JPH09505463A

JPH09505463A - バイオマス由来炭素源からアジピン酸を合成する方法

Info

Publication number: JPH09505463A
Application number: JP7509286A
Authority: JP
Inventors: フロスト，ジョン，ダブリュー．; ドレイス，カレン，エム．
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1993-09-16
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 1997-06-03
Also published as: FI961234A; AU687874B2; US5487987A; FI116298B; NZ273231A; CA2171327C; EP0722504A4; EP0722504A1; US5616496A; CA2171327A1; AU7646094A; FI961234A0; WO1995007996A1

Abstract

(57)【要約】アジピン酸の製法が提供される。その方法は３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子の構成性発現を特徴とするトランスフォーム細胞を炭素源をcis，cis−ムコン酸に変換するのに十分な時間培養し、cis，cis−ムコン酸を水素化してアジピン酸を生成する諸段階からなる。

Description

【発明の詳細な説明】バイオマス由来炭素源からアジピン酸を合成する方法技術分野・背景技術及び発明の開示本発明はバイオマス由来−炭素源の変換によってアジピン酸及びその前駆物質を生産することに関する。より詳細に述べるならば、本発明は芳香族アミノ酸の生合成に利用することができるグルコース及びその他の砂糖を３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素、及びカテコール１、２−二酸素添加酵素、その後の水素添加を経て生体触媒的にアジピン酸に変換することに向けられている。１９８９年のアジピン酸の世界年間生産高は４２億ポンドと推定された。１９９２年の米国生産高は１７.５億ポンドであった。アジピン酸は一貫して、国内で生産されるトップ化学物質５０種のなかの１つとしてランクづけされている。国内で生産されるアジピン酸のほぼ９０％がナイロン−６、６の生産に用いられている。アジピン酸のその他の用途は滑剤及び可塑剤の生産、及び食物の酸味剤としての使用である。アジピン酸合成のための主な工業的方法では、先ず最初にシクロヘキサンを空気酸化してシクロヘキサノン（ケトン−ｋｅｔｏｎ）とシクロヘキサノール（アルコール−ａｌｃｏｈｏｌ）との混合物を得る。これはＫＡと呼ばれる。フェノールを水素化してＫＡを得る方法も商業上用いられているが、この方法による生産は全アジピン酸生産の２％に過ぎない。両方法によって生産されるＫＡを硝酸で酸化するとアジピン酸が得られる。ＮＯ₂、ＮＯ、及びＮ₂Ｏを含む還元酸化窒素が副産物として生成し、種々のレベルで硝酸に再循環される。これらの方法は環境的に問題のある供給原料に大きく依存しているため、そして不都合な副産物を与える傾向があるため、そのままでは完全に好ましいとは言えない。シクロヘキサンは、再生し得ない化石燃料から得られる公知の発癌物質、ベンゼンから誘導される。シクロヘキサンそのものも現在毒性物質として試験中である。さらに、大気中亜酸化窒素の地球的増加の１０％が硝酸酸化に起因しているという報告がある。亜酸化窒素はオゾン層の破壊と関係がある。アジピン酸の別の合成法の探索のために包括的研究が行われたが、これまで商業化されたものはなかった。シクロヘキサンを直接アジピン酸に変換するシクロヘキサンのコバルト触媒空気酸化、またはオゾンによるシクロヘキサンの酸化などの諸反応が、ＫＡの中間的生成を避ける方法として研究された。この場合も原料としてのシクロヘキサン及びフェノールの使用は環境的観点から好ましくない。別の供給原料からアジピン酸を合成することに焦点を置いた研究が行われた。ブタジエンのカルボニル化が注目された。より最近になって、メチルアクリレートを二量体化する方法が報告され、Ｃ−３原料からのアジピン酸合成の可能性が生まれた。生物学的系の利用も試みられた。トルエンから cis，cis ムコン酸への変換を触媒する Pseudomonas putida 菌株が発見された。cis，cis ムコン酸は水素化されてアジピン酸を与える。しかしながらこの方法は、環境的に問題のある原料、トルエンから出発するという点で従来の方法と同様である。Acinetobacter 及び Norcardia の両菌株は、炭素の唯一のソースとしてシクロヘキサノールで増殖するときには、その代謝経路において中間体としてアジピン酸を生産することが報告された。その他に、菌株 Norcardia 及び Pishia carboniferus はそれぞれジアミノドデカン及びミリスチン酸からアジピン酸を合成することが報告された。しかしこれらの菌株に基づく方法は、出発材料が特に高価であるため商業上魅力がない。その上生化学的諸反応及び酵素活性の誘導がはっきりとは解明されていない。生体触媒要素と化学の要素とを組合わせる１方法は、バイオマスから１、６− ヘキサンジオールへの多段階化学的変換と、その後の Gluconobacter oxydans による１、６−ヘキサンジオールからアジピン酸への酸化とを含む。この方法は安価な出発材料を使用する一方、高温（１００℃−３５０℃）及び高圧（20000 ｐｓｉ［1406 ｋｇ／ｃｍ²］）で行われる複数の化学的変換を必要とし、銅クロマイトを含む多数の金属触媒を用いなければならない。環境的に問題のある出発材料の使用を回避するのみならず、安価な、再生可能の資源を効率的に利用するアジピン酸の合成法を提供することが所望である。さらに大量のエネルギー投入の必要がなく、毒性副産物の生成を最小にするアジピン酸合成法の提供が所望である。本発明は、芳香族アミノ酸生合成の一般的経路を有する微生物内で生体触媒によりエリトロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）及びホスフォエノールピルベート（ＰＥＰ）に変換可能の、容易に入手できる炭素源からアジピン酸を微生物的生合成する方法を提供する。１つの好適炭素源はＤ−グルコースである。好都合なことに、本発明に関して使用できるＤ−グルコース及びその他の炭素源は無毒性である。さらに、それらは澱粉、セルロース、そしてコーン、サトウキビ、砂糖大根に含まれる砂糖類、木材パルプ、その他のバイオマス資源から誘導される再生可能の物質である。本発明の実施のために適した宿主微生物は内因性芳香族アミノ酸生合成一般経路を有する種類に属するものである。好適宿主微生物は、Klebsiella pneumonia e 及び Acinetobacter calcoaceticus に内在する選択された遺伝子を発現するように、遺伝子操作された Escherichia coli 突然変異体である。本発明に使用するための１つの好適Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異体はＥ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４である；これは、シキメート脱水素酵素の遺伝暗号をもつａｒｏＥ座の突然変異によって、一般経路中の中間体である３−ジヒドロシキメート（ＤＨＳ）からシキミ酸へ、そしてその後コリスメートへの変換を触媒することができない栄養要求性突然変異体である。芳香族アミノ酸生合成一般経路は芳香族アミノ酸−フェニルアラニン、チロシン及びトリプロファン−を細菌及び植物体内で作り出す。この一般経路は分岐点分子コリスメートに終わり、コリスメートはその後３つの別々の末端経路によってフェニルアラニン、チロシン及びトリプロファンに変換される。一般経路の生産効率を高める方法は米国特許第 5168056号（１９９２年１２月１日発行）及び米国特許出願第 07/994194号（１９９２年１２月２１日提出）に記載されている；その開示は引例によってここに明白に挿入される。本発明によって遺伝子工学的に操作された突然変異宿主微生物を用いてアジピン酸を生産する場合、芳香族アミノ酸生合成に向かう炭素流はこの一般経路に沿って進み、ＤＨＳ中間体の細胞内濃度を高める。ＤＨＳからコリスメートへの変換を阻止する芳香族アミノ酸生合成一般経路に沿う突然変異によってＤＨＳ中間体は蓄積する。ＤＨＳ中間体は酵素、３−デヒドロシキメート脱水酵素の基質としてはたらき、プロトカテケートが生産される。プロトカテケートはその後プロトカテケート脱炭酸酵素によりカテコールに変換する。カテコールはそれはそれでカテコール１、２−二酸素添加酵素の作用により cis、cis−ムコン酸に変換する。合成された cis，cis−ムコン酸は細胞外に蓄積し、遠心分離によって細胞から分離することができる。cis，cis−ムコン酸はその後直ぐに水素化されてアジピン酸となる。好適には、cis、cis−ムコン酸の生合成を触媒する酵素は、構成性プロモーターのコントロール下でそれら酵素の遺伝暗号をもつ遺伝子を含む組替えＤＮＡによって宿主細胞に発現される。それによって炭素流は一般経路から離れて分岐経路（divergent pathway）に入ることを強いられ、cis，cis−ムコン酸を生成する。多大のエネルギーを消費する公知の多段階変換法とは異なり、本発明の方法は比較的低温で（例えば約３７℃）、大気圧下で行われる１段階微生物学的変換を基礎とし、その後の単一の化学的変換は周囲温度で軽度な加圧下（５０ｐｓｉ［３.５ｋｇ／ｃｍ²］）で白金触媒使用下で行われる。その上生合成された cis,c is-ムコン酸の９０％以上がアジピン酸に転化し得る。宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４を用いる好適１実施態様において、シキメート脱水素酵素の遺伝暗号を含む遺伝子（ａｒｏＥ）の突然変異によってＤＨＳの細胞内濃度が高まる。ＤＨＳは、ＤＨＳ脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素の遺伝暗号をもつ発現可能の遺伝子断片で、並びに増加量の炭素を芳香族アミノ酸生合成一般経路に引き渡す酵素の遺伝暗号をもつ遺伝子で宿主細胞を形質転換することによって利用可能となる分岐経路に沿って、カテコールに変換される。カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ発現可能の遺伝子断片でさらに宿主細胞を形質転換すると、カテコールから cis，cis−ムコン酸への生体触媒変換が可能となり、後者は細胞から分離され、炭素上１０％白金の使用下で、５０ｐｓｉ水素圧、室温で３時間直接水素化されてアジピン酸を生成する。本発明の組換え突然変異体の培養上澄液を核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を用いて分析すると、アジピン酸が主要生成物であることがわかる。cis，cis−ムコン酸の９０％がアジピン酸に変換する。本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、ここの示す発明の最良の実施法を例示する以下に述べる好適実施例の詳細な説明を考慮すれば熟練せる当業者には当然理解できる。図面の簡単な説明図１は、芳香族アミノ酸生合成一般経路及び３−デヒドロシキメートからアジピン酸を合成する分岐経路を示す；図２は、ｐ２−４７のプラスミド地図をあらわし、プラスミドｐＫＤ８.２４３Ａがプラスミドｐ２−４７、ｐＳＵ１−３１、及びｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７から生成する仕方を説明する。図３、はｐＫＤ８.２９２のプラスミド地図をあらわし、プラスミドｐＫＤ８.２９２がプラスミドｐＩＢ１３４５及びｐＣＬ１９２０から生成する仕方を説明する。発明を実施するための最良の形態及び産業上の利用の可能性本発明により、芳香族アミノ酸生合成一般経路を有する宿主細胞が利用することのできるバイオマス由来の炭素源からアジピン酸を生産する方法が提供される。１好適実施例において、その方法は宿主細胞を炭素源の存在下で培養し、cis ，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生産する諸段階からなる。本発明により利用できるバイオマス由来の炭素源は、生体触媒によってＤ−エリトロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）及びホスフォエノールピルベート（ＰＥＰ）― これらは芳香族アミノ酸生合成一般経路の２前駆体化合物である―に変換可能のあらゆる炭素源を含む（図１参照）。適した炭素源としては澱粉、セルロース、及びグルコース、ペントース、フルクトースなどの砂糖類が含まれる、ただしこれらに限定されるわけではない。好適実施例において、Ｄ−グルコースが本発明の宿主細胞によって使用される炭素源である。本発明の使用に適した宿主細胞は所望芳香族化合物の工業的生合成生産のために利用できる属のメンバーである。より詳細に述べるならば、適した宿主細胞は内在性芳香族アミノ酸生合成一般経路を有する。一般芳香族経路は非常に種々様々の微生物に内在性し、種々の芳香族化合物の生産のために利用される。図１に示すように、一般芳香族経路はＥ４Ｐ及びＰＥＰから（Ｅ４Ｐの有用性は、ｔｋｔ遺伝子に遺伝暗号化されたペントースリン酸経路酵素トランスケトラーゼによって高められる）、経路中の多くの中間体を経てコリスミン酸に至る。この経路の中間体としては３−デオキシＤ−アラビノ−ヘプツロソン酸７−リン酸（ＤＡＨＰ）、３−デヒドロキネート（ＤＨＱ）、３−デヒドロシキメート（ＤＡＳ）、シキミ酸、シキメート３−リン酸（Ｓ３Ｐ）、及び５−エノールピルボイルシキメート−３−リン酸（ＥＰＳＰ）がある。一般経路の酵素、及びそれらそれぞれの遺伝子としては、ＤＡＨＰ生成酵素（ａｒｏＦ）、ＤＨＱ生成酵素（ａｒｏＢ）、ＤＨＱ脱水酵素（ａｒｏＤ）、シキメート脱水素酵素（ａｒｏＥ）、シキメートキナーゼ（ａｒｏＬ、ａｒｏＫ）、ＥＰＳＰ生成酵素（ａｒｏＡ）及びコリスメート生成酵素（ａｒｏＣ）がある。この種の一般経路を含む宿主細胞としては Escherichia、Klebsiella、Coryne bacterium、Brevibacterium、Arthrobacter、Bacillus、Pseudomonas、Streptom yces、Staphylococcus または Serratia 属に属する原核生物が挙げられる。真核生物宿主細胞も使用でき、Saccharomyces または Schizosaccharomyces 属の酵母が好適である。より詳細に述べるならば、原核生物宿主細胞は、Escherichia coli、Klebsiel la pneumonia、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium herculis、Brev ibacterium divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium fl avum、Bacillus brevis、Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus coa gulans、Bacillus lichenformis、Bacillus megaterium、Bacillus mesentericu s、Bacillus pumilis、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomo na angulata、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas tabaci、Streptomyces a ureofaciens、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Streptom yces griseus、Streptomyces kasugensis、Streptomyces lavendulae、Streptom yces lipmanii、Streptomyces lividans、Staphylococcus epidermis、Staphylo coccus saprophyticus、または Serratia Marcescens を含める種属から誘導される。発明の好適実施例において、宿主細胞はＤＨＳから分岐点分子、コリスメート、への変換を阻止する突然変異を有する栄養要求性突然変異細胞系を含める。このような突然変異体は、シキメート脱水素酵素、シキメートキナーゼ、ＥＰＳＰ生成酵素及びコリスメート生成酵素の遺伝暗号をもつ遺伝子の１つまた複数における突然変異によって、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）からコリスメートへの変換を触媒することができず、そのため多量のＤＨＳを細胞内に蓄積する。好適突然変異細胞系としては Escherichia coli 菌株ＡＢ２８３４、ＡＢ２８２９及びＡＢ２８４９がある。Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４は、シキメート脱水素酵素の遺伝暗号をもつａｒｏＥ座における突然変異により、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）からシキミ酸への変換を触媒することができない。Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４を使用すると、芳香族アミノ酸生合成に向かう炭素流はＤＨＳの先へは進まない。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８２９（ＥＰＳＰ生成酵素の遺伝暗号をもつａｒｏＡ座における突然変異により、シキメート３−リン酸（Ｓ３Ｐ）から５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸（ＥＰＳＰ）への変換を触媒することができない）及びＥ.ｃｏｌｉＡＢ２８４９（コリスメート生成酵素の遺伝暗号をもつａｒｏＣ座における突然変異により、ＥＰＳＰからコリスミン酸への変換を触媒することができない）も細胞内ＤＨＳ濃度の増加をおこす。Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４は好適実施例に用いられる宿主細胞系である。本発明にしたがって使用するために、上記の種類の宿主細胞は、細胞内ＤＨＳをカテコールへの生体触媒的変換のための基質として使用できるように形質転換される。カテコールをその後アジピン酸に変換する。宿主細胞を組換えＤＮＡで形質転換し、ＤＨＳ生成後の炭素流を芳香族アミノ酸生合成一般経路から逸らし、アジピン酸を生産する分岐経路に導くのが好適である。分岐経路を図１に示す。ここに示すように、分岐経路の中間体はプロトカテケート、カテコール、及び cis，cis−ムコン酸である。ＤＨＳからプロトカテケートへの生体触媒的変換をおこす酵素は３−デヒドロシキメート脱水酵素であり（図１では“ｈ”であらわされる）、その遺伝子はａｒｏＺである。プロトカテケートを脱炭酸してカテコールを生成する酵素は図１では“ｉ”であらわされるプロトカテケート脱炭酸酵素であり、その遺伝子はａｒｏＹである。最後にカテコールを酸化して cis，cis−ムコン酸を生成する反応を触媒する酵素はカテコール１、２−二酸素添加酵素（図１では“ｊ”）である。その遺伝子はｃａｔＡである。cis，cis−ムコン酸はその後水素化され、アジピン酸を生成する；これは図１では“ｋ”の記号であらわされる。こうして本発明により利用される、組換えによって形質転換された宿主細胞は、好適には、３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子の構成性発現によって特徴づけられる。３−デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素は、オルト分解経路から集められる；この経路はNeurospora、Aspergillus、Acinetobacter 、Klebsiella、及び Pseudomonas などの細菌が、芳香族化合物（ベンゾエート及びp-ヒドロキシベンゾエート）並びにヒドロ芳香族化合物（シキメート及びキネート）を増殖のための唯一の炭素源として使用することを可能にする経路である。ＤＨＳ脱水酵素はキニン酸及びシキミ酸の微生物内異化に重要な役割を演ずる。パテル（Patel）は、Klebsiella aerogenes によるｐ-ヒドロキシベンゾエートの異化過程において、プロトカテケート脱炭酸酵素がプロトカテケートからカテコールへの変換を触媒することを系統立てて述べた。パテルの菌株（現在は E nterobacter aerogenes と呼ばれる）を再試験した結果［（ａ）グラント（Gran t,D.J.W.）;パテル（Patel,J.C.）、Autonie van Leewenhoek １９６９、３５、３２５。（ｂ）グラント、Autonie van Leewenhoek１９７０、３６、１６１］、オルンストン（Ornston）は最近、プロトカテケート脱炭酸酵素はｐ−ヒドロキシベンゾエートの異化には代謝的に重要でないと結論するに至った［ドーテン（ Doten,R.C.）；オルンストン、Bacteriol.１９８７、１６９、５８２７］。こうしてオルト分解におけるプロトカテケート脱炭酸酵素の真の役割は幾分なぞである。宿主細胞を形質転換して炭素流を分岐経路に向かわせるメカニズムは、好適には３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ発現可能配列を含む遺伝子要素の挿入を含む。利用する正確なメカニズムにもかかわわらず、これらの酵素活性の発現は組換え遺伝子要素の宿主細胞への移入によって起きるのか、または仲介されるのかは熟考中である。ここに定義される遺伝子要素とは、蛋白質、アポ蛋白質またはアンチセンスＲＮＡなどの生成物の遺伝暗号を含む発現可能配列を有する核酸（一般にＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。上記生成物は経路の酵素機能を発揮またはコントロールすることができる。発現した蛋白質は酵素としてはたらくことができ、酵素活性を促進または抑制し、または酵素の発現をコントロールすることができる。これらの発現可能の配列を規定する核酸は染色体（例えば相同組換えによって宿主細胞染色体に統合された）にあっても、染色体外（例えばプラスミド、コスミドなどによって行われる）にあってもよい。本発明の遺伝子要素はプラスミド、コスミド、ファージ、酵母人工染色体または遺伝子要素の宿主細胞への移動を仲介するその他のベクターによって宿主細胞に挿入される。これらのベクターは複製開始点と、ベクター及びそのベクターによって運ばれる遺伝子要素の複製を調節する cis−作用調節要素とを含む。選択可能マーカーがそのベクターに存在し、それは遺伝子要素を挿入した宿主細胞の同定に役立つ。例えば選択可能マーカーは、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはネオマイシンなどの特定の抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子である。遺伝子要素を宿主細胞に挿入する好適手段は、本発明による遺伝子要素を挿入する染色体外 multi-copy プラスミドベクターを利用する。プラスミドによる遺伝子要素の宿主細胞への導入は、先ず第一に制限酵素によるプラスミドの切断、その後のプラスミドと本発明の遺伝子要素との結合を含む。結合した組換えプラスミドの再循環の際には、プラスミド移入のための形質導入またはその他のメカニズム（例えばエレクトロポレーション、ミクロインジェクションなど）が用いられる。遺伝子要素を宿主細胞に挿入するために適したプラスミドは次のものである（ただしこれらに制限されるものではない）：ｐＢＲ３２２、及びその誘導体であるｐＡＴ１５３、ｐＸｆ３、ｐＢＲ３２５、ｐＢｒ３２７、ｐＵＣベクターなど、ｐＡＣＹＣ及びその誘導体、ｐＳＣ１０１及びその誘導体、及びＣｏｌＥ１。それに加えて、ｐＬＡＦＲ３などのコスミドベクターも宿主細胞への遺伝子要素挿入のためには適している。好適プラスミド構成物（constructs）としては次のものがある（ただしこれらに制限されるものではない）：ｐ２−４７、ｐＫＤ８.２４３Ａ、ｐＫＤ８.２４３Ｂ、及びｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７。これらは Klebsiellapneumoniae から分離されたａｒｏＺ及びａｒｏＹ座をもつ。これらの座はそれぞれ３−デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素の遺伝暗号をもつ。本発明に関連して好適に利用されるその他のプラスミド構成物はｐＫＤ８.２９２である；これは Acinetobacter calcoaseticus に内在する、カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ遺伝子断片ｃａｔＡを担う。普通は、本発明により宿主細胞を形質転換するメカニズムは、炭素の芳香族アミノ酸生合成一般経路への引き渡しを増やす酵素の遺伝暗号をもつ遺伝子の挿入も含む。或る遺伝子の発現は主としてそれ自体のプロモーターによって方向づけられる、ただしリプレッサーなどの任意の発現調節配列やエンハンサーも、蛋白質、アポ蛋白質またはアンチセンスＲＮＡの遺伝暗号化配列の発現または抑制解除の調節に関係する。その他に遺伝子の天然プロモーターを遺伝子生成物の発現を高める別のプロモーターに置き換えることによって、組換えＤＮＡ構成物を生成することができる。プロモーターは構成性であっても誘導性であってもよい。構成性プロモーターは細胞生存期間中遺伝子の転写を一定速度に調節する、一方誘導性プロモーターの活性は特異的誘導物質の存在（または不在）によって変動する。例えば調節配列を野性型宿主細胞に挿入し、宿主細胞ゲノムにすでに遺伝暗号化された選択された酵素の過剰発現を促進し、或いは染色体外に遺伝暗号化された酵素の合成を調節するために用いられる。本発明では、ＤＨＳの過剰生産を引き起こす調節配列が好適に用いられる。以上に述べたように、ＤＨＳは一般経路において、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ− ヘプツロソン酸７−リン酸（ＤＡＨＰ）生成酵素（ａｒｏＦに遺伝暗号化される）及び３−デヒドロキネート（ＤＨＱ）生成酵素（ａｒｏＢに遺伝暗号化される）のチロシン感受性イソ酵素、及びペントースリン酸経路酵素トランスケトラーゼ（ｔｋｔに遺伝暗号化される）の逐次的酵素活性によって合成される。これらの生合成酵素の発現を増幅し、Ｄ−グルコースからＤＨＳへの変換を高めることができる。一般経路の第一の酵素であるＤＡＨＰ生成酵素の in vivo 触媒活性を高めると、芳香環生合成に向かうＤ−グルコース等価物の流量は増加する。しかし、ＤＡＨＰ生成酵素触媒活性の水準は、“それ以上の水準になっても芳香環生合成に渡されるＤ−グルコースのパーセンテージはそれ以上改善されない”という水準に達する。芳香族アミノ酸生合成のこの限界水準では、ペントースリン酸経路酵素トランスケトラーゼの触媒水準の増加によって、その経路へ流れ出るＤ −グルコースのパーセンテージのかなりの増加が得られる。増加したトランスケトラーゼ活性はＤ−エリトロース４−リン酸濃度を高めることが示唆されている。ＤＡＨＰ生成酵素のための２基質のうちの１つであるＤ−エリトロース４−リン酸の利用可能性の制限は、多分ＤＡＨＰ生成酵素触媒活性の制限をもたらす。ＤＡＨＰ生成酵素、ＤＨＱ生成酵素及びＤＨＱ脱水酵素の触媒活性を増幅する好適手段の１つは、微生物触媒をこれらの酵素の遺伝暗号をもつ組換えＤＮＡ配列で形質転換することによってその酵素種を過剰発現させることである。ａｒｏＦに遺伝暗号化されたＤＡＨＰ生成酵素、及びｔｋｔに遺伝暗号化されたトランスケトラーゼの増幅した発現は芳香族アミノ酸生合成一般経路に向かう炭素流をこの経路の正規の炭素流量以上に急増させる。個々の一般経路酵素によって触媒される基質から生産物への変換の個々の速度がＤＡＨＰ合成速度と同様でない場合、これら速度−制限酵素類の基質は細胞内に蓄積する。例えばＥ．ｃｏｌｉのような微生物体は、このような基質を増殖上澄液に放出することによって蓄積物質をうまく処理することが多い。この結果一般経路に沿って炭素流の損失がおきる、なぜならば放出された基質は普通はその微生物の代謝にとって価値がないからである。ＤＨＱ生成酵素は一般経路の速度制限酵素の１つである。ＤＨＱ生成酵素の増加した発現はこの酵素の速度制限性を取り去り、ＤＡＨＰ及びその非リン酸化同族体、ＤＡＨ、の蓄積を防止する。ＤＨＱ脱水酵素は速度制限的ではない。そこでａｒｏＦに遺伝暗号化されたＤＡＨＰ生成酵素、ｔｋｔに遺伝暗号化されたトランスケトラーゼ及びａｒｏＢ−ＤＨＱ生成酵素の増幅された発現はＤＨＳ生産を増加させ、それはＤＨＳ脱水酵素及びプロトカテケートの存在下でカテコールに変換され、それは続いて生体触媒的に cis， cis− ムコン酸に、その後アジピン酸に変換される。炭素源とＤＨＳとの間の一般経路に沿って炭素流の効率を促進する特に好適な１プラスミドはプラスミドｐＫＤ１３６である；それはａｒｏＦ、ｔｋｔ及びａｒｏＢ遺伝子の暗号を有する。プラスミドｐＫＤ１３６は、ＤＡＨＰ生成酵素（ａｒｏＦに遺伝暗号化される）及びトランスケトラーゼ（ｔｋｔに遺伝暗号化される）の増加した発現によって芳香環生合成に向かう炭素流の急増をおこす。この急増した炭素流は、ＤＨＱ生成酵素（ａｒｏＢに遺伝暗号化される）の発現が増幅しているために、ｐＫＤ１３６によるＤＨＳ合成にそっくりそのまま渡される。こうして、本発明の好適１実施例により、ＤＨＳ脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素、及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ遺伝子を発現する Escherichia coli の異種（heterologous）菌株が構成され、それはＤ -グルコースから cis，cis−ムコン酸への生体触媒的変換を可能とし、cis，cis −ムコン酸はその後水素化されてアジピン酸を生成する。Ｄ−グルコースのＤＨＳへの効率的変換はｐＫＤ１３６による宿主細胞の形質転換で達せられる。菌株Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６をその後プラスミドｐＫＤ８.２４３Ａ及びｐＫＤ８.２９２で形質転換した。最終的にはＥ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２となった。その他の好適実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６をプラスミドｐ２−４７及びｐＫＤ８.２９２で形質転換してＥ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７／ｐＫＤ８.２９２を生成せしめた。これら異種宿主細胞系の各々はＤ−グルコースの cis，cis−ムコン酸への変換を触媒する。合成された ci s，cis−ムコン酸は細胞外に蓄積し、遠心分離によって細胞から分離できる。培養上澄液を１０％白金上で５０ｐｓｉ水素圧で直接水素化すると、cis，cis−ムコン酸の９０％がアジピン酸に変換する。本発明はこうして内因性芳香族アミノ酸生合成一般経路を有する宿主細胞のトランスフォーム細胞に関係する。トランスフォーム細胞は、３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素、及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ異種構造遺伝子の構成性発現によって特徴づけられる。発明の好適１実施例では形質転換細胞をさらに、酵素トランスケトラーゼ、ＤＡＨＰ生成酵素及びＤＨＱ生成酵素の遺伝暗号をもつ発現可能の組換えＤＮＡ配列で形質転換する。もう一つの好適面では、宿主細胞を、３−デヒドロシキメートからコリスメートへの変換を阻止するアミノ酸生合成一般経路の突然変異などの突然変異を含む突然変異体細胞系の群から選択する。もう一つの好適面では、３ −デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Klebsiella pneumoniae に内在する。もう一つの好適面では、カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ異種構造遺伝子が Acineto bacter calcoaseticus に内在する。本発明のその他の好適実施例ではアジピン酸を生産する方法が提供される。その方法は上記の種類の形質転換宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに変換し得る炭素源を含む培地中で培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生産し、cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生産する諸段階からなる。もう一つの好適実施例では、バイオマス由来の炭素源を生体触媒的に変換して cis，cis−ムコン酸を形成することのできる形質転換細胞を作製する方法を提供する。その方法は内因性芳香族アミノ酸生合成一般経路を有する宿主細胞を組換えＤＮＡで形質転換して異種宿主細胞を作り、上記ＤＮＡは３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素、及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ、構成性に発現される遺伝子を形成する、という諸段階を含む。もう一つの実施例では、アジピン酸を生産する方法において、上記方法による形質転換細胞を、炭素源を cis，cis−ムコン酸に変換することのできる条件下で培養し、cis，cis−ムコン酸を水素化してアジピン酸を生産する諸段階からなる方法が提供される。本発明のもう一つの実施例では、アジピン酸の製法において、炭素源をカテコールに変換することのできる形質転換細胞を、上記炭素源がカテコールに変換するために十分な時間培養し、カテコール１、２−二酸素添加酵素を用いてそのカテコールを cis，cis−ムコン酸に生体触媒的に変換し、その cis，cis−ムコン酸を水素化してアジピン酸を生産する諸段階からなる方法が提供される。実施例１ａｒｏＺ遺伝子のクローニングａｒｏＺと呼ばれる、ＤＨＳ脱水酵素の遺伝暗号を含む遺伝子を Klebsiella pneumoniae ＤＮＡゲノムライブラリーから分離した。ゲノムＤＮＡをＫ.ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株Ａ１７０−４０から精製し、ＢａｍＨＩで部分的に消化して、１５ｋｂから３０ｋｂまでの範囲の断片を生成した。生成したＤＮＡ断片をあらかじめＢａｍＨＩで消化したコスミドｐＬＡＦＲ３に結合し、続いて子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理した。ｐＬＡＦＲ３はＲＫ２レプリコンを有するテトラサイクリン耐性コスミドである。結合ＤＮＡは Packagene Packaging System（Promega）を用いて包装し、生成したファージ粒子を用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＫＤ１３６を感染させた。プラスミドｐＫＤ１３６は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、ＤＡＨＰ生成酵素（ａｒｏＦ）、及びＤＨＱ生成酵素（ａｒｏＢ）の遺伝暗号をもつ遺伝子、並びにアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２５基礎ベクター（複製のｐＭＢ１開始点）である。その後テトラサイクリン及びアンピシリン両方に耐性をもつコロニーを、Ｄ−グルコース（４ｇＬ）、シキミ酸（０.０４ｇＬ）、クエン酸鉄（０.０７ｇＬ）、ｐ−トルイジン（１ .９ｇＬ）、アンピシリン（０.０５ｇＬ）及びテトラサイクリン（０.０１３ｇＬ）を含む色素産生性最少培地（Ｍ９）プレートで培養した。３７℃で４８時間培養後、コロニー５−８７を取り巻く増殖培地が褐色になった；それはプロトカテキン酸をプレート上にスポットしたときに現れる培地の黒ずみに似ていた。コロニー５−８７の培地からＤＮＡを精製した。ＤＮＡはｐＫＤ１３６と、ｐ５− ８７と呼ばれるテトラサイクリン耐性コスミドからなっていた。コスミドｐ５− ８７は１４ｋｂＢａｍＨＩ断片を含んでおり、その断片はＢａｍＨＩで完全に消化すると、４つのはっきりと認められるＤＮＡ断片を生成した。実施例２ａｒｏＺ遺伝子のクローニングの確認コスミドｐ５−８７がａｒｏＺ遺伝子を含んでいることは次の事実によって確認された：普通はＤ−グルコースをＤＨＳに変換するＥ．ｃｏｌｉ菌株を形質転換すると、さらにＤＨＳをプロトカテキン酸に変換することができる。Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４は、シキメート脱水素酵素の遺伝暗号をもつａｒｏＥ遺伝子の突然変異によって培養上澄液にＤＨＳを蓄積させる。Ｄ−グルコースからＤＨＳへの変換は、ＡＢ２８３４をｐＫＤ１３６で形質転換したときに最大になる。ＡＢ２８３４をｐＫＤ１３６とｐ５−８７とで同時形質転換すると、アンピシリンにもテトラサイクリンにも耐性をもつコロニーが生成した。ＬＢ培地１リットル（４Ｌエルレンマイヤーフラスコ）にＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ５−８７の１晩培養物（５ｍＬ）を植え付けた。培養物を３７℃で８時間、撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）増殖させた。それから細胞を収穫し、グルコース（１０ｇＬ）、シキミ酸（０.０４ｇＬ）、アンピシリン（０.０５ｇＬ）、及びテトラサイクリン（０.０１３ｇＬ）を含む最少Ｍ９培地１リットル（４Ｌエルレンマイヤーフラスコ）に再懸濁させた。培養液を３７℃インキュベーションに戻した。２４時間及び６４時間後に培養液の１部を取り、遠心分離して細胞を取り除いた。分離した上澄液５ミリリットルづつを各サンプルから集め、真空下で水分を除去した。サンプルをＤ2Ｏに再溶解し、真空下で濃縮した。この操作を繰り返すと残留水はＤ2Ｏに置き換えられ、ＨＮＭＲによる分析に適したサンプルが得られた。３−（トリメチルシリル）プロピオン−２、２、３、３−ｄ4酸のナトリウム塩を内部標準として用い、約９ｍＭのプロトカテキン酸が培養上澄液中に蓄積したことが確認された。δ６.９４（ｄ、７Ｈｚ、１Ｈ）及びδ７.４８（ｄ、７Ｈｚ、２Ｈ）の診断的共鳴はプロトカテキン酸を示唆した。培養上澄液にＤＨＳは見つからなかった。この実験から、ＤＨＳ脱水酵素の遺伝暗号をもつ遺伝子はプラスミドｐ５−８７に位置すると結論づけた。実施例３ａｒｏＺ遺伝子のサブクローニングａｒｏＺに遺伝暗号化されるインサートの大きさを最小にするために、プラスミドｐ５−８７をＢａｍＨＩで消化し、生成した断片を、あらかじめＢａｍＨＩで消化し、ホスファターゼで処理したベクターｐＳＵ１９に結合した。プラスミドｐＳＵ１９はｐ１５Ａレプリコンと、クロラムフェニコール耐性をもたらす遺伝子を含む。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＫＤ１３６に形質転換した後、実施例１に述べたように、生成したアンピシリン及びクロラムフェニコール耐性コロニーをｐ−トルイジン及びクエン酸鉄を含む色素産生性最少培地アガロースプレートを褐色に変色させる能力に関してスクリーニングした。この方法を使用して、プレートｐＳＵ１−３１を分離した；それはｐＳＵ１９に含まれる３ .５ｋｂＢａｍＨＩインサートからなっていた。ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＳＵ１−３１を実施例１に記載ものと同様な条件下で１Ｌ規模で増殖させたとき、培養上澄液のＨＮＭＲ分析は、１１ｍＭプロトカテキン酸が細胞外に蓄積したことを示した。実施例４ａｒｏＹ遺伝子のクローニング普通ならばプロトカテケートを合成する菌株は触媒活性のあるプロトカテケート脱炭酸酵素の存在下ではプロトカテケートの代わりにカテコールを合成するという事実に基づき、ａｒｏＹ遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離した。ｐＬＡＦＲ３に位置する３.５ｋｂＢａｍＨＩａｒｏＺ断片を含むコスミドｐ４−２０を作った。ＥｃｏＲＩで消化した Klebsiella pneumoniae ＤＮＡライブラリーをコスミドｐ４−２０に作った；それは先にｐＬＡＦＲ３に作ったものと類似のものであった。ラムダファージヘッドに包装されたＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＫＤ１３６を感染させると、アンピシリン及びクロラムフェニコール両方に耐性をもつコロニーが生成した。ｐ−トルイジン及びクエン酸鉄を含む色素産生性最少培地アガロースプレート上でコロニーをスクリーニングした。カテコールを色素産生性最少培地に添加すると、同量のプロトカテキン酸を添加したときに比べて周囲アガロースの黒ずみはより強く出るから、カテコールを合成するコロニーはプロトカテケート合成コロニーのバックグラウンドから選択することができると考えた。３７℃で約２４時間培養後、コロニー２−４７が他のどのコロニーにもない局所的褐色領域を作り出した。コロニー２−４７からＤＮＡを分離すると、プラスミドｐＫＤ１３６及びプラスミドｐ２−４７が得られた。これらをその後コンピテント細胞に同時形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７を得た。ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７の培養上澄液で実施例２に記載したように¹ＨＮＭＲ分析を行った。最少培地で４８時間後、５６ｍＭＤ−グルコース溶液をＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ２−４７によって２０ｍＭカテコール溶液に変換した。実施例５ａｒｏＹ遺伝子のサブクローニングプロトカテケート脱炭酸酵素の遺伝暗号をもつＤＮＡを分離する最初の戦略と同様に、ａｒｏＹＥｃｏＲＩ断片の最小サイズへのサブクローニングも、ＤＨＳ脱水酵素の存在下におけるａｒｏＥ宿主菌によるカテコール合成に基づいて行われた。ｐ２−４７をＥｃｏＲＩで完全に消化すると、ａｒｏＹインサートが約８ｋｂ及び１１.９ｋｂの２つのＥｃｏＲＩ断片からなることがわかった。ｐＳＵ１−３１中の１１.９ｋｂＥｃｏＲＩ断片の位置測定によりプラスミドｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７であることがわかった。１Ｌ規模で実施例２に記載のような条件下で増殖させたとき、Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７は５６ｍＭＤ−グルコースを供給した場合培養上澄液に１６ｍＭカテコールを蓄積させた。その後のサブクローニングに関連して１１９ｋｂＥｃｏＲＩ断片の地図を作製すると、ａｒｏＹ遺伝子は１１.９ｋｂ断片の中心近くに位置するらしいことがわかった。ｐＳＵａｒｏＺＹ１５７−２７をＨｉｎｄＩＩＩで消化すると２.３ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片が生成し、これをｐＳＵ１−３１に挿入した。プラスミドｐＫＤ８.２４３Ａが得られた（図２）。プラスミドｐＫＤ８.２４３Ｂも分離された；ｐＫＤ８.２４３Ｂでは２.３ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片がベクターに対して反対方向にある。これらのプラスミドの各々をプラスミドｐＫＤ１３６でＡＢ２８３４に同時形質転換した。実施例２に記載したものと同様な条件下で１Ｌ規模で増殖させると、ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐ８.２４３Ａは４８時間以内に５６ｍＭＤ−グルコースから１６ｍＭカテコールを合成し、一方ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８.２４３Ｂは１０ｍＭカテコールを合成した。いくつかの培養上澄液にはプロトカテキン酸（＜４ｍＭ）も検出された。ただしそれは一貫した見いだされるものでなく、微生物合成の最後には必ずしも検出されなかった。実施例６ＤＨＳ脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素、及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の酵素活性Ｄ−グルコースからカテコールへの変換を触媒することができるカテコール１、２−二酸素添加酵素の微生物体における発現は、結果として cis，cis−ムコン酸の微生物合成をおこすことが期待される。プラスミドｐＩＢ１３４５を得た。それは宿主ベクターｐＵＣ１９によって供給されたｌａｃプロモーターから発現する Acinetobacter calcoaceticus ｃａｔＡ遺伝子を含む。Ｄ−グルコースから cis，cis−ムコン酸を微生物合成するために三プラスミド系が設計された。プラスミドｐＫＤ１３６（ｐＭＢ１開始点、アンピシリン耐性）及びｐＫＤ８.２４３Ａ（ｐ１５Ａ開始点、クロラムフェニコール耐性）は使用増殖条件下では安定に保持されることがわかった。第３のプラスミド、ｐＣＬ１９２０、はカテコール１、２−二酸素添加酵素の発現のために選択された。プラスミドｐＣＬ１９２９０はｐＳＣ１０１複製開始点とスペクチノマイシン耐性をもたらす遺伝子とを含む低コピーベクターである。ｐＩＢ１３４５をＳａｌＩ及びＫｐｎＩで消化すると１.５ｋｂ断片が生じ、それをその後ｐＣＬ１９２０に配置し、ｐＫＤ８. ２９２を作り出した（図３）；ここではカテコール１、２−二酸素添加酵素がベクター−encoded（ベクターに遺伝暗号化された）ｌａｃプロモーターから発現された。ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６をｐＫＤ８.２４３Ａ及びｐＫＤ８.２９２で形質転換すると、アンピシリン、クロラムフェニコール及びスペクチノマイシンに耐性を有するコロニーが得られた。酵素活性を測定し、Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２がオルト分解経路から、ＤＨＳを cis，cis−ムコネートに変換するのに必要な各遺伝子を発現していることを確認した。ＡＢ２８３４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２培養物を、ＩＰＴＧ（０ .２ｍＭ）、アンピシリン（０.０５ｇ）、クロラムフェニコール（０.０２ｇ）及びスペクチノマイシン（０.０５ｇ）を含むＬＢ（１Ｌ）中で３７℃、２５０ｒｐｍで１０時間増殖させた。細胞を収穫し、１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７ .５、２.５ｍＭＭｇＣｌ₂、に再懸濁した。French 加圧細胞（16000ｐｓｉ［１１２５ｋｇ／ｃｍ²］）を２回通過させた後、溶解物を遠心分離（40000ｇ、３０分、４℃）によって澄明にした。ＤＨＳ脱水酵素活性を測定するための各分析試験は（最終容量１ｍＭ）１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.５、２５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＨＳ及び細胞溶解物を含んでいた。ＤＨＳの添加後、プロトカテケート（ε＝３８９０Ｍｃｍ）の形成を２９０ｎｍで数分間モニターした。ＡＢ２８３４/ｐＫＤ１３６/ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２の３サンプルで測定したＤＨＳ脱水酵素活性は０.０７８ｕｎｉｔｍｇ±０.００９であることが確認された。ここで１ｕｎｉｔは、１分間にＤＨＳ１μｍｏｌをプロトカテキン酸に変換するのに必要な酵素量である。カテコール１、２−二酸素添加酵素の比活性を上で作った同じ細胞溶解物サンプルを用いて測定した。各分析試験は１００ｍＭリン酸カリ、ｐＨ７.５、０.２ｍＭカテコール及び細胞溶解物を含んでいた。cis，cis−ムコン酸の生成は２６０ｎｍにおける吸光度の増加を追跡することによってモニターした。cis,cis− ムコン酸とカテコールとの分子吸光係数の差は分析試験条件下では 16000 Ｍｃｍであると推定して、ＡＢ２８３４/ｐＫＤ１３６/ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２のカテコール１、２−二酸素添加酵素活性は０.２５ｕｎｉｔｓｍｇ ±０.０３であると確認された。ここで１ｕｎｉｔは１分間の cis，cis−ムコネート１μｍｏｌの生成に相当する。プロトカテケート脱炭酸酵素の活性を測定するために、ＡＢ２８３４/ｐＫＤ１３６/ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２をすでに実施例６に記載したように増殖させた。細胞を収穫し、７５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.１に再懸濁した。French 加圧細胞（16000ｐｓｉ）通過による破壊後、溶解物を遠心分離（4000 0ｇ、３０分、４℃）によって澄明にした。プロトカテケート脱炭酸酵素活性を確認するために、プロトカテキン酸の消費を追跡した。各分析試験は（最終容量１ｍＬ）７５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６.０、０.３ｍＭプロトカテキン酸及び細胞溶解物を含んでいた。２９０ｎｍにおける吸光度の減少を経時的にモニターした。ＡＢ２８３４/ｐＫＤ１３６/ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２のプロトカテケート脱炭酸酵素活性は０.０２８ｕｎｉｔｓｍｇ±０.００９であることが確認された。ここで１ｕｎｉｔは１分間におけるプロトカテキン酸１μｍｏｌの酸化に相当する。実施例７Ｄ−グルコースから cis，cis−ムコネートへの変換Ｅ．ｃｏｌｉＡＢ２８３４/ｐＫＤ１３６/ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２を利用してＤ−グルコースから cis，cis−ムコネートを微生物的に合成する方法は次のように進行する。ＩＰＴＧ（０.２ｍＭ）、アンピシリン（０.０５ｇ）、クロラムフェニコール（０.０２ｇ）及びスペクチノマイシン（０.０５ｇ）を含むＬＢ培地１リットル（４Ｌエルレンマイヤー振動フラスコ中）にＡＢ２８３４ /ｐＫＤ１３６/ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２の１晩培養物１０ｍＬを植え付けた。細胞を２５０ｒｐｍ、３７℃で１０分間増殖させた。細胞を収穫し、５６ｍＭＤ−グルコース、シキミ酸（０.０４ｇ）、ＩＰＴＧ（０.２ｍＭ）、アンピシリン（０.０５ｇ）、クロラムフェニコール（０.０２ｇ）及びスペクチノマイシン（０.０５ｇ）を含むＭ９最少培地１Ｌに再懸濁した。培養物を３７ ℃インキュベーションに戻した。最少培地に再懸濁した後、培養液のｐＨを綿密にモニターし、特に最初の１２時間は綿密にモニターした。培養液がｐＨ６.５に達したとき５ＮＮａＯＨを加えてｐＨを６.８に調節した。４８時間の蓄積期間中、培養液のｐＨが６.３以下にならないようにした。最少培地で２４時間後、実施例２に述べた方法を用いて、１２ｍＭ cis，cis−ムコネート及び１ｍＭプロトカテケートが培養上澄液に２３Ｄ−グルコースと共に検出された。最少培地で４８時間後、ＡＢ２８３４/ｐＫＤ１３６/ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２は５６ｍＭＤ−グルコースを１７ｍＭ cis，cis−ムコネートに置き換えた。最少培地における培養上澄液のｐＨを調節しない実験も行った。この場合は最少培地において最初の２４時間後に溶液のｐＨは約５に低下した。実施例２に記載の方法を用いて培地中に cis，cis−ムコネートと cis，trans-ムコネートの混合物を検出した；両者を合計すると１３ｍＭムコネートであった。Ｄ−グルコース（３２ｍＭ）も培養上澄液に検出された。その培養物を３７℃でさらにインキュベーションしてもムコネート合成の顕著な増加は起きなかった、ただし４８時間までには合成ムコネートのすべてが異性化し、cis，trans−異性体になった。微生物的に合成した cis，cis−ムコネートのアジピン酸への還元は次のように行われた。炭素上白金（１０％）５０ｍｇを、ＡＢ２８３４/ｐＫＤ１３６/ｐＫＤ８.２４３Ａ／ｐＫＤ８.２９２の無細胞、培養上澄液６ｍＬに加えた；その上澄液は１７.２ｍＭ cis，cis−ムコネートを含んでいた。サンプルを５０ｐｓｉ水素圧、室温で３時間水素化した。セライトを通して濾過して触媒を除去した後、その溶液の１部を真空下で蒸発乾固し、その後数回Ｄ₂Ｏから真空下で濃縮した。¹ＨＮＭＲ分析のためのサンプルを、未処理無細胞−培養上澄液の調製と同様にして調製した。¹ＨＮＭＲは、その溶液が１５.１ｍＭアジピン酸を含むことを示した（９０％変換率）。未反応の cis，cis−ムコネートは溶液中には見つからなかった。本発明をいくつかの好適実施例を参照して詳細に述べたとはいえ、次のクレイムに説明され、明確に述べられる発明の範囲及び精神にしたがって変化及び変更が行われ得るのは当然である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年８月３０日【補正内容】請求の範囲１．内因性芳香族アミノ酸生合成一般経路をもつ異種宿主細胞トランスフォーム細胞であって、３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ異種構造遺伝子の発現を特徴とするトランスフォーム細胞。２．酵素トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−リン酸生成酵素（ＤＡＨＰ生成酵素）、及び３−デヒドロキネート生成酵素（ＤＨＱ生成酵素）の遺伝暗号をもつ発現可能の組換えＤＮＡ配列でさらに形質転換された請求の範囲第１項記載の異種トランスフォーム細胞。３．宿主細胞が、３−デヒドロシキメートからコリスメートへの変換を阻止する芳香族アミノ酸生合成一般経路の突然変異を含む突然変異細胞系列群から選択される請求の範囲第２項記載の異種トランスフォーム細胞。４．３−デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素の遺伝暗号をもっ構造遺伝子が Klebsiella pneumoniae に内在する請求の範囲第２項記載の異種トランスフォーム細胞。５．カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Acineto bacter calcoaceticus に内在する請求の範囲第２項記載の異種トランスフォーム細胞。６．宿主細胞が、３−デヒドロシキメートからコリスメートへの変換を阻止する芳香族アミノ酸生合成一般経路の突然変異を含む突然変異細胞系群から選択される請求の範囲第１項記載の異種トランスフォーム細胞。７．３−デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Klebsiella pneumoniae に内在する請求の範囲第６項記載の異種トランスフォーム細胞。８．カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Acineto bacter calcoaceticus に内在する請求の範囲第６項記載の異種トランスフォーム細胞。９．３−デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素をコード化する構造遺伝子が Klebsiella pneumoniae に内在する請求の範囲第１項記載の異種トランスフォーム細胞。１０．カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Acine tobacter calcoaceticus に内在する請求の範囲第１項記載の異種トランスフォーム細胞。１１．アジピン酸の製法であって、上記方法は、請求の範囲第１項記載の前記形質転換した宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに転化し得る炭素源を含む培地に培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生成し、 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生成する諸段階からなる製法。１２．アジピン酸の製法であって、上記方法は、請求の範囲第２項記載の前記形質転換した宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに転化し得る炭素源を含む培地に培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生成し、 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生成する諸段階からなる製法。１３．アジピン酸の製法であって、上記方法は、請求の範囲第５項記載の前記形質転換した宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに転化し得る炭素源を含む培地に培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生成し、 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生成する諸段階からなる製法。１４．アジピン酸の製法であって、上記方法は、請求の範囲第８項記載の前記形質転換した宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに転化し得る炭素源を含む培地に培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生成し、 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生成する諸段階からなる製法。１５．アジピン酸の製法であって、請求の範囲第１５項記載の方法により生成したトランスフォーム細胞を、或る炭素源から cis，cis−ムコン酸への転化が可能な条件下で培養し、 cis，cis−ムコン酸を水素化してアジピン酸を生成する諸段階からなる方法。１６．内因性芳香族アミノ酸生合成一般経路を有し、芳香族アミノ酸生合成一般経路において３−デヒドロシキメートからコリスメートへの変換を阻止する突然変異をおこした菌株を含む群から選択され、さらに３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子の構成性発現を特徴とする突然変異株。１７．突然変異がａｒｏＥである請求の範囲第１６項記載の突然変異細胞系。１８．アジピン酸の製法であって、酵素種カテコール１、２−二酸素添加酵素を発現するAcinetobacter calcoaceticusからの構造遺伝子と、酵素種３−デヒドロシキメート脱水酵素とプロトカテケート脱炭酸酵素とを発現するKlebsiella p neumoniae からの構造遺伝子とともに形質転換された細菌細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに変換され得る炭素源を含む培地中で培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を毎時毎リットル当たり０.３５ミリモル以上の速度で生産し、前記cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生産する諸段階からなる製法。１９．アジピン酸の製法であって、３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素、カテコール１、２−二酸素添加酵素、トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−リン酸生成酵素、及び３ −デヒドロキネート生成酵素の遺伝暗号をもつ異種構造遺伝子を発現する形質転換した細菌細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３ − デヒドロシキメートに変換され得る炭素源を含む培地中で培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を毎時毎リットル当たり０.３５ミリモル以上の速度で生産し、前記 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生産する諸段階からなる製法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/44 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．内因性芳香族アミノ酸生合成一般経路をもつ宿主細胞の異種トランスフォーム細胞であって、３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子の構成性発現を特徴とする異種トランスフォーム細胞。２．酵素トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−リン酸生成酵素（ＤＡＨＰ生成酵素）、及び３−デヒドロキネート生成酵素（ＤＨＱ生成酵素）の遺伝暗号をもつ発現可能の組換えＤＮＡ配列でさらに形質転換された請求の範囲第１項記載の異種トランスフォーム細胞。３．宿主細胞が、３−デヒドロシキメートからコリスメートへの変換を阻止する芳香族アミノ酸生合成一般経路の突然変異を含む突然変異細胞系列群から選択される請求の範囲第２項記載の異種トランスフォーム細胞。４．３−デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Klebsiella pneumoniae に内在する請求の範囲第２項記載の異種トランスフォーム細胞。５．カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Acineto bacter calcoaceticus に内在する請求の範囲第２項記載の異種トランスフォーム細胞。６．宿主細胞が、３−デヒドロシキメートからコリスメートへの変換を阻止する芳香族アミノ酸生合成一般経路の突然変異を含む突然変異細胞系群から選択される請求の範囲第１項記載の異種トランスフォーム細胞。７．３−デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Klebsiella pneumoniae に内在する請求の範囲第６項記載の異種トランスフォーム細胞。８．カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Acineto bacter calcoaceticus に内在する請求の範囲第６項記載の異種トランスフォーム細胞。９．３−デヒドロシキメート脱水酵素及びプロトカテケート脱炭酸酵素をコード化する構造遺伝子が Klebsiella pneumoniae に内在する請求の範囲第１項記載の異種トランスフォーム細胞。１０．カテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子が Acine tobacter calcoaceticus に内在する請求の範囲第１項記載の異種トランスフォーム細胞。１１．アジピン酸の製法であって、上記方法は、請求の範囲第１項記載の形質転換した宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに転化し得る炭素源を含む培地に培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生成し、 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生成する諸段階からなる製法。１２．アジピン酸の製法であって、上記方法は、請求の範囲第２項記載の形質転換した宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに転化し得る炭素源を含む培地に培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生成し、 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生成する諸段階からなる製法。１３．アジピン酸の製法であって、上記方法は、請求の範囲第５項記載の形質転換した宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに転化し得る炭素源を含む培地に培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生成し、 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生成する諸段階からなる製法。１４．アジピン酸の製法であって、上記方法は、請求の範囲第８項記載の形質転換した宿主細胞を、上記細胞の芳香族アミノ酸生合成一般経路の酵素によって３−デヒドロシキメートに転化し得る炭素源を含む培地に培養し、３−デヒドロシキメートの生体触媒的変換によって cis，cis−ムコン酸を生成し、 cis，cis−ムコン酸を還元してアジピン酸を生成する諸段階からなる製法。１５．バイオマス由来の炭素源を生体触媒的に cis，cis−ムコン酸に変換できる異種トランスフォーム細胞の作製法であって、上記方法は、内因性芳香族アミノ酸生合成一般経路をもつ宿主細胞を、３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素、及びカテコール１、２−二酸素添加酵素のための遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換する段階からなり、上記遺伝子の各々が構成的に発現される上記作製法。１６．宿主細胞を、酵素トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−リン酸生成酵素（ＤＡＨＰ生成酵素）、及び３−デヒドロキネート生成酵素（ＤＨＱ生成酵素）の遺伝暗号をもつ配列を含む組換えＤＮＡで形質転換する請求の範囲第１５項記載の方法。１７．宿主細胞を、３−デヒドロシキメートからコリスメートへの変換を阻止する芳香族アミノ酸生合成一般経路の突然変異を含む突然変異細胞系群から選択する請求の範囲第１５項記載の方法。１８．アジピン酸の製法であって、請求の範囲第１５項記載の方法により生成したトランスフォーム細胞を、或る炭素源から cis，cis−ムコン酸への転化が可能な条件下で培養し、 cis，cis−ムコン酸を水素化してアジピン酸を生成する諸段階からなる方法。１９．内因性芳香族アミノ酸生合成一般経路を有し、芳香族アミノ酸生合成一般経路において３−デヒドロシキメートからコリスメートへの変換を阻止する突然変異をおこした菌株を含む群から選択され、さらに３−デヒドロシキメート脱水酵素、プロトカテケート脱炭酸酵素及びカテコール１、２−二酸素添加酵素の遺伝暗号をもつ構造遺伝子の構成性発現を特徴とする突然変異株。２０．突然変異がａｒｏＥである請求の範囲第１９項記載の突然変異細胞系。２１．アジピン酸の製法であって、或る炭素源をカテコールに変換することができるトランスフォーム細胞を上記炭素源をカテコールに変換するために十分な時間培養し、カテコール１、２−二酸素添加酵素を用いてカテコールを cis，cis −ムコン酸に生体触媒的に変換し、cis，cis−ムコン酸を水素化してアジピン酸を生成する諸段階からなる方法。