ES2541537T3 - Expresión de desaturasas de ácido graso en maíz - Google Patents

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Abstract

Una planta de maíz transgénica o semilla de maíz transgénica que comprende una construcción recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una Δ15 desaturasa de Neurospora crassa mutagenizada para aumentar su expresión en una monocotiledónea, tal como maíz, y una secuencia polinucleotídica que codifica una Δ6 desaturasa de Primula julia modificada para su expresión en plantas monocotiledóneas, comprendiendo dicha planta de maíz y semilla de maíz un aceite de semilla de maíz endógeno que tiene un contenido de ácido estearidónico (18:4 n-3) del 25 al 33%.

Description

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incorporada por referencia), promotor PER1 de peroxidina de semilla de cebada (véase por ejemplo, Stacey y col., Plant Mol. Biol., 31:1205-1216, 1996), y el promotor de oleosina L3 de Zea mays (P-Zm.L3, véase, por ejemplo, Hong y col., Plant Mol. Biol., 34(3):549-555, 1997; véase también la patente de Estados Unidos Nº 6.433.252).
Ejemplos de promotores altamente expresados en el endosperma incluyen promotores de genes que codifican zeinas, que son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en endosperma de maíz. Se han aislado clones genómicos para genes de zeina (Pedersen y col., Cell 29:1015-1026 (1982), y Russell y col., Transgenic Res. 6(2):157-168) y los promotores de estos clones, incluyendo los genes de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, y 27 kD, también podrían usarse para proporcionar expresión en el endosperma de acuerdo con la invención (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.326.527). Otros promotores adecuados conocidos por funcionar en maíz, y en otras plantas, incluyen los promotores para los siguientes genes: céreo (sintasa de almidón unido a gránulos), frágil y reducido 2 (ADP glucosa pirofosforilasa), reducido 1 (sacarosa sintasa), enzimas de ramificación I y II, sintasas de almidón, enzimas desramificantes, oleosinas, glutelinas, sacarosa sintasas (Yang y col., 1990), Betl1 (capa de transferencia de endosperma basal) y globulina1. Otros promotores útiles en la práctica de la invención que son conocidos por los especialistas en la técnica también se contemplan por la invención.
Los especialistas en la técnica pueden determinar vectores y elementos reguladores (incluyendo promotores y regiones codificantes unidas de forma funcional) adecuados para la expresión en una célula huésped particular. "Unido de forma funcional" en este contexto significa que el promotor y las secuencias terminadoras funcionan de forma eficaz regulando la transcripción. Como ejemplo adicional, un vector apropiado para la expresión de 6 y/o 15-desaturasa en plantas de maíz transgénicas puede comprender secuencias promotoras específicas de semilla unidas de forma funcional a la región codificante de desaturasa y adicionalmente unidas de forma funcional a una señal de terminación de proteína de almacenamiento en semilla o la señal de terminación de la nopalina sintasa. Como ejemplo adicional más, un vector para su uso en la expresión de desaturasas en plantas puede comprender un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido unido de forma funcional a la región codificante de desaturasa y unido de forma funcional adicional a un terminador constitutivo o específico de tejido o la señal de terminación de la nopalina sintasa.
Modificaciones de las secuencias de nucleótidos o elementos reguladores desvelados en el presente documento que mantienen las funciones contempladas en el presente documento están dentro del alcance de la presente invención. Dichas modificaciones incluyen inserciones, sustituciones y deleciones, y específicamente sustituciones que reflejan la degeneración del código genético.
Las técnicas convencionales para la construcción de dichos vectores recombinantes son bien conocidas para los especialistas en la técnica y pueden encontrarse en referencias tales como Sambrook y col. (2001), o cualquiera de la miríada de manuales de laboratorio sobre tecnología de ADN recombinante que están ampliamente disponibles. Está disponible una diversidad de estrategias para ligar fragmentos de ADN, la elección de los cuales depende de la naturaleza de los extremos de los fragmentos de ADN. Se contempla adicionalmente de acuerdo con la presente invención incluir en un vector de ácido nucleico otros elementos de secuencia de nucleótidos que faciliten la clonación, expresión o procesamiento, por ejemplo secuencias que codifican péptidos señal, una secuencia codificante de KDEL, que es necesaria para retención de proteínas en el retículo endoplasmático o secuencias que codifican péptidos de transición que dirigen la 6-desaturasa al cloroplasto. Dichas secuencias son conocidas para los especialistas en la técnica. Un péptido de tránsito optimizado se describe, por ejemplo, por Van den Broeck y col. (1985). Se desvelan secuencias señal procariotas y eucariotas, por ejemplo, por Michaelis y col. (1982).
Una vez se ha aislado el ADN genómico o ADNc deseado, puede secuenciarse por procedimientos conocidos. Se reconoce en la técnica que dichos procedimientos están sujetos a errores, de modo que la secuenciación múltiple de la misma región es rutinaria y aún se espera que conduzca a tasas medibles de errores en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensiva, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con un alto contenido de bases GC. Cuando surgen discrepancias, puede hacerse re-secuenciación y pueden emplearse procedimientos especiales. Los procedimientos especiales pueden incluir condiciones de secuenciación alterantes usando: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucleótidos de formar estructuras de orden mayor; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; diferentes composiciones de gel, por ejemplo añadiendo formamida; diferentes cebadores o cebadores localizados a diferentes distancias desde la región problemática; o diferentes moldes tales como ADN monocatenario. También puede emplearse secuenciación de ARNm.
Algo de o toda la secuencia codificante de un polipéptido que tiene actividad desaturasa puede ser de una fuente natural. En algunas situaciones, sin embargo, es deseable modificar todo o una parte de los codones, por ejemplo, para potenciar la expresión, empleando codones preferidos por el huésped. Los codones preferidos por el huésped pueden determinarse a partir de codones de la mayor frecuencia en las proteínas expresadas en la cantidad más grande en una especie de huésped particular y/o tejido de interés. Por tanto, la secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad desaturasa puede sintetizarse por completo o en parte. Todo o partes del ADN también pueden sintetizarse para retirar cualquier secuencia o región desestabilizante de estructura secundaria que estaría presente en el ARNm transcrito. Todo o partes del ADN también pueden sintetizarse para alterar la composición de bases a una más preferible en la célula huésped deseada. Los procedimientos para sintetizar secuencias y poner secuencias juntas están bien establecidos en la bibliografía. Puede emplearse mutagénesis y
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disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma preferida de administración oral. La suplementación en la dieta como se ha expuesto anteriormente también puede proporcionar una vía oral de administración. Los ácidos insaturados de la presente invención pueden administrarse en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos. Se desvela en el presente documento cualquier sal farmacéuticamente aceptable, son especialmente preferidas las sales de sodio, potasio o litio. También se desvelan las sales de Nalquilpolihidroxamina, tales como N-metil glucamina, encontradas en la publicación PCT WO 96/33155. Los ésteres preferidos son los ésteres de etilo. Como sales sólidas, los PUFA también pueden administrarse en forma de comprimido. Para administración intravenosa, los PUFA o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como Intralípidos.
Se proporcionan secuencias codificantes o fragmentos de las mismas unidas de forma funcional a un promotor heterólogo, en orientación con sentido o antisentido. También se proporcionan construcciones de expresión que comprenden estas secuencias, y también plantas y células vegetales transformadas con las secuencias. La construcción de construcciones que pueden emplearse junto con técnicas de transformación de plantas usando éstas u otras secuencias de acuerdo con la invención serán bien conocidas para los especialistas en la técnica a la luz de la presente divulgación (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001; Gelvin y col., 1990).
Un uso de las secuencias desveladas en el presente documento será en la alteración de la composición de aceite. El gen de la desaturasa puede proporcionarse con otras secuencias. Cuando se emplea una región codificante expresable que no es necesariamente una región codificante marcadora en combinación con una región codificante marcadora, pueden emplearse las regiones codificantes diferentes en el mismo segmento de ADN o en diferentes segmentos de ADN para la transformación. En el último caso, los diferentes vectores se suministran de forma concurrente a las células destinatarias para maximizar la cotransformación.
La elección de cualquier elemento adicional usado junto con las secuencias codificantes de desaturasa a menudo dependerá del propósito de la transformación. Uno de los propósitos principales de transformación de plantas de cultivo es añadir rasgos agronómicamente importantes comercialmente deseables, a la planta. Como se sabe que los PUFA confieren muchos efectos beneficiosos a la salud, aumentos concomitantes en la producción de SDA también pueden ser beneficiosos y podrían conseguirse mediante la expresión de Δ6-desaturasa de Primula. Dicho aumento de SDA puede comprender, en ciertas realizaciones de la invención, la expresión de Δ12 y/o Δ15 desaturasa.
Los vectores usados para la transformación de plantas pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, YAC (cromosomas artificiales de levadura), BAC (cromosomas artificiales de bacterias) o cualquier otro sistema de clonación adecuado, así como fragmentos de ADN de los mismos. Por tanto, cuando se usa el término "vector" o "vector de expresión", se incluyen todos los tipos anteriores de vectores, así como secuencias de ácido nucleico aisladas de los mismos. Se contempla que la utilización de sistemas de clonación con capacidades de insertos grandes permitirá la introducción de grandes secuencias de ADN que comprenden más de un gen seleccionado. Esto podría usarse para introducir diversos ácidos nucleicos codificantes de desaturasa. La introducción de dichas secuencias puede facilitarse mediante el uso de cromosomas artificial de bacterias o levaduras (BAC o YAC, respectivamente), o incluso cromosomas artificiales de plantas. Por ejemplo, se desveló el uso de BAC para transformación mediada por Agrobacterium por Hamilton y col. (1996).
Son particularmente útiles para la transformación los casetes de expresión que se han aislado de dichos vectores. Los segmentos de ADN usados para transformar células vegetales generalmente comprenderán, por supuesto, el ADNc, gen o genes que se desea introducir en y expresar en las células huésped. Estos segmentos de ADN pueden incluir adicionalmente estructuras tales como promotores, potenciadores, polienlazadores, o incluso genes reguladores según se desee. El segmento de ADN o gen elegido para introducción celular a menudo codificará una proteína que se expresará en las células recombinantes resultantes produciendo un rasgo investigable o seleccionable y/o que conferirá un fenotipo mejorado a la planta transgénica resultante. Sin embargo, éste puede no ser siempre el caso, y también se desvelan plantas transgénicas que incorporan transgenes no expresados. Los componentes preferidos a incluir probablemente con los vectores desvelados en el presente documento son los siguientes.
La secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante, es decir, la secuencia líder no traducida, también puede influir en la expresión génica. Por tanto se puede desear el empleo de una secuencia líder particular con la construcción de transformación. Se contempla que las secuencias líder preferidas incluyen aquellas que comprenden secuencias predichas para dirigir la expresión óptima del gen unido, es decir, para incluir una secuencia líder consenso preferida que puede aumentar o mantener la estabilidad del ARNm y evitar el inicio inapropiado de la traducción. La elección de dichas secuencias será conocida para los especialistas en la técnica a la luz de la presente divulgación. Las secuencias que se obtienen de genes que se expresan altamente en plantas serán típicamente preferidas.
Las construcciones de transformación preparadas de acuerdo con la invención típicamente incluirán una secuencia de ADN en el extremo 3' que actúa como señal para terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del ARNm producido por las secuencias codificantes unidas de forma funcional a un gen de desaturasa (por ejemplo, ADNc). En una realización de la invención, se usa el terminado nativo de un gen de desaturasa. Como alternativa, un
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar realizaciones de la invención. Los ejemplos no cubiertos por el alcance de las reivindicaciones son con fines ilustrativos.
Ejemplo 1
Vectores para la expresión de Δ15-y Δ6-desaturasas en maíz
Se construyó un vector binario para expresar una Δ15-desaturasa y una Δ6-desaturasa en embrión y tejido aleurona de maíz. Esta construcción se preparó con el promotor de globulina dirigiendo la expresión de una Δ15-desaturasa de Neurospora crassa mutagenizada para aumentar su expresión en una monocotiledónea tal como maíz (SEC ID Nº 5) y de una Δ6 desaturasa de Mortierella alpina (SEC ID Nº 6, pb 71-1444) (patente de Estados Unidos Nº 6.075.183). La Δ6 desaturasa de M. alpina se clonó en un vector lanzadera que contenía el promotor de globulina, pMON67624, produciendo pMON82809. La Δ15 desaturasa de N. crassa mutagenizada se clonó en un vector lanzadera que contenía el promotor de globulina, pMON67624, produciendo pMON82810.
Los dos casetes de expresión de globulina y desaturasa después se clonaron en el vector binario de maíz pMON30167 que contenía el gen marcador CP4 para resistencia a glifosato. El primer casete de expresión que contiene la Δ6 desaturasa de M. alpina se clonó en pMON30167, produciendo pMON82811. El segundo casete de expresión que contenía la Δ15 desaturasa de N. crassa mutagenizada después se clonó en pMON82811, produciendo la construcción de transformación de maíz pMON82812 (FIG. 1). Se obtienen explantes transformados mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las plantas se regeneran a partir de tejido transformado. Las plantas cultivadas en invernadero después se analizan para la composición de aceite.
Se construyó otro vector binario, pMON78175 para expresar una Δ15-desaturasa y una Δ6-desaturasa en embrión y tejido aleurona de maíz. Para generar el vector binario, se amplificó por PCR un casete de expresión que contenía la Δ15 desaturasa de N. crassa (SEC ID Nº 5) bajo el control del promotor de globulina usando pMON82812 como molde, se clonó en un vector lanzadera, y se verificó la secuencia del casete. El casete de expresión que contenía la Δ6-desaturasa de P. juliae (SEC ID Nº 7) dirigida por el promotor de globulina se generó por PCR. Como parte de este procedimiento, se cambiaron los nucleótidos que preceden inmediatamente al codón de inicio ATG de la Δ6desaturasa de P. juliae a CAGCC, para generar una región de inicio de la traducción optimizada para la expresión génica en plantas monocotiledóneas tales como maíz. Usando procedimientos convencionales de restricción y ligamiento que están bien establecidos en la técnica, se clonaron posteriormente la Δ6-desaturasa de P. juliae y la Δ15 desaturasa de N. crassa en un vector binario que albergaba un casete de expresión de CP4 como marcador de selección para generar el vector de transformación de maíz, pMON78175 (FIG. 2). Los explantes transformados se obtienen mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las plantas se regeneran a partir del tejido transformado. Las plantas cultivadas en invernadero después se analizan para la composición de aceite.
Ejemplo 2
Vector para la expresión de una Δ6 desaturasa de Primula juliae de secuencia optimizada paramonocotiledóneas en maíz
Este ejemplo expone el diseño y construcción de una molécula polinucleotídica de Δ6 desaturasa de Primula juliae modificada para su expresión en plantas monocotiledóneas. Es bien sabido en la técnica que las secuencias que codifican proteína no endógena pueden no expresarse bien en plantas (patente de Estados Unidos Nº 5.880.275). Por lo tanto, usando una secuencia polipeptídica PjD6D nativa (SEC ID Nº 3), se diseñó y construyó una secuencia polipeptídica codificante de proteína PjD6D artificial por 1) uso de una desviación de uso de codones similar a la de proteínas de monocotiledóneas altamente expresadas, y por 2) eliminación de elementos desestabilizantes del ARN previamente caracterizados y conocidos por afectar a la estabilidad del ARNm in planta (patente de Estados Unidos Nº 5.880.275). La secuencia polinucleotídica de PjD6D modificada resultante se denominó PjD6Dnno (SEC ID Nº 8) y codifica un polipéptido idéntico en secuencia al polipéptido PjD6D nativo (SEC ID Nº 3).
Se construyó un vector binario, pMON78171 para expresar una Δ15-desaturasa y la Δ6-desaturasa modificada en secuencia en embrión y tejido aleurona de maíz. Para generar el vector binario, se amplificó por PCR un casete de expresión que contenía la Δ15 desaturasa de N. crassa (SEC ID Nº 5) bajo el control del promotor de globulina usando pMON82812 como molde, se clonó en un vector lanzadera, y se verificó la secuencia del casete. El casete de expresión que contenía la Δ6-desaturasa de P. juliae (SEC ID Nº 9) dirigida por el promotor de globulina se generó por PCR. Como parte de este procedimiento, se cambiaron los nucleótidos que preceden inmediatamente el codón de inicio ATG de la Δ6-desaturasa de P. juliae a CAGCC, para generar una región de inicio de la traducción optimizada para la expresión génica en plantas monocotiledóneas, tales como maíz. Usando procedimientos convencionales de restricción y ligamiento que están bien establecidos en la técnica se clonaron posteriormente la Δ6-desaturasa de P. juliae y la Δ15 desaturasa de N. crassa en un vector binario que albergaba un casete de expresión de CP4 como marcador de selección para generar el vector de transformación de maíz, pMON78171 (FIG. 3). Los explantes transformados se obtienen mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las plantas se regeneran a partir del tejido transformado. Las plantas cultivadas en invernadero después se analizan para la composición de aceite.
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Ejemplo 3
Análisis de ácidos grasos
Se determinó la composición de ácidos grasos de granos maduros que expresaban pMON82812 moliendo granos de maíz y extrayendo el homogeneizado con heptano. El extracto de heptano se trató con tolueno que contenía 5 triheptadecanoína a 0,25 mg/ml y metóxido sódico en metanol (0,6 N). La reacción se detuvo con cloruro sódico acuoso (10% p/vol). Después de repartir a temperatura ambiente, la fase orgánica se analizó por GLC (Hewlett Packard modelo 6890 (120 voltios) equipado con una entrada de capilar con/sin fraccionamiento (250ºC) y un detector de ionización de llama (270ºC). La columna era una Supelco 24077 (0,25 mm d.e. x 15 m de longitud) con una fase estacionaria de polietilenglicol pegada de 0,25 mm. Los ésteres metílicos de ácido graso se identifican por
10 comparación del tiempo de retención con patrones comercial. Las composiciones porcentuales en peso cualitativas se calculan como porcentajes de área de picos identificados. Los resultados del análisis para los granos que mostraban SDA y GLA se dan en la Tabla 1. No se encontraron granos inválidos parciales que contuvieran solamente GLA. Globalmente, más de dos tercios de los granos analizados contenían GLA y SDA. El análisis de un grano maduro del evento ZM_103111:@, que se transformó con pMON82812, demostró un 9,68% de SDA.
15 TABLA 1: Análisis de ácidos grasos de granos de maíz maduros individuales que expresan SDA y/o GLA
Linaje
Gen Oleico (18:1) LA (18:2) GLA (18:3) ALA (18:3) SDA (18:4)
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R1 26,08 13,62 0,91 26,44 9,68
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R1 23,63 14,87 0,85 30,17 8,56
ZM_S103121:@.
R1 27,39 16,2 1,14 27,61 5,8
ZM_S103432:@.
R1 21,44 14,11 0,68 36,19 5,79
ZM_S103111:@.
R1 25,5 16,36 0,61 30,56 5,19
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F1 22,3 16,98 0,99 33,28 4,81
ZM_S103435/LH244
F1 23,85 19,52 0,84 29,91 4,21
ZM_S103121:@.
R1 26,2 15,07 1,11 32,29 3,93
ZM_S103432:@.
R1 20,38 18,37 0,85 35,49 3,84
ZM_S103121:@.
R1 25,07 17,73 0,77 30,96 3,78
ZM_S103110:@.
R1 21,57 18,99 0,68 34,07 3,69
ZM_S103432:@.
R1 19,99 19,61 0,78 34,71 3,69
ZM_S103110:@.
R1 22,17 18,57 0,58 34,81 3,67
ZM_S103427:@.
R1 18,42 23,76 1,01 32,27 3,61
ZM_S103435/LH244
F1 20,83 19,3 0,68 34,71 3,53
ZM_S103427:@.
R1 19,17 25,22 1,53 30,79 3,53
ZM_S103110:@.
R1 22,12 17,73 0,79 34,38 3,48
ZM_S103099/LH244
F1 20,26 21,88 0,75 32,13 3,4
ZM_S103432:@.
R1 16,98 18,61 0,8 40,32 3,27
ZM_S103432:@.
R1 21,18 19,65 0,73 34,34 3,25
ZM_S103111:@.
R1 24,59 19,08 0,35 30,79 3,23
ZM_S103111:@.
R1 21,29 19,93 0,71 33,77 3,23
ZM_S103099/LH244
F1 21,11 23,29 0,79 30,95 3,21
ZM_S103432:@.
R1 18,2 18,81 0,61 38,94 3,19
E05736285
03-07-2015
(continuación)
Linaje
Gen Oleico (18:1) LA (18:2) GLA (18:3) ALA (18:3) SDA (18:4)
ZM_S103435/LH244
F1 21,27 19,75 0,7 34,33 3,13
ZM_S103432:@.
R1 20,8 21,47 0,76 33,59 3,12
ZM_S103121:@.
R1 23,71 18,96 0,75 31,97 3,1
ZM_S103121:@.
R1 23,81 17,28 0,98 33,75 3,07
ZM S103099/LH244
F1 19,64 21,46 0,7 34,49 2,99
ZM_S103121:@.
R1 23,83 16,72 1,01 34,5 2,93
ZM_S103427:@.
R1 16,68 26,92 1,03 30,59 2,87
ZM_S103168/LH244
F1 18,58 23,81 1,34 32,42 2,87
ZM_S103432:@.
R1 17,94 18,89 0,72 39,8 2,84
ZM_SI03110:@.
R1 20,14 19,32 0,58 36,65 2,77
ZM_S103111:@.
R1 20,57 19,13 0,34 36,1 2,7
ZM_S103168/LH244
F1 20,04 25,44 1,26 30,32 2,69
ZM_S103110:@.
R1 21,6 19,78 0,61 35,15 2,66
ZM_S103099/LH244
F1 21,06 23,54 0,67 31,49 2,58
ZM_S103435/LH244
F1 19,26 22,53 0,9 34,92 2,53
ZM_S103433/LH244
F1 22,95 20,01 0,39 33,51 2,47
ZM_S103168/LH244
F1 19,39 26,31 1,23 31,06 2,4
ZM_S103110:@.
R1 18,05 22,96 0,65 35,53 2,39
ZM_S103110:@.
R1 18,99 21,92 0,65 35,22 2,38
ZM_S103111:@.
R1 17,14 22,59 0,71 36,95 2,32
ZM_S103433/LH244
F1 23,64 19,84 0,38 33,12 2,29
ZM_S103436/LH244
F1 20,71 26,64 1,07 28,11 2,26
ZM_S103435/LH244
F1 21,89 21,12 0,6 33,35 2,24
ZM_S103110:@.
R1 22,59 28,35 0,52 25,05 2,15
ZM_S103168/LH244
F1 19,41 27,76 1,19 28,96 2,14
ZM_S103168/LH244
F1 17,81 28,33 1,28 31,34 2,1
ZM_S103097/LH244
F1 18,61 25,34 1,19 31,88 2,09
ZM_S103168/LH244
F1 20,08 28,05 1,27 28,28 2,06
ZM_S103433/LH244
F1 20,11 19,18 0,38 38,29 2,04
ZM_S103427:@.
R1 18,38 30,32 1,19 26,79 1,98
ZM_S103427:@.
R1 20,06 29,56 1,13 27,23 1,95
ZM_S103436/LH244
F1 19,82 28,13 0,89 28,57 1,94
ZM_S103110:@.
R1 18,74 22,83 0,72 35,29 1,91
E05736285
03-07-2015
(continuación)
Linaje
Gen Oleico (18:1) LA (18:2) GLA (18:3) ALA (18:3) SDA (18:4)
ZM_S103433/LH244
F1 21,69 21,09 0,4 34,71 1,9
ZM_S103430/LH244
F1 23,25 25,64 0,92 27,64 1,89
ZM_S103099/LH244
F1 17,77 25,43 0,61 33,61 1,88
ZM_S103111:@.
R1 21,04 22,99 0,29 31,6 1,86
ZM_S103168/LH244
F1 18,19 27,7 1,18 31,55 1,86
ZM_S103099/LH244
F1 18,24 23,16 0,65 35,78 1,85
ZM_S103435/LH244
F1 21,02 27,67 0,88 28,27 1,83
ZM_S103433/LH244
F1 21,7 21,08 0,39 34,49 1,8
ZM_S103097/LH244
F1 20,11 26,32 1,08 29,94 1,8
ZM_S103427:@.
R1 16,95 30,23 1,08 30,11 1,8
ZM_S103437/LH244
F1 23,93 26,23 1,12 25,86 1,78
ZM_S103437/LH244
F1 23,5 26,49 0,99 26,32 1,77
ZM_S103168/LH244
F1 19,4 27,81 1,06 30,29 1,74
ZM_S103427:@.
R1 17,94 30,11 1,17 29,42 1,74
ZM_S103103/LH244
F1 21,32 31,31 1,16 24,36 1,66
ZM_S103433/LH244
F1 20,48 21,06 0,41 35,4 1,64
ZM_S103437/LH244
F1 19,71 26,4 1,06 31,7 1,6
ZM_S103433/LH244
F1 18,98 21,89 0,36 37,18 1,59
ZM_S103430/LH244
F1 21,41 26,76 0,91 27,06 1,56
ZM_S103437/LH244
F1 18,67 28,15 1,07 30,71 1,56
ZM_S103097/LH244
F1 19,97 28,13 1,18 28,16 1,55
ZM_S103436/LH244
F1 19,29 31,27 0,79 25,74 1,53
ZM_S103430/LH244
F1 22,43 25,58 0,81 28,41 1,53
ZM_S103430/LH244
F1 18,48 27,25 1,05 31,73 1,53
ZM_S103103/LH244
F1 21,25 31,91 1,13 24,06 1,53
ZM_S103435/LH244
F1 20,92 27,87 0,82 27,48 1,51
ZM_S103121:@.
R1 20 24,11 0,99 33,48 1,5
ZM_S103103/LH244
F1 20,9 31,44 1,08 25,09 1,5
ZM_S103103/LH244
F1 20,06 32,22 1,04 25,4 1,4
ZM_S103103/LH244
F1 20,02 33,05 1,09 24,5 1,39
ZM_S103097/LH244
F1 18,78 28,78 1,03 29,82 1,31
ZM_S103111:@.
R1 19,23 27,51 0,62 29,58 1,25
ZM_S103436/LH244
F1 18,53 30,87 0,66 27,55 1,22
E05736285
03-07-2015
(continuación)
Linaje
Gen Oleico (18:1) LA (18:2) GLA (18:3) ALA (18:3) SDA (18:4)
LH244/ZM_S103431
F1 20,88 23,22 0,34 32,46 1,19
LH244/ZM_S103431
F1 20,07 25,05 0,35 33,01 1,19
ZM_S103436/LH244
F1 20,39 31,62 0,69 26,02 1,16
ZM_S103111:@.
R1 20,48 24,18 0,47 32,33 1,11
ZM_S103435/LH244
F1 20,4 26,7 0,52 31,26 1,09
ZM_S103436/LH244
F1 19,35 31,69 0,71 27,3 1,08
LH244/ZM_S103431
F1 19,75 23,35 0,26 33,86 0,98
ZM_S103436/LH244
F1 20,11 32,54 0,71 26,25 0,96
ZM_S103430/LH244
F1 18,87 29,25 0,7 30,17 0,95
LH244/ZM_S103431
F1 21,18 25,86 0,2 29,33 0,87
LH244/ZM_S103098
F1 21,77 24,64 0,15 32,57 0,81
LH244/ZM_S103105
F1 17,72 32,84 0,41 27,61 0,68
ZM_S143434/LH244
F1 20,34 26,19 0,3 31,48 0,6
ZM_S103434/LH244
F1 21,59 26,44 0,28 29,99 0,58
ZM_S103434/LH244
F1 20,22 27,13 0,31 30,47 0,58
LH244/ZM_S103098
F1 19,29 27,08 0,19 33,6 0,52
ZM_S103434/LH244
F1 19,24 28,24 0,26 31,45 0,51
LH244/ZM_S103105
F1 17,73 34,46 0,44 27,24 0,5
LH244/ZM_S103431
F1 19,12 31,08 0,24 27,77 0,47
ZM_S103434/LH244
F1 17,63 29,39 0,24 32,47 0,38
LH244/ZM_S103105
F1 18,37 36,34 0,36 24,68 0,33
LH244/ZM_S103105
F1 18,62 38,05 0,34 22,84 0,27
ZM_S103110:@.
R1 18,35 57,16 0 2,25 0
LH244/ZM_S103098
F1 19,18 58,95 0 1,78 0
LH244/ZM_S103098
F1 19,35 58,56 0 1,79 0
LH244/ZM_S103098
F1 19,17 59,15 0 1,8 0
LH244/ZM_S103098
F1 16,76 62,23 0 1,81 0
LH244/ZM_S103098
F1 18,39 59,37 0 1,88 0
LH244/ZM_S103098
F1 18,26 59,91 0 1,96 0
LH244/ZM_S103098
F1 17,14 61,34 0 2,06 0
LH244/ZM_S103098
F1 16,65 61,17 0 2,39 0
El análisis de ácidos grasos de eventos generados por transformación con pMON78171 se muestra en la siguiente Tabla 2. Se analizaron diez semillas R1 o F1 maduras para su composición de ácidos grasos como anteriormente, y
18
E05736285
03-07-2015
se calculó la composición promedio de ácidos grasos a partir de esos números, excluyendo los inválidos. El evento de mejor rendimiento obtenido con vector pMON78171 contenía en promedio el 28,6% de SDA, y el 2,2% de GLA. La semilla individual de maíz de mejor rendimiento contenía el 32,9% de SDA y el 3,5% de GLA.
TABLA 2: Análisis de ácidos grasos de granos de maíz maduros
Linaje
Gen Oleico LA GLA ALA SDA
ZM_S126797:@.
R1 21,34 12,92 3,53 13,49 32,92
ZM_S126797:@.
R1 22,11 12,12 3,3 14,12 32,58
ZM_S126797:@.
R1 21,91 12,87 3,5 13,1 32,28
ZM_S127034:@.
R1 23,26 9,86 1,22 17,05 31,2
ZM_S126797:@.
R1 24,07 14,98 3,24 13,06 28,74
ZM_S128026/LH244
F1 21,96 16,99 3,24 12,69 28,5
ZM_S127034:@.
R1 24,15 11,3 1,2 18,06 28,19
ZM_S129919:@.
R1 21,79 17,34 2,43 14,1 28,19
ZM_S127034:@.
R1 27,39 9,56 1,28 16,03 28,04
ZM_S127034:@.
R1 29,01 9,8 1,19 15,19 27,41
ZM_S128026/LH244
F1 22,35 17,95 3,58 12,5 26,93
ZM_S129919:@.
R1 20,77 19,48 3,02 14,79 26,51
ZM_S127034:@.
R1 25,09 12,21 1,29 17,85 26,4
ZM_S127034:@.
R1 22,99 15,22 1,3 18,47 25,87
ZM_S126797:@.
R1 21,95 19,77 4,66 11,88 25,81
ZM_S127034:@.
R1 26,95 13,34 1,35 15,95 25,62
ZM_S126797:@.
R1 20,94 20,76 4,4 13,5 24,7
ZM_S126790/LH244
F1 24,46 19,05 2,71 13,05 24,57
ZM_S128026/LH244
F1 23,44 19,46 3,71 12,28 24,24
ZM_S126797:@.
R1 21,41 22,02 4,87 11,41 23,95
ZM_S126808:@.
R1 25,61 18,44 2,38 14,16 23,81
ZM_S126797:@.
R1 22,74 20,52 4,23 12,86 23,8
ZM_S126797:@.
R1 20,95 22,77 4,76 11,94 23,74
ZM_S126808:@.
R1 22 19,57 2,76 16,21 23,64
ZM_S129919:@
R1 21,49 23,45 2,95 13,33 22,4
ZM_S128026/LH244
F1 23,12 22,18 3,87 12,33 22,34
ZM_S126797:@.
R1 21,51 24,35 4,56 12 21,82
ZM_S126790/LH244
F1 25,99 20,48 2,46 13,48 21,71
ZM_S126995/LH244
F1 24,4 22,45 2,12 14,26 20,03
ZM_S126790/LH244
F1 24,33 23,6 2,87 13,24 19,76
ZM_S126790/LH244
F1 24,24 24,08 2,88 12,74 19,44
E05736285
03-07-2015
(continuación)
Linaje
Gen Oleico LA GLA ALA SDA
ZM_S126995/LH244
F1 29,51 20,1 1,96 12,44 19,17
ZM_S126800/LH244
F1 26,18 24,62 3,01 11,52 18,9
ZM_S126800/LH244
F1 24,35 26,28 3,26 10,89 18,56
ZM_S129919:@.
R1 21,87 27,84 2,77 12,76 18,28
ZM_S126995/LH244
F1 26,78 24,15 2,09 11,97 18,26
ZM_S129919:@.
R1 21,22 28,87 3 12,33 18,18
ZM_S126800/LH244
F1 23,23 27,22 3,54 11,35 17,98
ZM_S126790/LH244
F1 22,01 28,63 3,36 12,63 17,78
ZM_S126995/LH244
F1 26,48 23,9 1,84 12,93 17,78
ZM_S126800/LH244
F1 26,6 25,01 2,72 11,7 17,54
ZM_S126995/LH244
F1 25,83 25,52 2,12 12,59 17,15
ZM_S129919:@.
R1 21,8 30 2,79 11,51 16,89
ZM_S129919:@.
R1 20,77 31,81 3,03 11,33 16,65
ZM_S126808:@.
R1 22,22 30,61 2,64 11,91 16,07
ZM_S126808:@.
R1 22,6 30,58 2,5 11,72 15,54
ZM_S126800/LH244
F1 23,86 31,07 3,13 11,37 15,07
ZM_S126800/LH244
F1 26,73 29,67 2,92 9,6 14,26
ZM_S126995/LH244
F1 31,78 22,68 1,87 12,32 14,07
ZM_S126808:@.
R1 22,94 33,24 2,81 10,51 13,79
ZM_S126808:@.
R1 21,28 34,77 3,15 10,62 13,65
ZM_S126808:@.
R1 25,73 32,94 2,19 9,26 11,95
ZM_S128026/LH244
F1 18,81 62,08 0,09 1,61 0,7
ZM_S126790/LH244
F1 19,23 62,98 0 1,36 0,06
ZM_S126790/LH244
F1 19,62 63,27 0 1,18 0
ZM_S126790/LH244
F1 19,56 63,19 0 1,38 0
ZM_S126790/LH244
F1 19,88 61,96 0 1,3 0
ZM_S126790/LH244
F1 20,43 61,28 0 1,37 0
ZM_S126800/LH244
F1 22,09 59,61 0 1,22 0
ZM_S126800/LH244
F1 20,09 62,11 0 1,32 0
ZM_S126800/LH244
F1 21,8 59,52 0 1,34 0
ZM_S126800/LH244
F1 22,55 59,63 0 1,28 0
ZM_S126808:@.
R1 20,9 60,65 0 1,43 0
E05736285
03-07-2015
(continuación)
Linaje
Gen Oleico LA GLA ALA SDA
ZM_S126808:@.
R1 20,57 60,95 0 1,54 0
ZM_S126808:@.
R1 18,75 62,61 0 1,45 0
ZM_S126995/LH244
F1 20,03 63,35 0 1,22 0
ZM_S126995/LH244
F1 21,55 59,59 0 1,1 0
ZM_S126995/LH244
F1 24,63 56,02 0 1,12 0
ZM_S126995/LH244
F1 20,12 60,75 0 1,23 0
ZM_S126998:@.
R1 21,51 60 0 1,62 0
ZM_S126998:@.
R1 22,17 27,15 0 34,29 0
ZM_S126998:@.
R1 19,77 62,76 0 1,61 0
ZM_S126998:@.
R1 20,73 28,41 0 33,75 0
ZM_S126998:@.
R1 20,59 33,96 0 29,47 0
ZM_S126998:@.
R1 20,8 33,48 0 28,9 0
ZM_S126998:@.
R1 22,15 33,67 0 27,92 0
ZM_S126998:@.
R1 19,86 30,92 0 32,91 0
ZM_S126998:@.
R1 21,47 30,99 0 31,39 0
ZM_S126998:@.
R1 21,37 31,16 0 30,85 0
ZM_S127034:@.
R1 19,76 62,38 0 1,36 0
ZM_S127034:@.
R1 19,99 62,51 0 1,26 0
ZM_S127034:@.
R1 20,76 61,27 0 1,25 0
ZM_S128026/LH244
F1 20,86 59,51 0 1,63 0
ZM_S128026/LH244
F1 18,57 63,07 0 1,38 0
ZM_S128026/LH244
F1 19,7 62,41 0 1,13 0
ZM_S128026/LH244
F1 19,8 61,53 0 1,2 0
ZM_S128026/LH244
F1 17,96 65,06 0 1,32 0
ZM_S129919:@.
R1 20,7 60,71 0 1,29 0
ZM_S129919:@.
R1 20,04 61,49 0 1,45 0
ZM_S129919:@.
R1 19,53 61,77 0 1,37 0
El análisis de ácidos grasos de eventos generados por transformación con pMON78175 se muestra en la siguiente Tabla 3. Se analizaron diez semillas R1 o F1 maduras para su composición de ácidos grasos como anteriormente. La semilla individual de maíz de mejor rendimiento contenía el 12,4% de SDA y el 0% de GLA.
TABLA 3: Análisis de ácidos grasos de granos de maíz maduros
Linaje
Gen Ácido oleico Ácido linoleico GLA ALA SDA
ZM_S130139:@.
R1 26,57 8,39 0 34,39 12,36
E05736285
03-07-2015
(continuación)
Linaje
Gen Ácido oleico Ácido linoleico GLA ALA SDA
S130134:@.
R1 30,59 9,04 0 30,31 11,86
ZM_S130139:@.
R1 26,39 9,41 0 34,91 11,12
ZM S130135:@.
R1 25,09 12,98 0,12 34,81 9,93
ZM_S130133:@.
R1 30,62 10,85 0 30,93 9,63
ZM_S130136:@.
R1 30,55 11,99 0 32,28 7,63
ZM_S130136:@.
R1 28,27 13,53 0 33,41 7,45
ZM_S130136:@.
R1 29,14 10,61 0 34,59 7,44
ZM_S130134:@.
R1 25,43 14,32 0 35,68 7,3
ZM_S130134:@.
R1 23,94 16,92 0 35,7 6
ZM_S130133:@.
R1 22,93 17,14 0,02 37,21 5,88
ZM_S130136:@.
R1 28,28 11,89 0 35,63 5,86
ZM_S130140:@.
R1 23,47 15,34 0 37,85 5,68
ZM_S130133:@.
R1 21,75 17,83 0 37,43 5,59
ZM_S130072/LH244
F1 23,17 25,78 0,2 28,61 5,39
ZM_S130140:@.
R1 22,75 17,26 0 37,98 4,83
ZM_S130161:@.
R1 28,54 13,26 0 37,6 2,88
ZM_S130140:@.
R1 20,82 23,51 0 35,48 2,88
ZM_S130155/LH244
F1 20,87 59,43 0 2,2 0
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