CN100412197C

CN100412197C - 生产多不饱和脂肪酸的方法

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Publication number: CN100412197C
Application number: CNB200380106787XA
Authority: CN
Inventors: J·A·内皮尔; O·萨亚诺娃; C·M·拉扎勒斯; B·齐; E·海因茨; T·灿克; U·策林格
Original assignee: University of Bristol
Current assignee: University of Bristol
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2008-08-20
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: GB0229578D0; CN1729293A

Abstract

本发明涉及特异生产多不饱和ω-3和ω-6脂肪酸的改进方法；和生产不饱和脂肪酸含量增加的甘油三酯的方法，其中所述不饱和脂肪酸尤其是至少具有两个双键和20或22个碳原子链长度的ω-3和ω-6脂肪酸。本发明涉及制备转基因生物，优选转基因植物或转基因微生物，其中包含具有Δ-5、7、8、10双键的C20-或C22-脂肪酸在内的脂肪酸、油或脂质含量增加，这种增加分别可归因于来自诸如植物等生物的Δ-8-去饱和酶和Δ-9-延长酶的表达，所述植物优选藻类如绿光等鞭金藻或细小裸藻。此外，本发明还涉及通过诸如微生物或植物等生物中Δ-8-去饱和酶和Δ-9-延长酶和Δ-5-去饱和酶的共表达产生诸如二十碳五烯酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸等多不饱和脂肪酸的方法。本发明另外还涉及编码具有Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶或Δ-5-去饱和酶活性的前述蛋白质的特定核酸序列、含所述核酸序列的核酸构建体、载体和生物体的用途。本发明另外还涉及不饱和脂肪酸和按重量计具有至少1%的增加含量的不饱和脂肪酸的甘油三酯及其用途。

Description

生产多不饱和脂肪酸的方法

发明领域

本发明涉及特异生产多不饱和ω-3和ω-6脂肪酸的改进方法；和生产不饱和脂肪酸含量增加的甘油三酯的方法，其中所述不饱和脂肪酸尤其是具有至少两个双键和20或22个碳原子链长度的ω-3和ω-6脂肪酸。本发明涉及转基因生物的产生，优选转基因植物或转基因微生物，其中包含分别具有Δ-5、7、8、10双键的C₂₀-或C₂₂-脂肪酸在内的脂肪酸、油或脂质的含量增加，这种增加可归因于来自诸如植物等生物的Δ8-去饱和酶和Δ9-延长酶(elongase)的表达，所述植物优选藻类如绿光等鞭金藻或细小裸藻。此外，本发明还涉及通过诸如微生物或植物等生物中Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和Δ-5-去饱和酶的共表达，产生诸如二十碳五烯酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸等多不饱和脂肪酸的方法。

本发明另外还涉及编码具有Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶或Δ-5-去饱和酶活性的前述蛋白质的特异核酸序列、含所述核酸序列的核酸构建体、载体和生物体的用途。本发明另外还涉及不饱和脂肪酸和具有至少1％重量的增加含量的不饱和脂肪酸的甘油三酯及其用途。

背景技术

脂肪酸和甘油三酯在食品工业、动物营养学、化妆品和药品业内具有广泛的用途。取决于它们是否是游离的饱和或不饱和脂肪酸或是具有含量增加的饱和或不饱和脂肪酸的甘油三酯，它们适用于多种用途；因此，例如，将多不饱和脂肪酸(＝PUFA)添加到婴儿制品中以提高其营养价值。各种脂肪酸和甘油三酯主要获自诸如被孢霉属等微生物或诸如大豆、油籽油菜、向日葵等产油植物，其中它们通常以三酰基甘油酯的形式获得。或者，它们可方便的获自诸如鱼等动物。通过水解方便的制备游离脂肪酸。是否优选具有不饱和脂肪酸或具有饱和脂肪酸的油取决于使用目的；因此，例如，在人类营养学中优选具有不饱和脂肪酸、尤其是多不饱和脂肪酸的脂质，因为它们对于血液中的胆固醇水平以及由此而来对患心脏病的可能性具有正面的影响。它们可用于各种营养食品或药物中。此外，PUFA通常用于食品、饲料和化妆品工业中。多不饱和ω-3-和/或ω-6-脂肪酸是动物饲料和人类食品中的一个重要成分。由于人类食品的共同组成，应将多不饱和ω-3-脂肪酸(它是鱼油的基本组分)加入食品中以提高食品的营养价值；因此，例如，如上所述将诸如二十二碳六烯酸(＝DHA，C_22:6 ^Δ4、7、 ^{10、13、16、19})或二十碳五烯酸(＝EPA，C_20:5 ^{Δ5、8、11、14、17})等多不饱和脂肪酸加入婴儿制品中以提高其营养价值。而DHA对婴儿脑的发育具有积极的影响。优选添加多不饱和ω-3脂肪酸，因为在普通食品中添加多不饱和ω-6脂肪酸如花生四烯酸(＝ARA，C_20:4 ^{Δ5、8、11、14})对诸如类风湿性关节炎等风湿类疾病具有不希望有的结果。多不饱和ω-3和ω-6脂肪酸是诸如前列腺素等被称为类花生酸的旁分泌激素家族的前体，它们是Dihomo-γ-亚油酸、ARA或EPA代谢的产物。在脂解作用的调节、炎性反应的起始、血循环和血压的调节以及身体的其它重要功能中都涉及类花生酸。类花生酸包括前列腺素、白细胞三烯、血栓烷和前列环素。ω-3脂肪酸似乎主要通过调节不同的类花生酸的水平来预防动脉硬化症(artherosclerosis)和心血管疾病。其它的类花生酸是血栓烷和白细胞三烯，它们是ARA或EPA代谢的产物。

大体上，诸如被孢霉属等微生物或诸如大豆、油籽油菜或向日葵等产油植物或诸如Crytocodinium或褐指藻属等藻类是含PUFA的油类的常见来源，其中它们通常以其三酰基甘油酯的形式获得。或者，它们可方便的获自诸如鱼之类动物。通过用诸如氢氧化钾或氢氧化钠等强碱水解可方便的制备游离的脂肪酸。诸如DHA、EPA、ARA、Dihomo-γ-亚油酸(C_20: ₃ ^{Δ8、11、14})或二十二碳五烯酸(＝DPA，C_22:5 ^{Δ7、10、13、16、19})等更高级的多不饱和脂肪酸不能由诸如大豆、油籽油菜、红花或向日葵等产油植物产生。所说脂肪酸的天然来源是例如青鱼、鲑鱼、沙丁鱼、红鱼、鳗鲡、鲤鱼、鳟鱼、大比目鱼、鲭鱼、梭鲈或金枪鱼等鱼类或藻类。

由于它们的有效特性，过去作了许多尝试来制备参与脂肪酸或甘油三酯合成的基因以便在各种生物体内产生具有改变含量的不饱和脂肪酸的油。因此，在WO 91/13972和其美国同族专利中描述了一种Δ-9-去饱和酶。在WO 93/11245中公布了Δ-15-去饱和酶，在WO 94/11516中公布了Δ-12-去饱和酶。WO 00/34439公布了Δ-5-和Δ-8-去饱和酶。其它的去饱和酶参阅，例如，EP-A-0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、WO95/18222、EP-A-0794250，Stukey等，J.Biol.Chem.，265，1990：20144-20149，Wada等，Nature347，1990：200-203或Huang等，Lipids34，1999：649-659。不过，迄今为止，只在生化上对各种去饱和酶进行了不充分的表征，因为对膜结合蛋白质形式的酶进行分离和表征具有很大的困难(McKeon等，酶学方法(Methods in Enzymol)71，1981：12141-12147，Wang等，Plant Physiol.Biochem.，26，1988：777-792)。通常，膜结合去饱和酶的表征是通过将其引入适当的生物体中，然后以分析起始材料和产物的方式研究其酶活性来完成的。Δ-6-去饱和酶参阅WO 93/06712、US5614393、US5614393、WO 96/21022、WO 0021557和WO 99/27111，而在转基因生物中它们在生产中的应用参阅，如，WO 9846763、WO9846764和WO 9846765。同时，各种脂肪酸生物合成基因的表达，如WO 9964616或WO 9846776中所述，以及多不饱和脂肪酸的形成也有描述和专利申请。至于去饱和酶的表达效率和它们对多不饱和脂肪酸形成的影响，可提及的是，通过迄今为止所描述的去饱和酶和延长酶的表达，只获得了低含量的多不饱和脂肪酸/脂质，诸如二十碳五烯酸或花生四烯酸。因此，需要有使产量增高的其它更有效的途径。

因此，非常需要有新的和更适当的基因，这些基因编码参与不饱和脂肪酸生物合成的酶并使得可以以特异于工业规模的方式生产某些脂肪酸且没有不想要的副产物形成。在选择基因用于生物合成时，以上两个特性尤其重要。另一方面，仍然需要有改进的方法用于获取最高可能含量的多不饱和脂肪酸。

因此，本发明的一个目的是提供用于在生物体中(优选在微生物和植物中)合成多不饱和脂肪酸的去饱和酶和延长酶的基因，以及在工业方法中将它们用于产生多不饱和脂肪酸。所说方法应尽可能高的提高生物体中，优选产油植物的种子中的PUFA含量。

发明内容

我们已发现通过用于在转基因生物中产生以下通式化合物的方法可以达到此目的，

其中，在该转基因生物中，按重量计，所述化合物的含量占所述生物体的总脂质含量的至少1％，

所述方法包括以下步骤：

a)将至少一种编码Δ-9-延长酶的核酸序列引入转基因生物体中，

b)引入至少一种编码Δ-8-去饱和酶的第二核酸序列，

c)如果有必要，引入至少一种编码Δ-5-去饱和酶的第三核酸序列，和

d)培养并收获所说的生物体，

其中式I中的变量和取代基具有以下含义：

R¹＝羟基-、辅酶A-(硫酯)、磷脂酰胆碱-、磷脂酰乙醇胺-、磷脂酰甘油-、二磷脂酰甘油-、磷脂酰丝氨酸-、磷脂酰肌醇-、鞘脂-、鞘糖脂-或通式II的基团：

其中式II中的取代基具有以下含义：

R²＝氢-、磷脂酰胆碱-、磷脂酰乙醇胺-、磷脂酰甘油-、二磷脂酰甘油-、磷脂酰丝氨酸-、磷脂酰肌醇-、鞘脂-、鞘糖脂-、鞘糖脂-或饱和或不饱和的C₂-C₂₄-烷基羰基-，

R³＝氢-、饱和或不饱和的C₂-C₂₄-烷基羰基-，或

R²和R³相互独立地是式Ia的基团：

n＝3、4或6，m ＝3、4或5且p＝0或3，优选n＝3，m＝4或5且p＝0或3。

R¹在式I中表示羟基-、乙酰辅酶A-、磷脂酰胆碱-、磷脂酰乙醇胺-、磷脂酰甘油-、二磷脂酰甘油-、磷脂酰丝氨酸-、磷脂酰肌醇-、鞘脂-、鞘糖脂-或通式II的基团

上述R¹基团通常以其酯或硫酯的形式与通式I的化合物偶联。

R²在通式II的结构中表示氢、磷脂酰胆碱-、磷脂酰乙醇胺-、磷脂酰甘油-、二磷脂酰甘油-、磷脂酰丝氨酸-、磷脂酰肌醇-、鞘脂-、鞘糖脂-、鞘糖脂-或饱和或不饱和的C₂-C₂₄-烷基羰基-基团。

可以被提及的烷基是被取代或未被取代的、饱和或不饱和的C₂-C₂₄-烷基羰基链，诸如乙基羰基-、正丙基羰基-、正丁基羰基-、正戊基羰基-、正己基羰基-、正庚基羰基-、正辛基羰基-、正壬基羰基-、正癸基羰基-、正十一烷基羰基-、正十二烷基羰基-、正十三烷基羰基-、正十四烷基羰基-、正十五烷基羰基-、正十六烷基羰基-、正十七烷基羰基-、正十八烷基羰基-、正十九烷基羰基-、正二十烷基羰基-、正二十二烷基羰基-或正二十四烷基羰基-，它们包含一个或多个双键。优选饱和或不饱和的C₁₀-C₂₂-烷基羰基基团，诸如正癸基羰基-、正十一烷基羰基-、正十二烷基羰基-、正十三烷基羰基-、正十四烷基羰基-、正十五烷基羰基-、正十六烷基羰基-、正十七烷基羰基-、正十八烷基羰基-、正十九烷基羰基-、正二十烷基羰基-、正二十二烷基羰基-、或正二十四烷基羰基-，它们包含一个或多个双键。尤其优选的是饱和或不饱和的C₁₀-C₂₂-烷基羰基基团，诸如C₁₀-烷基羰基-、C₁₁-烷基羰基-、C₁₂-烷基羰基-、C₁₃-烷基羰基-、C₁₄-烷基羰基-、C₁₆-烷基羰基-、C₁₈-烷基羰基-、C₂₀-烷基羰基-、C₂₂-烷基羰基-或C₂₄-烷基羰基基团，它们包含一个或多个双键。尤其优选饱和或不饱和的C₁₆-C₂₂-烷基羰基基团，诸如C₁₆-烷基羰基-、C₁₈-烷基羰基-、C₂₀-烷基羰基-或C₂₂-烷基羰基基团，它们包含一个或多个双键。所述基团包含尤其是两个、三个、四个或五个双键。尤其优选的是具有不超过五个双键的20或22个碳原子的基团，优选三个、四个或五个双键。所有基团均来自已提及的相应脂肪酸。

R³在通式II结构中表示氢、饱和或不饱和的C₂-C₂₄-烷基羰基。

被取代或未被取代的、饱和或不饱和的C₂-C₂₄-烷基羰基-基团是例如乙基羰基-、正丙基羰基-、正丁基羰基-、正戊基羰基-、正己基羰基-、正庚基羰基-、正辛基羰基-、正壬基羰基-、正癸基羰基-、正十一烷基羰基-、正十二烷基羰基-、正十三烷基羰基-、正十四烷基羰基-、正十五烷基羰基-、正十六烷基羰基-、正十七烷基羰基-、正十八烷基羰基-、正十九烷基羰基-、正二十烷基羰基-、正二十二烷基羰基-、或正二十四烷基羰基-，它们包含一个或多个双键。优选饱和或不饱和的C₁₀-C₂₄-烷基羰基基团，诸如正癸基羰基-、正十一烷基羰基-、正十二烷基羰基-、正十三烷基羰基-、正十四烷基羰基-、正十五烷基羰基-、正十六烷基羰基-、正十七烷基羰基-、正十八烷基羰基-、正十九烷基羰基-、正二十烷基羰基-、正二十二烷基羰基-、或正二十四烷基羰基-，它们包含一个或多个双键。尤其是饱和或不饱和的C₁₀-C₂₄-烷基羰基基团，诸如C₁₀-烷基羰基-、C₁₁-烷基羰基-、C₁₂-烷基羰基-、C₁₃-烷基羰基-、C₁₄-烷基羰基-、C₁₆-烷基羰基-、C₁₈-烷基羰基-、C₂₀-烷基羰基-、C₂₂-烷基羰基-或C₂₄-烷基羰基基团，它们包含一个或多个双键。尤其优选的是饱和或不饱和的_C16-C₂₂-烷基羰基基团，诸如C₁₆-烷基羰基-、C₁₈-烷基羰基-、C₂₀-烷基羰基-或C₂₂-烷基羰基基团，它们具有多个双键。特别优选包含一个、两个、三个或四个双键的C₁₈-烷基羰基基团和含有三个、四个或五个双键的C₂₀-烷基羰基基团。所有基团均来自相应的脂肪酸。

R²和R³在通式II结构中相互独立地表示通式Ia的基团：

而式I和Ia中的变量设定为：n＝3、4或6，m＝3、4或5和p＝0或3。尤其是n＝3，m＝4或5和p＝0或3。

上述基团R¹、R²和R³可用羟基-或环氧基团取代或可以还包含三键。

依照本发明，所用的核酸序列是编码具有C₂₀-Δ5-或Δ-8去饱和酶或C₁₈-Δ9-延长酶活性的多肽的分离核酸序列。

依照本发明合成的含有式II基团作为R¹基团的式I物质优选包含不同的R²或R³基团的混合物。这些基团来自不同的脂肪酸分子——具有4-6个C原子的短链脂肪酸、具有8-12个C原子的中链脂肪酸和具有14-24个C原子的长链脂肪酸，而长链脂肪酸是优选的。所说的长链脂肪酸优选来自有利的含有2-5个双键的C₁₈-或C₂₀-多不饱和脂肪酸。此外，式I的主链也来自前述脂肪酸，其有利地不同于R²和R³。这意味着由本发明方法产生的化合物在本发明的一个方面是具有不同的取代或未取代的、饱和或不饱和的脂肪酸酯或硫酯的甘油三酯。

依照本发明的另一方面，尤其优选具有18、20或22个脂肪酸碳原子链长以及至少两个双键、优选3、4或5个双键的多不饱和脂肪酸酯(式I)。

尤其是，对于本发明方法中二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸(花生四烯酸)和二十碳五烯酸(C20：2n-6，Δ11，14；C20：3n-6，Δ8，11，14；C20：4n-6，Δ5，8，11，14；C20：3n-3，Δ11，14，17；C20：4n-3，Δ8，11，14，17；C20：5n-3，Δ5，8，11，14，17)的合成，优选具有3、4或5个双键的脂肪酸分子，而花生四烯酸和二十碳五烯酸是最优选的。我们已发现，通过组合表达依照本发明编码具有以下活性的多肽的三种分离核酸序列可以很方便的达到此目的：具有C20-Δ-8-去饱和酶活性、C18-Δ-9-延长酶活性和C20-Δ-5去饱和酶活性的多肽。此目的尤其通过依照本发明的分离核酸序列的共表达而达到。在Δ-9-位置具有双键的C18脂肪酸通过方便的用于本发明方法的Δ-9-延长酶进行延伸。通过本方法中所用的Δ-8-去饱和酶，Δ-8位置的双键被引入C20脂肪酸中。此外，可用Δ-5-去饱和酶在Δ-5位置将双键引入脂肪酸分子中。

本发明方法中合成的C₁₈-、C₂₀-和/或C₂₂-多不饱和脂肪酸的脂肪酸酯(有利地以酯或硫酯的形式在甘油三酯中)，可以以如下形式自微生物或植物等生产生物体分离，所述形式为油、脂质或脂质混合物的形式，例如作为鞘脂，磷酸甘油酯，脂质，糖脂诸如鞘糖脂，磷脂诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油，或作为单酰基甘油酯、二酰基甘油酯或三酰基甘油酯或作为诸如乙酰辅酶A硫酯等其它脂肪酸酯，它们包含饱和或不饱和脂肪酸，优选在脂肪酸分子中具有至少两个，优选至少三个双键的多不饱和脂肪酸。除了以上述酯形式结合的脂肪酸之外，结合于其它化合物中的脂肪酸或游离的脂肪酸也可用本发明方法产生。

通常，用于本发明方法中的转基因生物例如转基因微生物或植物包含脂肪酸酯或脂肪酸，其分配按重量计大约为三酰基甘油酯80-90％、二酰基甘油酯2-5％、单酰基甘油酯5-10％、游离脂肪酸1-5％和磷脂2-8％，其中前述化合物全部加在一起的总量是100％重量。

在本发明方法[单数应包括复数，反之亦然]中，参照本方法中所用生物体的总脂质含量，产生按重量计至少为1％，优选至少为2、3、4或5％，更优选至少为6、7、8或9％，最优选10、20或30％的式I化合物。用于本发明方法的优选原材料是亚油酸(C18:2)和/或亚麻酸(C18:3)，它们可转变成优选的终产物ARA或EPA。由于本发明方法使用生物体来实施，故该方法的产物本身不是一种纯物质。它是不同式I物质的混合物，其中一种或多种化合物是主要产物，而其它的只作为副产物包含在内。当本方法所用生物体中亚油酸和亚麻酸是可获得的时，终产物是ARA和EPA的混合物。有利地，副产物按重量计应不超过生物体的总脂质含量的20％，优选副产物不超过15％重量，更优选不超过10％重量，最优选不超过5％重量。本方法中优选使用含有作为原材料的亚油酸或亚麻酸的生物体，从而作为本方法终产物只产生ARA或EPA。当EPA和ARA一起产生，它们产生的比例应至少为1∶2(EPA∶ARA)，优选至少为1∶3，更优选至少为1∶4，最优选至少为1∶5。当诸如ARA和EPA等不同脂肪酸的混合物是本发明方法的产物时，所说的脂肪酸可用本领域技术人员已知的方法进行进一步的纯化，诸如蒸馏、抽提、低温结晶、层析或所述方法的组合。

方便地本发明方法包括以下步骤：

a)在植物中表达至少一种编码具有Δ-9延长酶活性的酶的核酸序列，

b)表达至少一种编码C20-特异性Δ-8去饱和酶的核酸序列，

c)任选地表达编码C20-特异性Δ-5去饱和酶的第三核酸序列，

d)随后培养转基因植物并收获种子。

原则上，所有的宿主生物都可用于本发明方法中，例如转基因生物体，如植物，如藓类；绿、红、褐或蓝藻；单子叶植物或双子叶植物。有利的是在本文所述的本发明方法中利用诸如真菌、细菌、藻类、藓类或植物等产油转基因生物(对于本发明而言，单数应包括复数，反之亦然)。另外的有利生物体是动物或优选地植物或其部分。真菌、酵母或植物优选使用，尤其优选真菌或植物，特别尤其优选植物，如含高含量的脂质化合物的油籽植物，诸如油籽油菜、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、胡麻、橄榄、金盏花、punica、榛子、杏、澳洲坚果、鳄梨、南瓜、胡桃、月桂、阿月浑子果实、报春花、canola、花生、亚麻籽、大豆、红花、向日葵、琉璃苣，或诸如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、棉花、木薯、胡椒、万寿菊等植物，诸如马铃薯、烟草、茄子和西红柿等茄科植物，蚕豆属种、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属植物、树(油椰、椰子)和多年生草和饲料作物。本发明尤其优选的植物是油籽植物，油菜籽、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、胡麻、橄榄、金盏花、punica、榛子、杏、澳洲坚果、鳄梨、南瓜、月桂、阿月浑子、报春花、canola、花生、亚麻子、大豆、红花、向日葵、琉璃苣或树(油椰、椰子)。最优选的是C_18:2-和/或C_18:3-脂肪酸丰富的植物，诸如大麻、胡麻、亚麻子、罂粟、南瓜、胡桃、烟草、棉花、红花或向日葵。

取决于本发明方法中所用的核酸和/或生物体，可以合成不同的通式I化合物。此外，取决于本方法中所用的植物或真菌，可以产生游离或结合形式的式I化合物的不同混合物或诸如花生四烯酸或二十碳五烯酸等单一的化合物。当本发明方法中所用的生物体含有优选地C_18:2-或C_18:3-脂肪酸作为脂肪酸合成前体时，可以合成不同的多不饱和脂肪酸，例如，从C_18: ₂-脂肪酸γ-亚油酸开始，可以产生dihomo-γ-亚油酸或花生四烯酸，或者从C_18:3-脂肪酸十八碳四烯酸(stearidonic acid)开始，可以产生二十碳四烯酸或二十碳五烯酸。通过影响不同的基因或其基因产物的活性，可以产生不同的单一化合物或化合物混合物。当在本发明方法中利用活的生物体时，原料意指分离自该生物体的粗脂质和/或粗油，其优选在产物中包含至少一些起始化合物，诸如C_18:2-或C_18:3-脂肪酸或它们的组合，以及取决于核酸序列及其基因产物的活性，生物合成链的脂肪酸中间体。所说的起始化合物或中间体在产物中的浓度低于分离自所用生物体的总脂肪酸重量的20％或15％，优选低于10、9、8、7或6％，更优选低于5、4、3、2或1％。

转基因植物应理解为指单个植物细胞和它们在固体培养基或液体培养基上的培养物、植物的部分和整株植物，诸如植物细胞培养物、来自植物的原生质体，愈伤组织培养物或植物组织，诸如叶、茎、种子、花、根等。所说的转基因植物可以培养于例如固体或液体培养基上，或进行土壤培养或水培。

经培养后，可将本发明方法中所用的转基因生物体优选转基因植物出售而无需分离通式I的化合物。优选的，通式I的化合物以其游离脂肪酸、脂质或油的形式自所说生物体分离。用常规方法可以完成纯化，诸如植物的挤压和抽提，或者取代抽提的其它方法，诸如蒸馏、低温结晶、层析或所说方法的组合。方便的方法是在挤压和抽提步骤前将植物研碎、加热和/或蒸发。利用己烷等溶剂作为抽提的溶剂。通过用例如磷酸酸化对分离的油进行进一步的纯化。游离脂肪酸通过水解作用而产生自所说的油或脂质。用活性炭或硅藻土去除液体中的染料。在本发明方法的另一优选实施方案中，脂肪酸的烷基酯通过常规化学或酶学的转酯作用产生自油和脂质。优选的方法是在诸如甲醇化物或乙醇化物等相应低级醇(C1至C10醇，诸如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、己醇等)的醇化物存在条件下生产烷基酯。因此，如本领域技术人员已知的，在催化量的碱(诸如NaOH或KOH)存在的条件下将醇加入油或脂质中。

在本发明方法的优选形式中，在培养生物体后，可以以常见方式获取脂质。为此目的，可以先收获生物体然后将其破碎，或者它们可直接使用。方便地利用合适的溶剂提取脂质，诸如非极性溶剂，例如己烷，或者极性溶剂，例如乙醇、异丙醇，或混合物，诸如己烷/异丙醇、酚/氯仿/异戊醇、温度在0℃-80℃之间，优选在20℃-50℃之间。通常，用过量的溶剂提取生物质，例如1∶4的过量的溶剂：生物质比率。溶剂随后通过例如蒸馏等方法去除。也可用超临界的CO₂进行提取。提取后，残余的生物质可通过例如过滤等方式去除。从植物和微生物提取脂肪酸的标准方法参阅Bligh等(Can.J.Biochem.Physiol.37，1959：911-917)或Vick等人(Plant Physiol.69，1982：1103-1108)的文献。

由此获得的粗油可然后通过例如添加丙酮等极性溶剂或氯仿等非极性溶剂去混浊并随后过滤或离心而被进一步纯化。通过柱子或其它技术进行进一步的纯化也是有可能的。

为了从甘油三酯中获取游离的脂肪酸，可以用常规方式水解甘油三酯，例如用NaOH或KOH。

在本发明方法中产生了油、脂质和/或游离的脂肪酸或它们的级分。所说的产物可用于生产饲料和食品、化妆品或药物。

原则上，编码具有Δ-8去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶活性的多肽的所有核酸都可用于本发明方法中。优选核酸序列可分离自例如微生物或植物，诸如真菌，象被孢霉属、藻类象裸藻属、隐甲藻属或等鞭金藻属、硅藻象褐指藻属或藓类象剑叶藓属或角齿藓属，而且诸如Caenorhabditis等非人动物也可作为核酸序列的来源。有利的是依照本发明编码具有Δ-8去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶活性的多肽的核酸序列来源于微生物或植物，尤其有利的是来自三角褐指藻、角齿藓、展叶剑叶藓、细小裸藻或绿光等鞭金藻。细小裸藻或绿光等鞭金藻特别用于ω-3-或ω-6脂肪酸的转化。因此，Δ-9延长酶和C20特异的Δ-8去饱和酶的共表达导致了二十碳三烯酸(C20：6n-3，Δ8、11、14)和二十碳四烯酸(C20：3n-4，Δ8、11、14、17)的形成。编码C20-Δ5特异性去饱和酶的第三基因的共表达导致了花生四烯酸(C20：6n-4，Δ5、8、11、14)或二十碳五烯酸(C20：3n-5，Δ5、8、11、14、17)的产生。

本发明序列的衍生物意指，例如，展示了相同的所说特异性酶活性的、由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：10编码的多肽或酶的功能同系物(homologues)。此特异性酶活性有利地使得脂肪酸分子中具有三个以上双键的不饱和脂肪酸可以合成。不饱和脂肪酸在下文中意指其中拥有双键的双不饱和或多不饱和脂肪酸。双键可以是共轭或非共轭的。所说序列编码展示Δ-9延长酶、Δ-8-去饱和酶或Δ-5-去饱和酶活性的酶。

依照本发明的酶，即Δ-9延长酶、Δ-8-去饱和酶或Δ-5-去饱和酶，方便的或者延长具18个碳原子的脂肪酸链(参见SEQ ID NO：2)或在C₈-C₉位置(参见SEQ ID NO：4)或C₅-C₆位置(参见SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10)将双键引入甘油脂质、游离脂肪酸或酰基辅酶A脂肪酸的脂肪酸基团中。

依照本发明的核酸序列(为了应用的目的，单数包括复数，反之亦然)或其片段可方便的用于通过同源筛选分离其它的基因组序列。

所说的衍生物可分离自，例如，其它的生物，诸如植物等真核生物，尤其是藓类、藻类、腰鞭毛虫或真菌，优选藻类和藓类。

等位基因变体尤其包括可通过在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示序列中缺失、插入或替代核苷酸获得的、保留了衍生的合成蛋白质的酶促活性的功能变体。

这些DNA序列可起始于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中所述DNA序列或所说序列的片段，用例如正常的杂交方法或PCR技术分离自其它真核生物，诸如上文的那些生物。在标准条件下将这些DNA序列与所说序列杂交。为了进行杂交，优选利用平均长度约15-70bp，优选约17-60bp，更优选约19-50bp，最优选约20-40bp的保守区的短寡核苷酸，可通过以本领域技术人员已知的方式与其它去饱和酶或延长酶比较而确定保守区。优选应用组氨酸盒序列。不过，本发明核酸的较长片段或完整序列也可用于杂交。取决于所应用的核酸：寡核苷酸、较长片段或完整序列，或取决于核酸的类型(DNA或RNA)，用于杂交的标准条件有所变化。因此，例如，DNA∶DNA杂交分子的解链温度比同样长度的DNA∶RNA杂交分子的解链温度低大约10℃。

标准条件是指，例如，取决于所述核酸，温度为42℃至58℃，在浓度介于0.1和5x SSC(1x SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2)之间的缓冲水溶液中，或另外地还存在50％甲酰胺，例如在42℃下5x SSC和50％甲酰胺中。DNA∶DNA杂交分子的杂交条件优选为0.1x SSC，温度在大约20℃和45℃之间，优选在约30℃和45℃之间。对于DNA∶RNA杂交分子而言，杂交条件优选0.1x SSC，和温度在大约30℃至55℃，优选在大约45℃至55℃。这些用于杂交的温度是以无甲酰胺条件下长度约为100个核苷酸且G+C含量为50％的核酸为例计算的解链温度值。DNA杂交的实验条件参阅相关的遗传学书籍，诸如Sambrook等，“分子克隆”，冷泉港实验室，1989，并可用本领域技术人员已知的公式计算，例如按核酸长度、杂交分子的特性或G+C含量的函数进行计算。本领域技术人员可通过以下书籍获取有关杂交的更多信息：Ausubel等(编辑)，1985，分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons，纽约；Hames和Higgins(编辑)，1985，核酸杂交：实用方法(Nucleic AcidsHybridization：A Pratical Approach)，牛津大学出版社的IRL Press，牛津；Brown(编辑)，1991，基础分子生物学：实用手册(Essential MolecularBiology：A Practical Approach)，牛津大学出版社的IRL Press，牛津。

此外，衍生物指序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的同系物(homologues)，例如真核同系物、截短的序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或编码和非编码DNA序列的RNA。

此外，序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：9的同系物还指诸如启动子变体等衍生物。这些变体可通过不对启动子的功能性或效力产生不良影响的一个或多个核苷酸的交换、插入和/或缺失进行修饰。此外，启动子还可通过改变自身序列来提高其效力或甚至被外源生物的更有效启动子完全替代。

衍生物还优选指其核苷酸序列在起始密码子前-1至-2000的区域内已改变的变体，以此方式，基因表达和/或蛋白质表达被改变，优选表达增加。此外，衍生物还指在3，末端已修饰的变体。

依照本发明编码Δ-8-去饱和酶、Δ-5-去饱和酶和/或Δ-9延长酶的核酸序列可通过合成产生或来自天然来源或包含合成的和天然的DNA组分的混合物以及由来自不同生物的多个异源Δ-8-去饱和酶、Δ-5-去饱和酶和/或Δ-9延长酶基因片段组成。一般而言，合成的核苷酸序列使用例如植物等相应宿主生物的优选密码子产生。这通常引起异源基因的最佳表达。为植物所优选的这些密码子可以从表达于大多数植物物种中且具有最高蛋白质频率的密码子来确定。关于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的例子参见文献Wada等(1992)Nucleic AcidsRes.20：2111-2118。这样的实验可用标准方法进行且对于本领域技术人员而言是已知的。

编码Δ-8-去饱和酶、Δ-5-去饱和酶和/或Δ-9延长酶基因的功能等价序列是依照本发明的序列的衍生物，尽管其核苷酸序列不同但仍然具有期望的功能，即所述蛋白质的酶促活性和特异选择性。因此，功能等价物包括本文所述序列的天然变体以及人工合成变体，如，通过化学合成获得的适应于植物密码子使用的人工核苷酸序列。

此外，人工合成的DNA序列是适宜的，只要，如上所述，它们可以介导期望的特性即可，例如，可以通过在优选地农作物中过表达Δ-8和/或Δ-5去饱和酶基因提高生物体诸如植物中脂肪酸、油或脂质的Δ-8和/或Δ5-双键的含量。这样的人工DNA序列可例如通过对分子模建方式构建的蛋白质进行反翻译而表现出Δ-8和/或Δ-5去饱和酶和/或Δ-9-延长酶活性，或者可以通过体外筛选而鉴定。可能用于DNA体外进化以修饰或改进DNA序列的技术参阅Patten，P.A.等Current Opinion in Biotechnology 8，724-733(1997)或Moore，J.C.等，Journal of Molecular Biology 272，336-347(1997)。尤其合适的是依据宿主植物特异密码子使用通过多肽序列的反翻译而获得的DNA编码序列。熟悉植物遗传学方法的本领域技术人员可通过对待转化植物的其它已知基因的计算机分析很容易的确定特异密码子使用。

可以被提及的其它合适的等价核酸序列是编码融合蛋白质的序列，融合蛋白的一个组分是Δ-8-和/或Δ-5-去饱和酶多肽和/或Δ-9延长酶多肽或其功能等价部分。融合蛋白的第二部分可以是，例如，具有酶活性的另一多肽或抗原多肽序列，由此方式可以证实Δ-8-和/或Δ-5-去饱和酶或Δ-9-延长酶的表达(如myc标签或his标签)。不过，优选的，这是指导Δ-8-和/或Δ-5-去饱和酶蛋白和或Δ-9-延长酶蛋白定向于期望的作用位点的调节性蛋白质序列，如内质网(＝ER)信号序列，或者这是影响本发明核酸序列表达的调节序列，诸如启动子或终止子。在另一优选的实施方案中，融合蛋白的第二部分是Napier J.A.[定向于叶绿体的外源蛋白质(Targetingof foreign proteins to the chloroplast)，Methods Mol.Biol.，49，1995：369-376]所述的质体靶向序列。含所述质体靶向序列的优选使用的载体如ColinLazarus所述[Guerineau F.，Woolston S.，Brooks L.，Mullineaux P.将外源蛋白质定向于叶绿体的表达盒(An expression cassette for targetingforeign proteins into chloroplast)；Nucleic.Acids Res.，Dec 9，16(23)，1988：11380]。

有利的，在依照本发明的方法中Δ-8-去饱和酶和Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因可与用于脂肪酸的生物合成的其它基因组合。所述基因的例子是酰基转移酶、其它的去饱和酶或延长酶诸如Δ-4-、Δ-5-或Δ-6-去饱和酶或ω-3-和/或ω-6-特异性去饱和酶诸如Δ-12(针对C₁₈脂肪酸)、Δ-15(针对C₁₈脂肪酸)或Δ-19(针对C₂₂脂肪酸)和/或诸如Δ-5-或Δ-6-延长酶。为了进行体内和尤其是体外合成，有利的是与例如可吸收或释放还原当量的NADH细胞色素B5还原酶组合使用。

依照本发明的氨基酸序列指含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的蛋白质或含有可以通过一个或多个氨基酸基团的替代、倒位、插入或缺失而获自上述序列的序列(这样的序列是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的衍生物)的蛋白质，其中后一蛋白质中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10中所述蛋白质的酶活性仍被保留或基本上未降低，即其仍然保持了相同的酶特异性。所谓的“基本上未降低”或“相同的酶活性”是指所有这样的酶，该酶仍至少呈现获自野生型来源生物的起始酶之酶活的10％，优选20％，特别优选30％，其中所述来源生物为诸如下述属的生物：剑叶藓属(Physcomitrella)、角齿藓属(Ceratodon)、琉璃苣属(Borago)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、Schizochytrium、疫霉属(Phytophtora)、被孢霉属(Mortierella)、Caenorhabditis、Aleuritia、Muscariodides、等鞭金藻属(Isochrysis)、褐指藻属(Phaeodactylum)、隐甲藻属(Crypthecodinium)或裸藻属(Euglenia)。优选的来源生物是诸如以下物种的生物：细小裸藻(Euglenia gracilis)、绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、致病疫霉(Phytophtora infestans)、角齿藓(Ceratodon purpureus)、绿光等鞭金藻、Aleuritia farinosa、Muscariodides vialii、高山被孢霉(Mortierella alpina)、琉璃苣(Borago officinalis)或展叶剑叶藓(Physco-mitrella patens)。为了估计“基本上未降低”或具有“相同酶活性”的酶活性，测定衍生序列的酶活性并与野生型酶活性进行比较。为此，例如，某些氨基酸可被其它具有相似理化特性(空间填充、碱性、疏水性等)的氨基酸替代。例如，精氨酸残基与赖氨酸残基交换、缬氨酸残基与异亮氨酸残基交换或者天冬氨酸残基与谷氨酸残基交换。不过，一个或多个氨基酸也可以被交换顺序、添加或去除，或者数种这些方法可以相互组合。

衍生物也指特别还含有天然或人为突变的最初分离的Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶编码序列的功能等价物，该功能等价物继续呈现期望的功能，即它们的酶活性和底物选择性基本上未降低。突变包括替代、添加、缺失、交换或插入一个或多个核苷酸残基。因此，例如，本发明还包括通过修饰本发明方法中所用的Δ-8-去饱和酶核苷酸序列、Δ-5-去饱和酶核苷酸序列和/或Δ-9-延长酶核苷酸序列获得的那些核苷酸序列。所述修饰的目的可能是，例如，进一步限定其中所含的编码序列的边界或以及，如，插入其它的限制性酶接口。

功能等价物也包括其功能如上所述与起始基因或基因片段比较而言减弱(＝基本上未降低)或得以加强(＝酶活性高于起始酶的活性，即活性高于100％，优选高于110％，尤其优选高于130％)的那些变体。

同时，核酸序列可，例如，有利地为DNA或cDNA序列。插入本发明表达盒的适宜编码序列包括例如编码具有上述序列的Δ-8-去饱和酶、Δ-5-去饱和酶和/或Δ-9-延长酶且赋予宿主过量生产Δ-8位置和Δ-5位置有双键的脂肪酸、油或脂质的能力的那些序列，优选同时产生具有至少4个双键的脂肪酸。这些序列可以是同源或异源的。

依照本发明的表达盒(＝核酸构建体或片段或基因构建体)指来自遗传密码的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：9中所示的序列和/或其衍生物与一个或多个调节信号功能性连接，以有利地提高基因表达以及调节宿主细胞中编码序列的表达。这些调节序列使基因和蛋白质的表达可以具有选择性。取决于宿主生物体，这可以意味着，例如，基因只在诱导后表达和/或过表达或它们立即表达和/或过表达。这些调节序列的例子是与诱导物或阻遏物结合并以此方式调节核酸表达的序列。除了这些新的调节序列外或代替这些序列，真正结构基因之前的天然调节可以仍然存在并可以任选地被遗传修饰以便关闭天然调节以使基因表达增加。不过，也可更简单地建立基因构建体，即在所述核酸序列或其衍生物之前不插入另外的调节信号且不去除天然启动子及其调节作用。代替此，可以突变天然调节序列从而使调节不再发生和/或基因表达增加。这些已修饰的启动子还可以以部分序列的形式(＝含有本发明核酸序列的部分的启动子)放在天然基因之前以提高活性。此外，基因构建体可以有利地还包含与启动子功能性连接的一个或多个所谓的增强子序列以增强核酸序列的表达。在DNA序列的3’端还可插入另外的有利序列，诸如其它调节元件或终止子。Δ-8和/或Δ-5去饱和酶基因和/或Δ-9延长酶基因可以以一个或多个拷贝存在于表达盒(＝基因构建体)中。

如上所述，调节序列或因子可优选地正面影响并因而提高被引入基因的基因表达。因此，通过使用诸如启动子和/或增强子等强转录信号可以方便的在转录水平上实现调节元件的增强作用。不过，例如，另外也可以通过提高mRNA的稳定性来增强翻译。

原则上，表达盒中适宜的启动子是能调节生物体中外源基因表达的所有启动子，所述生物体为：微生物诸如纤毛虫等原生动物，诸如裸藻之类的绿藻、褐藻、红藻或蓝藻等藻类，诸如革兰氏阳性或革兰氏阴性菌等细菌，诸如酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属等酵母或诸如被孢霉、破囊壶菌或Schizochytrium等真菌或诸如Aleuritia等植物，优选植物或真菌。特别优选使用植物启动子或来自植物病毒的启动子。用于依照本发明的方法中的优选调节序列见于例如以下启动子：例如方便的应用于革兰氏阴性菌中的cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacl^q-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-P_R或λ-P_L等启动子。其它优选的调节序列见于，例如，革兰氏阳性细菌启动子amy和SPO2，酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或植物启动子CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、nos(＝胭脂碱合酶启动子)或泛素或菜豆蛋白启动子。表达盒还可包含化学诱导型启动子，以此方式可有利地在植物中于特定的时间控制生物体中外源Δ-8和/或Δ-5去饱和酶基因和/或Δ-9延长酶基因的表达。举例而言，优选的此类植物启动子是PRP1启动子[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)，361-366]、苯磺酰胺可诱导的启动子(EP 388186)、四环素可诱导的启动子[Gatz等，(1992)Plant J.2，397-404]、水杨酸可诱导的启动子(WO 95/19443)、脱落酸可诱导的启动子(EP 335 528)以及乙醇或环己酮可诱导的启动子(WO 93/21334)。可方便使用的其它植物启动子的例子是来自马铃薯的胞质FBPase的启动子、来自马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)、来自大豆(Glycine max)的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(可见于Gen Bank收录号U87999)或EP249676中所述的nodiene特异启动子。尤其有利的是保证在发生脂肪酸生物合成或其前体阶段的组织或植物部分/器官中，诸如在胚乳或发育的胚中表达的植物启动子。尤其值得提及的是保证种子特异性表达的有利启动子，例如USP启动子或其衍生物、LEB4启动子、菜豆蛋白启动子或napin启动子。本发明所引用的尤其有利的USP启动子或其衍生物可以介导基因在种子发育中极早期表达[Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67]。可用于单子叶植物或双子叶植物的其它有利的种子特异性启动子是适于双子叶的启动子，诸如来自油籽油菜的napin基因启动子(US 5,608,152)，来自拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)，来自菜豆(phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)，来自芸苔的Bce4启动子(WO 91/13980)或豆类B4启动子(LeB4，Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：233-239)，或者适于单子叶植物的启动子，诸如大麦中的lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO95/23230)或大麦的大麦醇溶蛋白基因启动子，稻的谷蛋白基因启动子，稻的oryzin基因启动子，稻的谷醇溶蛋白基因启动子，小麦的麦醇溶蛋白基因启动子，小麦的谷蛋白基因启动子，玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子，燕麦的谷蛋白基因启动子，高粱的kasirin基因启动子或黑麦的裸麦醇溶蛋白(secalin)基因启动子(WO99/16890中所述)。

此外，尤其优选的是保证在例如发生脂肪酸、油和脂质或其前体阶段的生物合成的组织或植物部分中表达的那些启动子。特别值得注意的是保证种子特异性表达的启动子。尤其的是来自油籽油菜的napin基因启动子(US5,608,152)、来自蚕豆的USP启动子(USP＝未知的种子蛋白，Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、来自拟南芥的油质蛋白基因启动子(WO98/45461)、菜豆蛋白启动子(US5,504,200)或豆球蛋白B4基因启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)。其它可提及的启动子是来自大麦的lpt2或lpt1基因的启动子(WO95/15389和WO95/23230)，它们介导单子叶植物中的种子特异性表达。其它有利的种子特异性启动子是：诸如WO 99/16890中所述的来自稻、玉米或小麦的启动子或来自Amy32b、Amy6-6或aleurain(US 5,677,474)的启动子，来自Bce4(油菜，US 5,530,149)、大豆球蛋白(大豆，EP 571741)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆、JP 06/62870)、ADR12-2(大豆，WO 98/08962)、异柠檬酸酶(油菜，US 5,689,040)或β-淀粉酶(大麦，EP 781 849)的启动子。

如上所述，表达构建体(＝基因构建体，核酸构建体)可以还包含待引入生物体的其它基因。这些基因可分开受调节或与Δ-8-和/或Δ-5-去饱和酶基因和/或Δ-9-延长酶基因受相同的调节区调节。举例说来，这些基因是其它的生物合成基因(优选用于脂肪酸生物合成的)，其允许合成得以提高。可以被提及的例子是Δ-15-、Δ-12-、Δ-9-、Δ-5-、Δ-4-去饱和酶基因、α-酮酰基还原酶基因、α-酮酰基合酶基因、延长酶或各种羟化酶基因和酰基-ACP硫酯酶基因。去饱和酶基因有利地用于核酸构建体中。

原则上所有天然的启动子及其调节序列都可如上文所述的那样用于依照本发明的表达盒中以及依照本发明的方法中。除此之外，也可方便的使用合成的启动子。

在表达盒的制备中，可以操作各DNA片段以获得在正确方向上有效阅读并配以正确的阅读框架的核苷酸序列。为了将DNA片段(＝本发明的核酸)相互连接，可将衔接头或接头附着于片段上。

用含有一个或多个限制性切点以便插入启动子和终止子区序列的接头或多接头可在转录方向上有效提供启动子和终止子区。通常，接头具有1-10个限制性切点，大部分是1-8个，优选2-6个限制性切点。一般调节区内接头的大小小于100bp，常常小于60bp，但至少为5bp。启动子对于宿主生物体(例如，对宿主植物)而言既可以是天然的或同源的也可以是外源的或异源的。在5’-3’的转录方向上表达盒包含启动子、编码Δ-8-去饱和酶基因、Δ-5-去饱和酶基因和/或Δ-9-延长酶基因的DNA序列和用于转录终止的区域。不同的终止区可以以任何合乎需要的形式相互交换。

此外，可以进行操作以提供合适的限制性接口或去除多余DNA或限制性接口。当考虑插入、缺失或替代，诸如转换和颠换时，可以使用体外诱变、引物修复、限制性酶切或连接。在适宜的操作中，可以实施诸如限制性酶切、反嚼(chewing back)或补平突出端以形成平端、片段的互补末端，以便进行连接。

为了有利的高表达，特异ER停留信号SEKDEL等的附着可能是重要的(Schouten，A.等，Plant Mol.Biol.30(1996)，781-792)。以此方式，平均表达水平三倍化或甚至四倍化。天然存在于植物和动物蛋白质中且定位于ER的其它停留信号也可以用于表达盒的构建中。在另一优选的实施方案中，使用如Napier J.A.所述的质体靶向序列[靶向于叶绿体的外源蛋白质(Targeting of foreignproteins to the chloroplast)，Methods Mol.Biol.，49，1995：369-376]。包含所说质体靶向序列的优选使用的载体如Colin Lazarus所述[Guerineau F.，Woolston S.，Brooks L.，Mullineaux P.“将外源蛋白质定向于叶绿体的表达盒(An expression cassette for targeting foreignproteins into chloroplast)；Nucleic.Acids Res.，Dec 9，16(23)，1988：11380]。

优选的多腺苷酸化信号是植物多腺苷酸化信号，优选与来自根癌土壤杆菌的T-DNA多腺苷酸化信号，尤其是与Ti质粒pTiACH5的T-DNA基因3(章鱼碱合酶)的多腺苷酸化信号(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835及以下)基本相应的那些信号或相应的功能等价物。

通过用常见的重组和克隆技术将合适的启动子与合适的Δ-8-和/或Δ-5-去饱和酶DNA序列和/或合适的Δ-9-延长酶DNA序列以及多腺苷酸化信号融合形成表达盒，所述技术参阅，例如，T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enq uist，基因融合实验(Experiments with Gene Fusions)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)和Ausubel，F.M.等，分子生物学通用手册(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)。

在表达盒的制备中，可操作各DNA片段以产生以正确方向有效阅读并配以正确阅读框架的核苷酸序列。衔接头或接头可附着于片段上用于连接DNA片段。

启动子和终止子区可以用含有一个或多个限制性切点以便插入这些序列的接头或多接头在转录方向上有效提供。通常，接头具有1-10个限制性切点，大部分是1-8个，优选2-6个限制性切点。一般调节区内接头的大小小于100bp，常常小于60bp，但至少为5bp。启动子对于宿主生物体(例如，对宿主植物)而言既可以是天然的或同源的也可以是外源的或异源的。在5’-3’的转录方向上表达盒包含启动子、编码Δ-8-和/或Δ-5-去饱和酶基因和/或Δ-9-延长酶基因的DNA序列和用于转录终止的区域。不同的终止区可以以任何合乎需要的形式相互交换。

在表达盒的制备中，可操作各种DNA片段以产生以正确方向有效阅读并配以正确阅读框架的核苷酸序列。衔接头或接头可附着于片段上以便连接这些DNA片段。

编码本发明方法中所用核酸序列的DNA序列，诸如来自细小裸藻的Δ-8去饱和酶、来自绿光等鞭金藻的Δ-9-延长酶和/或例如来自秀丽隐杆线虫、高山被孢霉、琉璃苣或展叶剑叶藓的Δ-5-去饱和酶，含有为达到在脂肪酸、脂质或油生物合成位点正确定位所需的所有序列特征。因此，本身并不需要其它靶向序列。不过，该定位可能是合乎需要的且有利的并因此可以被人为修饰或加强，这样这些融合构建体也是本发明优选的有利实施方案。

尤其优选的是保证定向于质体中的序列。在某些情况下，定向于其它的区室(报道于Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423中)也可能是合乎需要的，如，进入液泡、线粒体、内质网(ER)、过氧化物酶体、脂质结构或由于缺乏相应的可操作序列而停留在来源区室-胞质中。

方便的，依照本发明的核酸序列或基因构建体与至少一个报道基因一起被克隆入表达盒中，表达盒通过载体被引入生物体中或直接进入基因组。此报道基因应易于通过生长试验、荧光试验、化学试验、生物发光试验或抗性试验或通过光度计测定而被检测。可以提及的报道基因的例子是抗生素或除草剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代谢基因或生物合成基因，诸如Ura3基因、IIv2基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐磷酸酶基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、β-内酰胺酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因或BASTA(＝gluphosinate抗性)基因。这些基因使得可以对基因的转录活性以及由此而来的基因表达方便地进行检测和定量。以此方式可以确定展示不同生产力的基因组位置。

在优选的实施方案中，表达盒包含上游(即编码序列的5’端)启动子和下游(即3’端)聚腺苷酸化信号以及与插入其间的Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱酶编码DNA序列可操作性连接的其它调节元件。可操作性的连接意指启动子、编码序列、终止子和任选的其它调节元件以一定的方式顺序排列，从而使得各个调节元件均可以以预期方式在编码序列的表达中发挥其功能。优选用于可操作性连接的序列是保证在质体中的亚细胞定位的靶向序列。不过，用于保证亚细胞定位于线粒体、内质网(＝ER)、细胞核、油体或其它区室内的靶向序列也可以使用，还可以使用翻译启动子，诸如烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。

表达盒可以包含，例如，组成型启动子或组织特异性启动子(优选USP或napin启动子)、待表达基因和ER停留信号。对于ER停留信号而言，优选使用KDEL氨基酸序列(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)或KKX氨基酸序列(赖氨酸-赖氨酸-X-终止密码子，其中X指任一其它的已知氨基酸)。

为了表达于原核或真核宿主生物中，例如真菌等微生物或植物中，表达盒优选插入载体，例如质粒、噬菌体或使得基因可以在宿主生物中最佳表达的其它DNA中。适当的质粒例子有：在大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、诸如pBR322等pBR系列、诸如pUC18或pUC19等pUC系列、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11或pBdCI；在链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；在芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214；在棒状杆菌中的pSA77或pAJ667；在真菌中的pALS1、pIL2或pBB116；其它的优选真菌载体参阅以下文献：Romanos，M.A.等[(1992)酵母中的外源基因表达：综述(Foreign gene expression in yeast：a review)，Yeast 8：423-488]和van den Hondel，C.A.M.J.J.等[(1991)，丝状真菌中的异源基因表达(Heterologous gene expression in filamentous fungi)，也参见“真菌的更多基因操作”(More Gene Manipulations in Fungi)[J.W.Bennet & L.L.Lasure编辑，第396-428页；Academic Press：San Diego]以及“为丝状真菌研发的基因转移系统和载体(Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi)[van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)《真菌的应用分子遗传学》(Applied Molecular Genetics ofFungi)，Peberdy，J.F.等编辑，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]。优选的酵母启动子的例子是2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子的例子是pLGV23、pGHlac⁺、pBIN19、pAK2004、pVKH或pDH51(参阅Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988)。以上给出的载体或以上给出的载体的衍生物只是可能使用的质粒中的一小部分备选载体。其它的质粒对于本领域技术人员而言是众所周知的且可参阅，例如，书籍“克隆载体”(Cloning Vectors)(编辑Pouwels P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)。适宜的植物载体特别参阅“植物分子生物学和生物工程学方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)”(CRC Press)，第6/7章，第71-119页。优选的载体为在大肠杆菌和土壤杆菌中复制的穿梭载体或二元载体。

载体也指本领域技术人员已知的除质粒之外的所有其它载体，例如噬菌体、病毒诸如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、噬粒、粘粒、线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物体中自主复制或随染色体复制，优选随染色体复制。

在载体的其它实施方案中，依照本发明的表达盒也可以有利地以线性DNA的形式引入生物体中并通过异源或同源重组的方式整合入宿主生物体的基因组中。此线性DNA可以由线性化的质粒组成或只由表达盒组成作为载体或由依照本发明的核酸序列组成。

在另一有利的实施方案中，依照本发明的核酸序列也可独自地被引入生物体中。

如果除了依照本发明的核酸序列之外，其它基因也将要被引入生物体中，可以将它们所有与报道基因一起在单一载体中引入生物体，或可以每一基因分别各与报道基因在载体中引入生物体，从而同时或相继引入不同的载体。

载体优选包含至少一拷贝的依照本发明的核酸序列和/或依照本发明的表达盒(＝基因构建体)。

例如，植物表达盒可被安置在pRT转化载体中((a)Toepfer等，1993，Methods Enzymol.，217：66-78；(b)Toepfer等，1987，Nucl.Acids.Res.15：5890 ff.)。

或者，重组载体(＝表达载体)也可在体外被转录和翻译，例如，通过利用T7启动子和T7 RNA聚合酶。

应用于原核生物的表达载体常常利用具有和不具有融合蛋白或融合寡肽的可诱导体系，其中这些融合可以以N末端和C末端两种形式发生或可以发生于蛋白质的其它有用结构域中。所述融合载体通常具有以下目的：i)提高RNA表达率；ii)提高可获得的蛋白质合成率；iii)提高蛋白质的溶解度；iv)或通过可用于亲和层析的结合序列简化纯化步骤。蛋白水解切割位点也经常通过融合蛋白质而被引入，使得可以切出融合蛋白的一部分并纯化。所述的蛋白酶识别序列被，例如因子Xa、凝血酶和肠激酶所识别。

典型的有利融合和表达载体是含谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白质或蛋白A的pGEX[Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40]、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。

大肠杆菌表达载体的其它例子有pTrc[Amann等，(1988)Gene69：301-315]和pET载体[Studier等，Gene Expression Technology：Methodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；Stratagene，Amsterdam，The Netherlands]。

用于酵母中的其它有利载体有pYepSec1(Baldari等，(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54：113-123)和pYES衍生物(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。用于丝状真菌中的载体参阅文献：van denHondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)，为丝状真菌研发的基因转移体系和载体(Gene transfer systems and vector development for filamentousfungi)，《真菌的应用分子遗传学》(Applied Molecular Genetics of Fungi)，J.F.Peberdy等编辑，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge。

或者，还可方便的利用昆虫细胞表达载体，例如，用于在Sf9细胞中表达。这些载体是例如，pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列载体(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。

此外，植物细胞或藻类细胞可方便的用于基因表达。植物表达载体的例子可以参阅文献Becker，D.等(1992)“具有紧临左边界的可选择标记的新植物二元载体(New plant binary vectors with selectable markers locatedproximal to the left border)”，Plant Mol.Biol.20：1195-1197或Bevan，M.W.(1984)“用于植物转化的二元土壤杆菌载体(Binary Agrobacteriumvectors for plant transformation)”Nucl.Acid.Res.12：8711-8721.

此外，核酸序列也可表达于哺乳动物细胞中，尤其是非人类哺乳动物细胞中。相应表达载体的例子为pCDM8和pMT2PC，参阅Seed，B.(1987)Nature 329：840或Kaufman等(1987)EMBO J.6：187-195)。同时优选使用病毒来源的启动子，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒或猿猴病毒SV40的启动子。其它的原核和真核表达体系参阅Sambrook等人所编辑的《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第二版，冷泉港实验室，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)的第16和17章。

宿主生物体(＝转基因生物)优选包含至少一拷贝依照本发明的核酸和/或依照本发明的核酸构建体。

原则上可以通过本领域技术人员已知的所有方法将依照本发明的核酸、表达盒或载体引入生物体(例如植物)中。核酸序列的引入产生了重组或转基因生物。

以微生物为例，本领域技术人员可在以下参考书中找到适当的方法：Sambrook，J.等(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：Alaboratory manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；F.M.Ausubel等(1994)分子生物学通用手册(Current protocols in molecular biology)，John Wiley and Sons；D.M.Glover等，DNA克隆(DNA Cloning)卷1(1995)，IRL Press(ISBN 019-963476-9)；Kaiser等(1994)酵母遗传学中的方法(Methods in Yeast Genetics)，Cold Spring Harbor Laboratory Press或Guthrie等，酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology)，Methods in Enzymology，1994，Academic Press。

将外源基因转移入植物基因组中被称为转化。为此，利用了用于转化和自植物组织或植物细胞再生植物的方法进行瞬时或稳定的转化。适宜的方法是通过聚乙二醇诱发的DNA摄取而进行的原生质体转化、利用了基因枪的“生物轰击”方法-称为粒子轰击方法、电穿孔、在DNA溶液中孵育干胚、显微注射和土壤杆菌介导的基因转移。所说的方法参阅，例如B.Jenes等，基因转移技术(Techniques for Gene Transfer)，《转基因植物》(Transgenic Plants)，卷1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)。待表达的核酸或构建体优选克隆入适于转化根癌土壤杆菌的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后被所述载体转化的土壤杆菌可以以已知方式用于植物转化中，尤其是农作物(例如烟草)的转化中，例如在土壤杆菌溶液中浸浴擦伤的叶子或切割的叶子然后将它们培养于合适的培养基中。用根癌土壤杆菌的方式转化植物可以参阅，例如，

和Willmitzer，Nucl.Acid Res.(1988)16，9877或F.F.White，用于高等植物中基因转移的载体(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)；Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，pp.15-38。

用依照本发明的表达载体转化的土壤杆菌同样可以以已知方式用于转化植物，诸如拟南芥等试验植物或作物如谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、西红柿、胡萝卜、红辣椒、油籽油菜、木薯(tapioca)、木薯(cassava)、竹芋、万寿菊、紫花苜蓿、莴苣和各种树，坚果和藤本植物，尤其是含油的农作物，诸如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油籽油菜、椰子、油椰、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆，例如，通过在土壤杆菌溶液中浸浴擦伤的叶子或切割的叶子并将其然后培养于适当的培养基中。为了生产PUFA，例如十八碳四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，琉璃苣、亚麻籽、向日葵、红花或报春花科植物(Primulaceae)尤其适宜。用于产生例如γ-亚油酸、dihomo-γ-亚油酸或花生四烯酸的其它合适生物体是例如亚麻子、向日葵或红花。

遗传修饰的植物细胞可用本领域技术人员已知的所有方法再生。适当的方法可参阅上文中S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或

和Willmitzer发表的文章。

因此，本发明的另一方面涉及由至少一种依照本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的转基因生物以及来源于所述生物的细胞、细胞培养物、组织、部分-例如对于植物生物体而言叶、根等-或繁殖材料。术语“宿主生物体”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物体”和“转基因(宿主)细胞”在此可交换使用。当然，这些术语不仅涉及特定的宿主生物体或特定的靶细胞，还涉及这些生物体或细胞的后代或潜在后代。因为，由于突变或环境影响，可能在后续世代中出现一定的改变，这些后代不一定与亲本细胞相同，但仍然包括在本文所用的此术语范围内。

就本发明的目的而言，例如，对于核酸序列、含本发明核酸序列的表达盒(＝基因构建体，核酸构建体)或载体或用依照本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物体，“转基因”或“重组”是指用遗传工程方法产生的所有那些构建物，其中

a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9所示核酸序列或其衍生物或其部分或

b)与(a)中所述核酸序列功能性连接的遗传调节序列，例如3’-和/或5’-遗传调节序列，诸如启动子或终止子，或

c)(a)和(b)

不存在于其天然的遗传环境中或已用遗传工程方法进行了修饰，其中的修饰可以是例如一个或多个核苷酸残基的替代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境指在来源生物体或宿主生物体或基因组文库中的天然基因组或染色体座位。在基因组文库的情形中，优选至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。所说的环境至少位于核酸序列的一侧且序列长度至少为50bp，优选至少500bp，尤其优选至少1,000bp，最尤其优选至少5,000bp。对于天然存在的表达盒——例如依照本发明的核酸序列的天然启动子与相应Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因的天然组合，在基因被诸如诱变等非天然的(“人为的”)合成方法修饰后其转变为转基因表达盒。适当的方法参阅，例如US 5,565,350或WO 00/15815。

适用于依照本发明的核酸、表达盒或载体的生物体或宿主生物体原则上有利地为能合成脂肪酸(尤其是不饱和脂肪酸)或适于上述重组基因表达的所有生物体。其它可被提及的例子是，植物诸如拟南芥，诸如金盏花等紫菀科植物(Asteraceae)或诸如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油籽油菜、椰子、油椰、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆等农作物，微生物诸如真菌，例如被孢霉属、水霉属(Saprolegnia)或腐霉属(Pythium)，细菌诸如埃希氏菌属(Escherichia)，酵母诸如酵母属(Saccharomyces)、蓝细菌、纤毛虫、藻类或原生动物如腰鞭毛虫，如隐甲藻属。优选可以天然相对大量合成油的生物体，诸如真菌，如高山被孢霉、Pythium insidiosum或植物诸如大豆、油籽油菜、椰子、油椰、红花、亚麻、蓖麻、金盏花、花生、可可豆或向日葵，或酵母诸如酿酒酵母且尤其优选大豆、亚麻、油籽油菜、向日葵、金盏花、被孢霉或酿酒酵母。原则上，除了上文的转基因生物之外，转基因动物，有利地非人动物，例如秀丽隐杆线虫也是适宜的。

其它有用的宿主细胞参阅：Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。

可用的表达株，例如，展示相对较低的蛋白酶活性的那些株系参阅Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128。

本发明的另一目的涉及将含有编码Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因的DNA序列或与之杂交的DNA序列的表达盒用于植物细胞、组织或植物部分的转化中。使用的目的是提高双键含量增高的脂肪酸、油或脂质的含量。

为此，取决于所选择的启动子，Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因可特异表达于叶、种子、结节、根、茎或植物的其它部分。那些过量产生在脂肪酸分子中具有至少三个双键的脂肪酸、油或脂质的转基因植物，其繁殖材料及其植物细胞、组织或部分是本发明另一主题。

此外，也可将含Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因序列的依照本发明的表达盒或核酸序列用于上文举例说明的生物体的转化中，所述生物体为诸如细菌、蓝细菌、酵母、丝状真菌、纤毛虫和藻类，其目的是提高具有至少三个双键的脂肪酸、油或脂质的含量。

在本发明的构架中，提高具有至少三个双键的脂肪酸、油或脂质的含量是指，例如，人为获得生物合成性能提高的性状，所述提高是由于在依照本发明的生物体中，尤其是在依照本发明的转基因植物中使Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因功能性过表达所致，并且所述提高是与未遗传修饰的起始植物进行至少持继至少一个植物世代的比较而言的。

脂肪酸、油或脂质生物合成的优选位置通常是，例如种子或种子的细胞层，这样Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因的种子特异性表达是适宜的。不过，显而易见，脂肪酸、油或脂质的生物合成不必局限于种子组织，也可以以组织特异性方式出现于植物的所有其它部分中-例如在表皮细胞或结节中。

此外，外源Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因的组成型表达是有利的。不过，另一方面，可诱导表达可能似乎也是合乎需要的。

例如，可以用茎的分生组织的增殖在体外确定Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因的表达效率。此外，在性质和水平上改变的Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因的表达及其对脂肪酸、油或脂质生物合成性能的影响可在温室试验中于试验植物上进行测试。

本发明的另一目的包括用含有依照本发明的Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因序列或与其杂交的DNA序列的表达盒转化的转基因生物诸如转基因植物，以及该植物的转基因细胞、组织、部分和繁殖材料。在这种情况下特别优选转基因农作物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、稻、棉花、甜菜、油籽油菜和canola、向日葵、亚麻、大麻、蓟、马铃薯、烟草、西红柿、木薯(tapioca)、木薯(cassava)、竹芋、紫花苜蓿、莴苣和各种树，坚果和藤生植物。

就本发明的目的而言，植物是单子叶和双子叶植物、藓类和藻类。更具体地，依照本发明的植物是如上所述含有依照本发明的核酸序列或依照本发明的表达盒的转基因植物。

本发明的其它目的是：

-转化植物的方法，包括将含有来自藻类诸如裸藻属或等鞭金藻属、真菌诸如被孢霉属或藓类诸如剑叶藓属的Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶基因序列或与其杂交的DNA序列的依照本发明的表达盒引入植物细胞、愈伤组织、整株植物或植物的原生质体中。

-生产PUFA的方法，其中所述方法包括培养含有本文所述核酸或编码Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶的载体的转基因生物体，它特异合成在脂肪酸分子中具有至少三个双键的多不饱和脂肪酸。

-利用Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶DNA序列或与其杂交的DNA序列生产由于所述Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶DNA序列在植物中的表达而具有至少三个双键的脂肪酸、油或脂质含量增加的植物。

-含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列或其衍生物的蛋白质。

-利用具有序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的所述蛋白质产生不饱和脂肪酸。

依照本发明的另一个目的是用于生产不饱和脂肪酸的方法，包括：将至少一种本文所述核酸序列或含所述核酸序列的至少一种核酸构建体或载体引入诸如植物或真菌等优选的产油生物体中；培养所述生物体；分离在所述生物体中包含的油；并释放存在于所述油中的脂肪酸。这些不饱和脂肪酸有利地在脂肪酸分子中含有至少三个双键。脂肪酸可以，例如通过碱水解，如用NaOH或KOH或通过酸水解，优选在诸如甲醇或乙醇等醇存在的条件下，从油或脂质中释放。所说的脂肪酸释放产生了游离的脂肪酸或脂肪酸的相应烷基酯。原则上例如用脂酶进行酶水解也是可以的。从所说的游离脂肪酸或脂肪酸烷基酯开始，可以化学合成或酶促合成甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯。在本发明方法另一优选的实施方案中，脂肪酸的烷基酯通过用常规化学或用酶进行酯转移产生自油和脂质。优选的方法是在诸如甲醇化物或乙醇化物等相应低级醇(C1至C10的醇，诸如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、己醇等)的醇化物存在的条件下产生烷基酯。因此正如技术人员所已知的，在催化量的碱如NaOH或KOH存在的条件下将醇加入油或脂质中。

产生具有提高含量的不饱和脂肪酸的甘油三酯的方法包括：将至少一种依照本发明的核酸序列或至少一种依照本发明的表达盒引入产油生物体中；培养所说的生物体；并分离所述生物体中所含的油；这也是本发明的目的之一。

本发明的另一目的是通过将含有饱和或不饱和脂肪酸或者饱和和不饱和脂肪酸的甘油三酯与至少一种由序列SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10编码的蛋白质一起孵育产生具有增加含量的不饱和脂肪酸的甘油三酯的方法。在可吸收或释放还原当量的化合物存在下有利地实施此方法。然后脂肪酸可从甘油三酯释放。

对用于产生具有增加含量的不饱和脂肪酸的甘油三酯的所述方法，依照本发明的另一目的是利用本领域技术人员已知的碱水解或诸如脂酶等酶从甘油三酯释放脂肪酸的方法。

上文的方法可方便的合成脂肪酸分子中含有至少三个双键的脂肪酸或具有增加含量的该脂肪酸的甘油三酯。

上文的方法可方便的合成脂肪酸分子中含有至少三个双键的脂肪酸或具有增加含量的该脂肪酸的甘油三酯，其中用于Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶反应的底物优选是亚油酸(C_20:2 ^Δ9，12)和/或α-亚麻酸(C_18:2 ^{Δ9，12，15})。以此方式，上述方法可有利地尤其合成来自亚油酸(C_20:2 ^Δ9，12)、α-亚麻酸(C_18:2 ^{Δ9，12，15})的脂肪酸，γ-亚油酸(C_18:3 ^Δ6，9，12)、十八碳四烯酸(C_18:4 ^Δ6， ^9，12，15)、dihomo-γ-亚油酸(C_20:3 ^{Δ8，11，14})或例如二十碳五烯酸和花生四烯酸。

用于上文所述方法中的生物体的例子是植物诸如拟南芥、报春花科、琉璃苣、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、稻、棉花、甜菜、油籽油菜和canola、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、西红柿、油菜、tapioca、cassava、竹芋、紫花苜蓿、花生、蓖麻油植物、椰子、油椰、红花(Carthamustinctorius)或可可豆，微生物诸如真菌，例如被孢霉属、Saprolegnia属或Pythium属，细菌诸如埃希氏菌属、蓝细菌，酵母诸如酵母属、藻类或原生动物如腰鞭毛虫，如隐甲藻属。优选可以相对大量地天然合成油的生物体，诸如真菌如高山被孢霉、Pythium insidiosum或植物诸如大豆、油籽油菜、椰子、油椰、红花、蓖麻、金盏花、花生、可可豆或向日葵，或酵母诸如酿酒酵母，并尤其优选大豆、油籽油菜、向日葵、亚麻、报春花科植物、琉璃苣、红花或酿酒酵母。

取决于宿主生物体，以本领域技术人员已知的方式生长或培养本发明方法中所用的生物体。微生物诸如真菌或藻类通常培养于含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源，诸如酵母提取物或诸如硫酸铵等盐的形式)、痕量元素(诸如铁、锰或镁盐)以及任选的维生素的液体培养基中，温度在10℃和60℃之间，优选在15℃和40℃之间，暴露于气态氧。为此可将营养液的pH保持在固定的值，即在生长期间pH被调节或不被调节。培养可以以分批形式、半分批形式或连续的形式进行。营养成分可以在发酵开始时提供或半连续地或连续地补加。

转化后，首先如上所述使植物再生，然后按正常方式培养或栽培。

生长后，以普通方式从生物体中分离脂质。为此目的，在收获后首先可以将所述生物体消化或直接使用。有利地用合适的溶剂提取脂质，诸如非极性溶剂象己烷或乙醇、异丙醇或诸如己烷/异丙醇、酚/氯仿/异戊醇等混合物，温度在0℃和80C之间，优选在20℃和50℃之间。通常用过量溶剂提取生物质，例如4倍过量的溶剂对生物量的比率。然后去除所述溶剂，例如通过蒸馏。还可用超临界CO₂进行提取。提取后剩余的生物质可通过例如过滤去除。

然后可以进一步纯化以此方式分离的粗油，例如通过用极性溶剂丙酮或氯仿处理然后过滤或离心以去除混浊。还可以通过柱子进行进一步的纯化。

为了从甘油三酯中获取游离酸，以常规方式将甘油三酯皂化。

本发明的另一目的包括用上文方法产生的不饱和脂肪酸和具有增加含量的不饱和脂肪酸的甘油三酯以及它们在食品、动物饲料、化妆品和药品生产中的应用。为此目的将甘油三酯以常规量添加到食品、动物饲料、化妆品或药品中。

用上述方法产生的依照本发明的所述不饱和脂肪酸以及具有增加含量的不饱和脂肪酸的甘油三酯是依照本发明的核酸在各种宿主生物体中表达的结果。这总的导致了与不含所述核酸的最初起始宿主细胞相比较，所述宿主细胞中含有不饱和脂肪酸的化合物的组成发生改变。与在天然状态下包含所述核酸编码的蛋白质或酶的宿主生物体相比，这些改变在天然状态下不含所述核酸所编码的蛋白质或酶的宿主生物体，例如植物细胞中更为显著。这导致宿主生物体含有的油、脂质、磷脂、鞘脂、糖脂、甘油三酯和/或游离脂肪酸具有更高含量的带至少三个双键的PUFA。就本发明的这一目的而言，提高的含量指与不含本发明核酸的起始生物体相比，所述宿主生物体包含多至少5％，优选至少10％，优选至少20％，尤其优选至少30％，最尤其优选至少40％的多不饱和脂肪酸。对于天然状态下不含较长链多不饱和C₂₀或C₂₂脂肪酸(诸如EPA或ARA)的植物，这尤其如此。由于所述核酸的表达，以所述方式产生了新的脂质组合物，这是本发明更进一步的方面。

通过以下实施例对本发明进行了更详细的解释。

实施例

实施例1：一般克隆方法

克隆方法，例如限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、核酸向硝酸纤维素膜和尼罗膜的转移、DNA片段的连接、大肠杆菌的转化、细菌的培养和重组DNA的序列分析，如Sambrook等(1989)(Cold SpringHarbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6)所述进行。

实施例2：重组DNA的序列分析

用来自ABI公司的激光荧光DNA测序仪通过Sanger法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)进行重组DNA分子的测序。对聚合酶链式反应产生的片段进行测序和检查以避免待表达构建体中的聚合酶错误。

实施例3：来自细小裸藻的Δ-8-去饱和酶(＝SEQ ID NO：1)的克隆

用来自细小裸藻株系Z的cDNA作为模板进行PCR扩增。cDNA合成自从E.gracilis株系Z的培养物中提取的总RNA。针对Euglena Δ-8-去饱和酶的起始甲硫氨酸和终止密码子的独特引物合成如下，其中包括限制性位点。

引物1：EDELTA8BamF

ATGGATCCACCATGAAGTCAAAGCGCCAA

引物2：EDELTA8XhoR

ATCTCGAGTTATAGAGCCTTCCCCGC

PCR方案

退火温度：45℃1分钟

变性温度：94℃1分钟

延伸温度：72℃2分钟

循环数：30

在琼脂糖凝胶上分离PCR产物得到一1270bp的片段。将PCR片段克隆入pGEM-T easy载体(Promega)中，然后对插入片段进行测序。这显示了编码421个氨基酸残基的蛋白质和终止密码子的1266个碱基对的开放阅读框架的存在。所克隆的Δ-8-去饱和酶的C末端与Wallis和Browse(Archives ofBiochem.and Biophysics，Vol.365，No.2，1999)所公布的Δ-8-去饱和酶具有高度的同源性，该酶据报道是一422个残基的酶；还可参阅这些作者给出的相关序列[GenBank AF139720/AAD45877]，其声称涉及同一种Δ-8去饱和酶但描述了一419个残基的开放阅读框架。本发明所述的裸藻Δ-8去饱和酶的推断氨基酸序列由于N末端的差异而与先前描述的序列有所区别。具体而言，LARS Δ-8-去饱和酶的前25个氨基酸残基是：MKSKRQALPLTIDGTTYDVS AWVNF，而Wallis和Browse所述序列是：MKSKRQALSPLQLMEQTYDV SAWVN(如ABB 1999中所给出的)或可选择性的MKSKRQALSPLQLMEQTYDVVNFH(如GenBank AAD45877中所给出的)。

出现在去饱和酶序列N末端的所说异质性不是PCR扩增或引物所造成的。所述区别是蛋白质之间真正的差异。

实施例4：表达绿光等鞭金藻延长酶组分IgASE1的转基因植物的构建

IgASE1 cDNA的克隆参阅：Qi，B.，Beaudoin，F.，Fraser，T.，Stobart，A.K.，Napier，J.A.和Lazarus，C.M，从生产二十二碳六烯酸(DHA)的显微藻类绿光等鞭金藻鉴定编码新的C18-Δ-9-多不饱和脂肪酸特异性延长活性的cDNA FEBS Letters 510，159-165(2002)。

cDNA通过用KpnI消化从pCR2.1-TOPO质粒载体释放并连接入中间载体pBlueBac 4.5(Invitrogen)的KpnI位点。用EcoRI筛选重组质粒中插入片段的方向。用PstI加EcoRI将插入片段自选定的质粒中释放并连接入已用同样的酶切割的二元载体质粒pCB302-1(Xiang等，1999)。这样就将IgASE1编码区置于CaMV 35S启动子的控制下，并与Rubisco小亚基转运肽(Xiang at al.，1999)翻译融合，目的是在转基因植物中表达时将此延长酶组分定向于叶绿体。此重组二元载体被命名为pCB302-1ASE。为了构建用于表达定向于微粒体膜的延长酶组分的类似载体，用BamHI加SpeI消化从中间载体中移出IgASE1编码区，并将其连接入pCB302-3的相应位点(Xiang etal.，1999，其中pCB302-3的图谱是不正确的：CaMV 35S启动子(加上ω序列)和nos终止子区相对于MCS2是倒转的)。此重组二元载体被命名为pCB302-3ASE。

实施例5：延长酶的植物表达

通过电穿孔将二元载体转移入根癌土壤杆菌菌株GV3101中；在含50μg ml^-1卡那霉素的培养基上选择被转化的菌落。在28℃将选定的菌落培养至稳定期，然后离心浓缩细胞并重悬于含5％蔗糖、0.03％Silwet-177和10mM MgCl₂的浸渍溶液中。

将拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Columbia4的种子于二分之一浓度的Murashige和Skoog培养基上萌发，并将幼苗转移至15cm花盆的堆肥中。将植物在21℃于生长室中培养至开花期，其中采用23小时光照1小时黑暗的周期。用Clough和Bent(1998，花的浸渍：用于土壤杆菌介导的拟南芥转化的简化方法。Plant Journal 16，735-743(1998))的花浸渍方法进行植物转化，基本上如下：

对于各构建体而言，将含16株植物的两个花盆倒置于含已转化的根癌土壤杆菌(如上文所述)的浸渍溶液中。然后将植物用塑料袋覆盖并在室温置于黑暗中过夜。之后将袋子拿走，将植物转移至生长室中。5天后重复浸渍(用新鲜的根癌土壤杆菌溶液)并使植物结籽。收集来自已浸渍植物的大量种子(＝T1种子)，将大约10000粒种子撒在种子盘的堆肥中，在4℃层积2天后，培养于生长室中。当幼苗达到2至4片真叶阶段，喷洒Liberty除草剂(Aventis，0.5g草铵膦l^-1)，一周后重复喷洒。选定12株除草剂抗性植物并按各株系(叶绿体或细胞质定向的延长酶组分)进行盆栽，并允许自花受精。将收集自这些植物的T2种子样品在浓度一半的Murashige和Skoog培养基上萌发，培养基中含有Liberty(5mg草铵膦l^-1)。然后将收集自存活植物个体的T3种子再次于Liberty平板上萌发以筛选已停止除草剂抗性分离的株系。分析提取自这些株系的叶的总脂肪酸并选择具有最高C20含量的那些株系(具有叶绿体定向的延长酶组分的CB12-4和具有细胞质定向的延长酶组分的CA1-9)。

实施例6：表达绿光等鞭金藻延长酶组分IgASE1和细小裸藻Δ8去饱和酶EUGD8的转基因植物的产生

用BamHI加XhoI从酵母表达载体pESC-Trp上切下Δ-8-去饱和酶编码区并连接入pBlueBac 4.5(Invitrogen)的BamHI和XhoI位点然后转化入大肠杆菌菌株Tam1中。用BglII和BamHI从重组质粒上切下插入片段，连入pBECKS₁₉.6的BamHI位点并转化入大肠杆菌菌株Tam1中。小量制备6个转化体菌落的重组质粒DNA；用XhoI消化这些DNA以确定二元载体中去饱和酶编码区插入的方向。将对于自CaMV 35S启动子的表达而言含有正确方向的插入片段的一个重组质粒通过电穿孔转移至根癌土壤杆菌GV3101中并如上所述自被转化菌落制备浸渍溶液。

如上所述对拟南芥株系CB12-4和CA1-9(见上文)进行花的浸渍。将来自各株系的大约2000个T1-种子散播于含有浓度一半的Murashige和Skoog(固体)培养基(补充有50μg ml^-1卡那霉素)的15cm培养皿上并于生长室中萌发。将CM-9亲本系的12株卡那霉素抗性植株和CB12-4亲本系的3株植株转移入盆栽堆肥中并进一步在生长室中培养。在来自各T2植株的叶上进行脂肪酸分析，T2植株被允许成熟并结籽。

参考文献

McCormac，A.C.，Eliott，M.C.和Chen，D-F.；pBECKS.用于土壤杆菌介导的植物转化的二元载体的可变系列(A flexible series of binary vectorsfor Agrobacterium-mediated plant transformation).MolecularBiotechnology 8，199-213(1997).

Xiang，C.，Han，P.，Lutziger，I.，Wang，K.和Oliver，D.J.；用于植物转化的小二元载体系列(A mini binary vector series for planttransformation).Plant Molecular Biology 40，711-717(1999).

实施例7：表达绿光等鞭金藻延长酶组分IgASE1和细小裸藻Δ8去饱和酶EUGD8和Δ5去饱和酶的转基因植物的产生

将来自三角褐指藻的Δ5去饱和酶克隆入含潮霉素抗性选择标记基因的pGPTV质粒(Becker，D.et al.；Plant Mol.Biol.20(1992)，1195-1197)中。为了进行种子特异性表达，将来自蚕豆(Vicia faber)的USP启动子克隆至Δ5去饱和酶ATG的5’-端。

将二元载体转移入根癌土壤杆菌菌株GV 3101并在含30μgml^-1潮霉素的培养基中选择已转化的菌落。将选定的土壤杆菌用于转化(花的转化)携带具有Δ9延长酶和Δ5去饱和酶的T-DNA插入片段的拟南芥植物。

于含潮霉素的Murashige和Skoog培养基上使拟南芥幼苗萌发并将抗性植物转移到温室中。

收获收集自植物个体的种子并用GC方法分析总脂肪酸谱。

实施例8：用于植物中种子特异性表达的表达质粒的克隆

pBin-USP是质粒pBin 19的衍生物。pBin-USP通过将EcoRI-BaMHI片段形式的USP启动子插入pBin19中而产生自pBin19(Bevan et al.(1980)Nucl.Acids Res.12，8711)。聚腺苷酸化信号是Ti质粒pTiACH5的T-DNA的基因3的聚腺苷酸化信号(Gielen et al.，(1984)EMBO J.3，835)，由此核苷酸11749-11939作为PvuII-HindIII片段分离，在PvuII切点处加入SphI接头后克隆至载体的SpHI-HindIII切点之间。USP启动子相当于核苷酸1-684(GenBank录入号X56240)，其中USP基因的非编码区的一部分包含在启动子内。利用商品化的T7标准引物(Stratagene)以及利用合成的引物通过PCR反应通过标准方法扩增全长684bp的启动子片段。

引物序列：

5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’

用EcoRI/SalI切割PCR片段并插入携带OCS终止子的载体pBin19中。得到命名为pBinUSP的质粒。将此构建体用于转化拟南芥、油籽油菜、烟草和亚麻。

实施例9：转基因油料作物的产生

转基因植物的产生(依照Moloney等人，1992，Plant Cell Reports，8：238-242的方法修正)

为了生产转基因油籽油菜植物，利用了在根癌土壤杆菌C58C1：pGV2260或大肠杆菌中的二元载体(Deblaere等，1984，Nucl.Acids.Res.13，4777-4788)。为了转化油菜植物(var.Drakkar，NPZ NordeutschePflanzenzucht，Hohenlieth，Germany)，使用了在含3％蔗糖的Murashige-Skoog培养基(3MS培养基)(Murashige和Skoog 1962Physiol.Plant.15，473)中1∶50稀释的阳性转化土壤杆菌菌落的过夜培养物。将无菌的新鲜萌发的油菜植株的叶柄或下胚轴(各约1cm²)与1∶50稀释的土壤杆菌溶液一起在培养皿中孵育5-10分钟。随后于25℃黑暗条件下在含0.8％细菌培养用琼脂的3MS培养基上共孵育3天。3天后，采用16小时光/8小时暗，以一周为周期继续在含500mg/l Claforan(头孢噻肟钠)、50mg/l卡那霉素、20μM苯甲基氨基嘌呤(BAP)和1.6g/l葡萄糖的MS培养基上进行培养。将正在生长的芽转移至含2％蔗糖、250mg/l Claforan和0.8％细菌培养用琼脂的MS培养基上。如果三周后未形成根，培养基中加入2-吲哚丁酸作为生长激素用于生根。

利用卡那霉素和Claforan在2MS培养基上获得再生的芽，生根后将其转移至土壤中，培养物在人工气候室中生长两周后开花，收获成熟的种子，通过脂质分析方式研究Δ-8去饱和酶的表达。鉴定在Δ-8位置双键含量增加的株系。在功能性表达转基因的稳定转化的转基因株系中，发现与对照未转化的植物相比，在Δ-8位置的双键含量提高了。

进行同样的步骤以建立具有Δ-9-延长酶和/或Δ-5-去饱和酶活性的植物。

a)转基因亚麻植物

通过如Bell et al.，1999，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant.35(6)：456-465的方法，通过粒子轰击的方式可以生产转基因亚麻植物。可以例如，如Mlynarova等(1994)，Plant Cell Report 13：282-285所述实施土壤杆菌介导的转化。

实施例10：从种子和叶材料中提取脂质

为了使植物材料更易于提取，首先用捣碎机对植物材料(约200mg)进行机械匀浆。

用1M盐酸甲醇溶液和5％的二甲氧基丙烷在85℃水解已破碎的细胞沉淀1小时并将脂质进行转甲基化。在己烷中提取产生的脂肪酸甲基酯(FAME)。用毛细管柱通过气-液色谱分析提取的FAME(Chrompack，WCOT fused silica，CP wax 52CB，25m，0.32mm)，其中温度梯度为：20分钟170℃至240℃和5分钟240℃。通过与相应的FAME标准品(Sigma)比较证实脂肪酸甲酯的身份。通过对FAME混合物的适当化学衍生，例如，以形成4，4-二甲氧基噁唑啉衍生物(Christie，1998)，通过GC-MS方式进一步分析双键的身份和位置。

图1显示了作为对照的野生型拟南芥的叶子组织的脂肪酸谱(FAMes)。图2显示了来自表达等鞭金藻属Δ-9-延长酶的转基因拟南芥(见实施例4)的叶子组织的脂肪酸谱(FAMes)。随后用裸藻属Δ-8-去饱和酶再转化此拟南芥株系。所说的双重转化的拟南芥株系(Line IsoElo X Eu D8des)的脂肪酸谱(FAMes)参阅图3。

此外，此双重转化的拟南芥株系(Line IsoElo X Eu D8des)随后用被孢霉属Δ5去饱和酶(Mort Δ5)基因再转化。所述三重转化的拟南芥株系(LineIsoElo X EU D8.des x Mort Δ5)的脂肪酸谱(FAMes)参阅图4。

实施例11：来自不同转基因的拟南芥叶子脂肪酸甲酯的GC谱

图5显示了提取自野生型(WT 5a)、表达绿光等鞭金藻Δ9延长酶基因Ig ASE1的单转基因植物(5b)、表达Ig ASE1和裸藻属Δ8去饱和酶(EU Δ8)基因的双重转基因植物(5c)和表达Ig ASE1、Eu Δ8和被孢霉属Δ5去饱和酶(Mort Δ5)基因的三重转基因植物(5d)的拟南芥叶子脂肪酸甲酯的GC谱。

表1显示了制备自野生型(Wt)、表达绿光等鞭金藻Ig ASE1Δ9延长酶基因的单转基因植物、表达Ig ASE1Δ9延长酶基因和裸藻属Δ8去饱和酶基因的双重转基因植物和表达Ig ASE1、裸藻属Δ8和被孢霉属Δ5去饱和酶基因的三重转基因植物的拟南芥植物的脂肪酸组成。分析来自簇生期(rosette stage)的拟南芥植物的叶子组织。各个值代表两次测定的平均。

所有的转基因都在35S-CaMV病毒启动子的控制下。用裸藻属Δ8-去饱和酶^mut175+313[T-DNA卡那霉素抗性]再转化具有SSU Rubisco转运序列的等鞭金藻属Δ9延长酶(IgASE1)[T-DNA Basta-r]。用被孢霉属Δ5去饱和酶(T-DNA潮霉素-r)再转化对于Basta-r和卡那霉素-r二者而言都是纯合的双转化株系。产生的三重转化株系对于Basta-r和卡那霉素-r二者而言是纯合的，但对于潮霉素-r而言是杂合的。

序列表

<110>巴斯福股份公司

<120>生产多不饱和脂肪酸的新方法

<130>2002_791

<140>2002_271

<141>2202-12-18

<160>10

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>1266

<212>DNA

<213>细小裸藻(Euglena gracilis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1266)

<223>delta-8-去饱和酶

<400>1

atg aag tca aag cgc caa gcg ctt ccc ctt aca att gat gga aca aca 48

Met Lys Ser Lys Arg Gln Ala Leu Pro Leu Thr Ile Asp Gly Thr Thr

1 5 10 15

tat gat gtg tct gcc tgg gtc aat ttc cac cct ggt ggt gcg gaa att 96

Tyr Asp Val Ser Ala Trp Val Asn Phe His Pro Gly Gly Ala Glu Ile

20 25 30

ata gag aat tac caa gga agg gat gcc act gat gcc ttc atg gtt atg 144

Ile Glu Asn Tyr Gln Gly Arg Asp Ala Thr Asp Ala Phe Met Val Met

35 40 45

cac tct caa gaa gcc ttc gac aag ctc aag cgc atg ccc aaa atc aat 192

His Ser Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Lys Arg Met Pro Lys Ile Asn

50 55 60

ccc agt tct gag ttg cca ccc cag gct gca gtg aat gaa gct caa gag 240

Pro Ser Ser Glu Leu Pro Pro Gln Ala Ala Val Asn Glu Ala Gln Glu

65 70 75 80

gat ttc cgg aag ctc cga gaa gag ttg atc gca act ggc atg ttt gat 288

Asp Phe Arg Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe Asp

85 90 95

gcc tcc ccc ctc tgg tac tca tac aaa atc agc acc aca ctg ggc ctt 336

Ala Ser Pro Leu Trp Tyr Ser Tyr Lys Ile Ser Thr Thr Leu Gly Leu

100 105 110

gga gtg ctg ggt tat ttc ctg atg gtt cag tat cag atg tat ttc att 384

Gly Val Leu Gly Tyr Phe Leu Met Val Gln Tyr Gln Met Tyr Phe Ile

115 120 125

ggg gca gtg ttg ctt ggg atg cac tat caa cag atg ggc tgg ctt tct 432

Gly Ala Val Leu Leu Gly Met His Tyr Gln Gln Met Gly Trp Leu Ser

130 135 140

cat gac att tgc cac cac cag act ttc aag aac cgg aac tgg aac aac 480

His Asp Ile Cys His His Gln Thr Phe Lys Asn Arg Asn Trp Asn Asn

145 150 155 160

ctc gtg gga ctg gta ttt ggc aat ggt ctg caa ggt ttt tcc gtg aca 528

Leu Val Gly Leu Val Phe Gly Asn Gly Leu Gln Gly Phe Ser Val Thr

165 170 175

tgc tgg aag gac aga cac aat gca cat cat tcg gca acc aat gtt caa 576

Cys Trp Lys Asp Arg His Asn Ala His His Ser Ala Thr Asn Val Gln

180 185 190

ggg cac gac cct gat att gac aac ctc ccc ctc tta gcc tgg tct gag 624

Gly His Asp Pro Asp Ile Asp Asn Leu Pro Leu Leu Ala Trp Ser Glu

195 200 205

gat gac gtc aca cgg gcg tca ccg att tcc cgc aag ctc att cag ttc 672

Asp Asp Val Thr Arg Ala Ser Pro Ile Ser Arg Lys Leu Ile Gln Phe

210 215 220

cag cag tat tat ttc ttg gtc atc tgt atc ttg ttg cgg ttc att tgg 720

Gln Gln Tyr Tyr Phe Leu Val Ile Cys Ile Leu Leu Arg Phe Ile Trp

225 230 235 240

tgt ttc cag agc gtg ttg acc gtg cgc agt ctg aag gac aga gat aac 768

Cys Phe Gln Ser Val Leu Thr Val Arg Ser Leu Lys Asp Arg Asp Asn

245 250 255

caa ttc tat cgc tct cag tat aag aag gag gcc att ggc ctc gcc ctg 816

Gln Phe Tyr Arg Ser Gln Tyr Lys Lys Glu Ala Ile Gly Leu Ala Leu

260 265 270

cat tgg aca ttg aag gcc ctg ttc cac tta ttc ttt atg ccc agc atc 864

His Trp Thr Leu Lys Ala Leu Phe His Leu Phe Phe Met Pro Ser Ile

275 280 285

ctc aca tcg ctg ttg gta ttt ttc gtt tcg gag ctg gtt ggc ggc ttc 912

Leu Thr Ser Leu Leu Val Phe Phe Val Ser Glu Leu Val Gly Gly Phe

290 295 300

ggc att gcg atc gtg gtg ttc atg aac cac tac cca ctg gag aag atc 960

Gly Ile Ala Ile Val Val Phe Met Asn His Tyr Pro Leu Glu Lys Ile

305 310 315 320

ggg gac tcg gtc tgg gat ggc cat gga ttc tcg gtt ggc cag atc cat 1008

Gly Asp Ser Val Trp Asp Gly His Gly Phe Ser Val Gly Gln Ile His

325 330 335

gag acc atg aac att cgg cga ggg att atc aca gat tgg ttt ttc gga 1056

Glu Thr Met Asn Ile Arg Arg Gly Ile Ile Thr Asp Trp Phe Phe Gly

340 345 350

ggc ttg sac tac cag atc gag cac cat ttg tgg ccg acc ctc cct cgc 1104

Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Trp Pro Thr Leu Pro Arg

355 360 365

cac aac ctg aca gcg gtt agc tac cag gtg gaa cag ctg tgc cag sag 1152

His Asn Leu Thr Ala Val Ser Tyr Gln Val Glu Gln Leu Cys Gln Lys

370 375 380

cac aac ctg ccg tat cgg aac ccg ctg ccc cat gaa ggg ttg gtc atc 1200

His Asn Leu Pro Tyr Arg Asn Pro Leu Pro His Glu Gly Leu Val Ile

385 390 395 400

ctg ctg cgc tat ctg gcg gtg ttc gcc cgg atg gcg gag aag caa ccc 1248

Leu Leu Arg Tyr Leu Ala Val Phe Ala Arg Met Ala Glu Lys Gln Pro

405 410 415

gcg ggg aag gct cta taa 1266

Ala Gly Lys Ala Leu

420

<210>2

<211>421

<212>PRT

<213>细小裸藻

<400>2

Met Lys Ser Lys Arg Gln Ala Leu Pro Leu Thr Ile Asp Gly Thr Thr

1 5 10 15

Tyr Asp Val Ser Ala Trp Val Asn Phe His Pro Gly Gly Ala Glu Ile

20 25 30

Ile Glu Asn Tyr Gln Gly Arg Asp Ala Thr Asp Ala Phe Met Val Met

35 40 45

His Ser Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Lys Arg Met Pro Lys Ile Asn

50 55 60

Pro Ser Ser Glu Leu Pro Pro Gln Ala Ala Val Asn Glu Ala Gln Glu

65 70 75 80

Asp Phe Arg Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe Asp

85 90 95

Ala Ser Pro Leu Trp Tyr Ser Tyr Lys Ile Ser Thr Thr Leu Gly Leu

100 105 110

Gly Val Leu Gly Tyr Phe Leu Met Val Gln Tyr Gln Met Tyr Phe Ile

115 120 125

Gly Ala Val Leu Leu Gly Met His Tyr Gln Gln Met Gly Trp Leu Ser

130 135 140

His Asp Ile Cys His His Gln Thr Phe Lys Asn Arg Asn Trp Asn Asn

145 150 155 160

Leu Val Gly Leu Val Phe Gly Asn Gly Leu Gln Gly Phe Ser Val Thr

165 170 175

Cys Trp Lys Asp Arg His Asn Ala His His Ser Ala Thr Asn Val Gln

180 185 190

Gly His Asp Pro Asp Ile Asp Asn Leu Pro Leu Leu Ala Trp Ser Glu

195 200 205

Asp Asp Val Thr Arg Ala Ser Pro Ile Ser Arg Lys Leu Ile Gln Phe

210 215 220

Gln Gln Tyr Tyr Phe Leu Val Ile Cys Ile Leu Leu Arg Phe Ile Trp

225 230 235 240

Cys Phe Gln Ser Val Leu Thr Val Arg Ser Leu Lys Asp Arg Asp Asn

245 250 255

Gln Phe Tyr Arg Ser Gln Tyr Lys Lys Glu Ala Ile Gly Leu Ala Leu

260 265 270

His Trp Thr Leu Lys Ala Leu Phe His Leu Phe Phe Met Pro Ser Ile

275 280 285

Leu Thr Ser Leu Leu Val Phe Phe Val Ser Glu Leu Val Gly Gly Phe

290 295 300

Gly Ile Ala Ile Val Val Phe Met Asn His Tyr Pro Leu Glu Lys Ile

305 310 315 320

Gly Asp Ser Val Trp Asp Gly His Gly Phe Ser Val Gly Gln Ile His

325 330 335

Glu Thr Met Asn Ile Arg Arg Gly Ile Ile Thr Asp Trp Phe Phe Gly

340 345 350

Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Trp Pro Thr Leu Pro Arg

355 360 365

His Asn Leu Thr Ala Val Ser Tyr Gln Val Glu Gln Leu Cys Gln Lys

370 375 380

His Asn Leu Pro Tyr Arg Asn Pro Leu Pro His Glu Gly Leu Val Ile

385 390 395 400

Leu Leu Arg Tyr Leu Ala Val Phe Ala Arg Met Ala Glu Lys Gln Pro

405 410 415

Ala Gly Lys Ala Leu

420

<210>3

<211>777

<212>DNA

<213>绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(777)

<223>delta-9-延长酶

<400>3

atg gcc ctc gca aac gac gcg gga gag cgc atc tgg gcg gct gtg acc 48

Met Ala Leu Ala Asn Asp Ala Gly Glu Arg Ile Trp Ala Ala Val Thr

1 5 10 15

gac ccg gaa atc ctc att ggc acc ttc tcg tac ttg cta ctc aaa ccg 96

Asp Pro Glu Ile Leu Ile Gly Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Pro

20 25 30

ctg ctc cgc aat tcc ggg ctg gtg gat gag aag aag ggc gca tac agg 144

Leu Leu Arg Asn Ser Gly Leu Val Asp Glu Lys Lys Gly Ala Tyr Arg

35 40 45

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Thr Ser Met Ile Trp Tyr Asn Val Leu Leu Ala Leu Phe Ser Ala Leu

50 55 60

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Ser Phe Tyr Val Thr Ala Thr Ala Leu Gly Trp Asp Tyr Gly Thr Gly

65 70 75 80

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Ala Trp Leu Arg Arg Gln Thr Gly Asp Thr Pro Gln Pro Leu Phe Gln

85 90 95

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Cys Pro Ser Pro Val Trp Asp Ser Lys Leu Phe Thr Trp Thr Ala Lys

100 105 110

gca ttc tat tac tcc aag tac gtg gag tac ctc gac acg gcc tgg ctg 384

Ala Phe Tyr Tyr Ser Lys Tyr Val Glu Tyr Leu Asp Thr Ala Trp Leu

115 120 125

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Arg Val Ser Phe Leu Gln Ala Phe His His Phe Gly Ala Pro Trp Asp

130 135 140

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145 150 155 160

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Phe Phe Asn Ser Phe Ile His Thr Ile Met Tyr Thr Tyr Tyr Gly Leu

165 170 175

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Thr Ala Ala Gly Tyr Lys Phe Lys Ala Lys Pro Leu Ile Thr Ala Met

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Phe Asn Tyr Ala Tyr Val Gly Ser Val Phe Leu Leu Phe Cys His Phe

225 230 235 240

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Phe Tyr Gln Asp Asn Leu Ala Thr Lys Lys Ser Ala Lys Ala Gly Lys

245 250 255

cag ctc tag 777

Gln Leu

<210>4

<211>258

<212>PRT

<213>绿光等鞭金藻

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Met Ala Leu Ala Asn Asp Ala Gly Glu Arg Ile Trp Ala Ala Val Thr

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Asp Pro Glu Ile Leu Ile Gly Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Pro

20 25 30

Leu Leu Arg Asn Ser Gly Leu Val Asp Glu Lys Lys Gly Ala Tyr Arg

35 40 45

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50 55 60

Ser Phe Tyr Val Thr Ala Thr Ala Leu Gly Trp Asp Tyr Gly Thr Gly

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Phe Phe Asn Ser Phe Ile His Thr Ile Met Tyr Thr Tyr Tyr Gly Leu

165 170 175

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180 185 190

Gln Ile Cys Gln Phe Val Gly Gly Phe Leu Leu Val Trp Asp Tyr Ile

195 200 205

Asn Val Pro Cys Phe Asn Ser Asp Lys Gly Lys Leu Phe Ser Trp Ala

210 215 220

Phe Asn Tyr Ala Tyr Val Gly Ser Val Phe Leu Leu Phe Cys His Phe

225 230 235 240

Phe Tyr Gln Asp Asn Leu Ala Thr Lys Lys Ser Ala Lys Ala Gly Lys

245 250 255

Gln Leu

<210>5

<211>1410

<212>DNA

<213>三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)

<220>

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<222>(1)..(1410)

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atg gct ccg gat gcg gat aag ctt cga caa cgc cag acg act gcg gta 48

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Phe Val Cys Glu Tyr Lys Phe Asp Thr Glu Phe Glu Arg Glu Ile Lys

100 105 110

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115 120 125

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Gly Trp Phe Phe Arg Ala Phe Cys Tyr Ile Ala Ile Phe Phe Tyr Leu

130 135 140

cag tac cat tgg gtc acc acg gga acc tct tgg ctg ctg gcc gtg gcc 480

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

ctt gac ctc cag caa cgc ggc gca ctt tcc gtc ggt atc cgt ctc gac 864

Leu Asp Leu Gln Gln Arg Gly Ala Leu Ser Val Gly Ile Arg Leu Asp

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Leu Glu Trp Ser Trp Arg Val Phe Gly Asn Ile Met Leu Met Gly Val

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340 345 350

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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Ala Ala Gly Thr Gly Ala Asn Trp Arg Gln Met Ala Arg Glu Asn Pro

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<210>6

<211>469

<212>PRT

<213>三角褐指藻

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Ala Lys His Asn Ala Ala Thr Ile Ser Thr Gln Glu Arg Leu Cys Ser

20 25 30

Leu Ser Ser Leu Lys Gly Glu Glu Val Cys Ile Asp Gly Ile Ile Tyr

35 40 45

Asp Leu Gln Ser Phe Asp His Pro Gly Gly Glu Thr Ile Lys Met Phe

50 55 60

Gly Gly Asn Asp Val Thr Val Gln Tyr Lys Met Ile His Pro Tyr His

65 70 75 80

Thr Glu Lys His Leu Glu Lys Met Lys Arg Val Gly Lys Val Thr Asp

85 90 95

Phe Val Cys Glu Tyr Lys Phe Asp Thr Glu Phe Glu Arg Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Glu Val Phe Lys Ile Val Arg Arg Gly Lys Asp Phe Gly Thr Leu

115 120 125

Gly Trp Phe Phe Arg Ala Phe Cys Tyr Ile Ala Ile Phe Phe Tyr Leu

130 135 140

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145 150 155 160

Tyr Gly Ile Ser Gln Ala Met Ile Gly Met Asn Val Gln His Asp Ala

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Ser Phe Gly Ala Glu Pro Met Leu Leu Phe Asn Asp Tyr Pro Leu Asp

225 230 235 240

His Pro Ala Arg Thr Trp Leu His Arg Phe Gln Ala Phe Phe Tyr Met

245 250 255

Pro Val Leu Ala Gly Tyr Trp Leu Ser Ala Val Phe Asn Pro Gln Ile

260 265 270

Leu Asp Leu Gln Gln Arg Gly Ala Leu Ser Val Gly Ile Arg Leu Asp

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Leu Glu Trp Ser Trp Arg Val Phe Gly Asn Ile Met Leu Met Gly Val

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Pro Val Asp Trp Phe Lys Thr Gln Val Glu Thr Ser Cys Thr Tyr Gly

370 375 380

Gly Phe Leu Ser Gly Cys Phe Thr Gly Gly Leu Asn Phe Gln Val Glu

385 390 395 400

His His Leu Phe Pro Arg Met Ser Ser Ala Trp Tyr Pro Tyr Ile Ala

405 410 415

Pro Lys Val Arg Glu Ile Cys Ala Lys His Gly Val His Tyr Ala Tyr

420 425 430

Tyr Pro Trp Ile His Gln Asn Phe Leu Ser Thr Val Arg Tyr Met His

435 440 445

Ala Ala Gly Thr Gly Ala Asn Trp Arg Gln Met Ala Arg Glu Asn Pro

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Leu Thr Gly Arg Ala

465

<210>7

<211>1344

<212>DNA

<213>角齿藓(ceratodon purpureus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1344)

<223>delta-5-去饱和酶

<400>7

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

gtt act ttc aat cat tat tca gtg gag aag ttt gca ttg agc tcg aac 1056

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340 345 350

atc atg tca aat tac gct tgt ctt caa atc atg acc aca aga aat atg 1104

Ile Met Ser Asn Tyr Ala Cys Leu Gln Ile Met Thr Thr Arg Asn Met

355 360 365

aga cct gga aga ttc att gac tgg ctt tgg gga ggt ctt aac tat cag 1152

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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Arg Asn Ile Ala Asn Val Ala Ala Lys Leu Thr Lys Lys Ile Ala

435 440 445

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<212>PRT

<213>角齿藓

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Gly Lys Trp Cys Gln Ile Asp Asp Ala Val Leu Arg Ser His Pro Gly

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Gly Ser Ala Ile Thr Thr Tyr Lys Asn Met Asp Ala Thr Thr Val Phe

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Asp Asp Pro Ile Lys Gly Ile Asp Asp Val Asn Met Gly Thr Phe Asn

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Arg Met Arg Val Arg Ala Glu Gly Leu Met Asp Gly Ser Pro Leu Phe

115 120 125

Tyr Ile Arg Lys Ile Leu Glu Thr Ile Phe Thr Ile Leu Phe Ala Phe

130 135 140

Tyr Leu Gln Tyr His Thr Tyr Tyr Leu Pro Ser Ala Ile Leu Met Gly

145 150 155 160

Val Ala Trp Gln Gln Leu Gly Trp Leu Ile His Glu Phe Ala His His

165 170 175

Gln Leu Phe Lys Asn Arg Tyr Tyr Asn Asp Leu Ala Ser Tyr Phe Val

180 185 190

Gly Asn Phe Leu Gln Gly Phe Ser Ser Gly Gly Trp Lys Glu Gln His

195 200 205

Asn Val His His Ala Ala Thr Asn Val Val Gly Arg Asp Gly Asp Leu

210 215 220

Asp Leu Val Pro Phe Tyr Ala Thr Val Ala Glu His Leu Asn Asn Tyr

225 230 235 240

Ser Gln Asp Ser Trp Val Met Thr Leu Phe Arg Trp Gln His Val His

245 250 255

Trp Thr Phe Met Leu Pro Phe Leu Arg Leu Ser Trp Leu Leu Gln Ser

260 265 270

Ile Ile Phe Val Ser Gln Met Pro Thr His Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Arg

275 280 285

Asn Thr Ala Ile Tyr Glu Gln Val Gly Leu Ser Leu His Trp Ala Trp

290 295 300

Ser Leu Gly Gln Leu Tyr Phe Leu Pro Asp Trp Ser Thr Arg Ile Met

305 310 315 320

Phe Phe Leu Val Ser His Leu Val Gly Gly Phe Leu Leu Ser His Val

325 330 335

Val Thr Phe Asn His Tyr Ser Val Glu Lys Phe Ala Leu Ser Ser Asn

340 345 350

Ile Met Ser Asn Tyr Ala Cys Leu Gln Ile Met Thr Thr Arg Asn Met

355 360 365

Arg Pro Gly Arg Phe Ile Asp Trp Leu Trp Gly Gly Leu Asn Tyr Gln

370 375 380

Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu Asn Thr

385 390 395 400

Val Met Pro Leu Val Lys Glu Phe Ala Ala Ala Asn Gly Leu Pro Tyr

405 410 415

Met Val Asp Asp Tyr Phe Thr Gly Phe Trp Leu Glu Ile Glu Gln Phe

420 425 430

Arg Asn Ile Ala Asn Val Ala Ala Lys Leu Thr Lys Lys Ile Ala

435 440 445

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<211>1443

<212>DNA

<213>展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)

<220>

<221>CDS

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<400>9

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35 40 45

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50 55 60

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Ile Pro Asn His Pro Gly Gly Ser Leu Ile His Val Lys Ala Gly Gln

65 70 75 80

gat tcc act cag ctt ttc gat tcc tat cac ccc ctt tat gtc agg aaa 288

Asp Ser Thr Gln Leu Phe Asp Ser Tyr His Pro Leu Tyr Val Arg Lys

85 90 95

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100 105 110

gac aag ttt aag aaa gca act ctg rag tat gca gat gcc gaa aat gaa 384

Asp Lys Phe Lys Lys Ala Thr Leu Xaa Tyr Ala Asp Ala Glu Asn Glu

115 120 125

gat ttc tat ttg gtt gtg aag caa cga gtt gaa tct tat ttc aag agt 432

Asp Phe Tyr Leu Val Val Lys Gln Arg Val Glu Ser Tyr Phe Lys Ser

130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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Phe Ala Ala Glu Val Gly Val Ser Ile Gln His Asp Gly Asn His Gly

195 200 205

tca tac act aaa tgg cgt ggc ttt gga tat atc atg gga gcc tcc cta 672

Ser Tyr Thr Lys Trp Arg Gly Phe Gly Tyr Ile Met Gly Ala Ser Leu

210 215 220

gat cta gtc gga gcc agt agc ttc atg tgg aga cag caa cac gtt gtg 720

Asp Leu Val Gly Ala Ser Ser Phe Met Trp Arg Gln Gln His Val Val

225 230 235 240

gga cat cac tcg ttt aca aat gtg gac aac tac gat cct gat att cgt 768

Gly His His Ser Phe Thr Asn Val Asp Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Arg

245 250 255

gtg aaa gat cca gat gtc agg agg gtt gcg acc aca caa cca aga caa 816

Val Lys Asp Pro Asp Val Arg Arg Val Ala Thr Thr Gln Pro Arg Gln

260 265 270

tgg tat cat gcg tat cag cat atc tac ctg gca gta tta tat gga act 864

Trp Tyr His Ala Tyr Gln His Ile Tyr Leu Ala Val Leu Tyr Gly Thr

275 280 285

cta gct ctt aag agt att ttt cta gat gat ttc ctt gcg tac ttc aca 912

Leu Ala Leu Lys Ser Ile Phe Leu Asp Asp Phe Leu Ala Tyr Phe Thr

290 295 300

gga tca att ggc cct gtc aag gtg gcg aaa atg acc ccc ctg gag ttc 960

Gly Ser Ile Gly Pro Val Lys Val Ala Lys Met Thr Pro Leu Glu Phe

305 310 315 320

aac atc ttc ttt cag gga aag ctg cta tat gcg ttc tac atg ttc gtg 1008

Asn Ile Phe Phe Gln Gly Lys Leu Leu Tyr Ala Phe Tyr Met Phe Val

325 330 335

ttg cca tct gtg tac ggt gtt cac tcc gga gga act ttc ttg gca cta 1056

Leu Pro Ser Val Tyr Gly Val His Ser Gly Gly Thr Phe Leu Ala Leu

340 345 350

tat gtg gct tct cag ctc att aca ggt tgg atg tta gct ttt ctt ttt 1104

Tyr Val Ala Ser Gln Leu Ile Thr Gly Trp Met Leu Ala Phe Leu Phe

355 360 365

caa gta gca cat gtc gtg gat gat gtt gca ttt cct aca cca gaa ggt 1152

Gln Val Ala His Val Val Asp Asp Val Ala Phe Pro Thr Pro Glu Gly

370 375 380

ggg aag gtg aag gga gga tgg gct gca atg cag gtt gca aca act acg 1200

Gly Lys Val Lys Gly Gly Trp Ala Ala Met Gln Val Ala Thr Thr Thr

385 390 395 400

gat ttc agt cca cgc tca tgg ttc tgg ggt cat gtc tct gga gga tta 1248

Asp Phe Ser Pro Arg Ser Trp Phe Trp Gly His Val Ser Gly Gly Leu

405 410 415

aac aac caa att gag cat cat ctg ttt cca gga gtg tgc cat gtt cat 1296

Asn Asn Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Gly Val Cys His Val His

420 425 430

tat cca gcc att cag cct att gtc gag aag acg tgc aag gaa ttc gat 1344

Tyr Pro Ala Ile Gln Pro Ile Val Glu Lys Thr Cys Lys Glu Phe Asp

435 440 445

gtg cct tat gta gcc tac cca act ttt tgg act gcg ttg aga gcc cac 1392

Val Pro Tyr Val Ala Tyr Pro Thr Phe Trp Thr Ala Leu Arg Ala His

450 455 460

ttt gcg cat ttg aaa aag gtt gga ttg aca gag ttt cgg ctc gat ggc 1440

Phe Ala His Leu Lys Lys Val Gly Leu Thr Glu Phe Arg Leu Asp Gly

465 470 475 480

tga 1443

<210>10

<211>480

<212>PRT

<213>展叶剑叶藓

<400>10

Met Ala Pro His Ser Ala Asp Thr Ala Gly Leu Val Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Leu Arg Leu Arg Thr Ser Asn Ser Lys Gly Pro Glu Gln Glu Gln Thr

20 25 30

Leu Lys Lys Tyr Thr Leu Glu Asp Val Ser Arg His Asn Thr Pro Ala

35 40 45

Asp Cys Trp Leu Val Ile Trp Gly Lys Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp

50 55 60

Ile Pro Asn His Pro Gly Gly Ser Leu Ile His Val Lys Ala Gly Gln

65 70 75 80

Asp Ser Thr Gln Leu Phe Asp Ser Tyr His Pro Leu Tyr Val Arg Lys

85 90 95

Met Leu Ala Lys Tyr Cys Ile Gly Glu Xaa Val Pro Ser Ala Gly Asp

100 105 110

Asp Lys Phe Lys Lys Ala Thr Leu Xaa Tyr Ala Asp Ala Glu Asn Glu

115 120 125

Asp Phe Tyr Leu Val Val Lys Gln Arg Val Glu Ser Tyr Phe Lys Ser

130 135 140

Asn Lys Ile Asn Pro Gln Ile His Pro His Met Ile Leu Lys Ser Leu

145 150 155 160

Phe Ile Leu Gly Gly Tyr Phe Ala Ser Tyr Tyr Leu Ala Phe Phe Trp

165 170 175

Ser Ser Ser Val Leu Val Ser Leu Phe Phe Ala Leu Trp Met Gly Phe

180 185 190

Phe Ala Ala Glu Val Gly Val Ser Ile Gln His Asp Gly Asn His Gly

195 200 205

Ser Tyr Thr Lys Trp Arg Gly Phe Gly Tyr Ile Met Gly Ala Ser Leu

210 215 220

Asp Leu Val Gly Ala Ser Ser Phe Met Trp Arg Gln Gln His Val Val

225 230 235 240

Gly His His Ser Phe Thr Asn Val Asp Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Arg

245 250 255

Val Lys Asp Pro Asp Val Arg Arg Val Ala Thr Thr Gln Pro Arg Gln

260 265 270

Trp Tyr His Ala Tyr Gln His Ile Tyr Leu Ala Val Leu Tyr Gly Thr

275 280 285

Leu Ala Leu Lys Ser Ile Phe Leu Asp Asp Phe Leu Ala Tyr Phe Thr

290 295 300

Gly Ser Ile Gly Pro Val Lys Val Ala Lys Met Thr Pro Leu Glu Phe

305 310 315 320

Asn Ile Phe Phe Gln Gly Lys Leu Leu Tyr Ala Phe Tyr Met Phe Val

325 330 335

Leu Pro Ser Val Tyr Gly Val His Ser Gly Gly Thr Phe Leu Ala Leu

340 345 350

Tyr Val Ala Ser Gln Leu Ile Thr Gly Trp Met Leu Ala Phe Leu Phe

355 360 365

Gln Val Ala His Val Val Asp Asp Val Ala Phe Pro Thr Pro Glu Gly

370 375 380

Gly Lys Val Lys Gly Gly Trp Ala Ala Met Gln Val Ala Thr Thr Thr

385 390 395 400

Asp Phe Ser Pro Arg Ser Trp Phe Trp Gly His Val Ser Gly Gly Leu

405 410 415

Asn Asn Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Gly Val Cys His Val His

420 425 430

Tyr Pro Ala Ile Gln Pro Ile Val Glu Lys Thr Cys Lys Glu Phe Asp

435 440 445

Val Pro Tyr Val Ala Tyr Pro Thr Phe Trp Thr Ala Leu Arg Ala His

450 455 460

Phe Ala His Leu Lys Lys Val Gly Leu Thr Glu Phe Arg Leu Asp Gly

465 470 475 480

Claims

1. 在转基因植物中生产以下通式I化合物的方法

其中，在该转基因植物中，按重量计，所述化合物的含量占所述植物体的总脂质含量的至少1％，

所述方法包括：

a)将至少一种编码Δ-9-延长酶的核酸序列引入转基因植物体，

b)引入至少一种编码Δ-8-去饱和酶的第二核酸序列，和

c)培养并收获所说的植物体；

其中式I中的变量和取代基具有以下含义：

R¹＝羟基-、辅酶A-硫酯、磷脂酰胆碱-、磷脂酰乙醇胺-、磷脂酰甘油-、二磷脂酰甘油-、磷脂酰丝氨酸-、磷脂酰肌醇-、鞘脂-、鞘糖脂-或通式II的基团：

R²＝氢-、磷脂酰胆碱-、磷脂酰乙醇胺-、磷脂酰甘油-、二磷脂酰甘油-、磷脂酰丝氨酸-、磷脂酰肌醇-、鞘脂-、鞘糖脂-、鞘糖脂-或饱和或不饱和的C₂-C₂₄-烷基羰基，

R³＝氢-、饱和或不饱和的C₂-C₂₄-烷基羰基-、或R²和R³相互独立地是式Ia的基团：

n＝3、4或6，m＝3、4或5且p＝0或3；

所述编码Δ-8-去饱和酶、Δ-9-延长酶的核酸序列选自：

a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3中所示核酸序列；

b)根据遗传密码简并性，衍生自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3中所示序列的核酸序列。

2. 权利要求1的方法，其中步骤b)还包括引入至少一种编码Δ-5-去饱和酶的第三核酸序列，所述编码Δ-5-去饱和酶的第三核酸序列选自：

a)SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中所示核酸序列，

b)根据遗传密码简并性，衍生自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中所示序列的核酸序列。

3. 权利要求1的方法，其中取代基R²和R³彼此独立地是饱和或不饱和C₁₀-C₂₂-烷基羰基-。

4. 权利要求3的方法，其中取代基R2和R³彼此独立地是饱和或不饱和C₁₆-、C₁₈-、C₂₀-或C₂₂-烷基羰基-。

5. 权利要求4的方法，其中取代基R²和R³彼此独立地是具有至少三个双键的不饱和C₁₆-、C₁₈-、C₂₀-或C₂₂-烷基羰基-。

6. 权利要求1的方法，其中的转基因植物是产油植物。

7. 权利要求6的方法，其中的转基因植物选自：油籽油菜、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、胡麻、橄榄、金盏花、punica、榛子、杏、澳洲坚果、鳄梨、南瓜、胡桃、月桂、阿月浑子、报春花、canola、花生、亚麻籽、大豆、红花、向日葵和琉璃苣。

8. 权利要求1的方法，其中通式I的化合物以其游离脂肪酸的油、脂质形式被分离。

9. 权利要求1的方法，其中通式I的化合物以占总脂质含量至少5％重量的浓度被分离。