JP2002534123A - Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｐｋｓ遺伝子 - Google Patents

Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｐｋｓ遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物、葉、根、果実及び種子等の植物の一部及び植物細胞で多価不飽和長鎖脂肪酸を調製するための組成物及び方法に関する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓのエイコサペンタエン酸の生産に寄与する遺伝子やＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓにおけるドコサヘキサエン酸の生産に関連する新規な遺伝子を含めた、多価不飽和長鎖脂肪酸の生産に必要なＰＫＳ様遺伝子をコードする核酸配列及び構築物が、そのような長鎖多価不飽和脂肪酸の生産に関連する１又は複数のＰＫＳ様遺伝子をコードする１又は複数の導入遺伝子を有すると共に発現するトランスジェニック植物、植物の一部及び植物細胞を作成するために使用される。植物系におけるＰＫＳ様遺伝子の発現により、植物、植物の一部、及び組織の脂肪酸プロファイルを改変する、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸等の多価不飽和長鎖脂肪酸の大量生産が許容される。脂肪酸プロファイルの人為的操作により、商業的な量の新規な植物油及び製品の生産が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明は、宿主細胞内の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）を改変すること
ができる酵素及び／又は酵素構成要素の調節と、宿主細胞でＰＵＦＡｓを生産す
るための構築物及び方法と関する。本発明は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒ
ｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ由来の遺伝子を用いたエイ
コサペンタエン酸（ＥＰＡ）の生産により例証される。
【０００２】 （背景） 多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）の２つの主要なファミリーは、エイコサペン
タエン酸を例とするω３脂肪酸とアラキドン酸を例とするω６脂肪酸である。Ｐ
ＵＦＡｓは、細胞の原形質膜の重要な構成要素であり、原形質膜ではＰＵＦＡｓ
はリン脂質等の形式で見出され、トリグリセリドとしても見出される。ＰＵＦＡ
ｓは、プロスタサイクリン類、ロイコトリエン類、プロスタグランジン類等の、
ヒト及び動物における他の重要な分子に対する前駆物質としても機能する。重要
な長鎖ＰＵＦＡｓとしては、様々な種類の魚油中に主に見出されるドコサヘキサ
エン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、マツヨイグサ（Ｏｅｎ
ｏｔｈｅｒａ ｂｉｅｎｎｉｓ）、ルリジサ（Ｂｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａ
ｌｉｓ）及びクロフサスグリ（Ｒｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ）を始めとする多くの
植物の種子中に見出されるガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）、魚油及び植物種子に
見出されるステアリドン酸（ＳＤＡ）及びＧＬＡと共に糸状菌類に見出されるア
ラキドン酸（ＡＲＡ）が挙げられる。ＡＲＡは肝臓及び副腎を始めとする動物組
織から精製することができる。ＥＰＡ又はＤＨＡのいずれかを合成するいくつか
の海洋細菌属が知られている。ＤＨＡはＡＲＡと共にヒトの乳の中に存在する。
【０００３】 ＰＵＦＡｓは、（特に幼児の脳における）適切な発達並びに組織の形成及び修
復に必要である。例としてＤＨＡは多くのヒト細胞膜（特に神経細胞（灰白質）
、筋肉細胞、及び精子における細胞膜）の重要な構成要素であり、一般に脳の機
能の発達に影響を及ぼし、視覚の発達に必須であると考えられている。ＥＰＡ及
びＤＮＡは、多くの栄養学的及び薬理学的用途を有している。例として、糖尿病
（特に非インスリン依存型）に罹患した成人はＤＨＡレベルの不足及び不均衡を
示し、これが後の冠動脈の病気に寄与すると考えられている。従って、ＤＨＡの
バランスが取れた食事は糖尿病患者にとって有益であり得る。
【０００４】 ＤＨＡの場合、種々の海洋生物、冷水の海洋魚から得られた油、及び卵黄の画
分を始めとする、商業的生産用の多くの供給源が存在する。魚からのＤＨＡの精
製は、技術的に困難であるために比較的高くつくため、ＤＨＡを高価かつ供給不
足なものとしている。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ及びＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕ
ｍ等の藻類やＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ等の海洋菌類では、ＤＨＡが細
胞の脂肪酸含量のうちの４８％に達することもある。数種の細菌でもＤＨＡを生
産することが報告されている。それらは一般にＶｉｂｒｉｃ ｍａｒｉｎｕｓ等
の深海細菌である。ＡＲＡの場合、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、Ｅｎｔｏｍｏｐ
ｈｔｈｏｒａ属、Ｐｈｙｔｉｕｍ属及びＰｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ属等の微生物
を、商業的生産用に使用することができる。ＳＤＡの商業的供給源としては、Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｓｍａ属及びＥｃｈｉｕｍ属が挙げられる。ＧＬＡの商業的供給
源としては、マツヨイグサ、クロフサスグリ及びルリヂサが挙げられる。しかし
、天然供給源からのＰＵＦＡｓの商業的生産に関しては、いくつかの欠点が存在
する。動物や植物等のＰＵＦＡの天然供給源は、異成分性の高い油の組成物を有
する傾向がある。そのような供給源から得られた油は、１または複数の所望のＰ
ＵＦＡを分離したり又は複数の所望のＰＵＦＡに濃縮される油を生産したりする
ためには、大いに精製しなければならない可能性がある。
【０００５】 天然供給源は、制御不能な有効性の変化も受ける。魚のストックは天然の変化
を受けたり、魚の濫獲によって枯渇したりする可能性がある。動物油、特に魚油
は、環境汚染物質を蓄積し得る。天候や病気が、魚及び植物の両供給源の生産高
を変動させる可能性もある。油の生産用の代替作物の生産に有効な耕作地は、人
口密度の定常的な増大と、それに関連する残りの耕作に適した土地での食物生産
の必要性の増大との理由から、競争を受けやすい。ルリヂサのようにＰＵＦＡｓ
を生産しない作物は、商業的栽培に適合せず、モノカルチャーではうまく機能し
ない可能性がある。従って、そのような作物の栽培は、収益性がより高くより確
立された作物を育成できる所では、経済的競争力がない。また、Ｓｈｅｗａｎｅ
ｌｌａ等の生物の大規模な発酵は高価である。天然動物組織は、ＡＲＡを少量含
み、加工が困難である。Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ等
の微生物は、商業的規模で培養するのが困難である。
【０００６】 ＰＵＦＡｓを含有する栄養補助食品及び医薬品製剤は、ＰＵＦＡ供給源の欠点
を保持している。魚油カプセルのような栄養補助食品は低レベルの特定の所望成
分を含有するため、多用量が必要となる。用量が多いと、汚染物質を含めた高レ
ベルの望ましくない成分を摂取することとなる。脂肪酸の補助食品を提供する場
合には注意する必要がある。その理由は、添加のしすぎが、内因性生合成経路を
抑制し、インビボでの種々の脂肪画分における他の必須脂肪酸との競争につなが
り、望ましくない結果となる可能性があるためである。例えば、ω３脂肪酸の高
い食事を摂っているエスキモー族は、出血の傾向が高い（米国特許第４，８７４
，６０３号）。魚油は不快な味と臭いを有するが、これを補助食品などの所望の
製品から経済的に分離することが不可能であり得る。補助食品の味及び臭いが不
快であると、そのような補助食品に関する摂取プログラムが望ましくないものと
なり、患者による受諾を抑制する可能性がある。
【０００７】 ＰＵＦＡ生合成に関する酵素として、多くの酵素が同定されている。リノール
酸（ＬＡ，１８：２ Δ９，１２）はΔ１２−デサチュラーゼによりオレイン酸
（１８：１ Δ９）から生産される。ＧＬＡ（１８：３ Δ６，９，１２）はΔ
６−デサチュラーゼによりリノール酸（ＬＡ，１８：２ Δ９，１２）から生産
される。ＡＲＡ（２０：４ Δ５，８，１１，１４）はΔ５−デサチュラーゼに
より触媒され、ＤＧＬＡ（２０：３ Δ８，１１，１４）から生産される。エイ
コサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、すべてがシス配置の、５つの二重結合（Δ５，
８，１１，１４，１７）を有する２０個の炭素から成るオメガ３系列脂肪酸であ
る。ＥＰＡとその関連のＤＨＡ（Δ４，７，１０，１３，１６，１９，Ｃ２２：
６）は、一連の延長及び不飽和化反応によりオレイン酸から生産される。さらに
、１８個の炭素から成るＰＵＦＡｓを２０及び２２炭素鎖長に伸ばすには、１つ
のエロンガーゼ（又は複数のエロンガーゼ）が必要である。しかし、動物はオレ
イン酸（１８：１ Δ９）をリノール酸（１８：２ Δ９，１２）に変換するこ
とができない。同様に、μ−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ Δ９，１２，１５
）も動物では合成することができない。菌類及び植物等の他の真核生物は、Δ１
２位及びΔ１５位で不飽和化する酵素を有している。従って、動物の主な多価不
飽和脂肪酸は、食事及び／又はリノール酸（１８：２ Δ９，１２）の不飽和化
及び延長に由来するものであるか、又はμ−リノレン酸（１８：３ Δ９，１２
，１５）に由来するものであるかのいずれかである。
【０００８】 多価不飽和脂肪酸は、栄養学的目的、医薬用目的、工業用目的、及び他の目的
に有効であると考えられている。天然源及び化学合成からの多価不飽和脂肪酸の
供給拡大は、商業上の要求に足りていない。大半の植物種に一般的なリノール酸
（ＬＡ，１８：２ Δ９，１２）からのより飽和した長鎖ＰＵＦＡｓへの脂肪酸
合成には多くの別個のデサチュラーゼ及びエロンガーゼ酵素が必要であるため、
ＥＰＡ及びＤＨＡの発現のための植物宿主細胞の構築には、少なくともＥＰＡ及
びＤＨＡに対する、発現を達成するための５つ又は６つの別個の酵素活性の発現
が必要であり、そのようなＰＵＦＡｓを一定量の生産するにはさらなる構築の努
力（例えば基質と競合する酵素のダウンレギュレーション、突然変異誘発による
高い酵素活性の構築、又はプラスミド細胞小器官への酵素のターゲティング）が
必要である。従って、ＰＵＦＡ生合成に関する遺伝子物質を、そのような脂肪酸
を天然で生産する種から手に入れ、商業的な量のＰＵＦＡｓが生産されるよう操
作できる異種系にて、そのような単離物質を単独で又は組み合わせて発現させる
ことが重要である。
【０００９】 （関連文献） ＥＰＡ又はＤＨＡのいずれかを合成する海洋細菌のいくつかの属が同定されて
いる（ドロング（DeLong）及びヤヤノス（Yayanos ）、Applied and Environmen
tal Microbiology（1986）51:730-737）。Sagami Chemical Research Institute
の研究者は、海洋細菌であるＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ
からの遺伝子クラスタにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉにおけるＥＰＡの生産
を報告した。Ｅ．ｃｏｌｉでのＥＰＡの脂肪酸合成には、最小５つの読み取り枠
（ＯＲＦｓ）必要である。現在までのところ、そのような遺伝子によってコード
されたタンパク質の機能の詳細な特徴付けは報告されていない（ヤザワ（Yazawa
）（1996）Lipids 31 ，S-297 ；ＷＯ第９３／２３５４５号；ＷＯ第９６／２１
７３５号）。
【００１０】 ヤザワ（Yazawa）、米国特許第５，６８３，８９８号によって公表された読み
取り枠（ＯＲＦ）３のタンパク質配列は、機能タンパク質ではない。ヤザワ（Ya
zawa）は、該タンパク質を、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＰＫＳ様クラスタ（Ｇｅｎ
ｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ７３９３５）のヌクレオチド９０１６−９０１４の位置
のメチオニンコドンから開始し、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＰＫＳ様クラスタのヌ
クレオチド８１８５−８１８３の位置の停止コドンで終わるタンパク質として定
義している。しかし、このＯＲＦをＯＲＦ３以外の完全なＰＫＳ様クラスタを含
むＥ．ｃｏｌｉ株において異種プロモーターの制御下で発現させた場合、組換え
細胞はＥＰＡを生産しない。
【００１１】 ポリケチドは、二次代謝産物であり、その合成は脂肪酸合成の酵素反応に類似
する一連の酵素反応に関する（ホップウッド（Hopwood ）及びシャーマン（Sher
man ）、Annu. Rev. Genet. （1990）24:37-66、キャッツ（Katz）及びドナジオ
（Donadio ）、in Annual Review of Microbiology（1993）47:875-912の総説を
参照のこと）。新規な抗生物質を生産するためのポリケチドシンターゼの使用が
提唱されている（ハッチンソン（Hutchinson）とフジイ（Fujii ）、Annual Rev
iew of Microbiology （1995）49:20 1238）。
【００１２】 （発明の概要） 植物及び植物細胞でポリケチド様合成（ＰＫＳ様）遺伝子を使用することによ
る、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）を調製するための新規な組成物及び方
法が提供される。公知の及び提唱されている脂肪酸合成遺伝子によるＰＵＦＡの
生産方法に対して、本発明によると、ＰＫＳ様系の遺伝子の使用による、ＰＵＦ
Ａの生産のための構築物及び方法が提供される。該方法は、宿主細胞内で機能す
る発現カセットにより形質転換された対象の宿主細胞を生育する工程から成り、
発現カセットは転写開始調節領域及び翻訳開始調節領域から成り、ＰＵＦＡｓの
生産を調節することができるＰＫＳ様系の遺伝子又は構成要素のＤＮＡ配列（Ｐ
ＫＳ様遺伝子）に対して、読み枠５’内で結合される。宿主細胞のＰＵＦＡプロ
ファイルの変更は、ＰＵＦＡ生合成を担う完全なＰＫＳ様系を宿主細胞へ導入し
た後の発現により達成される。本発明は、例えば、ＤＨＡ及びＥＰＡの大量生産
や、宿主細胞並びに食用植物組織及び／又は植物部分の脂肪酸プロファイルの改
変に使用される。
【００１３】 （好ましい実施形態の説明） 本発明によれば、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙ
ｔｒｉｕｍ又は他の微生物に由来するポリケチド様合成（ＰＫＳ様）経路遺伝子
の一部又は全部を含む、宿主細胞、特に宿主植物細胞の多価不飽和長鎖脂肪酸含
量を改変するための新規なＤＮＡ配列、ＤＮＡ構築物及び方法が提供される。本
発明は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ中のＥＰＡ合成遺伝
子がポリケチド様合成経路を構成することを証明している。機能はＳｈｅｗａｎ
ｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ及びＶｉｂｒｉｏ遺伝子によるもので
あり、宿主細胞においてＥＰＡ及びＤＨＡを生産するための方法が提供される。
該方法は、宿主細胞における１または複数のＰＵＦＡの量を増大させることが可
能なポリペプチドをコードするＤＮＡを有する発現カセットにより細胞を形質転
換する工程から成る。好ましくは、宿主細胞のゲノムへの発現カセットの組み込
みを与える組込み構築物が調製される。宿主細胞はＰＫＳ様遺伝子活性を有する
１つのポリペプチド（複数のポリペプチド）をコードするセンス又はアンチセン
スＤＮＡを発現するように操作される。「ＰＫＳ様遺伝子」が意味するのは、関
連のＰＫＳ様活性の１または複数の任意の機能の原因となっているポリペプチド
である。「ポリペプチド」が意味するのは、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコ
シル化又はリン酸化）に関係ない、任意のアミノ酸鎖である。宿主細胞の性質次
第で、発現された酵素に対する基質が宿主細胞によって生産されるか、又は外因
的に供給される。植物組織及び／又は葉、根、果実及び種子等の植物の一部にお
けるＰＵＦＡ生産の選択的制御は特に重要である。本発明は、宿主細胞でＥＰＡ
、ＤＨＡ、及び他の関連ＰＵＦＡｓを合成するために使用することができる。
【００１４】 ＰＵＦＡｓのトランスジェニックによる生産には多くの利点がある。例として
、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａと同様トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉでは、リン脂質
画分、特にｓｎ−２位置にＥＰＡが蓄積する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ又はＥ．ｃ
ｏｌｉのいずれかで生産される構造脂質とは実質的に異なる構造脂質を、所望の
宿主細胞内で生産することが可能である。さらに、特定の宿主細胞におけるＰＵ
ＦＡｓのトランスジェニックによる生産は、魚又は植物等の天然供給源からの精
製よりも優れたいくつかの利点を提供する。トランスジェニック植物では、ＰＫ
Ｓ様の系を用いることにより、マロニルＣｏ−Ａ及びアセチルＣｏ−Ａを基質と
して利用する脂肪酸のデノボ生産を介してＰＵＦＡｓを生産する系により、ＰＵ
ＦＡｓの脂肪酸合成が細胞質にて達成される。このように、基質の競合や宿主に
おける脂肪酸合成の通常の産物のＰＵＦＡ生産への迂回等の問題が回避される。
【００１５】 組換え植物での脂肪酸の生産は、宿主に新しい合成経路を与えるか又は望まし
くない経路を抑制して、レベル所望のＰＵＦＡｓ又はその共役体のレベルを増大
させるか望ましくないＰＵＦＡｓのレベルを減少させることにより、天然の植物
脂肪酸プロファイルを変更する能力を提供する。トランスジェニック植物におけ
る脂肪酸の生産も、特定の組織及び／又は植物の一部におけるＰＫＳ様遺伝子の
発現により、そのような組織及び／又は一部における所望のＰＵＦＡｓの大きな
増加が達成され、そのような組織からの回収がより経済的となることを意味する
という効果を提供する。植物組織及び／又は植物の一部における発現は、特に組
織又は一部が種子、葉、果実、花、根等のように容易に収穫されるものである場
合には、特定の有効性を示す。例えば、種子で所望のＰＵＦＡｓを発現させるこ
とが可能であり、種子油を単離する方法はよく確立されている。所望のＰＵＦＡ
ｓの精製のための供給源を供給することに加えて、種子油成分は、特定のＰＵＦ
Ａプロファイルを濃縮された形で有する種子油を提供するために、単独の又はエ
ロンガーゼ等の遺伝子と組み合わせたＰＫＳ様遺伝子の発現により操作され得る
。濃縮された種子油は、動物の乳及び／又はヒトによる授乳が不可能又は望まし
くないか、成人及び幼児の両方で栄養不良又は疾病の場合に幼児用調合乳として
機能する合成又は半合成乳に添加することができる。
【００１６】 トランスジェニック微生物による脂肪酸の生産は、高等生物と比較して多くの
微生物は非常に簡単な油の組成を有することが知られており、所望の成分の精製
が容易であるという効果を提供する。微生物による生産は、天候や食物の供給な
どの外部変化によって生じる変動の影響を受けない。微生物によって生産された
油は、環境汚染物質による汚染を実質的に受けない。さらに、微生物は特定の用
途を有する特定の形式でＰＵＦＡｓを提供し得る。例えば、スピルリナ（Ｓｐｉ
ｒｕｌｉｎａ）は、トリグリセリドの１位及び３位に優先的にＰＵＦＡｓを与え
、膵リパーゼによる消化は、脂肪酸をそれらの位置から解離させる。スピルリナ
由来のトリグリセリドのヒト又は動物による消化の後、そのようなＰＵＦＡｓは
膵リパーゼにより遊離脂肪酸として解離され、例えば幼児の脳の発達に直接利用
される。また、微生物油の生産は、培養条件を制御することにより、特に微生物
により発現された酵素に対する特定の基質を与えるか又は望ましくない生化学経
路を抑制する化合物を添加することにより、操作することができる。そのような
効果に加えて、組換え微生物からの脂肪酸の生産は、宿主に新しい合成経路を与
えるか又は望ましくない経路を抑制して、レベル所望のＰＵＦＡｓ又はその共役
体のレベルを増大させるか望ましくないＰＵＦＡｓのレベルを減少させることに
より、天然の微生物脂肪酸プロファイルを変更する能力を提供する。
【００１７】 動物での脂肪酸の生産もいくつかの利点を与える。動物でのデサチュラーゼ遺
伝子の発現により、動物組織における所望のＰＵＦＡｓのレベルが非常に増大し
、そのような組織からの回収をより経済的なものとすることができる。例えば、
所望のＰＵＦＡｓが動物の母乳中で発現している場合、動物の乳からのＰＵＦＡ
ｓの単離方法はよく確立されている。所望のＰＵＦＡｓの精製のための供給源を
提供することに加えて、動物の母乳は、幼児の発達の種々の段階の間にヒト母乳
と非常に類似したＰＵＦＡ組成物を動物の乳に与えるために、デサチュラーゼ遺
伝子の発現により操作され得る。母乳化した動物の乳は、ヒトによる授乳が不可
能又は望ましくないか、栄養不良又は疾病の場合に、幼児用調合乳として機能し
得る。
【００１８】 所望のＰＫＳ様遺伝子をコードするＤＮＡは、種々の方法で同定することが可
能である。１つの方法において、所望のＰＫＳ様遺伝子の供給源である、例えば
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ又はＶｉｂｒｉｏ種由来
のゲノムライブラリは、酵素的に又は化学的に合成された検出可能なプローブに
よりスクリーニングされる。ＰＫＳ様遺伝子を有するＯＲＦｓの供給源は、高圧
下又は比較的低温で選択的に成育するＤＨＡ生産又はＥＰＡ生産深海細菌を始め
とする、所望のＰＵＦＡを生産する生物である。ＥＰＡ又はＤＨＡを生産するＳ
ｈｅｗａｎｅｌｌａ等の微生物を、ＰＫＳ様遺伝子の供給源として使用すること
が可能である。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は非天然ヌクレオチド、若しく
はそれらの混合物より製造することが可能である。プローブは通常の又はストリ
ンジェンシーを減らしたハイブリッド形成方法で既知のＰＫＳ様遺伝子のＤＮＡ
から酵素的に合成することが可能である。核酸プローブの設計及びアニーリング
条件の議論に関しては例えば、サンブルック（Sambrook）ら、Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual （第2 版）、1 −3 巻、Cold Spring Harbor Laborato
ry ，（1989）又はC urrent Protocols in Molecular Biology，エフ アウスベ
ル（F. Ausubel）ら編、Greene Publishing and Wiley Interscience，New York
（1987）を参照されたい。各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＵ
ＦＡ酵素をコードしている核酸を操作する技術、例えば、発現ベクターへのポリ
ペプチドをコードする核酸配列のサブクローニング、プローブ標識、ＤＮＡハイ
ブリッド形成は、前掲のサンブルックに概説されている。
【００１９】 オリゴヌクレオチドプローブも、供給源をスクリーニングするために使用する
ことができ、オリゴヌクレオチドプローブは、既知のＰＫＳ様遺伝子間で保存さ
れている配列を含む既知ＰＫＳ様遺伝子配列に基づき得るか、所望の精製タンパ
ク質から得られるペプチド配列に基づき得る。アミノ酸配列に基づくオリゴヌク
レオチドプローブは、遺伝子コードの縮重を包含するように縮重されるか、供給
源である生物の好ましいコドンを選ぶように偏向される。代わりに、所望のタン
パク質は完全に配列決定された、その実施されたポリペプチドのＤＮＡ完全合成
体であり得る。
【００２０】 所望のＤＮＡが一旦単離されると、該ＤＮＡは既知の方法で配列決定される。
そのような方法にはエラーが起こりやすく、同じ領域を複数回配列決定すること
はルーチン作業であり、得られた配列（特に、ＧＣ塩基含量の高い領域等の、繰
り返しドメイン、広い二次構造、又は異常塩基組成物を有する領域）には測定で
きる割合の誤りがまだ存在すると予想されることが、当該技術分野では認識され
ている。矛盾が生じた場合には、再度の配列決定が行われ、特定の方法が使用さ
れ得る。特定の方法には、異なる温度；異なる酵素；オリゴヌクレオチドの高次
構造を形成する能力を変更するタンパク質；ＩＴＰ又はメチル化ｄＧＴＰ等の変
更ヌクレオチド；例えばホルムアミドの添加等の異なるゲル組成；異なるプライ
マー又は問題の領域とは異なる距離に位置するプライマー；又は一本鎖ＤＮＡ等
の異なる鋳型を用いた配列決定条件の変更が含まれる。ｍＲＮＡの配列決定も使
用することが可能である。
【００２１】 大半の場合、ＰＫＳ様遺伝子活性を有するポリペプチドに対するコード配列の
一部又は全体は、天然供給源に由来するものである。しかし場合によっては、例
えば発現を高めるために、宿主の好ましいコドンを用いて、コドンの全体又は一
部を改変することが望ましい。宿主の好ましいコドンは、関連の特定宿主種に大
量に発現しているタンパク質中の、最も頻度が高いコドンから決定することがで
きる。このようにＰＫＳ様遺伝子活性を有するポリペプチドに対するコード配列
は、全体又は一部が合成される。ＤＮＡの全体又は一部は、転写ｍＲＮＡに存在
する任意の不安定化配列又は二次構造の領域を除去すべく、合成することもでき
る。ＤＮＡの全体又は一部は、塩基組成を所望の宿主細胞にとってより好ましい
組成に変更すべく、合成することもできる。配列を合成し、配列をまとめるため
の方法が参考文献によく確立されている。インビトロ突然変異誘発及び選択、部
位特異的突然変異誘発、又は他の手段を用いて、自然ＰＫＳ様遺伝子の変異体を
得、所望の多価不飽和脂肪酸の長い半減期又は高速生産等の、宿主細胞で機能す
る望ましい物理的及び動力学的パラメータにより、インビボでＰＫＳ様遺伝子活
性を有するポリペプチドを生産することができる。
【００２２】 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ＯＲＦｓ並びにＶｉｂｒ
ｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ及びＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの対応するＯＲＦｓは
、特に重要である。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ＰＫＳ
様遺伝子は、ＥＰＡの生合成を遂行するためにトランスジェニック植物で発現さ
せることが可能である。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ Ｐ
ＫＳ様遺伝子と配列が実質的に同一な他のＤＮＡｓ、又はＶｉｂｒｉｏ ｍａｒ
ｉｎｕｓ又はＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍから同定されたＤＮＡｓのようなＳ
ｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓのＰＫＳ様遺伝子と実質的に同
様なポリペプチドをコードするＤＮＡｓが使用され得る。配列が実質的に同一で
あるとは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ＰＫＳ様遺伝子
のＤＮＡ配列又は該遺伝子に対するアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して
、順番に増加する少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％の相同性を示す
アミノ酸又は核酸配列を糸する。ポリペプチドの場合、比較する配列の長さは一
般に、少なくとも１６アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、及び最も
好ましくは３５アミノ酸である。核酸の場合、比較する配列の長さは一般に、少
なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、及びより
好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド、及び最も好ましくは、１１０ヌクレオ
チドである。
【００２３】 相同性は一般に、配列分析ソフトウェア、例えば、Genetics Computer Group
University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, ウ
ィスコンシン州マジソン（Madison ）53705 のSequence Analysis ソフトウェア
パッケージ、MEGAlign（DNAStar, Inc., 1228 S.Park St., ウィスコンシン州マ
ジソン（Madison ）53715 ）、及び MacVector（Oxford Molecular Group, 2105
S. Bascom Avenue, Suite 200,カリフォルニア州キャンベル（Campbell）95008
）を用いて測定される。BLAST （National Center for Biotechnology Informat
ion （WCBI） www.ncbi.nlm.gov; FASTA（Pearson 及び Lipma n 、 Science（1
985） 227:1435-1446）。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、及び
他の修飾に対する相同性の程度の割り当てにより、同様な配列に適合する。同類
置換は一般に以下のグループ内での置換を含む：グリシンとアラニン；バリン、
イソロイシンと、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンとグ
ルタミン；セリンとスレオニン；リジンとアルギニン；並びにフェニルアラニン
とチロシン。置換は疎水性又は親水性の保存に基づいて（カイト（Kyte）及びド
ゥーリトル（Doolittle ）、J. Mel. Biol. （1982）157 ：105-132 ）、又は同
様なポリペプチド二次構造を取る能力（チョウ（Chou）及びファスマン（Fasman
）, Adv. Enzymol. （1978）47:45-148 、1978）に基づいて行うことも可能であ
る。プローブ配列に対する関連タンパク質は、ｐ＞０．０１、好ましくは＞１０ -7 又は１０-8である時に同定される。
【００２４】 同じか又は別の生物由来の関連ＰＫＳ様遺伝子が本発明に包含される。そのよ
うな関連ＰＫＳ様遺伝子には、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａの同じか異なる種内で自然
に生じる開示されたＰＫＳ様ＯＲＦｓの変異体、開示されたＰＫＳ様遺伝子の他
の種由来の同族体、及び類似の機能及び活性を有する進化上関連するタンパク質
が含まれる。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓＰＫＳ様遺伝子
とは実質的に同一ではないが、ＰＫＳ様系の一部としてＰＵＦＡｓを生産するよ
うに同様な様式で作用するＰＫＳ様遺伝子も含まれる。関連ＰＫＳ様遺伝子は、
開示されたＰＫＳ様遺伝子と実質的に同じように機能する能力により同定される
。つまり、関連ＰＫＳ様遺伝子は、対応するＳｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚ
ｏｃｈｙｔｒｉｕｍ又はＶｉｂｒｉｏのＯＲＦｓの代わりを果たすことができる
が、なお有効にＥＰＡ又はＤＨＡを生産する。関連ＰＫＳ様遺伝子は、開示され
たＰＫＳ様遺伝子と相同な配列に対する配列データベースのスクリーニングによ
って、開示されたＰＫＳ様遺伝子に基づくプローブを供給源生物より構築したラ
イブラリとハイブリッド形成することによって、又は供給源生物由来のｍＲＮＡ
及び開示されたＰＫＳ様遺伝子に基づくプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによっ
ても同定することが可能である。従って、「ＰＫＳ様遺伝子」という言葉は、本
明細書に開示したヌクレオチド配列のみを指すわけではなく、対立遺伝子である
他の核酸又は上記ヌクレオチド配列の種変異体をも指す。そのような言葉は、組
換え技術を用いた単一点突然変異等の意図的突然変異により、ＰＵＦＡ酵素をコ
ードするＤＮＡ読み取り枠の短い部分を除去により、又は新たなコドンとの置換
又は新たなコドンの添加により導入された、非自然突然変異を含むことも理解さ
れる。そのような小さな変更は、元の発現産物の免疫同一性及び／又はその生物
活性を実質的に維持する。変更されたＰＵＦＡ酵素の生物学的特性は、酵素を適
切な細胞系で発現させたり酵素ＰＵＦＡｓを合成する該酵素の能力を決定したり
することにより決定することができる。小さいと考えられる特定の酵素の改変に
は、同様な化学的特性を有するアミノ酸の置換（例えば、グルタミン酸をアスパ
ラギン酸と置換又はグルタミンをアスパラギンと置換）が含まれる。
【００２５】 他の生物由来のＰＵＦＡ ＰＫＳ様系を使用した場合、ポリペプチドＰＫＳ様
遺伝子活性に重要なＰＫＳ様遺伝子の領域は定型の突然変異誘発、得られた変異
ポリペプチドの発現及びその活性の決定により決定することができる。変異体の
コーディング領域には、欠失、挿入及び点突然変異、又はそれらの組み合わせが
含まれ得る。一般的な機能分析は、タンパク質が機能するのに必要なタンパク質
のＮ及びＣ末端の限界を決定する欠失突然変異誘発から始まり、次に、機能する
のに必要な領域をさらに詳しく決定するために、内部欠失、挿入又は点突然変異
が読取り枠で行われる。カセット突然変異誘発又は全合成のような他の技術も使
用することが可能である。欠失突然変異誘発は、例えば、５’又は３’コーディ
ング領域を逐次除去するエキソヌクレアーゼを用いることにより達成される。そ
のような技術のためのキットを利用することが可能である。欠失後、コーディン
グ領域は開始コドン又は停止コドンを含むオリゴヌクレオチドを５’又は３’欠
失後の欠失したコーディング領域にライゲートすることにより完成される。
【００２６】 代わりに、開始コドン又は停止コドンを含むオリゴヌクレオチドは部位特異的
突然変異誘発、突然変異ＰＣＲ又は既存の制限部位で消化したＤＮＡに対するラ
イゲートを始めとする種々の方法によりコーディング領域に挿入される。内部欠
失は、部位特異的突然変異誘発又は突然変異ＰＣＲを介した突然変異プライマー
の使用により、ＤＮＡの既存の制限部位の使用を含む種々の方法により同様に行
われ得る。挿入はリンカー走査突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又は突然
変異ＰＣＲ等の方法により行われる。点突然変異は、部位特異的突然変異誘発又
は突然変異ＰＣＲ等の技術により行われる。
【００２７】 活性に重要なＰＫＳ様遺伝子ポリペプチドの領域を同定するためには、化学的
突然変異誘発も使用される。変異構築物を発現させ、得られた変更タンパク質の
ＰＫＳ様遺伝子として機能する能力が評価される。そのような構造−機能分析で
は、どの領域が欠失し、どの領域が挿入を許容し、どの点突然変異が天然ＰＫＳ
様遺伝子と実質的に同じ様に機能する突然変異タンパク質を許容するかを決定す
ることができる。それらをコードするすべてのそのような突然変異タンパク質及
びヌクレオチド配列は、本発明の範囲内にある。ＥＰＡはＳｈｅｗａｎｅｌｌａ
ではＰＫＳ様系の産物として生産され、ＥＰＡ遺伝子はその系の構成要素をコー
ドしている。Ｖｉｂｒｉｏでは、同様な系によりＤＨＡが生産される。そのよう
な脂肪酸を合成するクラスタ遺伝子によりコードされる酵素は、通常細菌及び植
物で見出されるＣ１６及びＣ１８脂肪酸の合成に関与する酵素をコードする脂肪
酸合成遺伝子とは異なる遺伝子クラスタによってコードされる。Ｓｈｅｗａｎｅ
ｌｌａ ＥＰＡ遺伝子はＰＫＳ様遺伝子クラスタを示し、ＥＰＡの生産は、少な
くともある程度は、細菌のタイプＩＩ型ＦＡＳ系から独立している。従って、植
物細胞の細胞質におけるＥＰＡの生産は、適切な植物調節信号下での植物細胞に
おけるＰＫＳ様経路遺伝子の発現により達成することができる。
【００２８】 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＥＰＡ遺伝子により形質転換されたＥ．ｃｏｌｉでの
ＥＰＡの生産は、嫌気的成長の間進行し、Ｏ2依存的なデサチュラーゼ反応は関
与しないことを示している。ＥＰＡの生産に必須のＯＲＦｓによりコードされた
タンパク質の分析により、ＰＫＳ様系の特徴であるドメイン構造が存在すること
が明らかとなっている。図２Ａは「ＢＬＡＳＴ」データバンクサーチにより検出
されたドメイン、モチーフ、及び重要な相同性の概要を示す。ＥＰＡはＰＫＳ様
経路で生産される他の物質の多くとは異なるため、すなわち分子に沿って３炭素
間隔で離間した５個のｃｉｓ二重結合を有するため、ＥＰＡの合成のためのＰＫ
Ｓ様系は予想されていない。
【００２９】 さらに ＥＰＡ ＯＲＦｓに存在するドメインを用いたＢＬＡＳＴサーチによ
り、いくつかのドメインがＡｎａｂｅａｎａに見出されたＰＫＳ様遺伝子クラス
タによりコードされたタンパク質に関連することが明らかになっている。Ａｎａ
ｂｅａｎａ染色体のそのような領域の構造を図２Ｆに示す。Ａｎａｂｅａｎａ
ＰＫＳ様遺伝子は、異質細胞の糖脂質層に見出された長鎖（Ｃ２６）のヒドロキ
シ脂肪酸の合成と結びつけられる。Ａｎａｂｅａｎａタンパク質に対する相同な
ＥＰＡタンパク質ドメインを図２Ｆに示す。
【００３０】 ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦ６は、活性部位モチーフ（ＤＸＡＣ*）（配列
番号３２）と同様、多くのＴｙｐｅ ＩＩ ＫＡＳタンパク質の端部に存在する
「ＧＦＧＧ」モチーフ（配列番号３３）を含む、ＫＡＳドメインを有する（図２
Ａを参照されたい）。延長されたモチーフも存在するが、本明細書には示さない
。次はマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインで
ある。活性部位モチーフ（ＧＨＳ*ＸＧ）（配列番号３４）付近の配列は、メチ
ルマロン酸塩ではなくマロン酸塩を移動させる、すなわち酢酸塩様ＡＴｓに類似
することを示唆している。リンカー領域の後、各々が約１００アミノ酸の長さで
ある６個の繰り返しドメインから成り、ＰＫＳ様ＡＣＰ配列と相同なクラスタが
存在する。各々は、パンテテイン結合部位モチーフ（ＬＧＸＤＳ*（Ｌ／Ｉ））
（配列番号３５及び３６を含む）。６個のそのようなＡＣＰドメインの存在は、
脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）又はＰＫＳ様系では以前には観察されていなかった
。タンパク質の端部付近には、β−ケト−ＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）に対する
相同性を示す領域が存在する。ＫＲは、ピリジンヌクレオチド結合部位モチーフ
「ＧＸＧＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）（配列番号３７、３８及び３９）を含む。
【００３１】 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ８は活性部位と終結モチーフ（図２）とを含む
ＫＡＳドメインから始まる。データバンクで最もよく適合したのは、Ａｎａｂｅ
ａｎａ ＨｇｌＤである。 ＨｇｌＣのＮ末端半分と相同な配列を有するドメイ
ンも存在する。この領域は、活性部位及び終結モチーフを欠いているが、やはり
ＫＡＳタンパク質に対する弱い相同性を示す。該領域は、Ｔｙｐｅ ＩＩ ＰＫ
Ｓ様系のいわゆる鎖長因子（ＣＬＦ）と呼ばれる特性を有する。ＯＲＦ８はＰＫ
Ｓ様系によるＥＰＡ対ＤＨＡの生産を指向していると思われる。また、ＯＲＦ８
はβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）と相同な２つのドメイン
を有する。両ドメインに対して最もよく適合するのは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦａｂＡ
、つまり得られた二重結合の脱水反応及び異性化（ｔｒａｎｓからｃｉｓへの）
の両方を遂行する二つの作用を有する酵素である。第１のＤＨドメインは、Ｆａ
ｂＡ触媒作用に関連する活性部位ヒスチジン（Ｈ）及び隣接システイン（Ｃ）を
含む。第２のＤＨドメインは活性部位Ｈは有するが隣接Ｃを欠いている（図２Ｃ
）。第２ＤＨドメインに関するＢｌａｓｔサーチはＦａｂＺ、すなわちイソメラ
ーゼ活性を持たない第２のＥ．ｃｏｌｉ ＤＨに対して適合していることも示す
。
【００３２】 ＯＲＦ７（図２Ｂ）のＮ末端半分は、データバンクで有意に適合するものがな
い。Ｃ末端半分と最もよく適合するのは、Ａｎａｂｅａｎａ ＨｇｌｃのＣ末端
部分である。このドメインはアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）モチーフ（ＧＸ
ＳＸＧ）（配列番号４０）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰ Ａ
Ｔの結晶構造に基づいて延長された活性部位配列を比較すると、ＯＲＦ７は活性
部位（Ｅ．ｃｏｌｉ名称；Ｑ１１及びＲ１１７）から水を排除するのに必要な２
つの残基を欠いていることが明らかである。以上のデータは、ＯＲＦ７がチオエ
ステラーゼとして機能し得ることを示唆している。
【００３３】 ＯＲＦ９（図２Ｄ）は、Ａｎａｂｅａｎａ Ｈｇｌクラスタの未知の機能を有
するＯＲＦと相同である。ＯＲＦ９は、窒素固定細菌における調節タンパク質で
あるＮＩＦＡとも非常に弱い相同性を示す。ＯＲＦ９タンパク質に関する調節の
役割はこれまで排除されていない。ＯＲＦ３（図２Ｅ）はＡｎａｂｅａｎａ Ｈ
ｅｔＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥｎｔＤ、及びバチルスのＳｆｐと相同である。近
年、ＨｅｔＩ、ＥｎｔＤ及びＳｆｐを含むリン酸パンテテニルトランスフェラー
ゼの新しい酵素ファミリーが同定されている。（ランブロット アール エイチ
（Lamblot RH）ら（1996）A new enzyme superfamily-the phophopantetheinyl
transferases. Chemistry&Biology,第3 巻、第11号、923-936 ）。図３のデータ
は、ＯＲＦ３の存在がＯＲＦ６タンパク質へのβ−アラニン（すなわちパンテテ
イン）の添加に必要であることを証明している。このように、ＯＲＦ３は、ＯＲ
Ｆ６ ＡＣＰドメインに特異的なリン酸パンテテニルトランスフェラーゼをコー
ドしている（ヘイドック エス エフ（Haydock SF）ら（1995）を参照のこと。
互いに異なる配列モチーフが、モジュラーポリケチドシンターゼの（メチル）マ
ロニル−ＣｏＡ：アシルキャリアタンパク質トランスアシラードメインの基質特
異性と相関関係にあった。FEBS Lett.,374, 246-248 ）マロン酸塩は、ＥＰＡ合
成の延長反応に使用される炭素の供給源である。その上、マロニル−ＡＣＰでは
なくマロニル−ＣｏＡがＡＴ基質である。すなわち、ＯＲＦ６のＡＴ領域はマロ
ニル−ＣｏＡを利用する。
【００３４】 ＰＵＦＡ生産を担う生物のＰＫＳ様遺伝子をコードするＤＮＡ配列が一旦得ら
れると、該ＤＮＡ配列は宿主細胞内の複製が可能なベクターに配置されるか、Ｐ
ＣＲ又はロングＰＣＲ等の技術によりインビトロで増幅される。複製用のベクタ
ーは、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド等を含み得る。望ましいベク
ターには、対象の遺伝子の突然変異誘発用や対象の遺伝子の宿主細胞での発現用
に有効なベクターが含まれる。ＰＵＦＡ合成酵素又は相同タンパク質は、組換え
により作成された種々の細胞で発現させることが可能である。ＰＵＦＡ酵素をコ
ードするＤＮＡを発現させるためには、多くの発現系が利用可能である。ＰＵＦ
Ａ酵素をコードする天然又は合成核酸の発現は、通常、発現ベクター内のプロモ
ーター（構成プロモータ又は誘導プロモータ）にＤＮＡを機能的に連結させるこ
とにより達成される。発現ベクターとは、その転写を与える追加セグメントと機
能的に連結した、ＰＵＦＡ酵素をコードするセグメントを有する線形又は円形の
ＤＮＡ分子を意味する。そのような追加セグメントには、プロモーター及びター
ミネーター配列が含まれる。発現ベクターは、１または複数の複製起点、１又は
複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含み得る。発
現ベクターは一般にプラスミド又はウイルスＤＮＡに由来し、両方の構成要素を
含み得る。「機能的に連結した」とは、セグメントが、例えば、転写がプロモー
ターで始まりコーディングセグメントを介してターミネータまで進むというよう
に、その意図された目的と適合して機能するように配列されることを意味する。
サンブルックら、前掲を参照されたい。
【００３５】 ロングＰＣＲの技術は、大きな構築物のインビトロ増幅を可能にし、突然変異
誘発や発現シグナルの付加等の対象遺伝子の改変及び得られた構築物の増幅が、
複製用ベクター又は宿主細胞を使用しなくても完全にインビトロで起こるように
なっている。インビトロでの発現は、例えば、インビトロでの使用のために設計
された発現ベクター内に、デサチュラーゼポリペプチドに対するコーディング領
域を配置し、ウサギ網赤血球溶菌液と補因子を添加することにより達成すること
が可能である。標識アミノ酸を所望に応じて組み込み得る。そのようなインビト
ロ発現ベクターは、使用する系に必要な発現シグナルの一部又は全部を提供し得
る。上記方法は当該技術分野においてよく知られており、系の構成要素は市販さ
れている。反応混合物は、例えばＰＫＳ用酵素の活性を決定することによりＰＫ
Ｓ用酵素用に直接測定されるか、合成酵素を精製して測定し得る。
【００３６】 宿主細胞での発現は、一時的な又は安定な様式で遂行することが可能である。
一時的発現は、宿主細胞で機能する発現シグナルを含む導入構築物から起こる。
ただし、構築物が複製しなかったり宿主細胞にめったに融合しなかったりする場
合や、宿主細胞が増殖しない場合は除く。一時的発現は、対象遺伝子と機能的に
連結した調節可能なプロモーターの活性を誘導することによっても遂行すること
が可能であるが、そのような誘導システムはしばしば発現の基礎レベルが低い。
安定な発現は、宿主ゲノムに組み込み可能であるか又は宿主細胞で自律的に複製
する核酸構築物の導入により達成することが可能である。対象遺伝子の安定な発
現は、発現構築物上に位置するか発現構築物により移入された選択マーカーの使
用によって選択され、後にマーカーを発現している細胞が選択される。安定な発
現が組込みによる場合、構築物の組込みは宿主ゲノム内でランダムに起こるか、
宿主の座との標的組換えに十分な程度の宿主ゲノムとの相同性を有する領域を含
む構築物の使用によって狙いを定められる。構築物が内因性の座を標的とする場
合、転写及び翻訳調節領域の全体又は一部が該内因性の座によって与えられる。
宿主細胞での発現を達成するために、形質転換ＤＮＡは、宿主細胞で機能する転
写及び翻訳の開始及び終結調節領域と機能的に連結される。
【００３７】 転写及び翻訳開始及び終結領域は、発現すべきＤＮＡ、既知の又は所望の系で
の発現を可能にすると推測されている遺伝子、発現ベクター、化学合成を始めと
する種々の非限定的な供給源に由来する。終結領域は開始領域が得られた遺伝子
の３’領域に由来するか、異なる遺伝子に由来し得る。多数の終結領域が知られ
ており、それらは同じ及び異なる属及び種に由来する種々の宿主で満足のいくも
のであることが判明している。終結領域は、任意の特定の特性のためというより
便宜のため選択される。同じ細胞中で２以上のＰＫＳ様ＯＲＦを発現させる場合
、適切な調節領域及び発現方法を使用すべきである。導入された遺伝子は、複製
用ベクターの使用か、宿主ゲノムへの組込みにより宿主細胞で増幅される。２又
はそれより多い遺伝子が別個の複製ベクターで発現している場合、各ベクターは
異なる複製手段を有することが望ましい。導入された各構築物は、組み込まれて
いようが組み込まれていまいが、安定な発現を維持し構築物間での構成要素の再
結合を防止するために、異なる選択手段を有すると共に、他の構築物との相同性
を欠いているべきである。調節領域の賢明な選択、選択手段及び導入された構築
物の増幅方法は、導入された遺伝子がすべて所望の産物の合成を与えるのに必要
なレベルで発現されるように、実験的に決定することができる。
【００３８】 ＰＵＦＡ酵素を発現させるためには種々の原核生物発現系を使用することが可
能である。転写のためのプロモーター、リボゾーム結合部位、及び転写ターミネ
ーターを有する発現ベクターを構築することが可能である。Ｅ．ｃｏｌｉにおけ
る上記目的に適した調節領域の例は、ヤノフスキ（Yanofsky）（1984）J. Bacte
riol., 158:1018-1024に説明されたようなＥ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経
路のプロモーター及びオペレータ領域や、ハースコヴィッツ（Hersko witz）と
ハーゲン（Hagen ）（1980）Ann. Rev. Genet., 14:399-445に説明されたような
ファージラムダ（Ｐλ）の左方向プロモーターである。Ｅ．ｃｏｌｉ中で形質転
換されるＤＮＡベクターに選択マーカーを入れることも有効である。そのような
マーカーの例には、アンピシリン、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコー
ルへの耐性を明確に示す遺伝子が含まれる。細菌宿主での外来遺伝子の発現に使
用されるベクターは、一般に、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーと宿主細胞
において機能するプロモーターとを含む。細菌を形質転換するのに有効なプラス
ミドには、ｐＢＲ３２２（ボリバー（Bolivar ）ら、（1977）Gene 2:95-113 ）
、ｐＵＣプラスミド（メッシング（Messing ）（1983）Meth. Enzymol. 101:20-
77、ヴィエラ（Vieira）とメッシング（Messing ）、（1982）Gene 19:259-268
）、ｐＣＱＣ２（Queen 、前掲）、及びそれらの派生物が含まれる。プラスミド
は、ウイルスの構成要素と細菌の構成要素の両方を含んでいてもよい。生物学的
に活性な形式でタンパク質を回収する方法については、米国特許第４，９６６，
９６３号及び４，９９９，４２２号に議論されている。両特許は参照により本明
細書に組み込まれる。他の原核生物発現系の説明についてはサンブルックらの文
献を参照されたい。
【００３９】 真核生物における発現の場合、本発明の実施に使用される宿主細胞としては、
ホ乳類、鳥類、植物、昆虫類、及び菌類細胞が包含される。例として、植物の場
合、プロモーターの選択は、構成又は誘導による発現が望ましいかどうかという
ことや、植物の特定の生育段階及び／又は特定の組織においてＰＵＦＡｓを生産
することが望ましいかどうかということに一部依存する。ＯＲＦｓの発現のため
に特定の組織及び／又は生育段階を選択するという考えは、競合する基質又は特
定のＰＵＦＡの発現を許容する宿主細胞の能力によって決まり得る。米国特許第
５，４６３，１７４号、米国特許第４，９４３，６７４号、米国特許第５，１０
６，７３９号、米国特許第５，１７５，０９５号、米国特許第５，４２０，０３
４号、米国特許第５，１８８，９５８号、及び米国特許第５，５８９，３７９号
に説明されたような特定の調節配列を用いることにより、発現は、種子、葉、果
実、花及び根等の宿主植物内の特定位置に定められる。宿主細胞が酵母である場
合、特に宿主種由来の、酵母細胞で機能する転写領域と翻訳領域が与えられる。
転写開始調節領域は、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホ
グリセリン酸キナーゼ等の解糖経路の遺伝子や、酸性ホスファターゼ、ラクター
ゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼ等の調節可能な遺伝子から得られる。
構成転写又は誘導転写が望ましいかどうか、問題の読み取り枠と関連させたプロ
モーターの特定の有効性、強力なプロモーターを誘導転写を許容する異なるプロ
モーター由来の制御領域と結合させる能力、構築のし易さ等に従って、特定の状
況で多くの調節配列のうちの任意の１つを使用することが可能である。特に重要
なのは、ガラクトースの存在下で活性化されるプロモーターである。ガラクトー
スで誘導されるプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＬＡ７、及びＧＡＬ１０）は酵母に
おいて高レベルレベルかつ調節されたタンパク質の発現を得るために広く使用さ
れている（ルー（Lue ）ら、（1987）Mol. Cell. Biol.7 :3446; ジョンストン
（Johnston）、（1987）Microbiol. Rev. 51:458）。ＧＡＬプロモーターからの
転写は、ＧＡＬ４タンパク質により活性化される。ＧＡＬ４タンパク質はガラク
トースが存在する場合にプロモーター領域に結合し、転写を活性化させる。ガラ
クトースが存在しない場合、アンタゴニストＧＡＬ８０がＧＡＬ４に結合し、Ｇ
ＡＬ４による転写の活性化を防止する。ガラクトースの添加により、ＧＡＬ８０
によるＧＡＬ４の活性化抑制が防止される。好ましくは、終結領域は酵母遺伝子
、特にサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセ
ス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）
又はクルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。２つのホ乳
類遺伝子の３’領域、つまりγインターフェロンとα２インターフェロンも酵母
で機能することが知られている。
【００４０】 翻訳開始コドンＡＴＧを包囲するヌクレオチド配列が酵母細胞での発現に影響
を及ぼすことがわかっている。所望のポリペプチドが酵母で少量しか発現してい
ない場合、内因性遺伝子のヌクレオチド配列を、最良の遺伝子発現を得るのに有
効な酵母翻訳開始を含むように改変することが可能である。配列サッカロマイセ
スでの発現の場合、それは、発現が有効でない遺伝子をフレーム内で内因性サッ
カロマイセス遺伝子（好ましくはラクターゼ遺伝子のように高度に発現する遺伝
子）と融合させることにより、該発現が有効でない遺伝子の部位特異的突然変異
誘発により行うことができる。
【００４１】 植物細胞細胞質でのＰＫＳ様遺伝子の代替方法は、葉緑体を酵素の標的にする
方法がある。葉緑体をタンパク質の標的にする１方法は、タンパク質のＮ末端に
取り付けられたリーダーペプチドを必要とする。一般的に使用されているリーダ
ーペプチドは、植物リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニット
に由来するものである。他の葉緑体タンパク質に由来するリーダー配列も使用す
ることが可能である。葉緑体をタンパク質の標的にする他の方法は、葉緑体ゲノ
ムの形質転換である（レシピエント細胞の外来ＤＮＡで被覆された高速タングス
テンミクロ投射物との衝撃を用いたクラミドモナス ラインハーティ（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｏｍｏｎａｓｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（緑藻の１つ）の葉緑体の安
定な形質転換が説明されている。例えば、ブラウワーズ（Blowers ）ら、Plant
Cell（1989）1:123-132 及びデバキー（Debuchy ）ら、EMBO J（1989）8:2803-2
809 を参照されたい。）タングステンミクロ投射物を用いた形質転換技術はクラ
イン（Kline ）ら、Nature（ロンドン）（1987）327:70-73 ）に説明されている
。葉緑体の形質転換の最も一般的な方法は微粒子銃技術の使用に関するが、この
目的で開発された他の技術も使用することが可能である。外来遺伝子産物を葉緑
体（シリアー（Shrier）ら、EMBO J. （1985）4:25-32 ）又はミトコンドリア（
mitochnodria）（ボウトリ（Boutry）ら、前掲）へ狙いを定めて入れる方法が説
明されている。核内遺伝子産物を葉緑体内に転位するための運搬ペプチドの利用
についてのトマイ（Tomai ）ら、Gen. Biol. Chem.（1988）263:15105-15109 及
び米国特許第４，９４０，８３５も参照されたい。タンパク質の輸送を葉緑体に
向ける方法はケナウフ（Kenauf）TIBTECH （1987）5:40-47 に概説されている。
【００４２】 ＰＵＦＡｓを鳥類種及び鳥類の細胞で生産する場合、遺伝子の移行は当該技術
分野において周知の手順に従って細胞ＰＵＦＡ酵素をコードする核酸配列を導入
することにより行われる。トランスジェニック動物が望ましい場合、多能性の胚
性幹細胞に導入遺伝子をコードするＰＵＦＡ酵素を備えたベクターを与え、成動
物中で生育することができる（米国特許第５，１６２，２１５号；オノ（Ono ）
ら、（1996）Comparative Biochemistry and Physiology A 113 (3 ):287-292
；ＷＯ第９６１２７９３号；ＷＯ第９６０６１６０号）。大半の場合、導入遺伝
子はＰＵＦＡｓの生産を増大させるべく高レベルのＰＫＳ様酵素を発現するよう
に改変される。導入遺伝子は、例えば、特定組織や卵黄のような卵の一部におけ
る発現を指向するプロモーターのように、鳥類細胞で機能する転写調節領域及び
／又は翻訳調節領域を与えることにより改変することができる。遺伝子調節領域
はニワトリ貧血ウイルス又は鳥類白血病ウイルス又はニワトリ卵白アルブミン等
の鳥類遺伝子を始めとする種々の供給源より得ることができる。
【００４３】 昆虫細胞におけるＰＵＦＡｓの生産は、ＰＫＳ様移行遺伝子を入れたバキュロ
ウイルス発現ベクターの使用により行うことが可能である。バキュロウイルス発
現ベクターは、クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）等のいくつかの市販先から
入手可能である。デサチュラーゼ導入遺伝子を有し該遺伝子を発現する海洋藻類
等の藻類のハイブリッド及びトランスジェニック株を生産する方法も提供される
。例えば、トランスジェニック海洋藻類は、米国特許第５，４２６，０４０号に
説明されているように調製することが可能である。上述した他の発現系に関して
、タイミング、発現の程度及びデサチュラーゼ導入遺伝子の活性は、ポリペプチ
ドコーディング配列を特定用途のために選択された適切な転写調節領域及び翻訳
調節領域と適合させることにより調節することが可能である。特に重要なのは、
予め選択した成長条件下で誘導可能なプロモーター領域である。例えば、デサチ
ュラーゼ導入遺伝子コーディング配列、その調節領域、及び／又は細胞ゲノムへ
の、温度感受性突然変異及び／又は代謝産物応答性突然変異の導入が上記目的に
使用され得る。
【００４４】 形質転換した宿主細胞は、所望の最終結果に適合された適切な条件下で成育す
る。宿主細胞を培養物中で成育する場合、ＰＵＦＡｓの最も多い収率か最も経済
的な収率が得られるように条件は最適下され、これには選択デサチュラーゼ活性
に関連する。最適化し得る培地条件には、炭素源、窒素源、基質の添加、添加し
た基質の最終濃度、添加した基質の形、好気性又は嫌気性培養、成育温度、誘導
剤、誘導温度、誘導時の成育時期、採取時の成育時期、ｐＨ、密度、及び選択の
メンテナンスが包含される。例えば、酵母等の微生物は、好ましくは、酵母ペプ
トンブロス（ＹＰＤ）と最小培地（アミノ酸、酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム
を含むが、例えばウラシル等の自由選択の成分を欠いている）とを含む問題の選
択培地を用いて成育される。好ましくは、添加する予定の基質は、最初にエタノ
ールに溶解される。必要な場合、例えばＧＡＬプロモーターから発現を誘導すべ
くガラクトースを含むか添加することにより、問題のポリペプチドの発現が誘導
され得る。
【００４５】 ＰＫＳ様遺伝子システムからＰＵＦＡを発現する宿主細胞において、ＰＫＳ様
遺伝子ポリペプチドの発現の増大が望まれる場合、いくつかの方法を使用するこ
とができる。ＰＫＳ様遺伝子ポリペプチドをコードするさらなる遺伝子を宿主生
物に導入することが可能である。天然ＰＫＳ様遺伝子座からの発現も、例えばよ
り強力なプロモーターを宿主ゲノムに挿入して発現を増大させたり、不安定化配
列を宿主ゲノムからその情報を削除することによりｍＲＮＡ又はコードされたタ
ンパク質から除去したり、又は安定化配列をｍＲＮＡに加えたり（米国特許第４
，９１０，１４１号及び米国特許第５，５００，３６５号を参照）することによ
り、相同的組換えを介して増大させることができる。従って、対象の宿主は、少
なくとも１つの発現構築物のコピーを有し、遺伝子をゲノムに組込んで増幅させ
るか、又は複数のコピー数を有する染色体外の構成要素上に存在するかによって
２つかそれ以上の発現構築物のコピーを有する場合もある。対象の宿主が酵母で
ある場合、４つの主なタイプの酵母プラスミドベクターを使用することができる
。すなわち、酵母組込プラスミド（Ｙｅａｓｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｐｌ
ａｓｍｉｄｓ）（ＹＩｐｓ）、酵母複製プラスミド（Ｙｅａｓｔ Ｒｅｐｌｉｃ
ａｔｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＲｐｓ）、酵母動原体プラスミド（Ｙｅａ
ｓｔ Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＣｐｓ）、及び酵母エピ
ソームプラスミド（Ｙｅａｓｔ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＥ
ｐｓ）である。ＹＩｐｓは酵母複製起点を欠いており、酵母ゲノムの組込要素と
して増殖しなければならない。ＹＲｐｓは染色体に由来する自律性複製配列及び
であり、プラスミドを自律的に複製し、不安定に分離する中程度のコピー数（２
０から４０）として増殖する。ＹＣｐｓは複製開始点も動原体配列も有し、プラ
スミドを自律的に複製し、安定に分離する低い程度のコピー数（１０から２０）
として増殖する。ＹＥｐｓは酵母２μｍプラスミド由来の複製起点を有し、プラ
スミドを自律的に複製し不規則に分離する高い程度のコピー数として増殖する。
酵母におけるプラスミドの存在は、プラスミド上のマーカーに対する選択を維持
することにより確かめられる。特に重要なのは、酵母ベクターｐＹＥＳ２（ウラ
シルプロトトロピー及び発現用ＧＡＬ１ガラクトース誘導プロモーターを与える
インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社から入手可能なプラスミド。）及
びｐＹＸ４２４（構成ＴＰ１プロモーターを有し、ロイシンプロトトロピーを与
えるＹＥｐプラスミド。アルバー（Alber ）とカワサキ（K awasaki）（1982）
J. Mel. & Appl. Genetics 1:419 ）である。
【００４６】 宿主細胞の選択は、トランスジェニック細胞の所望のＰＵＦＡプロファイル及
び宿主細胞の天然プロファイルによって一部左右される。宿主細胞が１つのＰＵ
ＦＡに対するＰＫＳ様遺伝子活性を発現している場合であっても、他のＰＫＳ様
システムのＰＫＳ様遺伝子の発現を、宿主細胞によって生産されない新規なＰＵ
ＦＡの生産のために与えることも可能である。ＰＫＳ様遺伝子活性の発現を異な
るＰＵＦＡを生産する生物のＯＲＦ８ ＰＫＳ様遺伝子の発現と結びつけた特定
の例では、宿主細胞はＯＲＦ８に対する低いＰＫＳ様遺伝子活性を天然状態で有
しているか又は変異により有することになることが好ましい。例として、ＥＰＡ
の生産の場合、使用するＤＮＡ配列は、ＥＰＡを生産する生物のＰＫＳ様遺伝子
活性を有するポリペプチドをコードするが、他方、ＤＨＡの生産の場合、使用す
るＤＮＡ配列は、ＤＨＡを生産する生物に由来するＤＮＡ配列である。すでにＰ
ＫＳ様遺伝子活性を発現している宿主細胞で使用する場合、所望のＰＫＳ様遺伝
子を単独か又はアンチセンス又は相互抑制効果等の既存のＰＫＳ様システムの既
存のＯＲＦの活性をダウンレギュレートする構築物と共に過剰発現する、発現カ
セットを使用することが必要である。同様に、ＰＫＳ様システムを用いて同じか
異なるＰＵＦＡｓを生産する別個の生物に由来するＯＲＦｓを組み合わせを使用
することが可能である。例えば、ＶｉｂｒｉｏのＯＲＦ８は、Ｓｈｅｗａｎｅｌ
ｌａのＯＲＦ８と結合するとＥＰＡを生じるＯＲＦ３、６、７及び９がＳｈｅｗ
ａｎｅｌｌａのものであっても、宿主細胞でのＤＨＡの発現を指向する。従って
、エイコサペンタエン酸の生産（ＥＰＡ）の場合、使用される発現カセットは、
一般に、海洋細菌Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（ＥＰＡの
生産用）又はＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ（ＤＨＡ生産用）等のＰＵＦＡ生産
生物に由来するＯＲＦ３、６、７、８及び９を含む１または複数のカセットから
成る。ＯＲＦ８はＤＨＡ生産を誘導するために使用することが可能であり、Ｖｉ
ｂｒｉｏのＯＲＦ８はＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦｓ３、６、７及び９と共に
使用することが可能である。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ遺伝子クラスタで同定された
ＯＲＦｓの構成及び番号付けスキームを図１Ａに示す。本研究において言及した
いくつかのサブクローンのマップを図１Ｂに示す。ＰＫＳ用遺伝子ポリペプチド
の発現の場合、宿主細胞で機能する転写及び翻訳開始及び終結領域は、ＰＫＳ様
遺伝子ポリペプチドをコードするＤＮＡと機能的に連結される。
【００４７】 問題のＰＫＳ様ＯＲＦを含む構築物は、宿主細胞の種類に一部依存して、種々
の任意の標準的方法により宿主細胞に導入することができる。そのような方法に
は、形質移入、感染、ボリスティック（bolistic）衝撃、電気穿孔法、マイクロ
インジェクション、引っ掻き（scraping）、又は対象の遺伝子を宿主細胞に導入
する他の任意の方法（米国特許第４，７４３，５４８号、米国特許第４，７９５
，８５５号、米国特許第５，０６８，１９３号、米国特許第５，１８８，９５８
号、米国特許第５，４６３，１７４号、米国特許第５，５６５，３４６号及び米
国特許第５，５６５，３４７号を参照）が含まれる。使用される形質転換法には
、酢酸リチウム形質転換（Methods in Enzymology 、（1991）194:186-187 ）が
含まれる。便宜のため、ＤＮＡ配列又は構築物を持つように任意の方法により操
作された宿主細胞のことを、本明細書では「形質転換」又は「組換え」と称され
る。対象の宿主は、少なくとも１つの発現構築物のコピーを有し、遺伝子がゲノ
ムに組込まれて増幅されるか、又は複数のコピー数を有する染色体外の構成要素
上に存在するかによって２つかそれ以上の発現構築物のコピーを有する場合もあ
る。
【００４８】 ＰＵＦＡｓの生産の場合、宿主細胞によるが、ｐＥＰＡ、ＯＲＦ３、６、７、
８及び９によって生産されるいくつかのポリペプチドが、個々の発現構築物とし
て導入されるか、又は宿主細胞に個別に導入されるか同時形質転換される２又は
それより多くのカセットに結合される。標準的な形質転換プロトコルが使用され
る。植物の場合、ＰＵＦＡ合成に必要なすべてのＰＫＳ様遺伝子よりも少ないＰ
ＫＳ様遺伝子が１つの植物に挿入され、１又は複数の補足遺伝子を含む植物が、
所望のＰＵＦＡを合成するためのＰＫＳ様遺伝子の完全な補足遺伝子を含む植物
を得るために交雑される。
【００４９】 ＰＫＳ様媒介性のＰＵＦＡｓの生産は、原核生物の宿主細胞でも真核生物の宿
主細胞でもいずれでも行うことができる。細胞は動物を始めとする宿主生物の一
部又は全体として培養又は作成することが可能である。ウイルス及びバクテリオ
ファージも、特に遺伝子移入、細胞のターゲティング及び細胞の選択用に、ＰＵ
ＦＡｓの生産に適した細胞と共に使用することが可能である。双子葉植物、単子
葉植物、及び穀類を始めとする任意の種類の植物細胞を宿主細胞用に使用するこ
とができる。特に重要なのはアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、シロイヌナズナ（
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ダイズ、トウモロコシ等の収穫植物である。対象の
原核生物の細胞には、大腸菌属（）、バチルス属（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ）、ラク
トバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ）、シアノバクテリア属（ｃｙａ
ｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）等が含まれる。真核生物の細胞には、植物細胞、授乳し
ている動物の細胞等のホ乳類細胞、ニワトリ等の鳥類の細胞、及び昆虫細胞、菌
類細胞及び藻類細胞等の遺伝子操作を受けやすい他の細胞が含まれる。宿主動物
の例には、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、ウシ、ヒツジ
、ブタ、ヤギ、ヤク等、の、遺伝子操作と導入遺伝子発現密度を急速に拡大する
クローニングとを受けやすい動物が含まれる。動物の場合、遺伝子調節領域の改
変により、ＰＫＳ様導入遺伝子は標的の細胞小器官、組織及び体液にて発現する
ように適合させることが可能である。特に重要なのは、宿主動物の母乳でのＰＵ
ＦＡｓの生産である。
【００５０】 宿主微生物の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、カンジダ属やク
ルベロマイセス属等の他の酵母、又は例えば、コウジカビ属、アカパンカビ、ア
オカビ属等の糸状菌類が含まれる。宿主微生物の望ましい特性には、例えば、遺
伝学的に十分に特徴付けられているものや、超高密度発酵を用いた高レベル産物
の発現に使用することができるものや、提唱最終産物がヒトによって消化される
よう意図されているためＧＲＡＳ（ＦＤＡにより一般に安全と認められる表示）
リストにのっているものが含まれる。特に重要なのは、本発明の細胞宿主として
の、酵母、詳細にはパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。特に重要な
株は、ＳＣ３３４（Ｍａｔ α ｐｅｐ４−３ ｐｒｂｌ−１１２２ ｕｒａ３
−５２ ｌｅｕ２−３、１１２ｒｅｇｌ−５０１ ｇａｌｌ；（ホフランド（Ho
vland ）ら（1989）Gene 83:57-64 ）；ＢＪ１９９５（Yeast Genetic Stock Ce
ntre, 1021 Douner Laboratory, カリフォルニア州バークレー（Berkeley）,947
20）、ＩＮＶＳＣ１（Ｍａｔ α ｈｉｗ３Δ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１−２８９
ｕｒａ３−５２（Invitrogen, 1600 Faraday Ave.,カリフォルニア州カールズ
バッド（Carlsbad）,92008）及びＩＮＶＳＣ２（Ｍａｔ α ｈｉｓΔ２００
ｕｒａ３−１６７；（Invitrogen）である。細菌細胞も宿主細胞として使用する
ことが可能である。そのようなものとしては、Ｅ．ｃｏｌｉが含まれ、これは発
酵プロセスに有効であり得る。代わりに、ラクトバチルスの種等の宿主をＰＫＳ
様経路の産物をヨーグルト等の製品に導入するための宿主として使用することも
可能である。
【００５１】 形質転換宿主細胞は、導入構築物に含まれるマーカーに関する選択により同定
することができる。代わりに、多くの形質転換技術が宿主細胞に複数のＤＮＡ分
子を導入するため、別のマーカー構築物を所望の構築物に導入することもできる
。一般に、形質転換宿主は、選択培地で成長できるその能力により選択される。
選択培地は、抗生物質を含有してもよいし、形質転換されていない宿主の成長に
必要な栄養素又は成長因子等の因子を欠いていてもよい。その結果、導入された
マーカー遺伝子は、抗生物質耐性を与えるか、必須の成長因子又は酵素をコード
し、形質転換宿主細胞で発現された場合に選択培地での成長を許容する好ましく
は、カナマイシン耐性及びアミノ配糖体Ｇ４１８が特に重要である（米国特許第
５，０３４，３２２号を参照）。酵母の形質転換体の場合、ウラシル、ロイシン
、リジン又はトリプトファンを欠いた培地で成長できる能力等の、酵母で機能す
る任意のマーカーを使用することが可能である。
【００５２】 形質転換宿主の選択は、発現したマーカータンパク質が直接又は間接的に検出
された場合に起こる。マーカータンパク質は、単独で発現させてもよいし、他の
タンパク質に対する融合タンパク質として発現させてもよい。マーカータンパク
質はその酵素活性によって検出されるタンパク質であり得る。例えば、β−ガラ
クトシダーゼは、Ｘ−ｇａｌ基質を着色生成物に変えることができ、ルシフェラ
ーゼはルシフェリンを発光生成物に変えることができる。マーカータンパク質は
、その光生成特性又は改変特性により検出されるタンパク質であり得る。例えば
、Aequorea victoria の緑色蛍光タンパク質は青色光で照射したときに蛍光を発
する。マーカータンパク質又は例えば問題のタンパク質上の分子タグを検出する
ために、抗体を使用することが可能である。マーカータンパク質又はタグを発現
する細胞は、例えば、視覚により、又はＦＡＣＳや抗体を用いたパニング等の方
法により、選択することができる。
【００５３】 主題の方法を用いて生産されたＰＵＦＡｓ及び組成物は、宿主植物組織及び／
又は植物の一部において、遊離脂肪酸として、及び／又はアシルグリセロール、
リン脂質、硫脂質又は糖脂質等の共役体として見出され、種々の当該技術分野に
おいて周知の手段によって宿主細胞から抽出することができる。そのような手段
には、有機溶媒による抽出、超音波処理、（例えば二酸化炭素を用いた）超臨界
流体抽出、圧力等の物理的手段又はそれらの組み合わせが含まれる。特に重要な
のはメタノール及びクロロホルムによる抽出である。適切な場合、水層を酸性化
して、負に帯電した部分に陽子を加え、それによって有機層への所望の産物の分
配を増大させてもよい。抽出後、有機溶媒は窒素流下で蒸発によって除去するこ
とができる。共役体で単離された場合、遊離脂肪酸又は複合度の低い対象共役物
を放出するように、生成物は酵素的又は化学的に解裂され、所望の最終産物を生
成するようにさらに操作を受ける。好ましくは、脂肪酸の共役型は、水酸化カリ
ウムによって解裂する。
【００５４】 精製がさらに必要な場合、標準的な方法を使用することができる。そのような
方法には、抽出、尿素処理、分別晶出、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマ
トグラフィ、高速遠心又は蒸留、又はそのような技術の組み合わせが含まれる。
酸の基又はアルケニル基のような反応基の保護は、例えばアルキル化又はヨード
化等の既知の技術により、任意のステップで行うことができる。使用される方法
には、メチルエステルを生成するための脂肪酸のメチル化が含まれる。同様に、
保護基は任意のステップで除去してよい。好ましくは、ＤＨＡ及びＥＰＡを含む
画分の精製が、尿素処理及び／又は分別蒸留により達成される。
【００５５】 主題の発明の使用方法はいくつか存在する。本発明のＤＮＡに基づくプローブ
は、関連分子の単離方法や又はＰＫＳ様遺伝子を発現している生物の検出方法に
使用される。プローブとして使用された場合、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドは
検出される必要がある。これは通常、（例えば修飾残基の組込により）内側部位
に標識を取り付けるか５’又は３’末端に標識を取り付けるかにより達成される
。そのような標識は、直接検出されるか、検出可能に標識された二次分子と結合
するか、非標識二次分子と検出可能に標識された三次分子と結合する。このプロ
セスは、容認できないバックグラウンドシグナルレベルのない十分に検出可能な
シグナルが達成されるように、実現可能な限りで延長することができる。二次シ
ステム、三次システム、又は架橋システムは、任意の他の分子（標識又は他の抗
体）に対する抗体の使用を含むか、互いに結合する任意の分子（例えばビオチン
とストレプトアビジン／アビジンシステム）を含む。検出可能な標識には、通常
、放射性同位元素、化学的又は酵素的に光を発生するか光を変化させる分子、検
出可能な反応生成物を生成する酵素、磁気分子、蛍光分子、又は蛍光又は発光特
性が結合のときに変化する分子が含まれる。標識方法の例は、米国特許第５，０
１１，７７０号に見出される。代わりに、標的分子の結合は、等温滴定熱量計に
よりプローブがターゲットに結合したときの熱の変化を測定するか、又はプロー
ブ又はターゲットをある表面にコーティングすることにより直接検出することが
でき、ターゲット又はプローブの結合によって生じる該表面からの光の散乱の変
化の検出は、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにより行われる。
【００５６】 組換え手段によって生産されたＰＵＦＡｓには、様々な分野での用途が見出さ
れる。ヒト又は動物の種々の形式でのＰＵＦＡｓの補充は、添加したＰＵＦＡｓ
のレベルを増大させるだけでなく、代謝後続産物のレベルも増大させる。複雑な
調節機構は、望ましい種々のＰＵＦＡｓを結合や、又は異なるＰＵＦＡｓの共役
体の添加を可能にし、そのような機構が固体における特定のＰＵＦＡｓの所望レ
ベルを達成するのを防止したり、抑制したり、又は克服したりする。本件の場合
、ＰＫＳ様遺伝子又はアンチセンスＰＫＳ様遺伝子転写物の発現が、植物の一部
及び／又は植物組織に見出される特定のＰＵＦＡｓのレベル又はその誘導体のレ
ベルを変え得る。ＰＫＳ様遺伝子ポリペプチドのコーディング領域は、所望のＰ
ＵＦＡｓを高い割合で含むか又は非修飾組織及び／又は植物の一部よりもヒト母
乳の組成に非常に類似したＰＵＦＡ組成物（プリエト（Prieto）ら、ＰＣＴ国際
出願公開公報ＷＯ第９５／２４４９４号）を含む組織及び／又は植物の一部を作
成するために、単独で又は他の遺伝子と共に発現される。
【００５７】 開示した方法によって作成されたＰＵＦＡｓ又はその誘導体は、静脈栄養を受
けている患者に対する栄養補助食品として、又は栄養不良を予防又は治療するた
めの栄養補助食品として使用することができる。栄養補助食品用に、ＰＵＦＡｓ
又はその誘導体は通常の使用の際に受容者が所望量のＰＵＦＡを受け取れるよう
に調製された料理油、脂肪又はマーガリンに組み込まれる。ＰＵＦＡｓは、幼児
用調合乳、栄養補助職人又は他の食物製品にも組み込むことができ、抗炎症剤コ
レステロール低下剤として使用される。
【００５８】 ＥＰＡ等の特定の脂肪酸は、ヒト母乳のＰＵＦＡ組成をより良好に複製すべく
幼児用調合乳の組成を変えるために使用することができる。ヒトの乳中の優勢な
トリグリセリドは、１，３−ジ−オレオイル−２−パルミトイルであると報告さ
れており、２−パルミトイルグリセリドは２−オレオイル又は２−リネオイルグ
リセリドよりもよく吸収されることが報告されている（米国特許第４，８７６，
１０７号を参照のこと）。一般に、ヒト母乳はＤＨＡとして約０．１５％から約
０．３６％、ＥＰＡとして約０．０３％から約０．１３％、ＡＲＡとして約０．
３０％から約０．８８％、ＤＧＬＡとして約０．２２％から約０．６７％、及び
ＧＬＡとして約０．２７％から約１．０４％を含む脂肪酸プロファイルを有する
。幼児用調合乳のＧＬＡ：ＤＧＬＡ：ＡＲＡの好ましい比は、それぞれ約１：１
：４から約１：１：１である。ＰＵＦＡのそのような比を与える油の量は、当業
者による過度の実験を伴わずに決定することができる。ＰＵＦＡｓ又はそれを含
む宿主細胞も、動物組織又は乳中の脂肪酸組成をよりヒト又は動物の消費用に望
ましい組成に変えるための動物の栄養補助食品として使用することができる。
【００５９】 医薬として使用する場合（ヒト又は家畜において）、組成物は一般に経口投与
されるが、例えば、腸管外（すなわち皮下、筋内又は静脈内）、直腸又は膣内又
は局所（例えば皮膚の軟膏又はローションとして）等の、組成物の吸収がうまく
いく任意の経路により投与することができる。利用可能な場合、ゼラチンカプセ
ルは経口投与の好ましい形式である。上述した栄養補助食品も経口投与経路を与
え得る。本発明の不飽和酸は、共役型で、又は塩、エステル、アミド、若しくは
脂肪酸のプロドラッグとして投与することができる。医薬として許容される任意
の塩が本発明に包含される。特に好ましいのは、ナトリウム塩、カリウム塩、又
は、リチウム塩である。ＰＣＴ国際出願出願公開第ＷＯ９６／３３１５５号に説
明されたＮ−メチルグルカミンのようなＮ−アルキルポリヒドロキサミンの塩も
包含される。好ましいエステルはエチルエステルである。
【００６０】 本発明のＰＵＦＡｓは、単独で投与することも、医薬として許容されるキャリ
ア又は賦形剤と共に投与することもできる。固体の塩として、ＰＵＦＡｓは錠剤
の形で投与することもできる。静脈内投与の場合、ＰＵＦＡｓ又はその誘導体は
Intralipids のような市販の製剤に組み込むことができる。望ましい場合、１又
は複数の用途のために、製剤の個々の成分はキットの形式で与えられる。特定の
脂肪酸の一般的投与量は、一日０．１ｍｇ〜２０ｇ又は１００ｇまででさえあり
、好ましくは一日必要量として１０ｍｇ〜１、２、５又は１０ｇ、又はその誘導
体型のモル等量である。トリグリセリドとして計算して約２から約３０重量パー
セントの脂肪酸を含む腸管外栄養組成物は本発明に包含される。他のビタミン、
特にビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＬ−カルニチン等の脂溶性ビタミンを任意に含むこ
とができる。望ましい場合、トコフェロール等の保存料が一般に約０．１重量％
加えられる。 以下、実施例を、制限ではなく例示として示す。
【００６１】 （実施例） （実施例１） Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ由来のＯＲＦｓの同定 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（Ｓｐ ＯＲＦ６）のＯＲＦ６配列に基づくプライマー
（Ｖｉｂｒｉｏ及びＳＳ９の各々に対する前方５’プライマーＣＵＡＣＵＡＣＵ
ＡＣＵＡＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＡＡＣＣＧＴＧ（配列番号４１）及
びＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＡＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＧ（配列
番号４２）、並びにＶｉｂｒｉｏ及びＳＳ９に対する３’後方プライマー：ＣＡ
ＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＣＧＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣ
（配列番号４３）と、ＥＰＡを生産するＶｉｂｒｉｏ及びｂａｒｏｐｈｙｌｌｉ
ｃ ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒ由来のゲノムＤＮＡ鋳型（バートレット（Bartlett
）博士、ＵＣサンディエゴ（San Diego ）より供与）とを用いたポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、相同なアミノ酸を直接数えることにより決定した
Ｓｐ ＯＲＦ６（図２５を参照）の対応断片に対して７５％よりも高い相同性を
示す、Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ（Ｖｉｂｒｉｏ）に対する約４００塩基対
のＰＣＲ産物と、及びＳＳ９に対する約９００塩基対のＰＣＲ産物とを得た。
【００６２】 次にＶｉｂｒｉｏコスミドライブラリを調製し、Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ６ Ｐ
ＣＲ産物をプローブとして利用して（図２６を参照）、少なくともＯＲＦ６を含
むクローンをコロニーハイブリダイゼイションにより選択した。
【００６３】 コスミド９番及びコスミド２１番等の選択コスミドのさらなる配列により、Ｏ
ＲＦｓ６−９と相同で、（ＯＲＦ６９）ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦｓ６−９
と同じ配列順序に編成されたＯＲＦｓを備えたＶｉｂｒｉｏクラスタ（図５）を
得た（図７）。この配列に由来するＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦｓは、１７３９４から
３６１１５の位置にあることがわかり、ＯＲＦ６−９を包含している。
【００６４】 表 Ｖｉｂｒｉｏオペロンの形態 １７３９４から２５３４９ 長さ＝７９５６ヌクレオチド ２５５０９から２８１５７ 長さ＝２６４９ヌクレオチド ２８２０９から３４２６２ 長さ＝６０５４ヌクレオチド ３４４５４から３６１１５ 長さ＝１６６２ヌクレオチド
【００６５】 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ遺伝子に対するＯＲＦの名称は、図４に開示した名称に
基づいており、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａクラスタ（ヤザワ（Yazawa）ら、米国特許
第５，６８３，８９８号）に対して公表された名称とは異なっている。例えば、
ヤザワらの米国特許第５，６８３，８９８号と比較すると、図４のＯＲＦ３は他
のＯＲＦｓから逆方向に読まれ、ヤザワ（Yazawa）らの米国特許第５，６８３，
８９８号（図２４参照）には開示されていない。
【００６６】 ＯＲＦ３と相同な配列は、ＯＲＦ６（ＯＲＦ６の上流の１７０００塩基）又は
ＯＲＦ９（ＯＲＦ９の下流の約４０００塩基）の付近では見出されなかった。リ
ン酸パンテテニルトランスフェラーゼに特徴的なモチーフ（ランバロット（Lamb
alot）ら（1996）Current Biology 3:923-936 ）は、そのようなモチーフを求め
てスクリーニングしたＶｉｂｒｉｏ配列では欠けていた。さらに、Ｖｉｂｒｉｏ
及びＳＣ２Ａ Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（サンディエゴ大学より供与された、やは
りＥＰＡを生産可能な別の細菌）のゲノム消化物ではＳｐ ＯＲＦ３に由来する
プローブとマッチするものはなかった。ＯＲＦ３はＶｉｂｒｉｏに存在し得るが
、そのＤＮＡＳｐ ＯＲＦ３のＤＮＡと相同ではなく、及び／又は配列決定され
ていないゲノムの部分に位置する可能性がある。
【００６７】 図６は、ＯＲＦｓ６−９を含む約１９ｋｂ Ｖｉｂｒｉｏクローンの配列を含
む。図７及び８は、Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ
ｐｕｔｒｅｆａｃｉａｎｓの ＰＫＳ様系の遺伝子クラスタ編成を比較したもの
である。図９から１２は、対応するＯＲＦｓ６、７、８及び９それぞれの間の配
列の相同性のレベルを示す。
【００６８】 （実施例２） ＯＲＦ８のＤＨＡ生産への指向 実施例１に説明したように、Ｓｐ ＯＲＦ６と相同なＤＮＡが、関係のない種
であるＳＳ９Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒで見つかった。ＳＳ９ Ｐｈｏｔｏｂａｃ
ｔｅｒもＥＰＡを生産することができる。その上、Ｓｐ ＯＲＦ６−９と相同な
ＯＲＦｓがＤＨＡ生産Ｖｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ（Ｖｉｂｒｉｏ）で見出され
た。そのようなＯＲＦｓから、Ｅ．ｃｏｌｉでのＥＰＡ合成を抑制するＳｐ Ｏ
ＲＦ６−９の各々の欠失（ヤザワ（Yazawa）（1996）前掲）を遺伝子Ｖｉｂｒｉ
ｏ由来の対応する相同な遺伝子によって補足した、一連の実験を設計した。
【００６９】 任意のＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦｓ６−９がＤＨＡの生産に寄与しているかどうか
を決定するためにＳｐ ＥＰＡクラスタを使用した。各Ｓｐ ＯＲＦｓに対して
与えた欠失突然変異は、ＥＰＡ及びＤＨＡの無効である。各欠失はｌａｃプロモ
ーター（図１３）の後方で発現された対応Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦによって補足し
た。
【００７０】 Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ６によるＳｐ ＯＲＦ６欠失の補足により、ＥＰＡの生
産を復活した。同様な結果が、Ｓｐ ＯＲＦ７及びＯＲＦ９欠失の補足によって
も得られた。対照的に、Ｓｐ ＯＲＦ８欠失の補足では、Ｃ２２：６が生産され
た。従って、Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ８はＤＨＡの合成の重要な要素であると考え
られる。図１４及び１５はＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦ６に関するＳｐ ｄｅｌ ＯＲ
Ｆ６の補足（ＥＰＡ有り、ＤＨＡ無し）とＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦ８に関するＳｐ
ｄｅｌ ＯＲＦ８（ＤＨＡ有り）の補足による脂肪酸プロファイルのクロマト
グラムを示す。図１６はＯＲＦ８補足に対する脂肪酸パーセントを示し、ここで
も、ＯＲＦ８がＤＨＡの生産に寄与していることが明らかである。
【００７１】 以上のデータは関連する又は類似のＯＲＦｓを有するポリケチド様合成遺伝子
が異種系で結合及び発現され、宿主系で異なるＰＵＦＡ種を生産するために使用
できることを示すと共に、ＯＲＦ８が最終的な鎖長の決定に役割を果たしている
ことを示す。Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦｓ６、７、８、及び９はＥＰＡ合成を復元す
る。ＶｉｂｒｉｏＯＲＦ８の場合、ＥＰＡ（約０．６％）と共にＤＨＡ（約０．
７％）も存在し、該遺伝子が上記系に関してＤＨＡ対ＥＰＡの合成を指向するの
に重要な役割を果たしていることを示す。
【００７２】 （実施例３） ＤＨＡの生産のための要件 クラスタＯＲＦ６−９のＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦｓがどのようにＶｉｂｒｉｏ
ＯＲＦ８と組み合わせて使用されるかを決定するために、又は他のＶｉｂｒｉｏ
ＯＲＦｓ６−９クラスターの一部又は全部とＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦ８とのいく
つかの組み合わせを形成し、ＤＨＡの合成を説明した。
【００７３】 Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ６−９はＳｐ ＯＲＦ３によって補われた。この補足の
結果を図１６ｂ及び１６ｃに示す。測定したＤＨＡがかなりの量（約９％よりも
大きい）であり、ＥＰＡが存在しないことは、Ｓｐ ＯＲＦ３と組み合わせると
ＤＨＡの合成にＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦｓ６−９以外のＯＲＦｓが必要ではないこ
とを示唆している。このことは、Ｓｐ ＯＲＦ３が細菌ＰＵＦＡｓの合成に一般
的な機能を果たしていることを示唆している。
【００７４】 ＤＨＡ対ＥＰＡの生産に関して、特にＤＨＡを生産するためにＶｉｂｒｉｏ
ＯＲＦ８を６−９クラスタの他のＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦｓと組み合わせることが
必要である可能性がある。Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ９及びＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦｓ
（６、８）、（７、８）、（８、９）等の各組み合わせのＤＨＡ合成における役
割は現在研究中である。
【００７５】 （実施例４） 植物発現構築物 長い断片のクローニングと及びそれらの後の操作を容易にするために、制限部
位の非常に少ないクローニングベクターを作成した。オリゴヌクレオチドを配列
ＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴ（配列番号４４）及びＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣ
ＴＴＡＧＣＴ（配列番号４５）とアニーリングすることによりアダプタを組み立
てた。制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７８及びＳｓｔＩによりベクターpBluescr
ipt II SK+（Stratagene）を消化した後、このアダプタをベクターにライゲート
した。得られたベクターであるｐＣＧＮ７７６９は、平滑末端ＤＮＡ断片のクロ
ーニングのための一つのＳｒｆＩクローニング部位を有し（及びＳｍａＩを埋設
し）ていた。
【００７６】 ｐＣＧＮ３２２３由来のナピン（napin ）カセットを有するプラスミド（米国
特許第５、６３９、７９０号）を、複数の制限部位を有する長いＤＮＡ断片のク
ローニングに有効にすると共に複数のナピン融合遺伝子の植物バイナリー形質転
換ベクターへのクローニングを許容するために改変した。配列ＣＧＣＧＡＴＴＴ
ＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧ
ＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴ（配列番号４６）の自己アニーリングするオリゴヌク
レオチドから成るアダプタを、ベクターpBC SK+ （Stratagene）を制限エンドヌ
クレアーゼＢｓｓＨＩＩで消化した後でベクターにライゲートし、ベクターｐＣ
ＧＮ７７６５を構築した。プラスミドｐＣＧＮ３２２３及びｐＣＧＮ７７６５は
、ＮｏｔＩで消化し、互いにライゲートした。得られたベクターｐＣＧＮ７７７
０（図１７）は、ｐＣＧＮ７７６５骨格と、ｐＣＧＮ３２２３のナピン種子特異
的発現カセットとを有する。
【００７７】 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ構築物 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａタンパク質をコードする遺伝子を突然変異させ、ＰＣＲ
を用いて適当なクローニング部位５’及び３’ＯＲＦｓを導入した。ＰＣＲ反応
用の鋳型はコスミドＥＰＡ（ヤザワら、前掲）のＤＮＡであった。ＰＣＲ反応は
製造業者のプロトコルに従ってＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。Ｐ
ＣＲ産物はｐＣＧＮ７７６９で消化したＳｒｆＩでクローニングした。プライマ
ーＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＣＴＴ
ＣＴＧＴＣＣ（配列番号４７）及びＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧ
ＴＣＴＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＧＡ（配列番号４８）を使用してＯＲＦ３を増
幅し、プラスミドｐＣＧＮ８５２０を作成した。プライマーＴＣＴＡＧＡＣＴＣ
ＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＡＣＡ（配列番号４
９）及びＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＧＴ
ＴＴＧＣＴ（配列番号５０）を使用してＯＲＦ６を増幅し、プラスミドｐＣＧＮ
７７７６を作成した。プライマーＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＧ
ＣＴＧＣＧＣＡＴＣＧＣＡＣＴＴＡＴＣ（配列番号５１）及びＧＧＴＡＣＣＡＧ
ＡＴＣＴＴＴＡＧＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＧＧ（配列番号５２
）を使用してＯＲＦ７を増幅し、プラスミドｐＣＧＮ７７７１を作成した。プラ
イマーＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＴ
ＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）及びＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＡＣＡＧ
ＡＴＴＣＴＴＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＡＧ（配列番号５４）を使用してＯＲＦ８を
増幅し、プラスミドｐＣＧＮ７７７５を作成した。プライマーＧＡＡＴＴＣＧＴ
ＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＡＡＣＧＡＡ（配列番号
５５）及びＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴ
ＧＧＣＴＴＣ（配列番号５６）を使用してＯＲＦ９を増幅し、プラスミドｐＣＧ
Ｎ７７７３を作成した。
【００７８】 ＰＣＲ産物の完全性は、ｐＣＧＮ７７７１、ｐＣＧＮ８５２０、及びｐＣＧＮ
７７７３のインサートのＤＮＡ配列決定により確認した。ＯＲＦ６及びＯＲＦ８
はサイズが非常に大きかった。クローン全体の配列決定を避けるため、ＯＲＦｓ
の中心部分をＥＰＡの制限断片で置き換えた。ＯＲＦ６の中心部分を含むｐＥＰ
Ａの６．６キロベースのＰａｃＩ／ＢａｍＨＩ断片をＰａｃＩ／ＢａｍＨＩで消
化したｐＣＧＮ７７７６にライゲートし、ｐＣＧＮ７７７６Ｂ４を得た。ＯＲＦ
８の中心部分を含むＥＰＡの４．４キロベースのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片を
ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＧＮ７７７５にライゲートし、ｐＣＧＮ
７７７５Ａを得た。ＥＰＡ断片に隣接する領域クローニング接合部はＤＮＡ配列
決定により確認した。
【００７９】 プラスミドｐＣＧＮ７７７１はＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩにより切断し、Ｓａｌ
Ｉ及びＢｇｌＩＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られた
ナピン／ＯＲＦ７遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ７７８３と名付けた。プラス
ミドｐＣＧＮ８５２０はＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩにより切断し、ＳａｌＩ及びＢ
ｇｌＩＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られたナピン／
ＯＲＦ３遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ８５２８と名付けた。プラスミドｐＣ
ＧＮ７７７３はＳａｌＩ及びＢａｍＨＩにより切断し、ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩ
で消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られたナピン／ＯＲＦ９
遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ７７８５と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ７７
７５ＡはＳａｌＩにより切断し、ＳａｌＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にラ
イゲートした。得られたナピン／ＯＲＦ８遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ７７
８２と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ７７７６Ｂ４はＸｈｏＩにより切断し、Ｓ
ａｌＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られたナピン／Ｏ
ＲＦ６遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ７７８６Ｂ４と名付けた。
【００８０】 植物形質転換に対するバイナリーベクターｐＣＧＮ５１３９を、ｐＣＧＮ１５
５８から構築した（マクブライド（McBride ）とサマーフェルト（Summerfelt）
（1990）Plant Molecular Biology, 14:269-276 ）。ｐＣＧＮ１５５８のポリリ
ンカーを、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位である、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、Ｘ
ｂａＩ、ＳｗａＩ、ＢａｍＨＩ、及びＮｏｔＩを有するポリリンカーにより、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８断片として置き換えた。ｐＣＧＮ５１３９には、Ａ
ｓｐ７１８及びＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が保持されている。
ＰＣＧＮ５１３９は、ＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＣＧＮ７７８６
Ｂ４ナピン／ＯＲＦ６遺伝子融合部を含む得られたバイナリーベクターをｐＣＧ
Ｎ８５３３と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ８３３をＳｓｅ８３８７Ｉで消化し
、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化したｐＣＧＮ７７８２とライゲートした。ナピン／Ｏ
ＲＦ６遺伝子融合部及びナピン／ＯＲＦ８遺伝子融合部を含む得られたバイナリ
ーベクターをｐＣＧＮ８５３５と名付けた（図１８）。
【００８１】 植物バイナリー形質転換ベクターｐＣＧＮ５１３９を、Ａｓｐ７１８で消化し
、Ａｓｐ７１８で消化したｐＣＧＮ８５２８とライゲートした。ナピン／ＯＲＦ
３遺伝子融合部を含む得られたバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５３２と名付け
た。プラスミドｐＣＧＮ８５３２をＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＣ
ＧＮ７７８３とライゲートした。ナピン／ＯＲＦ３遺伝子融合部及びナピンＯＲ
Ｆ７遺伝子融合部を含む得られたバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５３４と名付
けた。プラスミドｐＣＧＮ８５３４をＳｓｅ８３８７Ｉで消化し、Ｓｓｅ８３８
７Ｉで消化したｐＣＧＮ７７８５とライゲートした。ナピン／ＯＲＦ３遺伝子融
合部、ナピン／ＯＲＦ７遺伝子融合部及びナピン／ＯＲＦ９遺伝子融合部を含む
得られたバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５３７と名付けた（図１９）。
【００８２】 （Ｖｉｂｒｉｏ構築物） 植物発現用のＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦｓはすべて開始分子としてＶｉｂｒｉｏコ
スミド９番を用いて得た。Ｖｉｂｒｉｏコスミド９番は実施例１に説明したＶｉ
ｂｒｉｏＯＲＦ６ＰＣＲ産物を用いてＶｉｂｒｉｏコスミドライブラリから単離
したコスミドの一つである。
【００８３】 Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ７（図６）をコードする遺伝子を突然変異し、ＰＣＲプ
ライマー：ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧ
ＴＴＡＴＴＧＧＴ（配列番号５７）及びＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴ
ＧＴＴＣＧＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＡＴＧ（（配列番号５８）を用いて読み取り枠
の上流にＳａｌＩ部位及び読み取り枠の下流にＢａｍＨＩ部位を導入した。Ｖｉ
ｂｒｉｏ ＯＲＦ９（図６）をコードする遺伝子を突然変異し、ＰＣＲプライマ
ー：ＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＴＡＡＧＴＡＡＴＣ
ＡＴＴＣＧＧＣＡ（配列番号５９）及びＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣ
ＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＴＡＡＣＴＴＧＣＣ（配列番号６０）を用いて読み取り枠
の上流にＢａｍＨＩ部位及び読み取り枠の下流にＸｈｏＨＩ部位を導入した。制
限部位はＰＣＲを用いて導入し、変異プラスミドの完全性はＤＮＡ配列により確
認した。Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ７遺伝子はＳａｌ−ＢｇｌＩ断片としてＳａｌ−
ＢｇｌＩ消化したｐＣＧＮ７７７０（図１７）のナピンカセット内でクローニン
グし、ｐＣＧＮ８５３９を得た。Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ９遺伝子はＳａｌ−Ｂａ
ｍＨＩ断片としてＳａｌ−ＢａｌＩ消化したｐＣＧＮ７７７０（図１７）のナピ
ンカセット内でクローニングし、ｐＣＧＮ８５４３を得た。
【００８４】 Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ６及びＯＲＦ８をコードする遺伝子を突然変異し、読み
取り枠に隣接するＳａｌＩ部位を導入した。ＯＲＦ６に隣接するＳａｌＩ部位は
ＰＣＲを用いて導入された。使用したプライマーは：ＣＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＡ
ＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＴＣＧＡ（配列番号６１）及
びＣＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＧＡＣＡＴＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＣ
ＡＣＴＧＡ（配列番号６２）であった。ＰＣＲ産物の中心の７．３ｋｂＢａｍＨ
Ｉ−ＸｈｏＩ７断を、対応するＶｉｂｒｉｏコスミド９番由来の断片と置き換え
た。変異ＯＲＦ６をｐＣＧＮ７７７０のナピンカセットのＳａｌＩ部位に入れて
クローニングし、プラスミドｐＣＧＮ８５５４を得た。
【００８５】 ＯＲＦ８の突然変異誘発には異なるストラテジーをとった。ＯＲＦ８を含むＢ
ａｍＨＩ断片をプラスミドｐＨＣ７９でサブクローニングし、コスミド９”番を
得た。コーディング領域の上流のＳａｌＩ部位を、オリゴヌクレオチドＴＣＧＡ
ＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴ
ＧＴＴＣ（配列番号６３）及びＣＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＴＴＡＧＣＡＡＴＡＣＣ
ＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧ（配列番号６４）から成るアダ
プタ上に導入した。ＳａｌＩ及びＸｍａＩによる消化後、アダプタをコスミド９
”番とライゲートした。突然変異誘発を誘発するためにＰＣＲを用いて停止コド
ンの下流にＳａｌＩ部位を導入した。停止コドンを有するＤＮＡ断片はコスミド
９番”を鋳型として使用し、プライマーＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＴＣＧＡ
ＴＡＣ（配列番号６５）及びＴＣＡＴＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧ
ＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＡＣＴ（配列番号６６）を用いて生成した。ＰＣＲ産物を
制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩ及びＡａｔＩＩで消化し、同じ酵素で消化した
コスミド９”番派生物中でクローニングし、プラスミド８Ｐ３を得た。８Ｐ３由
来のＳａｌＩ断片をＳａｌＩ消化ｐＣＧＮ７７７０中でクローニングし、ｐＣＧ
Ｎ８５１５を得た。
【００８６】 ナピンプロモーターの制御下のＳｈｅｗａｎｎｅｌｌａ ＯＲＦ３を含むＰＣ
ＧＮ８５３２バイナリー植物形質転換ベクターを、ＮｏｔＩで消化し、ナピンＶ
ｉｂｒｉｏ ＯＲＦ７遺伝子融合部を含むｐＣＧＮ８５３９のＮｏｔＩ断片を挿
入し、ｐＣＧＮ８５５２を得た。Ｓｈｅｗａｎｎｅｌｌａ ＯＲＦ３と、ナピン
プロモーター制御下のＶｉｂｒｉｏ ＯＲＦ７及び９とを含むプラスミドｐＣＧ
Ｎ８５５６（図２３）を、ｐＣＧＮ８５４３由来のＳｓｅ８３５７断片をＳｓｅ
８３８７で消化したｐＣＧＮ８５５２中でクローニングすることにより構築した
。
【００８７】 プラスミドｐＣＧＮ８５１５由来のＮｏｔＩ消化したナピン／ＯＲＦ８遺伝子
を、ＮｏｔＩ消化した植物バイナリー形質転換ベクターｐＣＧＮ５１３９中でク
ローニングし、ｐＣＧＮ８５４８を得た。ｐＣＧＮ８５５４由来のＳｓｅ８３８
７消化したナピン／ＯＲＦ６遺伝子を、ｐＣＧＮ８５６６のＳｓｅ８３８７部位
に入れて引き続きクローニングした。得られたナピン／ＯＲＦ６遺伝子融合部及
びナピン／ＯＲＦ８遺伝子融合部を含むバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５６０
（図２２）と名付けた。
【００８８】 （実施例５） 植物の形質転換とＰＵＦＡの生産 ＥＰＡの生産 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ構築物ｐＣＧＮ８５３７及びｐＣＧＮ８５３７を、同じ
か又は異なる別個の植物に入れて、形質転換することができる。別個の植物が使
用される場合、トランスジェニック植物を交雑すると、両方の構築物を含むヘテ
ロ接合型の種子が得られる。
【００８９】 ｐＣＧＮ８５３５及びｐＣＧＮ８５３７はＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓに別
々に入れて形質転換される。植物はカナマイシンを含む培地上で選択され、構築
物の完全長インサートによる形質転換はサザン解析により確認される。未成熟な
種子も、ウェスタン解析を用いて、ＯＲＦ３、６、７、８、又は９によりコード
された酵素タンパク質の発現について試験される。いずれの場合も、最も発現が
良好なｐＣＧＮＥ８５３５及びｐＣＧＮ８５３７Ｔ1形質転換植物を選択し、更
なる実験及び交雑のために成長させる。代わりに、サザンによりインサートを示
すＴ1形質転換植物は、両方のインサートを有するＴ2を互いに生産するように交
雑される。この種子に関して、種子の半分は脂肪酸画分におけるＥＰＡの発現か
ら直接分析した。ＥＰＡの生産が最良であった残りの半分の種子は成育され、Ｅ
ＰＡの生産するＢｒａｓｓｉｃａ系を提供するよう従来の育種法により発達させ
る。
【００９０】 プラスミドｐＣＧＮ７７９２及びｐＣＧＮ７７９５も、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎ
ａｐｕｓ宿主細胞に同時に導入される。標準的な形質転換プロトコルを使用する
（例えば米国特許第５，４６３，１７４号及び米国特許第５，７５０，８７１号
を参照、）が、両方のプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを混合し、Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ と共にインキュベートし、同時培養中にＢｒａｓｓｉｃａの子
葉と共にインキュベートする。得られた植物の多くが、両プラスミドによって形
質転換される。
【００９１】 （ＤＨＡの生産） ｐＣＧＮ８５５６及びｐＣＧＮ８５６０を導入することにより、ＥＰＡの生産
に関して説明したように別個の植物中で又は同じ植物中で同時に、植物がＤＨＡ
の生産用に形質転換される。
【００９２】 代わりに、植物を構築物ｐＣＧＮ８５６０及びｐＣＧＮ７７９５で形質転換し
たり、植物細胞内での対応するＯＲＦｓの発現を許容したりすることにより、Ｓ
ｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦｓはＶｉｂｒｉｏのＯＲＦ６及び８と調和した様式
で使用することも可能である。この組み合わせは、Ｖｉｂｒｉｏ由来のＯＲＦ６
及びＶｉｂｒｉｏ由来のＯＲＦ８との、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦｓ３、７
及び９から成るＰＫＳ様遺伝子の整列を提供する。上述したように、ＯＲＦ８は
最終ＰＵＦＡ産物の同一性を制御するＰＫＳ様遺伝子である。このように、得ら
れた形質転換植物は植物油にＤＨＡを生成する。
【００９３】 （実施例６） Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＰＵＦＡ遺伝子を有するトランスジェニック植物 Ｂｒａｓｓｉｃａ植物 プラスミドｐＣＧＮ８５３５及びｐＣＧＮ８５３７により同時形質転換された
５２体の植物をＰＣＲを用いて分析し、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦｓがトラ
ンスジェニック植物中に存在するかどうかを決定した。４１体の植物がプラスミ
ドｐＣＧＮ８５３７を含み、３５体の植物がｐＣＧＮ８５３５を含んでいた。１
１体の植物がＥＰＡの合成に必要な５つのＯＲＦｓを含んでいた。いくつかの植
物はバイナリープラスミドの両方に由来する遺伝子を含んでいたが、少なくとも
１つのＯＲＦｓを喪失しているようであった。分析は約２０体のさらなる植物に
ついて現在行っているところである。
【００９４】 ｐＣＧＮ８５３５のみにより形質転換された２３体の植物をＰＣＲを用いて分
析し、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦがトランスジェニック植物中に存在するか
どうかを決定した。１３体の植物がＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ６及びＳｈｅｗ
ａｎｅｌｌａＯＲＦ８を共に含んでいた。６体の植物が一方のＯＲＦのみを含ん
でいた。
【００９５】 ｐＣＧＮ８５３７のみにより形質転換された１９体の植物をＰＣＲを用いて分
析し、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦがトランスジェニック植物中に存在するか
どうかを決定した。１８体の植物がＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ３、Ｓｈｅｗａ
ｎｅｌｌａＯＲＦ７、及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ９を含んでいた。１体の
植物がＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ３及び７を含んでいた。
【００９６】 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ プラスミドｐＣＧＮ８５３５及びｐＣＧＮ８５３７により同時形質転換した４
０体よりも多いトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を本願発明者の
成育チャンバで成育した。どのＯＲＦｓが植物中に存在するかを決定するＰＣＲ
解析は現在行っている最中である。
【００９７】 （実施例７） ＰＫＳシステムのＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍにおけるＰＵＦＡ合成の証拠 本実験の目的は、ＰＫＳ遺伝子の更なる供給源を同定することであった。多価
不飽和長鎖脂肪酸がＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ油中に同定された。さらに、
多価不飽和脂肪酸の生産がＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの培地中に検出された
。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの新鮮な希釈培地を［14Ｃ］−酢酸（５ｕＣｉ
／ｍＬ）の存在下で、２４℃、３０分間、撹拌しながらインキュベートした（１
５０ｒｐｍ）。次に細胞を遠心により収集し、凍結乾燥し、トルエン（酸性メタ
ノールの２体積当たりトルエン１体積）を第２の溶媒とした酸性メタノール（９
％Ｈ2ＳＯ4）の存在下で９０分間、９０℃まで加熱することに関するエステル交
換プロトコルに供した。得られたメチルエステル有機溶媒（ヘキサン）により抽
出し、ＴＬＣ（シリカゲルＧ、ヘキサン：ジエチルエーテル（１９：１）で３回
展開）により分離した。ＴＬＣプレート上の放射能をスキャナ（ＡＭＢＩＳ）を
用いて検出した。ＴＬＣプレート上に２つの顕著なバンドを検出した。定位置に
ＴＬＣプレート上を移動したそれらのバンドは短鎖（１４〜１６炭素）の飽和メ
チルエステル（上側のバンド）及び多価不飽和長鎖（２０〜２２炭素）脂肪酸（
下側のバンド）のメチルエステルと予想された。それらは、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙ
ｔｒｉｕｍ油のＦＡＭＥｓのＧＣ分析により検出された主な種類の脂肪酸でもあ
った。
【００９８】 並行実験において、タイプＩＩ型脂肪酸合成系とＳｈｅｗａｎｅｌｌａ由来の
ＰＫＳ遺伝子で形質転換したＥ．ｃｏｌｉによるＥＰＡの生産を始めとするいく
つかのポリケチド合成系との周知の阻害剤であるチオールアクトミオシンをＳｃ
ｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ細胞培養物及び及び［14Ｃ］酢酸の添加の前に種々の
濃度（０、１、１０及び１００μｇ／ｍｌ）の試験管に加えた。上述したように
、［14Ｃ］酢酸の取り込み分析により、１００μｇ／ｍＬのチオールアクトミオ
シンが多価不飽和脂肪酸の合成を完全にブロックすることが明らかとなったが、
１０μｇ／ｍＬのチオールアクトミオシンでは不飽和脂肪酸合成の部分的阻害が
観察された。短鎖飽和脂肪酸の合成は試験したすべてのチオールアクトミオシン
濃度において影響を受けなかった。チオールアクトミオシンはタイプＩ型脂肪酸
合成系を阻害せずマウスにとって毒性ではない。このことは、チオールアクトミ
オシンがＥＰＡ又はＤＨＡの生成に至る延長系を阻害しないことを示唆する。さ
らに、チオールアクトミオシンはＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎ
ｕｔｕｍにおけるＰＵＦＡ合成に至る延長系を阻害しなかった。従って、Ｓｃｈ
ｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍはタイプＩ型脂肪酸合成系を有することが知られている
が、データによると、該生物で生産された多価不飽和脂肪酸は、短鎖脂肪酸を生
産するタイプＩ型脂肪酸合成系とは異なる系と、マウス及びＰｈａｅｏｄａｃｔ
ｙｌｕｍで見出された延長／非飽和経路に類似する系とに由来するものであるこ
とが示唆された。データはＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ及びＳｈｅｗａｎｅｌ
ｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓに見出されたＰＫＳ経路の結果であるＤＨＡの形
成と一致している。
【００９９】 （実施例８） Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ由来のＰＫＳ関連配列 本実験の目的は、ＰＫＳ遺伝子をコードするＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに
由来する配列を同定することであった。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ由来のｃ
ＤＮＡライブラリを構築し、約８，０００個のランダムクローン（ＥＳＴ）を配
列決定した。ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＥＰＡ合成遺伝子によりコードされたタン
パク質の配列をＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントアルゴリズムを用
いてＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ＥＳＴの予測アミノ酸配列と比較した。Ｏ
ＲＦ６（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）のタンパク質配列をＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉ
ｕｍ ＥＳＴ由来のアミノ酸配列と比較した場合、３８個のＥＳＴクローンが有
意な相同性の程度を示した（Ｐ＜０．０１）。ＯＲＦ７のタンパク質配列をＳｃ
ｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ＥＳＴにより比較した場合、４個のＥＳＴクローン
が有意な相同性を示し（Ｐ＜０．０１）、分子が均質であることが示唆された。
ＯＲＦ８及びＯＲＦ９のタンパク質配列をＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ＥＳ
Ｔと比較した場合、７及び１４個のクローンがそれぞれ有意な相同性を示した（
Ｐ＜０．０１）。
【０１００】 （実施例９） Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｃＤＮＡクローンの分析 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ＥＳＴクローンの制限酵素分析を利用して、
最も長いクローンを決定し、該クローンの全体を次に配列決定した。実施例８に
説明したすべてのＥＳＴ配列を５ＤＮＡクローンの一部であると決定した。
【０１０１】 ＤＮＡクローンのうちの２つは、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ６と相同であっ
た。ＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５は、ＯＲＦ６のＣ末端と相同であった。ＬＩ
Ｂ３０３３−０４７−Ｂ５の配列はアミノ酸２０９３から前方へＳｈｅｗａｎｅ
ｌｌａＯＲＦ６と整列させることができた。ＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５の読
み取り枠は配列の５’末端まで伸びていたため、このクローンが完全長である可
能性は低い。ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６はＯＲＦ６のＡＣＰドメインに対す
る相同性を共有していた。ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６は６個のＡＣＰ繰り返
しを有していた。そのＤＮＡクローンはポリ−Ａ−テイルを有しておらず、ＤＮ
Ａの追加領域が配列の下流に見出される、部分ｃＤＮＡである可能性が高かった
。ＰＣＲプライマーＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡ
ＡＧＧ（配列番号６７）及びＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＧＣＡＧ
ＣＧＣＣＡＧＡ（配列番号６８）を使用して、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍゲ
ノムＤＮＡ由来の約５００ヌクレオチド断片を増幅した。プライマーＧＴＧＡＴ
ＧＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡＡＧＧはＬＩＢ３０３３−０４
６−Ｅ６に由来し、プライマーＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＧＣＡ
ＧＣＧＣＣＡＧＡはＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５に由来する。ＬＩＢ３０３３
−０４６−Ｅ６及びＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５は同じｍＲＮＡの異なる部分
を示し（図２８を参照）、図２９Ａ（配列番号７０）の配列に関するタンパク質
をコードすると予測されている、１つの部分ＤＮＡ配列（配列番号６９）に組み
込むことができた（図２７Ａを参照）。読み取り枠は配列の５’末端まで延びて
いたため、この部分ＤＮＡは完全長である可能性が低い。更なるＤＮＡ又はゲノ
ムクローンの分析により、クローンＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６及びＬＩＢ３
０３３−０４７−Ｂ５により表されたｍＲＮＡの全長を決定することができるで
あろう。それは、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ６のＮ末端付近に見出されるのと
同様の縮合酵素関連ドメインを含み得る。
【０１０２】 ＤＮＡクローンの１つであるＬＩＢ３０３３−０４６−Ｄ２は、３’末端がＳ
ｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ９と相同であった。このクローンは５’末端がＳｈ
ｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ８の鎖長要因領域と相同であった。該クローンはＡｎ
ａｂｅａｎａ ＨｇｌＣ ＯＲＦの読み取り枠全体とも相同であった。Ａｎａｂ
ｅａｎａ ＨｇｌＣ ＯＲＦはＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ８及びＳｈｅｗａ
ｎｅｌｌａ ＯＲＦ７の鎖長要因領域と相同である。従ってそのＤＮＡ（図２７
Ｂ）（配列番号７１）はＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ８、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌ
ａ ＯＲＦ７及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ９（図２８を参照）の一部と相
同である。ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｄ２の読み取り枠によりコードされたアミ
ノ酸配列（図２９Ｂ）（配列番号７２）は、配列の５’末端まで延びていた。従
ってそのクローンは完全長である可能性が低い。さらなるＤＮＡ又はゲノムクロ
ーンの分析により、ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６により表されたｍＲＮＡの全
長を決定することができるであろう。それは、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ８の
Ｎ末端付近に見出されるのと同様の縮合酵素関連ドメインを含み得る。
【０１０３】 ２つのさらなるＤＮＡクローンがＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ８と相同であ
った。ＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５はＯＲＦ８のＣ末端と相同であった。ＬＩＢ０
８１−０１５−Ｄ５の５’配列は、アミノ酸１９００から前方へＳｈｅｗａｎｅ
ｌｌａ ＯＲＦと整列させることができた。ＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５の３’末
端は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ９（図２８参照）と整列させることができ
た。ＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５の読み取り枠によってコードされたアミノ酸配列
（図２９）（配列番号７３）は配列の５’末端まで延びていたため、このクロー
ンは完全長である可能性が低い。ＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９は、Ｓｈｅｗａｎｅ
ｌｌａ ＯＲＦ８のアミノ酸１１５０〜１８５０と相同であった。ＬＩＢ８１−
０４２−Ｂ９はポリ−Ａ−テイルを有しておらず、従って追加領域が配列の下流
に見出される、部分ＤＮＡである可能性が高かった。ＰＣＲプライマーＴＡＣＣ
ＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣ（配列番号７４）及び
ＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＴＧ（配列番号７
５）を使用して、ＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍゲノムＤＮＡ由来の約５００ヌ
クレオチド断片を増幅した。プライマーＴＡＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣ
ＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９に由来し、プライマーＧＣ
ＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＴＧにはＬＩＢ８１−
０１５−Ｄ５に由来した。従って、ＬＩＢ８１−０４２−及びＬＩＢ８１−０１
５−Ｄ５は同じｍＲＮＡの異なる部分を示し、１つの部分ＤＮＡ配列（図２７Ｃ
を参照）（配列番号７６）内に組み込むことができた。ＬＩＢ８１−０４２−Ｂ
９の読み取り枠も５’末端まで延びていたため、この部分ＤＮＡは完全長である
可能性が低い。更なるＤＮＡ又はゲノムクローンの分析により、ＬＩＢ８１−０
４２−Ｂ９により表されたｍＲＮＡの全長を決定することができるであろう。
【０１０４】 本発明により、種々の生物に由来するＰＫＳ様遺伝子を使用して、植物細胞を
形質転換したり、形質転換した植物細胞でのＰＵＦＡｓ生合成を介して植物細胞
膜又は植物種子油の脂肪酸組成物を改変したりすることができる。ＰＫＳ様系の
性質により、植物細胞で生産された脂肪酸の最終産物は、多くの特定の化学構造
を含むように選択又は設計することが可能である。例えば、脂肪酸は以下の変化
を有し得る：炭素鎖に沿った種々の位置におけるケト又はヒドロキシ基の数の変
化；二重結合の数及び種類（シス又はトランス）の変化；線形炭素鎖の分岐（メ
チル、エチル、又はより長い分岐部分）の数及び種類の変化；及び飽和炭素の変
化。さらに、最終産物である脂肪酸の特定の長さは、使用する特定のＰＫＳ様遺
伝子によって制御することが可能である。
【０１０５】 本明細書で言及したすべての公表物及び特許出願は本発明が関連する当業者の
技能のレベルを示す。あたかも各公表物又は特許出願が詳細に及び個別に参照に
より組み込まれるのと同じ程度に、すべての公表物及び特許出願は本願に参照に
より組み込まれる。
【０１０６】 さて、本発明を完全に説明したが、当業者には特許請求の精神又は範囲から逸
脱することなく本発明に対して多くの変更及び改変を行いうることが理解されよ
う。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＥＰＡ遺伝子クラスタのＯＲＦｓに対する
呼称を提供する。図１Ａは、遺伝子の構成を示し、Ｅ．ｃｏｌｉでのＥＰＡの生
産に必須のＯＲＦｓには番号を付けている。図１Ｂは、サブクローンに対して与
えられる呼称を示す。
【図２】ＯＲＦ６（図２Ａ）、ＯＲＦ７（図２Ｂ）、ＯＲＦ８（図２Ｃ）、
ＯＲＦ９（図２Ｄ）及び／又はＥ３（図２Ｅ）のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ＰＫＳ
様ドメイン構造、モチーフ及び「ブラスト」適合を提供する。図２ＦはＳｈｅｗ
ａｎｅｌｌａ ＥＰＡ ＯＲＦｓに存在するドメインに関連する、Ａｎａｂｅａ
ｎａ染色体の領域の構造を示す。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ株であるＳＪ１６でのパンテテニレーション−ＯＲＦ
３に対する結果を示す。イメージは、列挙したプラスミドにより形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＪ１６株）由来の［Ｃ14］β−アラニン標識タンパク質を示す
。レーン１はｐＵＣ１９を示し、レーン２はｐＰＡ−ＮＥＢ（ΔＯＲＦ３）を示
し、レーン３はｐＡＡ−Ｎｅｂ（ＥＰＡ＋）を示し、レーン４はＯＲＦ６サブク
ローンを示し、レーン５はＯＲＦ６＋ＯＲＦ３サブクローンを示し、レーン６は
ＯＲＦ３サブクローンを示す。ＡＣＰ及び未知（ではあるが以前に観察された）
３５ｋＤタンパク質が、すべてのサンプルにおいて標識されている。レーン２及
び５で検出された高分子量のタンパク質は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦ６遺
伝子の完全長（最大のバンド）及び切断された（truncated ）産物である（ウェ
スタン分析により確認）。Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＳＪ１６のβ−アラニン合成を条件付
きでブロックしている。
【図４Ａ】ＯＲＦの３−９を含む、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａに見出されるＰＫ
Ｓ様クラスタに対するＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図４Ｂ】図４Ａに示した配列のうちのヌクレオチド６１２１−８１０３に
よりコードされた、ＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｃ】図４Ａに示した鎖であるヌクレオチド９０１６−８１８６の相補
鎖から翻訳した、公表ＯＲＦ３のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４Ｄ】ヌクレオチド配列８１８６−９１５７（配列番号４）を示す。こ
の配列の相補鎖は、ＥＰＡ合成に活性なＯＲＦ３をコードしている。
【図４Ｅ】図４Ａのヌクレオチド９６８１−１２５９０（配列番号８１）に
よりコードされたＯＲＦ４に対応するアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図４Ｆ】図４Ａのヌクレオチド１３０４０−１３９０３（配列番号８２）
によりコードされたＯＲＦ５に対応するアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図４Ｇ】図４Ａのヌクレオチド１３９０６−２２１７３（配列番号８３）
によりコードされたＯＲＦ６に対応するアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図４Ｈ】図４Ａのヌクレオチド２２２０３−２４５１５（配列番号８４）
によりコードされたＯＲＦ７に対応するアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図４Ｉ】図４Ａのヌクレオチド２４５１８−３０５２９（配列番号８５）
によりコードされたＯＲＦ８に対応するアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図４Ｊ】図４Ａのヌクレオチド３０７３０−３２３５８（配列番号８６）
によりコードされたＯＲＦ９に対応するアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図４Ｋ】ヌクレオチド３２８３４−３４３２７に対応するアミノ酸配列（
配列番号１１）を示す。
【図５】ＯＲＦ６，７，８及び９を含むＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓの約
４０ｋｂＤＮＡ断片におけるＰＫＳ様クラスタに対する配列（配列番号１２）を
示す。各ＯＲＦについての最初及び最後のコドンは以下の通りである：ＯＲＦ６
：１７３９４，２５３５２；ＯＲＦ７：２５５０９，２８１６０；ＯＲＦ８：２
８２０９，３４２６５；ＯＲＦ９：３４４５４，３６１１８。
【図６】ＯＲＦ６，７，８及び９を含む図５のＰＫＳ様クラスタの約１９ｋ
ｂ部分に対する配列（配列番号１３）を示す。各ＯＲＦについての最初及び最後
のコドンは以下の通りである：ＯＲＦ６：４１１，８３６９（配列番号７７）；
ＯＲＦ７：８５２６，１１１７７（配列番号７８）；ＯＲＦ８：１１２２６，１
７２８２（配列番号７９）；ＯＲＦ９：１７４７１，１９１３５（配列番号８０
）。
【図７】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓとＶｉｂｒｉｏ
ｍａｒｉｎｕｓのＰＫＳ様遺伝子クラスタの比較を示す。図７ＢはＶｉｂｒｉ
ｏ ｍａｒｉｎｕｓのオペロン配列である。
【図８】ＯＲＦ６，７及び８は読み枠２にあるが、ＯＲＦ９は読み枠３にあ
ることを示す、図７Ｂに示したＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓのＰＫＳ様遺伝子
クラスタ部分の拡大図。
【図９】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒｉ
ｏ ｍａｒｉｎｕｓのＯＲＦ６の配列相同性を実証する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ
ＯＲＦ６が垂直方向軸側に描かれ、Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ６が水平軸側に描か
れている。線は、６０％相同性を有するタンパク質の領域を示す。中央にある繰
り返し線は、ＯＲＦ６に見出される複数のＡＣＰドメインに対応する。
【図１０】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒ
ｉｏ ｍａｒｉｎｕｓのＯＲＦ７の配列相同性を実証する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌ
ａ ＯＲＦ７が垂直方向軸側に描かれ、Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ７が水平軸側に描
かれている。線は、６０％相同性を有するタンパク質の領域を示す。
【図１１】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒ
ｉｏ ｍａｒｉｎｕｓのＯＲＦ８の配列相同性を実証する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌ
ａ ＯＲＦ８が垂直方向軸側に描かれ、Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ８が水平軸側に描
かれている。線は、６０％相同性を有するタンパク質の領域を示す。
【図１２】 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂ
ｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓのＯＲＦ９の配列相同性を実証する。Ｓｈｅｗａｎｅｌ
ｌａ ＯＲＦ９が垂直方向軸側に描かれ、Ｖｉｂｒｉｏ ＯＲＦ９が水平軸側に
描かれている。線は、６０％相同性を有するタンパク質の領域を示す。
【図１３】種々の補足実験と得られたＰＵＦＡ産物とを示す。右側には、Ｖ
ｉｂｒｉｏ及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株において製造
された最も長いＰＵＦＡが左側に示されている。白抜きボックスはＳｈｅｗａｎ
ｅｌｌａ由来のＯＲＦｓを示す。中が描かれたボックスはＶｉｂｒｉｏ由来のＯ
ＲＦｓを示す。
【図１４】Ｅ．ｃｏｌｉＦａｄ Ｅ−での、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のＯ
ＲＦ８を用いた、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のｐＥＰＡＤ８（欠失ＯＲＦ８）の
補足遺伝子からの脂肪酸の生産を示す。クロマトグラムは、ＥＰＡ（２０：５）
ピークを示す。
【図１５】Ｅ．ｃｏｌｉＦａｄ Ｅ−での、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のＯ
ＲＦ８を用いた、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のｐＥＰＡＤ８（欠失ＯＲＦ８）の
補足遺伝子からの脂肪酸の生産を示す。クロマトグラムは、ＥＰＡ（２０：５）
ピーク及び（２２：６）ＤＨＡピークを示す。
【図１６】ＯＲＦ８の補足実験と図１５に示したクロマトグラムから得たＰ
ＵＦＡ値の表。
【図１７】ｐＣＧＮ７７７０の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図１８】ｐＣＧＮ８５３５の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図１９】ｐＣＧＮ８５３７の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図２０】ｐＣＧＮ８５２５の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図２１】ヤザワ（Yazawa）（１９９６）、前掲、に定義されたＳｈｅｗａ
ｎｅｌｌａ ＯＲＦｓと、図４に開示したＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ＯＲＦｓとの
比較。ヌクレオチド９１５７−９１５５の位置でロイシン（ＴＴＧ）コドンから
始まりヌクレオチド８１８５８−１８３の位置で停止コドンで終わるタンパク質
を、ＯＲＦ３以外の完全ＰＫＳ様クラスタを含むＥ．ｃｏｌｉ株中で異質プロモ
ーターの制御下で発現させている場合、組換え細胞はＥＰＡを生産する。従って
、公表されたタンパク質配列は間違っている可能性があり、該タンパク質のコー
ディング配列は、ヌクレオチド９１５７−９１５５の位置のＴＴＧコドンから始
まるか、ヌクレオチド９１７２−９１７０の位置のＴＴＧコドンから始まる可能
性がある。この情報は、機能ＰＫＳ様クラスタ異質系の発現に重要である。
【図２２】ｐＣＧＮ８５６０の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図２３】ｐＣＧＮ８５５６の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図２４】公表されたＯＲＦ３の上流での翻訳ＤＮＡ配列（配列番号１４）
と、それがコードしている対応アミノ酸（配列番号１５）とを示す。９０１６位
置のＡＴＧ開始コドンは、ヤザワ（Yazawa）ら（１９９６）、前掲、に説明され
たタンパク質に対する開始コドンである。他の矢印は、細菌での開始コドンとし
てやはり機能するＴＴＧ又はＡＴＴコドンを示す。ＯＲＦ３が９０１６位置の公
表されたＡＴＧコドンから始まる場合、タンパク質はＥＰＡ生産のためには機能
しない。ＯＲＦ３が９１５７位置のＴＴＧコドンから始まる場合、タンパク質は
ＥＰＡ合成を促進することができる。
【図２５】実施例１におけるプライマーを用いた、ＳＳ９ Ｐｈｏｔｏｂａ
ｃｔｅｒに関するＰＣＲ産物（配列番号１６）を示す。
【図２６】実施例１に示したプライマーを用いたＰＣＲより得たプローブ配
列（配列番号１７−３１）。
【図２７】Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ＥＳＴクローンのヌクレオチド
配列を示す。Ａ．ＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５、ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ
６及び架橋ＰＣＲ産物が、部分ｃＤＮＡ配列（ＯＲＦ６同族体）に組み込まれて
いる。Ｂ．ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｄ２（ｈｇｌｃ／ＯＲＦ７／ＯＲＦ８／Ｏ
ＲＦ９同族体）。Ｃ．ＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５、ＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９及
び架橋ＰＣＲ産物が、部分ｃＤＮＡ配列（ＯＲＦ８／ＯＲＦ９同族体）に組み込
まれている。
【図２８】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ＰＫＳ配列とＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉ
ｕｍ配列との間の類似性の略図。
【図２９】 Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ＥＳＴクローンから推定した
アミノ酸配列。Ａ．ＯＲＦ６同族体。Ｂ．ｈｇｌｃ／ＯＲＦ７／ＯＲＦ８／ＯＲ
Ｆ９同族体。Ｃ．ＯＲＦ８／ＯＲＦ９同族体。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｂ０６５ 1/19 1/21 ４Ｈ０５９ 1/21 9/00 5/10 Ｃ１２Ｐ 7/64 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:645 Ｃ１２Ｐ 7/64 1:91 //(Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:63 Ｃ１２Ｒ 1:645） 1:19 (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01 Ｃ１２Ｒ 1:91） 1:225 (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:63） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 メッツ、ジェームズ ジョージ アメリカ合衆国 95616 カリフォルニア 州 デイビス ベルハーベン プレイス 2830 (72)発明者 ラスナー、マイケル アメリカ合衆国 95616 カリフォルニア 州 デイビス ファルコン アベニュー 721 Ｆターム(参考） 4B018 LE02 MD15 MF13 4B024 AA05 AA08 BA07 BA80 CA04 DA01 DA05 DA06 DA12 EA04 GA11 4B026 DC05 DG04 DG05 DG08 DH10 DP10 DX01 4B050 CC03 CC08 DD02 LL02 4B064 AD88 AD90 CA02 CA05 CA06 CA11 CA19 CC24 DA10 4B065 AA01X AA01Y AA26X AA30X AA72X AA89X AB01 AC14 BA02 CA13 CA27 CA41 4H059 BA33 BB05 BC13 BC48 CA53 CA99

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】単離核酸であって、 図６に示した、ＯＲＦ６（配列番号７７）、ＯＲＦ７（配列番号７８）、ＯＲ
    Ｆ８（配列番号７９）、及びＯＲＦ９（配列番号８０）から成る群より選択され
    たＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓヌクレオチド配列から成る単離核酸。
  2. 【請求項２】単離核酸であって、 宿主細胞で発現されるとドコサヘキサエン酸を生産する、ポリケチド様合成系
    のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成る単離核酸。
  3. 【請求項３】前記ヌクレオチド配列が海洋細菌に由来するものである請求項
    ２に記載の単離核酸。
  4. 【請求項４】前記ヌクレオチド配列がＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来
    するものである請求項２に記載の単離核酸。
  5. 【請求項５】前記ヌクレオチド配列が、図６に示した、Ｖｉｂｒｉｏ ｍａ
    ｒｉｎｕｓ ＯＲＦ８（配列番号７９）である請求項２に記載の単離核酸。
  6. 【請求項６】配列番号６９、７１及び７６から成る群より選択された配列番
    号で示された配列を含むＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍヌクレオチド配列から成
    る単離核酸。
  7. 【請求項７】単離核酸であって、 図６に示した、ＯＲＦ６（配列番号７７）、ＯＲＦ７（配列番号７８）、ＯＲ
    Ｆ８（配列番号７９）、及びＯＲＦ９（配列番号８０）から成る群より選択され
    たＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓヌクレオチド配列の少なくとも５０ヌクレオチ
    ド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列から成る単離核酸。
  8. 【請求項８】請求項６に記載の単離核酸の少なくとも１つのコピーを有する
    組換え微生物細胞。
  9. 【請求項９】前記細胞は長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するのに必要なポリケ
    チド様合成系の各構成要素を有する請求項８に記載の組換え微生物細胞。
  10. 【請求項１０】前記細胞は真核生物細胞である請求項９に記載の組換え微生
    物細胞。
  11. 【請求項１１】前記真核生物細胞は、菌類細胞、藻類細胞又は動物細胞であ
    る請求項１０に記載の組換え微生物細胞。
  12. 【請求項１２】前記菌類細胞は酵母細胞であり、前記藻類細胞は海洋藻類細
    胞である請求項１１に記載の組換え微生物細胞。
  13. 【請求項１３】前記細胞は原核生物細胞である請求項８に記載の組換え微生
    物細胞。
  14. 【請求項１４】前記細胞は細菌細胞又はシアノバクテリア細胞である請求項
    １３に記載の組換え微生物細胞。
  15. 【請求項１５】前記細菌細胞はラクトバチルス属の細胞である請求項１４に
    記載の組換え細胞。
  16. 【請求項１６】前記組換え微生物細胞は前記単離核酸を欠いた非組換え微生
    物細胞と比較して２２：６脂肪酸が増強されている請求項８に記載の微生物細胞
    。
  17. 【請求項１７】微生物細胞培養物におけるドコサヘキサエン酸の生産方法で
    あって、前記方法は複数の微生物細胞を有する微生物細胞培養物を成育する工程
    から成り、前記微生物細胞又は前記微生物細胞の祖先が、ポリケチド合成系のポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１または複数の核酸を備えた
    ベクターにより形質転換され、前記１又は複数の核酸は、前記１又は複数の核酸
    が発現して前記微生物細胞培養物中でドコサヘキサエン酸が生産されるような条
    件で、プロモーターと機能的に連結している、方法。
  18. 【請求項１８】植物細胞における長鎖多価不飽和脂肪酸の生産方法であって
    、前記方法は複数の植物細胞を有する植物を成育する工程から成り、前記植物細
    胞又は前記植物細胞の祖先が、長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するポリケチド合成
    系のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１または複数の核酸を
    備えたベクターにより形質転換され、前記核酸の各々は、前記ペプチドが発現し
    て前記植物細胞内で長鎖多価不飽和脂肪酸が生産されるような条件で、植物細胞
    内で機能するプロモーターと機能的に連結している、方法。
  19. 【請求項１９】前記ヌクレオチド配列が配列番号６９、７１及び７６から成
    る群より選択された配列番号で示される請求項１７又は請求項１８に記載の方法
    。
  20. 【請求項２０】前記植物細胞内で生産された前記長鎖多価不飽和脂肪酸が２
    ０：５及び２２：６脂肪酸である請求項１８に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記ヌクレオチド配列が、図６に示したＶｉｂｒｉｏ ｍａ
    ｒｉｎｕｓ ＯＲＦ６（配列番号７７）、ＯＲＦ７（配列番号７８）、ＯＲＦ８
    （配列番号７９）、及びＯＲＦ９（配列番号８０）、及び図４に示したＳｈｅｗ
    ａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ＯＲＦ６（配列番号８３）、ＯＲＦ
    ７（配列番号８４）、ＯＲＦ８（配列番号８５）、ＯＲＦ９（配列番号８６）、
    並びに配列番号４と相補的なＯＲＦ３から成る群より選択される請求項１７に記
    載の方法。
  22. 【請求項２２】前記核酸構築物は２又はそれより多くのポリケチド合成系に
    由来するものである請求項１８に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記長鎖多価不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸である請
    求項１８に記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記長鎖多価不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である請求
    項１８に記載の方法。
  25. 【請求項２５】組換え植物細胞であって、 長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するポリケチド合成系の１又は複数のポリペプチ
    ドをコードするヌクレオチド配列を有する１または複数の核酸であって、その各
    々が前記植物細胞内で機能するプロモーターと機能的に連結している核酸 を含む組換え植物細胞。
  26. 【請求項２６】前記ヌクレオチド配列は配列番号６９、７１及び７６から成
    る群より選択された配列番号で示される請求項２５に記載の組換え植物細胞。
  27. 【請求項２７】前記組換え植物細胞は組換え種子細胞である請求項２６に記
    載の組換え植物細胞。
  28. 【請求項２８】前記組換え種子細胞は組換え胚細胞である請求項２７に記載
    の組換え植物細胞。
  29. 【請求項２９】前記組換え植物細胞はアブラナ属（Brassica）、大豆、ベニ
    バナ、及びヒマワリから成る群より選択された植物に由来する請求項２６に記載
    の組換え植物細胞。
  30. 【請求項３０】請求項２６に記載の組換え植物細胞によって生産された植物
    油。
  31. 【請求項３１】前記植物油はエイコサペンタエン酸を含む請求項３０に記載
    の植物油。
  32. 【請求項３２】前記植物油はドコサヘキサエン酸を含む請求項３０に記載の
    植物油。
  33. 【請求項３３】前記植物油はカプセルに包まれている請求項３０に記載の植
    物油。
  34. 【請求項３４】請求項３０に記載の植物油を含む栄養補助食品。
  35. 【請求項３５】組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞であって、 長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するポリケチド合成系のポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列を有する１または複数の核酸であって、その各々が前記Ｅ．
    ｃｏｌｉ細胞で機能するプロモーターと機能的に連結している核酸を含む組換え
    Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
  36. 【請求項３６】前記長鎖多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である請求
    項３５に記載の組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞。
  37. 【請求項３７】前記ヌクレオチド配列が配列番号６９、７１及び７６から成
    る群より選択された配列番号で示されている請求項３５に記載の組換えＥ．ｃｏ
    ｌｉ細胞。
  38. 【請求項３８】組換え植物細胞により生産された植物油であって、前記植物
    油は前記植物油に対して外因性の長鎖多価不飽和脂肪酸を含み、前記植物細胞が
    、 前記植物細胞又は前記植物細胞の先祖を長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するポリ
    ケチド合成系の１または複数のポリペプチドを有するベクターにより形質転換す
    る工程であって、前記核酸の各々が前記植物細胞内で機能するプロモーターと機
    能的に連結している核酸を含む工程 から成る方法に従って生産される植物油。
  39. 【請求項３９】前記長鎖多価不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸である請
    求項３８に記載の植物油。
  40. 【請求項４０】前記長鎖多価不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である請求
    項３８に記載の植物油。
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