FI120266B - Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa - Google Patents

Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa Download PDF

Info

Publication number
FI120266B
FI120266B FI944841A FI944841A FI120266B FI 120266 B FI120266 B FI 120266B FI 944841 A FI944841 A FI 944841A FI 944841 A FI944841 A FI 944841A FI 120266 B FI120266 B FI 120266B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
protein
chimeric
peptide
dna
expression
Prior art date
Application number
FI944841A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI944841A0 (fi
FI944841A (fi
Inventor
Maurice M Moloney
Original Assignee
Sembiosys Genetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sembiosys Genetics Inc filed Critical Sembiosys Genetics Inc
Priority to FI944841A priority Critical patent/FI120266B/fi
Publication of FI944841A0 publication Critical patent/FI944841A0/fi
Publication of FI944841A publication Critical patent/FI944841A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120266B publication Critical patent/FI120266B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Seasonings (AREA)
  • Edible Oils And Fats (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kas veissa 5 Tämä keksintö koskee menetelmää halutun proteiinin valmistamiseksi rekombinanttimenetelmällä siten, että proteiini on helposti puhdistettavissa isäntäsolun osista. Esimerkkinä menetelmästä on halutun proteiinin ilmentäminen kasveissa, erityisesti siemenissä, kimeerisenä peptidinä, johon sisäl-10 tyvät öljyonteloproteiini ja haluttu proteiini.
Useita erilaisia proteiineja on ilmennetty kasveissa. Vaikka vieraiden proteiinien ilmentymisen tuottaminen kasveissa on osoitettu yleensä mahdolliseksi, puhdistettujen proteiinien 15 saamiselle tästä lähteestä on joitakin rajoituksia. Näitä rajoituksia ovat se, että tarvitaan puhdistusvaihe, jotta saataisiin puhdasta proteiinia, jossa ei käytännöllisesti katsoen ole kasviperäisiä aineita, sekä sen että valmistetuissa uutteissa voi tapahtua hajoamista puhdistusprosessin 20 aikana, kun saadut rekombinanttiproteiinit ovat tekemisissä vettä sisältävien puskurien kanssa.
• ·
Kasvit, joiden siemenet ovat öljypitoisia, kuten soijapapu, • · · · rypsi, auringonkukka ja useat muut kasvilajit, kuten ohra, • · · 25 porkkana jne. varastoivat siemenissään triglyseridejä. Kas- **” vissa nämä triglyseridit ovat energian lähteinä itävälle • · · siemenelle ja sen jälkeen taimelle. Triglyseridejä käytetään • · · '·* * laajalti kasvisöljyinä ruoissa ja ruoanvalmistuksessa sekä myös joissakin teollisissa sovelluksissa.
• · · v ·* 3 0 • · ·
Triglyseridit ovat veteen sekoittumattomia ja erottuvat kel- :·]·. luen vesiliuosten pinnalla tai muodostaen pieniä pallosia eli • · liposomeja suspensiona vesifaasissa. Tällaiset palloset liit- • · *“ tyvät luonnostaan yhteen, ellei modifioitu pintakerros ..!·* 35 stabiloi niitä. Tämän yhteenliittymisen seurauksena voi olla menissä, triglyseridin varastoituessa, öljypalloset ovat itse asiassa kapseloituneita lipidi- tai öljyonteloita, jotka ovat : suspensio, jossa pallosten koot ovat sattumanvaraisia. Sie- • · 2 yleensä yhtenäisen kokoisia. Näiden öljyonteloiden pintaan liittyneenä on puolikas yksikkömembraani täynnä useita erilaisia proteiineja, joita kutsutaan yhteisesti öljyonteloproteiineiksi.
5
Ainakin yhdellä öljyonteloproteiinien luokalla on joitakin ominaisuuksia, jotka ovat lajienvälisesti hyvin säilyneitä. Tämän öljyonteloproteiiniluokan proteiineja kutsutaan "ole-osiineiksi". Näiden proteiinien N- ja C-päät näyttävät olevan 10 hyvin erilaisia, kun taas lipofiilinen sisäalue (ydin, central core) näyttää olevan lajienvälisesti hyvin säilynyt. Oleosiinit ovat liittyneet voimakkaasti öljyonteloihin. Tämä voimakas öljyonteloihin liittyminen voi suurimmaksi osaksi johtua ytimen lipofiilisestä luonteesta. Siksi on hyödyllistä 15 selvittää, voidaanko öljyonteloproteiineja, esimerkiksi ole-osiineja, käyttää yhdistelmäproteiinien valmistuksessa välineenä erottaa yhdistelmäproteiinit kasviperäisistä aineista .
20 Asiaa käsittelevä kirjallisuus
Vieraiden (yhdistelmä-) peptidien tuottamista kasveissa on tutkittu käyttäen useita erilaisia menettelytapoja, kuten .·[·. transkriptionaaliset fuusiot käyttäen voimakasta konstitutii- • · · I 25 vista kasvipromoottoria (esim. kukkakaalin mosaiikkiviruk-• · · *** sesta - Sijmons et ai. 1990. Bio/Technology 8:217-221) ja • · · •••j vieraan proteiinin koodausta; transkriptionaaliset fuusiot • · · ’·* * kasvinosalle spesifisiin sekvensseihin (Radke et ai. 1988.
Theoret. Appi. Genet. 75:685-694); ja translationaaliset • · 9 : 3 0 fuusiot, jotka vaativat myöhempää rekombinanttiproteiinin katkaisua (Vander Kerkove et ai. 1989. Bio/Technology 7:929- • · · 932). Vieraisiin proteiineihin, joita on ilmennetty kas- • · visoluissa, kuuluu aktiivisia proteiineja bakteereista (Fra- • · ’·;·* ley et ai. 1983. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 80: 4803-4807), *:* 35 eläimistä (Misra ja Gedamu 1989. Theor. Appi. Genet. 78:161- • · · · ^ 168), sienistä ja eri kasvilajeista (Fraley et ai. 1983.
• ·
Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 80:4803-4807).
3
Joitakin proteiineja, yleensä integraatiomarkkereita, on ilmennetty solukkospesifisellä tavalla, muun muassa siemenissä (Sen Gupta-Gopalan et ai. 1985. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 82:3320-3324); Radke et ai. 1988. Theor. Appi. Genet. 75:685-5 694) . Nämä raportit ovat keskittyneet erityisesti siementen varastointiproteiinien promoottorien käyttöön välineenä erityisesti siemenissä tapahtuvan ilmentymisen aikaansaamiseen. Tällaista systeemiä käyttäen Vanderkerkove et ai. 1989. Bio/Technol. 7:929-932, ilmensivät arvokasta 10 peptidiä (leu-enkefaliinia) Arabidopsis thalianan ja Brassica napuksen siemenissä. Tämän peptidin saanto oli varsin pieni, mutta osoittaa, että on mahdollista ilmentää eläimen peptidi-hormonia kasvisolukoissa. Maissin oleosiinia on ilmennetty siemenen öljyonteloissa maissin oleosiinigeenillä transfor-15 moidussa Brassica napuksessa. Geeni ilmentyi Brassican napii-nia, tärkeää siemenen varastoproteiinia, koodaavan geenin säätelyelementtien valvonnassa. Ilmentymisen ajallisen säätelyn ja solukkospesifisyyden raportoitiin olleen napiinigeenin promoottorin ja terminaattorin mukaista (korrektia). Katso 20 Lee et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1991. 88:6181-6185.
·;··· Öljypalloset, joita muodostuu siemenissä, näyttävät olevan kaikki (lähes) samankokokoisia, mikä viittaa siihen, että ne ovat stabiloituja (Huang A. H. C. 1985. Modern Meths. Plant • · · *#! 25 Analysis. Voi. 1:145-151. Springer Verlag. Berlin). Lähempi *'** tarkastelu on osoittanut, että ne eivät ole yksinkertaisia • · · öljypallosia, vaan ennemminkin menbraanin ympäröimiä öljyon- • · · *·’ * teloita. Näitä öljyonteloita elektronimikroskopistit ovat nimittäneet eri tavoin, oleosomeiksi, lipidionteloiksi (lipid ··· y ! 30 bodies) ja sferosomeiksi (Gurr M. I. 1980. Biochemistry of
Plants. 4:205-248. Acad. Press. Orlando, Florida). Joidenkin »»« lajien öljyonteloita on tutkittu, ja yleinen johtopäätös on, • · *..! että niitä ympäröi harvinainen "puoliyksikkömembraani" , joka • · ’·;·* ei ole klassinen lipidikaksoiskerros, vaan pikemminkin ..)·* 35 yksinkertainen amfofiilinen kerros, jossa sisäpuolella on hydrofobisia ryhmiä ja ulkopuolella hydrofiilisia (Huang A.
• « H. C. 1985. Modern Meths. Plant Analysis. Voi. 1:145-151. Springer Verlag. Berliini.).
4
Lipidionteloiden sisällön analyysi on osoittanut, että paitsi triglyseridejä ja membraanimateriaalia, niissä on myös monia polypeptidejä/proteiineja liittyneinä öljyontelon pintaan tai 5 sisäosaan (Bowman-Vance ja Huang. 1987. J. Biol. Chem. 262:11275-11279, Murphy et ai. 1989. Biochem. J. 258:285 -293, Taylor et ai. 1990. Planta. 181:18-26). Öljyontelopro-teiineja on tunnistettu varsin monissa taksonomisesti erilaisissa kasvilajeissa (Moreau et ai. 1980. Plant Physiol. 10 65:1176-1180, Qu et ai. 1986. Biochem. J. 235:57-65), ja on osoitettu, että ne sijaitsevat ainoastaan öljyonteloissa, eikä niitä löydy vegetatiivisten solukoiden organelleista. Brassica napuksen (rapsi) kehittyvien siementen öljyonteloi-hin liittyneinä on ainakin kolme polypeptidiä (Taylor et ai. 15 1990. Planta. 181:18-26). Öljyonteloihin liittyneiden pro teiinien määrät ja koot voivat vaihdella lajista toiseen. Esimerkiksi ohrassa on kaksi immunologisesti toisistaan eroavaa polypeptidiluokkaa, jotka on löydetty öljyonteloista (Bowman-Vance ja Huang. 1988. J. Biol. Chem. 263:1476-1481). 20 Oleosiineissa on osoitettu olevan vaihtelevasti hydro-fiilisiä, hydrofobisia ja hydrofiilisiä alueita (Bowman-Vance ja Huang. 1987. J. Biol. Chem. 262:11275-11279). Ohran, ,5. rapsin ja porkkanan oleosiinien aminohapposekvenssit on saatu selville. Katso Qu ja Huang 1990. J. Biol. Chem. 265:2238- ' 25 2243, Hatzopoulos et ai. 1990. Plant Cell 2:457-467, vas- • · · ***j taavasti. Öljypitoisessa siemenessä, kuten rapsin siemenissä, i·· oleosiini voi muodostaa 8 % (Taylor et ai. 1990. Planta • · · *.’* 181:18-26) - 20 % (Murphy et ai. 1989. Biochem. J. 258:285- 293) siemenen proteiinin kokonaismäärästä. Sellainen pi- • · · : 3 0 tosuustaso on verrattavissa monien siemenen varastoproteii- nien havaittuun tasoon.
• · · • · · • · · • · *.,* Öl jyonteloproteiineja koodaavia geenejä on raportoitu kah- • · **··* des ta lajista, maissista (Zea mays, Bowman-Vance ja Huang.
·!· 35 1987. J. Biol. Chem. 262:11275-11279 ja Qu ja Huang 1990: J.
• · · · :*·.· Biol. Chem. 265:2238-2243) ja porkkanasta (Hatzopoulos et ai.
1990. Plant Cell 2:457-467).
5
Yhteenveto keksinnöstä
Tarjotaan menetelmiä ja koostumuksia sellaisten peptidien tuottamiseen, joita voidaan helposti puhdistaa isännän prote-5 iineista. Menetelmään sisältyy vaiheet, joissa valmistetaan kimeerinen DNA-rakenne, joka sisältää öljyontelospesifistä sekvenssiä koodaavaan sekvenssin, johon sisältyy siemens-pesifisen öljyonteloproteiinin geeni tai sekvenssi, joka koodaa ainakin osaa öljyonteloproteiinin hydrofobisesta yti-10 mestä ja haluttua proteiinia koodaava sekvenssi, josta voidaan valmistaa ilmentymiskasetti, joka sisältää kimeerisen DNA-rakenteen, isäntäsolun transformoiminen ilmentymis-kasetilla olosuhteissa, jotka mahdollistavat integroitumisen genomiin ja saadun siirtogeenisen kasvin kasvattaminen tuot-15 tamaan siemeniä, joissa kiinnostuksen kohteena oleva polypep-tidi ilmentyy fuusioproteiinina oleosiinin kanssa.
Haluttu polypeptidi voidaan puhdistaa eristämällä siemenen soluista öljyontelot ja rikkomalla ne siten, että fuusiop-20 roteiini vapautuu. Öljyonteloproteiini erottuu sitten helposti muista proteiineista ja kasviperäisistä aineista faasi-·;··· erotuksella. Haluttaessa voidaan sijoittaa katkaisukohta ainakin joko ennen halutun proteiinin N-päätä tai sen C-pään • · · · jälkeen, jotta fuusioproteiini voidaan katkaista ja erotella • · · ' l' 25 osapeptideikseen faasierotuksen avulla. Tuotantosysteemi siis *’** mahdollistaa kimeerisen peptidin kohdistamisen sen öljyonte- • · · •|*| loproteiiniosan toiminnan avulla öljyonteloihin, mikä vuoros- • · · *·’ taan mahdollistaa halutun proteiinin puhdistamisen nopeasti.
Tästä tuotantosysteemistä on hyötyä useiden peptidien tuotan- • · · · 30 nossa, esimerkiksi sellaisten, joilla on farmaseuttisia, entsymaattisia, Teologisia tai adhesiivisia ominaisuuksia.
•« · • · · • · *..! Tämä keksintö tarjoaa kimeerisen DNA-konstruktion, johon "/ sisältyy: a) ensimmäinen DNA-sekvenssi, joka koodaa 35 oleosiinia tai sen osaa, joka on riittävä suuntaamaan kon- :*·.· struktion öljyonteloon ja • · (b) toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa peptidiä sillä varauk sella, että mainittu peptidi on muu kuin osa luonnossa esiin tyvästä Arabidopsiksen tai Brassican oleosiiniproteiinista.
6 5 Keksintö kohdistuu erityisesti patenttivaatimusten 1-4 mukaiseen kimeeriseen DNA-konstruktiin.
Tämä keksintö tarjoaa edelleen ilmentymiskasetin, joka käsittää: 10 komponentteina, transkription etenemissuunnassa: - säätelevän DNA-sekvenssin, joka käsittää siemenessä ilmentyvän geenin 5'-päästä osan, joka riittää aiheuttamaan DNA-sekvenssin ilmentymisen siemenissä; 15 - kimeerisen DNA-sekvenssin, joka käsittää (a) ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa oleosiinia tai sen osaa, joka riittää antamaan proteiinille ohjautuvuuden öljyonteloon, ja mainittu ensimmäinen DNA-sekvenssi sisältää ainakin yhden restriktiokohdan, ja (b) toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa 20 peptidiä, sillä varauksella, että mainittu peptidi on muu kuin osa luonnossa esiintyvästä Arabidopsiksen tai Brassican oleosiiniproteiinista, sekä • · - translaation ja transkription lopetusalueen, missä mainitut komponentit liittyvät yhteen toimivasti ja mainitun kimeeri- • · · ’ 1 25 sen DNA-sekvenssin ilmentymistä säätelee mainittu säätelevä • · · ···· DNA-sekvenssi.
• · · • · · · • · · V * Tämä keksintö tarjoaa käyttöön myös ilmentymiskasetin, joka käsittää: :: : 30 - öljyonteloproteiinin (OBP) geenin, joka sisältää 5 1-pään ja translaation aloituskohdan välisestä säätelyalueesta riittä- • ♦ ♦ vän osan, jotta mainittu geeni ilmentyy siemensolussa, ja • · · ·..* joka sisältää ainakin yhden restriktiokohdan välillä heti • · *·;♦* ensimmäisen metioniinin kodonin 5'-puolelta mainitun OBP- ·;· 35 geenin translaation lopetuskohdan 5'-puolelle, ja ♦ ··· samassa lukukehyksessä mainitun OBP-geenin kanssa, missä mainittu DNA-sekvenssi koodaa peptidiä, joka on muu kuin osa :*·.· - mainittuun restriktiokohtaan insertoidun DNA-sekvenssin • · 7
Arabidopsiksen tai Brassican luonnossa esiintyvää oleosiinip-roteiinia.
Tämä keksintö tarjoaa edelleen käyttöön ilmentymiskasetin, 5 joka käsittää: ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa peptidiä, sillä varauksella, että mainittu peptidi on muu kuin osa luonnossa esiintyvästä Arabidopsiksen tai Brassican oleosiiniproteii-nista, insertoituna lukukehykseen öljyonteloproteiinin (OBP) 10 -geeniin, joka sisältää 5'-pään ja translaation aloituskohdan välisestä alueesta riittävän osan, jotta mainittu geeni ilmentyy siemenessä. Mainittu sekvenssi on insertoitu mainittuun geeniin siten, että se ilmentyy mainitun säätelyalueen ohjauksessa.
15 Tämä keksintö kohdistuu erityisesti patenttivaatimusten 5-12 mukaiseen ilmentymiskasettiin.
Tämä keksintö tarjoaa edelleen käyttöön menetelmän kiinnos-20 tuksen kohteena olevan peptidin ilmentämiseen siemenissä, jolloin mainittu menetelmä käsittää: • · · · · • · isäntäkasvin solun transformoimisen ilmentymiskasetilla geno-misen integraation sallivissa olosuhteissa, missä mainittu • · · * * 25 ilmentymiskasetti käsittää osinaan, transkription etenemis- • · · ***! suunnassa, ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka käsittää riittä- • · · • vän osan siemenessä ilmentyvän geenin translaation aloitus- • · · ·.* * kohdan 5'-puolelta, jotta DNA-sekvenssi ilmentyy siemenessä; toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa jotakin oleosiinia tai sen ··· : 30 osaa, joka riittää suuntaamaan proteiinin öljyonteloon. Mai- nittuun toiseen DNA-sekvenssiin sisältyy ainakin yksi luon- • · · nollinen tai synteettinen restriktiokohta, johon on insertoi- • · · *..· tu lukukehyksessä kolmas DNA-sekvenssi, joka koodaa haluttua • · *·;·’ peptidiä sillä varauksella, että mainittu peptidi on muu kuin ·;· 35 osa luonnossa esiintyvästä Arabidopsiksen tai Brassican ole- • · · · :*·,· osiiniproteiinista, sekä translaation ja transkription lope- • · tuskohdan. Mainitut osat on liitetty yhteen toimivasti ja mainittu ensimmäinen DNA-sekvenssi säätelee mainitun toisen DNA-sekvenssin ilmentymistä, jotta ilmentyminen tapahtuu siemenissä.
8 Tämä keksintö tarjoaa myös menetelmän kiinnostuksen kohteena 5 olevan peptidin saamiseksi puhdistettuna. Mainittu menetelmä käsittää: isäntäkasvin solun transformoimisen DNA-konstruktiolla geno-misen integraation mahdollistavissa olosuhteissa siten, että 10 mainittu DNA-konstruktio käsittää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa haluttua peptidiä sillä varauksella, että mainittu peptidi on muu kuin osa luonnossa esiintyvästä Arapidop-siksen tai Brassican oleosiiniproteiinistä insertoituna luku-kehyksessä öljyonteloproteiinigeeniin, johon sisältyy riittä-15 vä osa säätelyalueesta mainitun öljyonteloproteiinigeenin translaation aloituskohdan 5'-puolella, jotta mainittu geeni ilmentyy siemenissä. Tässä mainittu sekvenssi insertoidaan mainittuun geeniin sellaiseen kohtaan, että mainittu säätelevä alue ohjaa mainitun DNA-sekvenssin ilmentymistä, jolloin 20 mainittu DNA-konstruktio integroituu mainitun kasvisolun genomiin; • · mainitun kasvin kasvattamisen siementen tuottamiseksi, joi-loin mainittu haluttu peptidi ilmentyy fuusioproteiinina • · · *l 25 mainitun öljyonteloproteiinigeenin ilmentymistuotteen kanssa; • · · ···· ·«« ···'· öljyonteloiden eristämisen mainitun siemenen soluista; ··· • · « ♦ ♦ · mainittujen öljyonteloiden rikkomiden, jolloin mainittu fuu- ··· : 30 sioproteiini vapautuu, sekä mainitun halutun proteiinin puh- distamisen.
• ·· • · * • · · ·..* Keksintö kohdistuu erityisesti patenttivaatimusten 13-20 • · *···’ mukaiseen menetelmään.
·:· 35
• •M
muksessa 22 kuvatun mukainen, suuntautumiskyvystä öljyonte-loon tunnettu fuusiopolypeptidi.
:*·.· Tämän keksinnön yhteydessä tarjotaan käyttöön patenttivaati- • · 9 Tässä on kuvattu fuusiopolypeptidi, joka käsittää: a) ensimmäisen peptidin, muotoa 5
aa25-aa26-V-V-T-L-aa3i-P-A A A T
aa34 - G - G - aa36 - L - L - aa39 - L - aa4* -
M
G - Γ-aa44 - L-aa46 - aa47-T - L-I-SL S V V
aasi - L - aa&3 - V - A - T - P - L - aa" - L -
V V
L-F-S-P- V-L-V-P-A-A-L-aa73-I I LI
aa?4 - aa75 - aa7* - aa77 - aa7® - G - F - L -
G L
S - S - aa®7 - G - V - aa®9 - aa" - L - S -T I IT
aa" - aa94 - S - aa9* - aa97 - aa9® - aa99 - aa100 - aaid
T
.,*·* sillä varauksella, että mainittu ensimmäinen peptidi on muu kuin porkkanan 16 kD:n oleosiinissa tai maissin 18 kD:n tai • · ··· 16 kD:n oleosiinissa luonnostaan esiintyvä, ja että siinä ···· 25 10 aa voi olla mikä tahansa aminohappo, .···, aa on neutraali alifaattinen aminohappo, • · · aa31 on neutraali 3-6 hiiliatomin substituoimaton alifaattinen ... aminohappo, • · · aa33 on neutraali 3-6 hiiliatomin substituoimaton alifaattinen • * *.·* 15 aminohappo, aa36 on neutraali 3-5 hiiliatomin substituoimaton alifaattinen • · .*··. aminohappo, ·. aa on neutraali, substituoimaton aminohappo, ··· 39 ···· aa on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo, ·: 20 aa41 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti- tuoitu aminohappo, 10 aa44 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti-tuoitu aminohappo, aa46 on neutraali, alifaattinen ja substituoimaton aminohappo tai oksisubstituoitu aminohappo, 5 aa47 on neutraali, alifaattinen, substituoimaton aminohappo, aa59 on neutraali alifaattinen tai aromaattinen substituoimaton aminohappo, aa76 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai tiosubsti-tuoitu aminohappo, 10 aa78 on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo, aa83 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubstituoitu aminohappo, aa on neutraali alifaattinen aminohappo, jossa on oksi-substituutio, 15 aa96 on neutraali, alifaattinen, tiosubstituoitu aminohappo tai neutraali aromaattinen heterosyklinen aminohappo, aa97 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai tiosubsti-tutioitu aminohappo, aa on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo tai 20 aromaattinen oksisubstituoitu aminohappo, aa99 voi olla mikä tahansa aminohappo, ·;··· aa100 on oksisubstituoitu aminohappo, joko alifaattinen tai aromaattinen, ···· 101 · aa on neutraali, substituoimaton alifaattinen tai aromaat- • · · 25 tinen aminohappo, liittyneenä: • · · • · · · M» b) toiseen peptidiin, sillä varauksella, että mainittu toinen • · · '·* * peptidi on muu kuin osa luonnossa esiintyvästä Arabidopsiksen tai Brassican oleosiiniproteiinista.
:T: 3 0 Tässä kuvataan myös fuusiopolypeptidi, tunnettu siitä, että se kykenee ohjautumaan öljyonteloon ja käsittää: • » • · • · · • · *“* a) ensimmäisen peptidin, joka on valittu seuraavasta ryhmäs- ·:· 35 tä: • · · · :*·.· (1) peptidi, johon kuuluu ainakin kahdeksan peräkkäistä • · aminohappoa, jotka sisältyvät seuraavaan aminohapposekvenssiin : 11 M-M-G-R-D-R-D-Q-Y-Q-M-S-G-R-G-S-D-Y-S-K- S-R-Q-I-A-K-A-A-T-A-V-T-A-G-G-S-L-L-V-L- S-S-L-T-L-V-G-T-V-I-A-L-T-V-A-T-P-L-L-V-5 I-F-S-P-I-L-V-P-A-L-I-T-V-A-L-L-I-T-G-F-L-S-S-G-G-F-G-I-A-A-I-T-V-F-S-W-I-Y-K*Y-A-T-G-E-H-P-Q-G-S-D-K-L-D-S-A-R-M-K-L-G- S-K-A-Q-D-L-K-D-R-A-Q-Y-Y-G-Q-Q-H-T-G-G-E-H-D-R-D-R-T-R-G-G-Q-H-T-T; 10 (2) joko peptidin, jota koodaa DNA-sekvenssi, joka on tunnistettu mainitun, luetteloon (1) sisältyvän aminohapposekvenssin perusteella laaditun oligonukleotidikoettimen avulla, tai pätkän siitä, sillä varauksella, että mainittu ensimmäi-15 nen peptidi on muu kuin täyspitkä luonnossa esiintyvä porkkanan 16 kD:n oleosiini tai maissina 18 kD:n tai 16 kD:n ole-osiini, liittyneenä b) toiseen peptidiin, sillä varauksella, että mainittu toinen 20 peptidi on muu kuin Arabidopsiksen tai Brassican luonnossa esiintyvän oleosiiniproteiinin a-osa.
• · • · ·
Lyhyt kuvaus piirroksista • · · •: 25 • · · •••j Kuvio IA esittää Arabidopsis thalianan öljyonteloproteiinin • · · •••ϊ (oleosiinin) geenin nukleotidisekvenssin ja siitä johdetun • · · ·.· * aminohapposekvenssin (17 kD:n proteiini) . Alleviivattuina ovat suorat toistot (Rl ja R2) ja käänteinen toisto (T) , :T: 30 CACA, TATA, TAAT ja polyadenylaatiosignaalit. Intronijakso on painettu pienin kirjaimin ja oletettu ABA:ta sitova kohta on osoitettu lihavoituna.
• · · • · • · • · · • · *···’ Kuvio IB esittää porkkanan 16 kD:n öl jyonteloproteiinin, ··· 35 maissin 16 kD:n ja 18 kD:n ja Arabidopsis thalianan 17 kD:n • · · · .’.j öl jyonteloproteiinin sekvenssien vertailun, joka osoittaa • · proteiinien säilyneet ja eriytyneet kohdat. Aminohapposek- 12 venssit on kirjoitettu alekkain proteiinien keskialueen sekvenssin säilyneisyyden osoittamiseksi.
Kuvio 2 esittää rakenteita, joita käytetään öljyonteloprote-5 iinigeenien yhdistämiseen vieraita peptidejä koodaaviin geeneihin. IA on halutun peptidin fuusio öljyonteloproteiinin C-päähän, IB on halutun peptidin N-terminaalinen fuusio OBP:hen, II on halutun peptidin internaalinen fuusio OBP:n sisään ja III on dimeerien välinen translationaalinen halutun 10 peptidin fuusio kahden olennaisilta osin täydellisen öljyon-teloproteiinin suuntaussekvenssin väliin. Kuvion yläosassa (A) esitetään DNA-rakenteet, joita käytetään haluttujen peptidien translationaaliseen yhdistämiseen öljyontelopro-teiineihin. Kuvion alaosassa (B) esitetään yläosassa esitet-15 tyjen geenien tuotteiden rakenteet translaation ja öljyonte-loihin siirtymisen jälkeen (gene products, shown on the upper portion of the translation and the delivery to the oil bodies). Kuvaa tulkitaan seuraavasti: suorakulmio, joka on viivoitettu alhaalta vasemmalta ylös oikealle, esittää öljy-20 onteloproteiinin promoottoria tai muuta siemenspesifistä promoottoria, alhaalta oikealta ylös vasemmalle viivoitettu ·;··· suorakulmio esittää haluttua peptidiä koodaavaa sekvenssiä, tyhjä suorakulmio esittää öl jyonteloproteiinin koodaavaa • · · · sekvenssiä tai öl jyonteloproteiinin säilyneisiin jaksoihin • · · 25 perustuvaa synteettistä suuntaus sekvenssiä, ruudutettu suora- • · · *'*' kulmio esittää geeniterminaattoria, johon sisältyy polyadeny- • · · •••j laatiosignaali, viivoitettu ympyrä esittää proteaasin tunnis- • · · tuskohtaa, kierteisviiva esittää öljyonteloproteiinin alkuperäistä C- tai N-päätä.
• · · V : 3 0
Kuvio 3. esittää C-pään fuusion rakenteen erään yksityiskoh-täisen järjestelyn. Kuviossa näkyy kollagenaasin tunnistus- • · *..* kohdan koodaava sekvenssi linkkerinä fuusioituna tyypilliseen • · *·;·* öljyonteloproteiinigeeniin ja fuusiopeptidi, joka yhdistetään '/l· 35 tässä Ncol:tä käyttäen kloonattavaksi ja ilmennettäväksi kasveissa.
• · 13
Kuvio 4. esittää kaavamaisesti fuusiopeptidivektorien rakentamisen, niiden siirtämisen kasveihin ja sitten halutun peptidin uuttamisen ja tutkimisen.
5 Kuvio 5. esittää kaavamaisesti pCGOBPiLT:in rakentamisen. Katkoviivoitettu suorakulmio esittää oleosiinin promoottoria, ylhäältä vasemmalta alas oikealle vinoviivoitettu suorakulmio esittää oleosiinia koodaavaa sekvenssiä, ruudutettu suorakulmio esittää intronia, pilkutettu suorakulmio esittää 31-pään 10 translatoitumatonta sekvenssiä ja ylhäältä vasemmalta alas oikealle paksuilla vinoviivoilla viivoitettu suorakulmio esittää interleukiini-l-p-sekvenssiä, jossa on proteaasin katkaisukohtaa koodaava sekvenssi (tekijä Xa tai trombiini heti ylävirtaan).
15
Kuvio 6 esittää oligonukleotidi GVRll:n rakenteen. Kuviossa 3A esittää A. thalianan oleosiinin koodaavaa 3'-sekvenssiä liitettynä translationaalisesti tekijä Xa/IL-l-£:aa koodaa-vaan sekvenssiin, jota seuraa TAA-lopetuskodoni. Myöhemmän 20 kloonauksen tarkoituksiin mukaan liitetään PvuI- ja Sall-restriktioentsyymien tunnistuskohdat. Pvul-restriktiokohdan ·;··· luomisesta seurasi ylimääräinen alaniinia (ala) koodaava sek- venssi. Restriktioentsyymin tunnistuskohdat ovat alleviivat- • · · · tuina. A. thalianan oleosiinisekvenssit ja tekijä Xa:n tun- • · · ‘I 25 nistussekvenssi on merkitty yläpuolelle. Varsinainen katkai-• · · **’1 sukohta on osoitettu asteriskilla (1). Kuviossa 3B esitetään • 1 1 ···· GVRll:n sekvenssi. Jotta A. thalianan oleosiiniin fuusioitu- • · · • · · *·’ ’ minen onnistuisi, alukkeen GVRll on oltava komplementaarinen ylimmän juosteen kanssa.
Ml v : 3 0
Kuvio 7 esittää OBPILT: in nukleotidisekvenssin. Alleviivattu • · · on IL-1-P:aa koodaava sekvenssi. Tekijä Xa:n tunnistuskohtaa # · *..! koodaava sekvenssi on merkitty lihavoimalla. Nopaliinisyntaa- • · *” sin terminaattorisekvenssi on merkitty pienillä kirjaimilla.
·:· 35 • ··· · • · · • · · • · 14
Keksinnön spesifisten toteutusten kuvaus Tämän keksinnön yhteydessä tarjotaan käyttöön menetelmät ja koostumukset helposti puhdistettavissa olevien peptidien 5 tuottamiseen. Kyseinen menetelmä käsittää vaiheet, joissa valmistetaan ilmentymiskasetti, joka sisältää DNA-sekvenssit, jotka koodaavaat ölyonteloproteiinin, esim. oleosiinin, osaa, joka riittää suuntaamaan proteiinin öljyonteloon, ja haluttua peptidiä; ilmentymiskasetin transformoimisen kasvisoluisän-10 tään; siirtogeenisen kasvin tuottamisen ja sen kasvattamisen tuottamaan siemeniä, joissa kimeeristä proteiinia on ilmentyneenä ja siirtyneenä öljyonteloihin. Kimeerinen peptidi käsittää halutun peptidin ja öljyonteloproteiinin, esimerkiksi oleosiinin. Haluttu peptidi on yleensä vieras peptidi, 15 joka ei yleensä ilmenny siemenissä eikä esiinny öljyontelois-sa. Öljyonteloproteiinin käyttö kantajana tai suuntauskeinona tarjoaa yksinkertaisen mekanismin saada vieras proteiini puhdistumaan. Kimeerinen proteiini erotetaan suurimmasta osasta solun proteiinia yhdellä vaiheella (kuten sentrifugoi-20 maila tai kelluttamalla); proteiini on myös suojattu hajoamiselta uuttamisen aikana, koska erottaminen irrottaa myös ♦:♦·· epäspesifiset proteaasit öl jyonteloproteiineista. Vierasta peptidiä koodaava geeni voi olla johdettu mistä tahansa läh- • · · · teestä, mukaan luettuna kasvi-, bakteeri-, sieni- ja eläin- • · · *#|# 25 lähteet. Kimeerinen peptidi saa mielellään sisältää sekvens- **** sejä, jotka mahdollistavat kiinnostuksen kohteena olevan *·*! peptidin irroittamisen oleosiinista. Menetelmää voidaan käyt- • · · *·* * tää ilmentämään useita erilaisia peptidejä, jotka voidaan sitten helposti puhdistaa.
30
Vieraan yhdistelmäproteiinin suuntaaminen öljyonteloon tuo useita etuja, mukaan luettuna seuraava: Proteiini voidaan • ♦ *..! erottaa suurimmasta osasta solun sisältöä sentrifugoimalla • · **** solun hajoamisen jälkeen. Öljyontelojaos kelluu sitten uut- 35 teen pinnalla. Proteiiniin voidaan haluttaessa liittää pepti-dilinkkeri, joka sisältää proteaasin tunni s tus kohdan. Tämä mahdollistaa peptidin irroittamisen öljyontelosta. Proteiini voidaan liittää yhdistelmäpolypeptidiin siten, että se on • · 15 lipofiilisen säilyneen alueen sisällä. Tästä seuraa, että yhdistelmäpeptidi joutuu öljyontelon sisään, mikä suojaa sitä proteaasihyökkäyksiltä.
5 Ilmentymiskasetti sisältää yleensä transkription etenemis-suunnassa 5'-3' transkriptionaalisen ja translationaalisen säätelyalueen, joka pystyy ilmentämään proteiinia kehittyvissä siemenissä. Tähän sisältyy tyypillisesti öljyonteloprote-iiniin liittyvät promoottori ja ylävirtaan sijaitsevat alu-10 eet, minkä ansiosta kimeerinen proteiini ilmentyy siemenissä, DNA-sekvenssi, joka koodaa kimeeristä peptidiä, johon sisältyy öljyonteloon suuntaamiskeinona toimiva aminohapposekvenssi ja haluttu proteiini sekä kasveissa toimivat transkription ja translaation lopetuskohdat. Mukana voi myös olla yksi tai 15 useampia introneja.
Öljyontelospesifinen sekvenssi on analoginen öljyonteloprote-iinien, erityisesti oleosiinien, osien kanssa. Öljyontelospesif inen sekvenssi voi olla sama kuin jonkin öljyontelopro-20 teiinista saatava sekvenssi, tai riittävän homologinen aiheuttaakseen halutun proteiinin toivotun suuntautumisen öljyonteloon. "Saatavalla" tarkoitetaan aminohapposekvenssiä, joka voi olla luonnollinen, synteettinen tai yhdistelmä, ”[·. riittävästi natiivin öljyonteloproteiinin aminohapposekvens- • · · I 25 sin kaltainen aiheuttaakseen toivotun suuntautumisen. Erityi-• · · ***· sen kiinnostava on öljyonteloproteiinien sisäosan hydrofobi- • · · ···· nen domeeni, joka näyttää olevan hyvin säilynyt eri kasvila- • · · *·* * jien välillä, sekä sen fragmentit ja aminohappotasolla homologiset sekvenssit.
·♦· : : : 30 • · · • · • · • · · «· · • · · • · * » ··· • · • · ··« ··♦· • · • · · • ·♦ • · 16
Arabidopsis thalianan öljyonteloproteiinin johdettu aminohapposekvenssi on seuraavanlainen: 10 20 M-M-G-R-D-R-D-Q-Y-Q-M-S-G-R-G-5-D-Y-S-K- 30 40 s-r-q-i-a-k-a-a-t-a-v-t-a-g-g-s-l-l-v-l- 50 50 s-s-l-t-l-v-g-t-v-i-a-l-t-v-a-t-p-l-l-v- 70 80 I-r-5-P-I-L-V-P-A-L-I-T-V-A-L-L-I-T-G-r- 90 100 L-S-S-G-G-F-G-I -A-A-1-T-V-F-s-w-: - Y-:< 1 Y- 110 120 a _G-Ξ-Η-Ρ-Q-G-S-D-K-L-D-S-A-R-M-K-L-G- 130 140 S-K-A-Q-D-L-K-D-R-A-Q-Y-Y-G-Q-Q-H-T-G-G- 150
..... Ξ-Κ-D-R-D-R-T-R-G-G-Q-H-T-T
• ♦ • 5 »·· GG. Aminohapot noin 25:stä 101:een muodostavat keskisen hydro- • · « * 1 fobisen domeenin.
·»· ···« ·«1 ···· Erityisen kiinnostavia suuntauskeinoiksi joihinkin sovelluk- • · · *.· · 10 siin ovat seuraavan kaavion mukaiset öljyontelospesifiset sekvenssit tai niiden osat, jotka suuntaavat proteiinin öljy- • · · : : : onteloon: • · · • · • · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · • · · · · ···· • · • · · • ·· • · 17 aa74 - aa75 - aa76 - aa77 - aa78 - G- r- L- s - S- aa87 - G- v - aa89 - aa90 - L - S -
T I IT
aa93 aa94 . s . aa96 . aa97 . aa98 . aa99 _
T
„100 101 2 aa *· aa — pp oc“- aa25- aa^6- V _ v- T - L- aa^1- ?-
A A A T
aa34. g- G- aa36 - L- L- aa39- L- aa41-
M
44 45 47^ 'w'-.-aa - a a - aa - τ - _ j. _ S L s v v "1 c3 - so aav - L- aa - V- A- T— P- -· - aa“ - L -
V V
L - F- S- P- v - L- V- ?- A- A _ L _ aa'3 -
*·* X i LI
···· missä: • · · .:. 5 pp1 ja pp2 ovat samat tai erilaiset, ja voivat olla samat tai **|Ιφ erilaiset kuin luonnon öljyonteloproteiinissa, yleensä eri- ♦ *1" laiset. Ne voivat olla vetyjä osoittamassa tarkoitetun poly- • · · * * peptidin loppukohtaa, tai ne voivat olla polypeptidejä, jois sa on korkeintaan 1000 aminohappoa, useammin korkeintaan noin • · ♦ *.* · 10 500 aminohappoa, tai kaikkiaan ainoastaan 1 aminohappo, tai ··· voivat yhdessä tai erikseen olla noin 1-100 aminohapon ·*.*. polypeptidejä, yleisemmin 1-75 :n aminohapon, erityisesti 5-50 • · .*··. aminohapon. Nämä polypeptidit ovat käyttökelpoisia • · erityisissä sovelluksissa, kun muotoillaan erityisesti kuvat- • # · •••Σ 15 tua sekvenssiä ennalta määrättyyn tarkoitukseen: • · • · · • ·· • · 18 aa25 voi olla mikä hyvänsä aminohappo, erityisesti neutraali alifaattinen aminohappo, yleensä 3-6 hiiliatomia sisältävä, varsinkin leusiini tai alaniini, 5 aa26 on neutraali alifaattinen aminohappo, erityisesti ala-niini tai hydroksisubstituoitu 3-4 hiiliatomin aminohappo, varsinkin treoniini tai emäksinen 5-6 hiiliatomin aminohappo, varsinkin lysiini, 10 aa31 on neutraali, substituoimaton, alifaattinen 3-6 hiiliatomin aminohappo, erityisesti alaniini, väliini tai leu siini, tai aromaattinen substituoimaton aminohappo, erityisesti fenyylialaniini, 15 aa33 on neutraali, substituoimaton alifaattinen 3-6 hiiliatomin aminohappo, erityisesti alaniini, väliini tai leu siini, tai oksisubstituoitu alifaattinen aminohappo, erityisesti treoniini, 20 aa36 on neutraali 3-5 hiiliatomin substituoimaton alifaattinen aminohappo, erityisesti leusiini, tai neutraali, alifaattinen, oksisubstituoitu aminohappo, jossa on 3-4 hiiliatomia, erityisesti treoniini tai seriini, ···· • · • · » *·# 1 37 I 25 aa on neutraali, substituoimaton aminohappo, erityisesti ··· ·2·1 leusiini, tai tiosubstituoitu aminohappo, erityisesti metio- ··· niini, • · · • · · • · · aa39 on neutraali, alifaattinen, substituoimaton aminohappo, ··· •m· ί 30 erityisesti väliini, tai aromaattinen substituoimaton amino- :3: happo, erityisesti f enyylialaniini, ··· ·· · • · ♦ • ♦ 1 *..1 aa on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti- • 1 *·;·1 tuoitu aminohappo, erityisesti alaniini, leusiini tai serii- *i1 35 ni, ···· · 2 • · · • ·♦ 3 • · 19 aa44 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti-tuoitu aminohappo, erityisesti alaniini, isoleusiini tai treoniini, 5 aa46 on neutraali, alifaattinen ja substituoimaton aminohappo tai oksisubstituoitu aminohappo, erityisesti alaniini, väliini tai treoniini, aa47 on neutraali, alifaattinen, substituoimaton aminohappo, 10 erityisesti glysiini tai alaniini, aa59 on neutraali alifaattinen tai aromaattinen substituoimaton aminohappo, erityisesti leusiini tai fenyylialaniini, 15 aa76 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai tiosubsti-tuoitu aminohappo, erityisesti alaniini, leusiini tai metio-niini, aa78 on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo, 20 erityisesti alaniini, tai neutraali alifaattinen aminohappo, jossa on tio- tai oksisubstituutio, erityisesti metioniini ·:*·) tai treoniini, • * · ···· 83 , aa on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti- • · · *#j# 25 tuoitu aminohappo, erityisesti glysiini, seriini tai **** treoniini, • · · • · · · • · · *·* * aa on neutraali alifaattinen aminohappo, jossa on ok sisubstituutio, erityisesti seriini tai treoniini, ··· : 30 : aa on neutraali, alifaattinen, tiosubstituoitu aminohappo tai neutraali aromaattinen heterosyklinen aminohappo, eri- • ♦ *..! tyisesti tryptofaani, • · • ♦ • · · #>’j* 35 aa on neutraali alifaattinen substituoimaton tai tiosubsti- tutioitu aminohappo, erityisesti väliini, leusiini, isoleu- siini tai metioniini, • · 20 aa98 on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo tai aromaattinen oksisubstituoitu aminohappo, erityisesti alanii-ni, leusiini tai tyrosiini, 5 aa99 voi olla mikä tahansa aminohappo, aa100 on oksisubstituoitu aminohappo, joko alifaattinen tai aromaattinen, erityisesti tyrosiini tai treoniini, 10 aa101 on neutraali, substituoimaton alifaattinen tai aromaat tinen aminohappo, erityisesti alaniini, leusiini tai fenyyli-alaniini.
Erityisen kiinnostavia lähteitä, joista voidaan saada koo-15 daavia DNA:sekvenssejä, jotka pystyvät suuntaamaan öljyon-teloproteiinin, ovat Arabidopsiksesta tai Brassica napuksesta saatavat öljyonteloproteiinigeenit, jotka mahdollistavat halutun proteiinin ilmentymisen siemenissä (katso Taylor et ai. 1990: Planta 181:18-26). Tarpeelliset alueet ja 20 aminohapposekvenssit, jotka antavat kyvyn suuntautua öljyon-teloon, ovat ilmeisesti öljyonteloproteiinien erittäin hydro-fobinen keskusalue.
• · • * *
Kun eristetään tai on aikaisemmin eristetty öl jyontelopro- • · · '1 25 teiini, niin jotta pystyttäisiin tunnistamaan muita öljyon- **" teloproteiinigeenejä, joilla on toivottuja ominaisuuksia, • · · ···· eristetty proteiini voidaan sekvensoida osittain, jotta voi- • · · V ' daan laatia koetin mENA:n tunnistamiseen. Sellainen koetin on erityisen arvokas, jos se on laadittu kohdistumaan keskuksen • · · ϊ.ί · 30 hydrofobista domeenia koodaavaan alueeseen, joka on eri kas- vilajien välisesti hyvin säilynyt. Siten tämän alueen DNA-tai RNA-koetin voi olla erityisen käyttökelpoinen öljyonte- • · *..* loproteiineja koodaavien sekvenssien etsimiseen muista kasvi- • · lajeista. mRNA:n konsentraation suurentamiseksi voidaan myös 35 valmistaa cDNA: ta ja poistaa siitä cDNA: ta öljyonteloja tuot- :*·.· tamattomien solujen mRNA: 11a tai cDNA: 11a. Jäännös-cDNA voi- • · daan sitten käyttää komplementaaristen sekvenssien etsimiseen genomista käyttäen sopivaa kasvisoluista valmistettua 21 geenikirjastoa. Sekvenssit, jotka hybridisoituvat cDNA:han tarkasti valvotuissa olosuhteissa, voidaan sitten eristää.
Joissakin tapauksissa, käytettäessä öljyonteloproteiinigeenin 5 (säilyneen alueen) koetinta yllä kuvatulla tavalla, koetinta voidaan käyttää suoraan genomisen cDNA-kirjaston seulomiseen ja koettimeen hybridisoituvien sekvenssien tunnistamiseen. Eristäminen voidaan suorittaa myös seulomalla siemenspesifi-nen cDNA:n ilmentymiskirjasto tavanomaisella immunologisella 10 menetelmällä. Öljyonteloproteiinien vasta-aineita saadaan helposti Taylorin et ai. (Planta. 1990. 181:18-26) kuvaaman puhdistusprosessin ja vasta-aineiden valmistusmenettelyn avulla. cDNA:n ilmentymiskirjaston seulonta vasta-aineiden avulla suoritetaan pääosin käyttäen Huynhin et ai. tekniikoi-15 ta (1985. DNA Cloning, Voi 1, a Practical Approach, toim. D.
M. Glover. IRL Press. s. 49-78). Sekvenssien tunnistamista helpottaa hydrofobisen keskusosan hyvä (lajienvälinen) säi-lyneisyys (ks. Kuvio 1). Kaikki oletetut kloonit voidaan DNA-sekvensoida Sangerin et ai. (Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1977. 20 74:5463-5467) tai Maxamin ja Gilbertin (1980. Meth. Enzymol.
1980. 65:497-560) menetelmällä, ja etsiä sitten homologioita. ·;··· Keskuksen hydrofobista domeenia koodaavien sekvenssien lajienvälinen homologia on normaalisti >70 % sekä aminohappo- että nukleotidi tasolla. Jos käytettävissä on • · · I 25 vasta-aine, sekvenssin tunnistaminen voidaan myös vahvistaa • · · **** Sambrookin et ai. (Molecular Cloning. 1990. Toinen painos, ·«· •••j Cold Spring Harbor Press. s. 8-49 - 8-51.) kuvaamilla hybri- ♦ · * *·* * din valinta- ja translaatio -kokeilla siemen-mRNA-valmisteis- ta.
··· : 30
Siemenistä tehtyjä cDNA-klooneja voidaan seuloa käyttäen minkä tahansa saatavissa olevan ölyonteloproteiinigeenin • · *..* säilyneistä koodaavista alueista tehtyjä cDNA-koettimia • ♦ **;·’ (esim. Bowman-Vance ja Huang. J. Biol. Chem. 1987. 262:11275- 35 11279) . Valitaan klooneja, jotka hybridisoituvat enemmän :*·.· siemen-DNA: iden kuin taimi-cDNA: iden kanssa. Seulonta • · toistetaan erityisen, kehittyvien siementen öljyonteloihin liittyvän DNA:n tunnistamiseksi käyttäen suoraa vasta- 22 aineseulontaa tai hybridin valitsemista ja translaatiota. Tätä spesifiselle cDNA:lle komplementaarista mRNA:ta ei ole muissa testatuissa solukoissa. Tätä cDNA:ta käytetään sitten genomisen kirjaston seulomiseen ja valitaan pätkä, joka 5 hybridisoituu kyseiseen cDNA:han.
Kimeerisen geenin saamiseksi ilmentymään siemenissä voidaan käyttää transkription alkamista säätelevää aluetta ja translaation alkamista säätelevää aluetta translatoitumattomista 10 5'-sekvensseistä, "ribosomin sitoutumiskohtia", jotka vastaavat mRNA:n kiinnittämisestä ribosomeihin. Voidaan käyttää minkä tahansa geenin, mielellään siemenessä ilmentyvän geenin ko. alueita. Esimerkkejä sellaisista geeneistä ovat mm. siementen varastoproteiinit esim. napiinista (Jo-15 sefsson et ai. J. Biol. Chem. 1987. 262:12196-12201; Scofield S. R. ja Crouch M. L. J. Biol. Chem. 1987. 262:12202-12208). Edullisesti alue saadaan öljyonteloproteiinista (Arabidopsiksen, porkkanan öljyonteloproteiinit, Hatzopoulos et. ai., alla tai maissin Huang et ai. 1987 ja 1990, alla). 20 Alue käsittää yleensä ainakin 100 ep rakennegeeniä koodaavan sekvenssin translaation alkukohdan 5'-puolelta, ja jopa 2,5 ·...: ke saman translaation alkukohdan 5'-puolelta. On eduksi, että kaikki transkriptiossa ja translaatiossa toimivat aloituksen ,·]·. säätelykohdan osat ovat peräisin tai saatavissa samasta • · · l 25 geenistä. "Saatavissa" tarkoittaa, että DNA-sekvenssi • · · **** muistuttaa riittävästi alkuperäistä sekvenssiä, että • · · ···· kimeeristä proteiinia koodaava DNA-sekvenssi tuottaa • · · *·* * kimeeristä proteiinia koodaavalle DNA: lie halutun transkrip- tiospesifisyyden. Se tarkoittaa sekä luonnollisia että ··· ί,Σ Σ 30 synteettisiä sekvenssejä ja voi olla synteettisten ja :***: luonnollisten sekvenssien yhdistelmä.
« · · • · · « « « ♦ · *..I Transkriptiotason pitäisi olla riittävä tuottamaan RNA- • · **;·’ määrän, joka kykenee modifioimaan siementä. "Modifioidulla >e*j* 35 siemenellä" tarkoitetaan siementä, jonka fenotyyppi on havaittavasti erilainen kuin saman lajin trans f ormoimat toman kasvin siemen, esimerkiksi sellaisen, jonka genomissa ei ole kyseistä ilmentymiskasettia. Useat erilaiset fenotyypin • · 23 muutokset ovat kiinnostavia. Tällaisia muutoksia ovat öljyonteloproteiinin yli-ilmentyminen, OBP:n kertyminen öljyonteloon tai saatavan kimeerisen proteiinin kertyminen sytoplasmaan.
5
Haluttu polypeptidi voi olla mikä tahansa proteiini, esimerkiksi entsyymi, hyytymisen estäjä, neuropeptidi, hormoni tai adhesiivinen prekursori. Esimerkkejä proteiineista ovat interleukiini-1-β, hyytymisen estäjä hirudiini, β-gluku-10 ronidaasientsyymi tai yksiketjuinen vasta-aine, jossa im-munoglobiinin VH- tai VL-ketjut ovat fuusioituneet translaatiossa. Haluttua polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi voi olla synteettinen, luonnosta saatu tai jokin niiden yhdistelmä. Haluttua polypeptidiä koodaavan DNA:n laadusta tai 15 lähteestä riippuen voi olla edullista syntetoida DNA-sek-venssin kasvin suosimista kodoneista. Kasvin suosimat kodonit voidaan määrittää sen mukaan, mitkä kodonit esiintyvät useimmin niissä proteiineissa, jotka ilmenevät runsaimmin kyseisessä isäntäkasviksi suunnitellussa kasvilajissa.
20 Käytettävä terminaatioalue voi ensisijaisesti olla jokin hel-posti käytettävä, sillä vaikuttaa siltä, että monissa tapauk- • · sissa on suhteellisen samantekevää, mitä terminaatioaluetta TI käytetään. Terminaatioalue voi olla peräisin samasta • · · • · · '* 25 lähteestä kuin transkription aloituskohta, samasta lähteestä • · · •••j kuin haluttua polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi tai se « ♦ « •••i voidaan saada eri lähteestä. Sopivia terminaatioalueita on • · · V * saatavissa A. tumefaciensin Ti-plasmidista, esimerkiksi oktopiinisyntaasin ja nopaliinisyntaasin terminaatioalueet.
• · · : : : 30 :*’*· Suuntaavaa sekvenssiä koodaava DNA-sekvenssi voidaan liga- ♦ · · toida haluttua peptidiä koodaavaan geeniin monella eri • · · tavalla, mm. terminaali fuusioina, sisäisinä fuusioina ja • · *·;·* polymeerisinä fuusioina. Joka tapauksessa fuusiot tehdään ··· 35 siten, että ne eivät häiritse öl jyonteloproteiinin lukuke- • ·· · leja liitosten kohdalla ja niiden lähellä. Eri tyyppiset :\j hystä, ja siten, että vältetään translaation lopetussignaa- • · 24 terminaaliset ja sisäiset fuusiot esitetään kuviossa 2, samoin kuvaus niiden rakenteista in vivo.
Kaikissa kuvatuissa tapauksissa peptipiä koodaavan geenin 5 liittymiskohta saisi mielellään sisältää jonkin proteaasin kohdetta koodaavan linkkerin. Tämä mahdollistaisi peptidin irroittamisen sen jälkeen, kun se on eritetty fuusioprote-iinina. Potentiaalisia käytettäviä katkaisukohtia ovat trom-biinin tunnistuskohta (leu-val-pro-arg-gly) (Fujikawa et ai. 10 Biochemistry. 1972. 11:4892-4899), tekijä Xa:n tunnistuskohta (phe-glu-gly-arg-aa) (Nagai et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1985. 82:7252-7255) tai kollagenaasin tunnistuskohta (pro-leu-gly-pro) (Scholtissek ja Grosse. Gene. 1988. 62:55-64) .
15
Sopivilla toimenpiteillä, kuten restriktiolla, ulkonevien päiden lyhentämisellä taaksepäin tai täyttämisellä tylppien päiden saamiseksi, linkkereiden liittämisellä tms. voidaan tuottaa osien komplementaariset päät liittämistä ja ligaa-20 tiota varten. Eri vaiheiden suorittamisessa käytetään kloonausta DNA:n määrän kasvattamiseksi ja jotta on mahdollista analysoida DNA: ta sen varmistamiseksi, että toimenpiteet ovat sujuneet oikein. On käytettävissä suuri määrä erilaisia kloonausvektoreita. Tällainen kloonausvektori sisältää E.
• · · • · · ’l 25 colissa toimivan replikaatiosysteemin ja markkerin, joka • · · ···· mahdollistaa transformoitujen solujen valikoimisen. Kuvaavia • · · »·'· esimerkkejä vektoreista ovat mm. pBR332, pUC-sarja, Ml3mp- • · · V * sarja, pACYC184 jne. Täten sekvenssi voidaan sijoittaa vektorin sisään sopivaan restriktiokohtaan tai sopiviin 3 0 restriktiokohtiin, käyttää saatavaa plasmidia E. coli ·*’*: isännän transformoimiseen, kasvattaa E. coli sopivassa • · · ravintoalustassa, kerätä ja hajottaa solut sekä ottaa plas- • · · *#>* midit talteen. Analyysi voi käsittää sekvenssianalyysin, • · *···* restriktioanalyysin, elektroforeesin tai muuta niiden kai- m 1 • · 35 täistä. Jokaisen käsittelyn jälkeen lopullisessa rakenteessa • · · · käytettävä voidaan erottaa restriktioentsyymillä (be restricted) ja liittää seuraavaan sekvenssiin, jolloin kaikki 25 osarakenteet voidaan kloonata joko samassa tai eri plasmi-deissa.
Käytettävissä on useita erilaisia tekniikoita DNA:n viemi-5 seksi kasvisoluisännän sisään. Voidaan esimerkiksi viedä kimeerisiä DNA-rakenteita isäntäsoluihin, jotka on saatu kaksisirkkaisista kasveista, kuten tupakasta tai öljykasvi-lajeista, kuten Brassica napus, käyttäen standardi-Agrobac-teriu/n-vektoreita ja Moloneyn et ai. (Plant Cell Rep. 1989. 10 8:238-242) tai Hincheen et ai. (Bio/Technol. 1988. 6:915-922) kuvaaman kaltaista transformointimenettelyä tai muita alaa taitavien tuntemia tekniikoita. Esimerkiksi T-DNA:n käyttämistä kasvisolujen transformoimiseen on tutkittu laajasti, ja sitä kuvaavat laajalti EPÄ sarjanro. 120 516, 15 Hoekema teoksessa The Binary Plant Vector System. Offset- drukkerij Kanters B. V. Alblasserdam. 1985, kappale V, Knauf et ai. Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium. Molecular Genetics of the Bacteria. Plant interaction. Toim. Puhler. A. Springer-Verlag. New York. 20 1983. s. 245 sekä An et al. EMBO J. 1985. 4:277-248. On käytännöllistä, että siirrännäisiä voidaan viljellä A. tumefaciensin tai A. rhizogenesin kanssa, jotta transkrip-tiokonstrukti voi siirtyä kasvisoluihin. Agrobakteereilla transformoinnin jälkeen kasvisolut erotetaan sopivassa väli- • * · • · · * * 25 koivassa aineessa seulonnan suorittamiseksi ja kasvatetaan ··· •••j kallukseksi. Kalluksesta kasvatetaan versoja ja taimia • · · •••i kasvattamalla juurtumisalustassa. Agrobacterium- isäntä • · · V * sisältää sitten plasmidin, jossa on T-DNA:n kasvisoluihin siirtämiseen tarvittavat vir-geenit, ja jossa joko on tai ei 30 ole T-DNA:ta. Injektiota ja elektroporaatiota (katso :1: jäljempänä) varten vaarattomiksi tehdyt Ti-plasmidit (ilman » · · kasvaingeenejä, varsinkin T-DNA-aluetta) voidaan siirtää * · « • ·’ kasvisoluihin.
• · · • · • · ··· •j* 35 Muiden kuin Agroba c t eri um~ tekniikoiden käyttö mahdollistaa • ·· · •\j tässä kuvattujen rakenteiden käyttämisen transformaation ja • · ilmentymisen tuottamiseen monissa erilaisissa yksisirkkai-sissa ja kaksisirkkaisissa kasveissa. Nämä tekniikat ovat 26 erityisen käyttökelpoisia lajeilla, joita on hankala käsitellä Agrohacterium-transformaatiosysteemillä. Muita gee- ninsiirtotekniikoita ovat muun muassa biolistiikka (biolis-tics) (Sanford. Trends in Biotech. 1988. 6:299-302), 5 elektroporaatio (Fromm et al. 1985. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA. 82:5824-5828; Riggs ja Bates. 1986. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 83. 5602-5606) tai PEG-välitteinen DNA:n sisäänotto (Potrykus et ai. 1985. Mol. Gen. Genet. 199:169-177.) 10 On monia siemenkasveja joiden soluja voidaan käyttää isän-täsoluna, ja solut otetaan kasvilajin mukaan kasvin osista, kuten varresta, lehdestä, juuresta tai siemenestä tai lisään-tymisrakenteista. Solut voivat olla eristettyjä soluja tai kasvinosia, esimerkiksi lehtikiekkoja. Jossakin erityisessä 15 sovelluksessa, esim. Brassica napuksella, isäntäsolut otetaan yleensä sirkkalehtien petioleista, minkä ovat kuvanneet Moloney et ai., Plant Cell Rep. 1989. 8:238-242. Muita esimerkkejä, joissa käytetään kaupallisia öljysiemenkasveja, ovat mm. sirkkalehtien transformaatio soijan siir-20 rännäissolukoissa (Hinchee et ai. Biotechnology. 1988. 6:915-922) ja puuvillan varren transformaatio. (Umbeck et ai. Biotechnology. 1981 5:263-266).
• · • · · TI Transformaation jälkeen soluja kasvatetaan esimerkiksi lehti- • · · * i 25 kiekkoina valikoivassa kasvualustassa. Versojen alkaessa • · · tulla esiin ne leikataan irti ja siirretään juurtu-misalustaan. Kun on muodostunut riittävä määrä juuria, kasvit • · · ·.·' ; siirretään multaan. Oletetuista transformoiduista kasveista testataan sitten, onko markkeri läsnä. Genomiselle DNA:lie 30 tehdään Southern-blottaus sopivaa koetinta, esimerkiksi A.
·*’*· thalianan oleosiinigeenin koetinta käyttäen haluttujen • · · sekvenssien isäntäsolun genomiin integroituneisuuden • · · • ·* osoittamiseksi.
··* • · • · • · · ··· 35 Ekspressiokasetti liitetään normaalisti johonkin kas- • · · · .·. : visoluseulontamarkkeriin. Sopiva markkeri voi olla vastus- • · · • · tuskyky kasvimyrkylle, erityisesti antibiootille, kuten kanamysiini11e, G418:lle, bleomysiinille, hygromysiinille, 27 kloramfenikolille tai muulle sellaiselle. Käytettävä erityinen markkeri voi olla sellainen, joka mahdollistaa transformoitujen solujen valikoimisen erotukseksi soluista, joissa ei ole kyseistä siirrettyä DNA:ta.
5
Edellä kuvatulla tavalla rakennetussa ekspressiokasetissa oleva fuusiopeptidi ilmentyy varsinkin (ellei ainoastaan) kehittyvissä siemenissä. Tavanomaisesti kasvatettujen siir-togeenisten kasvien annetaan siis tehdä siementä. Katso esim. 10 McCormick et ai. Plant Cell Reports. 1986. 5:81-84. Sopivaa geenikoetintä käyttäen voidaan suorittaa Northern-blottaus RNA:11e, joka on eristetty sellaisesta solukosta, jossa odotetaan tapahtuvan transkriptiota, esimerkiksi siemenen alkiosta. Transkriptien kokoja voidaan sitten verrata 15 fuusioproteiinitranskriptin odotettuun kokoon.
Öljyonteloproteiinit eristetään sitten siemenistä ja suoritetaan analyysejä, jotka vahvistavat fuusiopeptidin ilmentymisen tapahtuneen. Analyysit voidaan suorittaa esimerkiksi 20 PAGE:lla (polyakryyligeelielektroforeesi). Fuusiopeptidi voidaan löytää käyttämällä fuusiopeptidin oleosiiniosan vasta-ainetta. Saadun fuusiopeptidin kokoa voidaan sitten verrata fuusioproteiinin odotettuun kokoon.
• · · · • · • · · • · · * 25 Voidaan kasvattaa kaksi tai useampia sukupolvia siirto- • · · •**j geenisiä kasveja, jotka voidaan pölyttää joko samalla • · · transformoidulla kannalla tai eri kannoilla, ja tunnistetaan • · · V * saatu hybridi, jolla on toivotut fenotyyppiset ominaisuudet.
Näin halutaan varmistaa, että kyseiset fenotyyppiset ϊ 3 0 ominaisuudet ovat pysyviä ja periytyviä. Sitten kerätään :***: siemenet halutun peptidin eristämiseksi tai käytettäviksi • · · uuden f enotyyppisen ominaisuuden omaavien siementen • · · • · *..* tuottamiseen.
• · • · ··* ·:* 3 5 Haluttu proteiini voidaan uuttaa siirretyn ominaisuuden • · · · :*·.· suhteen homo- tai heterotsygoottisista siemenistä useilla • · erilaisilla tekniikoilla, joihin kuuluvat puskuroidun vesipohjaisen uuttoliuoksen käyttö ja jauhamis-, rikkomis- ja 28 hienontamismenetelmät tai muut tavat rikkoa siementen solut. Uutetut siemenet voidaan sitten jakaa (esim. sentrifugoimalla tai antamalla solususpension sedimentoitua) kolmeen fraktioon: sakkaan eli liukenemattomaan pellettiin, 5 supernatanttiin, joka on vesiliuos, ja tiiviiseen "vaahtoon", johon sisältyy siemenen varastoiipidiä ja öljyonteloita. Nämä öljyontelot sisältävät sekä luonnon öljyonteloproteiineja että kimeerisiä öljyonteloproteiineja, joista jälkimmäiset sisältävät vieraan peptidin. Nämä öljyontelot erotetaan 10 vesiliukoisista proteiineista ja lietetään uudelleen vesipohjaiseen puskuriin.
Jos ilmentämiskasettiin on sisällytetty linkkeri, joka käsittää proteaasin tunnistuskohdan, uudelleenliettämispus-15 kuriin lisätään linkkerisekvenssin translaation tuottamalle tunnistuskohdalle spesifinen proteaasi. Tämä vapauttaa halutun peptidin vesifaasiin. Nyt toinen sentrifugointivaihe saattaa prosessoidut öljyontelot proteiineineen kellumaan ja jättää jäljelle halutun peptidin vesiliuoksen. Haluttu 20 peptidi voidaan sakkauttaa, muuntaa kemiallisesti tai pakastuskuivata sen ominaisuuksien ja toivottujen sovellusten mukaan • · i··
Tietyissä sovelluksissa ei aina ole tarpeen irrottaa kimee- • · · * l 25 ristä proteiinia öljyonteloproteiinista. Sellaisia sovel-·· · •••| luksia olisivat mm. tapaukset, joissa fuusiopeptidi sisältää • ti ···! entsyymin, joka sietää N- tai C-terminaalisia fuusioita ··· V · säilyttäen aktiivisuutensa. Sellaisia entsyymejä voitaisiin käyttää katkaisematta ja puhdistamatta edelleen. Kimeerinen 30 entsyymi-OBP saatettaisiin kontaktiin substraatin kanssa :***; fuusioproteiinina. Haluttaessa on myös mahdollista puhdistaa • · · entsyymi-OBP-f uusioproteiini käyttäen immunoaf f initeet- • · · tipylvästä, joka sisältää runsaasti immobilisoitua öljyon- • # *···' teloproteiinin vasta-ainetta (katso esim. Taylor et ai. 1990.
··· 35 yllä) .
• · · · • · • · · • · · • ·
Muut keksinnön käyttökohteet ovat seuraavanlaisia. OBP:t muodostavat suuren osan siemenen kokonaisproteiinista, ja täten 29 on mahdollista voimistaa tiettyjä haluttuja ominaisuuksia siemenessä, kuten lysiinipitoisuutta, metioniinipitoisuutta ja muuta sellaista, yksinkertaisesti tekemällä fuusioproteiini runsaasti haluttua aminohappoa tai haluttuja 5 aminohappoja sisältäväksi. Tämä voisi olla erityisen hyödyllistä muunnettaessa viljoja (grains and cereals), joita käytetään joko suoraan tai epäsuorasti ravinnon lähteenä karjalle, mukaan lukien nautakarja ja siipikarja, sekä ihmisille. Voi olla mahdollista sisällyttää (siemeneen) 10 fuusioproteiinina entsyymi, joka voi avustaa öljyn tai jauhon jatkokäsittelyssä tavanomaisen öljysiemenen murskaamisen ja uuttamisen yhteydessä, esimerkiksi lämpökestävä, lipidiä modifioiva entsyymi, joka pysyisi aktiivisena kohotetuissa murskauslämpötiloissa, joita viljan prosessoinnissa 15 käytetään, ja lisätä siten uutetun triglyseridi- tai proteiinituotteen arvoa. Muita fuusioproteiinin käyttötapoja ovat mm. viljelyskasvin agronomisen terveyden parantaminen. Esimerkiksi hyönteismyrkkyproteiini tai osa viljelystuholaiselle, esim. sienisolun seinälle tai 20 solukalvolle spesifistä vasta-ainetta voitaisiin yhdistää öljyonteloproteiiniin ja vähentää siten tietyn kasvintuho-laisen hyökkäyksiä siementä kohtaan.
• · • · · *1“ Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön kuvaamiseksi, ei • · · ** ;’ 25 rajoittamiseksi.
··· ···· ···
Kokeita ··· « · t • · ·
Esimerkki 1 30 Vieraiden peptidien terminaalifuusioiden ilmentyminen öljy- :***; onteloproteiinien kanssa • · « ·· « • · · • ·* A. C-terminaali set fuusiot ··· • · • · ··· 9 ··· 35 Öl jyonteloproteiinigeenin genominen klooni, joka sisältää • · · · vähintään 100 ep translaation alkukohdan 5'-puolelta, kloona- « ♦ taan plasmidikuljettajaan, joka kykenee replikoitumaan sopivassa bakteeri-isännässä (esim. pUC:ssä tai pBR322 E.
30 colissa). Geeniin sijoitetaan restriktiokohta hydrofiilistä C-terminaalista osaa koodaavaan alueeseen. 19 kDa:n OBP:ssä tämä alue ulottuu tyypillisesti kodonista 125 kloonin loppuun. Ihanteellinen restriktiokohta on ainoa laatuaan, mutta 5 tämä ei ole täysin välttämätöntä. Ellei alueella ole sopivaa restriktiokohtaa, siihen voidaan viedä sopiva restriktiokohta Kunkelin (Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1985. 82:488-492) kohdennetun mutageneesimenetelmän avulla. Ainoa tärkeä rajoitus tämän kohdan geeniin viemisessä on, että se on 10 sijoitettava OBP-kloonin translaationlopetussignaalin 5'-puolelle.
Kun tämä mutatoitu klooni on kohdallaan, voidaan valmistaa synteettinen oligonukleotidiadapteri, joka sisältää prote-15 aasintunnistuskohtaa, kuten Pro-Leu-Gly-Pro, koodaavan sekvenssin tai sen multimeerin. Tämä on kollagenaasi-prote-aasin tunnistuskohta. Adapteri syntetisoitaisiin siten, että saadaan: 4 emäksen ulkoneva pää adapterin 5'-päässä, yhteensopiva OBP-kloonin 3'-pään restriktiokohdan kanssa, 20 jotta on helpompi ligatoida adapteri vieraan peptidin koodaavaan sekvenssiin ja tarvittaessa ylimääräisiin emäksiin, niin, ettei siirryttäessä öl jyonteloproteiinia koodaavan • · . sekvenssin, proteaasin tunnistuskohdan ja vierasta peptidiä **" koodaavan sekvenssin välillä tapahdu lukukehyksen muutosta.
• « · *·*·’ 25 Sellaisen fuusion tyypillinen järjestely esitetään kuvassa 3.
·· · ···· Tässä esitetyssä esimerkissä käytetään valmiiksi porkkanan ..ΙΓ OBP:n lopetuskodonin lähellä olevaa Xhol-kohtaa (Hatzopoulos * et ai. Plant Cell. 1990. 2:457-467). Tämä katkaistaan ja voidaan ligatoida kahdesta kuvatusta oligonukleotidista :*·*: 30 rakennettuun adapteriin. Tämä adapteri muodostaa täydellisen .“*j Xhol-ulkonevan pään toisessa päässä, eikä sekoita • · · translaation lukukehystä. Toinen pää muodostaa ulkonevan • · · • ♦* Ncol-kohdan, joka valitaan vapaasti (mikä tahansa kuuden «·· • ♦ emäksen katkaisukohta riittää) , paitsi että siihen sisältyy ··· 35 ATG halutusta vieraasta peptidistä.
• · · · • · • · · • · · • ·
Lopullinen ligaatiotuote sisältää melkein täydellisen OBP-geenin, kollgenaasin tunnistuskohtaa koodaavan sekvenssin ja 31 haluttua peptidiä koodaavan alueen, kaikki samassa lukukehyksessä. Tämä kolmiosainen pätkä kloonataan Agrobacteriumin sellaiseen binaariplasmidiin (Bevan. Nucl. Acid Res. 1984. 12:8711-8721), jota käytetään yleisesti vieraan DNA:n siirtä-5 miseen kasveihin (Fraley et ai. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1983. 80:4803-4807), ja sitä käytetään öljysiemenkasvien, kuten rapsin transformoimiseen Moloneyn et ai. (Plant Cell Rep. 1989. 8:238-242) menetelmää tai vastaavaa menettelyä käyttäen. Tästä transformaatiokokeesta voidaan saada 10 siirtogeenisiä kasveja, jotka kasvatetaan kukkiviksi. Kasvit tuottavat sitten siementä itsepölytyksellä.
Siementen annetaan saavuttaa kypsyys (60-80 päivää). Sitten ne kerätään ja jauhetaan vesipohjaisessa uuttopuskurissa 15 (Taylor et ai. Planta. 1990. 181:18-26). Liete sentrifugoidaan uudelleen 5000 x g:ssä 20 min. ja saadaan pintavaahto. Vaahto otetaan taas talteen ja lietetään voimakkaasti ravistelemalla kollagenaasimenetelmäpuskuriin (Scholtissek ja Grosse. Gene. 1988. 62:55-64). Lisätään viisi 20 yksikköä kollagenaasia ja suspensiota inkuboidaan ravistellen 4 h. Tämän ajan kuluttua suspensio sentrifugoidaan jälleen kerran, 5000 x g 20 min. ajan. Pintavaahto poistetaan ja • · vesifaasin proteiinisisältö analysoidaan SDS- *1*1 polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Jos noin halutun • · · • · · *l 25 peptiden kokoa oleva juova löydetään, proteiini voidaan ··· ···· sakkauttaa ammoniumsulfaatilla, tiivistää ultrasuodatuksella ...ί tai pakastuskuivata.
··· • · » • · · B. N-terminaaliset fuusiot 3 0 :***; Öl jyonteloproteiinien hydrof iiliseen N-terminaali seen päähän ··· voidaan liittää peptidejä siten, että on kuitenkin varmaa, • · · *##·* että vieras peptidi jää öljyontelon ulkopinnalle. Tällaisten • · *···* fuusioiden rakenne esitetään kuviossa 2IB.
·:♦ 35 • · · · ί Tämä rakenne voidaan rakentaa C-terminaalisiin fuusioihin • · · • · käytettyjen kaltaisista lähtöaineksista, mutta vaatii sopivan restriktiokohdan identifioimisen öljyonteloproteiinigeenin 32 translaation aloituskohdan läheltä. Sopiva kohta voidaan tehdä moniin öljyonteloproteiinigeeneihin muuttamatta koodaavaa sekvenssiä lainkaan, muuttamalla yhtä ainoaa emästä heti ensimmäisen 'ATG':n 5'-puolella. Tähän asti tutkituissa 5 öljyonteloproteiineissa toinen aminhappo on alaniini, jonka kodoni alkaa G:llä. Sekvenssien ympäristö on seuraavanlainen: I A-C-vaihdos tähän tuottaa Ncol-kohdan
T
3' . . . TC TCA AGA ATG GCA . . . Porkkanan OBP
3' . . .CG GCA GCA ATG Gcg . . . Maissin 18 kD:n OBP
10 Yhden emäksen, ATG:tä edeltävän adeniinin, muutos tuottaisi kummassakin tapauksessa sekvenssin ...CCATGG..., joka on
Ncol-kohta. Siten tämän emäksen muotoileminen käyttäen Kunkelin (Proc. Nat. Acad. Sei. US. 1985. 82:488-492) kohdennettu mutageneesi -menetelmää valmistaa kloonin käyt-15 töön, olettaen, että sekvenssissä ei ole muita Ncol-kohtia.
Vierasta peptidiä koodaava sekvenssi voi vaatia valmisteluja, jotka mahdollistavat sen ligatoimisen suoraan Ncol-kohtaan. Tämä vaatii tyypillisesti yhden tai kahden emäksen modifi- m 20 kaation kohdennetulla mutageneesillä (Kunkel 1985, yllä) • · ·.·.· Ncol-kohdan tuottamiseksi vieraan peptidin translaation *ϊ* aloituskohdan lähelle. Tämä peptidi irroitetaan sitten ···· ^ ^ ·;· kloonausvektoristaan käyttäen Ncol: tä ja toista entsyymiä, ···· ·*·*· joka katkaisee läheltä kohteen translaation lopetuskohtaa.
25 Taas voidaan tuoda toinen sopiva katkaisukohta yllä kuvattuja menetelmiä käyttäen kohdennetulla mutageneesillä. Qu ja Huang • ♦ · ovat ehdottaneet (1990, yllä), että N-terminaalinen alaniini • · • · V voitaisiin poistaa proteiinin in vivo -prosessoinnin aikana, ·· · • V ja että siitä välittömästi alavirtaan sijaitseva metioniini 30 voitaisiin asyloida. Tätä mahdollisuutta varten voi olla ·· · tarpeen säilyttää proteiinin N-pään Met-Ala-sekvenssi. Tämä *!*’. voidaan tehdä helposti useilla eri strategioilla, joilla * * viedään sopiva restriktiokohta koodaavaan sekvenssiin Ala- 33 kodoniin tai sen jälkeen. Esimerkiksi, sekvenssiä voitaisiin muokata kohdennetulla mutageneesillä seuraavasti: 3' ... TC TCA ACA ATG GCA GAA CGA GGC ACT TAT .....
mitätöit uu sekvenss iksi i N a rl 3' ... TC TCA ACA ATG GCA TGC CGA GGC GCC ^ TAT .....
i_!=ϋ l-J
Sphl 5 Tämä yksittäisen kodonin muutos toisi koodaavaan sekvenssiin Sphl-kohdan. Toinen muutos, joka voitaisiin tehdä saman muta-geneesikierroksen aikana, muuttaisi kaksi emästä kodonissa 6 tuottaen sekvenssin GGC GCC, joka on Narl-kohta. Tämä 10 mutatoitu geeni voitaisiin sitten avata Sphl:llä ja Narl:llä, jotta saadaan suunnattu kloonauskatkos, joka poistaa kolme kodonia. Tähän kohtaan voitaisiin viedä adapteri, joka sisältää 3’-ulkoneman, jonka sekvenssi on CATG... (Sphl-yhteensopiva) ja GC 51-ulkoneman vastakkaisessa päässä. Tämän 15 adapterin täsmällinen sekvenssi esitetään seuraavassa: "*: Sphl Narl • · · • · · · n kertaa • · · • · • · · -- - - _
'"I CCG CTC GGT CCG GG
• · ·
•;:l CTACG GGC GAG CCA GGC CCGC
• · · J— «—<»——— ..................
• · · Tämä adapteri muodostaisi sekä Sphl- että Narl -restriktio- • · · 20 kohdat, joita käytettäisiin diagnostisiin tarkoituksiin.
• · *1* Sphl-kohtaa voitaisiin nyt käyttää plasmiden avaamiseen ja ·· · • *.· kloonata lukukehykseen DNA-fragmentti, johon sisältyy hyö-• · · dyllisen peptidin sekvenssi. Kloonauksen suuntaa voitaisiin sitten tutkia katkaisemalla plasmidi Narl-kohdasta ja mistä '1". 25 tahansa epäsymmetrisesti sijaitsevasta kohdasta.
* ·· • · 34 Näistä N-terminaalisista fuusioista saatavat rakenteet olisivat tyypillisiä Kuvion 2 IB:n esimerkkien mukaisia rakenteita. Ne sisältäisivät OBP-promoottorisekvenssin, lukukehyksessä olevan fuusion arvokasta peptidiä koodaavan 5 OBP-geenin sekvenssin muutamissa ensimmäisissä OBP-geenin kodoneissa, oma ATG aloitussignaalina, jos tarpeen, lopun OBP-geenin ja terminaattorin.
Tämä muokattu geeni viedään binaariseen Agrobakterium-plas-10 midiin (Bevan 1984, yllä) ja mobilisoidaan Agrobakteeriin.
Transformaatiot suoritetaan yllä kuvatulla tavalla. Arvokkaan peptidin talteenotto siemenistä suoritetaan, kuten "C-terminaalisten fuusioiden" suhteen on kuvattu.
15 C. Sisäiset translationaaliset fuusiot
Kolmas fuusiotyyppi käsittää arvokkaan peptidin koodaavan sekvenssin sijoittamisen OBP:tä koodaavan sekvenssin sisään. Tämä fuusiotyyppi vaatii samaa strategiaa kuin N-20 terminaaliset fuusiot, mutta saattaa olla toimiva vain heikosti säilyneiden alueiden muuttuessa, koska uskotaan, ·;··· että näiden öljyonteloproteiinien hyvin (lajien välisesti) säilyneet alueet ovat välttämättömiä kypsän proteiinin • · · · suuntaamiseksi.
• ♦ · 25 • · · ***! Tällaisen fuusion tärkein erottava piirre on se, että prote- ··· **** iinin vapauttamiseksi tarvitaan kollagenaasin tunnistuskohdat • · · *·1 1 molemmin puolin. Tämä tarkoittaa, että tähän asti kuvatun s tandardi-koilagenenaas i-1inkkeri/adapteri-systeemin sijasta ··♦ ·.· · 30 tarvitaan 1 inkkeriä, joka on seuraavaa muotoa: • · · • · • · • · · _n kertaa n kertaa
·1 kohesiivi- CCG CTC GGT CCG restrik- CCG CTC GGT
• · · nen pää 1 GGC GAG CCA GGC tiokohta GGC GAG CCA GGC pää 2 • · · • · 35 riktiokohtaa käytetään sitten sopivien restriktiokohtien tai linkkereiden reunustaman arvokkasta peptidiä koodaavan sekvenssin tuomiseen. Suunta tarkastetaan käyttämällä asymmetrisesti sijoitettua restriktiokohtaa arvokasta peptidiä 5 koodaavassa sekvenssissä sekä toista kahdesta restrik- tiokohdasta kollagenaasin tunnistuskohtaa koodaavan sekvenssin molemmin puolin.
Näiden konstruktien siirto Agrobacteriumin plasmideihin ja 10 sitten kasveihin on täysin aiemmin kuvatun menettelyn kaltainen. Arvokkaan proteiinin ottaminen talteen transgeenisten kasvien siemenistä eroaa jonkin verran siinä, että kun öljyontelot on eristetty ja pesty, voi olla tarpeen poistaa öljyontelolipidit, jotta päästään käsiksi kollagenaasin 15 tunnistuskohtiin, jotka voivat olla piilossa öljyontelon sisällä lipidifaasissa. Tämä vaihe voi pienentää tiettyjä öljyonteloproteiinien kantajana käyttämisen etuja, mutta voi toisaalta olla hyvin käytännöllistä sellaisilla prote-iinisekvensseillä, jotka ovat labiileja vesiliuoksissa ja 20 kasvien solulimassa.
·;··· D. Dimeerien väliset translaatiofuusiot • · · • · · ·
On mahdollista luoda rakenne, jossa OBP:n koko koodaava sek- • · · .j, 25 venssi toistuu. Tästä rakenteesta tuotettu dimeerinen proteiini voi silti sisältää kaikki tarpeelliset tekijät **“ OBP:n suuntaamiseksi öljyonteloon. Sellainen rakenne sisäl- • · · täisi promoottorialueen, kokonaisen tai lähes täydellisen avoimen OBP:n lukukehyksen, mutta ilman translaation lope- • · · ·.* · 30 tuskohtaa, ja sitten kokonaisen toisen OBP:n avoimen luku- • · · :.,.ϊ kehyksen (an entire open-reading frame of a second OBP) , tällä kertaa translaation lopetuskohdalla ja terminaattori- • · *..! alueella varustettuna.
• · • · ..*·* 35 Tätä kimeeristä geeniä rakennettaessa kaksi erilaista rest- ϊ/.ϊ riktiokohtaa on joko valmiina tai luodaan kyseisten kahden kopion liittymäkohdan alueelle. Näiden restriktiokohtien tarkoitus on mahdollistaa yllä kuvatun kaltaisen linkkerin 36 siirto sisäisiä translationaalisia fuusioita varten. Linkkeri sisältää paitsi kollagenaasin tunnistuskohtia, myös sisäisen restriktiokohdan, jonka sisään voidaan sijoittaa arvokasta proteiinia koodaava sekvenssi. Tämän rakenteen muoto 5 esitetään kuvassa 2 III. Tämän rakenteen siirtäminen Agrobacteriumiin ja sitten kasveihin vastaa täysin edellä kuvattua. Arvokas proteiini otettaisiin talteen transformoitujen kasvien siemenistä samalla menettelytavalla, joka on kuvattu C-terminaalisten fuusioiden kohdalla edellä.
10
Esimerkki 2
Strategia interleukiini-1-β :n (ΙΙ,-1-β:η) kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi oleosiineihin fuusioituneena kasveissa 15 A. Arabidopsis thalianan oleosiinigeenin kloonaaminen ja sekvensointi
Brassica napuksen oleosiinigeeniä (Murphy et ai. 1991.
20 Biochim Biophys Acta 1088:86-94) käytettiin A. thalianan (lajike Columbia) genomisen kirjaston seulomiseen EMBLA3A:ssa ·;··: (Stratagene) . Seulonnalla saatiin eristetyksi EMBLA3A-klooni .j. (Iambda2.1), joka sisältää 15 ke:n genomisen fragmentin A.
• · · · thalianasta. Oleosiini paikallistettiin 6,6 ke: n Kpnl- • · · ’,1, 25 insertin sisään tässä 15 ke:n fragmentissa (Kuvio 5). 1,8 ’**! ke:n Ncol/Kpnl -pätkän, joka sisältää oleosiinigeenin, päät i·· täytettiin ja pätkä alakloonattiin RFMl3mpl9:n Smal-kohtaan.
• · · *·’ 1,8 ep:n insertti pilkottiin sopivilla restriktioentsyymeillä ja alakloonattiin Ml3mpl9:ään sekvensointia varten. A.
• · · ·.· : 30 thalianan oleosiinigeenin 1800 ep:n sekvenssi esitetään • · · i...i kuvassa 1 a. Kaikki kloonausprosessit suoritettiin Sambrookin et ai. mukaan (1989. Molecular Cloning: A laboratory manual.
• · 2 . painos . Cold Spring Haber Laboratory Press . ) • · ··· i((T 35 B. IL-l-p:aa koodaavan ollgonukleotldin laatiminen • · • · · • · · • · IL-1-β koostuu 9 aminohaposta (aa): val-gln-gly-glu-glu-ser-asn-asp-lys (Antoni et ai. 1986. J. Immunol. 137:3201 37 3204) . Proteaasitekijä Xa pystyy katkaisemaan proteiinisek-venssin, joka sisältää aminohapposekvenssin ile-glu-gly-arg. Katkaiseminen tapahtuu aminohapon arg jälkeen. Näihin sekvensseihin perustuen laadittiin oligonukleotidi (GVRll, 5 kuva 5), joka sisältää IL-l-p:aa koodaavan sekvenssin lisäksi Xa-tekijän katkaisukohdan koodaavan sekvenssin ja 18 nukleotidia A. thalianan oleosiinin 3'-pään koodaavasta alueesta (emäskohdat 742-759). Ιΐι-1-β:η koodaava sekvenssi laadittiin käyttäen B. napuksen ja A. thalianan oleosiinien 10 optimaalista kodonin käyttöä (Taulukko 1).
Taulukko 1 Λ. Thallanan^ ja B. napuksen oleosiinin^ kodonink&yttö TTT phe F 5 TCT ser S 0 ΤΛΤ tyr Y 6 TCT cyn C - TTC phe F 3 TCC ser S 10 TAC tyr Y 11 TGC cys C - ΤΤΛ leu L - TCC aer S 2 TAA OCM Z - TGA ΟΡΛ z - TTG leu L 4 TGA ser S - TAG AMD Z - TGG trp w 2 err lm) I, 10 CCT pro p 3 CAT h le H 4 CGT arg R 6 CTC leu L 11 CCC pro p 1 CAC hie It 6 CGC arg R - CTA leu h - CCA pro p 4 CAA gin Q 4 CGA arg R 1 CTG Igu l, 6 CCG pro p 2 CAG gin Q 17 CGG arg R - • · .:. ATT lie I 7 ACT thr T 11 ΑΛΤ aan N - AGT ser S 5 ATC Ilo I 13 ACC thr T 14 AAC aen N 1 AGC ser S 3 ΑΤΑ Ile I 3 ACA thr Y 7 ΛΛΛ ly e K 5 AGA arg R 5 \\t ATG met M 11 ACG thr T 5 AAG lys K 10 AGG arg R 3 • ••i G TT vai V 11 GCT ala A 17 GAT asp D 8 GGT gly G 0 GTC vai V 9 GCC ala A 2 GAC aep D 19 GGC gly G 9 CTA vai V - GCA ala A 10 GAA glu E 2 GGA gly G 14 GTG vai V - GCG aja A ? GAG gly E 2 GGG gly G 5 ··· • · · • · ·
:,..i 1 Katso kuvio IA
2 Lee ja Huang (1991) Plant Physical 96: 1395-1397 • · · • · *..* 15 C. A. thaliana -oleosiini - IL-l-p-fuusion valmistaminen • » • · • · · *:* Sekvenssin ···· :*·.· 5 ' CACACCAGGAACTCTCTGGTAAGC 3 ’ • · (emäskohdat -838 - -814) perusteella laadittiin oligonukle-20 otidi GVR10 38 5' CACTGCAGGAACTCTCTGGTAAGC 31 GVRlO sisältää Pstl-restriktiokohdan (alleviivattu) kloonauksen helpottamiseksi. Polymeraasiketjureaktion (PCR) 5 avulla monistettiin GVRlO:n ja GVRll välinen alue. Reak-tioseos sisälsi: 16 μΐ dNTPritä (1,25 mM), 10 x PCR -puskuria (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl2, 0,1 % (w/v) gelatiinia), 5 μΐ GVRll:tä (20 μΜ), 1 μΐ Taq-DNA-polymeraasia (1 u/μΐ) ja 64 μΐ H20:ta. Reaktiota suoritettiin 30 10 kierrosta. Kukin kierros käsitti yhden minuutin denaturoinnin 92 °C:ssa, 1 minuutin emäspariutuksen 45 °C:ssa ja 3 minuutin pidennyksen 72 °C:ssa. PCR-reaktio tuotti yhden 1652 nukleotidin fragmentin.
15 D. A. tha.lia.neaa. oleosiini - IL-1-β -fuusion (OBPIL) kloo naaminen 5' Sali - nopaliinisyntaasin (nos) terminaattori - EcoRI 3' -sekvenssi eristettiin pBH21:stä (Clontech -laboratoriot) ja 20 kloonattiin pUC19:n Sal/EcoRI-kohtiin. Plasmidia nimitettiin pTermiksi. (C.-kohdassa kuvattu) 1652 ep:n fragmentti ·;··; eristettiin ja pilkottiin restriktioentsyymeillä PstI ja
Sali. Tämä pätkä kloonattiin pTermiin. Saadulle plasmidille • · · · annettiin nimi pUCOBPILT (kuva 5) . Tämä plasmidi pilkottiin • · · 25 EcoRI:llä ja Pstl:llä ja saatiin katkaistu pUC19-vektori ja **** EcoRI - A. thalianan oleosiini - lL-1-β - nos -PstI -fuusio • · ·
PstI (OBPILT). OBPILT:in täydellinen sekvenssi esitetään • · · ’·* kuvassa 7. OBPILT alakloonattiin pBluescript+:an EcoRI/PstI - kohtiin. Tämä plasmidi (pBIOPILT) pilkottiinn Pstl:llä ja • · · ·.· · 30 HindIII:lla ja Pstl-OBPILT-Hindlll-pätkä alakloonattiin ϊ,.,ϊ binaariseen Agrobacterium-plasmidiin (Bin 19) Bevan, M. 1984.
Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721), joka sisälsi valintamarkkerin • · *..! (neomysiinifosfotransferaasi) ja Pstl-Hindlll kohdat yhden • · • · T kumpaakin. Saatu plasmidi nimitettiin pCGOBPILT:iksi. Kuvassa m ..*·* 35 5 on kaavamainen esitys kloonausprosessista. Kuvauksia erilaisista binaariplasmideista: pGA642 tai 645; An et ai. 1985. EMBO J. 4: 277-288 tai pCGNl558 tai 1559; MacBride ja Summerfeldt. 1990. Plant. Molec. Biol. 14: 269-276.
39 F. pCGOBPILT:in transformaatio Agrobacterium-kantaan EHA101
Yhdellä EHAlOl-pesäkkeellä (Hood et ai. 1986, J. Bact. 5 168:1291-1301) ympättiin 5 ml LB + 100 pg/ml kanamysiiniä.
Tätä viljelmää kasvatettiin 48 tuntia 28 °C:ssa. Tällä 5 ml viljelmällä ympättiin 500 ml LB + 100 pg/ml kanamysiiniä. Tätä viljelmää kasvatettiin 28 °C:ssa, kunnes viljelmä saavutti optisen tiheyden 600 = 0,5 (noin 4 tuntia). Solut 10 sentrifugoitiin pohjalle (10 min, 5000 x g) ja suspendoitiin uudelleen 500 ml:aan steriiliä H20:ta (toistettiin 2 x) . Solut sentrifugoitiin taas ja suspendoitiin uudelleen 3 ml:aan steriiliä H20:ta, joka sisälsi 10 % glyserolia. 40 μΐ soluista jaettiin eriin Eppendorf-putkiin ja joko käytettiin 15 suoraan elektroporaatioon tai säilytettiin -80 °C:ssa tulevaa käyttöä varten. Elektroporaatio suoritettiin Bowerin et ai. (Nucl. Acid. Res. 1988. 16:6127 - 6145 mukaan.
Pulssigeneraattori säädettiin 25 uF varaajalle, 2,5 kV:iin ja 200 ohmiin rinnan näytekammion kanssa.
20 G. Nicotiana tabacumin transformointi pCGOBPILT:illä • · pCGOBPILT:in sisältävä EHA 101 käytettiin tupakan lehti- • · · · kiekkojen transf ormointiin. Kahdeksasta kymmeneen sentti- • · m 25 metrin pituisia tupakanlehtiä otettiin kasvihuoneessa kas- ***I vatetuista kasveista, steriloitiin 70 % etanolissa 20 s ja • · · *”* sen jälkeen 10 % valkaisuaineessa (esim. Javex) 8 min. Lehdet • · · *·* * huuhdottiin sitten 6 kertaa steriilillä vedellä. Lehtien reunat ja keskisuoni poistettiin ja jäljelle jääneet lavat • · · · 30 jaettiin 5 x 7 mm suorakulmioiksi tai halkaisijaltaan 5 mm • · · kiekoiksi. Noin 30 lehtikiekkoa kerättiin ja asetettiin pienelle petrimaljalle. Agrobacterium-liuosta kaadettiin • · \.I sitten tupakkakiekkojen päälle ja inkuboitiin 9 minuuttia.
• ·
Lehden palaset painettiin sitten steriilille Whatmanin 35 suodatinpaperille ja asettetiin abaksiaalinen puoli alaspäin kasvatusaineeseen I (MS, 3 % sakkaroosia ja 2 mg/1 2,4-D:tä). Yhteiskasvatus kesti seuraavat 48 tuntia. Sitten lehtikiekot siirrettiin seulontakasvatusaineeseen (MD, 3 % sakkaroosia, 40 2,5 mg/1 Ba, 0,1 mg/1 NAA, 500 mg/1 karbenisilliinia ja 100 mg/1 kanamysiiniä) , johon ne jätettiin seuraaviksi 3-4 viikoksi. Versojen alettua kasvaa ne leikattiin ja pantiin juurtumisalustaan (MS, 3 % sakkaroosia, 0,1 mg/1 NAA, 500 5 mg/1 karbenisilliinia ja 50 mg/1 kanamysiiniä). Kun oli muodostunut riittävästi juuria, tupakkataimet siirrettiin multaan.
H. B. napuksen transformointi pCGOBPILTsillä 10 B. napuksen transformointi suoritettiin Moloneyn et ai. mukaan, 1989. Plant Cell Rep. 8:238-242, joka artikkeli sisällytetään tähän viittauksena.
15 Transformaatioprosessi
Yksittäisiä Agrobacterium tumefaciens -kannan EHA 101 pesäkkeitä, jotka sisältävät binaariplasmidin, kasvatettiin yön yli 28 °C:ssa AB-kasvatusalustassa. 50 μ1:η näytettä tästä 20 suspensiosta kasvatettiin yön yli 28 °C:ssa 5 ml:ssa MG/L -lientä, johon oli lisätty sopivat antibiootit. Tämä *j··· bakteerisuspensio pelletoitiin sentrifugoimalla 15 min 10 000 x g:ssä ja suspensoitiin sitten uudelleen 10 ml: aan MS- • ·· · kasvatusalustaa, joka sisälsi 3 % sakkaroosia, pH:ssa 5,8. 5 ♦ · · 25 cm:n petrimaljan pohja peitettiin ohuella kalvolla tätä **** suspensiota. Yksittäisiä irti leikattuja sirkkalehtiä otet- • · · ·*” tiin yllä kuvatuilta maljoilta, ja niiden petiolien leikattu • · · *·* * pinta upotettiin tähän bakteerisuspensioon muutamaksi sekunniksi. Ne siirrettiin välittömästi takaisin samoille MS- ··· · 30 maljoille, joilta ne oli otettu. Sirkkalehtiä viljeltiin : Agrobacteriumin kanssa 72 h. Ravintosolukerrosta ei käytetty.
»· · • · · • · *.,I Yhteisvil j elyn jälkeen sirkkalehdet siirrettiin regeneroin- • · ’*;·* tialustaan, joka käsitti MS-alustan, johon oli lisätty 20 μΜ
35 bentsyyliadeniinia, 3 % sakkaroosia, 0,7 % fytoagaria, pH
:*·.· 5,8, ja 500 mg/1 karbenisilliiniä (Pyopen, Ayerst) ja 15 mg/1 • m kanamysiinisulfaattia (Boehringer - Mannheim). Petiolit upotettiin taas huolellisesti agariin noin 2 mm syvyyteen.
41
Maljaustiheys pidettiin 10 istukkaana maljaa kohti. Suuremmat tiheydet vähentävät regeneraatiofrekvenssiä.
Valinta ja kasvien regenerointi 5
Istukkaita pidettiin regenerointialustassa yllä kuvatuissa valo- ja lämpöoloissa 2-3 viikkoa. Tänä aikana yli puolessa istukkaista ilmeni monia versoja, ja kallusta muodostui suhteellisen vähän. Jotkut näistä versoista valkaistuvat 10 neljännen viljelyviikon aikana. Jäljelle jääneitä vihreitä versoja siirrettiin erillään viljeltäviksi verson pituuskasvualustalle, joka oli samaa kuin regeneraatioalusta, mutta ilman bentsyyliadeniinia. Viikko tai kaksi tällä alustalla mahdollisti apikaalisen dominanssin vakiintumisen 15 muodostuneissa versoryppäissä. Näin saadut versot siirrettiin "juurtumis"alustalle, joka sisälsi MS-alustaa, 3 % sakkaroosia, 2 mg/1 indolibutyraattia, 0,7 % fytagaria ja 500 mg/1 karbenisilliiniä. Tässä vaiheessa ei käytetty lainkaan kanamysiiniä, koska havaittiin, että juuret muodostuivat 20 nopeammin ilman valintatekijää, ja vain muutamia "karkulaisia" onnistui juurtumaan kahden valintakierroksen -·;··· regeneraatioalustalla ja verson pituuskasvualustalla jälkeen.
• · · · • · • · · • · · I 25 I. OBPILT:in integrointi pysyvästi tupakan ja B. napuksen **** genomeihin • · · ···· • · · • · · '·* * Oletetut transformoidut kasvit testattiin neomysiinifosfo- transferaasiaktiivisuuden suhteen. Kasveista, joissa tätä • · · · 30 aktiivisuutta oli, eristettiin genomista DNA:ta. Suoritettiin
Southern-blottaus sen osoittamiseksi, että T-DNA-rajojen ;·]·. väliset sekvenssit (OBPILT ja neomysiinif osf otransf e- • · raasigeeni) olivat integroituneet pysyvästi B. napuksen ja *” tupakan genomeihin. Tupakka-Southern koetettiin A. thalianan ,.*·* 35 oleosiinigeenillä ja neomysiinin f osf otransf eraasigeenillä.
: B. napus -Southern koetettiin neomysiinifos- • · fotransferaasigeenillä.
42 J. Oleosiini-IL-p-fuusion ilmentyminen tupakkakasveissa
Transformoiduista ja transformoimattomista kasveista saaduista kehittyvistä alkioista eristettiin RNA:ta. Suoritet-5 tiin Northern-blottaus käyttäen A. thalianan oleosiinia geenikoettimena. Kaikista testatuista transformoiduista kasveista voitiin osoittaa 850 nukleotidin transkripti. Näiden transkriptien koko vastaa oleosiini-IL-l-0-mRNA:n odotettua kokoa. Näitä transkripteja ei voitu osoittaa 10 transformoimattomista kasveista.
K. Oleosiini-IL-l-p-proteiinin kertyminen Ö1jyonteloproteiinit eristettiin transformoiduista tupakan-15 siemenistä (Holbrook et ai. 1991. Plant Physical 97:1051- 1058). Tehtiin PAGE ja proteiini siirrettiin geelistä PVDF-kalvoille. Vasta-ainetta, joka tehtiin antigeeninä B. na-puksen 22 kD:n oleosiini, käytettiin oleosiini-IL-O-fuusi-oiden löytämiseen tupakansiemenistä. Tämä vasta-aine tun-20 nistaa kaikki tärkeimmät B. napuksen ja A. thalianan ole- osiinit. Lisäksi tämä vasta-aine tunnistaa tupakan ole-·;··· osiinit. Tupakan oleosiinit ovat eri kokoisia kuin A. tha-
Hanan ja B. napuksen oleosiinit. Transformoiduissa tupa- • · · · kansiemenissä anti- 22 kD -vasta-aine tunnisti 20 kD:n • · · *#je 25 proteiinin, jota ei ollut transformoimattomissa tupakan- •**| siemenissä. Oleosiini-IL-p-fuusion odotettu koko on 20,1 kD.
··· •••j Taulukossa 2 on yhteenveto tuloksista.
• · · • · ·
Ilmentämällä haluttua peptidiä liittyneenä johonkin öljyon- • · · ·.· · 30 teloproteiiniin tai sen osaan, joka riittää öljyonteloihin pääsemiseen, haluttu peptidi voidaan puhdistaa helposti olen- :·*·. naisesti puhtaaksi muista solun osista. Fuusioproteiini • · *..I voidaan katkaista puhdistamisen jälkeen, tai sitä voidaan • · • · *:* käyttää katkaisematta. Tämän keksinnön menetelmät ja koos- #>*j* 35 tumukset tarjoavat nopean, yksinkertaisen menetelmän kiin- :\j nostuksen kohteena olevan polypeptidin puhdistamiseksi.
43
Kaikki tässä selvityksessä mainitut julkaisut ja patenttihakemukset liitetään täten tähän viittaamalla, samassa määrin, kuin jos jokainen yksittäinen julkaisu ja patenttihakemus olisi erikseen mainittu viittaamalla hakemukseen liitetyksi.
5
Kun keksintö nyt on kokonaan kuvattu, alan tavanomaiset taidot omaaville on ilmeistä, että keksintöön voidaan tehdä monia muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta liitteenä olevien patenttivaatimusten hengestä ja alasta.
10
Taulukko 2
Ilmentymistulosten yhteenveto1 15 Pysyvä Oleosiini- 20 kD:n integraatio- IL-lb:n proteii nin
Southern- ilmentyminen löytymi nen 20 blottaus Northern- Western -blottaus -blottaus • · ··· • 1 " ............ 1 " 1 — ......
···· B. napus: • · · • · ,·. 25 transformoimaton - ei test. ei test.
’*’* transformantti #12 + ei test. ei test.
··· ···· • · · • · · *·* * Tupakka: transformoimaton - + + ··· ·.· · 3 0 transf ormant ti A + + + • · · ;...ϊ transf ormant ti B + + + transf ormant ti G + + + • · '··· transf ormant ti L + + + • · • · • · · ··· ---- • ‘Γ*. kysyvä integroituminen, kuten määritelty edellä kohdassa I.
·.*·: Oleosiini-lL-l-b -fuusion ilmentyminen, kuten määritelty edellä kohdassa J. Oletettu oleosiini-lL-l-b-fuusioproteiini tunnistettiin edellä kohdassa K kuvatulla tavalla. Ei test. = ei testattu.

Claims (22)

1. Kimeerinen DNA-konstrukti, joka koodaa kimeeristä poly-peptidiä, tunnettu siitä, että se käsittää: 5 a) ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa ainakin öljyonte-loproteiinin hydrofobista ydintä ja joka on riittävä suuntaamaan fuusiopolypeptidin öljyonteloon, ja b) toisen peptidiä koodaavan DNA-sekvenssin, jolloin 10 mainittu peptidi on muu kuin öljyontelossa luonnossa esiintyvä polypeptidi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kimeerinen DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen: 15 vektori-DNA:n, johon sisältyy ainakin yksi säätelysekvenssi toimivasti liittyneenä mainittuun kimeeriseen DNA-sekvens-siin, joka kykenee suuntaamaan mainitun kimeerisen DNA: n replikaation isäntäsolussa. 20
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen kimeerinen DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että mainittu säätelysekvenssi kykenee myös • · . ohjaamaan mainitun kimeerisen DNA:n ilmentymistä isän- ··· ···· täsolussa. • · • · · *.*.· 25 ..ΙΓ
4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen kimeerinen DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että mainittu DNA on cDNA: ta. ··· • · · • · ·
5. Ilmentymiskasetti, tunnettu siitä, että se käsittää osi-30 naan, transkription suunnassa: »·· • · • · ·] - säätelevän DNA-sekvenssin, johon sisältyy siemenissä ilmen- tyvän geenin translaation aloituskohdan 5'-puolelta osa, joka ··· ♦...· riittää aiheuttamaan sen, että DNA-sekvenssi ilmentyy sieme- .···. 35 nissä, • · t·· - kimeerisen DNA-sekvenssin, joka koodaa kimeeristä polypep-tidiä ja joka käsittää • · (a) ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa ainakin hydrofobista ydintä, joka on riittävä suuntaamaan kimeerisen polypeptidin öljyonteloon, mainitun ensimmäisen DNA-sekvens- 5 sin sisältäessä ainakin yhden restriktiokohdan, ja (b) toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa peptidiä, jolloin mainittu peptidi on muu kuin luonnostaan öljyontelossa esiintyvä, ja 10. translaation ja transkription lopetuskohdat, jolloin mainitut osat ovat liittyneinä yhteen toimivasti ja mainitun kimeerisen DNA-sekvenssin ilmentymistä säätelee mainittu säätelevä DNA-sekvenssi. 15
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ilmentymiskasetti, tunnettu siitä, että mainittu säätelevä DNA-sekvenssi on viljakasvin siemenen solussa ilmentyvästä geenistä.
7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen ilmentymiskasetti, tunnettu siitä, että mainittu säätelevä DNA-sekvenssi on . öljyonteloproteiinin geeni. • · • » · •••j
8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ilmentymiskasetti, jossa • · · *.*.* 25 ainakin joko mainittu säätelevä DNA-sekvenssi tai mainittu ensimmäinen DNA-sekvenssi on Arabidopsis thalianan genomista. • · · • · · · :T:
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-8 mukainen ilmenty miskasetti, tunnettu siitä, että mainittu ilmentymiskasetti 30 sisältää ainakin yhden restriktiokohdan välillä juuri alkume- .···. tioniinin 5'-puolelta mainitun öl jyonteloproteiinin geenin • · *·* translaation lopetussignaalin 5'-puolelle. • · · • · · • · · • · ·
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen ilmentymiskasetti, tun-.···. 35 nettu siitä, että mainittu restriktiokohta on synteettinen restriktiokohta. • ·
11. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-10 mukainen ilmen- tymiskasetti, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää oligonukleotidiadapterin, joka koodaa mainittuun restriktiokohtaan insertoitua proteaasin tunnistuskohtaa. 5
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen ilmentymiskasetti, tunnettu siitä, että mainittu proteaasi on kollagenaasi.
13. Menetelmä kiinnostuksen kohteena olevan peptidin ilmen-10 tymisen tuottamiseksi siemenessä, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä käsittää: isäntäkasvisolun transformoimisen minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-12 mukaisella ilmentymiskasetilla tai minkä 15 tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella DNA-konstruktilla genomisen integraation olosuhteissa.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua kasvia kasvatetaan siemenen tuotta- 20 miseksi, jolloin mainittu kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi ilmentyy kimeerisenä proteiinina, jonka ilmen- , tymistuote on mainittu öljyonteloproteiinin geeni. • · ··«
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu • · *.*.* 25 siitä, että se lisäksi käsittää: mainitun kimeerisen proteiinin eristämisen mainitun siemenen solujen öljy- *ϊ* onteloista. ···♦ • · · • · ♦ • · ·
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, jossa mainittu 30 eristäminen käsittää: • · · m ··· • · • · *Γ* mainittujen siementen solujen hajottamisen mainittujen öljy- onteloiden vapauttamiseksi ja; • · · mainittujen öl jyonteloiden rikkomisen, jolloin mainittu .···. 35 kimeerinen proteiini vapautuu. • · ··· • «
17. Patenttivaatimuksen 15 tai 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu eristäminen lisäksi käsittää: mainitun kimeerisen proteiinin saattaminen kontaktiin sellaisen proteaasin kanssa, joka pystyy tunnistamaan mainitussa kimeerisessä proteiinissa ennen mainitun, 5 kiinnostuksen kohteena olevan peptidin N-päätä sijaitsevan proteaasin tunnistuskohdan.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää: 10 ennen mainittua kontaktiin saattamista mainitun kimeerisen proteiinin sitomisen kiinteään kantajaan, joka käsittää vasta-aineen, joka pystyy sitoutumaan mainitun öljy-onteloproteiinin geenin ilmentymistuotteeseen. 15
19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää mainitun kiinnostuksen kohteena olevan peptidin puhdistamisen.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kiinnostuksen kohteena . oleva peptidi on muu kuin kasvigenomin koodaama peptidi. • · • · ·
21. Tupakan tai Brassica Napuksen siemen, kasvi tai • · * * * *.*.* 25 kasvisolu, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-12 mukaisen ilmentymiskasetin tai minkä ..*·* tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen DNA-konstruktin. • · · • · · • · ·
22. Kimeerinen polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää 30 ainakin öljyonteloproteiinin hydrofobisen ytimen, ja joka on .··♦. riittävä suuntaamaan kimeerisen polypeptidin öljyonteloon, ja • 9 *·* toisen polypeptidin, ja jota mainittua kimeeristä • · · polypeptidiä ilmentää minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-12 ··· ·...· mukainen ilmentymiskasetti tai minkä tahansa .*··. 35 patenttivaatimuksen 1-4 mukainen kimeerinen DNA-konstrukti. • ♦ ·»· • ·
FI944841A 1992-04-15 1994-10-14 Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa FI120266B (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI944841A FI120266B (fi) 1992-04-15 1994-10-14 Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA9200161 1992-04-15
PCT/CA1992/000161 WO1993021320A1 (en) 1991-02-22 1992-04-15 Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
FI944841A FI120266B (fi) 1992-04-15 1994-10-14 Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa
FI944841 1994-10-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI944841A0 FI944841A0 (fi) 1994-10-14
FI944841A FI944841A (fi) 1994-12-14
FI120266B true FI120266B (fi) 2009-08-31

Family

ID=32778493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI944841A FI120266B (fi) 1992-04-15 1994-10-14 Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0636179B1 (fi)
JP (1) JP3639592B2 (fi)
KR (1) KR950700992A (fi)
AT (1) ATE277180T1 (fi)
CA (1) CA2118113C (fi)
DE (1) DE69233416T2 (fi)
DK (1) DK0636179T3 (fi)
ES (1) ES2227511T3 (fi)
FI (1) FI120266B (fi)
NO (1) NO323038B1 (fi)
WO (1) WO1993021320A1 (fi)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5650554A (en) * 1991-02-22 1997-07-22 Sembiosys Genetics Inc. Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
US7091401B2 (en) 1991-02-22 2006-08-15 Sembiosys Genetics Inc. Expression of epidermal growth factor in plant seeds
US5869602A (en) * 1995-03-17 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
US5824870A (en) * 1995-11-06 1998-10-20 Baszczynski; Chris Commercial production of aprotinin in plants
WO1998021348A1 (en) * 1996-11-12 1998-05-22 Battelle Memorial Institute Method of producing human growth factors from whole plants or plant cell cultures
US5856452A (en) * 1996-12-16 1999-01-05 Sembiosys Genetics Inc. Oil bodies and associated proteins as affinity matrices
FR2757874B1 (fr) * 1996-12-17 2003-04-25 Biocem Collagenes recombinants et proteines derivees produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
US7585645B2 (en) * 1997-05-27 2009-09-08 Sembiosys Genetics Inc. Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products
US7008664B1 (en) * 1998-06-11 2006-03-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for improving the carcass quality of an animal
GB2364705A (en) * 2000-07-14 2002-02-06 Icgeb Fusion protein expression in plastids
WO2004113540A1 (en) * 2003-06-18 2004-12-29 The University Of York Expression of heterologous protein
US11311574B2 (en) 2003-08-08 2022-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP1934350B1 (en) * 2005-10-19 2018-04-18 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Polyoleosins
EP2044207A1 (en) * 2006-07-11 2009-04-08 Basf Se Protein targeting to lipid bodies
CN114409729B (zh) * 2021-11-11 2023-06-20 南京财经大学 一种菜籽肽及其在制备药物纳米载体方面的应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU1583292A (en) 1993-11-18
DK0636179T3 (da) 2004-12-20
AU678136B2 (en) 1997-05-22
CA2118113C (en) 2002-01-08
JP3639592B2 (ja) 2005-04-20
DE69233416T2 (de) 2005-03-03
NO323038B1 (no) 2006-12-27
ATE277180T1 (de) 2004-10-15
CA2118113A1 (en) 1993-10-28
NO943914D0 (no) 1994-10-14
EP0636179B1 (en) 2004-09-22
ES2227511T3 (es) 2005-04-01
EP0636179A1 (en) 1995-02-01
FI944841A0 (fi) 1994-10-14
WO1993021320A1 (en) 1993-10-28
DE69233416D1 (de) 2004-10-28
JPH07507199A (ja) 1995-08-10
FI944841A (fi) 1994-12-14
KR950700992A (ko) 1995-02-20
NO943914L (no) 1994-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120266B (fi) Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa
US5650554A (en) Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
US5948682A (en) Preparation of heterologous proteins on oil bodies
US5487991A (en) Process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants
FI120314B (fi) Öljyonteloproteiini-cis-elementit säätelysignaaleina
JP3232068B2 (ja) 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法
US6753167B2 (en) Preparation of heterologous proteins on oil bodies
Saalbach et al. A chimeric gene encoding the methionine-rich 2S albumin of the Brazil nut (Bertlrolletia excelsa HBK) is stably expressed and inherited in transgenic grain legumes
US6777591B1 (en) Legume-like storage protein promoter isolated from flax and methods of expressing proteins in plant seeds using the promoter
ZA200103557B (en) Novel expression cassette for expressing genes in plant seed.
US6288304B1 (en) Expression of somatotropin in plant seeds
KR20050024419A (ko) 식물 소포체 파생적 단백질체들 내의 축적에 의한 펩티드및 단백질들의 생산
CA1337048C (en) Process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants
JPH04229182A (ja) 新規シグナル配列
US5670635A (en) Seed storage protein with nutritionally balanced amino acid composition
EP0319353B1 (en) A process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants
RU2201449C2 (ru) Слитый полипептид, способный к целенаправленному переносу к масляному телу, химерная днк-контрукция, экспрессирующая кассета
AU678136C (en) Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
JP3927975B2 (ja) 植物中の高価値ペプチドの担体用の油体タンパク質
US20040117874A1 (en) Methods for accumulating translocated proteins
EP0723019A1 (en) A process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants
KR100333315B1 (ko) 식물에서 가치있는 펩타이드의 운반체인 기름체 단백질

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: SEMBIOSYS GENETICS INC.

FG Patent granted

Ref document number: 120266

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed