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Fachgebiet
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Diese
Erfindung bezieht sich auf die Modulation von Konzentrationen von
Enzymen und/oder Enzymkomponenten, die die Produktion von langkettigen,
mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
(PUFAs) in einer Wirtspflanze verändern können. Die Erfindung wird anhand
der Produktion von PUFAs in Pflanzen beispielhaft angewendet.
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EINFÜHRUNG Hintergrund
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Drei
Hauptfamilien von mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
(PUFAS) sind die 3-Fettsäuren, zum
Beispiel Arachidonsäure,
die ω9-Fettsäuren, zum
Beispiel Eicosatriensäure,
und die ω3-Fettsäuren, zum
Beispiel Eicosapentaensäure.
PUFAs sind wichtige Komponenten der Plasmamembran der Zelle, wo
sie etwa in Form von Phospholipiden zu finden sind. PUFAs dienen
auch als Vorläufer
von anderen Molekülen,
die in Menschen und Tieren wichtig sind, einschließlich der
Prostacycline, Leukotriene und Prostaglandine. PUFAs sind notwendig
für die
richtige Entwicklung, insbesondere bei der Entwicklung des Säuglingsgehirns,
und für
die Gewebebildung und -reparatur.
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Zu
den vier wichtigsten langkettigen PUFAs gehören Docosahexaensäure (DHA)
und Eicosapentaensäure
(EPA), die man in erster Linie in verschiedenen Arten von Fischöl findet, γ-Linolensäure (GLA),
die man in den Samen von mehreren Pflanzen einschließlich Nachtkerze
(Oenothera biennis), Borretsch (Borago officinalis) und Schwarzen
Johannisbeeren (Ribes nigrum) findet, und Stearidon säure (SDA),
die man in marinen Ölen
und Pflanzensamen findet. Sowohl GLA als auch eine andere wichtige
langkettige PUFA, Arachidonsäure (ARA),
findet man in Fadenpilzen. ARA kann aus Tiergeweben einschließlich Leber
und Nebenniere gereinigt werden. Eicosatriensäure reichert sich in Tieren
mit Mangel an essentiellen Fettsäuren
an.
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Für DHA gibt
es mehrere Quellen für
die kommerzielle Produktion einschließlich einer Vielzahl von marinen
Organismen, Ölen,
die man aus Kaltwassermeeresfischen erhält, und Eidotterfraktionen.
Für ARA
können
Mikroorganismen einschließlich
der Gattungen Mortierella, Entomophthora, Phytium und Porphyridium
für die
kommerzielle Produktion verwendet werden. Zu den kommerziellen Quellen
für SDA
gehören
die Gattungen Trichodesma und Echium. Zu den kommerziellen Quellen
für GLA
gehören
Nachtkerze, Schwarze Johannisbeere und Borretsch. Es gibt jedoch
mehrere Nachteile, die mit der kommerziellen Produktion von PUFAs aus
natürlichen
Quellen verbunden sind. Natürliche
Quellen von PUFAs, wie Tiere und Pflanzen, haben häufig hochgradig
heterogene Ölzusammensetzungen.
Die aus diesen Quellen erhaltenen Öle können daher eine aufwändige Reinigung
erfordern, um eine oder mehrere erwünschte PUFAs abzutrennen oder
ein Öl
zu produzieren, das an einer oder mehreren PUFAs angereichert ist.
Natürliche
Quellen unterliegen auch unkontrollierbaren Fluktuationen in der
Verfügbarkeit.
Fischbestände
können
einer natürlichen
Schwankung unterliegen oder durch Überfischung dezimiert werden.
Fischöle
haben einen unangenehmen Geschmack und Geruch, der vielleicht nicht ökonomisch
von dem gewünschten
Produkt abgetrennt werden kann und solche Produkte als Nahrungsergänzung unannehmbar
machen kann. Tieröle
und insbesondere Fischöle
können
Umweltschadstoffe anreichern. Wetter und Krankheit können Fluktuationen
der Ausbeute sowohl aus Fisch- als auch aus Pflanzenquellen verursachen.
Ackerland, das für
die Produktion von alternativen ölproduzierenden
Kulturpflanzen verfügbar
ist, unterliegt dem Wettbewerb aufgrund der stetigen Ausdehnung
der menschlichen Bevölkerung
und dem damit einhergehenden wachsenden Bedarf an Nahrungsproduktion
auf dem restlichen Ackerland. Kulturpflanzen, die PUFAs produzieren,
wie Borretsch, wurden nicht für
den kommerziellen Anbau angepasst und bieten in Monokultur vielleicht
keine gute Leistungsfähigkeit.
Der Anbau solcher Kulturpflanzen ist also dort, wo gewinnträchtigere
und besser etablierte Kulturpflanzen angebaut werden können, nicht
wirtschaftlich konkurrenzfähig.
Die Fermentation von Organismen wie Mortierella im großen Maßstab ist
ebenfalls kostspielig. Natürliche
Tiergewebe enthalten nur geringe Mengen an ARA und sind schwierig
zu verarbeiten. Mikroorganismen wie Porphyridium und Mortierella
sind schwierig im kommerziellen Maßstab zu kultivieren.
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Nahrungsergänzungen
und pharmazeutische Zubereitungen, die PUFAs enthalten, können die
Nachteile der PUFA-Quelle beibehalten. Ergänzungen, wie Fischölkapseln,
können
geringe Mengen der besonderen gewünschten Komponente enthalten
und somit hohe Dosierungen erfordern. Hohe Dosierungen führen zur Aufnahme
großer
Mengen von unerwünschten
Komponenten einschließlich
Kontaminanten. Bei der Bereitstellung von Fettsäureergänzungen muss Sorgfalt geübt werden,
da eine Überdosierung
zur Unterdrückung von
körpereigenen
Biosynthesewegen und in vivo in verschiedenen Lipidfraktionen zur
Konkurrenz mit anderen notwendigen Fettsäuren führen kann, was zu unerwünschten
Ergebnissen führt.
Zum Beispiel haben Inuits, deren Nahrung einen hohen Gehalt an ω3-Fettsäuren aufweist,
eine erhöhte
Blutungsneigung (
US-Patent Nr.
4,874,603 ). Wegen des unangenehmen Geschmacks und Geruchs
der Ergänzungen
können
solche Ernährungen
unerwünscht
sein, und die Patienten-Compliance kann gehemmt sein.
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Mehrere
Enzyme sind an der PUFA-Biosynthese beteiligt. Linolsäure (LA,
18:2 Δ9,
12) wird durch eine Δ12-Desaturase
aus Ölsäure (18:1 Δ9) produziert.
GLA (18:3 Δ6,
9, 12) wird durch eine Δ6-Desaturase
aus Linolsäure
(LA, 18:2 Δ9,
12) produziert. Die Produktion von ARA (20:4 Δ5, 8, 11, 14) aus DGLA (20:3 Δ8, 11, 14)
wird durch eine Δ5-Desaturase
katalysiert. Tiere können
jedoch nicht über
die Δ9-Position
hinaus desaturieren und können
daher Ölsäure (18:1 Δ9) nicht
in Linolsäure
(18:2 Δ9,
12) umwandeln. Ebenso kann α-Linolensäure (ALA,
18:3 Δ9,
12, 15) von Säugern
nicht synthetisiert werden. Andere Eukaryonten einschließlich Pilzen
und Pflanzen haben Enzyme, die an den Positionen Δ12 und Δ15 desaturieren.
Die meisten mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
von Tieren stammen daher entweder aus der Nahrung und/oder aus der
Desaturierung und Verlängerung
von Linolsäure
(18:2 Δ9,
12) oder α-Linolensäure (18:3 Δ9, 12, 15).
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Mehrfach
ungesättigte
Fettsäuren
gelten als nützlich
für ernährungstechnische,
pharmazeutische, industrielle und andere Zwecke. Eine teure Versorgung
mit mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
aus natürlichen Quellen
und aus der chemischen Synthese ist für die kommerziellen Bedürfnisse
nicht ausreichend. Daher besteht Interesse daran, genetisches Material,
das an der PUFA-Biosynthese beteiligt ist, von Spezies, die diese Fettsäuren natürlicherweise
produzieren, zu erhalten und das isolierte Material allein oder
in Kombination in einem heterologen System zu exprimieren, das so
manipuliert werden kann, dass es die Produktion von kommerziellen
Mengen von PUFAs erlaubt.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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Neue
Zusammensetzungen und Verfahren für die Herstellung von Stearidonsäure und
Desaturasen in Pflanzen und Pflanzenzellen werden bereitgestellt.
Die Verfahren beinhalten das Wachsenlassen einer Pflanze, in deren
Genom Folgendes integriert ist: ein erstes DNA-Konstrukt, das in
der 5' → 3'-Transcriptionsrichtung einen
Promotor, der in einer Pflanzensamenzelle funktioniert, eine DNA-Sequenz, die eine
Delta-6-Desaturase codiert, und einen in einer Pflanzenzelle funktionierenden
Transcriptionsterminationsbereich umfasst, und ein zweites Konstrukt,
das in der 5' → 3'-Transcriptionsrichtung
einen Promotor, der in einer Pflanzensamenzelle funktioniert, und
eine DNA-Sequenz, die eine Delta-15-Desaturase codiert, umfasst; und das
Wachsenlassen der Pflanze unter Bedingungen, bei denen die Delta-6-Desaturase
und die Delta-15-Desaturase exprimiert werden. Vorzugsweise weist
die Pflanze ein drittes Konstrukt auf, das in ihr Genom integriert
ist, wobei das dritte Konstrukt in der 5'-3'-Transcriptionsrichtung
einen Promotor, der in einer Pflanzensamenzelle funktioniert, und
eine DNA-Sequenz, die eine Delta-12-Desaturase codiert, aufweist.
Die Expression des Desaturase-Polypeptids sorgt für eine Veränderung
im PUFA-Profil von Wirtspflanzenzellen infolge von veränderten Konzentrationen
von Enzymen, die an der PUFA-Biosynthese beteiligt sind. Von besonderem
Interesse ist die selektive Steuerung der PUFA-Produktion in Pflanzensamen.
Die Erfindung findet Verwendung bei der Produktion von Stearidonsäure im großen Maßstab und
der Formmodifikation des Fettsäureprofils
von Samen und/oder Pflanzensamenölen.
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Die
Erfindung stellt weiterhin eine transgene Pflanze oder einen Samen
davon bereit, in deren Genom ein erstes DNA-Konstrukt, das in der
5' → 3'-Transcriptionsrichtung
einen Promotor, der in einer Pflanzensamenzelle funktioniert, eine
DNA-Sequenz, die eine Delta-6-Desaturase codiert, und einen in einer
Pflanzenzelle funktionierenden Transcriptionsterminationsbereich
umfasst, und ein zweites Konstrukt, das in der 5' → 3'-Transcriptionsrichtung
einen Promotor, der in einer Pflanzensamenzelle funktioniert, und
eine DNA-Sequenz, die eine Delta-15-Desaturase
codiert, umfasst, integriert ist und die Delta-6-Desaturase und
Delta-15-Desaturase exprimieren und Stearidonsäure enthaltendes Samenöl produzieren
kann. Der Samen der obigen transgenen Pflanze umfasst vorzugsweise
etwa 5 Gew.-% oder mehr an Stearidonsäure als Komponente der Gesamtfettsäuren, die
man in dem Samenöl
findet. Die Erfindung stellt weiterhin Samenöl, das aus dem Samen der transgenen
Pflanze erhalten wird, und ein Pflanzensamengewebe der transgenen
Pflanze, das das Samenöl
umfasst, bereit.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
mögliche
Wege für
die Synthese von Eicosatriensäure
(20:3, Δ5,
8, 11), Arachidonsäure (20:4, Δ5, 8, 11,
14) und Stearidonsäure
(18:4, Δ6,
9, 12, 15) aus Palmitinsäure
(C16) aus einer Vielzahl von Organismen
einschließlich
Algen, Mortierella und dem Menschen. Diese PUFAs können als
Vorläufer
für andere
Moleküle
dienen, die für
den Menschen und andere Tiere wichtig sind, einschließlich Prostacyclinen,
Leukotrienen und Prostaglandinen, von denen einige gezeigt sind.
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2 zeigt
mögliche
Wege für
die Produktion von PUFAs neben ARA einschließlich Taxolsäure und Pinolensäure, die
wiederum von einer Vielzahl von Organismen zusammengestellt wurden.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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Um
ein völliges
Verständnis
der Erfindung zu gewährleisten,
werden die folgenden Definitionen angegeben:
Δ5-Desaturase: Δ5-Desaturase
ist ein Enzym, das eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen
5 und 6 gezählt
vom Carboxylende eines Fettsäuremoleküls einführt.
Δ6-Desaturase: Δ6-Desaturase
ist ein Enzym, das eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen
6 und 7 gezählt
vom Carboxylende eines Fettsäuremoleküls einführt.
Δ9-Desaturase: Δ9-Desaturase
ist ein Enzym, das eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen
9 und 10 gezählt
vom Carboxylende eines Fettsäuremoleküls einführt.
Δ12-Desaturase: Δ12-Desaturase
ist ein Enzym, das eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 12
und 13 gezählt
vom Carboxylende eines Fettsäuremoleküls einführt.
Fettsäuren: Fettsäuren sind
eine Klasse von Verbindungen, die eine lange Kohlenwasserstoffkette
und eine terminale Carboxylatgruppe enthalten. Zu den Fettsäuren gehören die
folgenden:
| Fettsäure |
| 12:0 | Laurinsäure | |
| 16:0 | Palmitinsäure | |
| 16:1 | Palmitolsäure | |
| 18:0 | Stearinsäure | |
| 18:1 | Ölsäure | Δ9-18:1 |
| 18:2 Δ5, 9 | Taxolsäure | Δ5, 9-18:2 |
| 18:2 Δ6, 9 | 6,9-Octadecadiensäure | Δ6, 9-18:2 |
| 18:2 | Linolsäure | Δ9, 12-18:2
(LA) |
| 18:3 Δ6, 9, 12 | γ-Linolensäure | Δ6, 9, 12-18:3
(GLA) |
| 18:3 Δ5, 9, 12 | Pinolensäure | Δ5, 9, 12-18:3 |
| 18:3 | α-Linolensäure | Δ9, 12, 15-18:3
(ALA) |
| 18:4 | Stearidonsäure | Δ6, 9, 12,
15-18:4 (SDA) |
| 20:0 | Arachinsäure | |
| 20:1 | Eicosaensäure | |
| 20:2 Δ8, 11 | | Δ8, 11 |
| 20:3 Δ5, 8, 11 | Eicosatriensäure | Δ5, 8, 11 |
| 22:0 | Behensäure | |
| 22:1 | Erucasäure | |
| 22:2 | Docosadiensäure | |
| 20:4 γ6 | Arachidonsäure | Δ5, 8, 11,
14-20:4 (ARA) |
| 20:3 γ6 | γ6-Eicosatriendihomo-γ-linolensäure | Δ8, 11, 14-20:3
(DGLA) |
| 20:5 γ3 | Eicosapentaensäure (Timnodonsäure) | Δ5, 8, 11,
14, 17-20:5 (EPA) |
| 20:3 γ3 | γ3-Eicosatriensäure | Δ11, 16, 17-20:3 |
| 20:4 γ3 | γ3-Eicosatetraensäure | Δ8, 11, 14,
17-20:4 |
| 22:5 γ3 | Docosapentaensäure | Δ7, 10, 13,
16, 19-22:5 (γ3DPA) |
| 22:6 γ3 | Docosahexaensäure (Cervonsäure) | Δ4, 7, 10,
13, 16, 19-22:6 (DHA) |
| 24:0 | Lignocerinsäure | |
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Berücksichtigt
man diese Definitionen, so betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Konstrukte, die mit der
Produktion von Fettsäuren
in Pflanzen zusammenhängen.
Es werden Verfahren und Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine
Modifikation des Gehalts von Pflanzenzellen an mehrfach ungesättigten
langkettigen Fettsäuren
ermöglichen.
Pflanzenzellen werden mit einer Expressionscassette transformiert,
die eine DNA umfasst, welche ein Polypeptid codiert, das die Menge
von einer oder mehreren PUFAs in einer Pflanzenzelle erhöhen kann.
Die Integrationskonstrukte sorgen für eine Integration der Expressionscassette
in das Genom einer Wirtszelle. Wirtszellen werden so manipuliert,
dass sie eine Sense-DNA exprimieren, die ein oder mehrere Polypeptide
codiert, die Desaturase-Aktivität
aufweisen. "Desaturase" bedeutet ein Polypeptid,
das eine oder mehrere Fettsäuren
desaturieren kann, wobei eine interessierende einfach oder mehrfach
ungesättigte Fettsäure oder
ein Vorläufer
davon entsteht. "Polypeptid" bedeutet eine beliebige
Kette von Aminosäuren
unabhängig
von ihrer Länge
oder posttranslationalen Modifikation, zum Beispiel Glycosylierung
oder Phosphorylierung. Das oder die Substrate für das exprimierte Enzym kann
von der Wirtszelle produziert oder exogen zugeführt werden.
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Um
eine Expression in einer Wirtszelle zu erreichen, wird die transformierte
DNA funktionell mit transcriptionalen und translationalen initiations-
und terminationsregulierenden Bereichen, die in der Wirtszelle funktionieren,
assoziiert. Konstrukte, die das zu exprimierende Gen umfassen, sorgen
für eine
Integration in das Genom der Wirtszelle. Für die Produktion von SDA umfassen
die Expressionscassetten eine Cassette, die für Δ6-Desaturase-Aktivität sorgt,
insbesondere in einer Wirtszelle, die ALA produziert oder aufnehmen
kann.
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Produktion von Fettsäuren durch
transgene Pflanzen
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Die
Produktion von PUFAs durch transgene Pflanzen bietet gegenüber der
Reinigung aus natürlichen Quellen,
wie Fischen oder Pflanzen, mehrere Vorteile. Die Produktion von
Fettsäuren
aus rekombinanten Pflanzen ermöglicht
es, das natürlich
vorkommende Fettsäureprofil
der Pflanze zu verändern,
indem für
neue Synthesewege im Wirt gesorgt wird, wodurch die Mengen der gewünschten PUFAs
oder von konjugierten Formen davon erhöht und die Mengen der unerwünschten
PUFAs gesenkt werden. Die Produktion von Fettsäuren in transgenen Pflanzen
bietet auch den Vorteil, dass die Expression von Desaturase-Genen
in besonderen Geweben und/oder Pflanzenteilen bedeutet, dass stark
erhöhte
Mengen an gewünschten
PUFAs in diesen Geweben und/oder Teilen erreicht werden können, was
die Gewinnung aus diesen Geweben ökonomischer macht. Die gewünschten
PUFAs können
in Samen exprimiert werden; Verfahren zum Isolieren von Samenölen sind
gut etabliert. Außer
der Bereitstellung einer Quelle für die Reinigung von gewünschten
PUFAs können
Samenölkomponenten
durch die Expression von Desaturase-Genen, entweder allein oder
in Kombination mit anderen Genen, wie Elongasen, manipuliert werden,
wobei man Samenöle
mit einem besonderen PUFA-Profil in konzentrierter Form erhält. Die
konzentrierten Samenöle
können
dann zu Tiermilch und/oder synthetischer oder halbsynthetischer
Milch gegeben werden, um als Säuglingsrezeptur
zu dienen, wo ein Stillen beim Menschen unmöglich oder unerwünscht ist,
oder in Fällen
von Unterernährung
oder Krankheit sowohl bei Erwachsenen als auch bei Säuglingen.
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Zur
Produktion von Stearidonsäure
sind je nach der Wirtszelle, der Verfügbarkeit des Substrats und dem
oder den gewünschten
Endprodukten mehrere Polypeptide, insbesondere Desaturasen, von
Interesse, einschließlich
solcher Polypeptide, die die Umwandlung von ALA zu SDA, von Ölsäure zu LA
oder von LA zu ALA katalysieren; dazu gehören Enzyme, die in der Δ6-, Δ12- oder Δ15-Position
desaturieren. Zu den Kriterien für
die Auswahl eines speziellen Polypeptids mit Desaturase-Aktivität gehören das
pH-Optimum des Polypeptids, die Frage, ob das Polypeptid ein geschwindigkeitsbestimmendes
Enzym oder eine Komponente davon ist, ob die verwendete Desaturase
für die
Synthese einer gewünschten
mehrfach ungesättigten
Fettsäure
wesentlich ist, und/oder Cofaktoren, die für das Polypeptid erforderlich
sind. Das exprimierte Polypeptid hat vorzugsweise Parameter, die
mit der biochemischen Umgebung seines Ortes in der Wirtszelle verträglich sind. Zum
Beispiel kann es sein, dass das Polypeptid mit anderen Enzymen in
der Wirtszelle um das Substrat konkurrieren muss. Daher werden Analysen
in Bezug auf den Km-Wert und die spezifische
Aktivität
des fraglichen Polypeptids in Betracht gezogen, wenn man die Eignung
eines gegebenen Polypeptids zur Modifikation der PUFA-Produktion
in einer gegebenen Wirtszelle bestimmt. Das in einer bestimmten
Situation verwendete Polypeptid ist daher eines, das unter den in
der gewünschten
Wirtszelle vorhandenen Bedingungen funktionieren kann, aber ansonsten
kann es ein beliebiges Polypeptid mit Desaturase-Aktivität sein,
das das gewünschte Merkmal
aufweist, die relative Produktion von Stearidonsäure modifizieren zu können. Ein
beispielhaftes Schema für
die Synthese von Arachidonsäure
(20:4 Δ5,
8, 11, 14) aus Palmitinsäure
(C16) ist in 1 gezeigt.
Ein Schlüsselenzym
auf diesem Weg ist eine Δ5-Desaturase,
die DH-γ-Linolensäure (DGLA,
Eicosatriensäure)
in ARA umwandelt. Die Umwandlung von α-Linolensäure (ALA) in Stearidonsäure durch
eine Δ6-Desaturase
ist ebenfalls gezeigt. Die Produktion von PUFAs neben ARA einschließlich EPA
und DHA ist in 2 gezeigt. Ein Schlüsselenzym
bei der Synthese von Arachidonsäure
(20:4 Δ5,
8, 11, 14) aus Stearinsäure
(C18) ist eine Δ6-Desaturase, die die Linolsäure in γ-Linolensäure umwandelt.
Die Umwandlung von α-Linolensäure (ALA) in
Stearidonsäure
durch eine Δ6-Desaturase
ist ebenfalls gezeigt. Die Wahl der Kombination der verwendeten Cassetten
hängt zum
Teil von dem PUFA-Profil der Wirtszelle ab.
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Quellen von Polypeptiden mit
Desaturase-Aktivität
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Quellen
von Polypeptiden mit Desaturase-Aktivität und Oligonucleotide, die
solche Polypeptide codieren, sind Organismen, die eine gewünschte mehrfach
ungesättigte
Fettsäure
produzieren. Als Beispiel können Mikroorganismen,
die GLA oder SDA produzieren, als Quelle von Δ6-Desaturase- und/oder Δ12-Desaturase-Genen
verwendet werden. Zu diesen Mikroorganismen gehören zum Beispiel solche, die
zu den Gattungen Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora,
Penicillium, Porphyridium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus,
Rhodotorula und Entomophthora gehören. Im Kontext der Erfindung
stammt die Δ6-Desaturase-codierende
Sequenz vorzugsweise von der Gattung Mortierella. Innerhalb der
Gattung Porphyridium ist Porphyridium cruentum von besonderem Interesse.
Innerhalb der Gattung Mortierella sind Mortierella elongata, Mortierella
exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana var. angulispora
und Mortierella alpina von besonderem Interesse. Innerhalb der Gattung
Mucor sind Mucor circinelloides und Mucor javanicus von besonderem
Interesse.
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DNAs,
die gewünschte
Desaturasen codieren, können
auf vielerlei Weise identifiziert werden. Als Beispiel wird eine
Quelle der gewünschten
Desaturase, zum Beispiel genomische oder cDNA-Bibliotheken von Mortierella,
mit nachweisbaren enzymatisch oder chemisch synthetisierten Sonden
durchmustert, die aus DNA, RNA oder nicht natürlich vorkommenden Nucleotiden
oder Gemischen davon hergestellt werden können. Sonden können enzymatisch
aus DNAs von bekannten Desaturasen für Hybridisierungsverfahren
mit normaler oder reduzierter Stringenz synthetisiert werden. Oligonucleotidsonden
können
auch verwendet werden, um Quellen zu durchmustern, und können auf
Sequenzen bekannter Desaturasen einschließlich Sequenzen, die unter
bekannten Desaturasen konserviert werden, oder auf Peptidsequenzen,
die von dem gewünschten
gereinigten Protein erhalten werden, beruhen. Oligonucleotidsonden
auf der Basis von Aminosäuresequenzen
können
degeneriert sein, so dass sie die Degeneriertheit des genetischen
Codes umfassen, oder sie können
zugunsten der bevorzugten Codons des Quellorganismus ausgewählt sein.
Oligonucleotide können auch
als Primer für
PCR ausgehend von revers transcribierter mRNA aus einer bekannten
oder vermuteten Quelle verwendet werden: Bei dem PCR-Produkt kann es sich
um die cDNA voller Länge
handeln, oder es kann verwendet werden, um eine Sonde zu erzeugen,
mit der man die gewünschte
cDNA voller Länge
erhält. Alternativ
dazu kann ein gewünschtes
Protein auch vollständig
synthetisiert werden und die Totalsynthese einer DNA, die dieses
Polypeptid codiert, durchgeführt
werden.
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Sobald
die gewünschte
genomische DNA oder cDNA isoliert ist, kann sie nach bekannten Verfahren sequenziert
werden. Es ist in der Technik anerkannt, dass solche Verfahren fehlerbehaftet
sind, so dass die mehrfache Sequenzierung desselben Bereichs Routine
ist, und es wird immer noch erwartet, dass sie zu messbaren Fehlerraten
in der resultierenden abgeleiteten Sequenz führt, insbesondere in Bereichen
mit wiederholten Domänen,
einer extensiven Sekundärstruktur
oder ungewöhnlichen
Basenzusammensetzungen, wie Bereichen mit hohen GC-Basengehalt.
Wenn Diskrepanzen auftreten, kann eine erneute Sequenzierung erfolgen,
wobei spezielle Verfahren eingesetzt werden. Zu den speziellen Verfahren
können
die Veränderung der
Sequenzierungsbedingungen gehören
durch Verwendung von: anderen Temperaturen; anderen Enzymen; Proteinen,
die die Fähigkeit
von Oligonucleotiden zur Bildung von Strukturen höherer Ordnung
verändern;
veränderte
Nucleotide, wie ITP oder methyliertes dGTP: andere Gelzusammensetzungen,
zum Beispiel Zugabe von Formamid; andere Primer oder Primer, die
in anderen Abständen
von dem Problembereich lokalisiert sind; oder andere Matrizen, wie
einzelsträngige
DNAs. Eine Sequenzierung von mRNA kann ebenfalls eingesetzt werden.
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Meistens
stammt ein Teil oder die ganze codierende Sequenz für das Polypeptid
mit der Desaturase-Aktivität
aus einer natürlichen
Quelle. In einigen Situationen ist es jedoch wünschenswert, alle oder einen Teil
der Codons zu modifizieren, zum Beispiel, um die Expression zu verstärken, indem
man vom Wirt bevorzugte Codons einsetzt. Vom Wirt bevorzugte Codons
können
anhand der Codons mit der größten Häufigkeit in
den Proteinen, die in einer besonderen interessierenden Wirtsspezies
in der größten Menge
exprimiert werden, bestimmt werden. Die codierende Sequenz für ein Polypeptid
mit Desaturase-Aktivität
kann also ganz oder teilweise synthetisiert werden. Es kann auch
die ganze oder ein Teil der DNA synthetisiert werden, um destabilisierende
Sequenzen oder Bereiche mit einer Sekundärstruktur, die in der transcribierten
mRNA vorhanden sein würde,
zu entfernen. Die ganze oder Teile der DNA können auch synthetisiert werden,
um die Basenzusammensetzung so zu verändern, dass sie in der gewünschten
Wirtszelle besonders bevorzugt ist. Verfahren zum Synthetisieren
von Sequenzen und Zusammenbringen von Sequenzen sind in der Literatur
gut etabliert. In-vitro-Mutagenese und Selektion, ortsspezifische
Mutagenese oder andere Mittel können
eingesetzt werden, um Mutationen von natürlich vorkommenden Desaturase-Genen
zu erhalten und somit ein Polypeptid zu produzieren, das in vivo
eine Desaturase-Aktivität
mit wünschenswerteren
physikalischen und kinetischen Parametern für die Funktion in der Wirtszelle
aufweist, wie eine längere
Halbwertszeit oder eine höhere
Produktionsgeschwindigkeit einer gewünschten mehrfach ungesättigten
Fettsäure.
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Wünschenswerte
cDNAs haben weniger als 60% A + T-Zusammensetzung, vorzugsweise
weniger als 50% A + T-Zusammensetzung. Auf einer lokalisierten Skala
eines gleitenden Fensters von 20 Basenpaaren gibt es vorzugsweise
keine lokalisierten Bereiche der cDNA mit mehr als 75% A + T-Zusammensetzung;
bei einem Fenster von 60 Basenpaaren gibt es vorzugsweise keine
lokalisierten Bereiche der cDNA mit mehr als 60% und besonders bevorzugt
keine lokalisierten Bereiche mit mehr als 55% A + T-Zusammensetzung.
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Mortierella-alpina-Desaturasen
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Von
besonderem Interesse sind die Mortierella-alpina-Δ6-Desaturase,
-Δ12-Desaturase und -Δ15-Desaturase.
Das Gen, das die Mortierella-alpina-Δ6-Desaturase codiert, kann in transgenen
Pflanzen oder Tieren exprimiert werden, um eine stärkere Synthese
von Stearidonsäure
(SDA) aus ALA zu bewirken. Andere DNAs, deren Sequenz im Wesentlichen
identisch mit derjenigen der Mortierella-alpina-Δ6-Desaturase-DNA ist oder die
Polypeptide codieren, deren Sequenz im Wesentlichen identisch mit
derjenigen des Mortierella-alpina-Δ6-Desaturase-Polypeptids ist, können ebenfalls
verwendet werden.
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Das
Gen, das die Mortierella-alpina-Δ12-Desaturase
codiert, kann in transgenen Pflanzen exprimiert werden, so dass
eine stärkere
Synthese von LA aus Ölsäure bewirkt
wird. Andere DNAs, die mit der Mortierella-alpina-Δ12-Desaturase-DNA
im Wesentlichen identisch sind oder die Polypeptide codieren, die
mit dem Mortierella-alpina-Δ12-Desaturase-Polypeptids
im Wesentlichen identisch sind, können ebenfalls verwendet werden.
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"Im Wesentlichen identisch
in der Sequenz" bedeutet
eine Aminosäuresequenz
oder Nucleinsäuresequenz,
die in der Reihenfolge steigender Präferenz wenigs tens 60%, 80%,
90% oder 95% Homologie mit der Mortierella-alpina-Desaturase-Aminosäuresequenz
oder Nucleinsäuresequenz,
die die Aminosäuresequenz codiert,
aufweist. Für
Polypeptide beträgt
die Länge
der Vergleichssequenzen im Allgemeinen wenigstens 16 Aminosäuren, vorzugsweise
wenigstens 20 Aminosäuren
oder am meisten bevorzugt 35 Aminosäuren. Für Nucleinsäuren beträgt die Länge der Vergleichssequenzen
im Allgemeinen wenigstens 50 Nucleotide, vorzugsweise wenigstens
60 Nucleotide und besonders bevorzugt wenigstens 75 Nucleotide und
am meisten bevorzugt 110 Nucleotide. Die Homologie wird typischerweise
mit Hilfe von Sequenzanalyse-Software gemessen, zum Beispiel dem
Sequence-Analysis-Softwarepaket der Genetics Computer Group, University
of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison,
Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park, St. Madison,
Wisconsin 53715) und MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S.
Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). Diese Software
passt ähnliche
Sequenzen aneinander an, indem sie verschiedenen Substitutionen,
Deletionen und anderen Modifikationen Homologiegrade zuordnet. Zu
den konservativen Substitutionen gehören typischerweise Substitutionen
innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin und Alanin; Valin, Isoleucin
und Leucin; Asparaginsäure,
Glutaminsäure,
Asparagin und Glutamin; Serin und Threonin; Lysin und Arginin; sowie
Phenylalanin und Tyrosin. Substitutionen können auch auf der Basis der konservierten
Hydrophobie oder Hydrophilie (Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol.
157: 105-132, 1982) oder auf der Basis der Fähigkeit, eine ähnliche
Sekundärstruktur
des Polypeptids anzunehmen (Chou und Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45-148, 1978), vorgenommen
werden.
-
Expression von Desaturase-Genen
-
Sobald
die DNA, die ein Desaturase-Polypeptid codiert, erhalten wurde,
wird sie in einen Vektor eingefügt,
der zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist, oder er wird in vitro
mit Techniken wie PCR oder Lang-PCR vermehrt. Zu den replizierenden
Vektoren können
Plasmide, Phagen, Viren und Cosmide gehören. Zu den wünschenswerten
Vektoren gehören
solche, die für
die Mutagenese des interessierenden Gens oder für die Expression des interessierenden
Gens in Wirtszellen nützlich
sind. Die Technik der Lang-PCR ermöglichte die in-vitro-Vermehrung von großen Konstrukten,
so dass Modifikationen des interessierenden Gens, wie Mutagenese
oder Addition von Expressionssignalen, und die Vermehrung der resultierenden
Konstrukte ganz in vitro ohne Verwendung eines replizierenden Vektors
oder einer Wirtszelle erfolgen können.
-
Für die Expression
eines Desaturase-Polypeptids werden funktionelle transcriptionale
und translationale Initiations- und Terminationsbereiche funktionell
mit der DNA verknüpft,
die das Desaturase-Polypeptid codiert. Transcriptionale und translationale
Initiations- und Terminationsbereiche sind von einer Vielzahl von nichtausschließlichen
Quellen abgeleitet, einschließlich
der zu exprimierenden DNA, Genen, die bekanntermaßen oder
vermutlich zur Expression in dem gewünschten System befähigt sind,
Expressionsvektoren, chemischer Synthese oder von einem endogenen
Locus in einer Wirtszelle. Die Expression in einem Pflanzengewebe
und/oder Pflanzenteil bietet gewisse Effizienzen, insbesondere wenn
das Gewebe oder Teil leicht geerntet werden kann, wie Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Wurzeln
usw. Die Expression kann innerhalb der Pflanze zu diesem Ort gelenkt
werden, indem man spezifische regulatorische Sequenzen verwendet,
wie diejenigen von
US-Patent
Nr. 5,463,174 ,
4,943,674 ,
5,106,739 ,
5,175,095 ,
5,420,034 ,
5,188,958 und
5,589,379 . Alternativ dazu kann das
exprimierte Protein auch ein Enzym sein, das ein Produkt produziert,
welches entweder direkt oder nach weiteren Modifikationen in eine
Flüssigkeitsfraktion
aus der Wirtspflanze eingebaut werden kann. Im vorliegenden Fall
kann die Expression von Desaturase-Genen die Mengen an Stearidonsäure, die man
in Pflanzensamen und/oder Pflanzensamengeweben findet, verändern. Der
Initiationsbereich ist ein Promotor, der in einer Pflanzensamenzelle
funktioniert. Vorzugsweise ist der Promotor des ersten DNA-Konstrukts ein
Napin-Promotor oder stammt aus dem Transcriptionsstartbereich der
75-Untereinheit von Sojabohnen-β-Conglycinin.
Der Terminationsbereich funktioniert in einer Pflanzenzelle. Er
kann vom 3'-Bereich
des Gens, von dem der Startbereich erhalten wurde, oder von einem
anderen Gen abgeleitet sein. Von einer großen Zahl von Termi nationsbereichen
ist bekannt und hat sich herausgestellt, dass sie in einer Vielzahl
von Wirten aus derselben und verschiedenen Gattungen und Spezies
zufriedenstellend sind. Der Terminationsbereich wird gewöhnlich eher
nach Zweckmäßigkeit
als aufgrund irgendeiner bestimmten Eigenschaft ausgewählt.
-
Die
Wahl einer Wirtszelle ist zum Teil durch das gewünschte PUFA-Profil der transgenen
Zelle und das native Profil der Wirtszelle beeinflusst. Zum Beispiel
für die
Produktion von Linolsäure
aus Ölsäure codiert
die verwendete DNA-Sequenz
ein Polypeptid mit Δ12-Desaturase-Aktivität, und für die Produktion
von GLA aus Linolsäure
codiert die verwendete DNA-Sequenz ein Polypeptid mit Δ6-Desaturase-Aktivität. Die Verwendung einer
Wirtszelle, die Δ12-Desaturase-Aktivität exprimiert
und die keine oder nur wenig Δ15-Desaturase-Aktivität aufweist,
kann mit einer Expressionscassette erfolgen, die für die Überexpression
nur von Δ6-Desaturase sorgt,
ist im Allgemeinen ausreichend, um für eine verstärkte GLA-Produktion
in der transgenen Zelle zu sorgen. Wenn die Wirtszelle Δ9-Desaturase-Aktivität exprimiert,
kann die Expression sowohl einer Δ12-
als auch einer Δ6-Desaturase
für eine
verstärkte
GLA-Produktion sorgen. In besonderen Fällen, bei denen die Expression
der Δ6-Desaturase-Aktivität mit der
Expression von Δ12-Desaturase-Aktivität gekoppelt
ist, ist es wünschenswert,
dass die Wirtszelle eine niedrige Δ15-Desaturase-Aktivität natürlicherweise
aufweist oder entsprechend mutiert ist. Alternative dazu kann eine
Wirtszelle für
die Δ6-Desaturase-Expression
eine hohe Δ12-Desaturase-Aktivität aufweisen
oder entsprechend mutiert sein.
-
Die
Expression in einer Wirtszelle kann transient oder stabil erreicht
werden. Eine transiente Expression kann ausgehend von eingeführten Konstrukten
erfolgen, die Expressionssignale enthalten, die in der Wirtszelle
funktionieren, wobei diese Konstrukte aber nicht in der Wirtszelle
repliziert und nur selten integriert werden oder wobei die Wirtszelle
nicht proliferiert. Eine transiente Expression kann auch erreicht
werden, indem man die Aktivität
eines regulierbaren Promotors induziert, der funktionell mit dem
interessierenden Gen verknüpft
ist, obwohl solche induzierbaren Systeme häufig ein niedriges Grundexpressi onsniveau
aufweisen. Eine stabile Expression kann durch Einführung eines
Konstrukts erreicht werden, das in das Wirtsgenom integriert werden
kann oder sich in der Wirtszelle autonom repliziert. Die stabile
Expression des interessierenden Gens kann durch die Verwendung eines
selektierbaren Markers selektiert werden, der sich auf dem Expressionskonstrukt
befindet oder zusammen mit diesem transfiziert wird, und dann erfolgt
eine Selektion von Zellen, die den Marker exprimieren. In der vorliegenden
Erfindung resultiert die stabile Expression in der Pflanze aus einer
Integration. Die Integration von Konstrukten kann statistisch innerhalb
des Wirtsgenoms erfolgen oder kann durch die Verwendung von Konstrukten,
die ausreichende Bereiche der Homologie mit dem Wirtsgenom enthalten,
um sie zur Rekombination mit dem Wirtslocus zu lenken, gelenkt werden.
Wenn Konstrukte zu einem endogenen Locus gelenkt werden, können alle
oder einige der transcriptionalen oder translationalen regulatorischen
Bereiche vom endogenen Locus bereitgestellt werden.
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Wenn
eine verstärkte
Expression des Desaturase-Polypeptids in der Quellpflanze gewünscht wird, können mehrere
Verfahren eingesetzt werden. Zusätzliche
Gene, die das Desaturase-Polypeptid codieren, können in den Wirtsorganismus
eingeführt
werden. Die vom nativen Desaturase-Locus ausgehende Expression kann
auch durch homologe Rekombination erhöht werden, indem man zum Beispiel
einen stärkeren
Promotor in das Wirtsgenom einsetzt, um eine verstärkte Expression
zu verursachen, indem man destabilisierende Sequenzen entweder aus
der mRNA oder dem dort codierten Protein durch Deletion der entsprechenden Information
aus dem Wirtsgenom entfernt oder indem man stabilisierende Sequenzen
an die mRNA addiert (siehe
US-Patent
Nr. 4,910,141 und
5,500,365 .)
-
Wenn
es wünschenswert
ist, mehr als ein unterschiedliches Gen, geeignete regulatorische
Bereiche und Expressionsverfahren zu exprimieren, können eingeführte Gene
in der Wirtszelle durch Integration in das Wirtsgenom vermehrt werden.
Jedes eingeführte
Konstrukt sollte ein anderes Selektionsmittel haben und sollte keine
Homologie zu den anderen Konstrukten aufweisen, um eine stabile
Expression aufrechtzuerhalten und eine Umverteilung von Elementen
unter den Konstrukten zu verhindern. Eine vernünftige Wahl von regulatorischen
Bereichen, Selektionsmitteln und Verfahren zur Vermehrung des eingeführten Konstrukts
kann experimentell bestimmt werden, so dass alle eingeführten Gene
auf dem notwendigen Niveau exprimiert werden, um für eine Synthese
der gewünschten
Produkte zu sorgen.
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Konstrukte,
die das interessierende Gen umfassen, können durch Standardtechniken
in eine Wirtszelle eingeführt
werden. Zu diesen Techniken gehören
Transfektion, Infektion, Partikelbeschuss, Elektroporation, Mikroinjektion,
Scrape-Loading oder jedes andere Verfahren, mit dem das interessierende
Gen in die Wirtszelle eingeführt
wird (siehe
US-Patent Nr. 4,743,548 ,
4,795,855 ,
5,068,193 ,
5,188,958 ,
5,463,174 ,
5,565,346 und USPN
5,565,347 ). Zweckmäßigerweise wird eine Wirtszelle,
die durch irgendein Verfahren so manipuliert wurde, dass sie eine
DNA-Sequenz oder ein Konstrukt aufnimmt, hier als "transformiert" oder "rekombinant" bezeichnet. Der
betreffende Wirt weist wenigstens eine Kopie des Expressionskonstrukts
auf und kann auch zwei oder mehr aufweisen, je nachdem, ob das Gen
nur in das Genom integriert oder zusätzlich amplifiziert wird oder
ob es auf einem extrachromosomalen Element mit mehreren Kopienzahlen
vorliegt.
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Die
transformierte Wirtszelle kann durch Selektion eines in dem eingeführten Konstrukt
enthaltenen Markers identifiziert werden. Alternativ dazu kann auch
ein getrenntes Markerkonstrukt zusammen mit dem gewünschten
Konstrukt eingeführt
werden, da durch viele Transformationstechniken viele DNA-Moleküle in Wirtszellen
eingeführt
werden. Typischerweise werden transformierte Wirte anhand ihrer
Fähigkeit
selektiert, auf Selektionsmedien zu wachsen. Selektionsmedien können ein
Antibiotikum enthalten oder einen Faktor, der für das Wachstum des untransformierten
Wirts notwendig ist, wie einen Nährstoff
oder Wachstumsfaktor, nicht enthalten. Ein eingeführtes Marker-Gen
kann daher Antibiotikum-Resistenz verleihen oder einen essentiellen Wachstumsfaktor
oder ein essentielles Enzym codieren und das Wachstum auf Selektionsmedien ermöglichen,
wenn es in der transformierten Wirtszelle exprimiert wird. Wünschenswerterweise
sind Resistenz gegen Kanamycin und das Aminoglycosid G418 von Interesse
(siehe
US-Patent Nr. 5,034,322 ).
Die Selektion eines transformierten Wirts kann auch erfolgen, wenn
das exprimierte Markerprotein entweder direkt oder indirekt nachgewiesen
werden kann. Das Markerprotein kann allein oder als Fusion mit einem
anderen Protein exprimiert werden. Das Markerprotein kann anhand
seiner enzymatischen Aktivität
nachgewiesen werden: Zum Beispiel kann β-Galactosidase das Substrat
X-gal in ein farbiges Produkt umwandeln, und Luciferase kann Luciferin
in ein lichtemittierendes Produkt umwandeln. Das Markerprotein kann
anhand seiner lichterzeugenden oder -modifizierenden Merkmale nachgewiesen
werden; zum Beispiel fluoresziert das grüne fluoreszierende Protein
von Aequorea victoria, wenn es mit blauem Licht bestrahlt wird.
Antikörper
können
verwendet werden, um das Markerprotein oder ein molekulares Tag
zum Beispiel an einem interessierenden Protein nachzuweisen. Zellen,
die das Markerprotein oder Tag exprimieren, können zum Beispiel visuell oder
durch Techniken wie FACS oder Panning unter Verwendung von Antikörpern selektiert
werden.
-
Die
Stearidonsäure,
die mit Hilfe der betreffenden Verfahren und Zusammensetzungen produziert wird,
ist im Wirtspflanzen-Samengewebe und/oder Pflanzensamen in Form
der freien Säure
oder in konjugierter Form, wie als Acylglycerine, Phospholipide,
Sulfolipide oder Glycolipide, zu finden und kann mit einer Vielzahl
von Mitteln, die in der Technik wohlbekannt sind, aus der Wirtszelle
extrahiert werden. Zu diesen Mittel gehören die Extraktion mit organischen
Lösungsmitteln,
Ultraschallbehandlung, Extraktion mit überkritischen Fluiden zum Beispiel
unter Verwendung von Kohlendioxid sowie physikalische Mittel wie
Pressen oder Kombinationen davon. Von besonderem Interesse ist die
Extraktion mit Hexan oder Methanol und Chloroform. Falls gewünscht, kann
die wässrige
Schicht angesäuert
werden, um negativ geladene Struktureinheiten zu protonieren und
dadurch die Abtrennung von gewünschten
Produkten in die organische Schicht zu verstärken. Nach der Extraktion können die
organischen Lösungsmittel
durch Verdampfung unter einem Stickstoffstrom entfernt werden. Wenn
sie in konjugierter Form isoliert werden, werden die Produkte enzymatisch
oder chemisch gespalten, so dass die freie Fettsäure oder ein weniger komplexes
interessierendes Konjugat freigesetzt wird, und werden dann weiteren
Manipulationen unterzogen, um ein gewünschtes Endprodukt herzustellen.
Wünschenswerterweise
werden konjugierte Formen von Fettsäuren mit Kaliumhydroxid gespalten.
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Wie
ausführlicher
in den folgenden Beispielen bewiesen wird, führt die Expression der Mortierella-Δ6-Desaturase überraschenderweise
zur Produktion von Stearidonsäure
in dem Öl,
das aus dem Samengewebe der Wirtspflanzenzellen extrahiert wird.
Weiterhin sorgt die Expression der Δ6-Desaturase mit weiteren Desaturasen
für eine
verstärkte
Produktion von SDA im Samenöl.
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Die
vorliegende Erfindung gibt also Verfahren zur Produktion von Stearidonsäure (C18:4)
in Wirtspflanzensamen an. Die Verfahren ermöglichen die Produktion von
SDA in Wirtspflanzensamen im Bereich von 0,3 Gew.-% bis wenigstens
30 Gew.-%, vorzugsweise 5 Gew.-% bis wenigstens 25 Gew.-%, besonders
bevorzugt 7 Gew.-% bis wenigstens 25 Gew.-%. Die SDA wird vorzugsweise
im Samenöl
von Wirtspflanzen produziert, die ein oder mehrere der hier beschriebenen
Expressionskonstrukte enthalten.
-
Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung eine neue Quelle für Stearidonsäure enthaltende
Pflanzenöle
bereit. Die Öle
werden vorzugsweise aus dem Pflanzensamengewebe oder durch Extrahieren
von Öl
aus den Pflanzensamen erhalten. Die Samenöle enthalten Mengen von SDA
im Bereich von 0,3 Gew.-% bis wenigstens 30 Gew.-%, vorzugsweise
5 Gew.-% bis wenigstens 25 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 Gew.-%
bis wenigstens 25 Gew.-%.
-
Reinigung von Fettsäuren
-
Wenn
eine weitere Reinigung notwendig ist, können Standardverfahren eingesetzt
werden. Zu diesen Verfahren gehören
Extraktion, Behandlung mit Harnstoff, fraktionierende Kristallisation,
HPLC, fraktionierende Destillation, Silicagel- Chromatographie, Hochgeschwindigkeitszentrifugation
oder -destillation oder Kombinationen dieser Techniken. Der Schutz
von reaktiven Gruppen, wie der Säure-
oder Alkenylgruppen, kann bei jedem Schritt durch bekannte Techniken
erfolgen, zum Beispiel Alkylierung oder Iodierung. Zu den Verfahren gehören die
Methylierung der Fettsäuren
unter Bildung von Methylestern. Ähnlich
können
die Schutzgruppen auch bei jedem beliebigen Schritt wieder entfernt
werden. Wünschenswerterweise
erfolgt die Reinigung von Fraktionen, die ARA, DHA und EPA enthalten,
durch Behandlung mit Harnstoff und/oder fraktionierende Destillation.
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Verwendungen von Fettsäuren
-
Es
gibt mehrere Verwendungen der Fettsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Sonden auf der Basis der DNAs der vorliegenden Erfindung können bei
Verfahren zum Isolieren von verwandten Molekülen oder bei Verfahren zum
Nachweisen von Organismen, die Desaturasen exprimieren, Verwendung
finden. Wenn sie als Sonden verwendet werden, müssen die DNAs oder Oligonucleotide
nachweisbar sein. Dies wird gewöhnlich
bewerkstelligt, indem man einen Marker entweder an einer internen
Stelle, zum Beispiel über
den Einbau eines modifizierten Rests, oder am 5'- oder 3'-Terminus befestigt. Solche Marker können direkt
nachweisbar sein, können
an ein sekundäres
Molekül
binden, das nachweisbar markiert ist, oder können an ein unmarkiertes sekundäres Molekül und ein
nachweisbar markiertes tertiäres
Molekül
binden; dieses Verfahren kann noch ausgedehnt werden, solange es
praktizierbar ist, ein zufriedenstellend nachweisbares Signal ohne unannehmbare
Niveaus eines Hintergrundsignals zu erreichen. Sekundäre, tertiäre oder
verbrückende
Systeme können
die Verwendung von Antikörpern
beinhalten, die gegen irgendein anderes Molekül einschließlich Markern oder anderer
Antikörper
gerichtet sind, oder sie können
beliebige Moleküle
beinhalten, die aneinander binden, zum Beispiel ein Biotin-Streptavidin/Avidin-System.
Zu den nachweisbaren Markern gehören
typischerweise radioaktive Isotope, Moleküle, die chemisch oder enzymatisch
Licht erzeugen oder verändern,
Enzyme, die nachweisbare Reaktionsprodukte produ zieren, magnetische
Moleküle,
fluoreszierende Moleküle oder
Moleküle,
deren Fluoreszenz- oder Lichtemissionseigenschaften sich bei der
Bindung ändern.
Beispiele für
Markierungsverfahren findet man im
US-Patent
Nr. 5,011,770 . Alternativ dazu kann die Bindung von Zielmolekülen auch
direktnachgewiesen werden, indem man die Änderung der Wärme der
Lösung
bei der Bindung einer Sonde an ein Target über isotherme Titrationskalorimetrie
misst oder indem man die Sonde oder das Target auf eine Oberfläche aufträgt und die Änderung
der von der Oberfläche
ausgehenden Lichtstreuung durch die Bindung des Targets bzw. der
Sonde nachweist, was etwa mit dem BIAcore-System erfolgen kann.
-
Die
Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele besser verständlich.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
Expression von ω-3-Desaturase von C. elegans
in transgenen Pflanzen
-
Die Δ15/ω-3-Aktivität von Brassica
napus kann durch die Expression einer ω-3-Desaturase von C. elegans erhöht werden.
Der Fat-1-cDNA-Klon (Genbank Zugriffs-Nr. L41807; Spychalla, J.P.,
Kinney, A.J. und Browse, J. 1997 P.N.A.S. 94, 1142-1147) wurde von
John Browse an der Washington State University erhalten. Die Fat-1-cDNA
wurde durch PCR so modifiziert, dass Klonierungsstellen eingeführt wurden,
wobei man die folgenden Primer verwendete:
Fat-1forward:
5'-CUACUACUACUACTGCAGACAATGGTCGCTCATTCCTCAGA-3' (SEQ ID Nr. 1)
Fat-1reverse:
5'-CAUCAUCAUCAUGCGGCCGCTTACTTGGCCTTTGCCTT-3' (SEQ ID Nr. 2)
-
Diese
Primer ermöglichten
die Amplifikation des gesamten codierenden Bereichs und addierten
PstI- und NotI-Stellen an das 5'-
bzw. 3'-Ende. Das
PCR-Produkt wurde mit Hilfe des CloneAmp-Systems (GIBCOBRL) in pAMP1
(GIBCOBRL) subkloniert, wobei pCGN5562 entstand. Die Sequenz wurde
durch Sequenzierung beider Stränge
bestätigt,
um sicherzugehen, dass durch die PCR keine Veränderungen eingeführt worden
waren.
-
Ein
Unterschied von einem Basenpaar wurde im Fat-1-codierenden Bereich
aus pCGN5562 gegenüber
der Fat-1-Genbank-Sequenz beobachtet. Das C auf Position 705 der
Fat-1-Sequenz wurde zu einem A in pCGN5562 geändert. Dadurch entsteht eine Änderung
eines GAC-Codons zu GAA, wobei der Asp-Rest auf Position 231 von
Fat-1 zu einem Glu-Rest geändert
wird. Dieselbe Änderung
wurde in Produkten von zwei unabhängigen PCR-Reaktionen unter
Verwendung von Fat-1-Matrize beobachtet und ist höchstwahrscheinlich nicht
das Ergebnis eines Fehleinbaus eines Nucleotids durch PCR. Für die samenspezifische
Expression wurde der Fat-1-codierende Bereich als PstI/NotI-Fragment
aus pCGN5562 herausgeschnitten und zwischen die PstI/NotI-Stellen
des binären
Vektors pCGN8623 eingefügt,
wobei pCGN5563 entstand. pCGN5563 kann durch Agrobacterium-vermittelte
Transformation in Brassica napus eingeführt werden.
-
Konstruktion von pCGN8623
-
Der
Polylinker-Bereich der Napin-Promotorcassette, pCGN7770, wurde ersetzt,
indem man die folgenden Oligonucleotide ligierte:
5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID Nr. 3) und
5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3
(SEQ ID Nr. 4).
-
Diese
Oligonucleotide wurden in SalI/XhoI-verdautes pCGN7770 ligiert,
wobei pCGN8619 entstand. Diese Oligonucleotide codieren BamHI-,
NotI-, HindIII- und PstI-Restriktionsstellen. pCGN8619 enthält die Oligonucleotide
in einer solchen Orientierung, dass sich die PstI-Stelle am nächsten am
5'-regulatorischen
Bereich von Napin befindet. Ein Fragment, das den 5'-regulatorischen
Bereich von Napin, einen Polylinker und den Napin-3'-Bereich enthält, wurde
durch Verdau mit Asp718I aus pCGN8619 entfernt. Das Fragment wurde durch
Auffüllen
der 5'-Überhänge mittels
Klenow-Fragment mit glatten Enden verse hen, dann in pCGN5139 ligiert,
das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der
5'-Überhänge mittels
Klenow-Fragment mit glatten Enden versehen worden war. Ein Plasmid,
das den Einschub in einer solchen Orientierung enthielt, dass sich
der Napin-Promotor am nächsten
an der mit glatten Enden versehenen Asp718I-Stelle von pCGN5139
befand und sich der Napin-3'-Bereich
am nächsten
an der mit glatten Enden versehenen HindIII-Stelle befand, wurde
einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Orientierung des
Einschubs als auch die Integrität
der Klonierungsanschlüsse
zu bestätigen.
Das resultierende Plasmid wurde als pCGN8623 bezeichnet.
-
Zur
Herstellung hoher Konzentrationen von Stearidonsäure in Brassica kann die C.-elegans-ω-3-Desaturase
mit Δ6-
und Δ12-Desaturasen
von Mortierella alpina kombiniert werden. Mit pCGN5563 transformierte
Pflanzen können
mit den unten beschriebenen pCGN5544-transformierten Pflanzen, die Δ6- und Δ12-Desaturase
exprimieren, gekreuzt werden.
-
Die
resultierenden F1-Samen können
auf ihren Stearidonsäuregehalt
analysiert werden, und ausgewählte
F1-Pflanzen können
für eine
Selbstbestäubung
zur Herstellung von F2-Samen oder als Spender für die Produktion von Dihaploiden
oder zusätzliche
Kreuzungen verwendet werden.
-
Ein
alternatives Verfahren zum Kombinieren der Fat-1-cDNA mit M.-alpina-Δ6- und -Δ12-Desaturase besteht
darin, sie auf einer T-DNA für
die Transformation miteinander zu kombinieren. Der Fat-1-codierende Bereich
aus pCGN5562 kann als PstI/NotI-Fragment ausgeschnitten und in PstI/NotI-verdautes
pCGN8619 eingefügt
werden. Die Transcriptionseinheit, die aus dem 5'-regulatorischen Bereich von Napin,
dem Fat-1-codierenden Bereich und dem 3'-regulatorischen Bereich von Napin besteht,
kann als Sse8387I-Fragment ausgeschnitten und in mit Sse8387I geschnittenes
pCGN5544 eingefügt
werden. Das resultierende Plasmid würde drei Napin-Transcriptionseinheiten
enthalten, die die C.-elegans-ω-3-Desaturase,
M.-alpina-Δ6-Desaturase
und M.-alpina-Δ12-Desaturase
enthalten, alle in derselben Richtung orientiert wie die 35S/nptII/tml- Transcriptionseinheit,
die für
die Selektion von transformiertem Gewebe verwendet wird.
-
Beispiel 2
-
Überexpression
von Δ15-Desaturase-Aktivität in transgenem
Canola
-
Die Δ15-Desaturase-Aktivität von Brassica
napus kann durch Überexpression
des Δ15-Desaturase-cDNA-Klons
erhöht
werden.
-
Ein
B.-napus-Δ15-Desaturase-cDNA-Klon
wurde durch PCR-Amplifikation des ersten DNA-Strangs erhalten, der
von B. napus cv. 212/86 abgeleitet war. Die Primer beruhten auf
der veröffentlichten
Sequenz: Genbank-Nr. L01418, Arondel et al., 1992, Science 258:
1353-1355.
-
Die
folgenden Primer wurden verwendet:
Bnd15-FORWARD
5'-CUACUACUACUAGAGCTCAGCGATGGTTGTTGCTATGGAC-3' (SEQ ID Nr. 5)
Bnd15-REVERSE
5'-CAUCAUCAUCAUGAATTCTTAATTGATTTTAGATTTG-3' (SEQ ID Nr. 6)
-
Diese
Primer ermöglichten
die Amplifikation des gesamten codierenden Bereichs und addierten
SacI- und EcoRI-Stellen an das 5'-
bzw. 3'-Ende.
-
Das
PCR-Produkt wurde unter Verwendung des CloneAmp-Systems (GIBCOBRL)
in pAMP1 (GIBCOBRL) subkloniert, wobei pCGN5520 entstand. Die Sequenz
wurde durch Sequenzierung beider Stränge bestätigt, um sicherzugehen, dass
das offene Leseraster intakt blieb. Für die samenspezifische Expression wurde
der Δ15-Desaturase-codierende
Bereich als BamII/SalI-Fragment aus pCGN5520 herausgeschnitten und
zwischen die BglII- und XhoI-Stelle von pCGN7770 eingefügt, wobei
pCGN5557 entstand. Das PstI-Fragment von pCGN5557, das den 5'-regulatorischen
Bereich von Napin, den B.-napus-Δ15- Desaturase-codierenden
Bereich und den 3'-regulatorischen
Bereich von Napin enthielt, wurde in die PstI-Stelle des binären Vektors
pCGN5138 eingefügt,
wobei pCGN5558 entstand. pCGN5558 wurde durch Agrobacterium-vermittelte Transformation
in Brassica napus eingeführt.
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Um
hohe Konzentrationen von Stearidonsäure in Brassica zu erzeugen,
kann die Δ15-Desaturase
mit Δ6-
und Δ12-Desaturase
aus Mortierella alpina kombiniert werden. Mit pCGN5558 transformierte
Pflanzen können
mit pCGN5544-transformierten
Pflanzen, die Δ6-
und Δ12-Desaturase
exprimieren, gekreuzt werden. Die resultierenden F1-Samen werden
auf ihren Stearidonsäuregehalt
analysiert. Eine GC-FAME-Analyse von F1-Halbsamen ergab eine signifikante
Anreicherung von SDA im Samenöl
der Brassica-Linien. SDA-Konzentrationen (18:4) von mehr als ungefähr 25% wurden
in hemizygoten Linien erhalten und sind in Tabelle 1 angegeben.
Ausgewählte
F1-Pflanzen können
für eine
Selbstbestäubung
zur Herstellung von F2-Samen oder als Spender für die Produktion von Dihaploiden
oder zusätzliche
Kreuzungen verwendet werden.
-
Ein
alternatives Verfahren zum Kombinieren der B.-napus-Δ15-Desaturase
mit M.-alpina-Δ6-
und -Δ12-Desaturase
besteht darin, sie auf einer T-DNA für die Transformation miteinander
zu kombinieren. Die Transcriptionscassette, die aus dem 5'-regulatorischen
Bereich von Napin, dem Δ15-Desaturase-codierenden Bereich
und dem 3'-regulatorischen
Bereich von Napin besteht, kann als SwaI-Fragment aus pCGN5557 ausgeschnitten
und in SwaI-verdautes pCGN5544 eingefügt werden. Das resultierende
Plasmid, pCGN5561, enthält
drei Napin-Transcriptionseinheiten,
die die M.-alpina-Δ6-Desaturase,
die B.-napus-Δ15-Desaturase und die
M.-alpina-Δ12-Desaturase
enthalten, alle in derselben Richtung orientiert wie die 35S/nptII/tml-Transcriptionseinheit,
die für
die Selektion von transformiertem Gewebe verwendet wird. Außerdem wurde
die C.-elegans-ω-3-Desaturase-codierende
Sequenz auch in pCGN5544 kloniert, wobei das Konstrukt pCGN5565
entstand.
-
Gepoolte
T2-Samen von Pflanzen, die 5561 enthalten, enthalten erhebliche
Mengen von SDA (18:4), was in Tabelle 2 gezeigt ist. Konzentrationen
von mehr als etwa 7% SDA werden in gepoolten segregierenden 5561-Samen
erhalten. Weiterhin wurden erhebliche Konzentrationen an SDA aus
Samen von 5565-Brassica-Linien
erhalten, was ebenfalls in Tabelle 2 gezeigt ist. Wie in Tabelle
2 gezeigt ist, können
mit den Konstrukten 5561 und 5565 SDA-Konzentrationen im Bereich
von etwa 0,8 Gew.-% bis mehr als etwa 7 Gew.-% erhalten werden.
-
Beispiel 3 (Bezugsbeispiel)
-
Expression
von Δ5-Desaturase
bei der Pflanzenexpression in Blättern
Ma29 ist eine mutmaßliche M.-alpina-Δ5-Desaturase,
was durch Sequenzhomologie bestimmt wurde. Dieses Experiment sollte
bestimmen, ob Blätter,
die Ma29 exprimieren (durch Northern Blotting bestimmt), in der
Lage sind, exogen angewendetes DGLA (20:3) in ARA (20:4) umzuwandeln.
-
Die
Ma29-Desaturase-cDNA wurde durch PCR so modifiziert, dass zweckmäßige Restriktionsstellen für die Klonierung
eingeführt
wurden. Der Desaturasecodierende Bereich wurde unter der Kontrolle
des doppelten 35S-Promotors für
die Expression in Brassica-Blättern
(pCGN5525) in eine d35-Cassette eingefügt, wobei Standardvorschriften
befolgt wurden (siehe
US-Patent
Nr. 5,424,200 und
US-Patent
Nr. 5,106,739 ). Transgene Brassica-Pflanzen, die pCGN5525
enthalten, wurden gemäß Standardvorschriften
erzeugt (siehe
US-Patent Nr.
5,188,958 und
US-Patent
Nr. 5,463,174 ).
-
Im
ersten Experiment wurden drei Pflanzen verwendet: eine Kontrolle,
LP004-1, und zwei transgene, 5525-23 und 5525-29. LP004 ist eine
linolensäurearme
Brassica-Sorte. Blätter
davon wurden jeweils für
eine von drei Behandlungen ausgewählt: Wasser, GLA oder DGLA.
GLA und DGLA wurden als Natriumsalze von NuChek Prep bezogen und
lösten
sich in einer Menge von 1 mg/ml in Wasser. Aliquote wurden unter
N
2 verschlossen und bei -70°C aufbewahrt.
Die Blätter
wurden behandelt, indem man einen 50-μl-Tropfen auf die obere Oberfläche auftrug
und mit einem behandschuhten Finger sachte ausbreitete, so dass
die gesamte Oberfläche
bedeckt war. Anwendungen wurden ungefähr 30 Minuten vor dem Ende
des Lichtzyklus gemacht, um jede Photooxidation der aufgetragenen
Fettsäuren
zu minimieren. Nach 6 Tagen Behandlung wurde ein Blatt von jeder
Behandlung geerntet und durch die Mittelrippe in zwei Hälften geschnitten.
Eine Hälfte
wurde mit Wasser gewaschen, um zu versuchen, nicht eingebaute Fettsäure zu entfernen.
Blattproben wurden über Nacht
lyophilisiert, und die Fettsäurezusammensetzung
wurde durch Gaschromatographie (GC) bestimmt. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 3 gezeigt.
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Mit
GLA behandelte Blätter
enthielten 1,56 bis 2,4 Gew.-% GLA. Die Fettsäureanalyse zeigte, dass die Lipidzusammensetzung
von Kontroll- und transgenen Blättern
im Wesentlichen dieselbe war. Mit DGLA behandelte Blätter von
Kontrollpflanzen enthielten 1,2-1,9 Gew.-% DGLA und Hintergrundmengen
von ARA (0,26-0,27 Gew.-%). Transgene Blätter enthielten nur 0,2-0,7
Gew.-% DGLA, aber die ARA-Konzentrationen waren erhöht (0,74-1,1
Gew.-%), was darauf hinweist, dass die DGLA in diesen Blättern in
ARA umgewandelt wurde.
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Expression in Samen
-
Der
Zweck dieses Experiments bestand darin, zu bestimmen, ob ein Konstrukt
mit dem samenspezifischen Napin-Promotor die Expression in Samen
ermöglichen
würde.
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Die
Ma29-cDNA wurde durch PCR so modifiziert, dass XhoI-Klonierungsstellen
stromaufwärts
und stromabwärts
des Start- bzw. Stopcodons eingeführt wurden, wobei die folgenden
Primer verwendet wurden:
Madxho-forward:
5'-CUACUACUACUACTCGAGCAAGATGGGAACGGACCAAGG
(SEQ ID Nr. 7)
Madxho-reverse:
5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGCTACTCTTCCTTGGGACGGAG
(SEQ ID Nr. 8)
-
Das
PCR-Produkt wurde mit Hilfe des CloneAmp-Systems (GIBCOBRL) in pAMP1
(GIBCOBRL) subkloniert, wobei pCGN5522 entstand, und die Δ5-Desaturase-Sequenz wurde durch
Sequenzierung beider Stränge
bestätigt.
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Für die samenspezifische
Expression wurde der Ma29-codierende Bereich als XhoI-Fragment aus pCGN5522
herausgeschnitten und in die SalI-Stelle der Napin-Expressionscassette
pCGN3223 eingefügt,
wobei pCGN5528 entstand. Das HindIII-Fragment von pCGN5528, das
den 5'-regulatorischen
Bereich von Napin, den Ma29-codierenden Bereich und den 3'-regulatorischen
Bereich von Napin enthält,
wurde in die HindIII-Stelle von pCGN1557 eingefügt, wobei pCGN5531 entstand.
Zwei Kopien der Napin-Transcriptionseinheit wurden in Tandemanordnung
eingefügt.
Dieses Tandemkonstrukt kann eine höhere Expression der Desaturasen
pro Geniocus ermöglichen.
pCGN5531 wurde durch Agrobacteriumvermittelte Transformation in
Brassica napus cv. LP004 eingeführt.
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Die
Fettsäurezusammensetzung
von zwanzig Samenpools von reifen T2-Samen wurde durch GC analysiert.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse, die mit unabhängigen transformierten Linien
im Vergleich zu nichttransformierten LP004-Samen erhalten wurden.
Die transgenen Samen, die pCGN5531 enthalten, enthalten zwei Fettsäuren, die
in den Kontrollsamen nicht vorhanden sind und auf der Grundlage
ihrer Elution relativ zu Öl-
und Linolsäure
als Taxolsäure
(5,9-18:2) und Pinolensäure
(5,9,12-18:3) identifiziert wurden. Diese wären die erwarteten Produkte
einer Δ5-Desaturierung
von Öl-
und Linolsäure.
In den transgenen Samen wurden keine anderen Unterschiede in der
Fettsäurezusammensetzung
beobachtet.
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Beispiel 4 (Referenzbeispiel)
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Produktion von Δ5-desaturierten Fettsäuren in
transgenen Pflanzen
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Die
Konstruktion von pCGN5531 (Δ5-Desaturase)
und die Fettsäurezusammensetzung
von T2-Samenpools ist in Beispiel 3 beschrieben. In diesem Beispiel
werden die Samen durch eine weitere Generation gebracht, und es
werden Möglichkeiten
diskutiert, die Δ5-desaturierten
Fettsäuren
zu maximieren.
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Beispiel
3 beschreibt die Fettsäurezusammensetzung
von T2-Samenpools von pCGN5531-transformierten B.-napus-cv.-LP004-Pflanzen.
Um die Segregation von Δ5-desaturierten
Fettsäuren
in den T2-Samen zu untersuchen und einzelne Pflanzen zu identifizieren,
die zum Erhalt anschließender
Generationen dienen sollen, wurde eine Halbsamenanalyse durchgeführt. Die
Samen wurden über
Nacht im Dunkeln bei 30°C
auf wassergetränktem
Filterpapier keimen gelassen. Das äußere Keimblatt wurde für eine GC-Analyse
herausgeschnitten, und der Rest des Keimlings wurde in Erde gepflanzt.
Ergebnisse von einigen dieser Analysen sind in der begleitenden
Tabelle 4 gezeigt. Δ5,
9-18:2 wurde bis zu 12% der Gesamtfettsäuren angereichert, und Δ5, 9, 12-18:3
wurde bis zu 0,77% der Fettsäuren
angereichert. Diese und andere einzeln ausgewählte T2-Pflanzen wurden im
Treibhaus wachsen gelassen, um T3-Samen zu produzieren.
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-
-
Um
die Anreicherung von Δ5,
9-18:2 in Samenöl
zu maximieren, könnte
das pCGN5531-Konstrukt in eine ölsäurereiche
Canola-Sorte eingeführt
werden. Eine ölsäurereiche
Sorte könnte
durch Mutation, Cosuppression oder Antisense-Suppression der Δ12- und Δ15-Desaturasen oder anderer
notwendiger Cofaktoren erhalten werden.
-
Um
die Anreicherung von Δ5,
9, 12-18:3 in Canola zu maximieren, könnte das pCGN5531-Konstrukt in
einen linolsäurereichen
Canola-Stamm eingeführt
werden. Dies könnte
erreicht werden, indem man pCGN5531-transformierte Pflanzen mit
pCGN5542-(M.-alpina-Δ12-Desaturase)-transformierten
Pflanzen kreuzt. Alternativ dazu könnten die Δ5- und die Δ12-Desaturase für die Transformation
auch auf einer einzigen T-DNA kombiniert werden. Die Transcriptionseinheit,
die aus dem 5'-regulatorischen
Bereich von Napin, dem M.-alpina-Δ12-Desaturase-codierenden
Bereich und dem 3'-regulatorischen
Bereich von Napin besteht, kann als NotI-Fragment aus pCGN5541 ausgeschnitten
werden. NotI/XbaI-Linker könnten
daran ligiert werden, und das resultierende Fragment könnte in
die XbaI-Stelle von pCGN5531 eingefügt werden. Das resultierende Plasmid
würde drei
Napin-Transcriptionseinheiten, die die M.-alpina-Δ12-Desaturase
enthalten, und zwei Kopien der Napin/M.-alpina-Δ5-Desaturase/Napin-Einheit enthalten,
alle in derselben Richtung orientiert wie die 35S/nptII/tml-Transcriptionseinheit,
die für
die Selektion von transformiertem Gewebe verwendet wird.
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Beispiel 5
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Expression von M.-alpina-Δ6-Desaturase
in Brassica napus
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Eine
Nucleinsäuresequenz
von einem partiellen cDNA-Klon, Ma524, der eine Δ6-Fettsäure-Desaturase von Mortierella
alpina codiert, wurde durch statistische Sequenzierung von Klonen
aus der M.-alpina-cDNA-Bibliothek erhalten. Die Ma524-cDNA wurde
durch PCR so modifiziert, dass Klonierungsstellen eingeführt wurden,
wobei man die folgenden Primer verwendete:
Ma524PCR-1
5'-CUACUACUACUATCTAGACTCGAGACCATGGCTGCTGCTCCAGTGTG
(SEQ ID Nr. 9)
Ma524PCR-2
5'-CAUCAUCAUCAUAGGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCAT
(SEQ ID Nr. 10)
-
Diese
Primer ermöglichten
die Amplifikation des gesamten codierenden Bereichs und addierten
XbaI- und XhoI-Stellen an das 5'-Ende
sowie XhoI- und StuI-Stellen
an das 3'-Ende.
Das PCR-Produkt wurde mit Hilfe des CloneAmp-Systems (GIBCOBRL)
in pAMP1 (GIBCOBRL) subkloniert, wobei pCGN5535 entstand, und die Δ6-Desaturase-Sequenz
wurde durch Sequenzierung beider Stränge bestätigt.
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Konstruktion von pCGN5544
-
Pflanzenexpressionskonstrukte
wurden hergestellt, um die Mortierella-alpina-Δ6-Desaturase und die Mortierella-alpina-Δ12-Desaturase
in einer Pflanzenwirtszelle zu exprimieren. In den hergestellten
Konstrukten wurden Transcriptionsstartbereiche verwendet, die von
Genen abgeleitet sind, die in einem Pflanzensamen präferentiell
exprimiert werden. Die Isolierung der cDNA-Sequenzen, die die Mortierella-alpina-Δ6-Desaturase und
die Mortierella-alpina-Δ12-Desaturase
codieren, sind in
WO 98/46763 und
WO 98/46764 beschrieben.
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Für die samenspezifische
Expression wurde der Ma524-codierende Bereich als XhoI-Fragment
aus pCGN5535 herausgeschnitten und in die SalI-Stelle der Napin-Expressionscassette,
pCGN3223, eingefügt, wobei
pCGN5536 entstand. Das NotI-Fragment von pCGN5536, das den 5'-regulatorischen
Bereich von Napin, den Ma524-codierenden Bereich und den 3'-regulatorischen
Bereich von Napin enthielt, wurde in die NotI-Stelle von pCGN1557
eingefügt,
wobei pCGN5538 entstand.
-
Die
5542-cDNA, die die M.-alpina-Δ12-Desaturase
codiert, wurde durch PCR so modifiziert, dass Klonierungsstellen
eingeführt
wurden, wobei man die folgenden Primer verwendete:
Ma648PCR-for
5'-CUACUACUACUAGGATCCATGGCACCTCCCAACACT
(SEQ ID Nr. 11)
Ma648PCR-for
5'-CAUCAUCAUCAUGGTACCTCGAGTTACTTCTTGAAAAAGAC
(SEQ ID Nr. 12)
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Diese
Primer ermöglichten
die Amplifikation des gesamten codierenden Bereichs und addierten
eine BamHI-Stelle an das 5'Ende
und KPnI- und XhoI-Stellen an das 3'-Ende. Das PCR-Produkt wurde mit Hilfe des
CloneAmp-Systems (Gibco-BRL,
Gaithersburg, MD) in pAMP1 (Gibco-BRL) subkloniert, wobei pCGN5540
entstand, und die Δ12-Desaturase-Sequenz
wurde durch Sequenzierung beider Stränge bestätigt.
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Ein
samenpräferentielles
Expressionskonstrukt wurde für
die Δ12-DesaturasecDNA-Sequenz
hergestellt. Der Ma648-codierende Bereich wurde als Bam-HI/XhoI-Fragment
aus pCGN5540 herausgeschnitten und zwischen die BglII- und XhoI-Stellen
der Napin-Expressionscassette, pCGN3223 (beschrieben in
US-Patent Nr. 5,639,790 ) eingefügt, wobei
pCGN5542 entstand.
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Um
die M.-alpina-Δ6-
und -Δ12-Desaturase-Sequenzen
aus derselben T-DNA zu exprimieren, wurde das folgende Konstrukt
für die
samenpräferentielle
Expression hergestellt.
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Das
NotI-Fragment von pCGN5536, das den 5'-Transcriptionsstartbereich von Napin,
den Ma524-codierenden Bereich und den 3'-Transcriptionsterminationsbereich von
Napin enthält,
wurde in die NotI-Stelle von pCGN5542 eingefügt, wobei pCGN5544 entstand.
Die Expressionscassetten waren so orientiert, dass die Richtung
der Transcription ausgehend von Ma524 und Ma648 und dem nptII-Marker dieselbe ist.
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Für die samenspezifische
Expression wurde der Ma524-codierende Bereich als XhoI-Fragment
aus pCGN5535 herausgeschnitten und in die SalI-Stelle der Napin-Expressionscassette
pCGN3223 eingefügt,
wobei pCGN5536 entstand. Das NotI-Fragment von pCGN5536, das den
5'-regulatorischen
Bereich von Napin, den Ma524-codierenden Bereich und den 3'-regulatorischen
Bereich von Napin enthält,
wurde in die NotI-Stelle von pCGN1557 eingefügt, wobei pCGN5538 entstand.
pCGN5538 wurde durch Agrobacterium-vermittelte Transformation in
Brassica napus cv. LP004 eingeführt.
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Reifende
T2-Samen wurden im Treibhaus aus 6 unabhängigen Transformationsereignissen
gesammelt. Die Fettsäurezusammensetzung
von einzelnen Samen wurde durch GC analysiert. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse
von Kontroll-LP004-Samen
und sechs 5538-Linien. Alle 5538-Linien mit Ausnahme von Nr. 8 produzierten
Samen, die GLA enthielten. Die Anwesenheit von GLA segregierte in
diesen Samen, wie man für
die T2-selbstbestäubte
Samenpopulation erwarten würde.
Außer
GLA ist die M.-alpina-Δ6-Desaturase
auch in der Lage, 18:4-Fettsäure (Stearidonsäure) und
eine weitere Fettsäure, Δ6, 9-18:2,
zu produzieren.
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Es
wurden Kreuzungen zwischen transgenen Brassica-5544-Linien, die
GLA produzieren, und untransformierten Standard-Canola-Sorten durchgeführt. Kreuzungen
zwischen 5544-Linien mit Quantum, Eagle und Ebony wurden durchgeführt.
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F1-Halbsamen
wurden auf den SDA-Gehalt analysiert, und ausgesuchte Pflanzen wurden
wachsen gelassen und einer Selbstbestäubung unterzogen, um F2-Samen zu produzieren.
Eine GC-FAME-Analyse sowohl von Einzelsamen- als auch von Halbsamenproben
aus solchen Kreuzungen zeigten eine Anreicherung von erheblichen
Mengen an SDA (Tabelle 6). Die Halbsamenanalyse von 5544-LP108-6-16 mit der
Canolasorte Eagle ergab eine Konzentration von ungefähr 6,3%
SDA. Eine Analyse von F2-Samen aus einer Kreuzung von 5544-LP108-12-1 mit der Canolasorte
Ebony ergab SDA-Konzentrationen von bis zu etwa 7,4% SDA.
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Beispiel 6 (Bezugsbeispiel).
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Produktion von Δ6, 9-18:2 in Canolaöl
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In
Beispiel 5 ist die Konstruktion von pCGN5538 beschrieben, das entworfen
wurde, um die M.-alpina-Δ6-Desaturase
in Samen von transgenem Canola zu exprimieren. Tabelle 4 in diesem
Beispiel zeigte Beispiele für
Einzelsamenanalysen aus 6 unabhängigen
transgenen Ereignissen. Neben der Δ6, 9-18:2-Fettsäure wurden
erhebliche Mengen an GLA produziert.
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Insgesamt
29 unabhängige
pCGN5538-transformierte transgene Pflanzen der linolensäurearmen
Sorte LP004 wurden regeneriert und im Treibhaus wachsen gelassen.
Tabelle 7 zeigt die Fettsäurezusammensetzung
von 20-Samen-Pools von T2-Samen aus jedem Ereignis. Sieben der Linien
enthielten mehr als 2% der Δ6,
9-18:2-Säure
in den Samenpools. Um Pflanzen mit großen Mengen an Δ6, 9-18:2 zu identifizieren
und zur Erzeugung von anschließenden
Generationen auszuwählen,
wurde eine Halbsamenanalyse durchgeführt. Samen wurden über Nacht
im Dunkeln bei 30°C
auf wassergetränktem
Filterpapier keimen gelassen. Das äußere Keimblatt wurde für eine GC-Analyse
herausgeschnitten, und der Rest des Keimlings wurde in Erde gepflanzt. Auf
der Grundlage von Ergebnissen der Fettsäureanalyse wurden ausgewählte T2-Pflanzen
im Treibhaus wachsen gelassen, um T3-Samen zu produzieren. Der Selektionszyklus
wurde wiederholt; Pools von T3-Samen wurden auf Δ6, 9-18:2 analysiert. T3-Halbsamen
wurden seziert und analysiert, und ausgewählte T3-Pflanzen wurden im
Treibhaus wachsen gelassen, um T4-Samen zu produzieren. Pools von
T4-Samen wurden auf Fettsäurezusammensetzung
analysiert. Tabelle 6 fasst die Ergebnisse dieses Verfahrens für Linien zusammen,
die von einem der ursprünglichen
transgenen Ereignisse abgeleitet sind, 5538-LP004-25. Konzentrationen
von Δ6,
9-18:2 wurden somit über
3 Generationen hinweg aufrechterhalten.
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Um
die Menge an Δ6,
9-18:2, die produziert werden kann, zu maximieren, könnte das pCGN5538-Konstrukt
entweder durch Transformation oder durch Kreuzung in eine ölsäurereiche
Sorte von Canola eingeführt
werden. Eine ölsäurereiche
Sorte könnte
durch Mutation, Cosuppression oder Antisense-Suppression der Δ12- und Δ15-Desaturasen oder anderer
notwendiger Cofaktoren erhalten werden.
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