PT2166069T - Método de produção de ácidos gordos polinsaturados em organismos transgénicos - Google Patents

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Cirpus Petra
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Meyer Astrid
Kirsch Jelena
Vrinten Patricia
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Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GORDOS POLINSATURADOS EM ORGANISMOS TRANSGÉNICOS" A presente invenção diz respeito a um método para a preparação de ácidos gordos polinsaturados num organismo, no qual são introduzidos ácidos nucleicos que codificam polipéptidos com atividade A5-elongase no organismo. De forma vantajosa, estas sequências de ácidos nucleicos podem eventualmente ser expressas no organismo juntamente com outras sequências de ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos da biossintese dos ácidos gordos ou lipidos. Especialmente vantajosas são sequências de ácidos nucleicos que codificam uma atividade Δβ-dessaturase, uma atividade A5-dessaturase, uma atividade A4-dessaturase, uma atividade Al2-dessaturase e/ou uma atividade Δβ-elongase. De forma vantajosa, estas dessaturases e elongases são provenientes de Thalassiosira, Euglena ou Ostreococcus. Adicionalmente, a invenção também diz respeito a um método para a preparação de óleos e/ou triacilglicerídeos com um teor elevado de ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa.
Além disso, a presente invenção também se refere, numa forma de realização preferida, a um método para a preparação de ácidos gordos ω3 insaturados, assim como um método para a preparação de triglicerideos com um teor elevado de ácidos gordos insaturados, em especial de ácidos gordos ω3 com mais do que três ligações duplas. A invenção diz respeito à preparação de um organismo transgénico não humano, preferencialmente uma planta transgénica ou um microrganismo transgénico com teor elevado de ácidos gordos ω3 insaturados, óleos e lipidos com ligações duplas ω3, devido à expressão das elongases e dessaturases utilizadas no método de acordo com a invenção, de forma vantajosa em conjunto com G)3-dessaturases, por exemplo, uma ω3-dessaturase de fungos da família Pythiaceae, tal como o género Phytophtora, por exemplo o género e espécie Phytophtora infestans, ou uma c3-dessaturase de algas, tal como da família das Prasinophyceae, por exemplo do género Ostreococcus, em especial do género e espécie Ostreococcus tauri ou diatomáceas tal como o género Thalassiosira, em especial o género e espécie Thalassiosira pseudonana. A invenção diz respeito ainda a sequências de ácidos nucleicos, constructos de ácidos nucleicos, vetores e organismos que contêm as sequências de ácidos nucleicos, vetores contendo as sequências de ácidos nucleicos e/ou os constructos de ácidos nucleicos e/ou vetores de acordo com a invenção.
Uma outra parte da invenção diz respeito a óleos, lípidos e/ou ácidos gordos preparados através do método de acordo com a invenção e a utilização dos mesmos. Além disso, a invenção refere-se a ácidos gordos insaturados, assim como triglicerídeos com um teor elevado de ácidos gordos insaturados, e a utilização dos mesmos. Ácidos gordos e triacilglicerídeos têm uma grande variedade de utilizações nas indústrias da alimentação, de rações, de cosméticos e farmacêutica. Dependendo se se trata de ácidos gordos saturados ou insaturados livres, ou de triglicerídeos com um teor elevado de ácidos gordos saturados ou insaturados, os mesmos são apropriados para diferentes utilizações. Ácidos gordos polinsaturados tais como ácido linoleico e ácido linolénico são essenciais para mamíferos, uma vez que os mesmos não podem ser sintetizados por estes animais. Por isso, os ácidos gordos ω3 e ωβ polinsaturados são uma parte essencial da alimentação de animais e de humanos.
Os ácidos gordos ω3 polinsaturados de cadeia longa, tal como o ácido eicosapentaenóico (= EPA, 02ο:5Δ5,8'11,14'17) ou ácido docosahexaenóico (= DHA, C22:6M' 7,10,13,16,19) são componentes importantes da dieta humana devido aos diferentes papéis que desempenham na saúde, que compreendem aspetos tais como o desenvolvimento do cérebro das crianças, a funcionalidade dos olhos, a sintese de hormonas e de outros agentes de sinalização, assim como a prevenção de doenças cardiovasculares, cancro e diabetes (Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA e Yeo YK Pharmacol
Res 40:211-225, 1999). Por este motivo, existe a necessidade da produção de ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa.
Devido à composição normal atual da alimentação humana, é especialmente importante a suplementação de ácidos gordos ω3 polinsaturados, os quais estão presentes preferencialmente em óleos de peixes. Assim, são por exemplo adicionados à comida de bebé ácidos gordos polinsaturados tais como ácido docosahexaenóico (= DHA, C22:6a4'7'10'13'16'19) ou ácido eicosapentaenóico (= EPA, C2o:5a5'8'11'14'17) , para aumentar o seu valor nutritivo. O ácido gordo insaturado DHA tem aqui um efeito positivo no desenvolvimento e manutenção das funções cerebrais.
Os ácidos gordos polinsaturados são representados como PUFA, PUFA's, LCPUFA ou LCPUFAs (£oli unsaturated fatty acids, PUFA, ácidos gordos polinsaturados; long chain j>oli unsaturated fatty acids, ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa).
Os diferentes ácidos gordos e triglicerideos são principalmente obtidos a partir de microrganismos tais como Mortierella ou Schizochytrium, ou a partir de plantas produtoras de óleos tais como soja, colza, algas tais como Crypthecodinium ou Phaeodactylum, entre outros, onde eles estão normalmente presentes na forma dos seus triacilglicerideos (= triglicerideo = trigliceróis). Eles também podem ser obtidos a partir de animais, como por exemplo, peixes. Os ácidos gordos livres são produzidos, de forma vantajosa, através de saponificação. Ácidos gordos polinsaturados de cadeia muito longa, tais como DHA, EPA, ácido araquidónico (= ARA, C20:4A5,8,11'14) , ácido di-homo-y-linolénico (θ20:3Δ8'η'14) , ou ácido docosapentaenóico (DPA, θ22:5Δ7,10'13'16'19) não são sintetizados em plantas de frutos oleaginosos tais como a colza, soja, girassol, cártamo. As fontes naturais normais para estes ácidos gordos são peixes tais como o arenque, salmão, sardinhas, peixe vermelho, enguias, carpa, truta, linguado, cavala, lúcio-perca ou atum, ou algas.
Dependendo do objetivo da utilização, são preferidos os óleos com ácidos gordos saturados ou insaturados. Por exemplo, na alimentação humana, são preferidos lipidos com ácidos gordos insaturados, em especial ácidos gordos polinsaturados. Atribui-se aos ácidos gordos polinsaturados ω3 um efeito positivo nos níveis de colesterol no sangue e com isso, na prevenção de uma doença cardíaca. Através da adição de ácidos gordos ω3 na alimentação, o risco de uma doença cardíaca, de um acidente vascular cerebral ou de pressão arterial elevada é significativamente mais reduzido. De igual modo, processos inflamatórios crónicos no contexto de doenças imunológicas tais como artrite reumatóide, podem ser influenciados de forma positiva através de ácidos gordos ω3. Por este motivo, eles são adicionados a alimentos, ou então são utilizados em medicamentos. Devido à composição habitual dos alimentos, os ácidos gordos ωβ tais como o ácido araquidónico, têm um efeito negativo nestas doenças reumáticas. Ácidos gordos ω3 e ω6 são precursores de hormonas, dos denominados eicosanóides tal como as prostaglandinas, os quais são derivados do ácido di-homo-Y-linolénico, do ácido araquidónico e dos ácidos eicosapentaenóicos, dos tromoxanos e leucotrienos, os quais são derivados do ácido araquidónico e do ácido eicosapentaenóico. Os eicosanóides (da denominada série PG2) , os quais são formados a partir de ácidos gordos ω6, promovem geralmente reações inflamatórias, enquanto os eicosanóides (da denominada série PG3) formados a partir de ácidos gordos ω3, possuem uma pequena atividade inflamatória, ou mesmo nenhuma.
Devido às suas caracteristicas positivas, não têm faltado, no passado, tentativas para disponibilizar genes que estão envolvidos na síntese de ácidos gordos ou triglicerídeos, para a preparação de óleos em diferentes organismos com teor alterado de ácidos gordos polinsaturados. Assim, é descrita na WO 91/13972 e na sua equivalente americana, uma A9-dessaturase. Na WO 93/11245 é reivindicada uma Δ15 dessaturase, na WO 94/11516 é reivindicada uma Δ12-dessaturase. Outras dessaturases são descritas, por exemplo, nas EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 ou Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659. No entanto, a caracterização bioquímica das diferentes dessaturases tem sido insuficiente até a data, uma vez que as enzimas, na sua forma de proteínas ligadas a membranas, são difíceis de isolar e de caracterizar (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem. , 26, 1988: 777-792). Em regra, a caracterização de dessaturases ligadas a membranas é feita através da sua expressão num organismo apropriado, o qual é depois investigado para a atividade enzimática por intermédio de análise de reagentes e produtos. As Δ6-dessaturases são descritas nas WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022, WO 00/2155 e WO 99/27111 e também a utilização para a produção em organismos transgénicos é descrita por exemplo nas WO 98/46763 WO 98/46764, WO 9846765. Aqui, também é descrita a expressão de diferentes dessaturases, como por exemplo, nas WO 99/64616 ou WO 98/46776, e a formação de ácidos gordos polinsaturados é descrita e reivindicada.
Relativamente à eficácia da expressão de dessaturases e a sua influência na formação de ácidos gordos polinsaturados é de referir que, através da expressão de uma única dessaturase tal como descrito até aqui, se obteve apenas uma pequena quantidade de ácidos gordos / lípidos insaturados, como por exemplo, ácido γ-linolénico e ácido estearidónico. Além disso, obteve-se em regra uma mistura de ácidos gordos ω3 e ω6.
Microrganismos especialmente apropriados para a produção de PUFAs, são microrganismos tais como microalgas, como Phaeodactylum tricornutum, espécies de Porphiridium, espécies de Thraustochytrien, espécies de Schizochytrien ou espécies de Crypthecodinium, Ciliados, tais como Stylonychia ou Colpidium, fungos, tais como Mortierella, Entomophthora ou Mucor e/ou musgos tais como Physcomitrella, Ceratodon e Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: 269-278). Através de seleção, foram desenvolvidas estirpes mutantes dos microrganismos correspondentes, os quais produzem uma série de compostos desejáveis, incluindo PUFAs. A mutação e seleção de estirpes com produção melhorada de uma determinada molécula tal como os ácidos gordos polinsaturados é, contudo, um processo dificil e moroso. Por isso, sempre que possível, são preferidos os métodos de tecnologia genética, tais como os descritos anteriormente. No entanto, com auxilio dos microrganismos referidos, só é possível obter quantidades limitadas dos ácidos gordos polinsaturados desejados, como DPA, EPA ou ARA. Aqui, dependendo do microrganismo utilizado, eles ocorrem geralmente como mistura de ácidos gordos, por exemplo à base de EPA, DPA e ARA.
Para a síntese de ácido araquidónico, ácido eicosapentaenóico (EPA) e ácido docosahexaenóico (DHA), são discutidas várias vias de síntese (Figura 1) . Assim, a produção de EPA ou DHA decorre, por exemplo, em bactérias marinhas tais como espécies de Vibrio ou Shewanella, pela via dos policetideos (Yu, R. et al. Lipids 35:1061-1064, 2000; Takeyama, H. et al. Microbiology 143:2725-2731, 1997).
Uma estratégia alternativa tem por base a atividade alternada de dessaturases e elongases (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31:255-268, 2002; Sakuradani, E. et al. Gene 238:445-453, 1999). Uma modificação da via descrita através de A6-dessaturase, A6-elongase, A5-dessaturase, Δ5-elongase, A4-dessaturase é a via de síntese de Sprecher (Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta 1486:219-231) nos mamíferos. Em vez da A4-dessaturação, ocorre aqui um passo de extensão adicional em C24, uma A6-dessaturação adicional e finalmente uma β-oxidação no comprimento da cadeia C22. Para a produção em plantas e microrganismos, a referida via de síntese de Sprecher (ver Figura 1) não é, contudo, apropriada, uma vez que os mecanismos de regulação não são conhecidos.
Os ácidos gordos polinsaturados podem ser divididos em duas grandes classes, em ácidos gordos ω3 e ωβ, de acordo com o seu padrão de dessaturação, as quais têm atividades metabólicas e funcionais distintas (Figura 1).
Como produto de partida para a via metabólica ω6 pode ser usado o ácido linoleico (Ci8:2A9,12) , enquanto a via ω3 decorre por intermédio de ácido linolénico (Cis:3Δ9,12,15) . Aqui, o ácido linolénico é formado através da atividade de uma G)3-dessaturase (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117; Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113).
Os mamíferos, e como tal o homem, não possuem qualquer atividade dessaturase correspondente (Δ12 e ω3-dessaturase) , e por isso estes ácidos gordos têm de ser fornecidos com a alimentação (ácidos gordos essenciais). Através da sequência de reações de dessaturase e elongase, são então sintetizados, a partir destes precursores, os ácidos gordos polinsaturados fisiologicamente importantes ácido araquidónico (= ARA, Ο20:4δ5'8,11'14) , um ácido gordo ωβ e os dois ácidos gordos ω3 ácido eicosapentaenóico (= EPA, C20:5a5,8'11'14,17) e ácido docosahexaenóico (= DHA, C22:6m'7'10'13,17'19) . A aplicação de ácidos gordos ω3 possui o efeito terapêutico anteriormente descrito no tratamento de doenças cardiovasculares (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108), inflamações (Calder 2002, Proc. Nutr.
Soc. 61, 345-358) e artrite (Cleland und James 2000, J.
Rheumatol. 27, 2305-2307).
Do ponto de vista da fisiologia da alimentação, é assim importante na síntese de ácidos gordos polinsaturados conseguir uma mudança entre a via de síntese de ωβ e a via de síntese de ω3 (ver Figura 1), de forma que seja produzido mais ácido gordo ω3. Na literatura são descritas as atividades enzimáticas de diferentes <j)3-desaminases, as quais desnaturam os ácidos gordos Ci8=2, C22 = 4 ou C25:5 (ver Figura 1) . Nenhuma das dessaturases bioquimicamente descritas converte um grande espetro de substratos da via de síntese ωβ nos ácidos gordos correspondentes da via de síntese ω3.
Existe assim uma grande necessidade de uma co3-dessaturase, a qual seja adequada para a preparação de ácidos gordos polinsaturados ω3. Todas as oo3-dessaturases de origem vegetal e de cianobactérias dessaturam ácidos gordos Cie com ácido linoleico como substrato, mas não conseguem dessaturar ácidos gordos C20 ou C22 · É conhecida uma G)3-dessaturase do fungo Saprolegnia dicilina [Pereira et al. 2004, Biochem. J. 378 (Pt 2):665-71], a qual tem capacidade para dessaturar ácidos gordos polinsaturados C20. No entanto, é uma desvantagem que esta o)3-dessaturase não seja capaz de dessaturar quaisquer PUFAs Ci8 ou C22, tal como os importantes ácidos gordos Ci8:2, C22:4 ou C22:5 da via de síntese ω6. Uma outra desvantagem desta enzima é que ela não é capaz de dessaturar quaisquer ácidos gordos que estejam ligados a fosfolípidos. São apenas convertidos os CoA-ésteres de ácido gordo. O prolongamento dos ácidos gordos por intermédio de elongases em 2 ou 4 átomos C é decisivo para a produção de PUFAs C20 ou C22. Este processo decorre em 4 passos. O primeiro passo é a condensação de malonil-CoA no ácido gordo-acil-CoA através da cetoacil-CoA sintase (KCS, doravante referido como elongase). Segue-se depois um passo de redução (cetoacil-CoA redutase, KCR), um passo de desidratação (desidratase) e um passo final de redução (enoil-CoA redutase) . Foi postulado que a atividade da elongase influencia a especificidade e a velocidade de todos os processos (Millar and Kunst, 1997 Plant Journal 12:121-131).
No passado foram feitas inúmeras tentativas para obter o gene da elongase. Millar e Kunst, 1997 (Plant Journal 12:121-131) e Millar et al. 1999, (Plant Cell 11:825-838) descrevem a caracterização de elongases de origem vegetal para a sintese de ácidos gordos de cadeia longa monoinsaturados (C22:i) ou para a síntese de ácidos gordos de cadeia muito longa para a formação de cera em plantas (C28-C32) . Descrições para a síntese de ácido araquidónico e EPA podem ser encontradas, por exemplo, nas WO 0159128, WO 0012720, WO 02077213 e WO 0208401. A síntese de ácidos gordos C24 polinsaturados está descrita, por exemplo, em Tvrdik et al 2000, JCB 149:707-717 ou na WO 0244320.
Drexler et al 2003, Journal of Plant Physiology 160(7):779-802 descreve que com a utilização de Δ5-elongases ARA (C20:4) ou EPA (C20:s) é possível prolongar em um corpo C2. É feita referência a uma elongase de rato descrita por Moore et al., 2001 .
Até à data, não foi descrita qualquer elongase específica para a preparação de DHA (C22:6 n-3) em organismos que não produzem este ácido gordo naturalmente. Até aqui, foram apenas descritas elongases que produzem os ácidos gordos C20 ou C24. Não foi ainda descrita qualquer atividade Δ5-elongase.
As plantas superiores possuem ácidos gordos polinsaturados, tais como ácido linoleico (Cism) e ácido linolénico (Ci8:3) · ARA, EPA e DHA não estão presentes em óleos de sementes de plantas superiores, ou estão presentes apenas em quantidades vestigiais (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales. Technique &amp; Documentation - Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). No entanto, seria uma vantagem produzir LCPUFAs em plantas superiores, preferencialmente em sementes de oleaginosas tais como colza, linhaça, girassol e soja, uma vez que deste modo podem ser obtidas grandes quantidades de LCPUFAs de elevada qualidade para a indústria alimentar, de rações animais e farmacêutica, de forma económica. Para isso, genes que codificam enzimas para a biossintese de LCPUFAs têm de ser introduzidos e expressos em sementes de oleaginosas, por intermédio de métodos de tecnologia genética. Trata-se aqui de genes que codificam, por exemplo, para Δβ-dessaturases, A6-elongases, Δ5-dessaturases ou A4-dessaturases. Estes genes podem, de forma vantajosa, ser isolados a partir de microrganismos e plantas inferiores que produzem LCPUFAs, e os incorporam nas membranas ou triacilglicerideos. Já foi assim possível isolar genes da Δβ-dessaturase do musgo Physcomitrella patens e genes da Δβ-elongase de P. patens e do nemátodo C. elegans.
As primeiras plantas transgénicas que contêm e expressam genes que codificam para enzimas da biossintese de LCPUFAs e produzem os mesmos foram descritos pela primeira vez, por exemplo, na DE 102 19 203 (Método para a produção de ácidos gordos polinsaturados em plantas). Estas plantas produzem, contudo, LCPUFAs em quantidades que ainda têm de ser otimizadas, para um processamento dos óleos obtidos das plantas.
Para possibilitar uma suplementação de alimentos e/ou de rações com estes ácidos gordos polinsaturados, existe a necessidade de um método mais simples, mais económico, para a preparação destes ácidos gordos polinsaturados, especialmente em sistemas eucariontes.
Era por isso objetivo, disponibilizar mais genes ou enzimas que sejam apropriados para a síntese de LCPUFAs, em especial genes que apresentam atividade A5-elongase, para a produção de ácidos gordos polinsaturados. Este objetivo foi concretizado através da preparação de um ácido nucleico com uma sequência que codifica para um polipéptido com atividade A5-elongase, com a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO:67 b) um ácido nucleico que pode ser derivado como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO 68, ou c) derivado da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 67, que codifica polipéptidos com pelo menos 40% de identidade ao nível dos aminoácidos com a SEQ ID NO: 118, e apresenta uma atividade A5-elongase. e em que o ácido nucleico não possui a sequência representada na SEQ ID NO: 113.
Um outro objetivo desta invenção era fornecer genes ou enzimas que permitem uma mudança dos ácidos gordos ω6 para os ácidos gordos ω3. Este objetivo foi concretizado através do fornecimento de constructos genéticos contendo os ácidos nucleicos anteriormente mencionados, e adicionalmente outros genes envolvidos na biossíntese de ácidos gordos ou lípidos.
Além disso, o objetivo consistia também no desenvolvimento de um método para a preparação de ácidos gordos polinsaturados num organismo, de forma vantajosa num organismo eucariótico, preferencialmente numa planta ou num microrganismo. Este objetivo foi concretizado através do método para a preparação de compostos da fórmula geral I de acordo com a invenção
(I) em organismos transgénicos com um teor de pelo menos 1% peso destes compostos, em relação ao teor total de lípidos do organismo transgénico; o método é caracterizado pelo facto de conter os seguintes passos: a) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência, a qual codifica para uma atividade Δ9-elongase e/ou uma atividade Δβ-dessaturase, e b) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência, a qual codifica para uma atividade Δ8-dessaturase e/ou uma atividade Δβ-elongase, e c) introdução num organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência, a qual codifica para uma atividade Δ5-dessaturase, e d) introdução num organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência, a qual codifica para uma atividade Δ5-elongase, e e) introdução num organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência, a qual codifica para uma atividade Δ4-dessaturase, em que as variáveis e substituintes na fórmula I têm os significados seguintes: R1 = hidroxil, coenzima A-(tioéster) , liso- fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-
fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingobase ou um radical da fórmula geral II
<H) R2 = hidrogénio, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso- difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso- fosfatidilinositol ou alquilcarbonil C2-C24 saturado ou insaturado, R3 = hidrogénio, alquilcarbonil C2-C24 saturado ou insaturado, ou R2 ou R3 independentemente um do outro, um radical da fórmula geral Ia:
(la) n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 9, m = 2, 3, 4, 5ou6ep = 0ou 3, em que o ácido nucleico com uma sequência que codifica o polipéptido com atividade A5-elongase, é selecionado do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 67, ou b) ácidos nucleicos que podem ser derivados como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 68, ou c) derivado da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 67, a qual codifica para polipéptidos com pelo menos 40% identidade ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 68, e que apresentam uma atividade A5-elongase. e em que o ácido nucleico não possui a sequência representada pela SEQ ID NO: 113.
R1 significa, na fórmula geral I, hidroxil, coenzima A -(tioéster), liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingobase ou um radical da fórmula geral II
(»)
Os radicais de R1 anteriormente mencionados estão sempre ligados aos compostos da fórmula geral I na sua forma de tioéster. R2 significa, na fórmula geral II, hidrogénio, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol ou alquilcarbonil C2-C24 saturado ou insaturado.
Como radicais alquilo podem ser referidas cadeias alquilcarbonil C2-C24 substituídas ou não substituídas, saturadas ou insaturadas, tais como etilcarbonil, n-propilcarbonil, n-butilcarbonil, n-pentilcarbonil, n-hexilcarbonil, n-heptilcarbonil, n-octilcarbonil, n-nonilcarbonil, n-decilcarbonil, n-undecilcarbonil, n-dodecilcarbonil, n-tridecilcarbonil, n-tetradecilcarbonil, n-pentadecilcarbonil, n-hexadecilcarbonil, n-heptadecilcarbonil, n-octadecilcarbonil, n-nonadecilcarbonil, n-eicosilcarbonil, n-docosanilcarbonil ou n-tetracosanilcarbonil, os quais possuem uma ou mais ligações duplas. São preferidos radicais alquilcarbonil C10-C22 saturados ou insaturados, tais como n-decilcarbonil, n-undecilcarbonil, n-dodecilcarbonil, n-tridecilcarbonil, n-tetradecilcarbonil, n-pentadecilcarbonil, n-hexadecilcarbonil, n-heptadecilcarbonil, n-octadecilcarbonil, n-nonadecilcarbonil, n-eicosilcarbonil, n-docosanilcarbonil ou n-tetracosanilcarbonil, os quais possuem uma ou mais ligações duplas. Especialmente preferidos são radicais alquilcarbonil C10-C22 saturados ou insaturados, tais como alquilcarbonil Cio, alquilcarbonil Cu, alquilcarbonil C12, alquilcarbonil C13, alquilcarbonil C14, alquilcarbonil Ci6, alquilcarbonil Cis, alquilcarbonil C20 ou alquilcarbonil C22, os quais contêm uma ou mais ligações duplas. Mais especialmente preferidos são radicais alquilcarbonil C16-C22 saturados ou insaturados, tais como alquilcarbonil Ci6, alquilcarbonil Cis, alquilcarbonil C20 ou alquilcarbonil C22, os quais contêm uma ou mais ligações duplas. Estes radicais vantajosos podem conter duas, três, quatro, cinco ou seis ligações duplas. Os radicais especialmente vantajosos com 20 ou 22 átomos de carbono na cadeia de ácido gordo contêm até seis ligações duplas, de forma vantajosa três, quatro, cinco ou seis ligações duplas, de forma mais especialmente preferida, cinco ou seis ligações duplas. Todos os radicais referidos derivam dos ácidos gordos correspondentes. R3 significa, na fórmula geral II, hidrogénio ou alquilcarbonil C2-C24 saturado ou insaturado.
Como radicais alquilo podem ser referidos cadeias alquilcarbonil C2-C24, tais como etilcarbonil, n- propilcarbonil, n-butilcarbonil, n-pentilcarbonil, n-hexilcarbonil, n-heptilcarbonil, n-octilcarbonil, n- nonilcarbonil, n-decilcarbonil, n-undecilcarbonil, n- dodecilcarbonil, n-tridecilcarbonil, n-tetradecilcarbonil, n-pentadecilcarbonil, n-hexadecilcarbonil, n- heptadecilcarbonil, n-octadecilcarbonil, n- nonadecilcarbonil, n-eicosilcarbonil, n-docosanilcarbonil ou n-tetracosanilcarbonil, os quais contêm uma ou mais ligações duplas. São preferidos radicais alquilcarbonil C10-C22 saturados ou insaturados, tais como n-decilcarbonil, n-undecilcarbonil, n-dodecilcarbonil, n-tridecilcarbonil, n-tetradecilcarbonil, n-pentadecilcarbonil, n- hexadecilcarbonil, n-heptadecilcarbonil, n- octadecilcarbonil, n-nonadecilcarbonil, n-eicosilcarbonil, n-docosanilcarbonil ou n-tetracosanilcarbonil, os quais contêm uma ou mais ligações duplas. Especialmente preferidos são radicais alquilcarbonil C10-C22 saturados e/ou insaturados, tais como alquilcarbonil Cio, alquilcarbonil Cu, alquilcarbonil C12, alquilcarbonil C13, alquilcarbonil C14, alquilcarbonil Ci6, alquilcarbonil Cis, alquilcarbonil C20 ou alquilcarbonil C22, os quais contêm uma ou mais ligações duplas. Mais especialmente preferidos são radicais alquilcarbonil C16-C22 saturados ou insaturados, tais como alquilcarbonil Ci6, alquilcarbonil Ci8, alquilcarbonil C20 ou alquilcarbonil C22, os quais contêm uma ou mais ligações duplas. Estes radicais vantajosos podem conter duas, três, quatro, cinco ou seis ligações duplas. Estes radicais vantajosos podem conter duas, três, quatro, cinco ou seis ligações duplas. Estes radicais especialmente vantajosos com 20 ou 22 átomos de carbono na cadeia de ácido gordo contêm até seis ligações duplas, de forma vantajosa três, quatro, cinco ou seis ligações duplas, de forma mais especialmente preferida, cinco ou seis ligações duplas. Todos os radicais referidos derivam dos ácidos gordos correspondentes.
Os radicais de R1, R2 e R3 anteriormente referidos podem ser substituídos com grupos hidroxilo e/ou epoxi e/ou podem conter ligações triplas.
De forma vantajosa, os ácidos gordos polinsaturados preparados através do método de acordo com a invenção, contêm pelo menos duas ligações duplas, mas de forma vantajosa, três, quatro, cinco ou seis ligações duplas. De forma especialmente vantajosa, os ácidos gordos contêm cinco ou seis ligações duplas. Os ácidos gordos preparados pelo método têm, de forma vantajosa, 18, 20 ou 22 átomos C na cadeia de ácido gordo; os ácidos gordos contêm preferencialmente 20 ou 22 átomos de carbono na cadeia de ácido gordo. De forma vantajosa, os ácidos gordos saturados não são convertidos com os ácidos nucleicos utilizados no processo, ou são convertidos em pequena escala. Pequena escala quer dizer que, em comparação com ácidos gordos polinsaturados, os ácidos gordos saturados são convertidos com menos de 5% da atividade, de forma vantajosa com menos de 3%, de forma especialmente vantajosa com menos de 2%, e de forma mais especialmente vantajosa com menos de 1; 0,5; 0,25 ou 0,125%. Estes ácidos gordos podem ser preparados como produto único no processo, ou como mistura de ácidos gordos.
As sequências de ácidos nucleicos utilizadas no método de acordo com a invenção são ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade A5-elongase, selecionados do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 67, ou b) ácidos nucleicos que podem ser derivados como resultado da degeneração do código genético da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 68, ou c) derivado da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 67, a qual codifica para polipéptidos com pelo menos 40% identidade ao nivel dos aminoácidos com a SEQ ID NO: 68, e que apresenta atividade A5-elongase. e em que o ácido nucleico não possui a sequência representada pela SEQ ID NO: 113.
Como alternativa, podem ser utilizados no método ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos com atividade Δ9-elongase, Δδ-dessaturase, A8-dessaturase, Δδ-elongase, Δ5-dessaturase, A5-elongase ou á4-dessaturase, os quais são selecionados do grupo consistindo em:
a) um ácido nucleico com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49,
SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69,
SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83,
SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99,
SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 183, ou b) ácidos nucleicos que podem ser derivados do código genético degenerado das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12,
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,
SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40,
SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54,
SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74,
SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88,
SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118,
SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 184, ou
c) derivados da sequência de ácidos nucleicos apresentada nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:
19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:
33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:
47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO:
65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO:
81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ
ID NO: 91, NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 183, os quais codificam
polipéptidos com pelo menos 40% de identidade, ao nivel dos aminoácidos, com as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,
SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40,
SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54,
SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74,
SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88,
SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 184, e apresentam uma atividade A9-elongase, A6-dessaturase, Δδ-dessaturase, Δβ-elongase, Δδ-dessaturase, Δ5-elongase ou A4-dessaturase.
De forma vantajosa, os substituintes R2 ou R3 na fórmula I e II significam, independentemente um do outro, alquilcarbonil C18-C22 saturado ou insaturado, de forma especialmente vantajosa significam, independentemente um do outro, alquilcarbonil Cie, C20 ou C22 com pelo menos duas ligações duplas.
Uma forma de realização preferida do método é caracterizada pela introdução de uma sequência de ácidos nucleicos no organismo, a qual codifica para um polipéptido com atividade co3-dessaturase, e é selecionada do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 105, ou b) ácidos nucleicos que podem ser derivados como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 106, ou c) derivados da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 105, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 60% de identidade ao nivel dos aminoácidos com a SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 106, e que apresentam uma atividade m3-dessaturase.
Numa outra forma de realização preferida, o método é caracterizado pela introdução de uma sequência de ácido nucleico no organismo, a qual codifica para um polipéptido com atividade A12-dessaturase, e é selecionada do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 109, ou b) ácidos nucleicos que podem ser derivados como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 108 ou SEQ ID NO: 110, ou c) derivados da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 109, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 60% de identidade ao nivel dos aminoácidos com a SEQ ID NO: 108 ou SEQ ID NO: 110, e que apresentam uma atividade A12-dessaturase.
Estas sequências de A12-dessaturase anteriormente mencionadas podem ser utilizadas individualmente ou em combinação com as sequências co3-dessaturase, com as sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção e não inventivas, as quais codificam para A9-elongases, Δ6-dessaturases, Δδ-dessaturases, Δβ-elongases, Δ5- dessaturases, Δδ-elongases e/ou A4-dessaturases. A Tabela 1 fornece novamente as sequências de ácidos nucleicos, o microrganismo de origem e o número ID da sequência
De forma vantajosa, os ácidos gordos polinsaturados preparados no processo estão ligados a lipidos de membrana e/ou triacilglicerideos, mas também podem existir na forma de ácidos gordos livres, ou também ligados na forma de outros ésteres de ácido gordo no organismo. Assim, eles podem existir na forma de "produtos puros", mas também, de forma vantajosa, na forma de misturas de diferentes ácidos gordos, ou misturas de diferentes glicerideos. Os diferentes ácidos gordos ligados a triglicerideos podem ser derivados de ácidos gordos de cadeia curta com 4 a 6 átomos C, cadeia média com 8 a 12 átomos C ou de cadeia longa com 14 a 24 átomos C, sendo preferidos os ácidos gordos de cadeia longa, e muito preferidos os ácidos gordos de cadeia longa LCPUFAs de ácidos gordos Cis, C20 e/ou C22.
No processo de acordo com a invenção são preparados, de forma vantajosa, ésteres de ácido gordo com moléculas de ácidos gordos Cis, C20 e/ou C22 polinsaturados, com pelo menos duas ligações duplas no éster de ácido gordo, de forma vantajosa com pelo menos três, quatro, cinco ou seis ligações duplas no éster de ácido gordo, de forma especialmente vantajosa com pelo menos cinco ou seis ligações duplas no éster de ácido gordo, e conduzem à síntese de ácido linoleico (= LA, Ci8:2*9'12) , ácido γ-linolénico (= GLA, Ci8:3A6'9'12) , ácido estearidónico (= SDA, Ci8:4*6'9'12,15) , ácido dihomo-Y-linolénico (= DGLA, C20:3a8,11,14) , ácido G)3-eicosatetraenóico (= ETA, C20:4a5,8'11,14) , ácido araquidónico (= ARA, C20:4A5'8,11'14) , ácido eicosapentaenóico (= EPA, C20:5A5,8,11,14,17) , ácido ω6-docosapentaenóico (g22;5δ4,7,10,13,16) f ácido ωβ- docosatetraenóico (q22:4δ,7,10,13,16) f ácido ω3- docosapentaenóico (= DPA, q22:5a7,10,13,16,19) t ácido docosahexaenóico (= DHA, c22:6a4,7,10,13,16,19) ou as suas misturas, preferencialmente ARA, EPA e/ou DHA. Muito especialmente preferidos são ácidos gordos ω3, tais como EPA e/ou DHA.
Os ésteres de ácido gordo com moléculas de ácido gordo Cis, C20 e/ou C22 polinsaturados podem ser isolados dos organismos que foram utilizados para a preparação de ésteres de ácido gordo, na forma de um óleo ou lípido, por exemplo, na forma de compostos tais como esfingolípidos, fosfoglicerídeos, lípidos, glicolípidos tais como glicoesfingolípidos, fosfolípidos tais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol ou difosfatidilglicerol, monoacilglicerideos, diacilglicerideos, triacilglicerídeos ou outros ésteres de ácido gordo, tais como éster de acetil-coenzima A, os quais contêm ácidos gordos polinsaturados com pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis, preferencialmente cinco ou seis ligações duplas; de forma vantajosa, eles são isolados na forma dos seus diacilglicerídeos, triacilglicerídeos e/ou na forma de fosfatidilcolina, de forma especialmente preferida, na forma de triacilglicerídeos. Para além destes ésteres, os ácidos gordos polinsaturados também estão contidos nos organismos, de forma vantajosa, em plantas, na forma de ácidos gordos livres ou ligados a outros compostos. Em regra, os diferentes compostos mencionados (ésteres de ácido gordo e ácidos gordos livres) estão presentes no organismo com uma distribuição aproximada de 80 a 90% peso de triglicerídeos, 2 a 5% peso de diglicerídeos, 5 a 10% peso de monoglicerídeos, 1 a 5% peso de ácidos gordos livres, 2 a 8% peso de fosfolípidos, em que a soma dos diferentes compostos é igual a 100%.
No método de acordo com a invenção, os LCPUFAs são produzidos com um teor de pelo menos 3% peso, de forma vantajosa pelo menos 5% peso, preferencialmente pelo menos 8% peso, de forma mais preferida pelo menos 10% peso, e de forma ainda mais preferida, pelo menos 15% peso, em relação à totalidade de ácidos gordos nos organismos transgénicos, de forma vantajosa, numa planta transgénica. Aqui, são convertidos ácidos gordos Cis e/ou C20, os quais estão presentes no organismo hospedeiro, para pelo menos 10%, de forma vantajosa pelo menos 20%, de forma especialmente vantajosa pelo menos 30%, e de forma muito especialmente preferida 40%, nos produtos correspondentes tal como DPA ou DHA para referir apenas dois exemplos. De forma vantajosa, os ácidos gordos são produzido na forma ligada. Com auxílio dos ácidos nucleicos utilizados no método de acordo com a invenção, estes ácidos gordos insaturados podem ser ligados aos triglicerídeos produzidos de forma vantajosa, na posição snl, sn2 e/ou sn3. Uma vez que no método de acordo com a invenção decorrem vários passos de reação a partir dos compostos de partida ácido linoleico (Cis: 2) ou ácido linolénico (C18:3), os produtos finais do processo, como por exemplo, ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido ωβ-docosapentaenóico ou DHA não se originam como produtos completamente puros, mas há sempre pequenos vestígios de precursores no produto final. Caso esteja presente por exemplo ácido linoleico ou ácido linolénico no organismo de partida ou na planta de partida os produtos finais tais como ARA, EPA ou DHA estão presentes na forma de misturas. Os precursores não devem corresponder a mars do que 20% peso, preferencialmente não mais do que 15% peso, mais preferencialmente não mais do que 10% peso, e de forma mais especialmente preferida não mais do que 5% peso, em relação à quantidade de cada um dos produtos finais. De forma vantajosa, são produzidos como produtos finais numa planta transgénica, apenas ARA, EPA ou apenas DHA no método de acordo com a invenção, na forma ligada ou como ácidos livres. Caso os compostos ARA, EPA e DHA sejam produzidos em simultâneo, eles são produzidos, de forma vantajosa, numa razão de pelo menos 1:1:2 (EPA:ARA:DHA), de forma vantajosa pelo menos 1:1:3, preferencialmente 1:1:4, mais preferencialmente 1:1:5.
Os ésteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos, os quais foram produzidos de acordo com o método de acordo com a invenção contêm, de forma vantajosa, 6 a 15% de ácido palmitínico, 1 a 6% de ácido estearínico; 7 a 85% de ácido oleico; 0,5 a 8% de ácido vacénico, 0,1 a 1% de ácido araquínico, 7 a 25% de ácidos gordos saturados, 8 a 85% de ácidos gordos monoinsaturados e 60 a 85% de ácidos gordos polinsaturados, em cada caso relativamente a 100% e ao teor total de ácidos gordos do organismo. Como ácidos gordos polinsaturados vantajosos, estão contidos nos ésteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos, preferencialmente pelo menos 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 ou 1% de ácido araquidónico, em relação ao teor total de ácidos gordos. Além disso, os ésteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos que foram preparados de acordo com o método de acordo com a invenção, contêm, de forma vantajosa, ácidos gordos selecionados do grupo dos ácidos gordos: ácido erúcico (ácido 13-docosaenóico) , ácido esterculinico (9,10-metileno ácido octadec-9-enónico), ácido malvalinico (8,9-metileno heptadec-8-enónico), ácido ciclopenteno-dodecanóico, ácido gordo furano (ácido 9,12-epoxi-octadeca-9,11-dienóico), ácido vernonónico (ácido 9,10-epoxioctadec-12-enónico), ácido tarinico (ácido 6-octadecinóico), ácido 6-nonadecinóico, ácido tll-octadecen-9-óico, ácido 6,9-Octadecinóico, ácido tlO-heptadecen-8-óico, 9-octadecen- 12- inóico, ácido 13,14-dihidrorofeinico, ácido octadecen- 13- eno-9,11-diinóico, ácido petroselinico cis-6-octadecenóico, ácido 9c,12t-octadecadienóico, 8tl0tl2c-octadecatrienóico, ácido 9tlltl3c-octadecatrienóico, ácido eleoestearinico ácido 9clltl3t-octadecatrienóico, ácido 8cl0tl2c-octadecatrienóico, ácido punicico (ácido 9clltl3c-octadecatrienóico), ácido parinárico (ácido 9clltl3tl5c-octadecatetraenóico), ácido pinolénico (ácido all-cis-5,9,12-octadecatrienóico) , ácido labalénico (ácido 5,6-octadecadienalenóico) , óleo ricinoleico (ácido 12-hidroxioleico) e/ou ácido 13-hidroxi-9c, llt-octadecadienóico. Os ácidos gordos anteriormente referidos estão presentes nos ésteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos produzidos de acordo com o método de acordo com a invenção, em regra e de forma vantajosa, apenas em quantidades vestigiais, ou seja, estão presentes em quantidades menores do que 30%, preferencialmente menores do que 25%, 24%, 23%, 22% ou 21%, de forma especialmente preferida, em quantidades menores do que 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5%, de forma mais especialmente preferida, em quantidades menores do que 4%, 3%, 2% ou 1%, em relação à quantidade total de ácidos gordos. Numa outra forma de realização preferida da invenção, estes ácidos gordos mencionados estão presentes em quantidades menores do que 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6% ou 0,5%, de forma especialmente preferida, em quantidades menores do que 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1%, em relação à quantidade total de ácidos gordos. De forma vantajosa, os ésteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos preparados de acordo com o método de acordo com a invenção contêm menos do que 0,1%, em relação à quantidade total de ácidos gordos, ou nenhum, ácido butirico, nenhuma colesterina, nenhum ácido clupanodónico (= ácido docosapentaenóico, ç22;5A4,8,12,15,21) ^ assim como nenhum ácido nisinico (ácido tetracosahexaenóico, C23:6A3'8'12'15'18'21) .
Através das sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou das sequências de ácidos nucleicos utilizadas no método de acordo com a invenção, é possível conseguir um aumento do rendimento em ácidos gordos polinsaturados em pelo menos 50%, de forma vantajosa em pelo menos 80%, de forma especialmente vantajosa em pelo menos 100%, e de forma muito especialmente vantajosa em pelo menos 150%, em comparação com os organismos não transgénicos de partida, por exemplo, uma levedura, uma alga, um fungo ou uma planta tal como Arabidopsis ou linhaça, em comparação na análise GC, ver Exemplos.
Também podem ser preparados ácidos gordos ou composições de ácidos gordos polinsaturados quimicamente puros através do método anteriormente descrito. Para tal, os ácidos gordos ou as composições de ácidos gordos são isolados dos organismos não humanos, como dos microrganismos ou das plantas ou do meio de cultura no qual o organismo foi cultivado, ou derivados do organismo e do meio de cultura de forma conhecida, por exemplo, através de extração, destilação, cristalização, cromatografia ou combinações destes métodos. Estes ácidos gordos ou composições de ácidos gordos quimicamente puros são apropriados para utilizações no campo da indústria farmacêutica, cosmética e em especial na indústria farmacêutica.
Como organismos que podem ser usados no método de acordo com a invenção, podem ser considerados, em principio, todos os organismos não humanos, como microrganismos, animais não humanos ou plantas.
Como plantas podem ser usadas, em principio, todas as plantas que têm a capacidade de sintetizar ácidos gordos, como plantas dicotiledónias ou monocotiledónias, algas ou musgos. De forma vantajosa, as plantas são selecionadas a partir do grupo das famílias Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Euglenaceae, Prasinophyceae ou legumes ou plantas ornamentais tais como tagetes. A título de exemplo, são mencionadas as plantas seguintes, que são selecionadas a partir do grupo: Adelotheciaceae como o género Physcomitrella, por exemplo o género e espécie Physcomitrella patens, Anacardiaceae como os géneros Pistacia, Mangifera, Anacardium por exemplo o género e espécies Pistacia vera [pistácio], Mangifer indica [manga] ou Anacardium occidentale [caju], Asteraceae tal como os géneros Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana por exemplo o género e espécies Calendula officinalis [malmequer], Carthamus tinctorius [cártamo], Centaurea cyanus [flor de milho], Cichorium intybus [chicória], Cynara scolymus [alcachofra], Helianthus annus [girassol], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [canónigos], Tagetes lúcida, Tagetes erecta ou Tagetes tenuifolia [calêndula], Apiaceae tal como o género Daucus, por exemplo o género e espécie Daucus carota [cenoura], Betulaceae tal como o género Corylus, por exemplo o género e espécies Corylus avellana ou Corylus colurna [avelã], Boraginaceae tal como o género Borago, por exemplo o género e espécie Borago officinalis [borago], Brassicaceae tal como os géneros Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, por exemplo, os géneros e espécies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [colza], Sinapis arvensis, Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mostarda], Brassica oleracea [couve] ou Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae tal como os géneros Anana, Bromelia (ananás) por exemplo os géneros e espécies Anana comosus, Ananas ananas ou Bromelia comosa [ananás], Caricaceae tal como o género Carica tal como o género e espécie Carica papaia [papaia], Cannabaceae, tal como o género Cannabis, como o género e espécie Cannabis sative [cânhamo] , Convolvulaceae tal como os géneros Ipomea, Convolvulus, por exemplo os géneros e espécies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, I-pomoea fasfigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba ou Convolvulus panduratus [batata doce], Chenopodiaceae, tal como o género Beta, tal como os géneros e espécies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altíssima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta marítima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva ou Beta vulgaris var. esculenta [beterraba sacarina], Crypthecodiniaceae, tal como o género Crypthecodinium, por exemplo, o género e espécie Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, tal como o género Cucubita, por exemplo os géneros e espécies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo ou Cucurbita moschata [abóbora], Cymbellaceae, tal como os géneros Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, por exemplo o género e espécies Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, tal como os géneros Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, por exemplo, os géneros e espécies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpurascens, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falei folium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii,
Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trlchodon borealis, Trlchodon cylindricus ou Trlchodon cyllndrlcus var. oblongus, Elaeagnaceae, tal como o género Elaeagnus, por exemplo o género e espécie Olea europaea [oliveira], Ericaceae, tal como o género Kalmia, por exemplo, os géneros e espécies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia poll folia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros ou Kalmia lúcida [louro de montanha], Euglenaceae tal como os géneros Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalaphacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas, Trachelomonas, por exemplo o género e espécie Euglena gracilis; Euphorbiaceae tal como os géneros Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, por exemplo, os géneros e espécies Manihot utilíssima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [mandioca] ou Ricinus communis [mamona], Fabaceae tal como os géneros Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, por exemplo os géneros e espécies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [ervilhas], Albizia berteriana, Albizia j ulibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia j ulibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea j ulibrissin, Mimosa j ulibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda j ulibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [árvore da seda], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [alfalfa] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida,
Phaseolus max, Soja hispida ou Soja max [feijão de soja], Funariaceae tal como os géneros Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, por exemplo os géneros e espécies Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon j amesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria filavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria micrsotoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria piano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella callfornica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae tal como os géneros Pelargonium, Cocos, Oleum, por exemplo os géneros e Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides ou Oleum cocois [coqueiro], Gramineae tal como o género Saccharum, por exemplo, o género e espécie Saccharum officinarum, Juglandaceae tal como os géneros Juglans, Wallia, por exemplo, os géneros e espécies Juglans regia, Juglans ailanthi folia, Juglans síeboldíana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans j amaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra ou Wallia nigra [nogueira], Lauraceae tal como os géneros Persea, Laurus, por exemplo, os géneros e espécies Laurus nobilis [loureiro vulgar], Persea americana, Persea gratíssima ou Persea persea [abacateiro], Leguminosae tal como o género Arachis, por exemplo o género e espécie Arachis hypogaea [amendoim], Linaceae tal como os géneros Linum, Adenolinum, por exemplo, os géneros e espécies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum augustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense ou Linum trigynum [linho], Lythrarieae tal como o género Púnica, por exemplo, o género e espécie Púnica granatum [romã], Malvaceae tal como o género Gossypium, por exemplo, os géneros e espécies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum ou Gossypium thurberi [algodão], Marchantiaceae tal como o género Marchantia, por exemplo, os géneros e espécies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae tal como o género Musa, por exemplo, os géneros e espécies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisíaca, Musa spp. [banana], Onagraceae tal como os géneros Camissonia, Oenothera, por exemplo, os géneros e espécies Oenothera biennis ou Camissonia brevipes [primula], Palmae tal como o género Elacis, por exemplo, o género e espécie Elaeis guineensis [palmeira de óleo africana] , Papaveraceae tal como o género
Papaver, por exemplo, os géneros e espécies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [papoila], Pedaliaceae tal como o género Sesamum, por exemplo, o género e espécie Sesamum indicum [sésamo], Piperaceae tal como os géneros Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, por exemplo, os géneros e espécies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [pimenta de Cayenne], Poaceae tal como os géneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (milho), Triticum, por exemplo os géneros e espécies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cevada], Secale cereale [centeio], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena híbrida [aveia], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorgum miliaceum, Panicum militaceum [painço], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [milho] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [trigo], Porphyridiaceae tal como os géneros Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, por exemplo, o género e espécie Porphyridium cruentum,
Proteaceae tal como o género Macadamia, por exemplo, o género e espécie Macadamia intergrifolia [noz da macadâmia], Prasinophyceae tal como os géneros Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, por exemplo, os géneros e espécies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia duhia, Tetraselmis chui, Tetraselmis sued ca, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae tal como o género Coffea, por exemplo, os géneros e espécies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora ou Coffea liberica [café], Scrophulariaceae, tal como o género Verbascum, por exemplo, os géneros e espécies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum ou Verbascum thapsus [verbasco], Solanaceae tal como os géneros Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, por exemplo, os géneros e espécies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimenta], Capsicum annuum [pimento], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusi folia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rústica, Nicotiana sylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [batata], Solanum melongena [beringela] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrífolium ou Solanum lycopersicum [tomate], Sterculiaceae tal como o género Theobroma, por exemplo, o género e espécie Theobroma cacao [cacau] ou Theaceae tal como o género Camellia, por exemplo, o género e espécie Camellia sinensis [Tee].
Microrganismos vantajosos são, por exemplo, fungos selecionados do grupo das familias Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae ou Tuberculariaceae. A titulo de exemplo são mencionados os seguintes microrganismos, selecionados do grupo: Choanephoraceae tal como os géneros Blakeslea, Choanephora, por exemplo, os géneros e espécies Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae tal como o género Mortierella, por exemplo, os géneros e espécies Mortierella isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana, Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae tal como os géneros Phytium, Phytophthora, por exemplo, os géneros e espécies Pythium debaryanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetaceae tal como os géneros Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Yarrowia, por exemplo os géneros e espécies Hansenula anómala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polymorpha,
Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipiensis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomycetaceae tal como os géneros Schizosaccharomyces, por exemplo as espécies Schizosaccharomyces j aponicus var. japonicus, Schizosaccharomyces j aponicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schizosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae tal como os géneros Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, por exemplo, as espécies Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoeboideum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum ou Thraustochytrium visurgense.
Outros microrganismos vantajosos são, por exemplo, bactérias selecionadas do grupo das famílias Bacillaceae, Enterobacteriaceae ou Rhizobiaceae. A título de exemplo são mencionados os seguintes microrganismos, selecionados do grupo: Bacillaceae tal como o género Bacillus, por exemplo, os géneros e espécies Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Bacillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus psychrosaccharomicus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp. subtilis ou Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae tal como os géneros Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella ou Serratia, por exemplo os géneros e espécies Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter genomospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia cancerogena, Erwinia carnegieana, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora subesp. odorifera, Erwinia carotovora subesp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nigrifluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia persicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. communior, Escherichia colimutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia sp., Escherichia vulneris, Klebsiella aerogenes, Klebsiella edwardsii subesp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae, Klebsiella sp. , Klebsiella terrigena, Klebsiella trevisanii, Salmonella abony, Salmonella arizonae, Salmonella bongori, Salmonella choleraesuis subesp. arizonae, Salmonella choleraesuis subesp. bongori, Salmonella choleraesuis subesp. cholereasuis, Salmonella choleraesuis subesp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subesp. houtenae, Salmonella choleraesuis subesp. indica, Salmonella choleraesuis subesp. salamae, Salmonella daressalaam, Salmonella enterica subesp. houtenae, Salmonella enterica subesp. salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella heidelberg, Salmonella panama, Salmonella senftenberg, Salmonella typhimurium, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subesp. marcescens, Serratia marinorubra, Serratia odorífera, Serratia plymouthensis, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subesp. quinovora, Serratia quinivorans ou Serratia rubidaea; Rhizobiaceae tal como os géneros Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium, por exemplo, os géneros e espécies Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium steltulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Chelatobacter heintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium ciceri Rhizobium etli, Rhizobium fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense,
Rhizobium huakuii, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium j aponicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizogenes, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium saheli ou Sinorhizobium xinjiangense.
Outros microrganismos vantajosos para o método de acordo com a invenção são, por exemplo, protistas ou diatomáceas, selecionados do grupo das familias Dinophyceae, Turaniellidae ou Oxytrichidae tal como os géneros e espécies: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum ou Colpidium sp.
De forma vantajosa, são utilizados no método de acordo com a invenção organismos não humanos transgénicos, tais como fungos, como por exemplo Mortierella ou Traustochytrium, leveduras como Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, musgos como Physcomitrella ou Ceratodon, animais não humanos tais como Caenorhabditis, algas como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium ou Phaeodactylum ou plantas tais como plantas dicotiledónias ou monocotiledónias. De forma especialmente vantajosa são utilizados no método de acordo com a invenção, organismos que pertencem aos organismos produtores de óleos, ou seja, os organismos que são utilizados para o fabrico de óleos, tais como fungos tais como Mortierella ou Thraustochytrium, algas tais como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium, Phaeodactylum ou plantas, em especial plantas com frutos oleaginosos, os quais possuem grandes quantidades de lipidos, tais como, amendoim, colza, canola, girassol, cártamo (Carthamus tinctoria), papoila, mostarda, cânhamo, ricino, azeitona, sésamo, calendula, púnica, primula, verbasco, cardo, rosa selvagem, avelã, amêndoa, noz de macadâmia, abacate, louro, abóbora, linhaça, soja, pistáchio, borragem, árvores (palmeira de óleo africana, coqueiro, nogueira) ou culturas tais como milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, algodão, mandioca, pimenta, tagetes, culturas de Solanaceen, tais como batata, tabaco, beringela e tomate, espécies de Vicia, ervilhas, alfafa ou arbustos (café, cacau, chá), espécies de Salix, assim como gramineas perenes e culturas forrageiras. Plantas de acordo com a invenção preferidas são plantas com frutos oleaginosos, tais como amendoim, colza, canola, girassol, cártamo, papoila, mostarda, cânhamo, ricino, azeitona, calendula, púnica, primula, abóbora, linhaça, soja, borragem, árvores (palmeira de óleo africana, coqueiro). Especialmente preferidas são plantas ricas em ácidos gordos Ci8:2 e/ou Ci 8:3, tais como girassol, cártamo, tabaco, verbasco, sésamo, algodão, abóbora, papoila, primula, noz, linhaça, cardo, cártamo ou verbasco. Muito especialmente preferidas são plantas tais como o cártamo, girassol, papoila, primula, noz, linhaça ou cânhamo.
Para o método descrito de acordo com a invenção, é vantajoso introduzir no organismo, para além dos ácidos nucleicos introduzidos nos passos (a) a (d), assim como as sequências de ácidos nucleicos eventualmente introduzidas, as quais codificam para as co3-dessaturases, ainda outros ácidos nucleicos adicionais, os quais codificam para enzimas do metabolismo dos ácidos gordos ou lípidos.
Em principio, podem ser utilizados no método todos os genes do metabolismo dos ácidos gordos ou lipidos, de forma vantajosa em combinação com a ou as Δδ-elongase(s), Δ6-elongase(s) e/ou o3-dessaturase(s) da invenção [no âmbito deste pedido de patente, o plural deve incluir o singular e vice-versa], para a preparação de ácidos gordos polinsaturados; de forma vantajosa, os genes do metabolismo dos ácidos gordos ou lipidos são selecionados do grupo acil-CoA desidrogenase(s), acil-ACP [= proteína transportadora de acil] dessaturase(s), acil-ACP tioesterase (s), ácido gordo-acil transferase(s), acil-CoA:lisofosfolípidos aciltransferases, ácido gordo sintase (s), ácido gordo hidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s), ácido gordo dessaturase (s), ácido gordo acetilenases, lipoxigenases, triacilglicerol lipases, alenóxido sintases, hidroperóxido liases ou ácido gordo elongase(s), em combinação com a Δ5-elongase, Δβ-elongase e/ou co3-dessaturase. De forma especialmente preferida, são utilizados genes selecionados do grupo das A4-dessaturases, A5-dessaturases, Δ6-dessaturases, Δδ-dessaturases, A9-dessaturases, Δ12-dessaturases, Δβ-elongases ou A9-elongases, em combinação com os genes anteriormente referidos para a A5-elongase, Δβ-elongase e/ou co3-dessaturase, em que podem ser utilizados os genes individuais ou vários genes em combinação.
As Δδ-elongases de acordo com a invenção possuem, ao contrário das elongases humanas ou elongases de animais não humanos, tal como as de Oncorhynchus, Xenopus ou Ciona, a característica vantajosa de não realizarem a extensão dos ácidos gordos C22 nos seus ácidos gordos C24 correspondentes. Além disso, elas não convertem nenhum ácido gordo com uma ligação dupla na posição Δ6, como fazem as elongases humanas ou as elongases de animais não humanos. A5-Elongases especialmente vantajosas convertem preferencialmente apenas ácidos gordos C20 insaturados. Estas A5-elongases vantajosas apresentam algumas hélices transmembranares putativas (5-7) . De forma vantajosa, são apenas convertidos ácidos gordos C20 com uma ligação dupla na posição Δ5, sendo preferidos os ácidos gordos ω3-θ20 (EPA). Além disso, numa forma de realização preferida, elas possuem a propriedade de apresentarem, para além da atividade A5-elongase, de forma vantajosa, nenhuma atividade Δβ-elongase, ou uma atividade Δβ-elongase muito baixa. Pelo contrário, as elongases humanas ou de animais não humanos apresentam uma atividade aproximadamente igual em relação a ácidos gordos com uma ligação dupla Δ6 ou Δ5. Estas elongases vantajosas são descritas como elongases monofuncionais. As elongases humanas ou de animais não humanos são descritas como elongases multifuncionais e convertem, para além dos substratos referidos, também ácidos gordos Ci6 e Cis monoinsaturados, por exemplo, com uma ligação dupla Δ9 ou Δ11. De forma vantajosa, as elongases monofuncionais numa alimentação de levedura, na qual se fornece EPA como substrato para as leveduras, convertem pelo menos 15% peso dos EPAs adicionados para ácido docosapentaenóico (= DPA, C22:5^7'10'13'16'19) , de forma vantajosa, pelo menos 20% peso, e de forma especialmente vantajosa, pelo menos 25% peso. Caso seja fornecido ácido γ-linolénico (= GLA, Ci8:3A6,9,12) , este não é, de forma vantajosa, alongado. De igual modo, o Ci8:3a5,9'12 não é alongado. Numa outra forma de realização vantajosa, é convertido menos do que 60% peso do GLA adicionado para ácido γ-linolénico (θ20:3Δ8'ηΊ4) r de forma vantajosa menos do que 55% peso, de forma preferida menos do que 50% peso, de forma especialmente vantajosa, menos do que 45% peso e de forma muito especialmente preferida menos do que 40% peso. Numa outra forma de realização muito preferida da atividade A5-elonqase de acordo com a invenção, o GLA não é convertido.
As Figuras 27 e 28 apresentam a especificidade para o substrato medida para as diferentes elongases. Na Figura 27 são apresentadas as especificidades das elongases multifuncionais de Xenopus laevis (Figura 27A) , Ciona intestinalis (Figura 27B) e Oncorhynchus mykiss (Figura 27C) . Todas estas elongases convertem um largo espetro de substratos. Isto pode dar origem a produtos secundários no método de acordo com a invenção, os quais têm de ser convertidos por ação de outras atividades enzimáticas. Por este motivo, estas enzimas são menos preferidas no método de acordo com a invenção. As elongases monofuncionais preferidas e a sua especificidade para o substrato são apresentadas na Figura 28. A Figura 28A mostra a especificidade da A5-elongase de Ostreococcus tauri. Esta converte apenas ácidos gordos com uma ligação dupla na posição Δ5. De forma vantajosa, são apenas convertidos ácidos gordos C20. Uma especificidade para o substrato elevada semelhante é apresentada pela A5-elongase de Thalassiosira pseudonana (Figura 28C). Tanto a Δβ-elongase de Ostreococcus tauri (Figura 28B) como a de Thalassiosira pseudonana (Figura 28D) convertem, de forma vantajosa, apenas ácidos gordos com uma ligação dupla na posição Δ6. De forma vantajosa, são convertidos apenas ácidos gordos Cis-As A5-elongases de Arabidopsis thaliana e Euglena gracilis distinguem-se pela sua especificidade.
As Δβ-elongases descritas distinguem-se igualmente por uma elevada especificidade, ou seja, de forma preferida são alongados ácidos gordos Cie. De forma vantajosa, elas convertem ácidos gordos com uma ligação dupla na posição Δ6. De forma especialmente vantajosa, as Δβ-elongases convertem ácidos gordos Cis com três ou quatro ligações duplas na molécula, embora estes tenham que conter uma ligação dupla na posição Δ6. Além disso, estas têm, na melhor das hipóteses, a caracteristica de apresentarem, para além da atividade Δβ-elongase, de forma vantajosa, apenas uma relativamente pequena ou nenhuma atividade A5-elongase. Pelo contrário, as elongases humanas ou de animais não humanos apresentam uma atividade aproximadamente idêntica em relação a ácidos gordos com uma ligação dupla Δ6 ou Δ5. Estas elongases vantajosas são descritas como elongases monofuncionais. As elongases humanas ou de animais não humanos convertem, tal como descrito anteriormente, para além dos substratos anteriormente mencionados, também ácidos gordos Cie e Cis monoinsaturados, por exemplo, com ligação dupla Δ9 ou Δ11. De forma vantajosa, as elongases monofuncionais convertem, numa alimentação de levedura na qual se adiciona EPA como substrato às leveduras, pelo menos 10% peso do ácido a-linolénico (= ALA, Ci8:3* 9'12'15) , ou pelo menos 40% peso do ácido γ-linolénico (= GLA, Ci8:3*6'9,12) , de forma vantajosa pelo menos 20% peso ou 50% peso, de preferência pelo menos 25% peso ou 60% peso. De forma especialmente vantajosa, Ci8:4*6'9'12'15 (ácido estearidónico) também é alongado. O SDA é convertido em pelo menos 40% peso, de forma vantajosa em pelo menos 50% peso, de forma especialmente preferida em pelo menos 60% peso, e de forma muito especialmente preferida em pelo menos 70% peso. Δ6-Elongases especialmente boas apresentam muito baixa ou nenhuma atividade (menor do que 0,1% peso de conversão) para os seguintes substratos: 0ΐ8:ΐΔδ, Οΐ8 = ιΔ9, Cis:M1, C2o:2A11'14,
C20:3A11'14'17, C20:3A8'11'14, C20:4Δ5'8'11'14, C20:5Δ5'8'11'14'17 OU C22.4Δ7, 10, 13,16 _
As Figuras 29 e 30, assim como a Tabela 18 apresentam as especificidades para o substrato medidas para as diferentes elongases. A co3-dessaturase divulgada tem, em comparação com as ω3-dessaturases conhecidas, a propriedade vantajosa de ser capaz de dessaturar um largo espetro de ácidos gordos ωβ, preferencialmente ácidos gordos C20 e C22, tais como ácidos gordos C20:2, C20:3, C20:4, C22 = 4 ou C22:5. No entanto, também são bem dessaturados os ácidos gordos mais curtos, tal como ácidos gordos Cis, tal como Ci8:2 ou Ci8:3. Através destas caracteristicas da o)3-dessaturase é possivel alterar o espetro de ácidos gordos dentro de um organismo, de preferência dentro de um planta ou de um fungo, dos ácidos gordos ωβ para os ácidos gordos ω3. Preferencialmente a ω3-dessaturase descrita anteriormente dessatura ácidos gordos C20. Dentro do organismo, estes ácidos gordos do conjunto de ácidos gordos presentes são convertidos para os ácidos gordos ω3 correspondentes, em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25% ou 30%. Em relação aos ácidos gordos Cis, a co3-dessaturase apresenta um fator de atividade 10 vezes menor, ou seja, apenas cerca de 1,5 a 3% dos ácidos gordos no conjunto de ácidos gordos presentes é que é convertido para os ácidos gordos ω3 correspondentes. Os substratos preferidos da ω3-dessaturase de acordo com a invenção são os ácidos gordos ωβ ligados aos fosfolipidos. A Figura 19 mostra claramente no exemplo da dessaturação de ácido di-homo-Y-linolénico [C20:4Δ8'llf 14] , que a m3-dessaturase não distingue entre os ácidos gordos ligados na posição snl ou na posição sn2. Os ácidos gordos ligados em ambas as posições snl ou sn2 nos fosfolipidos são dessaturados. Além disso, é vantajoso o facto de a <a3-dessaturase converter uma grande variedade de fosfolipidos, tal como fosfatidilcolina (=PC), fosfatidilinositol (=PIS) ou fosfatidiletanolamina (=PE). Finalmente, também podem ser encontrados produtos de dessaturação nos lípidos neutros (-NL), ou seja, nos triglicerídeos.
Em comparação com as A4-dessaturases, Δδ-dessaturases e Δ6-dessaturases conhecidas, as A4-dessaturases, Δ5-dessaturases e Δβ-dessaturases descritas têm a vantagem de poder dessaturar ácidos gordos ligados a fosfolípidos ou ésteres de ácido gordo-CoA, de forma vantajosa, ésteres de ácido gordo-CoA.
De forma vantajosa, as Δ12-dessaturases utilizadas no método de acordo com a invenção convertem ácidos oleicos (Ci8: ιΔ9) para ácido linoleico (Cis: 2Δ9,12) ou Ci8:2A6,9 para Ci8:3A6'9,12 (= GLA) . De forma vantajosa, as Al2-dessaturases utilizadas convertem ácidos gordos ligados a fosfolipidos ou ésteres de ácido gordo-CoA, de forma vantajosa, ligados a ésteres de ácido gordo-CoA.
Através da atividade enzimática dos ácidos nucleicos utilizados no método de acordo com a invenção, os quais codificam para polipéptidos com atividade A5-elongase, Δ6-elongase e/ou co3-dessaturase, de forma vantajosa, em combinação com sequências de ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos do metabolismo dos ácidos gordos ou lipidos, tal como outros polipéptidos com atividade Δ4-, Δ5-, Δ6-, Δ8-, A12-dessaturase ou Δ5-, Δ6-, ou A9-elongase, podem ser preparados diversos ácidos gordos polinsaturados com o método de acordo com a invenção. Dependendo da escolha dos organismos utilizados no método de acordo com a invenção, como por exemplo, as plantas vantajosas, podem ser preparadas misturas de diferentes ácidos gordos polinsaturados, ou ácidos gordos polinsaturados individuais, tal como EPA ou ERA na forma livre ou ligada. Dependendo da composição de ácidos gordos que predomina na planta (ácidos gordos Ci8:2 ou Ci8:3) , originam-se ácidos gordos que derivam de ácidos gordos Ci8:2, tais como GLA, DGLA ou ARA ou que derivam de ácidos gordos Ci8:3, tais como SDA, ETA ou EPA. Caso esteja presente na planta usada no método apenas ácido linoleico (= LA, Ci8:2A19,12) como ácido gordo insaturado, então só podem resultar como produtos do método GLA; DGLA e ARA, os quais podem existir como ácidos gordos livres ou ligados. Caso esteja presente na planta usada no método apenas ácido α-linolénico (= ALA, Ci8:3A9'12'15) como ácido gordo insaturado, como por exemplo, na linhaça, então só podem resultar como produtos do método SDA, ETA, EPA e/ou DHA, os quais, tal como descrito anteriormente, podem existir como ácidos gordos livres ou ligados. Através de modificação da atividade da enzima Δ5-elongase envolvida na sintese, de forma vantajosa em combinação com a Δ4-, Δ5-, Δ6-, Al2-dessaturase e/ou Δ6-elongase, ou com a Δ4-, Δ5-,Δ8-, A12-dessaturase, e/ou Δ9-elongase, podem ser preparados apenas produtos individuais nos organismos mencionados, de forma vantajosa, nas plantas mencionadas. Através da atividade de Δβ-dessaturase e Δ6-elongase, formam-se, por exemplo, GLA e DGLA ou SDA e ETA, dependendo da planta e do ácido gordo insaturado. Preferencialmente, formam-se DGLA ou ETA ou misturas destes. Caso sejam introduzidos adicionalmente nos organismos, de forma vantajosa, nas plantas, a A5-elongase e a A4-dessaturase, são formados ainda ARA, EPA e/ou DHA. Isto é válido também para organismos nos quais foram previamente introduzidas Δδ-dessaturase e A9-elongase. De forma vantajosa, são sintetizados apenas ARA, EPA ou DHA, ou misturas dos mesmos, dependendo do ácido gordo presente no organismo ou na planta, o qual serve de substância de partida para a sintese. Uma vez que se trata de cadeias de biossintese, os respetivos produtos finais não se encontram no organismo na forma de substâncias puras. Estão sempre presentes no produto final pequenas quantidades de compostos precursores. Estas pequenas quantidades correspondem a menos de 20% peso, de forma vantajosa, menos de 15% peso, de forma especialmente vantajosa menos de 10% peso, de forma muito especialmente vantajosa menos de 5, 4, 3, 2, ou 1% peso, em relação ao produto final DGLA, ETA ou misturas destes, ou ARA, EPA, DHA ou misturas destes, de forma vantajosa, EPA ou DHA, ou misturas destes. A proteina codificada pelo ácido nucleico de acordo com a invenção apresenta uma elevada especificidade para ambos os precursores ácidos gordos Ci8:4A6,9'12'15 e C20:5a5,8'11,14'17, para a síntese de DHA (precursores e síntese de DHA, ver Figura 1). A proteína codificada pela SEQ ID NO: 53 tem assim uma especificidade para ácidos gordos Δ6 e Δ5, com uma ligação dupla ω3 adicional (Figura 2). A A5-elongase tem uma atividade ceto-acil-CoA sintase, a qual, de forma vantajosa, alonga radicais de ácido gordo de ésteres de acil-CoA em 2 átomos de carbono.
Por intermédio do gene da á5-elongase, da A5-dessaturase de Phaeodacylum assim como da á4-dessaturase de Euglena, pode ser demonstrada a síntese de DHA em levedura (Saccharomyces cerevisiae) (Figura 3).
Para além da produção dos ácidos gordos de partida para a A5-elongase de acordo com a invenção e/ou a Δβ-elongase, co3-dessaturase divulgadas, diretamente no organismo, os ácidos gordos também podem ser fornecidos de fontes externas. Por um motivo de custos, prefere-se a produção no organismo. Substratos da co3-dessaturase preferidos são o ácido linoleico (Ci8:2A9,12) , o ácido y-linolénico (Οΐ8:3Δ6,9,12) , o ácido eicosadienóico (C20:2M1,14) , o ácido di-homo-y-linolénico (C20:3A8'11,14) , o ácido araquidónico (C20:4a5,8,11,14) , o ácido docosatetraenóico (C22:4Δ7,10,13,1S) e o ácido docosapentaenóico (C22:5M'7,10,13'15) ·
Para aumentar o rendimento do método descrito para a produção de óleos e/ou triglicerideos que têm, de forma vantajosa, um teor elevado de ácidos gordos polinsaturados, é vantajoso aumentar a quantidade de produtos de partida para a sintese de ácidos gordos, o que pode ser conseguido, por exemplo, através da introdução de um ácido nucleico no organismo, o qual codifica para um polipéptido com atividade A12-dessaturase. Isto é especialmente vantajoso em organismos produtores de óleo, tal como a família das Brassicaceae, tal como o género Brassica, por exemplo, colza; a família das Elaeagnaceae, tal como o género Elaeagnus, por exemplo o género e espécie Olea europaea, ou a família Fabaceae, tal como o género Glycine, por exemplo, o género e espécie Glycine max, as quais apresentam um teor elevado de ácidos oleicos. Uma vez que estes organismos apresentam apenas um teor baixo em ácido linoleico (Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678 - 681), é vantajosa a utilização das referidas A12-dessaturases para a preparação do produto de partida.
No método de acordo com a invenção, os ácidos nucleicos usados provêm, de forma vantajosa, de plantas tais como algas, por exemplo algas da família Prasinophyceae tal como os géneros Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnococcus, Pyramimonas, Scherffelia ou Tetraselmis, tal como os géneros e espécies Heteromastix longifillis, Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephroselmis rotunda, Ostreococcus tauri, Ostreococcus sp, Prasinocladus ascus, Prasinocladus lubricus, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amylifera, Pyramimonas disomata, Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, Pyramimonas parkeae, Pyramimonas spinifera,
Pyramimonas sp., Tetraselmis apiculata, Tetraselmis carteriaformis, Tetraselmis chui, Tetraselmis convolutae, Tetraselmis desikacharyi, Tetraselmis gracilis, Tetraselmis hazeni, Tetraselmis impellucida, Tetraselmis inconspicua, Tetraselmis levis, Tetraselmis maculata, Tetraselmis marina, Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordiformis, Tetraselmis suecica, Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Tetraselmis verrucosa fo. rubens ou Tetraselmis sp. ou de algas da familia Euglenaceae tal como os géneros Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas ou Trachelomonas, tal como os géneros e espécies Euglena acus, Euglena geniculata, Euglena gracilis, Euglena mixocylindracea, Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonas cylindrica ou Trachelomonas volvocina. De forma vantajosa, os ácidos nucleicos utilizados provêm de algas dos géneros Euglena, Mantoniella ou Ostreococcus.
Outras plantas vantajosas são algas tais como Isochrysis ou Crypthecodinium, algas/diatomáceas tais como Thalassiosira ou Phaeodactylum, musgos tais como Physcomitrella ou Ceratodon ou plantas superiores tais como as Primulaceae, tal como Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens ou Osteospermum hyoseroides, microrganismos tais como fungos, como por exemplo Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor ou Mortierella, bactérias tais como Shewanella, leveduras ou animais tais como nemátodos, como Caenorhabditis, insetos, rãs, pepinos do mar ou peixes. De forma vantajosa, as sequências de ácidos nucleicos isoladas de acordo com a invenção, são provenientes de um animal pertencente à ordem dos vertebrados. Preferencialmente, as sequências de ácidos nucleicos são provenientes da classe
Vertebrate; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae ou Oncorhynchus ou Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus ou Evertebrata, tal como Protochordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae, tal como Amaroucium constellatum, Botryllus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgula citrina, Molgula manhattensis, Perophora viridis ou Styela partita. De forma especialmente vantajosa, os ácidos nucleicos são provenientes de fungos, animais ou plantas tais como algas ou musgos, preferencialmente da ordem dos salmonif ormes, tal como a familia Salmonidae, tal como o género Salmo, por exemplo, dos géneros e espécies Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta ou Salmo trutta fario, de algas tal como os géneros Mantoniella ou Ostreococcus ou de diatomáceas, tal como os géneros Thalassiosira ou Phaeodactylum, ou de algas tal como Crypthecodinium.
De forma vantajosa, as sequências de ácidos nucleicos no método de acordo com a invenção anteriormente mencionadas ou os seus derivados ou homólogos, os quais codificam para polipéptidos que possuem ainda a atividade enzimática das proteínas codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos. Estas sequências são clonadas individualmente ou em combinação com as sequências de ácidos nucleicos que codificam as A12-dessaturase, A4-dessaturase, Δ5-dessaturase, A6-dessaturase, A5-elongase, Δβ-elongase, e/ou co3-dessaturase, no constructo de expressão, e utilizadas para introdução e expressão nos organismos. Estes constructos de expressão permitem, de forma vantajosa e através da sua construção, uma síntese ótima dos ácidos gordos polinsaturados produzidos no método de acordo com a invenção.
Numa forma de realização preferida, o método compreende o passo de obtenção de uma célula ou de um organismo inteiro, o qual contém a sequência de ácidos nucleicos utilizada no método, em que as células e/ou o organismo são transformados com uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, a qual codifica para a A5-elongase, um constructo genético, ou um vetor tal como descrito a seguir, sozinho ou em combinação com outras sequências de ácidos nucleicos, as quais codificam para proteinas do metabolismo dos ácidos gordos ou lipidos. Numa outra forma de realização preferida, este método compreende ainda o passo de obtenção dos óleos, lipidos ou ácidos gordos livres do organismo ou da cultura. A cultura pode tratar-se, por exemplo, de uma cultura de fermentação, por exemplo, no caso do cultivo de microrganismos como por exemplo, Mortierella, Thalassiosira, Mantoniella, Ostreococcus, Saccharomyces ou Thraustochytrium, ou de uma estufa ou campo de cultura de uma planta. As células assim produzidas ou os organismos assim produzido é, de forma vantajosa, uma célula de um organismo produtor de óleo, tal como uma planta de frutos oleaginosos, como por exemplo, amendoim, colza, canola, linhaça, cânhamo, soja, cártamo, girassol ou borragem.
Cultivo refere-se, por exemplo, ao cultivo no caso de células, tecidos ou órgãos vegetais, num meio de cultura, ou da planta inteira num substrato, por exemplo, hidrocultura, terra para vasos de flores ou terra arável.
No âmbito da invenção, "transgénico" ou "recombinante" significa, relativamente aos exemplos, por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos, uma cassete de expressão (= constructo genético) ou um vetor, contendo a sequência de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, ou um organismo transformado com as sequências de ácidos nucleicos, cassetes de expressão ou vetor de acordo com a invenção, todas as construções originadas por métodos genéticos, nas quais: a) os ácidos nucleicos de acordo com a invenção, representados através das suas sequências de ácidos nucleicos, ou b) sequências genéticas de controlo ligadas funcionalmente a estas sequências de ácidos nucleicos, por exemplo, um promotor, ou c) (a) e (b) não estão no seu ambiente genético natural, ou foram modificados por métodos genéticos, em que a modificação pode ser, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um vários residuos de nucleotideos. Ambiente genético natural significa o locus cromossómico ou genómico natural no organismo de origem, ou a presença numa biblioteca genómica. No caso de uma biblioteca genómica, o ambiente genético natural da sequência de ácidos nucleicos é preferencialmente mantido, pelo menos parcialmente. 0 ambiente flanqueia a sequência de ácidos nucleicos pelo menos de um dos lados, e tem uma sequência com um comprimento de pelo menos 50 bp, preferencialmente pelo menos 500 bp, de forma especialmente preferida pelo menos 1000 bp, e de forma ainda mais especialmente preferida, pelo menos 5000 bp. Uma cassete de expressão de ocorrência natural, por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, com as A5-elongases correspondentes, forma uma cassete de expressão transgénica, quando esta é alterada através de métodos não naturais, sintéticos ("artificiais"), por exemplo, uma mutação. Métodos correspondentes são descritos, por exemplo, na US 5,565,350 ou WO 00/15815.
No contexto da invenção, organismos transgénicos ou plantas transgénicas deve ser entendido, tal como já referido, que os ácidos nucleicos utilizados no método não estão na sua localização normal no genoma de um organismo, podendo os ácidos nucleicos ser expressos de forma homóloga ou heteróloga. Transgénico significa também, tal como mencionado, que os ácidos nucleicos de acordo com a invenção estão na sua localização normal no genoma de um organismo, que a sequência foi alterada em relação à sequência natural e/ou que as sequências de regulação das sequências naturais foram alteradas. Preferencialmente, como transgénico deve ser entendido que a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção é feita em locais não normais do genoma, o que significa uma expressão homóloga ou, preferencialmente, heteróloga, dos ácidos nucleicos. Organismos transgénicos preferidos são plantas tais como Mortierella ou Phytophtora, musgos tais como Physcomitrella, algas tais como Mantoniella, Euglena, Crypthecodinium ou Ostreococcus, diatomáceas tais como Thalassiosira ou Phaeodyctylum, ou plantas tais como plantas com frutos oleaginosos.
Como organismos ou organismos hospedeiros para os ácidos nucleicos, cassete de expressão ou vetor usados no método de acordo com a invenção, são apropriados em principio e de forma vantajosa, todos os organismos que têm a capacidade para sintetizar ácidos gordos, em especial ácidos gordos insaturados, ou que são adequados para a expressão de genes recombinantes. A titulo de exemplo, podem ser referidos plantas, tais como Arabidopsis, Asteraceae tal como Calendula ou plantas de cultivo, tais como soja, amendoim, ricino, girassol, milho, algodão, linhaça, colza, coco, palmeira de óleo africana, cártamo (Carthamus tinctorius) ou cacau, microrganismos tais como fungos, por exemplo, o género Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia, Phytophtora ou Pythium, bactérias tais como o género Escherichia ou Shewanella, leveduras tais como o género Saccharomyces, cianobactérias, ciliados, algas tais como Mantoniella, Euglena, Thalassiosira ou Ostreococcus, ou protozoários tais como dinoflagelados tais como Crypthecodinium. São preferidos organismos que têm capacidade de produzir óleos naturais em grandes quantidades, como por exemplo, fungos tais como Mortierella alpina, Pythium insidiosum, Phytophtora infestans, ou plantas tais como soja, colza, coco, palmeira de óleo africana, cártamo, linhaça, cânhamo, ricino, calêndula, amendoim, cacau ou girassol, ou leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae; especialmente preferidos são soja, linho, colza, cártamo, girassol, calêndula, Mortierella ou Saccharomyces cerevisiae. Em principio, para além dos organismos transgénicos referidos, também são apropriados como organismos hospedeiros, animais transgénicos, de forma vantajosa, animais não humanos, por exemplo C. elegans, Ciona intestinalis ou Xenopus laevis. Células hospedeiras que podem ser utilizadas são ainda referidas em: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Estirpes de expressão que podem ser utilizadas, por exemplo, as que apresentam uma baixa atividade de protease, são descritas em: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Isto inclui células vegetais e determinados tecidos, órgãos e partes de plantas em todas as suas formas, como por exemplo, anteras, fibras, raízes, talos, embriões, caules, cotiledóneas, pecíolos, material de colheita, tecidos vegetais, tecido reprodutivo e culturas celulares, que sejam derivados das plantas transgénicas e/ou que possam ser utilizados para produzir as plantas transgénicas.
As plantas transgénicas que sintetizam ácidos gordos polinsaturados no método de acordo com a invenção podem, de forma vantajosa, ser diretamente comercializadas sem que os óleos, lípidos ou ácidos gordos sintetizados tenham de ser isolados. Plantas usadas no método de acordo com a invenção são plantas inteiras, e todas as partes de plantas, órgãos de plantas ou partes de plantas tais como folhas, talos, sementes, raízes, tubérculos, anteras, fibras, zona pilosa da raiz, talos, embriões, caules, cotiledóneas, pecíolos, material de colheita, tecidos vegetais, tecido reprodutivo e culturas celulares, que sejam derivados das plantas transgénicas, e/ou que possam ser utilizados para produzir as plantas transgénicas. As sementes incluem todas as partes da semente, tal como a cápsula da semente, células da epiderme e células da semente, endosperma ou tecido embrionário. Os compostos preparados no método de acordo com a invenção também podem ser isolados do organismo, de forma vantajosa, plantas, na forma dos seus óleos, gorduras, lípidos e/ou ácidos gordos. Os ácidos gordos polinsaturados preparados através deste método podem ser isolados através da colheita dos organismos, quer a partir da cultura onde os mesmos cresceram, quer diretamente do campo de cultivo. Isto pode ser feito através de prensagem ou extração das partes de plantas, preferencialmente das sementes de plantas. Podem assim ser obtidos óleos, gorduras, lípidos e/ou ácidos gordos livres através do denominado batimento a frio ou prensagem a frio sem aplicar calor, através de prensagem. De forma a que as partes de plantas, em especial as sementes, possam ser mais facilmente abertas, elas são previamente trituradas, vaporizadas ou torradas. As sementes assim tratadas previamente, podem depois ser prensadas ou submetidas a extração com hexano quente. A seguir, o solvente é novamente removido. No caso de microrganismos, estes são extraídos diretamente após a colheita, por exemplo, diretamente sem outros passos intermédios, ou extraídos após digestão através de diferentes métodos conhecidos do perito na especialidade. Desta forma, é possível isolar mais de 96% dos compostos preparados com o método. A seguir, os produtos assim obtidos são processados, ou seja, são refinados. Aqui, em primeiro lugar, por exemplo a mucilagem e o material em suspensão das plantas são removidos. A remoção desta mucilagem pode ser feita de forma enzimática ou por exemplo, por um método químico/físico, através da adição de ácidos tais como o ácido fosfórico. A seguir, os ácidos gordos livres são removidos através de tratamento com uma base, por exemplo, hidróxido de sódio. 0 produto obtido é lavado com grande quantidade de água e seco, para a remoção do hidróxido de sódio que ficou no produto. Para remover os corantes que ainda estão presentes no produto, o mesmo é submetido a um branqueamento, por exemplo com terra e Fuller ou carvão ativado. Por fim, o produto é ainda submetido a desodorização, por exemplo, com vapor de água.
As moléculas de ácidos gordos Cis, C20 ou C22, de forma vantajosa moléculas de ácidos gordos C20 ou C22 dos PUFAs ou LCPUFAs produzidos através deste método, têm pelo menos 2 ligações duplas por molécula de ácido gordo, preferencialmente três, quatro, cinco ou seis ligações duplas . Estas moléculas de ácidos gordos Cis, C20 ou C22 podem ser isoladas do organismo na forma de um óleo, lípido ou um ácido gordo livre. Organismos apropriados são, por exemplo, os mencionados anteriormente. Organismos preferidos são plantas transgénicas.
Uma forma de realização da invenção diz respeito portanto a óleos, lipidos ou ácidos gordos, ou frações destes, os quais são produzidos através do método descrito, de forma especialmente preferida, óleos, lipidos ou uma composição de ácidos gordos, os quais compreendem PUFAs e resultam de plantas transgénicas.
Estes óleos, lipidos ou ácidos gordos compreendem, tal como descrito anteriormente, de forma vantajosa, 6 a 15% de ácido palmitinico, 1 a 6% de ácido esteárico, 7 a 85% de ácido oleico, 0,5 a 8% de ácido vecénico, 0,1 a 1% de ácido araquidónico, 7 a 25% de ácidos gordos saturados, 8 a 25% de ácidos gordos monoinsaturados e 60 a 85% de ácidos gordos polinsaturados, em cada caso, relativamente a 100% e ao teor total de ácidos gordos do organismo. De forma vantajosa, os éteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos contêm preferencialmente pelo menos 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 ou 1% de ácido araquidónico, em relação ao teor total de ácidos gordos. Além disso, os ésteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos que foram preparados de acordo com o método de acordo com a invenção contêm, de forma vantajosa, ácidos gordos selecionados do grupo dos ácidos gordos: ácido erúcico (ácido 13-docosaenóico) , ácido esterculinico (9,10-metileno ácido octadec-9-enónico), ácido malvalinico (8,9-metileno heptadec-8-enónico), ácido ciclopenteno-dodecanóico, ácido gordo furano (ácido 9,12-epoxi-octadeca-9,11-dienóico), ácido vernonónico (ácido 9, 10-epoxioctadec-12-enónico), ácido tarinico (ácido 6-octadecinóico), ácido 6-nonadecinóico, ácido tll-octadecen-9-óico, ácido 6, 9-Octadecinóico, ácido tlO-heptadecen-8-óico, 9-octadecen-12-inóico, ácido 13,14-dihidrorofeinico, ácido octadecen- 13-eno-9,11-diinóico, ácido petroselínico cis-6- octadecenóico, ácido 9c,12t-octadecadienóico, 8tl0tl2c-octadecatrienóico, ácido 9tlltl3c-octadecatrienóico, ácido eleoestearínico ácido 9clltl3t-octadecatrienóico, ácido 8cl0tl2c-octadecatrienóico, ácido punicico (ácido 9clltl3c-octadecatrienóico) , ácido parinárico (ácido 9clltl3tl5c-octadecatetraenóico) , ácido pinolénico (ácido all-cis-5,9,12-octadecatrienóico) , ácido labalénico (ácido 5,6-octadecadienalenóico) , óleo ricinoleico (ácido 12-Hidroxioleico) e/ou ácido 13-hidroxi-9c, llt- octadecadienóico. De forma vantajosa, em regra os ácidos gordos anteriormente mencionados ocorrem apenas em quantidades vestigiais nos ésteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos preparados de acordo com o método de acordo com a invenção, ou seja, em relação ao teor total de ácidos gordos, eles estão presentes em quantidades inferiores a 30%, preferencialmente inferiores a 25%, 24%, 23%, 22% ou 21%, de forma especialmente preferida, inferiores a 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5%, de forma muito especialmente preferida, inferiores a 4%, 3%, 2% ou 1%. Numa outra forma de realização preferida da invenção, estes ácidos gordos acima referidos estão presentes em quantidades inferiores a 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6%; ou 0,5%, de forma especialmente preferida, em quantidades inferiores a 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1%, em relação aos ácidos gordos totais. De forma vantajosa, os ésteres de ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos preparados pelo método de acordo com a invenção não contêm, ou contêm menos de 0,1% de ácido butírico, em relação aos ácidos gordos totais, não contêm colesterina, nem ácido clupanodónico (= ácido docosapentaenóico, C22:5*4'8'12,15'21) , assim como não contêm ácido nisínico (ácido tetracosahexaenóico, C23:6a3'8'15,18,21) ·
De forma vantajosa, os óleos, lipidos ou ácidos gordos de acordo com a invenção contêm pelo menos 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, ou 5%, de forma vantajosa, pelo menos 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%, de forma especialmente vantajosa, pelo menos 11%, 12%, 13%, 14% ou 15% de ARA, ou pelo menos 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4% ou 5%, de forma vantajosa, pelo menos 6% ou 7%, de forma especialmente vantajosa pelo menos 8%, 9% ou 10% de EPA e/ DHA; em relação ao teor total de ácidos gordos do organismo onde ocorre a produção; de forma vantajosa, este organismo é uma planta, de forma especialmente vantajosa, é uma planta com frutos oleaginosos, tal como soja, colza, coco, palmeira de óleo africana, cártamo, linhaça, cânhamo, ricino, calendula, amendoim, cacau, girassol ou as plantas de frutos oleaginosos monocotiledóneas ou dicotiledóneas anteriormente mencionadas. O óleo, lipido ou ácidos gordos e/ou as composições de ácidos gordos, encontram aplicação, por exemplo, em rações, alimentos, cosméticos, ou medicamentos. Os óleos, lipidos ou ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos podem ser usados para fazer misturas com outros óleos, lipidos, ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos de origem animal, como por exemplo, óleos de peixes, através de formas conhecidas do perito na especialidade. Estes óleos, lipidos, ácidos gordos ou misturas de ácidos gordos, derivados de componentes vegetais e animais também podem ser utilizados para o fabrico de rações, alimentos, cosméticos ou medicamentos.
Os termos "óleo", "lipido" ou "gordura" devem ser entendidos como uma mistura de ácidos gordos que contém um ou mais ácidos gordos insaturados ou saturados, preferencialmente esterifiçados. É preferido que o óleo, lipido ou gordura possua uma grande quantidade de ácido gordo ou ácidos gordos polinsaturados livres, ou de forma vantajosa esterifiçados, em especial ácido linoleico, ácido γ-linolénico, ácido di-homo-Y-linolénico, ácido araquidónico, ácido α-linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenóico, ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico ou ácido docosahexaenóico. Preferencialmente, a quantidade de ácidos gordos insaturados esterifiçados corresponde a cerca de 30%, mais preferencialmente a 50%, ainda mais preferencialmente a 60%, 70%, 80% ou mais. Para o cálculo, a quantidade de ácidos gordos pode ser determinada por cromatografia gasosa após a transformação dos ácidos gordos nos metilésteres através de transesterificação. O óleo, lipido ou gordura pode conter vários outros ácidos gordos saturados ou insaturados, por exemplo, ácido de calêndula, ácido palmitico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, etc. A quantidade dos diferentes ácidos gordos no óleo ou gordura pode variar, dependendo do tipo de organismo.
No caso dos ácidos gordos polinsaturados preparados pelo método, os quais devem conter pelo menos duas ligações duplas, trata-se, tal como descrito anteriormente, de esfingolipidos, fosfoglicerídeos, lípidos, glicolipidos, fosfolipidos, monoacilglicerina, diacilglicerina, triacilglicerina ou outros ésteres de ácidos gordos. A partir dos ácidos gordos polinsaturados preparados pelo método de acordo com a invenção, de forma vantajosa com pelo menos cinco ou seis ligações duplas, podem ser libertados e isolados os ácidos gordos polinsaturados neles contidos, por exemplo através de um tratamento alcalino, por exemplo KOH ou NaOH aquoso, ou hidrólise ácida, de forma vantajosa, na presença de um álcool tal como metanol ou etanol, ou através de uma separação enzimática, por exemplo por intermédio de uma separação de fases seguida de acidificação com, por exemplo, H2SO4. A libertação dos ácidos gordos também pode realizar-se diretamente sem os processamentos anteriormente referidos.
Após introdução num organismo, de forma vantajosa uma célula vegetal ou planta, os ácidos nucleicos utilizados no método podem estar na forma de plasmídeo separado ou, de forma vantajosa, integrados no genoma da célula hospedeira. A integração no genoma pode ser feita ao acaso ou através de recombinação, em que o gene nativo é substituído pela cópia introduzida, em que a produção do composto desejado é modulado pela célula, ou através da utilização de um gene em trans, de forma que o gene com uma unidade de expressão funcional, o qual contém pelo menos uma sequência responsável pela expressão de um gene, e pelo menos uma sequência que resulta na poliadenilação de um gene funcionalmente transcrito, está ligado funcionalmente. De forma vantajosa, os ácidos nucleicos são introduzidos nas plantas através de cassetes de expressão múltipla ou constructos para expressão multiparalela no organismo, de forma vantajosa, para a expressão multiparalela de genes específica em sementes.
Musgos e algas são os únicos sistemas vegetais conhecidos capazes de produzir quantidades significativas de ácidos gordos polinsaturados, tais como ácido araquidónico (ARA) e/ou ácido eicosapentaenóico (EPA) e/ou ácido docosahexaenóico (DHA). Os musgos contêm PUFAs nos lípidos das membranas e as algas, organismos relacionados com algas e alguns fungos também acumulam quantidades significativas de PUFAs na fração triacilglicerol. Por isso, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas destas estirpes que também acumulam PUFAs na fração triacilglicerol, também são especialmente vantajosas para o método de acordo com a invenção, e por isso podem ser utilizadas para a modificação do sistema de produção de lípidos e PUFA num organismo hospedeiro, em especial plantas tais como plantas com frutos oleaginosos, por exemplo, colza, canola, linhaça, cânhamo, soja, girassol, borragem. De forma vantajosa, elas podem ser, por isso, utilizadas no método de acordo com a invenção.
Como substratos dos ácidos nucleicos utilizados no método de acordo com a invenção, os quais codificam para polipéptidos com atividade A5-elongase, e/ou dos outros ácidos nucleicos utilizados, como os ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos do metabolismo dos ácidos gordos ou lípidos, selecionados do grupo acil-CoA desidrogenase (s), acil-ACP [= proteina transportadora de acil]-desnaturase (s), acil-ACP tioesterase (s), ácido gordo-acil transferase (s), acil-CoA:lisofosfolípidos aciltransferase (s), ácido gordo sintase(s), ácido gordo hidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s), ácido gordo dessaturase(s), ácido gordo acetilenase(s), lipoxigenase (s), triacilglicerol lipase(s), alenóxido sintase(s), hidroperóxido liase(s) ou ácido gordo elongase(s), são apropriados, de forma vantajosa, ácidos gordos Ci6, Cis ou C20. Os ácidos gordos usados como substrato no método são usados, preferencialmente, na forma dos seus acil-CoA-ésteres e/ou dos seus ésteres de fosfolipidos.
Para a preparação dos PUFAs de cadeia longa divulgados, os ácidos gordos polinsaturados Cis têm de ser primeiro dessaturados através da atividade enzimática de uma dessaturase, e a seguir alongados em pelo menos dois átomos de carbono, através de uma elongase. Após uma ronda de extensão, esta atividade enzimática resulta em ácidos gordos C20, e após duas rondas de extensão, em ácidos gordos C22. A atividade das dessaturases e elongases utilizadas no método de acordo com a invenção resulta, preferencialmente, em ácidos gordos Cie, C20 e/ou C22 com pelo menos duas ligações duplas por molécula de ácido gordo, preferencialmente com três, quatro, cinco ou seis ligações duplas, de forma especialmente preferida, resulta em ácido gordos C20 e/ou C22 com pelo menos duas ligações duplas por molécula de ácido gordo, preferencialmente com três, quatro, cinco ou seis ligações duplas, e de forma muito especialmente preferida, com cinco ou seis ligações duplas por molécula. Após uma primeira dessaturação e extensão, podem ocorrer passos adicionais de dessaturação e extensão, como por exemplo, dessaturações na posição Δ4 e Δ5. Produtos especialmente preferidos do método de acordo com a invenção são ácido di-homo-Y-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e/ou ácido docosahexaenóico. Os ácidos gordos C20 com pelo menos duas ligações duplas no ácido gordo podem ser alongados através da atividade enzimática de acordo com a invenção, na forma do ácido gordo livre ou na forma do éster, tal como fosfolipidos, glicolipidos, esfingolipidos, fosfoglicerideos, monoacilglicerina, diacilglicerina ou triacilglicerina. 0 local de biossintese preferido para os ácidos gordos, óleos, lipidos ou gorduras nas plantas preferencialmente utilizadas é, por exemplo, em geral as sementes ou camadas celulares das sementes, de forma que faça sentido uma expressão especifica nas sementes dos ácidos nucleicos usados no método. No entanto, é óbvio que a biossintese de ácidos gordos, óleos ou lipidos não tem de ser limitada às sementes, mas também pode realizar-se em todas as outras partes da planta - por exemplo, nas células da epiderme ou nos tubérculos, de forma tecido-especifica.
Caso sejam usados no método de acordo com a invenção como organismos, microrganismos tais como leveduras tais como
Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, fungos tais como Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor ou Thraustochytrium, algas tais como Isochrysis, Mantoniella, Euglena, Ostreococcus, Phaeodactylum ou Crypthecodinium, os organismos são cultivados de forma fermentativa.
Através da utilização de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, os quais codificam para uma A5-elongase, os ácidos gordos polinsaturados preparados no método podem ser aumentados em pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 10%, mais preferencialmente pelo menos 20%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 50%, em comparação com os organismos tipo selvagem que não contêm os ácidos nucleicos.
Através do método de acordo com a invenção, os ácidos gordos polinsaturados produzidos nos organismos utilizados no método podem ser aumentados, em principio, de duas maneiras. De forma vantajosa, o conjunto de ácidos gordos polinsaturados livres e/ou a fração dos ácidos gordos polinsaturados esterifiçados produzidos através do método, podem ser aumentados. De forma vantajosa, o conjunto de ácidos gordos polinsaturados esterifiçados no organismo transgénico, pode ser aumentado.
Caso sejam utilizados microrganismos como organismos no método de acordo com a invenção, eles são cultivados de forma conhecida do perito na especialidade, dependendo do tipo de organismo hospedeiro. Os microrganismos são, em geral, cultivados num meio líquido que contém uma fonte de carbono principalmente na forma de açúcares, uma fonte de azoto principalmente na forma de azoto orgânico e eventualmente vitaminas, a uma temperatura ente 0 °C e 100 °C, preferencialmente entre 10 °C e 60 °C, com oxigenação. Aqui, o pH do liquido de cultura pode ser mantido a um valor constante, ou seja, pode ser ou não regulado durante o crescimento. A cultura pode ser feita em batch, semi batch ou de forma continua. Os nutrientes podem estar presentes no principio da fermentação ou ser adicionados de forma semicontinua ou continua. Os ácidos gordos polinsaturados produzidos podem ser isolados dos organismos por métodos conhecidos do perito na especialidade, tal como descrito anteriormente. Por exemplo, por intermédio de extração, destilação, cristalização, eventualmente precipitação com sais e/ou cromatografia. Para isso, os organismos podem ser previamente digeridos.
No caso em que o organismo hospedeiro é um microrganismo, o método de acordo com a invenção pode ser realizado, de forma vantajosa, a uma temperatura entre 0 °C e 95 °C, preferencialmente entre 10 °C e 85 °C, de forma especialmente preferida entre 15 °C e 75 °C, e de forma ainda mais especialmente preferida entre 15 °C e 45 °C. 0 valor de pH é mantido, de forma vantajosa, entre pH 4 e 12, preferencialmente entre pH 6 e 9, de forma especialmente preferida entre pH 7 e 8. O método de acordo com a invenção pode ser operado em batch, semibatch ou de forma continua. Um resumo dos métodos de cultivo conhecidos pode ser encontrado no livro de texto de Chmiel (Bioprozehtechnik 1. Einfuhrung in der Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Estugarda, 1991)) ou no livro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). 0 meio de cultura a utilizar é suficiente, de forma apropriada, para os requisitos de cada uma das estirpes. Descrições de meios de cultura para diferentes microrganismos podem ser encontradas no manual "Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society of Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981).
Estes meios aplicáveis de acordo com a invenção compreendem normalmente, tal como descrito anteriormente, uma ou mais fontes de carbono, fontes de azoto, sais inorgânicos, vitaminas e/ou elementos vestigiais.
Fontes de carbono preferidas são açúcares, tais como mono-, di- ou polissacarideos. Fontes de carbono muito boas são, por exemplo, glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose. Também se pode fornecer ao meio açúcar na forma de compostos complexos, tal como melaços, ou outros produtos secundários da refinação do açúcar. Também pode ser vantajoso fornecer misturas de diferentes fontes de carbono. Outras fontes de carbono possíveis são óleos e gorduras, como por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e/ou gordura de coco, ácidos gordos como por exemplo ácido palmítico, ácido esteárico e/ou ácido linoleico, álcoois e/ou poliálcoois como por exemplo glicerina, metanol e/ou etanol, e/ou ácidos orgânicos tais como o ácido acético e/ou ácido láctico.
Fontes de azoto são compostos de azoto orgânicos ou inorgânicos convencionais, ou materiais que contêm estes compostos. Exemplos de fontes de azoto são amoníaco na forma líquida ou gasosa, ou sais de amónio tais como sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio ou nitrato de amónio, nitratos, ureia, aminoácidos ou fontes complexas de azoto tais como milhocina, farinha de soja, proteína de soja, extrato de levedura, extrato de carne e outros. As fontes de azoto podem ser usadas sozinhas ou como misturas.
Compostos de sais inorgânicos que podem existir nos meios incluem os sais de cloreto, fósforo ou sulfato de cálcio, de magnésio, sódio, cobalto, molibdénio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro.
Como fontes de enxofre para a produção de químicos finos contendo enxofre, em especial de metionina, podem ser utilizados compostos inorgânicos contendo enxofre, como por exemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfetos, mas também compostos orgânicos de enxofre, tais como mercaptano e tióis.
Como fontes de fósforo, podem ser usados ácido fosfórico, hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais de sódio correspondentes.
Podem ser adicionados ao meio agentes quelantes, para manter os iões metálicos em solução. Agentes quelantes especialmente apropriados compreendem dihidroxifenois, tais como catecol ou ácido protocatecuico, ou ácidos orgânicos tal como o ácido cítrico.
Os meios de fermentação utilizados para o cultivo de microrganismos de acordo com a invenção contêm, normalmente, também fatores de crescimento, tais como vitaminas ou promotores de crescimento, incluindo por exemplo biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato e piridoxina. Os fatores de crescimento e sais provêm muitas vezes de componentes complexos do meio, tais como extrato de levedura, melaços, milhocina, e afins. Além disso, podem ser adicionados aos meios de cultura precursores apropriados. A composição exata dos compostos do meio depende fortemente da experiência e é decidido para cada caso especifico. Informação acerca de otimização de meios pode ser obtida no livro de texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Os meios de crescimento também podem ser obtidos comercialmente, como por exemplo o Standard 1 (Merck) ou BHI (brain heart infusion, DIFCO), e afins.
Todos os componentes do meio são esterilizados através de calor (20 min a 1,5 bar e 121 °C) ou através de filtração. Os componentes podem ser esterilizados juntos ou, caso necessário, em separado. Todos os componentes do meio podem ser adicionados no principio da cultura ou podem ser adicionados de forma continua ou em cargas, à escolha. A temperatura da cultura varia normalmente entre 15 °C e 45 °C, preferencialmente entre 25 °C e 40 °C, e pode ser mantida constante durante a experiência ou pode ser alterada. O pH do meio deve estar dentro do intervalo de 5 a 8,5, preferencialmente deve ser igual a 7. O valor de pH para a cultura pode ser controlado no decorrer do mesma, através da adição de compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amoníaco ou hidróxido de amónio, ou de compostos ácidos, tais como ácido fosfórico, ou ácido sulfúrico. Para controlar o desenvolvimento de espuma, podem ser utilizados agentes antiespuma, como por exemplo, poliglicoléster de ácido gordo. Para a manutenção da estabilidade de plasmídeos, podem ser adicionados ao meio agentes com ação seletiva, como por exemplo, antibióticos. Para manter condições aeróbias, são misturados na cultura oxigénio ou misturas contendo oxigénio, como por exemplo, ar ambiente. A temperatura da cultura varia normalmente entre 20 °C e 45 °C e preferencialmente entre 25 °C e 40 °C. A cultura é continuada até se formar uma quantidade máxima do produto desejado. Esta meta é atingida normalmente num espaço de 10 horas até 160 horas.
Os caldos de fermentação assim obtidos, em especial os que contêm ácidos gordos polinsaturados, possuem normalmente uma massa seca de 7,5 a 25% peso. O caldo de fermentação pode a seguir ser processado. Dependendo dos requisitos, a biomassa pode ser recolhida do caldo de fermentação parcialmente ou na totalidade, através de métodos de separação, como por exemplo, centrifugação, filtração, decantação ou uma combinação destes métodos, ou em alternativa, pode ser deixada completamente no caldo. De forma vantajosa, a biomassa é processada depois de separada. 0 caldo de fermentação também pode ser espessado ou concentrado sem separação das células por métodos conhecidos, como por exemplo, com auxilio de um evaporador rotativo, evaporador de camada fina, evaporador de filme descendente, através de osmose inversa, ou através de nanofiltração. Este caldo de concentração concentrado pode, por fim, ser processado para a obtenção dos ácidos gordos obtidos.
Os ácidos gordos obtidos com o método também são adequados como material de partida para a sintese quimica de outros produtos de valor. Eles podem ser usados isoladamente ou em combinação uns com os outros para o fabrico de medicamentos, alimentos, rações ou cosméticos.
Um outro objetivo da invenção são ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade Δδ-elongase, em que as Δδ-elongases codificadas através das sequências de ácidos nucleicos convertem ácidos gordos C20 com pelo menos quatro ligações duplas por molécula de ácido gordo; em última análise, de forma vantajosa, estes são incorporados em diacilglicerideos e/ou triacilglicerídeos. São divulgados ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade A5-elongase e os quais contêm uma sequência de aminoácidos, selecionada do grupo: SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 142.
Outros ácidos nucleicos isolados divulgados são apresentados através de sequências de ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos com atividade A5-elongase e que contêm uma combinação de aminoácidos com as sequências selecionadas do grupo: a) SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 140 ou SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 140; ou b) SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 142 ou SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 142; ou c) SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 140 ou SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 142.
As sequências dadas nas sequências SEQ ID NO: 115 (NXXXHXXMYXYYX) , SEQ ID NO: 116 (HHXXXXWAWW) , SEQ ID NO: 139 (LHXXHH) , SEQ ID NO: 140 (TXXQXXQF) , SEQ ID NO: 141 (DTXFMV) e SEQ ID NO: 142 (TQAQXXQF) representam regiões conservadas das diferentes elongases. A Tabela 2 apresenta o significado do aminoácido representado por X na sequência de ácidos nucleicos referida (coluna 3) . Os aminoácidos preferidos nas diferentes posições também podem ser encontrados na Tabela 3 (coluna 3). A coluna 1 dá a SEQ ID NO, a coluna 2 dá a posição na sequência.
Tabela 2: Significado dos aminoácidos representados por X nas sequências consenso
A5-Elongases especialmente preferidas contêm pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 141 e/ou SEQ ID NO: 142. Ácidos nucleicos isolados especialmente vantajosos são aqueles com sequências selecionadas do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 133, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados da degeneração do código genético da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132 ou SEQ ID NO: 134, ou
c) derivados da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 133, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 133 e apresentam uma atividade A5-elongase.
Também são divulgados ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade A6-elongase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 183, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados da degeneração do código genético da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 184, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 183, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com as SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 184, e apresentam uma atividade A6-elongase.
Num outro objetivo da invenção, são usados ácidos nucleicos com sequências que codificam para polipéptidos com atividade co3-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 105, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados da degeneração do código genético das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 106, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 105, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 60% de identidade, ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 106 e apresentam uma atividade ω3-dessaturase. São descritos ácidos nucleicos com sequências que codificam para polipéptidos com atividade Δβ-dessaturase, selecionados do grupo:
a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 97, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados da degeneração do código genético das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 90 ou SEQ ID NO: 98, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 97, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 90 ou SEQ ID NO: 98, e que apresentam uma atividade Δ6-dessaturase. São divulgados ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade A5-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 101, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados da degeneração do código genético das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100 ou SEQ ID NO: 102, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 101, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100 ou SEQ ID NO: 102 e que apresentam uma atividade A5-dessaturase. São divulgados ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade A4-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 95, ou SEQ ID NO: 103, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados da degeneração do código genético das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 96, ou SEQ ID NO: 104, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 95, ou SEQ ID NO: 103, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 96 ou SEQ ID NO: 104 e que apresentam uma atividade Δ4-dessaturase.
Num outro objetivo da invenção, são usados ácidos nucleicos com sequências que codificam para polipéptidos com atividade A12-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 107, ou SEQ ID NO: 109, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados da degeneração do código genético das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 108, ou SEQ ID NO: 110, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 107, ou SEQ ID NO: 109, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 60% de homologia, ao nível dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 108 ou SEQ ID NO: 110 e que apresentam uma atividade Δ12-dessaturase.
São divulgados constructos que contêm as sequências de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:
89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 183, em que os ácidos nucleicos estão ligados, de forma funcional, com um ou mais sinais de regulação. Além disso, podem conter outros genes de biossíntese do metabolismo de ácidos gordos ou lipidos, selecionados do grupo: acil-CoA desidrogenase(s) , acil-ACP [= proteína transportadora de acil] dessaturase (s) , acil-ACP tioesterase (s), ácido gordo aciltransferase(s), acil-CoA:lisofosfolípido aciltransferase(s) , ácido gordo sintase(s), ácido gordo hidroxilase(s), acetil-Coenzima A carboxilase(s), acil-Coenzima A oxidase(s), ácido gordo dessaturase (s), ácido gordo acetilenases, lipoxigenases, triacilglicerol lipases, alenóxido sintases, hidroperóxido liases ou ácido gordo elongase(s). De forma vantajosa, são incluídos genes da biossíntese dos ácidos gordos ou lipidos, selecionados do grupo das A4-dessaturases, A5-dessaturases, Δβ-dessaturases, A8-dessaturases, A9-dessaturases, Δ12-dessaturases, Δβ-elongases, A9-elongases ou co3-dessaturases.
De forma vantajosa, todas as sequências de ácidos nucleicos usadas no método de acordo com a invenção são provenientes de um organismo eucarionte, tal como uma planta, de um microrganismo, ou de um animal. Preferencialmente, as sequências de ácidos nucleicos são provenientes de organismos das ordens Salmoniformes, Xenopus ou Ciona, algas tais como Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena ou Ostreococcus, fungos tais como o género Phytophtora ou de diatomáceas tais como os géneros Thalassiosira ou Phaeodactylum.
Os ácidos nucleicos usados no método com sequências que codificam para proteínas com atividade co3-dessaturase, Δ4-dessaturase, A5-dessaturase, Δβ-dessaturase, Δ8-dessaturase, A9-dessaturase, A12-dessaturase, Δδ-elongase, Δβ-elongase ou A9-elongase, são introduzidos num organismo, de forma vantajosa, uma planta ou um microrganismo, de forma vantajosa, isoladamente ou, preferencialmente, em combinação com uma cassete de expressão (= constructo de ácidos nucleicos), que permite a expressão dos ácidos nucleicos nesse organismo, de preferência numa planta ou microrganismo. Cada constructo de ácidos nucleicos pode conter mais do que uma sequência de ácidos nucleicos de uma atividade enzimática, por exemplo de uma A12-dessaturase, A4-dessaturase, Δ5-dessaturase, Δβ-dessaturase, A5-elongase, Δβ-elongase e/ou ω3-dessaturase.
Para serem introduzidos nos organismos, os ácidos nucleicos usados no método de acordo com a invenção são, de forma vantajosa, submetidos a uma amplificação e ligação, o que ocorre de forma conhecida. Preferencialmente, procede-se em conformidade com o protocolo da Pfu-DNA polimerase ou de uma Pfu/Taq-DNA polimerase. Os primers são selecionados de acordo com a sequência a ser amplificada. De forma apropriada, os primers são selecionados de tal forma que o produto de amplificação compreende toda a sequência codogénica desde o codão de inicio até ao codão de finalização. A seguir à amplificação, o produto da mesma é analisado de forma adequada ao objetivo. Por exemplo, a análise pode ser feita por separação eletroforética em gel, com vista à determinação da qualidade e da quantidade. A seguir, o produto de amplificação pode ser purificado através de um protocolo Standard (por exemplo, Qiagen). Uma aliquota do produto de amplificação purificado fica assim disponível para a clonagem subsequente. Vetores de clonagem adequados são em geral conhecidos do perito na especialidade. Aqui estão incluídos em especial vetores que podem ser replicados em sistemas microbianos, principalmente vetores que permitem uma clonagem eficiente em leveduras ou fungos, e que permitem transformações estáveis em plantas. Podem ser referidos, em especial, diferentes sistemas de vetores binários e co-integrativos, apropriados para a transformação mediada por T-DNA. Este tipo de vetores e, em geral, caracterizado por conter pelo menos os genes vir necessários para a transformação mediada por agrobactérias, assim como as sequências que limitam os T-DNA (T-DNA border). Preferencialmente, estes sistemas de vetores compreendem também regiões cis-regulatórias, tais como promotores e sequências de terminação e/ou marcadores de seleção, com os quais os organismos transformados podem ser identificados. Enquanto nos sistemas de vetores co-integrados, os genes vir e sequências T-DNA estão ordenados no mesmo vetor, os sistemas binários baseiam-se em, pelo menos, dois vetores, dos quais um contém os genes vir mas não contém qualquer T-DNA, e um segundo que contém um T-DNA mas nenhum gene vir. Por isso, estes últimos vetores são relativamente pequenos, fáceis de manipular e podem ser replicados tanto em E. coli como em agrobactérias. Estes vetores binários incluem vetores das séries pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. De acordo com a invenção, são preferencialmente utilizados os Binl9, pBin 19, pBinAR, pGPTV e pCAMBIA. Uma visão geral sobre os vetores binários e a sua utilização pode ser encontrada em Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Para a preparação dos vetores, este podem primeiro ser linearizados por intermédio de uma ou várias endonucleases de restrição, e depois podem ser modificados enzimaticamente de forma apropriada. A seguir, o vetor é purificado e é usada uma aliquota para a clonagem. Na clonagem, o produto de amplificação eventualmente purificado é cortado enzimaticamente e ligado com fragmentos de vetor preparados da mesma forma, através da utilização de uma ligase. Aqui, um determinado constructo de ácidos nucleicos ou vetor ou plasmídeo pode apresentar uma ou mais porções codogénicas de genes. Preferencialmente, as porções codogénicas de genes nestes constructos estão ligadas, de forma funcional, a sequências regulatórias. Estas sequências regulatórias incluem, em especial, sequências vegetais tais como os promotores e sequências de terminação anteriormente mencionados. Os constructos podem ser propagados estavelmente, de forma vantajosa, em microrganismos, em especial Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens, em condições seletivas, e permitem uma transferência de DNA heterólogo em plantas ou microrganismos.
Dentro da utilização vantajosa de vetores de clonagem, os ácidos nucleicos utilizados no método, os ácidos nucleicos e constructos de ácidos nucleicos inventivos, podem ser introduzidos em organismos tais como microrganismos ou, de forma vantajosa, plantas, e assim serem utilizados na transformação de plantas tal como aquelas que são publicadas e citadas em Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), capitulo 6/7, pág. 71-119 (1993) ; F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Rung e R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Rung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)). Os ácidos nucleicos usados no método, os ácidos nucleicos e constructos de ácidos nucleicos e/ou vetores inventivos podem ser utilizados, para fins de modificação genética, numa grande variedade de organismos, de forma vantajosa em plantas, de forma que estas se tornem melhores e/ou mais eficientes como produtores de PUFAs.
Existe uma série de mecanismos, através dos quais é possivel uma modificação da proteina A5-elongase de acordo com a invenção, assim como das outras proteínas usadas no método, tal como as proteínas A12-dessaturase, A9-elongase, Δβ-dessaturase, Δδ-dessaturase, Δβ-elongase, A5-dessaturase ou A4-dessaturase, de forma que o rendimento, produção e/ou eficiência da produção dos ácidos gordos polinsaturados vantajosos numa planta, preferencialmente uma planta com frutos oleaginosos, ou num microrganismo possa ser diretamente influenciada através desta proteína modificada. 0 número ou atividade das proteínas ou genes Δ12-dessaturase, co3-dessaturase, ã9-elongase, Δβ-dessaturase, Δδ-dessaturase, Δβ-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase ou A4-dessaturase podem ser aumentados, de forma que sejam produzidas maiores quantidades dos compostos da fórmula geral I. Também é possível síntese de novo num organismo, o qual não possui a atividade e capacidade para a biossíntese de compostos, antes da introdução do ou dos genes correspondentes. 0 correspondente também é válido para a combinação com outras dessaturases ou elongases, ou outras enzimas do metabolismo de ácidos gordos e lípidos. Também pode ser vantajosa a utilização de diferentes sequências divergentes, ou seja, sequências diferentes ao nível do DNA ou a utilização de promotores para a expressão de genes que permitem uma outra expressão temporal de genes, por exemplo, dependendo do grau de maturação de uma semente ou tecido armazenador de gordura.
Através da introdução de um gene A12-dessaturase, ω3-dessaturase, A9-elongase, Δβ-dessaturase, Δδ-dessaturase, Δβ-elongase, A5-desaturase, Δό-elongase e/ou A4-dessaturase num organismo, sozinho ou em combinação com outros genes numa célula, pode aumentar-se não só o fluxo de biossíntese do produto final, mas também a composição de triacilglicerina correspondente, ou conseguir-se a síntese de novo. De igual modo, também pode ser aumentado o número ou atividade de outros genes que são necessários para a importação de nutrientes, para a biossíntese de um ou mais ácidos gordos, óleos, lípidos polares e/ou neutros, de forma que a concentração destes precursores, cofatores ou compostos intermédios é aumentada dentro da célula ou dentro do compartimento de armazenamento, através do que a capacidade das células para a produção de PUFAs, tal como a sequir descrito, é ainda mais aumentada. Através da otimização da atividade ou aumento do número de um ou mais genes Al2-dessaturase, m3-dessaturase, A9-elongase, Δ6-dessaturase, Δδ-dessaturase, A6-elongase, A5-dessaturase, A5-elongases e/ou A4-dessaturase, os quais estão envolvidos na biossintese destes compostos, ou através da destruição da atividade de um ou mais genes que estão envolvidos na degradação destes compostos, pode ser possivel aumentar o rendimento, produção e/ou eficiência da produção de moléculas de ácidos gordos e lipidos pelo organismo, e de forma vantajosa pela planta.
As moléculas de ácidos gordos isoladas utilizadas no método de acordo com a invenção codificam para proteínas ou partes destas, em que as proteínas ou a proteina, ou parte da mesma contêm uma sequência de aminoácidos que é suficientemente homóloga com uma sequência de aminoácidos que está apresentada na SEQ ID NO: 68, de forma que proteínas ou partes das mesmas ainda apresentam uma atividade A5-elongase, e em que a sequência de aminoácidos não possui a sequência apresentada na SEQ ID NO: 114. Preferencialmente, as proteínas ou partes das mesmas que são codificadas pela ou pelas moléculas de ácidos nucleicos, têm ainda a sua atividade enzimática e a capacidade de participarem no metabolismo de compostos necessários para a degradação de membranas celulares ou corpos lipidicos em organismos, preferencialmente em plantas, ou no transporte de moléculas através destas membranas. De forma vantajosa, as proteínas codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos são pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos cerca de 60%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticas à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 68, em que a sequência de aminoácidos não possui a sequência apresentada na SEQ ID NO: 114. No contexto da invenção, homologia ou homólogo deve ser entendido como identidade ou idêntico.
Também está descrito que podem ser usadas moléculas de ácidos nucleicos no método, as quais codificam para proteínas ou partes destas, em que as proteínas ou a proteína ou parte da mesma contêm uma sequência de aminoácidos que é suficientemente homóloga a uma sequência de aminoácidos que é apresentada nas sequências SEQ ID N NO: 2, SEQ ID N NO: 4, SEQ ID N NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID
NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO:
54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID
NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO:
90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO:
112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118,SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 184, de forma que as proteínas ou partes destas ainda apresentam uma atividade A12-dessaturase, ω3- dessaturase, A9-elongase, Δβ-dessaturase, Δδ-dessaturase, Δδ-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase ou A4-dessaturase.
Preferencialmente, as proteínas ou partes destas que são codificadas pela ou pelas moléculas de ácidos nucleicos têm ainda a sua atividade enzimática e a capacidade de participarem no metabolismo de compostos necessários para a degradação de membranas celulares ou corpos lipídicos em organismos, preferencialmente em plantas, ou no transporte de moléculas através destas membranas. De forma vantajosa, as proteínas codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos são pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos cerca de 60%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticas à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:
28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID
NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO:
62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID
NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 184. No contexto da invenção, homologia ou homólogo deve ser entendido como identidade ou idêntico. A homologia foi calculada para toda a sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Para a comparação de diferentes sequências existem disponíveis uma série de programas, os quais têm por base diferentes algoritmos. Os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman originam resultados especialmente confiáveis. Para a comparação das sequências foi usado o programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) e Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], os quais são obtidos com o GCG Software-Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] . Os valores percentuais de homologia fornecidos anteriormente foram determinados pelo programa GAP, ao longo de toda a sequência, com as seguintes configurações: Gap Weight: 50, Lenght Weight: 3, Average Match: 10,000 e Average Mismatch: 0,000. Caso não seja especificado em contrário, estas configurações foram sempre utilizadas como configurações padrão para as comparações de sequências.
Atividade enzimática essencial da A5-elongase usada no método de acordo com a invenção significa que a mesma, em comparação com as proteínas/enzimas codificadas pela SEQ ID NO: 67 e seus derivados ainda apresentam uma atividade enzimática de pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente 30% e ainda mais preferencialmente 40%, e assim são capazes de participar no metabolismo dos compostos necessários para a degradação de ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos tais como diacilglicerídeos e/ou triacilglicerídeos num organismo, preferencialmente uma planta ou célula vegetal, ou no transporte de moléculas através de membranas, em que cadeias de hidrocarbonetos Cie, C20 ou C22 na molécula de ácido gordo com ligações duplas em pelo menos dois, de forma vantajosa, três, quatro, cinco ou seis locais.
De forma vantajosa, os ácidos nucleicos usados no método são derivados de bactérias, fungos, diatomáceas, animais tais como Caenorhabditis ou Oncorhynchus ou plantas tais como algas ou musgos, tal como os géneros Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, especialmente dos géneros e espécies Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis, Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans ou de forma especialmente vantajosa de Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonana ou Crypthecodinium cohnii.
Alternativamente, as sequências de ácidos nucleicos usadas no método, as quais codificam para uma A12-dessaturase, ω3-dessaturase, A9-elongase, Δβ-dessaturase, A8-dessaturase, Δβ-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase ou A4-dessaturase, e que hibridizam com sequências de nucleotideos tais como as apresentadas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 183, de forma vantajosa, sob condições muito rigorosas.
Os ácidos nucleicos usados no método são introduzidos, de forma vantajosa, numa cassete de expressão, a qual permite a expressão de ácidos nucleicos em organismos tais como microrganismos ou plantas.
Aqui, as sequências de ácidos nucleicos que codificam para as Al2-dessaturase, co3-dessaturase, A9-elongase, Δ6-dessaturase, A8-dessaturase, Δβ-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase ou A4-dessaturase são acopladas de forma funcional a um ou mais sinais de regulação, de forma vantajosa, para aumentar a expressão dos genes. Estas sequências regulatórias devem permitir a expressão direcionada dos genes e da expressão de proteínas. Isto pode significar, por exemplo e dependendo do hospedeiro, que o gene só é expresso e/ou sobre-expresso após indução, ou que ele é imediatamente expresso e/ou sobre-expresso. Estas sequências regulatórias são, por exemplo, sequências às quais se ligam indutores ou repressores, regulando deste modo a expressão dos ácidos nucleicos. Para além destas novas sequências regulatórias ou em vez destas sequências, a regulação natural destas sequências pode ainda estar presente antes dos genes estruturais reais, e pode eventualmente ser geneticamente alterada, de forma que a regulação natural está desligada e a expressão dos genes é aumentada. A cassete de expressão (= constructo de expressão = constructo genético) também pode ser simplesmente construída, ou seja, não foram inseridos quaisquer sinais de regulação adicionais antes da sequência de ácidos nucleicos ou dos seus derivados e o promotor natural com a sua regulação não foi removido. Em vez disso, a sequência de regulação natural foi mutada, de tal forma que já não ocorre qualquer regulação e/ou não ocorre qualquer aumento da expressão genética. Estes promotores alterados podem ser introduzidos na forma de sequências parciais (= promotor com partes das sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção), ou também sozinho, antes do gene natural, para aumento da atividade. 0 constructo genético pode, além disso e de forma vantajosa, conter uma ou mais "sequências enhancer" acopladas funcionalmente ao promotor, as quais permitem um aumento da expressão da sequência de ácidos nucleicos. Também podem ser inseridas sequências vantajosas adicionais na extremidade 3' das sequências de DNA, como por exemplo, outros elementos regulatórios ou de terminação. Os genes A12-dessaturase, o3-dessaturase, A4-dessaturase, Δ5-dessaturase, Δβ-dessaturase, Δδ-dessaturase, Δδ-elongase, Δβ-elongase e/ou A9-elongase podem estar presentes na cassete de expressão (= constructo de expressão) em uma ou mais cópias. De forma vantajosa, existe apenas uma cópia de cada um dos genes na cassete de expressão. Este constructo genético ou os constructos genéticos podem ser expressos em conjunto no organismo hospedeiro. Aqui, o constructo ou os constructos genéticos podem ser inseridos em um ou mais vetores e estarem presentes livres na célula ou inseridos no genoma da mesma. Para a inserção de outros genes no genoma do hospedeiro, é vantajoso que os genes a expressar estejam presentes juntos num constructo genético.
As sequências ou fatores regulatórios podem, tal como anteriormente descrito, preferencialmente influenciar positivamente a expressão genética dos genes introduzidos, aumentando-a. Assim, pode obter-se um fortalecimento dos elementos regulatórios, de forma vantajosa, ao nivel da transcrição, podendo ser utilizados sinais de transcrição fortes, como "promotores" e/ou "enhancers". Além disso, também é possível um reforço da translação, através, por exemplo, da melhoria da estabilidade do mRNA.
Uma outra forma de realização da invenção corresponde a um ou mais constructos genéticos, os quais contêm uma ou mais sequências, as quais são definidas através da SEQ ID NO: 67 ou seus derivados e que codificam para os polipéptidos de acordo com a SEQ ID NO: 68, e em que os ácidos nucleicos não têm a sequência apresentada na SEQ ID NO: 113. As proteínas A5-elongase referidas resultam, de forma vantajosa, numa extensão de ácidos gordos, em que o substrato apresenta, de forma vantajosa, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis ligações duplas e, de forma vantajosa, 18, 20 ou 22 átomos de carbono na molécula de ácido gordo. O mesmo é válido para os seus homólogos, derivados ou análogos, os quais estão ligados funcionalmente com um ou mais sinais de regulação, preferencialmente para aumento da expressão genética.
Também são descritos um ou mais constructos genéticos, os quais contêm uma ou mais sequências, as quais são definidas através das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO:
71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID
NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO:
109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID
NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 183, ou dos seus derivados, e que codificam para os polipéptidos de acordo com as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID
NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:
40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID
NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:
76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID
NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 184. As proteínas A12-dessaturase, m3-dessaturase, A9-elongase, A6-dessaturase, Δδ-dessaturase, A6-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase ou A4-dessaturase resultam, de forma vantajosa, numa dessaturação ou extensão de ácidos gordos, em que o substrato apresenta, de forma vantajosa, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis ligações duplas e, de forma vantajosa, 18, 20 ou 22 átomos de carbono na molécula de ácido gordo. O mesmo é válido para os seus homólogos, derivados ou análogos, os quais estão ligados funcionalmente com um ou mais sinais de regulação, de forma vantajosa, para aumento da expressão genética.
Sequências de regulação vantajosas para o novo método estão localizadas, por exemplo, nos promotores, tais como os promotores cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR ou λ-PL, e são utilizadas, de forma vantajosa, em bactérias Gram-negativas. Outras sequências regulatórias vantajosas estão presentes, por exemplo, nos promotores Gram-negativos amy e SP02, nos promotores de fungos ou leveduras ADC1, MFa, AC, P-60, CYCl, GAPDH, TEF, rp28, ADH ou nos promotores de plantas CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS,
lib4, usp, STLS1, B33, nos ou em promotores ubiquitina ou faseolina. Neste contexto, são igualmente vantajosos promotores induziveis, tal como os promotores descritos em EP-AO 388 186 (induziveis por benzilsulfonamida) , Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz et al., induziveis por tetraciclina), EP-A-0 335 528 (induziveis por ácido abscisico) ou WO 93/21334 (induzível por etanol ou ciclohexenol) . Outros promotores de plantas adequados são os promotores de FBPase citosólica ou o promotor ST-LSI da batata (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), o promotor da fosforibosilpirofosfatoamido transferase de Glycine max (N° banco genético U87999) ou o promotor específico descrito na EP-A-0 249 676. Promotores especialmente vantajosos são promotores que permitem a expressão em tecidos que estão envolvidos na biossíntese de ácidos gordos. Muito especialmente vantajosos são promotores específicos para sementes, tal como o promotor USP de acordo com a forma de realização, mas também outros promotores, tal como os promotores de LeB4, DC3, faseolina ou napina. Outros promotores especialmente vantajoso são promotores específicos de sementes, os quais podem ser utilizados para monocotiledóneas ou dicotiledóneas e que são descritos em US 5,608,152 (promotor de napina de colza), WO 98/45461 (promotor da oleosina de Arobidopsis) , US 5,504,200 (promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Promotor de Bce4 de Brassica), von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (Promotor de LeB4 de uma leguminosa), sendo estes promotores adequados para dicotiledóneas. Os promotores seguintes são apropriados, por exemplo, para monocotiledóneas, promotor Ipt-2 ou Ipt-1 de cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230), o promotor de hordeina de cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230), promotor de hordeina de cevada e outros, descritos na WO 99/16890.
Em principio, é possivel utilizar todos os promotores naturais com as suas sequências de regulação, tal como os anteriormente mencionados. É igualmente possivel e vantajoso, utilizar em combinação ou isoladamente, promotores sintéticos, em especial quando eles permitem uma expressão especifica em sementes, como por exemplo, os descritos em WO 99/16890.
Para conseguir um teor especialmente elevado de PUFAs, em especial em plantas transgénicas, os genes da biossintese de PUFA devem ser expressos, de forma vantajosa e específica, em sementes de oleaginosas. Para tal podem ser usados promotores específicos para sementes, ou promotores que são ativos em embriões e/ou endosperma. Os promotores específicos para sementes podem, em princípio, ser isolados tanto a partir de plantas monocotiledóneas como de plantas dicotiledóneas. São a seguir listados os promotores vantajosos preferidos: USP ( = unknown seed protein) e vicilina (Vicia faba) [Báumlein et al., Mol. Gen Genet., 1991, 225(3)], napina (colza) [US 5,608,152], proteina transportadora de acil (colza) [US 5,315,001 e WO 92/18634], oleosina (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 e WO 93/20216], faseolina (Phaseolus vulgaris) [US 5,504,200], Bce4 [WO 91/13980], B4 de leguminosas (promotor LegB4) [Bàumlein et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 e Iptl (cevada) [WO 95/15389 e WO 95/23230], promotores específicos de sementes de arroz, milho e trigo [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 e aleuraina [US 5,677,474], Bce4 (colza) [US 5,530,149], glicinina (soja) [EP 571 741], fosfoenol piruvato carboxilase (soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (soja) [WO 98/08962], isocitratliase (colza) [US 5,689,040] ou α-amilase (cevada) [EP 781 849]. A expressão de genes em plantas pode ser facilitada através de um promotor induzivel quimicamente (para uma ideia geral ver Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Os promotores induziveis quimicamente são especialmente apropriados, caso desejado, para uma expressão genética dependente do tempo. Exemplos de promotores deste tipo são um promotor induzivel por ácido salicilico (WO 95/19443), um promotor induzivel por tetraciclina (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404) e um promotor induzivel por etanol.
Para garantir uma integração estável dos genes de biossintese nas plantas transgénicas ao longo de várias gerações, cada um dos ácidos nucleicos utilizados no método, os quais codificam para as A12-dessaturase, ω3-dessaturase, A9-elongase, Δδ-dessaturase, A8-dessaturase, Δδ-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase e/ou Δ4-dessaturase, deve ser expresso sob o controlo de um único, preferencialmente diferente, promotor, uma vez que motivos de sequências repetitivos podem levar a instabilidade do T-DNA ou eventos de recombinação. A cassete de expressão é então construida, de forma vantajosa, de tal forma que um local apropriado para inserção do ácido nucleico a exprimir se segue a um promotor, de forma vantajosa num polylinker a seguir a urn eventual sinal de terminação, atrás do polylinker. Esta sequência repete-se várias vezes, preferencialmente três, quatro ou cinco vezes, de forma que são introduzidos até 5 genes num constructo, e que podem assim ser expressos na planta transgénica. De forma vantajosa, a sequência repete-se até três vezes. As sequências de ácidos nucleicos são inseridas, para expressão, nos locais de corte, por exemplo no polylinker atrás do promotor. De forma vantajosa, cada sequência de ácido nucleico tem o seu próprio promotor e eventualmente a sua própria sequência de terminação. Este tipo de constructos vantajosos é divulgado, por exemplo, nas DE 10102337 ou DE 10102338. Contudo, também é possível inserir várias sequências de ácidos nucleicos atrás de um promotor e eventualmente à frente de uma sequência de terminação. Aqui, o local de inserção ou a sequência dos ácidos nucleicos inseridos na cassete de expressão não tem significado decisivo, ou seja, uma sequência de ácidos nucleicos pode ser inserido na cassete em primeiro ou em último lugar, sem que isso influencie de forma significativa a expressão. Na cassete de expressão podem ser usados diferentes promotores, como por exemplo, os promotores USP, LegB4 ou DC3, e diferentes sequências de terminação. Também é contudo possível utilizar apenas um tipo de promotor na cassete. No entanto, isto por resultar em eventos de recombinação indesejados.
Tal como descrito anteriormente, a transcrição dos genes introduzidos deve ser interrompida através de sequências de terminação apropriadas na extremidade 3' dos genes de biossíntese introduzidos (atrás do codão stop). Neste caso pode ser utilizado, por exemplo, a sequência de terminação 0CS1. Tal como para os promotores, também devem ser usadas diferentes sequências de terminação para cada gene. 0 constructo genético pode, tal como anteriormente descrito, compreender também genes adicionais, os quais devem ser introduzidos no organismo. É possivel e vantajoso introduzir e expressar genes de regulação no organismo hospedeiro, tal como genes para indutores, repressores ou enzimas, os quais intervêm na regulação de um ou vários genes de uma via biossintética. Estes genes podem ser de origem heteróloga ou homóloga. Além disso, o constructo de ácidos nucleicos ou constructo genético pode conter genes de biossintese do metabolismo dos ácidos gordos ou lípidos adicionais, ou estes genes podem estar num ou mais constructos de ácidos nucleicos adicionais. De forma vantajosa, é usado como gene de biossintese de ácidos gordos ou lípidos, um gene selecionado do grupo acil-CoA desidrogenase(s), acil-ACP [= proteína transportadora de acil] dessaturase(s), acil-ACP tioesterase(s), ácido gordo-acil transferase(s), acil-CoA:lisofosfolípido aciltransferase(s), ácido gordo sintase(s), ácido gordo hidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s), ácido gordo dessaturase(s), ácido gordo acetilenase(s), lipoxigenase(s), triacilglicerol lipase (s), alenóxido sintase(s), hidroperóxido liase(s) ou ácido gordo elongase(s), ou combinações destes. Sequências de ácidos nucleicos especialmente preferidas são genes da biossintese de ácidos gordos ou lípidos, selecionados do grupo dos acil-CoA:lisofosfolípido aciltransferase(s) , ω3-dessaturase, A4-dessaturase, A5-dessaturase, Δ 6- dessaturase, Δδ-dessaturase, A9-dessaturase, Δ12- dessaturase, A5-elongase, Δβ-elongase e/ou A9-elongase.
Aqui, os ácidos nucleicos ou genes anteriormente mencionados podem ser clonados em cassetes de expressão como as referidas, em combinação com outras elongases e dessaturases, e utilizados para a transformação de plantas com auxílio de agrobactérias.
As sequências ou fatores regulatórios podem, tal como já descrito, influenciar preferencialmente de forma positiva a expressão dos genes introduzidos, e assim aumentá-la. Assim, pode ocorrer um fortalecimento dos elementos regulatórios, de forma vantajosa, ao nível da transcrição, na medida em que são utilizados sinais de transcrição fortes, tais como promotores e/ou enhancers. Além disso, também é possível um reforço da translação, na medida em que, por exemplo, a estabilidade do mRNA é melhorada. As cassetes de expressão podem, em princípio, ser utilizadas para introdução direta nas plantas, ou ser introduzidas em vetores.
Estes vetores vantajosos, preferencialmente vetores de expressão, contêm os ácidos nucleicos usados no método, os quais codificam para as A12-dessaturases, co3-dessaturases, A9-elongases, Δβ-dessaturases, Δδ-dessaturases, Δ6-elongases, A5-dessaturases, Δδ-elongases ou Δ4-dessaturases, ou um constructo de ácidos nucleicos, o qual contém os ácidos nucleicos usados no método, sozinhos ou em combinação com outros genes da biossíntese de ácidos gordos ou lípidos, tal como os acil-CoA:lisofosfolípido aciltransferase (s) , co3-dessaturases, A4-dessaturases, Δδ-dessaturases, Δβ-dessaturases, Δδ-dessaturases, Δ9-dessaturases, A12-dessaturases, G)3-dessaturases, Δ5-elongases, Δβ-elongases e/ou A9-elongases. Tal como aqui utilizado, a expressão "vetor" corresponde a uma molécula de ácidos nucleicos que pode transportar um outro ácido nucleico, ao qual está ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que é uma molécula circular de DNA, de cadeia dupla, na qual podem ser ligados segmentos de DNA adicionais. Um outro tipo de vetor é um vetor virai, em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma virai. Alguns vetores específicos podem replicar-se de forma autónoma numa célula hospedeira em que sejam introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com origem de replicação bacteriana). Outros vetores são, de forma vantajosa, após introdução nas células hospedeiras, integrados no genoma das mesmas, e são assim replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores podem controlar a expressão de genes com os quais estão funcionalmente ligados. Estes vetores são aqui designados por "vetores de expressão". Habitualmente, os vetores de expressão que são apropriados para técnicas de recombinação de DNA têm a forma de plasmídeos. Na presente descrição, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados como sinónimos, uma vez que o plasmídeo é a forma de vetor mais frequentemente utilizada. A invenção deve, no entanto, incluir estas outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais, os quais possuem funções semelhantes. Além disso, a designação vetor também deve compreender outros vetores conhecidos do perito na especialidade, tal como fagos, vírus, tais como SV40, CMV, TMV, transposões, elementos IS, fagemídeos, fasmídeos, cosmídeos, DNA linear ou circular.
Os vetores de expressão recombinantes usados de forma vantajosa na invenção compreendem os ácidos nucleicos descritos a seguir, ou o constructo genético descrito acima, numa forma que é apropriada para a expressão dos ácidos nucleicos usados na célula hospedeira. Isto significa que os vetores de expressão recombinantes compreendem uma ou mais sequências de regulação, selecionadas à base da célula hospedeira utilizada para a expressão; estas sequências de regulação estão ligadas funcionalmente à sequência de ácidos nucleicos a expressar. Num vetor de expressão recombinante, "ligado funcionalmente" significa que a sequência de nucleotideos de interesse está ligada à ou às sequências de regulação, de tal forma que a expressão da sequência de nucleotideos é possível, e que elas estão ligadas uma à outra, de tal forma que ambas as sequências cumprem a função descrita para a sequência (por exemplo, num sistema de transcrição ou translação in vitro, ou numa célula hospedeira, quando o vetor é introduzido na mesma). 0 termo "sequência de regulação" deve compreender promotores, enhancers e outros elementos de controlo da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Estas sequências de regulação estão descritas, por exemplo em Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), ou ver: Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, capítulo 7, 89-108, incluindo as referências aí citadas. As sequências de regulação incluem as sequências que controlam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotideos em muitos tipos de células hospedeiras, e as sequências que controlam a expressão direta da sequência de nucleotideos apenas em células hospedeiras específicas e em condições específicas. O perito na especialidade sabe que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores, tal como a escolha da célula hospedeira a transformar, a extensão da expressão das proteínas desejadas, etc.
Os vetores de expressão recombinantes utilizados podem ser concebidos para a expressão de Al2-dessaturases, ω3-dessaturases, A9-elongases, Δβ-dessaturases, Δ8- dessaturases, Δβ-elongases, A5-dessaturases, A5-elongases e/ou A4-dessaturases em células procariontes ou eucariontes. Isto é vantajoso, uma vez que frequentemente são realizados passos intermédios da construção do vetor em microrganismos, para simplificação. Por exemplo, os genes A12-dessaturase, m3-dessaturase, A9-elongase, Δ6-dessaturase, Δδ-dessaturase, Δβ-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase e/ou A4-dessaturase podem ser expressos em células bacterianas, células de insetos (com utilização de vetores de expressão de baculovirus), células de levedura e outros fungos (ver Romanos, M.A., et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", em: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet &amp; L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J., &amp; Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, em: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Hrsgb., pág. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3:239-251), ciliados dos tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella e Stylonychia, em especial o género Stylonychia lemnae, com vetores após um método de transformação, tal como descrito em WO 98/01572, assim como preferencialmente em células de plantas multicelulares (ver Schmidt, R. e Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, pág. 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Bd. 1,
Engineering and Utilization, Hrsgb.: Rung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (e citações aqui incluídas)) . Células hospedeiras adequadas são discutidas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . O vetor de expressão recombinante pode, em alternativa, ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo com utilização de sequências de regulação promotor T7 e polimerase T7. A expressão de proteínas em procariontes decorre principalmente com vetores, os quais contêm promotores constitutivos ou induziveis, e os quais controlam a expressão de proteínas de fusão ou de não fusão. Vetores de expressão de fusão tipicos são, entre outros, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., e Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), nos quais estão ligados à proteina alvo recombinante, glutationa-S-transferase (GST), proteina ligada a maltose E ou proteina A.
Exemplos de vetores de expressão de não fusão para E. coli induziveis adequados são, entre outros, pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) e pET lld (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89). A expressão do gene alvo no vetor pET lld baseia-se na transcrição através da RNA polimerase do hospedeiro de um promotor de fusão trp-lac hibrido. A expressão do gene alvo no vetor pET lld baseia-se na transcrição de um promotor de fusão T7-gnl0-lac, a qual é mediada por uma RNA polimerase virai coexpressa (T7gnl). Esta polimerase virai é preparada a partir de uma estirpe hospedeira BL21 (DE3) ou HMS 174 (DE3) de um λ-profago residente, o qual contém um gene Tlgnl sob o controlo transcricional do promotor lacUV5.
Outros vetores apropriados para organismos procariotas são conhecidos do perito na especialidade. Estes vetores são por exemplo em E. coli pLG338, pACYC184, a série pBR, como o pBR322, a série pUC, como o pUC18 ou pUC19, a série M113mp, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL2 4, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, Xgtll ou pBdCl, em Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 ou pIJ361, em Bacillus pUBUO, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667.
Numa outra forma de realização, o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura S. cerevisiae compreendem o pYe-Desaturasecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vetores e métodos para a construção de vetores, os quais são adequados para utilização noutros fungos, como os fungos filamentosos, compreendem aqueles que são descritos em pormenor em van den Hondel, C.A.M.J.J., &amp; Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, em: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, ou em: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet &amp; L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego]. Outros vetores apropriados para expressão em leveduras são, por exemplo, pAG-1, YEp6, YEpl3 ou pEMBLYe23.
Como alternativa, as A12-dessaturases, o3-dessaturases, A9-elongases, A6-dessaturases, Δδ-dessaturases, Δ6-elongases, A5-dessaturases, A5-elongases e/ou Δ4-dessaturases podem ser expressas em células de insetos com a utilização de vetores de expressão de baculovirus. Os vetores de baculovirus que estão disponíveis para expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo, células Sf9), compreendem a série pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol.: 3: 2156-2165) e a série pVL (Lucklow e Summers (1989) Virology 170: 31-39).
Os vetores anteriormente mencionados são apenas uma pequena amostra de vetores possíveis apropriados. Outros plasmídeos são conhecidos do perito na especialidade e estão descritos, por exemplo, em: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) . Para outros sistemas de expressão apropriados para células procariontes e eucariontes ver capítulos 16 e 17 de Sambrook, J., Fritsch, E.F., e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Numa outra forma de realização do método, as Δ12-dessaturases, m3-dessaturases, A9-elongases, Δ6-dessaturases, Δδ-dessaturases, Δβ-elongases, Δ5-dessaturases, A5-elongases e/ou A4-dessaturases podem ser expressas em células vegetais unicelulares (como algas), ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3) :239-251 e a literatura aí citada, e em células vegetais de plantas superiores (por exemplo, espermatófitas, tal como frutos selvagens). Exemplos para vetores de expressão para plantas compreendem aqueles que são descritos em detalhe em: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., e Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; e Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em: Transgenic Plants,
Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Rung e R. Wu, Academic Press, 1993, pág. 15-38.
Uma cassete de expressão para plantas contém preferencialmente sequências de regulação, as quais podem controlar a expressão de genes em plantas e que estão funcionalmente ligadas, de forma que cada sequência possa cumprir a sua função, como por exemplo a terminação da transcrição, por exemplo sinais de poliadenilação. Sinais de poliadenilação preferidos são sinais originários de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, como é o caso do gene 3 conhecido como octopina sintase do plasmideo Ti, pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 e seguintes), ou equivalentes funcionais dos mesmos, mas todas as outras sequência de terminação funcionalmente ativas em plantas são também apropriadas.
Uma vez que a regulação da expressão de genes em plantas muitas vezes não é limitada ao nivel da transcrição, uma cassete de expressão para plantas contém, preferencialmente, outras sequências ligadas funcionalmente, como por exemplo, enhancers de translação, por exemplo a sequência overdrive, a qual contém a sequência leader 5'-não traduzida do virus do mosaico do tabaco, a qual por sua vez aumenta a razão proteina/RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711). 0 gene de plantas a expressar tem de estar ligado funcionalmente a um promotor apropriado, tal como descrito anteriormente, o qual realiza a expressão de genes na altura correta, e de forma especifica numa célula ou tecido. Promotores que podem ser utilizados são promotores constitutivos (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202),
como os que provêm de virus vegetais, como é o caso de 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (ver também US 5352605 e WO 84/02913) ou promotores de origem vegetal, como os descritos na US 4,962,028 da pequena subunidade da rubisco.
Outras sequências preferidas para a utilização como ligação funcional em cassetes de expressão para plantas, são sequências dirigidas a alvo, que são necessárias para o controlo do produto genético no seu compartimento celular correspondente (ver um resumo em Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 e literatura ai citada), por exemplo em vacúolos, nos núcleos celulares, todos os tipos de plastideos, como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, o compartimento extracelular, as mitocôndrias, o reticulo endoplasmático, oleoplastos, peroxissomas, e outros compartimentos de células vegetais. A expressão de genes em plantas também pode ser facilitada, tal como descrito anteriormente, por um promotor quimicamente induzivel (ver um resumo em Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Promotores quimicamente induziveis são especialmente apropriados quando é desejado que a expressão dos genes ocorra de forma especifica. Exemplos destes promotores são o promotor induzivel por ácido salicilico (WO 95/19443), um promotor induzivel por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) e um promotor induzivel por etanol.
Também são adequados promotores que reagem a condições de stress bióticas ou abióticas, por exemplo, o promotor do gene PRP1 induzivel por agentes patogénicos (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), o promotor hsp80 do tomate, induzivel pelo calor (US 5,187,267), o promotor alfa-amilase de batata induzível pelo frio (WO 96/12814) ou o promotor pinll induzível por ferimentos (EP-A-0 375091) . São especialmente preferidos promotores os quais levam à expressão de genes em tecidos e órgãos nos quais ocorre a biossíntese de ácidos gordos, lípidos e óleos, em células de sementes tal como células do endosperma e do embrião em desenvolvimento. Promotores apropriados são o promotor do gene da napina de colza (US 5, 608,152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67), o promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), o promotor de Bce4 de Brassica (WO 91/13980) ou o promotor de legumina-B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2): 233-9), assim como promotores, os quais levam à expressão específica em sementes em plantas monocotiledóneas, tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Os promotores apropriados mais significativos são o promotor dos genes Ipt2 ou Iptl de cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230) ou os descritos na WO 99/16890 (promotores do gene da hordeína de cevada, gene da glutelina de arroz, gene da orizina de arroz, gene da prolamina de arroz, gene da gliadina de trigo, gene da glutelina de trigo, gene da zeína de milho, gene da glutelina de aveia, o gene de casirina de sorgo, gene de secalina de centeio).
Em especial, pode ser desejada a expressão em paralelo das Al2-dessaturases, co3-dessaturases, A9-elongases, Δ6-dessaturases, A8-dessaturases, A6-elongases, Δ5-dessaturases, A5-elongases e/ou A4-dessaturases usadas no método. A introdução destas cassetes de expressão pode ser feita através de uma transformação simultânea de vários constructos de expressão individuais, ou preferencialmente através de combinação de várias cassetes de expressão num único constructo. Também podem ser transformados e transferidos para as células hospedeiras vários vetores cada um com várias cassetes de expressão.
De igual modo, são adequados promotores que levam à expressão especifica em plastideos, uma vez que os plastideos são um compartimento no qual são sintetizados os precursores e alguns produtos finais da biossintese dos lipidos. Promotores adequados, tal como o promotor da RNA polimerase virai, são descritos em WO 95/16783 e WO 97/06250, e o promotor de clpP de Arabidopsis, descrito na WO 99/46394. O vetor de DNA pode ser introduzido dentro das células procariontes ou eucariontes através de técnicas de transformação ou transfeção convencionais. Os termos "transformação" e "transfeção", conjugação e transdução, tal como aqui utilizado, devem compreender uma série de métodos conhecidos do estado da técnica para introdução de ácidos nucleicos externos (por exemplo, DNA) numa célula hospedeira, incluindo: coprecipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfeção mediada por DEAE-dextrano, lipofeção, competência natural, transferência quimicamente mediada, eletroporação ou bombardeamento com partículas. Métodos apropriados para a transformação ou transfeção de células hospedeiras, incluindo células vegetais, podem ser encontrados em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e outros manuais de laboratório, tal como Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44,
Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland e Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
As células hospedeiras que são apropriadas, em principio, para receber os ácidos nucleicos de acordo com a invenção, o produto de gene de acordo com a invenção, ou o vetor de acordo com a invenção, são todos os organismos procariontes ou eucariontes. Os microrganismos hospedeiros mais vantajosos são microrganismos, tais como fungos ou leveduras ou células vegetais, preferencialmente plantas ou partes destas. São preferencialmente usados fungos, leveduras ou plantas, de forma especialmente preferida, plantas, de forma muito especialmente preferida, plantas tais como oleaginosas, as quais contêm grandes quantidades de compostos lipidicos, tal como colza, primula, cânhamo, cardo, amendoim, canola, linhaça, soja, cártamo, girassol, borragem, ou plantas tais como milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, algodão, mandioca, pimenta, tagetes, plantas Solanaceae, tais como batata, tabaco, beringela e tomate, espécies de Vicia, ervilhas, alfafa, arbustos (café, cacau, chá), espécies de Salix, árvores (palmeira de óleo africana, coqueiro), assim como gramineas perenes e culturas forrageiras. Plantas de acordo com a invenção que são especialmente preferidas são plantas de frutos oleaginosos tais como soja, amendoim, colza, canola, linhaça, cânhamo, primula, girassol, cártamo, árvores (palmeira de óleo africana, coqueiro).
Um outro objetivo da invenção refere-se a ácidos nucleicos isolados, tal como descrito anteriormente, com uma sequência que codifica para polipéptidos com atividade Δ5-elongase, em que a elongase codificada pelas sequências de ácidos nucleicos converte os ácidos gordos Ci6 e Cie com uma ligação dupla e de forma vantajosa ácidos gordos Cis polinsaturados com uma ligação dupla Δ6, e ácidos gordos C20 polinsaturados com uma ligação dupla Δ5. Ácidos gordos C22 não sofrem extensão.
Os ácidos nucleicos isolados divulgados são representados por sequências de ácidos nucleicos, as quais codificam para polipéptidos com atividade Δδ-elongase e que contêm uma sequência de aminoácidos, selecionada do grupo de uma sequência de aminoácidos com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 142.
Outros ácidos nucleicos isolados descritos são representados através de sequências de ácidos nucleicos, os quais codificam para polipéptidos com atividade A5-elongase e que contêm uma combinação de sequências de aminoácidos, selecionadas do grupo: a) SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 140 ou SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 140; ou b) SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 142 ou SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 142; ou c) SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 140 ou SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 142.
Sequências de ácidos nucleicos preferidas, as quais codificam para polipéptidos com atividade A5-elongase contêm as sequências de aminoácidos anteriormente mencionadas. Estas foram descritas em detalhe na Tabela 2. Ácidos nucleicos isolados interessantes são representados através de sequências selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 133, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132 ou SEQ ID NO: 134, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 133, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132 ou SEQ ID NO: 134 e que apresentam uma atividade A5-elongase. A seguir são enumeradas sequências de ácidos nucleicos, as quais codificam para A6-elongases, m3-dessaturases, Δ6-dessaturases, A5-dessaturases, A4-dessaturases ou Δ12-dessaturases. Ácidos nucleicos isolados adicionais são representados através das sequências selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 183, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 184, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 183, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 112 ou SEQ ID NO: 184 e que apresentam uma atividade A6-elongase. Ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade co3-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 105, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 106, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 105, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 60% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 106, e que apresentam uma atividade ω3-dessaturase. Ácidos nucleicos com sequências que codificam para polipéptidos com atividade Δβ-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 97, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 90 ou SEQ ID NO: 98, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 97, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com SEQ ID NO: 90 ou SEQ ID NO: 98, e que apresentam uma atividade Δβ-dessaturase . Ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade Δδ-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 101, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100 ou SEQ ID NO: 102, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 101, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100 ou SEQ ID NO: 102, e que apresentam uma atividade A5-dessaturase. Ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade A4-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 103, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 96 ou SEQ ID NO: 104, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 103, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 40% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com SEQ ID NO: 96 ou SEQ ID NO: 104, e que apresentam uma atividade Δ6-dessaturase. Ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade A12-dessaturase, selecionados do grupo: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 109, b) ácidos nucleicos que podem ser derivados do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 108 ou SEQ ID NO: 110, ou c) derivados das sequências de ácidos nucleicos apresentadas em SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 109, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 50% de homologia, ao nivel dos aminoácidos, com SEQ ID NO: 108 ou SEQ ID NO: 110, e que apresentam uma atividade Δ12-dessaturase.
Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção anteriormente mencionados são provenientes de organismos tais como animais não humanos, ciliados, fungos, plantas tais como algas ou dinof lagelados, os quais têm a capacidade para sintetizar PUFAs.
As sequências de ácidos nucleicos isoladas anteriormente mencionadas provêm, de forma vantajosa, das ordens Salmoniformes, Xenopus ou Ciona, dos géneros de diatomáceas Thalassiosira ou Crythecodinium ou da familia das Prasinophyceae, tal como o género Ostreococcus ou da familia Euglenaceae, tal como o género Euglena ou Pythiaceae, tal como o género Phytophtora.
Além disso, são também descritos ácidos nucleicos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade G)3-dessaturase, em que as co3-dessaturases codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos convertem ácidos nucleicos Cis, C20 e C22 com duas, três, quatro ou cinco ligações duplas e, de forma vantajosa, ácidos gordos Ci8 polinsaturados com duas ou três ligações duplas, e ácidos gordos C20 polinsaturados com duas, três ou quatro ligações duplas. Ácidos gordos C22 com quatro ou cinco ligações duplas também são dessaturados.
Também são descritos ácidos gordos isolados com sequências que codificam para polipéptidos com atividade Δ12-dessaturase, A4-dessaturases, A5-dessaturase e Δ6- dessaturases, em que estas A12-dessaturases, Δ4- dessaturases, A5-dessaturase ou Δβ-dessaturases codificadas através destas sequências de ácidos nucleicos convertem ácidos gordos Cis, C20 e C22 com uma, duas, três, quatro ou cinco ligações duplas e, de forma vantajosa, ácidos gordos Ci8 polinsaturados com uma, duas ou três ligações duplas, tais como Ci8:iA9, Ci8:2A9'12 OU Ci8:3A9'12'15, ácidos gordos C20 polinsaturados com três ou quatro ligações duplas, tais como C20:3a8,11,14 ou C2 o: 4δ8 '11'14'17, ou ácidos gordos C22 polinsaturados com quatro ou cinco ligações duplas, tais como C22:4δ7, 10,13,16 ou C22:5Δ7'10,13,16,19 · De forma vantajosa, os ácidos gordos são dessaturados em fosfolipidos ou ésteres de ácidos gordos-CoA, de forma vantajosa, nos ésteres de ácidos gordos-CoA.
Numa forma de realização vantajosa, o termo "(molécula) de ácido nucleico", tal como aqui utilizado compreende, além disso, sequências não traduzidas presentes nas extremidades 3' e 5' da porção de gene codificado: pelo menos 500, preferencialmente 200, mais preferencialmente 100 nucleotideos da sequência a montante da extremidade 5' da porção de gene codificada e pelo menos 100, preferencialmente 50, mais preferencialmente 20 nucleotideos da sequência a montante da extremidade 3' da porção de gene codificada. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é separada de outras moléculas de ácidos nucleicos que estão presentes na fonte natural dos ácidos nucleicos. Um ácido nucleico isolado não tem, de preferência, qualquer sequência que flanqueia naturalmente os ácidos nucleicos no DNA genómico do organismo do qual o ácido nucleico provém (por exemplo, sequências que se encontram nas extremidades 3' e 5' do ácido nucleico) . Em diferentes formas de realização, a molécula de A5-elongase isolada contém, por exemplo, menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb, de sequências de nucleotideos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genómico das células, das quais o ácido nucleico provém.
As moléculas de ácidos nucleicos usadas no método, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 67 ou uma parte desta, pode ser isolada através da utilização de técnicas standard de biologia molecular, e da informação de sequências aqui fornecida. Também podem ser identificados, por exemplo, uma sequência homóloga ou homólogos, sequências conservadas ao nivel do DNA ou dos aminoácidos, com auxilio de algoritmos de comparação. Estas sequências podem ser utilizadas como sondas de hibridização, e com a utilização de técnicas de hibridização standard (como por exemplo, as descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), para isolamento de outras sequências de ácidos nucleicos que podem ser usadas no método. Além disso, pode ser isolada uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência completa da SEQ ID NO: 67 ou uma parte desta, através de reação em cadeia da polimerase, em que são utilizados primers oligonucleotidicos baseados nestas sequências ou em partes destas (por exemplo, uma molécula e ácido nucleico compreendendo a sequência completa ou uma parte da mesma, pode ser isolada através de reação em cadeia da polimerase, com a utilização de primers oligonucleotidicos, os quais são preparados com base nestas sequências iguais). Por exemplo, pode isolar-se mRNA de células (por exemplo, através do método da extração com tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) e preparar-se cDNA por intermédio da transcriptase reversa (por exemplo, transcritase reversa de Moloney-MLV, que pode ser obtida na Gibco/BRL, Bethesda, MD, ou da transcritase reversa AMV, a qual pode ser obtida na Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Primers oligonucleotidicos sintéticos para amplificação por intermédio da reação em cadeia da polimerase podem ser preparados com base na sequência apresentada em SEQ ID NO: 67, ou com auxilio das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 68. Um ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser amplificado com a utilização de cDNA ou, como alternativa, de DNA genómico como matriz, e primers oligonucleotidicos, de acordo com técnicas standard de amplificação por PCR. 0 ácido nucleico assim amplificado pode ser clonado num vetor apropriado e caracterizado por análise de sequenciação de DNA. Os oligonucleotideos que correspondem a uma sequência de nucleotideos de dessaturase, podem ser preparados através de métodos standard de síntese, por exemplo, com um instrumento de síntese de DNA automático.
Homólogos das sequências de ácidos nucleicos da A5-elongase utilizadas com a sequência SEQ ID NO: 67 significa, por exemplo, variantes alélicas com pelo menos 50 ou 60%, preferencialmente pelo menos cerca de 60 ou 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70 ou 80%, 90% ou 95%, e ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, de identidade ou homologia com uma das sequências apresentadas em SEQ ID NO: 67, ou os seus homólogos, derivados ou análogos, ou partes dos mesmos. Adicionalmente, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas são uma sequência de nucleotideos que hibridiza com uma das sequências de nucleotideos apresentadas na SEQ ID NO: 67 ou uma parte destas, por exemplo, sob condições rigorosas. 0 ácido nucleico de acordo com a invenção não possui a sequência apresentada na SEQ ID NO: 113. De acordo com a invenção, uma parte quer dizer que pelo menos 25 pares de bases (= bp) , 50 bp, 75 bp, 100 bp, 125 bp ou 150 bp, preferencialmente pelo menos 175 bp, 200 bp, 225 bp, 250 bp, 275 bp ou 300 bp, de forma especialmente preferida, 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp, ou mais pares de bases são utilizadas para a hibridização. Também pode ser vantajoso a utilização da sequência completa. Variantes alélicas compreendem, em especial, variantes funcionais, as quais podem ser obtidas através de deleção, inserção ou substituição de nucleotideos na sequência apresentada na SEQ ID NO: 67, embora a intenção seja que a atividade enzimática das proteínas sintetizadas obtidas para a inserção de um ou mais genes é mantida, e em que o ácido nucleico não possui a sequência apresentada na SEQ ID NO: 113, e em que a sequência de aminoácidos não possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 114. As proteínas que ainda mantêm a atividade enzimática da Δ5-elongase, ou seja, que não têm a sua atividade substancialmente reduzida, são proteínas com pelo menos 10%, preferencialmente 20%, mais preferencialmente 30%, ainda mais preferencialmente 40% da atividade enzimática original, em comparação com a proteína codificada através da SEQ ID NO: 67.
O mesmo é válido para as outras sequências divulgadas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID
NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO:
47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID
NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO:
83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID
NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 183 e as proteínas codificadas pelas mesmas. A homologia foi determinada na sequência completa de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Para a comparação das diferentes sequências existem disponíveis uma série de programas, os quais têm por base diferentes algoritmos. Os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman originam resultados especialmente confiáveis. Para a comparação das sequências foi usado o programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et ai., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) e Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], os quais são obtidos com o GCG Software-Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Os valores percentuais de homologia fornecidos anteriormente foram determinados pelo programa GAP, ao longo de toda a sequência, com as seguintes configurações: Gap Weight: 50, Lenght Weight: 3, Average Match: 10,000 e Average Mismatch: 0,000. Caso não seja especificado em contrário, estas configurações foram sempre utilizadas como configurações padrão para as comparações de sequências.
Homólogos das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ
ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:
29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID
NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:
63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID
NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:
93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 183 significa, por exemplo, também homólogos bacterianos, de fungos e de plantas, sequências mais curtas, DNA ou RNA de cadeia simples da sequência de DNA codificada e não codificada.
Homólogos das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ
ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:
29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID
NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:
63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID
NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 183 significam também derivados, como por exemplo, variantes de promotores. Os promotores a montante das sequências de nucleotideos referidas podem ser modificados através de uma ou mais trocas de nucleotideos, através de inserção ou inserções e/ou deleção ou deleções, sem que a funcionalidade ou atividade dos promotores seja, contudo, perturbada. É também possível que a atividade dos promotores seja aumentada através de modificação da sua sequência, ou que estes sejam completamente substituídos por promotores ativos, mesmo de organismos heterólogos.
Os ácidos nucleicos e moléculas de proteínas anteriormente mencionados com atividade A12-dessaturase, co3-dessaturase, A9-elongase, Δβ-dessaturase, Δδ-dessaturase, Δβ-elongase, A5-dessaturase, A5-elongase e/ou A4-dessaturase, as quais participam no metabolismo de lípidos e ácidos gordos, cofatores PUFA e enzimas, ou no transporte de compostos lipofílicos através de membranas, são utilizados no método de acordo com a invenção, para a modulação da produção de PUFAs em organismos transgénicos, de forma vantajosa, em plantas, tal como milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, espécies de Linum tal como linhaça ou linho, espécies de Brassica, tal como colza, canola e turnepo, pimenta, girassol, borragem prímula e tagetes, plantas Solanaceae, tal como batata, tabaco, beringela e tomate, espécies de Vicia, ervilhas, mandioca, alfafa, arbustos (café, cacau, chá), espécies de Salix, árvores (palmeira de óleo africana, coqueiro) e gramíneas perenes e plantas forrageiras. Isto pode ocorrer diretamente (por exemplo, quando a sobre-expressão ou otimização de uma proteína da biossíntese de ácidos gordos tem uma influência direta no rendimento, produção e/ou eficiência da produção do ácido gordo no organismo modificado), e/ou indiretamente através de um efeito indireto, o que resulta num aumento do rendimento, produção e/ou eficiência da produção dos PUFAs, ou numa diminuição de compostos indesejados (por exemplo, quando a modulação do metabolismo de lípidos e ácidos gordos, cofatores e enzimas conduz à alteração do rendimento, produção e/ou eficiência da produção ou da composição dos compostos desejados nas células, o que por sua vez pode influenciar a produção de um ou mais ácidos gordos). A combinação de diferentes moléculas precursoras e enzimas de biossíntese conduz à produção de diferentes moléculas de ácidos gordos, o que tem um efeito decisivo na composição dos lípidos, uma vez que os ácidos gordos polinsaturados (= PUFAs), não são apenas incorporados em triacilglicerina, mas também em lípidos da membrana.
Especialmente adequados para a produção de PUFAs, por exemplo, de ácido estearidónico, ácido eicosapentaenóico e ácido docosahexaenóico, são Brasicaceae, Boraginaceae, Primulaceae, ou Linaceae. De forma especialmente vantajosa, a linhaça (Linum usitatissimum) é adequada para a produção de PUFAs com as sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, de forma vantajosa, tal como descrito, em combinação com outras dessaturases e elongases. A síntese de lípidos pode ser dividida em duas partes: a síntese de ácidos gordos e a sua ligação a sn-glicerina-3-fosfato, assim como a adição ou modificação de um grupo de cabeça polar. Lípidos habituais, os quais são utilizados em membranas, compreendem fosfolípidos, glicolipidos, esfingolípidos e fosfoglicerídeos. A síntese de ácidos gordos começa com a conversão de acetil-CoA em malonil-CoA, através da acetil-CoA carboxilase, ou em acetil-ACP, através da acetiltransacilase. Após uma reação de condensação, estas duas moléculas de produto formam, juntas, acetoacetil-ACP, o qual é transformado através de uma série de reações de condensação, redução e desidratação, de forma que é obtida uma molécula de ácido gordo saturado com o comprimento de cadeia desejado. A produção dos ácidos gordos insaturados a partir destas moléculas é catalisada por dessaturases específicas, de forma aeróbia por intermédio de oxigénio molecular, ou de forma anaeróbia (em relação à síntese de ácidos gordos em microrganismos, ver F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli e Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., pág. 612-636 e a literatura aí citada; Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, e a literatura aí citada, assim como Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 e a literatura aí citada). Os ácidos gordos ligados a fosfolípidos assim produzidos têm de, a seguir, ser transferidos dos fosfolípidos para o conjunto de ésteres de ácido gordo-CoA, para as extensões adicionais. Isto é permitido pelas acil-CoA: lisofosfolípidos aciltransferases . Adicionalmente, estas enzimas podem transferir novamente os ácidos gordos que sofreram extensão dos ésteres-CoA para os fosfolípidos. Esta sequência de reações pode eventualmente ser feita várias vezes.
Precursores para a biossíntese de PUFA são, por exemplo, ácido oleico, ácido linoleico e ácido linolénico. Estes ácidos gordos hidrocarbonetos Cis têm de ser prolongados para C20 e C22, de forma que sejam obtidos ácidos gordos do tipo eicosa e docosa. Com auxílio das dessaturases utilizadas no método, tal como a Δ12-, ω3-, Δ4-, Δ5-, Δ6- e Δδ-dessaturases e/ou as Δ5-, Δ6-, A9-elongases, podem ser produzidos ácido araquidónico, ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico ou ácido docosahexaenóico, de forma vantajosa, ácido eicosapentaenóico e/ou ácido docosahexaenóico, os quais podem a seguir ser utilizados para diferentes fins, com utilização em alimentação, rações, cosméticos e medicamentos. Com as enzimas mencionadas, podem ser preparados ácidos gordos C20 e/ou C22, com pelo menos duas, de forma vantajosa, pelo menos três, quatro, cinco ou seis ligações duplas por molécula de ácido gordo, preferencialmente ácidos gordos C20 ou C22 com, de forma vantajosa, quatro, cinco ou seis ligações duplas por molécula de ácido gordo. A dessaturação pode ser feita antes ou depois da extensão do ácido gordo correspondente. Assim, os produtos da atividade das dessaturases e das possíveis dessaturações e extensões, resultam nos PUFAs com elevado grau de dessaturação preferidos, incluindo uma extensão adicional de ácidos gordos C20 para C22, para ácidos gordos tais como ácido γ-linolénico, ácido dihomo-y-linolénico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenóico ou ácido eicosapentaenóico. Os substratos das dessaturases e elongases no método de acordo com a invenção são ácidos gordos Ci6, Cis ou C20, como por exemplo, ácido linoleico, ácido γ-linolénico, ácido a-linolénico, ácido dihomo-Y-linolénico, ácido eicosatetraenóico ou ácido estearidónico. Substratos preferidos são ácido linoleico, ácido γ-linolénico e/ou ácido α-linolénico, ácido dihomo-Y-linolénico ou ácido araquidónico, ácido eicosatetraenóico ou ácido eicosapentaenóico. Os ácidos gordos C20 e C22 sintetizados com pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis ligações duplas no ácido gordo resultam, no método de acordo com a invenção, na forma dos ácidos gordos livres ou na forma dos seus ésteres, por exemplo, na forma dos seus glicerideos. 0 termo "glicerídeo" significa uma glicerina esterificada com um, dois ou três ésteres de ácido carboxilico (mono-, di- ou triglicerideo). Como "glicerídeo" entende-se também uma mistura de diferentes glicerídeos. 0 glicerídeo ou mistura de glicerídeos pode ainda conter outros ingrediente, por exemplo, ácidos gordos, antioxidantes, proteínas, hidratos de carbono, vitaminas e/ou outras substâncias.
No âmbito do método de acordo com a invenção, como "glicerídeo" entende-se ainda derivados de glicerina. Isto inclui, para além dos glicerídeos de ácidos gordos anteriormente descritos, também glicerofosfolípidos e gliceroglicolípidos. São aqui preferidos, por exemplo, os glicerofosfolípidos como a lecitina (fosfatidilcolina), cardiolipina, fosfatidilglicerina, fosfatidilserina e alquilacilglicerofosfolípidos.
Além disso, os ácidos gordos têm de ser, a seguir, transportados para diferentes locais de modificação, e ser incorporados no lípido de armazenamento triacilglicerina. Um outro passo importante na síntese de lípidos é a transferência de ácidos gordos dos grupos de cabeça polares, por exemplo, através da glicerina-ácido gordo aciltransferase (ver Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5): 161-166) .
Podem encontrar-se publicações acerca da biossíntese de ácidos gordos em plantas, dessaturação, metabolismo dos lípidos e transporte através de membranas de compostos contendo gorduras, beta-oxidação, modificação de ácidos gordos e cofatores, armazenamento e montagem de triacilglicerina, incluído a literatura aí citada nos seguintes artigos: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge e Browse, 1995,
Plant Cell 7:957-970; Shanklin e Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Guhnemann-Scháfer &amp; Kindi, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, em: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata e Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy &amp; Ross 1998, Plant Journal. 13 (1) :1-16.
Os PUFAs produzidos no método compreendem um grupo de moléculas que os animais superiores já não conseguem sintetizar e por isso têm de ser fornecidos, ou os animais superiores não conseguem sintetizar por si só quantidades suficientes e por isso têm de ser fornecidos com os mesmos, embora eles sejam facilmente produzidos por outros organismos, como por exemplo, bactérias; por exemplo, os gatos não são capazes de sintetizar ácido araquidónico.
No contexto da invenção, "fosfolipidos" deve ser entendido como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina e/ou fosfatidilinositol, de forma vantajosa, fosfatidilcolina. Os termos produção ou produtividade são conhecidos do campo na especialidade e incluem a concentração do produto de fermentação (compostos da fórmula I), os quais são produzidos num determinado intervalo de tempo e num determinado volume de fermentação (por exemplo, kg de produto por hora, por litro) . Inclui também a produtividade de uma célula vegetal ou de uma planta, ou seja, o teor dos ácidos gordos desejados produzidos no método, em relação ao teor de todos os ácidos gordos nesta célula ou planta. O termo eficiência da produção compreende o tempo que é necessário para obter uma determinada quantidade de produção (por exemplo, quanto tempo a célula precisa para atingir uma determinada taxa de conversão de um produto quimico). 0 termo rendimento ou rendimento de produto/hidrato de carbono é conhecido no campo da especialidade e compreende a eficiência da conversão da fonte de hidrato de carbono no produto (ou seja, do produto quimico). Isto é normalmente representado, por exemplo, como kg de produto por kg de fonte de hidrato de carbono. Através do aumento do rendimento ou da produção do composto, aumenta a quantidade da molécula obtida ou das moléculas obtidas adequadas deste composto, numa determinada quantidade de cultura, ao longo de um período de tempo especificado. Os termos biossíntese ou vias de biossíntese são conhecidos do campo da especialidade e compreendem a síntese de um composto, preferencialmente de um composto orgânico, por uma célula, a partir de compostos intermédios, por exemplo, num processo de vários passos e fortemente regulado. Os termos degradação ou via de degradação são conhecidos do campo da especialidade e compreendem a separação de um composto, preferencialmente um composto orgânico, por uma célula, em produtos de degradação (mais geralmente, moléculas mais pequenas ou menos complexas), por exemplo, num processo de vários passos e fortemente regulado. 0 termo metabolismo é conhecido do campo da especialidade e compreende a totalidade das reações bioquímicas que ocorrem num organismo. 0 metabolismo de um determinado composto (por exemplo, metabolismo de um ácido gordo) compreende a totalidade das vias de biossíntese, de modificação e de degradação deste composto na célula, que dizem respeito a este composto.
Em outras formas, os derivados da molécula de ácidos nucleicos codificam as proteínas representadas em SEQ ID
NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:
85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID
NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183, com pelo menos 40%, de forma vantajosa, pelo menos 50% ou 60%, preferencialmente pelo menos cerca de 60 ou 70%, e de forma mais preferida, pelo menos 70 ou 80%, 80 a 90%, 90 a 95% e, de forma ainda mais preferida, pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homologia (= identidade), com uma
sequência de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134 ou SEQ ID NO: 184. A homologia foi determinada na sequência completa de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Para a comparação das diferentes sequências existem disponíveis uma série de programas, os quais têm por base diferentes algoritmos. Os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman originam resultados especialmente confiáveis. Para a comparação das sequências foi usado o programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas
Gap e BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) e Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], os quais são obtidos com o GCG Software-
Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Os valores percentuais de homologia fornecidos anteriormente foram determinados pelo programa BestFit, ao longo de toda a sequência, com as seguintes configurações: Gap Weight: 50, Lenght Weight: 3, Average Match: 10,000 e Average Mismatch: 0,000. Caso não seja especificado em contrário, estas configurações foram sempre utilizadas como configurações padrão para as comparações de sequências. A divulgação compreende ainda moléculas de ácidos nucleicos que se distinguem de uma das sequências de nucleotideos apresentadas em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183 (e partes das mesmas), devido ao código genético degenerado, e que codificam as mesmas A12-dessaturase, ω3-dessaturase, A6-dessaturase, A5-dessaturase, Δ4-dessaturase, Δδ-elongase ou A5-elongase que as sequências de nucleotideos representadas nas SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183.
Para além das Al2-dessaturase, co3-dessaturase, A5-elongase Δδ-dessaturase, A5-dessaturase, A4-dessaturase ou Δ6-elongase representadas pelas SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183, o perito na especialidade sabe que, dentro de uma população, podem existir polimorfismos de DNA, os quais resultam em alterações nas sequências de aminoácidos das Δ12- dessaturase, m3-dessaturase, A5-elongase, Δδ-dessaturase, A5-dessaturase, A4-dessaturase e/ou Δδ-elongase. Estes polimorfismos genéticos nos genes das A12-dessaturase, ω3-dessaturase, A5-elongase, Δδ-dessaturase, A5-dessaturase, A4-dessaturase e/ou Δδ-elongase podem existir entre indivíduos dentro de uma população, devido a variação natural. Estas variantes naturais causam normalmente uma variância de 1 a 5% na sequência de nucleotídeos dos genes A12-dessaturase, m3-dessaturase, A5-elongase, Δδ- dessaturase, A5-dessaturase, A4-dessaturase e/ou Δδ-elongase. Todas estas variações de nucleotídeos e os polimorfismos de aminoácidos daí resultantes nas Δ12-dessaturase, co3-dessaturase, A5-elongase, Δδ-dessaturase, A5-dessaturase, A4-dessaturase e/ou Δδ-elongase que são resultado de variações naturais e que não alteram a atividade funcional, devem estar contidas no âmbito da invenção.
Para métodos alternativos, podem ser isoladas moléculas de ácidos nucleicos vantajosas, com base na sua homologia com os ácidos nucleicos das A12-dessaturase, m3-dessaturase, Δδ-elongase, Δβ-dessaturase, A5-dessaturase, Δ4-dessaturase e/ou Δβ-elongase aqui divulgados, utilizando a sequência ou uma parte da mesma como sonda de hibridização, de acordo com técnicas de hibridização standard, e sob condições rigorosas. Aqui podem ser usadas, por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos isoladas, as quais têm um comprimento de pelo menos 15 nucleotideos e que hibridizam, sob condições rigorosas, com as moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma das sequências de nucleotideos das SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183. Também podem ser usados ácidos nucleicos com pelo menos 25, 50, 100, 250 ou mais nucleotideos. A expressão "hibridiza sob condições rigorosas", tal como aqui utilizado, deve descrever condições de hibridização e crescimento, nas quais as sequências de nucleotideos que são pelo menos 60% homólogas entre si, permanecem hibridizadas uma à outra. As condições são, preferencialmente, tais, que as sequências que são pelo menos cerca de 65%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70% e de forma ainda mais preferida, pelo menos 75% ou mais homólogas, permanecem habitualmente hibridizadas uma com a outra. Estas condições rigorosas são conhecidas do perito na especialidade e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &amp; Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Um exemplo preferido, não limitativo para condições de hibridização rigorosas é a hibridização em cloreto de sódio/citrato de sódio 6x (cloreto de sódio/citrato de sódio = SSC) a cerca de 45 °C, seguido de um ou mais passos de lavagem em SSC 0,2X, SDS 0,1%, a 50 -65 °C. É conhecido do perito na especialidade, que estas condições de hibridização são diferentes consoante o tipo de ácidos nucleicos e, por exemplo, quando estão presentes solventes orgânicos, dependem da temperatura e da concentração do tampão. Em "condições de hibridização standard", a temperatura varia, por exemplo, dependendo do tipo de ácido nucleico, entre 42 °C e 58 °C em tampão aquoso com uma concentração de 0,1 a 5 X de SSC (pH 7,2). Caso o tampão referido contenha solvente orgânico, por exemplo 50% de formamida, a temperatura das condições standard é de cerca de 42 °C. As condições de hibridização para os hibridos DNA:DNA são, preferencialmente, por exemplo, SSC 0,1 X e de 20 °C a 45 °C, preferencialmente entre 30 °C e 45 °C. As condições de hibridização para os hibridos DNA:RNA são, preferencialmente, por exemplo, SSC 0,1 X e de 30 °C a 55 °C, preferencialmente entre 45 °C e 55 °C. As temperaturas de hibridização acima referidas são determinadas, por exemplo, para um ácido nucleico com um comprimento de cerca de 100 bp (= pares de bases), e um conteúdo G+C de 50%, na ausência de formamida. O perito na especialidade sabe como as condições de hibridização necessárias podem ser determinadas, com base em livros técnicos, tal como os já referidos, ou nos seguintes Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames e Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Para a determinação da homologia percentual (= identidade) de duas sequências de aminoácidos (por exemplo, uma das sequências SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134 ou SEQ ID NO: 184), ou de dois ácidos nucleicos (por exemplo, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183), as sequências são escritas uma a seguir à outra, para se conseguir uma comparação ótima (por exemplo, para conseguir um alinhamento ótimo com as outras proteínas ou outros ácidos nucleicos, podem ser introduzidas lacunas nas sequências de uma proteína ou de um ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou de nucleotídeos correspondentes são depois comparados. Quando uma posição numa sequência está ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou pelo mesmo nucleotídeo que a posição correspondente na outra sequência, então as moléculas são homólogas nessa posição (ou seja, "homologia" de aminoácidos ou ácidos nucleicos, tal como aqui utilizado, corresponde a "identidade" de aminoácidos ou de nucleotídeos). A homologia percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas que são comuns às sequências (ou seja, % de homologia = número de posições idênticas / número total de posições x 100) . O termo homologia e identidade são assim interpretados como sinónimos. Os programas ou algoritmos utilizados são os descritos anteriormente.
Uma molécula de ácidos nucleicos isolada, a qual codifica para uma A12-dessaturase, co3-dessaturase, Δβ-dessaturase, A5-dessaturase, A4-dessaturase, A5-elongase e/ou Δ6-elongase, e a qual é homóloga a uma sequência de proteinas SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134 ou SEQ ID NO: 184, pode ser obtida através da introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotideos numa sequência de nucleotideos das SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183, de forma que é introduzida uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos na proteina codificada. As mutações podem ser introduzidas numa das sequências SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183, através de técnicas standard, tais como mutagénese sítio-específica e mutagénese por PCR. Preferencialmente, são preparadas mutações conservadas de aminoácidos em um ou mais resíduos dos aminoácidos não essenciais referidos. Numa "substituição de aminoácidos do tipo conservativa" o radical de aminoácidos é trocado por um radical de aminoácidos com uma cadeia lateral semelhante. No estado da técnica estão definidas familias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes. Estas famílias compreendem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeia laterais apoiares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Um resíduo de aminoácido não essencial anteriormente mencionado numa Δ12-dessaturase, c3-dessaturase, Δβ-dessaturase, Δ5-dessaturase, A4-dessaturase, A5-elongase ou Δβ-elongase é, assim, preferencialmente trocado por um outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Em alternativa, em outras formas de realização, as mutações podem ser introduzidas de modo aleatório, na sequência total ou parcial que codifica as ál2-dessaturase, ω3-dessaturase, Δβ-dessaturase, A5-dessaturase, Δ4-dessaturase, A5-elongase ou Δβ-elongase, por exemplo, através de mutagénese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser estudados para a atividade Δ12-dessaturase, co3-dessaturase, Δβ-dessaturase, Δ5-dessaturase, A4-dessaturase, A5-elongase ou Δβ-elongase, para identificar mutantes que retêm a atividade Δ12-dessaturase, co3-dessaturase, Δβ-dessaturase, Δ5-dessaturase, A4-dessaturase, A5-elongase ou Δβ-elongase. Após mutagénese de uma das sequências SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47,SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183, a proteína recombinante codificada pode ser expressa e a atividade da proteína pode, por exemplo, ser determinada através da utilização do teste aqui descrito. São ainda divulgados organismos não humanos transgénicos, os quais contêm os ácidos nucleicos de acordo com a invenção SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 183, ou um constructo genético ou um vetor, que contém estas sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção. De forma vantajosa, organismos não humanos são microrganismos, um animal não humano ou uma planta, de forma especialmente preferida, é uma planta.
Esta invenção é ilustrada em maior detalhe através dos Exemplos seguintes, os quais não devem ser interpretados como limitação.
Exemplos
Exemplos de acordo com a invenção incluem todos os Exemplos que são dirigidos a uma sequência de ácidos nucleicos com - a SEQ ID NO: 67 ou - uma sequência de ácidos nucleicos que pode ser derivada do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 68, ou derivados da sequência de ácidos nucleicos apresentada na SEQ ID NO: 67, a qual codifica para o polipéptido com pelo menos 40% de identidade ao nivel dos aminoácidos com a SEQ ID NO: 68, e apresenta uma atividade A5-elongase. em que o ácido nucleico não possui a sequência representada pela SEQ ID NO: 113.
Exemplo 1: Método geral de clonagem
Os métodos de clonagem, como por exemplo, separação por restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos em membranas de nitrocelulose e de nylon, ligação de fragmentos de DNA, transformação de células de Escherichia coli, cultivo de bactérias e análise de sequência de DNA recombinante, foram realizados tal como descrito em
Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
Exemplo 2: Análise de sequência do DNA recombinante A sequenciação de moléculas de DNA recombinante é feita com um sequenciador de DNA da empresa ABI, de acordo com o método de Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Os fragmentos resultantes de uma reação de polimerase em cadeia foram sequenciados e analisados em constructos, para evitar erros da polimerase.
Exemplo 3: Clonagem de genes de Oncoryhnchus mykiss
Através da pesquisa de zonas conservadas nas sequências de proteínas dos genes de elongase enumerados no pedido de patente, foram identificadas duas sequências com motivos correspondentes na base de dados de sequências do Genbank.
O RNA total de Oncoryhnchus mykiss foi isolado com o kit RNAeasy da empresa Qiagen (Valencia, CA, US). Do RNA total, foi isolado RNA poli-A+ (mRNA) com oligo-dT-celulose (Sambrook et al., 1989). O RNA foi submetido a transcrição reversa com o kit Reverse Transcription System da Promega, e o cDNA sintetizado foi clonado no vetor lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene) . O cDNA foi empacotado em DNA plasmidico de acordo com as instruções do fabricante. O banco de cDNA-plasmídeo foi depois utilizado para a clonagem de plasmídeos de expressão.
Exemplo 4: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Para a clonagem das duas sequências para expressão heteróloga em levedura, foram usados os seguintes oligonucleotideos para a reação de PCR:
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35 O produto de PCR foi incubado durante 2 h a 37 °C com as enzimas de restrição HindIII e BamHI. O vetor de expressão de leveduras pYES3 (Invitrogen) foi incubado da mesma forma. A seguir, o produto de PCR com 812 bp ou 905 bp, assim como o vetor, foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA é feita pelo Qiagen Gel purification kit de acordo com as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e a elongase foram ligados. Para isso foi usado o Rapid Ligation Kit da Roche. Os plasmideos resultantes pYES3-0mEL02 e pYES3-0mEL03 foram verificados através de sequenciação e transformados na estirpe INVScl de Saccharomyces (Invitrogen) por eletroporação (1500 V). Como controlo, foi transformado em paralelo o plasmideo pYES3. A seguir, as leveduras foram plaqueadas em meio minimo completo sem triptofano, com 2% de glucose. As células que cresceram em meio sem triptofano contêm o plasmideo pYES3, pYES3-0mEL02 (SEQ ID NO: 51) e pYES3-0mEL03 (SEQ ID NO: 53) correspondente. Após seleção, foram selecionados dois transformantes de cada, para expressão funcional adicional.
Exemplo 5: Clonagem de plasmideos de expressão para expressão especifica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, preparou-se outro vetor de transformação à base de pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante, usando os seguintes pares de primers: PSUN-0mEL02
Forward: 5'-GCGGCCGCataatggcttcaacatggcaa (SEQ ID NO: 175) Reverse: 3'-GCGGCCGCttatgtcttcttgctcttcctgtt (SEQ ID NO: 176) pSUN-0mEL03
Forward: 5'-GCGGCCGCataatggagacttttaat (SEQ ID NO: 177)
Reverse: 3'-GCGGCCGCtcagtcccccctcactttcc (SEQ ID NO: 178)
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35 O produto de PCR foi incubado durante 16 h a 37 °C com a enzima de restrição NotI. O vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, o produto de PCR, assim como o vetor com 7 624 bp, foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA é feita pelo Qiagen Gel purification kit de acordo com as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e o produto de PCR foram ligados. Para isso foi usado o Rapid Ligation Kit da Roche. Os plasmideos resultantes pSUN-0mEL02 e pSUN-0mEL03 foram verificados através de sequenciação. 0 pSUN300 é um derivado do plasmideo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Malaga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). 0 pSUN-USP deriva de pSUN300, em que é inserido um promotor USP no pSUN300, como fragmento EcoRI. 0 sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmideo Ti de A. tumefaciens (sequência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). 0 promotor USP corresponde aos nucleotideos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos standard, usando primers standard T7 comerciais e um primer sintetizado. Sequência de primers: 5'- GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATG AA-3', SEQ ID NO: 174) . 0 fragmento de DNA foi cortado com EcoRI/SalI e introduzido no vetor pSUN300 com a sequência de terminação OCS. 0 plasmideo resultante é o pSUN-USP. 0 constructo foi utilizado para transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça.
Exemplo 6: Extração de lípidos a partir de leveduras e sementes 0 efeito da modificação genética em plantas, fungos, algas, ciliados, ou na produção de um composto desejado (como um ácido gordo), pode ser determinado cultivando o microrganismo modificado ou a planta modificada em condições apropriadas (como as descritas anteriormente) , e testando o meio e/ou componentes celulares para a produção aumentada do produto desejado (isto é, de lipidos ou ácidos gordos). Estas técnicas de análise são conhecidas do perito na especialidade e compreendem espetroscopia, cromatografia em camada fina, métodos colorimétricos de diferentes tipos, métodos enzimáticos e microbiológicos, assim como cromatografia analitica, como cromatografia liquida de alta eficiência (ver, por exemplo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, pág. 89-90 e pág. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" em: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", pág. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., e Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, em: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; capitulo 11, pág. 1-27, VCH: Weinheim; e Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Para além dos métodos anteriormente mencionados, os lipidos de plantas e de material vegetal são extraidos tal como descrito por Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22):12935-12940, e Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145. A análise qualitativa e quantitativa dos lipidos ou ácidos gordos é descrita por Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2);
Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other
Lipids CODEN.
Para além da medição do produto final da fermentação, também é possível analisar outros componentes da via metabólica, os quais são usados para a produção do composto desejado, tal como produtos intermédios e secundários, para determinar a eficiência total da produção do composto. Os métodos de análise compreendem a medição da quantidade de nutrientes no meio (por exemplo, de açúcar, hidratos de carbono, fontes de azoto, fosfato e outros iões), medição da composição de biomassa e do crescimento, análise da produção de metabolitos normais das vias metabólicas, e medição de gases que são produzidos durante a fermentação. Métodos Standard para estas medições são descritos em Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes e P.F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press, pág. 103-129; 131-163 e 165-192 (ISBN: 0199635773) e na literatura aí citada.
Um exemplo é a análise de ácidos gordos (abreviaturas: FAME, metiléster de ácido gordo; GC-MS, cromatografia gás-líquido com espetrometria de massa; TAG, triacilglicerina, TLC, cromatografia de camada fina). A prova inequívoca para a presença de produtos de ácidos gordos pode ser obtida através de análise de organismos recombinantes por métodos standard de análise: GC, GC-MS ou TLC, tal como descrito diversas vezes por Christie e a literatura aí citada (1997, em: Advances on Lipid Methodology, 4a edição: Christie, Oily Press, Dundee, 119- 169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-
Verfahren, Lipide 33:343-353). 0 material a analisar pode ser fragmentado por tratamento por ultra-sons, trituração num moinho de vidro, azoto liquido ou moagem, ou por outros métodos utilizáveis. 0 material tem de ser centrifugado após a fragmentação. 0 sedimento é suspenso em água destilada, aquecido durante 10 min a 100 °C, arrefecido em gelo e novamente centrifugado, seguindo-se extração em ácido sulfúrico 0,5M em metanol com 2% de dimetoxipropano, durante 1 hora, a 90 °C, o que leva à hidrólise dos compostos oleosos e lipidicos, resultando em lipidos transmetilados. Estes metilésteres de ácidos gordos são extraídos em éter de petróleo e a seguir submetidos a uma análise por GC com a utilização de uma coluna capilar (Chrompack, WCOT Fused Sílica, CO-Wax-52 CB, 25 ym, 0,32 mm), a um gradiente de temperaturas entre 170 °C e 240 °C, durante 20 min e 5 min a 240 °C. A identidade do metiléster de ácido gordo tem de ser definida, com a utilização de padrões que podem ser obtidos comercialmente (ou sej a, Sigma) . O material vegetal é a seguir homogeneizado num almofariz, para permitir uma extração.
Depois aquece-se 10 min a 100 °C e após o arrefecimento em gelo, ocorre nova sedimentação. O sedimento celular é hidrolisado com ácido sulfúrico metanólico 1M e dimetoxipropano 2%, durante 1 h a 90 °C, e os lipidos são transmetilados. Os metilésteres de ácidos gordos (FAME) resultantes são extraídos em éter de petróleo. Os FAME extraídos são analisados através de cromatografia gás-líquido com uma coluna capilar (Chrompack, WCOT Fused Sílica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm), e uma temperatura de 170 °C a 240 °C em 20 min, e 5 min a 240 °C. A identidade dos metilésteres de ácidos gordos é determinada através da comparação com os padrões FAME correspondentes (Sigma). A identidade e posição da ligação dupla pode ser novamente analisada através de derivatizações quimicas apropriadas da mistura FAME, por exemplo, para derivados 4,4-dimetoxioxazolina (Christie, 1998), por intermédio de GC-MS.
As leveduras que foram transformadas com os plasmideos pYES3, pYES3-0mEL02 e PYES-0mEL03 no Exemplo 4 foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 10 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHC03, pH 8,0, para remover o resto de meio e ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCL 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2SC>4, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os padrões de ácidos gordos correspondentes (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36 (8) :761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439 (3) :215-218 .
Exemplo 7: Caracterização funcional de 0mEL02 e OmELQ3 0mEL02 não apresenta qualquer atividade elongase, enquanto o 0mEL03 demonstrou atividade significativa com diferentes substratos. A especificidade para o substrato de 0mEL03 pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Figura 2). Os substratos alimentados são encontrados em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. Todas as leveduras transgénicas mostram a sintese de novos ácidos gordos, os produtos da reação 0mEL03. Isto significa que o gene 0mEL03 pode ser expresso de forma funcional. A Figura 2 mostra que o 0mEL03 apresenta uma especificidade para o substrato, que resulta na extensão de ácidos gordos Δ5 e Δ6 com uma ligação ω3, com maior especificidade. Além disso, ácidos gordos ωβ (Cis e C20) também podem ser alongados, com menos especificidade. O ácido estearidónico (Ci8:4 ω3) e o ácido eicosapentaenóico (C20:5 ω3) são os melhores substratos para a 0mEL03 (até 66% de extensão).
Exemplo 8: Reconstituição da síntese de DHA em leveduras A reconstituição da biossintese de DHA (C22:6 ω3) foi realizada partindo de EPA (C20:5 ω3) ou ácido estearidónico (Ci8:4 ω3) , através da co-expressão de 0mElo3 com a Δ4- dessaturase de Euglena gracilis ou a A5-dessaturase de Phaeodactylum tricornutum, e a A4-dessaturase de Euglena gracilis. Para isso, foram ainda construídos os vetores de expressão pYES2-EgD4 e pESCLeu-PtD5. A estirpe de levedura anteriormente referida, a qual já está transformada com o pYES3-OmElo3 (SEQ ID NO: 55), foi ainda transformada com o pYes2-EgD4 ou em simultâneo com pYes2-EgD4 e pESCLeu-PtD5. A seleção das leveduras transformadas é feita em placas de agar e meio mínimo completo com 2% de glicose, mas sem triptofano e uracilo no caso da estirpe pYes3-OmELO/pYes2-EgD4, e sem triptofano, uracilo e leucina no caso da estirpe pYes3-OmELO/pYes2-EgD4+pESCLeu-PtD5. A expressão foi induzida, tal como já explicado, através da adição de 2% (peso/volume) de galactose. As culturas foram incubadas durante mais 120 h a 15 °C. A Figura 3 mostra o perfil de ácidos gordos das leveduras transgénicas, as quais foram alimentadas com 020 = 5 ω3. Nas leveduras controlo (A) , as quais foram transformadas com o vetor pYes3-OmElo3 e o vetor pYes2 vazio, 020 = 5 ω3 foi alongado de forma muito eficiente para 022 = 5 ω3 (65% de extensão). A introdução adicional de EgA4-dessaturase resultou na conversão de 022 = 5 ω3 em 022 = 6 ω3 (DHA) . A composição de ácidos gordos das leveduras transgénicas é apresentada na Figura 5. Após a co-expressão de OmElo3 e EgD4, pode demonstrar-se a presença de 3% de DHA nas leveduras.
Numa outra experiência de co-expressão, foram expressas juntas OmElo3, EgD4 e uma A5-dessaturase de P. tricornutum (PtD5). As leveduras transgénicas foram alimentadas com ácido estearidónico (Cis: 4 ω3) e analisadas (Figura 4). A composição de ácidos gordos destas leveduras é mostrada na Figura 5. Os ácidos gordos Ci8:4 ω3 alimentados foram alongados para C20:4 ω3 (60% de extensão), através da OmElo3. Por fim, observou-se a dessaturação para C20:5 ω3 pelo PtD5. A atividade de PtD5 correspondeu a 15%. O C2o:s ω3 pode ainda ser alongado para C22:5 ω3 pela OmElo3. No fim, o C22:5 ω3 sintetizado foi dessaturado para C22:6 ω3 (DHA). Nestas experiências, obteve-se até 0,7% de DHA.
Destas experiências conclui-se que as sequências OmElo3, EgD4 e PtD5 usadas nesta invenção são apropriadas para a produção de DHA em células eucariontes.
Exemplo 9: Geração de plantas transgénicas a) Geração de plantas de colza transgénicas (modificação de Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)
Para a geração de plantas de colza transgénicas, podem ser usados vetores binários em Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260, ou Escherichia coli (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Para a transformação de plantas de colza (var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemanha), é usada uma diluição 1:50 de uma cultura feita durante a noite de uma colónia de Agrobacterium transformada em meio Murashige-Skoog (Mu-rashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) com 3% de sacarose (meio 3MS). Peciolos ou hipocotiledóneas de plantas de colza recém-germinadas, estéreis (cada cerca de 1 cm2) são incubados numa placa de Petri com uma diluição 1:50 de agrobactérias, durante 5-10 minutos. Segue-se uma co-incubação no escuro durante 3 dias a 25 °C em meio 3MS, com 0,8% de bacto-agar. O cultivo continua, após 3 dias com 16 horas de luz / 8 horas de escuro, e a um ritmo semanal em meio MS com 500 mg/L de Claforan (Cefotaxime-sódio) , 50 mg/L de canamicina, 20 μΜ de benzilaminopurina (BAP) e 1,6 g/L de glucose. Os rebentos em crescimento são transferidos para meio MS com 2% de sacarose, 250 mg/L de claforan e 0,8% de bacto-agar. Caso após 3 semanas não se formem quaisquer raizes, adiciona-se ao meio ácido 2-indolbutírico como hormona de crescimento, para a formação de raízes.
Os rebentos regenerados são mantidos em meio 2MS com canamicina e claforan, após formação de raízes são transferidos para a terra, e após cultivo durante 2 semanas, mudados para uma câmara climática ou estufa, deixados florescer; as sementes maduras são colhidas e analisadas para a expressão de elongase, como por exemplo atividade A5-elongase ou Δβ-elongase ou atividade ω3-dessaturase, por intermédio de análise de lípidos. As linhas com teor elevado de ácidos gordos polinsaturados C20 e C22 podem assim ser identificadas. b) Produção de plantas de linhaça transgénicas A produção de plantas de linhaça transgénicas pode, por exemplo, ser obtida de acordo com o método de Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465, por intermédio de bombardeamento de partículas. Normalmente, para a transformação de linhaça, é usada uma transformação por agrobactérias, por exemplo, de acordo com Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285.
Exemplo_10 :_Clonagem de genes A5-elongase de
Thraustochytrium aureum ATCC34304 e Thraustochytrium ssp
Através de comparação das diferentes sequências proteicas de elongase encontradas neste pedido de patente, puderam ser definidas áreas de ácidos nucleicos conservadas (Histidin-box: His-Val-X-His-His; Tyrosin-box: Met-Tyr-X-Tyr-Tyr). Com ajuda destas sequências, pesquisou-se uma base de dados EST de T. aureum ATCC34304 e Thraustochytrium ssp., para outras A5-elongases. Encontraram-se as seguintes sequências novas:
0 RNA total de T. aureum ATCC34304 e Thraustochytrium ssp. foi isolado com ajuda do kit RNAeasy da empresa Qiagen (Valencia, CA, US) . 0 mRNA foi isolado a partir do RNA total, através do sistema de isolamento PolyATract (Promega). 0 mRNA foi submetido a transcrição reversa com o Marathon cDNA Amplification kit (BD Biosciences), e ligado a adaptadores seguindo as instruções do fabricante. 0 banco de cDNA foi depois utilizado para o PCR, para clonagem de plasmideos de expressão, por intermédio de 5'- e 3'-RACE (extremidades de cDNA de amplificação rápida).
Exemplo 11: Clonagem de plasmideos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Para a clonagem da sequência para expressão heteróloga em leveduras, foram utilizados os seguintes oligonucleotideos para a reação de PCR:
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL pfu-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35
O produto de PCR BioTaurELOl (ver SEQ ID NO: 65) e TL16y2 (ver SEQ ID NO: 83) foi incubado durante 30 min a 21 °C com o vetor de expressão em leveduras pYES2.1-TOPO (Invitrogen) , de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR é ligado ao vetor por intermédio de um overhang T e atividade de uma topoisomerase (Invitrogen). Depois da incubação ocorre a transformação de células de E. coli DH5a. Os clones correspondentes foram identificados por PCR, o DNA plasmideo foi isolado com o Qiagen DNAeasy kit e verificado através de sequenciação. A sequência correta foi depois transformada na estirpe de Saccharomyces INVScl (Invitrogen) através de eletroporação (1500 V). O vetor vazio pYES2.1 foi transformado em paralelo como controlo. A seguir, as leveduras foram plaqueadas em meio mínimo completo sem uracilo, com 2% de glucose. As células que cresceram sem uracilo no meio contêm o plasmídeo pYES2.1, pYES2.1-BioTaurELOl e pYES2.1-TL16y2 correspondente. Após a seleção, foram selecionados dois transformantes de cada para expressão funcional adicional.
Exemplo 12: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão específica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, foi preparado um outro vetor de transformação à base do pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 3' e 5' da sequência codificante, usando os seguintes pares de primers: PSUN-BioTaurELOl
Forward: 5'-GCGGCCGCataatgacgagcaacatgagc (SEQ ID NO: 166)
Reverse: 3'-GCGGCCGCttaggccgacttggccttggg (SEQ ID NO: 167) PSUN-TL16y2
Forward: 5'-GCGGCCGCACCatggacgtcgtcgagcagcaatg (SEQ ID NO: 168)
Reverse: 5'-GCGGCCGCttagatggtcttctgcttcttgggcgcc (SEQ ID NO: 169)
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 yL cada primer (10 pmol/yL) 0,50 yL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35
Os produtos de PCR foram incubados durante 16 horas a 37 °C com a enzima de restrição Notl. O vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, o produto de PCR assim como o vetor com 7 624 bp foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA é feita com o Qiagen Gel Purification Kit, segundo as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e o produto de PCR foram ligados. Para tal, utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. Os plasmideos resultantes pSUN-BioTaurELOl e pSUN-TL16y2 foram verificados através de sequenciação. O pSUN300 é um derivado do plasmideo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). 0 pSUN-USP é derivado do pSUN300, sendo inserido um promotor USP neste último como fragmento EcoRI. O sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmideo Ti de A. tumefaciens (sequência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium
tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). 0 promotor USP corresponde aos nucleotideos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos standard, usando primers standard T7 comerciais (Stratagene) e um primer sintetizado. Sequência do primer: 5' - GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGA A- 3', SEQ ID NO: 165). 0 fragmento de PCR foi cortado com EcoRI/Sal e introduzido no vetor pSUN300 com a sequência de terminação OCS. 0 resultado foi o plasmideo com a designação pSUN-USP. 0 constructo foi usado para transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça. A extração de lípidos a partir de leveduras e sementes é feita de forma idêntica ao Exemplo 6.
Exemplo 13: Caracterização funcional de BioTaurELOl e TL16rL2 A especificidade do substrato de BioTAurELOl pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Figura 6). A Figura 6 mostra as experiências de alimentação para o cálculo da funcionalidade e especificidade do substrato com estirpes de levedura, as quais contêm o vetor pYES2.1 (Controlo = Control) ou o vetor pYes2.1-BioTau-rELOl (= BioTaur) com a A5-elongase. Adicionou-se 200 μΜ de ácido γ-linolénico e ácido eicosapentaenóico ao meio de incubação de leveduras a ambas as preparações e incubou-se durante 24 h. Após extração dos ácidos gordos das leveduras, estes foram transmetilados e eparados por cromatografia gasosa. Os produtos de extensão resultantes dos dois ácidos gordos alimentados são marcados através de setas. É demonstrada a presença dos substratos alimentados em grandes quantidades, em todas as leveduras transgénicas. Todas as leveduras transgénicas mostram a síntese de novos ácidos gordos, os produtos da reação BioTaurELOl. Isto significa que o gene BioTaurELOl pode ser expresso de forma funcional. A Figura 6 mostra que o BioTaurELOl apresenta uma especificidade para o substrato, a qual leva a uma extensão de ácidos gordos Δ5 e Δ6 com uma ligação dupla ω3, com maior especificidade. Além disso, os ácidos gordos ωβ (Cis e C20) também puderam ser alongados. São convertidos ácido γ-linolénico (Cie: 3 ωβ) com 65,28%, ácido estearidónico (Ci8:4 ω3) com 65, 66%, ácido eicosapentaenóico (C20:5 ω3) com 22,01% de conversão. As especificidades para o substrato das diferentes experiências de alimentação são apresentadas na Tabela 3 (ver no fim da Descrição). A conversão de GLA na alimentação de GLA e EPA correspondeu a 65,28%. A taxa de conversão de EPA para uma alimentação igual de GLA e EPA correspondeu a 9,99%. No caso em que foi alimentado apenas EPA, a taxa de conversão de EPA correspondeu a 22,01%. Na alimentação, o ácido araquidónico (= ARA) também foi convertido. A taxa de conversão correspondeu a 14,47%. O ácido estearidónico (= SDA) também foi convertido. Neste caso, a taxa de conversão correspondeu a 65,66%. A funcionalidade e especificidade para o substrato de TL16y2 pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos. A Tabela 4 mostra as experiências de alimentação. Os ensaios de alimentação foram realizados de forma idêntica ao descrito para BioTaurELOl. A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostraram a sintese de novos ácidos gordos, os produtos da reação TL16y2 (Figura 11) . Isto significa que o gene TL16y2 pode ser expresso de forma funcional.
Tabela 4: Expressão de TL16y2 em leveduras
Os resultados apresentados na Tabela 4 mostram que em comparação com o controlo, se obtêm as seguintes percentagens de conversão com TL16y2: a) % conversão EPA (250 μΜ) : 8%, b) % conversão EPA (50 μΜ) : 41%, c) % conversão ARA: 20,3%, d) % conversão SDA: 79,4% e e) % conversão de GLA: 74,9%. TL16y2 mostra assim atividade Δ5-, Δ6- e Δδ-elongase. Aqui, a atividade é mais elevada para os ácidos gordos Cie com ligação dupla Δ6. Dependendo da concentração de ácidos gordos alimentados, os ácidos gordos C20 com uma ligação dupla Δ5 ou Δ8 são alongados.
Exemplo 14: Clonagem de genes de Ostreococcus tauri
Através da procura de áreas conservadas nas sequências proteicas, puderam ser identificadas duas sequências com os motivos correspondentes numa base de dados de sequências (sequências genómicas) de Ostreococcus tauri, com auxilio dos genes de elongase com atividade A5-elongase ou Δ6-elongase introduzidos no pedido de patente.
Trata-se aqui das sequências seguintes:
0 OtELOl apresenta a maior semelhança com uma elongase de Danio rerio (GenBank AAN77156; cerca de 26% de identidade), enquanto 0tEL02 apresenta a maior semelhança com a Physcomitrella Elo (PSE) [cerca de 36% de identidade] (os alinhamentos foram feitos com o algoritmo tBLASTn (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403 - 410). A clonagem foi feita da seguinte forma: 40 mL de uma cultura de Ostreococcus tauri na fase estacionária foram centrifugados e suspensos em 100 pL de água bidestilada, e armazenados a -20 °C. Os DNAs genómicos foram amplificados por PCR. Os pares de
primers correspondentes foram selecionados de tal forma que continham a sequência consenso de levedura para translação de alta eficiência (Kozac, Cell 1986, 44: 283-292), junto ao codão de iniciação. A amplificação do DNA OtElo foi feita, respetivamente, com 1 pL de células descongeladas, 200 μΜ dNTPs, 2,5 U de Taq-Polymerase e 100 pmol de cada um dos primers, num volume total de 50 pL. As condições usadas no PCR foram as seguintes: primeira desnaturação a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos, e um último passo de extensão a 72 °C durante 10 minutos.
Exemplo 15: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Para a caracterização da função das elongases de Ostreococcus tauri, as grelhas de leitura aberta de cada um dos DNAs foram clonadas a jusante do promotor GAL1 induzivel por galactose de pYES2.l/V5-His-TOPO (Invitrogen) , tendo-se obtido pOTEl e pOTE2. A estirpe de Saccharomyces cerevisiae 334 foi transformada com o vetor pOTEl ou pOTE2 através de eletroporação. Como controlo, foi usada uma levedura transformada com o vetor vazio pYES2. A seleção das leveduras transformantes foi feita em placas de agar e meio minimo completo (CMdum) com 2% de glucose, mas sem uracilo. Após seleção, foram escolhidos três transformantes de cada, para expressão funcional adicional. A seguir, para a expressão das elongases Ot, pré-culturas com 5 mL de meio liquido CMdum cada, com 2% (peso/volume) de rafinose, mas sem uracilo, foram inoculadas com os transformantes selecionados e incubou-se durante 2 dias a 30 °C, 200 rpm. 5 mL de meio liquido CMdum (sem uracilo) com 2% rafinose e 300 μΜ de diferentes ácidos gordos foram depois inoculados com as pré-culturas, a uma ΟΌβοο de 0,05. A expressão foi induzida através da adição de 2% (peso/volume) de galactose. As culturas foram incubadas durante mais 96 h a 20 °C.
Exemplo 16: Clonagem de plasmideos de expressão para expressão especifica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, foi gerado um vetor de transformação à base de pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante, por intermédio de PCR. As sequências de primers correspondentes foram derivadas das zonas 5' e 3' de OtElol e OtElo2.
Composição da reação de PCR (50 yL): 5.00 yL cDNA modelo 5.00 yL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 yL dNTP 2 mM 1,25 yL cada primer (10 pmol/yL) 0,50 yL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35
Os produtos de PCR foram incubados durante 16 horas a 37 °C com a enzima de restrição NotI. 0 vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, os produtos de PCR, assim como o vetor, foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA foi feita por intermédio do Qiagen Gel Purification Kit, de acordo com as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e os produtos de PCR foram ligados. Para tal utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. 0 plasmideo resultante pSUN-OtELOl e pSUN-0tEL02 foi verificado por sequenciação. 0 pSUN300 é um derivado do plasmideo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). 0 pSUN-USP deriva de pSUN300, em que é inserido um promotor USP no pSUN300, como fragmento EcoRI. 0 sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmideo Ti de A. tumefaciens (sequência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982) . 0 promotor USP corresponde aos nucleotideos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos Standard, usando primers standard T7 comerciais e um primer sintetizado. Sequência de primers: 5'- GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATG AA-3', SEQ ID NO: 164) . O fragmento de PCR foi cortado com EcoRI/Sall e introduzido no vetor pSUN300 com uma sequência de terminação OCS. Obteve-se o plasmideo com a designação pSUN-USP. 0 constructo foi utilizado para a transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça.
Exemplo 17: Expressão de OtELOl e 0tEL02 em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmideos pYES3, pYES3-0tEL01 e pYES3-0tEL02 como descrito no Exemplo 15, foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 15 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCCL, pH 8,0, para remover o resto de meio e ácidos gordos. Os metilésteres de
ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE). Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCb 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2S04, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os padrões de ácidos gordos correspondentes (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental
Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 18: Caracterização funcional de OtELOl e OtELQ2 A especificidade para o substrato do OtElol pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Tabela 5). A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a síntese de novos ácidos gordos, os produtos da reação OtElol. Isto significa que o gene OtElol pode ser expresso de forma funcional. A Tabela 4 mostra que o OtElol tem uma estreita especificidade para o substrato. O OtElol foi apenas capaz de alongar os ácidos gordos C20 ácido eicosapentaenóico (Figura 7) e ácido araquidónico (Figura 8), preferencialmente ácido eicosapentaenóico co3-dessaturado.
Tabela 5:
A Tabela 5 mostra a especificidade para o substrato da elongase OtElol para ácidos gordos polinsaturados C20, com uma ligação dupla na posição Δ5, em comparação com diversos ácidos gordos.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pOTEl foram cultivadas em meio minimo na presença dos ácidos gordos referidos. A síntese de metiléster de ácidos gordos ocorre através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. Cada valor refere-se à média (n=3) ± desvio padrão. A especificidade para o substrato do 0tElo2 (SEQ ID NO: 81) pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Tabela 6) . A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. A leveduras transgénicas mostram a síntese de novos ácidos gordos, os produtos da reação 0tElo2. Isto significa que o gene 0tElo2 pode ser expresso de forma funcional.
Tabela 6
A Tabela 6 mostra a especificidade para o substrato da elongase 0tElo2 para diferentes ácidos gordos.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pOTE2 foram cultivadas em meio minimo na presença dos ácidos gordos referidos. A síntese de metiléster de ácidos gordos é feita através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. Cada valor refere-se à média (n=3) ± desvio padrão. A atividade enzimática que é dada na Tabela 6 mostra claramente que a 0TEL02 é uma A6-elongase.
Exemplo 19: Clonagem de genes de Thalassiosira pseudonana
Através da procura de áreas conservadas nas sequências proteicas, puderam ser identificadas duas sequências com os motivos correspondentes numa base de dados de sequências (sequências qenómicas) de Thalassiosira pseudonana, com auxilio dos qenes de elonqase com atividade A5-elonqase ou Δβ-elonqase introduzidos no pedido de patente. Trata-se aqui das sequências seguintes:
Uma cultura com 2 L de T. pseudonana foi cultivada em meio f/2 (Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Em Culture of Marine Invertebrate Animals (Eds. Smith, W.L. and Chanley, M.H.), Plenum Press, New York, pág. 29-60), durante 14 dias com uma intensidade luminosa de 80 E/cm2. Após centrifugação das células, o RNA foi isolado por intermédio do RNAeasy Kit da Qiagen (Valencia, CA, US) , segundo as instruções do fabricante. O mRNA foi submetido a transcrição reversa com o Marathon cDNA Amplification Kit (BD Biosciences) e ligado a adaptadores de acordo com as instruções do fabricante. O banco de cDNA foi depois usado para o PCR, para clonagem do plasmideo de expressão, por intermédio de RACE 5' e 3' (amplificação rápida de extremidades de cDNA).
Exemplo 20: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Os pares de primers correspondentes foram selecionados de tal forma que continham a sequência consenso de levedura para translação de alta eficiência (Kozac, Cell 1986, 44: 283-292), junto ao codão de iniciação. A amplificação dos DNAs TpElo foi feita, respetivamente, com 1 pL de cDNA, 200 μΜ dNTPs, 2,5 U de Advantage-Polymerase e 100 pmol de cada um dos primers, num volume total de 50 pL. As condições usadas no PCR foram as seguintes: primeira desnaturação a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos, e um último passo de extensão a 72 °C durante 10 minutos.
Para a clonagem das sequências para expressão heteróloga em leveduras, foram usados os seguintes oligonucleotideos para a reação de PCR:
O produto de PCR foi incubado com o vetor de expressão em leveduras pYES2.1-TOPO (Invitrogen), durante 30 min, a 21 °C, de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR é ligado ao vetor através de um overhang T e atividade de uma topoisomerase (Invitrogen). Depois da incubação, ocorre a transformação de células de E. coli DH5oí. Os clones correspondentes foram identificados por PCR, o DNA plasmideo foi isolado com o Qiagen DNAeasy kit e verificado através de sequenciação. A sequência correta foi depois transformada na estirpe de Saccharomyces INVScl (Invitrogen) através de eletroporação (1500 V). O vetor vazio pYES2.1 foi transformado em paralelo como controlo. A seguir, as leveduras foram plaqueadas em meio minimo completo sem uracilo, com 2% de glucose. As células que cresceram sem uracilo no meio contêm o plasmideo pYES2.1, pYES2.1-TpELOl, pYES2.1-TpEL02 e pYES2.l-TpEL03 correspondente. Após a seleção, foram selecionados dois transformantes de cada para expressão funcional adicional.
Exemplo 21: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão específica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, preparou-se outro vetor de transformação à base de pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante, usando os seguintes pares de primers: PSUN-TPELOl
Forward: 5'-GCGGCCGCaccatgtgctcaccaccgccgtc (SEQ ID NO: 152)
Reverse: 3'-GCGGCCGCctacatggcaccagtaac (SEQ ID NO: 153) PSUN-TPEL02
Forward: 5'-GCGGCCGCaccatgtgctcatcaccgccgtc (SEQ ID NO: 154)
Reverse: 3'-GCGGCCGCctacatggcaccagtaac (SEQ ID NO: 155) PSUN-TPEL03
Forward: 5'-GCGGCCGCaccatggacgcctacaacgctgc (SEQ ID NO: 156)
Reverse: 3'-GCGGCCGCctaagcactcttcttcttt (SEQ ID NO: 157)
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35 O produto de PCR foi incubado com a enzima de restrição Notl durante 16 h a 37 °C. O vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, o produto de PCR assim como o vetor com 7 624 bp foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA é feita com o Qiagen Gel Purification Kit, segundo as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e o produto de PCR foram ligados. Para tal, utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. Os plasmideos resultantes pSUN-TPELOl, pSUN-TPEL02 e pSUN-TPEL03 foram verificados através de sequenciação. 0 pSUN300 é um derivado do plasmídeo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). 0 pSUN-USP é derivado do pSUN300, tendo sido inserido um promotor USP neste último como fragmento EcoRI. 0 sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmideo Ti de A. tumefaciens (seguência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van
Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). 0 promotor USP corresponde aos nucleotideos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos standard, usando primers standard T7 comerciais (Stratagene) e um primer sintetizado. Sequência do primer: 5' - GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATG AA-3'; SEQ ID NO: 151) . 0 fragmento de PCR foi cortado com EcoRI/SalI, e introduzido no vetor pSUN300 com a sequência de terminação OCS. 0 resultado foi um plasmideo com a designação pSUN-USP. 0 constructo foi usado para transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça. A extração de lipidos a partir das leveduras é feita de forma idêntica ao explicado no Exemplo 6.
Exemplo 22: Expressão de TpELOl, TpEL02 e TpEL03 em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmídeos pYES2, pYES2-TpELOl, pYES2-TpEL02 e pYES2-TpEL03 tal como no Exemplo 4 foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 5 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCCç, pH 8,0, para remover o resto de meio e ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHC03 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2SC>4, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os padrões de ácidos gordos correspondentes (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental
Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):2 93-2 98 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 23: Caracterização funcional de TpELOl e TpEL03 A especificidade para o substrato de TpElol pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Figura 9) . A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a sintese de novos ácidos gordos, os produtos da reação TpElol. Isto significa que o gene TpElol pode ser expresso de forma funcional. A Tabela 7 mostra que o TpElol tem uma estreita especificidade para o substrato. 0 TpElol foi apenas capaz de alongar os ácidos gordos C20 ácido eicosapentaenóico e ácido araquidónico, preferencialmente ácido eicosapentaenóico m3-dessaturado.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pYES2-TpELOl foram cultivadas em meio minimo, na presença dos ácidos gordos referidos. A sintese dos metilésteres de ácidos gordos é feita através de metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC.
Tabela 7: Expressão de TpELOl em leveduras. Nas colunas 1 e 3 são apresentadas as reações controlo para as colunas 2 (alimentado 250 mM C20:4 Δ5,8,11,14) e 4 (alimentado 250 mM C20:5 Δ5,8,11,14,17 .
A especificidade para o substrato do TpElo3 pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Tabela 10) . A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a sintese de novos ácidos gordos, os produtos da reação TpElo3. Isto significa que o gene TpElo3 pode ser expresso de forma funcional. A Tabela 8 mostra que o TpElo3 tem uma estreita especificidade para o substrato. O TpElo3 foi apenas capaz de alongar os ácidos gordos Cis ácido γ-linolénico e ácido estearidónico (Figura 8), preferencialmente ácido estearidónico co3-dessaturado.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pYES2-TpEL03 foram cultivadas em meio minimo na presença dos ácidos gordos referidos. A sintese de metiléster de ácidos gordos ocorre através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. Cada valor refere-se à média (n=3) ± desvio padrão.
Tabela 8: Expressão de TpEL03 em leveduras. A coluna 1 mostra o perfil de ácidos gordos das leveduras sem alimentação. A coluna 2 mostra a reação controlo. Nas colunas 3 a 6 foram alimentados ácido γ-linolénico, ácido estearidónico, ácido araquidónico e ácido eicosapentaenóico (250 μΜ de cada ácido gordo).
Exemplo 24: Clonagem de um plasmídeo de expressão para expressão heteróloga de Pi-omega3Des em leveduras 0 clone Pi-omega3Des foi clonado para a expressão heteróloga em leveduras, através de PCR, com os primers específicos Piomega3-Des correspondentes, no vetor de expressão em leveduras pYES3. Para isso, foi amplificado apenas a grelha de leitura aberta do gene que codifica para a proteína Pi-omega3Des, no qual se introduziu dois locais de corte para a clonagem do vetor de expressão pYES3:
Forward Primer: 5'-TAAGCTTACATGGCGACGAAGGAGG (SEQ ID NO: 149)
Reverse Primer: 5'-TGGATCCACTTACGTGGACTTGGT (SEQ ID NO: 150)
Composição da reação de PCR (50 pL): 5,00 pL cDNA modelo 5.00 yL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 yL dNTP 2 mM 1,25 yL cada primer (10 pmol/yL do primer 5'-ATG e do primer 3'-stop) 0,50 yL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35 O produto de PCR foi incubado com as enzimas de restrição Hindu e BamHI durante 2 h a 37 °C. O vetor de expressão em leveduras pYES3 (Invitrogen) foi incubado da mesma forma. A seguir, o produto de PCR com 1104 bp, assim como o vetor, foram separados por eletroforese em gel de agarose, e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA é feita com o Qiagen Gel Purification Kit, segundo as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e o cDNA da dessaturase foram ligados. Para tal, utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. O plasmideo resultante pYES3-Pi-omega3Des foi verificado através de sequenciação e transformado em Saccharomyces, estirpe INVScl (Invitrogen) através de eletroporação (1500 V) . Como controlo, o pYES3 foi transformado em paralelo. A seguir, as leveduras foram plaqueadas em meio minimo completo sem triptofano, com 2% de glucose. As células que cresceram sem triptofano no meio contêm os plasmideos correspondentes pYES3 e pYES3-Pi-omega3Des. Após seleção, escolheram-se 2 transformantes de cada para expressão funcional adicional.
Exemplo 25: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão especifica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, preparou-se outro vetor de transformação à base de pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante, usando os seguintes pares de primers: PSUN-Pi-omega3Des
Reverse: 3'-GCGGCCGCTTACGTGGACTTGGTC (SEQ ID NO: 147) Forward: 5'-GCGGCCGCatGGCGACGAAGGAGG (SEQ ID NO: 148)
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35 O produto de PCR foi incubado com a enzima de restrição Notl durante 4 h a 37 °C. O vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, o produto de PCR com 7 624 bp, assim como o vetor foram separados por eletroforese em gel de agarose, e os
fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA é feita com o Qiagen Gel Purification Kit, segundo as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e o produto de PCR foram ligados. Para tal, utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. 0 plasmideo resultante pSUN-Pi-omega3Des foi verificado através de sequenciação.
Exemplo 26: Expressão de Pi-omega3Des em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmideos pYES3 ou pYES3-Pi-omega3Des tal como no Exemplo 24 foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 5 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCCb, pH 8,0, para remover o resto de meio e ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCb 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2S04, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os padrões de ácidos gordos correspondentes (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36 (8) :761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al. , 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 27: Caracterização funcional de Pi-omega3Des A especificidade para o substrato do Pi-omega3Des pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Figuras 12 a 18). A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a síntese de novos ácidos gordos, os produtos da reação Pi-omega3Des. Isto significa que o gene Pi-omega3Des pode ser expresso de forma funcional. A Figura 12 mostra a dessaturação de ácido linoleico (ácido gordo Cis-.2 ωβ) para ácido α-linolénico (ácido gordo Ci8:3 ω3) pela Pi-omega3Des. A síntese de metilésteres de ácidos gordos é feita através da metanólise ácida de células intactas, as quais foram transformadas com o vetor vazio pYES2 (Figura 12A) ou com o vetor pYES3-Pi-omega3Des (Figura 12B) . As leveduras foram cultivadas em meio mínimo na presença de ácido gordo Ci8:2A9,12 (300 μΜ) . A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC.
Na Figura 13 é mostrada a dessaturação de ácido γ-linolénico (ácido gordo Ci8:3 ω6) em ácido estearidónico (ácido gordo Ci8:4 ω3) pela Pi-omega3Des. A sintese de metilésteres de ácido gordo ocorre através de metanólise ácida de células intactas, as quais foram transformadas com o vetor vazio pYES2 (Figura 13A) ou com o vetor pYES3-Pi-omega3Des (Figura 13B) . As leveduras foram cultivadas em meio minimo na presença de ácido gordo Ci8:3A6,9'12 (300 μΜ) . A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC.
Na Figura 14 é mostrada a dessaturação de ácido gordo C20:2 ωβ em ácido gordo C20:3 ω3 pela Pi-omega3Des. A sintese de metilésteres de ácido gordo ocorre através de metanólise ácida de células intactas, as quais foram transformadas com o vetor vazio pYES2 (Figura 14A) ou com o vetor pYES3-Pi-omega3Des (Figura 14B) . As leveduras foram cultivadas em meio minimo na presença de ácido gordo C20:2A11,14 (300 μΜ) . A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC.
Na Figura 15 é mostrada a dessaturação de ácido gordo C20:3 ωβ em ácido gordo C20:4 ω3 pela Pi-omega3Des. A sintese de metilésteres de ácido gordo ocorre através de metanólise ácida de células intactas, as quais foram transformadas com o vetor vazio pYES2 (Figura 15A) ou com o vetor pYES3-Pi-omega3Des (Figura 15B) . As leveduras foram cultivadas em meio minimo na presença de ácido gordo Ο20:3δ8,11'14 (300 μΜ) . A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC.
Na Figura 16 é mostrada a dessaturação de ácido araquidónico (ácido gordo C20:4 ωβ) em ácido eicosapentaenóico (ácido gordo C20:5 ω3) pela Pi-omega3Des. A síntese de metilésteres de ácido gordo ocorre através de metanólise ácida de células intactas, as quais foram transformadas com o vetor vazio pYES2 (Figura 16A) ou com o vetor pYES3-Pi-omega3Des (Figura 16B) . As leveduras foram cultivadas em meio mínimo na presença de ácido gordo C20:4a5, 8'11'14 (300 μΜ) . A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC.
Na Figura 17 é mostrada a dessaturação de ácido docosatetraenóico (ácido gordo C22:4 ωβ) em ácido docosapentaenóico (ácido gordo C22:5 ω3) pela Pi-omega3Des. A síntese de metilésteres de ácido gordo ocorre através de metanólise ácida de células intactas, as quais foram transformadas com o vetor vazio pYES2 (Figura 17A) ou com o vetor pYES3-Pi-omega3Des (Figura 17B) . As leveduras foram cultivadas em meio mínimo na presença de ácido gordo C22:4Δ7,10,13,16 (300 μΜ) . A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. A especificidade para o substrato de Pi-omega3Des em relação a diferentes ácidos gordos é apresentada na Figura 18. As leveduras que foram transformadas com o vetor pYES3-Pi-omega3Des foram cultivadas em meio mínimo na presença dos ácidos gordos referidos. A síntese dos metilésteres de ácidos gordos ocorre através de metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. Cada valor dá uma média de três medições. As taxas de conversão (% de dessaturação) foram calculadas através da fórmula: [produto]/[produto]+[substrato]xlOO.
Tal como descrito no Exemplo 9, o Pi-omega3Des também pode ser usado para a geração de plantas transgénicas. A extração de lípidos pode ser feita a partir das sementes destas plantas, tal como descrito no Exemplo 6.
Exemplo 28: Clonagem de dessaturases de Ostreococcus tauri
Através da pesquisa de áreas conservadas nas sequências proteicas com auxilio de motivos conservados (Hix-Box, Domerque et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113), puderam ser identificadas cinco sequências com os motivos correspondentes numa base de dados de sequências (sequências genómicas) de Ostreococcus tauri. Trata-se aqui das sequências seguintes:
Os alinhamentos para a determinação da homologia dos genes individuais foram feitos com o algoritmo tBLASTn (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403 - 410). A clonagem foi feita do seguinte modo:
40 mL de uma cultura de Ostreococcus tauri na fase estacionária foram centrifugados e suspensos em 100 pL de água bidestilada, e armazenados a -20 °C. Os seus DNAs genómicos foram amplificados por PCR. Os pares de primers correspondentes foram selecionados de tal forma que continham a sequência consenso de levedura para translação de alta eficiência (Kozac, Cell 1986, 44: 283-292), junto ao codão de iniciação. A amplificação do DNA OtDes foi feita, respetivamente, com 1 pL de células descongeladas, 200 pM dNTPs, 2,5 U de Taq-Polymerase e 100 pmol de cada um dos primers, num volume total de 50 pL. As condições usadas no PCR foram as seguintes: primeira desnaturação a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos, e um último passo de extensão a 72 °C durante 10 minutos.
Foram usados os seguintes primers para o PCR:
OtDesô.l Forward: 5'ggtaccacataatgtgcgtggagacggaaaataacg3' (SEQ ID NO: 145)
OtDesô.l Reverse: 5'ctcgagttacgccgtctttccggagtgttggcc3' (SEQ ID NO: 146)
Exemplo 29: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Para a caracterização da função da dessaturase OtDesô.l (= Δβ-dessaturase) de Ostreococcus tauri, a grelha de leitura aberta do DNA foi clonada a jusante do promotor GAL1 induzivel por galactose de pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), tendo-se obtido o clone pYES2.l-OtDes6.1 correspondente. De forma idêntica, podem ser clonados outros genes de dessaturase de Ostreococcus tauri. A estirpe 334 de Saccharomyces cerevisiae foi transformada por eletroporação (1500 V) com o vetor pYES2.l-OtDes6.1. Como controlo foi usada uma levedura transformada com o vetor vazio pYES2. A seleção das leveduras transformadas foi feita em placas de agar com meio minimo completo (CMdum), com 2% glucose, mas sem uracilo. Após a seleção, foram escolhidos três transformantes para expressão funcional adicional.
Para a expressão da OtDesô.l dessaturase, pré-culturas com 5 mL de meio líquido CMdum cada, com 2% (peso/volume) de rafinose, mas sem uracilo, foram inoculadas com os transformantes selecionados e incubou-se durante 2 dias a 30 °C, 200 rpm. 5 mL de meio líquido CMdum (sem uracilo) com 2% rafinose e 300 μΜ de diferentes ácidos gordos foram depois inoculados com as pré-culturas, a uma Οϋδοο de 0,05. A expressão foi induzida através da adição de 2% (peso/volume) de galactose. As culturas foram incubadas durante mais 96 h a 20 °C.
Exemplo 30: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão específica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, preparou-se outro vetor de transformação à base de pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante por PCR. As sequências de primers correspondentes são derivadas das áreas 5' e 3' das dessaturases.
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35
Os produtos de PCR foram incubados durante 16 horas a 37 °C com a enzima de restrição NotI. 0 vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, os produtos de PCR, assim como o vetor, foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA foi feita por intermédio do Qiagen Gel Purification Kit, de acordo com as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e os produtos de PCR foram ligados. Para tal utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. Os plasmideos resultantes foram verificados por sequenciação. 0 pSUN300 é um derivado do plasmídeo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). 0 pSUN-USP deriva de pSUN300, em que é inserido um promotor USP no pSUN300, como fragmento EcoRI. 0 sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmideo Ti de A. tumefaciens (sequência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982) . 0 promotor USP corresponde aos nucleotideos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos standard, usando primers standard T7 comerciais e urn primer sintetizado. Sequência de primers: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATG AA-3', SEQ ID NO: 144). O fragmento de PCR foi cortado com EcoRI/Sall e introduzido no vetor pSUN300 com uma sequência de terminação OCS. Obteve-se o plasmideo com a designação pSUN-USP. 0 constructo foi utilizado para a transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça.
Exemplo 31: Expressão de QtDes6.1 em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmídeos pYES2 e pYES2-OtDes6.2 tal como descrito no Exemplo 4, foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 5 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCCb, pH 8,0, para remover o resto de meio e ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 ha 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCb 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2S04, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os respetivos padrões de ácidos gordos (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766,-Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(3 60):1581-1585, Sperling et al. , 2001, Arch. Biochem.
Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS
Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 32: Caracterização funcional de dessaturases de
Ostreococcus A especificidade para o substrato das dessaturases pode ser determinado após expressão em leveduras (ver Exemplos clonagem de genes de dessaturases, expressão em leveduras), através da alimentação em diferentes leveduras. Descrições para a determinação de atividades individuais podem ser encontradas em WO 93/11245 para A15-dessaturases, WO 94/11516 para A12-dessaturases, WO 93/06712, US 5,614,393, US 5614393, WO 96/21022, WO 0021557 e WO 99/27111 para A6-dessaturases, Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 para A4-dessaturases, Hong et al. 2002, Lipids 37,863-868 para A5-dessaturases. A Tabela 9 mostra a especificidade para o substrato da dessaturase OtDes6.1 em relação a diferentes ácidos gordos. A especificidade para o substrato do OtDesô.l pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos. A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a síntese de novos ácidos gordos, os produtos da reação OtDes6.2 (Figura 20). Isto significa que o gene OtDesô.l pode ser expresso de forma funcional.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pYES2-OtDesô.l foram cultivadas em meio mínimo na presença dos ácidos gordos referidos. A síntese de metiléster de ácidos gordos ocorre através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. Cada valor refere-se à média (n=3) ± desvio padrão. A atividade corresponde à taxa de conversão calculadas através da fórmula: [substrato/([substrato]+[produto])xlOO]. A Tabela 9 mostra que o OtDesô.l tem uma especificidade para o substrato para ácido linoleico e ácido linolénico (Ci8:2 e Ci8:3) , uma vez que a atividade foi máxima quando se usaram estes ácidos gordos. Pelo contrário, a atividade para o ácido oleico (Cia = 1) e ácido palmitoleico (Cie = i) é substancialmente menor. A conversão preferida de ácido linoleico e ácido linolénico mostra como estas dessaturases se adequam para a produção de ácidos gordos polinsaturados.
A Figura 20 mostra a conversão de ácido linoleico por OtDesô.l. A análise dos FAMEs é feita por cromatografia gasosa. O substrato alimentado (Ci8:2) é convertido em γ-Ci8:3 · Tanto reagentes como o produto resultante estão marcados com setas.
Na Figura 21 é apresentada a conversão de ácido linoleico (= LA) e ácido cx-linolénico (= ALA) na presença de OtDesô.l, para ácido γ-linolénico (= GLA), ou ácido estearidónico (= STA) (Figura 21A e C) . Além disso, a Figura 21 mostra a conversão de ácido linoleico (= LA) e ácido α-linolénico (= ALA) na presença da A6-dessaturase OtDesô.l juntamente com a A6-elongase PSE1 de
Physcomitrella patens (Zank et al. 2002, Plant J. 31:255- 2 68) e com a A5-dessaturase PtD5 de Phaeodactylum tricornutum (Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113), para ácido dihomo-y-linoldnico (= DHGLA) e ácido araquidónico (= ARA, Figura 21B) ou para ácido dihomoestearidónico (= DHSTA), ou ácido eicosapentaenóico (= EPA, Figura 21D) . A Figura 21 mostra claramente que os produtos de reação GLA e STA da A6-dessaturase OtDes6.1 na presença da A6-elongase PSE1 são alongados quase quantitativamente para DHGLA ou DHSTA. A dessaturação que se segue através da A5-dessaturase PtD5 ocorre igualmente facilmente para ARA ou EPA. Cerca de 25 a 30% do produto de elongase é dessaturado (Figura 21B e D). A seguinte Tabela 10 dá uma visão global das dessaturases de Ostreococcus clonadas:
Exemplo 33: Clonagem de genes de dessaturases de
Thalassiosira pseudonana
Através da pesquisa de áreas conservadas nas sequências proteicas com auxílio de motivos conservados (Hix-Box, ver motivos), puderam ser identificadas seis sequências com os motivos correspondentes numa base de dados de sequências (sequências genómicas) de Thalassiosira pseudonana. Trata-se aqui das sequências seguintes:
A clonagem foi feita da seguinte maneira: 40 mL de uma cultura de Thalassiosira pseudonana na fase estacionária foram centrifugados e suspensos em 100 yL de água bidestilada, e armazenados a -20 °C. Os seus DNAs genómicos foram amplificados por PCR. Os pares de primers correspondentes foram selecionados de tal forma que continham a sequência consenso de levedura para translação de alta eficiência (Kozac, Cell 1986, 44: 283-292), junto ao codão de iniciação.
A amplificação do DNA TpDes foi feita, respetivamente, com 1 yL de células descongeladas, 200 yM dNTPs, 2,5 U de Taq-polimerase e 100 pmol de cada um dos primers, num volume total de 50 yL. As condições usadas no PCR foram as seguintes: primeira desnaturação a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos, e um último passo de extensão a 72 °C durante 10 minutos.
Exemplo 34: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Para a caracterização da função das dessaturases de Thalassiosira pseudonana, a grelha de leitura aberta do DNA foi clonada a jusante do promotor GAL1 induzivel por galactose de pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen), tendo-se obtido os clones pYES2.1 correspondentes. A estirpe 334 de Saccharomyces cerevisiae foi transformada por eletroporação (1500 V) com os vetores pYES2.1-Tpdessaturase. Como controlo foi usada uma levedura transformada com o vetor vazio pYES2. A seleção das leveduras transformadas foi feita em placas de agar com meio mínimo completo (CMdum) , com 2% glucose, mas sem uracilo. Após a seleção, foram escolhidos três transformantes para expressão funcional adicional.
Para a expressão das Tp-dessaturases, pré-culturas com 5 mL de meio líquido CMdum cada, com 2% (peso/volume) de rafinose, mas sem uracilo, foram inoculadas com os transformantes selecionados e incubou-se durante 2 dias a 30 °C, 200 rpm. 5 mL de meio líquido CMdum (sem uracilo) com 2% rafinose e 300 μΜ de diferentes ácidos gordos foram depois inoculados com as pré-culturas, a uma Οϋεοο de 0,05. A expressão foi induzida através da adição de 2% (peso/volume) de galactose. As culturas foram incubadas durante mais 96 h a 20 °C.
Exemplo 35: Clonagem de plasmideos de expressão para expressão especifica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, preparou-se outro vetor de transformação à base de pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante através de PCR. As sequências de primers correspondentes foram derivadas das áreas 5' e 3' das dessaturases.
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C
Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C
Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35
Os produtos de PCR foram incubados com a enzima de restrição Notl durante 16 h a 37 °C. O vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, os produtos de PCR assim como o vetor foram separados por eletroforese em gel de agarose, e os
fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA é feita com o Qiagen Gel Purification Kit, segundo as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e o produto de PCR foram ligados. Para tal, utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. Os plasmideos resultante foram verificados através de sequenciação. 0 pSUN300 é um derivado do plasmideo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). 0 pSUN-USP deriva de pSUN300, em que é inserido um promotor USP no pSUN300, como fragmento EcoRI. 0 sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmideo Ti de A. tumefaciens (sequência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). 0 promotor USP corresponde aos nucleotideos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos Standard, usando primers Standard T7 comerciais e um primer sintetizado. Sequência de primers: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGA A-3'; SEQ ID NO: 143). 0 fragmento de PCR foi cortado com EcoRI/SalI e introduzido no vetor pSUN300 com uma sequência de terminação OCS. Obteve-se o plasmideo com a designação pSUN-USP. 0 constructo foi utilizado para a transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça.
Exemplo 36: Expressão de Tp-dessaturases em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmídeos pYES2 e pYES2-Tpdessaturases tal como descrito no Exemplo 4, foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 5 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCCd, pH 8,0, para remover o resto d meio de ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCh 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2SCd, evaporadas em árgon e colocadas em 100 yL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 ym, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os padrões de ácidos gordos correspondentes (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental
Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Brochem. Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 37: Caracterização funcional de dessaturases de Thalassiosira pseudonana A especificidade para o substrato das dessaturases pode ser determinada após expressão em leveduras (ver Exemplos clonagem de genes de dessaturases, expressão em leveduras), através da alimentação em diferentes leveduras. Descrições para a determinação de atividades individuais podem ser encontradas em WO 93/11245 para A15-dessaturases, WO 94/11516 para A12-dessaturases, WO 93/06712, US 5,614,393, US 5614393, WO 96/21022, WO 0021557 e WO 99/27111 para A6-dessaturases, Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 para A4-dessaturases, Hong et al. 2002, Lipids 37,863-868 para A5-dessaturases. A atividade das dessaturases individuais é calculada a partir taxa de conversão, calculadas através da fórmula: [substrato/([substrato]+[produto])xlOO].
As seguintes Tabelas 11 e 12 apresentam uma visão global das dessaturases de Thalassiosira pseudonana clonadas.
Tabela 11: Comprimento e traços caracteristicos das dessaturases de Thalassiosira clonadas
Tabela 12: Comprimento, exões, homologia e identidade das dessaturases clonadas
Os genes da Δ12-dessaturase de Ostreococcus e Thalassiosira podem ser clonados de forma análoga aos Exemplos descritos anteriormente.
Exemplo 38: Clonagem dos genes da elongase de Xenopus laevis e Ciona intestinalis
Através da procura de áreas conservadas (ver sequências consenso, SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 116) nas sequências proteicas em bases de dados genéticas (Genbank), puderam ser identificadas outras sequências de elongases de outros organismos, com auxilio dos genes de elongase com atividade Δδ-elongase ou Δβ-elongase introduzidos no pedido de patente. Foi possivel identificar sequências adicionais com motivos correspondentes de X. laevis e de C. intestinalis. Trata-se aqui das sequências seguintes:
0 clone de cDNA de X. laevis foi baseado no NIH (National Institute of Health) [Genetic and genomic tools for Xenopus research: The NIH Xenopus initiative, Dev. Dyn. 225 (4), 384-391 (2002)]. 0 clone de cDNA de c. intestinalis foi baseado no da Universidade de Kyto [Satou,Y., Yamada, L., Mochizuki, Y., Takatori, N., Kawashima, T., Sasaki, A., Hamaguchi, M., Awazu, S., Yagi, K., Sasakura, Y., Nakayama, A., Ishikawa, H., Inaba, K. and Satoh, N. "A cDNA resource from the basal chordate Ciona intestinalis" JOURNAL Genesis 33 (4) , 153-154 (2002)].
Exemplo 39: Clonagem de plasmideos de expressão para expressão heteróloga em leveduras A amplificação do DNA da elongase foi feita com 1 pL de cDNA, 200 μΜ dNTPs, 2,5 U de Advantage-Polymerase e 100 pmol de cada um dos primers, num volume total de 50 pL. As condições usadas no PCR foram as seguintes: primeira desnaturação a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos, e um último passo de extensão a 72 °C durante 10 minutos.
Para a clonagem das sequências para expressão heteróloga em leveduras, foram usados os oligonucleotideos seguintes para a reação de PCR:
0 produto de PCR foi incubado durante 30 min a 21 °C com o vetor de expressão em leveduras pYES2.l-TOPO (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR é ligado ao vetor por overhang T e atividade de uma topoisomerase (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Depois da incubação ocorre a transformação de células de E. coli DH5a. Os clones correspondentes foram identificados por PCR, o DNA plasmídeo foi isolado com o Qiagen DNAeasy kit e verificado através de sequenciação. A sequência correta foi depois transformada na estirpe de Saccharomyces INVScl (Invitrogen) através de eletroporação (1500 V). O vetor vazio pYES2.1 foi transformado em paralelo como controlo. A seguir, as leveduras foram plaqueadas em meio minimo completo sem uracilo, com 2% de glucose. As células que cresceram sem uracilo no meio contêm o plasmideo pYES2.1, pYES2.1-ELO (XI) e pYES2.1-ELO(Ci) correspondente. Após a seleção, foram selecionados dois transformantes de cada para expressão funcional adicional.
Exemplo 40: Clonagem de plasmideos de expressão para expressão específica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas foi gerado um outro vetor de transformação à base do pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante, usando os seguintes pares de primers: pSUN-ELO(XI)
Forward: 5'-GCGGCCGCACCATGGCCTTCAAGGAGCTCACATC (SEQ ID NO: 125)
Reverse: 3'-GCGGCCGCCTTCAATGGTTTTTGCTTTTCAATGCACCG (SEQ ID NO: 126) pSUN-ELO(Ci)
Forward: 5'-GCGGCCGCACCATGGACGTACTTCATCGT (SEQ ID NO: 127)
Reverse: 3' -GCGGCCGCTTTAATCGGTTTTACCATT (SEQ ID NO: 128)
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCÍ2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35
Os produtos de PCR foram incubados durante 16 horas a 37 °C com a enzima de restrição Notl. O vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, os produtos de PCR assim como o vetor com 7624 bp, foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA foi feita por intermédio do Qiagen Gel Purification Kit, de acordo com as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e os produtos de PCR foram ligados. Para tal utilizou-se o Rapid Ligation Kit da
Roche. Os plasmideos resultantes pSUN-ELO(XI) e pSUN-ELO(Ci) foram verificados por sequenciação. 0 pSUN300 é um derivado do plasmídeo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). 0 pSUN-USP deriva de pSUN300, em que é inserido um promotor USP no pSUN300, como fragmento EcoRI. 0 sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmideo Ti de A. tumefaciens (sequência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). 0 promotor USP corresponde aos nucleotideos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos standard, usando primers standard T7 comerciais e um primer sintetizado.
Sequência do primer: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATG AA-3' (SEQ ID NO: 129). 0 fragmento de PCR foi cortado com EcoRI/SalI e introduzido no vetor pSUN300 com uma sequência de terminação OCS. Obteve-se o plasmideo com a designação pSUN-USP. 0 constructo foi utilizado para a transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça. A extração de lípidos a partir das leveduras e sementes é feita de forma idêntica ao descrito no Exemplo 6.
Exemplo 41: Expressão de ELO(XI) e ELO(Ci) em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmídeos pYES2, pYES2-EL0(XI) e pYES2-EL0(Ci) tal como no Exemplo 4 foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 5 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCCh, pH 8,0, para remover o resto de meio de ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCh 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2S04, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os padrões de ácidos gordos correspondentes (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch.
Biochem. Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 42: Caracterização funcional de ELO(XI) e ELO(Ci) A especificidade para o substrato de ELO(XI) pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Figura 22). A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a sintese de novos ácidos gordos, os produtos da reação ELO(XI). Isto significa que o gene ELO(XI)pode ser expresso de forma funcional. A Tabela 13 mostra que o ELO (XI) tem uma ampla especificidade para o substrato. Foram alongados ácidos gordos Cis e C20, sendo contudo observada uma preferência para ácidos gordos Δ5- e A6-dessaturados.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pYES2-ELO(XI) foram cultivadas em meio mínimo na presença dos ácidos gordos referidos. A síntese de metiléster de ácidos gordos ocorre através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC.
Tabela 13: Expressão de ELO(XI) em leveduras. É descrita a taxa de conversão de diferentes reagentes (alimentado 250 μΜ de cada).
A especificidade para o substrato de ELO(Ci) pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Figura 23). A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a sintese de novos ácidos gordos, os produtos da reação ELO(Ci). Isto significa que o gene ELO(Ci)pode ser expresso de forma funcional.
Tabela 14: Expressão de ELO(Ci) em leveduras. É descrita a taxa de conversão de diferentes reagentes (alimentado 250 μΜ de cada).
A Tabela 14 mostra que o ELO(Ci) tem uma ampla especificidade para o substrato. Foram alongados ácidos gordos Cis e C20, sendo contudo observada uma preferência para ácidos gordos Δ5- e Δβ-dessaturados.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pYES2-ELO(Ci) foram cultivadas em meio minimo na presença dos ácidos gordos referidos. A sintese de metiléster de ácidos gordos ocorre através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC.
Exemplo 43: Clonagem de genes de Ostreococcus tauri
Através da procura de áreas conservadas nas sequências proteicas, com auxilio dos genes de elongase com atividade A5-elongase ou A6-elongase aqui descritos, puderam ser identificadas, em cada caso, duas sequências com os motivos correspondentes numa base de dados de sequências (sequências genómicas) de Ostreococcus tauri.
OtElol e OtElol.2 apresentam a maior semelhança com uma elongase de Danio rerio (Genbank AAN77156; cerca de 26% de identidade), enquanto 0tElo2 e 0tElo2.1 apresentam a maior semelhança com elo de Physcomitrella (PSE) [cerca de 36% de identidade] (os alinhamentos foram feitos com o algoritmo tBLASTn (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403 - 410) . A clonagem das elongases foi feita do seguinte modo:
40 mL de uma cultura de Ostreococcus tauri na fase estacionária foram centrifugados e suspensos em 100 pL de água bidestilada, e armazenados a -20 °C. Os seus DNAs genómicos foram amplificados por PCR. Os pares de primers correspondentes foram selecionados de tal forma que continham a sequência consenso de levedura para translação de alta eficiência (Kozac, Cell 1986, 44: 283-292), junto ao codão de iniciação. A amplificação do DNA OtElo foi feita, respetivamente, com 1 pL de células descongeladas, 200 μΜ dNTPs, 2,5 U de Taq-Polymerase e 100 pmol de cada um dos primers, num volume total de 50 pL. As condições usadas no PCR foram as seguintes: primeira desnaturação a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos, e um último passo de extensão a 72 °C durante 10 minutos.
Exemplo 44: Clonagem de plasmideos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Para a caracterização da função das elongases de Ostreococcus tauri, a grelha de leitura aberta do DNA foi clonada a jusante do promotor GAL1 induzivel por galactose de pYES2.l/V5-His-T0P0 (Invitrogen), tendo-se obtido pOTEl, pOTEl.2, pOTE2 e pOTE2.1. A estirpe 334 de Saccharomyces cerevisiae foi transformada por eletroporação (1500 V) com os vetores pOTEl, pOTE1.2, pOTE2 ou pOTE2.1. Como controlo foi usada uma levedura transformada com o vetor vazio pYES2. A seleção das leveduras transformadas foi feita em placas de agar com meio minimo completo (CMdum), com 2% glucose, mas sem uracilo. Após a seleção, foram escolhidos três transformantes de cada para expressão funcional adicional.
Para a expressão das elongases Ot, pré-culturas com 5 mL de meio liquido CMdum cada, com 2% (peso/volume) de rafinose, mas sem uracilo, foram inoculadas com os transformantes selecionados e incubou-se durante 2 dias a 30 °C, 200 rpm. 5 mL de meio liquido CMdum (sem uracilo) com 2% rafinose e 300 μΜ de diferentes ácidos gordos foram depois inoculados com as pré-culturas, a uma Οϋεοο de 0,05. A expressão foi induzida através da adição de 2% (peso/volume) de galactose. As culturas foram incubadas durante mais 96 h a 20 °C.
Exemplo 45: Clonagem de plasmideos de expressão para expressão específica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, preparou-se outro vetor de transformação à base de pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante por PCR. As sequências de primers correspondentes foram derivadas das áreas 5' e 3' de OtElol, OtElol.2, OtElo2 e OtElo2.1.
Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35
Os produtos de PCR foram incubados durante 16 horas a 37 °C com a enzima de restrição Notl. O vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, os produtos de PCR assim como o vetor, foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA foi feita por intermédio do Qiagen Gel Purification Kit, de acordo com as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e os produtos de PCR foram ligados. Para tal utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. Os plasmideos resultantes pSUN-OtELOl, pSUN-OtELOl.2, pSUN-0tEL02 e pSUN-0tEL02.2. foram verificados por sequenciação. O pSUN300 é um derivado do plasmideo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). O pSUN-USP deriva de pSUN300, em que é inserido um promotor USP no pSUN300, como fragmento EcoRI. O sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmideo Ti de A. tumefaciens (sequência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). 0 promotor USP corresponde aos nucleotideos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos Standard, usando primers standard T7 comerciais e um primer sintetizado. Sequência de primers: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGA A-3'). (SEQ ID NO: 130). O fragmento de PCR foi cortado com EcoRI/SalI e introduzido no vetor pSUN300 com uma sequência de terminação OCS. Obteve-se o plasmideo com a designação pSUN-USP. O constructo foi utilizado para a transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça.
Exemplo 46: Expressão de OtElol, OtElol.2, OtElo2 e OtElo2.2 em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmídeos pYES3 ou pYES3-OtElol, pYES3-OtElol.2, pYES3-OtElo2 e pYES3-OtElo2.2 tal como no Exemplo 15 foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 5 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCCb, pH 8,0, para remover o resto de meio de ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise
ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCL 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2SC>4, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os respetivos padrões de ácidos gordos (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36 (8) :751-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al. , 2001, Arch. Biochem.
Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 47: Caracterização funcional de OtElol, OtElol.2, OtElo2 e OtElo2.1 A especificidade para o substrato de OtElol pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Tabela 15). A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a síntese de novos ácidos gordos, os produtos da reação OtElol. Isto significa que o gene OtElol pode ser expresso de forma funcional. A Tabela 15 mostra que o OtElol ou OtElol. 2 tem uma ampla especificidade para o substrato. OtElol ou OtElol.2 foram capazes de alongar apenas os ácidos gordos C20 ácido eicosapentaenóico (Figura 24A, 24B) e ácido araquidónico (Figura 25A, 25B) sendo contudo observada uma preferência para ácido eicosapentaenóico co3-dessaturado. A Tabela 15 mostra a especificidade para o substrato das elongases OtElol e OtElol.2 para ácidos gordos polinsaturados C20 com uma ligação dupla na posição Δ5, para diferentes ácidos gordos.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pOTEl ou pOTE1.2 foram cultivadas em meio mínimo na presença dos ácidos gordos referidos. A síntese de metiléster de ácidos gordos ocorre através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. A especificidade para o substrato de 0tElo2 (SEQ ID NO: 81) e 0tElo2.1 (SEQ ID NO: 111) pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Tabela 16). A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a síntese de novos ácidos gordos, os produtos da reação 0tElo2. Isto significa que o gene 0tElo2 e 0tElo2.1 pode ser expresso de forma funcional.
Tabela 15:
A Tabela 16 mostra a especificidade para o substrato das elongases 0tElo2 e 0tElo2.1 para diferentes ácidos gordos. A 0tElo2.1 mostra uma atividade substancialmente mais elevada.
As leveduras que foram transformadas com o vetor pOTE2 ou pOTE2.1 foram cultivadas em meio minimo na presença dos ácidos gordos referidos. A síntese de metiléster de ácidos gordos ocorre através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. A atividade enzimática que é apresentada na Tabela 16 mostra claramente que a 0tElo2 ou EtElo2.1 é uma elongase Δ6.
Tabela 16:
A Figura 24A-D mostra a extensão de ácido eicosapentaenóico pela OtElol (B) ou OtElol.2 (D) . Os controlos (A, C) não mostram o produto da extensão (C22:5 ω3) . A Figura 25A-D mostra a extensão de ácido araquidónico pela OtElol (B) ou OtElol.2 (D). Os controlos (A, C) não mostram o produto da extensão (C22:4 ω3) .
Exemplo 48: Clonagem dos genes de elongase de Euglena gracilis e Arabidopsis thaliana
Através da procura de áreas conservadas nas sequências proteicas, com auxilio dos genes de elongase com atividade A5-elongase ou Δβ-elongase introduzidos neste pedido de patente, puderam ser identificadas sequências de Arabidopsis thaliana ou Euglena gracilis com os motivos correspondentes em bases de dados de sequências (Genbank, Euglena EST Bank). Trata-se aqui das sequências seguintes:
A clonagem das elongases de Euglena gracilis foi feita tal como se segue: A estirpe 1224-5/25 de Euglena gracilis foi obtida a partir da coleção Algenkulturen Gottingen (SAG). Para o isolamento, a estirpe foi cultivada em meio II (Calvayrac R e Douce R, FEBS Letters, 7: 259-262, 1970), durante 4 dias a 23 °C e com um intervalo de luz/escuridão de 8h/16h (35 mol s_1 nr1 intensidade luminosa). O RNA total de uma cultura com 4 dias de Euglena foi isolado com o kit RNAeasy da empresa Qiagen (Valencia, CA, US) . Do RNA total, foi isolado RNA poli-A+ (mRNA) com oligo-dT-celulose (Sambrook et al., 1989). O RNA foi submetido a transcrição reversa com o kit Reverse Transcription System da Promega, e o cDNA sintetizado foi clonado no vetor lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene). O cDNA foi empacotado em DNA plasmidico de acordo com as instruções do fabricante e clones foram sequenciados por sequenciação aleatória. Do RNA total isolou-se mRNA com o sistema de isolamento PolyATract (Promega). 0 mRNA foi submetido a transcrição reversa com o Marathon cDNA Amplification kit (BD Biosciences) e ligado a adaptadores de acordo com as instruções do fabricante. 0 banco de cDNA-plasmídeo foi depois utilizado para clonagem de plasmídeos de expressão por intermédio de RACE 5' e 3' (rapid amplification of cDNA ends). A clonagem das elongases de Arabidopsis thaliana foi feita do seguinte modo:
Partindo do DNA genómico, prepararam-se primers para ambos os genes correspondendo às extremidades 5' e 3' da grelha de leitura aberta.
Para o isolamento do RNA total de A. thaliana, usou-se o método de acordo com Chrigwin et al., (1979) . Folhas de plantas com 21 dias foram esmagadas em azoto liquido, adicionadas a tampão de lise e incubadas durante 15 min a 37 °C. Após centrifugação (10 min, 4 °C, 12000xg), o RNA no sobrenadante foi precipitado a -20 °C durante 5 h, com 0,02 volumes de acetato de sódio 3M pH 5,0 e 0,75 volumes de etanol. O RNA foi depois, após uma centrifugação adicional, colocado em 1 mL de TES por g de material de partida, extraído uma vez com um volume de fenol-clorofórmio e uma vez com um volume de clorofórmio, e precipitado com 2,5 mL de LiCl. Após centrifugação e lavagem com etanol a 80% subsequentes, o RNA foi suspenso em água. De acordo com Sambrook et al. 1989, o cDNA foi sintetizado e foi realizado RT-PCR com os primers derivados. Os produtos de PCR foram clonados no vetor pYES2.1-T0P0 (Invitrogen) segundo as instruções do fabricante.
Exemplo 49: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Para a caracterização da função das elongases de A. thalina, a grelha de leitura aberta do DNA foi clonada a jusante do promotor GAL1 induzivel por galactose de pYES2.l/V5-His-T0P0 (Invitrogen), tendo-se obtido pAt60 e pAt70. A estirpe 334 de Saccharomyces cerevisiae foi transformada por eletroporação (1500 V) com o vetor pAt60 ou pAt70. Como controlo foi usada uma levedura transformada com o vetor vazio pYES2. A seleção das leveduras transformadas foi feita em placas de agar com meio minimo completo (CMdum) , com 2% glucose, mas sem uracilo. Após a seleção, foram escolhidos três transformantes para expressão funcional adicional.
Para a expressão das At-elongases, pré-culturas com 5 mL de meio liquido CMdum cada, com 2% (peso/volume) de rafinose, mas sem uracilo, foram a seguir inoculadas com os transformantes selecionados e incubou-se durante 2 dias a 30 °C, 200 rpm. 5 mL de meio liquido CMdum (sem uracilo) com 2% rafinose e 300 μΜ de diferentes ácidos gordos foram depois inoculados com as pré-culturas, a uma Οϋεοο de 0,05. A expressão foi induzida através da adição de 2% (peso/volume) de galactose. As culturas foram incubadas durante mais 96 h a 20 °C.
Exemplo 50: Expressão de pAt60 e pAt70 em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmideos pYES2.1, pAt60 ou pAt70 tal como no Exemplo 5 foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 5 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCC>3, pH 8,0, para remover o resto de meio de ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCL 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2SC>4, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os padrões de ácidos gordos correspondentes (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental
Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch.
Biochem. Biophys. 38 8(2):2 93-2 98 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 51: Caracterização funcional de pAt60 e pAt70 A especificidade para o substrato das elongases At3g06460 ou At3g06470 pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Tabela 17, Figura 26). A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a sintese de novos ácidos gordos, os produtos dos genes At3g06460 ou At3g06470. Isto significa que estes genes puderam de ser expressos de forma funcional.
Tabela 17: Extensão de EPA pelas elongase At3g06460 ou At3g06470. Medição dos extratos de levedura após alimentação com 250 μΜ de EPA
A Figura 26 apresenta a extensão de C20:5n-3 pela elongase At3g0 647 0.
Exemplo 52: Clonagem de uma elongase de Phaeodactylum tricornutum
Partindo de zonas conservadas nas sequências proteinas, com auxílio dos genes de elongase com atividade A6-elongase introduzidos no pedido de patente, foram preparados primers degenerados, e com estes pesquisou-se um banco de cDNA de Phaeodactylum por PCR. Foram usadas as seguintes sequências de primers:
Os nucleotideos entre parêntesis significam que está presente uma mistura de oligonucleotideos com umas ou com as outras bases nucleotidicas.
Preparação do banco de cDNA de Phaeodactylum:
Uma cultura com 2 L de P. tricornutum UTEX 646 foi cultivada em meio f/2 (Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Em Culture of Marine Invertebrate Animals (Eds. Smith, W.L. and Chanley, M.H.), Plenum Press, New York, pp 29-60.) durante 14 dias a uma intensidade luminosa de 35 E/cm2. Células congeladas foram esmagadas num pó fino, após centrifugação na presença de azoto liquido, e ressuspensas em 2 mL de tampão de homogeneização (0,33 M sorbitol, 0,3 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 2% SDS, 2% mercaptoetanol em 0,2 M de tris-Cl pH 8,5) . Após adição de 4 mL de fenol e 2 mL de clorofórmio, agitou-se fortemente durante 15 min a 40-50 °C. A seguir, centrifugou-se (10 min x 10000g) e a fase aquosa foi extraída gradualmente com clorofórmio. Os ácidos nucleicos foram depois precipitados pela adição de 1/20 volumes de solução de hidrogenocarbonato de sódio 4 M, e centrifugados. O pellet foi colocado em tris-borato 80 mM pH 7,0 e EDTA 1 mM, e o RNA foi precipitado com cloreto de lítio 8 M. Após centrifugação e lavagem com etanol 70%, o pellet de RNA foi colocado em água sem RNAases. O RNA poli(A) foi isolado com Dynabeads (Dynal Oslo, Noruega), de acordo com as instruções do fabricante, e a síntese da primeira cadeia de cDNA foi feita com MLV-Rtase da Roche (Mannheim). A síntese da segunda cadeia é feita pela DNA polimerase I e fragmento de Klenow, seguida de digestão com RnaseH. 0 cDNA foi tratado com T4 DNA polimerase e a seguir foi ligado a adaptadores EcoRI/Xho (Pharmacia, Freiburg), por intermédio da T4 ligase. Após digestão com Xhol, fosforilação e separação em gel, os fragmentos maiores do que 300 bp foram ligados a fagos lambda ZAP Express (Stratagene, Amsterdão, Holanda), segundo as instruções do fabricante. Após excisão do banco de cDNA e recuperação do plasmídeo, o banco de plasmídeos foi transformado em células de E. coli DH10B e usado para PCR.
Por intermédio dos primers degenerados anteriormente mencionados, foi possível gerar o fragmento de PCR com o número de sequência SEQ ID NO: 187.
Este fragmento foi marcado do digoxigenina (Roche, Mannheim), e usado como sonda para a triagem do banco de fagos.
Com auxílio da SEQ ID NO: 187, foi possível obter a sequência genética SEQ ID NO: 183, a qual representa a molécula completa de RNA da Δβ-elongase de Phaeodactylum:
Exemplo 53: Clonagem dos plasmideos de expressão para expressão heteróloga em leveduras
Os pares de primers correspondentes foram selecionadas de tal forma que continham a sequência consenso de levedura para translação de alta eficiência (Kozac, Cell 1986, 44: 283-292), junto ao codão de iniciação. A amplificação do DNA PtEL06 foi feita, respetivamente, com 1 yL de cDNA, 200 μΜ dNTPs, 2,5 U de Advantage-Polymerase e 100 pmol de cada um dos primers, num volume total de 50 pL. As condições usadas no PCR foram as seguintes: primeira desnaturação a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos, e um último passo de extensão a 72 °C durante 10 minutos.
Para a clonagem da sequência para expressão heteróloga em leveduras foram usados os seguintes oligonucleotideos para a reação de PCR:
Os produtos de PCR foram incubados durante 30 min a 21 °C com o vetor de expressão em leveduras pYES2.1-TOPO (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR é ligado ao vetor através de um overhang T e atividade de uma topoisomerase (Invitrogen). Depois da incubação ocorre a transformação de células de E. coli DH5a. Os clones correspondentes foram identificados por PCR, o DNA plasmideo foi isolado com o Qiagen DNAeasy kit e verificado através de sequenciação. A sequência correta foi depois transformada na estirpe de Saccharomyces INVScl (Invitrogen) através de eletroporação (1500 V). O vetor vazio pYES2.1 foi transformado em paralelo como controlo. A seguir, as leveduras foram plaqueadas em meio minimo completo sem uracilo, com 2% de glucose. As células que cresceram sem uracilo no meio contêm o plasmídeo pYES2.1, pYES2.l-PtEL06 correspondente. Após a seleção, foram selecionados dois transformantes de cada para expressão funcional adicional.
Exemplo 54: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão específica em sementes de plantas
Para a transformação de plantas, preparou-se outro vetor de transformação à base de pSUN-USP. Para tal, foram introduzidos locais de corte para Notl nas extremidades 5' e 3' da sequência codificante, usando os seguintes pares de primers: PSUN-PtEL06
Forward: 5'-GCGGCCGCACCATGATGGTACCTTCAAGTTA (SEQ ID NO: 190)
Reverse: 3'-GAAGACAGCTTAATAGGCGGCCGC (SEQ ID NO: 191) Composição da reação de PCR (50 pL): 5.00 pL cDNA modelo 5.00 pL tampão 10X (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2
5.00 pL dNTP 2 mM 1,25 pL cada primer (10 pmol/pL) 0,50 pL Advantage-Polymerase
Foi usada a Advantage-Polymerase da Clontech.
Condições de reação da PCR:
Temperatura de hibridização: 1 min. 55 °C Temperatura de desnaturação: 1 min. 94 °C Temperatura de extensão: 2 min. 72 °C Número de ciclos: 35 0 produto de PCR foi incubado com a enzima de restrição Notl durante 16 h a 37 °C. 0 vetor de expressão em plantas pSUN300-USP foi incubado da mesma forma. A seguir, o produto de PCR com 7 624 bp, assim como o vetor foram separados por eletroforese em gel de agarose, e os fragmentos de DNA correspondentes foram cortados. A purificação do DNA é feita com o Qiagen Gel Purification Kit, segundo as instruções do fabricante. A seguir, o vetor e o produto de PCR foram ligados. Para tal, utilizou-se o Rapid Ligation Kit da Roche. 0 plasmídeo resultante pSUN-PtELO foi verificado através de sequenciação. 0 pSUN300 é um derivado do plasmídeo pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors forplant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). 0 pSUN-USP deriva de pSUN300, em que é inserido um promotor USP no pSUN300, como fragmento EcoRI. 0 sinal de poliadenilação é o do gene da octopina sintase do plasmídeo Ti de A. tumefaciens (sequência de terminação ocs, Acesso Genbank V00088) (De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). 0 promotor USP corresponde aos nucleotídeos 1-684 (Acesso Genbank X56240), em que uma parte da região não codificante do gene USP está contida no promotor. 0 fragmento do promotor com 684 pares de bases foi amplificado por uma reação de PCR de acordo com métodos standard, usando primers standard T7 comerciais e um primer sintetizado. Sequência de primers: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATG AA-3'; SEQ ID NO: 151). 0 fragmento de PCR foi cortado com EcoRI/SalI e introduzido no vetor pSUN300 com uma sequência de terminação OCS. Obteve-se o plasmídeo com a designação pSUN-USP. 0 constructo foi utilizado para a transformação de Arabidopsis thaliana, colza, tabaco e sementes de linhaça. A extração de lipidos a partir de leveduras e sementes foi feita tal como descrito no Exemplo 6.
Exemplo 55: Expressão de PtElo em leveduras
As leveduras que foram transformadas com os plasmideos pYES2 ou pYES2-PtEL06 tal como no Exemplo 4 foram analisadas da seguinte forma:
As células de levedura das culturas principais são recolhidas por centrifugação (100 x g, 5 min, 20 °C) e lavadas com 100 mM de NaHCCh, pH 8,0, para remover o resto de meio de ácidos gordos. Os metilésteres de ácidos gordos (FAMEs) foram preparados a partir do sedimento celular das leveduras, através de metanólise ácida. Para isso, os sedimentos celulares foram incubados com 2 mL de ácido sulfúrico metanólico IN e 2% (v/v) de dimetoxipropano durante 1 h a 80 °C. A extração dos FAMEs é feita por extração dupla com éter de petróleo (PE) . Para remoção de ácidos gordos não derivatisáveis, as fases orgânicas foram lavadas cada uma com 2 mL de NaHCCh 100 mM, pH 8,0 e 2 mL de água destilada. A seguir, as fases PE foram secas com Na2SC>4, evaporadas em árgon e colocadas em 100 pL de PE. As amostras foram separadas numa coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 pm, Agilent), num cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 com detetor de ionização de chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: a temperatura do forno foi programada de 50 °C a 250 °C com uma taxa de 5 °C / min e finalmente mantida 10 min a 250 °C. A identificação dos sinais realiza-se através da comparação dos tempos de retenção com os padrões de ácidos gordos correspondentes (Sigma). A metodologia está descrita, por exemplo, em Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental
Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Exemplo 56: Caracterização funcional de PtEL06
Na Figura 29 é apresentada a conversão de Ci8:3*6,9'12 e Οΐ8:4Δ6'9,12,15. Os substratos são, cada um, alongados em 2 átomos de carbono, e originam-se respetivamente os ácidos gordos C20:3Δ8,11 r 14 ou C20:4Δ8,n'14,17. A especificidade para o substrato de PtEL06 pode ser determinada após expressão e alimentação de diferentes ácidos gordos (Figura 30). A presença dos substratos alimentados pode ser demonstrada em grandes quantidades em todas as leveduras transgénicas. As leveduras transgénicas mostram a síntese de novos ácidos gordos, os produtos da reação PtElo6. Isto significa que o gene PtElo6 pode ser expresso de forma funcional. A Tabela 18 mostra que o PtEloô apresenta uma estreita especificidade. O PtEL06 foi capaz de alongar apenas os ácidos gordos Cis ácido linoleico, ácido linolénico, ácido γ-linolénico e ácido estearidónico, com preferência contudo para ácido estearidónico m3-dessaturado (ver também Figura 30) .
Experiência de alimentação: os ácidos gordos (gordura) foram adicionados, cada um, a 250 μΜ. Os ácidos gordos sublinhados foram produzidos de novo.
Tabela 18: Especificidade para o substrato de PtEloô
Os ácidos gordos seguintes foram alimentados, mas não foram convertidos: • 18 : 1Δδ, 18 : 1Δ9, 18:1Δ11 • 20 : 2Δ11'14, 20:3Δ11'14'17, 20 : 3Δ8'η'14, 20 : 4Δ5'8'41'14, 20: 5δ5'8'1:1'14'17 • 22: 4Δ7'10'13'16
As leveduras que foram transformadas com o vetor pYES2-PtEL06 foram cultivadas em meio minimo na presença dos ácidos gordos referidos. A síntese de metiléster de ácidos gordos ocorre através da metanólise ácida de células intactas. A seguir, os FAMEs foram analisados por GLC. Assim, foram determinados os resultados apresentados nas Figuras 29 e 30, assim como na Tabela 16.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> BASF Plant Science GmbH <120> Método para a produção de ácidos gordos polinsaturados em organismos transgénicos <130> PF54756 <140> 20030601 <141> 2003-08-01 <160> 192 <170> Patent In version 3.1 <210> 1 <211> 1266
<212> DNA <213> Euglena gracilis <22 0>
<221> CDS <222> (1) .. (1266) <223> Delta-8-dessaturase <4 0 0> 1 atf aag tea aag ege caa ge® etc sec ett aes act gat gga ata at* as
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Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Um ácido nucleico isolado com uma sequência que codifica para um polipéptido com atividade Δ5-elongase, com a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO:67, b) um ácido nucleico que pode ser derivado como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO 68, ou c) derivado da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 67, que codifica para polipéptidos com pelo menos 40% de identidade, ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 68, e apresenta uma atividade A5-elongase. e em que o ácido nucleico não possui a sequência representada na SEQ ID NO: 113.
  2. 2. .Polipéptidos que são codificados pelos ácidos nucleicos isolados de acordo com a reivindicação 1, e em que a sua sequência de aminoácidos não possui a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 114.
  3. 3. Um constructo genético contendo o ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ácido nucleico está ligado, de forma funcional, a um ou mais sinais de regulação.
  4. 4. Constructo genético de acordo com a reivindicação 3, em que o constructo de ácidos nucleicos contém, adicionalmente, genes da biossintese dos ácidos gordos ou lipidos, selecionados do grupo: acil-CoA desidrogenase(s) , acil-ACP [= proteína transportadora de acil] dessaturase(s) , acil-ACP tioesterase(s), ácido gordo-acil transferase(s) , acil-CoA:lisofosfolípido aciltransferase(s), ácido gordo sintase(s), ácido gordo hidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s), ácido gordo dessaturase(s), ácido gordo acetilenases, lipoxigenases, triacilglicerol lipases, alenóxido sintases, hidroperóxido liases ou ácido gordo elongase(s).
  5. 5. Constructo genético de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o constructo de ácido nucleico contém, adicionalmente, genes da biossintese de ácidos gordos ou lipidos, selecionados do grupo: A4-dessaturase, Δ5-dessaturase, Δβ-dessaturase, A8-dessaturase, Δ9-dessaturase, A12-dessaturase, Δβ-elongase, ou Δ9-elongase.
  6. 6. Vetor, contendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou um constructo genético de acordo com as reivindicações 3 a 5.
  7. 7. Microrganismos transgénicos, plantas, sementes, células, partes de plantas ou material de colheita transgénicos, contendo pelo menos um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, um constructo genético de acordo com as reivindicações 3 a 5, ou um vetor de acordo com a reivindicação 6.
  8. 8. Método para a produção de compostos da fórmula geral I
    (!) em organismos não humanos transgénicos, com um teor de pelo menos 1% peso destes compostos, em relação ao teor total de lípidos do organismo não humano transgénico, em que o método compreende os passos seguintes: a) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade A9-elongase ou Δβ-dessaturase, e b) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade Δδ-dessaturase ou Δβ-elongase, e c) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade A5-dessaturase, e d) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade A5-elongase, e e) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade A4-dessaturase, e em que as variáveis e substituintes na fórmula I têm os significados seguintes: R1 = hidroxil, coenzima A-(tioéster) , liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, 1iso-fosfatidilinositol, esfingobase ou um radical da fórmula geral II
    (Μ) R2 = hidrogénio, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol ou alquilcarbonil C2-C24 saturado ou insaturado, R3 = hidrogénio, alquilcarbonil C2-C24 saturado ou insaturado, ou R2 ou R3 independentemente um do outro, um radical da fórmula geral Ia:
    (la) n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 9, m = 2, 3, 4, 5ou6ep = 0 ou 3, em que o ácido nucleico com uma sequência que codifica o polipéptido com atividade A5-elongase, é selecionado do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 67, ou b) ácidos nucleicos que podem ser derivados como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 68, ou c) derivados da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 67, a qual codifica para polipéptidos com pelo menos 40% identidade ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 68, e que apresentam uma atividade A5-elongase.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que é introduzido no organismo, adicionalmente, um ácido nucleico com uma sequência que codifica para polipéptidos com atividade co3-dessaturase, selecionados do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 105, ou b) ácidos nucleicos que podem ser derivados como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 106, ou c) derivados da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 105, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 60% de identidade, ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 106, e que apresentam uma atividade co3-dessaturase.
  10. 10. Método de acordo com as reivindicações 8 ou 9, em que que é introduzido no organismo, adicionalmente, um ácido nucleico com uma sequência que codifica para polipéptidos com atividade A12-dessaturase, selecionados do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 109, ou b) ácidos nucleicos que podem ser derivados como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 108 ou SEQ ID NO: 110, ou c) derivados da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 109, os quais codificam para polipéptidos com pelo menos 60% de identidade ao nivel dos aminoácidos com a SEQ ID NO: 108 ou SEQ ID NO: 110, e que apresentam uma atividade Δ12-dessaturase.
  11. 11. Método de acordo com as reivindicações 8 a 10, em que o organismo não humano transgénico é um microrganismo transgénico ou uma planta transgénica.
  12. 12. Método para a produção de ésteres de ácidos gordos com ácidos gordos Cis, C20 e C22 polinsaturados, com pelo menos duas ligações duplas no éster de ácidos gordos, em organismos não humanos transgénicos com um teor de pelo menos 1% peso destes compostos, em relação ao teor total de lipidos do organismo transgénico, em que o método compreende os seguintes passos: a) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade A9-elongase ou Δβ-dessaturase, e b) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade A8-dessaturase ou Δβ-elongase, e c) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade á5-dessaturase, e d) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade á5-elongase, e e) introdução no organismo de pelo menos um ácido nucleico com uma sequência que codifica para uma atividade A4-dessaturase, em que o ácido nucleico com uma sequência que codifica para o polipéptido com atividade A5-elongase é selecionado do grupo consistindo em: a) um ácido nucleico com a sequência apresentada em SEQ ID NO:67, b) um ácido nucleico que pode ser derivado como resultado do código genético degenerado da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO 68, ou c) derivado da sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 67, que codifica para polipéptidos com pelo menos 40% de identidade, ao nivel dos aminoácidos, com a SEQ ID NO: 68, e apresenta uma atividade A5-elongase.
  13. 13. Método de acordo com as reivindicações 8 a 12, em que os compostos da fórmula geral I ou os ésteres de ácidos gordos do organismo são isolados na forma de lipidos de membrana e/ou triacilglicerídeos, ou na forma dos seus óleos, lipidos ou de ácidos gordos livres.
  14. 14. Método de acordo com as reivindicações 8 a 13, compreendendo os passos adicionais da produção de rações, alimentos, cosméticos ou medicamentos contendo o composto I de acordo com a reivindicação 8, ou os ésteres de ácidos gordos de acordo com a reivindicação 12.
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