ES2201054T3 - Modificacion de aceites vegetales usando desaturasa. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTAN SEMILLAS DE PLANTAS QUE TIENEN EN LAS MISMAS UN GEN DE DESATURASA DELTA-9 DE LEVADURA, PREFERIBLEMENTE EN ASOCIACION CON UN PROMOTOR ADECUADO Y UNA SECUENCIA DE FINALIZACION. TAMBIEN SE PRESENTA UN METODO PARA MODIFICAR EL CONTENIDO DE ACIDOS GRASOS DEL ACEITE DE SEMILLAS, MEDIANTE LA TRANSFORMACION DE SEMILLAS CON LA DESATURASA DELTA-9 DE LEVADURA.
Description
Modificación de aceites vegetales usando
desaturasa.
La presente invención se refiere a una semilla de
planta de un cultivo de semillas oleaginosas que contiene el gen
delta-9 desaturasa de levadura, y a un método para
modificar el contenido de ácido graso del aceite de semilla usando
el gen desaturasa.
Más específicamente, la presente invención está
dirigida a una semilla de planta, tal como una semilla de
Brassica, que contiene el gen delta-9
desaturasa de levadura bajo el control de un promotor específico
de semillas que provoca la expresión del gen en la semilla y, como
corolario, a un método para aumentar el contenido de ácido
palmitoleico del aceite de semilla usando el gen desaturasa.
Los aceites vegetales se usan no sólo en la
industria alimentaria, sino así mismo de forma creciente en la
industria química, y comienzan a encontrar su camino en
aplicaciones industriales como alternativas a fluidos lubricantes
más convencionales. La utilización de los aceites depende
principalmente de sus composiciones. Los triglicéridos comprenden
la mayor parte del aceite vegetal (alrededor del 95%), pero también
están presentes un gran número de otros lípidos importantes, tales
como fosfolípidos, ácidos grasos libres, ceras, y esteroles.
También puede haber una variedad de otros componentes, tales como
antioxidantes, que, aunque aparecen en cantidades relativamente
minoritarias, no obstante pueden tener un impacto significativo en
las características y, por tanto, utilidad de los aceites.
Las características de triglicéridos dependen en
gran medida de sus ácidos grasos constituyentes. Debido a que los
ácidos grasos que aparecen de forma natural en cepas
agronómicamente aceptables de cultivos de oleaginosas frecuentemente
hacen al aceite resultante inadecuado para un uso de otro modo
atractivo, es extremadamente deseable tener la capacidad para
cambiar la composición del aceite para cumplir parámetros
específicos.
La modificación de los aceites vegetales puede
efectuarse químicamente. Este enfoque se ha usado para obtener un
aceite para ensaladas/para cocinar que contiene ácidos grasos
saturados en una cantidad menor que alrededor del 3% (patente U.S.
número 4.948.811); el aceite se puede formar mediante reacción
química, o mediante separación física de los lípidos saturados. Se
hace referencia general al uso de la "ingeniería genética" para
lograr un aceite de las características deseadas (véase la columna
3, línea 58 y siguientes). Sin embargo, no hay una descripción
detallada de cómo se podría modificar cualquier planta oleaginosa
particular para proporcionar un aceite vegetal de las
características deseadas.
Típicamente, la composición de ácidos grasos de
los aceites vegetales se ha modificado por el contrario a través de
técnicas de reproducción tradicionales. Estas técnicas utilizan el
plasma germinal existente como una fuente de mutaciones de origen
natural que afectan a la composición de los ácidos grasos. Tales
mutaciones están reveladas y se seleccionan mediante el uso de la
selección apropiada, en conjunción con la reproducción
subsiguiente. Por ejemplo, tal enfoque se ha usado para disminuir la
cantidad de erucato de ácido graso de cadena larga en aceite de
semilla de colza (Stefansson, B.R. (1983) en High and Low Erucic
Acid Rapeseed Oils, Kramer JKG et al., eds; Academic Press, NY; p.
144-161), y para aumentar la cantidad del ácido
graso monoinsaturado oleato en aceite de maíz (Solicitud de Patente
de Estados Unidos, Número de Serie 07/554.526).
Recientemente, se han hecho intentos para
aumentar el conjunto de mutaciones disponibles a partir de las
cuales seleccionar las características deseadas mediante el uso de
mutágenos. Sin embargo, los mutágenos generalmente actúan por
inactivación o modificación de genes ya presentes, dando como
resultado la pérdida o disminución de una función particular. La
introducción de una nueva característica a través de mutagénesis a
menudo depende de este modo de la pérdida de algún rasgo ya
presente. Además, el logro de metas deseadas con mutágenos
generalmente es incierto. Usando este enfoque sólo se han logrado
unos pocos tipos de composiciones de ácidos grasos modificadas en
aceites vegetales. Un ejemplo de tal mutación "creada" que
afecta a la composición de ácidos grasos es la disminución de
ácidos grasos poliinsaturados, en particular de linoleato y
linolenato, en aceite de semilla de colza, con un aumento
concomitante en el ácido graso monoinsaturado oleato (Auld, M., et
al., (1992) Crop Sci. en prensa). Otro ejemplo es la disminución de
ácidos grasos saturados en aceite de semilla de colza (Solicitud de
patente Internacional PCT Número de Publicación WO 91/15578). Sin
embargo, la bioquímica de la síntesis del aceite de semillas es
compleja, y no se comprende bien; puede haber varios mecanismos que
contribuyan a los cambios en las composiciones de ácidos grasos
observados en el aceite de semilla de colza (Número de Publicación
de Solicitud de Patente Internacional PCT WO 91/15578). El uso de
la mutagénesis para efectuar tales cambios es esencialmente
aleatorio, y no específico.
La posibilidad de modificar la composición de
ácidos grasos mediante el uso de ingeniería genética permitiría, en
teoría, la introducción precisa y controlada de genes específicos
deseables, así como la inactivación de genes específicos indeseables
o de productos génicos. De este modo, se podrían introducir en las
plantas nuevos rasgos completamente independientes de los genes ya
presentes, o se podrían inactivar o modificar genes
preseleccionados. Sin embargo, un atributo para hacer uso efectivo
de la ingeniería genética para modificar las composiciones de
ácidos grasos es un modelo razonablemente exacto de los mecanismos
en juego en la célula de la planta que regulan la síntesis y
procesamiento de ácidos grasos.
Se postula que, en oleaginosas, la síntesis de
ácidos grasos ocurre en el plástido, y que los ácidos grasos
recientemente sintetizados se exportan del plástido al citoplasma.
Aquí son utilizados en la construcción de triglicéridos, que ocurre
en las membranas endorreticulares.
El producto principal de la síntesis de ácidos
grasos es palmitato (16:0), que parece que se alarga eficientemente
a estearato (18:0). Mientras que están aún en el plástido, los
ácidos grasos saturados se pueden entonces desaturar, mediante una
enzima conocida como delta-9 desaturasa, para
producir uno o más dobles enlaces carbono-carbono.
Específicamente, el estearato se puede desaturar rápidamente
mediante una enzima delta-9 desaturasa plastídica
para producir oleato (18:1). De hecho, el palmitato también se puede
desaturar a palmitoleato (16:1) mediante la delta-9
desaturasa plastídica, pero este ácido graso aparece sólo en
cantidades en trazas (0-0,2%) en la mayoría de los
aceites vegetales.
De este modo, los productos principales de la
síntesis de ácidos grasos en el plástido son palmitato, estearato y
oleato. En la mayoría de los aceites, el oleato es el principal
ácido graso sintetizado, puesto que los ácidos grasos saturados
están presentes en proporciones mucho menores.
La desaturación subsiguiente de ácidos grasos de
la planta fuera del plástido en el citoplasma parece estar limitada
a oleato, que se puede desaturar a linoleato (18:2) y linolenato
(18:3). Además, dependiendo de la planta, el oleato se puede
modificar adicionalmente por alargamiento (hasta 20:1, 22:1, y/o
24:1), o por adición de grupos funcionales. Estos ácidos grasos,
junto con los ácidos grasos saturados palmitato y estearato, se
pueden entonces ensamblar en triglicéridos.
La enzima delta-9 desaturasa de
las plantas es soluble. Está localizada en el estroma del plástido,
y usa ácidos grasos recientemente sintetizados esterificados a ACP,
predominantemente estearil-ACP, como sustratos. Esto
contrasta con la enzima delta-9 desaturasa de
levadura, que está localizada en la membrana reticular
endoplásmica, usa ácidos grasos esterificados a Co-A
como sustratos, y desatura a ambos ácidos grasos saturados,
palmitato y estearato.
El gen delta-9 desaturasa de
levadura se ha aislado de Saccharomyces cerevisiae, se ha
clonado, y se ha secuenciado (Stukey, J.E. et al., J. Biol.
Chem. 264:16537-16544 (1989); Stukey,
J.E. et al., J. Biol. Chem. 265:20144-20149
(1990)). Este gen también se ha usado para transformar la misma
cepa de levadura en condiciones en las que está aparentemente
sobreexpresado, dando como resultado un aumento de la acumulación de
lípido almacenado en las células de levadura transformadas, según
se determina por microscopía de fluorescencia usando Rojo Nilo como
tinte para triglicéridos (Patente U.S. Número 5.057.419). La
composición de ácidos grasos no se caracterizó. Esta referencia
contiene una discusión general de cómo usar información procedente
del gen delta-9 desaturasa de levadura aislado,
para aislar primeramente otros genes desaturasa a partir de
levadura, o de otros organismos, y entonces reintroducir estos
genes en una levadura o planta en condiciones que, se especula,
conducirían a una alta expresión, a fin de modificar el aceite
producido y su composición de ácidos grasos (véase Ejemplo 2, en la
columna 9, líneas 24 y siguientes). Sin embargo, esta discusión es
tanto general como hipotética. No se proporcionan ejemplos reales, y
la única técnica ofrecida para lograr esta meta es una enumeración
de la metodología clásica de ADN recombinante sin ninguna guía en
cuanto a la puesta en práctica específica (véase columna 10, líneas
25 y siguientes).
Subsiguientemente, se informó que el gen
delta-9 desaturasa de levadura se había introducido
de hecho en tejido de hoja de tabaco (Polashcok, J. et al., FASEB
J.5:A1157 (1991). Aparentemente, el gen se expresó en este
tejido, según se evidencia por un aumento dado a conocer de unas
diez veces en ácido palmitoleico y una disminución correspondiente
en ácidos palmítico y esteárico.
Recientemente se ha establecido el valor
saludable de niveles elevados de ácidos monoinsaturados,
particularmente oleico, como el principal constituyente dietético
de grasas. Se piensa que tales dietas reducen la incidencia de
arteriosclerosis que resulta de dietas ricas en ácidos grasos
saturados. En consecuencia, existe una necesidad de un aceite
vegetal comestible que tenga un elevado contenido de
monoinsaturados. Se ha usado la mutagénesis de semillas para
producir un aceite de semilla de colza con no más de 4% de
contenido de ácido graso saturado (Solicitud de Patente
Internacional PCT, Número de Publicación WO 91/15578); el valor más
bajo dado a conocer fue un valor de semilla única de 2,8% de
contenido de ácido graso saturado. Sin embargo, este aceite vegetal
pobre en ácidos grasos saturados está limitado al aceite de semilla
de colza.
La expresión del gen delta-9
desaturasa de levadura en cualquier tejido de semillas de plantas
podría dar como resultado una disminución en los ácidos grasos
saturados, con un aumento en ácidos grasos monoinsaturados en el
aceite de la semilla. En este caso, se propone que la enzima
desature aquellos ácidos grasos saturados que son exportados desde
el plástido y, de este modo, ya no son un sustrato para la
desaturación de ácidos grasos. De este modo, la transformación de
plantas con un gen delta-9 desaturasa de levadura en
condiciones en las que el gen se expresa en el tejido de la semilla
conduce a un aceite de semilla con ácido graso saturado
reducido.
Además, la expresión del gen desaturasa de
levadura en plantas con composiciones inusuales de ácidos grasos
podría dar como resultado el aumento o aparición de ácidos grasos
inusuales en el aceite vegetal. Por ejemplo, la expresión del gen
delta-9 desaturasa de levadura en tejido de
semillas en el que el aceite contiene niveles elevados de palmitato
podría dar como resultado un aumento en el nivel de palmitoleato. En
aquellos tejidos en los que ocurre el alargamiento del ácido graso
(tal como una semilla de colza rica en erucato), se podrían
acumular ácidos grasos de cadena más larga con dobles enlaces
inusuales. Tales ácidos grasos incluyen
cis-vaccénico (18:1 cis 11), 20:1 cis 13, 22:1 cis
15, y 24:1 cis 17. Estos ácidos grasos son de interés industrial.
Por ejemplo, la ruptura mediante ozonolisis oxidativa de 18:1 cis
11 da como resultado el ácido graso C7 monobásico y el ácido graso
C10 dibásico. Tanto el ácido graso dibásico como el monobásico son
un material de partida industrial y ácidos grasos de utilidad. Se
pueden usar como sustitutos, o en situaciones en las que se desea
una funcionalidad específica.
En consecuencia, se proporciona una semilla de
planta de cultivo de semillas oleaginosas que comprende un gen
delta-9 desaturasa de levadura, y medios para
expresar dicho gen delta-9 desaturasa de levadura en
dicha semilla de planta, en la que dichos medios para expresar
comprenden un promotor específico de semillas efectivo para
provocar la expresión de dicho gen delta-9
desaturasa de levadura en dicha semilla de planta, y en la que la
expresión de dicho gen delta-9 desaturasa de
levadura da como resultado un aumento en el contenido, en tanto por
ciento, de ácido palmitoleico en el aceite de semilla de dicha
semilla de planta. El promotor puede ser, por ejemplo, un promotor
de faseolina o un promotor de faseolina truncado. Preferiblemente,
el promotor es un promotor de faseolina truncado.
La semilla de planta también puede contener una
secuencia de terminación para el gen delta-9
desaturasa de levadura, tal como una secuencia de terminación de
delta-9 desaturasa de levadura, una secuencia de
terminación 3' de faseolina, una secuencia de terminación 3' de ORF
25.
La semilla de planta puede ser un miembro de un
género de monocotiledóneas, prefiriéndose el Sorgo. Como
alternativa, la semilla de planta puede pertenecer al género de
dicotiledóneas, tales como Brassica, Helianthus, Carthamus,
Sesamum, Glicine, Arachis, Gossypium, Lesquerella y
Vernonia, en cuyo caso se prefiere Brassica, y
particularmente Brassica rapa y Brassica napa.
En una realización adicional, la presente
invención está dirigida a un método para modificar el contenido de
ácidos grasos del aceite de semilla de una semilla de planta de
cultivo de oleaginosas, comprendiendo dicho método la etapa de
transformar la semilla de planta de cultivo de semillas oleaginosas
para expresar un gen delta-9 desaturasa de
levadura, en el que dicha modificación comprende aumentar el
contenido, en tanto por ciento, de ácido palmitoleico en el aceite
de semilla de dicha semilla de planta, y en el que dicha etapa de
transformación comprende añadir, al ADN nativo de dicha semilla de
planta, ADN exógeno, comprendiendo dicho ADN exógeno un gen
delta-9 desaturasa de levadura y un promotor
específico de semillas.
Como alternativa, el contenido de ácidos grasos
se puede modificar adicionalmente reduciendo el contenido, en tanto
por ciento, de ácido esteárico en el aceite de semilla.
En este método, la semilla de planta a modificar
se puede seleccionar de los mismos géneros de monocotiledóneas y
dicotiledóneas y especies enumeradas anteriormente.
La transformación generalmente se logra
añadiendo, al ADN nativo de la semilla de planta, ADN exógeno en
forma de gen delta-9 desaturasa de levadura y un
promotor específico de semillas para el gen delta-9
desaturasa de levadura. Las técnicas adecuadas de transformación
incluyen la mediación de la transformación usando Agrobacterium,
electroporación, polietilenglicol (PEG), fibra de carburo de
silicio, pistola de partículas, e inyección directa.
En una realización particular, la transformación
contempla construir un vector que contiene el gen
delta-9 desaturasa de levadura y el promotor
específico de semillas, colocar el vector en una cepa seleccionada
de Agrobacterium, y tratar las células seleccionadas de la planta
con el Agrobacterium en condiciones suficientes para dar como
resultado la transferencia de al menos algunos de los vectores
desde el Agrobacterium a las células de la planta, con lo que se
expresa el gen delta-9 desaturasa de levadura en las
células de la planta.
En una realización final, la presente invención
está dirigida a una planta oleaginosa obtenible a partir de la
semilla de planta como se define por cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en la que las semillas de dicha planta
comprenden un gen delta-9 desaturasa de levadura y
medios para expresar dicho gen delta-9 desaturasa de
levadura en dicha semilla de planta, en la que dichos medios para
expresar comprende un promotor específico de semillas efectivo para
provocar la expresión de dicho gen delta-9
desaturasa de levadura en dicha semilla de planta, y en la que la
expresión de dicho gen delta-9 desaturasa de
levadura da como resultado un aumento en el contenido, en tanto por
ciento, de ácido palmitoleico en el aceite de semilla de dicha
planta.
La Figura 1 muestra la secuencia de ADN y el mapa
de restricción parcial del gen delta-9 desaturasa
de levadura. Se muestra la cadena codificante de ADN junto con la
secuencia deducida de aminoácidos del gen desaturasa. Estas
secuencias también están representadas en ID SEQ n^{os} 1 y 2
anexas a este documento.
La Figura 2 representa un esquema de plásmido
pH602 y cuatro casetes de expresión de plantas con el gen
delta-9 desaturasa de levadura que se clonaron en el
sitio único BgIII del plásmido.
Brevemente, por medio de la presente invención se
proporciona una semilla de planta de cultivo de semillas
oleaginosas que contiene y que expresa un gen
delta-9 desaturasa de levadura. Además, se
proporciona un método para obtener aceite vegetal que tiene un
perfil de ácido palmitoleico elevado transformando una planta con un
gen delta-9 desaturasa de levadura en condiciones
en las que el gen delta-9 de levadura se expresa en
la semilla.
En forma de resumen, el gen
delta-9 desaturasa de levadura se puede aislar
mediante las siguientes etapas. El gen se clona primeramente
mediante complementación in vivo de una cepa mutante ole1
de levadura a OLE+ mediante transformación con un banco genómico de
levaduras obtenido a partir de ADN de levadura natural. Las
secuencias de complementación transportadas por el plásmido se
pueden caracterizar mediante la obtención del mapa de restricción,
se pueden verificar mediante medios genéticos, y se pueden
secuenciar.
La secuencia codificante del gen se coloca bajo
el control de secuencias reguladoras que funcionan en una semilla
de planta, y entonces se mueve a vectores de transformación de la
planta. Estos constructos, con un marcador seleccionable adecuado
para seleccionar transformantes positivos, se usan entonces para
transformar el tejido de la planta. Los callos resultantes se
regeneran en plantas; se seleccionan muestras de tejidos de estas
plantas mediante al menos un ensayo molecular o biológico para
determinar qué individuos contienen realmente un gen
delta-9 desaturasa de levadura.
Aquellos transformantes que contienen el
delta-9 desaturasa de levadura se hacen crecer
hasta madurez, y se dejan que hagan semillas. La expresión del gen
delta-9 desaturasa de levadura en la semilla se
determina por análisis de ARNm, tal como con un ensayo de PCR, y/o
mediante análisis de proteínas, tal como mediante un ensayo Western.
Además, se determina la composición de ácidos grasos de las
semillas maduras para identificar cualquier composición nueva de
ácidos grasos producida en respuesta a la presencia del
delta-9 desaturasa de levadura en las semillas.
Aquellas semillas que muestren una composición alterada de ácidos
grasos se hacen germinar, y se caracteriza la estabilidad y la
genética del rasgo o rasgos observados mediante los cruces
genéticos apropiados.
Cada uno de los aspectos de la invención se
discutirá ahora con más detalle.
La mayoría de las manipulaciones genéticas de ADN
y de la levadura descritas más abajo son protocolos estándares bien
establecidos, y se pueden encontrar en varios manuales de protocolo
(Sherman, F et al (1986) Laboratory Course Manual For Methods in
Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Sambrook, J
et al (1989) Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, NY; y Methods in Enzym 152: Guide to
Molecular Cloning Techniques, Berger, SL y Kimmel, AR, eds (1987)).
El ADN se puede secuenciar mediante varios métodos, incluyendo, por
ejemplo, el método de Sanger, usando el protocolo para moldes de
doble cadena según las instrucciones del fabricante (U.S. Biochem.
Corp., Cleveland, OH).
Se puede aislar un gen delta-9
desaturasa a partir de levadura mediante las siguientes etapas. Se
crea una cepa de levadura que es adecuada para la transformación y
complementación. Tal cepa debe ser deficiente en actividad
delta-9 desaturasa y, de este modo, requiere
ácidos grasos insaturados exógenos para su crecimiento. Además, la
cepa puede tener una segunda característica o marcador para
permitir la selección de células transformadas. Entonces se usa un
banco genómico de ADN natural de levadura para transformar la cepa
de levadura deficiente en actividad delta-9
desaturasa. Se presupone que aquellas cepas en las que se observó
la restauración de la función delta-9 desaturasa (es
decir, que exhibieron un fenotipo natural y ya no requirieron más
ácidos grasos exógenos para el crecimiento) contienen el gen
delta-9 desaturasa de levadura. Entonces se aíslan
los insertos de plásmidos recombinantes que contienen putativamente
el gen delta-9 desaturasa. Se prepara un mapa de
restricción del inserto, y se puede comparar con un mapa publicado
(Stukey, JE (1989) J. Biol. Chem. 264:
16537-16544). Finalmente, se verifica la identidad
del gen mediante análisis genético estándar.
El ADN del inserto se subclona y secuencia
entonces para localizar y caracterizar la región codificante del
gen delta-9 desaturasa de levadura. La región
codificante se mueve a casetes de expresión de la planta tras
seleccionar la secuencia o secuencias reguladoras apropiadas para
la expresión deseada. Las secuencias reguladoras incluyen tanto
secuencias promotoras como de terminación.
Los posibles promotores específicos de semillas
incluyen aquellos procedentes de genes de biosíntesis de ácidos
grasos/lípidos de plantas (ACP, aciltransferasas, desaturasas,
genes proteínicos de transferencia de lípidos) o procedentes de
genes de proteína de almacenamiento (genes de zeína, napina,
cruciferina, conglicinina, lectina), pudiéndose usar sus secuencias
correspondientes de terminación/poliA+ para la expresión objetivo.
Es claro para el experto en la técnica que un promotor se puede
usar tanto en forma original como truncada, y se puede emparejar
con su propia secuencia de terminación/poliA+ o una secuencia
heteróloga de terminación/poliA+.
Además, el producto génico
delta-9 desaturasa de levadura se puede localizar en
un orgánulo específico en la semilla de planta ligando el ADN que
codifica secuencias líder de péptidos al gen desaturasa. Tales
secuencias líder se obtienen a partir de varios genes, bien de
plantas o de otras fuentes. Estos genes codifican proteínas
sintetizadas citoplásmicamente dirigidas a, por ejemplo,
mitocondrias (la subunidad beta de F1-ATPasa a
partir de levadura o tabaco, citocromo c1 a partir de levadura),
cloroplastos (subunidad Va de citocromo-oxidasa a
partir de levadura, subunidad pequeña de rubisco a partir de
guisante), lumen del retículo endoplásmico (disulfuroisomerasa de
proteína), vacuolas (carboxipeptidasa Y y proteinasa A a partir de
levadura, fitohemaglutinina a partir de guisante francés),
peroxisomas (D-aminoácido-oxidasa,
uricasa) y lisosomas (hidrolasas). Estos constructos se pueden usar
con cualquiera de los promotores sugeridos mencionados
anteriormente.
También se escoge un marcador seleccionable para
la selección óptima de la transformación. Tales marcadores son
típicamente genes que codifican la resistencia a diversos productos
químicos tóxicos, tales como antibióticos y herbicidas; la
resistencia habitualmente es conferida por enzimas que convierten
típicamente al producto químico en no tóxico. Tales productos
químicos tóxicos incluyen, por ejemplo, higromicina, canamicina,
metotrexato, y fosfinotricina. Enzimas que confieren resistencia a
estos productos químicos son higromicinfosfotransferasa,
neomicinfosfotransferasa, dihidrofoliato-reductasa,
y fosfintricinacetiltransferasa. Los genes que codifican la
resistencia son bien conocidos por los expertos normales en la
técnica de la transformación de plantas. Las plantas transformadas
con tales genes son capaces de crecer en presencia del compuesto
tóxico, mientras que no así las plantas no transformadas. Por lo
tanto, tales genes sirven tanto como un medio para seleccionar
plantas transformadas así como marcadores para la transformación,
indicando que ha transcurrido la transformación.
Finalmente, el casete de expresión de la planta
que contiene el gen delta-9 desaturasa de levadura
se mueve en el vector que también contiene el marcador seleccionable
para uso en la transformación de la planta. El marcador
seleccionable está típicamente bajo el control de un promotor
constitutivo como se describe anteriormente. El vector se construye
de tal forma que tanto el gen delta-desaturasa de
la levadura como el gen marcador se transfieren juntos en el genoma
de la planta.
El tejido de la planta para uso en la
transformación se puede obtener a partir de cualquier planta
oleaginosa adecuada. Tales plantas se pueden encontrar en los
géneros Brassica, Helianthus, Carthamus, Sesamum, Glycine,
Arachis, Gossypium, Ricinus, Linum, Cuphea, Euphorbia, Limnanthes,
Crambe, Lesquerella, Vernonia, Simmondsia, Olea, Papaver,
Elaeis y Cocos. El tejido vegetal apropiado incluye pero
no se limita a hojas, hipocotilos, cotiledones, bulbos, callos,
células simples, y protoplastos.
Las técnicas de transformación son bien conocidas
por los expertos en la técnica de la transformación de plantas, e
incluyen la transformación mediada por Agrobacterias,
electroporación, polietilenglicol (PEG), fibras de carburo de
silicio, inyección directa y una pistola de partículas. Estos
métodos son diversos medios para introducir ADN foráneo en las
células de la planta. Una vez en la célula, una porción del ADN que
lleva tanto el gen delta-9 desaturasa de levadura
como el marcador seleccionable se incorpora en el genoma de la
planta vía las funciones de transferencia incluidas en el ADN.
El tejido calloso transformado se selecciona por
crecimiento sobre medio de selección (por ejemplo, un medio que
contiene un producto químico tóxico y para el cual la planta
transformada contiene un gen de resistencia, en virtud de su
transformación). Las plantas transformadas se regeneran y
seleccionan para determinar la presencia del gen
delta-9 desaturasa de levadura. Esto implica
analizar el tejido mediante al menos un ensayo molecular o
biológico para determinar que, si lo hay, los transformantes
contienen secuencias de ARNm o ADN específicas de
delta-9 desaturasa de levadura. Estos ensayos
incluyen ensayos del tejido para la expresión de la enzima del gen
de resistencia, y ensayos del tejido para determinar la presencia
del ADN delta-9 desaturasa de levadura mediante, por
ejemplo un ensayo Southern o un ensayo de PCR.
Aquellas plantas que son positivas para el gen
delta-9 desaturasa de levadura se hacen crecer
hasta madurez, se polinizan, y se dejan que den semillas. Las
semillas obtenidas a partir de plantas transformadas se analizan
para determinar la expresión del gen delta- 9 desaturasa de levadura
tanto buscando la proteína codificada por el gen, como por ejemplo
vía un análisis Western, como para determinar el fenotipo de la
composición grasa alterada como resultado de la actividad de la
desaturasa.
Un análisis Western determina la presencia de una
proteína codificada y expresada por el gen delta-9
desaturasa de levadura, y se utiliza para detectar la expresión del
gen en el tejido de la semilla de la planta. El ensayo requiere el
uso de anticuerpos a la delta- 9 desaturasa de levadura para
detectar la presencia de la proteína. Los anticuerpos específicos
para la proteína delta-9 desaturasa de levadura, que
no ha sido purificada previamente, se preparan según lo siguiente.
La secuencia codificante para la enzima delta-9
desaturasa de levadura se clona en un vector de expresión (por
ejemplo, pMAL-p, pMAL-cRI, de New
England Biolabs). La proteína resultante se aísla y se purifica
según las instrucciones de los fabricantes. Entonces se generan los
anticuerpos para la enzima delta-9 desaturasa
mediante técnicas convencionales. La especificidad de los
anticuerpos a la enzima delta-9 desaturasa se
determina mediante ensayos ELISA.
La composición de ácidos grasos de semillas tanto
enteras como en mitades, obtenidas a partir de plantas de control o
bien transgénicas, se determina extrayendo el aceite, preparando
ésteres metílicos de los ácidos grasos, y luego separando y
cuantificando los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante
procedimientos convencionales. Las nuevas características de los
ácidos grasos se determinan comparando la composición grasa de las
semillas transgénicas con la de la planta progenitora.
La estabilidad y herencia genética de los nuevos
rasgos de los ácidos grasos se determinan mediante cruces genéticos
clásicos. El rasgo o rasgos conferidos por el gen
delta-9 desaturasa de levadura se puede transferir
en otros cultivos agronómicamente aceptables mediante tecnología de
reproducción estándar.
El gen delta-9 desaturasa se
clonó en levadura mediante complementación usando un vector de 2
micrómetros y buscando la cosegregación de marcadores. Se preparó un
banco genómico de ADN de levadura de tipo natural a partir de la
cepa X2180-1A de Saccharomyces cerevisiae (the
Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA) en el plásmido autónomo
de levadura YEp13. Este plásmido se transforma a una elevada
eficiencia y se replica independientemente de los cromosomas a un
número elevado de copias. El YEp13 contiene un gen LEU2 de tipo
natural para la selección de transformantes, y es mitóticamente
inestable cuando se hace crecer en condiciones no selectivas. Con la
transformación en E. coli, el banco dio 1,7 x 10^{4}
transformantes independientes, muy por encima de la cifra de 9,5 x
10^{3} calculada como necesaria para dar como resultado una
probabilidad del 99% de que una copia del gen
delta-9 desaturasa de levadura estuviera contenida
en el banco.
Se construyó una cepa de levadura adecuada para
transformación apareando dos cepas de levaduras haploides y
analizando las esporas haploides resultantes. Se encontró que una
cepa contenía ambas mutaciones (ole1/leu2) necesarias para la
complementación. Se realizó una transformación de la levadura, y se
seleccionaron los transformantes tanto para el marcador LEU2
contenido en el plásmido como para la actividad de desaturasa
natural por crecimiento en un medio que carece de oleato. De esta
manera, se obtuvieron 450 transformantes que eran de tipo
fenotípicamente naturales tanto para LEU2 como para la actividad de
desaturasa. Estos transformantes se hicieron crecer a continuación
en condiciones no selectivas, induciendo de ese modo la
inestabilidad mitótica, y luego se detectaron sistemáticamente en
busca de la co-pérdida del marcador del plásmido
LEU2 y la actividad de desaturasa. La co-pérdida de
marcadores indicó que la actividad de desaturasa estaba portada por
plásmido y no era un revertiente cromosómico natural.
De este modo, se identificaron varios insertos
portados por plásmidos que restauraron la función natural cuando se
encuentran en células de levaduras mutantes. Se encontró un
fragmento Hind III de 5,7 kb que era común para la mayoría de los
insertos, y el análisis del mapa de restricción del inserto indicó
una extensa homología a la del mapa de restricción publicado
(Stukey, JE et al (1989) J. Biol. Chem. 264:
16537-16544). La principal diferencia entre los dos
mapas es que el inserto publicado es un fragmento Hind III de 4,8
kb, comparado con el fragmento Hind III de 5,7 kb aislado aquí. Sin
embargo, se ha demostrado que la región es polimórfica en diversas
cepas de levaduras, incluyendo la cepa progenitora de la cepa a
partir de la que se obtuvo el banco genómico (Stukey, JE et al, más
arriba). Adicionalmente, el mapa de restricción se conserva
sumamente en la región codificante de delta-9
desaturasa de levadura putativa en el inserto; la diferencia en el
tamaño es debida a las secuencias en dirección 3' fuera de la
región codificante.
Se realizó un intento para identificar, mediante
análisis Southern, secuencias de ADN de plantas que mostraron
homología con el gen de desaturasa de levadura. Se digirió ADN
genómico procedente de Brassica napus, Brassica rapa,
Arabidopsis thaliana, haba de soja, y maíz, con cada una de
las tres enzimas de restricción, y se transfirió a una membrana. La
membrana se examinó entonces con dos insertos subclonados marcados
con cebadores al azar, que contenían sólo secuencias de marco de
lectura abierta procedente del gen delta-9
desaturasa de levadura. Tras la hibridación, el filtro de lavó
secuencialmente en condiciones cada vez más rigurosas, a fin de
determinar si la relación de señal a ruido de cualquier homología
se pudiera reducir suficientemente para hacer factible la detección
sistemática de un banco genómico usando la misma sonda. Usando las
condiciones de lavado menos rigurosas, se pudieron observar bandas
tenues para todos los genomas, pero se observó, no inesperadamente,
un fuerte fondo. En las condiciones de lavado más rigurosas (es
decir, "normales"), el fondo se redujo notablemente; sin
embargo, en estas condiciones, sólo el ADN del maíz y del haba de
soja mostraron bandas obvias que seguían siendo tenues,
especialmente cuando se comparan con aquellas en el ADN de la
levadura.
Estos datos indican que el gen
delta-9 desaturasa de levadura tiene poca homología
con su gen correspondiente en Brassica, al menos al nivel del
ADN. Debido a que la delta-9 desaturasa de
levadura tiene tanto una localización diferente (microsómica frente
a cloroplástica) como una especificidad por el sustrato (tioésteres
de acil-CoA grasos frente a tioésteres de
acil-ACP grasos) que la que tiene la enzima de la
planta, no es inesperado que las dos enzimas, a pesar de su función
similar, muestren poca homología ya sea al nivel de ADN como al
nivel proteínico.
Estudios de ruptura de genes corroboraron los
resultados de complementación que indicaron que el gen clonado era
de hecho el gen delta-9 desaturasa de levadura. Se
obtuvo un constructo que insertó un gen LEU2 funcional en la región
codificante del gen de delta-9 desaturasa de
levadura putativo, rompiendo de ese modo el gen clonado. Usando
técnicas genéticas de levadura estándares, se sustituyó la copia
cromosómica del gen clonado con la versión rota con LEU2, y las
células resultantes se analizaron entonces para determinar su
capacidad para crecer sin ácido oleico suplementario. En este
análisis, si el gen clonado no fue el delta-9
desaturasa de levadura, entonces esta ruptura no debería afectar a
la biosíntesis de ácidos grasos. Si el gen clonado fue el
delta-9 desaturasa de levadura, entonces esta
ruptura debía dar como resultado células que no pueden fabricar
ácido oleico y por lo tanto requieren una fuente suplementaria. De
hecho, las células de levadura, verificadas mediante análisis
Southern que contienen el gen roto, no pueden crecer sin ácido
oleico suplementario.
Se produjeron fragmentos de restricción del gen
delta-9 desaturasa de levadura mediante digestiones
con varias enzimas diferentes que se subclonaron en el vector pUC18.
Estos fragmentos se secuenciaron usando moldes de doble cadena con
Sequenase (USB) según las instrucciones del fabricante. Los
resultados se presentan en la figura 1.
El análisis de la secuencia de ADN del inserto
clonado identificó una ventana de lectura abierta de 1530 pb con
una secuencia TATAA, la secuencia promotora preferida en levadura,
localizada a -30 desde la primera ATG de la proteína predicha que se
usa generalmente como el codón de iniciación de un péptido en
levadura. El análisis Northern demostró que las secuencias de ADN
de la ventana de lectura abierta se hibridaron a un ARNm
poliadenilado de aproximadamente 2,0 kb. El tamaño del transcripto
observado es un buen ajuste para una secuencia codificante de 1530
pb, permitiendo un espacio adecuado para una cola 3' poliA+, y
sugiere que el transcripto, al igual que la mayoría de los ARNm de
levaduras, no contiene intrones.
La región codificante de 1530 pb del gen clonado,
suponiendo que el comienzo de la traducción es la primera ATG en la
ventana de lectura tras la caja TATAA, codifica una proteína de 510
aa. Las investigaciones de homología de bancos de datos de
proteínas conocidas han demostrado que la secuencia de aminoácidos
predicha del gen delta-9 desaturasa de levadura es
homólogo tanto para las proteínas estearil-CoA
desaturasa de rata como de ratón. De forma interesante, la
homología para ambas proteínas de los mamíferos comienza a
alrededor de 42aa y termina a 397aa. Aunque la secuencia del gen
delta-9 desaturasa de levadura clonado procedente
de la cepa X2180-1A de Saccharomyces cerevisiae es
muy similar en secuencia a la dada a conocer aislada de la cepa R
254 (originalmente denominada AB320) (Stukey, JE et al (1990) J.
Biol. Chem. 265: 20144-20149), hay al menos una
diferencia de un aminoácido entre las dos regiones codificantes: la
secuencia publicada da a conocer una met en la posición 304 de los
aminoácidos, opuesto a una leu en la misma posición observada
aquí.
Los datos obtenidos a partir de estudios de
complementación génica, estudios de ruptura de genes, y análisis de
secuencias, han demostrado que el gen clonado fue el
delta-9 desaturasa de levadura.
Se construyeron 4 vectores de expresión, en los
que el gen delta-9 desaturasa de levadura se colocó
bajo el control de diferentes promotores, y se siguió por
diferentes secuencias de terminación/poliadenilación. El vector
usado para la transformación de la planta contenía tanto el
marcador seleccionable deseado como el casete de expresión del gen
delta-9 desaturasa de levadura.
El vector de transformación en el cual se
colocaron los casetes de expresión del gen delta-9
desaturasa de levadura es pH602 (véase Figura 2; RED). Este vector
es un vector binario de plásmido micro Ti similar al plásmido pH575
descrito previamente (Hoffman, LM et al (1987) EMBO J. 6:
3213-3221), excepto que contiene como marcador
seleccionable el gen higromicin-fosfotransferasa
(HPT) en lugar de un gen neofosfotransferasa II (NPTII) (Murria, EE
et al (1991) Plant Mol. Biol. Reporter 16:
1035-1050). El gen HPT, que confiere resistencia al
antibiótico higromicina, está bajo control del promotor constitutivo
CaMV 35S.
A fin de obtener la expresión del gen
delta-9 desaturasa de levadura, el gen se puso bajo
el control de un promotor de faseolina específico de semillas,
obtenido de la haba francesa, Phaseolus vulgaris (REF). Debido a
que la acumulación de aceite en la semilla ocurre antes que la
acumulación de la proteína de almacenamiento en la semilla durante
el desarrollo y maduración de la semilla, el promotor de faseolina
no es óptimo en términos de regulación temporal. Por lo tanto, el
gen se puso bajo el control de un promotor de faseolina modificado
diseñado para ser expresado antes que la faseolina nativa (Bustos et
al (1991) EMBO J. 10: 1469-1479) así como bajo el
control del promotor CaMV 35S constitutivamente expresado.
En este vector, el gen desaturasa de levadura se
colocó bajo el control de un promotor específico de semillas, el
promotor de faseolina de proteína de almacenamiento en la semilla,
y fue seguido por las secuencias de terminación de desaturasa de
levadura.
El vector pSPPneo contenía un gen de faseolina
genómica, y fue la fuente del promotor usado en este constructo. El
vector se digirió con EcoR1 y Sca1; el fragmento
EcoR1-Sca1 de 1,4 kb resultante, que contenía el
promotor de faseolina junto con un sitio de clonación múltiple, se
aisló y se clonó en pUC18, dando como resultado el vector
denominado scp5'phas.
La siguiente etapa eliminó el sitio de clonación
múltiple del promotor de faseolina. El scp5'phas se digirió con
EcoR1 y EcoRV, ambos extremos se rellenaron y el vector se volvió a
ligar. El vector resultante se denominó
scp5'phas-delta, y contenía la región del promotor
de faseolina menos el sitio de clonación múltiple.
\newpage
Se aisló un fragmento HindIII de 5,8 kb de ADN
genómico de levadura que contenía el gen desaturasa de levadura
(véase anteriormente), y se clonó en el sitio Hindi de pUC18, dando
como resultado el vector denominado pUC26A, Entonces se aisló a
partir de pUC26A un fragmento SnaB1-Xho1 de 3,5 kb
que contenía toda la secuencia codificante de desaturasa de
levadura y la secuencia de terminación, y se clonó en el sitio
Sma1-Sal1 de scp5'phas-delta. El
vector resultante se denominó pPO.
Finalmente, se aisló de pPO un fragmento
Nhe1-HindIII de 4,5 kb, que contenía el promotor de
faseolina y las secuencias codificantes y de terminación de
desaturasa de levadura; este fragmento se rellenó, se añadieron
ligantes BamH1, y el fragmento se clonó en el sitio BglII de pH606.
El vector resultante se denominó pH.PO.
En este vector, el gen desaturasa de levadura se
colocó bajo el control del promotor de faseolina y fue seguido por
las secuencias de terminación de faseolina.
Se aisló un fragmento Nhe1-BspH1
de 2,6 kb a partir de pPO (véase anteriormente), que contenía el
promotor de faseolina y la secuencia codificante de desaturasa de
levadura. El sitio BspH1 se rellenó, se añadieron los ligantes Pst1
y el fragmento se clonó en los sitios Xba1-Pst1 de
pUC18. El vector resultante se denominó pPO-2.
Se aisló un fragmento Pst1-Sst1
de 1,5 kb a partir de pSPPneo, que contenía las secuencias
terminantes 3' de faseolina. El sitio Sst1 se rellenó, se añadieron
los ligantes Pst1, y el fragmento se clonó en el sitio Pst1 de
pPO-2. El vector resultante se denominó pPOP.
El pPOP se digirió con BamH1, y el inserto que
contenía el promotor de faseolina, el gen desaturasa de levadura, y
la secuencia de terminación 3' de faseolina se clonó en el sitio
BglII en pH602. El vector resultante se denominó pH.POP.
En este vector, el gen desaturasa de levadura se
colocó bajo el control de un promotor de faseolina modificado, y
fue seguido por las secuencias de terminación de faseolina. El
promotor de faseolina se modificó por truncamiento, lo que se ha
informado que da como resultado una expresión temprana de los genes
regulados por el promotor (Bustos et al (1991) The EMBO J. 10:
1469-1479).
Se aisló un fragmento Bcl1-Pst1
de 2,0 kb a partir de pPO-2 (véase anteriormente),
que contenía un promotor de faseolina truncado y la secuencia
codificante de desaturasa de levadura. El promotor de faseolina
truncado contenía sólo alrededor de un tercio, o 295 pb, de la
secuencia del promotor original. Este fragmento se clonó en los
sitios BamH1- Pst1 de pUC18. El vector resultante se denominó
pPOdeltaB.
Se aisló a partir de POP (véase anteriormente) un
fragmento Pst1 de 1,5 kb, que contenía la secuencia de
poliadenilación 3' del gen de faseolina. Este fragmento se insertó
en el sitio Pst1 de pPOdeltaB, para crear un constructo que contiene
un promotor de faseolina truncado, el gen desaturasa de levadura y
la secuencia de terminación de faseolina. El vector resultante se
denominó pPdeltaBOP.
Se aisló un fragmento BamH1 de 3,2 kb a partir de
pPdeltaBOP, que contenía el promotor de faseolina truncado, la
secuencia codificante de desaturasa de levadura, y la secuencia de
terminación de faseolina. Este fragmento se insertó en el sitio de
clonación de BglII de pH606. El vector resultante se denominó
pH.PdeltaBOP.
En este vector, el gen desaturasa de levadura se
colocó bajo control de un promotor constitutivo, el promotor 35S, y
se siguió por las secuencias de terminación de ORF25.
El vector pIC35/A contiene el promotor CaMV 35S y
la secuencia de poliadenilación de ORF25; los dos están separados
por un sitio de clonación múltiple. De este modo, la estrategia
para construir el vector fue mover el gen desaturasa de levadura de
pUC26A a pIC35A entre el promotor y las secuencias de terminación, y
entonces moverlo al vector pH602.
Se aisló un fragmento BclI-BspH1
de 1665 pb a partir de pUC26A, que contenía la secuencia codificante
de desaturasa de levadura genómica; el sitio BspH1 se rellenó y se
añadieron los ligantes BamH1. Este fragmento se clonó entonces en el
sitio BamH1 de pIC35A; el vector resultante se denominó pSOA. Se
aisló un fragmento Xba1 de 3075 a partir de pSOA, que contenía el
promotor 35S, la secuencia codificante del gen desaturasa de
levadura y la secuencia de poliadenilación 3' de ORF25; el fragmento
se terminó de manera abrupta con ADN polimerasa de T4, y se clonó
en el sitio BglII de pH602, que se había terminado de forma abrupta
con ADN polimerasa de T4. El vector resultante se denominó
pH.SOA.
Los cuatro plásmidos descritos anteriormente,
pH.PO, pH.POP, pH.PdeltaBOP, y pH.SOA, se movieron a la cepa Z707s
de Agrobacterium por apareamiento triparental con las cepas DH15 y
RK2013 de E. coli, esencialmente como se describe (Rogers SG
et al (1988) Plant Molecular Biology Manual A2 (Kluwer Academic
Publisher, Dordrecht),
p. 1-12).
p. 1-12).
La semilla de colza es uno de los cultivos de
semillas oleaginosas más importantes del mundo. Se ha hecho un
esfuerzo considerable para mejorar sus cualidades agronómicas
mediante técnicas de reproducción selectiva. La Brassica
napus y Brassica rapa constituyen la mayoría de la
producción de semilla de colza en América del Norte.
La Brassica napus es bastante susceptible
al cultivo de tejidos, ofreciendo de este modo un buen sistema
para la introducción de genes foráneos. Se han dado a conocer
previamente plantas transgénicas de B. napus obtenidas por
transformación mediada por agrobacterias (Pua et a (1987)
Bio/Technology 5: 815-817; Fry et al (1987) Plant
Cell Reports 6: 321-325; Radke et al (1988) Theor,
Appl. Genet 75; 685-694; y Moloney et al (1989)
Plant Cell Reports 8: 238-242). También se han
usado técnicas de microinyección (Neuhaus et al (1987) Theor Appl.
Genet. 75: 30-36)) y de electroporación de
protoplastos (Guerche et al (1987) Plant Sci. 52:
111-116), para transformar B. napus. La
Brassica rapa también se puede transformar, como se ha dado
a conocer recientemente por Mehra-Palta et al
(1991, Proceedings of the Rapeseed GCIRC Congress, p.
1108-1115).
La planta usada en este ejemplo de transformación
de semilla de colza fue la variedad de cultivo Profit de
Brassica napus. Las semillas se obtuvieron tanto de plantas
normales como de plantas obtenidas a partir de una estirpe de
plantas previamente regeneradas. Esta estirpe regenerada de Profit
da como resultado plantas cuyo tejido demuestra una frecuencia
creciente de transformación, cuando la frecuencia se calcula como el
número de plantas transgénicas obtenidas a partir de un número
específico de explantes tisulares. Se esterilizó la semillas con
hipoclorito sódico al 1,05% (Chlorox al 20%) durante 20 minutos, y
se aclararon 3 veces con agua destilada estéril. Estas semillas se
hicieron germinar asépticamente en medio basal (BM) en cápsulas de
Petri de 20 x 100 mm durante 4-6 días. El BM
constaba de macro y micro elementos de Murashige y Skoog (1962),
con hierro en FeNa2EDTA 40 mg/l, y los siguientes constituyentes
(mg/l): mio-inositol, 100; ácido nicotínico, 0,1;
pirodoxina HCl, 0,1; tiamina HCl, 0,02; glicina, 0,4; sacarosa,
30.000; y bactoagar Difco, 8,000. Las plántulas se hicieron crecer
a 25ºC con un período de luz de 16 horas. Se cortaron segmentos
(2-3 mm) de hipocotilos de plántulas de
4-6 días, y se pretrataron durante 24 horas en BM o
en medio B5 de Gamborg (Gamborg et al, 1968) que contiene ácido
alfa-naftalenacético (NAA) a 5 mg/l o ácido
2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 1
mg/l) (medio formador de callos). Se colocó un papel de filtro
estéril sobre el medio antes del tratamiento.
Los segmentos de hipocotilos se trataron con la
disolución de Agrobacterium (diluida hasta 10 * 8/ml con medio
basal líquido) durante 30 minutos, y luego se colocaron sobre el
medio formador de callos durante 2-3 días de
cocultivo.
Los tejidos de los hipocotilos se transfirieron
al medio formador de callos que contenía carbenicillina (500 mg/l)
e higromicina (5-10 mg/l). Los cultivos se
mantuvieron a 22 \pm 2ºC, con un período de luz de 16 horas.
Después de 7 días, los segmentos de hipocotiledones se
transfirieron a un medio BM o B5 de regeneración de retoños, los
cuales contienen ambos BAP (1-4 mg/l), zeatina
(0-4 mg/l), nitrato de plata (AgNO3,
2,5-10 mg/l), carbenicillina (500 mg/l), e
higromicina (5-10 mg/l). Los medios de formadores
de callos y de regeneración se solidificaron con agarosa (SeaKem,
0,5%) o Gelrite (0,2%). Los tejidos se transfirieron a un medio de
selección reciente cada tres semanas. La formación del callo ocurrió
tras 1-3 semanas de cultivo y los retoños se
formaron 3-6 semanas después. Estos retoños se
transfirieron entonces a un BM que contiene BAP
(0,01-0,1 mg/l) y carbenicillina (100 mg/l) para
alargamiento y se hicieron arraigar más tarde en BM con ácido
indolbutílico (IBA, 0,1 mg/l).
Cada planta regenerada que sobrevivió en el medio
de selección se ensayó para determinar para determinar si de hecho
era transgénica, mediante al menos uno de los siguientes ensayos
biológicos y moleculares.
La presencia y expresión de un gen se puede
determinar mediante un ensayo de la actividad de la proteína que es
codificada por el gen. El ensayo del disco de hoja es un ensayo
biológico que detecta la actividad del gen marcador seleccionable,
HPT (que confiere resistencia frente a higromicina al tejido
transformado), midiendo el crecimiento del tejido en presencia de
higromicina. Puesto que tanto el gen HPT como el gen desaturasa de
levadura se transfieren juntos en una sola pieza de ADN, la
presencia del gen HPT indica que también está presente el gen
desaturasa de levadura en el tejido ensayado, como se confirma
separadamente por análisis de PCR (véase a continuación).
Se cultivaron pequeñas secciones de hojas
(2-3 mm cuadrados), obtenidas de retoños que se
hicieron crecer en el medio de selección, en BM que contenía BAP (4
mg/l), NAA (0,5 mg/l) e higromicina (10 mg/l), durante
3-4 semanas. Se determinó que aquellas secciones de
hojas que permanecían verdes, y producían callos, raíces, o retoños,
se originan a partir de plantas transgénicas. El tejido no
transformado (o "escapes") se puso marrón y murió.
La presencia de un gen se puede determinar
ensayando la presencia de su ADN en una muestra de tejido. Dos de
tales métodos de ensayo incluyen un ensayo de reacción en cadena de
polimerasa (PCR) y un ensayo Southern.
Se utilizó un ensayo en cadena de polimerasa
(PCR) para analizar cantidades muy pequeñas de ADN para determinar
la presencia de dos genes, las regiones codificantes de desaturasa
de levadura, y el gen HPT (que confiere resistencia frente a
higromicina). Sólo se ensayaron por muestra 100 ng de ADN aislado a
partir de tejido de hoja de semilla de colza, esencialmente según
se ha descrito (en Current Protocols in Molecular Biology (1987),
editado por Ausubel, RM et al; Greene Publishing Associates &
Wiley-Interscience). Los cebadores que corresonden
a las posiciones +543 y +1277 en la secuencia codificante del gen
desaturasa de levadura dieron como resultado la síntesis de un
fragmento de ADN que apareció como una banda de 751 pb en aquellas
plantas que contenían el gen. De manera similar, los cebadores para
secciones específicas del gen HPT dieron como resultado la síntesis
de un fragmento de ADN en aquellas plantas que contenían el gen
HPT.
Un análisis Southern detecta la presencia de una
secuencia específica de ADN en una muestra mediante hibridación de
una sonda marcada para esa secuencia en el ADN de la muestra. Para
el análisis, se requiere mucho más ADN que el necesario para un
ensayo de PCR (véase anteriormente). El número de copias del gen
desaturasa de levadura transferido a las plantas de semilla de
colza transformadas también se puede determinar a partir del
análisis Southern.
Se digirieron con HindIII 10 \mug de ADN por
muestra aislada a partir de tejido de semilla de colza, y se
sometió a análisis Southern esencialmente como se ha descrito
(Current Protocols in Molecular Biology (1987), editado por Ausubel,
RM et al; Greene Publishing Associates &
Wiley-Interscience). Se marcó un doblete EcoR1 de
402 pb y 422 pb, procedente de la secuencia codificante del gen
desaturasa de levadura, mediante el procedimiento de hexámero
aleatorio según las instrucciones del fabricante (United States
Biochemical), y se usó como una sonda.
La expresión del delta-9
desaturasa de levadura en tejido de semillas dio como resultado la
transcripción del ADN a ARNm; el ARNm se traduce a su vez en la
proteína. Finalmente, la proteína activa desatura ácidos grasos
saturados. De este modo, la determinación de la expresión del gen
delta-9 desaturasa de levadura en tejido de semillas
se puede determinar ensayando la presencia de ARNm, de la proteína,
o de una composición de ácido graso alterado en el aceite de
semilla.
La expresión del gen desaturasa de levadura se
determina al nivel de transcripción detectando la presencia del
ARNm de desaturasa. Esto se logra mediante ensayo de PCR y
transcripción inversa ligada, modificado a partir de Frohman et al
(1988; PNAS (USA) 85: 8998 - 9002), en el que se analizan pequeñas
cantidades de tejido en busca de la presencia de transcriptos de
ARN a partir del gen desaturasa.
Un análisis Western detecta la presencia de una
proteína uniendo la proteína, tras separación mediante
electroforesis en gel, a un anticuerpo marcado. De este modo, este
método detecta la expresión de un gen al nivel de traducción, o al
nivel de la proteína. Es preferible analizar el tejido cuando se
espera el nivel de expresión más alto del gen, por ejemplo durante
la acumulación de aceite durante el desarrollo de la semilla.
Las semillas procedentes de plantas transgénicas
se recogen a diversos tiempos tras la polinización. Las muestras
proteínicas se preparan de conjuntos de 10 semillas para cada
planta homogenizando en tampón de gel de SDS (50 mM
Tris-HCl, pH 6,8, 1% de SDS, 2 mN de DTT y 2 mM de
EDTA). Los homogenados se aclaran haciéndolos girar en una
microcentrífuga durante cinco minutos. Las proteínas en las
fracciones sobrenadantes se separan mediante
SDS-PAGE al 10% (Laemmli, UK (1970) Nature 227;
680-685), se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa (Towbin, H et al. (1979) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 76:
4350- 4354) y se hicieron reaccionar secuencialmente primero con
antisuero policlonal de conejo elevado a un péptido de desaturasa
de levadura, y entonces con IgG conjugada con enzima (bien
fosfatasa alcalina o bien peroxidasa de rábano picante) anticonejo.
Los anticuerpo conjugados se visualizaron mediante tinción de la
actividad según el protocolo o protocolos del fabricante.
La composición de ácidos grasos de la semilla de
colza se determinó a continuación para análisis de "media
semilla", análisis de "semilla única/completa", o análisis
del "conjunto de las semillas" (por ejemplo, el procedimiento
de metilación de ácidos grasos es una modificación del dado a
conocer por Craig, BM y Murty, NL, 1959, J Amer Oil Chem Soc 36:
549-552).
Para los análisis de "media semilla", se
retiró y analizó una porción de tejido de cotiledón procedente del
embrión; el resto de la semilla se guardó entonces, y se pudo
germinar si se desea.
1. La muestra de tejido de cotiledón se colocó en
un vial de 2 ml para toma de muestras automatizada.
2. Se añadió n-heptano (500
\mul), y el aceite se extrajo durante 16 horas por incubación a
temperatura ambiente.
3. Se añadió metóxido sódico en metanol (50
\mul de 0,5 M), y los ácidos grasos se transesterificaron durante
60 minutos a temperatura ambiente.
4. Entonces se añadió agua destilada (20 \mul),
y el vial se tapó con un tapón superior de bordes fruncidos forrado
con TPFE. La muestra estaba de este modo lista para ser procesada a
través del cromatógrafo gas-líquido.
Para los análisis de "semilla única" se
colocó una sola semilla en un vial de 2 ml para toma de muestras
automatizada, y se trituró con una varilla de vidrio.
1. Se añadió n-heptano (1,0 ml),
y el aceite se extrajo durante 16 horas por incubación a temperatura
ambiente.
2. Se añadió n-heptano (3,0 ml),
y el aceite se extrajo durante una hora por incubación a temperatura
ambiente.
3. Se añadió metóxido sódico en metanol (50
\mul de 0,5 N), el vial se sometió a un vórtex, y los ácidos
grasos se transesterificaron durante 60 minutos a temperatura
ambiente.
4. Se añadió agua destilada (20 \mul), el vial
se sometió a vórtex y entonces se tapó con un tapón superior de
bordes fruncidos forrado con TPFE. La muestra estaba de este modo
lista para ser procesada a través del cromatógrafo
gas-líquido.
Para los análisis del "conjunto de
semillas", se seleccionaron seis semillas maduras que eran de
color negro y estaban bien rellenas.
1. Las semillas se colocaron en un tubo de ensayo
de vidrio desechable de 16 x 100 mm.
2. Se añadió n-heptano (1,5 ml),
y las semillas se molieron con un homogeneizador de tejidos. El
aceite se extrajo durante un minuto.
3. Se añadió metóxido sódico en metanol (500
\mul de 0,5 N), el tubo se sometió a un vórtex, y la muestra se
incubó durante 5 minutos.
4. Se añadió agua destilada (7,0 ml), y el tubo
se sometió a un vórtex.
5. Una porción de la capa orgánica (1,5 ml) se
transfirió a un vial de 2,0 ml para toma de muestras automatizada,
y el vial se tapó entonces con un tapón superior de bordes
fruncidos forrado con TPFE. La muestra estaba de este modo lista
para ser procesada a través del cromatógrafo
gas-líquido.
Los análisis de GLC se realizaron con un
cromatógrafo de gas líquido Hewlett Packard 5890 equipado con un
detector de ionización por llama y un integrador ChromStation. Se
usó un aparato de toma de muestras automatizada Hewlett Packard 7376
para extraer una porción de 1 \mul de ácidos grasos libres
metilados de la fase orgánica superior en el vial, y para
inyectarlo en el GLC. La columna usada fue una columna capilar de
sílice fundida DB-23 (con un grosor de película de
0,24 micrómetros, y dimensiones de la columna de 0,25 mm de
diámetro interno x 30 mm de longitud.
Las condiciones de funcionamiento para el
análisis de GLC incluyeron una temperatura del inyector de 250ºC, y
una temperatura del detector de 300ºC. El gas portador fue helio
que fluye a 1,1 cm^{3}/minuto a través de la columna, y a 30
cm^{3}/minuto a través del detector. Cada experimento
cromatográfico comenzó a 180ºC durante 8 minutos; la temperatura se
incrementó entonces en 5ºC por minuto hasta 220ºC, y entonces se
mantuvo a 220ºC durante 4 minutos. Con este programa, eluyeron todos
los principales ésteres metílicos de ácidos grasos esperados para
aceites vegetales (es decir, palmitato, estearato, oleato,
linoleato y linolenato); además, se separaron entre sí los dos
isómeros del éster metílico del ácido graso de 18 carbonos
monoinsaturado, oleato y cis-vaccenato. La
proporción de cada ácido graso presente se expresó como el
porcentaje en peso con relación al contenido de ácido graso total
de la semilla.
La variedad Profit de B. napus de semilla
de colza es una semilla de colza de primavera de tipo Canola con
un alto contenido en oleato en el aceite de semilla. El análisis de
cincuenta semillas individuales dio como resultado el siguiente
perfil de ácidos grasos:
a. Perfil de ácidos grasos de B. napus,
variedad de cultivo
Profit
| Ácido graso | Media | Mínimo | Máximo |
| C16:0 | 4,05 | 3,20 | 7,40 |
| C16:1 | 0,18 | 0,00 | 0,50 |
| C18:0 | 2,07 | 1,20 | 3,80 |
| C18:1D9 | 63,78 | 51,90 | 72,10 |
| C18:1D11 | 2,72 | 1,80 | 5,90 |
| C18:2 | 16,76 | 11,50 | 21,80 |
| C18:3 | 6,82 | 3,60 | 11,20 |
| C20:0 | 0,73 | 0,50 | 1,30 |
| C20:1 | 1,24 | 0,90 | 1,50 |
| C22:0 | 0,38 | 0,00 | 0,80 |
| C24:0 | 0,24 | 0,00 | 0,90 |
| C24:1 | 0,21 | 0,00 | 0,40 |
b. Perfil de ácidos grasos de B. napus
regenerado, variedad de cultivo
Profit
| Ácido graso | Media | Mínimo | Máximo |
| C16:0 | 5,28 | 4,30 | 6,90 |
| C16:1 | 0,26 | 0,10 | 0,50 |
| C18:0 | 1,78 | 1,20 | 3,60 |
| C18:1D9 | 51,51 | 40,70 | 63,70 |
| C18:1D11 | 2,39 | 1,40 | 3,70 |
| C18:2 | 25,35 | 16,30 | 35,00 |
| C18:3 | 9,68 | 4,80 | 18,20 |
| C20:0 | 0,66 | 0,40 | 1,30 |
| C20:1 | 1,08 | 0,80 | 1,40 |
| C22:0 | 0,40 | 0,20 | 0,90 |
| C24:0 | 0,30 | 0,00 | 0,70 |
| C24:1 | 0,29 | 0,00 | 0,70 |
El tejido obtenido a partir de la variedad Profit
se transformó con cada uno de los cuatro vectores como se describe
anteriormente. Las plantas transformadas enraizadas se
transfirieron a tierra cuando los retoños tenían una longitud de 2
cm o más. Las plantas se mantuvieron en una cámara de crecimiento
Conviron a 20ºC con 16 horas de luz a 15ºC durante
3-4 semanas; entonces se movieron al invernadero,
donde se hicieron crecer hasta madurez. Con la floración, las
plantas se autopolinizaron, y se recogieron semillas maduras.
El contenido en ácidos grasos del aceite
resultante en las semillas maduras se analiza mediante análisis de
la semilla completa, o mediante análisis de media semilla en el que
se analiza una porción del cotiledón mientras se guarda el resto de
la semilla y se puede plantar.
\newpage
Como alternativa, a fin de detectar la presencia
de la proteína delta-9 desaturasa de levadura en la
semilla, se recogieron semillas en desarrollo, y se analizó el ARNm
mediante un ensayo de PCR o la proteína se analizó mediante un
ensayo Western.
El contenido en ácidos grasos de las semillas
obtenidas a partir de tejido de semilla de colza transformado con
el tercer vector, pH.PdeltaBOP, que entonces se regeneró y se
autopolinizó, contenía una disminución significativa en las
proporciones de los ácidos grasos saturados palmitato y estearato,
con un aumento concomitante en los niveles de palmitoleato y
oleato, cuando se compara con las proporciones observadas en la
planta "progenitora" no transformada (véase Tabla 1). En este
vector, el gen desaturasa de levadura se coloca bajo control de un
promotor de faseolina modificado. La modificación, que consiste en
eliminar los primeros 2/3 del promotor, da como resultado una
expresión más temprana del gen regulado durante el desarrollo de la
semilla. La expresión del gen parece que ocurre durante la
acumulación de líquidos, de forma que los ácidos grasos insaturados
se desaturan durante el ensamblaje con triglicerol. El aceite
vegetal resultante, con niveles muy bajos de ácidos grasos
saturados, es un sustituto deseable para aceites vegetales
actualmente en el mercado.
El contenido en ácidos grasos de las semillas
obtenidas a partir de plantas transformadas con cualquiera de los
otros tres vectores, que entonces se regeneran y se autopolinizan,
contienen proporciones variables de los ácidos grasos saturados
palmitato y estearato, las cuales, sin embargo, son todas iguales o
menores que las observadas en la planta "progenitora" no
transformada (véase Tabla 1). Estos vectores, que contienen
elementos reguladores que causan la expresión génica durante el
desarrollo de la semilla, dan como resultado niveles variables de
la expresión del gen durante la acumulación de los lípidos.
Las semillas que resultan de plantas
transformadas, regeneradas y autopolinizadas, se hacen germinar y
entonces se autopolinizan con la floración. Las semillas
resultantes se analizan para determinar la estabilidad de los rasgos
y la herencia génica.
El gen delta-9 desaturasa de
levadura se transfiere a otras Brassica mediante uno de los
dos métodos. Uno es transformar directamente otra semilla de colza y
mostaza de oleaginosa según se describe anteriormente; y el otro es
mover el rasgo a otra semilla de colza y mostaza de oleaginosa
mediante técnicas de reproducción clásicas. Las plantas adecuadas
para la transformación de plantas (véase anteriormente) son
Brassica rapa, Brassica napus, y Brassica
junceae. Además, se pueden aparear de forma cruzada en un
programa de reproducción.
Esto permite la transferencia del
delta-9 desaturasa de levadura a la semilla de
colza y mostaza de oleaginosas seleccionada en base a sus perfiles
iniciales de ácidos grasos o a sus características agronómicas. En
la Tabla 2 se resumen algunos ejemplos de semilla de colza y de
mostaza de oleaginosa a los que se transfiere el gen
delta-9 desaturasa de levadura.
| Brassica napus | |
| Canola de Primavera | Profit, Excel, Legend, Delta, cepas |
| patentadas con alto contenido en | |
| oleato/bajo contenido en linoleato | |
| HEAR de Primavera | Hero |
| Canola de Invierno | Ceres, Tapidor, Samoris, cepas |
| patentadas con alto contenido en oleato y | |
| alto contenido en oleato/bajo contenido en | |
| linoleato | |
| Brassica rapa | |
| HEAR de Invierno | Bridger, LEI |
| Canola de Primavera | Parkland, Colt, Horizon, Svalof, cepas |
| patentas con alto contenido en palmitato, | |
| alto contenido en oleato | |
| Brassica junceae | |
| HEAR de Primavera | R500 |
| Tipo de oleaginosa de la India con alto | RH30, Puva Bold |
| contenido en erucato | |
| Tipo de oleaginosa canadiense con bajo | ZEM 87-1 |
| contenido en erucato |
La presente invención se ha expuesto aquí
forzosamente con referencia a ciertos métodos y materiales
específicos. La enumeración de estos métodos y materiales fue
meramente ilustrativa, y de ningún modo constituye ninguna
limitación al alcance de la presente invención. Es de esperar que
aquellos expertos en la técnica pueden discernir y practicar
variaciones o alternativas a las enseñanzas específicas
proporcionadas en este documento, sin apartarse del alcance de la
presente invención.
Claims (23)
1. Semilla de planta de cultivo de semillas
oleaginosas que comprende un gen delta-9 desaturasa
de levadura y medios para expresar dicho gen delta-9
desaturasa de levadura en dicha semilla de planta, en la que dichos
medios para expresar comprende un promotor específico de semillas
efectivo para provocar la expresión de dicho gen
delta-9 desaturasa de levadura en dicha semilla de
planta, y en la que la expresión de dicho gen
delta-9 desaturasa de levadura da como resultado un
aumento en el contenido, en tanto por ciento, de ácido palmitoleico
en el aceite de semilla de dicha semilla de planta.
2. Semilla de planta según la reivindicación 1,
en la que dicho promotor específico de semillas es un promotor de
faseolina.
3. Semilla de planta según las reivindicaciones 1
y 2, en la que dicho promotor específico de semillas es un promotor
de faseolina truncado.
4. Semilla de planta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una secuencia de
terminación para dicho gen delta-9 desaturasa de
levadura.
5. Semilla de planta según la reivindicación 4,
en la que dicha secuencia de terminación se selecciona de una
secuencia de terminación de delta-9 desaturasa de
levadura, una secuencia de terminación 3' de faseolina, y una
secuencia de terminación 3' de ORF 25.
6. Semilla de planta según la reivindicación 5,
en la que dicha secuencia de terminación es una secuencia de
terminación de ORF.
7. Semilla de planta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha semilla de planta es una
semilla de un género de planta monocotiledónea.
8. Semilla de planta según la reivindicación 7,
en la que dicho género de planta monocotiledónea es sorgo.
9. Semilla de planta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha semilla de planta es una
semilla de un género de planta dicotiledónea.
10. Semilla de planta según la reivindicación 9,
en la que dicho género de planta dicotiledónea se selecciona de
Brassica, Helianthus, Carthamus, Sesamum, Glicine, Arachis,
Gossypium, Lesquerella y Vernonia.
11. Semilla de planta según la reivindicación 10,
en la que dicho género de planta dicotiledónea es
Brassica.
12. Semilla de planta según la reivindicación 11,
en la que dicha semilla de planta es una semilla seleccionada de
Brassica rapa y Brassica napus.
13. Método para modificar el contenido en ácidos
grasos del aceite de semilla de una semilla de planta de cultivo de
semillas oleaginosas, comprendiendo dicho método la etapa de
transformar la semilla de planta de cultivo de semillas oleaginosas
para expresar un gen delta-9 desaturasa de levadura,
en el que dicha modificación comprende aumentar el contenido en
tanto por ciento de ácido palmitoleico en el aceite de semilla de
dicha semilla de planta, y en el que dicha etapa de transformación
comprende añadir, al ADN nativo de dicha semilla de planta, ADN
exógeno, comprendiendo dicho ADN exógeno un gen
delta-9 desaturasa de levadura y un promotor
específico de semillas.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
dicha etapa de transformación se lleva a cabo usando una mediación
de la transformación seleccionada de Agrobacterium,
electroporación, polietilenglicol (PEG), fibra de carburo de
silicio, pistola de partículas, e inyección directa.
15. Método según las reivindicaciones 13 y 14,
que comprende además construir un vector que contiene dicho gen
delta-9 desaturasa de levadura y dicho promotor,
colocar dicho vector en una cepa seleccionada de Agrobacterium, y
tratar células seleccionadas de la planta con dicho Agrobacterium
en condiciones suficientes para dar como resultado la transferencia
de al menos algunos de dichos vectores desde dicho Agrobacterium a
dichas células de la planta, con lo que dicho gen
delta-9 desaturasa de levadura se expresa en dichas
células de la planta.
16. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha modificación comprende
además reducir el contenido en tanto por ciento de ácido esteárico
en el aceite de semilla de dicha semilla de planta.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha semilla de planta es una
semilla de un género de planta monocotiledónea.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
dicho género de planta monocotiledónea es Sorgom.
\newpage
19. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha semilla de planta es una
semilla de un género de planta dicotiledónea.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
dicho género de planta dicotiledónea se selecciona de Brassica,
Helianthus, Carthamus, Sesamum, Glicine, Arachis, Gossypium,
Lesquerella y Vernonia.
21. Método según la reivindicación 20, en el que
dicho género de planta dicotiledónea es Brassica.
22. Método según la reivindicación 21, en el que
además dicha semilla de planta es una semilla seleccionada de
Brassica rapa y Brassica napus.
23. Planta de semillas oleaginosas obtenible a
partir de la semilla de planta según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en la que las semillas de dicha planta
comprenden un gen delta-9 desaturasa de levadura y
medios para expresar dicho gen delta-9 desaturasa
de levadura en dicha semilla de planta, en la que dichos medios para
expresar comprende un promotor específico de semillas efectivo para
provocar la expresión de dicho gen delta-9
desaturasa de levadura en dicha semilla de planta, y en la que la
expresión de dicho gen delta-9 desaturasa de
levadura da como resultado un aumento en el contenido, en tanto por
ciento, de ácido palmitoleico en el aceite de semilla de dicha
planta.
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