ES2328427T3 - Modificacion de la composicion de acido graso en plantas mediante la expresion de una delta-9 coa desaturasa de aspergillus nidulans. - Google Patents

Abstract

Una planta transgénica que produce semillas para aceite, que produce semillas que contienen aceite que tiene, comparado con el tipo salvaje, un menor nivel de ácidos grasos saturados, en la que dicha planta expresa un transgén que codifica una delta-9 CoA desaturasa de Aspergillus que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

Description

Modificación de la composición de ácido graso en plantas mediante la expresión de una \Delta-9 CoA desaturasa de Aspergillus nidulans.

Referencia a la solicitud relacionada

Esta solicitud de patente reivindica la prioridad de una solicitud de patente provisional de EEUU nº de serie 60/079840, presentada el 30 de marzo, 1998.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la preparación y al uso de fragmentos de ácidos nucleicos o genes que codifican enzimas palmitoil-CoA A-9 desaturasas fúngicas para crear plantas transgénicas con perfiles de aceite alterados.

Antecedentes de la invención

Los aceites producidos por plantas pueden encontrarse en una amplia variedad de productos, incluyendo lubricantes y alimentos. De forma interesante, diferentes especies de plantas sintetizan diversos tipos de aceites. Por ejemplo, los cocoteros y las palmeras producen aceites que son abundantes en ácidos grasos que tienen una longitud de cadena media (10-12 átomos de carbono). Estos aceites se utilizan en la fabricación de sopas, detergentes y tensioactivos, y representan un mercado en EEUU de más de 350 millones de dólares anuales. Otras plantes, como la colza, producen aceites abundantes en ácidos grasos de cadena larga (22 átomos de carbono) y se emplean como lubricantes y agentes antideslizamiento. Otras aplicaciones de los aceites vegetales incluyen su uso en plastificantes, revestimientos, pinturas, barnices y cosméticos (Volker et al. (1992), Science 257:72-74; Ohlrogge (1994), Plant Physiol., 104:821-826). Sin embargo, el uso predominante de los aceites vegetales es para la producción de alimentos y productos alimentarios.

A lo largo de los años, los aceites derivados de vegetales han sustituido gradualmente a los aceites y grasas derivados de animales como fuente principal de la ingesta de grasa en la dieta. Sin embargo, la ingesta de grasas saturadas en la mayoría de las naciones industrializadas sigue siendo de aproximadamente 15% a 20% del consumo calórico total. Para intentar estimular estilos de vida más saludables, el departamente de agricultura de EEUU (United States Department of Agriculture (USDA)) ha recomendado recientemente que las grasas saturadas sean menos del 10% de la ingesta calórica diaria. Para facilitar la concienciación del consumidor, las directrices de etiquetado actuales emitidas por el USDA ahora requieren que los niveles de ácidos grasos saturados totales sean menores que 1,0 g por ración de 14 g para recibir el etiquetado de bajo en grasas saturadas, y menores que 0,5 g por ración de 14 g para recibir el etiquetado de no llevar grasas saturadas. Esto significa que el contenido en ácidos grasos saturados de los aceites vegetales debe ser menor que 7% y 1,75% para recibir el etiquetado de bajo en grasas saturadas y de no llevar grasas saturadas, respectivamente. Desde la emisión de estas directrices ha surgido en los consumidores la demanda de aceites con bajo contenido en grasas saturadas. Hasta la fecha, esto se ha cumplido principalmente con el aceite de canola y, en un grado mucho menor, con el aceite de girasol y de cártamo.

Las características de los aceites, tanto de origen vegetal como de origen animal, están determinadas predominantemente por el número de átomos de carbono e hidrógeno, así como por el número y la posición de los dobles enlaces que forman parte de la cadena de ácidos grasos. La mayoría de los aceites derivados de plantas están compuestos de cantidades variables de ácidos grasos palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1), linoleico (18:2) y linolénico (18:3). De forma convencional, los ácidos palmítico y esteárico se denominan "saturados", puesto que las cadenas de ácidos grasos tienen 16 y 18 átomos de carbono, respectivamente, y no tienen dobles enlaces. Por tanto, contienen el número máximo de átomos de hidrógeno posible. Sin embargo, los ácidos oleico, linoleico y linolénico son cadenas de ácidos grasos de 18 carbonos y tienen uno, dos y tres dobles enlaces, respectivamente. El ácido oleico se considera, de forma típica, un ácido graso monoinsaturado, mientras que el ácido linoleico y linolénico se consideran ácidos grasos poliinsaturados.

Los ácidos grasos saturados son moléculas lineales y tienden a formar estructuras autoapiladas dando como resultado, con ello, unas temperaturas de fusión elevadas, una característica que es bastante deseable cuando se producen alimentos como el chocolate. Las grasas animales, que también son sólidas a temperatura ambiente, son otra fuente fácilmente disponible de ácidos grasos saturados. Sin embargo, el uso de dichos aceites a menudo se desaconseja, debido a los altos niveles de colesterol asociados a ellos. Por comparación, las cadenas de ácidos grasos insaturados son no lineales debido a que la inserción de dobles enlaces induce a la formación de ángulos. La formación de ángulos en la molécula dificulta la capacidad de las cadenas de ácidos grasos para apilarse, provocando, por tanto, que permanezcan fluidos a temperatura más bajas. Los aceites vegetales, por ejemplo, tienen un alto contenido en ácidos grasos insaturados y, por tanto, son líquidos de forma típica a temperatura ambiente. Además, los ácidos grasos saturados pueden modificarse para transformarse en ácidos grasos insaturados mediante la eliminación de átomos de hidrógeno y la inserción de dobles enlaces entre dos átomos de carbono de la cadena de ácido graso. La desaturación puede lograrse de manera enzimática o química, y disminuye los puntos de fusión debido a la incapacidad de las moléculas de ácidos grasos a autoapilarse.

El nivel de ácidos grasos saturados totales en el aceite de maíz, cuya media es de aproximadamente 13,9%, no cumple las actuales directrices de etiquetado indicadas anteriormente. Como media, el aceite de maíz está formado por 11,5% de ácido palmítico, 2,2% de ácido esteárico, 26,6% de ácido oleico, 58,7% de ácido linoleico, y 0,8% de ácido linolénico. El aceite de maíz también contiene 0,2% de ácido araquídico, un ácido graso saturado de 20 carbonos [Dunlap et al. (1995), J. Amer. Oil Chem. Soc., 72:981-987] . La composición del aceite de maíz le confiere propiedades que son muy deseables para aceites comestibles. Éstas incluyen propiedades como termoestabilidad, aroma y caducidad larga. Sin embargo, la demanda de los consumidores de aceites con bajo contenido en grasas saturadas ha producido una disminución significativa en la utilización del aceite de maíz y, por tanto, una menor cuota de mercado. Por tanto, un aceite de maíz con unos niveles modificados de ácidos grasos saturados es muy deseable y tendría un uso práctico porque satisfaría la demanda de los consumidores de aceites más sanos mientras que conserva la mayoría o todas las propiedades que hacían que el aceite de maíz fuera un aceite popular y preferido en el pasado.

El maíz no se considera, de forma típica, un cultivo de aceite, comparado como la soja, la canola, el girasol y similares. De hecho, el aceite producido y extraído del maíz se considera un subproducto del proceso de trituración en húmedo que se utiliza en la extracción de almidón. Debido a esto, no ha habido mucho interés en modificar los niveles de saturación del aceite de maíz hasta los esfuerzos descritos en la presente.

Como se describe en la presente, los niveles de saturación de los ácidos grasos que incluyen los aceites vegetales pueden alterarse mediante la expresión de una palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa fúngica dentro de una célula vegetal. Es probable que estas proteínas desaturen enzimáticamente las moléculas de palmitato-CoA eliminando dos átomos de hidrógeno y añadiendo un doble enlace entre los átomos de carbono 9º y 10º de la porción de la CoA de la molécula, produciendo, con ello, ácido palmitoleico-CoA (16:1^{\Delta 9}). El palmitoleico-CoA se incorpora en último término al aceite de la semilla, disminuyendo, por tanto, los niveles de saturación totales de dicho aceite.

El documento EP-A-0736598 describe plantas que contienen un gen que codifica una \Delta-9 desaturasa para modificar los niveles de desaturación en ácidos grasos unidos a lípidos.

Das et al., Ind. J. Exp. Biol., vol. 21, 1983, pp. 339-342 describen la presencia de actividad \Delta-9 desaturasa en Aspergillus nidulans.

Gargano et al., Lipids, vol. 30, nº 10 (1995), pp. 899-906 describen un método para el aislamiento de una \Delta-9 desaturasa a partir de un hongo.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una planta transgénica que produce semillas para aceite, que produce semillas que contienen aceite que tiene, comparado con el tipo salvaje, un menor nivel de ácidos grasos saturados, en la que dicha planta expresa un transgén que codifica una \Delta-9 CoA desaturasa de Aspergillus que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. El nivel de saturación de los aceites que se encuentran en las células vegetales puede alterarse expresando dicha palmitato-CoA 6-9 desaturasa de Aspergillus nidulans.

Esta invención utiliza un gen que codifica dicha palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa, siendo dicho gen aislado y purificado de Aspergillus nidulans.

El gen puede ser tal que el sesgo de codones de un gen procedente de una fuente no vegetal se ha modificado para que parezca similar a los genes procedentes de una fuente vegetal.

Los niveles de saturación del aceite dentro de una células vegeral pueden alterarse mediante la expresión de dichos genes que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans. Los genes descritos en la presente pueden utilizarse para alterar los niveles de saturación colocando dichos genes en la orientación sentido. Las células vegetales que se han transformado con genes que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans en la orientación sentido dan como resultado que los aceites de dichas plantas tengan unos niveles mayores de 16:1 y unos niveles menores de saturación total frente las plantas no transformadas.

Pueden producirse genes quiméricos utilizando los genes descritos en la presente que codifican la palmitoíl CoA-\Delta-9 desaturasa en combinación con elementos reguladores promotores y el uso de dichos genes quiméricos dentro de una célula vegetal.

Las especies vegetales descritas en la presente pueden transformarse con dichos genes quiméricos.

Otros aspectos, realizaciones, ventajas y características de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente memoria descriptiva.

Descripción detallada de la invención

Las siguientes frases y términos se definen a continuación:

Unos "niveles de saturación alterados" significan que el nivel de ácidos grasos saturados totales de un aceite vegetal producido por una planta modificada es diferente del producido por una planta normal o no modificada.

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Un "ADNc" significa un ADN que es complementario con un ARNm y que deriva de éste.

Una "construcción de ADN quimérica" significa un ADN recombinante que contiene genes o sus porciones procedentes de una o más especies.

"Complementario" significa un ácido nucleico que puede formar un enlace o enlaces de hidrógeno con otras secuencias de ácidos nucleicos mediante interacciones de pares de bases tradicionales de tipo Watson-Crick u otros tipos no tradicionales de interacciones de pares de bases.

Un "promotor constitutivo" significa un elemento promotor que dirige la expresión génica continua en todos los tipos celulares y en todo momento (es decir, actina, ubiquitina, CaMV 35S, 35T, y similares).

Un promotor "específico del desarrollo" significa un elemento promotor responsable de la expresión génica en etapas del desarrollo vegetal específicas, como la embriogénesis temprana o tardía y similares.

Un "potenciador" significa un elemento de la secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad promotora, como los procedentes de la secuencia conductora de la proteína de virus del rayado del maíz (MSV), la secuencia conductora de la proteína del virus del mosaico de la alfalfa, el intrón 1 de la alcohol deshidrogenasa y similares.

La "expresión", tal como se emplea en la presente, significa la transcripción y la acumulación estable de ARNm dentro de una célula vegetal. La expresión de genes también implica la transcripción del gen para crear un ARNm y la traducción del ARNm para producir proteínas precursoras o maduras.

Un "gen extraño" o "heterólogo" significa un gen que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos exacta no se encuentra normalmente en la célula hospedante, sino que se introduce mediante técnicas de transferencia de genes convencionales.

Un "gen" pretende incluir todo el material genético implicado en la expresión de proteínas, incluyendo construcciones de ADN quimérico, genes, genes vegetales y sus porciones, y similares.

Un "genoma" significa el material genético contenido en cada célula de un organismo y/o virus y similares.

Un "promotor inducible" significa un elemento promotor que es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica como estímulos físicos (genes de choque térmico); luminosos (RUBP carboxilasa); hormonales (Em); de metabolitos, químicos, de estrés y similares.

Un "planta modificada" significa una planta en la está presente el gen, el ARNm o la proteína de la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans.

Una "planta" significa un organismo fotosintético que incluye eucariotas y procariotas.

Un "elemento regulador promotor" significa elementos de la secuencia de nucleótidos dentro de un gen o fragmento nucleico que controlan la expresión de ese gen o fragmento de ácido nucleico. Las secuencias promotoras proporcionan el reconocimiento para la ARN polimerasa y otros factores de la transcripción requeridos para una transcripción eficaz. Pueden utilizarse de forma eficaz elementos reguladores promotores de una diversidad de fuentes en células vegetales para expresar construcciones de genes. Los elementos reguladores promotores también incluyen promotores constitutivos, específicos de tejidos, específicos del desarrollo, inducibles y similares. Los elementos reguladores promotores también pueden incluir ciertos elementos de la secuencia potenciadores y similares que mejoren la eficacia de la traducción.

Un promotor "específico de tejidos" significa elementos promotores que son responsable de la expresión génica en un tipo celular o tisular específico, como las hojas o las semillas (es decir, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina y similares).

Una "planta transgénica" significa una planta que expresa un gen quimérico introducido mediante intentos de transformación.

En las células vegetales, los ácidos grasos se fabrican como sustratos de la acil-proteína vehículo de acilo (acil-ACP) y son alargadas por diversas enzimas mediante la adición de malonil-ACP para fabricar moléculas de acil-ACP que varían en longitud de 2 a 18 átomos de carbono. Después, las acil-ACP tioesterasas catalizan la ruptura hidrolítica del ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico del ACP, de una manera algo selectiva pero no específica, produciendo, con ello, un ácido graso libre. Las moléculas de ácido graso se mueven hacia el exterior del plástido hacia el citoplasma, en donde son modificadas en último término para producir moléculas de acil-CoA. Dichas moléculas entonces se incorporan en la fracción oleosa de los triglicéridos. Los inventores han descubierto, tal como se describe en la presente, que la desaturación de una molécula de acil-CoA, en la que dicha molécula es preferiblemente estearoil-CoA y lo más preferiblemente palmitato-CoA, puede reducir los niveles de saturación en la fracción oleosa de los triglicéridos. Dicha desaturación da como resultado, lo más preferiblemente, la producción y la acumulación de ácido palmitoleico (16:1^{\Delta-9}). Dicha desaturación también puede dar como resultado una disminución del ácido palmítico y esteárico en la fracción oleosa de los triglicéridos.

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En el aceite de semillas de maíz, los ácidos grasos predominantes son el ácido linoleico (18:2 a aproximadamente 59%), el ácido oleico (18:1 a aproximadamente 26%) y el ácido palmítico (16:0 a aproximadamente 11%), comprendiendo el ácido esteárico (18:0) en general aproximadamente 2,5% o menos [Glover y Mertz (1987), en: Nutritional Quality of Cereal Grains: genetic and agronomic improvement., pp.183-336, (eds. Olson, R.A. y Frey, K.J.), Amer. Soc. Agronomy, Inc., Madison, WI; Fitch-Haumann (1985), J. Am. Oil. Chem. Soc. 62:1524-1531]. La biosíntesis de ácidos grasos en células vegetales se inicia en los plástidos, en donde son sintetizados como acil-ACP tioésteres mediante un complejo de ácido graso sintasa. De forma más específica, la producción de ácidos grasos se realiza por una serie de reacciones de condensación que implican la adición de malonil-ACP secuencialmente a la cadena de ácido graso-ACP en crecimiento por la enzima \beta-cetoacil-ACP sintasa I (KAS I). La mayoría de las unidades de ácido graso-ACP alcanzan unas longitudes de la cadena carbonada de 16 y después son alargadas hasta 18 unidades de carbono por KAS II. La gran mayoría de los ácidos grasos C18 son desaturados por la estearoil-ACP \Delta-9 desaturasa en la posición C9 desde el extremo carboxilo para producir oleil-ACP.

Tanto las unidades saturadas como las insaturadas de ácido graso-ACP son hidrolizadas por acil-ACP tioesterasas para producir ácidos grasos libres. Estos ácidos grasos libres entonces atraviesan la membrana del plástido hacia el citosol de la célula, en donde son modificados por la adición de un resto CoA. Después, dichos ácidos grasos se incorporan en aceites vegetales (Somerville y Browse (1991), Science, 252:80-87; Browse y Sommerville (1991), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42:467-506; Harwood (1989), Critical Reviews in Plant Sci., 8:1-43; Chasan (1995), Plant Cell, 7:235-237; Ohlrogge (1994), Plant Physiol. 104:821-826).

La palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans desatura el ácido palmítico en la posición C9 con respecto al extremo carboxilo, con más probabilidad después del momento de la modificación con Co-A. En las células vegetales, esto se produce con más probabildad antes de ser incorporado en la fracción de triglicéridos del aceite. Por tanto, la expresión de palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans en células vegetales provocará una disminución en los niveles de saturación del aceite producido por dicha planta.

La palmitato-CoA A-9 desaturasa de Aspergillus nidulans descrita en la presente puede utilizarse para modificar los niveles de saturación en el aceite en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. En plantas dicotiledóneas, la expresión de dicha desaturasa preferiblemente produce una disminución en los niveles de 16:0 y 18:0 encontrados en el aceite derivado de dichas plantas. Más preferiblemente, la expresión de dicha desaturasa produce un aumento en los niveles de 16:1 de ácidos grasos en dicho aceite. En las plantas monocotiledóneas, la expresión de dicha desaturasa preferiblemente produce unos menores niveles de 18:0, y más preferiblemente un aumento en los niveles de 16:1 encontrados en dicho aceite. Sin embargo, la intención de los inventores no es limitar dicha expresión génica exclusivamente a plantas en que puedan expresarse dicha desaturasa y sus genes y puede utilizarse para modificar el contenido en lípidos en levaduras y bacterias.

Como se describe con más detalle en la presente, una palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus puede utilizarse para modificar los niveles de saturación en aceites producidos por plantas transgénicas. Preferiblemente, los genes y los fragmentos nucleicos que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa se derivan de Aspergillus nidulans. Más preferiblemente, los genes que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans son los descritos en la presente como SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:12, codificando dichos genes una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la presente como SEQ ID NO:6.

Un método mediante el cual pueden modificarse aceites vegetales es expresando la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans en una planta dicotiledónea. Esto puede lograrse colocando los genes o los fragmentos de ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas en la orientación sentido 3' a un elemento regulador promotor elegido, seguido de un terminador de la transcripción en el extremo 3' de dicho gen, produciendo con ello una construcción génica quimérica. Estos genes quiméricos entonces pueden transformarse en plantas, produciendo con ello aceites vegetales que tienen unos niveles de saturación alterados con relación a controles no transformados. La expresión de la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa, tal como se describe en la presente, de Aspergillus nidulans en plantas dicotiledóneas produce unos aceites vegetales derivados de ellas con unos niveles de 16:1 como porcentaje de los ácidos grasos totales de aproximadamente 0,23 a aproximadamente 4,65%; preferiblemente de aproximadamente 3,01 a aproximadamente 4,65%; más preferiblemente de aproximadamente 4,07 a aproximadamente 4,65%, siendo lo más preferido de aproximadamente 4,65%. Los niveles de saturación total varían preferiblemente de aproximadamente 9,8 a aproximadamente 12,5%, siendo aproximadamente 9,8% lo más preferido.

Otro método mediante el cual pueden modificarse aceites vegetales es expresando la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans en una planta monocotiledónea. Al igual que con las plantas dicotiledóneas, esto puede lograrse colocando los genes o los fragmentos de ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas en la orientación sentido 3' a un elemento regulador promotor elegido, seguido de un terminador de la transcripción en el extremo 3' de dicho gen, produciendo con ello una construcción génica quimérica. Estos genes quiméricos entonces pueden transformarse en plantas, produciendo con ello aceites vegetales que tienen unos niveles de saturación alterados con relación a controles no transformados. La expresión de la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans en plantas monocotiledóneas produce unos aceites vegetales derivados de ellas con unos niveles de 16:1 de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 3,2%; preferiblemente de aproximadamente 1,2 a aproximadamente 3,2%, siendo lo más preferido de aproximadamente 3,2%.

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Como se describe con más detalle en la presente, las contrucciones de genes quiméricos que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans pueden transformarse en otras cosechas de semillas productoras de aceite para modificar sus niveles de saturación. Dichas especies vegetales de cosechas de semillas productoras de aceite que pueden modificarse incluyen, pero no se limitan a soja, Brassicaceae sp., canola, colza, girasol, lino, cártamo, coco, palma, oliva, cacahuete, algodón, ricino, cilantro, Crambe sp., Cuphea sp., Euphorbia sp., Oenothera sp., yoyoba, Lesquerella sp., margarita, Limnanthes sp., Vernonia sp., Sinapis alba, y cacao, siendo el maíz el más preferido. La mayoría, sino todas, de estas especies vegetales han sido previamente transformadas por los expertos en la técnica.

Para obtener una alta expresión de genes heterólogos en plantas puede preferirse volver a modificar dichos genes de forma que se expresen con más eficacia en el citoplasma de las células vegetales. El maíz es una de estas plantas en que puede preferirse volver a modificar el gen o los genes heterólogos antes de la transformación para aumentar su nivel de expresión en dicha planta. Por tanto, otra etapa en el diseño de genes que codifican dicha palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans es la modificación diseñada de un gen heterólogo para su expresión óptima.

Una razón para volver a modificar el gen de A-9 Co-A desaturasa de Aspergillus nidulans para su expresión en el maíz es por el contenido no óptimo en G+C del gen nativo. Por ejemplo, el contenido muy bajo en G+C de muchos genes bacterianos nativos (y el consiguiente sesgo hacia un alto contenido en A+T) produce la generación de secuencias que imitan o duplican las secuencias control del gen vegetal, que tienen un alto contenido en A+T. La presencia de algunas secuencias ricas en A+T dentro del ADN del gen o los genes introducidos en las plantas (por ejemplo, las regiones de caja TATA que se encuentran normalmente en los promotores génicos) puede producir la transcripción aberrante del gen o los genes. Por otra parte, la presencia de otras secuencias reguladoras que residen en el ARNm transcrito (por ejemplo, secuencias señal de poliadenilación (AAUAAA), o secuencias complementarias con pequeños ARN nucleares implicados en la escisión de pre-ARNm) pueden conducir a la inestabilidad del ARN. Por tanto, un objetivo en el diseño de genes que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans para su expresión en el maíz, más preferiblemente denominados gen o genes optimizados para la planta, es generar una secuencia de ADN que tenga un mayor contenido en G+C, y preferiblemente un contenido parecido al de los genes del maíz que codifican las enzimas metabólicas. Otro objetivo en el diseño de genes optimizados para la planta que codifiquen la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans es generar una secuencia de ADN en que las modificaciones de la secuencia no dificulten la traducción.

La tabla a continuación (tabla 1) ilustra lo alto que es el contenido en G+C en el maíz. Para los datos en la tabla 1, las regiones codificadoras de los genes se extrajeron de las entradas de GenBank (publicación 71), y las composiciones de las bases se calcularon utilizando el programa informático MacVector^{TM} (IBI, New Haven, CT). Las secuencias de intrones no se tuvieron en cuenta en los cálculos.

Debido a la plasticidad otorgada por la redundancia del código genético (es decir, algunos aminoácidos son especificados por más de un codón), la evolución de los genomas en diferentes organismos o clases de organismos ha producido una utilización diferente de los codones redundantes. Este "sesgo en los codones" se refleja en la media de la composicion de bases de las regiones codificadoras de proteínas. Por ejemplo, los organismos con un contenido relativamente bajo en G+C utilizan codones que tienen A o T en la tercera posición de los codones redundantes, mientras que los que tienen un contenido mayor en G+C utilizan codones que tienen G o C en la tercera posición.

TABLA 1 Compilación del contenido en G+C de regiones codificadoras de proteínas de los genes del maíz

1

\quad

^{a}El número de genes en la clase aparece entre paréntesis.

\quad

^{b}Las desviaciones estándar aparecen entre paréntesis.

\quad

^{c}La media de los grupos combinados no se toma en cuenta en el cálculo de la media.

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Se cree que la presencia de codones "minoritarios" dentro de un ARNm puede reducir la velocidad de traducción absoluta de este ARNm, en especial cuando la abundancia relativa del ARNt cargado que corresponde al codón minoritario es baja. Una extensión de esto es que la disminución de la velocidad de traducción por los codones minoritarios individuales será al menos aditiva para múltiples codones minoritarios. Por tanto, los ARNm que tienen unos contenidos elevados relativos de codones minoritarios tendrán, en la misma medida, unas velocidades de traducción bajas. Esta velocidad se ve reflejada por unos posteriores niveles menores de la proteína codificada.

Cuando se vuelven a modificar los genes que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans para su expresión en el maíz, se determina el sesgo de codones de la planta. El sesgo de codones para el maíz es la distribución estadística de codones que emplea la planta para codificar sus proteínas, y la utilización de codones preferida se muestra en la tabla 2. Después de determinar el sesgo, se determina el porcentaje de frecuencia de los codones en el gen o en los genes de interés. Deben determinarse los codones principales preferidos por la planta, así como los codones preferidos en segundo y en tercer lugar. Después se realiza una traducción inversa de la secuencia de aminoácidos de la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans para que la secuencia de ácido nucleico resultante codifique exactamente la misma proteína que el gen nativo que se quiere expresar de modo heterólogo. La nueva secuencia de ADN se diseña utilizando la información del sesgo de codones de manera que se corresponde con los codones más preferidos de la planta deseada. La nueva secuencia entonces se analiza para determinar los sitios de enzimas de restricción que hayan podido ser creados por la modificación. Los sitios identificados se vuelven a modificar sustituyendo los codones por los codones preferidos en segundo o tercer lugar. Otros sitios en la secuencia que pudiesen afectar a la transcripción o la traducción del gen de interés son las uniones de exón:intrón 5' o 3' , las señales de adición de poli-A, o las señales de terminación de ARN polimerasa. La secuencia se vuelve a analizar y se modifica para reducir la frecuencia de dobletes de TA o GC. Además de los dobletes, los bloques de secuencia con G o C que tienen más de aproximadamente cuatro restos que son el mismo pueden afectar a la transcripción de la secuencia. Por tanto, estos bloques también se modifican sustituyendo los codones preferidos en primer o segundo lugar, etc. por el siguiente codón en orden decreciente de preferencia.

Se prefiere que el gen o los genes, optimizados para la planta, que codifican la palmitato-CoA A-9 desaturasa de Aspergillus nidulans contengan aproximadamente 63% de codones de primera preferencia, entre aproximadamente 22% a aproximadamente 37% de codones de segunda preferencia, y entre aproximadamente 15% a aproximadamente 0% de codones de tercera preferencia, siendo el porcentaje total de 100%. Se prefiere aún más que el gen o los genes, optimizados para la planta, contengan aproximadamente 63% de codones de primera preferencia, al menos aproximadamente 22% de codones de segunda preferencia, aproximadamente 7,5% de codones de tercera preferencia, y aproximadamente 7,5% codones de cuarta preferencia, siendo el porcentaje total de 100%. La utilización de codones preferida para modificar genes para la expresión en el maíz se muestra en la tabla 2. El método descrito anteriormente permite a los expertos en la técnica modificar un gen o genes que son extraños para una planta concreta, de forma que los genes se expresen de manera óptima en las plantas. El método se ilustra más a fondo en la solicitud en tramitación PCT WO 97/13402.

Para diseñar genes optimizados para plantas que codifiquen la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans, la secuencia de aminoácidos de dicha proteína se traduce inversamente en una secuencia de ADN que utilice un código genético no redundante establecido a partir de una tabla de sesgo de codones compilada para las secuencias génicas para la planta concreta, como se muestra en la tabla 2.

La secuencia de ADN resultante, que es completamente homogénea para la utilización de codones, se vuelve a modificar para establecer una secuencia de ADN que, además de tener un mayor grado de diversidad de codones, también contenga sitios de reconocimiento de enzimas de restricción colocados de forma estratética, una composición de bases deseable, y no contenga secuencias que puedan interferir con la transcripción del gen o la traducción del ARNm producto. Dicha secuencia producida utilizando los métodos descritos en la presente se describe como SEQ ID NO:12.

Los genes que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans pueden expresarse a partir de unidades transcripcionales insertadas en el genoma de la planta. Preferiblemente, dichas unidades transcripcionales son vectores recombinantes capaces de una integración estable en el genoma de la planta, y la selección de líneas de plantas transformadas que expresan ARNm que codifica dichas proteínas de desaturasa se expresa mediante promotores constitutivos o inducibles en la célula de la planta. Cuando se expresa, el ARNm se traduce en proteínas, incorporando, con ello, los aminoácidos de interés a la proteína. Los genes que codifican la palmitato-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans expresados en las células de la planta pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor específico de tejidos, o un promotor inducible, como se describe en la presente.

TABLA 2 Codones de aminoácidos preferidos para proteínas expresadas en el maíz

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Existen varias técnicas para introducir vectores recombinantes extraños en células vegetales, y para obtener plantas que mantengan y expresen de forma estable el gen introducido. Estas técnicas incluyen la aceleración de material genético revestido sobre micropartículas directamente a las células (patentes de EEUU 4.945.050 de Cornell, y 5.141.131 de DowElanco, ahora Dow AgroSciences). Además, las plantas pueden transformarse utilizando la tecnología de Agrobacterium, véanse las patentes de EEUU 5.177.010 de University of Toledo, 5.104.310 de Texas A&M, solicitud de patente europea 0131624B1, solicitudes de patente europea 120516, 159418B1 y 176.112 de Schilperoot, patentes de EEUU 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940.838 y 4.693.976 de Schilperoot, solicitudes de patente europea 116718, 290799, 320500 todas de Max Planck, solicitudes de patente europea 604662, 627752 y patente de EEUU 5.591.616 de Japan Tobacco, solicitudes de patente europea 0267159 y 0292435 y patente de EEUU 5.231.019 todas de Ciba Geigy, ahora Novartis, patentes de EEUU 5.463.174 y 4.762.785 ambas de Calgene, y patentes de EEUU 5.004.863 y 5.159.135 ambas de Agracetus. Otras tecnologías de transformación incluyen la tecnología de fibras cortas ("whiskers"), véanse las patentes de EEUU 5.302.523 y 5.464.765 ambas de Zeneca. También se ha empleado la tecnología de electroporación para transformar plantas, véase el documento WO 87/06614 de Boyce Thompson Institute, los documentos 5.472.869 y 5.384.253 ambos de Dekalb, los documentos WO9209696 y WO9321335 ambos de Plant Genetic Systems. Además también pueden utilizarse vectores víricos para producir plantas transgénicas que expresen la proteína de interés. Por ejemplo, una planta monocotiledónea puede transformarse con un vector vírico utilizando los métodos descritos en las patentes de EEUU 5.569.597 de Mycogen y Ciba-Giegy, ahora Novartis, así como las patentes de EEUU 5.589.367 y 5.316.931, ambas de Biosource.

Como se mencionó previamente, la manera en que la construcción de ADN se introduce en la planta hospedante no es crítica para esta invención. Puede emplearse cualquier método que proporcione una transformación eficaz. Por ejemplo, en la presente se describen diversos métodos para la transformación de células vegetales e incluyen el uso de plásmidos Ti o Ri y similares para realizar la transformación mediada por Agrobacterium. En muchos casos será deseable que la construcción utilizada para la transformación esté bordeada, en uno o ambos lados, por bordes de ADN-T, más específicamente el borde derecho. Esto resulta particularmente útil cuando la construcción utiliza Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como modo para la transformación, aunque los bordes de ADN-T pueden ser útiles con otros modos de transformación.

Cuando se utiliza Agrobacterium para la transformación de células vegetales puede utilizarse un vector que puede introducirse en el hospedante para la recombinación homógola con ADN-T o el plásmido Ti o Ri presente en el hospedante. La introducción del vector puede realizarse mediante electroporación, apareamiento triparental y otras técnicas para transformar bacterias gram-negativas que son conocidas por los expertos en la técnica. La manera en que se realiza la transformación con vectores en el hospedante de Agrobacterium no es crítica para esta invención. El plásmido Ti o Ri que contiene el ADN-T para la recombinación puede ser capaz o incapaz de provocar la formación de agallas, y esto no es crítico para dicha invención, con la condición de que los genes vir estén presentes en dicho hospedante.

En algunos casos en que se emplea Agrobacterium para la transformación, la construcción de expresión dentro de los bordes del ADN-T se inserta en el plásmido pDAB1542, como se describe en la presente, o en un vector de amplio espectro, como pRK2 o sus derivados, como se describe en Ditta et al., PNAS USA, (1980), 77:7347-7351, y el documento EPO 0 120 515, que se incorporan en la presente como referencia. Dentro de la construcción de expresión y del ADN-T se incluirán uno o más marcadores, como se describe en la presente, que permiten la selección de Agrobacterium transformado y de células vegetales transformadas. El marcador concreto empleado no es fundamental para esta invención, dependiendo el marcador preferido del hospedante y de la construcción utilizados.

Para la transformación de células vegetales utilizando Agrobacterium, pueden reunirse explantes e incubarse con el Agrobacterium transformado o durante un tiempo suficiente para permitir su transformación. Después de la transformación, las agrobacterias se destruyen mediante selección con el antibiótico apropiado, y las células vegetales se cultivan con el medio selectivo apropiado. Cuando se forman callos, la formación de brotes puede estimularse empleando las hormonas vegetales apropiadas según métodos muy conocidos en la técnica del cultivo de tejidos vegetales y de regeneración de plantas. Sin embargo no siempre es necesaria una etapa intermedia de callo. Después de la formación de brotes, dichas células vegetales pueden trasladarse a un medio que estimule la formación de raíces, completando con ello la regeneración de la planta. Las plantas entonces pueden cultivarse hasta la formación de semillas y esas semillas pueden utilizarse para establecer futuras generaciones, así como proporcionar una fuente para el aislamiento de aceite. Independientemente de la técnica de transformación, el gen que codifica la palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans se incorpora preferibmente al vector de transferencia del gen adaptado para expresar dicho gen en una célula vegetal incluyendo en el vector un elemento regulador promotor de la planta, así como regiones de terminación de la transcripción no traducidas 3', como Nos y similares.

Además de numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes extraños también puede variar. Este tejido incluye, pero no se limita a tejido embriogénico, tejido de callo de tipo I, II y III, hipocotilo, meristema y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden transformarse durante la desdiferenciación utilizando técnicas apropiadas descritas en la presente.

Otra variable es la elección de un marcador seleccionable. La preferencia por un marcador concreto está sometida al criterio de los expertos en la técnica, pero puede utilizarse cualquiera de los siguientes marcadores seleccionables, junto con cualquier otro gen no listado en la presente que pueda actuar como marcador seleccionable. Estos marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan al gen de aminoglicósido fosfotransferasa del transposón Tn5 (Aph II) que codifica resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y G418, así como aquellos genes que codifican la resistencia o la tolerancia al glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bialofós); herbicidas de imidazolinonas, sulfonilureas y triazolopirimidina, como clorsulfurona; bromoxinil, dalapón y similares.

Además de un marcador seleccionable, puede resultar deseable utilizar un gen indicador. En algunos casos puede utilizarse un gen indicador con o sin un marcador seleccionable. Los genes indicadores son genes que, de forma típica, no están presentes en el organismo o tejido receptor y que codifican, de forma típica, proteínas que producen algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Los ejemplos de dichos genes se proporcionan en K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988). Los genes indicadores preferidos incluyen la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de cloranfenicol acetil transferasa de Tn9 de E. coli, la proteína fluorescente verde de la medusa bioluminescente Aequorea victoria, y los genes de luciferasa de la luciérnaga Photinus pyralis. Entonces puede realizarse un ensayo para detectar la expresión del gen indicador en un momento adecuado después de que dicho gen se haya introducido en las células receptoras. Un ensayo preferido de este tipo implica el uso del gen que codifica la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, como se describe en Jefferson et al. (1987), Biochem. Soc. Trans., 15, 17-19) para identificar células transformadas.

Además de los elementos reguladores promotores vegetales, pueden utilizarse con eficacia en células vegetales elementos reguladores promotores procedentes de una diversidad de fuentes para expresar genes extraños. Por ejemplo, pueden utilizarse elementos reguladores promotores de origen bacteriano, como el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de mannopina sintasa; promotores de origen vírico, como del virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (que es un promotor 35S modificado, véase el documento PCT/US96/1682; el documento WO 97/13402, publicado el 17 de abril, 1997) y similares. Los elementos reguladores promotores vegetales incluyen, pero no se limitan a la subunidad pequeña (ssu) de la ribulosa-1,6-bisfosfato (RUBP) carboxilasa, el promotor de beta-conglicinina, el promotor de beta-faseolina, el promotor de ADH, los promotores de choque térmico y los promotores específicos de tejidos.

Otros elementos, como regiones de unión a matriz, regiones de unión al andamiaje, intrones, potenciadores, secuencias de poliadenilación y similares pueden estar presentes y, por tanto, pueden mejorar la eficacia de transcripción o la integración del ADN. Estos elementos pueden ser necesarios o no para la función del ADN, aunque pueden proporcionar una expresión o un funcionamiento mejor del ADN afectando a la transcripción, la estabilidad de ARNm y similares. Estos elementos pueden incluirse en el ADN según se desee para obtener una actuación óptima del ADN transformado en la planta. Los elementos típicos incluyen, pero no se limitan a Adh-intrón 1, Adh-intrón 6, la secuencia conductora de la proteína de la envuelta del virus del mosaico de la alfalfa, la secuencia conductora de la proteína de la envuelta del virus del rayado del maíz, así como otras disponibles para los expertos en la técnica.

Los elementos reguladores promotores constitutivos también pueden utilizarse para dirigir la expresión génica continua en todos los tipos celulares y en todo momento (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares). Los elementos promotores específicos de tejidos son responsable de la expresión génica en un tipo celular o tisular específico, como las hojas o las semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y éstos también pueden utilizarse.

Los elementos reguladores promotores también puede estar activos durante cierta etapa del desarrollo de las plantas, así como pueden estar activos en tejidos y órganos vegetales. Los ejemplos de éstos incluyen, pero no se limitan a elementos reguladores promotores específicos del polen, específicos del embrión, específicos de la seda del maíz, específicos de las fibras de algodón, específicos de las raíces, específicos del endospermo de la semilla y similares. Bajo ciertas circunstancias puede resultar deseable utilizar un elemento regulador promotor inducible, que es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, como estímulos físicos (genes de choque térmico); luminosos (RUBP carboxilasa); hormonales (Em); metabolitos; productos químicos; y estrés. Pueden emplearse otros elementos de transcripción y traducción deseables que actúan en plantas. Numerosos vectores de transferencia génica específicos de plantas son conocidos en la técnica.

Una de las cuestiones con respecto a la utilización de plantas transgénicas con niveles de saturación alterados es la expresión de múltiples genes quiméricos a la vez. La solicitud de patente europea 0400246A1 describe la transformación de dos genes Bt en una planta; sin embargo, éstos pueden ser dos genes cualquiera o sus fragmentos, en la orientación sentido o antisentido. Por ejemplo, ahora se han producido híbridos disponibles en el mercado que tienen rasgos acumulados, como ser herbicida y tener resistencia a los insectos. Las opciones pueden incluir, pero no se limitan a genes y fragmentos que codifican la palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans con genes de acil-ACP tioesterasa, o genes que codifican proteínas, como la estearoil-ACP desaturasa, la \beta-cetoacil sintasa II y similares, así como genes que imparten control frente a insectos o resistencia a herbicidas. Otra manera de producir una planta transgénica con múltiples rasgos es producir dos plantas, conteniendo cada planta el gen modificador del aceite de interés. Estas plantas entonces pueden retrocruzarse utilizando técnicas de cruzamiento de plantas tradicionales y muy conocidas por los expertos en la técnica, para producir plantas en que las características fenotípicas estén relacionadas con la presencia de más de un gen quimérico.

Las realizaciones particulares de esta invención se ejemplifican más a fondo en los ejemplos. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán con facilidad que los experimentos específicos detallados son sólo ilustrativos de la invención, tal como se describe más a fondo en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Aislamiento y clonación de una palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa fúngica

Se aisló el ARN total a partir de 1,1 g de células frescas de Aspergillus nidulans congelando y triturando dichas células con un mortero y una mano de mortero que estaban preenfriados con N_{2} líquido. Antes de triturar se añadió una pequeña cantidad de esferas de vidrio (150-212 \muM; SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO). El polvo resultante se trasladó a un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de fenol licuado equilibrado con Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 y se agitó en vórtice durante 1 min. Las fases orgánica y acuosa se separaron mediante centrifugación a 4ºC y la fase acuosas se trasladó a un tubo fresco, se extrajo tres veces con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1 v/v/v) y una vez con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1 v/v). Los ácidos nucleicos se precipitaron añadiendo 0,8 volúmenes de isopropanol, se incubaron a -20ºC durante 1 h, seguido de la recolección mediante centrifugación. El sedimento resultante se resuspendió en 5 ml de DEPC-H_{2}O (H_{2}O con dietilpirocarbonato al 0,1% v/v). El ARN se precipitó añadiendo 3 ml de LiCl 8,0 M, seguido de una incubación en hielo durante 1 h. Los precipitados se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en 5 m de DEPC-H_{2}O y se volvió a precipitar con LiCl. El sedimento de ARN final se resuspendió en 500 \mul de DEPC-H_{2}O y se determinó el rendimiento mediante A_{260 \ nm}. Se confirmó la pureza y la calidad del ARN mediante electroforesis sobre gel de agarosa.

Se purificó el ARN-poliA^{+} en columnas de oligo dT-celulosa (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Se equilibró la oligo-dT celulosa (0,1 g) de tipo 3 en 5 ml del tampón 1 durante 30 minutos, siendo el tampón 1 un tampón de carga con NaCl 0,5 M, y el tampón de carga es Tris-HCl 20 mM, pH 7,6, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 1 mM, y laurilsulfato de sodio (SDS) al 0,1%. La columna vertida se lavó con 3 volúmenes de DEPC-H_{2}O, 3 volúmenes de tampón de lavado [NaOH 0,1 N, EDTA 5 mM], 3 volúmenes de DEPC-H_{2}O, y 5 volúmenes de tampón 1. Un mg del ARN total de Aspergillus nidulins se calentó a 65ºC durante 5 minutos, se diluyó 2 veces con el tampón 2 [2 x tampón de carga] y, luego se aplicó a la columna de oligo-dT. El material de flujo se recogió, se volvió a calentar y se volvió a aplicar a la columna. A continuación, se lavó la columna con 10 volúmenes del tampón 1 y después con 10 volúmenes del tampón 3 [tampón de carga que tiene NaCl 0,1 M]. Se eluyó el ARN poliA^{+} con 3 volúmenes del tampón de elución [Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, SDS al 0,05%] y se recogió en fracciones de 0,5 ml. Las fracciones de ARN se reunieron, se tamponaron hasta acetato de sodio 0,3 M, pH 5,2, y se precipitaron a -20ºC durante 16 h después de la adición de 2,2 volúmenes de etanol al 100%. Se recogió el precipitado mediante centrifugación, se lavó con etanol al 70%, se secó y se disolvió en 50 \mul de DEPC-H_{2}O. A continuación se volvió a purificar este material sobre una columna nueva de oligo-dT, tal como se describe en la presente, para producir ARNm muy enriquecido en poliA^{+}.

Se convirtieron 3 \mug de ARN-poliA^{+} en ADNc y se clonaron en el vector LAMBDA UNI-ZAP utilizando el kit de síntesis y clonación de ADNc LAMBDA ZAP según los protocolos del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA). El banco tenía una valoración original de 7,0 x 10^{5} pfu/ml. Se amplificó el banco según Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) y se obtuvo una valoración de 3,5 x 10^{10} pfu/ml. Se determinó la calidad del banco mediante análisis de los clones individuales. Los clones tenían insertos con un tamaño que varía de 0,85 a 1,6 kb.

El banco de ADNc total se guardó por lotes y se aisló como sigue. Se mezclaron 5 ml de células E. coli XL1 Blue MRF' (Stratagene), a una OD_{600 \ nm} = 1,0 en MgSO_{4} 10 mM, con 1 \mul (3,5 x 10^{7} pfu) de la cepa de fagos del banco amplificado, 10 \mul (1,0 x 10^{8} pfu) de fago auxiliar ExAssist (Stratagene), y se incubaron a 37ºC durante 15 min. La mezcla se añadió a 20 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) [triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l] y se incubó a 37ºC durante 3,5 h. Las células se destruyeron con calor mediante una incubación a 68ºC durante 0,5 h y se retiraron los restos celulares mediante centrifugación. Se mezclaron 100 \mul de células E. coli SLOR (Stratagene) a OD_{600 \ nm} = 1,0 en MgSO_{4} 10 mM con 1,0 ml de sobrenadante y se incubaron a 37ºC durante 15 min. La mezcla se utilizó para inocular 100 ml de caldo de cultivo Terrific (TB) [triptona 12 g/l, extracto de levadura 24 g/l, glicerol 4 ml/l, KH_{2}PO_{4} 17 mM, K_{2}HPO_{4} 72 mM] que contenía ampicilina a 100 \mug/ml. Después de un cultivo durante la noche a 37ºC se preparó el ADN del plásmido utilizando lisis alcalina/purificación con CsCl según Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se determinó el rendimiento del ADNc rescatado del lote mediante A_{260 \ nm}.

Para aislar un clon que codifica una palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus, se amplificó un fragmento de ADN utilizando la tecnología de la reacción en cadena con polimerasa, en lo sucesivo PCR, para producir una sonda que podía utilizarse para aislar un ADNc de longitud completa. Se sintetizó un cebador 5' y un cebador 3', indicados en la presente como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente, en un sintetizador de ADN de alta capacidad de procesamiento de Applied Biosystems modelo 394 (Foster City, CA). El ADNc de embrión de maíz rescatado del lote se empleó como molde. La amplificación mediante PCR se realizó como sigue: 200 ng de ADN molde, 10 \mul de 10x tampón de reacción, en lo sucesivo 10X RB [Tris.HCl 100 mM, pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,01% (p/v)], 10 \mul de desoxirribosa nucleótido trifosfato 2 mM (dNTP), 3000 pmol de cebadores (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2), 2,5 unidades de ADN polimerasa AMPLITAQ (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) y H_{2}O para un volumen total de 100 \mul. Se programó un termociclador de ADN (Perkin-Elmer Cetus modelo nº 480) como sigue: 96ºC durante 1 min; [94ºC (30 seg), 37ºC (30 seg), 72ºC (2 min)] x 40 ciclos; seguido de una extensión de 7 min (72ºC). Se obtuvo un producto de ADN de 119 pb, se secuenció como se describe a continuación y se indica en la presente como SEQ ID NO:3. El ADN (SEQ ID NO:3) se clonó en el vector pCRI1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) después de una purificación en gel sobre un gel de agarosa SEAKEM GTG preparativa al 1% (FMC, Rockland, ME) en TAE [Tris-acetato 0,04 M, pH 8,1, EDTA 0,002 M]. El ADN se extrajo de la agarosa utilizando columnas de centrifugación de agarosa GenElute (Supelco Inc., Bellefonte, PA) según el fabricante. Los acoplamientos y las transformaciones se realizaron utilizando el kit de clonación Original TA (Invitrogen). Las transformaciones se cultivaron en placas de LB-agar que contenían kanamicina 25 \mug/ml y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido 50 \mug/ml, en lo sucesivo X-gal, y se dejan crecer durante la noche a 37ºC. Se aislan las colonias blancas y se hacen crecer en 2 ml de caldo de cultivo LB con kanamicina 25 \mug/ml, y el ADN del plásmido se extrae utilizando minipreps de lisis alcalina según Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los plásmidos que contienen el gen de interés se seleccionaron utilizando digestión de restricción con EcoRI para seleccionar un inserto de aproximadamente 120 pb.

Los clones recombinantes se secuenciaron mediante terminación de cadena didesoxi utilizand el kit de secuenciación de ciclos Terminator PRISM AMPLITAQ READY REACTION DYEDEOXY nº 401384 según el fabricante (Perkin-Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, CA). Las muestras se introdujeron en un secuenciador de ADN automático ABI373A (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division). El análisis de la secuencia de ADN de SEQ ID NO:3 se realizó utilizando MACVECTOR v. 4.1.4 (Oxford Molecular, Campbell, KY), que produjo una traducción teórica, generando con ello la secuencia de aminoácidos indicada en la presente como SEQ ID NO:4. Los primeros seis y los últimos seis aminoácidos de SEQ ID NO:4 se corresponden con los productos de la traducción de los cebadores de PCR SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. El resto de la secuencia de aminoácidos se corresponde con una secuencia parcial putativa de desaturasa de Aspergillus nidulans.

El fragmento de ADN que corresponde a SEQ ID NO:3 se escindió del vector mediante una digestión con EcoRI y se purificó utilizando columnas de centrifugación de agarosa GenElute (Supelco). Se generó una sonda marcada con [\alpha^{32}P]-desoxirribocitosina trifosfato (dCTP) utilizando el kit de marcaje aleatorio HIGHPRIME (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) según el fabricante, utilizando 5 \mul de [\alpha^{32}P] -dCTP (3000 Ci/mmol, 10 \muCi/\mul, DuPont, NEN Life Science Products, Boston, MA). La sonda marcada se purificó en columnas de empuje NucTrap (Stratagene) según los procedimientos del fabricante. Los métodos para la valoración de fagos, el cultivo en placas, la selección y el rescate se realizaron con el manual de instrucciones del banco LAMBDA ZAP II (Stratagene) y se utilizaron en la presente. El banco de ADNc descrito en la presente se cultivó en placa (50.000 pfu/placa) en cuatro placas de ensayo NUNC de 24,3 x 24,3 cm NUNC (Nunc Inc. Roskilde, Dinamarca). Se realizaron transferencias de fagos por duplicado de cada placa utilizando una membrana de nailon de 0,45 \mum MAGNAGRAPH-NT (MSI, Westborough, MA). Los filtros se trataron como sigue: 5 min con NaOH 0,5 N/NaCl 1,5 M, pH 12,8; 5 min se secaron al aire; 5 min con Tris 0,5 M, pH 7,6/NaCl 1,5 M; y 5 min se secaron al aire. El ADN se entrecruzó con las membranas mientras se encontraba sobre un papel de filtro humedecido con 2x SSC [1x SSC es NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0] utilizando un entrecruzador STRATALINKER UV (Stratagene). Se realizó la prehibridación de los filtros a 42ºC en 150 ml de tampón de hibridación que contenía formamida al 50% (v/v), 6x SSC, 10x disolución de Denhardt [1x disolución de Denhardt es Ficoll al 0,02% (tipo 400, Pharmacia), polivinilpirrolidona al 0,02%, y albúmina de suero bovina al 0,02%], SDS al 0,1% (p/v), y ADN de esperma de salmón sometido a cizallamiento y desnaturalizado 200 \mug/ml. Después de 3 h, el tampón de hibridación usado se sustituyó por 100 ml de tampón de hibridación fresco que contenía una sonda marcada con una actividad específica = 5 x 10^{8} dpm/\mug. La hibridación continuó durante 18-20 h a 42ºC con rotación suave. Después los filtros se lavaron dos veces a 55-60ºC durante 40 min en 1 l de disolución de lavado que contenía 0,2x SSC y SDS al 0,1%. Los filtros entonces se expusieron a una película Kodak XOMAT-AR (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) con pantallas intensificadoras (Lightening Plus, DuPont CRONEX, DuPont, Wilmington DE) durante 16 h a -70ºC. El examen de las películas permitió la identificación de las placas positivas. Las placas positivas se seleccionaron y se conservaron en 1 ml de tampón SM [NaCl 5,8 g/l, MgSO_{4} 2 g/l, Tris.HCl 20 mM, pH 7,5, 5 ml/l de gelatina al 2% (p/v)] con 50 \mul de cloroformo. Los fagos se cultivaron en placa para una selección secundaria utilizando 50 \mul de una dilución 1:1000 del cultivo madre de fagos primario. Las placas positivas de la selección secundaria se seleccionaron y se conservaron en 500 \mul de tampón SM. Los fagos positivos entonces se cultivaron en placa para las selecciones terciarias utilizando unas cantidades que varían de 5 \mul del cultivo madre secundario sin diluir a 20 \mul de la dilución 1:100 en tampón SM. Todas las posteriores hibridaciones se realizaron como se describe anteriormente. Los aislados se rescataron en forma de fágmido según el manual de instrucciones del banco LAMBDA-ZAP II (Stratagene). El fágmido rescatado se cultivó en placa junto con 200 \mul de células SOLR (Stratagene) cultivadas hasta OD_{600 \ nm} = 0,5 a 1,0 con 50 a 100 \mul de fágmido e incubando durante 15 min a 37ºC. Las células que contenían el fágmido se cultivaron en líneas sobre LB agar que contenía ampicilina (75 \mug/ml) y se cultivaron durante la noche a 37ºC. El ADN se extrajo de 2 ml de cultivos líquidos que se habían hecho crecer durante la noche a 37ºC en medio LB que contenía ampicilina 100 \mug/ml. El ADN se aisló mediante minipreps de lisis alcalina, se digirió con EcoRI y XhoI, y se fraccionó sobre geles de agarosa al 1,0%. El ADN se trasladó desde el gel a una membrana de nailon Hybond N (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL). Los clones que contenían insertos con una homología con la sonda de desaturasa de 119 pb se identificaron mediante una hibridación utilizando el sistema de marcaje y detección de ácidos nucleicos directo ECL (Amersham) según las instrucciones del fabricante. Los clones que se hibridaban con la sonda tenían insertos con un tamaño que varía de 0,7 a 1,6 kb.

Se transformó el ADN miniprep procedente de los clones positivos en E. coli DH5\alpha (Gibco-BRL Life Technologies, Bethesda, MD), se cultivó en línea para obtener colonias individuales, y se preparó el ADN del plásmido mediante un procedimiento de lisis alcalina/CsCl según Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El plásmido se secuenció con cebadores localizados en el vactor flanqueando el inserto y con cebadores basados en la secuencia del fragmento de PCR interno. Se diseñó una segunda ronda de cebadores basándose en la secuencia obtenida de la primera ronda de secuenciación. La secuenciación se realizó como se describió anteriormente, se compiló, se alineó y se editó con el programa SEQED (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division). La secuencia de ADN resultante se indica en la presente como SEQ ID NO:5. El análisis de la secuencia de ADN de SEQ ID NO:5 se realizó utilizando MACVECTOR v. 4.1.4 (Oxford Molecular, Campbell, KY), que produjo una traducción teórica, generando con ello la secuencia de aminoácidos indicada en la presente como SEQ ID NO:6.

Ejemplo 2 Construcción de vectores de transformación de plantas

Para expresar la desaturasa de Aspergillus en el maíz de una forma constitutiva, se clonó el marco de lectura abierto codificado por SEQ ID NO:5 en el plásmido pDAB439 entre el promotor/intrón de ubiquitina y el terminador Nos, fabricando con ello pDAB463. El plásmido pDAB439 es un vector de transformación de plantas bicatenario de 7040 pares de bases compuesto por las siguientes secuencias en orden según las agujas del reloj. El esqueleto del plásmido se deriva de pUC19 (Yanish-Perron et al. (1985), Gene, 33:103-119). Los nucleótidos 1 a 2252 de pDAB439 se corresponden con el complemento inverso de los nucleótidos 435 a 2686 de pUC19. Los nucleótidos 2253 a 2271 de pDAB439 tienen la secuencia TGCATGTGTT CTCCTTTTT. Los nucleótidos 2272 a 4264 de pDAB439 son el promotor de ubiquitina del maíz y el primer intrón, y se amplificaron mediante PCR a partir del ADN genómico de maíz de genotipo B73 (Christensen et al. (1992), Plant Mol. Biol., 18:675-689). Los nucleótidos 4265 a 4308 de pDAB439 tienen la secuencia GGTACGGCCA TATTGGCCGA GCTCGGCCTC TCTGGCCGAT CCCC. Los nucleótidos 4309 a 4576 de pDAB439 se corresponden con los nucleótidos 4420 a 4687 del plásmido pBI101 (Clontech, Palo Alto, CA), seguidos del conector GG como los nucleótidos 4577 y 4578 de pDAB439. Los nucleótidos 4579 a 4743 de pDAB439 se corresponden con el complemento inverso de los nucleótidos 238-402 de pUC19. Los nucleótidos 4744 a 4807 de pDAB439 se corresponden con: GCGGCCGCTT TAACGCCCGG GCATTTAAAT GGCGCGCCGC GATCGCTTGC AGATCTGCAT GGG. Los nucleótidos 4808-5416 de pDAB439 comprenden el promotor 35S potenciado doble, correspondiéndose los nucleótidos 5070 a 5416 con los nucleótidos 7093 a 7439 del genoma del virus del mosaico de la coliflor (Franck et al. (1980), Cell, 21:285-294). Los nucleótidos 4808 a 5061 de pDAB439 son una duplicación de los nucleótidos 5068 a 5321. Los nucleótidos 5062 a 5067 de pDAB439 comprenden el conector CATCGA. Los nucleótidos 5417-5436 de pDAB439 comprenden el conector GGGGACTCTA GAGGATCCAG. Los nucleótidos 5437 a 5547 de pDAB439 se corresponden con los nucleótidos 167 a 277 del genoma del virus del rayado del maíz (Mullineaux et al. (1984), EMBO J., 3:3063-3068). Los nucleótidos 5548 a 5764 de pDAB439 se corresponden con el primer intrón modificado del gen de la alcohol deshidrogenasa del maíz (Adhl-S) (Dennis et al. (1984), Nucleic Acids Res., 12:3983-4000] . La modificación produce la eliminación de 343 nucleótidos (bases 1313 a 1656), quedando las bases 1222 a 1312 (intrón del extremo 5') y los nucleótidos 1657 a 1775 (intrón del extremo 3') del gen Adhl-S del maíz. Los nucleótidos 5765 a 5802 de pDAB439 se corresponden con los nucleótidos 278 a 312 el virus del rayado del maíz (MSV), seguido por la secuencia conectora CAG. Ambas secciones de la secuencia del virus del rayado del maíz, en lo sucesivo MSV, comprenden el conductor no traducido del gen V2 de la proteína de la envuelta de MSV, y están interrumpidas en el plásmido pDAB439 por el intrón Adh1 modificado. Los nucleótidos 5803 a 6359 del plásmido pDAB439 se corresponden con los nucleótidos 29 a 585 del gen de fosfinotricina acetil transferasa (BAR) de Streptomyces hygroscopicus (White et al. (1989), Nucleic Acids Res., 18:1062). Para facilitar la clonación, los nucleótidos 34 y 575 de la secuencia publicada se cambiaron de A y G a G y A, respectivamente. Esta secuencia actúa como marcador seleccionable en las células vegetales. Los nucleótidos 6360 a 6364 comprenden el conector GATCT. Los nucleótidos 6365 a 6635 de pDAB439 se corresponden con los nucleótidos 4420 a 4683 del plásmido pBI101 (Clontech, Palo Alto, CA), seguidos de la secuencia conectora AGATCGC. Los nucleótidos 6636 a 6639 de pDAB439 comprenden el conector TCGG. El resto de la secuencia de pDAB439 (nucleótidos 6640 a 7040) se corresponden con los nucleótidos 284 a 684 de pUC19.

La SEQ ID NO:5 se modificó de forma que puede colocarse en el plásmido pDAB439. Para este fin, la SEQ ID NO:5 se amplificó con cebadores, como se describen en la presente en SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. La amplificación se realizó en seis reacciones simultáneas como sigue: 200 ng de ADN molde (SEQ ID NO:5), 10 \mul de 10x RB, 10 \mul de dNTP 2 mM, 3000 pmol de cebadores (SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8), 2,5 unidades de ADN polimerasa AMPLITAQ (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) y agua (volumen total = 100 \mul). Se programó un termociclador de ADN (Perkin-Elmer Cetus Model nº 480) como sigue: 96ºC durante 1 min; [94ºC (30 seg), 72ºC (2 min)] durante 15 ciclos; seguido de una extensión de 7 min (72ºC). Después de la amplificación las reacciones se reunieron, el ADN precipitó con etanol, y el sedimento se resuspendió en 40 \mul de tampón TE [Tris.HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM]. Se digirieron 20 \mul de ADN con 60 unidades de SfiI en 60 volúmenes de gel, se sometió a una electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% preparativa, y el fragmento de 1,4 kpb liberado se aisló del gel utilizando columnas GenElute. El ADN purificado se precipitó con etanol y el sedimento se resuspendió en 20 \mul de tampón TE. Se acoplaron 2 \mul del fragmento en 100 ng de pDAB439 que había sido digerido con SfiI. Los acoplamientos, la transformación, y el análisis de los clones recombinantes se realizó según Sambrook et al. Se seleccionó y se secuenció un clon que contenía el inserto de 1,4 kpb. La secuencia de este inserto es idéntica a los nucleótidos 4-1371 de SEQ ID NO:5, con la excepción de los cambios que se introdujeron de manera deliberada, para mejorar el contexto de traducción alrededor del codón ATG. Este plásmido se denominó pDAB463.

Para expresar la desaturasa de Aspergillus en el maíz de una manera específica de la semilla, el promotor/intrón de ubiquitina en pDAB463 se sustituyó por el promotor del gen de la globulina de maíz. El promotor de globulina se amplificó a partir del ADN genómico del maíz y se clonó en el plásmido pGGN62-2. El plásmido pGGN62-2 es un plásmido de 6321 pares de bases que comprende lo siguiente: los nucleótidos 1 a 1257 se corresponden con los nucleótidos 4 a 1260 de SEQ ID NO:9; los nucleótidos 1258 a 3399 se corresponden con las bases 898 a 3039 de pBI221 (Clontech), en el que ocho bases del gen de \beta-glucuronidasa, en lo sucesivo gen GUS, se volvieron a modificar para que contuviesen un sitio NcoI en el codón de inicio ATG para facilitar la clonación y para mantener las secuencias óptimas para el inicio de la traducción. Esto dio como resultado que los primeros ocho pares de bases del gen GUS tenían la secuencia CCATGGTC, que produce un cambio en la secuencia de aminoácidos de Met Leu a Met Val. El resto de los nucleótidos en pGGN62-2 (3400 a 6321) se corresponde con los nucleótidos 1 a 2916 de pBLUESCRIPT SK- (Stratagene), definiéndose el nucleótido 1 como el primer resto A del sitio exclusivo Hind3 y avanzando en el sentido de las agujas del reloj hacia el sitio XhoI. La diferencia en seis bases en el número de bases es debida a deleciones de bases en la secuencia publicada de 232 a 235 y 663 a 664.

Para subclonar el promotor de globulina en el plásmido pDAB463, se creó un sitio exclusivo PacI cadena arriba del promotor de globulina en el plásmido pGGN62-2. Un adaptador de XbaI a PacI que tiene la secuencia CTAGCTTAAT TAAG se fosforiló con ATP y T4 polinucleótido quinasa, se reasoció y se acopló en pGGN62-2 que había sido digerido con XbaI y tratado con fosfatasa intestinal de ternera, según Sambrook et al. Los clones que contenían el adaptador se seleccionaron mediante digestión de minipreps con PacI, y un clon que fue cortado por PacI pero no por XbaI se denominó pGGN62-2P1. El fragmento promotor de globulina se escindió mediante digestión con PacI y NcoI, se purificó mediante una electroforesis en gel preparativa, y con columnas GenElute. El plásmido pDAB463 se cortó con PacI para completarlo, y se realizó una digestión parcial con NcoI. El fragmento lineal de 6,4 kpb se purificó mediante electroforesis en gel preparativa y columnas GenElute, y tras una precipitación en etanol se acopló al fragmento promotor de globulina. Los clones que tenían el promotor de globulina cadena arriba de la desaturasa de Aspergillus se seleccionaron mediante digestión de ADN miniprep con NcoI. Un plásmido que tenía el patrón de digestión correcto se denominó pDAB470 y se secuenció a través de la unión de clonación para verificar que las secuencias alrededor del codón ATG no habían sido alteradas.

La desaturasa de Aspergillus también se utilizó para modificar la composición lipídica de especies dicotiledóneas. Para expresar el gen de una manera específica de la semilla, la desaturasa de Aspergillus se colocó detrás del promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris. Este promotor se ha caracterizado a fondo y se demostró que era adecuado para una expresión de alto nivel, específica de semillas, en el tabaco. El promotor de faseolina/gen de la desaturasa de Aspergillus se colocó en el plásmido phaGN184-2.

El plásmido phaGN184-2 se construyó como sigue. El vector de expresión del maíz, phaGN184-2, que contenía el elemento regulador 5' del gen de \beta-faseolina de Phaseolus vulgaris que dirige al gen de la \beta-glucuronidasa se usó en los estudios de expresión. El plásmido phaGN184-2 es un vector de transformación de plantas bicatenario de 6657 pares de bases compuesto por las siguientes secuencias en orden según las agujas del reloj. Los nucleótidos 1 a 64 tienen una secuencia policonectora procedente de varias subclonaciones e incluye la secuencia CCACCGCGGT GGCGGCCGCT CTAGATGCAT GCTCGAGCGG CCGCCAGTGT GATGGATATC TGCA. Los nucleótidos 65 a 1611 contienen las secuencias reguladoras 5' del gen de \beta-faseolina de Phaseolus vulgaris, según se describe en SEQ ID NO:10. La base 1113 de phaGN184-2 (que se corresponde con la base 1049 de SEQ ID NO:10) se modificó de C a T para facilitar la posterior clonación. El nucleótido 1612 de phaGN184-2 es una C. Los nucleótidos 1613 a 3464 se corresponden con los nucleótidos 2551 a 4402 del plásmido pBI101 (Clontech, Palo Alto, CA). Las bases 1613 a 3418 codifican el gen de la \beta-glucuronidasa de Jefferson et al. (1987, EMBO J., 6:3901-3907), modificándose las bases 1616-1618 de TTA a GTC para facilitar la clonación y maximizar el inicio de la traducción. Las bases 3465 a 3474 están compuestas de la secuencia conectora TGGGGAATTG. Las bases 3475 a 3744 de phaGN184-2 están compuestas de 4414 a 4683 de pBI101 (Clontech, Palo Alto, CA). A esta secuencia le sigue el conector ATCGGGAATT que se corresponde con las bases 3745 a 3754. El resto de la secuencia de phaGN184-2 (nucleótidos 3755 a 6657) se corresponden con el complemento inverso de los nucleótidos del esqueleto del plásmido que se deriva de pUC19 (Yanish-Perron et al. (1985), Gene, 33:103-119).

Para facilitar la transferencia del promotor de faseolina desde este plásmido a pDAB463, se cambió un sitio exclusivo XbaI cadena arriba del promotor de faseolina a un sitio exclusivo PacI, utilizando el adaptador como se describió anteriormente. El plásmido resultante, phaGN184-2P1, se cortó con PacI y NcoI. El fragmento promotor de faseolina liberado se purificó del gel y se acopló en pDAB463, que había sido digerido con PacI para completarlo, parcialmente digerido con NcoI y purificado como se describió anteriormente. Los plásmidos resultantes se seleccionaron con NcoI, y se identificaron dos clones que tenían el patrón de restricción apropiado. Uno de estos dos clones se denominó pDAB471, y se secuenció a través de la unión de faseolina/desaturasa para verificar que no se hubiesen producido cambios no intencionados durante la modificación. El módulo de faseolina/desaturasa/gen nosA se trasladó al vector binario pDAB1542.

El plásmido pDAB1542 se construyó utilizando procedimientos de biología molecular convencionales. La secuencia de 10323 pares de bases se describe en la presente como SEQ ID NO:11. La posición de inicio es el sitio Hind III (AAGCTT) que representa las bases 602 a 607 de la secuencia de ADN-T de pTi-15955 de Agrobacterium tumefaciens cepa 15955, y que tiene el nº de registro NCBI X00493 J05108 X00282. Los nucleótidos 1 a 579 de SEQ ID NO:11 representan las bases 602 a 1184 de pTi-15955, excepto que la secuencia GTAC, que representa los nucleótidos 622-625 de pTi-15955, había sido delecionada para destruir un sitio de reconocimiento Kpn I. Esta sección de secuencia incluye el borde A del ADN-T (bases 304 a 327). Los nucleótidos 580 a 597 de SEQ ID.NO:11 son los restos de las manipulaciones de clonación. Los nucleótidos 598 a 2027 de SEQ ID NO:11 se derivan de transposón Tn903 de Escherichia coli, y se corresponden en general a las bases 835 a 2264 del nº de registro NCBI J01839, con las siguiente modificaciones: la base 1467 de J01839 (C) se mutó a T (base 1230 de SEQ ID NO:11) para destruir un sitio de reconocimiento SmaI, y la base 1714 de J01839 (C) se mutó a T (base 1477 de SEQ ID NO:11) para destruir un sitio de reconocimiento HindIII. Las bases 925 a 1740 de SEQ ID NO:11 son un marco de lectura abierto que codifica la proteína neomicina fosfotransferasa I de Tn903. Los nucleótidos 2028 a 2062 de SEQ ID.NO:11 son los restos de las manipulaciones de clonación. Las bases 2063 a 2080 de SEQ ID NO:11 se derivan del transposón Tn5 de E. coli (NCBI nº de registro U00004 L19385), y representan las bases 2519 a 2536 de esa secuencia (hebra complementaria). Las bases 2081 a 2793 de SEQ ID NO:11 representan los nucleótidos 21728 a 22440 de pTi-15955 (NCBI nº de registro X00493 J05108 X00282). Las bases 2794 a 3772 de SEQ ID NO:11 son las bases 1540 a 2518 de Tn5 (hebra complementaria), con las siguientes modificaciones: la base 1532 de Tn5 (G) se mutó a T (base 3764 de SEQ ID NO:11) y la base 1536 de Tn5 (C) se mutó a G (base 3768 de SEQ ID NO:11) para crear un sitio BamHI. Las bases 2967 a 3761 de SEQ ID NO:11 (hebra complementaria) son el marco de lectura abierto que codifica la proteína neomicina fosfotransferasa II de Tn5. Los nucleótidos 3773 a 3784 de SEQ ID.NO:11 son los restos de las manipulaciones de clonación. Las bases 3785 a 4174 de SEQ ID NO:11 son las bases 5376 a 5765 de NCBI nº de registro V00141 J02048, y están compuestos del promotor 19S de la cepa CabbS del virus del mosaico de la coliflor. Las bases 4175 a 4272 de SEQ ID NO:11 comprenden un sitio de clonación múltiple para la introducción de fragmentos de ADN heterólogos en pDAB1542, e incluyen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción exclusivos para BglII (AGATCT), AscI (GGCGCGCC), SwaI (ATTTAAAT), SrfI (GCCCGGGC), PmeI (GTTTAAAC), NotI (GCGGCCGC), y PacI (TTAATTAA). Los nucleótidos 4273 a 4624 de SEQ ID NO:11 representan las bases 13926 a 14277 de pTi-15955 (NCBI nº de registro X00493 J05108 X00282), y incluyen el borde B del ADN-T como las bases 4407 a 4432, y la secuencia intensificadora como las bases 4445 a 4468. Las bases 4625 a 4630 son un sitio de reconocimiento de HindIII (AAGCTT), que representan la unión entre la porción del ADN-T modificado de pDAB1542 y los componentes del vector plasmídico.

Las bases 4631 a 5433 de SEQ ID NO:11 se derivan del plásmido pR29 (Morrisson, D.A., M.-C. Trombe, M.-K. Hayden, G.A. Waszak, y J.-D. Chen, J. Bacteriol., 159:870-876, 1984); su secuencia no ha sido previamente descrita. Se obtuvieron com parte de un fragmento HindIII/AvaI de 1824 pares de bases que contiene el determinante para la resistencia a eritromicina de pR29. Las bases 5434 a 5828 de SEQ ID NO:11 representan los nucleótidos 1 a 395 de STRERMAM1 (NCBI nº de registro M20334). Las bases 5534 a 6448 de SEQ ID NO:11 se corresponden, en general, con EHERMAM (NCBI nº de registro X81655), con las siguientes excepciones: las bases que se corresponden con los nucleótidos 5586, 5927, 5930 y 5931 (todas G) de SEQ ID NO:11 se indican como restos A en EHERMAM. Además, las bases 5933 (T), 5934 (T), 5935 (C), 5936 (T), y 5938 (C) de SEQ ID NO:11 son restos A en EHERMAM. Los nucleótidos 5943 a 6448 de SEQ ID NO:11 se corresponden con las bases 1 a 506 de STRERMAM2 (NCBI nº de registro M20335), comprendiendo las bases 5546 a 6280 de SEQ ID NO:11 un marco de lectura abierto que codifica una proteína putativa de adenina metilasa.

Los nucleótidos 6448 a 8866 de SEQ ID NO:11 representan los nucleótidos 15435 a 17853 del plásmido RK2 (NCBI nº de registro L27758), con las siguientes excepciones: la secuencia L27758 incluye una T adicional entre las bases 6573 y 6574 de SEQ ID NO:11, y una C adicional entre las bases 6904 y 6905 de SEQ ID NO:11. Además, las bases 6651 (G), 7446 (A), 7461 (A), 7479 (A), y 7494 (T) de SEQ ID NO:11 son una C, una C, una C, una G, y una C en L27758. Los nucleótidos 8861 a 9602 de SEQ ID NO:11 representan las bases 50632 a 51373 de L27758, y los nucleótidos 9614 a 10322 de SEQ ID NO:11 son la hebra complementaria de las bases 12109 a 12817 de L277758, con las siguientes excepciones: las bases 9742 (T) y 10024 (C) de SEQ ID NO:11 son ambas restos A en L27758, y la base 10191 (T) de SEQ ID NO:11 no aparece representada en la secuencia RK2 de L27758. Las bases 9603 a 9613, y la base 10323 de SEQ ID NO:11 son los restos de las manipulaciones de clonación.

El plásmido pDAB1542 se digirió con PacI y AscI para completarlo y se trató con fosfatasa intestinal de ternera. El plásmido pDAB471 se digirió con PacI y AscI, y el inserto de 3,4 kpb se purificó mediante una electroforesis en gel y columnas GenElute, se precipitó en etanol y se resuspendió en 20 \mul de tampón TE. Se acoplaron 7 \mul del fragmento purificado en gel con 200 ng del vector pDAB1542, y se transformó en células E. coli DH5\alpha. Las colonias resultantes se seleccionaron para la presencia del inserto mediante digestión de ADN miniprep con PacI y AscI. Un clon resultante que tiene el patrón de restricción deseado se denominó pDAB473, y se empleó en las posteriores transformaciones del tabaco.

Un plásmido control para la transformación del tabaco (pDAB1542) que contenía un módulo de faseolina/GUS/
nosA en lugar de faseolina/desaturasa/nosA, se construyó como sigue. El pDAB1542 se digirió con PacI y SrfI, y se trató con fosfatasa intestinal de ternera, como se describe en Sambrook et al. El plásmido phaGN184-2P1 se digirió con PacI y Pvu2, se precipitó en etanol y se resuspendió en tampón TE. Aproximadamente 1 \mug del phaGN184-2 digerido se acopló mediante pistola a 200 ng del vector y se transformó en células DH5\alpha E. coli. Se seleccionaron los clones con insertos mediante selección de ADN miniprep con BglII. Se identificaron dos clones con un fragmento BglII de 3,1 kpb, lo cual indica la presencia del módulo de faseolina/GUS/nosA. Un clon, denominado pDAB474, se empleó como control en posteriores transformaciones del tabaco.

Ejemplo 3 Transformación del tabaco con una construcción de faseolina/desaturasa de Aspergillus/nos y plásmidos control

Las cepas de E. coli DH5\alpha que portaban los plásmidos pDAB473 y pDAH474, y una cepa de E. coli que contenía el plásmido pRK2013 (Clontech), se cultivaron hasta la fase logarítmica en medio YEP [extracto de levadura 10 g/l, peptona 10 g/l, cloruro de sodio 5 g/l] que contenía kanamicina 50 \mug/l. La cepa EHA101S de Agrobacterium tumefaciens (depositada en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604; nº de depósito XXX) se cultivó a 28ºC hasta la fase logarítmica en medio YEP que contenía estreptomicina a 250 \mug/l. Los cultivos se centrifugaron para sedimentar las células y cada sedimento celular se resuspendió en 500 \mul de medio LB. Para el apareamiento de pDAB473, se mezclaron 100 \mul de la suspensión celular de E. coli DH5\alpha/pDAB473 con 100 \mul de E. coli que contenía pRK2013 y 100 \mul de EHA101S de Agrobacterium. La suspensión mezclada se cultivó en placas de LB-agar y se incubó durante la noche a 28ºC durante 24 h. Las células se rasparon de la placa y se resuspendieron en 1 ml de medio LB y se diluyeron en serie de 10^{-3} a 10^{-6} en agua estéril. Se colocaron 100 \mul de cada dilución en placas de YEP agar, que contenían eritromicina a 100 \mug/l y estreptomicina a 250 \mug/l, y se incubaron a 28ºC durante 2 días, hasta que las colonias fueron claramente visibles. Se cultivaron en línea diez colonias de la dilución en 10^{-5} para conseguir colonias individuales en el mismo medio dos veces, para asegurarse de que los transconjugados de Agrobacterium estuvieran exentos de E. coli contaminante. Para cada transconjugado se cultivaron 4 ml durante la noche en YEP que contenía eritromicina y estreptomicina, y se preparó el ADN plasmídico utilizando el procedimiento de lisis alcalina de miniprep convencional. El ADN miniprep se digirió con EcoRI, y se demostró que cada transconjugado contenía ADN plasmídico con el patrón de restricción esperado. La conjugación del plásmido pDAB474 en Agrobacterium se realizó como se describió anteriormente para pDAB473.

Ejemplo 4 Expresión de Aspergillus delta-9 en tabaco

La transformación del tabaco con Agrobacterium tumefaciens se realizó mediante un procedimiento similar a los métodos publicados (Horsch et al., 1988, Plant Molecular Biology Manual, Gelvin et al., eds., Kluwer Academic Publishers, Boston, MA). Para proporcionar el material de origen para la transformación, se esterilizó la superficie de semillas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) y se plantaron sobre la superficie de TOB- , que es un medio de Murashige y Skoog (MS) exento de hormonas (Murashige y Skoog, 1962, Plant Physiol., 75:473-497) solidificado con agar. Las plantas se cultivaron durante 6-8 semanas en una sala incubadora iluminada a 28-30ºC y las hojas se recogieron de forma estéril para su uso en el protocolo de transformación. Se cortaron fragmentos de aproximadamente 1 cm^{2} de forma estéril, excluyendo el nervio central. Cultivos de las cepas de Agrobacterium (EHA101S que contenía pDAB473 o pDAB474), que se habían hecho crecer durante la noche en un rotor a 28ºC, se sedimentaron en una centrífuga y se resuspendieron en sales MS estériles y se ajustaron a OD_{6000 \ nm}= 0,7. Los fragmentos de hojas se sumergieron en esta suspensión durante aproximadamente 30 segundos, después se secaron con paños de papel estériles y se colocaron boca arriba en medio TOB+ (medio MS que contenía ácido indolacético 1 mg/l y benciladenina 2,5 mg/l) y se incubaron en la oscuridad a 28ºC. Dos días más tarde los fragmentos de hojas se cambiaron a medio TOB+ que contenía cefotaxima 250 mg/l (Agri-Bio, North Miami, FA) y sulfato de kanamicina 100 mg/l (AgriBio) y se incubaron a 28-30ºC con luz. Los fragmentos de hojas se cambiaron a TOB+ nuevo con cefotaxima y kanamicina dos veces por semana durante las primeras dos semanas y una vez por semana posteriormente. Los fragmentos de hojas que mostraron un recrecimiento de la cepa de Agrobacterium se cambiaron a medio TOB+ con cefotaxima y kanamicina, más HCl de vancomicina 100 mg/l (Sigma). Después de cuatro semanas, se retiraron las plántulas que surgieron de los focos transformados, se plantaron en medio TOB- que contenía cefotaxima 250 mg/l y kanamicina 100 mg/l, y se cultivaron en una cámara incubadora iluminada. Después de 3-4 semanas, estas plantas habían crecido lo suficiente como para poder analizar muestras de hojas para la presencia del transgén. Después las plantas se transplantaron a tierra en un invernadero y se mantuvieron bajo condiciones de invernadero convencionales (30ºC, 16 h de luz) hasta que se desarrollaron cápsulas de semillas autopolinizadas maduras. Entonces se analizó el contenido en aceite de dichas cápsulas de semillas como se describe en la presente.

Ejemplo 5 Análisis de la composición de ácidos grasos de semillas de tabaco transformadas con palmitoil-CoA A-9 desaturasa de Aspergillus

El procedimiento para la extracción y la esterificación de ácidos grasos procedentes de tejidos vegetales fue una modificación de Browse et. al. ((1986), Anal. Biochem., 152:141-145). Se colocaron de 1 a 20 mg de tejido de la planta en un tubo de ensayo. Después de la adición de 1 ml de HCL-metanólico (Supelco, Bellefonte, PA), los tubos se purgaron con nitrógeno gaseoso y se sellaron. Los tubos entonces se calentaron a 80ºC durante 1 h y se dejaron enfriar. Se retiraron los ésteres metílicos de ácidos grasos de la mezcla de reacción mediante una extracción con hexano, que implicó la adición de 1 ml de hexano y 1 ml de NaCl al 0.9% (p/v), seguido de una agitación vigorosa. Después de una centrifugación a 16.000 x g durante 5 min, la capa superior de hexano se retiró y se utilizó para un análisis FAME. El análisis se realizó mediante la inyección de 1 \mul de muestra en un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard (Wilmington, DE), serie II, modelo 5890, equipado con un detector de ionización de llama y una columna J&W Scientific (Folsom, CA) DB-23. La temperatura del horno se mantuvo a 150ºC a lo largo del ensayo (20 min) y el flujo del gas vehículo (helio) fue de 80 cm/seg. Las condiciones permiten la separación de seis ésteres metílicos de ácidos grasos de interés que tenían diferentes longitudes de carbonos: 16:0, palmitil metil éster; 16:1, palmitoíl metil éster; 18:0, estearil metil éster; 18:1, oleoíl metil éster; 18:2, linoleoíl metil éster; y 18:3, linolenil metil éster. La recogida de datos y el análisis se realizaron con un integrador Hewlett-Packard, serie II, modelo 3396, y un sistema de recogida de datos PE Nelson (Perkin-Elmer). El porcentaje de cada éster metílico de ácido graso en la muestra se tomó directamente, como se indica en el sistema de recogida de datos. Se calcularon las cantidades cuantitativas de cada éster metílico de ácido graso utilizando las áreas bajo los picos de un patrón (Matreya, Pleasant Gap, PA) que tiene cantidades conocidas de los cinco ésteres metílicos de ácidos grasos de interés. La cantidad determinada se utilizó para estimar el porcentaje de cada ácido graso por peso fresco total. No se hicieron ajustes para la pérdida de ácidos grasos durante el procedimiento de extracción y esterificación, puesto que las recuperaciones variaban, de forma típica, de 90 a 100% dependiendo de la cantidad original de muestra. La presencia de tejido vegetal en la mezcla de extracción no tuvo efecto sobre la recuperación de cantidades conocidas de patrón.

Las semillas de tabaco transgénicas producidas como se describe en la presente se analizaron cuando estuvieron maduras. De cada planta independiente se recolectaron tres recipientes de semillas. Se extrajeron los ésteres metílicos de ácidos grasos de 20 mg de semillas para cada muestra como se describió anteriormente. Los datos se resumen en la tabla 3.

TABLA 3 Composición de ácidos grasos y porcentaje de lípidos por peso fresco de semillas de tabaco procedentes de plantas transformadas con pDAB473 (construcción de desaturasa de Aspergillus) y pDAB474 (construcción control)

4

La transformación del tabaco con pDAB473, que contenía el gen de la palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus expresado bajo el control del promotor de faseolina, condujo a cambios muy notables en la composición de ácidos grasos de la semilla del tabaco, cuando se compara con controles (pDAB474). El ácido palmitoleico (16:1A9), que normalmente está presente sólo en cantidades minúsculas, sumó aproximadamente 4,0%. Como resultado, la cantidad de ácidos grasos saturados disminuyó, y resultaron afectados el ácido palmítico (16:0) y el ácido esteárico (18:0).

Ejemplo 6 Producción y regeneración de aislados de maíz transgénicos de \Delta-9 desaturasa de Aspergillus

Se iniciaron cultivos de callos de tipo II a partir de embriones cigóticos inmaduros del genotipo "Hi-II." [Armstrong et al. (1991), Maize Cooperation Newsletter, pp. 92-93]. Los embriones se aislaron de espigas crecidas en invernadero a partir de cruces entre un padre A Hi-II y un padre B Hi-II, o embriones F2 derivados de una autopolinización o la polinización entre hermanos de una planta Hi-II. Se cultivaron los embriones inmaduros (de 1,5 a 3,5 mm) en medio de iniciación que consistía en sales N6 y vitaminas [Chu et al. (1978), "The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops", Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56], 2,4-D 1,0 mg/l, L-prolina 25 mM, hidrolizado de caseína 100 mg/l, AgNO_{3} 10 mg/l, GELRITE 2,5 g/l y sacarosa 20 g/l, con un pH de 5,8. La selección del callo de tipo II tuvo lugar en alrededor de las 2 a 12 semanas. Después de cuatro a seis semanas, el callo fue subcultivado en medio de mantenimiento (medio de iniciación en el que se omitió el AgNO_{3} y la L-prolina se redujo a 6 mM).

Los plásmidos pDAB463 y pDAB470 se transformaron en callos embriogénicos mediante bombardeo con helio. Para aplicar el chorro, se precipitaron 140 \mug de ADN plasmídico sobre 60 mg de partículas de oro esféricas enjuagadas con alcohol (1,5 - 3,0 \mum de diámetro), añadiendo 74 \mul de CaCl_{2} H_{2}O 2,5 M y 30 \mul de espermidina 0,1 M (base libre) a 300 \mul del ADN plasmídico y H_{2}O. Inmediatamente, se mezcló en vórtice la disolución y se dejaron reposar las partículas de oro recubiertas de ADN. Se retiró el sobrenadante transparente resultante y se volvieron a suspender las partículas de oro en 1 ml de etanol absoluto. Esta suspensión se diluyó con etanol absoluto para obtener 15 mg de oro revestido de ADN/ml.

\newpage

Se extendieron aproximadamente 600 mg de tejido de callo embriogénico sobre la superficie de un medio de mantenimiento de callo de tipo II, como se describe en la presente, que carecía de hidrolizado de caseína y de L-prolina, pero que estaba complementado con sorbitol 0,2 M y manitol 0,2 M como agente osmótico. Tras un pretratamiento de 4 horas, se transfirió el tejido a placas de cultivo que contenían el medio de chorro [medio osmótico solidificado con agar de cultivo de tejidos 20 g/l (JRH Biosciences, Lenexa, KS) en lugar de GELRITE 7 g/l (Schweizerhall, South Plainfield, NJ). El chorro de helio aceleró las partículas de oro en suspensión recubiertas de ADN hacia las dianas de tejido preparadas y las introdujo en ellas. El dispositivo utilizado fue un prototipo anterior al descrito en la patente de EEUU nº 5.141.131. Se cubrieron los tejidos con una rejilla de acero inoxidable (aberturas de 104 \mum) y se colocaron a un vacío parcial de 635 mm de Hg en la cámara del dispositivo. Las partículas de oro recubiertas de ADN se diluyeron hasta 1:1 con etanol absoluto antes de la aplicación del chorro y se aceleraron en las dianas de callos cuatro veces mediante el uso de una presión de helio de 10,3 x 10^{6} Pa, dispensándose con cada detonación 20 \mul de la suspensión de ADN/oro. Inmediatamente después de la aplicación del chorro, se transfirió el tejido a medio osmótico durante un periodo de recuperación de 16-24 horas. Después, se dividió el tejido en trozos pequeños y se transfirió al medio de selección [medio de mantenimiento que carece de hidrolizado de caseína y de L-prolina pero que tiene BASTA a 30 mg/l (Agrevo)]. Cada 4 semanas durante 3 meses, los trozos de tejido se transfirieron de manera no selectiva a un medio de selección nuevo. Después de 7 semanas y hasta las 22 semanas, se retiraron y se aislaron los sectores del callo que se encontraban en proliferación en un entorno de tejido con el crecimiento inhibido. El tejido resistente a BASTA resultante se subcultivó bisemanalmente en medio de selección nuevo. Tras los análisis de cromatografía de gases/ésteres metílicos de ácidos grasos, en lo sucesivo análisis GC/FAME, como se describe en la presente, se identificaron las líneas transgénicas positivas y se trasladaro a un medio de
regeneración.

Se inició la regeneración transfiriendo tejido de callo a un medio de inducción con una base de citoquinas, que consistía en sales de Murashige y Skoog, en lo sucesivo sales de MS, y vitaminas [Murashige and Skoog (1962), Physiol. Plant, 15:473-497], sacarosa 30 g/l, mioinositol a 100 mg/l, manitol 30 g/l, 6-bencilaminopurina 5 mg/l, en lo sucesivo BAP, 2,4-D 0,025 mg/l, BASTA 30 mg/l y GELRITE 2,5 g/l (Schweizerhall) a pH 5,7. Se colocaron los cultivos con poca luz (1345 lx) durante una semana y después otra semana con mucha luz (3497 lx). Después de un periodo de inducción de dos semanas, se transfirió el tejido de manera no selectiva a un medio de regeneración sin hormonas, que era idéntico al medio de inducción, salvo que carecía de 2,4-D y de BAP, y se mantuvo con mucha luz. Se retiraron plántulas pequeñas (1,5 a 3 cm) y se colocaron en tubos de cultivo de 150 x 25 mm que contenían un medio SH [sales de SH y vitaminas [Schenk y Hildebrandt (1972,) Can. J. Bot., 50:199-204], sacarosa 10 g/l, mioinositol 100 mg/l, FeEDTA 5 ml/l y GELRITE 2,5 g/l (Schweizerhall), pH 5,8]. Se transfirieron las plántulas a macetas de 10 cm que contenían aproximadamente 0,1 kg de METRO-MIX 360 (The Scotts Co. Marysville, OH) en el invernadero en cuanto mostraron crecimiento y desarrollaron un sistema radical suficiente. Se cultivaron con un fotoperiodo de 16 h complementado mediante una combinación de lámparas de sodio y de haluros metálicos a gran presión, y se mojaron según se necesitara con una combinación de tres formulaciones de fertilizantes de Peters Excel independientes (Grace-Sierra Horticultural Products Company, Milpitas, CA). En la etapa de 3 a 5 hojas, se transfirieron las plantas a macetas de 22,73 litros que contenían unos 4 kg de METRO-MIX 360.

Los regenerantes primarios se autopolinizaron o fueron polinizados por hermanos, o se cruzaron externamente con plantas endogámicas elite o plantas transgénicas después de 6-10 semanas más en las macetas de 22,73 litros. Las semillas R_{1} se recogieron a los 40-45 días después de la polinización.

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Ejemplo 7 Procedimiento para la producción de embriones somáticos de maíz y análisis de los ácidos grasos contenidos en ellos

Se mantuvo material de callo embriogénico que contiene los genes de interés como se describe en la presente. La producción continua de embriones somáticos, que constituyen una gran porción del callo embriogénico, se llevó a cabo trasladando el tejido del callo cada dos semanas. Aunque los embriones somáticos continuaron proliferando, normalmente se mantuvieron en una etapa temprana del desarrollo embrionario debido a la presencia continua de 2,4-D en el medio de cultivo. Los embriones somáticos pudieron regenerarseen plántulas cuando el callo se sometió al procedimiento de regeneración descrito en la presente. Durante la regeneración, los embriones somáticos formaron raíces y un brote, y posteriormente cesaron su desarrollo como embrión.

Se obligó a que los embriones somáticos se desarrollasen como embriones de semillas haciendo crecer los callos embriogénicos en medio MS que contenía sacarosa al 6% (p/v). Se hizo crecer el callo durante 7 días y, a continuación, se transfirieron individualmente los embriones somáticos al medio MS con sacarosa al 6% y ácido abscísico a 10 \muM, en lo sucesivo ABA.

Los embriones somáticos se ensayaron para la composición de ácidos grasos utilizando GC/FAME de 3 a 7 días después del crecimiento en medio MS que contenía sacarosa al 6% y ABA 10 \muM. Su composición de ácidos grasos se comparó con la composición de ácidos grasos de callos embriogénicos y con embriones cigóticos de maíz 12 DAP (tabla 4). La composición de ácidos grasos de los callos embriogénicos se diferenciaba de la de los embriones somáticos en que los callos tienen un porcentaje mayor de 16:0 y 18:3, mientras que tienen un porcentaje menor de 18:1 y 18:2. Además, el porcentaje de lípidos por peso fresco para los callos embriogénicos era de 0,4%, comparado con los embriones somáticos, 4,0%. La composición de ácidos grasos de los embriones cigóticos y de los embriones somáticos era muy similar y su porcentaje de lípidos por peso fresco era casi idéntico. Estos datos validan el uso del sistema de cultivo de embriones somáticos como sistema in vitro para ensayar el efecto de ciertos genes sobre la síntesis de lípidos en embriones de maíz en desarrollo.

Se produjeron embriones somáticos transformados con pDAB463 y pDAB470 a partir de callos embriogénicos utilizando los métodos descritos en la presente. Se produjeron embriones somáticos control a partir de líneas no transformadas que tienen un entorno idéntico al de las líneas transformadas. Para las líneas ensayadas se detectó 16:1\Delta9 en los embriones somáticos, siendo el nivel más alto de aproximadamente 2,7%. La detección de 16:1\Delta9 fue rara en las líneas control y cuando se detectó, los niveles nunca fueron más altos que aproximadamente 0,2% en un único embrión. La tabla 5 muestra la composición de ácidos grasos totales de embriones somáticos producidos a partir de las líneas 463-09 y 463-43, en que 16:1\Delta9 presentaba una media de aproximadamente 0,4% y aproximadamente 1,2%, respectivamente.

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TABLA 4 Comparación de la composición de ácidos grasos de callos embriogénicos, embriones somáticos y embriones cigóticos

6

\quad

^{a} El porcentaje de lípidos por peso fresco de tejido fue de 0,4 \pm 0,1, 4,0 \pm 1,1, y 3,9 \pm 0,6 para los callos embriogénicos, los embriones somáticos y los embriones cigóticos, respectivamente.

\quad

^{b}Los embriones somáticos se cultivaron sobre medio MS que contenía sacarosa al 6% y ABA 10 mM.

\quad

^{c} Los embriones cigóticos se ensayaron 12 DAP.

TABLA 5 Composición de ácidos grasos de embriones somáticos producidos a partir de cultivos transgénicos que contenían pDAH463

8

Se emplearon los callos embriogénicos procedentes de las líneas 463-09 y 463-43 para regenerar plantas como se describe en la presente. El procedimiento de análisis de los ésteres metílicos de ácidos grasos, como se describe en la presente, se realizó con tejido de hoja procedente de estas plantas. La tabla 6 muestra la composición de ácidos grasos totales de tejidos de hoja procedentes de las líneas 463-09 y 463-43, en que 16:1\Delta9 presentaba una media de aproximadamente 4,8% y aproximadamente 5,5%, respectivamente. Estos niveles de 16:1\Delta9 representan aproximadamente un aumento en tres veces o mayor que el que se encuentra normalmente en hojas control. El nivel de 16:0 se redujo en 20% comparado con el control en la línea 463-43.

Se realizaron polinizaciones con plantas procedentes de las líneas 463-09 y 463-43, se obtuvieron semillas como se describe en la presente, y se realizó el análisis de los ésteres metílicos de ácidos grasos sobre una pequeña porción (de 0,5 a 1,5 mg) de cada embrión de semilla. La media de la composición de ácidos grasos de las semillas que contenían 16:1\Delta9 se muestra en la tabla 7. El contenido en 16:1\Delta9 de las líneas 463-09 y 463-43 presentaba una media de aproximadamente 0,7% a aproximadamente 1,1%. El contenido en 18:0 de ambas líneas se redujo en aproximadamente 50%. Los datos descritos en la presente demuestran que una mayor proporción de 16:1\Delta9 en los embriones somáticos, las hojas y las semillas del maíz, puede obtenerse mediante la transformación con una construcción génica compuesta de un gen de palmitoil-CoA A9 de Aspergillus dirigido por un promotor de ubiquitina.

TABLA 6 Composición de ácidos grasos de hojas procedentes de plantas producidas a partir de cultivos transgénicos que contenían pDAB463

9

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TABLA 7 Composición de ácidos grasos de embriones de semillas procedentes de 463-09 y 463-43

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El análisis de los ésteres metílicos de ácidos grasos de callos embriogénicos transformados con pDAB470 demostró que se detectaba 16:1\Delta9 en embriones somáticos y que alcanzaba niveles de aproximadamente 1,8%. La detección de 16:1\Delta9 fue rara en las líneas control y cuando se detectó, los niveles nunca fueron más altos que aproximadamente 0,2% en un único embrión. La tabla 8 muestra la composición de ácidos grasos totales de embriones somáticos producidos a partir de las líneas 470-10 y 470-12, en que 16:1\Delta9 presentaba una media de aproximadamente 0,5% y aproximadamente 0,4%, respectivamente.

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Se emplearon los callos embriogénicos procedentes de las líneas 470-10 y 470-12 para regenerar plantas como se describe en la presente. El procedimiento de análisis de los ésteres metílicos de ácidos grasos, como se describe en la presente, se realizó con tejido de hoja procedente de estas plantas. Los niveles de 16:1\Delta9 en hojas procedentes de estas plantas fueron normales, tal como se esperaba, debido a la ausencia de expresión del promotor específico del embrión en el tejido de las hojas. Se realizaron polinizaciones con plantas procedentes de las líneas 470-10 y 463-43, se obtuvieron semillas como se describe en la presente, y se realizó el análisis de los ésteres metílicos de ácidos grasos sobre una pequeña porción (de 0,5 a 1,5 mg) de cada embrión de semilla.

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TABLA 8 Composición de ácidos grasos de embriones somáticos producidos a partir de cultivos transgénicos que contenían pDAB470

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La media de la composición de ácidos grasos de las semillas que contenían 16:1\Delta9 se muestra en la tabla 9. El contenido en 16:1\Delta9 de las líneas 470-10 y 470-12 presentaba una media de aproximadamente 0,9% a aproximadamente 1,7%, respectivamente. El contenido en 18:0 de ambas líneas se redujo en más de aproximadamente 50%. El contenido de 16:1\Delta9 observado en algunas líneas de embriones de semillas era de aproximadamente 3,2%. En ambas líneas se observó una reducción en el contenido de 16:0 de aproximadamente 6% y una reducción en los ácidos grasos saturados totales de aproximadamente 10%. Los datos descritos en la presente demuestran que puede obtenerse una mayor producción de 16:1\Delta9 y una disminución concomitante en 16:0 y ácidos grasos saturados totales en el maíz, mediante la transformación con una construcción génica compuesta por un gen \Delta9 de Aspergillus dirigido por un promotor de globulina específico del embrión.

TABLA 9 Composición de ácidos grasos de embriones de semillas procedentes de 470-10 y 470-12

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Ejemplo 8 Identificación de 16:1\Delta9 en un extracto procedente de un embrión de semilla transformado con \Delta-9 desaturasa de Aspergillus

Se extrajeron los ésteres metílicos de ácidos grasos de un embrión de semilla producido a partir de la línea 470-12 como se describe en la presente. El éster metílico de 16:1\Delta9 en el extracto se identificó mediante la comparación del tiempo de retención con el de un patrón de 16:1\Delta9 (Matreya, Pleasant Gap, PA). Para un ensayo GC típico, el patrón de 16:1\Delta9 y el presunto 16:1\Delta9 procedente del extracto de embrión de semilla tenían ambos unos tiempos de retención de aproximadamente 4,3 min.

Una confirmación adicional de la producción de 16:1 implica la identificación del pico del presunto 16:1\Delta9 mediante una cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) e ionización de impacto de electrones utilizando una columna capilar DB-WAX (J&W Scientific, Folsom, CA) en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard (Wilmington, DE) 5890, serie II, equipado con un detector selectivo de masas Hewlett Packard 5972. Inicialmente, se estudió el patrón de 16:1\Delta9 para determinar el patrón de fragmentación espectral de masas. Este pico eluye a los 14,12 minutos y tiene un espectro de masas con el ion molecular a m/z 268 y los iones fragmentados a m/z 152, m/z 194 y m/z 236. Para determinar la posición de la insaturación se realizó una derivatización con sulfuro de dimetilo catalizada por yodo, siguiendo un método publicado (Yamamoto et al., 1991, Chemistry and Physics of Lipids, 60:39), con el patrón de 16:1\Delta9 durante 1 h a 35ºC. Tras la adición de hexano/éter y Na_{2}S_{2}O_{3} acuoso, los productos de la reacción se analizaron directamente mediante GC-MS. El derivado resultante eluyó a los 32,46 minutos. El espectro de masas de este patrón derivatizado tenía un ion molecular presente a m/z 362 y los iones fragmentados principales aparecían a m/z 145 y m/z 217. Este patrón de ruptura entre los carbonos sustituidos con metiltio se empleó para determinar que la posición del doble enlace estaba entre la posición C9 y C10 con relación a la porción ácida de la molécula en el patrón 16:1\Delta9.

El extracto procedente del embrión de semilla 470-12 se analizó mediante GC-MS. Esta muestra contenía el pico del presunto 16:1\Delta9 a aproximadamente 14,11 min con un patrón de fragmentación coherente con el patrón de éster metílico de 16:1\Delta9 (ion molecular a m/z 268 y iones fragmentados a m/z 152, m/z 194 y m/z 236). Después de la derivatización de esta muestra como se describe en la presente, el pico se desplazó desde aproximadamente 14,11 min a aproximadamente 32,43 min. El espectro de masas producido a partir del pico a aproximadamente 32,43 min resultó coherente con el patrón derivatizado (ion molecular presente a m/z 362 y los iones fragmentados principales aparecían a m/z 145 y m/z 217). Estos resultados indican que el presunto éster metílico de 16:1\Delta9 en la muestra de 470-12 es, en efecto, 16:1\Delta9, y que la proteína codificada por el gen descrito en la presente es verdaderamente una palmitoil-CoA A-9 desaturasa.

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Ejemplo 9 Diseño de un gen que codifica la delta-9 desaturasa de Aspergillus para un alto nivel de expresión en el maíz

Se sintetizó químicamente una nueva secuencia de ADN de tal forma que la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la nueva secuencia de ADN es sustancialmente la misma, o idéntica, a la secuencia de aminoácidos de la palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus, como se muestra en SEQ ID NO:6. Tal como se describe en la presente, se realizan sustituciones para los nucleótidos de la secuencia génica nativa de tal manera que se conserva la identidad del aminoácido codificado. Sin embargo, se realizan alteraciones en la composición de codones de la nueva secuencia de ADN, de forma que la composición global de codones de la nueva secuencia de ADN se parece mucho a la composición global de codones que se encuentra en los genes del maíz que codifican proteínas. Además, la elección de dichos codones utilizados para sustituir a los codones nativos es, preferiblemente, el codón más abundantemente utilizado en el maíz, pero también pueden elegirse codones menos preferidos en el maíz para conseguir atributos deseables como aumentar el número de dobles de bases TG y CT, para disminuir el número de dobletes de CG y TA, para eliminar sitios de ruptura de intrones, para eliminar secuencias señal de poliadenilación, para añadir o eliminar secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción, o para añadir o eliminar otras secuencias que puedan potenciar o disminuir, respectivamente, el nivel global de expresión del gen, como entienden los expertos en la técnica. Un ejemplo de un gen rediseñado adecuado para conseguir un alto nivel de expresión en plantas de maíz se describe en la presente como SEQ ID NO:12. Excepto por la adición de un nuevo resto alanina codificado por el segundo codón, la proteína codificada de SEQ ID NO:12 es idéntica a la proteína codificada por el gen nativo de la delta-9 desaturasa de Aspergillus como se describe en la presente. Como puede observarse tras el examen de la tabla 10, el gen nativo de la delta-9 desaturasa de Aspergillus tiene una composición de codones sustancialmente diferente de la empleada por el maíz, en particular para los codones de arginina CGT y AGG, el codón de serina AGC, y el codón de glutamina CAA. Como se indica también en la tabla 10, la región codificadora rediseñada descrita como SEQ ID NO:12 emplea una composición de codones que refleja la composición media de codones de los genes del maíz que codifican proteínas, excepto que se evitan los codones que se emplean menos de 10% del tiempo. El gen rediseñado tiene un contenido en restos G más C de 56,8%, que está dentro del intervalo de otros genes del maíz que codifican proteínas.

El gen creado como se describe en la presente y que tiene la SEQ ID NO:12 entonces puede clonarse en el vector apropiado para su expresión. Tal como se describe en la presente, el gen con el sesgo en los codones para el maíz (SEQ ID NO:12) puede clonarse en pBAD439 e insertarse en plantas de maíz, como se describe en la presente, para producir una planta en que el gen se expresa de manera constitutiva. Además, el gen también puede clonarse 3' al promotor de globulina, como se describe en la presente para pDAB470, para producir plantas de maíz en que el gen delta-9 de Aspergillus con el sesgo en los codones para el maíz se expresa en embriones de semillas.

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TABLA 10 Tabla de utilización de codones de Aspergillus y sesgo para el maíz para crear un gen optimizado para el maíz que codifique la delta-9 desaturasa de Aspergillus

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14

15

16

17

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<110> Folkerts, Otto

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Merlo, Donald J.

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<120> Modificación de la composición de ácidos grasos en plantas mediante la expresión de una acil-CoA desaturasa fúngica

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<130> 50612

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<140>

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<141>

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<150> 60/079840

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<151> 30-03-1998

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<160> 12

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cayaayayyc aycaygartt ycc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 3'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttyttnarrt crtangc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(116)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1589

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aspergillus nidulans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(1368)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 455

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aspergillus nidulans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtacggcca tattggccac catggcacca acggcggaca tcagggct

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatcggcca gagaggcctc acgccgcatc cgctgtggga atggg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: porción de pGGN62-2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1547

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Phaseolus vulgaris

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10323

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: pDAB1542

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

29

31

32

33

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: gen rediseñado para la palmitoil-CoA desaturasa de Aspergillus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(1368)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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36

37

Claims (10)

1. Una planta transgénica que produce semillas para aceite, que produce semillas que contienen aceite que tiene, comparado con el tipo salvaje, un menor nivel de ácidos grasos saturados, en la que dicha planta expresa un transgén que codifica una \Delta-9 CoA desaturasa de Aspergillus que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

2. Una planta según la reivindicación 1, en la que dicho transgén contiene una construcción de ácido nucleico que comprende, en la dirección 5' a 3': un elemento regulador promotor, un fragmento de ácido nucleico que codifica una palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, y una secuencia de fin de la transcripción, en la que dicho elemento regulador promotor o dicha secuencia de fin de la transcripción no están asociados en la naturaleza con dicho fragmento de ácido nucleico.

3. Una planta según la reivindicación 2, en la que dicho fragmento de ácido nucleico que codifica una palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:12.

4. Una planta según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en soja, Brassicaceae sp., canola, colza, girasol, lino, cártamo, coco, palma, oliva, cacahuete, algodón, ricino, cilantro, Crambe sp., Cuphea sp., Euphorbia sp., Oenothera sp., yoyoba, Lesquerella sp., margarita, Limnanthes sp., Vernonia sp., Sinapis alba, cacao, tabaco y maíz.

5. Una célula vegetal procedente de una planta según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que dicha célula expresa dicho transgén que codifica una \Delta-9 CoA desaturasa de Aspergillus que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

6. Una célula vegetal según la reivindicación 5, en la que dicha célula es una célula de embrión de semilla.

7. Un método para producir un aceite vegetal que tiene niveles alterados de ácidos grasos, que comprende: hacer crecer una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, obtener a partir de ella semillas que contienen aceite, y extraer dicho aceite.

8. Una semilla transgénica y su progenie producida a partir de una planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que expresa dicho transgén que codifica una \Delta-9 CoA desaturasa de Aspergillus que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

9. Una construcción de ADN que comprende, en la dirección 5' a 3': un elemento regulador promotor específico de tejido de semilla, un fragmento de ácido nucleico que codifica una palmitoil-CoA \Delta-9 desaturasa de Aspergillus que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, y una secuencia de fin de la transcripción, en la que dicho elemento regulador promotor o dicha secuencia de fin de la transcripción no están asociados en la naturaleza con dicho fragmento de ácido nucleico.

10. La construcción de la reivindicación 9, en la que dicho fragmento de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:12.