MXPA00012323A - Acidos grasos poliinsaturados en plantas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para prepararácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en plantas, partes de plantas y células vegetales, tales como hojas, raíces, frutos y semillas;las secuencias deácido nucleico y construcciones que codifican para desaturasas deácido graso, incluyendo A5-desaturasas, A6-desaturasas y Al 2-desatu rasas, se utilizan para generar plantas transgénicas, partes de plantas y células que contienen y expresan uno o más transgenes que codifican para una o más desaturasas;la expresión de las desaturasas con diferente carácter específico por el substrato en el sistema de plantas permite la producción a gran escala deácidos grasos poliinsaturados de cadena larga tales comoácido docosahexaenoico,ácido eicosapentaenoico,ácido alfalinolénico,ácido gama-linolénico,ácido araquidónico y similares para modificación del perfil deácido graso de las plantas, partes de plantas y tejidos;la manipulación de los perfiles deácido graso permite la producción de cantidades comerciales de aceites de plantas y productos novedosos.

Description

ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS EN PLANTAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de f E.U.A. No. 60/089,043, presentada el 12 de junio de 1998.

CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a la modulación de los niveles de enzimas y/o componentes de enzimas capaces de alterar la producción de • 10 ácidos grasos poliinsaturados (PUFAS) de cadena larga en una planta hospedera. La invención es ejemplificada mediante la producción de PUFAS en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 15 Tres familias importantes de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAS) son 3 ácidos grasos, ejemplificados por el ácido araquidónico, los ácidos grasos ?9 ejemplificados por el ácido de Mead, y los ácidos grasos ?3, ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico. Los PFUAs son componentes 20 importantes de la membrana plasmática de la célula, en donde se pueden encontrar en formas tales como fosfolípidos. Los PUFAs funcionan también como precursores de otras moléculas de importancia en seres humanos y animales, incluyendo las prostaciclinas, leucotrienos y prostaglandinas. Los PUFAs son necesarios para el desarrollo adecuado, particularmente en el desarrollo del cerebro del infante, y para la formación y reparación de tejidos. Cuatro PUFAs de cadena larga de importancia incluyen el ácido docosahexaenoico (DHA) y el ácido eicosapentaenoico (EPA), los cuales se encuentran principalmente en diferentes tipos de aceite de pescado, el ácido gamma-linolénico (GLA), el cual se encuentra en las semillas de un número de plantas, incluyendo la hierba del asno {Oenothera biennis), el borago {Borago offícinalis) y los casis {Ribes nigrum), y el ácido estearidónico (SDA), el cual se encuentra en aceites marinos y semillas de plantas. El GLA y otro PUFA de cadena larga importante, el ácido araquidónico (ARA), se encuentran en hongos filamentosos. El ARA puede ser purificado de tejidos animales incluyendo hígado y glándulas suprarrenales. El ácido de Mead se acumula en animales deficientes en ácidos grasos esenciales. Para el DHA, existe un número de fuentes para producción comercial, incluyendo una variedad de organismos marinos, aceite obtenidos de peces marinos de aguas frías, y fracciones de la yema de huevo. P' ra el ARA, los microorganismos que incluyen los géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium se pueden usar para producción comercial. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros Trichodesma y Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen la hierba del asno, casis y borago. Sin embargo, existen varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFAs a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFAs, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceite altamente heterogéneas. Los aceite obtenidos de estas fuentes pueden requerir por lo tanto purificación exhaustiva para separar uno o más PUFAs deseados, o para producir un aceite el cual sea enriquecido en uno o más PUFAs. Las fuentes naturales están sujetas también a fluctuaciones de disponibilidad sin control. Los materiales de abastecimiento de peces pueden sufrir variación natural, o pueden ser agotadas por la pesca excesiva. Los aceites de pescado tienen sabores y aromas desagradables, los cuales pueden ser imposibles de separar económicamente del producto deseado, y pueden hacer que dichos productos sean inaceptables como complementos alimenticios. Los aceites de origen animal, y particularmente los aceites de peces, pueden acumular contaminantes ambientales. El tiempo atmosférico y las enfermedades pueden causar fluctuaciones en los rendimientos de fuentes de peces y plantas. Los terrenos de cultivo disponibles para la producción de cultivos alternos que producen aceite, están sujetos a competencia por la expansión estable de poblaciones humanas, y la necesidad incrementada asociada para la producción de alimentos en la tierra de cultivo restante. Los cultivos que producen PUFAs, tales como el borago, no se han adaptado al crecimiento comercial, y pueden no tener un buen rendimiento en monocultivo. De esta manera, el desarrollo de dichos cultivos no es económicamente competitivo, en donde se pueden desarrollar cultivos más provechosos y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella, es también costosa. Los tejidos animales naturales contienen bajas cantidades de ARA, y son difíciles de procesar.

Microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial. Los complementos dietéticos y las formulaciones farmacéuticas que contienen PUFAs pueden retener las desventajas de la fuente de PUFA.

Complementos tales como las cápsulas de aceite de pescado pueden contener bajos niveles del componente deseado en particular, y de esta manera requieren altas dosificaciones. Las altas dosificaciones dan como resultado la ingesta de altos niveles de componentes no deseados, incluyendo contaminantes. Debe tenerse cuidado de proveer complementos de ácidos f 10 grasos, ya que la adición excesiva puede dar como resultado la supresión de vías biosintéticas endógenas, y conducir a competencia con otros ácidos grasos necesarios en varias fracciones de lípidos in vivo, conduciendo a resultados no deseados. Por ejemplo, los esquimales que tienen una dieta alta en ácidos grasos ?3 tienen una tendencia incrementada a sangrar (patente de E.U.A. No. 4,874,603). Los sabores y aromas desagradables de los complementos pueden hacer que dichos regímenes sean indeseables, y f pueden inhibir el acatamiento por el paciente. Varias enzimas intervienen en la biosíntesis de PUFA. El ácido linoleico (LA, 18:2 ?9, 12) es producido a partir de ácido oleico (18:1 ?9) por 20 una ?l2-desaturasa. El GLA (18:3 ?6, 9, 12) es producido a partir de ácido linoleico (LA, 18:2 ?9, 12) por una ?6-desturasa. La producción de ARA (20:4 ?5, 8, 11 ,14) a partir de DGLA (20:3 ?8, 11 , 14) es catalizada por una ?5- desturasa. Sin embargo, los animales no pueden desaturar más allá de la posición ?9 y por lo tanto no pueden convertir el ácido oleico (18:1 ?9) en ácido linoleico (18:2 ?9, 12). Del mismo modo, el ácido a-linolénico (ALA, 18:3 ?9, 12, 15) no puede ser sintetizado por mamíferos. Otros eucariontes, • incluyendo hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones 5 ?12 y ?15. Por lo tanto, los ácidos grasos poliinsaturados importantes de animales, derivan de la dieta y/o de la desaturación y/o elongación del ácido linoleico (18:2 ?9, 12) o ácido oc-linolénico (18:3 ?9, 12, 15). Se considera que los ácidos grasos poliinsaturados son útiles para propósitos nutricionales, farmacéuticos, industriales y de otro tipo. Un • 10 suministro expansivo de ácidos grasos poliinsaturados de fuentes naturales y de síntesis química, no es suficiente para cubrir las necesidades comerciales. Por lo tanto, es de interés obtener material genético que intervenga en la biosíntesis de PUFA a partir de especies que producen naturalmente estos ácidos grasos, y expresar el material aislado solo o en combinación en un sistema heterólogo el cual pueda ser manipulado para permitir la producción de cantidades comerciales de PUFAs.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos novedosos para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga y desaturasas en plantas y células vegetales. Los métodos consisten en desarrollar una célula vegetal hospedera de interés transformada con un cassette de expresión funcional en una célula vegetal hospedera, el cassette de expresión comprendiendo una región reguladora de inicio de la transcripción y traducción, unida en el marco de lectura 5' a una secuencia de ADN que fl codifica para un polipéptido de desaturasa capaz de modular la producción de PUFAs. La expresión del polipéptido de desaturasa provee una alteración en el perfil de PUFA de células vegetales hospederas como resultado de concentraciones alteradas de enzimas que intervienen en la biosíntesis PUFA. De particular interés es el control selectivo de la producción de PUFA de tejidos vegetales y/o partes de plantas tales como hojas, raíces, frutos y f 10 semillas. La invención encuentra uso, por ejemplo, en la producción a gran escala de DHA, ácido de Mead, EPA, ARA, DGLA, ácido estearidónico, GLA y otros ácidos grasos, y para la modificación del perfil de ácidos grasos de tejidos de plantas y/o partes de plantas comestibles.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS f La figura 1 muestra vías posibles para la síntesis de ácido de Mead (20:3 ?5, 8,11 ), ácido araquidónico (20:4 ?5, 8, 11 , 14) y ácido estearidónico (18:4 ?6, 9, 12, 15) a partir de ácido palmítico (C-iß) de una 20 variedad de organismos, incluyendo algas, Mortierella y humanos. Estos PUFAs pueden funcionar como precursores de otras moléculas importantes para humanos y otros animales, e incluyen prostaciclinas, leucotrienos y prostaglandinas, algunas de los cuales se muestran. -^s ^wae&í La figura 2 muestra vías posibles para la producción de PUFAs además de ARA, incluyendo ácido taxoleico y ácido pinolénico, de nuevo obtenidos de varios organismos. • 5 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Para asegurar un conocimiento completo de la invención, se proveen las siguientes definiciones: ?5-desaturasa: ?5 desaturasa es una enzima que introduce un • 10 doble enlace entre los carbonos 5 y 6 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. ?6-desaturasa: ?6 desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 6 y 7 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. 15 ?9-desaturasa: ?9 desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso. ?12-desaturasa: ?12 desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 12 y 13 del extremo carboxilo de una 20 molécula de ácido graso. Ácidos grasos: Los ácidos grasos son una clase de compuestos que contienen una cadena larga de hidrocarburo y un grupo carboxilato terminal. Los ácidos grasos incluyen los siguientes: ¿¿¡¡^.^¡¡¡¿¿¡¡¿ • f 10 Tomando en cuenta estas definiciones, la presente invención está dirigida a secuencias de ADN novedosas, y construcciones de ADN ^^J&^^&^ *¡¡ relacionadas con la producción de ácidos grasos en plantas. Se proveen métodos y composiciones que permiten la modificación del contenido de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga de células vegetales. Las células vegetales son transformadas con un cassette de expresión que comprende un ADN que codifica para un polipéptido capaz de incrementar la cantidad de uno o más PUFA en una célula vegetal. Deseablemente, se pueden preparar construcciones de integración que permitan la integración del cassette de expresión en el genoma de una célula hospedera. Las células hospederas son manipuladas para expresar un ADN sentido o antisentido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa. Por "desaturasa" se entiende un polipéptido el cual puede desaturar uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono- o poli-insaturado o precursor del mismo de interés. Por "polipéptido" se entiende cualquier cadena de aminoácidos, sin importar la modificación de longitud o post-traducción, por ejemplo, glucosilación o fosforilación. El substrato para la enzima expresade puede ser producido por la célula hospedera, o puede ser suministrado exógenamente. Para lograr la expresión en una célula hospedera, el ADN transformado es asociado operablemente con regiones reguladoras de inicio y término de la transcripción y traducción que sean funcionales en la célula hospedera. Construcciones que comprendan el gen que será expresado pueden permitir la integración en el genoma de la célula hospedera, o se pueden replicar en forma independiente en la misma. Para la producción de at_-_-M_M_-^_-^__-aaI_ ácido taxoleico, los cassettes de expresión usados incluyen generalmente un cassette que provee actividad de ?5 desaturasa, particularmente en una célula hospedera que produce o puede absorber ácido oleico. Para la f producción de ?6,9 18:2 u otros ácidos grasos ?9 insaturados, los cassettes de expresión que se usan generalmente incluyen un cassette que provee actividad de ?6 desaturasa, particularmente en una célula hospedera que produce o puede absorber ácido oleico. La producción de ácido oleico, ácido taxoleico o ácidos grasos ?9 insaturados en una planta que tiene actividad de ?12 desaturasa, se favorece proveyendo un cassette de expresión para un • 10 transcrito de ?12 antisentido, o desorganizando un gen de ?12 desaturasa. Para la producción de ácido linoleico (LA), los cassettes de expresión que se usan generalmente incluyen un cassette que provee actividad de ?12 desaturasa, particularmente en una célula hospedera que produce o puede absorber ácido oleico. Para la producción de ALA, los cassettes de expresión que se usan generalmente incluyen un cassette que provee actividad de ?15 o ?3 desaturasa, particularmente en una célula hospedera que produce o puede • absorber LA. Para la producción de GLA o SDA, los cassettes de expresión que se usan generalmente incluyen un cassette que provee actividad de ?6 desaturasa, particularmente en una célula hospedera que produce o puede absorber LA o ALA, respectivamente. La producción de ácidos grasos insaturados tipo ?6, tales como LA o GLA, en una planta capaz de producir ALA, se favorece inhibiendo la actividad de desaturasa tipo ?15 o ?3; esto se — --*•- - - - logra proveyendo un cassette de expresión para un transcrito de ?15 o ?3, o desorganizando un gen de ?15 o co3 desaturasa. Asimismo, la producción de LA o ALA en una planta que tiene actividad de ?6 desaturasa se favorece • proveyendo un cassette de expresión para un transcrito de ?6 antisentido, o 5 desorganizando un gen de ?6 desaturasa. Para la producción de ARA en una célula hospedera que produce o puede absorber DGLA, el cassette de expresión que se usa generalmente provee actividad de D5 desaturasa. La producción de ácidos grasos insaturados tipo ?6, tales como ARA, en una planta capaz de producir ALA, se favorece inhibiendo la actividad de una 10 desaturasa tipo ?15 o ?3; esto se logra proveyendo un cassette de expresión para una copia de ?15 o ?3 antisentido, o desorganizando un gen de ?15 o ?3 desaturasa.

Producción de ácidos grasos en plantas transgénicas 15 La producción de PUFAs en plantas transgénicas ofrece varias ventajas sobre la purificación a partir de fuentes naturales tales como peces o • plantas. La producción de ácidos grasos a partir de plantas recombinantes provee la capacidad para alterar el perfil de ácido grasos que ocurren naturalmente en la planta, proveyendo nuevas vías de síntesis en el 20 hospedero, o suprimiendo vías no deseadas, aumentando de esta manera los niveles de PUFAs deseados, o formas conjugadas de los mismos, y disminuyendo los niveles de PUFAs no deseados. La producción de ácidos grasos en plantas transgénicas ofrece también la ventaja de que la expresión de genes de desaturasa en partes de plantas y/o tejidos particulares significa que se pueden lograr niveles ampliamente incrementados de PUFAs deseados en dichos tejidos y/o partes, haciendo que sea más económica la f recuperación de esos tejidos. Por ejemplo, los PUFAs deseados pueden ser expresados en la semilla; métodos para aislar aceites de semillas están bien establecidos. Además de proveer una fuente de purificación de PUFAs deseados, los componentes de aceite de la semilla pueden ser manipulados mediante la expresión de genes de desaturasa, solos o en combinación, con otros genes tales como elongasas, para proveer aceites de semilla que tengan ft 10 un perfil particular de PUFA en forma concentrada. Los aceites de semilla concentrados pueden ser añadidos entonces a leche de animales y/o leche sintética o semi-sintética para servir como fórmulas infantiles en donde la lactancia humana es imposible o no deseada, o en casos de mala nutrición o enfermedad en adultos e infantes. 15 Para la producción de PUFAs, dependiendo de la célula hospedera, la disponibilidad del substrato, y los proc" jctos terminales deseados, varios polipéptidos, particularmente desaturasas, son de interés incluyendo aquellos polipéptidos que catalizan la conversión de ácido esteárico a ácido oleico, LA a GLA, ALA a SDA, de ácido oleico a LA, o de LA 20 o ALA, ácido oleico a ácido taxólico, LA a ácido pinolénico, ácido oleico a ácido 6,9-octadeca-dienoico, los cuales incluyen enzimas las cuales desaturan en las posiciones ?6, ?9, ?5, ?12, ?15, ?5 o ?3. Las consideraciones que se toman en cuenta para elegir un polipéptido específico que tenga actividades de saturasa, incluyen el pH óptimo del polipéptido, si el polipéptido es una enzima limitativa de la velocidad o un componente de la misma, si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un ácido graso f poliinsaturado deseado, y/o co-factores requeridos por el polipéptido. El polipéptido expresado tiene preferiblemente parámetros compatibles con el ambiente bioquímico de su localización en la célula hospedera. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por el substrato con otras enzimas en la célula hospedera. Los análisis de la Km y la actividad específica del polipéptido en cuestión son considerados por lo tanto para determinar la 10 conveniencia de un polipéptido dado para modificar la producción de PUFA en una célula hospedera determinada. El polipéptido usado en una situación particular es por lo tanto uno que pueda funcionar bajo las condiciones presentes en la célula hospedera propuesta, pero de otra manera puede ser cualquier polipéptido que tenga actividad de desaturasa que tenga la característica deseada de ser capaz de modificar la producción relativa de un PUFA deseado. Un esquema para la síntesis de ácido araquidónico (2J:4 ?5, f 8, 11 , 14) a partir de ácido palmítico (C-?6) se muestra en la figura 1. Una enzima clave en esta vía es una ?5-desaturasa que convierte el ácido DH-?- linolénico (DGLA, ácido eicosatrienoico) en ARA. Se muestra también la conversión de ácido a-linolénico (ALA) a ácido estearidónico por una ?6- desaturasa. La producción de PUFAs además de ARA, incluyendo EPA y DHA, se muestra en la figura 2. Una enzima clave en la síntesis de ácido araquidónico (20:4 ?5, 8, 11 , 14) a partir de ácido esteárico (Cíe) es una ?6- desaturasa que convierte el ácido linoleico en ácido ?-linolénicp. Se muestra también la conversión de ácido a-linolénico (ALA) a ácido estearidónico por una ?6-desaturasa. Para la producción de ARA, la secuencia de ADN usada • codifica para un polipéptido que tiene actividad de ?5-desaturasa. En casos 5 particulares, éste puede ser acoplado con un cassette de expresión que permita la producción de un polipéptido que tanga actividad de ?6-desaturasa y, opcionalmente, un cassette de transcripción que permita la producción de secuencias antisentido a un producto de transcripción de ?15. La elección de la combinación de los cassettes usados, depende en parte del perfil de PUFA • 10 de la célula hospedera. En los casos en donde la actividad de ?5-desaturasa de la célula hospedera es limitativa, la sobreexpresión de ?5-desaturasa sola será generalmente suficiente para proveer la producción incrementada de ARA.

Fuentes de polipéptidos que tienen actividad de desaturasa Como fuentes de polipéptidos que tienen actividad de desaturasa • y oligonucleótidos que codifican para dichos polipéptidos, son los organismos que producen un ácido graso poliinsaturado deseado. Como ejemplo, se pueden usar microorganismos que tengan la capacidad de producir ARA como fuente de genes de ?5-desaturasa; se pueden usar microorganismos cuyos GLA o SDA se puedan usar como fuente de genes de ?6-desaturasa y/o ?l2-desaturasa. Dichos microorganismos incluyen, por ejemplo, los que pertenecen a los géneros Mortierella, Conidiobolus, Phytophthora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula y Entomophthora. Dentro del género Porphyridium, de interés particular es Porphyridium cruentum. Dentro del género Mortierella, de interés particular f son Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. angulispora, y Mortierella alpina. Dentro del género Mucor, de interés particular son Mucor circinelloides y Mucor javanicus. Se pueden identificar moléculas de ADN que codifican para desaturasas deseadas de varias formas. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo genotecas genómicas o de ADNc de f 10 Mortierella, se seleccionan con sondas detectables enzimáticamente o químicamente sintetizadas, las cuales se pueden obtener a partir de ADN, ARN o nucleótidos que no ocurren naturalmente, o mezclas de los mismos. Se pueden sintetizar enzimáticamente sondas a partir de moléculas de ADN de desaturasas conocidas mediante métodos de hibridación de severidad normal o reducida. También se pueden usar sondas de oligonucleótidos para seleccionar fuentes, y se pueden basar en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre desaturasas conocidas, o en secuencias de polipéptidos obtenidas de la proteína purificada deseada. Las sondas de oligonucleótidos basadas en secuencias de aminoácidos pueden ser degeneradas para abarcar la degeneración del código genético, o pueden ser desviadas a favor de los codones preferidos del organismo original. También se pueden usar oligonucleótidos como iniciadores para PCR a partir de ARN mensajero transcrito en forma inversa de una fuente conocida o probable; el producto de PCR puede ser ADNc de longitud total, o se puede usar para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud total deseado.

En forma alternativa, una proteína deseada puede ser secuenciada totalmente, y se puede llevar a cabo la síntesis total de un ADN que codifique para ese polipéptido. Una vez que el ADN genómico o ADNc deseado ha sido aislado, puede ser secuenciado mediante métodos conocidos. Se reconoce en la técnica que dichos métodos están sujetos a errores, de modo que la secuenciación múltiple de la misma región es habitual, y se espera aún que conduzca a índices medibles de errores en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensiva, o composiciones de bases no usuales, tales como regiones con alto contenido de bases GC. Cuando surgen discrepancias, se puede llevar a cabo secuenciación repetida, y se pueden utilizar métodos especiales. Dichos métodos pueden incluir alterar las condiciones de secuenciación mediante el uso de: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteren la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; diferentes composiciones de gel, por ejemplo, añadiendo formamida; diferentes iniciadores o iniciadores localizados a distancias diferentes de la región problema; o diferentes moldes tales como moléculas de ADN de cadena sencilla. También se puede utilizar la secuenciación del ARN mensajero.

En su mayor parte, la secuencia de codificación completa o parte de la misma para el polipéptido que tiene actividad de desaturasa, es de una fuente natural. Sin embargo, en algunas situaciones, es deseable modificar F toda o una porción de los codones, por ejemplo, para incrementar la expresión, utilizando codones preferidos del hospedero. Los codones preferidos del hospedero se pueden determinar a partir de los codones de más alta frecuencia en las proteínas expresadas en la cantidad más grande en una especie de hospedero en particular de interés. De esta manera, la secuencia de codificación de un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, puede ser sintetizada totalmente o en parte. Todo el ADN o porciones del mismo pueden ser sintetizados también para remover cualquier secuencia o región desestabilizante de la estructura secundaria, las cuales estarían presentes en el ARN mensajero transcrito. Todo el ADN o porciones del mismo pueden ser sintetizados también para alterar la composición de bases hacia una composición más preferible en la célula hospedera deseada. Métodos para sintetizar secuencias y unir secuencias entre sí, están bien f establecidos en la literatura. Mutagénesis y selección in vitro, mutagénesis dirigida a sitio u otros medios, se pueden utilizar para obtener mutaciones de genes de desaturasa que ocurren naturalmente para producir un polipéptido que tenga actividad de desaturasa in vivo con parámetros físicos y cinéticos más deseables para funcionar en la célula hospedera, tales como una vida media más larga o una velocidad de producción mayor de un ácido graso poliinsaturado deseado.

Las moléculas de ADNc deseables tienen una composición de A+T menor de 60%, preferiblemente menor de 50%. Sobre una escala localizada de una ventana de deslizamiento de 20 pares de bases, se prefiere f . que no existan regiones localizadas del ADNc con una composición de A+T mayor de 75%; con una ventana de 60 pares de bases, se prefiere que no existan regiones localizadas del ADNc con más de 60%, más preferiblemente sin regiones localizadas con una composición de A+T mayor de 55%.

Desaturasas de Mortierella alpina f 10 De particular interés son las enzimas ?5-desaturasa, ?6- desaturasa, ?l2-desaturasa y ?15 desaturasa de Mortierella alpina. El gen que codifica para la ?5-desaturasa de Mortierella alpina puede ser expresado en plantas transgénicas para efectuar una síntesis mayor de ARA a partir de DGLA, o ácido pinolénico a partir de LA, ácido taxoleico a partir de ácido 15 oleico o de Mead y de ?8, 11-20:2. También se pueden usar otras moléculas de ADN que sean sustancialmente idénticas en secuencia al ADN de ?5- • desaturasa de Mortierella alpina, o que codifiquen para polipéptidos que sean sustancialmente idénticos en secuencia al polipéptido de ?5-desaturasa de Mortierella alpina. El gen que codifica para la ?5-desaturasa de Mortierella 20 alpina puede ser expresado en plantas transgénicas o animales para efectuar una síntesis mayor de GLA a partir de ácido linoleico o ácido estearidónico (SDA) a partir de ALA o de ácido 6,9-ocatadecadienoico a partir ácido oleico. También se pueden usar otras moléculas de ADN que sean sustancialmente idénticas en secuencia al ADN de ?6-desaturasa de Mortierella alpina, o que codifiquen para polipéptidos que sean sustancialmente idénticos en secuencia al polipéptido de ?6-desaturasa de Mortierella alpina. • El gen que codifica para la ?12-desaturasa de Mortierella alpina 5 puede ser expresado en plantas transgénicas para efectuar la síntesis mayor de LA a partir de ácido oleico. También se pueden usar otras moléculas de ADN que sean sustancialmente idénticas al ADN de ?l2-desaturasa de Mortierella alpina, o que codifiquen para polipéptidos que sean sustancialmente idénticos al polipéptido de ?l2-desaturasa de Mortierella alpina. Por sustancialmente idéntico en secuencias se entiende una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que exhiba en orden de preferencia creciente, por lo menos 60%, 80%, 90% o 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de ?5-desaturasa de Mortierella alpina o secuencia de ácido nucleico que codifique para la secuencia de aminoácidos. Para polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación es generalmente de por lo menos 16 aminoácidos, de preferencia por lo menos 20 aminoácidos, o más preferiblemente 35 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación es generalmente de por lo menos 50 nucleótidos, de preferencia por lo menos 60 nucleótidos, y más preferiblemente por lo menos 75 nucleótidos, y muy preferiblemente 110 nucleótidos. Tipicamente, la homología se mide usando programas de análisis de secuencias, por ejemplo, el paquete de programas de análisis de secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), y f Mac Vector (Oxford Molecular Group. 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). Dicho programa iguala secuencias similares asignando grados de homología a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas incluyen típicamente , sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina y glutamina; ^ 10 serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. También se pueden hacer sustituciones sobre la base del carácter hidrofóbico o hidrofílico conservado (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982), o sobre la base de la capacidad para asumir una estructura secundaria similar del polipéptido (Chou y Fasman, Adv. Enzymol., 47: 45-148, 1978). 15 Expresión de genes de desaturasa f Una vez que se ha obtenido el ADN que codifica para un polipéptido de desaturasa, es colocado en un vector capaz de replicarse en una célula hospedera, o es propagado in vitro mediante técnicas tales como 20 PCR o PCR larga. Los vectores de replicación pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos, y similares. Los vectores deseables pueden incluir aquellos útiles para mutagénesis del gen de interés, o para la expresión del gen de interés en células hospederas. La técnica de PCF? larga ha hecho posible la propagación in vitro de grandes construcciones, de modo que modificaciones del gen de interés, tales como mutagénesis o adición de señales de expresión, y la propagación de las construcciones resultantes, f pueden ocurrir completamente in vitro sin el uso de un vector de replicación o una célula hospedera. Para la expresión de un polipéptido de desaturasa, regiones funcionales de inicio y término de la transcripción y traducción son enlazadas operablemente al ADN que codifica para el polipéptido de desaturasa. Las regiones de inicio y término de la transcripción y traducción se derivan de una f 10 variedad de fuentes no exclusivas, incluyendo el ADN que será expresado, genes que se sabe o se piensa son capaces de expresarse en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o a partir de un locus endógeno en una célula hospedera. La expresión en un tejido de la planta y/o parte de la planta presenta ciertas eficiencias, particularmente en los casos en donde el tejido o la parte es uno que es cosechado fácilmente, tal como semillas, hojas, frutos, flo.es, raíces, etc. La expresión puede ser dirigida hacia esa ubicación dentro de la planta, usando secuencias reguladoras específicas, tales como aquellas de los documentos USPN 5,463,174, USPN 4,943,674, USPN 5,106,739, USPN 5,175,095, USPN 5,420,034, USPN 5,188,958 y USPN 5,589,379. En forma alternativa, la proteína expresada puede ser una enzima que produzca un producto que puede ser incorporado, directamente o después de otras modificaciones, en una fracción de fluido de la planta hospedera. En el presente caso, la expresión de genes de desaturasa, o transcritos de desaturasa antisentido, puede alterar los niveles de PUFAs específicos, o derivados de los mismos, presentes en partes de la planta y/o f tejidos de la planta. La región de codificación del polipéptido de ?5-desaturasa es expresada por sí misma o con otros genes, para producir tejidos y/o partes de la planta que contengan proporciones mayores de PUFAs deseados o en los cuales la composición de PUFA se asemeje más estrechamente a la de la leche de la mama humana (Prieto ef al., publicación de PCT WO 95/24494). La región de terminación puede ser derivada de una región 3' del gen del cual ?^ß 10 la región de inicio se obtuvo de un gen distinto. Se conoce un gran número de regiones de terminación, y se ha encontrado que son satisfactorias en una variedad de hospederos de los mismos géneros y especies o de géneros y especies distintos. La región de terminación se selecciona usualmente más como una materia de conveniencia que debido a cualquier propiedad en particular. La elección de una céluü hospedera es influenciada en parte por f el perfil de PUFA deseados de la célula transgénica, y el perfil nativo de la célula hospedera. Como ejemplo, para la producción de ácido linoleico a partir de ácido oleico, la secuencia de ADN usada codifica para un polipéptido que 20 tiene actividad de ?12 desaturasa, y para la producción de GLA a partir de ácido linoleico, la secuencia de ADN usada codifica para un polipéptido que tiene actividad de ?6 desaturasa. El uso de una célula hospedera que expresa actividad de ?12 desaturasa, y que carece o está agotada en actividad de ?15 desaturasa, se puede usar con un cassette de expresión que permita la sobreexpresión únicamente de ?6 desaturasa, y es generalmente suficiente para proveer la producción incrementada de GLA en la célula transgénica. f Cuando la célula hospedera expresa actividad de ?9 desaturasa, la expresión de ?12 y ?6 desaturasa puede proveer una producción incrementada de GLA. En casos particulares en donde la expresión de actividad de ?6 desaturasa es acoplada con la expresión de actividad de ?12 desaturasa, es deseable que la célula hospedera tenga naturalmente, o sea mutada para que tenga, baja actividad de ?15 desaturasa. En forma alternativa, una célula hospedera para • 10 expresión de ?6 desaturasa puede tener, o puede ser mutada para que tenga, alta actividad de ?12 desaturasa. La expresión en una célula hospedera se puede llevar a cabo en forma transitoria o estable. La expresión transitoria puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contengan señales de expresión funcionales 15 en la célula hospedera, pero cuyas construcciones no se repliquen y rara vez se integren en la célula hospedera, o en donde la célula hospedera no esté proliferando. La expresión transitoria también se puede llevar a cabo induciendo la actividad de un promotor regulable enlazado operablemente al 20 gen de interés, aunque dichos sistemas inducibles exhiben con frecuencia un bajo nivel basal de expresión. La expresión estable se puede lograr mediante la introducción de una construcción que pueda integrarse en el genoma del hospedero, o que se replique en forma autónoma en la célula hospedera. La expresión estable del gen de interés se puede seleccionar mediante el uso de un marcador seleccionable localizado en, o transfectado con, la construcción de expresión, seguido de selección para las células que expresan el f marcador. Cuando la expresión estable resulta de integración, la integración de construcciones puede ocurrir aleatoriamente dentro del genoma del hospedero, o puede ser dirigida mediante el uso de construcciones que contengan regiones de homología con el genoma del hospedero suficientes para dirigir la recombinación con el locus del hospedero. Cuando las construcciones son dirigidas a un locus endógeno, todas o algunas de las f 10 regiones reguladoras de la transcripción y traducción pueden ser provistas por el locus endógeno. Cuando se desea la expresión incrementada del polipéptido de desaturasa en la planta original, se pueden utilizar varios métodos. Genes adicionales que codifican para el polipéptido de desaturasa pueden ser introducidos en el organismo hospedero. La expresión a partir del locus de desaturasa nativo también puede ser incrementada medie.ite recombinación f homologa, por ejemplo, insertando un promotor más fuerte en el genoma del hospedero para que cause expresión incrementada, removiendo secuencias de desestabilización del ARN mensajero o la proteína codificada eliminando 20 esa información del genoma del hospedero, o añadiendo secuencias de estabilización al ARN mensajero (véase los documentos USPN 4,910,141 y USPN 5,500,365).

Cuando es deseable expresar más de un gen diferente, regiones reguladoras apropiadas y métodos de expresión, los genes introducidos pueden ser propagados en la célula hospedera mediante el uso de vectores de replicación, o mediante integración en el genoma del hospedero. Cuando dos o más genes son expresados a partir de vectores de replicación separados, es deseable que cada vector tenga medios de replicación diferentes. Cada construcción introducida, sea integrada o no, debe tener medios de selección diferentes, y debe carecer de homología con las otras construcciones para mantener la expresión estable y evitar la redistribución de elementos entre las construcciones. Elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección y métodos de propagación de la construcción introducida pueden ser determinadas experimentalmente, de modo que todos los genes introducidos sean expresados a los niveles necesarios para proveer la síntesis de los productos deseados. Construcciones que comprendan el gen de interés pueden ser introducidas en una célula hospedera mediante técnicas estánda . Estas técnicas incluyen transfección, infección, impacto holístico, electroporación, microinyección, raspado, o cualquier otro método que introduzca el gen de interés en la célula hospedera (véase los documentos USPN 4,743,548, USPN 4,795,855, USPN 5,068,193, USPN 5,188,958, USPN 5,463,174, USPN 5,565,346 y USPN 5,565,347). Por conveniencia, una célula hospedera que haya sido manipulada mediante cualquier método para absorber una secuencia o construcción de ADN, será referida como "transformada" o "recombinante" en la presente. El hospedero en cuestión tendrá que tener por lo menos una copia de la construcción de expresión, y podrá tener dos o más, dependiendo de si el gen es integrado en el genoma, amplificado, o está presente en un elemento extracromosómico que tenga números de copias múltiples. La célula hospedera transformada puede ser identificada mediante selección para un marcador contenido en la construcción introducida. En forma alternativa, una construcción separada del marcador puede ser introducida por la construcción deseada, ya que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en las células hospederas. Típicamente, los hospederos transformados se seleccionan por su capacidad para crecer en medios selectivos. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico, o carecer de un factor necesario para el crecimiento del hospedero no transformado, tal como un factor de crecimiento o nutritivo. Un gen de marcador introducido para el mismo puede conferir resistencia a antibióticos, o codificar para un factor de crecimiento o enzima esencial, y permitir el crecimiento en medios selectivos cuando es expresado en la célula hospedera transformada. Deseablemente, la resistencia a kanamicina y el aminoglucósido G418 es de interés (véase el documento USPN 5,034,322). La selección de un hospedero transformado puede ocurrir también cuando la proteína de marcación expresada puede ser detectada, ya sea directamente o indirectamente. La proteína de marcación puede ser expresada sola o como una fusión con otra proteína. La proteína de marcación puede ser detectada por su actividad enzimática, por ejemplo, la ß-galactosidasa puede convertir el substrato X-gal a un producto coloreado, y la luciferasa puede convertir la luciferina a un producto emisor de luz. La proteína de marcación puede ser detectada por sus características de producción o modificación de la luz, por ejemplo, la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria fluoresce cuando es iluminada con luz azul. Se pueden usar anticuerpos para detectar la proteína de marcación o una marca molecular en, por ejemplo, una proteína de interés. Células que expresen la marca o proteína de marcación se pueden seleccionar, por ejemplo, visualmente, o mediante técnicas tales como FACS o toma panorámica usando anticuerpos. Los PUFAs producidos usando los presentes métodos y composiciones, se pueden encontrar en el tejido y/o parte de la planta hospedera como ácidos grasos libres o en formas conjugadas tales como acilgliceroles, fosfolípidos, sulfolípidos o glucolípidos, y se pueden extraer de la célula hospedera mediante varios métodos bien conocidos en la materia. Dichos medios pueden incluir extracción con solventes orgánicos, tratamiento con sonido, extracción supercrítica de fluido usando, por ejemplo, dióxido de carbono, y medios físicos tales como prensas, o combinaciones de los mismos. De particular interés es la extracción con hexano o metanol y cloroformo. Cuando es deseable, la capa acuosa puede ser acidificada para protonar las porciones con carga negativa, e incrementar de esta manera la separación de los productos deseados en la capa orgánica. Después de la extracción, los solventes orgánicos pueden ser removidos mediante evaporación bajo una corriente de nitrógeno. Cuando son aislados en formas conjugadas, los productos son digeridos enzimáticamente o químicamente para liberar el ácido graso libre o un conjugado menos complejo de interés, y son sometidos entonces a manipulaciones adicionales para obtener un producto final deseado. En forma deseable, las formas conjugadas de ácidos grasos son cortadas con hidróxido de potasio. En forma sorprendente, como se demuestra más detalladamente en los ejemplos siguientes, la expresión de la ?6 desaturasa de Mortierella conduce a la producción de ácido esteariodónico en el aceite extraído del tejido de la semilla de células de la planta hospedera. Además, la expresión de la ?6 desaturasa con desaturasas adicionales permitió la producción incrementada en SDA en el aceite de la semilla. De esta manera, la presente invención provee métodos para la producción de ácido esteariodónico (C18:4) en células vegetales hospederas. Los métodos permiten la producción de SDA en células vegetales hospederas que varían de aproximadamente 0.3% en peso a por lo menos aproximadamente 30% en peso, de preferencia de aproximadamente 5% en peso a por lo menos aproximadamente 25% en peso, más preferiblemente de aproximadamente 7% en peso a por lo menos aproximadamente 25% en peso. El SDA es producido de preferencia en el aceite de las semillas de plantas hospederas que contienen una o más construcciones de expresión como se describieron en la presente.

Además, la presente invención provee una fuente novedosa de aceites vegetales que contienen ácido esteariodónico. Los aceites se obtienen de preferencia del tejido de la semilla. Los aceites de la semilla contienen cantidades de SDA que varían de aproximadamente 0.3% en peso a por lo menos aproximadamente 30% en peso, de preferencia de aproximadamente 5% en peso a por lo menos aproximadamente 25% en peso, más preferiblemente de aproximadamente 7% en peso a por lo menos aproximadamente 25% en peso.

Purificación de ácidos grasos Si es necesaria una purificación adicional, se pueden utilizar métodos estándar. Dichos métodos incluyen extracción, tratamiento con urea, cristalización fraccional, CLAR, destilación fraccional, cromatografía en gel de sílice, centrifugación a alta velocidad o destilación, o combinaciones de estas técnicas. La protección de grupos reactivos tales como el ácido o los grupos alquenilo, se puede realizar en cualquier paso mediante técnicas conocidas, por ejemplo, alquilación o yodación. Los métodos usados incluyen metilación de los ácidos grasos para producir esteres metílicos. En forma similar, se pueden remover grupos protectores en cualquier paso. En forma deseable, la purificación de las fracciones que contengan ARA, DHA y EPA se lleva a cabo mediante tratamiento con urea y/o destilación fraccional.

Usos de los ácidos grasos Los usos de los ácidos grasos de la presente invención son varios. Las sondas basadas en las moléculas de ADN de la presente f invención pueden encontrar uso en métodos para aislar moléculas relacionadas, o en métodos para detectar organismos que expresan desaturasas. Cuando se usan como sondas, las moléculas de ADN u oligonucleótidos necesitan ser detectables. Esto se logra usualmente adheriendo una marca en un sitio interno, por ejemplo, mediante incorporación de un residuo modificado, o en el extremo 5' o 3'. Dichas marcas pueden ser detectables directamente, se pueden unir a una molécula secundaria que sea marcada detectablemente, o se pueden unir a una molécula secundaria no marcada y una molécula terciaria marcada en forma detectable; este procedimiento se puede extender mientras sea práctico para lograr una señal satisfactoriamente detectable sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciarios o de unión pueden incluir el uso de anticuerpos dirigid JS contra cualquier otra molécula, incluyendo marcas u f otros anticuerpos, o pueden incluir cualquier molécula que se una a alguna otra, por ejemplo, un sistema de biotina-estreptavidina/avidina. Las marcas detectables incluyen típicamente isótopos radiactivos, moléculas que producen o alteran químicamente o enzimáticamente la luz, enzimas que producen productos de reacción detectables, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes o moléculas cuya fluorescencia o características de emisión de luz cambian después de la unión. Ejemplos de métodos de marcación se pueden encontrar en el documento USPN 5,011 ,770. En forma alternativa, la unión de moléculas objetivo puede ser detectada directamente midiendo el cambio en el calor de solución después de la unión de la sonda al >f objetivo mediante calorimetría de titulación isotérmica, o revistiendo la sonda u objetivo sobre una superficie, y detectando el cambio en la dispersión de luz de la superficie producido por la unión del objetivo o sonda, respectivamente, como se puede hacer mediante el sistema BIAcore. La invención se entenderá mejor con relación a los siguientes ejemplos no limitativos. 10 EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión de ?-3 desaturasa de C. elegans en plantas transgénicas 15 La actividad de ^15/?-3 de Brassica napus se puede incrementar • mediante la expresión de una ?-3 desaturasa de C. elegans. Se obtuvo el clon de ADNc fat-1 (número de acceso del banco de genes L41807; Spychalla, J. P., Kinney, A. J., y Browse, J. 1997 P.N.A.S. 94, 1142-1147) a partir de John 20 Browse en la Universidad Estatal de Washington. El ADNc de fat-1 fue modificado mediante PCR para introducir sitios de clonación usando los siguientes iniciadores: Iniciador delantero de fat-1 : 5'-CUACUACUACUACTGCAGACAATGGTCGCTCATTCCTCA GA-3' (SEQ ID NO: 1 ). Iniciador inverso de fat-1 : • 5 5'-CAUCAUCAUCAUGCGGCCGCTTACTTGGCCTTTGCCTT-3' (SEQ ID NO: 2). Estos iniciadores permitieron la amplificación de la región de codificación completa, y añadieron sitios Pstl y Notl a los extremos 5' y 3', respectivamente. El producto de PCR fue subclonado en pAMP1 (GIBCO 10 BRL) usando el sistema CloneAmp (GIBCO BRL) para crear pCGN5562. La secuencia fue verificada mediante secuenciación de ambas cadenas para asegurarse que no se introdujeran cambios mediante PCR. Se observó una diferencia en un par de bases en la región de codificación de fat-1 de pCGN5562 contra ia secuencia de fat-1 del banco de genes. El C en la posición 705 de la secuencia de fat-1 fue cambiado a A en pCGN5562. Esto creó un cambio de u ? codón GAC a GAA, cambiando el átk residuo Asp en la posición 231 de fat-1 a un residuo Glu. Este cambio idéntico se observó en productos de dos reacciones de PCR independientes usando el molde de fat-1 , y más probablemente no es un resultado de una incorporación errónea de un nucleótido mediante PCR. Para expresión específica en semillas, la región de codificación de fat-1 fue cortada de pCGN5562 como un fragmento Pstl/Notl, e insertada entre los sitios Pstl/Notl del vector binario, pCGN8623, para crear pCGN5563. PCGN5563 puede ser introducido en Brassica napus mediante transformación mediada por Agrobacterium.

Construcción de pCGN8623 # 5 La región del polienlazador del cassette del promotor napin, pCGN7770, fue reemplazada ligando los siguientes oligonucleótidos: 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO: 3) y 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3, (SEQ 10 ID NO: 4). Estos oligonucleótidos fueron ligados en pCGN7770 digerido con Sall/Xhol para producir pCGN8619. Estos oligonucleótidos codifican para los sitios de restricción BamHl, Notl, Hindlll y Pstl. pCGN8619 contiene los oligonucleótidos orientados de modo que el sitio Pstl esté más cerca de la 15 región reguladora 5' de napin. Un fragmento que contiene la región reguladora 5' de napin, polienlazador, y la región 3' de napin, f.e removida de pCGN8619 mediante digestión con Asp718l. El fragmento fue rasurado en sus extremos • mediante llenado en la región 5' saliente con fragmento de Klenow, y ligado entonces en pCGN5139 que había sido digerido con Asp718l y Hindlll, y 20 rasurado en sus extremos mediante llenado en la región 5' saliente con fragmento de Klenow. Un plásmido que contiene la inserción orientada, de modo que el promotor napin estuviera más cerca del sitio Asp718l rasurado en sus extremos de pCGN5139, y la región 3' de napin estuviera más cerca del sitio Hindlll rasurado en sus extremos, fue sometido a análisis de secuencias para confirmar la orientación de la inserción y la integridad de las uniones de clonación. El plásmido resultante fue designado como pCGN8623. Para producir altos niveles de ácido estearidónico en Brassica, la ?-3 desaturasa de C. elegans puede ser combinada con ?6 y ?12 desaturasas de Mortierella alpina. Las plantas transformadas con pCGN5563 pueden ser cruzadas con plantas transformadas con pCGN5544 que expresan las ?6 y ?12 desaturasas, como se describe a continuación. Las semillas F1 resultantes pueden ser analizadas para • 10 contendido de ácido estearidónico, y las plantas F1 seleccionadas se pueden usar para autopolinización para producir semillas F2, o como donadores para la producción de dihaploides, o cruzas adicionales. Un método alternativo para combinar el ADNc de fat-1 con ?6 y ?12 desaturasas de M. alpina, es combinarlas en un ADN-T para 15 transformación. La región de codificación de fat-1 de pCGN5562, puede ser cortada como un fragmento Pstl/Notl, e insertada en pCGN8619 digerido con • Pstl/Notl. La unidad de transcripción que consiste de la región reguladora 5' de napin, la región de codificación de fat-1 , y la región reguladora 3' de napin, puede se cortada como un fragmento Sse8387l, e insertada en pCGN5544 20 cortado con Sse8387l. El plásmido resultante contendría tres unidades de transcripción de napin que contienen la ?-3 desaturasa de C. elegans, la ?6 desaturasa de M. alpina y la ?12 desaturasa de M. alpina, todas orientadas en la misma dirección que la unidad de transcripción de 35S/nptll/tml usada para la selección del tejido transformado. f EJEMPLO 2 5 Sobreexpresión de la actividad de ?15-desaturasa en ca óla transgénica La actividad de ?l 5-desturasa de Brassica napus puede ser incrementada mediante sobreexpresión del clon de ADNc de ?l5-desaturasa. Un clon de ADNc de ?l5-desturasa de B. napus se obtuvo • 10 mediante amplificación de PCR de ADNc de primera cadena derivado de B. napus ve. 212/86. Los iniciadores estuvieron basados en la secuencia publicada: #L01418 del banco de genes, Arondel et al, 1992 Science 258:1353-1355. Se utilizaron los siguientes iniciadores: 15 Delantero de Bnd 15 5'- • CUACUACUACUAGAGCTCAGCGATGGTTGTTGCTATGGAC-3' (SEQ ID NO. 5) Inverso de BND15 20 S'-CAUCAUCAUCAUGAATTCTTAATTGATTTTAGATTTG-S' (SEQ ID NO. 6) Estos iniciadores permitieron la amplificación de toda la región de codificación y agregaron sitios Sacl y EcoRI a los extremos 5'- y 3'-, respectivamente. f El producto de PCR se subclonó en pAMP1 (GIBCOBRL) utilizando el sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para crear pCGN5520. La secuencia se verificó secuenciando ambas cadenas para asegurar que el marco de lectura abierto permaneciera intacto. Para expresión específica de semilla, la región de codificación de ?15-desaturasa se separó de pCGN5520 como un fragmento BamHI/Sall y se insertó entre los sitios Bglll y Xhol de • 10 pCGN7770, para crear pCGN5557. El fragmento Pstl de pCGN5557 que contenía la región 5'-reguladora de napin, ?15-desaturasa de B. napus, y región 3'-reguladora de napin se insertó en el sitio Pstl del vector binario, pCGN5138 para producir pCGN5558. pCGN5558 se introdujo en Brassica napus a través de transformación mediada por Agrobacterium. 15 Para producir altos niveles de ácido estearidónico en Brassica, la ?15-desaturasa puede combinarse con ?6- y ?l2-desaturasas de Mortierella • alpina. Las plantas transformadas con PCGN5558 pueden cruzarse con plantas transformadas con pCGN5544 expresando las ?6- y ?12-desaturasas. Las semillas F1 resultantes se analizan para contenido de ácido estearidónico.

El análisis GC-FAME de la mitad de semillas F1 reveló una acumulación importante de SDA en el aceite de semilla de las líneas de Brassica. Los niveles SDA (18:4) de más de aproximadamente 25% se obtuvieron en líneas hemicigóticas y se proveen en el cuadro 1. Plantas F1 seleccionadas pueden utilizarse para autopolinización para producir semilla F2, o como donadoras para la producción de dihaploides, o cruzas adicionales. • • • • CUADRO 1 co CO • Un método alternativo para combinar la ?15-desaturasa de B. napus con ?6 y ?12 desaturasas de M. alpina es combinarlas en un ADN-T para transformación. El cassette de transcripción que consiste de la región 5'-reguladora de napin, la región de codificación de ?15-desaturasa, y la región 3'-reguladora de napin puede separarse de pCGN5557 como un fragmento Swal e insertarse en pCGN5544 digerida con Swah El plásmido resultante, pCGN5561 , contiene tres unidades de transcripción de napin que comprenden ?6 desaturasa de M. alpina, ?15-desaturasa de B. napus, y ?12 desaturasa de M. alpina, todas orientadas en la misma dirección como la unidad de transcripción 35S/nptll/tml utilizada para la selección de tejido transformado. Además, la secuencia de codificación de ?-3 desaturasa de C. elegans también se clonó en pCGN5544 para crear la construcción pCGN5565. La semillas T2 agrupadas de plantas que contienen 5561 contienen cantidades importantes de SDA (18:4), como se muestra en el cuadro 2. Los niveles de más de alrededor de 7% de SDA se obtuvieron en semillas de segregación 5561 agrupadas. Además, niveles importantes de SDA se obtuvieron a partir de semillas de líneas 5565 de Brassica, también mostrados en el cuadro 2. Como se muestra en el cuadro 2, con construcciones 5561 y 5565, pueden obtenerse niveles de SDA en la escala de alrededor de 0.8% en peso a más de alrededor de 7% en peso.

CUADRO 2 EJEMPLO 3 Expresión de ?5 Desaturasa para expresión en hojas de plantas f Ma29 es una ?5 desaturasa putativa de M. alpina como se determinó por homología de secuencias. Este experimento se diseñó para determinar si las hojas que expresan Ma29 (como se determinó por Northern) eran capaces de convertir DGLA (20:3) exógenamente aplicado en ARA (20:4). El ADNc de Ma29 desaturasa se modificó por PCR para 10 introducir sitios de restricción convenientes para clonación. La región de codificación de desaturasa se insertó en un cassette d35 bajo el control del promotor doble 35S para expresión en hojas de Brassica (pCGN5525) siguiendo los protocolos estándares (véase USPN 5,424,200 y USPN ,106,739). Las plantas transgénicas de Brassica que contenían pCGN5525 se generaron siguiendo los protocolos estándares (véase USPN 5,188,958 y USPN 5,463,174). f En el primer experimento, se utilizaron tres plantas: un control, LPOO4-1 , y dos transgénicas, 5525-23 y 5525-29. LPOO4 es una variedad de Brassica de bajo contenido de ácido linolénico. Se seleccionaron hojas de cada una para uno de tres tratamientos: agua, GLA o DGLA. GLA y DGLA se compraron como sales de sodio de NuChek Prep y se disolvieron en agua a 1 mg/ml. Las alícuotas se cubrieron bajo N2 y se almacenaron a -70 °C. Las hojas se trataron aplicando una gota de 50 µl a la superficie superior y se esparció cuidadosamente con un dedo cubierto con guante para cubrir la superficie entera. Las aplicaciones se realizaron aproximadamente 30 minutos antes del término del ciclo de luz para minimizar cualquier foto-oxidación de f los ácidos grasos aplicados. Después de 6 días de tratamiento se cultivó una hoja de cada tratamiento y se cortó a la mitad a través de la nervadura central. Una mitad se lavó con agua para intentar remover el ácido graso no incorporado. Las muestras de hojas se liofilizaron durante la noche, y la composición de ácido graso se determino por cromatografía de gas (GC). Los resultados se muestran en el cuadro 3. • # CUADRO 3 Análisis de ácido graso de hojas de plantas transgénicas Ma29 de Brassica • -l en Las hojas tratadas con GLA contenían de 1.56 a 2.4% en peso de GLA. El análisis de ácido graso mostró que la composición de lípidos de las hojas de control y las hojas transgénicas era esencialmente la misma. Las jf hojas de las plantas de control tratadas con DGLA contenían 1.2-1.9% en peso de DGLA y cantidades antecedentes de ARA (.26-.27% en peso). Las hojas transgénicas contenían sólo .2-.7% en peso de DGLA, pero los niveles de ARA se incrementaron (.74-1.1% en peso) indicando que DGLA se había convertido en ARA en estas hojas.

EXPRESIÓN EN SEMILLAS El propósito de este experimento era determinar si una construcción con el promotor de napin específico de semilla permitiría la expresión en semilla. 15 El ADNc de Ma29 se modificó por PCR para introducir sitios de clonación Xho\ hacia el extremo 5' y 3' de los codones de nicio y detención, f respectivamente, utilizando los siguientes iniciadores: Delantero de Madxho: 5'-CUACUACUACUACTCGAGCAAGATGGGAACGGACCAAGG 20 (SEQ ID NO. 7) Inverso de Madxho: 5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGCTACTCTTCCpGGGACGGAG (SEQ ID NO. 8) El producto de PCR se subclonó en pAMP1 (GIBCOBRL) utilizando el sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para crear pCGN5522 y la secuencia de ?5 desaturasa se verificó por secuenciación de ambas cadenas.

• Para expresión específica de semilla, la región de codificación 5 Ma29 se separó de pCGN5522 como un fragmento Xhol y se insertó en el sitio Sa/I del cassette de expresión de napin, pCGN3223, para crear pCGN5528. El fragmento Hind\\\ de pCGN5528 que contenía la región reguladora 5' de napin, la región de codificación Ma29 y la región reguladora 3' de napin se insertó en el sitio Hind\\\ de pCGN1557 para crear pCGN5531. 10 Dos copias de la unidad de transcripción de napin se insertaron una tras otra. Esta construcción doble puede permitir una expresión más alta de desaturasas por loci genético. Se introdujo pCGN5531 en cv.LP004 de Brassica napus a través de transformación mediada por Agrobacterium. La composición de ácido graso de veinte agrupaciones de semillas de semillas maduras T2 se analizó por GC. El cuadro 2 muestra los resultados obtenidos con líneas independientes transformadjs en f comparación con la semilla LP004 no transformada. Las semillas transgénicas que contienen pCGN5531 comprenden dos ácidos grasos que no están presentes en las semillas de control, identificados como ácido taxoleico (5,9- 20 18:2) y ácido pinolénico (5,9,12-18:3), con base en su elución relativa a los ácidos oleico y linoleico. Estos serán los productos esperados de la ?5 desaturación de ácidos oleico y linoleico. No se observaron otras diferencias en la composición de ácido graso en las semillas transgénicas.

EJEMPLO 4 Producción de ácidos grasos D5-desaturados en plantas transgénicas f La construcción de pCGN5531 (?5 desaturasa) y composición de ácido graso de agrupamientos de semillas T2 se describe en el ejemplo 3. Este ejemplo toma las semillas a través de una generación más y discute las maneras de llevar al máximo los ácidos grasos ?5-desaturados. El ejemplo 3 describe la composición de ácido graso de agrupamientos de semillas T2 de plantas cv. LP004 de B. napus • 10 transformadas con pCGN5531. Para investigar la segregación de ácidos grasos ?5-desaturados en las semillas T2 y para identificar las plantas individuales que se tomarán en generaciones subsecuentes, se realizaron análisis de las mitades de semillas. Las semillas se germinaron durante la noche en la oscuridad a 30 grados sobre papel filtro remojado en agua. El cotiledón externo se removió para análisis de GC y el resto de la plántula se plantó en tierra. Los resultados de algunos de estos análisis se muestran en el • cuadro 4 acompañante. ?5,9-18:2 acumuló hasta 12% de los ácidos grasos totales y ?5,9,12-18:3 acumuló hasta 0.77% de los ácidos grasos. Estas y otras plantas T2 individualmente seleccionadas se cultivaron en el invernadero para producir semilla T3.

• CUADRO 4 Composición de semilla agrupada de T2 CUADRO 4 ?o Análisis de ácido graso de la mitad de semillas de T2 seleccionadas de eventos para LP004 de pCGN5531 Para llevar al máximo la acumulación de ?5,9 18:2 en aceite de semilla, la construcción de pCGN5531 puede introducirse en una variedad de cañóla de alto contenido de ácido oleico. Una variedad de alto contenido de ácido oleico puede obtenerse por mutación, so-supresión o supresión antisentido de las ?12 y ?15 desaturasas u otros co-factores necesarios. Para llevar al máximo la acumulación de ?5,9,12 18:3 en cánola, la construcción de pCGN5531 puede introducirse en una cepa de cañóla de alto contenido de ácido linoleico. Esto puede lograrse cruzando plantas transformadas con pCGN5531 con plantas transformadas con pCGN5542 (?12-desaturasa de M. alpina). De manera alternativa, las ?5 y ?12 desaturasas puede combinarse en un ADN-T para transformación. La unidad de transcripción que consiste de la región 5'-reguladora de napin, la región de codificación de ? 12-desaturasa de M. alpina, y la región 3'-reguladora de napin puede separarse de pCGN5541 como un fragmento Notl. Los enlazadores Notl/Xbal pueden ligarse y el fragmento resultante insertarse en el sitio Xbal de pCGN5531. El plásmido resultante contendrá tres unidades de transcripción de napin que contienen la ?12 desaturasa de M. alpina, y dos copias de la unidad ?5 desaturasa/napin de napin//Vf. alpina, todas orientadas en la misma dirección como la unidad de transcripción 35S ptll/tml utilizada para seleccionar el tejido transformado.

EJEMPLO 5 Expresión de ?6 Desaturasa de M. alpina en Brassica napus Una secuencia de ácido nucleico de un clon de ADNc parcial, Ma524, que codifica para una ?6 desaturasa de ácido graso de Mortierella alpina se obtuvo por secuenciación aleatoria de clones de la genoteca de ADNc de M. alpina. El ADNc de Ma524 se modificó por PCR para introducir sitios de clonación utilizando los siguientes iniciadores: Ma524PCR-1 5'-CUACUACUACUATCTAGACTCGAGACCATGGCTGCTGCTCCAGTGT (SEQ ID NO. 9) Ma524PCR-2 5'-CAUCAUCAUCAUAGGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCAT (SEQ ID NO. 10) Estos iniciadores permitieron la amplificación de toda la región de codificación y agregaron sitios Xbal y Xhol al extremo 5' y sitios Xhol y Stul al extremo 3'. El producto de PCR se subclonó en pAMP1 (GIBCOBRL) utilizando el sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para crear pCGN5535 y la secuencia de ?6 desaturasa se verificó por secuenciación de ambas cadenas.

Construcción de pCGN5544 Las construcciones de expresión en planta se prepararon para expresar la ?6 desaturasa de Mortierella alpina y la ?12 desaturasa de Mortierella alpina en una célula hospedero de planta. Las construcciones preparadas utilizaron regiones de iniciación de transcripción derivadas de genes preferiblemente expresados en una semilla de planta. El aislamiento de • las secuencias de ADNc que codifica para ?6 desaturasa de M. alpina y ?12 5 desaturasa de M. alpina se describen en las publicaciones de PCT WO 98/46763 y WO 98/46764, las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Para expresión específica de semilla, la región de codificación Ma524 se separó de pCGN5535 como un fragmento Xhol y se insertó en el • 10 sitio Salí del cassette de expresión de napin, pCGN3223, para crear pCGN5536. El fragmento Notl de pCGN5536 que contenía la región 5'- reguladora de napin, la región de codificación Ma524, y la región reguladora 3' de napin se insertó en el sitio Notl de pCGN1557 para crear pCGN5538. El ADNc de 5542, que codifica para ?12 desaturasa de M. 15 alpina, se modificó por PCR para introducir sitios de clonación utilizando los siguientes iniciadores: Delantero de Ma648PCR 5'-CUACUACUACUAGGATCCATGGCACCTCCCAACACT (SEQ ID NO. 11 ) 20 Delantero de Ma648PCR 5'- CAUCAUCAUCAUGGTACCTCGAGTTACTTCTTGAAAAAGAC (SEQ ID NO. 12) Estos iniciadores permitieron la amplificación de toda la región de codificación y agregaron un sitio BamHl al extremo 5' y sitios Kpnl y Xhol al extremo 3'. El productor de PCR se subclonó en pAMP1 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) utilizando el sistema CloneAMP (Gibco-BRL) para crear pCGN5540, y la secuencia de ?12 desaturasa se verificó por secuenciación de ambas cadenas. Se preparó una construcción de expresión preferencial de semilla para la secuencia de ADNc de ?12 desaturasa. La región de codificación Ma648 se separó de pCGN5540 como un fragmento BamHI/Xhol y se insertó entre los sitios Bgl ll y Xhol del cassette de expresión de napin, pCGN3223 (descrito en USPN 5,639,790), para crear pCGN5542. Para poder expresar las secuencias de ?6 y ?12 desaturasa de M.alpina del mismo ADN-T se preparó la siguiente construcción para expresión preferencial en semillas. El fragmento Notl de pCGN5536 que contenía la región de iniciación de transcripción 5' de napin, la región de codificación Ma524, y la región de terminación de transcripción 3' de napin, se insertó en el sitio Notl de pCGN5542 para crear pCGN5544. Los cassettes de expresión se orientaron de tal manera que la dirección de transcripción de Ma524 y Ma648 y el marcador nptll es la misma. Para expresión especifica en semilla, la región de codificación Ma524 se separó de pCGN5535 como un fragmento Xhol y se insertó en el sitio Salí del cassette de expresión de napin, pCGN3223 para crear pCGN5536. El fragmento Notl de pCGN5536 que contenía la región reguladora 5' de napin, la región de codificación Ma524, y la región reguladora 3" de napin se insertó en el sitio Notl de pCGN1557 para crear pCGN5538. Se introdujo pCGN5538 en cv.LP004 de Brassica napus a través de • 5 transformación mediada por Agrobacterium. Las semillas T2 en maduración se recolectaron de 6 eventos de transformación independientes en el invernadero. La composición de ácido graso de semillas individuales se analizó por GC. El cuadro 5 muestra los resultados de las semillas LP004 de control y seis líneas 5538. Todas las 10 líneas 5538 excepto la #8 produjeron semillas que contenían GLA. La • presencia de GLA se segregó en estas semillas como se esperó para la población de semillas T2. Además de GLA, la ?6 desaturasa de M. alpina es capaz de producir 18:4 (ácido estearidónico) y otro ácido graso: ?6,9-18:2.

• • • CUADRO 5 Análisis de ácido graso de semillas de plantas transgénicas Ma524 de Brassica tp n • • • • • Las cruzas se hicieron entre líneas 5544 transgénicas de Brassica produciendo GLA y variedades de cañóla no transformada estándar. Se llevaron a cabo cruzas entre las líneas 5544 con Quantum, Eagle y Ebony. La mitad de las semillas F1 se analizaron para contenido de SDA y plantas seleccionadas se cultivaron y se dejaron autopolinizar para producir semillas F2. El análisis GC-FAME de las muestras tanto de semillas individuales como de mitades de semillas de dichas cruzas revelaron acumulación de niveles importantes de SDA (cuadro 6). El análisis de la mitad de las semillas de 55445-LP108-6-16 con variedad Eagle de cañóla produjo un nivel de aproximadamente 6.3% SDA. El análisis de semilla F2 de una cruza de 5544-LP108-12-1 con la variedad Ebony de cañóla produjo niveles de SDA tan altos como alrededor de 7.4% de SDA.

• CUADRO 6 o EJEMPLO 6 Producción de ?6.9 18:2 en aceite de cañ la • El ejemplo 5 describió la construcción de pCGN5538 diseñada para expresar la ?6 desaturasa de M. alpina en semillas de cañóla transgénica. El cuadro 4 en ese ejemplo mostró ejemplos de análisis de semilla individual de 6 eventos transgénicos independientes. Se produjeron cantidades importantes de GLA, además del ácido graso de ?-6,9 18:2. Un total de 29 plantas transgénicas independientes transformadas con pCGN5538 del cultivo LP004 de bajo contenido de ácido linolénico se regeneraron y se cultivaron en el invernadero. El cuadro 7 muestra la composición de ácido graso de agrupaciones de 20 semillas de semilla T2 de cada evento. Siete de las líneas contenían más de 2% de ?-6,9 18:2 en las agrupaciones de semilla. Para identificar y seleccionar plantas con altas cantidades de ?-6,9 18:2 para tomarse en generaciones subsecuentes, se realizaron análisis de las mitades de la semilla. Las semillas se germinaron durante la noche en la oscuridad a 30 grados sobre papel filtro remojado en agua. El cotiledón externo se removió para análisis de GC y el resto de la plántula se plantó en tierra. Con base en los resultados del análisis de ácido graso, las plantas T2 seleccionadas se cultivaron en el invernadero para producir semilla T3. El ciclo de selección se repitió; las agrupaciones de semilla T3 se analizaron para ?-6,9 18:2, las mitades de semilla T3 se cortaron y analizaron, y las plantas T3 seleccionadas se cultivaron en el invernadero para producir semilla T4. Las agrupaciones de semilla T4 se analizaron para composición de ácido graso. El cuadro 6 resume los resultados de este procedimiento para líneas derivadas de uno de los eventos f transgénicos originales, 5538-LP004-25. De esta manera, los niveles de ?-6,9 18:2 se habían mantenido a través de tres generaciones. Para llevar al máximo la cantidad de ?-6,9 18:2 que puede producirse, la construcción de pCGN5538 puede introducirse en una variedad de cañóla de alto contenido de ácido oleico ya sea por transformación o cruzamiento. Una variedad de alto contenido de ácido oleico puede obtenerse • 10 por mutación, co-supresión o supresión anti-sentido de las ?12 y ?15 desaturasas u otros co-factores necesarios.

• • • CUADRO 7 en • • Tl 71 # • • oo Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta descripción indican el nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara específica e individualmente para incorporarse como referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir ácido estearidónico en una semilla oleaginosa, dicho método comprende cultivar una planta que tiene integrado en su genoma una primera construcción de ADN que comprende, en la dirección 5' a 3' de transcripción, un promotor funcional en una célula de semilla de planta, una secuencia de ADN que codifica para una delta-seis desaturasa, y una región de terminación de transcripción funcional en una célula de planta, y cultivar dicha planta bajo condiciones en las cuales dicha delta-seis desaturasa es expresada.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho método comprende cultivar una planta que tiene una segunda construcción que tiene en dirección 5' a 3' de transcripción, un promotor funcione en una célula de semilla de planta, una secuencia de ADN que codifica para una delta-12 desaturasa.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho método comprende cultivar una planta que tiene una tercera construcción que tiene en dirección 5' a 3' de transcripción, un promotor funcional en una célula de semilla de planta, una secuencia de ADN que codifica para una delta-15 desaturasa.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha secuencia de codificación de tioesterasa es del género Mortierella. •

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 5 caracterizado además porque dicho promotor es el promotor napin.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho promotor es de la región de iniciación de transcripción de la subunidad 7S de ß-conglicinina de soya.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , • 10 caracterizado además porque dichos triglicéridos de semilla de planta comprenden alrededor de 5 por ciento en peso o más de ácido estearidónico.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos triglicéridos de semilla de planta comprenden alrededor de 10 por ciento en peso o más de ácido estearidónico. 15

9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos triglióéridos de semilla de planta • comprenden alrededor de 15 por ciento en peso o más de ácido estearidónico.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos triglicéridos de semilla de planta 20 comprenden alrededor de 20 por ciento en peso o más de ácido estearidónico.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos triglicéridos de semilla de planta comprenden alrededor de 25 por ciento en peso o más de ácido estearidónico.

12.- Una semilla que comprende alrededor de 5 por ciento en peso o más de ácido estearidónico como un componente de ácidos grasos totales encontrados en triglicéridos de semilla.

13.- La semilla de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende alrededor de 10 por ciento en peso o más de ácido estearidónico como un componente de dichos triglicéridos de semilla.

14.- La semilla de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque comprende alrededor de 15 por ciento en peso o más de ácido estearidónico como un componente de dichos triglicéridos de semilla.

15.- La semilla de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque comprende alrededor de 20 por ciento en peso o más de ácido estearidónico como un componente de dichos triglicéridos de semilla.

16.- La semilla de conformidad con Li reivindicación 13, caracterizada además porque comprende alrededor de 25 por ciento en peso o más de ácido estearidónico como un componente de dichos triglicéridos de semilla.

17.- El aceite de semilla obtenido de la semilla de conformidad con la reivindicación 12.