ES2427017T3 - Genes de la PKS de Schizochytrium - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico o porción de la misma seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº71, SEC ID Nº 69 y SEC ID Nº 76, en la que la secuencia de ácido nucleico o porción de la misma codifica unasecuencia de aminoácidos que tiene al menos una actividad de gen de síntesis de tipo policétidos (de tipo PKS); o (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos o porción de la misma seleccionadadel grupo que consiste en las SEC ID Nº 72 SEC ID Nº 70 y SEC ID Nº 73, en la que la secuencia de aminoácidos oporción de la misma tiene al menos una actividad de gen de síntesis de tipo policétidos (de tipo PKS).

Description

Genes de la PKS de Schizochytrium

5 Introducción

Campo de la invención

La presente invención se refiere a niveles de modulación de enzimas y/o componentes enzimáticos capaces de modificar los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA) en una célula huésped y a construcciones y a métodos para producir PUFA en una célula huésped. La invención se ejemplifica mediante la producción de ácido eicosapentenoico (EPA) usando genes derivados de Shewanella putrefaciens y de Vibrio marinus.

Antecedentes

15 Existen dos familias principales de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) que son los ácidos grasos ω3, ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico y los ácidos grasos ω6, ejemplificados por el ácido araquidónico. Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de las células, en donde pueden hallarse en formas tales como los fosfolípidos y también se pueden encontrar en triglicéridos. Los PUFA también sirven como precursores de otras moléculas importantes en los seres humanos y animales, incluyendo las prostaciclinas, los leucotrienos y las prostaglandinas. Los PUFA de cadena larga principales incluyen el ácido docosahexaenoico (DHA) y el ácido eicosapentanoico (EPA), que se hallan primordialmente en diferentes tipos de aceites de pescado, el ácido gammalinolénico (GLA), que se halla en las semillas de un cierto número de plantas, incluyendo la onagra (Oenothera biennis), la borraja (Borago officinalis) y el grosellero negro (Ribes nigrum) y el ácido estearidónico

25 (SDA), que se encuentra en aceites marinos y semillas de plantas y el ácido araquidónico, que junto con el GLA se halla en los hongos filamentosos. El ARA puede purificarse a partir de tejidos animales, incluyendo el hígado y la glándula suprarrenal. Varios géneros de bacterias marinas sintetizan EPA o DHA. El DHA está presente en la leche humana junto con el ARA.

Los PUFA son necesarios para un correcto desarrollo, particularmente en el cerebro en desarrollo de los niños y para la formación y reparación de tejidos. Como ejemplo, el DHA es un importante constituyente de muchas membranas celulares humanas, en particular de las células nerviosas (materia gris), células musculares y espermatozoides y se cree que afecta al desarrollo de las funciones cerebrales en general y es esencial para el desarrollo de la visión. El EPA y el DHA tienen una serie de usos nutricionales y farmacológicos. Como ejemplo los

35 adultos afectados por diabetes (especialmente los no insulinodependientes) muestran deficiencias y desequilbrios en sus niveles de DHA que se cree que contribuyen a afecciones coronarias posteriores. Por tanto, una dieta equilibrada con DHA puede ser beneficiosa para los diabéticos.

Para el DHA, existen numerosas fuentes para la producción comercial incluidos diversos organismos marinos, aceites obtenidos a partir de peces marinos de aguas frías y fracciones de la yema del huevo. La purificación del DHA a partir de fuentes de peces es relativamente cara debido a dificultades técnicas, lo que hace del DHA algo caro y escaso. En algas tales como Amphidinium y Schizochytrium y hongos marinos tales como Thraustochytrium el DHA puede representar hasta el 48 % del contenido en ácidos grasos de la célula. También se ha notificado que unas pocas bacterias producen DHA. Estas son en general bacterias de las profundidades marinas tales como Vibrio

45 marinus. Para ARA, pueden usarse para su producción comercial microorganismos incluyendo los géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros Trichodesma y Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen la onagra, el grosellero negro y la borraja. Sin embargo, hay varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFA a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceites altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes pueden por tanto requerir purificación extensa para separar uno o más PUFA deseados, o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFA deseados.

Las fuentes naturales están sometidas también a fluctuaciones incontrolables en su disponibilidad. Las reservas de peces pueden experimentar variaciones naturales o pueden agotarse por sobrepesca. Los aceites animales y

55 particularmente los aceites de peces, pueden acumular contaminantes medioambientales. El tiempo y las enfermedades pueden causar fluctuaciones en los rendimientos de ambas fuentes, peces y plantas. La tierra cultivable disponible para la producción de cultivos alternativos productores de aceites está sometida a la competición procedente de la continua expansión de las poblaciones humanas y de la creciente necesidad asociada a la producción de alimentos en las tierras arables que quedan. Los cultivos que sí producen PUFA, tales como la borraja, no han sido adaptados al crecimiento comercial y pueden no comportarse bien en monocultivo. El crecimiento de tales cultivos es por tanto económicamente no competitivo cuando pueden cultivarse cultivos más provechosos y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Shewanella también es cara. Los tejidos animales naturales contienen cantidades bajas de ARA y son difíciles de procesar. Los microorganismos tales como Porphyridium y Shewanella son difíciles de cultivar a escala comercial.

65 Los suplementos dietarios y las formulaciones farmacéuticas que contienen PUFA pueden retener las desventajas de la fuente de PUFA. Los suplementos tales como las cápsulas de aceite de pescado pueden contener niveles bajos del componente concreto deseado y por tanto requerir dosis elevadas. Las dosis elevadas dan lugar a la ingestión de niveles elevados de componentes no deseados, incluyendo contaminantes. Debe tenerse cuidado al proporcionar suplementos de ácidos grasos, puesto que la sobreadición puede dar lugar a la supresión de las rutas

5 biosintéticas endógenas y conducir a una competición con otros ácidos grasos necesarios en varias fracciones de lípidos in vivo, conduciendo a resultados no deseables. Por ejemplo, los esquimales que tienen una dieta rica en ácidos grasos ω3 tienen una tendencia incrementada a sangrar (Patente estadounidense nº 4.874.603). Los aceites de pescado tienen sabores y olores desagradables, que pueden ser imposibles de separar, en términos económicos, del producto deseado, tal como suplementos alimenticios. Los sabores y olores desagradables de los suplementos pueden hacer indeseables regímenes tales que implican el suplemento y pueden inhibir la conformidad por parte del paciente.

Se ha identificado un número de enzimas que están implicadas en la biosíntesis de los PUFA. El ácido linoleico (LA,

18:2 Δ 9, 12) se produce a partir del ácido oleico (18:1 Δ9) mediante una Δ12-desaturasa. El GLA (18:3 Δ 6, 9, 12) se

15 produce a partir del ácido linoleico (LA, 18:2 Δ9, 12) mediante una Δ6-desaturasa. El ARA (20:4 Δ 5, 8, 11, 14) se produce a partir de DGLA (20:3 Δ 8, 11, 14), catalizada por una Δ5-desaturasa. El ácido eicosapentenoico (EPA) es un ácido graso omega 3 de 20 átomos de carbono que contiene 5 dobles enlaces (Δ 5, 8, 11, 14, 17), todos ellos en configuración cis. El EPA y el DHA relacionado (Δ 4, 7, 10, 13, 16, 19, C22:6) se producen a partir del ácido oleico mediante una serie de reacciones de elongación y desaturación. Adicionalmente, se necesita una elongasa (o elongasas) para prolongar los PUFA de 18 carbonos hasta longitudes de 20 y 22 carbonos. No obstante, los animales no pueden convertir el ácido oleico (18:1 Δ 9) en ácido linoleico (18:2 Δ 9, 12). Asimismo, los mamíferos no pueden sintetizar el ácido μ-linolénico (ALA, 18:3 Δ 9, 12, 15). Otros eucariotas, incluyendo los hongos y las plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones Δ12 y Δ15. Por tanto, los principales ácidos grasos poliinsaturados de los animales se derivan de la dieta y/o de la desaturación y elongación del ácido linoleico (18:2 Δ 9, 12) o del

25 ácido μ-linolénico (18:3 Δ 9, 12, 15).

Los ácidos grasos poliinsaturados se consideran que son útiles para fines nutricionales, farmacéuticos, industriales y otros. Un suministro expansivo de ácidos grasos poliinsaturados a partir de fuentes naturales y de síntesis química no es suficiente para las necesidades comerciales. Debido a que se requiere un número de enzimas desaturasas y elongasas distintas para la síntesis de ácidos grasos a partir de ácido linoleico (LA, 18:2 Δ 9, 12), común en la mayoría de las especies vegetales, para los PUFA más saturados y de cadena más larga, la ingeniería en células huésped vegetales para la expresión de EPA y DHA puede requerir la expresión de cinco o seis actividades enzimáticas distintas para conseguir la expresión, al menos para EPA y DHA y para la producción de cantidades de tales PUFA adicionales pueden ser necesarios esfuerzos de modificación por ingeniería adicionales, por ejemplo, la

35 regulación a la baja de enzimas que compiten por el sustrato, la modificación por ingeniería de actividades enzimáticas más altas tal como mediante mutagénesis o dirigiendo las enzimas a orgánulos plastídicos. Por tanto es de interés obtener material genético implicado en la biosíntesis de PUFA a partir de especies que producen de forma natural estos ácidos grasos y expresar el material aislado solo o en combinación en un sistema heterólogo que se pueda manipular para permitir la producción de cantidades comerciales de PUFA.

Bibliografía relevante

Se han identificado varios géneros de bacterias marinas que sintetizan EPA o DHA (DeLong y Yayanos, Applied and Environmental Microbiology (1986) 51: 730-737). Los investigadores del Sagami Chemical Research Institute han

45 notificado la producción de EPA en E. coli que se ha transformado con un clúster génico a partir de la bacteria marina Shewanella putrefaciens. Para la síntesis de ácidos grasos de EPA en E. coli se necesita un mínimo de 5 marcos de lectura abiertos (ORF). Hasta la fecha no se ha notificado la caracterización extensa de las funciones de las proteínas codificadas por estos genes (Yazawa (1996) Lipids 31, S-297; documento WO 93/23545; documento WO 96/21735).

La secuencia proteica del marco de lectura abierto (ORF) 3 como publica Yazawa, patente de EE.UU. nº 5.683.898 no es una proteína funcional. Yazawa define la proteína como iniciadora en el codón de la metionina en los nucleótidos 9016-9014 del clúster de tipo PKS de Shewanella (número de acceso en Genbank U73935) y termina en el codón de terminación en los nucleótidos 8185-8183 del clúster de tipo PKS de Shewanella. No obstante, cuando

55 este ORF se expresa sometido al control de un promotor heterólogo en una cepa de E. coli que contiene todo el clúster de tipo PKS, a excepción del ORF3, las células recombinantes no producen EPA.

Los policétidos son metabolitos secundarios cuya síntesis implica un conjunto de reacciones enzimáticas análogas a las de los ácidos grasos (véanse las revisiones: Hopwood y Sherman, Annu. Rev. Genet. (1990) 24: 37-66 y Katz y Donadio, en Annual Review of Microbiology (1993) 47: 875-912). Se ha propuesto el uso de policétido sintasas para producir nuevos antibióticos (Hutchinson y Fujii, Annual Review of Microbiology (1995) 49: 201-238).

Sumario de la invención

65 Se proporcionan nuevas composiciones y métodos para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados de cadena

larga (PUFA) usando genes para la síntesis de tipo policétidos (tipo PKS) en plantas y células vegetales. En contraste con los métodos conocidos y propuestos para la producción de PUFA por medio de genes de síntesis de ácidos grasos, mediante la invención se proporcionan construcciones y métodos para producir PUFA usando genes de un sistema de tipo PKS. Los métodos implican el crecimiento de una célula huésped de interés transformada con 5 un casete de expresión funcional en la célula huésped, comprendiendo el casete de expresión una región reguladora del inicio de la transcripción y la traducción, unida en un marco de lectura en 5’ a una secuencia de ADN a un gen o componente de un sistema de tipo PKS capaz de modular la producción de PUFA (gen de tipo PKS). Una alteración en el perfil de los PUFA de las células huésped se consigue mediante la expresión tras la introducción de un sistema de tipo PKS completo responsable de la biosíntesis de un PUFA en células huésped. La invención encuentra utilidad

10 en, por ejemplo, la producción a gran escala de DHA y EPA y para la modificación del perfil de ácidos grasos de las células huésped y tejidos de plantas comestibles y/o partes de plantas.

Breve descripción de las figuras

15 La figura 1 proporciona designaciones para los ORF del clúster del gen de EPA de Shewanella. La figura 1A muestra la organización de los genes; se enumeran los ORF esenciales para la producción de EPA en E. coli. La figura 1B muestra las designaciones dadas a los subclones.

La figura 2 proporciona la estructura del dominio de tipo PKS, motivos y correspondencias en 'Blast' del ORF 6

20 (figura 2A), el ORF 7 (figura 2B), el ORF 8 (figura 2C), el ORF 9 (figura 2D) y el ORF 3 (figura 2E). La figura 2F muestra la estructura de la región del cromosoma de Anabeana que está relacionada con los dominios presentes en los ORF para EPA de Shewanella.

La figura 3 muestra los resultados para la pantetenilación-ORF 3 en la cepa SJ16 de E. coli. La imagen muestra

25 proteínas marcadas con [C14] β-alanina de células de E. coli (cepa SJ16) transformadas con plásmidos de la lista. La calle 1 representa pUC19, la calle 2 representa pPA-NEB (Δ ORF 3), la calle 3 representa pAA-Neb (EPA+), la calle 4 representa el subclón del ORF 6, la calle 5 representa los subclones de ORF 6 + ORF 3 y la calle 6 representa el subclón de ORF 3. La ACP y una proteína de 35 kDa desconocida (pero observada previamente) se marcaron en todas las muestras. Las proteínas de alta masa molecular detectadas en las calles 2 y 5 son productos de longitud

30 completa (banda más grande) y truncados del gen de ORF-6 de Shewanella (confirmado mediante análisis Western). La cepa SJ16 de E. coli está bloqueada condicionalmente en la síntesis de la β-alanina.

La figura 4A muestra la secuencia del ADN (SEC ID Nº 1) para el clúster de tipo PKS encontrado en Shewanella, que contiene los ORF 3-9. La figura 4B muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 2) del ORF 2 que está 35 codificada por los nucleótidos 6121-8103 de la secuencia mostrada en la figura 4A. La figura 4C muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 3) del ORF3 inactivo publicado, traducida de la hebra complementaria a la mostrada en la figura 4A, los nucleótidos 9016-8186. La figura 4D muestra la secuencia de nucleótidos 8186-9157 (SEC ID Nº 4); su hebra complementaria codifica el ORF3 activo en la síntesis de EPA. Las figuras 4E-J muestran las secuencias de aminoácidos (SEC ID Nº 5-10) correspondientes a los ORF 4-9, que están codificados por los

40 nucleótidos 9681-12590 (SEC ID Nº 81), 13040-13903 (SEC ID Nº 82), 13906-22173 (SEC ID Nº :83), 22203-24515 (SEC ID Nº 84), 24518-30529 (SEC ID Nº 85) y 30730-32358 (SEC ID Nº 86), respectivamente, de la figura 4A. La figura 4K muestra la secuencia de aminoácidos de Nod2 (SEC ID Nº 11) correspondiente a los nucleótidos 3283434327.

45 La figura 5 muestra la secuencia (SEC ID Nº 12) para el clúster de tipo PKS en un fragmento de ADN de aproximadamente 40 kb de Vibrio marinus, que contiene los ORF 6, 7, 8 y 9. Los codones de iniciación y terminación para cada ORF son los siguientes: ORF 6: 17394, 25352; ORF 7: 25509, 28160; ORF 8: 28209, 34265; ORF 9: 34454, 36118.

50 La figura 6 muestra la secuencia (SEC ID Nº 13) para una porción de aproximadamente 19 kb del clúster de tipo PKS de la figura 5, que contiene los ORF 6, 7, 8 y 9. Los codones de iniciación y terminación para cada ORF son los siguientes: ORF 6:411, 8369 (SEC ID Nº 77); ORF 7: 8526, 11177 (SEC ID Nº 78); ORF 8: 11226, 17282 (SEC ID Nº 79); ORF 9:17471, 19135 (SEC ID Nº 80).

55 La figura 7 muestra una comparación de los clúster génicos de tipo PKA de Shewanella putrefaciens y Vibrio marinus; la figura 7B es la secuencia del operón de Vibrio marinus.

La figura 8 es una vista expandida de la porción del clúster génico de tipo PKS de Vibrio marinus mostrado en la figura 7B que muestra que los ORF 6, 7 y 8 están en el marco de lectura 2, mientras que el ORF 9 está en el marco

60 de lectura 3.

La figura 9 demuestra la homología de secuencia del ORF 6 de Shewanella putrefaciens y Vibrio marinus. El ORF 6 de Shewanella se representa en el eje vertical y el ORF 6 de Vibrio se representa en el eje horizontal. Las líneas indican regiones de las proteínas que tienen una identidad del 60 %. Las líneas repetidas en el medio corresponden

65 a los múltiples dominios de ACP encontrados en el ORF 6.

La figura 10 demuestra la homología de secuencia del ORF 7 de Shewanella putrefaciens y Vibrio marinus. El ORF 7 de Shewanella se representa en el eje vertical y el ORF 7 de Vibrio se representa en el eje horizontal. Las líneas indican regiones de las proteínas que tienen una identidad del 60 %.

5 La figura 11 demuestra la homología de secuencia del ORF 8 de Shewanella putrefaciens y Vibrio marinus. El ORF 8 de Shewanella se representa en el eje vertical y el ORF 8 de Vibrio se representa en el eje horizontal. Las líneas indican regiones de las proteínas que tienen una identidad del 60 %.

La figura 12 demuestra la homología de secuencia del ORF 9 de Shewanella putrefaciens y Vibrio marinus. El ORF 9 de Shewanella se representa en el eje vertical y el ORF 9 de Vibrio se representa en el eje horizontal. Las líneas indican regiones de las proteínas que tienen una identidad del 60 %.

La figura 13 es una representación de varios experimentos de complementación y la producción resultante de PUFA. A la derecha se muestra el PUFA más largo fabricado en la cepa de E. coli que contiene los genes de Vibrio y

15 Shewanella representados a la izquierda. Los recuadros huecos indican los ORF de Shewanella. Los recuadros llenos indican los ORF de Vibrio.

La figura 14 es un cromatograma que muestra la producción de ácidos grasos a partir de la complementación de pEPAD8 de Shewanella (deleción de ORF 8) con el ORF 8 de Shewanella, en E. coli Fad E-. El cromatograma presenta un pico del EPA (20:5).

La FIGURA 15 es un cromatograma que muestra la producción de ácidos grasos a partir de la complementación de pEPAD8 de Shewanella (deleción de ORF 8) con el ORF 8 de Vibrio marinus, en E. coli Fad E-. El cromatograma presenta picos del EPA (20:5).y DHA (22:6)

25 La figura 16 es una tabla de los valores de PUFA del experimento de complementación del ORF 8, cuyo cromatograma se muestra en la figura 15.

La figura 17 es un mapa del plásmido que muestra los elementos de pCGN7770.

La figura 18 es un mapa del plásmido que muestra los elementos de pCGN8535.

La figura 19 es un mapa del plásmido que muestra los elementos de pCGN8537.

35 La figura 20 es un mapa del plásmido que muestra los elementos de pCGN8525.

La figura 21 es una comparación de los ORF de Shewanella definidos por Yazawa (1996) supra y los divulgados en la figura 4. Cuando una proteína que se inicia en el codón de la leucina (TTG) en los nucleótidos 9157-9155 y termina en el codón de terminación en los nucleótidos 8185-8183 se expresa sometida al control de un promotor heterólogo en una cepa de E. coli que contiene todo el clúster de tipo PKS a excepción del ORF 3, las células recombinantes producen EPA. Por tanto, es probable que la secuencia publicada de la proteína sea incorrecta y la secuencia de codificación para la proteína puede comenzar en el codón TTG en los nucleótidos 9157-9155 o el codón TTG en los nucleótidos 9172-9170. Esta información es crucial para la expresión de un sistema heterólogo del clúster de tipo PKS funcional.

45 La figura 22 es un mapa del plásmido que muestra los elementos de pCGN8560.

La figura 23 es un mapa del plásmido que muestra los elementos de pCGN8556.

La figura 24 muestra la secuencia de ADN traducida (SEC ID Nº 14) cadena arriba del ORF 3 publicado y los correspondientes aminoácidos que codifican (SEC ID Nº 15). El codón de iniciación ATG en la posición 9016 es el codón de iniciación para la proteína descrita por Yazawa y col. (1996) supra. Las otras flechas representan los codones TTG o ATT que también pueden servir como codones de iniciación en bacterias. Cuando el OTF 3 se inicia a partir del codón ATG publicado en 9016, la proteína no es funcional para sintetizar EPA. Cuando el ORF 3 se inicia

55 a partir del codón TTG en la posición 9157, la proteína es capaz de facilitar la síntesis de EPA.

La figura 25 muestra el producto de la PCR (SEC ID Nº 16) para SS9 Photobacter usando los cebadores del Ejemplo

1.

La figura 26 muestra las secuencias de las sondas (SEC ID Nº 17-31) resultantes de la PCR con cebadores presentados en el Ejemplo 1.

La figura 27 muestra la secuencia de nucleótidos de los clones EST de Schizochytrium A. LIB 3033-047-B5, LIB3033-046-E6 y un producto de unión de PCR que se han ensamblado ahora en una secuencia parcial de ADNc 65 (homóloga de ORF6), B. LIB3033-046-D2 (homólogo de hgle/ORF7/ORF8/ORF9), C. LIB81-015-D5, LIB81-042-B9 y un producto de unión de PCR que se han ensamblado ahora en una secuencia de ADNc parcial (homóloga de

ORF8/ORF9).

La figura 28 muestra un esquema de las similitudes entre las secuencias de PKS de Shewanella y las secuencias de Schizochytrium.

5 La figura 29 muestra las secuencias de aminoácidos deducidas de los clones EST de Schizochytrium A. homólogo de ORF 6, B. homólogo de hglc/ORF7/ORF8/ORF9, C. homólogo de ORF8/ORF9.

Descripción de las realizaciones preferidas

De acuerdo con la invención objeto, se proporcionan nuevas secuencias de ADN, construcciones de ADN y métodos, que incluyen algunos o todos los genes de la ruta de síntesis de tipo policétido (de tipo PKS) de Shewanella, Vibrio, Schizochytrium u otros microorganismos para modificar el contenido en ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados de las células huésped, en particular células huésped vegetales. La presente invención 15 demuestra que los genes de la síntesis de EPA en Shewanella putrefaciens constituyen una ruta de síntesis de tipo policétidos. Las funciones se atribuyen a los genes de Shewanella, Schizochytrium y Vibrio y se proporcionan métodos para la producción de EPA y DHA en células huésped. El método incluye la etapa de transformar células con un casete de expresión que comprende un ADN que codifica un polipéptido capaz de incrementar la cantidad de uno o más PUFA en la célula huésped. Deseablemente, se preparan construcciones de integración que proporcionan la integración del casete de expresión en el genoma de una célula huésped. Las células huésped se manipulan para expresar un ADN sentido o antisentido que codifica un polipéptido o polipéptidos que tienen actividad del gen de tipo PKS. Por “gen de tipo PKS” se pretende decir un polipéptido que es responsable de una cualquiera o más de las funciones de una actividad de tipo PKS de interés. Por “polipéptido” se quiere indicar cualquier cadena de aminoácidos, con independencia de la longitud o modificación posterior a la traducción, por

25 ejemplo, glucosilación o fosforilación. Dependiendo de la naturaleza de la célula huésped, el sustrato o sustratos para la enzima expresada pueden producirse por la célula huésped o pueden suministrarse exógenamente. De particular interés es el control selectivo de la producción de PUFA en tejidos vegetales y/o partes de plantas, tales como hojas, raíces, frutas y semillas. La invención se puede usar para sintetizar EPA, DHA y otros PUFA relacionados en las células huésped.

Hay muchas ventajas en la producción transgénica de los PUFA. Como ejemplo, en E. coli transgénica, como en Shewanella, el EPA se acumula en la fracción de fosfolípidos, específicamente en la posición sn-2. Puede ser posible producir un lípido estructurado en una célula huésped deseada que difiera sustancialmente del producido en Shewanella o E. coli. Adicionalmente, la producción transgénica de PUFA en células huésped particulares ofrece

35 varias ventajas sobre la purificación a partir de fuentes naturales, tales como peces o plantas. En plantas transgénicas, usando un sistema de tipo PKS, la síntesis de ácidos grasos de PUFA se consigue en el citoplasma mediante un sistema que produce los PUFA a través de la producción de novo de los ácidos grasos usando como sustratos malonil-CoA y acetil-CoA. De este modo se evitan posibles problemas, tales como los asociados con la competición del sustrato y la desviación de productos normales de la síntesis de ácidos grasos en un huésped a la producción de PUFA.

La producción de ácidos grasos a partir de plantas recombinantes proporciona la capacidad de alterar el perfil de ácidos grasos en la planta natural proporcionando nuevas rutas de síntesis en el huésped o suprimiendo las rutas no deseadas, aumentando de este modo los niveles de PUFA deseados, o formas conjugadas de los mismos y 45 disminuyendo los niveles de PUFA no deseados. La producción de ácidos grasos en plantas transgénicas también ofrece la ventaja de que la expresión de los genes de tipo PKS en tejidos concretos y/o partes de plantas significa que se pueden conseguir niveles considerablemente aumentados de PUFA deseados en dichos tejidos y/o partes, haciendo la recuperación de dichos tejidos más económica. La expresión en un tejido vegetal y/o una parte de planta presenta ciertas eficiencias, en particular cuando el tejido o parte es uno que se recolecta con facilidad, tal como semillas, hojas, frutas, flores, raíces, etc. Por ejemplo, los PUFA deseados se pueden expresar en semillas; los métodos de aislamiento de aceites de semillas están bien establecidos. Además de proporcionar una fuente de purificación de los PUFA deseados, los componentes del aceite de semillas se pueden manipular mediante la expresión de genes de tipo PKS, solos o en combinación con otros genes tales como elongasas, para proporcionar aceites de semillas que tienen un perfil de PUFA concreto en forma concentrada. Los aceites de semillas

55 concentrados se pueden añadir a leches de animales y/o a leches sintéticas o semisintéticas para que sirvan como fórmulas para lactantes cuando la lactancia humana es imposible o no deseada, o en los casos de malnutrición o enfermedad.

La producción microbiana transgénica de ácidos grasos ofrece las ventajas de que se conocen muchos microbios con composiciones de aceites enormemente simplificadas en comparación con aquellas de organismos superiores, haciendo más fácil la purificación de los componentes deseados. La producción microbiana no está sujeta a fluctuaciones causadas por variables externas tales como el tiempo y el aporte de nutrientes. El aceite producido microbianamente está sustancialmente libre de contaminación por parte de contaminantes medioambientales. Adicionalmente, los microbios pueden proporcionar PUFA en formas particulares que pueden tener usos específicos. 65 Por ejemplo, Spirullina puede proporcionar PUFA predominantemente en las posiciones primera y tercera de los triglicéridos; la digestión mediante lipasas pancreáticas preferentemente libera ácidos grasos en estas posiciones. A

continuación de la ingestión humana o animal de triglicéridos derivados de Spirullina, estos PUFA son liberados por las lipasas pancreáticas como ácidos grasos libres y por tanto, están directamente disponibles para, por ejemplo, el desarrollo cerebral de los niños. Adicionalmente, la producción de aceites microbiana puede manipularse mediante el control de las condiciones de cultivo, notablemente mediante el suministro de sustratos particulares para enzimas

5 expresadas microbianamente, o mediante la adición de compuestos que suprimen rutas bioquímicas no deseadas. Además de estas ventajas, la producción de ácidos grasos a partir de microbios recombinantes proporciona la capacidad de alterar el perfil de ácidos grasos del microbio natural proporcionando nuevas rutas sintéticas en el huésped o suprimiendo las rutas no deseadas, aumentando de este modo los niveles de PUFA deseados, o formas conjugadas de los mismos y disminuyendo los niveles de PUFA no deseados.

La producción de ácidos grasos en animales también presenta varias ventajas. La expresión de genes de desaturasas en animales puede producir niveles enormemente incrementados de PUFA deseados en tejidos animales, haciendo la recuperación a partir de estos tejidos más económica. Por ejemplo, cuando los PUFA deseados se expresan en la leche materna de animales, los métodos para aislar PUFA a partir de la leche del

15 animal están bien establecidos. Además de proporcionar una fuente para la purificación de los PUFA deseados, la leche materna de animales puede manipularse a través de la expresión de genes de desaturasas, bien solos o en combinación con otros genes humanos, para proporcionar leches de animales con una composición de PUFA sustancialmente similar a la leche materna humana durante las diferentes etapas de desarrollo infantil. Las leches de animales humanizadas pueden servir como fórmulas para bebés cuando la lactancia humana es imposible o no deseada, o en los casos de malnutrición o enfermedad.

Los ADN que codifican los genes deseados de tipo PKS se pueden identificar de varias formas. En un método, una fuente de un gen deseado de tipo PKS, por ejemplo las bibliotecas genómicas de Shewanella, Schizochytrium o Vibrio spp se examinan con sondas detectables sintetizadas enzimática o químicamente. Las fuentes de ORF que 25 tienen genes de tipo PKS son los organismos que producen un PUFA deseado, incluidas bacterias de profundidades marinas productoras de DHA o productoras de EPA que crecen, preferentemente, a presión alta o a una temperatura relativamente baja. Los microorganismos tales como Shewanella que producen EPA o DHA también se pueden usar como fuente de genes de tipo PKS. Las sondas pueden construirse a partir de ADN, ARN o nucleótidos no naturales

o mezclas de los mismos. Las sondas pueden sintetizarse enzimáticamente a partir de ADN de genes de tipo PKS para métodos de hibridación con rigurosidad normal o reducida. Para una discusión de las condiciones para la hibridación y diseño de sondas, véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) o Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel y col., ed., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1987). Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos que codifican enzimas de PUFA, tal como subclonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican

35 polipéptidos en vectores de expresión, sondas de marcaje, hibridación de ADN y similares se describen en general en Sambrook, supra.

Las sondas de oligonucleótidos pueden usarse también para examinar fuentes y pueden basarse en secuencias de genes conocidos de tipo PKS, incluidas secuencias conservadas entre los genes conocidos de tipo PKS, o en secuencias de péptidos obtenidas a partir de la proteína deseada purificada. Las sondas de oligonucleótidos basadas en secuencias de aminoácidos pueden hacerse degenerar para abarcar la degeneración del código genético, o pueden predisponerse en favor de los codones preferidos del organismo fuente. Alternativamente, puede secuenciarse completamente una proteína deseada y realizarse la síntesis total de un ADN que codifica ese polipéptido.

45 Una vez se ha aislado el ADN deseado, este puede secuenciarse mediante métodos conocidos. Se sabe en la técnica que tales métodos están sujetos a errores, de tal forma que la múltiple secuenciación de la misma región es práctica rutinaria y todavía se espera que conduzca a frecuencias de errores medibles en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, extensa estructura secundaria, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con un contenido elevado en bases GC. Cuando surgen discrepancias, puede realizarse el secuenciado de nuevo y pueden emplearse métodos especiales. Tales métodos especiales pueden incluir alterar las condiciones de secuenciación mediante el uso de: temperaturas diferentes; enzimas diferentes; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; composiciones de gel diferentes, por ejemplo,

55 añadiendo formamida; cebadores diferentes o cebadores ubicados a diferentes distancias de la región problema; o plantillas diferentes tales como ADN de hebra única. También puede emplearse la secuenciación del ARNm.

En la mayor parte de los casos, parte o toda la secuencia codificante de los polipéptidos que tienen actividad de gen de tipo PKS procede de una fuente natural. No obstante, en algunas situaciones, es deseable modificar toda o una porción de los codones, por ejemplo, para potenciar la expresión, mediante el empleo de codones preferidos del huésped. Los codones preferidos del huésped pueden determinarse a partir de los codones con la frecuencia más elevada en las proteínas expresadas en la cantidad más elevada en una especie de huésped concreta de interés. De ese modo, la secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad de gen de tipo PKS puede sintetizarse completamente o en parte Puede sintetizarse también la totalidad o porciones del ADN para suprimir cualquier 65 secuencia o región de estructura secundaria desestabilizante que estaría presente en el ARNm transcrito. Puede sintetizarse también la totalidad o porciones del ADN para alterar la composición de bases a una más preferible en la

célula huésped deseada. Los métodos para sintetizar secuencias y agrupar las secuencias juntas están bien establecidos en la literatura. Pueden emplearse la mutagénesis in vitro y la selección, la mutagénesis dirigida a un sitio, u otros medios, para obtener mutaciones de genes de tipo PKS que ocurren de forma natural, para producir un polipéptido que tenga actividad de gen de tipo PKS in vivo con parámetros cinéticos y físicos más deseables para su

5 función en la célula huésped, tales como una semivida más larga o una velocidad de producción más elevada de un ácido graso poliinsaturado deseado.

De particular interés son los ORF de Shewanella putrefaciens y los correspondientes ORF de Vibrio marinus y Schizochytrium. Los genes de tipo PKS de Shewanella putrefaciens se pueden expresar en plantas transgénicas para efectuar la biosíntesis de EPA. También pueden usarse otros ADN que son sustancialmente idénticos a los genes de tipo PKS de Shewanella putrefaciens, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a los genes de tipo PKS de Shewanella putrefaciens, como los identificados en Vibrio marinus o Schizochytrium. Por sustancialmente idéntico se quiere indicar una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que presentan, en orden de preferencia creciente, al menos un 60 %, 80 %, 90 % o 95 % de homología con la secuencia

15 de ADN de los genes de tipo PKS de Shewanella putrefaciens o con la secuencia de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos para dichos genes. Para los polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente es de al menos 16 aminoácidos, preferentemente al menos 20 aminoácidos, o más preferentemente 35 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación es generalmente de al menos 50 nucleótidos, preferentemente al menos 60 nucleótidos y más preferentemente al menos 75 nucleótidos y lo más preferentemente, 110 nucleótidos.

La homología se mide típicamente usando un programa de análisis de secuencias, por ejemplo, el paquete de programas de Análisis de Secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison,

25 Wisconsin 53715) y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). BLAST (National Center for Biotechnology Information (WCBI) www.ncbi.nlm.gov; FASTA (Pearson y Lipman, Science (1985) 227: 1435-1446). Dicho software aparea secuencias similares asignando grados de homología a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Normalmente, las sustituciones conservadoras incluyen sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las sustituciones pueden hacerse también en base a la hidrofobicidad o hidrofilicidad conservada (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-132), o en base a la capacidad de asumir una estructura secundaria de polipéptido parecida (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45-148, 1978). Una proteína relacionada con la secuencia de sonda se identifica cuando p � 0,01, preferentemente p � 10-7 o 10-8.

35 Abarcados por la presente invención están los genes de tipo PKS relacionados procedentes de los mismos organismos o de otros organismos. Dichos genes de tipo PKS relacionados incluyen variantes de los ORF de tipo PKS divulgados que se producen de forma natural en la misma o diferentes especies de Shewanella, así como los homólogos de los genes de tipo PKS divulgados de otras especies y proteínas relacionadas evolutivamente que tienen una función y actividad análogas. También se incluyen genes de tipo PKS que, aunque no son sustancialmente idénticos a los genes de tipo PKS de Shewanella putrefaciens funcionan de un modo similar para producir PUFA como parte de un sistema de tipo PKS. Los genes de tipo PKS relacionados pueden identificarse por su capacidad para funcionar sustancialmente del mismo modo que los genes de tipo PKS divulgados, es decir pueden sustituirse por los correspondientes ORF de Shewanella, Schizochytrium o Vibrio y seguir produciendo con

45 eficacia EPA o DHA. Los genes de tipo PKS relacionados también pueden identificarse mediante la búsqueda de secuencias homólogas a los genes de tipo PKS divulgados, mediante la hibridación de una sonda basada en los genes de tipo PKS divulgados con una biblioteca construida a partir del organismo fuente, o mediante la RT-PCR usando ARNm procedente del organismo fuente y cebadores basados en los genes de tipo PKS divulgados. Por tanto, la expresión “genes de tipo PKS" no solo hace referencia a las secuencias de nucleótidos divulgadas en el presente documento sino también a ácidos nucleicos que son alélicos o variantes de especies de estas secuencias de nucleótidos. También se entiende que estos términos incluyen mutaciones no naturales introducidas mediante mutación deliberada usando tecnología recombinante, como mutación de un solo sitio o escindiendo secciones cortas de marcos de lectura abiertos de ADN que codifican enzimas de PUFA o sustituyendo nuevos codones o añadiendo nuevos codones. Estas alteraciones menores mantienen sustancialmente la inmunoidentidad del

55 producto de expresión original y/o su actividad biológica. Las propiedades biológicas de las enzimas PUFA alteradas se pueden determinar expresando las enzimas en una línea celular adecuada y determinando la capacidad de las enzimas para sintetizar PUFA. Modificaciones concretas de enzimas consideradas menores incluirían sustitución de aminoácidos de propiedades químicas similares, por ejemplo ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina.

Cuando se usa un sistema de tipo PKS para PUFA de otro organismo, las regiones de un polipéptido de un gen de tipo PKS importante para la actividad del gen de tipo PKS se pueden determinar mediante mutagénesis de rutina, la expresión de los polipéptidos mutantes resultantes y la determinación de sus actividades. La región de codificación para los mutantes puede incluir supresiones, inserciones y mutaciones puntuales o combinaciones de las mismas. 65 Un análisis de función típico empieza con la mutagénesis de deleción para determinar los límites N- y C-terminales de la proteína necesaria para la función y a continuación, se hacen deleciones, inserciones o mutaciones puntuales

internas en el marco de lectura abierto para determinar además otras regiones necesarias para la función. También pueden usarse otras técnicas tales como la mutagénesis en casete o la síntesis total. La mutagénesis de deleción se consigue, por ejemplo, usando exonucleasas para suprimir secuencialmente las regiones codificantes 5’ y 3’. Hay equipos disponibles para tales técnicas Después de la supresión, la región codificante se completa mediante la

5 ligación de oligonucleótidos, que contienen respectivamente codones de iniciación o terminación, a la región codificante delecionada después de la deleción 5’ o 3’. Alternativamente, los oligonucleótidos que contienen codones de iniciación o terminación se insertan en la región codificante mediante una variedad de métodos que incluyen la mutagénesis dirigida a un sitio, la PCR mutagénica, o mediante ligación en ADN digerido en sitios de restricción existentes. Las deleciones internas pueden realizarse de forma similar a través de un variedad de métodos, incluyendo el uso de sitios de restricción existentes en el ADN, mediante el uso de cebadores mutagénicos a través de la mutagénesis dirigida o la PCR mutagénica. Las inserciones se hacen a través de métodos tales como la mutagénesis de barrido con engarce, la mutagénesis dirigida a un sitio, o la PCR mutagénica Las mutaciones puntuales se realizan a través de técnicas tales como mutagénesis dirigida a un sitio o PCR mutagénica.

15 También puede usarse la mutagénesis química para identificar regiones de un polipéptido del gen de tipo PKS importante para su actividad. Se expresa una construcción mutada y se analiza la capacidad de la proteína alterada para funcionar como un gen de tipo PKS. Tal análisis estructura-función puede determinar qué regiones pueden delecionarse, qué regiones toleran inserciones y que mutaciones puntuales permiten que la proteína mutante funcione sustancialmente de la misma forma que el gen de tipo PKS nativo. La totalidad de tales proteínas mutantes y secuencias de nucleótidos que las codifican se hallan dentro del ámbito de la presente invención. El EPA se produce en Shewanelia como producto de un sistema de tipo PKS, de un modo tal que los genes de EPA codifican componentes de este sistema. En Vibrio, el DHA se produce mediante un sistema similar. Las enzimas que sintetizan estos ácidos grasos están codificadas por un grupo de genes que son distintos de los genes de síntesis de ácidos grasos que codifican las enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos de C16 y C18 que normalmente

25 se hallan en bacterias y en plantas. Dado que los genes de EPA de Shewanella representan un grupo de genes de tipo PKS, la producción de EPA es, al menos en cierta medida, independiente del sistema FAS de tipo II bacteriano. Por tanto, la producción de EPA en el citoplasma de células vegetales se puede conseguir mediante la expresión de la ruta de los genes de tipo PKS en las células vegetales sometidos al control de las señales reguladoras de plantas.

La producción de E. coli transformada con los genes de EPA de Shewanella continúa durante el crecimiento anaeróbico, lo que indica que no participan las reacciones de desaturasa dependientes de O2. El análisis de las proteínas codificadas por los ORF esenciales para la producción de EPA revela la presencia de estructuras de dominio características de sistemas de tipo PKS. La figura 2A muestra un resumen de los dominios, motivos y también homologías claves detectadas por las búsquedas en el banco de datos "BLAST" Dado que el EPA es

35 diferente de muchas de las demás sustancias producidas por las rutas de tipo PKS, es decir contiene dobles enlaces en cis, espaciados a intervalos de 3 carbonos a lo largo de la molécula, no cabe esperar un sistema de tipo PKS para la síntesis de EPA.

Adicionalmente, búsquedas en BLAST que usan los dominios presentes en los ORF de EPA de Shewanella revelan que varios están relacionados con proteínas codificadas por un grupo de genes de tipo PLS encontrado en Ababeana. La estructura de dicha región del cromosoma de Anabeana se muestra en la figura 2F. Los genes de tipo PKS de Anabeana se han relacionado con la síntesis de un hidroxiácido de cadena larga (C26) hallado en una capa de glucolípidos de heteroquistes. Los dominios proteicos de EPA con homología con las proteínas de Anabeana se indican en la figura 2F.

45 El ORF 6 de Shewanella contiene un dominio KAS que incluye un motivo de sitio activo (DXAC*), SEC ID Nº 32, así como un "GFGG", SEC ID Nº 33, motivo que está presente al final de muchas proteínas KAS de tipo II (véase la figura 2A). Están presentes motivos prolongados pero no se muestran. Después hay un dominio de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (AT). Las secuencias cercanas al motivo del sitio activo (GHS*XG), SEC ID Nº 34 sugieren que transfiere el malonato en lugar de metilmalonato, es decir se asemeja a los AT de tipo acetato. Tras una región de engarce hay un grupo de 6 dominios de repetición, cada uno con ~100 aminoácidos de longitud, que son homólogos a las secuencias de ACP de tipo PKS. Cada uno contiene un motivo de unión a panteteína (LGXDS*(L/I)), SEC ID Nº 35 y 36. La presencia de 6 de estos dominios ACP no se ha observado anteriormente en las ácido graso sintasas (FAS) o sistemas de tipo PKS. Cerca del extremo de la proteína hay una región que

55 muestra homología con las β-ceto-ACP reductasas (KR). Contiene un motivo del sitio de unión a nucleótidos piridínicos "GXGXX(G/A/P)", SEC ID Nº 37, 38 y 39.

El ORF 8 de Shewanella comienza con un dominio KAS, incluido un sitio activo y motivos de terminación (figura 2C). La mejor correspondencia en los bancos de datos está con el HglD de Anabeana. También hay un dominio que tiene homología de secuencia con la mitad en el extremo N de Anabeana Hg1C. Esta región también muestra una débil homología con las proteínas KAS, aunque carece del sitio activo y de los motivos de terminación. Tiene las características de los denominados factores de longitud de cadena (CLF) de los sistemas de tipo PKS de tipo II. El ORF 8 parece dirigir la producción de EPA frente a DHA mediante el sistema de tipo PKS. El ORF 8 también tiene dos dominios con homología con las β-hidroxiacil-ACP deshidrasas (DH). La mejor coincidencia de ambos dominios 65 es con FabA de E. coli, una enzima bifuncional que lleva a cabo la reacción de la deshidrasa y una isomerización (trans en cis) del doble enlace resultante. El primer dominio DH contiene tanto la histidina (H) de sitio activo como

una cisteína (C) adyacente implicada en la catálisis de FabA. El segundo dominio DH tiene la H de sitio activo pero carece de la C adyacente (figura 2C). Las búsquedas en BLAST con el segundo dominio DH también muestran coincidencias con FabZ, un segundo DH de E. coli que no posee actividad isomerasa.

5 La mitad N-terminal de ORF 7 (figura 2B) no tiene coincidencias significativas en los bancos de datos. La mejor coincidencia de la mitad C-terminal es con una porción C-terminal del Anabeana HglC. Este dominio contiene un motivo acil-transferasa (AT) (GXSXG), SEC ID Nº 40. La comparación de las secuencias extendidas del sitio activo en base a la estructura cristalina del malonil-CoA-AT de ACP de E. coli revela que el ORF 7 carece de dos residuos esenciales para la exclusión del agua del sitio activo (nomenclatura de E. coli; Q11 y R117). Estos datos sugieren que el ORF7 puede funcionar como una tioesterasa.

El ORF 9 (figura 2D) es homólogo a un ORF de función desconocida en el clúster Anabeana Hgl. También exhibe una homología muy débil con NIFA, una proteína reguladora de las bacterias fijadoras de nitrógeno. No se ha excluido que la proteína del ORF 9 tenga una función reguladora. El ORF 3 (figura 2E) es homólogo a Anabeana

15 HetI así como a EntD de E. coli y a Sfp de Bacillus. Recientemente se ha identificado una nueva familia de fosfopanteteinil-transferasas que incluye HetI, EntD y Sfp (Lamblot RH y col. (1996) A new enzyme superfamily-the phophopantetheinyl transferases. Chemistry & Biology, vol. 3, nº 11, 923-936). Los datos de la figura 3 demuestran que la presencia del ORF 3 es necesaria para la adición de β-alanina (es decir, panteteína) a la proteína del ORF 6. Por tanto, el ORF 3 codifica la fosfopanteteinil-transferasa específica de los dominios ACP del ORF 6. (Véase, Haydock SF y col. (1995) Divergent sequence motifs correlated with the substrate specificity of (methyl)malonylCoA:acyl carrier protein transacylase domains in modular polyketide synthases, FEBS Lett., 374, 246-248). El malonato es la fuente de los carbonos usados en las reacciones de extensión de la síntesis de EPA. Adicionalmente, malonil-CoA y es el sustrato de AT más que malonil-ACP, es decir la región AT del ORF6 usa malonil-CoA.

25 Una vez que se han obtenido las secuencias de ADN que codifican los genes de tipo PKS de un organismo responsables de la producción de PUFA, se introducen en un vector capaz de replicarse en una célula huésped y propagarse in vitro mediante técnicas tales como PCR o PCR extendida. Los vectores de replicación pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos y similares. Los vectores deseables incluyen aquellos útiles para la mutagénesis del gen de interés o para la expresión del gen de interés en las células huésped. Una enzima de síntesis de PUFA o una proteína homóloga se puede expresar en varias células modificadas mediante tecnología recombinante. Se dispone de numerosos sistemas de expresión para la expresión de ADN que codifica una enzima de PUFA. La expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican una enzima de PUFA normalmente se consigue uniendo operablemente el ADN a un promotor (constitutivo o inducible) dentro de un vector de expresión. Por vector de expresión se quiere decir una molécula de ADN lineal o circular que comprende un segmento que codifica una

35 enzima de PUFA unido operablemente a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Dichos segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y de terminación. Un vector de expresión también puede incluir uno o más orígenes de replicación; uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación etc. Generalmente, los vectores de expresión derivan de ADN plasmídico o viral y pueden contener elementos de ambos. La expresión ”unido de forma operable” indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan en concierto para los fines para los que están destinados, por ejemplo la transcripción se inicia en un promotor y continúa a través del segmento de codificación al terminador. Véase Sambrook y col., supra.

La técnica de la PCR de largo alcance ha hecho posible la propagación in vitro de construcciones grandes, de forma que las modificaciones del gen de interés, tales como la mutagénesis o la adición de señales de expresión y la

45 propagación de las construcciones resultantes puedan efectuarse completamente in vitro sin el uso de un vector de replicación o una célula huésped. La expresión in vitro se puede realizar, por ejemplo, introduciendo la región de codificación del polipéptido desaturasa en un vector de expresión diseñado para usar in vitro y añadiendo lisado de reticulocitos de conejo y cofactores; si se desea pueden incorporarse aminoácidos marcados. Tales vectores de expresión in vitro pueden proporcionar algunas o todas las señales de expresión necesarias en el sistema usado. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente. La mezcla de reacción puede analizarse después directamente en busca de las enzimas de tipo PKS, por ejemplo, determinando su actividad, o la enzima sintetizada puede purificarse y analizarse a continuación.

La expresión en una célula huésped puede conseguirse de forma transitoria o estable. La expresión transitoria

55 puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula huésped, construcciones que sin embargo no se replican y raramente se integran en la célula huésped, o en donde la célula huésped no está proliferando. La expresión transitoria puede conseguirse también induciendo la actividad de un promotor regulable unido operablemente al gen de interés, aunque tales sistemas inducibles frecuentemente exhiben un nivel de expresión basal bajo. La expresión estable puede conseguirse mediante la introducción de una construcción que puede integrarse en el genoma del huésped o que se replica autónomamente en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse a través del uso de un marcador seleccionable ubicado en o transfectado con la construcción de expresión, seguida por la selección de células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable es el resultado de la integración, la integración de las construcciones puede ocurrir al azar dentro del genoma huésped, o puede dirigirse a través del uso de

65 construcciones que contienen regiones con homología suficiente con el genoma huésped como para dirigir la recombinación al locus del huésped. Cuando las construcciones se apuntan hacia un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripción y traducción pueden proporcionarse por el locus endógeno. Para conseguir la expresión en una célula huésped, el ADN transformado está asociado operablemente con regiones reguladoras de la iniciación y la terminación de la transcripción y de la traducción que son funcionales en la célula huésped.

5 Las regiones de iniciación o terminación de la transcripción o traducción se derivan de una variedad de especies no exclusivas, incluyendo el ADN a expresar, genes conocidos o sospechosos de ser capaces de expresarse en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química. La región de terminación puede derivar de la región 3’ del gen del que se obtuvo la región de iniciación o de un gen diferente. Se conoce un gran número de regiones de terminación y se ha encontrado que son satisfactorias en varios huéspedes del mismo género y especie o de géneros y especies diferentes. Normalmente, la región de terminación se selecciona más por comodidad que por alguna propiedad concreta. Al expresar más de un ORF de tipo PKS en la misma célula se usarán regiones reguladoras y métodos de expresión adecuados. Los genes introducidos se pueden propagar en la célula huésped a través del uso de vectores de replicación o mediante la integración en el genoma del huésped. Cuando se expresan

15 dos o más genes en vectores de replicación distintos, es deseable que cada vector tenga un medio de replicación diferente. Cada construcción introducida, integrada o no, deberá tener un medio de selección diferente y deberá carecer de homología con las otras construcciones para mantener una expresión estable y prevenir la reasignación de elementos entre las construcciones. Las elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección y métodos de propagación de la construcción introducida se pueden determinar experimentalmente de modo que los genes introducidos se expresan a los niveles necesarios para proporcionar la síntesis de los productos deseados.

Para expresar la enzima de PUFA se pueden usar numerosos sistemas de expresión procariotas. Se pueden construir vectores de expresión que contengan un promotor para dirigir la transcripción, un sitio de unión al ribosoma y un terminador de la transcripción. Ejemplos de regiones reguladoras adecuadas para este fin en E. coli son la 25 región promotora y operadora de la ruta de la biosíntesis del triptófano en E. coli, como describen Yanofsky (1984) J. Bacteriol., 158: 1018-1024 y el promotor hacia la izquierda del fago lambda (PA) como describen Herskowitz y Hagen, (1980) Ann. Rev. Genet., 14: 399-445. La inclusión de marcadores de selección en los vectores de ADN transformados en E.coli también es útil. Ejemplos de estos marcadores incluyen genes que especifican resistencia a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol. Los vectores usados para expresar genes extraños en huéspedes bacterianos normalmente contendrán un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a antibiótico y un promotor que funciona en la célula huésped. Los plásmidos útiles para transformar bacterias incluyen pBR322 (Bolivar y col., (1977) Gene 2: 95-113), los plásmidos pUC (Messing, (1983) Meth. Enzymol. 101: 20-77, Vieira y Messing, (1982) Gene 19: 259-268), pCQV2 (Queen, ibid.) y derivados de los mismos. Los plásmidos pueden contener elementos virales y bacterianos. Métodos para la recuperación de las proteínas en forma biológicamente activa se tratan en las

35 patentes de EE.UU. Nº 4.966.963 y 4.999.422. Véase Sambrook y col. para una descripción de otros sistemas de expresión procariotas,

Para la expresión en eucariotas, las células huésped para usar en la práctica de la presente invención incluyen células de mamífero, de ave, de plantas, de insectos y fúngicas. Como ejemplo de plantas, la elección de un promotor dependerá, en parte, de si se desea una expresión constitutiva o inducible y si se desea producir los PUFA en una etapa concreta del desarrollo de la planta y/o en un tejido concreto. Las consideraciones para elegir un tejido específico y/o etapa de desarrollo específica para la expresión de los ORF pueden depender de sustratos de competición o de la capacidad de la célula huésped para tolerar la expresión de un PUFA concreto. La expresión puede estar dirigida a una localización concreta dentro de una planta huésped, como semillas, hojas, frutos, flores y 45 raíces usando secuencias reguladoras específicas, como las descritas en la patente de EE.UU. nº 5.463.174, la patente de EE.UU. nº 4.943.674, la patente de EE.UU. nº 5.106.739, la patente de EE.UU. nº 5.175.095, la patente de EE.UU. nº 5.420.034, la patente de EE.UU. nº 5.188.958 y la patente de EE.UU. nº 5.589.379. Cuando la célula huésped es una levadura, se proporcionan regiones transcripcional y traduccional funcionales en células de levadura, en particular de especies huésped. Las regiones reguladoras del inicio de la transcripción se pueden obtener de, por ejemplo, genes en la ruta glucolítica, tales como alcohol deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD), fosfoglucoisomerasa, fosfoglicerato cinasa, etc. o genes regulables tales como la fosfatasa ácida, lactasa, metalotioneína, glucoamilasa etc. Se puede usar una cualquiera de una serie de secuencias reguladoras en una situación concreta, dependiendo de si se desea transcripción constitutiva o inducida, la eficiencia concreta del promotor junto con el marco de lectura abierto de interés, la capacidad de unir un promotor fuerte con

55 una región de control de un promotor diferente que permite la transcripción inducible, la facilidad de la construcción y similares. De interés particular son los promotores que se activan en presencia de galactosa. Los promotores inducibles con galactosa (GAL1, GAL7 y GAL10) se han usado ampliamente para la expresión con elevados niveles y regulada en levaduras (Lue y col., Mol. Cell Biol. 7: 3446 (1987); Johnson, Microbiol. Rev. 51:458 (1987)). La transcripción a partir de los promotores GAL se activa por la proteína GAL4, que se une a la región promotora y activa la transcripción cuando la galactosa está presente. En ausencia de galactosa, el antagonista GAL80 se une al GAL4 e impide que el GAL4 active la transcripción. La adición de galactosa impide que el GAL80 inhiba la activación de la GAL4. Preferentemente, la región de terminación se deriva de un gen de levadura, particularmente de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida o Kluyveromyces. Se sabe también que las regiones 3’ de dos genes de mamíferos, del γ-interferón y α2-interferón, funcionan en levaduras.

65 Se ha encontrado que las secuencias de nucleótidos que rodean al codón de iniciación de la traducción ATG afectan a la expresión en células de levadura. Si el polipéptido deseado se expresa poco en levaduras, las secuencias de nucleótidos pueden modificarse para incluir una secuencia de iniciación de la traducción en levadura eficiente para obtener una expresión óptima del gen. Para la expresión en Saccharomyces, esto puede hacerse mediante mutagénesis dirigida a un sitio de un gen expresado ineficientemente, fusionándolo dentro del marco con un gen

5 endógeno de Saccharomyces, preferentemente un gen muy expresado, tal como el gen de la lactasa.

Como una alternativa a expresar los genes de tipo PKS en el citoplasma de células vegetales, está el dirigir las enzimas al cloroplasto. Un método para dirigir proteínas al cloroplasto entraña el uso de péptidos líder unidos al extremo N de las proteínas. Los péptidos líder usados habitualmente derivan de la subunidad pequeña de la ribulosa bis-fosfato-carboxilasa de plantas. También se pueden usar secuencias líder de otras proteínas de cloroplastos. Otro método para dirigir proteínas al cloroplasto es transformar el genoma del cloroplasto (la transformación estable de los cloroplastos de Chlamydomonas reinhardtii (un alga verde) usando bombardeo de las células receptoras con microproyectiles de tungsteno de alta velocidad revestidos con ADN extraño se ha descrito). Véanse, por ejemplo, Blowers y col. Plant Cell (1989) 1: 123-132 y Debuchy y col. EMBO J (1989) 8: 2803-2809. La técnica de

15 transformación con microproyectiles de tungsteno la describe Kline y col., Nature (Londres) (1987) 327: 70-73). El método más habitual de transformar cloroplastos implica el uso de técnicas biolísticas pero también se pueden usar otras técnicas desarrolladas para tal fin, Se han descrito métodos para dirigir productos génicos extraños a cloroplastos (Shrier y col. EMBO J. (1985) 4: 25-32) o a mitocondrias (Boutry y col., supra). Véase también Tomai y col. Gen. Biol. Chem. (1988) 263: 15104-15109 y la patente de EE.UU. nº 4.940.835 para el uso de péptidos de tránsito para translocar productos génicos en el cloroplasto. En Kenauf TIBTECH (1987) 5: 40-47 se revisan métodos para dirigir el transporte de proteínas al cloroplasto.

Para producir PUFA en especies y células de aves, tales como pollos, pavos, codornices y patos, la transferencia del gen puede realizarse introduciendo una secuencia de ácido nucleico que codifique una enzima de PUFA en las

25 células siguiendo procedimientos conocidos en la técnica. Si se desea un animal transgénico, pueden proporcionarse células madres pluripotenciales de embriones con un vector portador de un transgén y desarrollarlas hasta un animal adulto (patente de EE.UU. nº 5.162.215; Ono y col.. Comparative Biochemistry and Physiology A 113 (3): 287-292 (1996); documento WO 96/12.793; documento WO 96/06.160). En la mayoría de los casos, el transgén se modificará para expresar niveles elevados de los genes de tipo PKS con objeto de incrementar la producción de PUFA. El transgén puede modificarse, por ejemplo, proporcionando regiones reguladoras de la transcripción y/o traducción que funcionan en células de aves, tales como promotores que dirigen la expresión en tejidos concretos y partes del huevo tales como la yema. Las regiones reguladoras del gen pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluyendo los virus de la anemia de los pollos o de la leucosis aviar, o genes de aves tales como el gen de la ovoalbúmina del pollo.

35 La producción de PUFA en células de insectos puede realizarse usando vectores de expresión de baculovirus que alberguen uno o más transgenes de desaturasa. Los vectores de expresión de baculovirus están disponibles a partir de varias fuentes comerciales tales como Clonetech. También se proporcionan métodos para producir cepas transgénicas e híbridas de algas, tales como las algas marinas, que contienen y expresan un transgén de desaturasa. Por ejemplo, pueden prepararse algas marinas transgénicas tal como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.426.040. Al igual que con los otros sistemas de expresión descritos más arriba, el momento, la extensión de la expresión y la actividad del transgén de desaturasa pueden regularse ajustando la secuencia codificante del polipéptido con las regiones reguladoras de la transcripción y traducción apropiadas seleccionadas para un uso particular. Son de especial interés las regiones promotoras que pueden inducirse en condiciones de

45 crecimiento preseleccionadas. Por ejemplo, puede usarse para este propósito la introducción de mutaciones sensibles a la temperatura y/o que responden a metabolitos en las secuencias codificantes del transgén de desaturasa, sus regiones reguladoras, y/o el genoma de las células en las que se introduce el transgén.

La célula huésped transformada se cultiva en condiciones apropiadas adaptadas para un resultado final deseado. Para células huésped hechas crecer en cultivo, las condiciones están típicamente optimizadas para producir el rendimiento mayor o más económico de PUFA, que se relaciona con la actividad desaturasa seleccionada. Las condiciones de medio que pueden optimizarse incluyen: la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno, la adición de sustrato, la concentración final de sustrato añadido, la forma del sustrato añadido, el crecimiento aeróbico o anaeróbico, la temperatura de crecimiento, el agente inductor, la temperatura de inducción, la fase de crecimiento en

55 el momento de la inducción, la fase de crecimiento en el momento de la recolección, el pH, la densidad y el mantenimiento de la selección. Por ejemplo, los microorganismos tales como las levaduras preferentemente se cultivan usando el medio seleccionado de interés, que incluye caldo de peptona de levadura (YPB) y medio mínimo (contiene aminoácidos, bases nitrogenadas de levadura y sulfato amónico y carece de un componente para la selección, por ejemplo, uracilo). Deseablemente, los sustratos a añadir se disuelven primero en etanol. Cuando fuera necesario, puede inducirse la expresión del polipéptido de interés, por ejemplo, incluyendo o añadiendo galactosa para inducir la expresión a partir de un promotor GAL.

Cuando se desea una mayor expresión del polipéptido del gen de tipo PKS en una célula huésped que expresa PUFA de un sistema de tipo PKS se pueden usar varios métodos. En el organismo huésped se pueden introducir 65 genes adicionales que codifican el polipéptido del gen de tipo PKS. La expresión del locus del gen de tipo PKS nativo también se puede aumentar mediante recombinación homóloga, por ejemplo, insertando un promotor más

fuerte en el genoma del huésped para aumentar la expresión, eliminando las secuencias desestabilzantes del ARNm

o de la proteína codificada delecionando la información del genoma del huésped o añadiendo secuencias estabilizantes al ARNm (véanse la patente de EE.UU. nº 4.910.141 y la patente de EE.UU. nº 5.500.365). Por tanto, el huésped objeto tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos o más en función de 5 si el gen está integrado en el genoma, amplificado o está presente en un elemento extracromosómico que tiene múltiples copias. Cuando el huésped es una levadura, se pueden usar cuatro tipos principales de vectores plasmídicos de levaduras. Plásmidos de integración en levaduras (YIp), plásmidos de replicación en levaduras (YRp), plásmidos de centrómeros en levaduras (YCp) y plásmidos episomales de levaduras (YEP). Los Ylp carecen de origen de replicación de levaduras y deben propagase como elementos de integración en el genoma del huésped. Los YRp tienen una secuencia de replicación autónoma derivada del cromosoma y se propagan como número medio de copias (20 a 40), plásmidos de replicación autónoma de segregación inestable. Los YCp tienen un origen de replicación y una secuencia de centrómero y se propagan como número bajo de copias (20 a -20), plásmidos de replicación autónoma de segregación estable. Los YEp tienen un origen de replicación del plásmido de levadura 2 μm y se propagan como número alto de copias, plásmidos de replicación autónoma de segregación

15 irregular. La presencia de los plásmidos en las levaduras se puede garantizar manteniendo una selección de un marcador en el plásmido. De particular interés son los vectores de levaduras pYES2 (plásmido YEp disponible de Invitrogen, que confiere prototrofia de uracilo y un promotor inducible de galactosa GAL 1 para la expresión) y pYX424 (un plásmido YEp que tiene un promotor constitutivo de TP1 y confiere prototrofia a leucina; (Alber y Kawasaki (1982). J. Mol. & Appl. Genetics 1: 419)).

La elección de una célula huésped se ve influida en parte por el perfil deseado de PUFA de la célula transgénica y el perfil nativo de la célula huésped. Incluso cuando la célula huésped expresa actividad de genes de tipo PKS para un PUFA, la expresión de genes de tipo PKA de otro sistema de tipo PKS puede proporcionar la producción de un nuevo PUFA no producido por la célula huésped. En casos concretos en los que la expresión de actividad de genes 25 de tipo PKS está acoplada a la expresión de un gen de tipo PKS del ORF8 de un organismo que produce un PUFA diferente, puede ser deseable que la célula huésped natural tenga, o haya mutado para tener, poca actividad de genes de tipo PKS para el ORF 8. Como ejemplo, para la producción de EPA, la secuencia de ADN usada codifica el polipéptido que tiene actividad de genes de tipo PKS de un organismo que produce EPA, mientras que para la producción de DHA, las secuencias de ADN usadas son las de un organismo que produce DHA. Para usar en una célula huésped que ya expresa actividad de genes de tipo PKS puede ser necesario usar un casete de expresión que proporcione la sobreexpresión de los genes de tipo PKS deseados solos o con una construcción para regular por disminución la actividad de un ORF existente del sistema de tipo PKS existente, tal como mediante antisentido o co-supresión. De un modo similar, se puede usar una combinación de ORF derivados de distintos organismos que producen los mismos o diferentes PUFA usando sistemas de tipo PKS. Por ejemplo, el ORF 8 de Vibrio dirige la 35 expresión de DHA en una célula huésped incluso cuando los ORF 3, 6, 7 y 9 proceden de Shewanella, que produce EPA cuando se acopla al ORF 8 de Shewanella. Por tanto, para la producción de ácido eicosapentanoico (EPA), los casetes de expresión usados normalmente incluyen uno o más casetes que incluyen los ORF 3, 6, 7, 8 y 9 de un organismo productor de PUFA tal como la bacteria marina Shewanella putrefaciens (para la producción de EPA) o Vibrio marinus (para la producción de DHA). El ORF 8 se puede usar para la inducción de la producción de DHA y el ORF 8 de Vibrio se puede usar junto con los ORF 6, 7 y 9 de Shewanella para producir DHA. El esquema de organización y numeración de los ORF identificados en el clúster de genes de Shewanella se muestra en la figura 1A. Los mapas de varios subclones a los que se hace referencia en este estudio se muestran en la figura 1B. Para la expresión de un polipéptido del gen de tipo PKS, las regiones de terminación y de iniciación de la transcripción funcionales en la célula huésped están operablemente unidas al ADN que codifica el polipéptido del gen de tipo

45 PKS.

Las construcciones que comprenden los ORF de tipo PKS de interés se pueden introducir en una célula huésped mediante cualquiera de una diversidad de técnicas estándar, dependiendo, en parte, del tipo de célula huésped. Estas técnicas incluyen transformación, infección, impacto bolístico, electroporación, microinyección, raspado o cualquier otro método que introduzca el gen de interés dentro de la célula huésped (véanse la patente de EE.UU. nº 4.743.548, la patente de EE.UU. nº 4.795.855, la patente de EE.UU. nº 5.068.193, la patente de EE.UU. nº 5.188.958, la patente de EE.UU. nº 5.463.174, la patente de EE.UU. nº 5.565.346 y la patente de EE.UU. nº 5.565.347). Los métodos de transformación que se usan incluyen la transformación con acetato de litio (Methods in Enzymology 194: 186-187). Por conveniencia, una célula huésped que ha sido manipulada mediante cualquier

55 método para captar una secuencia o construcción de ADN se denominará en esta como “transformada” o “recombinante”. El huésped objeto tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos o más en función de si el gen está integrado en el genoma, amplificado o está presente en un elemento extracromosómico que tiene múltiples copias.

Para la producción de PUFA, dependiendo de la célula huésped, los diversos polipéptidos producidos por pEPA, ORF 3, 6, 7, 8 y 9, se introducen como construcciones de expresión individuales o se pueden combinar en dos o más casetes que se introducen de forma individual o se cotransforman en una célula huésped. Se usa un protocolo de transformación estándar. Para plantas, cuando menos que todos los genes de tipo PKS requeridos para la síntesis de PUFA se han insertado en una única planta, las plantas que contienen un gen o genes complementario

65 se pueden cruzar para obtener plantas que contienen un complemento completo de los genes de tipo PKS para sintetizar un PUFA deseado.

La producción mediada por genes de tipo PKS de PUFA se puede realizar en células procariotas o eucariotas. Las células se pueden cultivar como una parte o totalidad de un organismo huésped, incluyendo un animal. Los virus y los bacteriófagos pueden usarse también con las células en la producción de PUFA, particularmente para la 5 transferencia de genes, marcaje celular y selección. Se puede usar para células huésped cualquier tipo de célula vegetal, incluidas plantas dicotiledóneas, plantas monocotiledóneas y cereales. De particular interés son las plantas de cultivo como Brassica, Arabidopsis, soja, maíz y similares. Las células procariotas de interés incluyen Eschericia, Baccillus, Lactobaccillus, Cyanobacteria y similares. Células eucariotas incluyen células vegetales, células de mamífero, como las de animales lactantes, células de aves como las de los pollos y otras células que se pueden someter a manipulación genética, incluidas células de insectos, fúngicas y de algas. Ejemplos de animales huésped incluyen ratones, ratas, conejos, pollos, codorniz, pavos, bovinos, ovejas, cerdos, cabras, yak, etc., que son susceptibles de manipulación genética y clonación para la expansión rápida de la población que expresa el transgén. Para los animales, los transgenes de tipo PKS se pueden adaptar para su expresión en orgánulos, tejidos y fluidos corporales deseados, a través de la modificación de las regiones reguladoras del gen. Es de especial interés la

15 producción de PUFA en la leche de lactancia del animal huésped.

Los ejemplos de microorganismos huéspedes incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, u otros tipos de levaduras tales como Candida, Kluyveromyces, u otros hongos, por ejemplo, hongos filamentosos tales como Aspergillus, Neurospora, Penicillium, etc. Las características deseables de un microorganismo huésped son, por ejemplo, que esté bien caracterizado genéticamente, que pueda usarse para niveles elevados de expresión del producto usando fermentación a densidad ultra-alta y que esté en la lista GRAS (generalmente reconocida como segura) puesto que el producto final propuesto está destinado a ingestión por parte de humanos. Es de particular interés el uso de una levadura, más particularmente de la levadura de panadería (S. cerevisiae), como una célula huésped en la presente invención. Las cepas de particular interés son SC334 (Mat a pep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2

25 3, 112 regl-501 gall; (Hovland y col. (1989) Gene 83:57-64); BJ1995 (Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720), INVSC1 (Mat a hiw3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008) e INVSC2 (Mat a his3Δ200 ura3-167; (Invitrogen). También se puede usar como huéspedes las células bacterianas. Estas incluyen E. coli, que se puede usar en métodos de fermentación. Como alternativa, un huésped tal como especies de Lactobacillus se puede usar como huésped para introducir los productos de la ruta de tipo PKS en un producto como, por ejemplo, un yogur.

La célula huésped transformada puede identificarse mediante la selección para un marcador contenido en la construcción introducida. Alternativamente, puede introducirse una construcción marcadora separada con la construcción deseada, puesto que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en las

35 células huésped. Típicamente, las células transformadas se seleccionan por su capacidad para crecer en un medio selectivo. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico o carecer de un factor necesario para el crecimiento de los huéspedes no transformados, tal como un nutriente o un factor de crecimiento. Por consiguiente, un gen marcador introducido puede conferir resistencia al antibiótico, o codifica un factor de crecimiento o enzima esencial y permitir el crecimiento en medio selectivo cuando se expresa en el huésped transformado. Deseablemente, son de interés la resistencia a la kanamicina y al aminoglucósido G418 (véase la patente de EE.UU. nº 5.034.322). Para transformantes de levaduras se puede usar cualquier marcador que funcione en levaduras, tales como la capacidad para crecer en medio que carece de uracilo, leucina, lisina o triptófano.

La selección de un huésped transformado puede ocurrir también cuando la proteína marcadora expresada puede

45 detectarse, bien directa o indirectamente. La proteína marcadora puede expresarse sola o como una fusión con otra proteína. La proteína marcadora puede detectarse mediante su actividad enzimática; por ejemplo, la β-galactosidasa puede convertir el sustrato X-gal en un producto coloreado y la luciferasa puede convertir la luciferina en un producto emisor de luz. La proteína marcadora puede detectarse por sus características productoras de luz o modificantes; por ejemplo, la proteína fluorescente verde de brilla cuando se ilumina con luz azul. Pueden usarse anticuerpos para detectar la proteína marcadora o una marca molecular sobre, por ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresan la proteína marcadora o la etiqueta pueden seleccionarse, por ejemplo, visualmente, o mediante técnicas tales como el FACS o el cribado usando anticuerpos.

Los PUFA producidos usando los métodos y las composiciones objeto se encuentran en el tejido vegetal y/o parte

55 de la planta huésped como ácidos grasos libres o en formas conjugadas tales como acilgliceroles, fosfolípidos, sulfolípidos o glucolípidos y pueden extraerse a partir de la célula huésped a través de una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir la extracción con solventes orgánicos, la sonicación, la extracción con fluidos supercrítica usando por ejemplo dióxido de carbono y medios físicos tales como las prensas, o las combinaciones de los mismos. Es de particular interés la extracción con metanol y cloroformo. Cuando sea deseable, la capa acuosa puede acidificarse para protonar los grupos cargados negativamente e incrementar de ese modo el reparto de los productos deseados en la capa orgánica. Después de la extracción, los disolventes orgánicos pueden suprimirse mediante evaporación en una corriente de nitrógeno Cuando se aíslan en formas conjugadas, los productos pueden descomponerse enzimática o químicamente para liberar el ácido graso libre o un conjugado menos complejo de interés y pueden someterse a continuación a manipulaciones adicionales para producir un

65 producto final deseado. Deseablemente, las formas conjugadas de los ácidos grasos se descomponen con hidróxido potásico.

Si es necesaria la purificación adicional, pueden emplearse métodos convencionales. Tales métodos pueden incluir la extracción, el tratamiento con urea, la cristalización fraccionaria, la HPLC, la destilación fraccionaria, la cromatografía en gel de sílice, la centrifugación a alta velocidad, o la destilación, o combinaciones de estas técnicas.

5 La protección de los grupos reactivos, tales como los grupos ácidos o alquenilos, puede hacerse en cualquier paso a través de técnicas conocidas, por ejemplo, alquilación o yodación. Los métodos usados incluyen la metilación de los ácidos grasos para producir metilésteres. De un modo similar, los grupos protectores pueden retirarse en cualquier etapa. Deseablemente, la purificación de fracciones que contienen DHA y EPA puede conseguirse mediante tratamiento con urea y/o destilación fraccionaria.

Los usos de la invención objeto son diversos. Las sondas basadas en los ADN de la invención pueden hallar uso en métodos para aislar moléculas relacionadas o en métodos para detectar organismos que expresan genes de tipo PKS. Cuando se usan como sondas, los ADN u oligonucleótidos deben ser detectables. Normalmente, esto se consigue uniendo una marca bien en un sitio interno, por ejemplo a través de la incorporación de un residuo 15 modificado, o en los extremos 5’ o 3’. Tales marcas deben ser directamente detectables, pueden unirse a una molécula secundaria que está marcada detectablemente, o pueden unirse a una molécula secundaria no marcada y a una molécula terciaria marcada detectablemente; este proceso puede extenderse tanto como sea práctico para conseguir una señal detectable satisfactoriamente sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciario, o de puente pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo marcas u otros anticuerpos, o pueden implicar cualesquiera moléculas que se unan entre ellas, por ejemplo, un sistema biotina-estreptoavidina/avidina. Las marcas detectables típicamente incluyen isótopos radiactivos, moléculas que química o enzimáticamente producen o alteran la luz, los enzimas que producen productos de reacción detectables, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes o moléculas cuya fluorescencia

o características de emisión de luz cambian a partir de la unión. Pueden hallarse ejemplos de métodos de marcado

25 en la patente de EE.UU. nº 5.011.770. Alternativamente, la unión de moléculas diana puede detectarse directamente midiendo el cambio en el calor de solución, a partir de la unión de la sonda a la diana, a través de la calorimetría de valoración isotérmica, o recubriendo una superficie con la sonda o diana y detectando el cambio en la dispersión de la luz a partir de la superficie producido por la unión de la diana o sonda, respectivamente, tal como puede hacerse con el sistema BIAcore.

Los PUFA producidos mediante medios recombinantes hallan aplicaciones en una amplia variedad de áreas. El suplemento de humanos o animales con PUFA en varias formas puede resultar en niveles incrementados, no solo de los PUFA añadidos, sino también de su progenie metabólica. Complejos mecanismos reguladores pueden hacer deseable combinar varios PUFA o añadir diferentes conjugados de PUFA con el fin de prevenir, controlar o superar

35 dichos mecanismos para conseguir los niveles deseados de PUFA específicos en un individuo. En el presente caso, la expresión de genes de tipo PKS o de tránscritos de genes de tipo PKS puede alterar los niveles de PUFA específicos, derivados de los mismos, hallados en tejidos vegetales y/o partes de plantas. La región de codificación del gen de tipo PKS se expresa por sí sola o con otros genes con el fin de producir tejidos y/o partes de plantas que contienen proporciones más altas de los PUFA deseados o que contienen una composición de PUFA que se asemeja más estrechamente a la de la leche humana (Prieto y col., publicación PCT WO 95/24494) que los tejidos y/o partes de plantas sin modificar.

Los PUFA, o derivados de los mismos, preparados mediante el método descubierto pueden usarse como para pacientes que experimentan alimentación intravenosa o para prevenir o tratar la malnutrición suplementos dietéticos.

45 Para el suplemento dietético, los PUFA purificados, o los derivados de los mismos, pueden incorporarse en los aceites, grasas o margarinas de cocción, formulados de tal forma que el receptor recibiría la cantidad deseada de PUFA. Los PUFA también pueden incorporarse en fórmulas para niños, suplementos nutricionales u otros productos alimentarios y puede hallar un uso como agentes antiinflamatorios o reductores del colesterol.

Ácidos grasos concretos, tales como EPA, se pueden usar para alterar la composición de las fórmulas para lactantes para duplicar mejor la composición en PUFA de la leche de lactancia humana. Se ha descrito que el triglicérido predominante en la leche humana es el 1,3-di-oleoil-2-palmitoil, indicándose que los 2-palmitoil glicéridos se absorben mejor que los 2-oleoil o 2-lineoil glicéridos (patente de EE.UU. nº 4.876.107). Típicamente, la leche para lactancia humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende desde aproximadamente el 0,15 % hasta

55 aproximadamente el 0,36 % como DHA, desde aproximadamente el 0,03 % hasta aproximadamente el 0,13 % como EPA, desde aproximadamente el 0,30 % hasta aproximadamente el 0,88 % como ARA, desde aproximadamente el 0,22 % hasta aproximadamente el 0,67 % como DGLA y desde aproximadamente el 0,27 % hasta aproximadamente el 1,04 % como GLA. Una proporción preferida de GLA:DGLA:ARA en fórmulas para lactantes es de aproximadamente 1:1:4 a aproximadamente 1:1:1, respectivamente. Un experto en la técnica puede determinar las cantidades de aceites que proporcionan estas proporciones de PUFA sin experimentación indebida. Los PUFA, o las células huésped que los contienen, también se pueden usar como suplementos dietéticos para animales para alterar la composición en ácidos grasos de tejido de un animal o de la leche a una más deseable para consumo humano o animal.

65 Para un uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones se administran generalmente de forma oral, pero pueden administrarse por cualquier vía por la que se pueda absorber con éxito, por ejemplo, por vía parenteral (es decir, subcutánea, intramuscular o intravenosa), rectal o vaginal o tópicamente, por ejemplo, como una pomada

o loción para la piel. Cuando están disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma de administración oral preferida. El suplemento dietético, tal como se ha establecido anteriormente, puede proporcionar también una vía oral de administración Los ácidos insaturados pueden administrarse en formas conjugadas, o como sales, ésteres,

5 amidas o profármacos de los ácidos grasos. Cualquier sal farmacéuticamente aceptable está contemplada, son especialmente preferidas las sales de sodio, potasio o litio. También se contemplan las sales de Nalquilpolihidroxamina, tales como la N-metilglucamina, halladas en la publicación del documento PCT WO 96/33.155. Los ésteres preferidos son los ésteres etílicos.

10 Los PUFA de la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Como sales sólidas, los PUFA pueden administrarse también en forma de comprimido. Para la administración intravenosa, los PUFA o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como intralípidos. Cuando se desee, los componentes individuales de las formulaciones pueden proporcionarse individualmente en forma de equipo, para uso único o múltiple. Una

15 dosificación típica para un ácido graso particular va desde 0,1 mg hasta 20 g, o incluso 100 g, diarios y preferentemente es de 10 mg hasta 1, 2, 5 o 10 g diarios según se requiera, o cantidades molares equivalentes de formas derivadas del mismo. Se contemplan las composiciones de nutrición parenteral que comprenden desde aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 30 por ciento en peso de ácidos grasos, calculados como triglicéridos. Opcionalmente pueden añadirse otras vitaminas y particularmente vitaminas solubles en grasas, tales

20 como las vitaminas A, D, E y la L-carnitina. Cuando se desee, puede añadirse un conservante tal como el αtocoferol, típicamente a aproximadamente el 0,1 % en peso.

Los ejemplos siguientes se presentan a modo de ilustración y no como limitación.

25 Ejemplos

Ejemplo 1

La identidad de los ORF derivados de Vibrio marinus

30 Usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores a base de secuencias de ORF 6 de Shewanella (Sp ORF 6) (cebadores directos 5' CUACUACUACUACCAAGCT AAAGCACTTAACCGTG, SEC ID Nº 41 y CUACUACUACUAACAGCGAAATG CTTATCAAG, SEC ID Nº 42, para Vibrio y SS9 respectivamente y cebadores inversos 3': CAUCAUCAUCAUGCGACCAAAACCAAATGAGCTAATAC, SEC ID Nº 43, para Vibrio y

35 SS9) y moldes de ADN genómico de Vibrio y de una Photobacter borófila productora de EPA (proporcionado por el Dr. Bartlett, UC San Diego), tuvo como resultado productos de PCR de aproximadamente 400 bases para Vibrio marinus (Vibrio) y de de aproximadamente 900 bases para SS9 con una homología superior al 75 % con los fragmentos correspondientes del ORF6 de Sp (véase la figura 25) determinado mediante recuento directo de los aminoácidos homólogos.

40 Después se preparó una biblioteca de cósmidos de Vibrio y usando el producto de la PCR del ORF 6 de Vibrio como sonda (véase la figura 6); los clones que contienen al menos el ORF 6 se seleccionaron mediante hibridación de colonias.

45 A través de secuencias adicionales de los cósmidos seleccionados, tales como el cósmido nº 9 y el cósmido nº 21, se obtuvo un clúster de Vibrio (figura 5) con ORF homólogos y organizados en un orden secuencial (ORF 6-9) como los ORF 6-9 de Shewanella (figura 7). Los ORF de Vibrio a partir de esta secuencia se encuentran en de 17394 a 36115 y comprenden los ORF 6-9.

50 Tabla Cifras del operón de Vibrio

17394 a 25349 Longitud = 7956 nt

25509 a 28157 Longitud = 2649 nt

28209 a 34262 Longitud = 6054 nt

34454 a 36115 Longitud = 1662 nt

Las designaciones de los ORF para los genes de Shewanella se basan en los divulgados en la figura 4 y difieren de los publicados para el clúster de Shewanella (Yazawa y col., patente de EE.UU. nº 5.683.898). Por ejemplo, el ORF 3 de la figura 4 se lee en dirección opuesta de los demás ORF y no se divulga en Yazawa y col. patente de EE.UU.

55 nº 5.683.898 (véase la figura 24) comparando con Yazawa y col. patente de EE.UU. nº 5.683.898

Las secuencias homólogas al ORF3 no se encontraron en la proximidad del ORF 6 (17.000 bases cadena arriba del ORF 6) o del ORF 9 (aprox. 4.000 bases cadena abajo del ORF 9). Los motivos característicos de las fosfopantetenil-transferasas (Lambalot y col. (1996) Current Biology 3: 923-936) no estaban en las secuencias de Vibrio sometidas a cribados para estos motivos. Además, no había coincidencia con las sondas derivadas del ORF 3 de Sp en digestos genómicos de Vibrio y de SC2A Shewanella (otra bacteria proporcionada por la University of San Diego y también capaz de producir EPA). Aunque el ORF3 puede existir en Vibrio, su ADN puede no ser homólogo

5 al del ORF3 de Sp y/o podría localizarse en porciones del genoma que no se han secuenciado.

La figura 6 proporciona la secuencia de un clon de Vibrio de aproximadamente 19 kb que comprende los ORF 6-9. Las figuras 7 y 8 comparan las organizaciones del clúster génico de los sistemas de tipo PKS de Vibrio marinus y Shewanella putrefacians Las figuras 9 a 12 muestran los niveles de la homología de secuencia entre los correspondientes ORG 6, 7, 8 y 9, respectivamente.

Ejemplo 2

El ORF 8 dirige la producción de DHA

15 Como se describe en el ejemplo 1, el ADN homólogo al ORF6 de Sp se encontró en una especie no relacionada, SS9 Photobacter, que también es capaz de producir EPA. Adicionalmente, los ORF homólogos al ORF 6-9 de Sp se encontraron en Vibrio marinus (Vibrio) productora de DHA. A partir de estos ORF se diseñó una serie de experimentos en los que las deleciones en cada ORF 6-9 de Sp que suprime la síntesis de EPA en E. coli (Yazawa (1996) supra) se complementaron mediante los correspondientes genes homólogos de Vibrio.

El clúster de EPA de Sp se usó determinando si alguno de los ORF 6-9 de Vibrio era responsable de la producción de DHA. Las mutaciones de deleción proporcionadas para cada uno de los ORF de Sp son nulas par EPA y DHA. Después, cada deleción se complementó mediante el correspondiente ORF de Vibrio expresado tras un promotor lac

25 (figura 13).

La complementación de una deleción e ORF 6 de Sp mediante un ORF 6 de Vibrio reestableció la producción de EPA. Se obtuvieron resultados similares complementando las deleciones de ORF 7 y ORF 9 de Sp. Por el contrario, la complementación de una deleción en ORF 8 de Sp tuvo como resultado la producción de C22:6. Por tanto, el ORF 8 de Vibrio parece ser un elemento clave en la síntesis de DHA. Las figuras 14 y 15 muestran cromatogramas de perfiles de ácidos grasos de las respectivas complementaciones de del ORF 6 de Sp con el ORF 6 de Vibrio (EPA y no DHA) y del ORF 8 de Sp con ORF 8 de Vibrio (DHA). La figura 16 muestra los porcentajes de ácido graso para la complementación del ORF 8, que de nuevo demuestra que el ORF8 es responsable de la producción de DHA.

35 Estos datos muestran que los genes de síntesis de tipo policétidos con ORF relacionados o similares se pueden combinar y expresar en un sistema heterólogo y usar produciendo una especie de PUFA distinta en el sistema huésped y que el ORF8 desempeña un papel en la determinación de la longitud última de la cadena. Los ORF 6, 7, 8 y 9 de Vibrio reestablecen la síntesis de EPA. En el caso del ORF 8 de Vibrio también hay DHA (aprox. 0,7 %) junto con EPA (aprox. 0,6 %) que indica que este gen desempeña un papel significativo en la dirección de la síntesis de DHA frente de EPA para estos sistemas.

Ejemplo 3

Requisitos para la producción de DHA

45 Determinando cómo los ORF de Vibrio del clúster de ORF 6-9 se usan en combinación con el ORF 8 de Vibrio se crearon algunas combinaciones del ORF 8 de Vibrio con algunos o todos los clúster de ORF 6-9 de Vibrio explicando la síntesis de DHA-

Los ORF 6-9 de Vibrio se complementaron con el ORF 3 de Sp, Los resultados de esta complementación se presentan en las figuras 16b y16c. Las cantidades significativas de DHA medidas (más de aproximadamente un 9 %) y la ausencia de EPA sugieren que no se requieren ORF aparte de los ORF 6-9 de Vibrio para la síntesis de DHA cuando se combinan con el ORF 3 de Sp. Esto sugiere que el ORF 3 de Sp desempeña una función general en la síntesis de PUFA bacterianos.

55 Con respecto a la producción de DHA frente a EPA, puede ser necesario combinar el ORF 8 de Vibrio con otros ORF de Vibrio del clúster 6-9 con el fin de producir específicamente DHA. Las funciones del ORF 9 de Vibrio y cada una de las combinaciones de ORF de Vibrio (6,8), (7, 8), (8, 9), etc., en la síntesis de DHA se están estudiando.

Ejemplo 4

Construcciones de expresión en plantas

Se diseñó un vector de clonación con muy pocos sitios de restricción facilitando la clonación de fragmentos grandes

65 y su posterior manipulación. Un adaptador se montó mediante hibridación de oligonucleótidos con las secuencias AAGCCCGGGCTT, SEC ID Nº 44 y GTACAAGCCCGGGCTTAGCT, SEC ID Nº 45. Este adaptador se unió al vector pBluescript II SK+ (Stratagene) tras la digestión del vector con las endonucleasas de restricción Asp718 y SstI. El vector resultante pCGN7769 tiene un único sitio de clonación SrfI (y un SmaI incluido) para la clonación de fragmentos de ADN de extremos romos.

5 Un plásmido que contiene el casete de napina de pCGN3223, (patente de EE.UU. nº 5.639.790) se modificó haciéndolo más útil clonando fragmentos grandes de ADN que contienen múltiples sitios de restricción y permitiendo la clonación de varios genes de fusión de napina en vectores de transformación binaria de plantas. Un adaptador comprendido por el oliginucleótido autohibridado de secuencia CGCGATTTAAATGGCGCGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGC GCCATTTAAAT, SED ID Nº 46 se ligó en el vector pBC SK+ (Stratagene) tras la digestión del vector con la endonucleasa de restricción BssHII construyendo el vector pCGN7765. Los plásmidos pCGN3223 y pCGN7765 se digirieron con NotI y se ligaron. El vector resultante, pCGN7770 (figura 17), contiene la estructura de pCGN7765 y el casete de expresión específico de la semilla de napina de pCGN3223.

15 Construcciones de Shewanella

Los genes que codifican proteínas de Shewanella se mutagenizaron introduciendo sitios de clonación adecuados en los ORF en 5' y 3' ORF usando PCR. El molde para las reacciones de PCR fue en ADN del cósmido pEPA (Yazawa y col., supra). Las reacciones de PCR se realizaron con la ADN polimerasa Pfu de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Los productos de la PCR se clonaron en pCGN7769.digerido con SrfI. Los cebadores CTGCAGCTCGAGACAATGTTGATT TCCTTATACTTCTGTCC, SEC ID Nº 47 y GGATCCAGATCTCTAGCTAGTC TTAGCTGAAGCTCGA, SEC ID Nº 48, se usaron amplificando el ORF 3 y generar el plásmido pCGN8520. Los cebadores TCTAGACTCGAGACAATGAGCCAGACCTC TAAACCTACA, SEC ID Nº 49 y CCCGGGCTCGAGCTAATTCGCCTCACTGTC GTTTGCT, SEC ID Nº 50, se usaron amplificando el ORF 6 y

25 generando el plásmido pCGN7776. Los cebadores GAATTCCTCGAGACAATGCCGCTGCGCATCG CACTTATC,SEC ID Nº 51 y GGTACCAGATCTTTAGACTTCCCCTTGAAG TAAATGG, SEC ID Nº 52, se usaron amplificando el ORF 7 y generando el plásmido pCGN7771. Los cebadores GAATTCGTCGACACAATGTCATTACCAGACAATGC TTCT, SEC ID Nº 53 y TCTAGAGTCGACTTATACAGATTCTTCGATGCT GATAG, , SEC ID Nº 54, se usaron amplificando el ORF 8 y generando el plásmido pCGN7775. Los cebadores GAATTCGTCGACACAATGAATCCTACAGCAACTAACGAA, SEC ID Nº 55 y TCTAGAGGATCCTTAGGCCATTCTTTGGTTTGGCTTC, SEC ID Nº 56, se usaron amplificando el ORF 9 y generando el plásmido pCGN7773.

La integridad de los productos de PCR se verificó mediante secuenciación del ADN de los insertos de pCGN7771,

35 PCGN8520 y pCGN7773. EL ORF 6 y el ORF 8 tenían un tamaño bastante grande. Con el fin de evitar la secuenciación de todos los clones, las porciones centrales de los ORF se sustituyeron con fragmentos de restricción de pEPA. El fragmento de pEPA sometido a PacI/BamHI de 6,6 kilobases que contiene la porción central del ORF 6 se ligó en pCGN777 digerido con PacI/BamHI dando pCGN7776B4. El fragmento de pEPA sometido a BamHI/BglII de 4,4 kilobases que contiene la porción central del ORF 8 se ligó en pCGN7775 digerido con BamHI/BglII dando pCGN7775A Las regiones flanqueantes del fragmento de pEPA y las uniones de clonación se verificaron mediante secuenciación del ADN.

El plásmido pCGN7771 se cortó con XhoI y BglII y se ligó en pCGN7770 tras la digestión con SalI y BgIII. El plásmido de fusión con el gen de napina/ORF7 resultante se diseñó pCGN7783. El plásmido pCGN8520 se cortó

45 con XhoI y BglII y se ligó en pCGN7770 tras la digestión con SalI y BgIII. El plásmido de fusión con el gen de napina/ORF7 resultante se designó pCGN8528.. El plásmido pCGN7773 se cortó con SalI y BamHI y se ligó en pCGN7770 tras la digestión con SalI y BgIII. El plásmido de fusión con el gen de napina/ORF 9 resultante se designó pCGN7785. El plásmido pCGN7775A se cortó con SalI y se ligó en pCGN7770 tras la digestión con SalI. El plásmido de fusión con el gen de napina/ORF 8 resultante se designó pCGN7782. El plásmido pCGN7776B4 se cortó con XhoI y se ligó en pCGN7770 tras la digestión con SalI. El plásmido de fusión con el gen de napina/ORF 6 resultante se designó pCGN7786B4.

Se construyó un vector binario para la transformación en plantas, pCGN5139, a partir de pCGN1558 (McBride y Summerfelt (1990) Plant Molecular Biology, 14: 269-276). El poliligador de pCGN1558 se sustituyó como un

55 fragmento de HindIII/Asp718 por un poliligador que contiene sitios de endonucleasas de restricción únicos AscI, PacI, XbaI, SwaI, BamHI y NotI. Los sitios de endonucleasas de restricción Asp718 y HindIII se conservan en pCGN5139 El PCGN5139 se digirió con NotI y se ligó con pCGN7786B4.digerido con NotI. El vector binario resultante que contiene el gen de napina/ORF 6 resultante se designó pCGN8533. El pCGN8533 se digirió con Sse8387I y se ligó con pCGN7786B4.digerido con Sse8387I. El vector binario resultante que contiene el gen de napina/ORF 6 resultante y el gen de fusión de napina/ORF 8 se designó pCGN8535 (figura 18).

El vector de transformación binario en plantas, pCGN5139, se digirió con Asp718 y se ligó con pCGN7786B4.digerido con Asp718I. El vector binario resultante que contiene el gen de napina/ORF 3 resultante se designó pCGN8532. El plásmido pCGN8532 9 se digirió con NotI y se ligó con pCGN7783 digerido con NotI. El 65 vector binario resultante que contiene el gen de napina/ORF 3 resultante y el gen de fusión de napina/ORF 7 se designó pCGN8534. El pCGN8534 se digirió con Sse8387I y se ligó con pCGN7785 digerido con Sse8387I. El

vector binario resultante que contiene el gen de napina/ORF 3 resultante y el gen de fusión de napina/ORF 7 y el gen de fusión de napina/ORF 8 se designó pCGN8537 (figura 19).

Construcciones de Vibrio

5 Los ORF de Vibrio para la expresión en plantas se obtuvieron todos ellos usando el cósmido nº 9 de Vibrio como molécula de partida. El cósmido nº 9 de Vibrio fue uno de los cósmidos aislados de la biblioteca de cósmidos de Vibrio usando el producto de la PCR del ORF 6 de Vibrio como se describe en el Ejemplo 1.

Un gen que codifica el ORF 7 de Vibrio (figura 6) se mutagenizó introduciendo el sitio de SalI cadena arriba del marco de lectura abierto y el sitio de BamHI cadena abajo del marco de lectura abierto usando los cebadores de PCR: TCTAGAGTCGACACAATGGCGGAATTAGCTG TTATTGGT, SEC ID Nº 57 y GTCGACGGATCCCTATTTGTTCGTGTTTGCTA TATG SEC ID Nº. Un gen que codifica el ORF 9 de Vibrio (figura 6) se mutagenizó introduciendo el sitio de SalI cadena arriba del marco de lectura abierto y el sitio de XhoHI cadena

15 abajo del marco de lectura abierto usando los cebadores de PCR: GTCGACGGATCCA CAATGAATATAGTAAGTAATCATTCGGCA, SEC ID Nº 59 y GTCGACCTC GAGTTAATCACTCGTACGATAACTTGCC, SEC ID Nº 60. Los sitios de restricción se introdujeron usando PCR y la integridad de los plásmidos mutageneizados se verificó mediante la secuencia del ADN. El gen del ORF 7 de Vibrio se clonó como fragmento de digestión con SalI-BamHI en el casete de napina del pCGN7770 digerido con Sal-BglI (figura 17) dando pCGN8539 El gen del ORF 9 de Vibrio se clonó como fragmento de digestión con SalI-BamHI en el casete de napina del pCGN7770 digerido con Sal-BglI (figura 17) dando pCGN8543.

Los genes que codifican el ORF 6 y el ORF 8 de Vibrio se mutagenizaron introduciendo los sitios SalI flanqueando a los marcos de lectura abiertos. Los sitios SalI flanqueando a ORF 6 se introdujeron usando PCR. Los cebadores

25 usados fueron: CCCGGGTCGACACAATGGCTAAAAAGAACA CCACATCGA, SEC ID Nº 61 y CCCGGGTCGACTCATGACATATCGTTCAAA ATGTCACTGA, SEC ID Nº 62. El fragmento central de 7,3 Kb digerido con BamHI-XhoI del producto de la PCR se sustituyó con el correspondiente fragmento del cósmido nº 9 de Vibrio. El ORF 6 mutageneizado se clonó en el sitio SalI del casete de la napina de pCGN7770 dando el plásmido pCGN8554.

La mutagénesis del ORF 8 usó una estrategia diferente. Un fragmento de BamHI que contenía el ORF8 se subclonó en el plásmido pHC79 dando el cósmido nº 9. Se introdujo un sitio SalI cadena arriba de la región de codificación y un adaptador compuesto por los oligonucleótidos TCGACATGGAAAATATTGCAGTAGTAGGTATTGCTAATTT GTTC, SEC ID Nº 63 y CCGGGAACAAATTAGCAATACCTACTACTGCAAT ATTTTCCATG, SEC ID Nº 64. El

35 adaptador se ligó en el cósmido nº 9 tras la digestión con SalI y XmaI. Mediante PCR para mutagénesis se introdujo un sitio SalI cadena abajo del codón de terminación. Un fragmento de ADN que contiene el codón de terminación se generó usando el cósmido nº 9 como molde con los cebadores TCAGATGAACTTTATCGATAC, SEC ID Nº 65 y TCATGAGACGTCGTCGACTTACGCTTCAACAATACT, SEC ID Nº 66. El producto de la PCR se digirió con las endonucleasas de restricción ClaI y AatII y se clonó en el derivado del cósmido nº 9 digerido con las mismas enzimas dando el plásmido 8P3. El fragmento de SalI de 8P3 se clonó en pCGN7770 digerido con SalI dando pCGN8515.

PCGN8532, un vector de transformación en plantas binario que contiene un ORF 3 de Shewannella sometido al control del promotor de la napina se digirió con NotI y se insertó un fragmento NotI de pCGN8539 que contiene una

45 fusión génica del ORF 7 de Vibrio ORF 7 de napina dando pCGN8552. El plásmido de pCGN8556 (figura 23), que contiene el ORF 3 de Shewannella y el ORF 7 y 9 de Vibrio sometido al control del promotor de la napina se construyó mediante clonación del fragmento pCGN8543 en pCGN8552 digerido con Sse8387.

El gen de napina/ORF 8 digerido con NotI del plásmido pCGN8515 se clonó en un vector de transformación en plantas binario diferido con NotI pCGN5139 dando pCGN8548. El gen de napina/ORF 6 digerido con Sse8387 del plásmido pCGN8554 se clonó después en el sitio de Sse8387 de pCGN8566. El vector binario resultante que contiene el gen de napina/ORF 6 resultante y el gen de fusión de napina/ORF 8 se designó pCGN8560 (figura 22).

Ejemplo 5

55 Transformación de plantas y producción de PUFA

Producción de EPA

Las construcciones pCGN8535 y pCGN8537 de Shewanella se pueden transformar en las mismas plantas o en plantas distintas. Si se usan plantas distintas, las plantas transgénicas se pueden cruzar y dar lugar a semillas heterocigotos que contienen ambas construcciones.

pCGN8535 y pCGN8537 se transforman por separado en Brassica napus. Las plantas se seleccionan en medio que

65 contiene kanamicina y la transformación mediante insertos de longitud completa de las construcciones se verifica mediante análisis de tipo Southern. Las semillas inmaduras también se pueden analizar determinando la expresión de proteínas de la enzima codificada por los ORF 3, 6, 7, 8, o 9 usando análisis de tipo western, en cuyo caso, se escogen las plantas transformadas T1 que mejor expresan pCGNE8535 y pCGN8537 y se cultivan para su posterior experimentación y cruzamiento. Como alternativa, las plantas transformadas T1 que muestran la inserción mediante Southern se cruzan entre sí produciendo semillas T2 que tienen ambas inserciones. En esta semilla, en la mitad de

5 las semillas se puede analizar directamente la expresión de EPA en la fracción de ácidos grasos. La mitad de las semillas que quedan de casos con la mejor producción de EPA se cultivan y desarrollan mediante técnicas de cultivo convencionales proporcionando líneas de Brassica para la producción de EPA.

Los plásmidos pCGN7792 y pCGN7795 también se introducen de forma simultánea en células huésped de Brassica napus . Se usa un protocolo de transformación estándar (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.463.174 y la patente de EE.UU. nº 5.750.871, aunque Agrobacteria que contienen ambos plásmidos se mezclan e incuban con cotiledones de Brassica durante la etapa de cocultivo. Muchas de las plantas resultantes se transforman con ambos plásmidos.

15 Producción de DHA

Una planta se transforma para la producción de DHA introduciendo pCGN8556 y pCGN8560, en plantas separadas

o de forma simultánea en las mismas plantas, como se ha descrito para la producción de EPA.

Como alternativa, los ORF de Shewanella se pueden usar de un modo concertado con los ORF 6 y 8 de Vibrio, mediante transformación con una planta las construcciones pCGN8560 and pCGN7795, lo que permite la expresión de los correspondientes ORF en una célula vegetal. Esta combinación proporciona una disposición de genes de tipo PKS que comprenden los ORF 3, 7 y 9 de Shewanella, con un ORF 6 derivado de Vibrio y un OFR 8 derivado de Vibrio. Como se ha descrito anteriormente, el ORF 8 es el gen de tipo PKS que controla la identidad del producto

25 PUFA final. Por tanto, las plantas transformadas resultantes produce DHA en un aceite de la planta.

Ejemplo 6

Plantas transgénicas que contienen los genes de PUFA de Shewanella

Plantas de Brassica

Se analizaron cincuenta y dos plantas cotransformadas con los plásmidos pCGN8535 y pCGN8537 usando PCR determinando si había ORF de Shewanella en las plantas transgénicas. Cuarenta y una plantas contenían el

35 plásmido pCGN8537 y treinta y cinco contenían el pCGN8535. 11 de las plantas contenían los cinco ORF requeridos para la síntesis de EPA. Varias plantas contenían genes de los plásmidos binarios pero parecían carecer de al menos uno de los ORF. En la actualidad se está realizando el análisis de aproximadamente veinte plantas más.

Se analizaron veintitrés plantas transformadas solo con pCGN8535 usando PCR determinando si había ORF de Shewanella en las plantas transgénicas. Trece de estas plantas contenían el ORF 6 de Shewanella yel ORF 8 de Shewanella. Seis de las plantas solo contenían un ORF.

Se analizaron diecinueve plantas transformadas con pCGN8537 usando PCR determinando si había ORF de Shewanella en las plantas transgénicas. Dieciocho de las plantas contenían el ORF 3 de Shewanella, el ORF 7 de

45 Shewanella y el ORF 9 de Shewanella. Una planta contenía los ORF 3 y 7 de Shewanella.

Arabidopsis

En nuestras cámaras de crecimiento están creciendo más de 40 plantas transgénicas de Arabidopsis cotransformadas con los plásmidos pCGN8535 y pCGN8537. El análisis mediante PCR determinando qué ORF están presentes en las plantas se está realizando actualmente.

Ejemplo 7

55 Pruebas de un sistema de PKS de la síntesis de PUFA en Schizochytrium

La finalidad de este experimento era identificar fuentes adicionales de genes de PK. Los ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados se identificaron en aceite de Schizochytrium. Además, la producción de ácidos grasos poliinsaturados se detectó en un cultivo de Schizochytrium. Un cultivo recién diluido de Schizochytrium se incubó a 24 ºC en presencia de [14C]-acetato (5uCi/ml) durante 30 minutos con agitación (150 rpm). Después, las células se recolectaron mediante centrifugación, se liofilizaron y se sometieron a un protocolo de transesterificación que implicó calentamiento hasta 90 ºC durante 90 minutos en presencia de metanol ácido (9 % de H2SO4) con tolueno (1 volumen de tolueno por dos volúmenes de metanol ácido) como segundo disolvente. Los ésteres metílicos resultantes se extrajeron con un disolvente orgánico (hexano) y se separaron mediante TLC (gel de sílice G, 65 desarrollado tres veces con hexano:éter dietílico ((19:1)). La radioactividad de la placa de TLC se detectó con un escáner (AMBIS). Se detectaron dos bandas principales en la placa de TLC. Estas bandas migraron en la placa de

TLC en las posiciones previstas para los ésteres metílicos saturados de cadena corta (14 a 16 carbonos) (banda superior) y con ésteres metílicos de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (de 20 a 22 carbonos) (la banda inferior). Estos fueron también los tipos principales de ácidos grasos detectados mediante análisis CG de FAME del aceite de Schizochytrium.

5 En un experimento paralelo, a los tubos de ensayo se añadió tiolactomicina, un conocido inhibidor de los sistemas de síntesis de ácidos grasos de tipo II, así como de diversos sistemas de síntesis de policétidos, incluida la producción de EPA por E. coli transformada con genes de PKS derivados de Shewanella, en concentraciones variables (0, 1, 10 y 100 μg/ml) antes de la adición de los cultivos celulares de Schizochytrium y [14C] acetato. El análisis de la incorporación de [14C] acetato, como se ha descrito anteriormente, reveló que la concentración de 100 ug/ml de tiolactomicina bloqueaba por completo la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados, mientras que se observó inhibición parcial de la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados con 10 ug/ml de tiolactomicina. La síntesis de los ácidos grasos saturados de cadena corta no se vió afectada con ninguna de las concentraciones de tiolactomicina. La tiolactomicina no inhibe los sistemas de síntesis de ácidos grasos de tipo I y no es tóxica para los

15 ratones, lo que sugiere que no inhibe el sistema de elongación que da lugar a la formación de EPA o DHA. Además, la tiolactomicina no inhibió el sistema de elongación que da lugar a la síntesis de PUFA en Phaeodactylum tricornutum. Por tanto, aunque se sabe que Schizochytrium posee un sistema de síntesis de ácidos grasos de tipo I, los datos sugirieron que los ácidos grasos poliinsaturados producidos en este organismo derivaban de un sistema distinto al del sistema de síntesis de ácidos grasos de tipo I que producía ácidos grasos de cadena corta y a partir de un sistema similar a la ruta de elongación/desaturación hallada en Phaeodactylum Los datos son consistentes con la formación de DHA como resultado de una ruta de PKS como en Vibrio marinus y Shewanella putrefaciens.

Ejemplo 8

25 Secuencias relacionadas con PKS de Schizochytrium

La finalidad de este experimento era identificar secuencias de Schizochytrium con genes de PKS codificados. Se construyó una biblioteca de ADNc de Schizochytrium y se secuenciaron aproximadamente 8.000 clones al azar (EST). La secuencia de proteínas codificada por los genes de síntesis de EPA de Shewanella se comparó con las secuencias de aminoácidos predichas de los EST de Schizochytrium usando un algoritmo de alineamiento de Smith/Waterman. Cuando la secuencia de proteínas del ORF6 (Shewanella) se comparó con las secuencias de aminoácidos de los EST de Schizochytrium, 38 clones de EST mostraron un grado significativo de identidad (P<0,01). Cuando la secuencia de proteínas del ORF7 se comparó con los EST de Schizochytrium, 4 clones de EST mostraron una identidad significativa (P < 0,01) lo que sugiere que las moléculas eran homólogas. Cuando la

35 secuencia de proteínas del ORF8 y ORF9 se compararon con los EST de Schizochytrium, 7 y 14 clones, respectivamente, mostraron un grado significativo de identidad (P < 0,01).

Ejemplo 9

Análisis de los clones de ADNc de Schizochytrium

Se usó el análisis con enzimas de restricción de los clones EST de Schizochytrium determinando los clones más grandes, que después se secuenciaron en su totalidad. Se determinó que todas las secuencias EST descritas en el Ejemplo 8 eran parte de los 5 clones de ADNc. Dos de los clones de ADNc eran homólogos al ORF 6 de 45 Shewanella. LIB3033-047-B5 era homólogo del extremo C del ORF6. La secuencia de LIB3033-047-B5 se pudo alinear con el ORF6 de Shewanella de los aminoácidos 2093 en adelante. El marco de lectura abierto de LIB3033047-B5 se extendió hasta el extremo 5’ de la secuencia, de modo que no es probable que este clon sea de longitud completa. LIB3033-046-E6 compartía homología con el dominio ACP del ORF6. Contenía 6 repeticiones de ACP. Este clon de ADNc no tenía una cola de poli A y por tanto, era probable que fuera un ADNc parcial con regiones adicionales del ADNc cadena abajo de la secuencia. Los cebadores para PCR GTGATGATCTTTCCCTGATGCACGCCAAGG (SEC ID Nº 67) y AGCTCGAGACCGGCAACCCGCAGCGCCAGA (SEC ID Nº 68) se usaron amplificando un fragmento de aproximadamente 500 nucleótidos del ADN genómico de Schizochytrium. El cebador GTGATGATCTTTCCCTGATGCACGCCAAGG se obtuvo de LIB3033-046-E6 y el cebador AGCTCGAGACCGGCAACCCGCAGCGCCAGA se obtuvo de LIB3033-047-B5. Por tanto, LIB3033-046-E6

55 and LIB3033-047-B5 representaban diferentes porciones del mismo ARNm (véase la figura 28) y se pudieron montar en una única secuencia de ADNc parcial (véase la figura 27A), SEC ID Nº 69, de la que se ha predicho que codificaba una proteína con la secuencia en la figura 29A (SEC ID Nº 70). El marco de lectura abierto se extendió hasta el extremo 5’ de la secuencia, de modo que no es probable que este ADNc parcial sea de longitud completa. El análisis del ADNc adicional o los clones genómicos permiten la determinación de la extensión completa del ARNm representado por los clones LIB3033-046-E6 y LIB3033-047-B5. Puede contener dominios relacionados de enzima de condensación similares a los hallados cerca del extremo N del ORF6 de Shewanella.

Uno de los clones de ADNc, LIB3033-046-D2, era homólogo al ORF9 de Shewanella en su extremo 3’. Este clon fue homólogo a la región del factor de longitud de la cadena del ORF9 de Shewanella en su extremo 5’. Este clon 65 también fue homólogo del marco de lectura abierto completo del ORF de Anabaena HgIC. El ORF de Anabaena HgIC es homólogo a la región del factor de longitud de la cadena del ORF8 de Shewanella y el ORF87 de

Shewanella, Por tanto, este ADNc (figura 27B), SEC ID Nº 71 era homólogo de parte del ORF8 de Shewanella, el ORF8, el ORF7 de Shewanella y el ORF9 de Shewanella (véase la figura 28). La secuencia de aminoácidos (figura 29B), SEC ID Nº 72, codificada por el marco de lectura abierto de LIB3033-046-D2 se extendió hasta el extremo 5’ de la secuencia, de modo que no es probable que este clon sea de longitud completa. El análisis del ADNc adicional

5 o los clones genómicos permiten la determinación de la extensión completa del ARNm representado por LIB3033046-E6. Puede contener dominios relacionados de enzima de condensación similares a los hallados cerca del extremo N del ORF8 de Shewanella.

Dos de los clones de ADNc adicionales eran homólogos al ORF 8 de Shewanella. LIB81-015-D5 era homólogo del

10 extremo C del ORF8. La secuencia de LIB81-015-D5 en 5’ se pudo alinear con el ORF8 de Shewanella de los aminoácidos 1900 en adelante. El extremo 3’ de LIB81-015-D5 se pudo alinear con el ORF9 de Shewanella (véase la figura 28). La secuencia de aminoácidos (figura 29C), SEC ID Nº 73, codificada por el marco de lectura abierto de LIB81-015-D5 se extendió hasta el extremo 5’ de la secuencia, de modo que no es probable que este clon sea de longitud completa. LIB81-042-B9 fue homólogo de los aminoácidos 1150 a 1850 del ORF 8 de Shewanella. LIB81

15 042-B9 no tenía una cola de poli A y por tanto, era probable que fuera un ADNc parcial con regiones adicionales del ADNc cadena abajo de la secuencia. Los cebadores para PCR TACCGCGGCAAGACTATCCGCAACGTCACC (SEC ID Nº 74 y GCCGTCGTGGGCGTCCACGGACACGATGTG (SEC ID Nº: 75) se usaron amplificando un fragmento de aproximadamente 500 nucleótidos del ADN genómico de Schizochytrium. El cebador TACCGCGGCAAGACTATCCGCAACGTCACC se obtuvo de LIB81-042-B9 y el cebador

20 GCCGTCGTGGGCGTCCACGGACACGATGTG se obtuvo de LIB81-015-D5. Por tanto, LIB81-042 y LIB81-015-D5 representaban diferentes porciones del mismo ARNm y se montaron en una única secuencia de ADNc parcial (véase la figura 27C), SEC ID Nº 76. El marco de lectura abierto de LIB81-042-B9 se extendió hasta el extremo 5’ de la secuencia, de modo que tampoco es probable que este clon sea de longitud completa. El análisis del ADNc adicional o los clones genómicos permiten la determinación de la extensión completa del ARNm representado por

25 LIB81-042-B9.

Mediante la presente invención, los genes de tipo PKS de varios organismos se pueden usar ahora transformando células vegetales y modificando las composiciones de ácidos grasos de las membranas de células vegetales de aceites de semillas de plantas a través de la biosíntesis de PUFA en las células vegetales transformadas. Debido a 30 la naturaleza de los sistemas de tipo PKS, los productos finales de ácidos grasos producidos en las células vegetales se pueden seleccionar o diseñar conteniendo una serie de estructuras químicas específicas. Por ejemplo, los ácidos grasos pueden comprender las variantes siguientes: variaciones en los números de grupos ceto o hidroxilo en varias posiciones a lo largo de la cadena de carbono; variaciones en el número y tipos (cis o trans) de dobles enlaces; variaciones en el número y tipos de ramificaciones de la cadena lineal de carbonos (metilo, etilo o

35 restos ramificados más largos) y variaciones en los carbonos saturados. Además, la longitud concreta del ácido graso final se puede controlar mediante los genes de tipo PKS concretos usados.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención.

40 Habiéndose descrito completamente la invención, será obvio para un experto en la técnica que se pueden realizar muchos cambios y modificaciones de la misma sin desviarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Listado de secuencias

<110> Lassner, Michael Metz, James G Facciotti, Daniel

<120> GENES DE LA PKS DE SCHIZOCHYTRIUM

<130> CGNE.131.02WO

<140> Pendiente de asignación 50 <141> 14-1-2000

<150> 09/231.899

<151> 14-1-1999

<150> 09/090.793

<151> 4-6-1998 55 <150> 60/048.650

<151> 4-6-1997

<160> 86

<170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 60 <211> 37895

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 1

<210> 2

<211> 654

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 2

<210> 3

<211> 277

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 3

<210> 4

<211> 1480

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 4

<210> 5

<211> 970

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 5

<210> 6

<211> 288

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 6

<210> 7

<211> 2756

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 7

<210> 8

<211> 771

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 8

<210> 9

<211> 2004

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 9

<210> 10

<211> 543

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 10

<210> 11

<211> 499

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 11

<210> 12

<211> 40138

<212> ADN

<213> Vibrio marinus <400>.12

<210> 13

<211> 19227

<212> ADN

<213> Vibrio marinus

<400> 13

<210> 14

<211> 217

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 14

<210> 15

<211> 72 10 <212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 15

<210> 16 15 <211> 885

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 16

20 <210> 17

<211> 409

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 17

<210> 18

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 18

<210> 19 15 <211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA 20 <400> 19

<210> 20

<211> 43

<212> ADN

25

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 20

agaacgcaaa gttgccgcac tgtttggtcg ccaaggttca caa 43

30

<210> 21

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

35

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 21

caaagcgggt gatgccgcac tgtttggtcg cttgacctaa cac 43

<210> 22

<211> 55

40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 22

45

cattgcgcta ggttcagtta aatcacaaat tggtcatact aaatcaactg caggt 55

<210> 23

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 23

tatcgcctta ggctcagtta aatcgcaaat tggtcatact aaatctgcgg ctggc

55

<210> 24

55

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 24 cggcttcgat tttggcggca tgaacggtg 29

<210> 25

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 25 cgcgtatgat taaggcggca ttagcgctg 29

<210> 26

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 26 gcactgctgc aagcatgaac gcgtcgtt 28

<210> 27

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial : SINTÉTICA

<400> 27 gctctgcggc tatcattaac gcggcatt 28

<210> 28

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 28 tccctggtgc taaccatatc agcaaacca 29

<210> 29

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 29 tacctgcaac gatccatatc gataaacca 29

<210> 30

<211> 98

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 30

<210> 31

<211> 98

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 31

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 32

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 33

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 34 Gly His Ser Xaa Gly 1 5

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 35

<210> 36

<211> 6

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 36

<210> 37

<211> 6

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 37

<210> 38

<211> 6

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 38

<210> 39

<211> 6

<212> PRT

<213> poliqueto polinoide de 'Axial Seamount'

<400> 39

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 40

<210> 41

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 41 cuacuacuac uaccaagcta aagcacttaa ccgtg 35

<210> 42

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 42 cuacuacuac uaacagcgaa atgcttatca ag 32

<210> 43

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 43 cuacuacuac uagcgaccaa aaccaaatga gctaatac 38

<210> 44

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 44 aagcccgggc tt 12

<210> 45

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 45 gtacaagccc gggcttagct 20

<210> 46

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 46 cgcgatttaa atggcgcgcc ctgcaggcgg ccgcctgcag ggcgcgccat ttaaat

<210> 47

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 47 ctgcagctcg agacaatgtt gatttcctta tacttctgtc c 41

<210> 48

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 48 ggatccagat ctctagctag tcttagctga agctcga 37

<210> 49

<211> 39

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 49 tctagactcg agacaatgag ccagacctct aaacctaca 39

<210> 50

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 50 cccgggctcg agctaattcg cctcactgtc gtttgct 37

<210> 51

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 51 gaattcctcg agacaatgcc gctgcgcatc gcacttatc 39

<210> 52

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 52 ggtaccagat ctttagactt ccccttgaag taaatgg 37

<210> 53

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 53 gaattcgtcg acacaatgtc attaccagac aatgcttct 39

<210> 54

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 54 tctagagtcg acttatacag attcttcgat gctgatag 38

<210> 55

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 55 gaattcgtcg acacaatgaa tcctacagca actaacgaa 39

<210> 56

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 56 tctagaggat ccttaggcca ttctttggtt tggcttc 37

<210> 57

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 57 tctagagtcg acacaatggc ggaattagct gttattggt 39

<210> 58

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 58 gtcgacggat ccctatttgt tcgtgtttgc tatatg 36

<210> 59

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 59 gtcgacggat ccacaatgaa tatagtaagt aatcattcgg ca 42

<210> 60

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 60 gtcgacctcg agttaatcac tcgtacgata acttgcc 37

<210> 61

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 61 cccgggtcga cacaatggct aaaaagaaca ccacatcga 39

<210> 62

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 62 cccgggtcga ctcatgacat atcgttcaaa atgtcactga 40

<210> 63

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 63 tcgacatgga aaatattgca gtagtaggta ttgctaattt gttc 44

<210> 64

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 64 ccgggaacaa attagcaata cctactactg caatattttc catg 44

<210> 65

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA

<400> 65 tcagatgaac tttatcgata c 21

<210> 66

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: SINTÉTICA <400> 66 tcatgagacg tcgtcgactt acgcttcaac aatact 36

<210> 67

<211> 30 5 <212> ADN

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 67 gtgatgatct ttccctgatg cacgccaagg 30

<210> 68 10 <211> 30

<212> ADN

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 68

agctcgagac cggcaacccg cagcgccaga 30 15 <210> 69

<211> 4446

<212> ADN

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 69

<210> 70

<211> 1481

<212> PRT

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 70.

<210> 71

<211> 5215

<212> ADN

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 71

<210> 72

<211> 1622

<212> PRT

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 72

<210> 73

<211> 1551

<212> PRT

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 73

<210> 74

<211> 30

<212> ADN

5

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 74

taccgcggca agactatccg caacgtcacc

30

<210> 75

<211> 30

10

<212> ADN

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 75

gccgtcgtgg gcgtccacgg acacgatgtg

30

<210> 76

15

<211> 4767

<212> ADN

<213> Schizochytrium aggregatum

<400> 76

<210> 77

<211> 7959

<212> ADN

<213> Vibrio marinus

<400> 77

<210> 78

<211> 2652

<212> ADN

<213> Vibrio marinus

<400> 78

<210> 79

<211> 6057

<212> ADN

<213> Vibrio marinus

<400> 79

<210> 80

<211> 1665

<212> ADN

<213> Vibrio marinus

<400> 80

<210> 81

<211> 2910

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 81

<210> 82

<211> 864

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 82

<210> 83

<211> 8268

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 83

<210> 84

<211> 2313

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 84

<210> 85

<211> 6012

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 85

<210> 86

<211> 1629

<212> ADN

<213> Shewanella putrefaciens

<400> 86

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende:

   (a)

   una secuencia de ácido nucleico o porción de la misma seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 71, SEC ID Nº 69 y SEC ID Nº 76, en la que la secuencia de ácido nucleico o porción de la misma codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una actividad de gen de síntesis de tipo policétidos (de tipo PKS); o

   (b)

   una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos o porción de la misma seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 72 SEC ID Nº 70 y SEC ID Nº 73, en la que la secuencia de aminoácidos o porción de la misma tiene al menos una actividad de gen de síntesis de tipo policétidos (de tipo PKS).

2. 2.

   La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 72, SEC ID Nº70 y SEC ID Nº 73.

3. 3.

   La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, en la que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 71, SEC ID Nº 69 y SEC ID Nº 76.

4. 4.

   Una proteína aislada codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. 5.

   Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 unida operablemente a un promotor.

6. 6.

   Una célula microbiana recombinante que comprende el menos una copia de una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. 7.

   Un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado de cadena larga en un cultivo de células microbianas, comprendiendo el método cultivar un cultivo de células microbianas que tiene una pluralidad de células microbianas recombinantes como se establece en la reivindicación 6, en condiciones en las que un ácido graso poliinsaturado de cadena larga se produce por el cultivo de células microbianas.

8. 8.

   Una célula vegetal recombinante que comprende al menos una copia de una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. 9.

   Un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado de cadena larga en una célula vegetal, comprendiendo el método cultivar una planta que tiene una pluralidad de células vegetales recombinantes como se establece en la reivindicación 8, en condiciones en las que un ácido graso poliinsaturado de cadena larga se produce en las células vegetales.