ES2366297T3 - Desaturasas de ácidos grasos de tetraselmis suecica. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4; b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3; c) un polinucleótido que hibrida con la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3, o un complemento del mismo, en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42 ºC; y d) un polinucleótido que codifica un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos un 75% con una secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4.

Description

Desaturasas de ácidos grasos de tetraselmis suecica.

1. Campo de la Invención

La invención se refiere, en general, a enzimas desaturasas que modulan el número y localización de dobles enlaces en ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (AGPI-CL). En particular, la invención se refiere a la mejora de perfiles de ácidos grasos usando enzimas desaturasas delta 6 y ácidos nucleicos que codifican dichas enzimas desaturasas.

2. Descripción de la Técnica Relacionada

Los productos primarios de la biosíntesis de ácidos grasos en la mayoría de los organismos son compuestos de 16y 18-carbonos. La proporción relativa de longitudes de cadenas y el grado de insaturación de estos ácidos grasos varía ampliamente entre las especies. Los mamíferos, por ejemplo, producen principalmente ácidos grasos saturados y monoinsaturados, mientras que la mayoría de las plantas superiores producen ácidos grasos con uno, dos o tres dobles enlaces, constituyendo estos dos últimos ácidos grasos poliinsaturados (AGPI).

Dos familias principales de AGPI son los ácidos grasos omega-3 (representados también como ácidos grasos “n-3”), ejemplificados por el ácido estearidónico (SDA, 18:4, n-3) y los ácidos grasos omega-6 (representados también como ácidos grasos “n-6”), ejemplificados por el ácido y-linolénico (GLA, 18:3, n-6). Los AGPI son componentes importantes de la membrana plasmática de las células y del tejido adiposo, donde pueden encontrarse en formas tales como fosfolípidos y triglicéridos, respectivamente. Los AGPI son necesarios para el correcto desarrollo en mamíferos, particularmente en el desarrollo del cerebro en niños y para la formación y reparación tisular.

Diversos trastornos responden al tratamiento con ácidos grasos. Se ha demostrado que el suplemento con AGPI reduce la tasa de reestenosis después de una angioplastia. También están bien documentados efectos beneficiosos para la salud de determinados ácidos grasos omega-3 en la dieta para enfermedades cardiovasculares y artritis reumatoide (Simopoulos y col., 1999; James y col., 2000). Adicionalmente, se han sugerido AGPI para su uso en tratamientos de asma y psoriasis. Las pruebas indican que los AGPI pueden estar implicados en el metabolismo del calcio, lo que sugiere que los AGPI pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de osteoporosis y de los cálculos renales o del tracto urinario. La mayoría de las pruebas de los efectos beneficiosos para la salud se aplican a las grasas omega-3 de cadena larga, ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5, n-3) y ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6, n-3) que se encuentran en el pescado y en el aceite de pescado. Con esta base de pruebas, las autoridades sanitarias y los nutricionistas en Canadá (Scientific Review Committee, 1990, Nutrition Recommendations, Minister of National Health and Welfare, Ottawa, Canadá), Europa (de Deckerer, Eur. J. Clin. Nutr., 52:749, 1998), el Reino Unido (The British Nutrition Foundation, 1992, Unsaturated fatty-acids - nutritional and physiological significance: The report of the British Nutrition Foundation’s Task Force, Chapman and Hall, Londres) y los Estados Unidos (Simopoulos y col., 1999) han recomendado un mayor consumo en la dieta de estos AGPI.

Los AGPI también pueden usarse para tratar la diabetes (Patente de Estados Unidos Nº 4.826.877; Horobin y col., 1993). Se han demostrado un metabolismo y composición alterados de ácidos grasos en animales diabéticos. Se ha sugerido que estas alteraciones están implicadas en algunas de las complicaciones a largo plazo debidas a la diabetes, incluyendo retinopatía, neuropatía, nefropatía y lesiones en el sistema reproductor. Se ha mostrado que el aceite de onagra, que contiene GLA, impide e invierte la lesión nerviosa en diabéticos. Se ha mostrado que la administración de un ácido graso omega-3, tal como SDA, inhibe la biosíntesis de leucotrienos (Patente de Estados Unidos Nº 5.158.975). Se ha mostrado que el consumo de SDA conduce a una disminución de los niveles en sangre de citocinas proinflamatorias TNF-a e IL-11 (documento PCT US 0306870).

Los AGPI, tales como el ácido linoleico (LA, 18:2, �9, 12) y el ácido a-linolénico (ALA, 18:3, �9, 12, 15), se consideran ácidos grasos esenciales en la dieta debido a que los mamíferos carecen de la capacidad de sintetizar estos ácidos. El LA se produce a partir del ácido oleico (OA, 18:1, �9) por una desaturasa �12 mientras que el ALA se produce a partir de LA por una desaturasa �15. Sin embargo, cuando se ingieren, los mamíferos tienen la capacidad de metabolizar el LA y el ALA para formar las familias n-6 y n-3 de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPI-CL). Estos AGPI-CL son importantes componentes celulares que confieren fluidez a las membranas y que funcionan como precursores de eicosanoides biológicamente activos tales como prostaglandinas, prostaciclinas y leucotrienos, que regulan las funciones fisiológicas normales. El ácido araquidónico (ARA, 20:4, n-6) es el precursor principal para la síntesis de eicosanoides, que incluyen leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos, y que también desempeñan una función en el proceso inflamatorio.

En mamíferos, la formación de AGPI-CL tiene limitada la velocidad por la etapa de desaturación de �6, que transforma LA en GLA y ALA en SDA. Se ha mostrado que muchas condiciones fisiológicas y patológicas deprimen esta etapa metabólica incluso adicionalmente y, por consiguiente, la producción de AGPI-CL. Para superar la etapa limitante de la velocidad y aumentar los niveles de EPA tisulares, podrían consumirse grandes cantidades de ALA. Sin embargo, el consumo de sólo cantidades moderadas de SDA proporciona una fuente eficaz de EPA, ya que SDA es aproximadamente cuatro veces más eficaz que ALA para elevar los niveles tisulares de EPA en seres humanos (Publicación de Patente de Estados Unidos 20040039058 (Ursin y col.). En los mismos estudios, la administración de SDA también pudo aumentar los niveles tisulares de ácido docosapentaenoico (DPA), que es un producto de elongación de EPA. Como alternativa, el desvío de la desaturación 6 mediante el suplemento en la dieta con EPA o DHA puede aliviar eficazmente muchas enfermedades patológicas asociadas con bajos niveles de AGPI. Sin embargo, como se indica con más detalle más adelante, las fuentes actualmente disponibles de AGPI no son deseables por múltiples razones. La necesidad de una fuente fiable y económica de AGPI ha suscitado interés en fuentes alternativas de AGPI.

Los AGPI de cadena larga principales de importancia incluyen DHA y EPA, que se encuentran principalmente en diferentes tipos de aceites de pescado, y ARA, encontrado en hongos filamentosos tales como Montierella. Para DHA, existen varias fuentes para la producción comercial que incluyen una diversidad de organismos marinos, aceites obtenidos de peces marinos de agua fría y fracciones de yema de huevo. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros de plantas Trichodesma, Borago (borraja) y Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen los géneros de plantas Borago, Oenothera y Ribes. Sin embargo, existen varios inconvenientes asociados con la producción comercial de AGPI a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de AGPI, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceites altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes, por lo tanto, pueden requerir una purificación considerable para separar uno o más AGPI deseados o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más AGPI.

Las fuentes naturales de AGPI también están sujetas a fluctuaciones incontrolables en la disponibilidad. Los bancos de peces pueden experimentar variaciones naturales o pueden agotarse por exceso de pesca. Además, incluso con pruebas abrumadoras de sus efectos terapéuticos beneficiosos, no se tienen en cuenta las recomendaciones dietéticas con respecto a los ácidos grasos omega-3. Los aceites de pescado tienen un sabor y olor desagradables, que pueden ser imposibles de separar de manera económica del producto deseado, y pueden hacer que estos productos sean inaceptables como suplementos alimentarios. Los aceites animales, y particularmente aceites de pescado, pueden acumular contaminantes ambientales. Los alimentos pueden enriquecerse con aceites de pescado, pero de nuevo, dicho enriquecimiento es problemático debido al coste y a la disminución de los bancos de peces en todo el mundo. Este problema es también un impedimento para el consumo e ingesta de peces completos. Sin embargo, si las comunidades aceptasen los mensajes sanitarios para aumentar el consumo del pescado, probablemente existiría un problema para satisfacer la demanda de peces. Adicionalmente, existen problemas en cuanto a la sostenibilidad de esta industria, que se basa en gran medida en bancos de peces silvestres para la alimentación en piscifactorías (Naylor y col., 2000).

Otras limitaciones naturales favorecen un nuevo enfoque para la producción de AGPI. El clima y las enfermedades pueden ocasionar fluctuaciones en los rendimientos tanto de fuentes de peces como de plantas. Las tierras de cultivo disponibles para la producción de cultivos alternativos productores de aceite están sujetas a la competencia por la expansión constante de las poblaciones humanas y la mayor necesidad asociada de la producción de alimento en las tierras cultivables restantes. Los cultivos que producen AGPI, tales como borraja, no se han adaptado al crecimiento comercial y pueden no comportarse bien en monocultivo. Por lo tanto, el crecimiento de dichos cultivos no es económicamente competitivo cuando pueden desarrollarse cultivos más aprovechables y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella también es costosa. Los tejidos animales naturales contienen bajas cantidades de ARA y son difíciles de procesar. Microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a una escala comercial.

Por lo tanto, sería ventajoso obtener material genético implicado en la biosíntesis de AGPI y expresar el material aislado en un sistema de plantas, en particular, un sistema de plantas de cultivo terrestre basado en el terreno, que pueda manipularse para proporcionar la producción de cantidades comerciales de uno o más AGPI. En cultivos de soja comerciales, tales como canola, soja, maíz, girasol, cártamo o lino, la conversión de alguna fracción de los ácidos grasos mono- y poliinsaturados que caracteriza su aceite de semilla en SDA y GLA requiere la expresión específica de semilla de múltiples enzimas desaturasas que incluyen las desaturasas delta 6 y delta 15. Los aceites procedentes de plantas que expresan niveles elevados de desaturasas 6 y 15 son ricos en SDA y GLA. Dado que también es necesario aumentar el consumo de ácidos grasos omega-3 en seres humanos y animales, existe la necesidad de proporcionar una amplia gama de suplementos alimentarios y alimentos enriquecidos en omega-3 de manera que los sujetos puedan escoger alimentos, ingredientes de alimentos, productos alimentarios e ingredientes de productos alimentarios que se ajusten a sus hábitos dietéticos habituales. También es ventajoso proporcionar cantidades comerciales de GLA. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de nuevos ácidos nucleicos de desaturasas 6 para su uso en plantas de cultivo transgénicas con aceites enriquecidos en AGPI, así como los alimentos y productos alimentarios mejorados producidos de esta manera.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido capaz de desaturaruna molécula de ácido graso en el carbono 6. Éstos pueden usarse para transformar células o modificar la composición de ácidos grasos de una planta o el aceite producido por una planta. Una realización de la invención es secuencias de polinucleótidos aisladas de Tetraselmis suecica que tienen una actividad desaturasa única. En ciertas realizaciones adicionales de la invención, los polinucleótidos codifican un polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 75% con la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4, incluyendo al menos aproximadamente una homología del 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98% y 99% con estas secuencias. Los expertos en la materia reconocerán que, dado que estas secuencias están relacionadas, un polipéptido determinado puede compartir simultáneamente una homología del 75% o superior con más de una de estas secuencias polipeptídicas.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3; (c) un polinucleótido que hibrida con la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3, o un complemento del mismo, en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42º C; y (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos el 75%, 85%, 95%, 98% o 99% con una secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende las secuencias polipeptídicas de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4 o un fragmento del mismo que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula ácido graso en el carbono 6.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende el polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3; (c) un polinucleótido que hibrida con la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3, o un complemento del mismo, en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42º C; y (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75%, 85%, 95%, 98% o 99% con una secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4. En una realización adicional, la construcción de ADN comprende adicionalmente un promotor heterólogo unido operativamente al polinucleótido aislado descrito anteriormente. En otras realizaciones, el promotor es funcional en una célula procariota o una célula eucariota. En ciertas realizaciones, la célula eucariota en la que el promotor es funcional es una célula vegetal. En una realización adicional, el promotor es un promotor potenciado en semillas. En otra realización, la construcción de ADN comprende adicionalmente al menos una secuencia polinucleotídica adicional que codifica una desaturasa de ácidos grasos.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona una célula huésped trasformada con una construcción de ADN que comprende el polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6 proporcionado por la invención. La célula huésped puede ser una célula vegetal, animal, fúngica o bacteriana. En una realización adicional, la célula huésped de la invención proporciona una célula huésped que presenta una biosíntesis de ácidos grasos modificada con respecto a una célula del mismo genotipo que la célula huésped pero que carece de la construcción de ADN. En otro aspecto adicional, la célula huésped ha heredado la construcción de ADN de un progenitor de la célula.

En otro aspecto adicional más, la invención proporciona una planta y su descendencia que comprende las células huésped transformadas con una construcción de ADN de la invención. Dicha planta puede definirse como una planta que comprende un metabolismo de ácidos grasos modificado con respecto a una planta del mismo genotipo que carece de la construcción de ADN. En otro aspecto adicional, dicha planta puede comprender adicionalmente al menos una secuencia polinucleotídica adicional que codifica una desaturasa de ácidos grasos. En una realización, la planta se selecciona del grupo que consiste en canola, Brassica campestris, colza, colinabo, soja, crambe, mostaza, ricino, cacahuete, sésamo, semilla de algodón, linaza, cártamo, palma, lino, girasol, maíz, arroz, cebada, mijo, centeno, trigo, avena, alfalfa y sorgo. La invención también proporciona semillas de la planta de la invención.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para producir un pienso o producto alimentario que comprende las etapas de (a) obtener la planta transgénica de la invención; y (b) producir el producto alimentario

o pienso. El producto alimentario o pienso puede ser aceite, ensilaje, harina, grano, almidón, fécula o proteína. La composición de producto alimentario o pienso se define como una composición que comprende una secuencia polinucleotídica detectable o polipéptido detectable proporcionado por la invención.

Breve descripción de las figuras

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en la presente memoria.

La Figura 1 muestra un alineamiento de aminoácidos de desaturasas 6 de Tetraselmis suecica, TsD6D-1 y TsD6D-2 (SEC ID Nº: 2 y 4), Ig6D-1 de Isochrysis galba (SEC ID Nº: 11) y D6D de Mortierella alpina (SEC ID Nº: 12).

La Figura 2 muestra un mapa del vector pMON94002.

La Figura 3 muestra un mapa del vector pMON82848.

La Figura 4 muestra un mapa del vector pMON82849.

La Figura 5 muestra un mapa del vector pMON94502.

La Figura 6 muestra un mapa del vector pMON94503.

La Figura 7 muestra un mapa del vector pMON94060.

Descripción detallada de la invención

La invención supera las limitaciones de la técnica anterior proporcionado procedimientos y composiciones para la creación de plantas con un contenido de AGPI mejorado. La modificación del contenido de ácidos grasos de un organismo tal como una planta presenta muchas ventajas, incluyendo mejor nutrición y efectos beneficiosos para la salud. La modificación del contenido de ácidos grasos puede usarse para conseguir niveles o perfiles beneficiosos de AGPI deseados en plantas, partes de plantas y productos de plantas, que incluyen aceites de semilla de plantas. Por ejemplo, cuando los AGPI deseados se producen en el tejido seminal de una planta, puede aislarse el aceite de las semillas dando como resultado típicamente un aceite con alto contenido en los AGPI deseados o un aceite que tiene un contenido o perfil de ácidos grasos deseado, que a su vez puede usarse para proporcionar características beneficiosas a productos alimentarios y otros productos.

Diversos aspectos de la invención incluyen procedimientos y composiciones para la modificación del contenido de AGPI de una célula, por ejemplo, la modificación del contenido de AGPI de una o más células de una planta. Las composiciones relacionadas con la invención incluyen nuevas secuencias de polinucleótidos aisladas, construcciones de polinucleótidos y plantas y/o partes de plantas transformadas por polinucleótidos de la invención. El polinucleótido aislado puede codificar una desaturasa 6 de Tetraselmis suecica. Las células huésped pueden manipularse para expresar un polinucleótido que codifique uno o más polipéptidos de desaturasa delta 6 que catalicen la desaturación de uno o más ácidos grasos.

Las siguientes definiciones se proporcionan como una ayuda para comprender la presente invención. Las expresiones “secuencia de ADN”, “secuencia de ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “polinucleótido” y “segmento de ácido nucleico” se refieren a una estructura física que comprende una disposición de nucleótidos ordenada. El segmento de ADN, secuencia o secuencia de nucleótidos puede estar contenido dentro de una molécula de nucleótido, vector o similar, de mayor tamaño. Además, la disposición de ácidos nucleicos ordenada en estas secuencias puede representarse en forma de un listado de secuencias, figura, tabla, medio electrónico o similar.

Las expresiones “secuencia codificante”, “región codificante”, “secuencia estructural” y “secuencia de ácido nucleico estructural” se refieren a todo o un segmento de una secuencia de ADN, secuencia de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico en la que los nucleótidos se disponen en una serie de tripletes formando cada uno un codón. Cada codón codifica un aminoácido específico. Por lo tanto, la secuencia codificante, región codificante, secuencia estructural y secuencia de ácido nucleico estructural codifica una serie de aminoácidos que forman una proteína, polipéptido o secuencia peptídica. La secuencia codificante, región codificante, secuencia estructural y secuencia de ácido nucleico estructural puede estar contenida dentro de una molécula de acido nucleico, vector o similar, de mayor tamaño. Además, la disposición de nucleótidos en estas secuencias puede representarse en forma de un listado de secuencias, figura, tabla, medio electrónico o similar.

El término “ADNc” se refiere a un ADN bicatenario que es complementario a y deriva de un ARNm.

“Desaturasa” se refiere a un polipéptido que puede desaturar o catalizar la formación de un doble enlace entre carbonos consecutivos de uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono- o poliinsaturado o un precursor del mismo. Son de particular interés polipéptidos que catalizan la conversión de OA en LA, LA en ALA o ALA en SDA, que incluyen enzimas que desaturan en las posiciones 12, 15 o 6. Las consideraciones para seleccionar un polipéptido específico que tenga actividad desaturasa incluyen, pero sin limitación, el pH óptimo del polipéptido, si el polipéptido es una enzima limitante de la velocidad o un componente de la misma, si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un AGPI deseado y/o si el polipéptido necesita un cofactor. El polipéptido expresado preferentemente tiene características que son compatibles con entorno bioquímico de su localización en la célula huésped. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por el sustrato (o sustratos).

“Expresión” se refiere al procedimiento mediante el cual una información codificada por un gen se transforma en estructuras presentes y que funcionan en la célula. Los genes expresados incluyen los que se transcriben en ARN y después se traducen en proteínas y los que se transcriben en ARN pero no se traducen en proteínas (por ejemplo, ARN de transferencia y ARN ribosomal).

Como se usa en la presente memoria, “gen” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5’ no codificantes) y que siguen (secuencias 3’ no codificantes) a la secuencia codificante. “Gen nativo” se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. “Gen quimérico” se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que proceden de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes procedentes de las mismas fuentes pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. Gen “endógeno” se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen “exógeno” o “transgén” se refiere a un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. Un transgén incluye ADN genómico introducido por un procedimiento de transformación (por ejemplo, un ADN genómico unido a su promotor activo).

“Heterólogo” se refiere a la relación entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos o proteínas que proceden de diferentes fuentes. Por ejemplo, un promotor es heterólogo con respecto a una secuencia codificante si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Además, una secuencia de ácido nucleico particular puede ser “heteróloga” con respecto a una célula u organismo en el que se inserta si no se produce de manera natural en esa célula u organismo particular.

“Homología de secuencia” se refiere al nivel de similitud entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos en términos de porcentaje de identidad posicional. El término homología también se usa para referirse al concepto de propiedades funcionales similares entre diferentes ácidos nucleicos o proteínas.

“Hibridación” se refiere a la capacidad de una primera cadena de ácido nucleico para unirse con una segunda cadena mediante emparejamiento de bases por enlaces de hidrógeno cuando las cadenas de ácido nucleico tienen suficiente complementariedad de secuencia. Como se usa en la presente memoria, se dice que una molécula de ácido nucleico es “complementaria” a otra molécula de ácido nucleico si muestran complementariedad completa. Como se usa en la presente memoria, se dice que las moléculas presentan “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido del la otra. Por tanto, se dice que dos cadenas de ácido nucleico tienen suficiente complementariedad cuando pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan hibridadas una a la otra en condiciones apropiadas.

El termino “aislado” significa que se ha eliminado de su entorno natural, independientemente de su disposición final. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico “aislada” de arroz, tal como por clonación de una célula de arroz, permanece “aislada” cuando se inserta en el genoma de una célula de maíz.

La El termino “unido operativamente” se refiere a la disposición espacial de dos o más regiones de ácido nucleico o secuencias de ácido nucleico de manera que ejercen sus efectos apropiados una con respecto a la otra. Por ejemplo, una región promotora puede colocarse con respecto a una secuencia de ácido nucleico de manera que la transcripción de la secuencia de ácido nucleico se dirija por la región promotora. La región promotora y la secuencia de ácido nucleico están “unidas operativamente”.

“Cadena arriba” y “cadena abajo” son términos posicionales usados con referencia a la localización de una secuencia de nucleótidos y la dirección de la transcripción o traducción de secuencias codificantes, que normalmente avanza en dirección 5’ a 3’.

Los terminos “promotor” o “región promotora” se refieren a una secuencia de ácido nucleico, normalmente encontrada aguas arriba (5’) con respecto a una secuencia codificante, capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico en una molécula de ARN. El promotor o región promotora típicamente proporciona un sitio de reconocimiento para la ARN polimerasa y los otros factores necesarios para la iniciación correcta de la transcripción. Como se contempla en la presente memoria, un promotor o región promotora incluye variaciones de promotores obtenidas insertando o delecionando regiones reguladoras, sometiendo al promotor a mutagénesis aleatoria o dirigida, y similares. La actividad o fuerza de un promotor puede medirse en términos de las cantidades de ARN que produce, o la cantidad de la acumulación de proteína en una célula o tejido, respecto a un segundo promotor que se mide de manera similar.

La expresión “secuencias 3’ no codificantes” se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas aguas debajo de una secuencia codificante e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codificanseñales reguladoras capaces de aceptar el procesamiento del ARNm o la expresión de genes. Éstas normalmente se denominan regiones 3’ no traducidas o 3’-UTR. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente porque influye en la adición de regiones de ácido adenílico en el extremo 3’ del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias 3’ no codificantes se ejemplifica por Ingelbrecht y col. (1989).

“Secuencia líder de traducción” o “región 5’ no traducida” o “5’-UTR” se refieren, todas ellas, a una secuencia de nucleótidos localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La 5’-UTR está presente en el ARNm completamente procesado aguas debajo de la secuencia de inicio de la traducción. La 5’-UTR puede influir en el procesamiento del transcrito primario para dar ARNm, en la estabilidad del ARNm o en la eficacia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias líder de la traducción (Turner y Foster, 1995).

“Transcrito de ARN” se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por la ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia perfectamente complementaria de la secuencia de ADN, se denomina transcrito primario. Una secuencia de ARN derivada de procesamiento postraduccional del transcrito primario se denomina ARN maduro. “ARN mensajero” (ARNm) se refiere al ARN que no posee intrones y que puede traducir en polipéptidos por la célula.

“Construcción de ADN” se refiere a elementos genéticos heterólogos unidos operativamente entre sí constituyendo una molécula de ADN recombinante y puede comprender elementos que permiten la expresión de una molécula polinucleotídica de ADN en una célula huésped y elementos que permiten la conservación de la construcción. Un casete de expresión en plantas comprende la unión operativa de elementos genéticos que cuando se transfieren dentro de una célula de una planta permite la expresión de un producto génico deseable.

“Vector recombinante” se refiere a cualquier agente mediante el cual o en el que un ácido nucleico de interés se amplifica, expresa o almacena, tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencia de replicación autónoma, fago o secuencia de nucleótidos de ADN o ARN lineal monocatenaria, circular monocatenaria, lineal bicatenaria o circular monocatenaria. El vector recombinante puede sintetizarse o proceder de cualquier fuente y tiene capacidad de integración genómica o replicación autónoma.

“Secuencia reguladora” se refiere a una secuencia de nucleótidos localizada aguas arriba (5’), dentro, o aguas abajo (3’) con respecto a una secuencia codificante, o un intrón, cuya presencia o ausencia influye en la transcripción y expresión de la secuencia codificante.

“Sustancialmente homólogo” se refiere a dos secuencias que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad en la secuencia, como se mide mediante el algoritmo CLUSTAL W en, por ejemplo DNAStar (DNAStar, Madison, WI).

“Sustancialmente purificado” se refiere a una molécula separada sustancialmente de todas las demás moléculas con las que normalmente está asociada en su estado nativo. Más preferentemente, una molécula sustancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparación. Una molécula sustancialmente purificada puede estar libre en más de aproximadamente el 60%, preferentemente libre en aproximadamente el 75%, más preferentemente libre en aproximadamente el 90% y más preferentemente libre en aproximadamente el 95% de las demás moléculas (exclusivo de disolvente) presente en la mezcla natural. La frase “sustancialmente purificado” no pretende incluir moléculas presentes en su estado nativo. Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de la presente invención están sustancialmente purificadas.

El término “transformación” se refiere a la introducción de un ácido nucleico en un huésped receptor. El término “huésped” se refiere a células bacterianas, hongos, animales o células de animales, plantas o semillas o cualquier parte o tejido de planta incluyendo células de plantas, protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, plántulas, embriones y polen.

Como se usa en la presente memoria, una “planta transgénica” es una planta que tiene estabilidad introducida en su genoma, por ejemplo, los genomas nucleares o plastidiales, un ácido nucleico exógeno.

El término “isogénico” como término comparativo entre plantas o líneas de plantas que tienen o carecen de un transgén significa plantas o líneas que tienen el mismo fondo genético o un fondo genético similar, con la excepción del transgén en cuestión. Por ejemplo, las líneas denominadas hermanas que representan selecciones fenotípicamente similares o idénticas de la misma población parental F2 se consideran “isogénicas”. Cuando la descendencia de una planta transformante estable se cruza y retrocruza con las plantas de la línea parental no transformada durante tres a seis generaciones (o más) usando el parental no transformado como parental recurrente seleccionando al mismo tiempo con respecto al tipo (genotipo por análisis de marcadores moleculares, fenotipo por observación de campo, o ambos) y con respecto al transgén, se considera que la línea transgénica resultante es altamente “isogénica” con respecto a su línea parental no transformada.

Se entiende que los términos “semillas”, “pepitas” y “grano” son equivalentes en cuanto al significado. El término pepita se usa frecuentemente describiendo la semilla de una planta de maíz o de arroz. En todas las plantas, la semilla es el óvulo maduro que consiste en una cubierta de semilla, embrión, aleurona y un endospermo.

Ácidos nucleicos que codifican desaturasas delta 6

La invención proporciona, en una realización, nuevos ácidos nucleicos que codifican desaturasas delta 6 de Tetraselmis suecica, un alga flagelada verde móvil. En una realización particular, los ácidos nucleicos se aíslan a partir de la cepa CCMP904 de Tetraselmis suecica (disponible en CCMP; Center for Culture of Marine Phytoplankton; West Boothbay Harbor, Maine, Estados Unidos). En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos comprenden la SEC ID Nº: 1 o 3. La invención también proporciona procedimientos para el uso de dichos ácidos nucleicos, incluyendo las SEC ID Nº: 1 o 3. En una realización, estas moléculas de ácido nucleico se usan en el contexto de la presente invención para modificar la composición de aceite de una semilla de una planta.

Dicho ácido nucleico puede amplificarse usando ADNc, ARNm o ADN genómico como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación por PCRTM convencionales. Como alternativa, pueden sintetizarse usando técnicas sintéticas convencionales, tales como sintetizador de ADN automático. Los polinucleótidos que codifican las desaturasas delta 6 deseadas pueden identificarse de diversas maneras. Como un ejemplo, una fuente de las desaturasas delta 6 deseadas, por ejemplo una biblioteca de Tetraselmis, se explora con sondas sintetizadas enzimática- o químicamente detectables, que pueden prepararse a partir de ADN, ARN o nucleótidos de origen no natural o mezclas de los mismos. Las sondas pueden sintetizarse enzimáticamente a partir de polinucleótidos de desaturasas delta 6 conocidas por procedimientos de hibridación de rigurosidad normal o reducida. Las sondas oligonucleotídicas también pueden usarse para explorar fuentes y pueden basarse en secuencias de desaturasas delta 6 conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre desaturasas delta 6 conocidas, o en secuencias peptídicas obtenidas a partir de la proteína purificada deseada. Las sondas oligonucleotídicas basadas en secuencias de aminoácidos pueden estar degeneradas para incluir la degeneración del código genético o pueden estar sesgadas a favor de los codones preferidos del organismo fuente. También pueden usarse oligonucleótidos como cebadores para PCRTM a partir de ARNm transcrito de manera inversa procedente de una fuente conocida o supuesta; el producto de PCRTM puede ser el ADNc de longitud completa o puede usarse para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseado. Como alternativa, puede secuenciarse completamente una proteína deseada y realizarse la síntesis total de un ADN que codifica ese polipéptido.

Una vez que el producto genómico o el ADNc deseado se ha aislado, éste puede secuenciarse por procedimientos conocidos. En la técnica se reconoce que dichos procedimientos están sujetos a error, de tal forma que es rutinaria la secuenciación múltiple de la misma región y aún se espera obtener proporciones medibles de errores en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, amplia estructura secundaria o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con un contenido elevado de bases GC. Cuando surgen discrepancias, puede realizarse una segunda secuenciación y pueden emplearse procedimientos especiales. Los procedimientos especiales pueden incluir la alteración de las condiciones de secuenciación usando: diferentes temperaturas; enzimas diferentes, proteínas que modifican la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de mayor orden; nucleótidos modificados tales como ITP o dGTP metilado; diferentes composiciones del gel, por ejemplo adición de formamida; diferentes cebadores o cebadores localizados a diferentes distancias de la región problema; o diferentes moldes tales como ADN monocatenarios. También puede emplearse la secuenciación de ARNm.

Si se desea, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las desaturasas delta 6 pueden modificarse sin cambiar la secuencia de aminoácidos resultante de la proteína expresada de manera que las secuencias sean más susceptibles de expresión en huéspedes vegetales. Una secuencia codificante puede ser un ADN artificial. Un ADN artificial, como se usa en la presente memoria, significa una molécula polinucleotídica de ADN que se produce de manera no natural. Las moléculas de ADN artificiales pueden diseñarse mediante una diversidad de procedimientos, tales como procedimientos conocidos en la técnica que se basan en la sustitución del codón (o codones) de un primer polinucleótido para crear un polinucleótido artificial equivalente, o incluso de segunda generación mejorado, en el que este nuevo polinucleótido artificial es útil para potenciar la expresión en plantas transgénicas. El aspecto del diseño a menudo emplea una tabla de uso de codones producida recopilando al frecuencia de ocurrencia de codones en una colección de secuencias codificantes aisladas a partir de una planta, tipo de planta, familia o género. Otro aspecto de diseño incluye la reducción de la existencia de señales de poliadenilación, sitios de corte y empalme de intrones o tramos de secuencia largos de AT o GC (Patente de Estados Unidos 5.500.365). Pueden obtenerse secuencias codificantes de longitud completa de ADN artificial o fragmentos de los mismos usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Las modificaciones de las secuencias de nucleótidos o elementos reguladores desvelados en la presente memoria que conservan as funciones contempladas en la presente memoria se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Dichas modificaciones incluyen inserciones, sustituciones y deleciones, y especialmente sustituciones que reflejan la degeneración del código genético.

Los inventores han aislado secuencias de ADN de Tetraselmis suecica que producen polipéptidos con actividad desaturasa delta 6. Las secuencias que codifican las desaturasas delta 6 pueden emplearse en plantas transgénicas, microorganismos o animales para modificar el contenido en ácidos grasos. También pueden usarse otros polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polinucleótidos de desaturasas delta 6 proporcionados en la presente memoria, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos de desaturasas delta 6. “Sustancialmente idéntico” se refiere a una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que muestra en orden de preferencia creciente al menos el 75%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98 o 99% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptido de desaturasa delta 6 de la SEQ ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 o secuencias que codifican estos polipéptidos. Pueden realizarse comparaciones de polipéptidos o polinucleótidos usando programas informáticos de análisis de secuencias, por ejemplo, el paquete informático de Análisis de Secuencias de GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA) y MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715). Estos programas informáticos emparejan secuencias similares asignando grados de similitud o identidad.

Construcciones de ADN

La invención proporciona construcciones de ADN que comprenden un promotor heterólogo unido operativamente a un ácido nucleico descrito en la presente memoria. La selección de promotores, por ejemplo promotores que pueden describirse como fuertemente expresados, débilmente expresados, expresados de manera inducible, expresados de forma potenciada en tejidos (es decir, expresados en un tejido específica o preferentemente), expresados de forma potenciada en órganos (es decir, expresados en un órgano específica o preferentemente) y expresados de forma potenciada en el desarrollo (es decir, expresados específica o preferentemente durante una etapa (o etapas) particular(es) del desarrollo) está dentro de la experiencia en la técnica. De manera similar, la combinación de una molécula de ácida nucleico como se ha descrito anteriormente con un promotor también se encuentra dentro de la experiencia en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001, 1989).

Los promotores para su uso con la invención incluyen, pero sin limitación, promotores que funcionan en bacterias, bacteriófagos, hongos o células de plantas. Los promotores útiles para la expresión bacteriana son los promotores lacZ, Sp6, T7, T5 o g/gC de E. coli. Los promotores útiles para hongos incluyen gall de Saccharomyces cerevisiae (West y col., 1984), nmt1 de Saccharomyces pombe (Maundrell, 1990), ccg-1 de Neurospora crassa (Freitag y Selker, 2005) y AUG 1 de Pichia methanolica (Invitrogen). Los promotores útiles para células de plantas incluyen el promotor Z27 de gamma zeína (véase, por ejemplo, Prem Das y col., 1991), el promotor de oleosina L3 (Patente de Estados Unidos Nº 6.433.252, Kriz y col.), el promotor PERI de cebada (Stacey y col., 1996), el promotor 35S de CaMV (Patente de Estados Unidos Nº 5.530.196 (Fraley y col.)), el promotor nos (Ebert y col., 1987), el promotor de actina de arroz (Patente de Estados Unidos Nº 5.641.876) y el promotor de PEPCasa (Hudspeth y col., 1989). Otros ejemplos de promotores útiles son el promotor del Virus del Mosaico de la Escrofularia (FMV) (Patente de Estados Unidos Nº 6.051.753 (Comai y col.)), promotores de arcelina, tomate E8, patatina, ubiquitina, manopina sintasa (mas) y tubulina.

Existe una amplia diversidad de secuencias de promotores en plantas que pueden usarse para dirigir la expresión específica de tejido de polinucleótidos que codifican desaturasas delta 6 y otras desaturasas de plantas transgénicas. Además, en realizaciones particulares de la invención, el promotor usado es un promotor específico de semilla. Los ejemplos de dichos promotores incluyen las regiones reguladoras 5’ de genes tales como napina (Kridl y col., 1991), faseolina (Bustos, y col., 1989), subunidad a de 1-conglicinina de soja (P-Gm7S alfa’, véase por ejemplo, Chen y col., 1986), USP de Vicia faba (P-Vf.Usp, véase por ejemplo, la SEC ID Nº: 1, 2 y 3, Publicación de Patente de Estados Unidos 20030229918), el promotor de globulina (véase, por ejemplo, Belanger y Kriz, 1991) y la subunidad alfa de soja de 1-conglicinina (7S alfa) (Publicación de Patente de Estados Unidos 20030093828).

Otros promotores potenciados en la expresión en semillas conocidos que actúan en maíz y en otras plantas incluyen los promotores de los siguientes genes: Waxy (almidón sintasa unida a gránulos), Brittle y Shrunken 2 (ADP glucosa pirofosforilasa), Shrunken 1 (sacarosa sintasa), enzimas de ramificación I y II, almidón sintasas, enzimas de desramificación, oleosinas, glutelinas y Betl1 (capa de transferencia de endospermo basal). También pueden contemplarse por la invención otros promotores útiles en práctica de la invención que se conocen por un experto en la materia.

Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción o duplicaciones de potenciadores para aumentar la expresión a partir de un promotor particular. Los ejemplos de dichos potenciadores incluyen, pero sin limitación, el intrón 1 de Adh (Callis y col., 1987), un intrón de actina de arroz (McElroy y col., 1991, Patente de Estados Unidos Nº 5.641.876), intrón de sacarosa sintasa (Vasil y col., 1989), intrón de HSP70 de maíz (denominado también Zm.DnaK) (Patente de Estados Unidos Nº 5.424.412, Brown y col.), un elemento omega de TMV (Gallie y col., 1999), el potenciador 35S de CaMV (Patentes de Estados Unidos Nº 5.359.142 & 5.196.525, McPherson y col.) o un potenciador de octopina sintasa (Patente de Estados Unidos 5.290924, Last y col.). Dado que la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el comienzo de la secuencia codificante, es decir, la secuencia líder no traducida, puede influenciar en la expresión génica, también puede desearse emplear una secuencia líder particular. Puede emplearse cualquier secuencia líder disponible para un experto en la materia. Las secuencias líder preferidas dirigen niveles óptimos de expresión del gen unido, por ejemplo, aumentando o manteniendo la estabilidad del ARNm y/o impidiendo el inicio inapropiado de la traducción (Joshi, 1987). La elección de dichas secuencias es a criterio de los expertos en la materia.

Las construcciones de ADN de la invención pueden incluir una secuencia próxima al extremo 3’ del casete que actúa como una señal para finalizar la transcripción de un ácido nucleico heterólogo y que dirige la poliadenilación delARNm resultante. Éstas normalmente se denominan regiones 3’ no traducidas o 3’UTR. Algunos elementos 3’ que pueden actuar como señales de terminación de la transcripción incluyen las de los genes de la nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan y col., 1983), una región 3’ no traducida de napina (Krid1 y col., 1991), una región 3’ no traducida de globulina (Belanger y Kriz, 1991), una región 3’ no traducida del gen Adr12 de soja (auxina regulada negativamente) (Wang y col., WO200250295) o una de un gen de zeína, tal como Z27 (Lopes y col., 1995). También pueden usarse otros elementos 3’ reguladores conocidos en la técnica en los vectores de la invención.

Una molécula de ácido nucleico como se describe en la presente memoria puede clonarse en cualquier vector adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. La selección de vectores y los procedimientos para construirlos se conocen normalmente en la técnica y se describen en referencias técnicas generales (véase, en general, Recombinant DNA Part D, 1987). El vector comprende preferentemente secuencias reguladoras, tales como codones de inicio y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas del tipo de huésped (por ejemplo, bacteria, hongo o planta) en la que se introduce el vector, según sea apropiado, y considerando si el vector es ADN o ARN.

Pueden prepararse vectores que son circulares o lineales para contener una secuencia de ácido nucleico entera como se ha descrito anteriormente o una parte de la misma ligada a un sistema de replicación funcional en una célula huésped procariota o eucariota. Los sistemas de replicación pueden proceder de CoIE1, plásmido 2 ml, fago I, fago filamentoso f1 y especies de Agrobacterium (por ejemplo, A. tumefaciens y A. rhizogenes).

Además del sistema de replicación y de la secuencia de ácido nucleico insertada, el vector puede incluir uno o más genes marcadores que permitan la selección de huéspedes transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, tales como resistencia a antibióticos, metales pesados o herbicidas, y complementación en un huésped auxotrófico para proporcionar prototrofia.

La invención proporciona células huésped que comprenden una molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria, opcionalmente en forma de vector. Los huéspedes adecuados incluyen células de plantas, bacterias y hongos, incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Agrobacterium tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae y Neurospora crassa. Los huéspedes E. coli incluyen TB-1, TG-2, DH5a, XL-Blue MRF’ (Stratagene, Austin, TX), SA2821, Y1090 y TG02. Las células de plantas incluyen, pero sin limitación, soja, Brassica campestris, canola, colza, colinabo, crambe, mostaza, ricino, cacahuete, sésamo, semilla de algodón, linaza, cártamo, palma, lino, girasol, alfalfa, maíz, trigo, cebada, avena, centeno, mijo, sorgo y arroz.

La expresión en una célula huésped puede conseguirse de manera transitoria o estable. La expresión transitoria puede producirse a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula huésped, pero dichas construcciones no se replican y raramente se integran en la célula huésped, o cuando la célula huésped no prolifera. La expresión transitoria también puede conseguirse induciendo la actividad de un promotor regulable unido operativamente al gen de interés, aunque dichos sistemas inducibles frecuentemente muestran un nivel basal de expresión bajo. La expresión estable puede conseguirse introduciendo una construcción que puede integrarse en el genoma huésped o que autónomamente se replica en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse mediante el uso de un marcador seleccionable localizado sobre o transfectado con la construcción de expresión, seguido por la selección de células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable resulta de la integración, la integración de construcciones se puede producir aleatoriamente dentro del genoma huésped o puede dirigirse mediante el uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma huésped suficientes para dirigir la recombinación con el locus del huésped. Cuando las construcciones se dirigen a un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripción y traducción pueden proporcionarse por el locus endógeno.

La expresión en una célula huésped puede implicar técnicas de fermentación conocidas para un experto en la materia. La célula huésped fermentada puede ser una procariota, tal como Escherichia coli, o un eucariota, tal como la levadura Saccharomyces cerevisiae o Neurospora crassa, un hongo filamentosos. Los ejemplos de producción de AGPI por fermentación incluyen Mortierella (Patente de Estados Unidos 6.319.698) y Thraustrochytriales (Patente de Estados Unidos 6.451.567).

Se contempla que puede introducirse y propagarse más de un gen en una célula huésped mediante el uso de vectores de expresión episomales o integrados. Cuando se expresan dos o más genes a partir de vectores de replicación distintos, es deseable que cada vector tenga un medio de replicación diferente. Cada construcción introducida, integrada o no, debe tener un diferente medio de selección y debe carecer de homología con las otras construcciones para mantener la expresión estable e impedir la reclasificación de elementos entre construcciones. Pueden determinarse experimentalmente elecciones sensatas de regiones reguladoras, medios de selección y procedimientos de propagación de la construcción introducida de manera que todos los polinucleótidos introducidos se expresen a los niveles necesarios para permitir la síntesis de los productos deseados.

Polipéptidos

La invención proporciona desaturasas delta 6 codificadas por moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria. Las desaturasas delta 6 son enzimas que pueden desaturar o catalizar la formación de un doble enlace entre carbonos consecutivos en la posición 6 de uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono- o poliinsaturado o un precursor del mismo. El polipéptido puede comprender D-aminoácidos, L-aminoácidos o una mezcla de D- y L-aminoácidos.

Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos natural para producir polipéptidos variantes pueden prepararse mediante una diversidad de medios conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, en los polipéptidos pueden introducirse convenientemente sustituciones de aminoácidos cambiando la secuencia de la molécula de ácido nucleico en el momento de la síntesis. También pueden introducirse mutaciones específicas de sitio ligando en un vector de expresión un oligonucleótido sintetizado que comprende la secuencia modificada. Como alternativa, pueden usarse procedimientos de mutagénesis dirigida a oligonucleótidos y específica de sitio, tales como los descritos en Walder y col. (1986); Bauer y col. (1985); y en las Patentes de Estados Unidos 4.518.584 y 4.737.462.

Se encuentra dentro de la experiencia del experto en la técnica seleccionar aminoácidos sintéticos y naturales para realizar sustituciones conservativas o neutras de cualquier aminoácido de origen natural particular. El experto en la materia considerará de manera deseable el contexto en el cual se realice cualquier sustitución de aminoácido particular, además de considerar la hidrofobia o polaridad de la cadena lateral, el tamaño general de la cadena lateral y el valor de pK de las cadenas laterales con carácter ácido o básico en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, la lisina, arginina e histidina frecuentemente se sustituyen adecuadamente entre sí, y más a menudo a arginina e histidina. Como se sabe en la técnica, esto se debe a que los tres aminoácidos tienen cadenas laterales básicas, mientras que los valores de pK de las cadenas laterales de la lisina y arginina están más próximos entre sí (aproximadamente 10 y 12) que al de histidina (aproximadamente 6). De manera similar, la glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina a menudo se sustituyen adecuadamente entre sí, siempre que la glicina frecuentemente no sustituya adecuadamente a los otros miembros del grupo. Esto es debido a que cada uno de estos aminoácidos es relativamente hidrófobo cuando se incorpora en un polipéptido, pero la ausencia en las glicinas de un carbono a permite los ángulos de rotación phi y psi (alrededor del carbono a), de manera que la gran libertad conformacional de los restos de glicina puede desencadenar cambios en la conformación o estructura secundaria que no se producirían con frecuencia cuando los otros aminoácidos se sustituyen entre sí. Otros grupos de aminoácidos frecuentemente sustituidos de manera adecuada entre sí incluyen, pero sin limitación, el grupo que consiste en ácidos glutámico y aspártico; el grupo que consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano, y el grupo que consiste en serina, treonina y, opcionalmente, tirosina. Adicionalmente, el experto habitual en la técnica puede agrupar fácilmente aminoácidos sintéticos con aminoácidos de origen natural.

Si se desea, los polipéptidos pueden modificarse, por ejemplo, por glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación, o por la creación de sales de adición de ácidos, amidas, ésteres, en particular ésteres C-terminales y derivados N-acilo de los polipéptidos de la invención. Los polipéptidos también pueden modificarse para crear derivados de proteínas formando complejos covalentes o no covalentes con otros restos de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Los complejos unidos covalentemente pueden prepararse uniendo los restos químicos a grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos que comprenden los polipéptidos, o en los extremos N o C. De manera deseable, dichas modificaciones y conjugaciones no influyen de manera adversa a la actividad de los polipéptidos (y sus variantes). Aunque dichas modificaciones y conjugaciones puedan tener mayor o menor actividad, la actividad deseablemente no se anula y es característica del polipéptido no modificado.

Los polipéptidos (y fragmentos, variantes y proteínas de fusión) pueden prepararse mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. El polipéptido puede aislarse o purificarse sustancialmente a partir de una fuente de origen natural o de una fuente recombinante. Por ejemplo, en el caso de proteínas recombinantes, un fragmento de ADN que codifica una proteína deseada puede subclonarse en un vector apropiado usando técnicas de genética molecular bien conocidas (véase, por ejemplo, Maniatis y col., 1989) y otras referencias citadas en la presente memoria en “EJEMPLOS”). El fragmento puede transcribirse y la proteína posteriormente traducirse in vitro. También pueden emplearse kits disponibles en el mercado (por ejemplo, tales como los fabricados por Clontech, Mountain View, CA; Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL; Invitrogen, Carlsbad, CA y similares). También puede emplearse la reacción en cadena de la polimerasa en la manipulación de los ácidos nucleicos).

Los polipéptidos pueden sintetizarse usando un sintetizador de péptidos automático de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Como alternativa, el polipéptido (y fragmentos, variantes y proteínas de fusión) pueden sintetizarse usando técnicas de síntesis de péptidos convencionales bien conocidas por los expertos habituales en la técnica (por ejemplo, como se resume en Bodanszky, 1984). En particular, el polipéptido puede sintetizarse usando el procedimiento de síntesis en fase sólida (véase, por ejemplo, Merrifield, 1963; Barany y col., 1987 y Patente de Estados Unidos 5.424.398). Si se desea, esto puede realizarse usando un sintetizador de péptidos automático. La eliminación de los grupos bloqueantes de aminoácidos t-butiloxicarbonilo (t-BOC) o 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y la separación de la proteína de la resina pueden conseguirse mediante, por ejemplo, tratamiento ácido a temperatura reducida. La mezcla que contiene el polipéptido después puede extraerse, por ejemplo, con dietil éter, para extraer compuestos orgánicos no peptídicos, y la proteína sintetizada puede extraerse del polvo de resina (por ejemplo, con ácido acético aproximadamente al 25% p/v). Después de la síntesis del polipéptido, puede realizarse opcionalmente una purificación adicional (por ejemplo, usando HPLC) para eliminar cualquier proteína incompleta, polipéptido, péptido o aminoácido libre. Puede realizarse un análisis de aminoácidos y/o HPLC en el polipéptido sintetizado para validar su identidad. Para otras aplicaciones de acuerdo con la invención, puede ser preferible producir el polipéptido como parte de una proteína de fusión más grande, por conjugación química o mediante medios genéticos conocidos en la técnica. A este aspecto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende el polipéptido (o fragmento del mismo) o variante del mismo y uno o más de otros polipéptidos/proteína(s) que tengan cualquier propiedad o función efectora deseada.

Los ensayos para la producción e identificación de proteínas específicas se basan en diversas propiedades físicoquímicas, estructurales, funcionales u otras propiedades de las proteínas. Las propiedades físico-químicas o estructurales únicas permiten que las proteínas se separen o se identifiquen por procedimientos electroforéticos, tales como electroforesis en gel natural o desnaturalizante o isoelectroenfoque o por técnicas cromatográficas tales como cromatografía de intercambio iónico o exclusión en gel. Las estructuras únicas de proteínas individuales ofrecen oportunidades para el uso de anticuerpos específicos para detectar su presencia en formatos tales como un ensayo ELISA. Pueden usarse combinaciones de enfoques para conseguir incluso mayor especificidad, tales como transferencia de western en la que se usan anticuerpos para localizar productos génicos individuales que se han separado por técnicas electroforéticas. Pueden usarse técnicas adicionales para confirmar de manera absoluta la identidad del producto de interés tal como la evaluación por secuenciación de aminoácidos después de la purificación. Aunque éstos son los más comunes, también pueden usarse otros procedimientos.

Los procedimientos de ensayo pueden identificar la expresión de proteínas por su funcionalidad, particularmente cuando la proteína expresada es una enzima que puede catalizar reacciones químicas que implican sustratos y productos específicos. Por ejemplo, en extractos de plantas estas reacciones pueden medirse proporcionando y cuantificando la pérdida de sustratos o la generación de productos de las reacciones mediante procedimientos físicos y/o químicos.

En muchos casos, la expresión de un producto génico se determina evaluando el resultado fenotípico de su expresión. Dichas evaluaciones pueden ser tan sencillas como observaciones visuales o pueden implicar ensayos. Dichos ensayos pueden adoptar varias formas, tales como el análisis de cambios en la composición, química, morfología o propiedades fisiológicas de la planta. La composición química puede modificarse por expresión de genes que codifican enzimas o proteínas de almacenamiento que cambian la composición de aminoácidos y estos cambios pueden detectarse por análisis de aminoácidos, o por enzimas que cambian la cantidad de almidón, que puede analizarse por espectrometría de reflectancia en el infrarrojo cercano, o por enzimas que cambian la composición de aceite, que puede detectarse por cromatografía de gases. Los cambios morfológicos pueden incluir una mayor estatura o tallos más gruesos.

Las moléculas de ácido nucleico, construcciones de ADN y polipéptidos de la presente invención pueden usarse en procedimientos agrícolas y en diversos ensayos de exploración. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede usarse para expresar una desaturasa delta 6 mediante un vector en una células huésped, para detectar transcritos de ARNm que codifican desaturasas delta 6 en una muestra biológica, para detectar una alteración genética en un gen que codifica una desaturasa delta 6 mediante una transferencia de Southern, para suprimir desaturasas delta 6

o para regular positivamente desaturasas delta 6. Los polipéptidos pueden usarse para compensar los déficits en las desaturasas delta 6 o la presencia de una desaturasa delta 6 mutada que tiene actividad reducida o nula en una planta, o para tratar niveles excesivos de sustratos, tanto directos como indirectos, para desaturasas delta 6 en una planta. Como alternativa, los polipéptidos pueden usarse para explorar agentes con respecto a la capacidad de modular su actividad. Los anticuerpos pueden usarse para detectar y aislar los polipéptidos respectivos, así como para disminuir la disponibilidad de dichos polipéptidos in vivo.

Transformación de plantas

En una realización preferida de la invención, se produce una planta transgénica que expresa la proteína o proteínas deseadas. En la técnica se conocen diversos procedimientos para la introducción de una secuencia polinucleotídica deseada que codifica la proteína deseada en células de plantas, que incluyen: (1) procedimientos físicos tales como microinyección, electroporación y suministro mediado por micropartículas (biolística o tecnología de bombardeo con genes); (2) suministro mediado por virus y (3) transformación mediada por Agrobacterium.

Los procedimientos más frecuentemente usados para la transformación de células de plantas son los procedimientos de transferencia de ADN mediada por Agrobacterium y los procedimientos de biolística o mediados por bombardeo de micropartículas por microproyectiles. Típicamente, se desea la transformación nuclear, pero cuando es deseable transformar específicamente plastidios, tales como cloroplastos o amiloplastos, los plastidios de las plantas pueden transformarse usando un suministro mediado por micropartículas del polinucleótido deseado.

La transformación mediada por Agrobacterium se consigue mediante el uso de una bacteria del suelo modificada genéticamente perteneciente al género Agrobacterium. Para la transferencia de genes en plantas pueden usarse diversas cepas de tipo silvestre y desactivadas de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que incluyen plásmidos Ti o Ri. La transferencia de genes se realiza mediante la transferencia de un ADN específico conocido como “ADN-T” que puede modificarse genéticamente para incluir cualquier trozo de ADN deseado en muchas especies vegetales, como se elabora adicionalmente, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos

6.265.638 de Bidney y col.

La transformación genética de plantas mediada por Agrobacterium implica diversas etapas. La primera etapa, en la que en primer lugar se ponen en contacto entre sí Agrobacterium virulento y las células de la planta, se denomina generalmente “inoculación”. La inoculación preferentemente viene acompañada por algún procedimiento de lesión de algunas células de la planta, que libera constituyentes celulares de la planta tales como alcohol cumarílico, sinapinato (que se reduce en acetosiringona), alcohol sinapílico y alcohol coniferílico, que activa los factores de virulencia en Agrobacterium. Después de la inoculación, se deja que se desarrollen los tejidos/células de Agrobacterium y de la planta conjuntamente durante un periodo de varias horas a varios días o más en condiciones adecuadas para el crecimiento y transferencia del ADN-T. Esta etapa se denomina “co-cultivo”. Después del cocultivo y del suministro de ADN-T, las células de la planta se tratan con agentes bactericidas o bacteriostáticos para destruir al Agrobacterium que queda en contacto con el explante y/o en el recipiente que contiene el explante. Si este se hace en ausencia de algún agente selectivo para promover el crecimiento preferente de las células de planta transgénicas frente a no transgénicas, entonces esto se denomina típicamente etapa de “retraso”. Si se realiza en presencia de presión selectiva que favorece las células de planta transgénicas, entonces esto se denomina etapa de “selección”. Cuando se usa la etapa de “retraso”, típicamente va seguida de una o más etapas de “selección”.

Con respecto al bombardeo con micropartículas (Patente de Estados Unidos 5.550.318 (Adams y col.); Patente de Estados Unidos 5.538.880 (Lundquist y col.), Patente de Estados Unidos 5.610.042 (Chang y col.); y documento WO 95/06128 (Adams y col.)), las partículas microscópicas se recubren con ácidos nucleicos y se introducen en las células mediante una fuerza propulsora. Las partículas ejemplares incluyen las compuestas por tungsteno, platino y preferentemente oro.

Una realización ilustrativa de un procedimiento de suministro de ADN en células de planta por aceleración es el Sistema de Suministro de Partículas Biolístico (BioRad, Hercules, CA), que puede usarse para propulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células de plantas monocotiledóneas cultivadas en suspensión.

Las técnicas de bombardeo con micropartículas se pueden aplicar ampliamente y pueden usarse para transformar prácticamente cualquier especie de planta. Los ejemplos de especies que se han transformado por bombardeo de micropartículas incluyen especies de monocotiledóneas tales como maíz (WO 95/06128 (Adams y col.)), cebada, trigo (Patente de Estados Unidos 5.563.055 (Townsend y col.)), arroz, avena, centeno, caña de azúcar y sorgo; así como diversas dicotiledóneas que incluyen tabaco, soja (Patente de Estados Unidos 5.322.783 (Tomes y col.)), girasol, cacahuete, algodón, tomate y legumbres en general (Patente de Estados Unidos 5.563.055 (Townsend y col.)).

Para seleccionar o clasificar las células de plantas transformadas independientemente de la metodología de transformación, el ADN introducido en la células contiene un gen que funciona en un tejido de la planta regenerable para producir un compuesto que confiere al tejido de la planta resistencia a un compuesto que de otra manera sería tóxico. Los genes de interés para su uso como marcadores seleccionables, explorables o clasificables incluirían, pero sin limitación, 1-glucuronidasa (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), luciferasa (LUX), y genes de tolerancia a antibióticos o herbicidas. Los ejemplos de genes de resistencia a antibióticos incluyen las penicilinas, kanamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprima); cloranfenicol; kanamicina y tetraciclina. En la técnica se conocen moléculas de polinucleótidos que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas e incluyen, pero sin limitación una molécula de polinucleótido que codifica la 5-enolpiruvilsiquimato-3fosfato sintasa (EPSPS) descrita en la Patente de Estados Unidos 5.627.061 (Barry, y col.), Patente de Estados Unidos 5.633.435 (Barry, y col.), y Patente de Estados Unidos 6.040.497 (Spencer, y col.) y aroA descrita en la Patente de Estados Unidos 5.094.945 (Comai) para tolerancia a glifosato; una molécula de polinucleótido que codifica bromoxinil nitrilasa (Bxn) descrita en la Patente de Estados Unidos 4.810.648 (Duerrschnabel, y col.) para tolerancia a Bromoxinil; una molécula polinucleotídica que codifica fitoeno desaturasa (crtI) descrita en Misawa y col. (1993); Misawa y col. (1994) para tolerancia a noflurazón; una molécula polinucleotídica que codifica acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan y col. (1990) para tolerancia a herbicidas de sulfonilurea; y tanto el gen pat descrito en Wohlleben y col. (1988) como el gen bar descrito en DeBlock y col. (1987), proporcionando cada uno de ellos tolerancia a glufosinato y bialafos.

La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas de diversos explantes transformados están bien documentados en la técnica. Este procedimiento de regeneración y crecimiento incluye típicamente las etapas de seleccionar células transformadas y cultivar esas células individualizadas mediante las fases normales de desarrollo embrionario mediante la fase de enraizamiento de plántula. Los embriones y semillas transgénicos se regeneran de manera similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes después de esto se plantan en un medio de crecimiento para plantas apropiado tal como un sustrato. Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o las células que se han clasificado como positivas en un ensayo de exploración, pueden cultivarse en medios que soporten la regeneración de plantas. Las plántulas en desarrollo se transfieren a mezcla de crecimiento de plantas sin sustrato y se estabilizan, antes de transferirlas a un invernadero o a una cámara de crecimiento para maduración.

La presente invención puede usarse con cualquier célula o tejido transformable. Por transformable, como se usa en la presente memoria, se entiende una célula o tejido que puede propagarse adicionalmente para dar lugar a una planta. Los expertos en la materia reconocen que varias células o tejidos de plantas son transformables, en los cuales después de la inserción de un ADN exógeno y en condiciones de cultivo apropiadas, las células o tejidos de la planta pueden formar una planta diferenciada. El tejido adecuado para estos propósitos puede incluir, pero sin limitación, embriones inmaduros, tejido escutelar, cultivos de células en suspensión, inflorescencias inmaduras, meristemo de brotes, explantes nodales, tejido calloso, tejido de hipocótilo, cotiledones, raíces y hojas. La patente de Tomes y col. 5.322.783, indicado anteriormente, describe un procedimiento de tratamiento con una citocinina seguido de incubación durante un periodo suficiente para permitir que las células indiferenciadas en tejido nodal cotiledonario se diferencien en células meristemáticas y para permitir que las células entren en las fases entre G1 y las fases de división del desarrollo, que se constata que mejoran la susceptibilidad para la transformación.

Puede usarse cualquier medio de cultivo para plantas adecuado. Los medios adecuados incluyen, pero sin limitación, medios basados en MS (Murashige y Skoog, 1962) o medios basados en N6 (Chu y col., 1975) complementados con reguladores del crecimiento de las plantas adicionales que incluyen, pero sin limitación, auxinas, citocininas, ABA y giberelinas. Los expertos en la materia están familiarizados con la diversidad de medios de cultivo tisular que, cuando se complementan adecuadamente, soportan el crecimiento y el desarrollo de tejidos de las plantas y son adecuados para la transformación y regeneración de plantas. Estos medios de cultivo de tejidos pueden adquirirse como una preparación comercial o prepararse y modificarse a medida. Los expertos en la materia son conscientes de que los medios y los complementos de los medios tales como nutrientes y reguladores de crecimiento para su uso en la transformación y regeneración, y otras condiciones de cultivo tales como la intensidad de la luz durante la incubación, el pH y las temperatura de incubación, pueden optimizarse para la diversidad particular de interés.

Después de incorporar de manera estable una construcción de ADN en plantas transgénicas y de confirmarse su operatividad, puede introducirse en otras plantas de la misma especie o de otra especie sexualmente compatible mediante cruce sexual. Puede usarse cualquiera de una diversidad de técnicas de reproducción convencionales, dependiendo de las especies a cruzar. Por lo tanto, la presente invención no solamente incluye una planta directamente transformada o regenerada a partir de células que se han transformado de acuerdo con la presente invención, sin o también la descendencia de dichas plantas. Como se usa en la presente memoria, el término “descendencia” significa la descendencia de cualquier generación de una planta parental preparada de acuerdo con la presente invención, en la que la descendencia comprende una construcción de ADN seleccionada preparada de acuerdo con la invención. El “cruce” de una planta para proporcionar una línea de plantas que tiene uno o más transgenes o alelos añadidos con respecto a la línea de plantas de partida, como se desvela en la presente memoria, se define como las técnicas que hacen que una secuencia particular se introduzca en una línea de planta por cruce de una línea de partida con una línea de planta donante que comprende un transgén o alelo de la invención. Para conseguir esto, por ejemplo, se podrían realizar las siguientes etapas: (a) semillas de plantas de la primera (línea de partida) y segunda (línea de planta donante que comprende un transgén o alelo deseado) de plantas parentales; (b) cultivar las semillas de la primera y segunda plantas parentales para obtener plantas que lleven flores; (c) polinizar una flor de la primera planta parental con polen de la segunda planta parental y (d) recoger las semillas producidas en la planta parental que tiene la flor fertilizada.

El retrocruzamiento en la presente memoria se define como el procedimiento que incluye las etapas de (a) cruzar una planta de un primer genotipo que contiene un gen, secuencia de ADN o elemento deseado con una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (b) seleccionar una o más plantas de la descendencia que contengan el gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (c) cruzar la planta de la descendencia con una planta del segundo genotipo; y (d) repetir las etapas (b) y (c) para los propósitos de transferir una secuencia de ADN deseada desde una planta de un primer genotipo a una planta de un segundo genotipo.

La introgresión de un elemento de ADN en un genotipo de una planta se define como el resultado del procedimiento de conversión por retrocruzamiento. Un genotipo de planta en el que se ha introducido por introgresión una secuencia de ADN puede denominarse genotipo, línea, organismo endogámico o híbrido convertido por retrocruzamiento. De manera similar un genotipo de planta que carece de la secuencia de ADN deseada puede denominarse genotipo, línea, organismo endogámico o híbrido no convertido.

Semillas, Harina, Aceite y Productos que Comprenden Semillas, Harina y Aceite

La presente invención también proporciona un recipiente de más de aproximadamente 1000, más preferentemente aproximadamente 20.000, e incluso más preferentemente aproximadamente 40.000 semillas en que más de aproximadamente el 10%, más preferentemente aproximadamente el 25%, más preferentemente aproximadamente 50% e incluso más preferentemente aproximadamente el 75% o más preferentemente aproximadamente el 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención.

La presente invención también proporciona un recipiente de más de aproximadamente 10 kg, más preferentemente aproximadamente 25 kg e incluso más preferentemente aproximadamente 50 kg de semillas en las que más de aproximadamente el 10%, más preferentemente aproximadamente el 25%, más preferentemente aproximadamente 50% e incluso más preferentemente aproximadamente el 75% o más preferentemente aproximadamente el 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención.

Cualquier planta o parte de la misma de la presente invención puede cosecharse y, opcionalmente, procesarse para producir una preparación de alimento, harina o aceite. Una parte de planta particularmente preferida para este propósito es el grano cosechado, pero también pueden cosecharse otras partes de la planta y usarse para forraje o ensilaje. Los procedimientos para producir preparaciones de alimento, harina y aceite se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.957.748; 5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; y 6.156.227. El grano o harina de la presente invención puede mezclarse con otros granos o harinas.

Procedimientos

La presente invención proporciona un procedimiento para proporcionar plantas transgénicas con un contenido aumentado de GLA o SDA. Este procedimiento puede incluir, por ejemplo, introducir ADN que codifica una desaturasa delta 6 y opcionalmente al menos una desaturasa adicional en células de plantas y regenerar plantas con un contenido de GLA o SDA aumentado a partir de las células transgénicas.

Más específicamente, la invención proporciona un procedimiento para producir un pienso o producto alimentario que comprende las etapas de (a) obtener la planta transgénica de la invención; y (b) producir el alimento o producto alimentario. El alimento o producto alimentario puede ser aceite, ensilaje, harina, grano, almidón, fécula o proteína. La composición para el alimento o producto alimentario se define como una composición que comprende una secuencia polinucleotídica detectable o polipéptido detectable proporcionado por la invención. Adicionalmente, la invención proporciona pienso para animales y composiciones alimentarias para seres humanos que comprenden GLA o SDA.

Para el complemento de la dieta, los AGPI purificados, plantas o partes de la planta transformadas, o derivados de las mismas, pueden incorporarse en aceite, grasa o margarina para cocinar formulados de manera que durante el uso normal el receptor reciba la cantidad deseada. Los AGPI también pueden incorporarse en fórmulas infantiles, complementos nutricionales u otros productos alimentarios y pueden encontrar uso como agentes antiinflamatorios o reductores del colesterol.

Como se usa en la presente memoria, “composición comestible” se define como composiciones que pueden ingerirse por un mamífero, tales como productos alimentarios, sustancias nutricionales y composiciones farmacéuticas. Como se usa en la presente memoria, “productos alimentarios” se refiere a sustancias que pueden usarse o prepararse para su uso como alimento para un mamífero e incluyen sustancias que pueden usarse en la preparación de alimentos (tales como aceites para fritos) o aditivos alimentarios. Por ejemplo, los productos alimentarios incluyen animales usados para consumo humano o cualquier producto de los mismos, tales como, por ejemplo, huevos. Los productos alimentarios típicos incluyen, pero sin limitación, bebidas (por ejemplo, refrescos, bebidas carbonatadas, bebidas listas para mezclar), fórmulas infantiles, alimentos de infusión (por ejemplo frutas y verduras), salsas, condimentos, aliños para ensaladas, zumos de fruta, jarabes, postres (por ejemplo, pudines, gelatina, glaseados y rellenos, artículos de repostería y postres congelados tales como helados y sorbetes), productos blandos congelados (por ejemplo, cremas blandas congeladas, cremas heladas blandas y yogures, recubrimientos blandos congelados tales como recubrimientos batidos lácteos o no lácteos), aceites y productos emulsionados (por ejemplo, manteca, margarina, mayonesa, mantequilla, aceite para cocinar y aliños para ensalada) y alimentos con un grado de humedad intermedio (por ejemplo, arroz y alimento para perros).

Adicionalmente, las composiciones comestibles descritas en la presente memoria también pueden ingerirse como unaditivo o complemento contenido en alimentos y bebidas. Éstos pueden formularse junto con una sustancia nutricional tal como diversas vitaminas y minerales e incorporarse en composiciones sustancialmente líquidas tales como bebidas nutrientes, leche de soja y sopas; composiciones sustancialmente sólidas; y gelatinas, o usarse en forma de polvo para incorporarse en diversos alimentos. El contenido del principio activo en dicho alimento funcional

o sanitario puede ser similar a la dosis contenida en un agente farmacéutico típico.

Los AGPI purificados, las plantas transformadas o las partes de plantas también pueden incorporarse en pienso para animales, particularmente en pienso para el ganado. De esta manera, los propios animales pueden beneficiarse de una dieta rica en AGPI, mientras que también pueden beneficiarse los consumidores humanos de productos alimentarios producidos a partir de dicho ganado.

Para el uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones pueden administrarse generalmente por vía oral, pero también pueden administrarse por cualquier vía mediante la cual pueda absorberse de manera satisfactoria, por ejemplo, por vía parenteral (es decir, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa), rectal, vaginal o tópica, por ejemplo, como una pomada o loción para la piel. Los AGPI, plantas o partes de plantas transformadas de la presente invención pueden administrarse en solitario o en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cuando están disponibles, las formas de administración oral preferidas son las cápsulas de gelatina. La complementación en la dieta indicada anteriormente también puede proporcionar una vía de administración oral. Los ácidos insaturados de la presente invención pueden administrarse en formas conjugadas o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos. Cualquier sal farmacéuticamente aceptable se incluye en la presente invención; se prefieren especialmente las sales de sodio, potasio o litio. También se incluyen las sales de N-alquilpolihidroxamina, tales como N-metil glucamina, encontradas en el documento WO 96/33155. Los ésteres preferidos son ésteres etílicos. Como sales sólidas, los AGPI también pueden administrarse en forma de comprimidos. Para la administración intravenosa, los AGPI o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como intralípidos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar realizaciones de la invención.

Ejemplo 1

Clonación de secuencias de desaturasa 6 de Tetraselmis suecica

La clonación de la desaturasa 6 de Tetraselmis suecica (TsD6D) se consiguió por amplificación por PCR de una región de ADN genómico interno parcial usando oligonucleótidos degenerados, seguido de exploración de la biblioteca RACE. Se aisló ADN genómico a partir de la cepa CCMP904 de T. suecica (CCMP, West Boothbay Harbor, ME, USA) usando DNasol (InVitrogen, Carlsbad, CA). Se amplificó una región interna de 578 pb por PCR usando los cebadores oligonucleotídicos degenerados D6DegF2: 5’-TGGTGGAARRMSAAGCAYAAC-3’ (SEC ID Nº: 5) y D6DegR3: 5’-ARDCCWCCVBDRAACCARTY-3’ (SEC ID Nº: 6). Estos cebadores se diseñaron usando alineamientos de secuencias de ADN de desaturasas 6 relacionadas. El fragmento de PCR resultante se ligó a PCR2.1-TOPO (Invitrogen), dando el plásmido pMON67050. Después de la secuenciación, se observó que el inserto clonado contenía la secuencia de aminoácidos conservada QXXHH (SEC ID Nº: 22), que se encuentra en todas las desaturasas de extremo frontal (front-end) (Napier y col., 1997, Napier y col., 2003, Sperling y Heinz, 2001). Los ejemplos de desaturasas de extremo frontal incluyen las desaturasas de ácidos grasos 4, 5 y 6, además de las desaturasas 8 de espingolípidos. Esta secuencia genómica permitió el diseño de cebadores específicos de gen de

forma que pudo clonarse un supuesto ADNc de desaturasa 6 de longitud completa.

Se aisló ARN total a partir de células de T. suecica por un procedimiento CTAB modificado (Jones y col., 1995) y el ARN se usó para generar una biblioteca GeneRacer™ siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Una reacción 5’ RACE usando el cebador específico de gen, Phy D6 R2: 5’- AGTAGCCAGGCATAGTGCAGCGCAAT-3’ 5 (SEC ID Nº: 7) y el cebador 5’ GeneRacer: 5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’ (Invitrogen; (SEC ID Nº: 23)) produjo un fragmento de 1264 pb que solapaba con pMON67050 por 310 pb. Una reacción 3’ RACE usando el cebador específico de gen D6DegF3: 5’-TTCAACGATTGGTTCACGGGTGGC-3’ (SEC ID Nº: 8) y el cebador 3’ GeneRacer: 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’ (Invitrogen (SEC ID Nº:24)) produjo un fragmento de 405 pb que solapaba en 56 pb con el producto de 5’ RACE para dar un fragmento virtual combinado con una fase de 10 lectura abierta (ORF) de 1529 nucleótidos. La secuencia de aminoácidos predicha a partir de la ORF contenía secuencias conservadas que sirven de diagnóstico para una desaturasa de ácidos grasos 6 incluyendo el dominio de citocromo b5 N-terminal que se encuentra en todas las desaturasas de extremo frontal (Napier y col., 2003) y tres cajas de histidina conservadas que son características de todas las desaturasas unidas a la membrana (Shanklin y col., 1994). Una característica de distinción encontrada en todas las desaturasas de extremo frontal, incluyendo la

15 supuesta TsD6D de la presente memoria, es que la tercera caja de histidina contiene un resto de glutamina en la primera posición (Q-x-x-H-H) en lugar de una histidina (Napier y col., 1997, Napier y col., 2003, Sperling y Heinz, 2001).

Usando las secuencias de RACE de T. suecica descritas anteriormente, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos específicos para amplificar la ORF completa para la supuesta TsD6D. El primer cebador (TsD6D-F1:5’20 AACATGGGCAGGGGTGGGTTTACTG-3’ (SEC ID Nº: 9)) añadió una secuencia Kozak de levadura 5’ del sitio de inicio ATG y el cebador inverso (TsD6D-R1: 5’-CTAAGCAAGTGCCGCGATGTCCG-3’ (SEC ID Nº: 10)) añadió un codón de terminación en el extremo 3’ del producto amplificado. Estos cebadores se usaron para generar un fragmento de 1536 pb por amplificación por PCR a partir de la biblioteca RACE que se ligó al vector de expresión de levadura pYES2.1N5-His-TOPO (invitrogen). Se identificaron dos versiones distintas de las ORF de longitud

25 completa que diferían en 22 nucleótidos y 5 aminoácidos. Las secuencias de ácido nucleico de las dos supuestas desaturasas de ácidos grasos 6 de T. suecica, denominadas TsD6D-1 y TsD6D-2, se muestran en la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para TsD6D-1 y TsD6D-2 se muestran en las SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 4, respectivamente. Las dos secuencias codifican un polipéptido potencial de 510 aminoácidos.

30 El alineamiento de las dos secuencias de aminoácidos de T. suecica con desaturasas 6 de Isochrysis galbana y Mortierella alpina muestra una diversidad extensiva a lo largo de toda la proteína, con regiones de alta homología rodeando a las cajas de histidina conservadas (FIG. 1). I. galbana y T. suecica son algas marinas y M. alpina es un hongo oleaginoso que acumula altos niveles de ácido araquidónico. El porcentaje de identidad para estas secuencias de aminoácidos se muestra en la Tabla 1.

35 Tabla 1: Porcentaje de identidades del alineamiento por parejas para las secuencias de aminoácidos deducidas de desaturasas D6

1 2 3 4 Organismo

--------

22 22 22 1 Isochrysis galbana SEC ID Nº: 11

--------

37 37 2 Mortierella alpina SEC ID Nº: 12

--------

99 3 TsD6D-1 SEC ID Nº: 2

--------

4 TsD6D-2 SEC ID Nº: 4

I. galbana: Acceso AX577009, aminoácidos deducidos a partir de (SEC ID Nº: 34, documento W002081668).

M. alpina: Acceso AAF08685

Ejemplo 2

Transformación y expresión en levadura

40 Se introdujeron los clones pYES2.1/V5-His que contenían TsD6D-1 y TsD6D-2 en la cepa huésped Saccharomyces cerevisiae INVSc1 (auxotrófica para uracilo) (Invitrogen) usando el protocolo PEG/Li Ac como se describe en el manual de Invitrogen para pYES2.1N5-His-TOPO. Los transformantes se seleccionaron en placas hechas de medio mínimo SC menos uracilo con glucosa al 2%. Las colonias de transformantes se usaron para inocular 8 ml de medio mínimo SC menos uracilo y glucosa al 2% y se dejaron crecer una durante una noche a 30 ºC. Para la inducción, se sedimentaron células de levadura en fase estacionaria y se resuspendieron en medio mínimo SC menos uracilo suplementado con galactosa al 2% y cultivadas durante 3 días a 15 ºC. Cuando se proporcionaron ácidos grasos

5 exógenos a los cultivos, se añadió LA ( 9, 12-18:2) al 0,01% o ALA ( 9, 12, 15-18:3) al 0,01% con el emulsionante Tergitol al 0,1%. Los cultivos se dejaron crecer durante 3 días a 15 ºC y posteriormente se recogieron por centrifugación. Los sedimentos celulares se lavaron una vez con tampón TE estéril pH 7,5 para retirar el medio, y se liofilizaron a sequedad. La cepa huésped transformada con el vector que contenía el gen LacZ se usó como control negativo en todos los experimentos.

10 Se extrajeron lípidos a partir de sedimentos de levadura liofilizados añadiendo 0,1 ml de tolueno e incubando durante una noche a temperatura ambiente. Los lípidos extraídos se convirtieron en ésteres metílicos de ácidos grasos (EMAG) in situ por adición de 0,5 ml de metóxido sódico 0,6 N en metanol e incubación durante 45 min a temperatura ambiente. Los EMAG se extrajeron por adición de 0,8 ml de NaCl al 10% (p/v) y 0,15 ml de heptano. La capa de heptano que contenía EMAG se retiró y se usó directamente para la cromatografía de gases (CG). Los

15 EMAG se identificaron en una CG Hewlett-Packard 5890 II Plus (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) equipada con un detector de ionización de llama y una columna capilar (omegawax 250; 30 m x 0,25 mm d.i.. x 0,25 lm; Supelco, Bellefonte, PA). Se usó una relación de división de 100:1 para las inyecciones. El inyector se mantuvo a 250 ºC y el detector de ionización de llama se mantuvo a 270 ºC. La temperatura de la columna se mantuvo a 180 ºC durante 1,5 min después de la inyección, se aumentó a 240 ºC a 40 ºC/min y se mantuvo a 245 ºC durante 3,38 min.

20 Los resultados mostrados en la Tabla 2 demuestran que los clones de T. suecica TsD6D-1 y TsD6D-2 presentan actividad desaturasa 6 en un sistema de expresión de levadura. La preferencia de sustrato se dedujo a partir de un ensayo de inducción de levaduras, en el que a cultivos de levadura inducidos para expresar desaturasa recombinante se le suministra LA, ALA o volúmenes iguales de LA y ALA. La levadura incorpora estos ácidos grasos en sus membranas en las que se vuelven sustratos para la desaturasa recombinante. Los productos de la

25 desaturación 6 de LA y ALA son GLA y SDA, respectivamente. Se seleccionaron dos colonias individuales para cada vector. Los dos clones de T. suecica demostraron una selectividad de sustrato para ALA que es de 2 a 2,6 veces mayor que para LA. El control negativo es el vector pYES2.1 que contiene un inserto LacZ.

Tabla 2: Actividad desaturasa delta 6 de TsD6D-1 y TsD6D-2 de T. suecica en un sistema de expresión de levadura

Construcción Fa en medio LA GLA ALA SDA SDA/GLA

control neg. -0 0 0 0

control neg. LA 13,69 0 0 0

control neg. ALA 0 0 25,02 0

control neg. L+ALA 7,96 0 12,17 0

control neg. -0 0 0 0

control neg. LA 14,07 0 0 0

control neg. ALA 0 0 26,82 0

control neg. LA+ALA 8,62 0 13,44 0

TsD6D-1 -0 0 0 0

TsD6D-1 LA 12,08 1,39 0 0

TsD6D-1 ALA 0 0 19,87 1,27

TsD6D-1 LA+ALA 8,65 0,44 13,54 1,08 2,45

TsD6D-1 -0 0 0 0

TsD6D-1 LA 11,61 1,2 0 0

(cont.) TsD6D-1 ALA 0,53 0 20,81 1,21

TsD6D-1 LA+ALA 8,44 0,39 13,68 1,02 2,62

TsD6D-2 -9,43 0 1,24 0

TsD6D-2 LA 16,85 0,76 0 0

TsD6D-2 ALA 0 0 31,62 1,7

TsD6D-2 LA+ALA 5,83 0,35 8,02 0,69 1,97

TsD6D-2 -0 0 0 0

TsD6D-2 LA 9,07 0,61 0 0

TsD6D-2 ALA 0 0 25,78 1,54

TsD6D-2 LA+ALA 9,43 0,5 15,15 1,23 2,46

Ejemplo 3

Expresión de desaturasa 6 de Tetraselmis suecica en soja

5 La actividad de la desaturasa 6 de T. suecica se evaluó en semillas de soja combinándola con una desaturasa 15 potenciada por codones de dicotiledónea procedente de Neurospora crassa (NcFad3nno) (SEC ID Nº: 13) para dar pMON94002 (FIG. 2). El vector pMON94002 se construyó en 3 etapas. En primer lugar, se añadieron los sitios de restricción Sall y Sse8387I a los extremos de la secuencia codificante de TsD6D-1 (CDS) por amplificación por PCR a partir de pMON67034 (TsD6D-1 en pYES2.1) usando los oligonucleótidos TsD6D-F3: 5’

10 GTCGACAAACAATGGGCAGGGGTGGGTTTA-3’ (SEC ID Nº: 14) y TsD6D-R3: 5’-CCTGCAGGCTAAGCAAGTGCCGCGATGTC-3’ (SEC ID Nº: 15) para dar pMON67051. La CDS de TsD6D-1 a continuación se puso detrás del promotor de 7Sa específico de semilla por digestión de pMON67051 con Sall y Sse8387I y ligamiento del fragmento resultante en pMON67052 digerido con XhoI/Sse8387I para dar pMON67053. El casete de expresión 7Sa::TSD6D-1::E9 resultante se introdujo en un vector binario de plantas que contenía el

15 NcFad3nno dirigido por el promotor específico de semilla, USP99. Esto se consiguió digiriendo el vector pMON67053 con NotI y después ligando el fragmento resultante en pMON67046 digerido parcialmente con NotI (vector que contiene USP99::NcFAD3nno::nos) para dar pMON94002.

Se obtuvieron explantes transformados que contenían pMON94002 por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Se regeneraron plantas a partir del tejido transformado. Después, las plantas cultivadas en invernadero 20 se analizaron con respecto a la composición de aceite. El efecto de la expresión de la secuencia codificante de TsD6D-1 junto con el NcFad3nno se midió determinando la composición de ácidos grasos de la semilla madura por cromatografía de gases de derivados de éster metílico de lípidos (documento PCT US03/16144, presentado el 21 de mayo de 2003, cuya divulgación entera se incorpora específicamente en la presente memoria por referencia). Los niveles de OA (ácido oleico), LA (ácido linoleico), GLA (ácido y-linolénico), ALA (ácido a-linolénico) y SDA (ácido 25 estearidónico) se expresan como un porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos y se muestran en la Tabla

3. La línea no transgénica A3525 se incluye como control negativo. Los valores se expresan como una media de no nulos a partir de hasta 6 semillas R1 individuales.

Tabla 3: Resultados de porcentaje de área relativa a partir de una sola semilla R1 de soja transformada con pMON94002

Ácidos grasos (porcentaje en peso)

Linaje Gen Oleico LA ALA GLA SDA GLA/SDA

A3525 -17,44 56,1 9,1 ---

GM_A74156 R1 15,5 47,7 16,1 3,1 0,4 7,2

GM_A74004 R1 14,4 37,2 12,4 13,7 4,9 2,8

GM_A73961 R1 15,8 38,6 7,0 19,2 1,5 13,0

(cont.) Ácidos grasos (porcentaje en peso)

Linaje

Gen Oleico LA ALA GLA SDA GLA/SDA

GM_A73654

R1 14,5 28,1 5,7 27,4 4,6 5,9

GM_A73962

R1 14,0 25,7 6,4 28,4 4,9 5,8

GM_A73657

R1 13,5 17,3 8,7 31,8 9,2 3,5

GM_A74165

R1 17,9 20,3 4,7 33,8 3,9 8,6

GM_A74162

R1 15,2 19,5 5,1 35,3 5,3 6,7

GM_A73612

R1 22,6 8,1 3,1 38,1 4,3 8,8

GM_A73597

R1 18,4 6,7 3,7 39,3 6,2 6,3

GM_A74496

R1 18,5 10,6 4,3 39,4 6,5 6,0

GM_A73977

R1 15,6 10,6 4,9 41,1 7,9 5,2

GM_A73611

R1 18,4 12,2 3,9 41,4 4,7 8,9

GM_A74014

R1 16,3 11,0 3,9 41,9 5,5 7,6

GM_A74462

R1 15,4 10,1 4,8 42,3 7,0 6,0

GM_A74410

R1 15,7 8,1 4,0 42,6 7,2 6,0

GM_A73997

R1 13,0 13,6 4,8 42,8 6,0 7,1

GM_A73590

R1 14,8 8,4 4,3 42,8 8,0 5,3

GM_A73633

R1 18,3 9,3 3,4 43,3 4,8 9,1

GM_A73645

R1 14,4 8,0 4,5 43,4 8,0 5,4

GM_A74474

R1 15,1 11,4 3,9 43,5 5,6 7,8

GM_A74440

R1 15,5 7,7 4,4 43,8 7,6 5,7

GM_A74155

R1 12,5 8,8 4,3 43,9 8,8 5,0

GM_A73603

R1 15,1 8,1 4,5 44,0 7,3 6,0

GM_A74170

R1 14,5 13,6 3,6 44,1 3,7 11,8

GM_A73675

R1 15,4 12,8 3,9 44,4 4,2 10,5

GM_A74016

R1 14,0 10,7 4,1 44,6 6,1 7,3

GM_A73963

R1 11,8 8,0 4,2 44,9 9,0 5,0

GM_A73617

R1 15,6 7,4 3,7 45,0 6,8 6,6

GM_A74263

R1 13,3 9,4 4,6 45,0 8,2 5,5

GM_A74511

R1 12,6 7,0 4,1 45,2 9,3 4,9

GM_A74422

R1 12,0 8,1 4,7 45,6 9,8 4,7

GM_A74176

R1 13,8 8,6 4,2 45,7 7,6 6,0

GM_A73598

R1 14,6 8,8 3,6 45,8 5,9 7,8

GM_A74463

R1 15,3 9,3 3,9 45,9 5,3 8,7

GM_A74259

R1 13,5 12,4 4,2 46,1 5,8 7,9

(cont.)

Ácidos grasos (porcentaje en peso)

Linaje Gen Oleico LA ALA GLA SDA GLA/SDA

GM_A74166 R1 14,0 10,3 3,8 46,1 5,5 8,4

GM_A73588 R1 10,6 10,3 4,6 46,3 7,6 6,1

GM_A74160 R1 16,9 10,1 2,8 46,4 2,5 18,3

GM_A73971 R1 15,5 10,4 2,9 47,0 3,1 15,0

GM_A74451 R1 12,7 10,5 3,7 47,9 6,0 7,9

GM_A73981 R1 12,9 7,2 2,8 50,3 5,3 9,5

Todos los acontecimientos transgénicos de pMON94002 en la Tabla 3 acumulan cantidades medibles de GLA y SDA. En todos los casos, los niveles de GLA fueron mayores que los de SDA, variando los valores de GLA del 3,1% 5 al 50,3% y variando los valores de SDA del 0,4% al 9,8%. El máximo valor de una sola semilla para GLA se observó en el acontecimiento GM_A73981, que contenía un 50,3% de GLA y un 5,3% de SDA. El acontecimiento GM_A74160 tiene la máxima relación de GLA/SDA de 18,3. De los 41 acontecimientos mostrados anteriormente, 31 tuvieron valores de GLA >40% en al menos tres de cuatro semillas. Cuando aumentan los valores de GLA, los niveles de LA se reducen significativamente empezando los valores al 56% y reduciéndose hasta el 6,7%. Los

10 valores de OA y ALA también se redujeron al aumentar los AGPI, pero no en la misma medida que LA.

Ejemplo 4

Actividad de la desaturasa 6 de Tetraselmis suecica en Canola y Arabidopsis

La actividad de la desaturasa 6 de Tetraselmis suecica se evaluó por transformación de Arabidopsis y canola con pMON82848 (TsD6D-1, FIG. 3) y pMON82849 (TsD6D-2, FIG. 4). Los genes de TsD6D-1 y -2 de T. suecica nativos

15 se dirigen por un promotor constitutivo de 35S.

pMON82848 se construyó en 2 etapas. En primer lugar, se añadió una secuencia Kozak de dicotiledóneas consenso a la secuencia codificante de TsD6D por PCR a partir de pMON67034 usando los cebadores TsD6D-F2: 5’-AAAAATGGGCAGGGGTGGGTTTACT-3’ (SEC ID Nº: 16) y TsD6D-R1: 5’- CTAAGCAAGTGCCGCGATGTCCG -3’ (SEC ID Nº: 10) y después ligando el fragmento resultante a pCR2.1-TOPO (Invitrogen) para dar pMON82833. El

20 vector pMON82833 después se digirió con XhoI y SacI y el fragmento resultante se ligó a pMON73273 digerido con Sall/SacI para dar pMON82848. El vector binario pMON82849 se construyó de una forma similar usando la variante TsD6D-2.

Se obtuvieron explantes transformados que contenían pMON82848 y pMON82849 por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Se regeneraron plantas a partir del tejido transformado. Las plantas cultivadas en

25 invernadero después se analizaron con respecto a la composición de aceites. La composición de ácidos grasos de hojas liofilizadas se determinó por análisis de CG de lípidos derivados de éster metílico como se ha hecho anteriormente para los transformantes de soja y se muestra en las Tablas 4 y 5. Los niveles de OA, LA, GLA, ALA y SDA se expresan como porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos.

El análisis de CG de hoja de canola de plantas transformadas con pMON82848 produjo 33 acontecimientos,

30 variando los niveles de GLA del 0,7% al 21,5% y variando los niveles de SDA del 0,5% al 12,9%, respectivamente. Los valores de GLA son sistemáticamente mayores que los valores de SDA, dando relaciones de GLA/SDA de 1,1 a 2,2. La línea Ebony no transgénica se incluye como control negativo mostrando altos niveles de ALA al 54,6%, menores niveles de LA al 13,5% y cantidades no medibles de GLA y SDA. El acontecimiento BN_G13396 tiene el máximo nivel de GLA al 21,5% con LA al 6,6%. El acontecimiento BN_G13295 contenía un 12,9% de SDA, que es el

35 mayor valor observado para esta serie de plantas de canola. El ácido oleico mostró un ligero aumento desde el control de Ebony del 1,3% hasta un valor tan alto como del 3,6% en el acontecimiento BN_G13299. ALA se vio afectado negativamente empezando al 54,6% en el control de Ebony y reduciéndose a un valor tan bajo como del 22,2% en el acontecimiento BN_G13296.

Tabla 4: Resultados de porcentaje de área relativa a partir de hojas R1 de Canola transformada con pMON82848

Ácidos Grasos (porcentaje en peso)

Acontecimiento

Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

EBONY

VARIEDAD 1,4 14,3 0,0 54,2 0,0 -

BN_G13292

R0 1,9 16,8 0,7 49,5 0,5 1,4

BN_G13286

R0 1,9 16,1 2,1 47,6 1,9 1,1

BN_G13320

R0 1,7 11,2 7,2 40,8 5,3 1,3

BN_G9283

R0 1,0 6,7 9,4 32,1 8,1 1,2

BN_G9282

R0 0,9 6,0 10,1 30,6 7,8 1,3

BN_G13336

R0 2,3 14,3 10,5 34,0 6,6 1,6

BN_G9281

R0 1,1 6,1 10,9 28,9 8,7 1,2

BN_G13299

R0 3,6 11,0 12,7 30,0 9,0 1,4

BN_G13367

R0 2,3 8,1 14,5 30,1 9,8 1,5

BN_G13351

R0 2,4 7,4 14,7 29,8 10,8 1,4

BN_G13297

R0 2,8 7,9 14,9 26,6 12,0 1,2

BN_G13289

R0 2,5 8,8 15,2 29,0 9,9 1,5

BN_G13339

R0 2,7 8,0 15,6 26,7 10,0 1,6

BN_G13291

R0 2,0 6,5 16,2 29,1 10,3 1,6

BN_G13337

R0 2,4 9,0 16,2 27,9 10,1 1,6

BN_G13369

R0 2,8 8,1 16,4 27,4 9,3 1,8

BN_G13334

R0 2,0 8,9 16,5 29,0 9,6 1,7

BN_G13295

R0 2,8 6,5 16,6 24,1 12,9 1,3

BN_G13346

R0 2,6 9,3 16,7 26,6 9,3 1,8

BN_G13298

R0 2,7 9,0 16,8 27,9 9,6 1,7

BN_G13342

R0 3,4 11,5 17,0 26,3 9,1 1,9

BN_G13327

R0 2,2 9,3 17,0 28,2 9,2 1,8

BN_G13344

R0 2,7 7,6 17,2 26,6 9,8 1,8

BN_G13294

R0 2,5 5,9 17,4 27,5 9,9 1,8

BN_G13324

R0 1,4 7,0 17,5 27,8 11,3 1,6

BN_G13341

R0 2,6 8,9 18,3 26,0 9,4 1,9

BN_G13332

R0 2,7 8,1 18,8 24,7 10,0 1,9

BN_G13288

R0 2,5 7,4 18,8 25,5 9,9 1,9

BN_G13296

R0 3,0 7,2 20,0 22,2 11,7 1,7

BN_G13340

R0 2,4 9,0 20,1 25,5 9,6 2,1

BN_G13383

R0 2,5 6,1 20,5 23,5 10,0 2,1

(cont)

Ácidos Grasos (porcentaje en peso)

Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

BN_G13347 R0 2,1 7,4 20,5 25,0 10,1 2,0 BN_G13396 R0 2,3 6,6 21,5 24,0 9,9 2,2

En la Tabla 5 se muestran los resultados de GC para 31 acontecimientos de pMON82849 de Canola. El patrón de más GLA que SDA es coherente con lo observado para plantas pMON82848 con relaciones de GLA/SDA que varían de 1,0 a 2,3. El acontecimiento BN_G13422 tiene el máximo nivel de GLA al 21,9%, que es muy similar al mayor valor de pMON82848 del 21,5% (acontecimiento BN_G13996).

Tabla 5: Resultados de porcentaje de área relativa a partir de hojas R1 de Canola transformada con pMON82849 Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

BN_G9624 R0 1,4 13,2 3,0 45,4 2,5 1,2 BN_G13441 R0 3,0 15,5 5,6 39,9 5,3 1,1 BN_G9307 R0 0,6 5,0 9,9 32,7 9,5 1,0 BN_G13425 R0 2,3 9,6 11,6 32,4 10,0 1,2 BN_G13460 R0 3,2 13,2 11,7 32,3 7,6 1,5 BN_G13309 R0 2,1 8,3 11,8 30,9 11,3 1,0 BN_G13440 R0 2,9 13,8 12,1 31,9 8,0 1,5 BN_G9364 R0 1,0 4,9 13,5 29,0 8,6 1,6 BN_G13448 R0 2,5 7,7 14,6 28,0 11,9 1,2 BN_G13433 R0 2,8 11,5 14,6 29,1 9,3 1,6 BN_G13313 R0 2,1 6,4 15,3 28,3 11,0 1,4 BN_G13305 R0 2,5 6,1 15,7 25,2 12,2 1,3 BN_G13317 R0 2,6 6,3 16,2 27,6 11,4 1,4 BN_G13489 R0 3,6 7,8 16,6 24,4 13,4 1,2 BN_G13436 R0 3,2 9,9 16,7 26,9 9,7 1,7 BN_G13314 R0 3,1 7,4 16,8 22,8 12,3 1,4 BN_G13319 R0 2,7 7,2 17,1 26,0 10,8 1,6 BN_G13431 R0 1,8 7,0 17,2 29,5 9,2 1,9 BN_G13302 R0 2,5 7,3 17,9 24,0 12,6 1,4 BN_G13308 R0 2,9 10,3 17,9 24,4 10,2 1,7 BN_G13315 R0 1,5 6,5 18,1 25,1 12,8 1,4 BN_G13434 R0 2,7 9,8 18,2 25,4 9,4 1,9 BN_G13300 R0 3,0 8,5 18,6 23,0 11,4 1,6 BN_G13310 R0 1,9 6,6 18,8 25,9 10,7 1,8

(cont.)

Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

BN_G3311 R0 3,0 7,5 19,3 23,8 10,5 1,8 BN_G13306 R0 2,0 7,5 19,4 21,6 13,2 1,5 BN_G13316 R0 2,6 6,1 20,1 23,9 11,1 1,8 BN_G13318 R0 2,4 6,7 20,9 23,0 11,4 1,8 BN_G13428 R0 2,6 7,3 21,3 25,8 8,9 2,4 BN_G13304 R0 2,1 6,8 21,6 22,0 11,0 2,0 BN_G13422 R0 2,5 6,4 21,9 23,7 9,7 2,3

La composición de ácidos grasos de semillas maduras recogidas a partir de los mismos acontecimientos pMON82848 y pMON82849 se determinó por análisis de CG de lípidos derivados de éster metílico como se ha hecho anteriormente para soja transgénica y se muestra en las Tablas 6 y 7. Los niveles de OA, LA, GLA, ALA y

5 SDA se expresan como un porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos.

El análisis de CG de semillas de canola de plantas transformadas con pMON82848 produjo 32 acontecimientos variando los niveles de GLA y SDA desde el 1,4% al 5,9% y desde el 0,0% al 1,5%, respectivamente (% en peso, conjunto de 100 semillas). Los valores de GLA son sistemáticamente mayores que los valores de SDA dando relaciones de GLA/SDA de 3,6 a 6,1. A esta generación, las plantas son hemicigotas para el transgén y, por lo tanto, 10 las semillas R1 reunidas representan una población de segregación de homogocitos, hemicigotos y nulos. La línea Ebony no transgénica se incluye como control negativo con un 70,9% de Ácido Oleico, un 15,7% de LA, un 5,8% de ALA y cantidades no medibles de GLA o SDA. El acontecimiento BN_G13368 tiene el máximo nivel de GLA al 5,9% con LA al 10,6%, que se reduce desde el nivel no transgénico del 15,7%. Los acontecimientos BN_G13295 y BN_G13368 contenían un 1,5% de SDA, que es el máximo valor observado para esta serie de plantas de canola.

15 OA y ALA se vieron menos afectados por niveles crecientes de GLA que LA. Aunque los acontecimientos BN_G13367 y BN_G13299 tenían entre un 1,6% y un 2,0% de GLA, respectivamente, ninguno contenía cantidades medibles de SDA.

Tabla 6: Resultados de porcentaje de área relativa media a partir de 100 semillas R1 individuales de Canola transformada con pMON82848 Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

EBONY VARIEDAD 70,9 15,7 0,0 5,8 0,0 NA BN_G13336 R1 67,8 17,2 1,4 6,0 0,4 3,9 BN_G13342 R1 71,8 14,3 1,5 5,1 0,3 4,5 BN_G13367 R1 71,3 14,0 1,6 5,1 0,0 NA BN_G13299 R1 69,4 15,3 2,0 5,5 0,0 NA BN_G13297 R1 68,9 15,2 2,3 5,0 0,5 4,9 BN_G13334 R1 65,5 17,5 2,4 7,0 0,6 4,0 BN_G13339 R1 67,5 16,5 2,5 5,6 0,6 4,6

BN_G9283 R1 65,7 17,1 2,6 6,2 0,7 3,6 BN_G9281 R1 66,7 16,6 2,6 6,4 0,7 3,9 BN_G13337 R1 70,3 14,1 2,7 5,1 0,6 4,5 BN_G13286 R1 67,0 16,4 2,7 6,0 0,7 4,0

(cont.)

Ácidos Grasos (porcentaje en peso)

Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

BN_G13327 R1 69,7 14,3 2,8 5,2 0,6 4,5 BN_G13298 R1 68,2 15,7 2,9 5,1 0,6 5,0 BN_G13346 R1 67,7 15,3 3,1 5,9 0,7 4,3 BN_G13351 R1 63,9 18,2 3,2 6,7 0,7 4,3 BN_G13289 R1 66,8 15,1 3,4 4,5 0,6 6,1 BN_G13296 R1 68,7 14,5 3,4 4,8 0,7 5,2 BN_G13369 R1 65,1 16,3 3,5 7,1 0,9 3,9 BN_G13324 R1 66,5 16,2 3,5 5,9 0,8 4,2 BN_G13291 R1 65,9 15,0 3,6 5,0 0,7 5,6 BN_G13340 R1 69,3 14,4 3,8 4,3 0,8 4,9 BN_G13344 R1 67,1 15,5 4,0 5,4 0,9 4,7 BN_G9282 R1 64,5 16,5 4,0 6,2 1,2 3,4 BN_G13347 R1 66,5 15,8 4,1 5,1 0,8 5,2 BN_G13341 R1 66,6 15,9 4,1 5,0 0,8 5,4 BN_G13396 R1 68,6 13,4 4,3 5,2 1,1 4,1 BN_G13332 R1 67,2 14,9 4,7 5,0 1,0 4,7 BN_G13294 R1 63,7 17,3 4,7 5,7 1,0 4,9 BN_G13288 R1 66,9 13,4 5,0 5,7 1,3 4,0 BN_G13295 R1 67,9 11,0 5,1 4,3 1,5 3,3 BN_G13383 R1 65,9 14,7 5,7 4,9 1,2 4,9 BN_G13368 R1 68,7 10,7 5,9 4,5 1,5 3,9

En la Tabla 7 se muestran los resultados de GC para 30 acontecimientos de Canola pMON82849. El patrón de más GLA que SDA es coherente con lo observado para plantas pMON82848 con relaciones de GLA/SDA que varían de 3,1 a 6,0. El acontecimiento BN_G13316 tiene el máximo nivel de GLA al 8,3%, que es ligeramente mayor que el máximo valor de pMON82848 del 5,9% (acontecimiento BN_G13368).

Tabla 7: Resultados de porcentaje de área relativa media a partir de 100 semillas R1 individuales de Canola transformada con pMON82849 Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

BN_G9397 R1 59,9 19,7 1,9 9,0 0,5 4,2 BN_G13313 R1 69,7 14,2 1,9 6,2 0,5 4,0 BN_G13425 R1 74,3 11,1 2,0 3,7 0,5 4,1 BN_G13440 R1 72,1 13,2 2,0 4,7 0,5 3,7 BN_G13433 R1 71,7 14,1 2,1 4,3 0,5 4,1

(cont.)

Ácidos Grasos (porcentaje en peso)

Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

BN_G9307 R1 68,1 15,4 2,1 6,1 0,6 3,3 BN_G13460 R1 68,0 15,7 2,1 6,4 0,6 3,5 BN_G13302 R1 68,7 14,1 2,7 6,1 0,7 4,0 BN_G13306 R1 68,8 13,4 2,9 6,3 0,8 3,7 BN_G13448 R1 68,1 15,7 3,0 5,2 0,7 4,4 BN_G13431 R1 70,7 13,5 3,2 4,4 0,8 4,3 BN_G13436 R1 71,3 12,8 3,3 4,4 0,7 4,9 BN_G13319 R1 68,7 14,2 3,4 5,3 0,7 4,6 BN_G13311 R1 72,3 11,5 3,5 4,3 0,7 4,9 BN_G13434 R1 66,5 16,2 3,6 5,6 0,8 4,5 BN_G13308 R1 69,2 12,8 3,7 3,8 0,6 6,0 BN_G13309 R1 71,7 10,9 3,7 4,3 0,9 4,4 BN_G13422 R1 71,5 11,1 3,8 4,4 1,2 3,2 BN_G13300 R1 67,4 14,1 4,1 5,6 1,0 4,1 BN_G13310 R1 70,6 12,2 4,3 4,4 0,8 5,1 BN_G13428 R1 73,6 9,2 4,4 3,8 1,1 3,9 BN_G13305 R1 65,5 14,8 4,6 6,3 1,1 4,2 BN_G13314 R1 65,3 13,4 4,7 4,6 0,9 5,6 BN_G13489 R1 63,6 16,4 4,8 6,0 1,3 3,6 BN_G9364 R1 63,6 15,4 4,9 7,1 1,6 3,1 BN_G13304 R1 69,8 12,4 4,9 4,1 1,0 5,2 BN_G13318 R1 70,1 9,8 6,3 3,4 1,2 5,3 BN_G13317 R1 61,2 15,9 6,4 5,6 1,6 4,1 BN_G13315 R1 63,2 15,1 6,6 5,5 1,5 4,4 BN_G13316 R1 61,7 13,7 8,3 4,7 1,9 4,5

pMON82848 y pMON82849 también se introdujeron por transformación en Arabidopsis para determinar la composición de ácidos grados en hojas y semillas. Se obtuvieron explantes transformados que contenían pMON82848 y pMON82849 por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las plantas se

5 regeneraron a partir del tejido transformado. Después, las plantas cultivadas en invernadero se analizaron con respecto a la composición de aceite.

El efecto de la expresión de TsD6D-1 y TsD6D-2 se midió determinando la composición de ácidos grasos de hoja de Arabidopsis por cromatografía de gases de derivados de éster metílico de lípidos (documento PCT US03/16144, presentado en 21 de mayo de 2003, cuya divulgación entera se incorpora específicamente en la presente memoria

10 por referencia). Las hojas de Arabidopsis se recogieron a partir de plantas jóvenes y se liofilizaron para retirar toda la humedad antes de la derivatización. En la Tabla 8 se muestran los niveles de OA, LA, GLA, ALA y SDA expresados como porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos para 12 acontecimientos de pMON82848. Como control negativo se incluye el ecotipo no transgénico Columbia.

Tabla 8: Resultados de porcentaje de área relativa a partir de hojas R1 de Arabidopsis transformado con pMON82848 Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

Columbia VARIEDAD 1,6 13,6 0,0 53,3 0,0 -

AT_G2951 R1 3,1 14,4 4,0 38,9 3,0 1,4

AT_G2951 R1 9,7 15,4 5,5 29,1 3,4 1,6

AT_G2951 R1 5,0 14,0 5,9 34,4 3,8 1,5

AT_G2951 R1 4,3 15,5 5,9 33,4 3,9 1,5

AT_G2951 R1 5,3 14,6 5,9 34,3 4,3 1,4

AT_G2951 R1 5,2 12,8 6,4 33,8 4,6 1,4

AT_G2951 R1 7,5 14,9 7,3 29,4 4,3 1,7

AT_G2951 R1 6,9 14,4 7,9 29,3 4,8 1,7

AT_G2951 R1 7,4 14,6 9,3 26,7 6,1 1,5

AT_G2951 R1 3,7 10,8 10,4 30,7 6,8 1,5

AT_G2951 R1 5,9 12,8 10,6 27,1 6,1 1,7

AT_G2951 R1 3,2 8,2 17,4 20,5 6,8 2,5

La Tabla 8 muestra que TsD6D es capaz de alterar la composición de ácidos grasos de hojas de Arabidopsis. En

5 todos los acontecimientos indicados anteriormente, los valores son mayores para GLA que SDA, que es similar al patrón de ácidos grasos observado en canola transgénica y semillas de soja. El aumento en GLA y SDA fue a expensas de ALA, que se reduce desde un valor no transgénico del 62,8% a un valor bajo del 20,5% observado en el acontecimiento AT_G29511. Este acontecimiento tenía el máximo nivel de GLA (17,4%) y SDA (6,8%). Es interesante destacar que aunque el nivel de ALA es 4,5 veces mayor que el de LA, los niveles de GLA son

10 sistemáticamente mayores que los de SDA, demostrando de nuevo la preferencia que tiene TsD6D por el sustrato omega-6.

En la Tabla 9 se muestran los resultados de CG para 12 acontecimientos de Arabidopsis de pMON82849. El patrón de más GLA que SDA es coherente con lo observado para plantas pMON82848 con relaciones de GLA/SDA que varían de 1,4 a 1,9. El acontecimiento AG_G2952 tiene el mayor nivel de GLA al 9,9% en comparación con el mayor

15 valor de GLA del 17,4% para el acontecimiento AT_G2951 (pMON82848).

Tabla 9: Resultados de porcentaje de área relativa a partir de hojas R1 de Arabidopsis transformado con pMON82849 Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

AT_G2952 R1 5,5 16,1 4,6 33,5 3,0 1,6 AT_G2952 R1 4,4 14,0 5,2 36,2 3,7 1,4 AT_G2952 R1 3,7 15,3 5,4 35,6 3,7 1,5 AT_G2952 R1 6,2 15,7 5,4 32,4 3,4 1,6 AT_G2952 R1 4,8 20,1 6,2 31,8 3,3 1,9 AT_G2952 R1 3,3 14,9 6,6 33,2 4,3 1,5 AT_G2952 R1 3,7 12,1 6,8 35,3 4,7 1,4

(cont.)

Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

AT_G2952 R1 3,4 15,0 7,1 32,7 4,2 1,7 AT_G2952 R1 6,7 14,8 7,5 27,0 4,1 1,9 AT_G2952 R1 3,5 13,8 7,9 31,0 5,4 1,5 AT_G2952 R1 2,9 13,1 8,2 33,1 5,5 1,5 AT_G2952 R1 3,8 13,0 9,9 31,3 5,3 1,9

La composición de ácidos grasos de semillas R2 maduras de Arabidopsis se determinó por análisis de CG de lípidos derivados de éster metílico como se ha hecho anteriormente para semillas de soja. En la Tabla 10 se muestran los valores de semillas reunidas de 20 acontecimientos transgénicos de pMON82848 (% en peso, conjunto de 100

5 semillas). Los niveles de GLA y SDA varían del 0,8% al 14,2% y del 0,3% al 2,8% respectivamente. Los valores de GLA son sistemáticamente mayores que los valores de SDA. En esta generación R1, las plantas son hemicigotas para el transgén y, por lo tanto, las semillas R2 reunidas representan una población de segregación de homocigotos, hemicigotos y nulos. La línea Columbia no transgénica se incluye como control negativo. El acontecimiento AT_G2914 tiene el máximo nivel de GLA al 14,3% con SDA al 2,7%.

10 Tabla 10: Resultados de porcentaje de área relativa media a partir de semillas de Arabidopsis transformado con pMON82848

Ácidos Grasos (porcentaje en peso)

Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

Columbia VARIEDAD 15,4 28,3 0,0 17,9 0,0 NA AT_G2929 R2 17,4 26,8 0,8 16,5 0,3 2,7 AT_G2926 R2 15,8 25,7 1,9 17,1 0,6 3,0 AT_G2923 R2 18,3 22,5 6,0 13,2 1,7 3,5 AT_G2913 R2 17,5 22,6 6,1 13,5 1,7 3,5 AT_G2917 R2 16,1 22,6 6,1 14,5 1,9 3,3 AT_G2912 R2 17,0 21,8 6,6 13,7 1,7 3,9 AT_G2928 R2 15,2 22,2 6,7 15,1 1,5 4,4 AT_G2915 R2 16,4 22,1 7,0 14,3 1,3 5,4 AT_G2918 R2 18,0 21,5 7,5 12,7 1,6 4,6 AT_G2922 R2 16,9 20,4 8,2 12,9 2,4 3,5 AT_G2916 R2 16,7 20,5 8,4 12,8 2,2 3,8 AT_G2925 R2 16,8 20,3 8,8 12,6 2,0 4,3 AT_G2924 R2 16,5 20,1 9,8 11,9 2,2 4,4 AT_G2911 R2 16,8 19,6 9,9 12,2 2,1 4,6 AT_G2919 R2 17,1 19,8 10,2 11,0 2,3 4,4 AT_G2930 R2 15,4 19,0 11,3 12,1 2,6 4,4 AT_G2927 R2 15,6 18,5 12,0 12,2 2,3 5,2 AT_G2921 R2 16,6 17,1 13,2 10,7 2,9 4,6

(cont.)

Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

AT_G2920 R2 16,4 16,2 14,2 10,7 2,8 5,1

AT_G2914 R2 17,9 16,1 14,3 9,8 2,7 5,3

Los resultados de CG para 12 acontecimientos de Arabidopsis de pMON82849 se muestran en la Tabla 11. El patrón de más GLA que SDA es coherente con lo observado para plantas pMON82848 con relaciones de GLA/SDA que varían de 3,2 a 5,1. El acontecimiento AT_G2947 tiene el máximo nivel de GLA al 13,3%, que es muy similar al

5 máximo valor de GLA del 14,3% para el acontecimiento AT_G2914 (pMON82848).

Tabla 11: Resultados de porcentaje de área relativa media a partir de semillas de Arabidopsis transformado con pMON82849 Ácidos Grasos (porcentaje en peso) Acontecimiento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA

AT_G2946 R2 16,3 25,9 1,5 17,1 0,4 3,8 AT_G2949 R2 16,4 26,2 1,9 16,6 0,4 4,4 AT_G2945 R2 17,1 23,7 5,1 13,6 1,4 3,8 AT_G2932 R2 17,2 22,1 6,7 13,5 1,7 4,0 AT_G2936 R2 17,9 20,3 8,7 12,1 2,1 4,2 AT_G2939 R2 18,6 18,1 10,3 11,1 2,1 4,9 AT_G2944 R2 18,2 20,2 8,2 11,8 2,3 3,6 AT_G2938 R2 16,3 21,2 7,5 13,5 2,3 3,3 AT_G2943 R2 16,1 21,8 7,5 13,1 2,3 3,2 AT_G2931 R2 16,5 17,5 12,5 11,6 2,5 5,0 AT_G2950 R2 16,3 16,7 13,3 10,9 2,6 5,1 AT_G2942 R2 16,4 19,8 9,5 12,1 2,7 3,6 AT_G2935 R2 17,0 18,8 10,9 11,4 2,7 4,1 AT_G2941 R2 17,1 19,0 9,3 12,1 2,7 3,4 AT_G2948 R2 16,4 18,7 10,6 11,9 2,7 3,9 AT_G2940 R2 17,3 17,1 13,0 9,9 2,8 4,7 AT_G2934 R2 17,4 17,0 12,5 10,6 2,9 4,3 AT_G2937 R2 15,9 17,8 12,4 11,6 3,1 3,9 AT_G2947 R2 15,7 17,2 13,3 10,9 3,3 4,0

Ejemplo 5

10 Expresión de desaturasa 6 de Tetraselmis suecica en maíz

Para la expresión específica de semillas de la desaturasa delta-6 de Tetraselmis suecica en maíz, se clonó TsD6D-1 bajo el control del promotor L3 de maíz en pMON94502 (FIG. 5) con la 3’-UTR de glutelina de arroz para la terminación de la traducción. Este vector también contenía un casete de expresión de desaturasa delta-15 de Neurospora crassa (SEC ID Nº: 17) dirigida por L3. El casete de expresión de delta-15 utilizaba la secuencia de

terminación de la traducción de HSP17 de trigo como 3’UTR.

Adicionalmente, se diseñó y construyó un vector que contenía el gen de TsD6D-1 modificado para la expresión en plantas monocotiledóneas. Es bien sabido en la técnica que las secuencias codificantes de proteínas no endógenas pueden no expresarse bien en plantas (Patente de Estados Unidos Nº 5.880.274, incorporada en la presente 5 memoria por referencia). Por lo tanto, usando la secuencia del polipéptido TsD6d-1 nativa (SEC ID Nº: 2), se diseñó una secuencia polinucleotídica que codificaba la proteína TsD6D-1 modificada y se construyó 1) usando una desviación del uso de codones similar a la de proteínas monocotiledóneas de alta expresión y 2) retirando elementos desestabilizadores del ARN previamente caracterizados y que se sabe que afectan a la estabilidad del ARNm en plantas (Patente de Estados Unidos Nº 5.880.275). La secuencia polinucleotídica de TsD6D-1 modificada resultante

10 se denominó TsD6Dnno (SEC ID Nº: 18) y codifica un polipéptido idéntico en secuencia al polipéptido TsD6D nativo (SEC ID Nº: 2). TsD6Dnno se clonó en un vector binario que por lo demás era idéntico a pMON94502. El nuevo vector binario se denominó pMON94503 (FIG. 6).

Se obtuvieron explantes transformados que contenían pMON94502 o pMON94503, respectivamente, por transformación mediada por Agrobacterim tumefaciens. Se regeneraron plantas a partir del tejido transformado. Las

15 plantas cultivadas en invernadero después se analizaron con respecto a la composición de aceite. Para todos los acontecimientos transgénicos que se obtuvieron, se analizaron diez semillas R1 con respecto a la composición de ácidos grasos. Las composiciones medias de ácidos grasos de las semillas que presentaron el rasgo transgénico se muestran en las Tablas 12 y 13. Las semillas individuales de mejor comportamiento contenían un 18,6% de SDA, y la semilla de mejor comportamiento con respecto a los niveles de GLA contenía un 30,9% de GLA.

20 Tabla 12: Composición de ácidos grasos de acontecimientos que contienen pMON94502.

Acontecimiento % OA % LA % ALA % GLA % SDA GLA/SDA

ZM_S137162

0,3 22,5 5,4 25,7 6,9 3,7

ZM_S137159

0,9 19,5 6,7 26,1 8,7 3,0

ZM_S137155

1,3 15,0 7,6 25,1 12,6 2,0

ZM_S137149

0,1 24,0 6,6 23,2 7,7 3,0

Tabla 13: Composición de ácidos grasos de acontecimientos que contienen pMON94503. Acontecimiento % Ole % LA % ALA % GLA % SDA GLA/SDA

ZM_S139635 22,8 22,2 7,2 21,9 8,0 2,7

ZM_S139623 22,7 20,3 7,2 22,2 9,1 2,4

ZM_S139618 22,6 33,1 19,5 4,2 3,4 1,3

ZM_S139616 22,0 27,5 7,0 19,7 5,8 3,4

ZM_S139613 21,9 16,4 7,6 23,8 11,8 2,0

ZM_S139542 22,4 23,6 7,2 21,2 7,0 3,0

ZM_S139458 22,4 19,2 7,1 23,0 9,4 2,5

Ejemplo 6

25 Expresión de desaturasa 6 de Tetraselmis suecica en relación con otras desaturasas

Para algunas aplicaciones, puede ser ventajoso optimizar la biosíntesis de GLA o la biosíntesis de SDA para maximizar los niveles de GLA o SDA en el aceite. Cada especie de cultivo varía con respecto a su composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla. Como resultado, la estrategia específica para optimizar la biosíntesis de GLA o SDA puede variar ligeramente de un cultivo a otro. Para optimizar la biosíntesis de SDA, es ventajoso 30 combinar la expresión de una desaturasa delta-6 con una desaturasa delta-15 para maximizar el ALA del conjunto de sustratos para que la desaturasa delta-6 produzca SDA. Por ejemplo, para obtener un aceite de semillas con un nivel maximizado de SDA, se clonan la desaturasa delta-15 de Mortierella alpina y la desaturasa delta-6 de T. suecica bajo el control de promotores fuertes específicos de semilla utilizando el promotor más fuerte para la desaturasa delta-15. La construcción se introduce en una planta por transformación y las semillas R1 de esas

35 plantas se analizan con respecto a la composición de ácidos grasos.

Algunas plantas tales como canola o los olivos producen aceites de semillas con cantidades sustanciales de ácidos grasos monoinsaturados (ácido oleico). Para convertir el ácido oleico en un sustrato para la formación de SDA, es deseable convertir OA en LA. Esto se consigue por la adición de una desaturasa delta-12 a la combinación de desaturasas descrita anteriormente. Por ejemplo, una desaturasa delta-12 de N. Grassa (Publicación PCT

5 WO2003099216 (Ursin y col.)), una desaturasa delta-15 de N. crassa y una desaturasa delta-6 de T. suecica se clonan bajo el control de promotores específicos de semilla y se utilizan para transformar plantas. Las semillas R1 de estas plantas se analizan con respecto a la composición de ácidos grasos.

Se demuestra un ejemplo de optimización de los niveles de ácidos grasos en soja. La actividad de la desaturasa 6 de T. suecica se evaluó en semillas de soja combinándola con una desaturasa 15 potenciada por codones de 10 dicotiledónea de M. alpina (MaFad3nno) (SEC ID Nº: 19) para dar pMON94060 (FIG. 7). El vector pMON94060 se construyó en 6 etapas. En primer lugar, se añadieron los sitios de restricción Salt y Sse8387 I a los extremos de la secuencia codificante de TsD6D-1 (CDS) por amplificación por PCR a partir de pMON67034 (TsD6d-1 en pYES2.1) usando los oligonucleótidos TsD6D-F3: 5’-GTCGACAAACAATGGGCAGGGGTGGGTTTA-3’ (SEC ID Nº: 14) y TsD6D-R3: 5’-CCTGCAGGCTAAGCAAGTGCCGCGATGTC-3’ (SEC ID Nº: 15) para dar pMON67051. La CDS de 15 TsD6D-1 después se puso detrás del promotor de 7Sa específico de semilla por digestión de pMON67051 con Sall y Sse8387I y ligamiento del fragmento resultante en pMON67052 digerido con Xhol/Sse8387I para dar pMON67053. El casete de expresión 7Sa::TsD6D-1::E9 después se introdujo en un vector binario de plantas, dando como resultado pMON94055. Se añadieron sitios de restricción, Sall y Sse8387I, a los extremos de la CDS de MaFad3nno por amplificación por PCR a partir de pMON10351 (MaFad3nno en pYES2.1), usando los oligonucleótidos MaD15D 20 F1: 5’-GTCGACAAACAATGGCGCCACCACACGTAGTAGA-3’ (SEC ID Nº: 20) y MaD15D R1: 5’-CCTGCAGGTTAGTGCTTGTAGAACACCACATCTCC-3’ (SEC ID Nº: 21) para dar pMON94047. La CDS de MaFad3nno después se puso detrás del promotor de eUSP88 específico de semillas por digestión de pMON94047 con Sall y Sse8387I y ligamiento del fragmento resultante en pMON68776 digerido con XhoI/Sse8387I para dar pMON94049. Después, el casete de expresión eUSP88::MaFad3nno::Nos se introdujo en pMON94055, dando como

25 resultado pMON94060.

Se obtuvieron explantes transformados que contenían pMON94060 por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Se regeneraron plantas a partir del tejido transformado. Las plantas cultivadas en invernadero después se analizaron con respecto a la composición de aceite. El efecto de la expresión de la secuencia codificante de TsD6D-1 junto con MaFad3nno se midió determinando la composición de ácidos grasos de semillas maduras por 30 cromatografía de gases de derivados de éster metílico de lípidos (documento (PCT US03/16144, presentado el 21 de mayo de 2003, cuya divulgación entera se incorpora específicamente en la presente memoria por referencia). Los niveles de OA (ácido oleico, 18:9 9), LA (ácido linoleico, 18:2 9,12), GLA (ácido y-linolénico, 18:3 6,9,12), ALA (ácido a-linolénico, 18:3, 9,12,15) y SDA (ácido estearidónico, 18:4 6,9,12,15) se expresan como un porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos y se muestran en la Tabla 14. La línea no transgénica A3525 se incluye

35 como un control negativo. Los valores se expresan como una media de no nulos a partir de hasta 8 semillas R1 individuales

Tabla 14: Resultados de porcentaje de área relativa a partir de una sola semilla R1 de soja transformada con pMON94060.

Acontecimiento Oleico LA GLA ALA SDA SDA/GLA GLA/SDA

A3525 17,4 56,1 9,1

GM_A172392 22,8 13,0 36,1 2,8 2,2 0,1 16,2

GM_A172882 14,9 29,6 28,8 5,9 2,5 0,1 11,3

GM_A172335 18,6 10,1 43,1 2,7 2,7 0,1 15,9

GM_A172377 21,4 8,1 38,8 3,0 2,8 0,1 13,9

GM_A172386 20,9 12,7 39,0 3,7 2,9 0,1 13,7

GM_A172342 27,2 7,9 34,8 2,7 3,0 0,1 11,5

GM_A172349 19,0 8,3 40,5 2,7 3,6 0,1 11,1

GM_A172423 19,4 12,6 37,0 4,1 7,4 0,2 5,0

GM_A172352 21,9 8,2 35,6 3,4 7,5 0,2 4,7

GM_A172900 19,9 27,5 1,0 20,2 12,2 12,7 0,1

GM_A173156 20,2 13,0 2,0 35,4 12,9 6,3 0,2

(cont.)

Acontecimiento

Oleico LA GLA ALA SDA SDA/GLA GLA/SDA

GM_A172866

26,0 28,4 0,7 11,2 13,3 18,8 0,1

GM_A172400

20,6 6,9 29,3 3,8 13,7 0,5 2,1

GM_A172390

23,0 12,4 2,9 24,9 16,1 5,5 0,2

GM_A172897

25,2 25,5 1,1 8,7 16,1 15,4 0,1

GM_A172368

38,8 1,1 0,7 7,1 24,3 34,5 0,0

GM_A172343

18,6 16,2 9,4 7,1 25,1 2,7 0,4

GM_A172365

32,4 2,7 0,5 8,4 25,9 52,2 0,0

GM_A172405

30,1 2,3 2,9 8,4 27,3 9,5 0,1

GM_A172384

12,2 11,8 19,5 6,9 28,3 1,4 0,7

GM_A172883

30,4 3,6 2,1 8,6 28,4 13,7 0,1

GM_A172885

22,2 10,1 3,2 9,9 30,4 9,4 0,1

GM_A172411

22,9 8,9 2,0 9,6 31,2 15,5 0,1

GM_A172356

22,0 8,7 3,4 8,3 31,4 9,1 0,1

GM_A172855

23,7 6,0 5,9 10,7 31,6 5,4 0,2

GM_A172393

19,1 4,9 10,3 8,5 31,7 3,1 0,3

GM_A172889

23,4 4,5 3,8 8,7 32,6 8,7 0,1

GM_A172339

20,5 4,7 3,4 13,7 33,1 9,7 0,1

GM_A172849

23,2 3,7 4,2 8,9 33,7 8,0 0,1

GM_A173155

14,4 15,5 4,4 7,0 34,6 7,9 0,1

GM_A172891

15,6 15,8 5,0 8,7 34,7 6,9 0,1

GM_A172357

24,4 3,8 3,6 8,6 35,0 9,7 0,1

GM_A172888

18,5 10,4 3,4 8,7 35,1 10,5 0,1

GM_A173152

14,8 15,6 5,4 9,2 35,4 6,6 0,2

GM_A172862

21,3 4,9 5,2 8,8 35,7 6,9 0,1

GM_A172421

21,6 5,2 6,1 8,3 36,1 5,9 0,2

GM_A172370

17,0 4,7 4,5 11,9 36,7 8,1 0,1

GM_A172347

20,6 3,3 3,4 8,7 36,8 10,8 0,1

GM_A172389

18,4 5,0 6,6 8,5 37,8 5,7 0,2

GM_A172838

17,6 6,3 3,2 10,9 38,1 12,1 0,1

GM_A172896

14,6 10,4 5,3 10,2 38,1 7,2 0,1

GM_A172860

16,1 10,9 4,3 8,9 38,3 8,8 0,1

GM_A172363

22,3 5,2 6,8 7,4 38,5 5,6 0,2

GM_A172415

17,4 6,2 7,1 9,0 38,5 5,5 0,2

GM_A172852

17,5 8,5 3,9 8,4 38,7 10,0 0,1

(cont.) Acontecimiento Oleico LA GLA ALA SDA SDA/GLA GLA/SDA

GM_A172847 15,0 12,5 5,4 8,9 38,8 7,2 0,1 GM_A172355 12,6 12,7 6,2 8,2 38,8 6,2 0,2 GM_A172408 16,9 6,4 7,3 8,5 39,2 5,4 0,2 GM_A172371 12,5 12,2 7,0 8,0 39,4 5,7 0,2 GM_A172341 17,3 5,8 7,4 8,5 39,5 5,3 0,2 GM_A172871 16,5 9,1 3,9 8,7 40,0 10,2 0,1 GM_A172337 14,5 6,9 5,9 10,0 41,0 6,9 0,1 GM_A172387 16,6 4,3 6,7 8,2 41,1 6,1 0,2 GM_A172417 16,6 5,8 4,3 8,9 41,7 9,6 0,1 GM_A172361 20,9 3,2 2,2 9,2 41,8 19,2 0,1 GM_A172351 15,1 5,8 6,0 9,4 41,9 7,0 0,1 GM_A172880 18,1 4,5 4,2 7,9 42,1 10,0 0,1 GM_A172419 15,0 4,3 6,3 7,7 42,1 6,7 0,2 GM_A172398 14,9 5,2 7,8 7,3 42,4 5,5 0,2 GM_A172854 15,4 3,6 3,5 12,9 42,5 12,3 0,1 GM_A172843 13,5 6,7 7,9 8,0 42,6 5,4 0,2 GM_A172840 13,6 6,3 8,4 7,9 42,9 5,1 0,2 GM_A173157 12,6 6,2 9,2 8,1 43,0 4,7 0,2 GM_A172345 15,2 4,1 5,6 8,0 44,0 7,8 0,1 GM_A172853 14,8 5,1 5,4 9,2 44,0 8,2 0,1 GM_A172372 14,8 5,2 6,5 7,1 44,1 6,7 0,1 GM_A172358 15,9 6,8 3,3 7,6 45,0 13,5 0,1 GM_A172868 13,8 5,0 5,0 8,7 45,5 9,0 0,1 GM_A172884 14,0 4,4 4,9 7,9 46,2 9,4 0,1 GM_A172879 11,9 5,9 5,0 8,8 46,6 9,3 0,1 GM_A172360 12,4 6,4 7,6 7,3 46,7 6,2 0,2 GM_A172858 13,0 4,0 5,1 8,8 46,9 9,3 0,1 GM_A172873 12,7 4,3 5,3 7,9 47,5 8,9 0,1

Todos los acontecimientos transgénicos de pMON94060 de la Tabla 14 acumulan cantidades medibles de GLA y SDA. No se incluyeron valores de semillas individuales menores del 1% para calcular la media para cada acontecimiento individual. Para 10 de los acontecimientos, los niveles de GLA son mayores que los de SDA, pero 5 para los acontecimientos restantes los niveles de SDA/GLA variaban del 1,6% al 52,2%. El máximo valor medio para GLA es del 43,1% observado en el acontecimiento GM_A172335, que sólo tiene un 2,72% de SDA. El acontecimiento GM_A1723765 tiene la máxima relación SDA/GLA de 52,2. El treinta y dos por ciento de los acontecimientos tienen valores de SDA mayores que el 40%. El máximo valor de SDA era un 47,5% en el acontecimiento GM_A172873. Los niveles de LA se redujeron al aumentar los niveles de SDA y variaban del 1,1% al 10 29,6%. Para 38 de los acontecimientos, los niveles de ácido oleico son mayores que el valor de control no transgénico del 17,4%. El máximo valor de ácido oleico fue del 38,8% observado en el acontecimiento

GM_A172368. Los valores de GLA variaban desde un valor bajo de 0,5 en el acontecimiento GM_A172365 a un valor alto del 43,1% en el acontecimiento GM_A172335. En la mayoría de los acontecimientos, los niveles de ALA estuvieron cerca del nivel no transgénico original del 9,1%. Aproximadamente el 83,5% o 61 acontecimientos de los 73 tienen entre un 5,0% y un 13,7% de ALA.

REFERENCIAS

Patente de Estados Unidos 4.518.584; Patente de Estados Unidos 4.737.462; Patente de Estados Unidos

4.810.648; Patente de Estados Unidos 4.826.877; Patente de Estados Unidos 4.957.748; Patente de Estados

Unidos 5.094.945; Patente de Estados Unidos 5.100.679; Patente de Estados Unidos 5.158.975; Patente de

Estados Unidos 5.196.525; Patente de Estados Unidos 5.219.596; Patente de Estados Unidos 5.290.924;

Patente de Estados Unidos 5.322.783; Patente de Estados Unidos 5.359.142; Patente de Estados Unidos

5.424.398; Patente de Estados Unidos 5.424.412; Patente de Estados Unidos 5.500.365; Patente de Estados

Unidos 5.530.196; Patente de Estados Unidos 5.538.880; Patente de Estados Unidos 5.550.318; Patente de

Estados Unidos 5.563.055; Patente de Estados Unidos 5.610.042; Patente de Estados Unidos 5.627.061;

Patente de Estados Unidos 5.633.435; Patente de Estados Unidos 5.641.876; Patente de Estados Unidos

5.880.275; Patente de Estados Unidos 5.936.069; Patente de Estados Unidos 6.005.076; Patente de Estados

Unidos 6.040.497; Patente de Estados Unidos 6.051.753; Patente de Estados Unidos 6.146.669; Patente de

Estados Unidos 6.156.227; Patente de Estados Unidos 6.319.698; Patente de Estados Unidos 6.433.252;

Patente de Estados Unidos 6.451.567; Publicación de Patente de Estados Unidos 20030093828; Publicación de Patente de Estados Unidos 20030229918; Publicación de Patente de Estados Unidos 20040039058 Barany y col., Int. J. Peptide Protein Res., 30: 705-739, 1987. Bauer y col., Gene, 37: 73, 1985. Belanger and Kriz, Genetics, 129: 863-872, 1991. Bevan y col., Nucleic Acids Res., 11 (2): 369-385, 1983. Bodanszky, En: Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984. Bustos y col., Plant Cell, 1(9): 839-853, 1989 Callis y col., Genes Dev., 1: 1183-1200, 1987. Chen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8560-8564, 1986. Chu y col., Scientia Sinica, 18: 659, 1975. de Deckerer, Eur. J. Clin. Nutr., 52: 749, 1998. DeBlock y col., EMBO J., 6:2513-2519, 1987. Ebert y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84(16): 5745-5749, 1987. Freitag M and Selker EU, Curr Opin Genet Dev. 15(2): 191-9, 2005. Gallie y col., The Plant Cell, 1: 301, 1999. Hudspeth y col., Plant. Mol. Biol., 12: 579, 1989. Ingelbrecht y col., Plant Cell, 1(7): 671-680, 1989. James y col., Semin. Arthritis Rheum., 28: 85, 2000. Jones y col., Plant Cell, 7(3): 359-371, 1995. Joshi, Nucl. Acid Res., 15: 6643, 1987. Kridl y col., Seed Sci. Res., 1: 209-219, 1991 Lopes y col., Mol. Gen. Genet., 247: 603-613, 1995. Maniatis, y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Ursin, Virginia Froman, Byron Valentin, Henry

<120> Desaturasas de Tetraselmis suecica

<130> MON53599

<140> PCT/US07/73793

<141> 18-07-2007

<150> US 60/831.838

<151> 19-07-2006 5

<160> 24

<170> Patent In version 3.3

10 <210> 1

<211> 1533

<212> ADN

<213> Tetraselmis suecica

15 <400> 1

<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> Tetraselmis suecica

<400> 2

<210> 3

<211> 1533

<212> ADN

<213> Tetraselmis suecica

<400> 3

<210> 4

<211> 510

<212> PRT

<213> Tetraselmis suecica

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 5 tggtggaarr msaagcayaa c 21

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 6 ardccwccvb draaccarty 20

<210> 7

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 7 agtagccagg catagtgcag cgcaat 26

<210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

<400> 8 ttcaacgatt ggttcacggg tggc

24

<210> 9 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

<400> 9 aacatgggca ggggtgggtt tactg

25

<210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

<400> 10 ctaagcaagt gccgcgatgt ccg

23

<210> 11 <211> 442 <212> PRT

<213> Isochrysis galbana

<400> 11

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4;

   b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3; c) un polinucleótido que hibrida con la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3, o un complemento del mismo, en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42 ºC; y

   d) un polinucleótido que codifica un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos un 75% con una secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4.

2. 2.

   Un polipéptido aislado que comprende la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4 o un fragmento del mismo que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6.

3. 3.

   Una construcción de ADN que comprende la secuencia polinucleotídica aislada de la reivindicación 1.

4. 4.

   La construcción de ADN de la reivindicación 3, que comprende además

   (i)

   un promotor heterólogo unido operativamente a la secuencia polinucleotídica aislada de la reivindicación 1; o

   (ii)

   al menos una secuencia polinucleotídica adicional que codifica una desaturasa de ácidos grasos.

5. 5.

   Una célula huésped transformada con la construcción de ADN de la reivindicación 3.

6. 6.

   La célula huésped de la reivindicación 5, en la que la célula huésped

   (i)

   es una célula vegetal; o

   (ii)

   es una célula fúngica o bacteriana; o

   (iii) presenta una biosíntesis de ácidos grasos alterada con respecto a una célula del mismo genotipo que dicha célula huésped pero que carece de dicha construcción de ADN; o

   (iv) ha heredado dicha construcción de ADN a partir de un progenitor de la célula.

7. 7.

   Una planta transgénica transformada con la construcción de ADN de la reivindicación 3.

8. 8.

   La planta de la reivindicación 7, en la que

   (i)

   la planta se selecciona del grupo que consiste en canola, Brassica campestres, colza, colinabo, soja, crambe, mostaza, ricino, cacahuete, sésamo, semilla de algodón, linaza, cártamo, palma, lino, girasol, maíz, arroz, cebada, mijo, centeno, trigo, avena, alfalfa y sorgo; o

   (ii)

   la planta comprende además al menos un polinucleótido adicional que codifica una desaturasa de ácidos grasos.

9. 9.

   Una semilla de la planta de la reivindicación 7, en la que la semilla comprende la construcción de ADN.

10. 10.

    Un procedimiento para producir un producto alimentario o pienso, que comprende las etapas de:

    (a)

    obtener la planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 7 o una parte de la misma; y

    (b)

    producir dicho producto alimentario o pienso.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el producto alimentario o pienso es un aceite, ensilaje, harina, grano, almidón, fécula o proteína.

12. 12.

    Una composición de producto alimentario o pienso producida por el procedimiento de la reivindicación 10 y que comprende (i) una molécula de ácido nucleico detectable que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 1 o (ii) un polipéptido detectable codificado por el polinucleótido aislado de la reivindicación 1.