JP2010515465A - 微生物によって生成される有機化学物質の生成に対する耐性を高めるための組成物および方法 - Google Patents
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本明細書の実施形態は一般に、微生物による有機酸およびアルコールの生成の耐性を高めるための方法、組成物および使用に関する。本出願は一般に、微生物による有機酸またはアルコールの耐性を増大させる１つまたは複数の遺伝要素を有するベクターの方法、組成物および使用にも関する。特定の実施形態は、細菌による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成に対する耐性を高める組成物および方法に関する。幾つかの実施形態では、組成物および方法は、微生物による有機酸の生成を増大させるための増強遺伝子の阻害分子の発現の制御に関する。
Description
関連出願
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる２００７年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／８８０，１０８号の、合衆国法典第３５巻第１１９条の下の特典を請求するものである。
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる２００７年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／８８０，１０８号の、合衆国法典第３５巻第１１９条の下の特典を請求するものである。
連邦政府の資金による研究
本明細書に開示する実施形態は、国立科学財団からの助成金ＢＥＳ０２２８５８４によって一部支援された。米国政府は、本発明を実施するためのある特定の権利を有し得る。
本明細書に開示する実施形態は、国立科学財団からの助成金ＢＥＳ０２２８５８４によって一部支援された。米国政府は、本発明を実施するためのある特定の権利を有し得る。
本明細書の実施形態は一般に、微生物による有機酸およびアルコールの耐性および／または生成を高めるための方法、組成物および使用に関する。本出願は一般に、微生物による有機酸またはアルコールの生成を増大させるベクターの方法、組成物および使用にも関する。特定の実施形態は、細菌による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成を増大させるための手段としての、３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性を高める組成物および方法に関する。他の実施形態では、組成物および方法は、微生物による有機酸の生成に対する耐性を増大させるための、微生物のコリスミ酸超経路（chorismate super-pathway)の１つまたは複数の阻害分子または増強分子の制御に関する。
石油価格は、過去数年間で劇的に上昇している。大部分の専門家は、このような価格の高騰は継続し、かつ石油生産能力は近い将来ピークに達するであろうと現在考えている。燃料および他の化学物質を生成するための、安価な物質およびエネルギーの代替源が開発されなければならない。バイオリファイニング（biorefining)は、このような目的の農業または都市廃棄物などの再生可能資源の開発を追及する。基本モデルでは、燃料（例えば、エタノールまたは水素）または汎用化学物質（例えば、モノマー／ポリマー）などの付加価値生成物を生成するために、廃棄物（例えばコーン）を技術操作された生物により発酵させることができる糖類（例えばヘキソース、ペントース）に変換することを伴う。ガソリン代替物としてのエタノールの長期の商業実用化に関する多くの議論が依然として存在するが、汎用化学物質の生成に関する生物学的経路は、従来の石油化学経路に対する経済的に魅力的な代替物として証明されている。一例として、１０年に及ぶＤｕｐｏｎｔ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒのコラボレーションによって、Ｄｕｐｏｎｔは１，３プロパンジオールを生成するための８００，０００リットルの大腸菌ベースのプロセスの開発に投資することになった（推定５０〜８０億ドル／年間生成）。
有機酸は、将来のバイオリファイニング化学物質の重要な基盤となる。国立再生可能エネルギー研究所によって発表された報告では、３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）を含む上位１２個の最優先バイオリファイニング化学物質の中で８個の異なる有機酸を評価した。低価格の有効な方法でこれらのバイオリファイニング化学物質を早急に作製する必要性が依然として存在する。
本明細書の実施形態は、微生物による有機化合物生成に対する耐性を増大させるための方法および組成物に関する。特定の実施形態は、バイオリファイニング化学物質に対する耐性の増大に関する。他の実施形態では、本明細書の組成物および方法は３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成に関する。本明細書での使用を企図する微生物には、それだけには限られないが、大腸菌が含まれ得る。
経路の生成物には、限定するものではないが、コリスミ酸（chorismate）、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸（folate）、ユビキノン、メニキノン、シキミ酸（shikimate）、Ｄ−エリスロース−４−リン酸(D-Erythrose-4-phosphate)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate）、３−デヒドロキナ酸（3-dehydroquinate）、３−デヒドロ−シキミ酸（3-dehydro-shikimate）、シキミ酸（shikimate）、シキミ酸−３−リン酸（shikimate-3-phosphate）、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate）、コリスミ酸、イソコリスミ酸（isochorismate）、プレフェン酸（prephenate）、フェニルピルビン酸（phenylpyruvate）、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（para-hydroxyphenylpyruvate）、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸（2,3-dihydro-2,3-dihydroxybenzoate）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（2,3-dihydroxybenzoate）、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸（o-succinybenzoate）、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸（anthranilate）、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸（N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate）、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（4-amino-4-deoxychorismate）、パラ−アミノ安息香酸（para-aminobenzoate）、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸（7,8-dihydrofolate）、テトラヒドロ葉酸（tetrahydrofolate）、４−ヒドロキシ安息香酸（4-hydroxybenzoate）、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸（3-octaprenyl-4-hydroxybenzoate）、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、またはユビキノン−８，３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（ubiquinone-8,3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase）（DAHPS）アイソザイム、またはこれらの混合物が含まれ得る。
幾つかの実施形態は、微生物のコリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の遺伝要素を有し、そのコリスミ酸超経路の調節が微生物による３−ＨＰの耐性を増大させるベクターを含む、微生物による３−ＨＰ生成の耐性を増大させるための組成物に関する。他の実施形態では、組成物はコリスミ酸超経路の中間体を含むことができる。さらに他の実施形態では、組成物は経路の１つまたは複数の生成物または前駆体を含むことができる。
経路の生成物は、限定するものではないが、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、またはユビキノン−８の１つまたは複数が含まれ得る。
本明細書の他の実施形態は、微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）生成の耐性を増大させるための組成物であって、限定するものではないが微生物のコリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の化合物を含み、コリスミ酸超経路の誘導が微生物による３−ＨＰの生成を増大させる組成物を含む。これらの実施形態によれば、組成物は、限定するものではないが、コリスミ酸超経路の１つまたは複数の中間体、またはコリスミ酸超経路の１つまたは複数の中間体の生成を増大および／または低下させることができる組成物を含み得る。他の組成物は、１つまたは複数の前駆体、またはコリスミ酸超経路に対する１つまたは複数の前駆体の生成を増大および／または低下させるための組成物を含むことができる。幾つかの実施形態は、限定するものではないが、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、またはユビキノン−８，３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイムの１つまたは複数から選択される１つまたは複数の化合物またはこれらの混合物をさらに含み得る。他の実施形態は、微生物中のコリスミ酸超経路の１つまたは複数の酵素を誘導する化合物を含むことができる。他の例示的な化合物は、有機酸生成微生物に導入される、コリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数のベクターを含むことができる。
幾つかの実施形態は、微生物によりコリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の化合物を含み、コリスミ酸超経路の誘導が微生物による３−ＨＰの生成を増大させる、微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の耐性を調節するための組成物を含む。
本明細書の特定の実施形態は、限定するものではないが、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、またはユビキノン−８，３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイムを含むが限定するものではない１つまたは複数の化合物またはこれらの混合物を含む組成物に関する。
本明細書の他の実施形態は、限定するものではないが、微生物中のコリスミ酸超経路に影響を与えることができるリプレッサーを阻害することを含む、微生物による有機酸の生成に対する耐性を増大させるための方法を含む。これらの実施形態によれば、有機酸またはアルコールの生成または有機酸またはアルコールに対する耐性を増大させることができる他の化合物を組合せてもよいし、あるいは本明細書で企図する任意の培養物に別々に加えてもよい。さらに、開示する方法および組成物は、当技術分野で知られている他の周知の３−ＨＰ生成技術と組合せて使用することができることは、本明細書において企図される。
これらの実施形態のいずれかによれば、１つまたは複数の化合物およびまたは組成物を微生物に導入することができ、この化合物および／または組成物はコリスミ酸超経路を調節することができ、３−ＨＰ生成に対する微生物の耐性を増大させることができる。さらに、本明細書の方法および組成物を、微生物における有機酸に対する耐性または生成を増大させることが知られている任意の他の方法と組合せることができることは、本明細書において企図される。
幾つかの実施形態は、微生物による有機酸の生成および／または有機酸の生成に対する耐性を増大させるための方法であって、ａ）微生物によるコリスミ酸超経路の態様を調節することができる１つまたは複数の化合物を得ることと、ｂ）微生物の培養物に化合物を導入することとを含む方法を含むことができる。特定の実施形態では、コリスミ酸超経路の調節は、微生物による３−ＨＰ生成に対する耐性を増大させる。
本明細書の特定の実施形態は、有機酸である３−ＨＰの生成または３−ＨＰに対する増大した耐性に関する。これらの実施形態によれば、３−ＨＰに対する耐性または３−ＨＰの生成を増大させると本明細書において企図する１つまたは複数の化合物には、限定するものではないが、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８およびこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の中間体を含む組成物が含まれ得る。
本明細書のさらに他の実施形態は、微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）などの有機酸の生成を増大させるための方法であって、微生物の培養物を、コリスミ酸超経路の化合物および／またはコリスミ酸超経路を調節することができる化合物を１つまたは複数含む組成物を接触させることを含む方法を含む。これらの実施形態によれば、１つまたは複数の該化合物は、コリスミ酸超経路の増大または低下などの調節ができる、１つまたは複数の遺伝要素を有するベクターを含むことができる。本明細書で企図する幾つかの実施形態では他の化合物の使用を対象とし、これらの化合物は、微生物中の３−ＨＰに対する耐性を増大させるためにコリスミ酸超経路の下流成分を増大させることができる、１つまたは複数の遺伝要素を有するベクターを含むことができる。
幾つかの実施形態では、微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成および／または耐性を増大させるための方法は、限定するものではないが、微生物中のコリスミ酸超経路を遺伝子操作することを含むことができる。これらの微生物中のコリスミ酸超経路の遺伝子操作の幾つかは、新たな遺伝物質を導入するためのベクターを加えることによる、微生物中のコリスミ酸超経路の調節；既存の遺伝物質の遺伝子の挿入、破壊または除去；遺伝物質の突然変異およびこれらの組合せから選択される。遺伝子操作は、コリスミ酸超経路の前駆体、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸の１つまたは複数またはこれらの混合物の誘導を含むことができる。
本明細書の幾つかの実施形態は、微生物中の有機酸生成に対する耐性を増大させることが当技術分野で知られている他の方法または組成物と組合せることができる。他の実施形態では、本明細書の方法および組成物を株選択法と組合せて、増大した濃度の３−ＨＰを生成および／または許容することができる株を同定することができる。例えば、本明細書で参照するように、濃縮ライブラリーの多重スケール解析（Multi-Scale Analysis of Library Enrichments)（SCALE）を使用して、連続的な流れの選択において適合性の増大をもたらす遺伝子を同定することができる。これらの選択は、対象となる１つまたは複数の有機酸またはアルコールなどの選択化合物の存在または不存在に基づいてもよい。幾つかの実施形態は、阻害レベルが増大した有機酸、例えば３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）を用いた選択に関する。これらの選択法はＳＣＡＬＥ単独、または他の選択技術、例えば他のゲノム選択技術との組合せに基づくものであってよい。
特定の実施形態では、キットを本明細書で企図する。特定の実施形態では、微生物における有機酸の生成を増大させるためのキットは、限定するものではないが、コリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の化合物、および１つまたは複数の容器を含むことができる。これらの実施形態によれば、キットは、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、コリスミ酸超経路の前駆体、コリスミ酸超経路の１つまたは複数の酵素、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８およびこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択される１つまたは複数の化合物を含むことができる。
特定の実施形態では、微生物における有機酸の生成を増大させるためのキットは、限定するものではないが、コリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の化合物を含むことができ、その調節は、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８およびこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の中間体の細胞内レベルに関する。
方法および組成物は微生物における３−ＨＰ生成に対する耐性の増大の適用例に関する実施形態の点で記載しているが、それらは微生物における他のタイプの有機酸耐性にも有用であり得ることを当業者なら理解するであろう。
図面による実施形態の記載
以下の図面は本明細書の一部分を形成し、特定の実施形態をさらに実証するために含める。これらの実施形態は、本明細書で示す具体的な実施形態の詳細な記載と組合せて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによりさらに理解することができる。
以下の図面は本明細書の一部分を形成し、特定の実施形態をさらに実証するために含める。これらの実施形態は、本明細書で示す具体的な実施形態の詳細な記載と組合せて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによりさらに理解することができる。
定義
本明細書で使用する「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上の事項を意味することができる。
本明細書で使用する「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上の事項を意味することができる。
本明細書で使用する「調節する」または「調節すること」または「調節」は、改変、増大または低下を意味することができる。
以下の項では、様々な例示的な組成物および方法を、本発明の様々な実施形態を詳述するために記載する。様々な実施形態の実施は本明細書で概説する具体的な詳細の全てまたはさらに一部の利用を必要とせず、むしろ濃度、時間、温度および他の具体的な詳細は通常の実験によって改変することができることは、当業者には明らかであろう。幾つかの場合、よく知られている方法または構成要素は記載中に含めていない。
本明細書の実施形態によれば、当技術分野の技術内で、従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技法を利用することができる。このような技法は文献中で十分に説明されている。（例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition 1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.; Animal Cell Culture,R.I.Freshney,ed.,1986を参照）。
バイオリファイニングは、再生可能な炭素源およびエネルギーを多量の汎用化学物質に変換するのに有効な方法の開発に関する。米国エネルギー省（USDOE）は、例えば３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）を含む、将来のバイオリファイニング活動の構成単位である化学物質の優先順位リストを公表している。以前の生成は、グルコースを３−ＨＰに変換する組換え宿主の開発の開発によって実施された。少なくとも１００ｇ／Ｌの最終的な３−ＨＰの力価が、工業生産の経済的実現可能性を確実にするのに必要とされることが提案されているが、これらの培養中において１０ｇ／Ｌほどの低い力価で増殖が阻害され得る。
幾つかの異なる遺伝的戦略が、他の生物と比較したときの、その多大な栄養源範囲（例えばペントース）、速い増殖、および容易に遺伝的改変される能力のために魅力的な宿主生物である大腸菌における３−ＨＰの生成に関して調べられている。１つの問題は、微生物による有機化合物の高レベルな生成に対する低い耐性となっている。しばしば、増大した有機化合物は微生物に対して毒性となる。微生物による有機酸およびアルコールの生成または生成に対する耐性の改善に関する必要性が存在する。
濃縮ライブラリーの多重スケール解析（Multi-Scale Analysis of Library Enrichments）（SCALE）は、ゲノム−ライブラリー集団内の個々のクローンの濃縮および希釈をモニタリングするために使用することができる、高解像度のゲノム規模での手法である。この方法は、様々な挿入サイズを有する例示的なゲノムライブラリーの作製、選択環境中でのクローンの増殖、マイクロアレイを使用した選択集団の調査、およびその増大したコピー数が全体の適合性を改善する遺伝子を同定するための数学的多重スケール解析を含む。この方法を利用して、有機酸の表現型、例えば３−ＨＰ耐性の表現型と関係がある制御された株選択の技法が開発されている（データ示さず）。以前の作業は、バイオフィルムの形成、透過性の変化、輸送の増大、生成物の修飾または炭素の利用、および特定の代謝変化を含む、生成物の毒性を緩和する幾つかのメカニズムを同定している。特定の実施形態では、本明細書の方法は、コリスミ酸生合成経路と関係がある細胞内での、有機酸ストレス、例えば３−ＨＰストレスに特異的な代謝効果による阻害を評価することを求めるものである。
特定の実施形態は、バイオリファイニング、バイオマス（例えば、穀物、樹木、牧草、穀物残渣、森林残渣）および有機化合物を生成および使用するための生物学的変換、発酵、化学的変換および触媒作用の使用に関する。これらの有機化合物は、次いで後に有益な誘導化学物質に変換され得る。しかしながら、有機酸は本来毒性であり得るものであり、したがって低レベルで生産生物に対して阻害的であり得る。有機酸中間体の生成を最適化するために、有機酸に対する耐性を工学的に作り出すことは１つのファクターとなり得る。これは、外因性分子を供給して非許容分子の生成を増大するかまたは非許容分子の発現を阻害し、それによって生成レベルの増大を可能にすることにより、実施することができる。汎用化学物質は競合的環境に存在するので、バイオリファイニングの経済的実現可能性のために最適化が必要であろう。したがって、本明細書で開示する組成物および方法は、生合成産物および生合成系において使用するための、有機化合物の生成または有機化合物に対する耐性を増大させる細菌株および分子内の遺伝領域の同定に関する。
コリスミ酸超経路
コリスミ酸超経路は、細胞の生存に必要不可欠な主要代謝経路である。例えばコリスミ酸は、細胞の生存に必要とされる幾つかの芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）およびビタミン（葉酸、ユビキノン、およびメニキノン）に対する一般的な前駆体である。より特定の一例では、コリスミ酸合成の第一工程で活性がある３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム（aroF、aroG、aroH）は、下流で生成される芳香族アミノ酸プールの増大の有意なフィードバック阻害を示す。本明細書の一実施形態では、コリスミ酸超経路は３−ＨＰストレスによって阻害することができ、これはコリスミ酸超経路の下流生成物を増殖培地に加えることによって部分的に緩和することができる。さらに特定の一実施形態では、下流生成物はシキミ酸であってよい。コリスミ酸由来のそれぞれの下流生成物の添加は、特異的増殖および最終細胞密度の少なくとも部分的な再生を示す。特定の一実施形態では、シキミ酸の添加は、野生型の増殖と比較して約２０％の増殖再生をもたらすことができ、このことはシキミ酸の形成前に阻害が起こり、細胞内でアミノ酸およびビタミンプールの減少をもたらし得ることを示す。
コリスミ酸超経路は、細胞の生存に必要不可欠な主要代謝経路である。例えばコリスミ酸は、細胞の生存に必要とされる幾つかの芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）およびビタミン（葉酸、ユビキノン、およびメニキノン）に対する一般的な前駆体である。より特定の一例では、コリスミ酸合成の第一工程で活性がある３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム（aroF、aroG、aroH）は、下流で生成される芳香族アミノ酸プールの増大の有意なフィードバック阻害を示す。本明細書の一実施形態では、コリスミ酸超経路は３−ＨＰストレスによって阻害することができ、これはコリスミ酸超経路の下流生成物を増殖培地に加えることによって部分的に緩和することができる。さらに特定の一実施形態では、下流生成物はシキミ酸であってよい。コリスミ酸由来のそれぞれの下流生成物の添加は、特異的増殖および最終細胞密度の少なくとも部分的な再生を示す。特定の一実施形態では、シキミ酸の添加は、野生型の増殖と比較して約２０％の増殖再生をもたらすことができ、このことはシキミ酸の形成前に阻害が起こり、細胞内でアミノ酸およびビタミンプールの減少をもたらし得ることを示す。
様々な実施形態において、発現の調節を伴って有機化合物の耐性および／または生成を増大させ得る遺伝子を同定することによって増殖を高めることができる。幾つかの実施形態において、調節はコリスミ酸超経路の１つまたは複数の遺伝子の発現または活性の増大を含むことができる。他の実施形態では、調節はコリスミ酸超経路の１つまたは複数の遺伝子の発現または活性の低下を含むことができる。他の実施形態では、コリスミ酸超経路の調節は、他の遺伝子の発現および／または活性を低下させながら、幾つかの遺伝子の発現および／または活性を増大させる組合せを含むことができる。幾つかの実施形態において、コリスミ酸超経路を改変することができる遺伝子は、経路の中間体の形成を改変するおよび／または経路の前駆体を改変する遺伝子を含むことができる。遺伝子操作がコリスミ酸超経路中の中間体の流れの増大および／または低下を含むことができることは、本明細書において企図される。
個々の化合物を検出するために使用する遺伝子スクリーニングは、しばしば同時に１つの細胞を進行させる。選択は、特定環境での生命力と関係がある。したがって一実施形態では、増大した増殖または有機酸に対する耐性を実証する細菌生物を選択することができ、増殖、生成および／または耐性に影響を与える遺伝領域を同定することができる。幾つかの実施形態において、チロシンをコードする遺伝領域の選択は、細菌中で生成される有機酸分子の増大した生成および／または耐性を実証した。
本明細書の特定の実施形態は、微生物中の有機化合物生成の耐性を高めることができるコリスミ酸超経路の調節に関する。これらの実施形態によれば、この経路内の特定分子の発現は、経路の遺伝子の発現を調節することによって有機化合物の耐性を増大させることが可能である。この新規な耐性戦略は、３−ＨＰなどの有機化合物の増大した生成を可能にする。例えば、３−ＨＰを生成するように既に工学的に作製されている株は、本明細書で開示するコリスミ酸超経路中の１つまたは複数の遺伝子を調節して、３−ＨＰを生成するその株の耐性を増大させることによって改変することができる。さらに、これらの方法は、生物の遺伝子改変および遺伝子選択戦略用に、ＳＣＡＬＥ技術（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、いずれも「Mixed-Library Parallel Gene Mapping Quantitation Microarray Technique for Genome Wide Identification of Trait Conferring Genes」という表題の、2004年9月20日に出願された米国仮出願第60/611,377号、および2005年9月20日に出願された米国特許出願第11/231,018号）と共に使用することができる。
幾つかの実施形態では、微生物の遺伝子操作を使用して望ましい遺伝子の変化を作製することができ、遺伝子操作は望ましい表現型をもたらすことができ、かつ多数の技法によって実施することができる。これらの技法は、限定するものではないが、望ましい遺伝子の変化および求める望ましい表現型をもたらす、ｉ）新たな遺伝物質を導入するためのベクター、ｉｉ）既存の遺伝物質の遺伝子の挿入、破壊または除去、およびｉｉｉ）遺伝物質の突然変異、またはｉ、ｉｉ、およびｉｉｉの任意の組合せの使用を含む。ベクターは、限定するものではないが、生物に新たな遺伝物質を導入するために使用する任意の遺伝要素を含むことができる。これらのベクターには、限定するものではないが、任意のコピー数のプラスミド、ゲノム中に任意のコピーで組込まれる組込み可能な要素、ウイルス、ファージまたはファージミドが含まれ得る。本明細書の他の実施形態では、遺伝子の挿入、破壊または除去は、ゲノム中への新たな遺伝要素の挿入、挿入部位の領域以外のゲノムの多大な領域に影響を与え得る挿入による転写または正常な制御機能の破壊、およびゲノムの領域の欠失または除去の一部として含めることができる。これらは、限定するものではないが、指向性（directed)ノックアウトまたは突然変異、遺伝子置換、トランスポゾン、ランダム突然変異誘発またはこれらの組合せを含む技法によって行なうことができる。突然変異は、当技術分野で知られている任意の技法による、限定するものではないが、ＰＣＲによるエラープローンまたは指向性突然変異誘発、突然変異誘発株、およびランダム突然変異誘発を含む技法以外に、ベクター、挿入、破壊または除去を必要とする任意の技法を使用する、指向性突然変異またはランダム突然変異であってよい。
特定の実施形態では、ＳＣＡＬＥを使用して、ゲノム−ライブラリー集団内の個々のクローンの濃縮および希釈をモニタリングすることができる。この方法は、様々な挿入サイズを有する例示的なゲノムライブラリーの作製、選択環境中でのクローンの増殖、マイクロアレイを使用した選択集団の調査、およびその増大したコピー数が全体の適合性を改善する遺伝子を同定するための数学的多重スケール解析を含む。
さらに、本明細書で企図する特定の実施形態は、増強遺伝子（例えば、微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させる遺伝子）に対応するリプレッサー遺伝子の発現または活性を阻害することに関する。他の実施形態では、ＴｙｒＲ領域（チロシンリプレッサー遺伝子領域）、チロシンおよびコリスミ酸経路に対応するリプレッサー領域中の欠失を有するクローンを使用して、チロシンプールを増大させることができる。このリプレッサーと他のコリスミ酸経路の突然変異の組合せは、増大したシキミ酸生成および対応する増大した３−ＨＰ耐性と関係がある中間体プールの変化をもたらし得る。特定の実施形態では、ＭＡＣＨ１培養物中の（チロシンAクローン）２７３６７９９〜２７３８１００に広がる遺伝子領域、および／または（チロシンAクローン）２７３６７００〜２７３９２２３に広がる遺伝子領域の約５０％、または約６０％、または約７０％、またはさらに約８０％または約９０％と等しい、それらに対応するまたはそれらを含む遺伝領域を本明細書で使用して、微生物による３−ＨＰの生成または生成に対する耐性を増大させることができる。さらに、（チロシンRクローン）１３８４７４４〜１３８６２８５に広がる遺伝子領域の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％と等しい、それらに対応するまたはそれらを含む遺伝領域内の突然変異／欠失を本明細書で使用して、微生物による３−ＨＰの生成または３−ＨＰ生成に対する耐性を増大させることが可能であることは、本明細書において企図される。一実施形態では、１つまたは複数の突然変異／欠失は、コリスミ酸超経路中で生成される任意のアミノ酸、例えばチロシンを抑制することができるリプレッサーをコードする遺伝領域内であってよい。注釈：本明細書で企図する割合は非連続領域を含むことができる。
１つの例示的な方法では、経路の適合性の分析によって、コリスミ酸超経路およびヒスチジン、プリン、およびピリミジン生合成超経路（PRPP）を含む、その各々が増大したレベルの３−ＨＰに特異的な増殖阻害において役割を果たす多数の経路を同定した（例えば図２参照）。このゲノム規模での定量法によって、我々は３−ＨＰストレスによる増殖阻害と関係がある完全な代謝経路を同定することができた。
幾つかの実施形態は、微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）に対する耐性を増大させるための組成物であって、微生物のコリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の化合物を含み、コリスミ酸超経路の調節が３−ＨＰの耐性を増大させる組成物に関する。特定の実施形態では、組成物はコリスミ酸超経路の中間体を含む。他の実施形態では、組成物はコリスミ酸超経路に対する前駆体を含む。さらに他の実施形態では、組成物はコリスミ酸超経路中の流れの調節を含む。幾つかの実施形態では、調節は、コリスミ酸超経路の１つまたは複数の遺伝子の発現または活性の増大または低下を意味することができる。これらの実施形態によれば、１つまたは複数の化合物は、微生物中のコリスミ酸超経路の酵素を誘導することができる。他の実施形態では、化合物は、コリスミ酸超経路を調節することができる遺伝要素を有するベクターを含むことができる。
本明細書で使用を企図する組成物および方法は、限定するものではないが、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の中間体を含むことができる。
本明細書で使用を企図する組成物および方法は、限定するものではないが、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８およびこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の前駆体を含むことができる。
本明細書で使用を企図する組成物および方法は、限定するものではないが、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８およびこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の中間体の細胞内レベルを変化させることができる１つまたは複数の組成物を含むことができる。
本明細書で使用を企図する組成物および方法は、限定するものではないが、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８およびこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の前駆体の細胞内レベルを変化させることができる１つまたは複数の組成物を含むことができる。
本明細書で使用を企図する組成物および方法は、限定するものではないが、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、またはユビキノン−８から選択される１つまたは複数の化合物を含むことができる。
幾つかの実施形態では、本明細書で使用する組成物および方法は、微生物中のコリスミ酸超経路の１つまたは複数の酵素を調節する化合物の使用に関係し得る。特定の実施形態では、本明細書で使用する組成物および方法は、コリスミ酸超経路の代謝産物を変化させることができる遺伝要素を有する１つまたは複数のベクターを導入することによって、１つまたは複数の化合物を調節する化合物の使用に関係し得る。特定の実施形態では、本明細書で使用する組成物および方法は、コリスミ酸超経路中の代謝産物を変化させる遺伝的変化を調節することができる、１つまたは複数の化合物に関係し得る。
他の実施形態は、３−ＨＰに対する微生物の耐性を増大させることができる１つまたは複数の化合物を使用して、微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成を増大させるために使用する組成物または方法に関するものであり、この組成物は少なくとも３０ｇ／１Ｌの３−ＨＰまで耐性を誘導する。企図する他の実施形態は、少なくとも３５ｇ／１Ｌの３−ＨＰまで、少なくとも４０ｇ／１Ｌの３−ＨＰまで、野生型組成物の少なくとも１．２倍の３−ＨＰまで、野生型組成物の少なくとも１．４倍の３−ＨＰまで、野生型組成物の少なくとも１．６倍の３−ＨＰまでの耐性を含んでいた、この場合野生型組成物は、組成物または方法を変化させるコリスミ酸超経路をほとんどまたは全く有していない。
本明細書で企図する他の例示的な方法は、微生物中のコリスミ酸超経路を調節することを含む、微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させることに関する。これらの例示的な方法によれば、微生物中のコリスミ酸超経路の調節は、コリスミ酸超経路を調節することができる微生物に化合物を導入することを含み得る。微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させるために企図する他の方法は、微生物によるコリスミ酸超経路の中間体を調節することができる１つまたは複数の化合物を得ることであって、コリスミ酸超経路の調節が微生物による有機酸の生成または有機酸に対する耐性を増大させることと、微生物の培養物に化合物を導入することとを含むことができる。特定のより詳細な実施形態では、有機酸は３−ＨＰまたは３−ＨＰ組成物である。
幾つかの実施形態では、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物の１つまたは複数から化合物を選択することができる。
本明細書で企図する幾つかの実施形態では、３−ＨＰの組成物は、３−ＨＰ、および任意選択により１つまたは複数の３，３−ジオキシプロピオン酸およびアクリル酸の混合物を含むことができる。
本明細書で企図する幾つかの例示的な方法は、微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させる方法であって、微生物によるコリスミ酸超経路の前駆体を調節することができる１つまたは複数の化合物を得ることであって、コリスミ酸超経路の誘導が微生物による有機酸の生成または有機酸に対する耐性を増大させることと、微生物の培養物に化合物を導入することとを含む方法に関する。
幾つかのさらに特定の方法では、微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成の増大は、微生物の培養物を、コリスミ酸超経路の化合物またはコリスミ酸超経路を調節することができる化合物を１つまたは複数含む組成物と接触させることを含むことができる。これらの実施形態によれば、化合物はコリスミ酸超経路を調節することができる遺伝要素を有するベクターを含むことができる。微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成および／または耐性を増大させるための他の例示的な方法は、微生物中のコリスミ酸超経路を遺伝子操作することを含むことができる。本明細書で企図するコリスミ酸超経路の遺伝子操作は、新たな遺伝物質を導入するためのベクターを加えることによる、微生物中のコリスミ酸超経路に関与する１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の改変；既存の遺伝物質の遺伝子の挿入、破壊または除去；遺伝物質の突然変異、またはこれらの２つ以上の組合せを含むことができる。
例示的な遺伝子挿入は、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８およびこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物の１つまたは複数の細胞内レベルを調節することを含むことができる。
幾つかの実施形態では、本明細書で使用を企図する組成物および方法に使用するためのキットを企図する。特定の実施形態は、微生物における有機酸の生成を増大させるためのキットであって、コリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の化合物、および１つまたは複数の容器を含むキットを含む。これらの実施形態によれば、本明細書で使用するキットは、コリスミ酸超経路の改変、または３−ＨＰの生成用に使用する微生物中のコリスミ酸超経路の流れを変化させることができる補助組成物をもたらすことができる。特定の実施形態は、限定するものではないが、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８およびこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択される１つまたは複数の化合物を含むことができる。
本明細書で企図する幾つかの実施形態では、組成物は、コリスミ酸超経路中の代謝産物の流れを調節して、経路中の代謝産物生成を増大および／または低下させることが可能である組成物を含むことができる。特定の例では、流れの増大はＤ−エリスロース−４−リン酸からシキミ酸、および／またはシキミ酸からコリスミ酸、および／またはコリスミ酸からパラ−アミノ安息香酸、および／またはコリスミ酸からユビキノン、および／またはコリスミ酸からトリプトファン、および／またはコリスミ酸からプレフェン酸、および／またはコリスミ酸からイソコリスミ酸、および／またはパラ−アミノ安息香酸からテトラヒドロ葉酸、および／またはプレフェン酸からＬ−フェニルアラニン、および／またはプレフェン酸からチロシン、および／またはイソコリスミ酸からエンテロバクチン、イソコリスミ酸からメニキノン、および／またはチロシンからチアミンであってよい。
幾つかの実施形態では、遺伝子操作を実施して、コリスミ酸超経路中の中間体の細胞内濃度を変化させることができる。これらの実施形態によれば、この経路はフィードバック阻害され、これにより、フィードバック阻害の低下を引き起こすことによってコリスミ酸超経路を介する流れおよび３−ＨＰに対する耐性を増大させることが示されている下流産物の有用性を増大させると予想し得る１つまたは複数の特定の中間体の減少を引き起こし得る。特定の実施形態では、遺伝子操作を使用してコリスミ酸超経路の中間体の量を減少させることができ、この減少は微生物による３−ＨＰの耐性の増大をもたらすことができる。
本明細書の方法および組成物中で使用するコリスミ酸超経路の１つまたは複数の遺伝子は、この経路を調節するための遺伝子の全てまたは一部を含むことができることは企図される。例えば、おそらく３０パーセント以上の遺伝子、５０パーセント以上の遺伝子、７０パーセント以上の遺伝子、または８０パーセント以上の遺伝子、または９０パーセント以上の遺伝子、またはさらに１００パーセント以上の遺伝子を、本明細書で企図する方法および組成物中で使用して、微生物中の３−ＨＰ耐性を増大させることができる（例えば、TyrA遺伝子を参照）。特定の実施形態では、コリスミ酸超経路に関与する遺伝子から選択される配列を有する、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、またはそれより多くの隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを企図する。さらに、遺伝子操作と他の耐性誘導法を使用する併用法を企図する。
耐性の増大は３−Ｈｐを生成するための商業的発酵において生産性および力価の増大をもたらすことができるので、３−ＨＰ耐性は重要である。基本的な発酵モデルは、燃料（例えば、エタノールまたは水素）または３−ＨＰなどの汎用化学物質（例えば、モノマー／ポリマー）などの付加価値生成物を生成するために工学的操作の施された生物により発酵することができる糖類（例えばヘキソース、ペントース）への、廃棄物または再生可能な糖原料（例えばコーン）の変換を含む。３−ＨＰ、およびアクリル酸、アクリルアミド、メチル−アクリレート、１，３プロパンジオールなどの従来の大規模市場化学物質は、新規なポリマーおよび物質を含む、化学産業、バイオ技術、衣料およびおそらくヘルスケア産業の対象であり得る高価値の化学物質に変換することができる。
核酸
本明細書で企図する範囲内の核酸は、当業者に知られている任意の技法によって作製することができる。核酸、特に合成オリゴヌクレオチドの例は、ホスホトリエステル、亜リン酸またはホスホラミダイト化学法を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成、およびデオキシヌクレオシドＨ−ホスホン酸中間体を介した固相技法によって作製される核酸を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書で企図する核酸配列を作製することができ、修飾することができる。修飾核酸配列の例は、ＰＣＲ（商標）などの増幅反応またはオリゴヌクレオチドの合成の後に修飾することができる配列を含む。生物学的に生成される核酸の例は、細菌中の組換えＤＮＡベクター生成などの、生存細胞中の組換え核酸生成を含む。
本明細書で企図する範囲内の核酸は、当業者に知られている任意の技法によって作製することができる。核酸、特に合成オリゴヌクレオチドの例は、ホスホトリエステル、亜リン酸またはホスホラミダイト化学法を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成、およびデオキシヌクレオシドＨ−ホスホン酸中間体を介した固相技法によって作製される核酸を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書で企図する核酸配列を作製することができ、修飾することができる。修飾核酸配列の例は、ＰＣＲ（商標）などの増幅反応またはオリゴヌクレオチドの合成の後に修飾することができる配列を含む。生物学的に生成される核酸の例は、細菌中の組換えＤＮＡベクター生成などの、生存細胞中の組換え核酸生成を含む。
核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチド模倣体または誘導体は当技術分野でよく知られており、記載されてきている。プリンおよびピリミジン核酸塩基は、天然に存在するプリンおよびピリミジンならびにその誘導体および模倣体を包含する。これらは、１つまたは複数のアルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（例えばフルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、チオール、またはアルキルチオール基で置換されたプリンおよびピリミジンだけには限らないが、これらを含む。アルキル置換は、約１、２、３、４、または５個から約６個までの炭素原子を含むことができる。
本明細書で生成する核酸を修飾するために企図されるプリンおよびピリミジンの例には、デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、ブロモチミン、８−アミノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、アザグアニン、２−アミノプリン、５−エチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−エチルウラシル、５−ヨードウラシル、５−クロロウラシル、５−プロピルウラシル、チオウラシル、２−メチルアデニン、メチルチオアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、アザアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヒドロキシアデニン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、４−（６−アミノヘキシル／シトシン）などがあるが、これらだけには限られない。さらに、プリンおよびピリミジンの誘導体または模倣体は、本明細書で開示する任意の方法中で塩基置換体として使用することができる。
核酸セグメントをプラスミド、コスミドまたはウイルスなどのベクターに導入する用途では、これらのセグメントをプロモーター、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、マルチクローニングサイト、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と組合せることができ、それによりそれらの全長は著しく変わり得る。ほぼ任意の長さの核酸断片を利用することができ、目的とする組換えＤＮＡプロトコルにおける調製のしやすさおよび使用によって、全長が制限されることが好ましいことが企図される。
幾つかの実施形態では、特定の遺伝子をコードするＤＮＡセグメントを組換え宿主細胞中に導入することができ、特定の構造または制御タンパク質の発現に利用することができる。代替的に、遺伝子工学技法の適用によって、選択遺伝子の一部分または誘導体を利用することができる。プロモーター領域などの制御領域を含む上流領域を単離し、後に選択遺伝子または選択遺伝子セグメントの発現に利用することができる。
発現産物を作製する場合、同じ産物をコードする能力を保持しながら核酸配列を変化させることが可能である。
増幅
増幅は、所与の核酸配列の多数のコピーを作製するための反復プロセスにおいて有用であり得る。本発明の範囲内では、増幅は当技術分野で知られている任意の手段によって実施することができる。
増幅は、所与の核酸配列の多数のコピーを作製するための反復プロセスにおいて有用であり得る。本発明の範囲内では、増幅は当技術分野で知られている任意の手段によって実施することができる。
プライマー
プライマーは、本明細書では必要に応じて、鋳型依存的プロセスにおいて新生核酸の合成を促進することができる任意の核酸を包含することを意味する。典型的には、プライマーは約５〜１００塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、さらに長い配列を利用することができる。プライマーは二本鎖または一本鎖形で与えることができる。
プライマーは、本明細書では必要に応じて、鋳型依存的プロセスにおいて新生核酸の合成を促進することができる任意の核酸を包含することを意味する。典型的には、プライマーは約５〜１００塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、さらに長い配列を利用することができる。プライマーは二本鎖または一本鎖形で与えることができる。
幾つかの実施形態では、ランダムな領域の増幅は、各位置の等モル量の各窒素含有塩基（A、C、G、およびT）を混合して、非常に短いセグメント中に多数の置換を作製することによって実施する（例えばこの場合、「n」はオリゴ鎖長である）。これは、１匹のマウスによって生成されるネズミ抗体の１０．９〜１０１１変異体と比較して、高親和性の核酸配列を発見するより一層の可能性を劇的に与える。
幾つかの鋳型依存的プロセスは、所与の鋳型サンプル中に存在するマーカー配列を増幅させるために利用可能である。最も知られている増幅法の１つは、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，８００，１５９号中に詳細に記載されている、（PCRと呼ばれる）ポリメラーゼ連鎖反応である。
他の実施形態では、核酸を増幅させるための他の方法には、限定するものではないが、リガーゼ連鎖反応（「LCR」）、Ｑβレプリカーゼ、等温増幅法、および鎖置換型増幅(Strand Displacement Amplification）（SDA）、および当技術分野で知られている他の方法が含まれる。さらに他の増幅法を、本明細書で開示する実施形態に従い使用することができる。他の核酸増幅手順は、核酸配列ベースの増幅（NASBA）を含む転写ベースの増幅系（TAS）を含むことができる。開示する方法の幾つかでは、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床サンプルの熱変性、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離またはＲＮＡの塩化グアニジウム抽出用の溶解バッファーおよびミニ−スピンカラムを用いた処理によって、増幅用に核酸配列を調製することができる。等温サイクル反応では、複数のＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに逆転写し、Ｔ７またはＳＰ６などのポリメラーゼを用いてもう一度転写する。
ポリメラーゼおよび逆転写酵素には、限定するものではないが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ：ＯｎｍｉＢａｓｅＴＭ．シークエンシング用酵素 Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、シークエンシング用Ｇｒａｄｅ Ｔａｑ Ｂｅａｄ．ＴＭ． ホットスタートポリメラーゼ Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ ＤＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、エクソヌクレアーゼマイナスＤＮＡポリメラーゼＩ ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｌａｒｇｅ（クレノウ）断片末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼＴ４ＤＮＡポリメラーゼ逆転写酵素：ＡＭＶ逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素が含まれる。
特定の実施形態に関して、核酸配列、増幅産物、プローブまたはプライマーに標識を導入することが望ましいものであってもよい。限定するものではないが、フルオロフォア、発色団（chromophore）、放射性同位体、酵素タグ、抗体、化学発光、電気発光、および親和性標識を含む、幾つかの異なる標識を使用することができる。
本明細書で企図する親和性標識の例には、限定するものではないが、抗体、抗体断片、受容体タンパク質、ホルモン、ビオチン、ＤＮＰ、および親和性標識と結合する任意のポリペプチド／タンパク質分子が含まれ得る。
酵素タグの例には、限定するものではないが、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼが含まれる。比色分析用指標基質をこのような酵素と共に利用して、人の目に見える検出手段または分光学的測定によって目に見える検出手段を提供することができる。
本明細書で開示する以下のフルオロフォアには、限定するものではないが、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッドが含まれる。
ゲル電気泳動
幾つかの実施形態では、当技術分野で知られている標準的方法を使用することによって、ゲル電気泳動を使用して、本明細書で同定または企図する成分を分離、部分的に精製、または精製することができる。
幾つかの実施形態では、当技術分野で知られている標準的方法を使用することによって、ゲル電気泳動を使用して、本明細書で同定または企図する成分を分離、部分的に精製、または精製することができる。
電気泳動による分離は当技術分野で知られている方法に基づく。このようにして分離したサンプルは、生じる染色の測光密度を絶えずモニタリングする密度計を使用して、相対的観点で、染色および定量化によって目に見える状態にすることができる。電解質は連続（単一バッファー）または不連続であってよく、その場合、サンプルは、それが泳動ゲル／泳動バッファーに入る前にバッファーの不連続性によって積み重なる。
クロマトグラフィー技法
代替的に、クロマトグラフィー技法を利用して分離を実施することができる。使用することができる多くの種類のクロマトグラフィー、例えば吸着、分配、イオン交換およびモレキュラーシーブ、およびカラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィーを含むそれらを使用するための多くの特殊な技法が存在する。
代替的に、クロマトグラフィー技法を利用して分離を実施することができる。使用することができる多くの種類のクロマトグラフィー、例えば吸着、分配、イオン交換およびモレキュラーシーブ、およびカラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィーを含むそれらを使用するための多くの特殊な技法が存在する。
マイクロ流体技法
マイクロ流体技法は、ＡＣＬＡＲＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．により設計されたマイクロキャピラリー、またはＣａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により作製されたＬａｂＣｈｉｐ（商標）液体用集積回路などのプラットホーム上での分離を含む。これらのマイクロ流体用プラットホームは、他の分離技術によって必要とされるマイクロリットル体積とは対照的に、わずかナノリットル体積のサンプルを必要とする。遺伝子分析に関するプロセスの幾つかの小型化は、当技術分野で知られているマイクロ流体技法を使用して実施されている。
マイクロ流体技法は、ＡＣＬＡＲＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．により設計されたマイクロキャピラリー、またはＣａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により作製されたＬａｂＣｈｉｐ（商標）液体用集積回路などのプラットホーム上での分離を含む。これらのマイクロ流体用プラットホームは、他の分離技術によって必要とされるマイクロリットル体積とは対照的に、わずかナノリットル体積のサンプルを必要とする。遺伝子分析に関するプロセスの幾つかの小型化は、当技術分野で知られているマイクロ流体技法を使用して実施されている。
核酸送達
リポソーム配合物
本発明の特定の広義の実施形態では、オリゴまたはポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターをリポソーム中に封入することができる。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた多数の脂質層を有する。脂質成分は閉構造の形成前に自己再配列を経て、脂質二重層間の水および溶解溶質を捕捉する（GhoshおよびBachhawat、1991）。リポフェクタミン核酸複合体などのカチオン性脂質−核酸複合体も企図される。
リポソーム配合物
本発明の特定の広義の実施形態では、オリゴまたはポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターをリポソーム中に封入することができる。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた多数の脂質層を有する。脂質成分は閉構造の形成前に自己再配列を経て、脂質二重層間の水および溶解溶質を捕捉する（GhoshおよびBachhawat、1991）。リポフェクタミン核酸複合体などのカチオン性脂質−核酸複合体も企図される。
本発明の特定の実施形態では、リポソームはセンダイウイルス（HVJ）と複合体形成することができる。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソーム被包ＤＮＡの細胞進入を促進することが示されている（Kaneda et al.,1989）。他の実施形態では、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（HMG1）と共に複合体形成または利用することができる（Kato et al.,1991）。さらに他の実施形態では、リポソームは、ＨＶＪとＨＭＧ１の両方と共に複合体形成または利用することができる。このような発現ベクターがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのポリヌクレオチドの移動および発現において首尾よく利用されているという点で、したがってそれらは本発明に適用可能である。細菌プロモーターをＤＮＡ構築体において利用する場合、適切な細菌ポリメラーゼをリポソーム中に封入することも望ましいはずである。
「リポソーム」は、封入脂質二重層の生成によって形成される、様々な単膜および多重膜脂質媒体を包含する一般名称である。リン脂質は本発明によるリポソームを調製するのに使用し、正味の正電荷、正味の負電荷を有することができ、または中性である。リン酸ジセチルを利用してリポソームに負電荷を与えることができ、かつステアリルアミンを使用してリポソームに正電荷を与えることができる。
本発明による使用に適した脂質は、市販の供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手することができ、リン酸ジセチル（「DCP」）はＫ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Plainview,NY）から入手し、コレステロール（「Chol」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｈｒｉｎｇから入手し、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Birmingham,Ala.）から入手することができる。クロロホルム、クロロホルム／メタノールまたはｔ−ブタノールに溶かした脂質のストック溶液は約２０℃で保存することができる。クロロホルムは唯一の溶媒として使用することが好ましい、何故ならそれはメタノールより容易に蒸発するからである。
卵または大豆ホスファチジルコリン、脳内ホスファチジン酸、脳内または植物性ホスファチジルイノシトール、心臓内カルジオリピンおよび植物性または細菌性ホスファチジルエタノールアミンなどの天然源由来のリン脂質は、生成するリポソームの不安定性および漏出性のために、主要ホスファチド、すなわち全ホスファチド組成の５０％以上を構成するホスファチドとして使用しないことが好ましい。
本明細書の実施形態により使用するリポソームは、異なる方法によって作製することができる。リポソームの大きさは合成の方法に応じて変わる。水溶液に懸濁したリポソームは一般に、１つまたは複数の脂質二重層分子の同心円層を有する球形小胞の形状である。それぞれの層は、Ｘが親水性部分でありＹが疎水性部分である式ＸＹによって表される、平行配列の分子からなる。水性懸濁液中では、親水性部分が水相と依然として接触し、かつ疎水性領域が自己集合しやすくなるように同心円層が配列する。例えば、水相がリポソーム内とリポソームなしの両方で存在するとき、脂質分子は、配列ＸＹＹＸのラメラとして知られる二重層を形成するはずである。
本明細書の範囲内のリポソームは、知られている研究室の技法に従い調製することができる。
特定の実施形態では、脂質ジオレオイルホスファチジルコリンを利用する。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドを、過剰のブタノールの存在下で脂質と混合した。アセトン／ドライアイス浴中に凍結する前に混合物をボルテックスした。凍結した混合物は凍結乾燥し、一晩Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（1mM Hepes,10mM NaCl,pH7.5）で水和し、次いで１０〜１５分間バスタイプの超音波処理装置中でリポソームを超音波処理した。リポソームオリゴヌクレオチドの大きさは典型的には、サブミクロン粒子選別機自動希釈モデル３７０（Nicomp,Santa Barbara,CA）により決定して、直径２００ｎｍと３００ｎｍの間の範囲であった。
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発は、根底のＤＮＡの特異的突然変異誘発によって、個々のペプチド、または生物学的機能が等しいタンパク質もしくはペプチドの調製において有用な技法である。この技法は、１つまたは複数の前述の考慮事項を組み込んで、１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化をＤＮＡに導入することにより、配列変異体を調製および試験するのが容易な能力をさらに与える。部位特異的突然変異誘発は、望ましい突然変異のＤＮＡ配列、および十分な数の隣接ヌクレオチドをコードする特異的オリゴヌクレオチド配列の使用による突然変異体の生成を可能にして、横断する欠失接合部の両側に安定した二重鎖を形成するのに十分な大きさおよび配列複雑性のプライマー配列を与える。約１５〜３０ヌクレオチド長のプライマーを使用することができ、配列の接合部の両側の約５〜１０残基を変化させることができる。
部位特異的突然変異誘発は、根底のＤＮＡの特異的突然変異誘発によって、個々のペプチド、または生物学的機能が等しいタンパク質もしくはペプチドの調製において有用な技法である。この技法は、１つまたは複数の前述の考慮事項を組み込んで、１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化をＤＮＡに導入することにより、配列変異体を調製および試験するのが容易な能力をさらに与える。部位特異的突然変異誘発は、望ましい突然変異のＤＮＡ配列、および十分な数の隣接ヌクレオチドをコードする特異的オリゴヌクレオチド配列の使用による突然変異体の生成を可能にして、横断する欠失接合部の両側に安定した二重鎖を形成するのに十分な大きさおよび配列複雑性のプライマー配列を与える。約１５〜３０ヌクレオチド長のプライマーを使用することができ、配列の接合部の両側の約５〜１０残基を変化させることができる。
一般に、部位特異的突然変異誘発の技法は当技術分野でよく知られている。理解されているように、この技法は、一本鎖と二本鎖の両方の形で存在するバクテリオファージベクターを利用することが多い。部位特異的突然変異誘発において有用である典型的なベクターは、Ｍ１３ファージなどのベクターを含む。これらのファージベクターは市販されており、かつそれらの使用は当業者には一般によく知られている。二本鎖プラスミドも部位特異的突然変異誘発において通常利用されており、これは対象となる遺伝子をファージからプラスミドに移すことを排除する。
一般に、部位特異的突然変異誘発は、最初に一本鎖ベクターを得ること、またはその配列内に望ましいタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む二本鎖ベクターの二本の鎖を溶かすことによって実施することができる。望ましい突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成的に調製する。このプライマーは次いで一本鎖ＤＮＡ調製物とアニーリングさせることが可能であり、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウ断片などのＤＮＡ重合酵素に施して、突然変異を有する鎖の合成を完了することができる。したがって、一本の鎖が元の非突然変異配列をコードし、かつ第二の鎖が望ましい突然変異を有するヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖ベクターを次いで使用して、大腸菌細胞などの適切な細胞を形質転換し、突然変異配列配置を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
部位特異的突然変異誘発を使用した選択遺伝子の配列変異体の調製は、おそらく有用な種を生成する手段として与え、限定的であることを意味しない、何故なら遺伝子の配列変異体を得ることができる他の方法が存在するからである。例えば、望ましい遺伝子をコードする組換えベクターは、ヒドロキシルアミンなどの突然変異誘発剤で処理して、配列変異体を得ることができる。
発現するタンパク質またはその断片
当業者に知られている発現系の例は、大腸菌などの細菌、ピキアパストリス（Pichia pastoris）などの酵母菌、バキュロウイルス、およびＣｏｓまたはＣＨＯ細胞中などの哺乳動物発現系を含む。完全な遺伝子を発現させることが可能であり、または代替的に、ポリペプチドの一部分をコードする遺伝子の断片を生成することができる。
当業者に知られている発現系の例は、大腸菌などの細菌、ピキアパストリス（Pichia pastoris）などの酵母菌、バキュロウイルス、およびＣｏｓまたはＣＨＯ細胞中などの哺乳動物発現系を含む。完全な遺伝子を発現させることが可能であり、または代替的に、ポリペプチドの一部分をコードする遺伝子の断片を生成することができる。
本明細書における特定の広範囲の適用例では、ポリペプチドをコードする遺伝子配列を分析して、推定膜貫通配列を検出する。このような配列は典型的には非常に疎水性であり、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（IBI,New Haven,CT）などの標準的な配列分析用ソフトウェアの使用により容易に検出される。組換えタンパク質が多くの発現系、特に大腸菌で合成されるとき、膜貫通配列の存在は有害であることが多いが、それは、タンパク質の元の立体配座に復元するのが困難である不溶性凝集体の生成をもたらすからである。膜貫通配列の欠失は典型的には、残りのタンパク質構造の立体配座を著しく変化させることはない。
本明細書による突然変異型または野生型のいずれかの、組換えコードタンパク質またはペプチドを発現させるために、１つまたは複数のプロモーターの制御下の、またはプロモーターと作動可能に連結した核酸配列を含む発現ベクターを調製することができる。コード配列をプロモーターの「制御下」にするために、選択プロモーターの「下流の」（例えば３’）一般に約１〜約５０ヌクレオチドの転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を配置することができる。「上流」プロモーターはＤＮＡの転写を刺激し、コード組換えタンパク質の発現を促進する。
多くの標準的な技法が、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含む発現ベクターを構築して、様々な宿主−発現系中でタンパク質またはペプチドの発現を得るために利用可能である。発現に利用可能な細胞型には、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した大腸菌および枯草菌などの細菌があるが、これらだけには限られない。
原核生物宿主の特定の例は、大腸菌株ＲＲ１、大腸菌ＬＥ３９２、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ATCC No.31537）ならびに大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ラムダ−、原栄養、ATCC No.273325）、枯草菌などの桿菌、およびネズミチフス菌、セラチアマルセッセンス（Serratia marcescens）などの他の腸内細菌科、および様々なシュードモナス菌種である。
一般に、宿主細胞と適合性がある種に由来するレプリコンおよび対照配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主に関して使用される。ベクターは通常、複製部位、および形質転換細胞において表現型選択を与えることができるマーキング配列を有する。例えば、ｐＢＲ３２２、大腸菌種由来のプラスミドを使用して大腸菌を形質転換することが多い。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、したがって形質転換細胞を同定するための容易な手段を与える。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージは、その独自のタンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターも含まなければならず、またはこれらを修飾してプロモーターを含まなければならない。
さらに、宿主微生物と適合性があるレプリコンおよび対照配列を含むファージベクターは、これらの宿主に関して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、ファージラムダＧＥＭＴＭ−１１は、大腸菌ＬＥ３９２などの宿主細胞を形質転換するために使用することができる、組換えファージベクターを作製する際に利用することができる。
さらなる有用なベクターには、後の精製および分離または切断用の、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）可溶性融合タンパク質の生成において使用するための、ｐＩＮベクター（Inouye et al.,1985）およびｐＧＥＸベクターがある。他の適切な融合タンパク質は、βガラクトシダーゼ、ユビキチンなどとの融合タンパク質である。
組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されているプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（trp）プロモーター系がある。これらは最も一般的に使用されているが、他の微生物プロモーターが発見され利用されており、かつそれらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されており、当業者はそれらをプラスミドベクターと機能的に連結させることができる。
増殖条件によって制御される転写の追加的利点を有する他の適切なプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関係がある分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域がある。
微生物以外に、多細胞生物由来の細胞の培養物を宿主として使用することもできる。原則として、任意のこのような細胞培養物が、脊椎動物または無脊椎動物培養物由来であろうと働き得る。
コリスミ酸超経路およびチロシン
微生物のアミノ酸調節コード領域は、微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させるのに重要であり得ることは、本明細書において企図される。１つの例示的な方法では、チロシン生合成酵素をコードする遺伝子領域、およびチロシン生成に関与する遺伝子のリプレッサーをコードする遺伝子領域を操作して、微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させることができる。
微生物のアミノ酸調節コード領域は、微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させるのに重要であり得ることは、本明細書において企図される。１つの例示的な方法では、チロシン生合成酵素をコードする遺伝子領域、およびチロシン生成に関与する遺伝子のリプレッサーをコードする遺伝子領域を操作して、微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させることができる。
特定の実施形態では、外因的に加えたチロシンを３−ＨＰを生成することができる細菌培養物に加えることができる。特定の具体的な実施形態では、チロシン濃度は約０．０５ｍＭ〜約０．５ｍＭであってよい。一例では、０．２ｍＭのチロシンを培養物に加え、３−ＨＰ生成の増大は約３５％であった。
本発明の具体的な実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択される配列を有する少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関する。
ＴｙｒＡ（この配列はプライマー設計の５０ｂｐ上流および下流を含む）：
配列番号５ＴｙｒＲ、および配列番号６はＴｙｒＲおよび２つのプライマーをいずれかの末端に有する。
ＡｒｏＦ配列は以下の通りである：
以下の実施例は幾つかの実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例中に開示する技法は、本明細書に開示する実施形態の実施において十分機能し得る本発明者により発見された技法を表し、したがってその実施の例示的な形態を構成すると考えることができることは、当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示する特定の実施形態において多くの変形を作製することができ、さらに本明細書の精神および範囲から逸脱せずに同様または類似の結果を得ることを理解しているはずである。
材料および方法
細菌、プラスミド、および培地
幾つかの方法は、ゲノムＤＮＡの調製に使用した野生型大腸菌Ｋ１２（ATCC#29425）に関する。ゲノムライブラリーはｐＳＭＡＲＴ−ＬＣＫＡＮ（Lucigen,Middleton,WI）を使用して構築した。ライブラリーは前に詳述した選択用に大腸菌株Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）（Invitrogen,Carlsbad,CA.）中に導入した。ｐＳＭＡＲＴ−ＬＣＫＡＮ空ベクターを含むＭａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）を全ての対照試験に使用した。増殖曲線はＭＯＰＳ最少培地で作製した。この実施例では、抗生物質濃度は２０ｕｇカナマイシン／ｍＬであった。
細菌、プラスミド、および培地
幾つかの方法は、ゲノムＤＮＡの調製に使用した野生型大腸菌Ｋ１２（ATCC#29425）に関する。ゲノムライブラリーはｐＳＭＡＲＴ−ＬＣＫＡＮ（Lucigen,Middleton,WI）を使用して構築した。ライブラリーは前に詳述した選択用に大腸菌株Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）（Invitrogen,Carlsbad,CA.）中に導入した。ｐＳＭＡＲＴ−ＬＣＫＡＮ空ベクターを含むＭａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）を全ての対照試験に使用した。増殖曲線はＭＯＰＳ最少培地で作製した。この実施例では、抗生物質濃度は２０ｕｇカナマイシン／ｍＬであった。
ゲノムライブラリーの構築
大腸菌Ｋ１２の培養物を、６００ｎｍでの吸光度（OD600）により測定した１．０の光学濃度まで、３７℃において５００ｍｌのＬＢ中で一晩培養した。ＤＮＡは製造者の説明書に従いゲノムＤＮＡ精製キット（例えばQiagen）を使用して抽出した。５０ｕｇの精製ゲノムＤＮＡを含む５つのサンプルを、２つの平滑末端切断制限酵素：ＡｌｕＩおよびＲｓａＩ（例えばInvitrogen）を使用して消化した。両方の酵素が４塩基対認識配列を有し、これらはタンデムに使用してゲノムＤＮＡのランダムな消化を確実にする。消化反応は５０ｕＬの合計体積で実施した。反応混合物は１単位のＲｓａｌ、１単位のＡｌｕｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH8.0）、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含んでおり、それぞれ１、２、５、１０、および１５分間３７℃においてインキュベートした。部分的に消化したＤＮＡをすぐに混合し、アガロースゲル電気泳動を使用して大きさに基づいて分離した。０．５、１、２、４ｋｂ、および８ｋｂを超えるＤＮＡ断片をゲルから切除し、ゲル抽出キット（例えばQiagen）を用いて精製した。
大腸菌Ｋ１２の培養物を、６００ｎｍでの吸光度（OD600）により測定した１．０の光学濃度まで、３７℃において５００ｍｌのＬＢ中で一晩培養した。ＤＮＡは製造者の説明書に従いゲノムＤＮＡ精製キット（例えばQiagen）を使用して抽出した。５０ｕｇの精製ゲノムＤＮＡを含む５つのサンプルを、２つの平滑末端切断制限酵素：ＡｌｕＩおよびＲｓａＩ（例えばInvitrogen）を使用して消化した。両方の酵素が４塩基対認識配列を有し、これらはタンデムに使用してゲノムＤＮＡのランダムな消化を確実にする。消化反応は５０ｕＬの合計体積で実施した。反応混合物は１単位のＲｓａｌ、１単位のＡｌｕｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH8.0）、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含んでおり、それぞれ１、２、５、１０、および１５分間３７℃においてインキュベートした。部分的に消化したＤＮＡをすぐに混合し、アガロースゲル電気泳動を使用して大きさに基づいて分離した。０．５、１、２、４ｋｂ、および８ｋｂを超えるＤＮＡ断片をゲルから切除し、ゲル抽出キット（例えばQiagen）を用いて精製した。
ＤＮＡ断片の純度は、それぞれ１．７を超えるＡ２６０／Ａ２８０の吸光度比でＵＶ吸光度を使用して定量化した。精製、断片化ＤＮＡとｐＳＭＡＲＴ−Ｋａｎベクターの連結は、製造者の説明書に従いＣｌｏｎｅＳＭＡＲＴキット（Lucigen）を用いて実施した。次いで連結生成物は大腸菌１０ＧＦ’エリートエレクトロコンピテントセル（Lucigen）にエレクトロポレーションし、ＬＢ＋カナマイシンに平板培養し、２４時間３７℃においてインキュベートした。元の形質転換体積の１／１０００での希釈培養物を三連でＬＢ＋カナマイシンに平板培養して、形質転換効率および形質転換体の数を決定した。希釈プレートは三連で行って、形質転換体の数の正確な計数を確認し、例示的なゲノムライブラリーを確実にした。
プレートをＴＢ培地に軽くこすり落とすことによって、コロニーを採取した。培養物はボルテックスによってすぐに再懸濁し、１５％ｖ／ｗの最終グリセロール濃度で１５〜１ｍＬの冷凍庫のストック培養物に分配した。培養物の残りは、３０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によってペレット状にした。プラスミドＤＮＡを抽出した。挿入サイズおよび陽性形質転換の数を確認するために、プラスミドは、例えばＱｉａｇｅｎ（Valencia,CA）からのＱｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐキットを使用して、各ライブラリーサイズのランダムなクローンから単離した。精製したプラスミドは、次いでＰＣＲまたは制限酵素による消化のいずれかによって分析した。ＳＬ１
およびＳＲ２
プライマーを使用するＰＣＲを、０．５、１、および２ｋｂｐの挿入ライブラリー由来の８個のクローンに実施した。酵素ＥｃｏｒＶを用いた制限酵素による消化は、２、４、および８ｋｂｐの挿入ライブラリー由来の８個のクローンに実施した。電気泳動による検査は、必要とされる数のコロニーは固有表現のために予想サイズの挿入体を含んでおり、キメラは存在しなかったことを示した。
ライブラリーＤＮＡの形質転換
それぞれのライブラリーから精製したプラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションによってＭＡＣＨ１（商標）−Ｔ１（登録商標）（Invitrogen）に導入した。ＭＡＣＨ１（商標）−Ｔ１（登録商標）培養物は、１０１１個の細胞／ｍｌの最終濃度まで氷上での標準的なグリセロール洗浄手順によってエレクトロコンピテントにした（Sanbrook et al.）。元の形質転換の１／１０００の体積を三連でＬＢ＋カナマイシンに平板培養して、形質転換効率および適切な形質転換体の数を決定した。元の培養物を組合せて、ＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシンを含む１００ｍｌに希釈し、０．２０のＯＤ６００に達するまで６時間３７℃においてインキュベートした。
それぞれのライブラリーから精製したプラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションによってＭＡＣＨ１（商標）−Ｔ１（登録商標）（Invitrogen）に導入した。ＭＡＣＨ１（商標）−Ｔ１（登録商標）培養物は、１０１１個の細胞／ｍｌの最終濃度まで氷上での標準的なグリセロール洗浄手順によってエレクトロコンピテントにした（Sanbrook et al.）。元の形質転換の１／１０００の体積を三連でＬＢ＋カナマイシンに平板培養して、形質転換効率および適切な形質転換体の数を決定した。元の培養物を組合せて、ＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシンを含む１００ｍｌに希釈し、０．２０のＯＤ６００に達するまで６時間３７℃においてインキュベートした。
選択
１つの例示的な方法では、４つの例示的なゲノムライブラリーを、１、２、４、および８ｋｂの明確な挿入サイズを有する大腸菌Ｋ１２ゲノムＤＮＡから作製した。形質転換ライブラリーの混合物は、１０ＭのＮａＯＨでｐＨ７に中和した１Ｌの３−ＨＰ（TCI America）当たり２０ｇの最終濃度で、２本の１５ｍＬスクリューキャップチューブに等分した。選択培養物の細胞密度を、それらが０．３〜０．４の最終ＯＤ６００に近づくときモニタリングした。元の選択培養物を後に使用して、反復バッチ選択戦略の一部として他の一連の１５ｍＬのＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシン＋３−ＨＰを接種した。３−ＨＰを含む反復バッチ培養物をモニタリングして、６０時間の間接種して３−ＨＰの存在下で増大した増殖を示すクローンの濃度を高めた。１ｍＬの選択集団を選択プレートおよびそれぞれのバッチに平板培養することによって、サンプルを採取した。プラスミドＤＮＡをそれぞれのサンプルから抽出し、次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ大腸菌アンチセンス遺伝子チップ（登録商標）アレイ（Affymetrix,Santa Clara,CA）とハイブリダイズさせた。
１つの例示的な方法では、４つの例示的なゲノムライブラリーを、１、２、４、および８ｋｂの明確な挿入サイズを有する大腸菌Ｋ１２ゲノムＤＮＡから作製した。形質転換ライブラリーの混合物は、１０ＭのＮａＯＨでｐＨ７に中和した１Ｌの３−ＨＰ（TCI America）当たり２０ｇの最終濃度で、２本の１５ｍＬスクリューキャップチューブに等分した。選択培養物の細胞密度を、それらが０．３〜０．４の最終ＯＤ６００に近づくときモニタリングした。元の選択培養物を後に使用して、反復バッチ選択戦略の一部として他の一連の１５ｍＬのＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシン＋３−ＨＰを接種した。３−ＨＰを含む反復バッチ培養物をモニタリングして、６０時間の間接種して３−ＨＰの存在下で増大した増殖を示すクローンの濃度を高めた。１ｍＬの選択集団を選択プレートおよびそれぞれのバッチに平板培養することによって、サンプルを採取した。プラスミドＤＮＡをそれぞれのサンプルから抽出し、次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ大腸菌アンチセンス遺伝子チップ（登録商標）アレイ（Affymetrix,Santa Clara,CA）とハイブリダイズさせた。
データ解析
ソフトウェアパッケージ、ＳＣＡＬＥソフトウェアパッケージ、（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００５年９月２０日に出願された米国特許出願第11/231,018号）を使用することによって、データ解析を完了した。特定のゲノム要素からの適合貢献度を、以前に記載されたように（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Lynch,M.,Warnecke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analysis of library enrichment.Nature Methods,2007,4(87-93)）、選択集団の一部分としてそれぞれの領域の濃縮から計算した。遺伝要素とそれらの対応する適合性を、次いでそれらのＥｃｏＣｙｃ分類（ecocyc.org）に基づいて代謝経路によって分離した。この適合性マトリクスを使用して、選択集団において見られた経路の適合性（W）と濃縮頻度の両方を計算した。
ソフトウェアパッケージ、ＳＣＡＬＥソフトウェアパッケージ、（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００５年９月２０日に出願された米国特許出願第11/231,018号）を使用することによって、データ解析を完了した。特定のゲノム要素からの適合貢献度を、以前に記載されたように（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Lynch,M.,Warnecke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analysis of library enrichment.Nature Methods,2007,4(87-93)）、選択集団の一部分としてそれぞれの領域の濃縮から計算した。遺伝要素とそれらの対応する適合性を、次いでそれらのＥｃｏＣｙｃ分類（ecocyc.org）に基づいて代謝経路によって分離した。この適合性マトリクスを使用して、選択集団において見られた経路の適合性（W）と濃縮頻度の両方を計算した。
経路割り当ての冗長性を、経路の適合性の最初の等級序列、次に第一級で確認した一次経路への多数の経路と関係がある遺伝要素の具体的な割り当て、および二次経路からの遺伝子特異的適合値のその後の除去によって確認した。
増殖の確認
Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）＋ｐＳＭＡＲＴＬＣ−ＫＡＮの一晩培養物を５ｍＬのＬＢ＋カナマイシンに接種した。サプリメント（表１）および一晩培養物由来の１５ｍＬＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシン＋３−ＨＰを含む１５ｍＬスクリューキャップチューブ中への接種によって増殖曲線を構築した。培養物は３７℃においてインキュベートし、光学濃度はＯＤ６００＞０．２までモニタリングした。次いで培養物を正確なＯＤ６００＝０．２まで希釈し、これらを使用して０．４０の最初の光学濃度まで１５ｍＬＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシン＋３−ＨＰ（pH=7.0）を含む培養物を接種して、静止期中の増殖の影響を最小にした。最少培地中の微好気的増殖の全範囲で、または最終ＯＤ６０００．５〜０．６まで、光学濃度をモニタリングおよび記録した。増殖パラメータは、特異的増殖、増殖期の全盛時におけるＯＤ６００（約１４時間）、および最大増殖期の終結時におけるＯＤ６００、および最終ＯＤ６００（２４時間）に関して評価した。特定の中間体の制約に対処するために、関連するコリスミ酸経路のサプリメントを表１中に挙げる最終濃度まで加えた。
Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）＋ｐＳＭＡＲＴＬＣ−ＫＡＮの一晩培養物を５ｍＬのＬＢ＋カナマイシンに接種した。サプリメント（表１）および一晩培養物由来の１５ｍＬＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシン＋３−ＨＰを含む１５ｍＬスクリューキャップチューブ中への接種によって増殖曲線を構築した。培養物は３７℃においてインキュベートし、光学濃度はＯＤ６００＞０．２までモニタリングした。次いで培養物を正確なＯＤ６００＝０．２まで希釈し、これらを使用して０．４０の最初の光学濃度まで１５ｍＬＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシン＋３−ＨＰ（pH=7.0）を含む培養物を接種して、静止期中の増殖の影響を最小にした。最少培地中の微好気的増殖の全範囲で、または最終ＯＤ６０００．５〜０．６まで、光学濃度をモニタリングおよび記録した。増殖パラメータは、特異的増殖、増殖期の全盛時におけるＯＤ６００（約１４時間）、および最大増殖期の終結時におけるＯＤ６００、および最終ＯＤ６００（２４時間）に関して評価した。特定の中間体の制約に対処するために、関連するコリスミ酸経路のサプリメントを表１中に挙げる最終濃度まで加えた。
クローン構築
上流ａｒｏＦｐプロモーターおよびｒｈｏ−非依存性転写ターミネーターを含むように設計したプライマーを用いるＰＣＲを使用して、ａｒｏＦ−ｔｙｒＡ領域に対応する大腸菌Ｋ１２ゲノムＤＮＡを増幅した。精製、断片化ＤＮＡとｐＳＭＡＲＴ−カナマイシンベクターの連結は、製造者の説明書に従いＣｌｏｎｅＳＭＡＲＴキット（Lucigen,Middleton,WI）を用いて実施した。次いで連結生成物はケミカルコンピテントＭＡＣＨ１−Ｔ１Ｒ（Invitrogen,Carlsbad,CA）に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシンに平板培養し、２４時間３７℃においてインキュベートした。陽性形質転換体の挿入を確認するために、プラスミドをＱｉａｇｅｎ（Valencia,CA）からのＱｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐキットを使用してクローンから単離し、塩基配列決定した（Macrogen、韓国）。
上流ａｒｏＦｐプロモーターおよびｒｈｏ−非依存性転写ターミネーターを含むように設計したプライマーを用いるＰＣＲを使用して、ａｒｏＦ−ｔｙｒＡ領域に対応する大腸菌Ｋ１２ゲノムＤＮＡを増幅した。精製、断片化ＤＮＡとｐＳＭＡＲＴ−カナマイシンベクターの連結は、製造者の説明書に従いＣｌｏｎｅＳＭＡＲＴキット（Lucigen,Middleton,WI）を用いて実施した。次いで連結生成物はケミカルコンピテントＭＡＣＨ１−Ｔ１Ｒ（Invitrogen,Carlsbad,CA）に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシンに平板培養し、２４時間３７℃においてインキュベートした。陽性形質転換体の挿入を確認するために、プラスミドをＱｉａｇｅｎ（Valencia,CA）からのＱｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐキットを使用してクローンから単離し、塩基配列決定した（Macrogen、韓国）。
（実施例１）
１つの例示的な方法では、選択は６０時間の３−ＨＰの減少勾配で８個の連続移動式バッチにおいて実施した。最初の集団はＭＡＣＨ１−ＴＲに形質転換した５つの例示的な大腸菌Ｋ１２ゲノムライブラリーからなっており、微好気的状態（OD600〜0.2）に対応する指数中期まで培養した。バッチ移動時間は、栄養制限された選択環境を避けるために必要に応じて調整する変数パラメータとして維持した。サンプルは前に記載したように選択中のそれぞれのバッチの全盛時に採取し、ＳＣＡＬＥソフトウェアでさらに分析して、マイクロアレイシグナルを対応するライブラリークローンに分解し、経時的な特定領域の相対的濃縮を計算した。このようにして、ゲノム規模での適合性（ln（Xi/Xi0））を、工業的関連がある有機酸である３−ＨＰの存在下での選択に関する領域特異的濃縮パターンに基づいて測定した。
１つの例示的な方法では、選択は６０時間の３−ＨＰの減少勾配で８個の連続移動式バッチにおいて実施した。最初の集団はＭＡＣＨ１−ＴＲに形質転換した５つの例示的な大腸菌Ｋ１２ゲノムライブラリーからなっており、微好気的状態（OD600〜0.2）に対応する指数中期まで培養した。バッチ移動時間は、栄養制限された選択環境を避けるために必要に応じて調整する変数パラメータとして維持した。サンプルは前に記載したように選択中のそれぞれのバッチの全盛時に採取し、ＳＣＡＬＥソフトウェアでさらに分析して、マイクロアレイシグナルを対応するライブラリークローンに分解し、経時的な特定領域の相対的濃縮を計算した。このようにして、ゲノム規模での適合性（ln（Xi/Xi0））を、工業的関連がある有機酸である３−ＨＰの存在下での選択に関する領域特異的濃縮パターンに基づいて測定した。
図１は、３−ＨＰ選択からのゲノム規模での多重スケール解析のプロットを表す。それぞれのピークは、対応するゲノム領域によって表されるシグナル（選択集団の一部分）を示す。プロットは大腸菌の環状染色体による円として表し、ゲノム位置はそれぞれの円周辺に時計回りに増大し、ゲノムの最初と最後の塩基対は１２時の位置に存在する。それぞれのプロットＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれ１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、４０００ｂｐおよび８０００ｂｐスケールと関係があるシグナルを表す。円周辺の数字は、コリスミ酸超経路の構成要素をコードする遺伝子に対応する。これらの遺伝子は、３−ＨＰ選択において有意な濃縮を示したゲノム領域上に存在した。
ＳＣＡＬＥ手法の１つの利点は、選択期間中クローン集団の適合性を定量的に追跡する能力である。したがって個々のクローンの適合性は遺伝子によって分けることができ、経路によってさらに分類することができ、全体的な３−ＨＰ耐性に貢献するゲノム規模範囲の経路適合性を生み出すことができる。この方法を使用して、系に対する適合性に貢献している大部分のクローンを含む幾つかの重要な代謝経路を同定している（図２）。図２は、全体的な適合性に貢献する上位７経路に関する経路適合性の結果を表す。コリスミ酸超経路は、全体的な適合性と選択集団中に含まれる遺伝要素の最高頻度の両方に最も貢献するとして認識されており、１９の遺伝要素を増大した適合性を示す集団の上位１０％中で同定した（図３Ａ）。図３Ａは大腸菌のコリスミ酸超経路を表す。上位１０％のクローン中で見られる遺伝子の濃縮レベルを強調表示する。さらに、コリスミ酸超経路に関与する３３個の遺伝子が有意な適合性の獲得を示し、かつ全５７個の遺伝子が選択中ある程度の濃縮を示した。したがって、コリスミ酸の下流の必要な酵素をコードする遺伝要素を含むクローンは、阻害レベルの３−ＨＰの存在下で有意な適合性の増大を実証した。この発見は、３−ＨＰの存在下での培養に関して観察した増殖阻害は、コリスミ酸生合成経路の中断の結果であることを示す。
図３Ａはコリスミ酸超経路の概略を表す。中間体は標識し、またはその他の場合は矢印の分岐点で示す。酵素機能（矢印）をコードする遺伝子の名称は対応する矢印の隣に書く。経路中の生成物または中間体の負のフィードバック阻害は、グレーの矢印として示す。
コリスミ酸経路の阻害
これらの発見を確認するために、コリスミ酸の下流で合成された産物を培養培地に補充した。それぞれの産物の添加は増殖を個別に刺激し、阻害はコリスミ酸の合成時、または合成前に起こることをさらに確認した（図３Ｂ）。図３Ｂは増殖の確認を表す：コリスミ酸の下流産物の添加は、特異的増殖の増大（黒色）および増殖期の全盛時ＯＤ６００の増大（グレー）によって確認した増殖の阻害を部分的に軽減する。しかしながら、幾つかの下流産物（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）の補充の増大は、コリスミ酸超経路に対して最初に働く工程のフィードバック阻害をもたらし、したがってユビキノン、メニキノン、およびテトラヒドロ葉酸を含む他の下流産物の形成を減らし、かつ関連する増殖の利点を制限するはずである。ここでは、３−ＨＰの不存在下での増殖培地へのコリスミ酸誘導体の添加は、特異的増殖または最終細胞密度に対してほとんど〜全く有益な影響がなく、補充は３−ＨＰ依存性であることをさらに確認した。観察した阻害をさらに調べるために、主なコリスミ酸経路の中間体であるシキミ酸を細胞外に供給し、特異的増殖の２０％の増大をもたらした（図３Ｂ）。
これらの発見を確認するために、コリスミ酸の下流で合成された産物を培養培地に補充した。それぞれの産物の添加は増殖を個別に刺激し、阻害はコリスミ酸の合成時、または合成前に起こることをさらに確認した（図３Ｂ）。図３Ｂは増殖の確認を表す：コリスミ酸の下流産物の添加は、特異的増殖の増大（黒色）および増殖期の全盛時ＯＤ６００の増大（グレー）によって確認した増殖の阻害を部分的に軽減する。しかしながら、幾つかの下流産物（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）の補充の増大は、コリスミ酸超経路に対して最初に働く工程のフィードバック阻害をもたらし、したがってユビキノン、メニキノン、およびテトラヒドロ葉酸を含む他の下流産物の形成を減らし、かつ関連する増殖の利点を制限するはずである。ここでは、３−ＨＰの不存在下での増殖培地へのコリスミ酸誘導体の添加は、特異的増殖または最終細胞密度に対してほとんど〜全く有益な影響がなく、補充は３−ＨＰ依存性であることをさらに確認した。観察した阻害をさらに調べるために、主なコリスミ酸経路の中間体であるシキミ酸を細胞外に供給し、特異的増殖の２０％の増大をもたらした（図３Ｂ）。
図３Ｂは、コリスミ酸超経路における遺伝子のコピー数の増大と関係がある適合性（３−ＨＰの存在下での増殖率の増大）を例示するための例示的な方法を表す。
さらに、コリスミ酸経路の最初の工程では、エリスロース−４−リン酸（E-4-P）はホスホエノールピルビン酸（PEP）と反応して３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸を形成する。Ｅ−４−Ｐは、非酸化的部分のペントースリン酸経路およびピリドキサル−５’−リン酸（ビタミンＢ６）の生合成を含む幾つかの重要な経路に必要とされる。一発見は、Ｅ−４−Ｐプールは制限されないこと、および阻害はＥ−４−Ｐとシキミ酸の形成の間で起こる可能性が最も高いことを暗示する。他の実験では、リボース、ヒスチジン、およびヌクレオチドを個別に増殖培地に加えた。これらの分子は、経路分析に対する有意な適合性にも貢献する（図３Ｂ）ヒスチジン、プリン、およびピリミジン生合成超経路（PRPP）の副産物である。
混乱したフィードバック阻害
ＳＣＡＬＥ法を使用することによって、３−ＨＰの存在下で増殖の阻害を軽減するための幾つかの遺伝的標的を同定している。具体的には、図２中に示すように、ｔｙｒＡ−ａｒｏＦオペロンのコピーの増大は選択中に有意な濃縮をもたらし、この遺伝領域は魅力的な標的となる。ｔｙｒＡ−ａｒｏＦオペロンを含むクローンを構築し、２０ｇ／Ｌの３−ＨＰの存在下で培養した。この領域のコピーの増大は増殖の阻害を部分的に軽減し、特異的増殖の１５％の増大をもたらす。この領域は有意な適合性の獲得を示した一方で、チロシンおよびフェニルアラニン生成の関連した増大はコリスミ酸経路中の最初の工程を阻害した。この固有の制御を回避するための１つの方法は、下流産物の増大したプールの存在下で活性を維持しながらＥ−４−Ｐの変換を増大し、これによってコリスミ酸経路の必要な副産物の合成障害による増殖の阻害を軽減する、誘導性フィードバック耐性ａｒｏＨ突然変異体を得ることであった。２０ｇ／Ｌの３−ＨＰの存在下でのａｒｏＨ突然変異体の増殖は、特異的増殖の有意な増大をもたらした。さらに、Ｍ９最少培地中の３−ＨＰの２４時間の最小阻害濃度（２４時間での目に見える増殖を停止させるための最小濃度）は、ベクター対照の２５ｇ／ＬからこのａｒｏＨ突然変異体を発現する大腸菌クローンの４０ｇ／Ｌまで増大した。本明細書の特定の実施形態では、微生物における３−ＨＰ生成の耐性を増大させるために、ａｒｏＨ突然変異体は単独で、または他の遺伝子操作または選択と組合せて有用であり得ることが企図される。
ＳＣＡＬＥ法を使用することによって、３−ＨＰの存在下で増殖の阻害を軽減するための幾つかの遺伝的標的を同定している。具体的には、図２中に示すように、ｔｙｒＡ−ａｒｏＦオペロンのコピーの増大は選択中に有意な濃縮をもたらし、この遺伝領域は魅力的な標的となる。ｔｙｒＡ−ａｒｏＦオペロンを含むクローンを構築し、２０ｇ／Ｌの３−ＨＰの存在下で培養した。この領域のコピーの増大は増殖の阻害を部分的に軽減し、特異的増殖の１５％の増大をもたらす。この領域は有意な適合性の獲得を示した一方で、チロシンおよびフェニルアラニン生成の関連した増大はコリスミ酸経路中の最初の工程を阻害した。この固有の制御を回避するための１つの方法は、下流産物の増大したプールの存在下で活性を維持しながらＥ−４−Ｐの変換を増大し、これによってコリスミ酸経路の必要な副産物の合成障害による増殖の阻害を軽減する、誘導性フィードバック耐性ａｒｏＨ突然変異体を得ることであった。２０ｇ／Ｌの３−ＨＰの存在下でのａｒｏＨ突然変異体の増殖は、特異的増殖の有意な増大をもたらした。さらに、Ｍ９最少培地中の３−ＨＰの２４時間の最小阻害濃度（２４時間での目に見える増殖を停止させるための最小濃度）は、ベクター対照の２５ｇ／ＬからこのａｒｏＨ突然変異体を発現する大腸菌クローンの４０ｇ／Ｌまで増大した。本明細書の特定の実施形態では、微生物における３−ＨＰ生成の耐性を増大させるために、ａｒｏＨ突然変異体は単独で、または他の遺伝子操作または選択と組合せて有用であり得ることが企図される。
前に記載したこの増殖の阻害は、下流の芳香族アミノ酸、チロシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンに影響を与え得る。この増殖の阻害によれば、これらのアミノ酸のプールの増大は、コリスミ酸超経路の最初に働くことに対応するＤＡＨＰＳアイソザイムの活性を低下させる。この実施例は、増大した耐性はそれぞれの中間体プールの増大した濃度に特異的ではないが、プールの調節によって得ることができることを示す。１つの例示的な方法では、フェニルアラニンを増殖培地に補充することは、３−ＨＰの存在下における特異的増殖に対して有害な影響があったが、一方チロシンの添加は有益な影響があった。これは、ＤＡＨＰＳ酵素の最適活性を与えるためにチロシンプールを同時に増大させながら、フェニルアラニンプールを減少させることにより生成物濃度を調節することによって、最適な３−ＨＰ耐性を得ることができるという概念を示す。１つの例示的な実施形態は、ＤＡＨＰＳ酵素の最適活性を与えるためのチロシンレベルの増大と組合せてフェニルアラニンを減少させることにより、コリスミ酸超経路の生成物濃度を調節することに関する。
図４は、増殖の阻害を低下させるための、コリスミ酸超経路中のコリスミ酸の例示的な下流構成要素を使用する増殖の確認を表す。特異的増殖の増大は黒色で示し、一方増殖期の全盛時のＯＤ６００の増大はグレーで示す。コリスミ酸超経路の１つまたは複数の下流産物を使用して、微生物における３−ＨＰ耐性を増大させることができることは、本明細書において企図される。これらの使用によれば、微生物の培養物に１つまたは複数の下流産物を補充することができる。
初回ライブラリー選択および全ての後の増殖の確認のために、例えばＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａから入手した３−ＨＰ組成物は、様々な量のアクリル酸汚染を含み得る。最少培地中で増殖した大腸菌Ｍａｃｈ１に関するアクリル酸の最小阻害濃度は、約０．６ｇ／Ｌであったと決定した。コリスミ酸超経路に特異的な耐性機構は３−ＨＰの毒性に限られることを支持して、アクリル酸の最小阻害濃度は、シキミ酸またはホモシステインの添加で補充した最少培地中で増殖した大腸菌Ｍａｃｈ１に関して０．６ｇ／Ｌであったと決定した。さらに、最少培地中で増殖したフィードバック耐性ａｒｏＨ突然変異体に関して、最小阻害濃度は０．６ｇ／Ｌであったと決定した。このデータは、コリスミ酸超経路に関与する任意の中間体の濃度の増大は３−ＨＰの毒性に特異的な耐性を増大させ、３−ＨＰ組成物のアクリル酸汚染によって影響を受けないことを裏付けている。
本明細書に記載する実施例において、増殖培地へのコリスミ酸由来の下流産物の添加は特異的増殖を増大させ、有機酸の生成または増殖の阻害は、コリスミ酸関連アミノ酸および必須ビタミンの制限に原因があり得ることを確認した。補助的シキミ酸も増殖の劇的な増大を引き起こし、コリスミ酸生合成経路中シキミ酸の前に阻害が起こることを示した。さらなる試験は、阻害はエリスロース−４−リン酸とシキミ酸の形成の間に存在することを示唆する。前に示した発見は、組換え宿主として使用するための３−ＨＰ耐性株を作製する難点を克服する際に大いに役立つ。
本明細書に記載する実施例において、コリスミ酸超経路中の遺伝子を含む遺伝要素の発現または添加の変化は、３−ＨＰの存在下での特異的増殖の増大、したがって３−ＨＰ生成に対する耐性の増大を実証する。
本明細書で開示し特許請求する、全ての組成物および／または方法および／または装置は、本開示に照らして過度の実験なしで作製および実施することができる。組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載してきたが、本明細書の概念、精神および範囲から逸脱せずに、組成物および／または方法および／または装置に、および本明細書に記載する方法の工程または工程の順序において変更を施すことができることは、当業者には明らかであるはずである。より特定すれば、化学的にも生理的にも関係がある特定の作用物質は本明細書に記載する作用物質で置換することができ、一方で同一または類似の結果を達成し得ることは明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義する真意、範囲および概念内にあるとみなす。
Claims (31)
- 微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）に対する耐性を増大させるための組成物であって、微生物のコリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の化合物を含み、コリスミ酸超経路の調節が３−ＨＰの耐性を増大させる組成物。
- コリスミ酸超経路の中間体を含む、請求項１に記載の組成物。
- コリスミ酸超経路に対する前駆体を含む、請求項１に記載の組成物。
- コリスミ酸超経路中の流れの調節を含む、請求項１に記載の組成物。
- コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸の１つまたは複数から選択される化合物またはこれらの混合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記化合物が微生物中のコリスミ酸超経路の酵素を誘導する、請求項１に記載の組成物。
- 前記化合物がコリスミ酸超経路を調節することができる遺伝要素を有するベクターを含む、請求項１に記載の組成物。
- Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の中間体を含む、請求項２に記載の組成物。
- Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の前駆体を含む、請求項３に記載の組成物。
- Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の中間体の細胞内レベルを変化させることができる、請求項１に記載の組成物。
- Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択されるコリスミ酸超経路の１つまたは複数の前駆体の細胞内レベルを変化させることができる、請求項１に記載の組成物。
- コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、またはユビキノン−８の１つまたは複数から選択される化合物またはこれらの混合物もしくはこれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記化合物が微生物中のコリスミ酸超経路の酵素を調節する、請求項１に記載の組成物。
- 前記化合物が、コリスミ酸超経路の代謝産物を変化させることができる１つまたは複数の遺伝要素を有するベクターを含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記化合物が、コリスミ酸超経路中の代謝産物を変化させることができる遺伝的変化を誘導する、請求項１に記載の組成物。
- 微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成を増大させるための組成物であって、３−ＨＰに対する微生物の耐性を増大させることができる１つまたは複数の化合物を含み、少なくとも３０ｇ／Ｌまで耐性を誘導する組成物。
- 微生物による有機酸の生成または生成に対する耐性を増大させるための方法であって、微生物中のコリスミ酸超経路を調節することを含む方法。
- 微生物中のコリスミ酸超経路の調節が、コリスミ酸超経路を調節することができる微生物に化合物を導入することを含む、請求項１７に記載の方法。
- 微生物による有機酸の生成に対する耐性を増大させるための方法であって、
ａ）微生物によるコリスミ酸超経路の中間体を調節することができる１つまたは複数の化合物を得ることであって、コリスミ酸超経路の誘導が微生物による有機酸の生成および／または有機酸に対する耐性を増大させることと、
ｂ）微生物の培養物に化合物を導入することと
を含む方法。 - 前記有機酸が３−ＨＰおよび任意選択により１つまたは複数の３，３−ジオキシプロピオン酸およびアクリル酸の混合物を含む、請求項１９に記載の方法。
- 前記化合物がコリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物の１つまたは複数から選択される、請求項１９に記載の方法。
- 有機酸が３−ＨＰ、および任意選択により１つまたは複数の３，３−ジオキシプロピオン酸およびアクリル酸の混合物を含む、請求項１９に記載の方法。
- 微生物による有機酸の生成に対する耐性を増大させるための方法であって、
ａ）微生物によるコリスミ酸超経路の前駆体を調節することができる１つまたは複数の化合物を得ることであって、コリスミ酸超経路の誘導が微生物による有機酸に対する耐性を増大させることと、
ｂ）微生物の培養物に化合物を導入することと
を含む方法。 - 有機酸が３−ＨＰ、および任意選択により１つまたは複数の３，３−ジオキシプロピオン酸およびアクリル酸の混合物を含む、請求項２３に記載の方法。
- 微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成を増大させるための方法であって、微生物の培養物を、コリスミ酸超経路の化合物またはコリスミ酸超経路を調節することができる化合物を１つまたは複数含む組成物と接触させることを含む方法。
- 化合物が、コリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の遺伝要素を有するベクターを含む、請求項２５に記載の方法。
- 微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）の生成および／または耐性を増大させるための方法であって、微生物中のコリスミ酸超経路を遺伝子操作することを含む方法。
- 微生物中のコリスミ酸超経路の遺伝子操作が、新たな遺伝物質を導入するためのベクターを加えることによる、微生物中のコリスミ酸超経路に関与する１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の改変；既存の遺伝物質の遺伝子の挿入、破壊または除去；遺伝物質の突然変異、またはこれらの２つ以上の組合せから選択される、請求項２７に記載の方法。
- 遺伝子の挿入が、コリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物の１つまたは複数の細胞内レベルを調節することを含む、請求項２７に記載の方法。
- 微生物における有機酸の生成に対する耐性を増大させるためのキットであって、微生物のコリスミ酸超経路を調節することができる１つまたは複数の化合物、および１つまたは複数の容器を含み、１つまたは複数の前記化合物が有機酸に対する耐性を増大させることができるキット。
- １つまたは複数の前記化合物がコリスミ酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、葉酸、ユビキノン、メニキノン、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（DAHPS）アイソザイム、シキミ酸、Ｄ−エリスロース−４−リン酸、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ−シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−リン酸、コリスミ酸、イソコリスミ酸、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、エンテロバクチン、２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−ｌ−カルボキシレート、ｏ−スクシニル安息香酸、ｏ−スクシニルベンゾイル−ｃｏＡ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート、メナキノン、アントラニル酸、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）−アントラニル酸、１−（ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１’−デオキシリボース−５’−リン酸、インドール−３−グリセロール−リン酸、インドール、Ｌ−トリプトファン、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸、パラ−アミノ安息香酸、７，８−ジヒドロプテロエート、７，８−ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸、２−オクタプレニルフェノール、２，２−オクタプレニル−６−ヒドロキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール、２−オクタプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ１，４−ベンゾキノン、３−デメチルユビキノン−８、ユビキノン−８またはこれらの２つ以上の組合せもしくは混合物から選択される、請求項３０に記載のキット。
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| KR102223521B1 (ko) | 2019-02-26 | 2021-03-05 | 한국과학기술원 | 안트라닐산 메틸 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 안트라닐산 메틸의 제조방법 |
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