MX2009000757A - Acido graso desaturasas de tetraselmis suecica. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere generalmente a métodos y composiciones relacionados con enzimas desaturasas que modulan el número y ubicación de dobles enlaces en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA); en particular, la invención se refiere a métodos y composiciones para mejorar perfiles de ácido graso omega-3 en productos vegetales y partes de plantas usando enzimas desaturasas y ácidos nucleicos que codifican dichas enzimas: en modalidades particulares, las enzimas desaturasas son delta 6 desaturasas de Tetraselmis suecica; también se proveen composiciones de aceite de soya mejoradas que tienen GLA y SDA.

Description

ACIDO GRASO DESATURASAS DE TETRASELMIS SUECICA ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U.A. con número de serie 60/831 ,838, presentada el 19 de julio de 2006, cuya descripción se incorpora específicamente aquí por referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere generalmente a enzimas desaturasas que modulan el número y ubicación de dobles enlaces en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA). En particular, la invención se refiere a mejora de perfiles de ácido graso usando enzimas delta 6 desaturasas y ácidos nucleicos que codifican dichas enzimas desaturasas.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Los productos primarios de la biosíntesis de ácido graso en la mayoría de los organismos son compuestos de 16 y 18 carbonos. La proporción relativa de longitudes de cadena y grado de instauración de estos ácidos grasos varían ampliamente entre las especies. Los mamíferos, por ejemplo, producen principalmente ácidos grasos saturados y monoinsaturados, mientras que la mayoría de las plantas superiores producen ácidos grasos con uno, dos o tres dobles enlaces, los últimos dos comprendiendo ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). Dos familias principales de PUFA son los ácidos grasos omega-3 (también representados como ácidos grasos "n-3"), ejemplificados por ácido estearidónico (SDA, 18:4, n-3), y los ácidos grasos omega-6 (también representados como "n-6" ácidos grasos), ejemplificados por ácido ?-linolénico (GLA, 18:3, n-6). Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula y tejido adiposo, en donde se pueden encontrar en formas tales como fosfolípidos y como triglicéridos, respectivamente. Los PUFA son necesarios para el desarrollo apropiado en mamíferos, particularmente en el desarrollo del cerebro en recién nacidos, y para la formación y reparación de tejido. Varios trastornos responden al tratamiento con ácidos grasos. Se ha mostrado que la complementación con lod PUFA reduce la velocidad de restenosis después de angioplastia. Los beneficios de salud de ciertos ácidos grasos omega-3 de la dieta para enfermedad cardiovascular y artritis reumatoide también han sido bien documentados (Simopoulos et al., 1999; James et al., 2000). Además, los PUFA han sido sugeridos para usarse en tratamientos para asma y psoriasis. La evidencia indica que los PUFA pueden estar implicados en el metabolismo del calcio, lo que sugiere que los PUFA pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de osteoporosis y de cálculos en el riñon y tracto urinario. La mayor parte de la evidencia para beneficios de la salud se aplican a las grasas de omega-3 de cadena larga, ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5, n-3) y ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6, n-3) que se encuentran en pescado y aceite de pescado. Con esta base de evidencia, las autoridades de salud y nutricionistas en Canadá (Scientific Review Committee, 1990, Nutrition Recommendations, Minister of National Health and Welfare, Ottawa, Canadá), Europa (de Deckerer, Eur. J. Clin. Nutr., 52:749, 1998), el Reino Unido (The British Nutrition Foundation, 1992, Unsaturated fatty-acids - nutritional and physiological significance: The report of the British Nutrition Foundation's Task Forcé, Chapman and Hall, London), y los Estados Unidos (Simopoulos et al., 1999) han recomendado el incremento de consumo en la dieta de estos PUFA. Los PUFA también se pueden usar para tratar diabetes (patente de E.U.A. No. 4,826,877; Horobin er a/., 1993). El metabolismo y composición de ácido graso alterados se han demostrado en animales diabéticos. Se ha sugerido que estas alteraciones están implicadas en algunas de las complicaciones a largo plazo que resultan de diabetes, incluyendo retinopatía, neuropatía, nefropatía y daño al sistema reproductor. Se ha mostrado que el aceite de prímula, que contiene GLA, previene y revierte el daño a nervios diabético. Se ha mostrado que la administración de un ácido graso omega-3, tal como SDA, inhibe la biosíntesis de leucotrienos (patente de E.U.A. No. 5,158,975). Se ha mostrado que el consumo de SDA conduce a una disminución en los niveles de citocinas proinflamatorias TNF-a y IL-? ß en la sangre (PCT US 0306870). Los PUFA, tales como ácido linoleico (LA, 18:2, ?9, 12) y ácido a-linolénico (ALA, 18:3, ?9, 12, 15), se consideran como ácidos grasos esenciales en la dieta debido a que los mamíferos carecen de la capacidad para sintetizar estos ácidos. LA se produce a partir de ácido oleico (OA, 18:1 , ?9) por una A12-desaturasa, mientras que ALA se produce a partir de LA por una ?? d-desaturasa. Sin embargo, cuando son ingeridos, los mamíferos tienen la capacidad para metabolizar LA y ALA para formar las familias n-6 y n-3 de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA). Estos LC-PUFA son componentes celulares importantes que confieren fluidez a las membranas y funcionan como precursores de eicosanoides biológicamente activos tales como prostaglandinas, prostaciclinas y leucotrienos, que regulan las funciones fisiológicas normales. El ácido araquidónico (ARA, 20:4, n-6) es el precursor principal para la síntesis de eicosanoides, que incluyen leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos, y que también juegan un papel en el proceso de inflamación. En mamíferos, la formación de LC-PUFA es limitado en velocidad por el paso de ?6 desaturación, que convierte LA a GLA y ALA a SDA. Se ha mostrado que muchas condiciones fisiológicas y patológicas deprimen este paso metabólico aún más, y consecuentemente, la producción de LC-PUFA. Para superar el paso de limitación de velocidad e incrementar los niveles de EPA en el tejido, se podrían consumir grandes cantidades de ALA. Sin embargo, el consumo de cantidades moderadas de SDA provee una fuente eficiente de EPA, ya que SDA es aproximadamente cuatro veces más eficiente que ALA a niveles de EPA en tejido elevados en humanos (publicación de patente de E.U.A. 20040039058 (Ursin et al.). En los mismos estudios, la administración de SDA también fue capaz de incrementar los niveles de ácido docosapentaenoico (DPA) en tejido, que es un producto de elongación de EPA. Alternativamente, al desviar la ??-desaturación por complemento dietético con EPA o DHA pueden aliviar de manera efectiva muchas enfermedades patológicas asociadas con niveles bajos de PUFA. Sin embargo, como se expone con más detalle más adelante, las fuentes de PUFA actualmente disponibles no son deseables por muchas razones. La necesidad de una fuente confiable y económica de PUFA ha despertado el interés en fuentes alternativas de PUFA. Los PUFA de cadena larga mayores de importancia incluyen DHA y EPA, que se encuentran principalmente en diferentes tipos de aceite de pescado, y ARA, encontrados en hongos filamentosos tales como Mortierella. Para DHA, existe un número de fuentes para producción comercial incluyendo una variedad de organismos marinos, aceites obtenidos de peces marinos de agua fría, y fracciones de yema de huevo. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros vegetales Trichodesma, Borago (borage) y Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen los géneros vegetales Borago, Oenothera y Ribes. Sin embargo, existen varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFA de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceite altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos de estas fuentes por lo tanto pueden requerir purificación extensiva para separar uno o más PUFA deseados o para producir un aceite que es enriquecido en uno o más PUFA. Fuentes naturales de PUFA también están sujetas a fluctuaciones no controlables en disponibilidad. Los abastos de peces pueden sufrir variación natural o pueden agotarse por sobrepesca. Además, aún con evidencia abrumadora de sus beneficios terapéuticos, las recomendaciones dietéticas referentes a ácidos grasos omega-3 no son atendidas. Los aceites de pescado tienen sabores y olores desagradables, que puede ser imposible de separar económicamente del producto deseado, y pueden hacer a dichos productos inaceptables como complementos alimenticios. Los aceites de origen animal, y particularmente aceites de pescado, pueden acumular contaminantes ambientales. Los alimentos pueden ser enriquecidos con aceites de pescado, pero nuevamente, dicho enriquecimiento es problemático debido al costo y declinación de abasto de peces a nivel mundial. Este problema también es un impedimento para el consumo e ingesta de pez entero. Sin embargo, si los mensajes de salud incrementan la ingesta de pescado fueran aprovechados por las comunidades, probablemente habría un problema para satisfacer la demanda de pescado. Además, hay problemas con la sustantividad de esta industria, que se basa fuertemente en abastos de peces silvestres para alimentación de acuacultura (Naylor et al., 2000). Otras limitaciones naturales favorecen un enfoque novedoso para la producción de PUFA. El clima y las enfermedades pueden causar fluctuación en campos tanto de peces como de plantas. La tierra cultivable para la producción de cultivos alternativos productores de aceite está sujeta a competencia con la constante expansión de las poblaciones humanas y la necesidad incrementada asociada para producción de alimento en el resto de la tierra arable. Los cultivos que producen PUFA, tales como borraja, no se han adaptado al crecimiento comercial y pueden no tener buen rendimiento en monocultivo. El crecimiento de dichos cultivos por lo tanto no es económicamente competitivo en donde se pueden cultivar plantas de cultivo más rentables y mejor establecidas. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella también es costosa. Los tejidos de animales naturales contienen bajas cantidades de ARA y son difíciles de procesar. Los microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial. Por lo tanto, sería ventajoso obtener material genético implicado en la biosíntesis de PUFA y expresar el material aislado en un sistema de plantas, en particular, un sistema de plantas de cultivo terrestres con base en tierra, que pueda ser manipulado para proveer la producción de cantidades comerciales de uno o más PUFA. En cultivos de semillas oleaginosas comerciales, tales como cañóla, soya, maíz, girasol, cártamo o linaza, la conversión de alguna fracción de los ácidos grasos mono- y poliinsaturados que tipifican su aceite de semilla a SDA y GLA requiere la expresión específica de semilla de múltiples enzimas desaturasas que incluyen delta 6- y delta 15-desaturasas. Los aceites derivados de plantas que expresan niveles elevados de ?6- y ?15-desaturasas son ricos en SDA y GLA. Como también existe la necesidad de incrementar la ingesta de ácido graso omega-3 en humanos y animales, existe la necesidad de proveer una amplia gama de alimentos enriquecidos con omega-3 y complementos alimenticios de modo que los sujetos puedan escoger alimentos para animales, ingredientes de alimento para animales, alimentos e ingredientes para alimentos que se adecúen a sus hábitos dietéticos usuales. También es ventajoso proveer cantidades comerciales de GLA. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de ácidos nucleicos novedosos de ?ß-desaturasas para usarse en plantas de cultivo transgénicas con aceites enriquecidas en PUFA, así como el alimento y alimentos para animales mejorados producidos por los mismos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 6. Estos se pueden usar para transformar células o modificar la composición de ácido graso de una planta o el aceite producido por una planta. Una modalidad de la invención son secuencias de polinucleótido aisladas, que son secuencias de polinucleótido aisladas de Tetraselmis suecica que tienen actividad de desaturasa única. En ciertas modalidades adicionales de la invención, los polinucleótidos codifican un polipéptido que tiene por lo menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4, incluyendo por lo menos aproximadamente 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98% y 99% de homología con estas secuencias. Los expertos en la técnica reconocerán que, puesto que estas secuencias están relacionadas, un polipéptido dado puede compartir simultáneamente 75% o más homología con más de una de estas secuencias de polipéptido. En otro aspecto, la invención provee un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; (c) un polinucleótido que híbrida a SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o un complemento del mismo, bajo condiciones de 5X SSC, 50% de formamida y 42°C; y (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido con por lo menos 75%, 85%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. En otro aspecto, la invención provee un polipéptido aislado que comprende las secuencias de polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o un fragmento de las mismas que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6. En otro aspecto más, la invención provee una construcción de ADN que comprende el polinucleotido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polinucleotido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4; (b) un polinucleotido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; (c) un polinucleotido que híbrida a SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o un complemento del mismo, bajo condiciones de 5X SSC, 50% formamida y 42°C; y (d) un polinucleotido que codifica un polipéptido con por lo menos 75%, 85%, 95%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. En una modalidad adicional, la construcción de ADN además comprende un promotor heterólogo operablemente enlazado al polinucleotido aislado descrito anteriormente. En otras modalidades, el promotor es funcional en una célula procariótica o célula eucariótica. En ciertas modalidades, la célula eucariótica en la cual el promotor es funcional es una célula vegetal. En una modalidad adicional, el promotor es un promotor mejorador de semilla. En otra modalidad más, la construcción de ADN además comprende por lo menos una secuencia de polinucleotido adicional que codifica una ácido graso desaturasa. En otro aspecto adicional, la invención provee una célula hospedero transformada con una construcción de ADN que comprende el polinucleotido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6 provista por la invención. La célula hospedero puede ser una célula vegetal, animal, fungal o bacteriana. En una modalidad adicional, la célula hospedero de la invención provee una célula hospedero que presenta biosíntesis de ácido graso alterada en relación con una célula del mismo genotipo que la célula hospedero pero que carece de la construcción de ADN. En otro aspecto más, la célula hospedero ha heredado la construcción de ADN de un progenitor de la célula. En otro aspecto adicional, la invención provee una planta y su progenie que comprende las células hospedero transformadas con una construcción de ADN de la invención. Dicha planta se puede definir como que comprende metabolismo de ácido graso alterado en relación con una planta del mismo genotipo que carece de la construcción de ADN. En otro aspecto, dicha planta además puede comprender por lo menos una secuencia de polinucleótido adicional que codifica una ácido graso desaturasa. En una modalidad, la planta se selecciona del grupo que consiste de cañóla, Brassica campestris, colza de semilla oleaginosa, semilla de colza, soya, crambe, mostaza, algarrobo, cacahuate, ajonjolí, semilla de algodón, semilla de linaza, cártamo, palma de aceite, linaza, girasol, maíz, arroz, cebada, mijo, centeno, trigo, avena, alfalfa y sorgo. La invención también provee semilla de la planta de la invención. En otro aspecto, la invención provee una composición de aceite extraída de semilla de maíz que comprende un contenido de GLA de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, o aproximadamente 26% en peso del total de ácidos grasos. En una modalidad, la composición de aceite además comprende un contenido de SDA de aproximadamente 3% a aproximadamente 13% en peso del total de ácidos grasos, incluyendo contenido de intermediario SDA, tal como aproximadamente 5%, aproximadamente 8%, o aproximadamente 10% de contenido de SDA en peso del total de ácidos grasos. La invención también está modalizada por una composición de aceite extraída de semilla de maíz que comprende un contenido de GLA de por lo menos aproximadamente 3%, por lo menos aproximadamente 5%, o por lo menos aproximadamente 10% en peso del total de ácidos grasos; y un contenido de SDA de por lo menos aproximadamente 3%, aproximadamente 5%, aproximadamente 8%, aproximadamente 10%, aproximadamente 13%, o aproximadamente 20% en peso del total de ácidos grasos, en donde la relación de GLA/SDA es entre aproximadamente 1.3 y aproximadamente 3.7. En otro aspecto más, la invención provee una composición de aceite extraída de semilla de soya que tiene un contenido de GLA de aproximadamente 9% a aproximadamente 51% en peso del total de ácidos grasos, incluyendo aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, o aproximadamente 40% en peso del total de ácidos grasos. En una modalidad, la composición de aceite además comprende un contenido de SDA de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10% en peso del total de ácidos grasos. La invención también está modalizada por una composición de aceite extraída de semilla de soya que comprende un contenido de GLA de por lo menos aproximadamente 1%, aproximadamente 3% , aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 13%, o aproximadamente 20% en peso del total de ácidos grasos y un contenido de SDA de por lo menos 1 % en peso del total de ácidos grasos, en donde la relación de GLA/SDA es entre aproximadamente 2.8 y aproximadamente 18.3. En otro aspecto adicional, la invención provee un método para producir alimento o alimento para animales, que comprende los pasos de (a) obtener la planta transgénica de la invención; y (b) producir el alimento o alimento para animales. El alimento o alimento para animales puede ser aceite, ensilaje, harina, grano, almidón, harina fina o proteína. La composición de alimento o alimento para animales se define como que comprende una secuencia de polinucleótido detectable o polipéptido detectable provista por la invención. Además, la invención provee composiciones de alimento para animales y alimento para humanos que comprende GLA o SDA. En otro aspecto adicional, la invención provee un método para incrementar el valor nutricional de un producto comestible para consumo humano o por animales, que comprende añadir plantas o partes de plantas transformadas, o derivados de las mismas por la invención al producto comestible. En ciertas modalidades, el producto es alimento para humanos y/o animales. El producto comestible también puede ser alimento para animales y/o un complemento alimenticio. En otro aspecto adicional, la invención provee un método para fabricar alimento o alimento para animales, que comprende añadir plantas o partes de plantas transformadas, o derivados de las mismas provistas por la invención a ingredientes de partida de alimento o alimento para animales para producir el alimento o alimento para animales. En ciertas modalidades, el método además se define como un método para fabricar alimento y/o alimento para animales. La invención también provee alimento o alimento para animales hecho por el método.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas aquí. La figura 1 muestra una alineación de aminoácidos de ?6-desaturasas TsD6D-1 y TsD6D-2 de Tetraselmis suecica (SEQ ID NOs: 2 y 4), Isochrysis galba lg6D-1 (SEQ ID NO: 1 1 ) y Mortierella alpina D6D (SEQ ID NO: 12). La figura 2 muestra un mapa del vector pMON94002. La figura 3 muestra un mapa del vector pMON82848. La figura 4 muestra un mapa del vector pMON82849. La figura 5 muestra un mapa del vector pMON94502. La figura 6 muestra un mapa del vector pMON94503. La figura 7 muestra un mapa del vector pMON94060.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención supera las limitaciones de la técnica anterior al proveer métodos y composiciones para la creación de plantas con contenido de PUFA mejorado. La modificación de contenido de ácido graso de un organismo tal como una planta presenta muchas ventajas, incluyendo beneficios de nutrición y salud mejorados. La modificación de contenido de ácido graso se puede usar para lograr PUFA deseados con niveles o perfiles benéficos en plantas, partes de plantas y productos de plantas, incluyendo aceites de semillas de plantas. Por ejemplo, cuando los PUFA deseados se producen en el tejido seminal de una planta, el aceite se puede aislar de las semillas dando típicamente un aceite alto en PUFA o un aceite que tiene un contenido o perfil de ácido graso deseado, que a su vez se puede usar para proveer características benéficas en productos alimenticios y otros productos. Varios aspectos de la invención incluyen métodos y composiciones para modificación de contenido de PUFA de una célula, por ejemplo, modificación del contenido de PUFA de una células(s) vegetal. Composiciones relacionadas con la invención incluyen secuencias de polinucleótido aisladas novedosas, construcciones de polinucleótido y plantas y/o partes de plantas transformadas por polinucleótidos de la invención. El polinucleótido aislado puede codificar una A6-desaturasa de Tetraselmis suecica. Las células hospedero pueden ser manipuladas para expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido(s) de delta 6 desaturasa que cataliza(s) desaturación de un ácido(s) graso(s). Las siguientes definiciones se proveen como una ayuda para entender esta invención. Las frases "secuencia de ADN," "secuencia de ácido nucleico," "molécula de ácido nucleico," "polinucleótido" y "segmento de ácido nucleico" se refieren a una estructura física que comprende una disposición ordenada de nucleotidos. El segmento, secuencia de ADN, o secuencia de nucleotidos puede ser contenida dentro de una molécula de nucleotidos, vector o similar más grande. Además, la disposición ordenada de ácidos nucleicos en estas secuencias se puede representar en la forma de un listado de secuencias, figura, cuadro, medio electrónico o similar. Las frases "secuencia codificadora," "región codificadora," "secuencia estructural," y "secuencia de ácido nucleico estructural" se refieren a todas o a un segmento de una secuencia de ADN, secuencia de ácido nucleico, molécula de ácido nucleico en la cual los nucleotidos están dispuestos en una series de tripletes que forman cada uno de ellos un codón. Cada codón codifica un aminoácido específico. Por lo tanto, la secuencia codificadora, región codificadora, secuencia estructural, y secuencia de ácido nucleico estructural codifican una serie de aminoácidos que forman una secuencia de proteína, polipéptido o péptido. La secuencia codificadora, región codificadora, secuencia estructural, y secuencia de ácido nucleico estructural puede estar contenida dentro de una molécula de ácido nucleico más grande, vector o similar. Además, la disposición de nucleotidos en estas secuencias puede ser representada en forma de un listado de secuencias, figura, cuadro, medio electrónico, o similares. El término "ADNc" se refiere a un ADN de doble cadena que es complementario a ARNm y derivado del mismo. "Desaturasa" se refiere a un polipéptido que puede desaturar o catalizar la formación de un doble enlace entre carbonos consecutivos de uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono- o poli-insaturado o un precursor de los mismos. De particular interés son polipéptidos que pueden catalizar la conversión de OA a LA, LA a ALA, o ALA a SDA, que incluye enzimas que desaturan en las posiciones 12, 15 ó 6. Consideraciones para escoger un polipéptido específico que tiene actividad de desaturasa incluyen, pero no se limitan al pH óptimo del polipéptido, ya sea que el polipéptido sea una enzima limitadora de velocidad o un componente de la misma, ya sea que la desaturasa usada sea esencial para la síntesis de un PUFA deseado, y/o ya sea que un co-factor sea requerido por el polipéptido. El polipéptido expresado preferiblemente tiene características que son compatibles con el ambiente bioquímico de su ubicación en la célula hospedero. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por sustrato(s). "Expresión" se refiere al proceso por el cual la información codificada por un gen es convertida en estructuras presentes y que operan en la célula. Los genes expresados incluyen aquellos que son transcritos en ARN y después traducidos a proteína y aquellos que son transcritos a ARN pero no traducidos a proteína {v.gr., ARN de transferencia y ARN ribosomal). Como se usa aquí, "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificadoras 5') y que siguen (secuencias no codificadoras 3') a la secuencia codificadora. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprende secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. Gen "endógeno" se refiere a un gen nativo en se ubicación natural en el genoma de un organismo. Un "gen exógeno" o "transgén" se refieren a un gen que ha sido introducido en el genoma por un procedimiento de transformación. Un transgén incluye ADN genómico introducido por un proceso de transformación (v.gr., un ADN genómico enlazado a su promotor activo). "Heterólogo" se refiere a la relación entre 2 o más secuencias de ácido nucleico o proteína que se derivando diferentes fuentes. Por ejemplo, un promotor es heterólogo con respecto a una secuencia codificadora si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Además, una secuencia de ácido nucleico particular puede ser "heteróloga" con respecto a una célula u organismo en el cual se inserta si no ocurre naturalmente en esa célula u organismo particular.

"Homología de secuencia" se refiere al nivel de similitud entre 2 o más secuencias de ácido nucleico o aminoácidos en términos de por ciento de identidad posicional. El término homología también se usa para referirse al concepto de propiedades funcionales similares entre diferentes ácidos nucleicos o proteínas. "Hibridización" se refiere a la capacidad de una primera cadena de ácido nucleico para unirse con una segunda cadena mediante apareamiento de bases con enlaces de hidrógeno cuando las cadenas de ácido nucleico tienen suficiente complementariedad de secuencia. Como se usa aquí, se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si presentan complementariedad completa. Como se usa aquí, se dice que las moléculas presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleotido de una de las moléculas es complementario a un nucleotido de la otra. Por lo tanto, se dice que 2 cadenas de ácido nucleico tienen suficiente complementariedad cuando su pueden hibridar una a otra con suficiente estabilidad para permitirles permanecer apareadas unas a otra bajo condiciones apropiadas. La frase "aislado" significa que ha sido removido de su ambiente natural, independientemente de su disposición eventual. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico "aislada" de arroz, tal como por clonación de una célula de arroz, permanece "aislada" cuando es insertada en el genoma de una célula de maíz. La frase "operablemente enlazada" se refiere a la disposición espacial de dos o más regiones de ácido nucleico o secuencias de ácido nucleico de modo que ejercen sus efectos apropiados uno con respecto a otro. Por ejemplo, una región promotora puede ser colocada en relación con una secuencia de ácido nucleico tal que la transcripción de la secuencia de ácido nucleico es dirigida por la región promotora. La región promotora y la secuencia de ácido nucleico son "operablemente enlazadas". "Hacia el extremo 5"' y "hacia el extremo 3"' son términos posicionales usados con referencia a la ubicación de una secuencia de nucleótidos y la dirección de transcripción o traducción de secuencias codificadoras, que normalmente procede en la dirección 5' a 3'. Los términos "promotor" o "región promotora" se refieren a una secuencia de ácido nucleico, usualmente encontrada hacia el extremo 5' (5') a una secuencia codificadora, capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico en una molécula de ARN. El promotor o región promotora típicamente provee un sitio de reconocimiento para ARN polimerasa y los otros factores necesarios para el inicio apropiado de transcrición. Como se contempla aquí, un promotor o región promotora incluye variaciones de promotores derivadas al insertar o deletar regiones reguladoras, sometiendo el promotor a mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, y similares. La actividad o resistencia de un promotor se puede medir en términos de las cantidades de ARN que produce, o la cantidad de acumulación de proteína en una célula o tejido, en relación con un segundo promotor que es medido de manera similar. La frase "secuencias no codificadoras 3'" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas hacia el extremo 3' de una secuencia codificadora e incluye secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento de ARNm o expresión de gen. Estas se refieren comúnmente como regiones no traducidas 3' o 3'-UTRs. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente por afectar la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias no codificadoras 3' es ejemplificado por Ingelbrecht er a/. (1989). "Secuencia líder de traducción" o "región no traducida 5"' o "5'-UTR" se refieren todas ellas a una secuencia de nucleótido ubicada entre la secuencia de promotor de un gen y la secuencia codificadora. La 5'-UTR está presente en el ARNm completamente procesado hacia el extremo 5' de la secuencia de inicio de traducción. La 5'-UTR puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria a ARNm, estabilidad de ARNm o eficiencia de traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias líderes de traducción (Turner y Foster, 1995). "Transcripción de ARN" se refiere al producto que resulta de transcripción de una secuencia de ADN catalizada por ARN polimerasa. Cuando la transcripción de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se refiere como la transcripción primaria. Una secuencia de ARN derivada de procesamiento post-transcripcional de la transcripción primaria se refiere como el ARN maduro. "ARN mensajero" (ARNm) se refiere al ARN que está sin intrones y que puede ser traducido a polipéptido por la célula. "Construcción de ADN" se refiere a los elementos genéticos heterólogos operablemente enlazados unos a otros haciendo una molécula de ADN recombinante y pueden comprender elementos que proveen expresión de una molécula de polinucleotido de ADN en una célula hospedero y elementos que proveen mantenimiento de la construcción. Un cásete de expresión de planta comprende el enlace operable de elementos genéticos que cuando son transferidos a una célula vegetal proveen expresión de un producto de gen deseable. "Vector recombinante" se refiere a cualquier agente por el cual o en el cual un ácido nucleico de interés es amplificado, expresado o almacenado, tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencia de replicación autónoma, fago o cadena individual lineal, cadena individual circular, doble cadena lineal, o doble cadena de ADN circula o secuencia de nucleótidos de ARN. El vector recombinante se pude sintetizar o derivar de cualquier fuente y es capaz de integración genómica o replicación autónoma. "Secuencia reguladora" se refiere a una secuencia de nucleótidos ubicada hacia el extremo 5' (5'), dentro, o hacia el extremo 3' (3') con respecto a una secuencia codificadora, o un intrón, cuya presencia o ausencia afecta la transcripción y expresión de la secuencia codificadora. "Sustancialmente homólogo" se refiere a dos secuencias que son por lo menos aproximadamente 90% idénticos en secuencia, como se mide por el algoritmo CLUSTAL W en, por ejemplo DNAStar (DNAStar, Madison, Wl). "Sustancialmente purificado" se refiere a una molécula separada de sustancialmente todas las otras moléculas normalmente asociadas con ella en su estado nativo. Muy preferiblemente, una molécula sustancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparación. Una molécula sustancialmente purificada puede ser mayor que aproximadamente 60% libre, preferiblemente aproximadamente 75% libre, muy preferiblemente aproximadamente 90% libre, y muy preferiblemente aún aproximadamente 95% libre de las otras moléculas (exclusivas de solvente) presentes en la mezcla natural. La frase "sustancialmente purificada" no pretende abarcar moléculas presentes en su estado nativo. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de esta invención son sustancialmente purificadas. El término "transformación" se refiere a la introducción de ácido nucleico en un hospedero receptor. El término "hospedero" se refiere a células bacterianas, hongos, animales o células animales, plantas o semillas, o cualesquiera partes de plantas o tejidos incluyendo células vegetales, protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, vástagos, hojas, plántulas, embriones y polen. Como se usa aquí, una "planta transgénica" es una planta que ha introducido establemente en su genoma, por ejemplo, los genomas nuclear o de plástido, un ácido nucleico exógeno. El término "isogénico" como un término comparativo entre plantas o líneas de plantas que tienen o que carecen de un transgén significa plantas o líneas que tienen los mismos o similares antecedentes genéticos, con la excepción del transgén en cuestión. Por ejemplo, las llamadas líneas hermanas que representan selecciones fenotípicamente similares o idénticas de la misma población F2 progenitora se considera que son "isogénicas." Cuando la progenie de una planta transformante estable se cruzan y retrocruzan con las plantas de la línea progenitora no transformada para 3 a 6 generaciones (o más) usando el progenitor no transformado como el progenitor recurrente mientras se selecciona para el tipo (genotipo por análisis de marcador molecular, fenotipo por observación de campo, o ambos) y para el transgén, la línea transgénica resultante se considera que es altamente "isogénica" a su línea progenitora no transformada. Se entiende que los términos "semillas" "granos" y "grano" son equivalentes en cuanto a significado. El término granos se usa frecuentemente para describir la semilla de una planta de maíz o arroz. En todas las plantas la semilla es el óvulo maduro que consiste de una cubierta seminal, embrión, aleurona y un endospermo.

Acidos nucleicos que codifican delta 6 desaturasas La invención provee, en una modalidad, ácidos nucleicos novedosos que codifican delta 6 desaturasas de Tetraselmis suecica, un alga flagelada verde móvil. En una modalidad particular, los ácidos nucleicos se aislan de la cepa CCMP904 de Tetraselmis suecica (disponible de CCMP; Center for Culture of Marine Phytoplankton; West Boothbay Harbor, Maine, USA). En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos comprenden SEQ ID NOs:1 ó 3. La invención también provee métodos para usar esos ácidos nucleicos, incluyendo SEQ ID NOs:1 y 3. En una modalidad, estas moléculas de ácido nucleico se usan en el contexto de esta invención para alterar la composición de aceite de una semilla de una planta. Dicho ácido nucleico puede ser amplificado usando ADNc, ARNm o ADN genómico como una plantilla e iniciadores de oligonucleótido apropiados de conformidad con técnicas de amplificación por PCR™ estándares. Alternativamente, se pueden sintetizar usando técnicas de síntesis estándares, tales como un sintetizador de ADN automatizado. Los polinucleótidos que codifican delta 6 desaturasas deseadas pueden ser identificadas en una variedad de formas. Como un ejemplo, una fuente de las delta 6 desaturasas deseadas, por ejemplo una genoteca de Tetraselmis, se determina selectivamente con sondas enzimáticamente o químicamente sintetizadas detectables, que se pueden hacer a partir de ADN, ARN, o nucleótidos que no ocurren naturalmente, o mezclas de los mismos. Las sondas pueden ser enzimáticamente sintetizadas a partir de polinucleótidos de delta 6 desaturasas conocidas para métodos de hibridación normal o de astringencia reducida. Las sondas de oligonucleótidos también se pueden usar para determinar selectivamente fuentes y se pueden basar en secuencias de delta 6 desaturasas conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre las delta 6 desaturasas conocidas, o en secuencias de péptido obtenidas de la proteína purificada deseada. Las sondas de oligonucleótido basadas en secuencias de aminoácidos pueden ser degeneradas para abarcar la degeneración del código genético, o se pueden derivar en favor de los codónes preferidos del organismo fuente. Los oligonucleótidos también se pueden usar como iniciadores para PCR™ a partir de ARNm transcrito inversamente a partir de una fuente conocida o sospechada; el producto de PCR™ puede ser el ADNc de longitud completa o se puede usar para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseada. Alternativamente, una proteína deseada puede ser completamente secuenciada y se puede realizar la síntesis total de un ADN que codifica ese polipéptido. Una vez que se ha aislado el ADN genómico o ADNc, se puede secuenciar por métodos conocidos. Se reconoce en la técnica que dichos métodos están sujetos a errores, de tal manera que la secuenciación múltiple de la misma región es rutina y se espera que conduzca a tasas de errores medibles en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensiva, o composiciones de bases usuales, tales como regiones con alto contenido de bases GC. Cuando surgen discrepancias, se puede realizar nuevamente la secuenciación y se pueden utilizar métodos especiales. Los métodos especiales pueden incluir condiciones de secuenciación alternativas usando: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; composiciones de gel diferentes, por ejemplo añadiendo formamida; iniciadores diferentes o iniciadores ubicados a distancias diferentes de la región del problema; o plantillas diferentes tales como ADNs de una sola cadena. También se puede utilizar la secuenciación de ARNm. Si se desea, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican delta 6 desaturasas pueden ser modificadas sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada resultante por lo que las secuencias son más susceptibles a expresión en hospederos de plantas. Una secuencia codificadora puede ser un ADN artificial. Un ADN artificial, como se usa aquí significa una molécula de polinucleótido de ADN que no ocurre naturalmente. Las moléculas de ADN artificiales pueden ser diseñadas por una variedad de métodos, tales como, métodos conocidos en la técnica que se basan en la sustitución de los codón(es) de un primer polinucleótido para crear un equivalente, o incluso un polinucleótido artificial de segunda generación mejorado, en donde este nuevo polinucleótido artificial es útil para expresión mejorada en plantas transgénicas. Este aspecto de diseño a menudo utiliza un cuadro de uso de codón producido al compilar la frecuencia de ocurrencia de codones en una colección de secuencias codificadoras aisladas de una planta, tipo de planta, familia o género. Otros aspectos de diseño incluyen reducir la ocurrencia de señales de poliadenilación, sitios de empalme de intrón, o extensiones de secuencia de AT o GC largas (patente de E.U.A. 5,500,365). Las secuencias codificadoras de longitud completa o fragmentos de las mismas se pueden hacer de ADN artificial usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Modificaciones de las secuencias de nucleotidos o elementos reguladores descritas aquí que mantienen las funciones contempladas aquí están dentro del alcance de esta invención. Dichas modificaciones incluyen inserciones, sustituciones y deleciones, y específicamente sustituciones que reflejan la degeneración del código genético. Los inventores han aislado secuencias de ADN de Tetraselmis suecica que producen polipéptidos con actividad de delta 6 desaturasa. Las secuencias que codifican las delta 6 desaturasas se pueden expresar en plantas transgénicas, microorganismos o animales para modificar el contenido de ácido graso. También se pueden usar otros polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polinucleótidos de delta 6 desaturasa provistos aquí, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos de delta 6 desaturasa. "Sustancialmente idénticos" se refiere a una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que presenta en orden de preferencia cada vez mayor por lo menos 75%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98 o 99% de identidad a la secuencia de polipéptido de delta 6 desaturasa en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o secuencias que codifican otros polipéptidos. Comparaciones de polipéptido o polinucleótido se pueden llevar a cabo usando software de análisis de secuencia, por ejemplo, el paquete de software Sequence Análisis del GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA) y MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715). Dicho software hace concordar secuencias similares asignando grados de similitud o identidad.

Construcciones de ADN La invención provee construcciones de ADN que comprenden un promotor heterólogo operablemente enlazado a un ácido nucleico descrito aquí. La selección de promotores, v.gr., promotores que se pueden describir como fuertemente expresados, débilmente expresados, induciblemente expresados, expresados mejorado en tejido (es decir, específicamente o preferencialmente expresados en un tejido), expresados mejorados en órgano (es decir, específicamente o preferencialmente expresados en un órgano) y expresados mejorados en desarrollo (es decir, específicamente o preferencialmente expresados durante una etapa(s) particular del desarrollo), está dentro del alcance de la técnica. De manera similar, la combinación de una molécula de ácido nucleico como se describió antes con un promotor también está dentro del alcance de la técnica (véase, v.gr., Sambrook et al., 2001 , 1989). Los promotores que se han de usar con la invención incluyen, pero no se limitan a, promotores que funcionan en bacterias, bacteriófagos, hongos o células vegetales. Los promotores útiles para expresión bacteriana son los promotores lacZ, Sp6, T7, T5 o glgC de E. coli. Los promotores útiles para hongos incluyen incluyen gal1 de Saccharomyces cerevisiae (West et al., 1984), nmt1 de Saccharomyces pombe (Maundrell, 1990), ccg-1 de Neurospora crassa (Freitag y Selker, 2005) y AUG1 de Pichia methanolica (Invitrogen). Los promotores útiles para células vegetales incluyen el promotor gamma zeína Z27 (véase, por ejemplo, Prem Das et al., 1991 ), promotor L3 oleosin (patente de E.U.A. No. 6,433,252, Kriz et al.), promotor PER1 de cebada (Stacey et al., 1996), promotor CaMV 35S (patente de E.U.A. No. 5,530,196 (Fraley et al.)), promotor nos (Ebert et al., 1987), promotor de actina de arroz (patente de E.U.A. No.5, 641 , 876), y PEPCase promotor (Hudspeth et al., 1989). The Figwort Mosaic Virus (FMV) promotor (patente de E.U.A. No. 6,051 ,753 (Comai et al.)), promotores arcelina, tomate E8, patatina, ubiquitina, manopina sintasa (mas) y tubulina son otros ejemplos de promotores útiles. Existe una amplia variedad de secuencias promotoras de plantas que se pueden usar para impulsar la expresión específica de tejido de polinucleótidos que codifican delta 6 desaturasas y otras desaturasas en plantas transgénicas. De hecho, en modalidades particulares de la invención, el promotor usado es un promotor específico de semilla. Ejemplos de dichos promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de genes tales como napin (Kridl et al., 1991 ), faseolina (Bustos, et al., 1989), subunidad a' de ß-conglicinina de soya (P-Gm7S alfa', véase, por ejemplo, Chen et al., 1986), Vicia faba USP (P-Vf.Usp, véase, por ejemplo, SEQ ID NO:1 , 2, y 3, publicación de patente de E.U.A. 20030229918), el promotor de globulina (véase, por ejemplo, Belanger y Kriz, 1991 ), y subunidad alfa de ß-conglicinina de soy (7S alfa) (publicación de patente de E.U.A. 20030093828, incorporada por referencia).

Otros promotores mejorados de expresión de semilla que se sabe que funcionan en maíz y en otras plantas incluyen los promotores para los siguientes genes: ceroso (almidón sintasa ligada a gránulo), quebradizo y encogido 2 (ADP glucosa pirofosforilasa), encogido 1 (sacarosa sintasa), enzimas ramificantes I y II, almidón sintasas, enzimas desramificadoras, oleosinas, glutelinas, y BetU (capa de transferencia de endospermo basal). Otros promotores útiles en la práctica de la invención que son conocidos por u experto en la técnica también son contemplados por la invención. Más aún, los mejoradores de transcripción o duplicaciones de mejoradores se pueden usar para incrementar la expresión de un promotor particular. Ejemplos de dichos mejoradores incluyen, pero no se limitan a Adh intrónl (Callís et al., 1987), un intrón de actina de arroz (McEIroy et al., 1991 , patente de E.U.A. No. 5,641 ,876), intrón de sacarosa sintasa (Vasil et al., 1989), un intrón HSP70 de maíz (también referido como Zm.DnaK) (patente de E.U.A. 5,424,412, Brown et al.) un elemento omega de TMV (Gallie et al., 1999), el mejorador 35S de CaMV (patentes de E.U.A. 5,359,142 y 5,196,525, McPherson et al.) o un mejorador de octopina sintasa (patente de E.U.A. 5,290,924, Last et al.). Como la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de transcripción y el inicio de la secuencia codificadora, es decir, la secuencia líder no traducida, puede influir en la expresión de gen, también se puede desear utilizar una secuencia líder particular. Se puede utilizar cualquier secuencia líder disponible para un experto en la técnica. Las secuencias líderes preferidas dirigen niveles óptimos de expresión del gen unido, por ejemplo, incrementando o manteniendo la estabilidad del ARNm y/o impidiendo el inicio inapropiado de traducción (Joshi, 1987). La elección de dichas secuencias es a discreción de los expertos en la técnica. Las construcciones de ADN de la invención pueden incluir una secuencia cerca del extremo 3' del cásete que actúa como una señal para terminar la transcripción de un ácido nucleico heterólogo y que dirige poliadenilación del ARNm resultante. Estas comúnmente se refieren como regiones no traducidas 3' o 3' UTRs. Algunos elementos 3' que pueden actuar como señales de terminación de transcripción incluyen aquellas del gen de nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983), una región no traducida 3' de napin (Kridl er a/., 1991 ), una región no traducida 3' de globulina (Belanger y Kriz, 1991 ), una región no traducida 3' del gen Adñ 2 de soya (auxina descendentemente regulada) (Wang et al., publicación del PCT WO200250295) o una de un gen de zeína, tal como Z27 (Lopes et al., 1995). Otros elementos reguladores 3' conocidos en la técnica también se pueden usar en los vectores de la invención. Una molécula de ácido nucleico como se describe aquí se puede clonar en cualquier vector adecuado y se puede usar para transformar o transfectar cualquier hospedero adecuado. La selección de vectores y métodos para construirlos son comúnmente conocidos en la técnica y se describen en referencias técnicas generales (véase, en general, Recombinant ADN Part D, 1987). El vector preferiblemente comprenderá secuencias reguladoras, tales como codones de inicio y terminación de transcripción y traducción, que son específicos para el tipo de hospedero (v.gr., bacterias, hongos o plantas) en el cual el vector ha de ser introducido, según sea apropiado y tomando en consideración si el vector es ADN o ARN. Los vectores que son circulares o lineales se pueden preparar para contener una secuencia de ácido nucleico entera como se describió antes o una porción de la misma ligada a un sistema de replicación funcional en una célula hospedero procariótica o eucariótica. Los sistemas de replicación pueden ser derivados de ColE1 , 2 ?t?µ de plásmido, fago ?, fago filamentoso f1 , especies de Agrobacteríum (v.gr., A. tumefaciens y A. rhizogenes), y similares. Además del sistema de replicación y la secuencia de ácido nucleico insertada, el vector puede incluir uno o más genes marcadores que permiten la selección de hospederos transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, tal como resistencia a antibióticos, metales pesados, herbicidas, efe, complementación en un hospedero autotrófico para proveer prototrofía, y similares. La invención provee células hospedero que comprenden una molécula de ácido nucleico descrita aquí, opcionalmente en forma de un vector. Los hospederos adecuados incluyen células vegetales, bacterianas y de hongos, incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Agrobacteríum tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae y Neurospora crassa. Hospederos de E. coli incluyen TB-1 , TG-2, DH5a, XL-Blue MRF' (Stratagene, Austin, TX), SA2821 , Y1090 y TG02. Las células vegetales incluyen, pero no se limitan a, soya, Brassica campestris, cañóla, colza de semilla oleaginosa, semilla de colza, crambe, mostaza, algarrobo, cacahuate, ajonjolí, semilla de algodón, semilla de linaza, cártamo, palma de aceite, linaza, girasol, alfalfa, maíz, trigo, cebada, avena, centeno, mijo, sorgo y arroz. La expresión en una célula hospedero se puede lograr de una manera transitoria o estable. La expresión transitoria puede ocurrir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcional en la célula hospedero, pero dichas construcciones no se replican y rara vez se integran en la célula hospedero, o en donde la célula hospedero no está proliferando. La expresión transitoria también se puede lograr induciendo la actividad de un promotor regulable operablemente enlazado al gen de interés, aunque dichos sistemas inducibles frecuentemente presentan un nivel basal de expresión bajo. La expresión estable se puede lograr mediante introducción de una construcción que se puede integrar en el genoma del hospedero o que se replica de manera autónoma en la célula hospedero. La expresión estable del gen de interés se puede seleccionar a través del uso de un marcador seleccionable ubicado en o transfectado con la construcción de expresión, seguido por selección para células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable resulta de la integración, la integración de construcciones puede ocurrir aleatoriamente dentro del genoma del hospedero o puede ser dirigida a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma del hospedero suficientes para dirigir la recombinación con el locus del hospedero. En donde las construcciones son dirigidas a un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de transcripción y traducción pueden ser provistas por el locus endógeno. La expresión en una célula hospedero puede implicar técnicas de fermentación conocidas por un experto en la técnica. La célula hospedero fermentada puede ser un procariote, tal como Escherichia coli, o un eucariote, tal como la levadura Saccharomyces cerevisiae o Neurospora crassa, un hongo filamentoso. Ejemplos de producción de PUFA por fermentación incluyen Mortierella (patente de E.U.A. 6,319,698) y Thraustrochytriales (patente de E.U.A. 6,451 ,567). Se contempla que más de un gen puede ser introducido y propagado en una célula hospedero a través del uso de vectores de expresión episomales o integrados. En donde dos o más genes se expresan a partir de vectores de replicación separados, es deseable que cada vector tenga un medio de replicación diferente. Cada construcción introducida, ya sea o no integrada, debe tener un medio de selección diferente y debe carecer de homología con las otras construcciones para mantener la expresión estable y prevenir la redistribución de elementos entre las construcciones. Elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección y método de propagación de la construcción introducido se pueden determinar experimentalmente de modo que todos los polinucléotidos introducidos se expresen a los niveles necesarios para proveer síntesis de los productos deseados.

Polipéptidos La invención provee delta 6 desaturasas codificadas por moléculas de ácido nucleico descritas aquí. Las delta 6 desaturasas son enzimas que pueden desaturar o catalizar la formación de un doble enlace entre carbonos consecutivos en la posición 6 de uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono- o poli-insaturado o un precursor del mismo. El polipéptido puede comprender D-aminoácidos, L-aminoácidos o una mezcla de D- y L-aminoácidos. Alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa para producir polipéptidos variantes se pueden preparar mediante una variedad de medios conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, sustituciones de aminoácidos pueden ser introducidas convenientemente en los polipéptidos cambiando la secuencia de la molécula de ácido nucleico en el tiempo de síntesis. Mutaciones específicas de sitio también pueden ser introducidas ligando en un vector de expresión un oligonucleótido sintetizado que comprende la secuencia modificada. Alternativamente, procedimientos de mutagénesis específicos de sitio, dirigidos a oligonucleótido, se pueden usar tal como se describe en Walder et al. (1986); Bauer et al. (1985); y patentes de E.U.A. 4,518,584 y 4,737,462. Está dentro del alcance de un experto en la técnica seleccionar aminoácidos sintéticos y que ocurren naturalmente que efectúan sustituciones conservativas o neutras para cualesquiera aminoácidos que ocurren naturalmente particulares. El experto en la técnica deseablemente considerará el contexto en el cual se hace cualquier sustitución de aminoácidos particular, además de considerar el carácter hidrofóbico o polaridad de la cadena lateral, el tamaño general de la cadena lateral y el valor de pK de cadenas laterales con carácter ácido o básico bajo condiciones fisiológicas. Por ejemplo, la lisina, arginina e histidina a menudo son adecuadamente sustituidas unas por otras, y muy a menudo arginina e histidina. Como se conoce en la técnica, esto se debe a que los tres aminoácidos tienen cadenas laterales básicas, en donde el valor de pK para las cadenas laterales de lisina y arginina están mucho más cerca una de otra (aproximadamente 10 y 12) que a la histidina (aproximadamente 6). De manera similar, la glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina a menudo son adecuadamente sustituidas unas por otras, con la condición de que la glicina frecuentemente no sustituye a los otros miembros del grupo. Esto se debe a que cada uno de estos aminoácidos es relativamente hidrofóbico cuando se incorpora en un polipéptido, pero la falta de un carbono a en las glicinas permite que los ángulos de rotación phi y psi (alrededor del carbono a) tengan tanta libertad conformacional que los residuos de glicinilo pueden disparar cambios en conformación o estructura secundaria que a menudo no ocurren cuando los otros aminoácidos sustituyen a otros. Otros grupos de aminoácidos que frecuentemente sustituyen de manera adecuada a otros incluyen, pero no se limitan a, el grupo que consiste de ácidos glutámico y aspártico; el grupo que consiste de fenilalanina, tirosina y triptofano; y el grupo que consiste de serina, treonina y opcionalmente tirosina. Además, el experto en la técnica puede agrupar fácilmente aminoácidos sintéticos con aminoácidos que ocurren naturalmente. Si se desea, los polipéptidos pueden ser modificados, por ejemplo, por glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación, o por la creación de sales ácidas de adición, amidas, ésteres, en particular ésteres C-terminales y derivados de N-acilo de los polipéptidos de la invención. Los polipéptidos también pueden ser modificados para crear derivados de proteína formando complejos covalentes o no covalentes con otras porciones de conformidad con métodos conocidos en la técnica. Los complejos covalentemente unidos se pueden preparar enlazando las porciones químicas a grupos funcionales sobre las cadenas laterales de aminoácidos que comprenden los polipéptidos, o el N- o C-terminal. De manera deseable, dichas modificaciones y conjugaciones no afectan adversamente la actividad de los polipéptidos (y variantes de los mismos). Aunque dichas modificaciones y conjugaciones pueden tener mayor o menor actividad, la actividad deseablemente no es negada y es característica del polipéptido no alterado. Los polipéptidos (y fragmentos, variantes y proteínas de fusión) se pueden preparar por cualquier número de técnicas convencionales. El polipéptido puede ser aislado o sustancialmente purificado a partir de una fuente que ocurre naturalmente o de una fuente recombinante. Por ejemplo, en el caso de proteínas recombinantes, un fragmento de ADN que codifica una proteína deseada puede ser subclonado en un vector apropiado usando técnicas de genética molecular bien conocidas (véase, v.gr. Maniatis et al., 1989) y otras referencias citadas aquí bajo "EJEMPLOS". El fragmento se puede transcribir y la proteína subsecuentemente traducir in vitro. También se pueden utilizar equipos comercialmente disponibles (v.gr., tales como los fabricados por Clontech, Mountain View, CA; Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL; Invitrogen, Carlsbad, CA y similares). La reacción en cadena de polimerasa opcionalmente se puede utilizar en la manipulación de ácidos nucleicos. Los polipéptidos pueden ser sintetizados usando un sintetizador de polipéptido de conformidad con métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido (y fragmentos, variantes y proteínas de fusión) se pueden sintetizar usando técnicas de síntesis de péptidos estándares bien conocidas por los expertos en la técnica (v.gr., como se resume en Bodansky, 1984). En particular, el polipéptido se puede sintetizar usando el procedimiento de síntesis de fase sólida (véase v.gr., Merrifield, 1963; Barany et al., 1987 y patente de E.U.A. 5,424,398). Si se desea, esto se puede hacer usando un sintetizador de péptido automatizado. La remoción de grupos bloqueadores de aminoácido de t-butiloxicarbonilo (t-BOC) o 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y la separación de la proteína de la resina se puede lograr, por ejemplo, mediante tratamiento con ácido a temperatura reducida. La mezcla que contiene polipéptido entonces se puede extraer, por ejemplo, con éter dietílico, para remover compuestos orgánicos no peptídicos y la proteína sintetizada se puede extraer del polvo de resina (v.gr., con aproximadamente 25 p/v de ácido acético). Después de la síntesis del polipéptido, opcionalmente se puede realizar purificación adicional (v.gr., usando CLAR) a fin de eliminar cualesquiera proteínas, polipéptidos, péptidos o aminoácidos libres incompletos. El análisis de aminoácido y/o CLAR se puede realizar sobre el polipéptido sintetizado para validar su identidad. Para otras aplicaciones de conformidad con la invención, puede ser preferible producir el polipéptido como parte de una proteína de fusión más grande, ya sea por conjugación química o a través de medios genéticos conocidos en la técnica. A este respecto, esta invención también provee una proteína de fusión que comprende un polipéptido (o fragmento del mismo) o variante del mismo y uno o más polipéptidos/ proteína(s) que tienen cualesquiera propiedades o funciones efectoras deseadas. Las pruebas para la producción e identificación de proteínas específicas se basan en varias propiedades fisicoquímicas, estructurales, funcionales u otras propiedades de las proteínas. Las propiedades fisicoquímicas o estructurales únicas permiten a las proteínas ser separadas e identificadas por procedimientos electroforéticos tales como electroforesis en gel nativa o desnaturalizante o enfoque isoeléctrico, o por técnicas cromatográficas tales como cromatografía de intercambio de iones o de exclusión de gel. Las estructuras únicas de proteínas individuales ofrecen oportunidades para el uso de anticuerpos específicos para detectar su presencia en formatos tales como una prueba de ELISA. Combinaciones de enfoques se pueden usar para lograr especificidad aun mayor tal como análisis de Western blot en el cual los anticuerpos se usan para localizar productos de gen individuales que han sido separados por técnicas electroforéticas. Técnicas adicionales se pueden usar para confirmar de manera absoluta la identidad del producto de interés tales como evaluación por secuenciacion de aminoácidos después de purificación. Aunque éstas están entre las más comunes, también se pueden usar otros procedimientos. Los procedimientos de prueba pueden identificar la expresión de proteínas por su funcionalidad, particularmente en donde la proteína expresada es una enzima capaz de catalizar reacciones químicas que implican sustratos y productos específicos. Por ejemplo, en extractos de plantas, estas reacciones se pueden medir proveyendo y cuantificando la pérdida de sustratos o la generación de productos de las reacciones por procedimientos físicos y/o químicos. En muchos casos, la expresión de un producto de gen se determina evaluado los resultados fenotípicos de su expresión, Dichas evaluaciones pueden ser simplemente como observaciones visuales, o pueden implicar pruebas. Dichas pruebas pueden adoptar muchas formas, tales como análisis de cambios en la composición química, morfología o propiedades fisiológicas de la planta. La composición química puede ser alterada por expresión de genes que codifican enzimas o proteínas de almacenamiento que cambian la composición de aminoácidos y estos cambios pueden ser detectados por análisis de aminoácidos, o por enzimas que cambian la cantidad de almidón, que puede ser analizada por espectrometría de reflectancia con infrarrojo o por enzimas que cambian la composición del aceite, que se puede detectar por cromatografía de gases.

Cambios morfológicos pueden incluir pedúnculos de mayor estatura o más gruesos. Las moléculas de ácido nucleico, construcciones de ADN y polipéptidos de esta invención se pueden usar en métodos agrícolas y varias pruebas de determinación selectiva. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico se puede usar para expresar una delta 6 desaturasa por medio de un vector en una célula hospedero, para detectar transcripciones de ARNm que codifican delta 6 desaturasas en una muestra biológica, para detectar una alteración genética en un gen que codifica delta 6 desaturasa mediante un análisis de Southern blot, para suprimir delta 6 desaturasas, o para regular ascendentemente delta 6 desaturasas. Los polipéptidos se pueden usar para compensar deficiencias en delta 6 desaturasas o para la presencia de delta 6 desaturasas mutadas que han reducido o no la actividad en una planta, o para tratar niveles excesivos de sustratos, ya sea directos o indirectos, para delta 6 desaturasas en una planta. Alternativamente, los polipéptidos se pueden usar para determinar selectivamente agentes para la capacidad de modular su actividad. Los anticuerpos se pueden usar para detectar y aislar los polipéptidos respectivos así como disminuir la disponibilidad de dichos polipéptidos in vivo.

Transformación de la planta En una modalidad preferida de la invención, una planta transgénica que expresa la proteína o proteínas deseadas es producida.

Varios métodos para la introducción de una secuencia de polinucleótido deseada que codifica la proteína deseada en células vegetales son conocidas en la técnica, incluyendo: (1 ) métodos físicos tales como microinyección, electroporación y suministro mediado por micropartículas (biolística o tecnología de pistola de genes); (2) suministro mediado por virus; y (3) transformación mediada por Agrobacterium. Los métodos más comúnmente usados para transformación de células vegetales son el procedimiento de transferencia de ADN mediado por Agrobacterium y la biolística o procedimiento mediado por bombardeo de micropartículas con microproyectiles. Típicamente, se desea la transformación nuclear pero en donde es deseable transformar específicamente plástidos, tales como cloroplastos o amiloplastos, los plástidos vegetales pueden ser transformados utilizando un suministro mediado por micropartículas del polinucleótido deseado. La transformación mediada por Agrobacterium se logra a través del uso de una bacteria del suelo genéticamente manipulada que pertenece al género Agrobacterium. Un número de cepas de tipo silvestre y desarmadas de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que portan plásmidos Ti o Ri se pueden usar para transferencia de genes en plantas. La transferencia de genes se hace mediante la transferencia de un ADN específico conocido como "T-ADN" que puede ser genéticamente manipulado para portar cualquier pieza deseada de ADN en muchas especies vegetales, como se elaboró adicionalmente, por ejemplo, en la patente de E.U.A. 6,265,638 a Bidney et al., cuya descripción se incorpora aquí por referencia. La transformación genética mediada por Agrobacterium de plantas implica varios pasos. El primer paso, en el cual el Agrobacterium virulenta y las células vegetales primero se llevan a contacto unas con otras, generalmente se denomina "inoculación". La inoculación preferiblemente está acompañada por algún método de lesión o algunas de las células vegetales, que liberan constituyentes celulares de la planta, tales como alcohol cumarílico, sinapinato (que es reducido a acetosiringona), alcohol sinapílico, y alcohol coniferílico, que activan factores de virulencia en Agarobacterium. Después de la inoculación, Agarobacterium y células/ tejidos vegetales se dejan crecer juntos durante un periodo de algunas horas a algunos días o más bajo condiciones adecuadas para crecimiento y transferencia de T-ADN. Este paso se denomina co-cultivo. Después del co-cultivo y suministro de T-ADN, las células vegetales se tratan con agentes bactericidas o bacteriostáticos para matar Agrobacterium que permanece en contacto con el explante y/o en el recipiente que contiene el explante. Si esto se hace en ausencia de algunos agentes selectivos para promover el crecimiento preferencial de células vegetales transgénicas versus no transgénicas, entonces esto típicamente se refiere como el paso de "demora". Si se hace en presencia de presión selectiva que favorece a las células vegetales transgénicas, entonces se refiere como un paso de "selección". Cuando una "demora" se usa, típicamente es seguida por uno o más pasos de "selección". Con respecto al bombardeo de micropartículas (patente de E.U.A. 5,550,318 (Adams et al.); patente de E.U.A. 5,538,880 (Lundquist et al.), patente de E.U.A. 5,610,042 (Chang et al.); y PCT WO 95/06128 (Adams et al.); cada una de las cuales se incorpora específicamente aquí por referencia en su totalidad), las micropartículas microscópicas son revestidas con ácidos nucleicos y suministradas en células por una fuerza propelente. Las partículas ilustrativas incluyen aquellas compuestas de tungsteno, platino y preferiblemente oro. Una modalidad ilustrativa de un método para suministrar ADN en células vegetales por aceleración es el Sistema de Suministro de Partículas de Biolística (BioRad, Hercules, CA), que se puede usar para propulsar partículas revestidas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o tamiz Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células de plantas monocotiledóneas cultivadas en suspensión. Las técnicas de bombardeo de micropartículas son ampliamente aplicables y se pueden usar para transformar virtualmente cualquier especie vegetal. Ejemplos de especies que han sido transformadas por bombardeo de micropartículas incluyen especies de monocotiledóneas tales como maíz (Publicación Internacional No. WO 95/06128 (Adams et al.)), cebada, trigo (patente de E.U.A. 5,563,055 (Townsend et al.)) incorporada aquí por referencia en su totalidad), arroz, avena, centeno, caña de azúcar y sorgo; así como un número de dicotiledóneas incluyendo tabaco, soya (patente de E.U.A. 5,322,783 (Tomes et al.)), incorporada aquí por referencia en su totalidad), girasol, cacahuate, algodón, tomate y leguminosas en general (patente de E.U.A. 5,563,055 (Townsend et al.)) incorporada aquí por su referencia en su totalidad). Para seleccionar o calificar las células vegetales transformadas independientemente de la metodología de transformación, el ADN introducido en la célula contiene un gen que funciona en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que confiere la resistencia del tejido vegetal a un compuesto de otra manera tóxico. Los genes de interés para usarse como un marcador seleccionable, selectivamente determinable o calificable incluirían pero no se limitarían genes de tolerancia a ß-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa (LUX), antibióticos o herbicidas. Ejemplos de genes de resistencia a antibióticos incluyen las penicilinas, kanamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprim); cloramfenicol; kanamicina y tetraciclina. Las moléculas de polinucleótico que codifican proteínas implicadas en tolerancia a herbicidas son conocidas en la técnica e incluyen pero no se limitan a una molécula de polinucleótido que codifica 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) descrito en la patente de E.U.A. 5,627,061 (Barry, et al.), patente de E.U.A. 5,633,435 (Barry, et al.) y patente de E.U.A. 6,040,497 (Spencer, et al.) y aroA descrito en la patente de E.U.A. 5,094,945 (Comai) para tolerancia a glifosato; una molécula de polinucleótido que codifica bromoxinil nitrilasa (Bxn) descrita en la patente de E.U.A. 4,810,648 (Duerrschnabel, et al.) para tolerancia a bromoxinil; una molécula de polinucleótido que codifica fitoeno desaturasa (crtl) descrita en Misawa et al. (1993); Misawa et al. (1994) para tolerancia a norflurazon; una molécula de polinucleótido que codifica acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan et al. (1990) para tolerancia a herbicidas de sulfonilurea; y tanto el gen pat descrito en Wohlleben et al., (1988) como el gen bar descrito en DeBlock et al. (1987), cada uno de los cuales provee tolerancia a glufosinato y bialafos. La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas de varios explantes transformados están bien documentados en la técnica. Los procesos de regeneración y crecimiento típicamente incluyen los pasos de seleccionar células transformadas y cultivar aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales de desarrollo embrionario a través de la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicos son similarmente regenerados. Los vástagos enraizados transgénicos resultantes por lo tanto se plantan en un medio de crecimiento de plantas apropiado tal como suelo. Las células que sobreviven la exposición al agente selectivo, o células que han sido calificadas positivas en una prueba de determinación selectiva, se pueden cultivar en un medio que soporta la regeneración de plantas. Las plántulas en desarrollo son transferidas a mezcla de crecimiento de plantas sin suelo, y endurecidas, antes de ser transferidas a un invernadero o cámara de crecimiento para maduración. Esta invención se puede usar con cualquier célula o tejido transformable. Por transformable como se usa aquí se entiende una célula o tejido que es capaz de propagarse adicionalmente para dar origen a una planta. Los expertos en la técnica reconocerán que un número de células o tejidos vegetales son transformables en los cuales después de la inserción de ADN exógeno y condiciones de cultivo apropiadas, las células o tejidos vegetales pueden formar una planta diferenciada. El tejido adecuado para estos propósitos puede incluir pero no se limita a embriones inmaduros, tejidos escutelares, cultivos de células en suspensión, influorescencia inmadura, meristema de vástago, explantes nodales, tejido de callo, tejido de hipocotilo, cotiledóneos, raíces y hojas. La patente de Tomes et al. 793, citada anteriormente, describe un método de tratamiento con una citocinina seguida por incubación durante un periodo suficiente para permitir que las células no diferenciadas en tejido de nodo de cotiledóneos se diferencien en células meristemáticas y permitan a las células entrar a las fases entre las fases G1 y de división de desarrollo, que mejora la susceptibilidad para la transformación. Se puede usar cualquier medio de cultivo de plantas adecuado. Los medios adecuados incluyen pero no se limitan a medios basados en MS (Murashige y Skoog, 1962) o medios basados en N6 (Chu et al., 1975) complementado con reguladores de crecimiento vegetal adicional incluyendo pero sin limitarse a auxinas, citocinas, ABA y giberelinas. Los expertos en la técnica están familiarizados con la variedad de medio de cultivo de tejido, que cuando son complementados apropiadamente, soportan el crecimiento y desarrollo del tejido vegetal y son adecuados para transformación y regeneración vegetal. Estos medios de cultivo de tejido pueden ser ya sea comprados como una preparación comercial o preparados y modificados personalmente. Los expertos en la técnica están conscientes de que los medios y complementos de medios tales como nutrientes y reguladores de crecimiento para usarse en transformación y regeneración y otras condiciones de cultivo tales como intensidad de la luz durante la incubación, pH y temperaturas de incubación pueden ser optimizados para la variedad particular de interés. Después de que una construcción de ADN es establemente incorporada en plantas transgénicas y que se ha confirmado que es operable, se puede introducir en otras plantas de la misma u otra especie sexualmente compatible mediante cruza sexual. Cualquiera de un número de técnicas de reproducción estándares se pueden usar, dependiendo de la especie que se ha de cruzar. Por lo tanto, la presente invención no sólo abarca una planta directamente transformada o regenerada a partir de células que han sido transformadas de conformidad con la presente invención, sino también la progenie de dichas plantas. Como se usa aquí, el término "progenie" denota la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de conformidad con la presente invención, en donde la progenie comprende una construcción de ADN seleccionada preparada de conformidad con la invención. "Cruza" de una planta para proveer una línea vegetal que tiene uno o más transgenes o alelos agregados en relación con una línea vegetal de partida, como se describe aquí, se define como las técnicas que dan por resultado una secuencia particular que es introducida en una línea vegetal al cruzar una línea de partida con una línea de plantas donadoras que comprenden un transgén o alelo de la invención. Para lograr esto, por ejemplo se podrían realizar los siguientes pasos: (a) plantar semillas de la primera (línea de partida) y segunda (línea de planta donadora que comprende un transgén o alelo deseado) plantas progenitoras; (b) hacer crecer las semillas de la primera y segunda plantas progenitoras en plantas que contienen flores; (c) polinizar una flor de la primera planta progenitora con polen de la segunda planta progenitora; y (d) cosechar semillas producidas en la planta progenitora que contiene la flor fertilizada. La retrocruza se define aquí como el proceso que incluye los pasos de: (a) cruzar una planta de un primer genotipo que contiene un gen, secuencia de ADN o elemento deseado con una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (b) seleccionar una o más plantas de progenie que contienen el gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (c) cruzar la planta de progenie con una planta de un segundo genotipo; y (d) repetir los pasos (b) y (c) para el propósito de transferir una secuencia de ADN deseada de una planta de un primer genotipo con una planta de un segundo genotipo. La introgresión de un elemento de ADN en un genotipo de planta se define como el resultado del proceso de conversión por retrocruza. Un genotipo de planta en el cual la secuencia de ADN ha sido introgresada puede referirse como un genotipo, línea, línea endogámíca o híbrido convertido por retrocruza. De manera similar, un genotipo de planta que carece de la secuencia de ADN deseada puede referirse como un genotipo, línea, línea endogámica o híbrido convertido por retrocruza.

Semillas, harina, aceite y productos que comprenden semilla, harina y aceite Esta invención también provee un contenedor de aproximadamente 1000, muy preferiblemente aproximadamente 20,000, y muy preferiblemente aún aproximadamente 40,000 semillas en donde aproximadamente 10%, muy preferiblemente aproximadamente 25%, muy preferiblemente aproximadamente 50% y muy preferiblemente aún aproximadamente 75% o muy preferiblemente todavía aproximadamente 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de esta invención. Esta invención también provee un contenedor de aproximadamente 10 kg, muy preferiblemente aproximadamente 25 kg y muy preferiblemente aún aproximadamente 50 kg de semillas en donde aproximadamente 10%, muy preferiblemente aproximadamente 25%, muy preferiblemente aproximadamente 50% y muy preferiblemente aún aproximadamente 75% o muy preferiblemente todavía aproximadamente 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de esta invención. Cualquiera de las plantas o partes de las mismas de esta invención pueden ser cosechadas y opcionalmente procesadas para producir un alimento para animales, harina o preparación de aceite. Una parte de planta particularmente preferida para este propósito es el grano cosechado, pero otras partes de plantas pueden ser cosechadas y usadas para forraje o ensilaje. Los métodos para producir alimento para animales, harina y preparaciones de aceite son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. 4,957,748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669; y 6,156,227. El grano o harina de esta invención se puede mezclar con otros granos o harinas. La invención provee una composición de aceite extraída de semilla de maíz que tiene un contenido de GLA de aproximadamente 5% a aproximadamente 26% en peso del total de ácidos grasos y que comprende además y un contenido de SDA de aproximadamente 3% a aproximadamente 13%. La invención también es modalizada por una composición de aceite extraída de semilla de maíz que comprende un contenido de GLA de por lo menos 3% en peso del total de ácidos grasos y un contenido de SDA de por lo menos 3% en peso del total de ácidos grasos, en donde la relación de GLA/SDA es entre aproximadamente 1.3 y aproximadamente 3.7. La invención también provee una composición de aceite extraída de semilla de soya que tiene un contenido de GLA de aproximadamente 9% a aproximadamente 51 % en peso del total de ácidos grasos y puede comprender además un contenido de SDA de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10% en peso del total de ácidos grasos. La invención también es modalizada por una composición de aceite extraída de semilla de soya que comprende un contenido de GLA de por lo menos 1 % en peso del total de ácidos grasos y un contenido de SDA de por lo menos 1 % en peso del total de ácidos grasos, en donde la relación de GLA/SDA es entre aproximadamente 2.8 y aproximadamente 18.3.

Métodos La presente invención provee un método para proveer plantas transgénicas con un contenido incrementado de GLA o SDA. Este método puede incluir, por ejemplo, introducir ADN que codifica una delta 6 desaturasa y opcionalmente por lo menos una desaturasa adicional en células vegetales y regenerar plantas con contenido de GLA o SDA incrementado de las células transgénicas. De manera más especifica, la invención provee un método para producir alimento o alimento para animales, que comprende los pasos de (a) obtener la planta transgénica de la invención; y (b) producir el alimento o alimento para animales. El alimento o alimento para animales puede ser aceite, ensilaje, harina, grano, almidón, harina o proteína. La composición de alimento o alimento para animales se define como aquella que comprende una secuencia de polinucleótido detectable o polipéptido detectable provisto por la invención. Además, la invención provee composiciones de alimento para animales y alimento para humanos que comprende GLA o SDA. Para complementación dietética, los PUFA purificados, plantas o partes de plantas transformadas o derivados de las mismas, se pueden incorporar en aceite para cocinar, grasas o margarinas formuladas de modo que durante el uso normal el receptor reciba la cantidad deseada. Los PUFA también se pueden incorporar en formulas para recién nacidos, complementos nutricionales u otros productos alimenticios, y pueden encontrar uso como antiinflamatorios o agentes reductores de colesterol. Como se usa aquí, "composición comestible" se define como composiciones que pueden ser ingeridas por un mamífero tales como productos alimenticios, sustancias nutricionales y composiciones farmacéuticas. Como se usa aquí "productos alimenticios" se refiere a sustancias que pueden ser usadas o preparadas para usarse como alimento para un mamífero e incluye sustancias que pueden ser usadas en la preparación de alimento (tal como aceites para freír) o aditivos para alimentos. Por ejemplo, los productos alimenticios incluyen animales usados para consumo humano o cualquier producto de los mismos, tales como, por ejemplo, huevos. Los productos alimenticios típicos incluyen pero no se limitan a bebidas (v.gr., bebidas suaves, bebidas carbonatadas, bebidas listas para mezclarse), fórmula para recién nacidos, alimentos de infusión (v.gr., frutas y verduras), salsas, condimentos, aderezos para ensaladas, jugos de frutas, jarabes, postres (v.gr., budines, gelatina, cubiertas y rellenos, productos horneados y postres congelados tales como helados y nieves), productos congelados suaves (v.gr., cremas congeladas suaves, helados congelados suaves y yogurt, cubiertas congeladas suaves tales como cubiertas congeladas batidas lácteas o no lácteas), aceites y productos emulsionados (v.gr., manteca, margarina, mayonesa, mantequilla, aceite para cocinar y aderezos para ensaladas) y alimentos de humedad intermedia (v.gr., arroz y alimentos para perro).

Además, las composiciones comestibles descritas aquí, también pueden ser ingeridas como un aditivo o complemento contenido en alimentos o bebidas. Estas se pueden formular junto con una sustancia nutricional tal como varias vitaminas y minerales e incorporarse en composiciones sustancialmente líquidas tales como bebidas con nutrientes, leches de soya y sopas; composiciones sustancialmente sólidas; y gelatinas o usarse en forma de un polvo para ser incorporado en varios alimentos. El contenido del ingrediente efectivo en dicho alimento funcional o saludable puede ser similar a la dosis contenida en un agente farmacéutico típico. Los PUFA purificados, plantas o partes de plantas transformadas también se pueden incorporar en alimento para animales, particularmente ganado. De esta manera, los animales mismos se pueden beneficiar de una dieta rica en PUFA, mientras que los consumidores humanos de productos alimenticios producidos a partir de dicho ganado también pueden beneficiarse. Para uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones generalmente se pueden administrar por vía oral, pero se pueden administrar por cualquier vía por la cual pueden ser absorbidas exitosamente, v.gr., parenteral (es decir, subcutánea, intramuscular o intravenosa), rectal, vaginal o tópica, por ejemplo, como una pomada o loción para la piel. Los PUFA, plantas o partes de plantas transformadas de la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En donde están disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma preferida de administración oral. La complementación dietética como se expuso anteriormente también puede proveer una vía de administración oral. Los ácidos insaturados de la presente invención se pueden administrar en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos. Cualquier sal farmacéuticamente aceptable es abarcada por la presente invención; especialmente preferidas son las sales de sodio, potasio o litio. También abarcadas son las sales de N-alquilpolihidroxamina, tales como N-metilglucamina, encontrada en la publicación del PCT WO 96/33155. Los ésteres preferidos son los ésteres etílicos. Como sales sólidas, los PUFA también se pueden administrar en forma de tableta. Para administración intravenosa, los PUFA o derivados de los mismos se pueden incorporar en formulaciones comerciales tales como intralípidos.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar modalidades de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descritas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención. Sin embargo, los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción apreciarán que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y no obstante obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes descritos aquí mientras se obtienen los mismos resultados o similares. Todos esos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como lo definen las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Clonación de secuencias de ?6 desaturasa de Tetraselmis suecica La clonación de la ?6 desaturasa (TsD6D) de Tetraselmis suecica se logró por amplificación de PCR de una región de ADN genómica interna parcial usando oligonucleótidos degenerados, seguido por determinación selectiva de genoteca RACE. El ADN genómico se aisló de la cepa CCMP904 de T. suecica (CCMP, West Boothbay Harbor, ME, USA) usando DNasol (InVitrogen, Carlsbad, CA). Una región interna de 578 pb fue amplificada por PCR usando los iniciadores de oligonucleótido degenerados D6DegF2: 5'-TGGTGGAARRMSAAGCAYAAC-3' (SEQ ID NO: 5) y D6DegR3: 5'-ARDCCWCCVBDRAACCARTY-3' (SEQ ID NO: 6). Estos iniciadores se diseñaron usando alineaciones de secuencia de ADN de ?6 desaturasas relacionadas. El fragmento de PCR resultante fue ligado a pCR2.1-TOPO (Invitrogen), dando el plásmido pMON67050. Después de la secuenciación, se encontró que el inserto clonado contenía la secuencia de aminoácidos conservada QXXHH (SEQ ID NO:22), que se encuentra en todas las desaturasas de extremo anterior (Napier et al., 1997, Napier et al., 2003, Sperling y Heinz, 2001 ). Ejemplos de desaturasas de extremo anterior incluyen las ?4, ?5, y ?6 ácido graso desaturasas, además de las esfingolípido ?8 desaturasas. Estas secuencias genómicas consideraron el diseño de iniciadores específicos de gen por lo que se pudo clonar un ADNc de ?6 desaturasa putativo. El ARN total se aisló de células de T. suecica por un procedimiento de CTAB modificado (Jones et al., 1995) y el ARN se usó para generar una genoteca GeneRacer™ siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Una reacción de 5' RACE usando el iniciador específico de gen, Phy D6 R2: 5'- AGTAGCCAGGCATAGTGCAGCGCAAT-3' (SEQ ID NO: 7) y el iniciador GeneRacer 5': 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' (Invitrogen; (SEQ ID NO:23)) dio un fragmento de 1264 pb que se traslapó con pMON67050 por 310 pb. Una reacción de 3' RACE usando el iniciador específico de gen D6DegF3: 5'-TTCAACGATTGGTTCACGGGTGGC-3' (SEQ ID NO: 8) y el iniciador GeneRacer 3': 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3' (Invitrogen (SEQ ID NO:24)) dio un fragmento de 405 pb que fue traslapado por 56 pb con el producto 5' RACE para dar un fragmento virtual combinado con un marco de lectura abierta (ORF) de 1529 nucleótidos. La secuencia de aminoácidos predicha de ORF contenía secuencias conservadas que son diagnóstico para una ?6 ácido graso desaturasa que incluye un dominio de citocromo terminal b5 que se encuentra en todas las desaturasas de extremo anterior (Napier et al., 2003) y tres cajas de histidina conservadas que son características de todas las desaturasas ligadas a membrana (Shanklin et al., 1994). Una característica distinguible en todas las desaturasas de extremo anterior incluyendo TsD6D putativa aquí es que la tercera caja de histidina contiene un residuo de glutamina en la primera posición (Q-x-x-H-H) en lugar de una histidina (Napier et al., 1997, Napier et al., 2003, Sperling y Heinz, 2001 ). Usando las secuencias de RACE de T. suecica descritas anteriormente, los iniciadores de oligonucleótido específicos se diseñaron para amplificar el ORF completo de TsD6D putativo. El primer iniciador (TsD6D-F1 : 5'-AACATGGGCAGGGGTGGGTTTACTG-3' (SEQ ID NO: 9)) añadió una secuencia de levadura Kozak 5' del sitio de inicio de ATG y el iniciador de reversa (TsD6D-R1 : 5'-CTAAGCAAGTGCCGCGATGTCCG-3' (SEQ ID NO: 10)) añadió un codón de detención a extremo 3' del producto amplificado. Estos iniciadores se usaron para generar un fragmento de 1536 pb por amplificación de PCR de la genoteca RACE que se ligó en el vector de expresión de levadura pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen). Dos versiones distintas de los ORFs de longitud completa se identificaron, los cuales difirieron por 22 nucleótidos y 5 aminoácidos. Las secuencia de ácido nucleico de las dos ?6 ácido graso desaturasas de T. suecica putativas, referidas como TsD6D-1 y TsD6D-2, se muestran en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para TsD6D-1 y TsD6D-2 se muestran en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Ambas secuencias codifican un polipéptido potencial de 510 aminoácidos. La alineación de dos secuencias de aminoácidos de T. suecica con ?6 desaturasas de Isochrysis galbana y Mortierella alpina muestra diversidad extensiva a través déla proteína entera con regiones de alta homología que rodean las cajas de histidina conservadas (figura 1 ). /. galbana y T. suecica son algas marinas y M. alpina es un hongo oleaginoso que acumula altos niveles de ácido araquidónico. El por ciento de identidades para las secuencias de aminoácidos se muestra en el cuadro 1 .

CUADRO 1 Porcentaje de identidades de alineación por pares para secuencias de aminoácidos deducidas de D6 desaturasas /. galbana: Acceso a AX577009, aminoácido deducido de SEQ ID NO: 34, WO02081668. M. alpina: Acceso a AAF08685.

EJEMPLO 2 Transformación y expresión de levadura Los clones de pYES2.1/V5-His que contenían TsD6D-1 y TsD6D-2 fueron introducidos en la cepa INVSd Saccharomyces cerevisiae (auxotrófica para uracilo) (Invitrogen) usando el protocolo PEG/Li Ac como se describe en el manual de Invitrogen para pYES2.1/V5-His-TOPO. Los transformantes se seleccionaron sobre placas hechas de medio mínimo de SC menos uracilo con 2% de glucosa. Las colonias de transformantes se usaron para inocular 8 mi de medio mínimo de SC menos uracilo y 2% de glucosa que crecieron durante la noche a 30°C. Para inducción, células de levadura de fase estacionaria fueron comprimidas en pastilla y se resuspendieron en medio mínimo de SC menos uracilo complementado con 2% de galactosa y que crecieron durante 3 días a 15°C. Cuando se proveen ácidos grasos exógenos a los cultivos, se añade 0.01 % LA (?9, 12-18:2) o 0.01 % ALA (?9, 12, 15-18:3) con el emulsionante Tergitol al 0.1 %. Los cultivos se hicieron crecer durante 3 días a 15°C, y subsecuentemente se cosecharon por centrifugación. Las pastillas de células se lavaron una vez con regulador de pH TE estéril a un pH de 7.5, para remover el medio y se liofilizaron a sequedad. La cepa hospedera transformada con el vector que contenía el gen LacZ se usó como un control negativo en todos los experimentos. Los lípidos se extrajeron de pastillas de levadura liofilizadas añadiendo 0.1 mi de tolueno e incubando durante la noche a temperatura ambiente. Los lípidos extraídos se convirtieron a ésteres metílicos de ácido graso (FAMEs) in situ mediante la adición de 0.5 mi de metóxido de sodio 0.6N en metanol y se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente. Los FAMEs se extrajeron mediante la adición de 0.8 mi de NaCI 10% (p/v) y 0.15 mi de heptano. La capa de heptano que contenía FAMEs se removió y se usó directamente para cromatografía de gases (CG). Los FAMEs se identificaron en un Hewlett-Packard 5890 II Plus GC (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) equipado con un detector de ionización de llama y una columna capilar (omegawax 250; 30m x 0.25mm i.d. x 0.25 µ??; Supelco, Bellefonte, PA). Una relación de división de 100:1 se usó para inyecciones. El inyector se mantuvo a 250°C y el detector de ionización de llama se mantuvo a 270°C. La temperatura de columna se mantuvo a 180°C durante 1.5 min después de la inyección, incrementada a 240°C a 40°C/min, y se mantuvo a 245°C durante 3.38 min. Los resultados mostrados en el cuadro 2 demuestran que los clones TsD6D-1 y TsD6D-2 de T. suecica presentan actividad de ?6 de desaturasa en un sistema de expresión de levadura. La preferencia de sustrato se dedujo de una prueba de inyección de levadura, por lo que cultivos de levaduras inducidos para expresar desaturasa recombinante son fed LA, ALA, o volúmenes iguales de LA y ALA. La levadura incorpora estos ácidos grasos en sus membranas en donde se convierten en sustratos para la desaturasa recombinante. Los productos de ?6 desaturación LA y ALA son GLA y SDA, respectivamente. Dos colonias individuales se seleccionaron para cada valor. Ambos clones de T. suecica demostraron selectividad de sustrato para ALA que es 2 a 2.6 veces más alta que para LA. El control negativo es vector pYES2.1 que contiene un inserto LacZ.

CUADRO 2 Actividad de Delta 6 de desaturasa de TsD6D-1 y TsD6D-2 de T. suecica en un sistema de expresión de levadura Construcción FA en medio LA GLA ALA SDA SDA/GLA control neg - 0 0 0 0 control neg LA 13.69 0 0 0 control neg ALA 0 0 25.02 0 control neg LA+ALA 7.96 0 12.17 0 control neg - 0 0 0 0 control neg LA 14.07 0 0 0 control neg ALA 0 0 26.82 0 control neg LA+ALA 8.62 0 13.44 0 TsD6D-1 - 0 0 0 0 TSD6D-1 LA 12.08 1.39 0 0 TsD6D-1 ALA 0 0 19.87 1 .27 TsD6D-1 LA+ALA 8.65 0.44 13.54 1.08 2.45 TsD6D-1 - 0 0 0 0 TsD6D-1 LA 11.61 1.2 0 0 TsD6D-1 ALA 0.53 0 20.81 1.21 TsD6D-1 LA+ALA 8.44 0.39 13.68 1.02 2.62 TsD6D-2 - 9.43 0 1.24 0 TsD6D-2 LA 16.85 0.76 0 0 TsD6D-2 ALA 0 0 31.62 1.7 TsD6D-2 LA+ALA 5.83 0.35 8.02 0.69 1.97 TsD6D-2 - 0 0 0 0 TsD6D-2 LA 9.07 0.61 0 0 TsD6D-2 ALA 0 0 25.78 1.54 TsD6D-2 LA+ALA 9.43 0.5 15.15 1.23 2.46 EJEMPLO 3 Expresión de A6-desaturasa de Tetraselmis suecica en soya La actividad de la ??-desaturasa de T. suecica se evaluó en semilla de soya combinándola con A15-desaturasa incrementada por codón de dicotiledónea de Neurospora crassa (NcFad3nno) (SEQ ID NO: 13) para dar pMON94002 (figura 2). El vector pMON94002 se construyó en 3 pasos. Primero, los sitios de restricción, Salí y Sse8387 I se añadieron a los extremos de la secuencia codificadora de TsD6D-1 (CDS) por amplificación por PCR de pMON67034 (TsD6D-1 en pYES2.1 ) usando los oligonucleótidos TsD6D-F3: 5'-GTCGACAAACAATGGGCAGGGGTGGGTTTA-3' (SEQ ID NO: 14), y TsD6D-R3: 5'-CCTGCAGGCTAAGCAAGTGCCGCGATGTC-3' (SEQ ID NO: 15) para dar pMON67051. La TsD6D-1 CDS se colocó enseguida por atrás de promotor específico de semila 7S digiriendo pMON67051 con Salí y Sse8387l y ligando el fragmento resultante en pMON67052 digerido por Xhol/Sse8387l para dar pMON67053. El cassette de expresión 7Sa::TsD6D-1 ::E9 resultante se movió a un vector binario de planta que contenía el NcFad3nno impulsado por el promotor específico de semilla, USP99. Esto se logró digiriendo el vector pMON67053 con Notl y después ligando el fragmento resultante en pMON67046 parcialmente digerido por Notl (vector que contenía USP99::NcFAD3nno::nos) para dar pMON94002. Explantes transformados que contenían pMON94002, se obtuvieron mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Las plantas se regeneraron a partir de tejido transformado. Las plantas que crecieron en invernadero después se analizaron para composición de aceite.

El efecto de expresión de la secuencia codificadora de TsD6D-1 junto con NcFad3nno se midió determinando la composición de ácido graso de semilla madura por cromatografía de gases de derivados de éster metílico lipídico ((PCT US03/16144, presentada el 21 de mayo de 2003, cuya descripción se incorpora específicamente aquí por referencia en su totalidad). Los niveles de OA (ácido oleico), LA (ácido linoleico), GLA (ácido ?-linolénico), ALA (ácido a- linolénico) y SDA (ácido estearidónico) se expresan como un porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos y se muestran en el cuadro 3. La línea no transgénica A3525 se incluye como control negativo. Los valores se expresan como un promedio de valores no nulos de tantas como 6 semillas R1 individuales.

CUADRO 3 Resultados de por ciento de área relativa de semilla R1 individual de soya transformada con pMON94002 Acido graso (por ciento en peso) Pedigrí Gen Oleico LA ALA GLA SDA GLA/SDA A3525 - 17.44 56.1 9.1 - - - GM A74156 R1 15.5 47.7 16.1 3.1 0.4 7.2 GM A74004 R1 14.4 37.2 12.4 13.7 4.9 2.8 GM A73961 R1 15.8 38.6 7.0 19.2 1 .5 13.0 GM A73654 R1 14.5 28.1 5.7 27.4 4.6 5.9 GM A73962 R1 14.0 25.7 6.4 28.4 4.9 5.8 GM A73657 R1 13.5 17.3 8.7 31 .8 9.2 3.5 GM_A74165 R1 17.9 20.3 4.7 33.8 3.9 8.6 GM A74162 R1 15.2 19.5 5.1 35.3 5.3 6.7 GM_A73612. R1 22.6 8.1 3.1 38.1 4.3 8.8 GM A73597 R1 18.4 6.7 3.7 39.3 6.2 6.3 GM A74496 R1 18.5 10.6 4.3 39.4 6.5 6.0 GM A73977 R1 15.6 10.6 4.9 41.1 7.9 5.2 GM A7361 1 R1 18.4 12.2 3.9 41.4 4.7 8.9 GM A74014 R1 16.3 1 .0 3.9 41.9 5.5 7.6 GM A74462 R1 15.4 10.1 4.8 42.3 7.0 6.0 GM A74410 R1 15.7 8.1 4.0 42.6 7.2 6.0 GM A73997 R1 13.0 13.6 4.8 42.8 6.0 7.1 GM A73590 R1 14.8 8.4 4.3 42.8 8.0 5.3 GM A73633 R1 18.3 9.3 3.4 43.3 4.8 9.1 GM_A73645 R1 14.4 8.0 4.5 43.4 8.0 5.4 GM_A74474 R1 15.1 1 1.4 3.9 43.5 5.6 7.8 GM A74440 R1 15.5 7.7 4.4 43.8 7.6 5.7 GM A74155 R1 12.5 8.8 4.3 43.9 8.8 5.0 GM A73603 R1 15.1 8.1 4.5 44.0 7.3 6.0 GM A74 70 R1 14.5 13.6 3.6 44.1 3.7 1 1 .8 GM_A73675 R1 15.4 12.8 3.9 44.4 4.2 10.5 GM A74016 R1 14.0 10.7 4.1 44.6 6.1 7.3 GM A73963 R1 1 1.8 8.0 4.2 44.9 9.0 5.0 GM A7361 7 R1 15.6 7.4 3.7 45.0 6.8 6.6 GM A74263 R1 13.3 9.4 4.6 45.0 8.2 5.5 GM A7451 1 R1 12.6 7.0 4.1 45.2 9.3 4.9 GM A74422 R1 12.0 8.1 4.7 45.6 9.8 4.7 GM A74176 R1 13.8 8.6 4.2 45.7 7.6 6.0 GM_A73598 R1 14.6 8.8 3.6 45.8 5.9 7.8 GM_A74463 R1 15.3 9.3 3.9 45.9 5.3 8.7 GM A74259 R1 13.5 12.4 4.2 46.1 5.8 7.9 GM A74166 R1 14.0 10.3 3.8 46.1 5.5 8.4 GM A73588 R1 10.6 10.3 4.6 46.3 7.6 6.1 GM A74160 R1 16.9 10.1 2.8 46.4 2.5 18.3 GM A73971 R1 15.5 10.4 2.9 47.0 3.1 15.0 GM_A74451 R1 12.7 10.5 3.7 47.9 6.0 7.9 GM_A73981 R1 12.9 7.2 2.8 50.3 5.3 9.5 Todos los eventos transgénicos de pMON94002 en el cuadro 3 acumulan cantidades medibles de GLA y SDA. En todos los casos, los niveles de GLA fueron mayores que los de SDA, en donde los valores de GLA variaban de 3.1 % a 50.3% y los valores de SDA variaban de 0.4% a 9.8%. El valor de semilla individual más alto para GLA se observó el evento GM_A73981 , que contenía 50.3% de GLA y 5.3% de SDA. El evento GM_A74160 tuvo la relación de GLA/SDA más alta de 18.3. De los 41 eventos mostrados anteriormente, 31 tuvieron valores de GLA >40% en por lo menos tres de cuatro semillas. A medida que los valores de GLA incrementaron, los niveles de LA disminuyeron significativamente con valores que empezaban en 56% y llegaban tan bajo como 6.7%. Los valores de OA y ALA también disminuyeron al incrementar PUFA pero no al mismo grado que LA.

EJEMPLO 4 Actividad de A6-desaturasa de Tetraselmis suecica en cañóla y Arabidopsis La actividad de ?ß-desaturasa de Tetraselmis suecica se evaluó transformando Arabidopsis y cañóla con pMON82848 (TsD6D-1 , figura 3) y pMON82849 (TsD6D-2, figura 4). Los genes TsD6D-1 y -2 de T. suecica nativos fueron ambos impulsados por un promotor constitutivo 35S. Se construyó pMON82848 en 2 pasos. Primero, una secuencia Kozak de dicotiledónea de consenso se añadió a la secuencia codificadora de TsD6D por PCR a partir de pMON67034 usando los iniciadores TsD6D-F2: 5'-AAAAATGGGCAGGGGTGGGTTTACT-3' (SEQ ID NO: 16) y TsD6D-R1 : 5'- CTAAGCAAGTGCCGCGATGTCCG -3' (SEQ ID NO: 10) y después ligando el fragmento resultante en pCR2.1 -TOPO (Invitrogen) para dar pMON82833. El vector pMON82833 fue digerido después con Xhol y SacI y el fragmento resultante se ligó a pMON73273 digerido por Sall/Sacl para dar pMON82848. El vector binario pMON82849 se construyó de una manera similar usando la variante TsD6D-2. Los explantes transformados que contenían pMON82848 y pMON82849 se obtuvieron mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las plantas se regeneraron a partir de tejido transformado. Las plantas que crecieron en invernadero fueron después analizadas para composición de aceite. La composición de ácido graso de hojas liofilizadas se determinó por análisis de CG de lípidos derivados de éster metílico como se hizo anteriormente para transformantes de soya y se muestran en los cuadros 4 y 5. Los niveles de OA, LA, GLA, ALA, y SDA se expresan como porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos. El análisis de CG de hoja de cañóla de plantas transformadas con pMON82848 dio 33 eventos con niveles de GLA que variaban de 0.7% a 21 .5% y niveles de SDA que variaban de 0.5% a 12.9%, respectivamente. Los valores de GLA son consistentemente mayores que los valores de SDA dando relaciones de GLA SDA de .1 a 2.2. La línea Ebony no transgénica se incluyó como un control negativo que mostró niveles altos de ALA a 54.6%, niveles más bajos de LA a 13.5%, y cantidades no medibles de GLA y SDA. El evento BN 13396 tiene el nivel más alto de GLA a 21 .5% con LA a 6.6%. El evento BN_G13295 contenía 12.9% de SDA, que es el valor más alto observado para este conjunto de plantas de cañota. El ácido oleico mostró un ligero incremento del control de Ebony de 1 .3% a un valor alto de 3.6% en el evento BN_G13299. ALA fue afectado negativamente empezando a 54.6% en el control de Ebony y disminuyó a un valor tan bajo como 22.2% en el evento BN G13296.

CUADRO 4 Resultados de por ciento de área relativa de hojas de cañóla R1 transformadas con pMON82848 Ácid o graso ( por ciento en peso) Evento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA EBONY VARIEDAD 1 .4 14.3 0.0 54.2 0.0 - BN G13292 RO 1.9 16.8 0.7 49.5 0.5 1.4 BN G 13286 RO 1.9 16.1 2.1 47.6 1.9 1.1 BN G13320 RO 1.7 11.2 7.2 40.8 5.3 1.3 BN G9283 RO 1.0 6.7 9.4 32.1 8.1 1.2 BN G9282 RO 0.9 6.0 10.1 30.6 7.8 1.3 BN G 13336 RO 2.3 14.3 10.5 34.0 6.6 1.6 BN G9281 RO 1.1 6.1 10.9 28.9 8.7 1.2 BN G13299 RO 3.6 1 1 .0 12.7 30.0 9.0 1.4 BN G 13367 RO 2.3 8.1 14.5 30.1 9.8 1.5 BN G13351 RO 2.4 7.4 14.7 29.8 10.8 1.4 BN G13297 RO 2.8 7.9 14.9 26.6 12.0 1.2 BN G13289 RO 2.5 8.8 15.2 29.0 9.9 1.5 BN G13339 RO 2.7 8.0 15.6 26.7 10.0 1.6 BN G13291 RO 2.0 6.5 16.2 29.1 10.3 1.6 BN_G 13337 RO 2.4 9.0 16.2 27.9 10.1 1.6 BN G 13369 RO 2.8 8.1 16.4 27.4 9.3 1.8 BN G 13334 RO 2.0 8.9 16.5 29.0 9.6 1.7 BN G 13295 RO 2.8 6.5 16.6 24.1 12.9 1.3 BN G 13346 RO 2.6 9.3 16.7 26.6 9.3 1.8 BN G 13298 R0 2.7 9.0 16.8 27.9 9.6 1 .7 BN G13342 RO 3.4 1 1.5 17.0 26.3 9.1 1.9 BN G13327 RO 2.2 9.3 17.0 28.2 9.2 1 .8 BN G 13344 RO 2.7 7.6 17.2 26.6 9.8 1.8 BN G 13294 RO 2.5 5.9 7.4 27.5 9.9 1 .8 BN G13324 RO 1.4 7.0 1 7.5 27.8 11.3 1.6 BN G13341 RO 2.6 8.9 18.3 26.0 9.4 1.9 BN G13332 RO 2.7 8.1 18.8 24.7 10.0 1.9 BN G 13288 RO 2.5 7.4 18.8 25.5 9.9 1 .9 BN G 13296 RO 3.0 7.2 20.0 22.2 11.7 1 .7 BN G 13340 RO 2.4 9.0 20.1 25.5 9.6 2.1 BN_G 13383 RO 2.5 6.1 20.5 23.5 10.0 2.1 BN G13347 RO 2.1 7.4 20.5 25.0 10.1 2.0 BN G 13396 RO 2.3 6.6 21.5 24.0 9.9 2.2 Los resultados de CG para 31 eventos de cañóla pMON82849 se muestran en el cuadro 5. El patrón de más GLA que SDA es consistente con el observado pata plantas pMON82848 con relaciones de GLA/SDA que varían de 1 .0 a 2.3. El evento BN G13422 tiene el nivel más alto de GLA a 21.9%, que es muy similar al valor de pMON82848 de 21.5% (evento BN_G 13396).

CUADRO 5 Resultados de por ciento de área relativa de hojas de cañóla R1 transformadas con pMON82849 Ácido graso (por ciento en peso) Evento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA BN G9624 R0 1 .4 13.2 3.0 45.4 2.5 1.2 BN G13441 R0 3.0 15.5 5.6 39.9 5.3 1.1 BN G9307 R0 0.6 5.0 9.9 32.7 9.5 1.0 BN G13425 R0 2.3 9.6 1 1 .6 32.4 10.0 1.2 BN G 3460 R0 3.2 13.2 11.7 32.3 7.6 1.5 BN G 13309 RO 2.1 8.3 1.8 30.9 11.3 1.0 BN G 13440 RO 2.9 13.8 12.1 31.9 8.0 1.5 BN G9364 RO 1.0 4.9 13.5 29.0 8.6 1.6 BN G 13448 RO 2.5 7.7 14.6 28.0 11.9 1.2 BN G 3433 RO 2.8 11.5 14.6 29.1 9.3 1.6 BN G13313 RO 2.1 6.4 15.3 28.3 11.0 1.4 BN G13305 RO 2.5 6.1 15.7 25.2 12.2 1.3 BN G13317 RO 2.6 6.3 16.2 27.6 11.4 1.4 BN G 3489 RO 3.6 7.8 16.6 24.4 13.4 1.2 BN G 13436 RO 3.2 9.9 16.7 26.9 9.7 1.7 BN G13314 RO 3.1 7.4 16.8 22.8 12.3 1.4 BN G13319 RO 2.7 7.2 17.1 26.0 10.8 1.6 BN G 3431 RO 1.8 7.0 17.2 29.5 9.2 1.9 BN G13302 RO 2.5 7.3 17.9 24.0 12.6 1.4 BN G 13308 RO 2.9 10.3 17.9 24.4 10.2 1.7 BN G13315 RO 1.5 6.5 18.1 25.1 12.8 1.4 BN G 13434 RO 2.7 9.8 18.2 25.4 9.4 1.9 BN G 13300 RO 3.0 8.5 18.6 23.0 11.4 1.6 BN G13310 RO 1.9 6.6 18.8 25.9 10.7 1.8 BN G13311 RO 3.0 7.5 19.3 23.8 10.5 1.8 BN G13306 RO 2.0 7.5 19.4 21.6 13.2 1.5 BN G13316 RO 2.6 6.1 20.1 23.9 11.1 1.8 BN G13318 RO 2.4 6.7 20.9 23.0 11.4 1.8 BN G 13428 RO 2.6 7.3 21.3 25.8 8.9 2.4 BN G 13304 RO 2.1 6.8 21.6 22.0 11.0 2.0 BN G13422 RO 2.5 6.4 21.9 23.7 9.7 2.3 La composición de ácido graso de semilla madura recolectada de los mismos eventos pMON82848 y pMON82849 se determinó por análisis de CG de lípidos derivados de éster metílico como se hizo átomos para soya transgénica y se muestran en el cuadro 6 y 7. Los niveles de OA, LA, GLA, ALA, y SDA se expresan como un porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos.

El análisis de CG de semilla de cañóla de plantas transformadas con pMON82848 dio 32 eventos con niveles de GLA y SDA que variaban de 1 .4% a 5.9% y 0.0% a 1.5%, respectivamente (% en peso, acervo de 100 semillas). Los valores de GLA son consistentemente mayores que los valores de SDA dando relaciones de GLA/SDA de 3.6 a 6.1. En esta generación, las plantas son hemicigóticas para el transgén y por lo tanto la semilla R1 de acervo representa una población segregante de homocigoticos, hemicigóticos y nulos. La línea Ebony no transgénica se incluye como un control negativo con 70.9% de ácido oleico, 15.7% de LA, 5.8% de ALA, y cantidades no medibles de GLA o SDA. El evento BN_G13368 tiene el nivel más alto de GLA a 5.9% con LA a 10.6%, que es reducido del nivel no transgénico de 15.7%.

Los eventos BN_G13295 y BN_G13368 contenían ambos 1.5% de SDA, que es el nivel más alto observado para este conjunto de plantas de cañóla. OA y ALA fueron menos afectados por niveles cada vez mayores de GLA que LA.

Aunque los eventos BN_G13367 y BN_G13299 tuvieron entre 1 .6% y 2.0% de GLA, respectivamente, ninguno contenía cantidades medibles de SDA.

CUADRO 6 Resultados de por ciento de área relativa promedio de 100 semillas R1 individuales de cañóla transformadas con pMON82848 Ácido graso ( por ciento en peso) Evento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA EBONY VARIEDAD 70.9 15.7 0.0 5.8 0.0 NA BN G 13336 R1 67.8 17.2 1.4 6.0 0.4 3.9 BN G 13342 R1 71 .8 14.3 1.5 5.1 0.3 4.5 BN G13367 R1 71 .3 14.0 1 .6 5.1 0.0 NA BN G 13299 R1 69.4 15.3 2.0 5.5 0.0 NA BN G13297 R1 68.9 15.2 2.3 5.0 0.5 4.9 BN G13334 R1 65.5 17.5 2.4 7.0 0.6 4.0 BN G 13339 R1 67.5 16.5 2.5 5.6 0.6 4.6 BN G9283 R1 65.7 17.1 2.6 6.2 0.7 3.6 BN G9281 R1 66.7 16.6 2.6 6.4 0.7 3.9 BN G13337 R1 70.3 14.1 2.7 5.1 0.6 4.5 BN G13286 R1 67.0 16.4 2.7 6.0 0.7 4.0 BN G13327 R1 69.7 14.3 2.8 5.2 0.6 4.5 BN G13298 R1 68.2 15.7 2.9 5.1 0.6 5.0 BN G 13346 R1 67.7 15.3 3.1 5.9 0.7 4.3 BN G13351 R1 63.9 18.2 3.2 6.7 0.7 4.3 BN G13289 R1 66.8 15.1 3.4 4.5 0.6 6.1 BN G13296 R1 68.7 14.5 3.4 4.8 0.7 5.2 BN G13369 R1 65.1 16.3 3.5 7.1 0.9 3.9 BN G13324 R1 66.5 16.2 3.5 5.9 0.8 4.2 BN G13291 R1 65.9 15.0 3.6 5.0 0.7 5.6 BN G13340 R1 69.3 14.4 3.8 4.3 0.8 4.9 BN G 13344 R1 67.1 15.5 4.0 5.4 0.9 4.7 BN G9282 R1 64.5 16.5 4.0 6.2 1.2 3.4 BN G13347 R1 66.5 15.8 4.1 5.1 0.8 5.2 BN G 3341 R1 66.6 15.9 4.1 5.0 0.8 5.4 BN G13396 R1 68.6 13.4 4.3 5.2 1 .1 4.1 BN G13332 R1 67.2 14.9 4.7 5.0 1 .0 4.7 BN G13294 R1 63.7 17.3 4.7 5.7 1.0 4.9 BN G13288 R1 66.9 13.4 5.0 5.7 1.3 4.0 BN G13295 R1 67.9 1.0 5.1 4.3 1 .5 3.3 BN G13383 R1 65.9 14.7 5.7 4.9 1 .2 4.9 BN G 13368 R1 68.7 10.7 5.9 4.5 1 .5 3.9 Los resultados de CG para 30 eventos de cañóla pMON82849 se muestran en el cuadro 7. El patrón de más GLA que SDA es consistente con aquél observado para plantas pMON82848 con relaciones de GLA/SDA que varían de 3.1 a 6.0. El evento BN_G13316 tiene el valor más alto de GLA a 8.3%, que es ligeramente mayor que el valor de pMON82848 más alto de 5.9% (evento BN_G 13368).

CUADRO 7 Resultados de por ciento de área relativa promedio de 100 semillas R1 individuales de cañóla transformadas con pMON82849 pMON82848 y pMON82849 también fueron transformad Arabidopsis para determinar la composición de ácido graso en hojas y semillas. Los explantes transformados que contenían pMON82848 y pMON82849 se obtuvieron mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las plantas se regeneraron a partir de tejido transformado. Las plantas que crecieron en invernadero fueron después analizadas para composición de aceite.

El efecto de expresión de TsD6D-1 y TsD6D-2 se midió determinando la composición de ácido graso de hoja de Arabidopsis por cromatografía de gases de derivados de éster metílico lipídico (PCT US03/16144, presentada el 21 de mayo de 2003, cuya descripción se incorpora específicamente aquí por referencia en su totalidad). Las hojas de Arabidopsis se cosecharon de plantas jóvenes y se liofilizaron para remover toda la humedad antes de la derivación. Los niveles de OA, LA, GLA, ALA, y SDA expresados como porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos para 12 eventos pMON82848 se muestran en el cuadro 8. El ecotipo no transgénico Columbia se incluye como un control negativo CUADRO 8 Resultados de por ciento de área relativa de hojas R1 de Arabidopsis transformada con pMON82848 Acido graso (por ciento en peso) Evento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA Columbia VARIEDAD 1 .6 13.6 0.0 53.3 0.0 - AT G2951 R1 3.1 14.4 4.0 38.9 3.0 1 .4 AT G2951 R1 9.7 15.4 5.5 29.1 3.4 1.6 AT G2951 R1 5.0 14.0 5.9 34.4 3.8 1 .5 AT G2951 R1 4.3 15.5 5.9 33.4 3.9 1.5 AT G2951 R1 5.3 14.6 5.9 34.3 4.3 1.4 AT G2951 R1 5.2 12.8 6.4 33.8 4.6 1.4 AT G2951 R1 7.5 14.9 7.3 29.4 4.3 1.7 AT G2951 R1 6.9 14.4 7.9 29.3 4.8 1 .7 AT G2951 R1 7.4 14.6 9.3 26.7 6.1 1 .5 AT G2951 R1 3.7 10.8 10.4 30.7 6.8 1 .5 AT G2951 R1 5.9 12.8 10.6 27.1 6.1 1.7 AT_G2951 R1 3.2 8.2 17.4 20.5 6.8 2.5 El cuadro 8 muestra que TsD6D es capaz de alterar la composición de ácido graso de hoja de Arabidopsis. En todos los eventos listados anteriormente, los valores son mayores para GLA que SDA, que es similar al patrón de ácido graso observado en semilla cañóla y soya transgénica. El incremento en GLA y SDA fue a expensas de ALA, que disminuye de un valor no transgénico de 62.8% a un valor bajo de 20.5% observado en el evento ATJ32951. Este evento tuvo un nivel más alto de GLA (17.4%) y SDA (6.8%). Es interesante notar que aun cuando el nivel de ALA es 4.5 veces mayor que LA, los niveles de GLA son consistentemente mayores que SDA, lo que demuestra nuevamente la preferencia que tiene TsD6D para el sustrato omega-6.

Los resultados de CG para 12 eventos de Arabidopsis pMON82849 se muestran en el cuadro 9. El patrón de más de GLA que SDA es consistente con el observado para plantas pMON82848 con relaciones de GLA/SDA que varían de 1.4 a 1.9. El evento AT_G2952 tiene el nivel más alto de GLA a 9.9% en comparación con el valor de GLA más alto de 17.4% para el evento AT_G2951 (pMON82848).

CUADRO 9 Resultados de por ciento de área relativa de hojas R1 de Arabidopsis transformada con pMON82849 La composición de ácido graso de semillas R2 maduras de Arabidopsis se determinó por análisis de CG de lípidos derivados de éster metílico como se hizo anteriormente para semilla de soya. Los valores para semilla de acervo de 20 eventos transgénicos de pMON82848 se muestran en el cuadro 10 (% en peso, acervo de 100 semillas). Los niveles de GLA y SDA varían de 0.8% a 14.2% y 0.3% a 2.8%, respectivamente. Los valores de GLA son consistentemente mayores que los valores de SDA. En esta generación R1 , las plantas son hemicigóticas para el transgén y por lo tanto la semilla R2 de acervo representa una población segregante de homocigóticos, hemicigóticos y nulos. La línea no transgenica Columbia se incluye como un control negativo. El evento AT_G2914 tiene el nivel más alto de GLA a 14.3% con SDA a 2.7%.

CUADRO 10 Resultados de por ciento de área relativa promedio de semilla de Arabidopsis transformada con pMON82848 Los resultados de CG para 12 eventos de Arabidopsis pMON82849 se muestran en el cuadro 1 1 . El patrón de más GLA que SDA es consistente con el observado para plantas pMON82848 con relaciones de GLA/SDA que varían de 3.2 a 5.1. El evento AT_G2947 tiene el nivel más alto de GLA a 13.3%, que es muy similar al valor de GLA más alto de 14.3% para el evento AT_G2914 (pMON82848).

CUADRO 11 Resultados de por ciento de área relativa promedio de semilla de Arabidopsis transformada con pMON82849 Ácido graso (por ciento en peso) Evento Gen Oleico LA GLA ALA SDA GLA/SDA AT G2946 R2 16.3 25.9 1.5 17.1 0.4 3.8 AT_G2949 R2 16.4 26.2 1.9 16.6 0.4 4.4 AT_G2945 R2 17.1 23.7 5.1 13.6 1.4 3.8 AT G2932 R2 17.2 22.1 6.7 13.5 1.7 4.0 AT G2936 R2 17.9 20.3 8.7 12.1 2.1 4.2 AT G2939 R2 18.6 18.1 10.3 1 1.1 2.1 4.9 AT G2944 R2 18.2 20.2 8.2 1 1.8 2.3 3.6 AT G2938 R2 16.3 21.2 7.5 13.5 2.3 3.3 AT G2943 R2 16.1 21.8 7.5 13.1 2.3 3.2 AT G2931 R2 16.5 17.5 12.5 1 1 .6 2.5 5.0 AT_G2950 R2 16.3 16.7 13.3 10.9 2.6 5.1 AT G2942 R2 16.4 19.8 9.5 12.1 2.7 3.6 AT G2935 R2 17.0 18.8 10.9 1 1.4 2.7 4.1 AT G2941 R2 17.1 19.0 9.3 12.1 2.7 3.4 AT G2948 R2 16.4 18.7 10.6 1 1 .9 2.7 3.9 AT_G2940 R2 17.3 17.1 13.0 9.9 2.8 4.7 AT G2934 R2 17.4 17.0 12.5 10.6 2.9 4.3 AT G2937 R2 15.9 17.8 12.4 1 1.6 3.1 3.9 AT_G2947 R2 15.7 17.2 13.3 10.9 3.3 4.0 EJEMPLO 5 Expresión de ?6 Desaturasa de Tetraselmis suecica en maíz Para expresión específica de semilla de la delta-6 desaturasa de Tetraselmis suecica en maíz, se clonó TsD6D-1 bajo el control del promotor L3 de maíz en pMON94502 (figura 5) con la glutelina de arroz 3 -UTR para terminación de traducción. Este vector también contenía un cassette de expresión de delta-15 desaturasa de Neurospora crassa impulsado por L3 (SEQ ID NO: 17). El cassette de expresión de delta-15 utilizó la secuencia de terminación de traducción HSP17 de trigo como 3'UTR. Además, un vector que contenía el gen TsD6D-1 modificado para expresión en plantas monocotiledóneas fue diseñado y construido. Es bien sabido en la técnica que las secuencias codificadoras de proteína no endógena se pueden expresar bien en plantas (patente de E.U.A No. 5,880,275, incorporada aquí por referencia). Por lo tanto, el uso de la secuencia de polipéptido TsD6D-1 nativa (SEQ ID NO: 2), una secuencia de polinucleótido que codifica proteína TsD6D-1 modificada se diseñó y se construyó 1 ) usando un derivador de uso de codón similar a proteínas monocotiledóneas altamente expresadas y 2) removiendo elementos desestabilizadores de ARN previamente caracterizados y que se sabe que afectan la estabilidad de ARNm in planta (patente de E.U.A No. 5,880,275). La secuencia de polinucleótido TsD6D-1 modificada resultante fue designada TsD6Dnno (SEQ ID NO: 18) y codifica un polipéptido idéntico en secuencia al polipéptido TsD6D nativo (SEQ ID NO: 2). TsD6Dnno se clonó en un vector binario que de otra manera fue idéntico a pMON94502. El vector binario nuevo fue designado pMON94503 (figura 6).

Explantes transformados que contenían pMON94502 o pMON94503, respectivamente, se obtuvieron mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las plantas se regeneraron a partir de tejido transformado. Las plantas que crecieron en invernadero se analizaron para composición de aceite. Para cada evento transgénico que se obtuvo, diez semillas R1 se analizaron para composición de ácido graso. Las composiciones de ácido graso promedio de aquellas semillas que presentaron el rasgo transgénico se muestran en los cuadros 12 y 13. La semilla individual de mayor rendimiento contenía 18.6% de SDA, y la semilla de mejor rendimiento con respecto a niveles de GLA contenía 30.9% de GLA.

CUADRO 12 Composición de ácido graso de eventos que contienen pMON94502 % de % de % de % de % de Evento OA LA ALA GLA SDA GLA/SDA ZM S137162 0.3 22.5 5.4 25.7 6.9 3.7 ZM S137159 0.9 19.5 6.7 26.1 8.7 3.0 ZM S137155 1.3 15.0 7.6 25.1 12.6 2.0 ZM S137149 0.1 24.0 6.6 23.2 7.7 3.0 CUADRO 13 Composición de ácido graso de eventos que contienen pMON94503 % de % de % de % de % de Evento Ole LA ALA GLA SDA GLA/SDA ZM S139635 22.8 22.2 7.2 21.9 8.0 2.7 ZM S 139623 22.7 20.3 7.2 22.2 9.1 2.4 ZM S139618 22.6 33.1 19.5 4.2 3.4 1.3 ZM S139616 22.0 27.5 7.0 19.7 5.8 3.4 ZM S139613 21.9 16.4 7.6 23.8 11.8 2.0 ZM S 139542 22.4 23.6 7.2 21.2 7.0 3.0 ZM S 139458 22.4 19.2 7.1 23.0 9.4 2.5 EJEMPLO 6 Expresión de ?6 Desaturasa de Tetraselmis suecica en relación con otras desatu rasas Para algunas aplicaciones puede ser ventajoso optimizar la biosíntesis de GLA o biosíntesis de SDA a fin de aumentar al máximo los niveles de GLA o SDA en el aceite. Cada especie de cultivo varía con respecto a su composición de ácido graso de aceite de semilla. Como resultado, la estrategia específica para optimizar la biosíntesis de GLA o SDA puede variar ligeramente de un cultivo a otro. Para optimizar la biosíntesis de SDA, es ventajoso combinar la expresión de delta-6 desaturasa con un delta- 15 desaturasa a fin de aumentar al máximo el ALA de acervo de sustrato para la delta-6 desaturasa para producir SDA. Por ejemplo, para obtener un aceite de semilla aumentada al máximo por SDA, la delta-15 desaturasa de Mortierella alpina y la delta-6 desaturasa de T. suecica se clonan bajo el control de promotores específicos de semilla fuertes utilizando el promotor más fuerte para la delta-15 desaturasa. La construcción se transforma en una planta y la semilla R1 de esas plantas se analiza para composición de ácido graso. Algunas plantas tales como cañóla o olivos producen aceites de semilla con cantidades sustanciales de ácidos grasos monoinsaturados (ácido oleico). A fin de convertir ácido oleico a un sustrato para la formación de SDA es deseable convertir OA a LA. Esto se logra mediante la adición de delta-12 desaturasa a la combinación de desaturasa descrita anteriormente. Por ejemplo, una delta-12 desaturasa de N. crassa (publicación del PCT WO2003099216 (Ursin et al.)), una delta-15 desaturasa de N. crassa y una delta-6 desaturasa de T. suecica se clonan bajo el control de promotores específicos de semilla y se transforman en plantas. La semilla R1 de estas plantas se analiza para composición de ácido graso. Un ejemplo de optimización de los niveles de ácidos grasos en soya se demuestra. La actividad de A6-desaturasa de T. suecica se evalúa en semilla de soya combinándolo con una A 5-desaturasa incrementada por codón de dicotiledónea de M. alpina (MaFad3nno) (SEQ ID NO: 19) para dar pMON94060 (figura 7). El vector pMON94060 se construyó en 6 pasos. Primero, los sitios de restricción, Salí y Sse8387 I se añadieron a los extremos de la secuencia codificadora de TsD6D-1 (CDS) mediante amplificación por PCR de pMON67034 (TsD6D-1 en pYES2.1 ) usando oligonucleótidos TsD6D- F3: 5'-GTCGACAAACAATGGGCAGGGGTGGGTTTA-3' (SEQ ID NO: 14), y TsD6D-R3: 5'-CCTGCAGGCTAAGCAAGTGCCGCGATGTC-3' (SEQ ID NO: 15) para dar pMON67051 . TsD6D-1 CDS se colocó enseguida por atrás del promotor específico de semilla 7S mediante digestión de pMON67051 con Salí y Sse8387l y ligando el fragmento resultante en pMON67052 digerido por Xhol/Sse8387l para dar pMON67053. El cassette de expresión de 7Sa::TsD6D-1 ::E9 se movió después a un vector binario de planta, dando por resultado pMON94055. Los sitios de restricción, Salí y Sse8387l, se añadieron a los extremos de MaFad3nno CDS mediante amplificación por PCR de pMON10351 (MaFad3nno en pYES2.1 ), usando los oligonucleótidos MaD15D F1 : 5'-GTCGACAAACAATGGCGCCACCACACGTAGTAGA-3' (SEQ ID NO: 20), y MaD15D R1 : 5'-CCTGCAGGTTAGTGCTTGTAGAACACCACATCTCC-3' (SEQ ID NO: 21 ) para dar pMON94047. Después se colocó MaFad3nno CDS por atrás del promotor eUSP88 específico de semilla digiriendo pMON94047 con Salí y Sse8387l y ligando el fragmento resultante con pMON68776 digerido por Xhol/Sse8387l para dar pMON94049. El cassette de expresión eUSP88::MaFad3nno::Nos fue después movido a pMON94055, dando por resultado pMON94060. Los explantes transformados que contenían pMON94060 se obtuvieron mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las plantas se regeneraron a partir de tejido transformado. Las plantas que pusieron en invernadero fueron después analizadas para composición de aceite. El efecto de expresión de la secuencia codificadora de TsD6D-1 junto con MaFad3nno se midió determinando la composición de ácido graso de semilla madura por cromatografía de gases de derivados de éster metílico lipídico (PCT US03/16144, presentada el 21 de mayo de 2003, cuya descripción se incorpora específicamente aquí por referencia en su totalidad).

Los niveles de OA (ácido oleico, 18:9 ?9), LA (ácido linoleico, 18:2 ?9.12), GLA (ácido ?-linolénico, 18:3 ?6.9.12), ALA (ácido a-linolénico, 18:3 ?9.12.15) y SDA (ácido estearidonico, 18:4 ?6,9, 12, 15) se expresan como el porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos y se muestra en el cuadro 14. La línea no transgénica A3525 se incluye como un control negativo. Los valores se expresan como un promedio de valores no nulos de tantas como 8 semillas R1 individuales.

CUADRO 14 Resultados de por ciento de área relativa de semilla de R1 individual de soya transformada con p ON94060 Evento Oleico LA GLA ALA SDA SDA/GLA GLA/SDA A3525 17.4 56.1 9.1 GM A172392 22.8 13.0 36.1 2.8 2.2 0.1 16.2 GM A 72882 14.9 29.6 28.8 5.9 2.5 0.1 1 1 .3 GM A172335 18.6 10.1 43.1 2.7 2.7 0.1 15.9 GM A172377 21 .4 8.1 38.8 3.0 2.8 0.1 13.9 GM A172386 20.9 12.7 39.0 3.7 2.9 0.1 13.7 GM A172342 27.2 7.9 34.8 2.7 3.0 0.1 1 1 .5 GM A172349 19.0 8.3 40.5 2.7 3.6 0.1 1 1 .1 GM A 72423 19.4 12.6 37.0 4.1 7.4 0.2 5.0 GM A 72352 21.9 8.2 35.6 3.4 7.5 0.2 4.7 GM A172900 19.9 27.5 1 .0 20.2 12.2 12.7 0.1 GM A173156 20.2 13.0 2.0 35.4 12.9 6.3 0.2 GM A172866 26.0 28.4 0.7 1 1 .2 13.3 18.8 0.1 GM A172400 20.6 6.9 29.3 3.8 13.7 0.5 2.1 GM A172390 23.0 12.4 2.9 24.9 16.1 5.5 0.2 GM A172897 25.2 25.5 1 .1 8.7 16.1 15.4 0.1 GM A172368 38.8 1.1 0.7 7.1 24.3 34.5 0.0 GM A172343 18.6 16.2 9.4 7.1 25.1 2.7 0.4 GM A172365 32.4 2.7 0.5 8.4 25.9 52.2 0.0 GM A172405 30.1 2.3 2.9 8.4 27.3 9.5 0.1 GM A172384 12.2 1 1 .8 19.5 6.9 28.3 1 .4 0.7 GM A172883 30.4 3.6 2.1 8.6 28.4 13.7 0.1 GM A172885 22.2 10.1 3.2 9.9 30.4 9.4 0.1 GM_A17241 1 22.9 8.9 2.0 9.6 31.2 15.5 0.1 GM A172356 22.0 8.7 3.4 8.3 31.4 9.1 0.1 GM A172855 23.7 6.0 5.9 10.7 31.6 5.4 0.2 GM A172393 19.1 4.9 10.3 8.5 31.7 3.1 0.3 GM A172889 23.4 4.5 3.8 8.7 32.6 8.7 0.1 GM A172339 20.5 4.7 3.4 13.7 33.1 9.7 0.1 GM A172849 23.2 3.7 4.2 8.9 33.7 8.0 0.1 GM A173 55 14.4 15.5 4.4 7.0 34.6 7.9 0.1 GM A172891 15.6 15.8 5.0 8.7 34.7 6.9 0.1 GM A172357 24.4 3.8 3.6 8.6 35.0 9.7 0.1 GM A172888 18.5 10.4 3.4 8.7 35.1 10.5 0.1 GM A173152 14.8 15.6 5.4 9.2 35.4 6.6 0.2 GM A 72862 21 .3 4.9 5.2 8.8 35.7 6.9 0.1 GM A172421 21 .6 5.2 6.1 8.3 36.1 5.9 0.2 GM A172370 17.0 4.7 4.5 1 1 .9 36.7 8.1 0.1 GM A1 72347 20.6 3.3 3.4 8.7 36.8 10.8 0.1 GM A172389 18.4 5.0 6.6 8.5 37.8 5.7 0.2 GM A172838 17.6 6.3 3.2 10.9 38.1 12.1 0.1 GM A172896 14.6 10.4 5.3 10.2 38.1 7.2 0.1 GM A172860 16.1 10.9 4.3 8.9 38.3 8.8 0.1 GM A172363 22.3 5.2 6.8 7.4 38.5 5.6 0.2 GM A172415 17.4 6.2 7.1 9.0 38.5 5.5 0.2 GM A172852 17.5 8.5 3.9 8.4 38.7 10.0 0.1 GM A172847 15.0 12.5 5.4 8.9 38.8 7.2 0.1 GM A 72355 12.6 12.7 6.2 8.2 38.8 6.2 0.2 GM A172408 16.9 6.4 7.3 8.5 39.2 5.4 0.2 GM_A172371 12.5 12.2 7.0 8.0 39.4 5.7 0.2 GM A172341 17.3 5.8 7.4 8.5 39.5 5.3 0.2 GM A172871 16.5 9.1 3.9 8.7 40.0 10.2 0.1 GM A172337 14.5 6.9 5.9 10.0 41 .0 6.9 0.1 GM A172387 16.6 4.3 6.7 8.2 41 .1 6.1 0.2 GM A172417 16.6 5.8 4.3 8.9 41 .7 9.6 0.1 GM A172361 20.9 3.2 2.2 9.2 41 .8 19.2 0.1 GM A172351 15.1 5.8 6.0 9.4 41 .9 7.0 0.1 GM A172880 18.1 4.5 4.2 7.9 42.1 10.0 0.1 GM A172419 15.0 4.3 6.3 7.7 42.1 6.7 0.2 GM A172398 14.9 5.2 7.8 7.3 42.4 5.5 0.2 GM A1 72854 15.4 3.6 3.5 12.9 42.5 12.3 0.1 GM A172843 13.5 6.7 7.9 8.0 42.6 5.4 0.2 GM_A172840 13.6 6.3 8.4 7.9 42.9 5.1 0.2 GM_A173157 12.6 6.2 9.2 8.1 43.0 4.7 0.2 GM A172345 15.2 4.1 5.6 8.0 44.0 7.8 0.1 GM A172853 14.8 5.1 5.4 9.2 44.0 8.2 0.1 GM A172372 14.8 5.2 6.5 7.1 44.1 6.7 0.1 GM A172358 15.9 6.8 3.3 7.6 45.0 13.5 0.1 GM A172868 13.8 5.0 5.0 8.7 45.5 9.0 0.1 GM_A 172884 14.0 4.4 4.9 7.9 46.2 9.4 0.1 GM A172879 1 1.9 5.9 5.0 8.8 46.6 9.3 0.1 GM_A1 72360 12.4 6.4 7.6 7.3 46.7 6.2 0.2 GM A172858 13.0 4.0 5.1 8.8 46.9 9.3 0.1 GM A172873 12.7 4.3 5.3 7.9 47.5 8.9 0.1 Todos los eventos transgénicos de pMON94060 en el cuadro 14 acumulan cantidades medibles de GLA y SDA. Valores de semilla individuales menores que 1 % no se incluyeron en el cálculo del promedio para cada evento individual. Para 10 de los eventos, los niveles de GLA son mayores que SDA, pero para los eventos restantes los niveles de SDA/GLA variaron de 1 .6% a 52.2. El valor promedio más alto para GLA es 43.1 % observado en el evento GM_A172335, que tiene sólo aproximadamente 2.72% de SDA. El evento GM_A172365 tiene la relación de SDA/GLA más alta de 52.2. Treinta y dos por ciento de los eventos tienen valores de SDA mayores que 40%. El valor de SDA más alto fue 47.5% en el evento GM_A172873. Los niveles de LA disminuyeron al aumentar los niveles de SDA y variaron de 1 .1 % a 29.6%.

Para 38 de los eventos, los niveles de ácido oleico son mayores que el valor de control no transgénico de 17.4%. El valor de ácido oleico más alto fue 38.8% observado en el evento GM_A172368. Los valores de GLA variaron de tan bajo como 0.5 en el evento GM_A172365 a tan alto como 43.1 % en el evento GM_A172335. Los niveles de ALA en la mayoría de los eventos fueron cercanos al nivel no transgénico original de 9.1 %. Aproximadamente 83.5% de 61 eventos de los 73 tuvieron entre 5.0% y 13.7% de ALA. Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados aquí se pueden hacer y ejecutar sin experimentación extraordinaria a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito aquí sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes descritos aquí mientras se obtienen los mismos resultados o resultados similares. Todos esos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica se considera que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como lo definen las reivindicaciones anexas.

Referencias Las siguientes referencias, al grado que pueden proveer detalles de procedimiento ilustrativos u otros detalles complementarios a los expuestos aquí se incorporan específicamente aquí por referencia. Patente de E.U.A. 4,518,584; patente de E.U.A. 4,737,462; patente de E.U.A. 4,810,648; patente de E.U.A. 4,826,877; patente de E.U.A. 4,957,748; patente de E.U.A. 5,094,945; patente de E.U.A. 5,100,679; patente de E.U.A. 5,158,975; patente de E.U.A. 5,196,525; patente de E.U.A. 5,219,596; patente de E.U.A. 5,290,924; patente de E.U.A. 5,322,783; patente de E.U.A. 5,359,142; patente de E.U.A. 5,424,398; patente de E.U.A. 5,424,412; patente de E.U.A. 5,500,365; patente de E.U.A. 5,530,196; patente de E.U.A. 5,538,880; patente de E.U.A. 5,550,318; patente de E.U.A. 5,563,055; patente de E.U.A. 5,610,042; patente de E.U.A. 5,627,061 ; patente de E.U.A. 5,633,435; patente de E.U.A. 5,641 ,876; patente de E.U.A. 5,880,275; patente de E.U.A. 5,936,069; patente de E.U.A. 6,005,076; patente de E.U.A. 6,040,497; patente de E.U.A. 6,051 ,753; patente de E.U.A. 6,146,669; patente de E.U.A. 6,156,227; patente de E.U.A. 6,319,698; patente de E.U.A. 6,433,252; patente de E.U.A. 6,451 ,567; publicación de patente de E.U.A. 20030093828; publicación de patente de E.U.A. 20030229918; publicación de patente de E.U.A. 20040039058 Barany er a/., Int. J. Peptide Protein Res., 30:705-739, 1987. Bauer ef a/., Gene, 37:73, 1985. Belanger y Kriz, Genetics, 129:863-872, 1991.

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Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un polinucleotido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, en donde el polinucleotido se selecciona del grupo que consiste de: a) un polinucleotido que codifica la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4; b) un polinucleotido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; c) un polinucleotido que híbrida a SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o un complemento del mismo, bajo condiciones de 5X SSC, 50% de formamida y 42°C; y d) un polinucleotido que codifica un polipéptido con por lo menos 75% de identidad de secuencia a una secuencia de polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4.

2.- Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o un fragmento de la misma que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6.

3. - Una construcción de ADN que comprende la secuencia de polinucleotido aislada de la reivindicación 1.

4. - La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque también comprende un promotor heterólogo operablemente enlazado a la secuencia de polinucleotido aislada de la reivindicación 1.

5. - La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque también comprende por lo menos una secuencia de polinucleótido adicional que codifica una ácido graso desaturasa.

6. - Una célula hospedero transformada con la construcción de ADN de la reivindicación 3.

7. - La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la célula hospedero es una célula vegetal.

8. - La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la célula hospedero es una célula fungal o bacteriana.

9. - La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la célula hospedero presenta biosíntesis de ácido graso alterada en relación con una célula del mismo genotipo que la célula hospedero pero que carece de la construcción de ADN.

10. - La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la célula ha heredado la construcción de ADN de un progenitor de la célula.

11. - Una planta transgénica transformada con la construcción de ADN de la reivindicación 3.

12. - La planta de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque la planta se selecciona del grupo que consiste de cañóla, Brassica campestris, colza de semilla oleaginosa, semilla de colza, soya, crambe, mostaza, algarrobo, cacahuate, ajonjolí, semilla de algodón, semilla de linaza, cártamo, palma de aceite, linaza, girasol, maíz, arroz, cebada, mijo, centeno, trigo, avena, alfalfa y sorgo.

13.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque también comprende por lo menos un polinucleótido adicional que codifica una ácido graso desaturasa.

14.- Una semilla de la planta de la reivindicación 1 , en donde la semilla comprende la construcción de ADN.

15.- Una composición de aceite extraída de semilla de maíz que comprende un contenido de GLA de aproximadamente 5% a aproximadamente 26% en peso del total de ácidos grasos.

16. - La composición de aceite de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque comprende un contenido de SDA de aproximadamente 3% a aproximadamente 13% en peso del total de ácidos grasos.

17. - Una composición de aceite extraída de semilla de maíz que comprende un contenido de GLA de por lo menos 3% en peso del total de ácidos grasos y un contenido de SDA de por lo menos 3% en peso del total de ácidos grasos, en donde la relación de GLA/SDA es entre aproximadamente .3 y aproximadamente 3.7.

18. - Una composición de aceite extraída de semilla de soya que comprende un contenido de GLA de aproximadamente 9% a aproximadamente 51% en peso del total de ácidos grasos.

19. - La composición de aceite de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque comprende un contenido de SDA de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10% en peso del total de ácidos grasos.

20. - Una composición de aceite extraída de semilla de soya que comprende un contenido de GLA de por lo menos 1 % en peso del total de ácidos grasos y un contenido de SDA de por lo menos 1% en peso del total de ácidos grasos, en donde la relación de GLA/SDA es entre aproximadamente 2.8 y aproximadamente 8.3.

21. - Un método para producir alimento o alimento para animales, que comprende los pasos de: (a) obtener la planta transgénica de conformidad con la reivindicación 11 o una parte de la misma; y (b) producir dicho alimento o alimento para animales.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , en donde el alimento o alimento para animales es aceite, ensilaje, harina, grano, almidón, harina fina o proteína.

23. - Una composición de alimento o alimento para animales producida por el método de la reivindicación 21 y que comprende una molécula de ácido nucleico detectable que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 1 o un polipéptido detectable codificado por el polinucleótido aislado de la reivindicación 1.

24. - Una composición de alimento o alimento para animales producida por el método de la reivindicación 21 , en donde la composición de alimento o alimento para animales comprende GLA o SDA.