのTKONeorの導入
比較例１－５で作製した人工合成Neorを選択マーカーとしたTaELO2ターゲティングベクター、pTKONeorを鋳型とし、1対のオリゴヌクレオチドプライマーKO Pro F SmaI (比較例１－５、配列番号78) /KO Term R SmaI (比較例１－５、配列番号83) 、およびPrimeSTAR(登録商標) HS DNA polymerase (タカラバイオ社製) を用いて、TaELO2 ORF上流配列/人工合成Neor/ TaELO2 ORF下流配列を増幅し [PCR cycles: 98℃ 2 min/98℃ 10 sec, 68℃ 3 min, 30 cycles/68℃ 10 min/4℃ ∞]、1%アガロースゲルを用いた電気泳動後に該DNA断片を抽出し、エタノール沈殿後に適当量のTEに溶解した。DNA断片の量と純度の検定は、O.D.260およびO.D.280測定によって行った。得られたDNA断片を、以降TKONeorと呼称する。
次に、遺伝子銃法によるDNAの打ち込み操作を行った。すなわち、GY液体培地を用いて、T. aureum ATCC 34304を25℃、150 rpmで対数増殖期中期～後期まで培養後に、3,500 x g, 4℃, 10 min遠心し上清を除いた。次に、得た菌体を元の培養液の100倍濃縮となるようにGY液体培地に再懸濁し、うち20 μl分の細胞懸濁液を、1 mg/ml G418 (ナカライテスク社製)を含有する直径5 cmのPDA寒天平板培地上に、直径3 cm程度に薄く均一に塗布して乾燥させた。これに対し、PDS-1000 /Heシステム (BioRad社製) を使用して、target distance - 6 cm、vacuum - 26 inches Hg、micro carrier size - 0.6 μm、Rupture disk (打ち込み圧) - 1,100 psiの条件で打ち込み操作を行った。その後PDA寒天平板培地に100 μlのPD液体培地を滴下して菌体を拡げ直して静置培養を行った。その結果、4.7 x 101 cfu/μg DNAの効率でG418耐性能が付与された形質転換体が得られた。
［比較例１－７］TKONeorを導入した形質転換体のゲノムDNAを鋳型としたPCR
形質転換体7コロニーを爪楊枝で釣菌後に、0.5 mg/ml G418 (ナカライテスク社製)を含有するGY液体培地に植菌した。複数回継代後に、比較例１－４記載の方法で菌体からゲノムDNAを抽出し、エタノール沈殿後に適当量のTEに溶解した。抽出したゲノムDNAの量と純度の検定はO.D.260およびO.D.280測定によって行った。次に、得た形質転換体および野生株のゲノムDNAを鋳型として、様々なオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてPCRを行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、
(1)Neor検出 - Sneo F (比較例１－５記載。配列番号80) およびSNeo R (比較例１－５記載。配列番号81)
(2)KO確認1 - KO Pro F SmaI (比較例１－５記載。配列番号78) およびKO Term R SmaI (比較例１－５記載。配列番号83)
(3)KO確認2 - E2 KO ProF EcoRV(30 mer: 5’- GGA TAT CCC CCG CGA GGC GAT GGC TGC TCC -3’) (配列番号85)およびSNeo R (比較例１－５記載。配列番号81)
(4)KO確認3 - Sneo F (比較例１－５記載。配列番号80)およびE2 KO Term R EcoRV (30 mer: 5’- TGA TAT CGG GCC GCG CCC TGG GCC GTA GAT -3’) (配列番号86)
(5)TaELO2増幅 - E2 HindIII (比較例１－３記載。配列番号72) およびE2 XbaI (比較例１－３記載。配列番号73)
である (図３６A) 。
その結果、解析した7クローンのうち6クローンはランダムインテグレーションによる形質転換体であったが、1クローンは相同組換えによってTaELO2 ORFがNeorへ置き換わっていることが確認された (図３６B, レーン9, 13)。しかし同時に、TaELO2 ORFが増幅する(図３６B, レーン17) ことが分かった。以上のことから、T. aureum ATCC 34304は2倍体以上であるか、もしくはTaELO2がマルチコピー遺伝子である可能性が示唆された。
［比較例１－８］サザンブロッティングによるTaELO2のコピー数の確認
以下の実験は「DIG説明書集[日本語版] 8th, Roche Applied Science」（非特許文献１８）記載の方法に準じて行った。すなわち、野生株のゲノムDNAを各種制限酵素で切断後、１レーンあたり2.5 μgずつ0.7％ のSeaKem(登録商標) GTGTM agarose (タカラバイオ社製) を使用した電気泳動に供した。これをナイロンメンブラン (HybondTM-N+, GEヘルスケア社製) にトランスファーし、PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Applied Science社製) を使用して作製したDIGラベルプローブと48 ℃、16 hr でハイブリダイズさせた。DIGラベルプローブ作製に用いた1対のオリゴヌクレオチドプライマーは、TaELO2 det F (25 mer: 5’- GTA CGT GCT CGG TGT GAT GCT GCT C -3’) (配列番号87) およびTaELO2 det R (24 mer: 5’- GCG GCG TCC GAA CAG GTA GAG CAT-3’) (配列番号88) である[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 65℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 7 min/4℃ ∞]。ハイブリダイズしたプローブの検出は発色法（NBT/BCIP溶液）を用いて行った。
その結果、各種制限酵素で処理したレーン全てにシングルバンドが検出されることから (図３７)、TaELO2はシングルコピー遺伝子であることが示された。このことから、T. aureum ATCC 34304が2倍体以上であることが示唆された。
［比較例１－９］TKONeorを遺伝子導入した形質転換体のサザンブロッティングによる評価
比較例１－８記載の方法でサザンブロッティングを行った。すなわち、1対のオリゴヌクレオチドプライマーuprobe F (35 mer: 5’- ATC CGC GTA TAT ATC CGT AAA CAA CGG AAC ATT CT-3’) (配列番号89) およびuprobe R (26 mer: 5’-CTT CGG GTG GAT CAG CGA GCG ACA GC-3’) (配列番号90) を用いてPCR [PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 65℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 7 min/4℃ ∞] で増幅したDIGラベルプローブを用いて、EcoRVおよびPstIで消化した野生株と形質転換体のゲノムDNAに対する発色法（NBT/BCIP溶液）を用いたサザンブロッティングを行った。この場合、野生型アリルでは約1.2 kbpのDNA断片が検出されるが、相同組換えによってTaELO2 ORFがNeorへ置き換わっている変異アリルでは、約2.5 kbpのDNA断片が検出される (図３８A)。
解析の結果、形質転換体においては変異アリルと同時に野生型アリルのバンドも検出される (図３８B) ことから、T. aureum ATCC 34304は2倍体以上であることが示された。
［比較例１－１０］Hygrを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターの構築
残存した野生型アリルを破壊するために、Hygrを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターの構築を行った。
先ず、fusion PCRによってT. aureum ATCC 34304由来ユビキチンプロモーター配列とHygrの連結を行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す。
・ubi-600p F (27 mer: 5’- GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG-3’) (配列番号91)
・ubi-hygro R (59 mer: 5’-TCG CGGG TGA GTT CAG GCT TTT TCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCT G-3’) (配列番号92)
・ubi-hygro F (57 mer; 5’-AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGGC CAA CAT GAA AAA GCC TGA ACT CAC CGC GAC GTC TG-3’) (配列番号93)
・hygro R (29 mer; 5’-CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG AGT GCT GG-3’) (配列番号94)
これらのオリゴヌクレオチドプライマーのうち、ubi-600p F/ubi-hygro Rは比較例１－４に記載したT. aureum ATCC 34304ゲノムDNAを鋳型にしたT. aureum ATCC 34304由来ユビキチンプロモーター配列の増幅に使用した。ubi-hygro F/ hygro RはpcDNA 3.1 Zeo (Invitrogen) を鋳型にした人工合成Hygrの増幅に使用した。尚、PCR反応条件は変性温度を98℃10秒とし、アニーリングおよび伸長反応はプライマーのTmおよび増幅産物の長さによって適宜調節して行った。
その結果、1,636 bp (配列番号95) のT. aureum ATCC 34304由来ユビキチンプロモーター配列/ Hygrの連結に成功し、これをpGEM-T easy Vector（Promega社製）を使用してTAクローン化したものをpTub600Hygrと名付けた。
続いて、pTub600Hygrを鋳型とし、PrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社製) を使用して、1対のオリゴヌクレオチドプライマーubi-600p F NheI (33 mer: 5’-GTG CTA GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG-3’) (配列番号96) およびhygro R XbaI (37 mer: 5’-GTT CTA GAC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CGA GTG CTG G-3’) (配列番号97) を用いてPCR [PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 3 min, 30 cycles/ 68℃ 10 min/4℃ ∞] を行い、5’末端にNheI、3’末端にXbaIサイトを付加したT. aureum ATCC 34304由来ユビキチンプロモーター配列/ Hygr DNA断片を調製した。また、比較例１－５記載のpTKONeorを鋳型とし、PrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社製) を使用して、1対のオリゴヌクレオチドプライマーKO vec F XbaI (37 mer: 5’-GTT CTA GAC CTG TTT CCG GCT GGC TCC CGA GCC ATG C -3’) (配列番号98) およびKO vec R NheI (40 mer: 5’-GTG CTA GCG GTC GCG TTT ACA AAG CAG CGC AGC AAC AGA A -3’) (配列番号99) を用いてPCR [PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 3 min, 30 cycles/ 68℃ 10 min/4℃ ∞] を行い、比較例１－５記載の pTKONeorのNeorを除去し3’末端にNheI、5’末端にXbaIサイトを付加した直鎖状ベクターを調製した。両DNA断片を制限酵素NheIおよびXbaIで消化後にアガロースゲルを用いた精製を行い、Ligation Convenience Kit (ニッポンジーン社製) を用いて環状ベクターを構築した。
構築したHygrを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターは、pGEM-T easy Vector（Promega社製）を基本骨格とし、挿入配列として3,537 bp (配列番号100)のTaELO2 ORF上流配列/T. aureum ATCC 34304由来ユビキチンプロモーター配列/ Hygr /TaELO2 ORF下流配列を有している。これをpTKOub600Hygrと命名した。
［比較例１－１１］KOub600Hygrの再導入とゲノムDNAを鋳型にしたPCR、サザンブロッティング、RT-PCRによる形質転換体の評価
構築したHygrを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターpTKOub600Hygr(比較例１－１０記載) を鋳型として、1対のオリゴヌクレオチドプライマーKO Pro F SmaI (比較例１－５、配列番号78) /KO Term R SmaI (比較例１－５、配列番号83) 、およびPrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社製) を用いて、TaELO2 ORF上流配列/T. aureum ATCC 34304由来ユビキチンプロモーター配列/ Hygr /TaELO2 ORF下流配列を増幅し[PCR cycles: 98℃ 2 min/98℃ 10 sec, 68℃ 3.5 min, 30 cycles/68℃ 10 min/4℃ ∞]、得られたDNA断片をKOub600Hygrと名付けた。これを比較例１－７で得た形質転換体に対して同様の手法で導入し、1 mg/ml G418 (ナカライテスク社製)含有PDA寒天平板培地上で24時間静置培養後、菌体を回収して1 mg/ml G418 (ナカライテスク社製)および2 mg/ml ハイグロマイシンB (和光純薬工業社製) を含有するPDA寒天平板培地上で静置培養を続けたところ、多数の形質転換体が得られた (導入効率: 1.02 x 103 cfu/μg DNA)。
そのうち50クローンを釣菌し、1 mg/ml G418 (ナカライテスク社製) および2 mg/ml ハイグロマイシンB (和光純薬工業社製) 含有GY液体培地中で複数回継代培養後に、比較例１－４記載と同様の手法でゲノムDNAを抽出し、エタノール沈殿後に適当量のTEに溶解した。抽出したゲノムDNAの量と純度の検定はO.D.260およびO.D.280測定によって行った。次に、得た形質転換体および野生株のゲノムDNAを鋳型として、様々なオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてPCR [PCR cycles: 98℃ 2 min/98℃ 10 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/68℃ 10 min/4℃ ∞] を行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、
(1)TaELO2 ORF検出 - Sneo F (比較例１－５記載。配列番号80) およびSNeo R (比較例１－５記載。配列番号81) 、
(2)KO確認 - E2 KO Pro F EcoRV (比較例１－７記載。配列番号85) および ubi-hygro R (比較例１－１０記載。配列番号92)
である (図３９A) 。
その結果、解析した50クローンのうち、14クローンがTaELO2 ORFを置換する形での相同組み換えを起こした形質転換体であることが示唆された (図３９B, 矢印)。またそれらのクローンに関しては、TaELO2 ORFが増幅しないこと (図３９C) が確認された。
引き続き、比較例１－９記載の手法を用いたサザンブロッティングを行った。すなわち、1対のオリゴヌクレオチドプライマーuprobe F (配列番号89) およびuprobe R (配列番号90) を用いて調製したDIGラベルプローブを用いて、EcoRVおよびPstIで消化した野生株と形質転換体のゲノムDNAに対する発色法（NBT/BCIP溶液）を用いたサザンブロッティングを行った。この場合、野生型アリルでは約1.2 kbpのDNA断片、相同組換えによってTaELO2 ORFがNeorへ置き換わっている変異アリルでは約2.5 kbpのDNA断片、相同組換えによってTaELO2 ORFがHygrへ置き換わっている変異アリルでは約1 .9 kbpのDNA断片が検出される (図４０A)。
解析の結果、得た形質転換体では約2.5 kbpの野生型アリルのバンドが消失し、代わりにTaELO2 ORFがHygrへ置き換わっている約1 .9 kbpの変異アリルのバンドが新たに検出された (図４０B)。
同様に、1対のオリゴヌクレオチドプライマーTaELO2 probe F (30 mer: 5’-ATG GCG ACG CGC ACC TCG AAG AGC GCT CCG-3’) (配列番号101) およびTaELO2 probe R (30 mer: 5’-AGG ATC ATC ATG AAC GTG TCG CTC CAG TCG-3’) (配列番号102) を用いて、PCR [PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 65℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 7 min/4℃ ∞] でTaELO2を検出するDIGラベルプローブを調製し、EcoRVで消化した野生株と形質転換体 (クローン1, 8, 9, 10) のゲノムDNAに対する発色法（NBT/BCIP溶液）を用いたサザンブロッティングを行った。この場合、TaELO2は約2.5 kbpのDNA断片として検出される (図３８A)。
解析の結果、野生株ではTaELO2 が検出される (図４１, レーン1) のに対し、形質転換体では全く検出されないことが分かった (図４１, レーン2-5)。
さらに、TaELO2破壊をmRNAレベルで検証するために、RT-PCRによるTaELO2 mRNAの検出を行った。GY 液体培地を用いた培養3日目の野生株、および形質転換体 (クローン1, 8, 9, 10) の菌体から比較例１－１の場合と同様にセパゾールRNA I Super (ナカライテスク社製) を使用してtotal RNAを抽出した。引き続き、RNeasy Mini Kit (QIAGEN社製) を使用して添付のプロトコールに従いクリーンナップしたtotal RNA 50 μgを、50 UのRecombinant DNase I (タカラバイオ社製) を使用して37℃で1時間処理し、コンタミしたゲノムDNAの分解除去を行った。続いて、得たtotal RNAを鋳型として、oligo(dT) primer (Novagen社製) およびPrimeScript Reverse Transcriptase (タカラバイオ社製) を使用し、添付のマニュアルに従い1本鎖cDNAライブラリを調製した。さらに、得た1本鎖cDNAライブラリを鋳型として、1対のオリゴヌクレオチドプライマーE2 HindIII (比較例１－３記載。配列番号72) およびE2 XbaI (比較例１－３記載。配列番号73) 、およびLA Taq Hot Start Version (タカラバイオ社製) を使用し、TaELO2 ORFを増幅 [PCR cycles: 98℃ 2 min/98℃ 10 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/68℃ 10 min/4℃ ∞]した。
その結果、野生株では検出されるTaELO2 mRNAが (図４２, レーン5)、形質転換体(クローン1, 8, 9, 10) では全く検出されないことが分かった(図４２, レーン1-4)。
以上の結果から、TaELO2を完全に破壊したTaELO2欠損ホモ接合体の取得に成功したことが分かった。またこの結果から、T. aureum ATCC 34304が2倍体であることが判明した。
［比較例１－１２］野生株、およびTaELO2欠損ホモ接合体の脂肪酸組成の比較
比較例１－１１で得たTaELO2欠損ホモ接合体と野生株の脂肪酸組成を、メチルエステル化した脂肪酸のGC解析によって行った。すなわち、GY液体培地で培養5日後のTaELO2欠損ホモ接合体と野生株の菌体を回収し、比較例１－３記載の方法で菌体由来脂肪酸の抽出とメチルエステル化、およびGC解析を行った。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（5℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で行った。
その結果、TaELO2欠損ホモ接合体（TaELO2 KO）では、TaELO2の基質となるEPA量が野生株（Wild type）の2倍程度まで増加すると共に、下流の代謝産物であるDHA量の減少が観察された (図４３)。
以上のように、T. aureum ATCC34304でもParietichytrium属ラビリンチュラ類と同様、C20エロンガーゼ遺伝子KOにより、野生株と比較してC20エロンガーゼの基質であるEPAが増加し、逆に下流の代謝産物であるDHA等が減少することが確認された。しかし、Parietichytrium属ラビリンチュラ類と異なり、C20エロンガーゼ遺伝子をKOしてもT. aureum ATCC34304ではDHAの割合はあまり減少しなかった。具体的には、野生株におけるDHAの割合が54.38%であるのに対し、C20エロンガーゼ遺伝子KO株におけるDHAの割合は48.77%と、若干の減少にとどまった。DPA n-6も同様の傾向だった。
比較例１－２に記載のとおり、T. aureum ATCC34304には今回KOしたTaELO2の他にTaELO1が存在し、比較例１－３でいずれもΔ5エロンガーゼ活性（＝C20エロンガーゼ活性）を有することを示した。しかし、TaELO1のΔ5エロンガーゼ活性はTaELO2のΔ5エロンガーゼ活性と比較してかなり低いことも明らかになっており、今回のTaELO2欠損ホモ接合体（TaELO2 KO）においてDHAとDPA n-6があまり減少しなかった原因をTaELO1のΔ5エロンガーゼ活性（＝C20エロンガーゼ活性）で説明することは難しい。以上から、Thraustochytrium aureum ATCC34304ではDHAとDPA n-6はエロンガーゼ/デサチュラーゼ経路に加え、それ以外の生合成経路でも生産される可能性が示唆された。
このようなラビリンチュラ類を選択すると、実施例２、４、６とは異なり、C20エロンガーゼ遺伝子をKOしてもDHA、DPA n-6以外のPUFAを蓄積する株を作出することが出来ない。したがい、そのような株を作出するためにはエロンガーゼ/デサチュラーゼ経路以外のDHA、DPA n-6を生合成経路の関連遺伝子をKOする必要がある。
［比較例２］
［Thraustochytrium aureum ATCC34304のPUFA-PKS遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定］
［比較例２－１］PUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfAの上流配列のクローニング
実施例２－２記載の方法でThraustochytrium aureum ATCC 34304よりゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。これを用い、LA PCRTM in vitro Cloning Kit (タカラバイオ社製) を使用して、ゲノムカセットライブラリを作製した。特許文献４に記載のPUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfA上にPCR lower primer [RHO20: 23mer: 5’- CGA TGA AAG GTC ACA GAA GAG TC -3’ (配列番号103)] を設定し、上記記載のKit付属カセットプライマーと組み合わせてDNAを増幅した[1st PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 4 min, 30 cycles/ 72℃ 5min]。つづいて、1st PCR 増幅産物を100倍希釈し、PCR lower primer [RHO20] および上記記載のKit付属ネスティッド プライマーを組み合わせてDNAを増幅した[2nd PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 4 min, 30 cycles/ 72℃ 5min]。得られたDNA断片はpGEM-T easy vector にクローニングし、大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。
OrfAの上流3,181 bp (配列番号104) を含む3,377 bp (配列番号105) のDNA断片をクローニングした。OrfAの上流DNA配列情報として3,181 bpが明らかになった。
［比較例２－２］PUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfAの下流配列のクローニング
比較例２－１で作製したゲノムカセットライブラリを鋳型として使用した。特許文献４に記載のPUFA PKS経路関連遺伝子: OrfA上にPCR upper primer [RHO21: 21mer: 5’- CAG GGC GAG CGA GTG TGG TTC -3’ (配列番号106) ] を設定し、比較例２－１記載の方法でDNAを増幅した。得られたDNA断片をpGEM-T easy vector にクローニングし、大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。OrfAの下流1,160 bp (配列番号107) を含む1,204 bpのDNA断片 (配列番号108) をクローニングした。
配列番号94上に再度PCR upper primer [RHO28: 20mer: 5’- TGA TGC CGA TGC TAC AAA AG -3’ (配列番号109) ] を作製し、比較例２－１記載の方法でDNAを増幅した。得られたDNA断片をpGEM-T easy vector にクローニングし、大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。
さらに下流配列を含む1,488 bpのDNA断片 (配列番号110) をクローニングした。OrfAの下流DNA配列情報として通算2,551 bp (配列番号111) が明らかになった。
［比較例２－３］PUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfAターゲティングベクターの作製
Thraustochytrium aureum ATCC 34304のゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase （タカラバイオ社製）により18S rDNA 配列 (1835 bp、配列番号：112) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、TMO30は18S rDNA 配列上に設定した。TMO31は18S rDNA配列とEF1α promoter配列を含む。 [TMO30: 30mer: 5’- CGA ATA TTC CTG GTT GAT CCT GCC AGT AGT -3’ (配列番号113) 、 TMO31: 46mer: 5’- GTA ACG GCT TTT TTT GAA TTG CAG GTT CAC TAC GCT TGT TAG AAA C -3’ (配列番号114) ]。[PCR cycles: 98℃ 10 sec/ 98℃ 10 sec, 58℃ 30 sec, 72℃ 2 min, 30 cycles/ 72℃ 2min]。
また、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 ゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase （タカラバイオ社製）によりEF1α promoter配列 ( 661 bp、配列番号115) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、TMO32は18S rDNA配列とEF1α promoter配列を含む。TMO33はEF1α promoter配列と人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含む。 [TMO32: 46mer: 5’- GGT TTC CGT AGT GAA CCT GCA ATT CAA AAA AAG CCG TTA CTC ACA T -3’ (配列番号116) 、 TMO33: 46mer: 5’- GCG TGA AGG CCG TCC TGT TCA ATC ATC TAG CCT TCC TTT GCC GCT G-3’ (配列番号117) ]。[PCR cycles: 98℃ 10 sec/ 98℃ 10 sec, 58℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 1min]。
人工合成ネオマイシン耐性遺伝子を鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase （タカラバイオ社製）により人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列 ( 835 bp、配列番号118) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、TMO34はEF1α promoter配列と人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含む。TMO35は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列とEF1α terminator 配列を含む。 [TMO34: 45mer: 5’- CAT CGG CAA AGG AAG GCT AGA TGA TTG AAC AGG ACG GCC TTC ACG -3’ (配列番号119)、 TMO 35: 46mer: 5’- GCG CAT AGC CGG CGC GGA TCT CAA AAG AAC TCG TCC AGG AGG CGG T -3’ (配列番号120) ]。[PCR cycles: 98℃ 10 sec/ 98℃ 10 sec, 58℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 1min]。
また、Thraustochytrium aureum ATCC 34304 ゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase （タカラバイオ社製）によりEF1α terminator配列 (1249 bp、配列番号121) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、TMO36は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列とEF1α terminator 配列を含む。TMO37はEF1α terminator 中に設定した。 [TMO36: 46mer: 5’- TCC TGG ACG AGT TCT TTT GAG ATC CGC GCC GGC TAT GCG CCC GTG C -3’ (配列番号122)、 TMO37: 30mer: 5’- CAC TGC AGC GAA AGA CGG GCC GTA AGG ACG -3’ (配列番号123) ]。[PCR cycles: 98℃ 10 sec/ 98℃ 10 sec, 58℃ 30 sec, 72℃ 2 min, 30 cycles/ 72℃ 2min]。
配列番号112、115、118、121を鋳型に、非特許文献９記載の方法に従ってFusion PCRを行った。酵素にはLA Taq Hot start version（タカラバイオ社製）を用いた。初回の増幅には、TMO30 (配列番号113) およびTMO33 (配列番号117)のset、TMO34 (配列番号119) およびTMO37 (配列番号123) のsetを用いた。2度目の増幅はTMO30 (配列番号113) およびTMO37 (配列番号123) のsetを用いた。PCR反応の条件は変性温度を98℃ 10 sec とし、アニーリングおよび伸長反応はプライマーのTm値および増幅断片の長さによって適宜調節した(図４２)。
上記のようにして連結したDNA断片 (図４４、配列番号124、4453 bp ) をT. aureum 18S rDNA 中のEcoRIサイト、および、T. aureum EF1α terminator 中のNcoI サイトで切り出し、pGEM-T easy vector由来のvectorにつなぎ換えた。これをpRH5と名付けた（図４５）。
Thraustochytrium aureum ATCC 34304 ゲノムDNAを鋳型にし、比較例２－１で明らかにした上流配列 (配列番号104)および特許文献４に記載のPUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfA 中にPCR primerを設定し、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）によりDNAを増幅した。この増幅により、1218 bp のDNA断片 (配列番号125) が得られた。これをターゲティングベクターの5’ 相同領域とした。用いたPCR primer は下記の通りで、それぞれリンカー配列としてEcoRIサイト、もしくはHindIIIサイトを付加した。[RHO33: 32mer: 5’- CCC GAA TTC GGA CGA TGA CTG ACT GAC TGA TT -3’ (配列番号126)、RHO34: 28mer: 5’- CCC AAG CTT GTC TGC CTC GGC TCT TGG T -3’ (配列番号127) ]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 57℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 3min]。
Thraustochytrium aureum ATCC 34304 ゲノムDNAを鋳型にし、比較例２－２で明らかにした下流配列 (配列番号111) 中にPCR primerを設定し、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）によりDNAを増幅した。この増幅により、1000 bp のDNA断片 (配列番号128) が得られた。これをターゲティングベクターの3’ 相同領域とした。用いたPCR primer は下記の通りで、ともにリンカー配列NcoIサイトを付加した。[RHO29: 28mer: 5’- CCC CCA TGG TGT TGC TGT GGG ATT GGT C -3’ (配列番号129)、RHO30: 30mer: 5’- CCC CCA TGG CTC GGT TAC ATC TCT GAG GAA -3’ (配列番号130) ]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 57℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 3min]。
増幅した上流配列を図４３記載 pRH5中のEcoRIサイトおよびHindIIIサイトに連結した。増幅した下流配列をNcoIサイトに連結した。このベクターをpRH21と名付けた。
作製した人工合成ネオマイシン耐性遺伝子を使用したターゲティングベクター（pRH21）を図４４に示す。
［比較例２－４］PUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfAターゲティングベクターの作製（ハイグロマイシン耐性遺伝子）
実施例２－３記載pRH32 (図６)を鋳型にし、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）によりubiqitin promoter-ハイグロマイシン耐性遺伝子断片 (1632 bp、配列番号131) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、RHO59はubiquitin promoter上に設定し、リンカー配列HindIIIサイトを付加した。RHO60はハイグロマイシン耐性遺伝子配列を終止codon含み、リンカー配列SphI、SalIを有する。[RHO59: 36mer: 5’- CCC AAG CTT GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG -3’ (配列番号132)、RHO60: 43mer: 5’- CCC GCA TGC GTC GAC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CGA GTG CTG G -3’ (配列番号133) ]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。
増幅した断片を比較例２－３記載pRH21 (図４６) のHindIIIおよびSphIサイトに連結した（図４７、pRH30)。
Thraustochytrium aureum ATCC 34304ゲノムDNAを鋳型にし、比較例２－２で明らかにした下流配列 (配列番号111) 中に作製したPCR primer を用いて、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）により遺伝子を増幅した。この増幅により、1000 bp のDNA断片 (配列番号134) が得られた。これをターゲティングベクターの3’ 相同領域とした。用いたPCR primer は下記の通りで、ともにリンカー配列SalIサイトを付加した。[RHO61: 29mer: 5’- CCC GTC GAC GTG TTG CTG TGG GAT TGG TC -3’ (配列番号135)、RHO62: 29mer: 5’- CCC GTC GAC TCG GTT ACA TCT CTG AGG AA -3’ (配列番号136) ]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 57℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 3min]。
増幅した下流配列をpRH30 (図４５) のSalIサイトに連結した。これをpRH33と名付けた。作製したハイグロマイシン耐性遺伝子を使用したターゲティングベクター（pRH33）を図４８に示す。
［比較例２－５］PUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfAターゲティングベクター導入
比較例２－３および２－４で作製したターゲティングベクターを鋳型に、RHO30 (比較例２－３記載。配列番号130) およびRHO33 (比較例２－３記載。配列番号126) をprimerとして用いて、PrimeSTAR Max DNA polymerase（タカラバイオ社製）により遺伝子を増幅した。 [PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 3min]。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を0.1×TEに溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。比較例２－３記載pRH21 (図４６) を鋳型とした際に得られる導入断片は 3705 bpで、Thraustochytrium aureum OrfA遺伝子上流－EF1α promoter配列－人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列－Thraustochytrium aureum OrfA 遺伝子下流という並びになる (配列番号137)。比較例２－４記載pRH33 (図４６) を鋳型とした際に得られる導入断片は 3826 bpで、Thraustochytrium aureum OrfA遺伝子上流－ubiquitin promoter配列－ハイグロマイシン耐性遺伝子配列－Thraustochytrium aureum OrfA 遺伝子下流という並びになる (配列番号138)。
Thraustochytrium aureum ATCC 34304株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD600 = 1～1.5相当分の細胞に対し、0.625μgのDNA断片を遺伝子銃法（マイクロキャリア：0.6 micronの金粒子、target distance：6 cm、chamber vacuum：26 mmHg、Rupture disk：1,100 PSI）により導入した。遺伝子導入した細胞は4～6時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地(2 mg/ml G418 含有もしくは2 mg/ml ハイグロマイシン含有)に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり100から200個の薬剤耐性株を得た。
［比較例２－６］PUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfAジーンターゲティング相同組換体の同定
実施例２－２記載の方法でThraustochytrium aureum ATCC 34304、およびヘテロ相同組換体、ホモ相同組換体（PKS経路関連遺伝子破壊株）よりゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。
ゲノムDNAを制限酵素で切断後、１ウェルあたり約2～3 μgずつ0.7％ SeaKem GTG アガロースゲル（タカラバイオ社製）に電気泳動した。これをナイロンメンブレンにトランスファーし、DIGシステム(Roche Applied Science社製) を使用して作製したprobeと54 ℃、16 hr でハイブリダイズさせた。 probe作製に用いたprimerは下記の通り。5’側[RHO37: 22mer: 5’- GAA GCG TCC CGT AGA TGT GGT C -3’ (配列番号139)、RHO38: 21mer: 5’- GCC CGA GAG GTC AAA GTA CGC -3’ (配列番号140) ]、3’側[RHO39: 20mer: 5’- GCG AGC CCA GGT CCA CTT GC -3’ (配列番号141)、RHO40: 22mer: 5’- CAG CCC GAT GAA AAA CTT GGT C -3’ (配列番号142) ]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 60℃ 30 sec、72℃ 2 min, 30 cycles/ 72℃ 3min]。使用した制限酵素およびprobeの位置を図４９に示した。ハイブリダイズしたプローブの検出は、発色法（NBT/BCIP溶液）を用いて行った。
5’ 側および3’ 側の解析いずれにおいても、薬剤耐性遺伝子が相同組換えをおこした際あらかじめ予想されるサイズに、バンドが観察された (図５０)。
［比較例２－７］
実施例２－９記載の方法でThraustochytrium aureum ATCC 34304および遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。
脂肪酸組成の変化を図５１に示す。図５２に野生型株を100%ととした時の割合を示した。全脂肪酸組成のうちARA3.10%,DGLA0.23%,ETA0.04%,EPA6.82%, n-6DPA10.66,DHA22.58%を示している。GC面積でLA/DHAの値0.05,GLA/ DHAの値0.03,DGLA/ DHAの値0.01,ARA/DHAの値0.1,EPA/DHAの値0.3, LA/EPAの値0.16,GLA/EPAの値0.11,DTA/EPAの値0.29,DTA/ARAの値0.65,DTA/DGLAの値8.7,LA/n-6DPAの値0.1,GLA/n-6DPAの値0.07,DGLA/n-6DPAの値0.02,ARA/n-6DPAの値0.3,EPA/n-6DPAの値0.6,DGLA/LAの値0.2、ARA/LAの値2.9,EPA/LAの値6.4,DTA/LAの値1.9,DGLA/GLAの値0.3,ARA/GLAの値4.0,n-6DPA/DTAの値5.3,DHA/n-3DPAの値20.0,C20PUFA/C22PUFAの値0.3,n-6PUFA/n-3PUFAの値0.52を示している。
この結果、Thraustochytrium aureumにおいてPUFA PKS経路関連遺伝子：OrfAを破壊すると、DPA（C22: 5n-6）に増加傾向、DHA（C22: 6n-3）に減少傾向が見られた。
シゾキトリウム属（Schizochytrium）やオーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）ではPUFA-PKS経路の遺伝子の破壊により外因性のPUFA要求性となり、外因性PUFAの供給が無ければ生育できないことが知られている（非特許文献４）。しかしThraustochytrium aureum ATCC34304はこれらとは異なり、PUFA-PKS経路関連遺伝子の破壊により外因性のPUFAを培地に添加することなく培養可能であった。また、PUFA-PKS経路関連遺伝子の破壊により、野生株と比較してDHAは約2/3程度しか減少せず、DPA（C22: 5n-6）は若干増加した。
これらの結果から、Thraustochytrium aureum ATCC34304ではDHAとDPA n-6はPUFA-PKS経路に加え、それ以外の生合成経路でも生産される可能性が示唆された。Thraustochytrium aureum ATCC34304が外因性のPUFAを培地に添加することなく培養可能な理由は、このPUFA-PKS経路以外の生合成経路によって内因性のPUFAが供給されるためと推察される。
［比較例３］
［Thraustochytrium aureum ATCC34304のPUFA-PKS遺伝子とC20エロンガーゼ遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定］
［比較例３－１］Thraustochytrium aureum C20エロンガーゼ遺伝子の上流配列のクローニング
比較例２－１で作製したゲノムカセットライブラリを鋳型として使用した。比較例１－４記載のC20エロンガーゼ遺伝子上流配列 (配列番号76) 上にPCR lower primer [RHO71: 22mer: 5’- GGG AGC GCA GGG AAA ACG GTC T -3’ (配列番号143) ] を作製し、比較例２－１記載のKit付属カセットプライマーと組み合わせて遺伝子を増幅した[1st PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 4 min, 30 cycles/ 72℃ 5min]。続いて、1st PCR 増幅産物を100倍希釈し、PCR lower primer [RHO72: 20mer: 5’- CCA GCC CAC GTC GTC GGA GC -3’ (配列番号144) ] および比較例２－１記載のKit付属ネスティッド プライマーを組み合わせて遺伝子を増幅した[2nd PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 4 min, 30 cycles/ 72℃ 5min]。得られたDNA断片はpGEM-T easy vector にクローニングし、大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。
C20エロンガーゼ遺伝子の上流－3277 bp～－981 bpの領域を含む2297 bpのDNA断片 (配列番号145) をクローニングした。
［比較例３－２］C20エロンガーゼ遺伝子の下流配列のクローニング
比較例２－１で作製したゲノムカセットライブラリを鋳型として使用した。比較例１－４記載のC20エロンガーゼ遺伝子下流配列 (配列番号77) 上にPCR upper primer [RHO87: 23 mer: 5’- GCC GCT CAT GCC CAC GCT CAA AC -3’ (配列番号146) ] を作製し、比較例２－１記載のKit付属カセットプライマーと組み合わせて遺伝子を増幅した[1st PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 4 min, 30 cycles/ 72℃ 5min]。続いて、1st PCR 増幅産物を100倍希釈し、PCR lower primer [RHO73: 23 mer: 5’- CTT TCG GCT GCC AGG AAT CTA CG -3’ (配列番号147) ] および比較例２－１記載のKit付属ネスティッド プライマーを組み合わせて遺伝子を増幅した[2nd PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 4 min, 30 cycles/ 72℃ 5min]。得られたDNA断片はpGEM-T easy vector にクローニングし、大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。
C20エロンガーゼ遺伝子の下流1,106 bp～3,294 bpの領域を含む2,189 bpのDNA断片(配列番号148) をクローニングした。
［比較例３－３］ブラストサイジン耐性遺伝子カセットの作製
Thraustochytrium aureum ATCC 34304よりゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）によりubiquitin promoter 配列 (618 bp、配列番号149) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、RHO53はubiquitin promoter 配列上に設定、BglIIリンカー配列を含む (実施例２－２、配列番号5)。RHO48はubiquitin promoter 配列とブラストサイジン耐性遺伝子配列を含む。 [RHO48: 58mer: 5’- CTT CTT GAG ACA AAG GCT TGG CCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCT G -3’ (配列番号150) ]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 1min]。
pTracer-CMV/Bsd/lacZ (invitrogen社製)を鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Bufferによりブラストサイジン耐性遺伝子(432 bp、配列番号151) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、RHO47はubiquitin promoter 配列とブラストサイジン耐性遺伝子配列を含む。RHO49はブラストサイジン耐性遺伝子配列を含み、BglIIリンカー配列を有する。[RHO47: 54mer:5’- AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGC CAA CAT GGC CAA GCC TTT GTC TCA AGA AGA ATC -3’ (配列番号152)、RHO49: 38mer: 5’- CCC AGA TCT TAG CCC TCC CAC ACA TAA CCA GAG GGC AG -3’ (配列番号153)]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 1min]。
配列番号149および151を鋳型に、非特許文献９記載の方法に従ってRHO53 (実施例２－２、配列番号5) およびRHO49 (配列番号153) を用いてFusion PCRを行った。酵素はLA Taq Hot start version（タカラバイオ社製）を使用し、下記の条件で増幅後、BglIIにて消化した。 [PCR cycles: 94℃ 2min/ 94℃ 20 sec, 55℃ 30 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 1min。ただし55℃から68℃へは1℃/ 10sec とした] (図５３)。
上記のようにしてFusionしたThraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoter－pTracer-CMV/Bsd/lacZ由来ブラストサイジン耐性遺伝子 (1000 bp、配列番号154) を、BglIIにて消化し、これを実施例２－１記載pRH27 (図２) のBamHIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。これをpRH38と名付けた。
作製したブラストサイジン耐性遺伝子カセット (pRH38) を図５４に示す。
［比較例３－４］GFP融合ゼオシン耐性遺伝子カセットの作製
Thraustochytrium aureum ATCC 34304よりゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（タカラバイオ社製）によりubiquitin promoter 配列 (812 bp、配列番号155) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、TMO38はubiquitin promoter配列上に設定した。TMO39はubiquitin promoter配列とEnhanced GFP 遺伝子配列を含む。 [TMO38: 29mer: 5’- TCG GTA CCC GTT AGA ACG CGT AAT ACG AC -3’ (配列番号156)、TMO39: 41mer: 5’- TCC TCG CCC TTG CTC ACC ATG TTG GCT AGT GTT GCT TAG GT -3’ (配列番号157) ]。[PCR cycles: 98℃ 10 sec/ 98℃ 10 sec, 58℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 1min]。
Enhanced GFP 遺伝子配列（clontech社製）を鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ社製）によりEnhanced GFP 遺伝子配列 (748 bp、配列番号158) を増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、TMO40はubiquitin promoter配列とEnhanced GFP 遺伝子配列を含む。RHO91はEnhanced GFP配列およびゼオシン耐性遺伝子配列を含む。 [TMO40: 41mer: 5’- ACC TAA GCA ACA CTA GCC AAC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GA -3’ (配列番号159)、RHO91: 58mer: 5’- GAA CGG CAC TGG TCA ACT TGG CGT CCA TGC CGA GAG TGA TCC CGG CGG CGG TCA CGA A-3’(配列番号160)]。[PCR cycles: 98℃ 10 sec/ 98℃ 10 sec, 58℃ 30 sec, 72℃ 2 min, 30 cycles/ 72℃ 2min]。
配列番号156および158を鋳型に、非特許文献９記載の方法に従ってLA Taq Hot start version（タカラバイオ社製） により、Fusion PCRを行った。PrimerにはTMO38 (配列番号156) およびRHO91 (配列番号160) を用い、条件はPCR cycles: 94℃ 2min/ 94℃ 20 sec, 55℃ 30 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min（ただし、55℃から68℃へは1℃/ 10sec）とした (図５５、1519 bp、配列番号161)。
配列番号161を鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ社製）によりubiquitin promoter配列－Enhanced GFP遺伝子配列 (1319 bp、配列番号162) を増幅した。用いたprimerは下記の通り。RHO53 (実施例２－２、配列番号5) はubiquitin promoter配列を含み、BglIIサイトを有する。RHO91 (配列番号160) はEnhanced GFP配列およびゼオシン耐性遺伝子配列を含む。[PCR cycles: 98℃ 2 min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。
pcDNA3.1 Zeo(+)を鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ社製）によりゼオシン耐性遺伝子配列 (408 bp、配列番号163) を増幅した。RHO92はEnhanced GFP配列およびゼオシン耐性遺伝子配列を含む。RHO64はゼオシン耐性遺伝子配列を含み、BglIIサイトを有する。 [RHO92: 54mer: 5’- CGC CGC CGG GAT CAC TCT CGG CAT GGA CGC CAA GTT GAC CAG TGC CGT TCC GGT -3’ (配列番号164)、 RHO64: 38mer: 5’- CCC AGA TCT CAG TCC TGC TCC TCG GCC ACG AAG TGC AC -3’ (配列番号165) ]。[PCR cycles: 98℃ 2 min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 1 min, 30 cycles/ 68℃ 1min]。
配列番号162および163を鋳型に、非特許文献９記載の方法に従ってLA taq Hot start version（タカラバイオ社製）によりFusion PCRを行った。PrimerにはRHO53 (実施例２－２、配列番号5) およびRHO64 (配列番号165) を用い、条件はPCR cycles: 94℃ 2min/ 94℃ 20 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min（ただし55℃から68℃へは1℃/ 10sec）とした (図５６)。
上記のようにしてFusionしたThraustochytrium aureum ATCC 34304 由来ubiquitin promoter－Enhanced GFP遺伝子－pcDNA3.1 Zeo(+) 由来ゼオシン耐性遺伝子（図５６、 1677 bp、配列番号166) をBglIIにて消化し、これを実施例２－１記載pRH27 （図２）のBamHIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。これをpRH51と名付けた。
作製したGFP融合ゼオシン耐性遺伝子カセット (pRH51) を図５７に示す。
［比較例３－５］C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台となるプラスミド作製
Thraustochytrium aureum ATCC 34304ゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ社製）により、C20 エロンガーゼ遺伝子およびその周辺配列をPCR法にて増幅した 2884 bp、配列番号167) 。用いたPCR primer は下記の通りで、いずれもEcoRIリンカー配列を含み、KSO9はC20 エロンガーゼ遺伝子上流 (配列番号76) 中に、KSO10はC20 エロンガーゼ遺伝子下流 (配列番号77) に設定した。 [KSO9: 50mer: 5’- CCC GAA TTC ACT AGT GAT TCT CCC GGG TGG ACC TAG CGC GTG TGT CAC CT -3’ (配列番号168)、 KSO10: 40mer: 5’- CCC GAA TTC GAT TAT CCC GGG GCC GAG AAC GGG GTC GCC C -3’ (配列番号169) ]。[PCR cycles: 98℃ 2 min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 3.5 min, 30 cycles/ 68℃ 10 min]。酵素はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を使用し、増幅後、EcoRIにて消化したのち、pBluescript(SK) (Stratagene社製) vector EcoRIサイトにクローニングした。大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した（図５８)。
図５８記載のプラスミドを鋳型に、C20 エロンガーゼ遺伝子配列部分を欠失し、BglIIサイトを挿入 (1939 bp、配列番号170) する目的で、逆向きに設定したprimer setを用意し、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社製）にて増幅した。用いたPCR primer は下記の通りで、ともにBglIIリンカー配列を有する。 [RHO69: 38mer: 5’- CCC AGA TCT ACC TGT TTC CGG CTG GCT CCC GAG CCA TG -3’ (配列番号171)、 RHO70: 38mer: 5’- CCC AGA TCT GGT CGC GTT TAC AAA GCA GCG CAG CAA CA -3’ (配列番号172) ]。[PCR cycles: 98℃ 2 min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 1.5 min, 30 cycles/ 68℃ 1.5 min]上記条件で増幅後、BglIIにて消化したのち、セルフライゲーションした。ライゲーションしたサンプルは大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製） を用いて配列を確認した。これをpRH40と名付けた。
作製したC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台となるプラスミド (pRH40) を図５９に示す。
［比較例３－６］ターゲティングベクターの作製（ブラストサイジン耐性遺伝子およびGFP融合ゼオシン耐性遺伝子）
比較例３－３記載のpRH38 (図５２) をBglIIにて消化し、ブラストサイジン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を比較例３－５記載のpRH40 (図５９) のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH43と名付けた。
比較例３－４記載のpRH51 (図５５) をBglIIにて消化し、GFP融合ゼオシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を比較例３－５記載のpRH40 (図５７) のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH54と名付けた。
作製した2種のターゲティングベクター(pRH43および54)を図６０に示す。
［比較例３－７］Thraustochytrium aureum OrfA破壊株へのC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入
比較例３－６で作製した2種類のターゲティングベクターを鋳型に、KSO11およびKSO12をprimerとして用いて、PrimeSTAR Max DNA polymerase（タカラバイオ社製）により遺伝子を増幅した。KSO11はThraustochytrium aureum C20エロンガーゼ遺伝子上流に、KSO12はThraustochytrium aureum C20エロンガーゼ遺伝子下流に設定した。[KSO11: 31mer: 5’- CTC CCG GGT GGA CCT AGC GCG TGT GTC ACC T -3’ (配列番号173)、 KSO12: 27mer: 5’- ATC CCG GGG CCG AGA ACG CCC TCG CCC -3’ (配列番号174)]。 [PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 68℃ 2 min, 30 cycles/ 68℃ 2min]。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を0.1×TEに溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。比較例３－６記載pRH43 (図６０) を鋳型とした際に得られる導入断片は 3215 bpで、Thraustochytrium aureum C20エロンガーゼ遺伝子上流－ubiquitin promoter－ブラストサイジン耐性遺伝子配列－SV40 terminator 配列－Thraustochytrium aureum C20エロンガーゼ遺伝子下流という並びになる (配列番号175)。比較例３－６記載pRH54 (図６０) を鋳型とした際に得られる導入断片は 3887 bpで、Thraustochytrium aureum C20エロンガーゼ遺伝子上流－ubiquitin promoter－Enhanced GFP遺伝子配列－ゼオシン耐性遺伝子配列－SV40 terminator 配列－Thraustochytrium aureum C20エロンガーゼ遺伝子下流という並びになる (配列番号176)。
比較例２記載のPUFA-PKS経路関連遺伝子: OrfA遺伝子破壊株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD600 = 1～1.5相当分の細胞に対し、0.625μgのDNA断片を遺伝子銃法（マイクロキャリア：0.6 micronの金粒子、target distance：6 cm、chamber vacuum：26 mmHg、Rupture disk：1,100 PSI）により導入した。遺伝子導入した細胞は4～6時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地(2 mg/ml G418 含有もしくは2 mg/ml ハイグロマイシン含有)に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり100から200個の薬剤耐性株を得た。
［比較例３－８］C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定
実施例２－２記載の方法で、Thraustochytrium aureumおよびThraustochytrium aureum OrfA破壊株におけるC20エロンガーゼ遺伝子の破壊株からゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。
ゲノムDNAを制限酵素で切断後、１ウェルあたり約2～3 μgずつ0.7％ SeaKem GTG アガロースゲル（タカラバイオ社製）に電気泳動した。これをナイロンメンブレンにトランスファーし、DIGシステム(Roche Applied Science社製) を使用して作製したprobeと51 ℃、16 hr でハイブリダイズさせた。 probe作製に用いたprimerは下記の通り。5’側[RHO94: 21mer: 5’- ACG TCC GCT TCA AAC ACC TCG -3’ (配列番号177)、RHO95: 24mer: 5’- TCG GAA CAA CTG GAA CAA CTA AAG -3’ (配列番号178) ]、3’側[RHO96: 22mer: 5’- ATG TCG CTC TCC TTC TTC TCA G-3’ (配列番号179)、RHO97: 21mer: 5’- TCG GCT CCT GGA AAG TGC TCT -3’ (配列番号180)]。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 30 sec, 58℃ 30 sec、72℃ 1 min, 30 cycles/ 72℃ 3min]。使用した制限酵素およびprobeの位置は図６１に示した。ハイブリダイズしたプローブの検出は発色法（NBT/BCIP溶液）を用いて行った。
5’側および3’側の解析いずれにおいても、薬剤耐性遺伝子が相同組換えをおこした際あらかじめ予想されるサイズにバンドが観察された(図６２)。この実験により、Thraustochytrium aureum ATCC 34304株は、PKS経路関連遺伝子: OrfA および C20 エロンガーゼ遺伝子を欠損しても栄養要求性にならないことが分かった。
［比較例３－９］Thraustochytrium aureum OrfA破壊株におけるC20エロンガーゼ遺伝子の破壊による脂肪酸組成の変化
実施例２－９記載の方法でThraustochytrium aureum ATCC 34304および遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（5℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で行った。
脂肪酸組成の変化を図６３に示す。また、図６４に野生型株を100%とした時の割合を示す。全脂肪酸組成のうちARA19.50%,DGLA1.81%, ETA0.31%, EPA24.92%,n-6DPA5.90%,DHA6.78%を示している。GC面積でLA/DHAの値0.25, GLA/ DHAの値0.07,DGLA/ DHAの値0.27,ARA/DHAの値2.88,EPA/DHAの値3.68, LA/EPAの値0.07,GLA/EPAの値0.02,DTA/EPAの値0.02,DTA/ARAの値0.02, DTA/DGLAの値0.26,LA/n-6DPAの値0.29,GLA/n-6DPAの値0.08,DGLA/n-6DPAの値0.31,ARA/n-6DPAの値3.31,EPA/n-6DPAの値4.22,DGLA/LAの値1.06.ARA/LAの値11.40,EPA/LAの値14.57,DTA/LAの値0.27,DGLA/GLAの値4.02,ARA/GLAの値43.33,n-6DPA/DTAの値12.55,DHA/n-3DPAの値11.69,C20PUFA/C22PUFAの値3.39,n-6PUFA/n-3PUFAの値0.85を示している。
この結果、Thraustochytrium aureum OrfA破壊株においてC20エロンガーゼ遺伝子を破壊すると、C20: 4n-6(ARA)が約8倍に増加、C20: 5n3(EPA)が約4倍に増加、C22: 6n-3(DHA)が約1/5倍に減少した。
このように内因性エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路と内因性PUFA-PKS経路の両方を有するThraustochytrium aureum ATCC34304から、野生株と比較してDHAとDPA n-6の生産量が顕著に減少した株を作出するためには、エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路を構成する酵素の遺伝子（例えばC20エロンガーゼ遺伝子）およびPUFA-PKS経路関連遺伝子の双方の遺伝子を破壊しなければならないことが明らかになった。
［比較例４］
［Thraustochytrium aureum ATCC34304のPUFA-PKS遺伝子とΔ4デサチュラーゼ遺伝子の破壊および形質転換株が生産する脂質の脂肪酸組成の測定］
［比較例４－１］Thraustochytrium aureum ATCC 34304株のΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流1071 bp～Δ4デサチュラーゼ遺伝子内1500 bpの配列のクローニング
実施例２－２に記載の方法で抽出したThraustochytrium aureum ATCC 34304株のゲノムDNAを解読し、既知のΔ4デサチュラーゼと相同性の高い遺伝子配列を検索した。この検索結果をもとに2種のPCR primer を設計した。TMO3は、Thraustochytrium aureum ATCC 34304株のΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流1071～1049 bpに位置する配列で、TMO4は、開始コドンから数えて1477～1500 bpに位置するたんぱく質コーディング領域内の配列である。[TMO3: 23 mer: 5’- GGC GGA GCG AAG TGT GAA AGT TA -3’ (配列番号181)、TMO4: 24 mer: 5’- GCG ACA GCA TCT TGA AAT AGG CAG -3’ (配列番号182) ]。この2種のprimer を使用し、Thraustochytrium aureum ATCC 34304株のゲノムDNAを鋳型に、LA Taq Hot start version（タカラバイオ社製）によりThraustochytrium aureum ATCC 34304株のΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流1071 bp～Δ4デサチュラーゼ遺伝子内1500 bpの配列 (2571 bp、配列番号183) を増幅した。増幅条件は下記の通り。[PCR cycles: 98℃ 2min/ 98℃ 20 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 3 min, 30 cycles/ 72℃ 8 min]。得られたDNA断片はpGEM-T easy vector にクローニングし、大腸菌にて増幅後、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製）を用いて配列を確認した。これをpTM1と名付けた(図６５)。
［比較例４－２］Δ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター作製のための、土台となるプラスミド作製
比較例４－１で作製したpTM1（図６５）を鋳型に、Δ4デサチュラーゼ遺伝子上流60 bpおよびΔ4デサチュラーゼ遺伝子内の開始コドンを含む556 bpの配列 (616 bp、配列番号184) を欠失させ、かつ、欠失部分にBglII サイトが生じる様、逆向きに設定したprimer setを用意した。TMO7、TMO8ともにBglII配列を包含する。増幅にはPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を使用した。 [TMO7: 25 mer: 5’-CAG GAG ATC TCC AAG TCG CGA TTC A -3’ (配列番号185)、 TMO8: 26 mer: 5’- CTT GGA GAT CTC CTG CCC GTC CCG AA -3’ (配列番号186) ]。[PCR cycles: 98℃ 3 min/ 98℃ 10 sec, 55℃ 15 sec, 72℃ 30 sec, 30 cycles/ 72℃ 30 sec]。上記条件で増幅後、アガロースゲルに泳動して精製した。得られたDNA断片を大腸菌に導入して増幅し、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER社製）を用いて配列を確認した。これをpTM2と名付けた。
作製したΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター作製のための土台となるプラスミド (pTM2) を図６６に示す。
［比較例４－３］ターゲティングベクターの作製（ブラストサイジン耐性遺伝子およびGFP融合ゼオシン耐性遺伝子）
比較例３－３記載のpRH38 (図５４) をBglIIにて消化し、ブラストサイジン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を比較例４－２記載のpTM2 (図６６) のBglIIサイトに繋いだ。これをpTM6と名付けた。
比較例３－４記載のpRH51 (図５７) をBglIIにて消化し、GFP融合ゼオシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を比較例４－２記載のpTM2 (図６６) のBglIIサイトに繋いだ。これをpTM8と名付けた。
作製した2種のターゲティングベクター(pTM6および8)を図６７に示す。
［比較例４－４］Thraustochytrium aureum OrfA破壊株へのΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入
比較例４－３で作製した2種類のターゲティングベクターを鋳型に、TMO3(比較例４－１記載。配列番号181)およびTMO4(比較例４－１記載。配列番号182)をprimerとして用いて、PrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社製)により遺伝子を増幅した。[PCR cycles: 98℃ 3min/ 98℃ 10 sec, 55℃ 5 sec, 72℃ 4 min, 30 cycles/ 72℃ 3 min]。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を0.1×TEに溶解した。A260/280を測定しDNA濃度を算出した。比較例４－３記載pTM6 (図６７) を鋳型とした際に得られる導入断片は 3264 bpで、Thraustochytrium aureum Δ4デサチュラーゼ遺伝子上流－SV40 terminator 配列－ブラストサイジン耐性遺伝子配列－ubiquitin promoter－Thraustochytrium aureum Δ4デサチュラーゼ遺伝子内の配列という並びになる (配列番号187)。比較例４－３記載pTM8 (図６７) を鋳型とした際に得られる導入断片は 3935 bpで、Thraustochytrium aureum Δ4デサチュラーゼ遺伝子上流－SV40 terminator 配列－ゼオシン耐性遺伝子配列－Enhanced GFP遺伝子配列－ubiquitin promoter－Thraustochytrium aureum Δ4デサチュラーゼ遺伝子内の配列という並びになる (配列番号188)。
比較例２記載のPUFA PKS経路関連遺伝子: OrfA遺伝子破壊株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD600 = 1～1.5相当分の細胞に対し、0.625μgのDNA断片を遺伝子銃法（マイクロキャリア：0.6 micronの金粒子、target distance：6 cm、chamber vacuum：26 mmHg、Rupture disk：1,100 PSI）により導入した。遺伝子導入した細胞は4～6時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地(20 mg/ml ゼオシン 含有もしくは0.2 mg/ml ブラストサイジン含有)に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり100から200個の薬剤耐性株を得た。
［比較例４－５］Δ4デサチュラーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定
実施例２－２記載の方法で、Thraustochytrium aureumおよびThraustochytrium aureum OrfA破壊株におけるΔ4デサチュラーゼ遺伝子の破壊株からゲノムDNAを抽出後、A260/280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、Mighty Amp DNA polymerase (タカラバイオ社製)を用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズを図６８に示す。TMO1はΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流、TMO2はΔ4デサチュラーゼ遺伝子下流、RHO198(配列番号191)およびRHO49(比較例３－３記載。配列番号153) はブラストサイジン耐性遺伝子上、RHO128はEnhanced GFP遺伝子上、RHO64(比較例３－４記載。配列番号165)はゼオシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。[TMO1: 23 mer: 5’- AAA AGA ACA AGC CCT CTC CTG GA -3’ (配列番号189)、TMO2: 23 mer: 5’- GAG GTT TGT ATG TTC GGC GGT TT -3’ (配列番号190)、RHO198: 26 mer: 5’- TGG GGG ACC TTG TGC AGA ACT CGT GG -3’ (配列番号191)、RHO128: 22 mer: 5’- GAC CTA CGG CGT GCA GTG CTT C -3’ (配列番号192)]。[PCR cycles: 98℃ 2 min/ 98℃ 10 sec, 68℃ 4 min 30 sec, 30 cycles/ 68℃ 4min]。 野生型アリル (Wt allele) に増幅がなく、ブラストサイジン耐性遺伝子アリル (BlaR allele) およびゼオシン耐性遺伝子アリル (ZeoR allele) に増幅のあるΔ4デサチュラーゼ遺伝子遺伝子破壊株が得られた (図６９)。この実験により、Thraustochytrium aureum ATCC 34304株は、PKS経路関連遺伝子: OrfA および Δ4デサチュラーゼ遺伝子を欠損しても栄養要求性にならないことが分かった。
［比較例４－６］Thraustochytrium aureum OrfA破壊株におけるΔ4デサチュラーゼ遺伝子の破壊による脂肪酸組成の変化
実施例２－９記載の方法でThraustochytrium aureum ATCC 34304および遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC-2014（島津製作所社製）を使用し、カラム：HR-SS-10（30 m x 0.25 mm；信和化工社製）、カラム温度：150℃ →（5℃/min）→ 220℃（10 min）、キャリアガス：He（1.3 mL/min）の条件で行った。
脂肪酸組成の変化を図７０に示す。また、図７１に野生型株を100%ととした時の割合を示す。全脂肪酸組成のうちARA6.35%,DGLA0.90%,ETA0.28%, EPA6.22%, n-6DPA0.21%,DHA0.51%を示している。GC面積でLA/DHAの値8.76, GLA/ DHAの値1.59,DGLA/ DHAの値1.76,ARA/DHAの値12.45,EPA/DHAの値12.20, LA/EPAの値0.72,GLA/EPAの値0.13,DTA/EPAの値1.77,DTA/ARAの値1.73, DTA/DGLAの値12.23,LA/n-6DPAの値21.29,GLA/n-6DPAの値3.86,DGLA/n-6DPAの値4.29,ARA/n-6DPAの値30.24,EPA/n-6DPAの値29.62,DGLA/LAの値0.20.ARA/LAの値1.42,EPA/LAの値1.39,DTA/LAの値2.46,DGLA/GLAの値1.11,ARA/GLAの値7.84,n-6DPA/DTAの値0.02,DHA/n-3DPAの値0.03,C20PUFA/C22PUFAの値0.50,n-6PUFA/n-3PUFAの値0.81を示している。
この結果、Thraustochytrium aureum OrfA破壊株においてΔ4デサチュラーゼ遺伝子を破壊すると、C22: 5n-6(DPA) およびC22: 6n-3(DHA) がほとんど生合成されなくなり、Δ4デサチュラーゼの基質であるC22: 4n-6(DTA) およびC22: 5n-3(DPA) が蓄積した。
このように内因性エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路と内因性PUFA-PKS経路の両方を有するThraustochytrium aureum ATCC34304から、DHAとDPA n-6をほとんど生合成できない株を作出するためには、エロンガーゼ/デサチュラーゼ経路を構成する酵素の遺伝子（例えばΔ4デサチュラーゼ遺伝子）とPUFA-PKS遺伝子の両方の遺伝子を破壊しなければならないことが明らかになった。
このようにして得られた微生物油を用いることにより、DHA,n-6 DPA以外のPUFAの組成比率を上げた脂肪酸組成の微生物油を得ることができる。DHAを多く産生する微生物をもとにして、遺伝子を改変することにより任意のPUFAを生産することが可能となる。またDHA,n-6 DPAが特に少ない微生物油を作ることにより、精製する工程で負担の少ない微生物油を作ることができる。また、このように微生物にエロンガーゼ、デサチュラーゼを導入することにより、微生物油を産生する微生物を得ることができる。
ラビリンチュラ類という微生物において、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生合成経路として新規の「パターン」を発見した。エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみでＰＵＦＡを生産するラビリンチュラを提供することができるため、エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路のみを利用してＰＵＦＡを大量生産することが期待される。

Claims (18)

  1. 下記（ａ）または（ｂ）を満たす微生物油であって、微生物が、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路による高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類であって、かつ、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を破壊または／および発現抑制することにより、脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類である、微生物油。
    （ａ）ＤＨＡが全脂肪酸組成のうち、０．５０％以下である。
    （ｂ）ＤＨＡとｎ－６ＤＰＡの合計が全脂肪酸組成のうち、０．７％以下である。
  2. ラビリンチュラ類の遺伝子を破壊する方法が、エレクトロポレーション、遺伝子銃法またはゲノム編集である、請求項１に記載の微生物油。
  3. ラビリンチュラ類の遺伝子を発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはＲＮＡ干渉である、請求項１に記載の微生物油。
  4. 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ４デサチュラーゼ遺伝子である、請求項１ないし３のいずれかに記載の微生物油。
  5. Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍに属し、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍに属するラビリンチュラ類である、請求項１ないし４のいずれかに記載の微生物油。
  6. Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ３５８、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０５、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍ ＳＥＫ３６４、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２９８またはＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ５７１、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０６であり、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ＡＴＣＣ２８２９である、請求項１ないし４のいずれかに記載の微生物油。
  7. 脂肪酸組成が改変するように遺伝子改変されたラビリンチュラ類から、微生物油を製造する方法であって、ラビリンチュラ類が、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路による高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属し、ラビリンチュラ類の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を破壊または／および発現抑制することにより、脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類であって、該ラビリンチュラ類から得られる微生物油が、下記（ａ）または（ｂ）を満たす微生物油であることを特徴とする、微生物油の製造方法。
    （ａ）ＤＨＡが全脂肪酸組成のうち、０．５０％以下である微生物油。
    （ｂ）ＤＨＡとｎ－６ＤＰＡの合計が全脂肪酸組成のうち、０．７％以下である微生物油。
  8. ラビリンチュラ類の遺伝子を破壊する方法を、エレクトロポレーション、遺伝子銃法またはゲノム編集によって行う、請求項７に記載の微生物油の製造方法。
  9. ラビリンチュラ類の遺伝子を発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはＲＮＡ干渉である、請求項７に記載の微生物油の製造方法。
  10. 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ４デサチュラーゼ遺伝子である、請求項７ないし９のいずれかに記載の微生物油の製造方法。
  11. Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍに属し、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍに属するラビリンチュラ類である、請求項７ないし１０のいずれかに記載の微生物油の製造方法。
  12. Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ３５８、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０５、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍ ＳＥＫ３６４、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２９８またはＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ５７１、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０６であり、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ＡＴＣＣ２８２９である、請求項７ないし１０のいずれかに記載の微生物油の製造方法。
  13. 下記（ａ）または（ｂ）を満たす微生物油を製造する微生物であって、該微生物は、内因性ＰＵＦＡ－ＰＫＳ経路による高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産能が無いあるいは極めて微弱であり、かつ内因性エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡ生産能を有するＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類であり、かつ、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を破壊または／および発現抑制することにより、脂肪酸組成が改変されたラビリンチュラ類である、微生物。
    （ａ）ＤＨＡが全脂肪酸組成のうち、０．５０％以下である。
    （ｂ）ＤＨＡとｎ－６ＤＰＡの合計が全脂肪酸組成のうち、０．７％以下である。
  14. ラビリンチュラ類の遺伝子を破壊する方法が、エレクトロポレーション、遺伝子銃法またはゲノム編集である、請求項１３に記載の微生物。
  15. ラビリンチュラ類の遺伝子を発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはＲＮＡ干渉である、請求項１３に記載の微生物。
  16. 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ４デサチュラーゼ遺伝子である、請求項１３ないし１５のいずれかに記載の微生物。
  17. Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍに属し、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍに属するラビリンチュラ類である、請求項１３ないし１６のいずれかに記載の微生物。
  18. Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ３５８、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０５、Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍ ＳＥＫ３６４、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２９８またはＰａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＥＫ５７１、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４０６であり、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属するラビリンチュラ類が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ ＡＴＣＣ２８２９である、請求項１３ないし１６のいずれかに記載の微生物。
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