FI120266B - Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa - Google Patents
Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa Download PDFInfo
- Publication number
- FI120266B FI120266B FI944841A FI944841A FI120266B FI 120266 B FI120266 B FI 120266B FI 944841 A FI944841 A FI 944841A FI 944841 A FI944841 A FI 944841A FI 120266 B FI120266 B FI 120266B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- chimeric
- peptide
- dna
- expression
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 175
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 125
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 120
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 239000000969 carrier Substances 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 84
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 56
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 36
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 20
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 19
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 12
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 11
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 11
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 6
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 claims description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 110
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 103
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 103
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 63
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 63
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 47
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 41
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 41
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 31
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 27
- 102100027196 Odorant-binding protein 2a Human genes 0.000 description 20
- 229920001237 Oxo Biodegradable Polymers 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 14
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 14
- -1 aliphatic amino acid Chemical class 0.000 description 14
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 11
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 11
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 9
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 7
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 6
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 6
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 6
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 5
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 5
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 5
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 101150055581 obp gene Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 3
- 101100293593 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nar-1 gene Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 101000617808 Homo sapiens Synphilin-1 Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000201976 Polycarpon Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 102100021997 Synphilin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013709 carrot oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150042997 21 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101100275990 Drosophila melanogaster Naus gene Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100029880 Glycodelin Human genes 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N Leu-Val-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- 102400000243 Leu-enkephalin Human genes 0.000 description 1
- 108010022337 Leucine Enkephalin Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical group CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108050002788 RNA polymerase sigma-H factor Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 108700007346 Zea mays oleosin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012711 adhesive precursor Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N leu-enkephalin Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1CC(N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229960005375 lutein Drugs 0.000 description 1
- 235000012680 lutein Nutrition 0.000 description 1
- KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N lutein Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=C[C@H](O)CC1(C)C KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N 0.000 description 1
- ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N 0.000 description 1
- 239000001656 lutein Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000004069 plant analysis Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010074709 ronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N trans-lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N xanthophyll Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C=C(C)C(O)CC2(C)C FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Botany (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Seasonings (AREA)
- Edible Oils And Fats (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kas veissa 5 Tämä keksintö koskee menetelmää halutun proteiinin valmistamiseksi rekombinanttimenetelmällä siten, että proteiini on helposti puhdistettavissa isäntäsolun osista. Esimerkkinä menetelmästä on halutun proteiinin ilmentäminen kasveissa, erityisesti siemenissä, kimeerisenä peptidinä, johon sisäl-10 tyvät öljyonteloproteiini ja haluttu proteiini.
Useita erilaisia proteiineja on ilmennetty kasveissa. Vaikka vieraiden proteiinien ilmentymisen tuottaminen kasveissa on osoitettu yleensä mahdolliseksi, puhdistettujen proteiinien 15 saamiselle tästä lähteestä on joitakin rajoituksia. Näitä rajoituksia ovat se, että tarvitaan puhdistusvaihe, jotta saataisiin puhdasta proteiinia, jossa ei käytännöllisesti katsoen ole kasviperäisiä aineita, sekä sen että valmistetuissa uutteissa voi tapahtua hajoamista puhdistusprosessin 20 aikana, kun saadut rekombinanttiproteiinit ovat tekemisissä vettä sisältävien puskurien kanssa.
• ·
Kasvit, joiden siemenet ovat öljypitoisia, kuten soijapapu, • · · · rypsi, auringonkukka ja useat muut kasvilajit, kuten ohra, • · · 25 porkkana jne. varastoivat siemenissään triglyseridejä. Kas- **” vissa nämä triglyseridit ovat energian lähteinä itävälle • · · siemenelle ja sen jälkeen taimelle. Triglyseridejä käytetään • · · '·* * laajalti kasvisöljyinä ruoissa ja ruoanvalmistuksessa sekä myös joissakin teollisissa sovelluksissa.
• · · v ·* 3 0 • · ·
Triglyseridit ovat veteen sekoittumattomia ja erottuvat kel- :·]·. luen vesiliuosten pinnalla tai muodostaen pieniä pallosia eli • · liposomeja suspensiona vesifaasissa. Tällaiset palloset liit- • · *“ tyvät luonnostaan yhteen, ellei modifioitu pintakerros ..!·* 35 stabiloi niitä. Tämän yhteenliittymisen seurauksena voi olla menissä, triglyseridin varastoituessa, öljypalloset ovat itse asiassa kapseloituneita lipidi- tai öljyonteloita, jotka ovat : suspensio, jossa pallosten koot ovat sattumanvaraisia. Sie- • · 2 yleensä yhtenäisen kokoisia. Näiden öljyonteloiden pintaan liittyneenä on puolikas yksikkömembraani täynnä useita erilaisia proteiineja, joita kutsutaan yhteisesti öljyonteloproteiineiksi.
5
Ainakin yhdellä öljyonteloproteiinien luokalla on joitakin ominaisuuksia, jotka ovat lajienvälisesti hyvin säilyneitä. Tämän öljyonteloproteiiniluokan proteiineja kutsutaan "ole-osiineiksi". Näiden proteiinien N- ja C-päät näyttävät olevan 10 hyvin erilaisia, kun taas lipofiilinen sisäalue (ydin, central core) näyttää olevan lajienvälisesti hyvin säilynyt. Oleosiinit ovat liittyneet voimakkaasti öljyonteloihin. Tämä voimakas öljyonteloihin liittyminen voi suurimmaksi osaksi johtua ytimen lipofiilisestä luonteesta. Siksi on hyödyllistä 15 selvittää, voidaanko öljyonteloproteiineja, esimerkiksi ole-osiineja, käyttää yhdistelmäproteiinien valmistuksessa välineenä erottaa yhdistelmäproteiinit kasviperäisistä aineista .
20 Asiaa käsittelevä kirjallisuus
Vieraiden (yhdistelmä-) peptidien tuottamista kasveissa on tutkittu käyttäen useita erilaisia menettelytapoja, kuten .·[·. transkriptionaaliset fuusiot käyttäen voimakasta konstitutii- • · · I 25 vista kasvipromoottoria (esim. kukkakaalin mosaiikkiviruk-• · · *** sesta - Sijmons et ai. 1990. Bio/Technology 8:217-221) ja • · · •••j vieraan proteiinin koodausta; transkriptionaaliset fuusiot • · · ’·* * kasvinosalle spesifisiin sekvensseihin (Radke et ai. 1988.
Theoret. Appi. Genet. 75:685-694); ja translationaaliset • · 9 : 3 0 fuusiot, jotka vaativat myöhempää rekombinanttiproteiinin katkaisua (Vander Kerkove et ai. 1989. Bio/Technology 7:929- • · · 932). Vieraisiin proteiineihin, joita on ilmennetty kas- • · visoluissa, kuuluu aktiivisia proteiineja bakteereista (Fra- • · ’·;·* ley et ai. 1983. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 80: 4803-4807), *:* 35 eläimistä (Misra ja Gedamu 1989. Theor. Appi. Genet. 78:161- • · · · ^ 168), sienistä ja eri kasvilajeista (Fraley et ai. 1983.
• ·
Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 80:4803-4807).
3
Joitakin proteiineja, yleensä integraatiomarkkereita, on ilmennetty solukkospesifisellä tavalla, muun muassa siemenissä (Sen Gupta-Gopalan et ai. 1985. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 82:3320-3324); Radke et ai. 1988. Theor. Appi. Genet. 75:685-5 694) . Nämä raportit ovat keskittyneet erityisesti siementen varastointiproteiinien promoottorien käyttöön välineenä erityisesti siemenissä tapahtuvan ilmentymisen aikaansaamiseen. Tällaista systeemiä käyttäen Vanderkerkove et ai. 1989. Bio/Technol. 7:929-932, ilmensivät arvokasta 10 peptidiä (leu-enkefaliinia) Arabidopsis thalianan ja Brassica napuksen siemenissä. Tämän peptidin saanto oli varsin pieni, mutta osoittaa, että on mahdollista ilmentää eläimen peptidi-hormonia kasvisolukoissa. Maissin oleosiinia on ilmennetty siemenen öljyonteloissa maissin oleosiinigeenillä transfor-15 moidussa Brassica napuksessa. Geeni ilmentyi Brassican napii-nia, tärkeää siemenen varastoproteiinia, koodaavan geenin säätelyelementtien valvonnassa. Ilmentymisen ajallisen säätelyn ja solukkospesifisyyden raportoitiin olleen napiinigeenin promoottorin ja terminaattorin mukaista (korrektia). Katso 20 Lee et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1991. 88:6181-6185.
·;··· Öljypalloset, joita muodostuu siemenissä, näyttävät olevan kaikki (lähes) samankokokoisia, mikä viittaa siihen, että ne ovat stabiloituja (Huang A. H. C. 1985. Modern Meths. Plant • · · *#! 25 Analysis. Voi. 1:145-151. Springer Verlag. Berlin). Lähempi *'** tarkastelu on osoittanut, että ne eivät ole yksinkertaisia • · · öljypallosia, vaan ennemminkin menbraanin ympäröimiä öljyon- • · · *·’ * teloita. Näitä öljyonteloita elektronimikroskopistit ovat nimittäneet eri tavoin, oleosomeiksi, lipidionteloiksi (lipid ··· y ! 30 bodies) ja sferosomeiksi (Gurr M. I. 1980. Biochemistry of
Plants. 4:205-248. Acad. Press. Orlando, Florida). Joidenkin »»« lajien öljyonteloita on tutkittu, ja yleinen johtopäätös on, • · *..! että niitä ympäröi harvinainen "puoliyksikkömembraani" , joka • · ’·;·* ei ole klassinen lipidikaksoiskerros, vaan pikemminkin ..)·* 35 yksinkertainen amfofiilinen kerros, jossa sisäpuolella on hydrofobisia ryhmiä ja ulkopuolella hydrofiilisia (Huang A.
• « H. C. 1985. Modern Meths. Plant Analysis. Voi. 1:145-151. Springer Verlag. Berliini.).
4
Lipidionteloiden sisällön analyysi on osoittanut, että paitsi triglyseridejä ja membraanimateriaalia, niissä on myös monia polypeptidejä/proteiineja liittyneinä öljyontelon pintaan tai 5 sisäosaan (Bowman-Vance ja Huang. 1987. J. Biol. Chem. 262:11275-11279, Murphy et ai. 1989. Biochem. J. 258:285 -293, Taylor et ai. 1990. Planta. 181:18-26). Öljyontelopro-teiineja on tunnistettu varsin monissa taksonomisesti erilaisissa kasvilajeissa (Moreau et ai. 1980. Plant Physiol. 10 65:1176-1180, Qu et ai. 1986. Biochem. J. 235:57-65), ja on osoitettu, että ne sijaitsevat ainoastaan öljyonteloissa, eikä niitä löydy vegetatiivisten solukoiden organelleista. Brassica napuksen (rapsi) kehittyvien siementen öljyonteloi-hin liittyneinä on ainakin kolme polypeptidiä (Taylor et ai. 15 1990. Planta. 181:18-26). Öljyonteloihin liittyneiden pro teiinien määrät ja koot voivat vaihdella lajista toiseen. Esimerkiksi ohrassa on kaksi immunologisesti toisistaan eroavaa polypeptidiluokkaa, jotka on löydetty öljyonteloista (Bowman-Vance ja Huang. 1988. J. Biol. Chem. 263:1476-1481). 20 Oleosiineissa on osoitettu olevan vaihtelevasti hydro-fiilisiä, hydrofobisia ja hydrofiilisiä alueita (Bowman-Vance ja Huang. 1987. J. Biol. Chem. 262:11275-11279). Ohran, ,5. rapsin ja porkkanan oleosiinien aminohapposekvenssit on saatu selville. Katso Qu ja Huang 1990. J. Biol. Chem. 265:2238- ' 25 2243, Hatzopoulos et ai. 1990. Plant Cell 2:457-467, vas- • · · ***j taavasti. Öljypitoisessa siemenessä, kuten rapsin siemenissä, i·· oleosiini voi muodostaa 8 % (Taylor et ai. 1990. Planta • · · *.’* 181:18-26) - 20 % (Murphy et ai. 1989. Biochem. J. 258:285- 293) siemenen proteiinin kokonaismäärästä. Sellainen pi- • · · : 3 0 tosuustaso on verrattavissa monien siemenen varastoproteii- nien havaittuun tasoon.
• · · • · · • · · • · *.,* Öl jyonteloproteiineja koodaavia geenejä on raportoitu kah- • · **··* des ta lajista, maissista (Zea mays, Bowman-Vance ja Huang.
·!· 35 1987. J. Biol. Chem. 262:11275-11279 ja Qu ja Huang 1990: J.
• · · · :*·.· Biol. Chem. 265:2238-2243) ja porkkanasta (Hatzopoulos et ai.
1990. Plant Cell 2:457-467).
5
Yhteenveto keksinnöstä
Tarjotaan menetelmiä ja koostumuksia sellaisten peptidien tuottamiseen, joita voidaan helposti puhdistaa isännän prote-5 iineista. Menetelmään sisältyy vaiheet, joissa valmistetaan kimeerinen DNA-rakenne, joka sisältää öljyontelospesifistä sekvenssiä koodaavaan sekvenssin, johon sisältyy siemens-pesifisen öljyonteloproteiinin geeni tai sekvenssi, joka koodaa ainakin osaa öljyonteloproteiinin hydrofobisesta yti-10 mestä ja haluttua proteiinia koodaava sekvenssi, josta voidaan valmistaa ilmentymiskasetti, joka sisältää kimeerisen DNA-rakenteen, isäntäsolun transformoiminen ilmentymis-kasetilla olosuhteissa, jotka mahdollistavat integroitumisen genomiin ja saadun siirtogeenisen kasvin kasvattaminen tuot-15 tamaan siemeniä, joissa kiinnostuksen kohteena oleva polypep-tidi ilmentyy fuusioproteiinina oleosiinin kanssa.
Haluttu polypeptidi voidaan puhdistaa eristämällä siemenen soluista öljyontelot ja rikkomalla ne siten, että fuusiop-20 roteiini vapautuu. Öljyonteloproteiini erottuu sitten helposti muista proteiineista ja kasviperäisistä aineista faasi-·;··· erotuksella. Haluttaessa voidaan sijoittaa katkaisukohta ainakin joko ennen halutun proteiinin N-päätä tai sen C-pään • · · · jälkeen, jotta fuusioproteiini voidaan katkaista ja erotella • · · ' l' 25 osapeptideikseen faasierotuksen avulla. Tuotantosysteemi siis *’** mahdollistaa kimeerisen peptidin kohdistamisen sen öljyonte- • · · •|*| loproteiiniosan toiminnan avulla öljyonteloihin, mikä vuoros- • · · *·’ taan mahdollistaa halutun proteiinin puhdistamisen nopeasti.
Tästä tuotantosysteemistä on hyötyä useiden peptidien tuotan- • · · · 30 nossa, esimerkiksi sellaisten, joilla on farmaseuttisia, entsymaattisia, Teologisia tai adhesiivisia ominaisuuksia.
•« · • · · • · *..! Tämä keksintö tarjoaa kimeerisen DNA-konstruktion, johon "/ sisältyy: a) ensimmäinen DNA-sekvenssi, joka koodaa 35 oleosiinia tai sen osaa, joka on riittävä suuntaamaan kon- :*·.· struktion öljyonteloon ja • · (b) toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa peptidiä sillä varauk sella, että mainittu peptidi on muu kuin osa luonnossa esiin tyvästä Arabidopsiksen tai Brassican oleosiiniproteiinista.
6 5 Keksintö kohdistuu erityisesti patenttivaatimusten 1-4 mukaiseen kimeeriseen DNA-konstruktiin.
Tämä keksintö tarjoaa edelleen ilmentymiskasetin, joka käsittää: 10 komponentteina, transkription etenemissuunnassa: - säätelevän DNA-sekvenssin, joka käsittää siemenessä ilmentyvän geenin 5'-päästä osan, joka riittää aiheuttamaan DNA-sekvenssin ilmentymisen siemenissä; 15 - kimeerisen DNA-sekvenssin, joka käsittää (a) ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa oleosiinia tai sen osaa, joka riittää antamaan proteiinille ohjautuvuuden öljyonteloon, ja mainittu ensimmäinen DNA-sekvenssi sisältää ainakin yhden restriktiokohdan, ja (b) toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa 20 peptidiä, sillä varauksella, että mainittu peptidi on muu kuin osa luonnossa esiintyvästä Arabidopsiksen tai Brassican oleosiiniproteiinista, sekä • · - translaation ja transkription lopetusalueen, missä mainitut komponentit liittyvät yhteen toimivasti ja mainitun kimeeri- • · · ’ 1 25 sen DNA-sekvenssin ilmentymistä säätelee mainittu säätelevä • · · ···· DNA-sekvenssi.
• · · • · · · • · · V * Tämä keksintö tarjoaa käyttöön myös ilmentymiskasetin, joka käsittää: :: : 30 - öljyonteloproteiinin (OBP) geenin, joka sisältää 5 1-pään ja translaation aloituskohdan välisestä säätelyalueesta riittä- • ♦ ♦ vän osan, jotta mainittu geeni ilmentyy siemensolussa, ja • · · ·..* joka sisältää ainakin yhden restriktiokohdan välillä heti • · *·;♦* ensimmäisen metioniinin kodonin 5'-puolelta mainitun OBP- ·;· 35 geenin translaation lopetuskohdan 5'-puolelle, ja ♦ ··· samassa lukukehyksessä mainitun OBP-geenin kanssa, missä mainittu DNA-sekvenssi koodaa peptidiä, joka on muu kuin osa :*·.· - mainittuun restriktiokohtaan insertoidun DNA-sekvenssin • · 7
Arabidopsiksen tai Brassican luonnossa esiintyvää oleosiinip-roteiinia.
Tämä keksintö tarjoaa edelleen käyttöön ilmentymiskasetin, 5 joka käsittää: ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa peptidiä, sillä varauksella, että mainittu peptidi on muu kuin osa luonnossa esiintyvästä Arabidopsiksen tai Brassican oleosiiniproteii-nista, insertoituna lukukehykseen öljyonteloproteiinin (OBP) 10 -geeniin, joka sisältää 5'-pään ja translaation aloituskohdan välisestä alueesta riittävän osan, jotta mainittu geeni ilmentyy siemenessä. Mainittu sekvenssi on insertoitu mainittuun geeniin siten, että se ilmentyy mainitun säätelyalueen ohjauksessa.
15 Tämä keksintö kohdistuu erityisesti patenttivaatimusten 5-12 mukaiseen ilmentymiskasettiin.
Tämä keksintö tarjoaa edelleen käyttöön menetelmän kiinnos-20 tuksen kohteena olevan peptidin ilmentämiseen siemenissä, jolloin mainittu menetelmä käsittää: • · · · · • · isäntäkasvin solun transformoimisen ilmentymiskasetilla geno-misen integraation sallivissa olosuhteissa, missä mainittu • · · * * 25 ilmentymiskasetti käsittää osinaan, transkription etenemis- • · · ***! suunnassa, ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka käsittää riittä- • · · • vän osan siemenessä ilmentyvän geenin translaation aloitus- • · · ·.* * kohdan 5'-puolelta, jotta DNA-sekvenssi ilmentyy siemenessä; toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa jotakin oleosiinia tai sen ··· : 30 osaa, joka riittää suuntaamaan proteiinin öljyonteloon. Mai- nittuun toiseen DNA-sekvenssiin sisältyy ainakin yksi luon- • · · nollinen tai synteettinen restriktiokohta, johon on insertoi- • · · *..· tu lukukehyksessä kolmas DNA-sekvenssi, joka koodaa haluttua • · *·;·’ peptidiä sillä varauksella, että mainittu peptidi on muu kuin ·;· 35 osa luonnossa esiintyvästä Arabidopsiksen tai Brassican ole- • · · · :*·,· osiiniproteiinista, sekä translaation ja transkription lope- • · tuskohdan. Mainitut osat on liitetty yhteen toimivasti ja mainittu ensimmäinen DNA-sekvenssi säätelee mainitun toisen DNA-sekvenssin ilmentymistä, jotta ilmentyminen tapahtuu siemenissä.
8 Tämä keksintö tarjoaa myös menetelmän kiinnostuksen kohteena 5 olevan peptidin saamiseksi puhdistettuna. Mainittu menetelmä käsittää: isäntäkasvin solun transformoimisen DNA-konstruktiolla geno-misen integraation mahdollistavissa olosuhteissa siten, että 10 mainittu DNA-konstruktio käsittää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa haluttua peptidiä sillä varauksella, että mainittu peptidi on muu kuin osa luonnossa esiintyvästä Arapidop-siksen tai Brassican oleosiiniproteiinistä insertoituna luku-kehyksessä öljyonteloproteiinigeeniin, johon sisältyy riittä-15 vä osa säätelyalueesta mainitun öljyonteloproteiinigeenin translaation aloituskohdan 5'-puolella, jotta mainittu geeni ilmentyy siemenissä. Tässä mainittu sekvenssi insertoidaan mainittuun geeniin sellaiseen kohtaan, että mainittu säätelevä alue ohjaa mainitun DNA-sekvenssin ilmentymistä, jolloin 20 mainittu DNA-konstruktio integroituu mainitun kasvisolun genomiin; • · mainitun kasvin kasvattamisen siementen tuottamiseksi, joi-loin mainittu haluttu peptidi ilmentyy fuusioproteiinina • · · *l 25 mainitun öljyonteloproteiinigeenin ilmentymistuotteen kanssa; • · · ···· ·«« ···'· öljyonteloiden eristämisen mainitun siemenen soluista; ··· • · « ♦ ♦ · mainittujen öljyonteloiden rikkomiden, jolloin mainittu fuu- ··· : 30 sioproteiini vapautuu, sekä mainitun halutun proteiinin puh- distamisen.
• ·· • · * • · · ·..* Keksintö kohdistuu erityisesti patenttivaatimusten 13-20 • · *···’ mukaiseen menetelmään.
·:· 35
• •M
muksessa 22 kuvatun mukainen, suuntautumiskyvystä öljyonte-loon tunnettu fuusiopolypeptidi.
:*·.· Tämän keksinnön yhteydessä tarjotaan käyttöön patenttivaati- • · 9 Tässä on kuvattu fuusiopolypeptidi, joka käsittää: a) ensimmäisen peptidin, muotoa 5
aa25-aa26-V-V-T-L-aa3i-P-A A A T
aa34 - G - G - aa36 - L - L - aa39 - L - aa4* -
M
G - Γ-aa44 - L-aa46 - aa47-T - L-I-SL S V V
aasi - L - aa&3 - V - A - T - P - L - aa" - L -
V V
L-F-S-P- V-L-V-P-A-A-L-aa73-I I LI
aa?4 - aa75 - aa7* - aa77 - aa7® - G - F - L -
G L
S - S - aa®7 - G - V - aa®9 - aa" - L - S -T I IT
aa" - aa94 - S - aa9* - aa97 - aa9® - aa99 - aa100 - aaid
T
.,*·* sillä varauksella, että mainittu ensimmäinen peptidi on muu kuin porkkanan 16 kD:n oleosiinissa tai maissin 18 kD:n tai • · ··· 16 kD:n oleosiinissa luonnostaan esiintyvä, ja että siinä ···· 25 10 aa voi olla mikä tahansa aminohappo, .···, aa on neutraali alifaattinen aminohappo, • · · aa31 on neutraali 3-6 hiiliatomin substituoimaton alifaattinen ... aminohappo, • · · aa33 on neutraali 3-6 hiiliatomin substituoimaton alifaattinen • * *.·* 15 aminohappo, aa36 on neutraali 3-5 hiiliatomin substituoimaton alifaattinen • · .*··. aminohappo, ·. aa on neutraali, substituoimaton aminohappo, ··· 39 ···· aa on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo, ·: 20 aa41 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti- tuoitu aminohappo, 10 aa44 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti-tuoitu aminohappo, aa46 on neutraali, alifaattinen ja substituoimaton aminohappo tai oksisubstituoitu aminohappo, 5 aa47 on neutraali, alifaattinen, substituoimaton aminohappo, aa59 on neutraali alifaattinen tai aromaattinen substituoimaton aminohappo, aa76 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai tiosubsti-tuoitu aminohappo, 10 aa78 on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo, aa83 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubstituoitu aminohappo, aa on neutraali alifaattinen aminohappo, jossa on oksi-substituutio, 15 aa96 on neutraali, alifaattinen, tiosubstituoitu aminohappo tai neutraali aromaattinen heterosyklinen aminohappo, aa97 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai tiosubsti-tutioitu aminohappo, aa on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo tai 20 aromaattinen oksisubstituoitu aminohappo, aa99 voi olla mikä tahansa aminohappo, ·;··· aa100 on oksisubstituoitu aminohappo, joko alifaattinen tai aromaattinen, ···· 101 · aa on neutraali, substituoimaton alifaattinen tai aromaat- • · · 25 tinen aminohappo, liittyneenä: • · · • · · · M» b) toiseen peptidiin, sillä varauksella, että mainittu toinen • · · '·* * peptidi on muu kuin osa luonnossa esiintyvästä Arabidopsiksen tai Brassican oleosiiniproteiinista.
:T: 3 0 Tässä kuvataan myös fuusiopolypeptidi, tunnettu siitä, että se kykenee ohjautumaan öljyonteloon ja käsittää: • » • · • · · • · *“* a) ensimmäisen peptidin, joka on valittu seuraavasta ryhmäs- ·:· 35 tä: • · · · :*·.· (1) peptidi, johon kuuluu ainakin kahdeksan peräkkäistä • · aminohappoa, jotka sisältyvät seuraavaan aminohapposekvenssiin : 11 M-M-G-R-D-R-D-Q-Y-Q-M-S-G-R-G-S-D-Y-S-K- S-R-Q-I-A-K-A-A-T-A-V-T-A-G-G-S-L-L-V-L- S-S-L-T-L-V-G-T-V-I-A-L-T-V-A-T-P-L-L-V-5 I-F-S-P-I-L-V-P-A-L-I-T-V-A-L-L-I-T-G-F-L-S-S-G-G-F-G-I-A-A-I-T-V-F-S-W-I-Y-K*Y-A-T-G-E-H-P-Q-G-S-D-K-L-D-S-A-R-M-K-L-G- S-K-A-Q-D-L-K-D-R-A-Q-Y-Y-G-Q-Q-H-T-G-G-E-H-D-R-D-R-T-R-G-G-Q-H-T-T; 10 (2) joko peptidin, jota koodaa DNA-sekvenssi, joka on tunnistettu mainitun, luetteloon (1) sisältyvän aminohapposekvenssin perusteella laaditun oligonukleotidikoettimen avulla, tai pätkän siitä, sillä varauksella, että mainittu ensimmäi-15 nen peptidi on muu kuin täyspitkä luonnossa esiintyvä porkkanan 16 kD:n oleosiini tai maissina 18 kD:n tai 16 kD:n ole-osiini, liittyneenä b) toiseen peptidiin, sillä varauksella, että mainittu toinen 20 peptidi on muu kuin Arabidopsiksen tai Brassican luonnossa esiintyvän oleosiiniproteiinin a-osa.
• · • · ·
Lyhyt kuvaus piirroksista • · · •: 25 • · · •••j Kuvio IA esittää Arabidopsis thalianan öljyonteloproteiinin • · · •••ϊ (oleosiinin) geenin nukleotidisekvenssin ja siitä johdetun • · · ·.· * aminohapposekvenssin (17 kD:n proteiini) . Alleviivattuina ovat suorat toistot (Rl ja R2) ja käänteinen toisto (T) , :T: 30 CACA, TATA, TAAT ja polyadenylaatiosignaalit. Intronijakso on painettu pienin kirjaimin ja oletettu ABA:ta sitova kohta on osoitettu lihavoituna.
• · · • · • · • · · • · *···’ Kuvio IB esittää porkkanan 16 kD:n öl jyonteloproteiinin, ··· 35 maissin 16 kD:n ja 18 kD:n ja Arabidopsis thalianan 17 kD:n • · · · .’.j öl jyonteloproteiinin sekvenssien vertailun, joka osoittaa • · proteiinien säilyneet ja eriytyneet kohdat. Aminohapposek- 12 venssit on kirjoitettu alekkain proteiinien keskialueen sekvenssin säilyneisyyden osoittamiseksi.
Kuvio 2 esittää rakenteita, joita käytetään öljyonteloprote-5 iinigeenien yhdistämiseen vieraita peptidejä koodaaviin geeneihin. IA on halutun peptidin fuusio öljyonteloproteiinin C-päähän, IB on halutun peptidin N-terminaalinen fuusio OBP:hen, II on halutun peptidin internaalinen fuusio OBP:n sisään ja III on dimeerien välinen translationaalinen halutun 10 peptidin fuusio kahden olennaisilta osin täydellisen öljyon-teloproteiinin suuntaussekvenssin väliin. Kuvion yläosassa (A) esitetään DNA-rakenteet, joita käytetään haluttujen peptidien translationaaliseen yhdistämiseen öljyontelopro-teiineihin. Kuvion alaosassa (B) esitetään yläosassa esitet-15 tyjen geenien tuotteiden rakenteet translaation ja öljyonte-loihin siirtymisen jälkeen (gene products, shown on the upper portion of the translation and the delivery to the oil bodies). Kuvaa tulkitaan seuraavasti: suorakulmio, joka on viivoitettu alhaalta vasemmalta ylös oikealle, esittää öljy-20 onteloproteiinin promoottoria tai muuta siemenspesifistä promoottoria, alhaalta oikealta ylös vasemmalle viivoitettu ·;··· suorakulmio esittää haluttua peptidiä koodaavaa sekvenssiä, tyhjä suorakulmio esittää öl jyonteloproteiinin koodaavaa • · · · sekvenssiä tai öl jyonteloproteiinin säilyneisiin jaksoihin • · · 25 perustuvaa synteettistä suuntaus sekvenssiä, ruudutettu suora- • · · *'*' kulmio esittää geeniterminaattoria, johon sisältyy polyadeny- • · · •••j laatiosignaali, viivoitettu ympyrä esittää proteaasin tunnis- • · · tuskohtaa, kierteisviiva esittää öljyonteloproteiinin alkuperäistä C- tai N-päätä.
• · · V : 3 0
Kuvio 3. esittää C-pään fuusion rakenteen erään yksityiskoh-täisen järjestelyn. Kuviossa näkyy kollagenaasin tunnistus- • · *..* kohdan koodaava sekvenssi linkkerinä fuusioituna tyypilliseen • · *·;·* öljyonteloproteiinigeeniin ja fuusiopeptidi, joka yhdistetään '/l· 35 tässä Ncol:tä käyttäen kloonattavaksi ja ilmennettäväksi kasveissa.
• · 13
Kuvio 4. esittää kaavamaisesti fuusiopeptidivektorien rakentamisen, niiden siirtämisen kasveihin ja sitten halutun peptidin uuttamisen ja tutkimisen.
5 Kuvio 5. esittää kaavamaisesti pCGOBPiLT:in rakentamisen. Katkoviivoitettu suorakulmio esittää oleosiinin promoottoria, ylhäältä vasemmalta alas oikealle vinoviivoitettu suorakulmio esittää oleosiinia koodaavaa sekvenssiä, ruudutettu suorakulmio esittää intronia, pilkutettu suorakulmio esittää 31-pään 10 translatoitumatonta sekvenssiä ja ylhäältä vasemmalta alas oikealle paksuilla vinoviivoilla viivoitettu suorakulmio esittää interleukiini-l-p-sekvenssiä, jossa on proteaasin katkaisukohtaa koodaava sekvenssi (tekijä Xa tai trombiini heti ylävirtaan).
15
Kuvio 6 esittää oligonukleotidi GVRll:n rakenteen. Kuviossa 3A esittää A. thalianan oleosiinin koodaavaa 3'-sekvenssiä liitettynä translationaalisesti tekijä Xa/IL-l-£:aa koodaa-vaan sekvenssiin, jota seuraa TAA-lopetuskodoni. Myöhemmän 20 kloonauksen tarkoituksiin mukaan liitetään PvuI- ja Sall-restriktioentsyymien tunnistuskohdat. Pvul-restriktiokohdan ·;··· luomisesta seurasi ylimääräinen alaniinia (ala) koodaava sek- venssi. Restriktioentsyymin tunnistuskohdat ovat alleviivat- • · · · tuina. A. thalianan oleosiinisekvenssit ja tekijä Xa:n tun- • · · ‘I 25 nistussekvenssi on merkitty yläpuolelle. Varsinainen katkai-• · · **’1 sukohta on osoitettu asteriskilla (1). Kuviossa 3B esitetään • 1 1 ···· GVRll:n sekvenssi. Jotta A. thalianan oleosiiniin fuusioitu- • · · • · · *·’ ’ minen onnistuisi, alukkeen GVRll on oltava komplementaarinen ylimmän juosteen kanssa.
Ml v : 3 0
Kuvio 7 esittää OBPILT: in nukleotidisekvenssin. Alleviivattu • · · on IL-1-P:aa koodaava sekvenssi. Tekijä Xa:n tunnistuskohtaa # · *..! koodaava sekvenssi on merkitty lihavoimalla. Nopaliinisyntaa- • · *” sin terminaattorisekvenssi on merkitty pienillä kirjaimilla.
·:· 35 • ··· · • · · • · · • · 14
Keksinnön spesifisten toteutusten kuvaus Tämän keksinnön yhteydessä tarjotaan käyttöön menetelmät ja koostumukset helposti puhdistettavissa olevien peptidien 5 tuottamiseen. Kyseinen menetelmä käsittää vaiheet, joissa valmistetaan ilmentymiskasetti, joka sisältää DNA-sekvenssit, jotka koodaavaat ölyonteloproteiinin, esim. oleosiinin, osaa, joka riittää suuntaamaan proteiinin öljyonteloon, ja haluttua peptidiä; ilmentymiskasetin transformoimisen kasvisoluisän-10 tään; siirtogeenisen kasvin tuottamisen ja sen kasvattamisen tuottamaan siemeniä, joissa kimeeristä proteiinia on ilmentyneenä ja siirtyneenä öljyonteloihin. Kimeerinen peptidi käsittää halutun peptidin ja öljyonteloproteiinin, esimerkiksi oleosiinin. Haluttu peptidi on yleensä vieras peptidi, 15 joka ei yleensä ilmenny siemenissä eikä esiinny öljyontelois-sa. Öljyonteloproteiinin käyttö kantajana tai suuntauskeinona tarjoaa yksinkertaisen mekanismin saada vieras proteiini puhdistumaan. Kimeerinen proteiini erotetaan suurimmasta osasta solun proteiinia yhdellä vaiheella (kuten sentrifugoi-20 maila tai kelluttamalla); proteiini on myös suojattu hajoamiselta uuttamisen aikana, koska erottaminen irrottaa myös ♦:♦·· epäspesifiset proteaasit öl jyonteloproteiineista. Vierasta peptidiä koodaava geeni voi olla johdettu mistä tahansa läh- • · · · teestä, mukaan luettuna kasvi-, bakteeri-, sieni- ja eläin- • · · *#|# 25 lähteet. Kimeerinen peptidi saa mielellään sisältää sekvens- **** sejä, jotka mahdollistavat kiinnostuksen kohteena olevan *·*! peptidin irroittamisen oleosiinista. Menetelmää voidaan käyt- • · · *·* * tää ilmentämään useita erilaisia peptidejä, jotka voidaan sitten helposti puhdistaa.
30
Vieraan yhdistelmäproteiinin suuntaaminen öljyonteloon tuo useita etuja, mukaan luettuna seuraava: Proteiini voidaan • ♦ *..! erottaa suurimmasta osasta solun sisältöä sentrifugoimalla • · **** solun hajoamisen jälkeen. Öljyontelojaos kelluu sitten uut- 35 teen pinnalla. Proteiiniin voidaan haluttaessa liittää pepti-dilinkkeri, joka sisältää proteaasin tunni s tus kohdan. Tämä mahdollistaa peptidin irroittamisen öljyontelosta. Proteiini voidaan liittää yhdistelmäpolypeptidiin siten, että se on • · 15 lipofiilisen säilyneen alueen sisällä. Tästä seuraa, että yhdistelmäpeptidi joutuu öljyontelon sisään, mikä suojaa sitä proteaasihyökkäyksiltä.
5 Ilmentymiskasetti sisältää yleensä transkription etenemis-suunnassa 5'-3' transkriptionaalisen ja translationaalisen säätelyalueen, joka pystyy ilmentämään proteiinia kehittyvissä siemenissä. Tähän sisältyy tyypillisesti öljyonteloprote-iiniin liittyvät promoottori ja ylävirtaan sijaitsevat alu-10 eet, minkä ansiosta kimeerinen proteiini ilmentyy siemenissä, DNA-sekvenssi, joka koodaa kimeeristä peptidiä, johon sisältyy öljyonteloon suuntaamiskeinona toimiva aminohapposekvenssi ja haluttu proteiini sekä kasveissa toimivat transkription ja translaation lopetuskohdat. Mukana voi myös olla yksi tai 15 useampia introneja.
Öljyontelospesifinen sekvenssi on analoginen öljyonteloprote-iinien, erityisesti oleosiinien, osien kanssa. Öljyontelospesif inen sekvenssi voi olla sama kuin jonkin öljyontelopro-20 teiinista saatava sekvenssi, tai riittävän homologinen aiheuttaakseen halutun proteiinin toivotun suuntautumisen öljyonteloon. "Saatavalla" tarkoitetaan aminohapposekvenssiä, joka voi olla luonnollinen, synteettinen tai yhdistelmä, ”[·. riittävästi natiivin öljyonteloproteiinin aminohapposekvens- • · · I 25 sin kaltainen aiheuttaakseen toivotun suuntautumisen. Erityi-• · · ***· sen kiinnostava on öljyonteloproteiinien sisäosan hydrofobi- • · · ···· nen domeeni, joka näyttää olevan hyvin säilynyt eri kasvila- • · · *·* * jien välillä, sekä sen fragmentit ja aminohappotasolla homologiset sekvenssit.
·♦· : : : 30 • · · • · • · • · · «· · • · · • · * » ··· • · • · ··« ··♦· • · • · · • ·♦ • · 16
Arabidopsis thalianan öljyonteloproteiinin johdettu aminohapposekvenssi on seuraavanlainen: 10 20 M-M-G-R-D-R-D-Q-Y-Q-M-S-G-R-G-5-D-Y-S-K- 30 40 s-r-q-i-a-k-a-a-t-a-v-t-a-g-g-s-l-l-v-l- 50 50 s-s-l-t-l-v-g-t-v-i-a-l-t-v-a-t-p-l-l-v- 70 80 I-r-5-P-I-L-V-P-A-L-I-T-V-A-L-L-I-T-G-r- 90 100 L-S-S-G-G-F-G-I -A-A-1-T-V-F-s-w-: - Y-:< 1 Y- 110 120 a _G-Ξ-Η-Ρ-Q-G-S-D-K-L-D-S-A-R-M-K-L-G- 130 140 S-K-A-Q-D-L-K-D-R-A-Q-Y-Y-G-Q-Q-H-T-G-G- 150
..... Ξ-Κ-D-R-D-R-T-R-G-G-Q-H-T-T
• ♦ • 5 »·· GG. Aminohapot noin 25:stä 101:een muodostavat keskisen hydro- • · « * 1 fobisen domeenin.
·»· ···« ·«1 ···· Erityisen kiinnostavia suuntauskeinoiksi joihinkin sovelluk- • · · *.· · 10 siin ovat seuraavan kaavion mukaiset öljyontelospesifiset sekvenssit tai niiden osat, jotka suuntaavat proteiinin öljy- • · · : : : onteloon: • · · • · • · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · • · · · · ···· • · • · · • ·· • · 17 aa74 - aa75 - aa76 - aa77 - aa78 - G- r- L- s - S- aa87 - G- v - aa89 - aa90 - L - S -
T I IT
aa93 aa94 . s . aa96 . aa97 . aa98 . aa99 _
T
„100 101 2 aa *· aa — pp oc“- aa25- aa^6- V _ v- T - L- aa^1- ?-
A A A T
aa34. g- G- aa36 - L- L- aa39- L- aa41-
M
44 45 47^ 'w'-.-aa - a a - aa - τ - _ j. _ S L s v v "1 c3 - so aav - L- aa - V- A- T— P- -· - aa“ - L -
V V
L - F- S- P- v - L- V- ?- A- A _ L _ aa'3 -
*·* X i LI
···· missä: • · · .:. 5 pp1 ja pp2 ovat samat tai erilaiset, ja voivat olla samat tai **|Ιφ erilaiset kuin luonnon öljyonteloproteiinissa, yleensä eri- ♦ *1" laiset. Ne voivat olla vetyjä osoittamassa tarkoitetun poly- • · · * * peptidin loppukohtaa, tai ne voivat olla polypeptidejä, jois sa on korkeintaan 1000 aminohappoa, useammin korkeintaan noin • · ♦ *.* · 10 500 aminohappoa, tai kaikkiaan ainoastaan 1 aminohappo, tai ··· voivat yhdessä tai erikseen olla noin 1-100 aminohapon ·*.*. polypeptidejä, yleisemmin 1-75 :n aminohapon, erityisesti 5-50 • · .*··. aminohapon. Nämä polypeptidit ovat käyttökelpoisia • · erityisissä sovelluksissa, kun muotoillaan erityisesti kuvat- • # · •••Σ 15 tua sekvenssiä ennalta määrättyyn tarkoitukseen: • · • · · • ·· • · 18 aa25 voi olla mikä hyvänsä aminohappo, erityisesti neutraali alifaattinen aminohappo, yleensä 3-6 hiiliatomia sisältävä, varsinkin leusiini tai alaniini, 5 aa26 on neutraali alifaattinen aminohappo, erityisesti ala-niini tai hydroksisubstituoitu 3-4 hiiliatomin aminohappo, varsinkin treoniini tai emäksinen 5-6 hiiliatomin aminohappo, varsinkin lysiini, 10 aa31 on neutraali, substituoimaton, alifaattinen 3-6 hiiliatomin aminohappo, erityisesti alaniini, väliini tai leu siini, tai aromaattinen substituoimaton aminohappo, erityisesti fenyylialaniini, 15 aa33 on neutraali, substituoimaton alifaattinen 3-6 hiiliatomin aminohappo, erityisesti alaniini, väliini tai leu siini, tai oksisubstituoitu alifaattinen aminohappo, erityisesti treoniini, 20 aa36 on neutraali 3-5 hiiliatomin substituoimaton alifaattinen aminohappo, erityisesti leusiini, tai neutraali, alifaattinen, oksisubstituoitu aminohappo, jossa on 3-4 hiiliatomia, erityisesti treoniini tai seriini, ···· • · • · » *·# 1 37 I 25 aa on neutraali, substituoimaton aminohappo, erityisesti ··· ·2·1 leusiini, tai tiosubstituoitu aminohappo, erityisesti metio- ··· niini, • · · • · · • · · aa39 on neutraali, alifaattinen, substituoimaton aminohappo, ··· •m· ί 30 erityisesti väliini, tai aromaattinen substituoimaton amino- :3: happo, erityisesti f enyylialaniini, ··· ·· · • · ♦ • ♦ 1 *..1 aa on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti- • 1 *·;·1 tuoitu aminohappo, erityisesti alaniini, leusiini tai serii- *i1 35 ni, ···· · 2 • · · • ·♦ 3 • · 19 aa44 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti-tuoitu aminohappo, erityisesti alaniini, isoleusiini tai treoniini, 5 aa46 on neutraali, alifaattinen ja substituoimaton aminohappo tai oksisubstituoitu aminohappo, erityisesti alaniini, väliini tai treoniini, aa47 on neutraali, alifaattinen, substituoimaton aminohappo, 10 erityisesti glysiini tai alaniini, aa59 on neutraali alifaattinen tai aromaattinen substituoimaton aminohappo, erityisesti leusiini tai fenyylialaniini, 15 aa76 on neutraali alifaattinen substituoimaton tai tiosubsti-tuoitu aminohappo, erityisesti alaniini, leusiini tai metio-niini, aa78 on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo, 20 erityisesti alaniini, tai neutraali alifaattinen aminohappo, jossa on tio- tai oksisubstituutio, erityisesti metioniini ·:*·) tai treoniini, • * · ···· 83 , aa on neutraali alifaattinen substituoimaton tai oksisubsti- • · · *#j# 25 tuoitu aminohappo, erityisesti glysiini, seriini tai **** treoniini, • · · • · · · • · · *·* * aa on neutraali alifaattinen aminohappo, jossa on ok sisubstituutio, erityisesti seriini tai treoniini, ··· : 30 : aa on neutraali, alifaattinen, tiosubstituoitu aminohappo tai neutraali aromaattinen heterosyklinen aminohappo, eri- • ♦ *..! tyisesti tryptofaani, • · • ♦ • · · #>’j* 35 aa on neutraali alifaattinen substituoimaton tai tiosubsti- tutioitu aminohappo, erityisesti väliini, leusiini, isoleu- siini tai metioniini, • · 20 aa98 on neutraali alifaattinen substituoimaton aminohappo tai aromaattinen oksisubstituoitu aminohappo, erityisesti alanii-ni, leusiini tai tyrosiini, 5 aa99 voi olla mikä tahansa aminohappo, aa100 on oksisubstituoitu aminohappo, joko alifaattinen tai aromaattinen, erityisesti tyrosiini tai treoniini, 10 aa101 on neutraali, substituoimaton alifaattinen tai aromaat tinen aminohappo, erityisesti alaniini, leusiini tai fenyyli-alaniini.
Erityisen kiinnostavia lähteitä, joista voidaan saada koo-15 daavia DNA:sekvenssejä, jotka pystyvät suuntaamaan öljyon-teloproteiinin, ovat Arabidopsiksesta tai Brassica napuksesta saatavat öljyonteloproteiinigeenit, jotka mahdollistavat halutun proteiinin ilmentymisen siemenissä (katso Taylor et ai. 1990: Planta 181:18-26). Tarpeelliset alueet ja 20 aminohapposekvenssit, jotka antavat kyvyn suuntautua öljyon-teloon, ovat ilmeisesti öljyonteloproteiinien erittäin hydro-fobinen keskusalue.
• · • * *
Kun eristetään tai on aikaisemmin eristetty öl jyontelopro- • · · '1 25 teiini, niin jotta pystyttäisiin tunnistamaan muita öljyon- **" teloproteiinigeenejä, joilla on toivottuja ominaisuuksia, • · · ···· eristetty proteiini voidaan sekvensoida osittain, jotta voi- • · · V ' daan laatia koetin mENA:n tunnistamiseen. Sellainen koetin on erityisen arvokas, jos se on laadittu kohdistumaan keskuksen • · · ϊ.ί · 30 hydrofobista domeenia koodaavaan alueeseen, joka on eri kas- vilajien välisesti hyvin säilynyt. Siten tämän alueen DNA-tai RNA-koetin voi olla erityisen käyttökelpoinen öljyonte- • · *..* loproteiineja koodaavien sekvenssien etsimiseen muista kasvi- • · lajeista. mRNA:n konsentraation suurentamiseksi voidaan myös 35 valmistaa cDNA: ta ja poistaa siitä cDNA: ta öljyonteloja tuot- :*·.· tamattomien solujen mRNA: 11a tai cDNA: 11a. Jäännös-cDNA voi- • · daan sitten käyttää komplementaaristen sekvenssien etsimiseen genomista käyttäen sopivaa kasvisoluista valmistettua 21 geenikirjastoa. Sekvenssit, jotka hybridisoituvat cDNA:han tarkasti valvotuissa olosuhteissa, voidaan sitten eristää.
Joissakin tapauksissa, käytettäessä öljyonteloproteiinigeenin 5 (säilyneen alueen) koetinta yllä kuvatulla tavalla, koetinta voidaan käyttää suoraan genomisen cDNA-kirjaston seulomiseen ja koettimeen hybridisoituvien sekvenssien tunnistamiseen. Eristäminen voidaan suorittaa myös seulomalla siemenspesifi-nen cDNA:n ilmentymiskirjasto tavanomaisella immunologisella 10 menetelmällä. Öljyonteloproteiinien vasta-aineita saadaan helposti Taylorin et ai. (Planta. 1990. 181:18-26) kuvaaman puhdistusprosessin ja vasta-aineiden valmistusmenettelyn avulla. cDNA:n ilmentymiskirjaston seulonta vasta-aineiden avulla suoritetaan pääosin käyttäen Huynhin et ai. tekniikoi-15 ta (1985. DNA Cloning, Voi 1, a Practical Approach, toim. D.
M. Glover. IRL Press. s. 49-78). Sekvenssien tunnistamista helpottaa hydrofobisen keskusosan hyvä (lajienvälinen) säi-lyneisyys (ks. Kuvio 1). Kaikki oletetut kloonit voidaan DNA-sekvensoida Sangerin et ai. (Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1977. 20 74:5463-5467) tai Maxamin ja Gilbertin (1980. Meth. Enzymol.
1980. 65:497-560) menetelmällä, ja etsiä sitten homologioita. ·;··· Keskuksen hydrofobista domeenia koodaavien sekvenssien lajienvälinen homologia on normaalisti >70 % sekä aminohappo- että nukleotidi tasolla. Jos käytettävissä on • · · I 25 vasta-aine, sekvenssin tunnistaminen voidaan myös vahvistaa • · · **** Sambrookin et ai. (Molecular Cloning. 1990. Toinen painos, ·«· •••j Cold Spring Harbor Press. s. 8-49 - 8-51.) kuvaamilla hybri- ♦ · * *·* * din valinta- ja translaatio -kokeilla siemen-mRNA-valmisteis- ta.
··· : 30
Siemenistä tehtyjä cDNA-klooneja voidaan seuloa käyttäen minkä tahansa saatavissa olevan ölyonteloproteiinigeenin • · *..* säilyneistä koodaavista alueista tehtyjä cDNA-koettimia • ♦ **;·’ (esim. Bowman-Vance ja Huang. J. Biol. Chem. 1987. 262:11275- 35 11279) . Valitaan klooneja, jotka hybridisoituvat enemmän :*·.· siemen-DNA: iden kuin taimi-cDNA: iden kanssa. Seulonta • · toistetaan erityisen, kehittyvien siementen öljyonteloihin liittyvän DNA:n tunnistamiseksi käyttäen suoraa vasta- 22 aineseulontaa tai hybridin valitsemista ja translaatiota. Tätä spesifiselle cDNA:lle komplementaarista mRNA:ta ei ole muissa testatuissa solukoissa. Tätä cDNA:ta käytetään sitten genomisen kirjaston seulomiseen ja valitaan pätkä, joka 5 hybridisoituu kyseiseen cDNA:han.
Kimeerisen geenin saamiseksi ilmentymään siemenissä voidaan käyttää transkription alkamista säätelevää aluetta ja translaation alkamista säätelevää aluetta translatoitumattomista 10 5'-sekvensseistä, "ribosomin sitoutumiskohtia", jotka vastaavat mRNA:n kiinnittämisestä ribosomeihin. Voidaan käyttää minkä tahansa geenin, mielellään siemenessä ilmentyvän geenin ko. alueita. Esimerkkejä sellaisista geeneistä ovat mm. siementen varastoproteiinit esim. napiinista (Jo-15 sefsson et ai. J. Biol. Chem. 1987. 262:12196-12201; Scofield S. R. ja Crouch M. L. J. Biol. Chem. 1987. 262:12202-12208). Edullisesti alue saadaan öljyonteloproteiinista (Arabidopsiksen, porkkanan öljyonteloproteiinit, Hatzopoulos et. ai., alla tai maissin Huang et ai. 1987 ja 1990, alla). 20 Alue käsittää yleensä ainakin 100 ep rakennegeeniä koodaavan sekvenssin translaation alkukohdan 5'-puolelta, ja jopa 2,5 ·...: ke saman translaation alkukohdan 5'-puolelta. On eduksi, että kaikki transkriptiossa ja translaatiossa toimivat aloituksen ,·]·. säätelykohdan osat ovat peräisin tai saatavissa samasta • · · l 25 geenistä. "Saatavissa" tarkoittaa, että DNA-sekvenssi • · · **** muistuttaa riittävästi alkuperäistä sekvenssiä, että • · · ···· kimeeristä proteiinia koodaava DNA-sekvenssi tuottaa • · · *·* * kimeeristä proteiinia koodaavalle DNA: lie halutun transkrip- tiospesifisyyden. Se tarkoittaa sekä luonnollisia että ··· ί,Σ Σ 30 synteettisiä sekvenssejä ja voi olla synteettisten ja :***: luonnollisten sekvenssien yhdistelmä.
« · · • · · « « « ♦ · *..I Transkriptiotason pitäisi olla riittävä tuottamaan RNA- • · **;·’ määrän, joka kykenee modifioimaan siementä. "Modifioidulla >e*j* 35 siemenellä" tarkoitetaan siementä, jonka fenotyyppi on havaittavasti erilainen kuin saman lajin trans f ormoimat toman kasvin siemen, esimerkiksi sellaisen, jonka genomissa ei ole kyseistä ilmentymiskasettia. Useat erilaiset fenotyypin • · 23 muutokset ovat kiinnostavia. Tällaisia muutoksia ovat öljyonteloproteiinin yli-ilmentyminen, OBP:n kertyminen öljyonteloon tai saatavan kimeerisen proteiinin kertyminen sytoplasmaan.
5
Haluttu polypeptidi voi olla mikä tahansa proteiini, esimerkiksi entsyymi, hyytymisen estäjä, neuropeptidi, hormoni tai adhesiivinen prekursori. Esimerkkejä proteiineista ovat interleukiini-1-β, hyytymisen estäjä hirudiini, β-gluku-10 ronidaasientsyymi tai yksiketjuinen vasta-aine, jossa im-munoglobiinin VH- tai VL-ketjut ovat fuusioituneet translaatiossa. Haluttua polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi voi olla synteettinen, luonnosta saatu tai jokin niiden yhdistelmä. Haluttua polypeptidiä koodaavan DNA:n laadusta tai 15 lähteestä riippuen voi olla edullista syntetoida DNA-sek-venssin kasvin suosimista kodoneista. Kasvin suosimat kodonit voidaan määrittää sen mukaan, mitkä kodonit esiintyvät useimmin niissä proteiineissa, jotka ilmenevät runsaimmin kyseisessä isäntäkasviksi suunnitellussa kasvilajissa.
20 Käytettävä terminaatioalue voi ensisijaisesti olla jokin hel-posti käytettävä, sillä vaikuttaa siltä, että monissa tapauk- • · sissa on suhteellisen samantekevää, mitä terminaatioaluetta TI käytetään. Terminaatioalue voi olla peräisin samasta • · · • · · '* 25 lähteestä kuin transkription aloituskohta, samasta lähteestä • · · •••j kuin haluttua polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi tai se « ♦ « •••i voidaan saada eri lähteestä. Sopivia terminaatioalueita on • · · V * saatavissa A. tumefaciensin Ti-plasmidista, esimerkiksi oktopiinisyntaasin ja nopaliinisyntaasin terminaatioalueet.
• · · : : : 30 :*’*· Suuntaavaa sekvenssiä koodaava DNA-sekvenssi voidaan liga- ♦ · · toida haluttua peptidiä koodaavaan geeniin monella eri • · · tavalla, mm. terminaali fuusioina, sisäisinä fuusioina ja • · *·;·* polymeerisinä fuusioina. Joka tapauksessa fuusiot tehdään ··· 35 siten, että ne eivät häiritse öl jyonteloproteiinin lukuke- • ·· · leja liitosten kohdalla ja niiden lähellä. Eri tyyppiset :\j hystä, ja siten, että vältetään translaation lopetussignaa- • · 24 terminaaliset ja sisäiset fuusiot esitetään kuviossa 2, samoin kuvaus niiden rakenteista in vivo.
Kaikissa kuvatuissa tapauksissa peptipiä koodaavan geenin 5 liittymiskohta saisi mielellään sisältää jonkin proteaasin kohdetta koodaavan linkkerin. Tämä mahdollistaisi peptidin irroittamisen sen jälkeen, kun se on eritetty fuusioprote-iinina. Potentiaalisia käytettäviä katkaisukohtia ovat trom-biinin tunnistuskohta (leu-val-pro-arg-gly) (Fujikawa et ai. 10 Biochemistry. 1972. 11:4892-4899), tekijä Xa:n tunnistuskohta (phe-glu-gly-arg-aa) (Nagai et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1985. 82:7252-7255) tai kollagenaasin tunnistuskohta (pro-leu-gly-pro) (Scholtissek ja Grosse. Gene. 1988. 62:55-64) .
15
Sopivilla toimenpiteillä, kuten restriktiolla, ulkonevien päiden lyhentämisellä taaksepäin tai täyttämisellä tylppien päiden saamiseksi, linkkereiden liittämisellä tms. voidaan tuottaa osien komplementaariset päät liittämistä ja ligaa-20 tiota varten. Eri vaiheiden suorittamisessa käytetään kloonausta DNA:n määrän kasvattamiseksi ja jotta on mahdollista analysoida DNA: ta sen varmistamiseksi, että toimenpiteet ovat sujuneet oikein. On käytettävissä suuri määrä erilaisia kloonausvektoreita. Tällainen kloonausvektori sisältää E.
• · · • · · ’l 25 colissa toimivan replikaatiosysteemin ja markkerin, joka • · · ···· mahdollistaa transformoitujen solujen valikoimisen. Kuvaavia • · · »·'· esimerkkejä vektoreista ovat mm. pBR332, pUC-sarja, Ml3mp- • · · V * sarja, pACYC184 jne. Täten sekvenssi voidaan sijoittaa vektorin sisään sopivaan restriktiokohtaan tai sopiviin 3 0 restriktiokohtiin, käyttää saatavaa plasmidia E. coli ·*’*: isännän transformoimiseen, kasvattaa E. coli sopivassa • · · ravintoalustassa, kerätä ja hajottaa solut sekä ottaa plas- • · · *#>* midit talteen. Analyysi voi käsittää sekvenssianalyysin, • · *···* restriktioanalyysin, elektroforeesin tai muuta niiden kai- m 1 • · 35 täistä. Jokaisen käsittelyn jälkeen lopullisessa rakenteessa • · · · käytettävä voidaan erottaa restriktioentsyymillä (be restricted) ja liittää seuraavaan sekvenssiin, jolloin kaikki 25 osarakenteet voidaan kloonata joko samassa tai eri plasmi-deissa.
Käytettävissä on useita erilaisia tekniikoita DNA:n viemi-5 seksi kasvisoluisännän sisään. Voidaan esimerkiksi viedä kimeerisiä DNA-rakenteita isäntäsoluihin, jotka on saatu kaksisirkkaisista kasveista, kuten tupakasta tai öljykasvi-lajeista, kuten Brassica napus, käyttäen standardi-Agrobac-teriu/n-vektoreita ja Moloneyn et ai. (Plant Cell Rep. 1989. 10 8:238-242) tai Hincheen et ai. (Bio/Technol. 1988. 6:915-922) kuvaaman kaltaista transformointimenettelyä tai muita alaa taitavien tuntemia tekniikoita. Esimerkiksi T-DNA:n käyttämistä kasvisolujen transformoimiseen on tutkittu laajasti, ja sitä kuvaavat laajalti EPÄ sarjanro. 120 516, 15 Hoekema teoksessa The Binary Plant Vector System. Offset- drukkerij Kanters B. V. Alblasserdam. 1985, kappale V, Knauf et ai. Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium. Molecular Genetics of the Bacteria. Plant interaction. Toim. Puhler. A. Springer-Verlag. New York. 20 1983. s. 245 sekä An et al. EMBO J. 1985. 4:277-248. On käytännöllistä, että siirrännäisiä voidaan viljellä A. tumefaciensin tai A. rhizogenesin kanssa, jotta transkrip-tiokonstrukti voi siirtyä kasvisoluihin. Agrobakteereilla transformoinnin jälkeen kasvisolut erotetaan sopivassa väli- • * · • · · * * 25 koivassa aineessa seulonnan suorittamiseksi ja kasvatetaan ··· •••j kallukseksi. Kalluksesta kasvatetaan versoja ja taimia • · · •••i kasvattamalla juurtumisalustassa. Agrobacterium- isäntä • · · V * sisältää sitten plasmidin, jossa on T-DNA:n kasvisoluihin siirtämiseen tarvittavat vir-geenit, ja jossa joko on tai ei 30 ole T-DNA:ta. Injektiota ja elektroporaatiota (katso :1: jäljempänä) varten vaarattomiksi tehdyt Ti-plasmidit (ilman » · · kasvaingeenejä, varsinkin T-DNA-aluetta) voidaan siirtää * · « • ·’ kasvisoluihin.
• · · • · • · ··· •j* 35 Muiden kuin Agroba c t eri um~ tekniikoiden käyttö mahdollistaa • ·· · •\j tässä kuvattujen rakenteiden käyttämisen transformaation ja • · ilmentymisen tuottamiseen monissa erilaisissa yksisirkkai-sissa ja kaksisirkkaisissa kasveissa. Nämä tekniikat ovat 26 erityisen käyttökelpoisia lajeilla, joita on hankala käsitellä Agrohacterium-transformaatiosysteemillä. Muita gee- ninsiirtotekniikoita ovat muun muassa biolistiikka (biolis-tics) (Sanford. Trends in Biotech. 1988. 6:299-302), 5 elektroporaatio (Fromm et al. 1985. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA. 82:5824-5828; Riggs ja Bates. 1986. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 83. 5602-5606) tai PEG-välitteinen DNA:n sisäänotto (Potrykus et ai. 1985. Mol. Gen. Genet. 199:169-177.) 10 On monia siemenkasveja joiden soluja voidaan käyttää isän-täsoluna, ja solut otetaan kasvilajin mukaan kasvin osista, kuten varresta, lehdestä, juuresta tai siemenestä tai lisään-tymisrakenteista. Solut voivat olla eristettyjä soluja tai kasvinosia, esimerkiksi lehtikiekkoja. Jossakin erityisessä 15 sovelluksessa, esim. Brassica napuksella, isäntäsolut otetaan yleensä sirkkalehtien petioleista, minkä ovat kuvanneet Moloney et ai., Plant Cell Rep. 1989. 8:238-242. Muita esimerkkejä, joissa käytetään kaupallisia öljysiemenkasveja, ovat mm. sirkkalehtien transformaatio soijan siir-20 rännäissolukoissa (Hinchee et ai. Biotechnology. 1988. 6:915-922) ja puuvillan varren transformaatio. (Umbeck et ai. Biotechnology. 1981 5:263-266).
• · • · · TI Transformaation jälkeen soluja kasvatetaan esimerkiksi lehti- • · · * i 25 kiekkoina valikoivassa kasvualustassa. Versojen alkaessa • · · tulla esiin ne leikataan irti ja siirretään juurtu-misalustaan. Kun on muodostunut riittävä määrä juuria, kasvit • · · ·.·' ; siirretään multaan. Oletetuista transformoiduista kasveista testataan sitten, onko markkeri läsnä. Genomiselle DNA:lie 30 tehdään Southern-blottaus sopivaa koetinta, esimerkiksi A.
·*’*· thalianan oleosiinigeenin koetinta käyttäen haluttujen • · · sekvenssien isäntäsolun genomiin integroituneisuuden • · · • ·* osoittamiseksi.
··* • · • · • · · ··· 35 Ekspressiokasetti liitetään normaalisti johonkin kas- • · · · .·. : visoluseulontamarkkeriin. Sopiva markkeri voi olla vastus- • · · • · tuskyky kasvimyrkylle, erityisesti antibiootille, kuten kanamysiini11e, G418:lle, bleomysiinille, hygromysiinille, 27 kloramfenikolille tai muulle sellaiselle. Käytettävä erityinen markkeri voi olla sellainen, joka mahdollistaa transformoitujen solujen valikoimisen erotukseksi soluista, joissa ei ole kyseistä siirrettyä DNA:ta.
5
Edellä kuvatulla tavalla rakennetussa ekspressiokasetissa oleva fuusiopeptidi ilmentyy varsinkin (ellei ainoastaan) kehittyvissä siemenissä. Tavanomaisesti kasvatettujen siir-togeenisten kasvien annetaan siis tehdä siementä. Katso esim. 10 McCormick et ai. Plant Cell Reports. 1986. 5:81-84. Sopivaa geenikoetintä käyttäen voidaan suorittaa Northern-blottaus RNA:11e, joka on eristetty sellaisesta solukosta, jossa odotetaan tapahtuvan transkriptiota, esimerkiksi siemenen alkiosta. Transkriptien kokoja voidaan sitten verrata 15 fuusioproteiinitranskriptin odotettuun kokoon.
Öljyonteloproteiinit eristetään sitten siemenistä ja suoritetaan analyysejä, jotka vahvistavat fuusiopeptidin ilmentymisen tapahtuneen. Analyysit voidaan suorittaa esimerkiksi 20 PAGE:lla (polyakryyligeelielektroforeesi). Fuusiopeptidi voidaan löytää käyttämällä fuusiopeptidin oleosiiniosan vasta-ainetta. Saadun fuusiopeptidin kokoa voidaan sitten verrata fuusioproteiinin odotettuun kokoon.
• · · · • · • · · • · · * 25 Voidaan kasvattaa kaksi tai useampia sukupolvia siirto- • · · •**j geenisiä kasveja, jotka voidaan pölyttää joko samalla • · · transformoidulla kannalla tai eri kannoilla, ja tunnistetaan • · · V * saatu hybridi, jolla on toivotut fenotyyppiset ominaisuudet.
Näin halutaan varmistaa, että kyseiset fenotyyppiset ϊ 3 0 ominaisuudet ovat pysyviä ja periytyviä. Sitten kerätään :***: siemenet halutun peptidin eristämiseksi tai käytettäviksi • · · uuden f enotyyppisen ominaisuuden omaavien siementen • · · • · *..* tuottamiseen.
• · • · ··* ·:* 3 5 Haluttu proteiini voidaan uuttaa siirretyn ominaisuuden • · · · :*·.· suhteen homo- tai heterotsygoottisista siemenistä useilla • · erilaisilla tekniikoilla, joihin kuuluvat puskuroidun vesipohjaisen uuttoliuoksen käyttö ja jauhamis-, rikkomis- ja 28 hienontamismenetelmät tai muut tavat rikkoa siementen solut. Uutetut siemenet voidaan sitten jakaa (esim. sentrifugoimalla tai antamalla solususpension sedimentoitua) kolmeen fraktioon: sakkaan eli liukenemattomaan pellettiin, 5 supernatanttiin, joka on vesiliuos, ja tiiviiseen "vaahtoon", johon sisältyy siemenen varastoiipidiä ja öljyonteloita. Nämä öljyontelot sisältävät sekä luonnon öljyonteloproteiineja että kimeerisiä öljyonteloproteiineja, joista jälkimmäiset sisältävät vieraan peptidin. Nämä öljyontelot erotetaan 10 vesiliukoisista proteiineista ja lietetään uudelleen vesipohjaiseen puskuriin.
Jos ilmentämiskasettiin on sisällytetty linkkeri, joka käsittää proteaasin tunnistuskohdan, uudelleenliettämispus-15 kuriin lisätään linkkerisekvenssin translaation tuottamalle tunnistuskohdalle spesifinen proteaasi. Tämä vapauttaa halutun peptidin vesifaasiin. Nyt toinen sentrifugointivaihe saattaa prosessoidut öljyontelot proteiineineen kellumaan ja jättää jäljelle halutun peptidin vesiliuoksen. Haluttu 20 peptidi voidaan sakkauttaa, muuntaa kemiallisesti tai pakastuskuivata sen ominaisuuksien ja toivottujen sovellusten mukaan • · i··
Tietyissä sovelluksissa ei aina ole tarpeen irrottaa kimee- • · · * l 25 ristä proteiinia öljyonteloproteiinista. Sellaisia sovel-·· · •••| luksia olisivat mm. tapaukset, joissa fuusiopeptidi sisältää • ti ···! entsyymin, joka sietää N- tai C-terminaalisia fuusioita ··· V · säilyttäen aktiivisuutensa. Sellaisia entsyymejä voitaisiin käyttää katkaisematta ja puhdistamatta edelleen. Kimeerinen 30 entsyymi-OBP saatettaisiin kontaktiin substraatin kanssa :***; fuusioproteiinina. Haluttaessa on myös mahdollista puhdistaa • · · entsyymi-OBP-f uusioproteiini käyttäen immunoaf f initeet- • · · tipylvästä, joka sisältää runsaasti immobilisoitua öljyon- • # *···' teloproteiinin vasta-ainetta (katso esim. Taylor et ai. 1990.
··· 35 yllä) .
• · · · • · • · · • · · • ·
Muut keksinnön käyttökohteet ovat seuraavanlaisia. OBP:t muodostavat suuren osan siemenen kokonaisproteiinista, ja täten 29 on mahdollista voimistaa tiettyjä haluttuja ominaisuuksia siemenessä, kuten lysiinipitoisuutta, metioniinipitoisuutta ja muuta sellaista, yksinkertaisesti tekemällä fuusioproteiini runsaasti haluttua aminohappoa tai haluttuja 5 aminohappoja sisältäväksi. Tämä voisi olla erityisen hyödyllistä muunnettaessa viljoja (grains and cereals), joita käytetään joko suoraan tai epäsuorasti ravinnon lähteenä karjalle, mukaan lukien nautakarja ja siipikarja, sekä ihmisille. Voi olla mahdollista sisällyttää (siemeneen) 10 fuusioproteiinina entsyymi, joka voi avustaa öljyn tai jauhon jatkokäsittelyssä tavanomaisen öljysiemenen murskaamisen ja uuttamisen yhteydessä, esimerkiksi lämpökestävä, lipidiä modifioiva entsyymi, joka pysyisi aktiivisena kohotetuissa murskauslämpötiloissa, joita viljan prosessoinnissa 15 käytetään, ja lisätä siten uutetun triglyseridi- tai proteiinituotteen arvoa. Muita fuusioproteiinin käyttötapoja ovat mm. viljelyskasvin agronomisen terveyden parantaminen. Esimerkiksi hyönteismyrkkyproteiini tai osa viljelystuholaiselle, esim. sienisolun seinälle tai 20 solukalvolle spesifistä vasta-ainetta voitaisiin yhdistää öljyonteloproteiiniin ja vähentää siten tietyn kasvintuho-laisen hyökkäyksiä siementä kohtaan.
• · • · · *1“ Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön kuvaamiseksi, ei • · · ** ;’ 25 rajoittamiseksi.
··· ···· ···
Kokeita ··· « · t • · ·
Esimerkki 1 30 Vieraiden peptidien terminaalifuusioiden ilmentyminen öljy- :***; onteloproteiinien kanssa • · « ·· « • · · • ·* A. C-terminaali set fuusiot ··· • · • · ··· 9 ··· 35 Öl jyonteloproteiinigeenin genominen klooni, joka sisältää • · · · vähintään 100 ep translaation alkukohdan 5'-puolelta, kloona- « ♦ taan plasmidikuljettajaan, joka kykenee replikoitumaan sopivassa bakteeri-isännässä (esim. pUC:ssä tai pBR322 E.
30 colissa). Geeniin sijoitetaan restriktiokohta hydrofiilistä C-terminaalista osaa koodaavaan alueeseen. 19 kDa:n OBP:ssä tämä alue ulottuu tyypillisesti kodonista 125 kloonin loppuun. Ihanteellinen restriktiokohta on ainoa laatuaan, mutta 5 tämä ei ole täysin välttämätöntä. Ellei alueella ole sopivaa restriktiokohtaa, siihen voidaan viedä sopiva restriktiokohta Kunkelin (Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1985. 82:488-492) kohdennetun mutageneesimenetelmän avulla. Ainoa tärkeä rajoitus tämän kohdan geeniin viemisessä on, että se on 10 sijoitettava OBP-kloonin translaationlopetussignaalin 5'-puolelle.
Kun tämä mutatoitu klooni on kohdallaan, voidaan valmistaa synteettinen oligonukleotidiadapteri, joka sisältää prote-15 aasintunnistuskohtaa, kuten Pro-Leu-Gly-Pro, koodaavan sekvenssin tai sen multimeerin. Tämä on kollagenaasi-prote-aasin tunnistuskohta. Adapteri syntetisoitaisiin siten, että saadaan: 4 emäksen ulkoneva pää adapterin 5'-päässä, yhteensopiva OBP-kloonin 3'-pään restriktiokohdan kanssa, 20 jotta on helpompi ligatoida adapteri vieraan peptidin koodaavaan sekvenssiin ja tarvittaessa ylimääräisiin emäksiin, niin, ettei siirryttäessä öl jyonteloproteiinia koodaavan • · . sekvenssin, proteaasin tunnistuskohdan ja vierasta peptidiä **" koodaavan sekvenssin välillä tapahdu lukukehyksen muutosta.
• « · *·*·’ 25 Sellaisen fuusion tyypillinen järjestely esitetään kuvassa 3.
·· · ···· Tässä esitetyssä esimerkissä käytetään valmiiksi porkkanan ..ΙΓ OBP:n lopetuskodonin lähellä olevaa Xhol-kohtaa (Hatzopoulos * et ai. Plant Cell. 1990. 2:457-467). Tämä katkaistaan ja voidaan ligatoida kahdesta kuvatusta oligonukleotidista :*·*: 30 rakennettuun adapteriin. Tämä adapteri muodostaa täydellisen .“*j Xhol-ulkonevan pään toisessa päässä, eikä sekoita • · · translaation lukukehystä. Toinen pää muodostaa ulkonevan • · · • ♦* Ncol-kohdan, joka valitaan vapaasti (mikä tahansa kuuden «·· • ♦ emäksen katkaisukohta riittää) , paitsi että siihen sisältyy ··· 35 ATG halutusta vieraasta peptidistä.
• · · · • · • · · • · · • ·
Lopullinen ligaatiotuote sisältää melkein täydellisen OBP-geenin, kollgenaasin tunnistuskohtaa koodaavan sekvenssin ja 31 haluttua peptidiä koodaavan alueen, kaikki samassa lukukehyksessä. Tämä kolmiosainen pätkä kloonataan Agrobacteriumin sellaiseen binaariplasmidiin (Bevan. Nucl. Acid Res. 1984. 12:8711-8721), jota käytetään yleisesti vieraan DNA:n siirtä-5 miseen kasveihin (Fraley et ai. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1983. 80:4803-4807), ja sitä käytetään öljysiemenkasvien, kuten rapsin transformoimiseen Moloneyn et ai. (Plant Cell Rep. 1989. 8:238-242) menetelmää tai vastaavaa menettelyä käyttäen. Tästä transformaatiokokeesta voidaan saada 10 siirtogeenisiä kasveja, jotka kasvatetaan kukkiviksi. Kasvit tuottavat sitten siementä itsepölytyksellä.
Siementen annetaan saavuttaa kypsyys (60-80 päivää). Sitten ne kerätään ja jauhetaan vesipohjaisessa uuttopuskurissa 15 (Taylor et ai. Planta. 1990. 181:18-26). Liete sentrifugoidaan uudelleen 5000 x g:ssä 20 min. ja saadaan pintavaahto. Vaahto otetaan taas talteen ja lietetään voimakkaasti ravistelemalla kollagenaasimenetelmäpuskuriin (Scholtissek ja Grosse. Gene. 1988. 62:55-64). Lisätään viisi 20 yksikköä kollagenaasia ja suspensiota inkuboidaan ravistellen 4 h. Tämän ajan kuluttua suspensio sentrifugoidaan jälleen kerran, 5000 x g 20 min. ajan. Pintavaahto poistetaan ja • · vesifaasin proteiinisisältö analysoidaan SDS- *1*1 polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Jos noin halutun • · · • · · *l 25 peptiden kokoa oleva juova löydetään, proteiini voidaan ··· ···· sakkauttaa ammoniumsulfaatilla, tiivistää ultrasuodatuksella ...ί tai pakastuskuivata.
··· • · » • · · B. N-terminaaliset fuusiot 3 0 :***; Öl jyonteloproteiinien hydrof iiliseen N-terminaali seen päähän ··· voidaan liittää peptidejä siten, että on kuitenkin varmaa, • · · *##·* että vieras peptidi jää öljyontelon ulkopinnalle. Tällaisten • · *···* fuusioiden rakenne esitetään kuviossa 2IB.
·:♦ 35 • · · · ί Tämä rakenne voidaan rakentaa C-terminaalisiin fuusioihin • · · • · käytettyjen kaltaisista lähtöaineksista, mutta vaatii sopivan restriktiokohdan identifioimisen öljyonteloproteiinigeenin 32 translaation aloituskohdan läheltä. Sopiva kohta voidaan tehdä moniin öljyonteloproteiinigeeneihin muuttamatta koodaavaa sekvenssiä lainkaan, muuttamalla yhtä ainoaa emästä heti ensimmäisen 'ATG':n 5'-puolella. Tähän asti tutkituissa 5 öljyonteloproteiineissa toinen aminhappo on alaniini, jonka kodoni alkaa G:llä. Sekvenssien ympäristö on seuraavanlainen: I A-C-vaihdos tähän tuottaa Ncol-kohdan
T
3' . . . TC TCA AGA ATG GCA . . . Porkkanan OBP
3' . . .CG GCA GCA ATG Gcg . . . Maissin 18 kD:n OBP
10 Yhden emäksen, ATG:tä edeltävän adeniinin, muutos tuottaisi kummassakin tapauksessa sekvenssin ...CCATGG..., joka on
Ncol-kohta. Siten tämän emäksen muotoileminen käyttäen Kunkelin (Proc. Nat. Acad. Sei. US. 1985. 82:488-492) kohdennettu mutageneesi -menetelmää valmistaa kloonin käyt-15 töön, olettaen, että sekvenssissä ei ole muita Ncol-kohtia.
Vierasta peptidiä koodaava sekvenssi voi vaatia valmisteluja, jotka mahdollistavat sen ligatoimisen suoraan Ncol-kohtaan. Tämä vaatii tyypillisesti yhden tai kahden emäksen modifi- m 20 kaation kohdennetulla mutageneesillä (Kunkel 1985, yllä) • · ·.·.· Ncol-kohdan tuottamiseksi vieraan peptidin translaation *ϊ* aloituskohdan lähelle. Tämä peptidi irroitetaan sitten ···· ^ ^ ·;· kloonausvektoristaan käyttäen Ncol: tä ja toista entsyymiä, ···· ·*·*· joka katkaisee läheltä kohteen translaation lopetuskohtaa.
25 Taas voidaan tuoda toinen sopiva katkaisukohta yllä kuvattuja menetelmiä käyttäen kohdennetulla mutageneesillä. Qu ja Huang • ♦ · ovat ehdottaneet (1990, yllä), että N-terminaalinen alaniini • · • · V voitaisiin poistaa proteiinin in vivo -prosessoinnin aikana, ·· · • V ja että siitä välittömästi alavirtaan sijaitseva metioniini 30 voitaisiin asyloida. Tätä mahdollisuutta varten voi olla ·· · tarpeen säilyttää proteiinin N-pään Met-Ala-sekvenssi. Tämä *!*’. voidaan tehdä helposti useilla eri strategioilla, joilla * * viedään sopiva restriktiokohta koodaavaan sekvenssiin Ala- 33 kodoniin tai sen jälkeen. Esimerkiksi, sekvenssiä voitaisiin muokata kohdennetulla mutageneesillä seuraavasti: 3' ... TC TCA ACA ATG GCA GAA CGA GGC ACT TAT .....
mitätöit uu sekvenss iksi i N a rl 3' ... TC TCA ACA ATG GCA TGC CGA GGC GCC ^ TAT .....
i_!=ϋ l-J
Sphl 5 Tämä yksittäisen kodonin muutos toisi koodaavaan sekvenssiin Sphl-kohdan. Toinen muutos, joka voitaisiin tehdä saman muta-geneesikierroksen aikana, muuttaisi kaksi emästä kodonissa 6 tuottaen sekvenssin GGC GCC, joka on Narl-kohta. Tämä 10 mutatoitu geeni voitaisiin sitten avata Sphl:llä ja Narl:llä, jotta saadaan suunnattu kloonauskatkos, joka poistaa kolme kodonia. Tähän kohtaan voitaisiin viedä adapteri, joka sisältää 3’-ulkoneman, jonka sekvenssi on CATG... (Sphl-yhteensopiva) ja GC 51-ulkoneman vastakkaisessa päässä. Tämän 15 adapterin täsmällinen sekvenssi esitetään seuraavassa: "*: Sphl Narl • · · • · · · n kertaa • · · • · • · · -- - - _
'"I CCG CTC GGT CCG GG
• · ·
•;:l CTACG GGC GAG CCA GGC CCGC
• · · J— «—<»——— ..................
• · · Tämä adapteri muodostaisi sekä Sphl- että Narl -restriktio- • · · 20 kohdat, joita käytettäisiin diagnostisiin tarkoituksiin.
• · *1* Sphl-kohtaa voitaisiin nyt käyttää plasmiden avaamiseen ja ·· · • *.· kloonata lukukehykseen DNA-fragmentti, johon sisältyy hyö-• · · dyllisen peptidin sekvenssi. Kloonauksen suuntaa voitaisiin sitten tutkia katkaisemalla plasmidi Narl-kohdasta ja mistä '1". 25 tahansa epäsymmetrisesti sijaitsevasta kohdasta.
* ·· • · 34 Näistä N-terminaalisista fuusioista saatavat rakenteet olisivat tyypillisiä Kuvion 2 IB:n esimerkkien mukaisia rakenteita. Ne sisältäisivät OBP-promoottorisekvenssin, lukukehyksessä olevan fuusion arvokasta peptidiä koodaavan 5 OBP-geenin sekvenssin muutamissa ensimmäisissä OBP-geenin kodoneissa, oma ATG aloitussignaalina, jos tarpeen, lopun OBP-geenin ja terminaattorin.
Tämä muokattu geeni viedään binaariseen Agrobakterium-plas-10 midiin (Bevan 1984, yllä) ja mobilisoidaan Agrobakteeriin.
Transformaatiot suoritetaan yllä kuvatulla tavalla. Arvokkaan peptidin talteenotto siemenistä suoritetaan, kuten "C-terminaalisten fuusioiden" suhteen on kuvattu.
15 C. Sisäiset translationaaliset fuusiot
Kolmas fuusiotyyppi käsittää arvokkaan peptidin koodaavan sekvenssin sijoittamisen OBP:tä koodaavan sekvenssin sisään. Tämä fuusiotyyppi vaatii samaa strategiaa kuin N-20 terminaaliset fuusiot, mutta saattaa olla toimiva vain heikosti säilyneiden alueiden muuttuessa, koska uskotaan, ·;··· että näiden öljyonteloproteiinien hyvin (lajien välisesti) säilyneet alueet ovat välttämättömiä kypsän proteiinin • · · · suuntaamiseksi.
• ♦ · 25 • · · ***! Tällaisen fuusion tärkein erottava piirre on se, että prote- ··· **** iinin vapauttamiseksi tarvitaan kollagenaasin tunnistuskohdat • · · *·1 1 molemmin puolin. Tämä tarkoittaa, että tähän asti kuvatun s tandardi-koilagenenaas i-1inkkeri/adapteri-systeemin sijasta ··♦ ·.· · 30 tarvitaan 1 inkkeriä, joka on seuraavaa muotoa: • · · • · • · • · · _n kertaa n kertaa
·1 kohesiivi- CCG CTC GGT CCG restrik- CCG CTC GGT
• · · nen pää 1 GGC GAG CCA GGC tiokohta GGC GAG CCA GGC pää 2 • · · • · 35 riktiokohtaa käytetään sitten sopivien restriktiokohtien tai linkkereiden reunustaman arvokkasta peptidiä koodaavan sekvenssin tuomiseen. Suunta tarkastetaan käyttämällä asymmetrisesti sijoitettua restriktiokohtaa arvokasta peptidiä 5 koodaavassa sekvenssissä sekä toista kahdesta restrik- tiokohdasta kollagenaasin tunnistuskohtaa koodaavan sekvenssin molemmin puolin.
Näiden konstruktien siirto Agrobacteriumin plasmideihin ja 10 sitten kasveihin on täysin aiemmin kuvatun menettelyn kaltainen. Arvokkaan proteiinin ottaminen talteen transgeenisten kasvien siemenistä eroaa jonkin verran siinä, että kun öljyontelot on eristetty ja pesty, voi olla tarpeen poistaa öljyontelolipidit, jotta päästään käsiksi kollagenaasin 15 tunnistuskohtiin, jotka voivat olla piilossa öljyontelon sisällä lipidifaasissa. Tämä vaihe voi pienentää tiettyjä öljyonteloproteiinien kantajana käyttämisen etuja, mutta voi toisaalta olla hyvin käytännöllistä sellaisilla prote-iinisekvensseillä, jotka ovat labiileja vesiliuoksissa ja 20 kasvien solulimassa.
·;··· D. Dimeerien väliset translaatiofuusiot • · · • · · ·
On mahdollista luoda rakenne, jossa OBP:n koko koodaava sek- • · · .j, 25 venssi toistuu. Tästä rakenteesta tuotettu dimeerinen proteiini voi silti sisältää kaikki tarpeelliset tekijät **“ OBP:n suuntaamiseksi öljyonteloon. Sellainen rakenne sisäl- • · · täisi promoottorialueen, kokonaisen tai lähes täydellisen avoimen OBP:n lukukehyksen, mutta ilman translaation lope- • · · ·.* · 30 tuskohtaa, ja sitten kokonaisen toisen OBP:n avoimen luku- • · · :.,.ϊ kehyksen (an entire open-reading frame of a second OBP) , tällä kertaa translaation lopetuskohdalla ja terminaattori- • · *..! alueella varustettuna.
• · • · ..*·* 35 Tätä kimeeristä geeniä rakennettaessa kaksi erilaista rest- ϊ/.ϊ riktiokohtaa on joko valmiina tai luodaan kyseisten kahden kopion liittymäkohdan alueelle. Näiden restriktiokohtien tarkoitus on mahdollistaa yllä kuvatun kaltaisen linkkerin 36 siirto sisäisiä translationaalisia fuusioita varten. Linkkeri sisältää paitsi kollagenaasin tunnistuskohtia, myös sisäisen restriktiokohdan, jonka sisään voidaan sijoittaa arvokasta proteiinia koodaava sekvenssi. Tämän rakenteen muoto 5 esitetään kuvassa 2 III. Tämän rakenteen siirtäminen Agrobacteriumiin ja sitten kasveihin vastaa täysin edellä kuvattua. Arvokas proteiini otettaisiin talteen transformoitujen kasvien siemenistä samalla menettelytavalla, joka on kuvattu C-terminaalisten fuusioiden kohdalla edellä.
10
Esimerkki 2
Strategia interleukiini-1-β :n (ΙΙ,-1-β:η) kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi oleosiineihin fuusioituneena kasveissa 15 A. Arabidopsis thalianan oleosiinigeenin kloonaaminen ja sekvensointi
Brassica napuksen oleosiinigeeniä (Murphy et ai. 1991.
20 Biochim Biophys Acta 1088:86-94) käytettiin A. thalianan (lajike Columbia) genomisen kirjaston seulomiseen EMBLA3A:ssa ·;··: (Stratagene) . Seulonnalla saatiin eristetyksi EMBLA3A-klooni .j. (Iambda2.1), joka sisältää 15 ke:n genomisen fragmentin A.
• · · · thalianasta. Oleosiini paikallistettiin 6,6 ke: n Kpnl- • · · ’,1, 25 insertin sisään tässä 15 ke:n fragmentissa (Kuvio 5). 1,8 ’**! ke:n Ncol/Kpnl -pätkän, joka sisältää oleosiinigeenin, päät i·· täytettiin ja pätkä alakloonattiin RFMl3mpl9:n Smal-kohtaan.
• · · *·’ 1,8 ep:n insertti pilkottiin sopivilla restriktioentsyymeillä ja alakloonattiin Ml3mpl9:ään sekvensointia varten. A.
• · · ·.· : 30 thalianan oleosiinigeenin 1800 ep:n sekvenssi esitetään • · · i...i kuvassa 1 a. Kaikki kloonausprosessit suoritettiin Sambrookin et ai. mukaan (1989. Molecular Cloning: A laboratory manual.
• · 2 . painos . Cold Spring Haber Laboratory Press . ) • · ··· i((T 35 B. IL-l-p:aa koodaavan ollgonukleotldin laatiminen • · • · · • · · • · IL-1-β koostuu 9 aminohaposta (aa): val-gln-gly-glu-glu-ser-asn-asp-lys (Antoni et ai. 1986. J. Immunol. 137:3201 37 3204) . Proteaasitekijä Xa pystyy katkaisemaan proteiinisek-venssin, joka sisältää aminohapposekvenssin ile-glu-gly-arg. Katkaiseminen tapahtuu aminohapon arg jälkeen. Näihin sekvensseihin perustuen laadittiin oligonukleotidi (GVRll, 5 kuva 5), joka sisältää IL-l-p:aa koodaavan sekvenssin lisäksi Xa-tekijän katkaisukohdan koodaavan sekvenssin ja 18 nukleotidia A. thalianan oleosiinin 3'-pään koodaavasta alueesta (emäskohdat 742-759). Ιΐι-1-β:η koodaava sekvenssi laadittiin käyttäen B. napuksen ja A. thalianan oleosiinien 10 optimaalista kodonin käyttöä (Taulukko 1).
Taulukko 1 Λ. Thallanan^ ja B. napuksen oleosiinin^ kodonink&yttö TTT phe F 5 TCT ser S 0 ΤΛΤ tyr Y 6 TCT cyn C - TTC phe F 3 TCC ser S 10 TAC tyr Y 11 TGC cys C - ΤΤΛ leu L - TCC aer S 2 TAA OCM Z - TGA ΟΡΛ z - TTG leu L 4 TGA ser S - TAG AMD Z - TGG trp w 2 err lm) I, 10 CCT pro p 3 CAT h le H 4 CGT arg R 6 CTC leu L 11 CCC pro p 1 CAC hie It 6 CGC arg R - CTA leu h - CCA pro p 4 CAA gin Q 4 CGA arg R 1 CTG Igu l, 6 CCG pro p 2 CAG gin Q 17 CGG arg R - • · .:. ATT lie I 7 ACT thr T 11 ΑΛΤ aan N - AGT ser S 5 ATC Ilo I 13 ACC thr T 14 AAC aen N 1 AGC ser S 3 ΑΤΑ Ile I 3 ACA thr Y 7 ΛΛΛ ly e K 5 AGA arg R 5 \\t ATG met M 11 ACG thr T 5 AAG lys K 10 AGG arg R 3 • ••i G TT vai V 11 GCT ala A 17 GAT asp D 8 GGT gly G 0 GTC vai V 9 GCC ala A 2 GAC aep D 19 GGC gly G 9 CTA vai V - GCA ala A 10 GAA glu E 2 GGA gly G 14 GTG vai V - GCG aja A ? GAG gly E 2 GGG gly G 5 ··· • · · • · ·
:,..i 1 Katso kuvio IA
2 Lee ja Huang (1991) Plant Physical 96: 1395-1397 • · · • · *..* 15 C. A. thaliana -oleosiini - IL-l-p-fuusion valmistaminen • » • · • · · *:* Sekvenssin ···· :*·.· 5 ' CACACCAGGAACTCTCTGGTAAGC 3 ’ • · (emäskohdat -838 - -814) perusteella laadittiin oligonukle-20 otidi GVR10 38 5' CACTGCAGGAACTCTCTGGTAAGC 31 GVRlO sisältää Pstl-restriktiokohdan (alleviivattu) kloonauksen helpottamiseksi. Polymeraasiketjureaktion (PCR) 5 avulla monistettiin GVRlO:n ja GVRll välinen alue. Reak-tioseos sisälsi: 16 μΐ dNTPritä (1,25 mM), 10 x PCR -puskuria (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl2, 0,1 % (w/v) gelatiinia), 5 μΐ GVRll:tä (20 μΜ), 1 μΐ Taq-DNA-polymeraasia (1 u/μΐ) ja 64 μΐ H20:ta. Reaktiota suoritettiin 30 10 kierrosta. Kukin kierros käsitti yhden minuutin denaturoinnin 92 °C:ssa, 1 minuutin emäspariutuksen 45 °C:ssa ja 3 minuutin pidennyksen 72 °C:ssa. PCR-reaktio tuotti yhden 1652 nukleotidin fragmentin.
15 D. A. tha.lia.neaa. oleosiini - IL-1-β -fuusion (OBPIL) kloo naaminen 5' Sali - nopaliinisyntaasin (nos) terminaattori - EcoRI 3' -sekvenssi eristettiin pBH21:stä (Clontech -laboratoriot) ja 20 kloonattiin pUC19:n Sal/EcoRI-kohtiin. Plasmidia nimitettiin pTermiksi. (C.-kohdassa kuvattu) 1652 ep:n fragmentti ·;··; eristettiin ja pilkottiin restriktioentsyymeillä PstI ja
Sali. Tämä pätkä kloonattiin pTermiin. Saadulle plasmidille • · · · annettiin nimi pUCOBPILT (kuva 5) . Tämä plasmidi pilkottiin • · · 25 EcoRI:llä ja Pstl:llä ja saatiin katkaistu pUC19-vektori ja **** EcoRI - A. thalianan oleosiini - lL-1-β - nos -PstI -fuusio • · ·
PstI (OBPILT). OBPILT:in täydellinen sekvenssi esitetään • · · ’·* kuvassa 7. OBPILT alakloonattiin pBluescript+:an EcoRI/PstI - kohtiin. Tämä plasmidi (pBIOPILT) pilkottiinn Pstl:llä ja • · · ·.· · 30 HindIII:lla ja Pstl-OBPILT-Hindlll-pätkä alakloonattiin ϊ,.,ϊ binaariseen Agrobacterium-plasmidiin (Bin 19) Bevan, M. 1984.
Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721), joka sisälsi valintamarkkerin • · *..! (neomysiinifosfotransferaasi) ja Pstl-Hindlll kohdat yhden • · • · T kumpaakin. Saatu plasmidi nimitettiin pCGOBPILT:iksi. Kuvassa m ..*·* 35 5 on kaavamainen esitys kloonausprosessista. Kuvauksia erilaisista binaariplasmideista: pGA642 tai 645; An et ai. 1985. EMBO J. 4: 277-288 tai pCGNl558 tai 1559; MacBride ja Summerfeldt. 1990. Plant. Molec. Biol. 14: 269-276.
39 F. pCGOBPILT:in transformaatio Agrobacterium-kantaan EHA101
Yhdellä EHAlOl-pesäkkeellä (Hood et ai. 1986, J. Bact. 5 168:1291-1301) ympättiin 5 ml LB + 100 pg/ml kanamysiiniä.
Tätä viljelmää kasvatettiin 48 tuntia 28 °C:ssa. Tällä 5 ml viljelmällä ympättiin 500 ml LB + 100 pg/ml kanamysiiniä. Tätä viljelmää kasvatettiin 28 °C:ssa, kunnes viljelmä saavutti optisen tiheyden 600 = 0,5 (noin 4 tuntia). Solut 10 sentrifugoitiin pohjalle (10 min, 5000 x g) ja suspendoitiin uudelleen 500 ml:aan steriiliä H20:ta (toistettiin 2 x) . Solut sentrifugoitiin taas ja suspendoitiin uudelleen 3 ml:aan steriiliä H20:ta, joka sisälsi 10 % glyserolia. 40 μΐ soluista jaettiin eriin Eppendorf-putkiin ja joko käytettiin 15 suoraan elektroporaatioon tai säilytettiin -80 °C:ssa tulevaa käyttöä varten. Elektroporaatio suoritettiin Bowerin et ai. (Nucl. Acid. Res. 1988. 16:6127 - 6145 mukaan.
Pulssigeneraattori säädettiin 25 uF varaajalle, 2,5 kV:iin ja 200 ohmiin rinnan näytekammion kanssa.
20 G. Nicotiana tabacumin transformointi pCGOBPILT:illä • · pCGOBPILT:in sisältävä EHA 101 käytettiin tupakan lehti- • · · · kiekkojen transf ormointiin. Kahdeksasta kymmeneen sentti- • · m 25 metrin pituisia tupakanlehtiä otettiin kasvihuoneessa kas- ***I vatetuista kasveista, steriloitiin 70 % etanolissa 20 s ja • · · *”* sen jälkeen 10 % valkaisuaineessa (esim. Javex) 8 min. Lehdet • · · *·* * huuhdottiin sitten 6 kertaa steriilillä vedellä. Lehtien reunat ja keskisuoni poistettiin ja jäljelle jääneet lavat • · · · 30 jaettiin 5 x 7 mm suorakulmioiksi tai halkaisijaltaan 5 mm • · · kiekoiksi. Noin 30 lehtikiekkoa kerättiin ja asetettiin pienelle petrimaljalle. Agrobacterium-liuosta kaadettiin • · \.I sitten tupakkakiekkojen päälle ja inkuboitiin 9 minuuttia.
• ·
Lehden palaset painettiin sitten steriilille Whatmanin 35 suodatinpaperille ja asettetiin abaksiaalinen puoli alaspäin kasvatusaineeseen I (MS, 3 % sakkaroosia ja 2 mg/1 2,4-D:tä). Yhteiskasvatus kesti seuraavat 48 tuntia. Sitten lehtikiekot siirrettiin seulontakasvatusaineeseen (MD, 3 % sakkaroosia, 40 2,5 mg/1 Ba, 0,1 mg/1 NAA, 500 mg/1 karbenisilliinia ja 100 mg/1 kanamysiiniä) , johon ne jätettiin seuraaviksi 3-4 viikoksi. Versojen alettua kasvaa ne leikattiin ja pantiin juurtumisalustaan (MS, 3 % sakkaroosia, 0,1 mg/1 NAA, 500 5 mg/1 karbenisilliinia ja 50 mg/1 kanamysiiniä). Kun oli muodostunut riittävästi juuria, tupakkataimet siirrettiin multaan.
H. B. napuksen transformointi pCGOBPILTsillä 10 B. napuksen transformointi suoritettiin Moloneyn et ai. mukaan, 1989. Plant Cell Rep. 8:238-242, joka artikkeli sisällytetään tähän viittauksena.
15 Transformaatioprosessi
Yksittäisiä Agrobacterium tumefaciens -kannan EHA 101 pesäkkeitä, jotka sisältävät binaariplasmidin, kasvatettiin yön yli 28 °C:ssa AB-kasvatusalustassa. 50 μ1:η näytettä tästä 20 suspensiosta kasvatettiin yön yli 28 °C:ssa 5 ml:ssa MG/L -lientä, johon oli lisätty sopivat antibiootit. Tämä *j··· bakteerisuspensio pelletoitiin sentrifugoimalla 15 min 10 000 x g:ssä ja suspensoitiin sitten uudelleen 10 ml: aan MS- • ·· · kasvatusalustaa, joka sisälsi 3 % sakkaroosia, pH:ssa 5,8. 5 ♦ · · 25 cm:n petrimaljan pohja peitettiin ohuella kalvolla tätä **** suspensiota. Yksittäisiä irti leikattuja sirkkalehtiä otet- • · · ·*” tiin yllä kuvatuilta maljoilta, ja niiden petiolien leikattu • · · *·* * pinta upotettiin tähän bakteerisuspensioon muutamaksi sekunniksi. Ne siirrettiin välittömästi takaisin samoille MS- ··· · 30 maljoille, joilta ne oli otettu. Sirkkalehtiä viljeltiin : Agrobacteriumin kanssa 72 h. Ravintosolukerrosta ei käytetty.
»· · • · · • · *.,I Yhteisvil j elyn jälkeen sirkkalehdet siirrettiin regeneroin- • · ’*;·* tialustaan, joka käsitti MS-alustan, johon oli lisätty 20 μΜ
35 bentsyyliadeniinia, 3 % sakkaroosia, 0,7 % fytoagaria, pH
:*·.· 5,8, ja 500 mg/1 karbenisilliiniä (Pyopen, Ayerst) ja 15 mg/1 • m kanamysiinisulfaattia (Boehringer - Mannheim). Petiolit upotettiin taas huolellisesti agariin noin 2 mm syvyyteen.
41
Maljaustiheys pidettiin 10 istukkaana maljaa kohti. Suuremmat tiheydet vähentävät regeneraatiofrekvenssiä.
Valinta ja kasvien regenerointi 5
Istukkaita pidettiin regenerointialustassa yllä kuvatuissa valo- ja lämpöoloissa 2-3 viikkoa. Tänä aikana yli puolessa istukkaista ilmeni monia versoja, ja kallusta muodostui suhteellisen vähän. Jotkut näistä versoista valkaistuvat 10 neljännen viljelyviikon aikana. Jäljelle jääneitä vihreitä versoja siirrettiin erillään viljeltäviksi verson pituuskasvualustalle, joka oli samaa kuin regeneraatioalusta, mutta ilman bentsyyliadeniinia. Viikko tai kaksi tällä alustalla mahdollisti apikaalisen dominanssin vakiintumisen 15 muodostuneissa versoryppäissä. Näin saadut versot siirrettiin "juurtumis"alustalle, joka sisälsi MS-alustaa, 3 % sakkaroosia, 2 mg/1 indolibutyraattia, 0,7 % fytagaria ja 500 mg/1 karbenisilliiniä. Tässä vaiheessa ei käytetty lainkaan kanamysiiniä, koska havaittiin, että juuret muodostuivat 20 nopeammin ilman valintatekijää, ja vain muutamia "karkulaisia" onnistui juurtumaan kahden valintakierroksen -·;··· regeneraatioalustalla ja verson pituuskasvualustalla jälkeen.
• · · · • · • · · • · · I 25 I. OBPILT:in integrointi pysyvästi tupakan ja B. napuksen **** genomeihin • · · ···· • · · • · · '·* * Oletetut transformoidut kasvit testattiin neomysiinifosfo- transferaasiaktiivisuuden suhteen. Kasveista, joissa tätä • · · · 30 aktiivisuutta oli, eristettiin genomista DNA:ta. Suoritettiin
Southern-blottaus sen osoittamiseksi, että T-DNA-rajojen ;·]·. väliset sekvenssit (OBPILT ja neomysiinif osf otransf e- • · raasigeeni) olivat integroituneet pysyvästi B. napuksen ja *” tupakan genomeihin. Tupakka-Southern koetettiin A. thalianan ,.*·* 35 oleosiinigeenillä ja neomysiinin f osf otransf eraasigeenillä.
: B. napus -Southern koetettiin neomysiinifos- • · fotransferaasigeenillä.
42 J. Oleosiini-IL-p-fuusion ilmentyminen tupakkakasveissa
Transformoiduista ja transformoimattomista kasveista saaduista kehittyvistä alkioista eristettiin RNA:ta. Suoritet-5 tiin Northern-blottaus käyttäen A. thalianan oleosiinia geenikoettimena. Kaikista testatuista transformoiduista kasveista voitiin osoittaa 850 nukleotidin transkripti. Näiden transkriptien koko vastaa oleosiini-IL-l-0-mRNA:n odotettua kokoa. Näitä transkripteja ei voitu osoittaa 10 transformoimattomista kasveista.
K. Oleosiini-IL-l-p-proteiinin kertyminen Ö1jyonteloproteiinit eristettiin transformoiduista tupakan-15 siemenistä (Holbrook et ai. 1991. Plant Physical 97:1051- 1058). Tehtiin PAGE ja proteiini siirrettiin geelistä PVDF-kalvoille. Vasta-ainetta, joka tehtiin antigeeninä B. na-puksen 22 kD:n oleosiini, käytettiin oleosiini-IL-O-fuusi-oiden löytämiseen tupakansiemenistä. Tämä vasta-aine tun-20 nistaa kaikki tärkeimmät B. napuksen ja A. thalianan ole- osiinit. Lisäksi tämä vasta-aine tunnistaa tupakan ole-·;··· osiinit. Tupakan oleosiinit ovat eri kokoisia kuin A. tha-
Hanan ja B. napuksen oleosiinit. Transformoiduissa tupa- • · · · kansiemenissä anti- 22 kD -vasta-aine tunnisti 20 kD:n • · · *#je 25 proteiinin, jota ei ollut transformoimattomissa tupakan- •**| siemenissä. Oleosiini-IL-p-fuusion odotettu koko on 20,1 kD.
··· •••j Taulukossa 2 on yhteenveto tuloksista.
• · · • · ·
Ilmentämällä haluttua peptidiä liittyneenä johonkin öljyon- • · · ·.· · 30 teloproteiiniin tai sen osaan, joka riittää öljyonteloihin pääsemiseen, haluttu peptidi voidaan puhdistaa helposti olen- :·*·. naisesti puhtaaksi muista solun osista. Fuusioproteiini • · *..I voidaan katkaista puhdistamisen jälkeen, tai sitä voidaan • · • · *:* käyttää katkaisematta. Tämän keksinnön menetelmät ja koos- #>*j* 35 tumukset tarjoavat nopean, yksinkertaisen menetelmän kiin- :\j nostuksen kohteena olevan polypeptidin puhdistamiseksi.
43
Kaikki tässä selvityksessä mainitut julkaisut ja patenttihakemukset liitetään täten tähän viittaamalla, samassa määrin, kuin jos jokainen yksittäinen julkaisu ja patenttihakemus olisi erikseen mainittu viittaamalla hakemukseen liitetyksi.
5
Kun keksintö nyt on kokonaan kuvattu, alan tavanomaiset taidot omaaville on ilmeistä, että keksintöön voidaan tehdä monia muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta liitteenä olevien patenttivaatimusten hengestä ja alasta.
10
Taulukko 2
Ilmentymistulosten yhteenveto1 15 Pysyvä Oleosiini- 20 kD:n integraatio- IL-lb:n proteii nin
Southern- ilmentyminen löytymi nen 20 blottaus Northern- Western -blottaus -blottaus • · ··· • 1 " ............ 1 " 1 — ......
···· B. napus: • · · • · ,·. 25 transformoimaton - ei test. ei test.
’*’* transformantti #12 + ei test. ei test.
··· ···· • · · • · · *·* * Tupakka: transformoimaton - + + ··· ·.· · 3 0 transf ormant ti A + + + • · · ;...ϊ transf ormant ti B + + + transf ormant ti G + + + • · '··· transf ormant ti L + + + • · • · • · · ··· ---- • ‘Γ*. kysyvä integroituminen, kuten määritelty edellä kohdassa I.
·.*·: Oleosiini-lL-l-b -fuusion ilmentyminen, kuten määritelty edellä kohdassa J. Oletettu oleosiini-lL-l-b-fuusioproteiini tunnistettiin edellä kohdassa K kuvatulla tavalla. Ei test. = ei testattu.
Claims (22)
1. Kimeerinen DNA-konstrukti, joka koodaa kimeeristä poly-peptidiä, tunnettu siitä, että se käsittää: 5 a) ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa ainakin öljyonte-loproteiinin hydrofobista ydintä ja joka on riittävä suuntaamaan fuusiopolypeptidin öljyonteloon, ja b) toisen peptidiä koodaavan DNA-sekvenssin, jolloin 10 mainittu peptidi on muu kuin öljyontelossa luonnossa esiintyvä polypeptidi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kimeerinen DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen: 15 vektori-DNA:n, johon sisältyy ainakin yksi säätelysekvenssi toimivasti liittyneenä mainittuun kimeeriseen DNA-sekvens-siin, joka kykenee suuntaamaan mainitun kimeerisen DNA: n replikaation isäntäsolussa. 20
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen kimeerinen DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että mainittu säätelysekvenssi kykenee myös • · . ohjaamaan mainitun kimeerisen DNA:n ilmentymistä isän- ··· ···· täsolussa. • · • · · *.*.· 25 ..ΙΓ
4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen kimeerinen DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että mainittu DNA on cDNA: ta. ··· • · · • · ·
5. Ilmentymiskasetti, tunnettu siitä, että se käsittää osi-30 naan, transkription suunnassa: »·· • · • · ·] - säätelevän DNA-sekvenssin, johon sisältyy siemenissä ilmen- tyvän geenin translaation aloituskohdan 5'-puolelta osa, joka ··· ♦...· riittää aiheuttamaan sen, että DNA-sekvenssi ilmentyy sieme- .···. 35 nissä, • · t·· - kimeerisen DNA-sekvenssin, joka koodaa kimeeristä polypep-tidiä ja joka käsittää • · (a) ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodaa ainakin hydrofobista ydintä, joka on riittävä suuntaamaan kimeerisen polypeptidin öljyonteloon, mainitun ensimmäisen DNA-sekvens- 5 sin sisältäessä ainakin yhden restriktiokohdan, ja (b) toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa peptidiä, jolloin mainittu peptidi on muu kuin luonnostaan öljyontelossa esiintyvä, ja 10. translaation ja transkription lopetuskohdat, jolloin mainitut osat ovat liittyneinä yhteen toimivasti ja mainitun kimeerisen DNA-sekvenssin ilmentymistä säätelee mainittu säätelevä DNA-sekvenssi. 15
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ilmentymiskasetti, tunnettu siitä, että mainittu säätelevä DNA-sekvenssi on viljakasvin siemenen solussa ilmentyvästä geenistä.
7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen ilmentymiskasetti, tunnettu siitä, että mainittu säätelevä DNA-sekvenssi on . öljyonteloproteiinin geeni. • · • » · •••j
8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ilmentymiskasetti, jossa • · · *.*.* 25 ainakin joko mainittu säätelevä DNA-sekvenssi tai mainittu ensimmäinen DNA-sekvenssi on Arabidopsis thalianan genomista. • · · • · · · :T:
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-8 mukainen ilmenty miskasetti, tunnettu siitä, että mainittu ilmentymiskasetti 30 sisältää ainakin yhden restriktiokohdan välillä juuri alkume- .···. tioniinin 5'-puolelta mainitun öl jyonteloproteiinin geenin • · *·* translaation lopetussignaalin 5'-puolelle. • · · • · · • · · • · ·
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen ilmentymiskasetti, tun-.···. 35 nettu siitä, että mainittu restriktiokohta on synteettinen restriktiokohta. • ·
11. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-10 mukainen ilmen- tymiskasetti, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää oligonukleotidiadapterin, joka koodaa mainittuun restriktiokohtaan insertoitua proteaasin tunnistuskohtaa. 5
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen ilmentymiskasetti, tunnettu siitä, että mainittu proteaasi on kollagenaasi.
13. Menetelmä kiinnostuksen kohteena olevan peptidin ilmen-10 tymisen tuottamiseksi siemenessä, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä käsittää: isäntäkasvisolun transformoimisen minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-12 mukaisella ilmentymiskasetilla tai minkä 15 tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella DNA-konstruktilla genomisen integraation olosuhteissa.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua kasvia kasvatetaan siemenen tuotta- 20 miseksi, jolloin mainittu kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi ilmentyy kimeerisenä proteiinina, jonka ilmen- , tymistuote on mainittu öljyonteloproteiinin geeni. • · ··«
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu • · *.*.* 25 siitä, että se lisäksi käsittää: mainitun kimeerisen proteiinin eristämisen mainitun siemenen solujen öljy- *ϊ* onteloista. ···♦ • · · • · ♦ • · ·
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, jossa mainittu 30 eristäminen käsittää: • · · m ··· • · • · *Γ* mainittujen siementen solujen hajottamisen mainittujen öljy- onteloiden vapauttamiseksi ja; • · · mainittujen öl jyonteloiden rikkomisen, jolloin mainittu .···. 35 kimeerinen proteiini vapautuu. • · ··· • «
17. Patenttivaatimuksen 15 tai 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu eristäminen lisäksi käsittää: mainitun kimeerisen proteiinin saattaminen kontaktiin sellaisen proteaasin kanssa, joka pystyy tunnistamaan mainitussa kimeerisessä proteiinissa ennen mainitun, 5 kiinnostuksen kohteena olevan peptidin N-päätä sijaitsevan proteaasin tunnistuskohdan.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää: 10 ennen mainittua kontaktiin saattamista mainitun kimeerisen proteiinin sitomisen kiinteään kantajaan, joka käsittää vasta-aineen, joka pystyy sitoutumaan mainitun öljy-onteloproteiinin geenin ilmentymistuotteeseen. 15
19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää mainitun kiinnostuksen kohteena olevan peptidin puhdistamisen.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kiinnostuksen kohteena . oleva peptidi on muu kuin kasvigenomin koodaama peptidi. • · • · ·
21. Tupakan tai Brassica Napuksen siemen, kasvi tai • · * * * *.*.* 25 kasvisolu, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-12 mukaisen ilmentymiskasetin tai minkä ..*·* tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen DNA-konstruktin. • · · • · · • · ·
22. Kimeerinen polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää 30 ainakin öljyonteloproteiinin hydrofobisen ytimen, ja joka on .··♦. riittävä suuntaamaan kimeerisen polypeptidin öljyonteloon, ja • 9 *·* toisen polypeptidin, ja jota mainittua kimeeristä • · · polypeptidiä ilmentää minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-12 ··· ·...· mukainen ilmentymiskasetti tai minkä tahansa .*··. 35 patenttivaatimuksen 1-4 mukainen kimeerinen DNA-konstrukti. • ♦ ·»· • ·
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI944841A FI120266B (fi) | 1992-04-15 | 1994-10-14 | Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CA9200161 | 1992-04-15 | ||
PCT/CA1992/000161 WO1993021320A1 (en) | 1991-02-22 | 1992-04-15 | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants |
FI944841A FI120266B (fi) | 1992-04-15 | 1994-10-14 | Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa |
FI944841 | 1994-10-14 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI944841A0 FI944841A0 (fi) | 1994-10-14 |
FI944841A FI944841A (fi) | 1994-12-14 |
FI120266B true FI120266B (fi) | 2009-08-31 |
Family
ID=32778493
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI944841A FI120266B (fi) | 1992-04-15 | 1994-10-14 | Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0636179B1 (fi) |
JP (1) | JP3639592B2 (fi) |
KR (1) | KR950700992A (fi) |
AT (1) | ATE277180T1 (fi) |
CA (1) | CA2118113C (fi) |
DE (1) | DE69233416T2 (fi) |
DK (1) | DK0636179T3 (fi) |
ES (1) | ES2227511T3 (fi) |
FI (1) | FI120266B (fi) |
NO (1) | NO323038B1 (fi) |
WO (1) | WO1993021320A1 (fi) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5650554A (en) * | 1991-02-22 | 1997-07-22 | Sembiosys Genetics Inc. | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants |
US7091401B2 (en) | 1991-02-22 | 2006-08-15 | Sembiosys Genetics Inc. | Expression of epidermal growth factor in plant seeds |
US5869602A (en) | 1995-03-17 | 1999-02-09 | Novo Nordisk A/S | Peptide derivatives |
US5824870A (en) * | 1995-11-06 | 1998-10-20 | Baszczynski; Chris | Commercial production of aprotinin in plants |
WO1998021348A1 (en) * | 1996-11-12 | 1998-05-22 | Battelle Memorial Institute | Method of producing human growth factors from whole plants or plant cell cultures |
US5856452A (en) | 1996-12-16 | 1999-01-05 | Sembiosys Genetics Inc. | Oil bodies and associated proteins as affinity matrices |
FR2757874B1 (fr) * | 1996-12-17 | 2003-04-25 | Biocem | Collagenes recombinants et proteines derivees produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations |
US7585645B2 (en) * | 1997-05-27 | 2009-09-08 | Sembiosys Genetics Inc. | Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products |
US7008664B1 (en) * | 1998-06-11 | 2006-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for improving the carcass quality of an animal |
GB2364705A (en) * | 2000-07-14 | 2002-02-06 | Icgeb | Fusion protein expression in plastids |
WO2004113540A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-29 | The University Of York | Expression of heterologous protein |
US11311574B2 (en) | 2003-08-08 | 2022-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
EP1934350B1 (en) * | 2005-10-19 | 2018-04-18 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Polyoleosins |
CA2655764A1 (en) * | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Basf Se | Protein targeting to lipid bodies |
CN114409729B (zh) * | 2021-11-11 | 2023-06-20 | 南京财经大学 | 一种菜籽肽及其在制备药物纳米载体方面的应用 |
-
1992
- 1992-04-15 DE DE69233416T patent/DE69233416T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-15 EP EP92908088A patent/EP0636179B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-15 AT AT92908088T patent/ATE277180T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-04-15 WO PCT/CA1992/000161 patent/WO1993021320A1/en active Search and Examination
- 1992-04-15 JP JP50792492A patent/JP3639592B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-15 CA CA002118113A patent/CA2118113C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-15 ES ES92908088T patent/ES2227511T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-15 DK DK92908088T patent/DK0636179T3/da active
-
1994
- 1994-10-14 FI FI944841A patent/FI120266B/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-10-14 NO NO19943914A patent/NO323038B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-10-15 KR KR1019940703672A patent/KR950700992A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU678136B2 (en) | 1997-05-22 |
DE69233416T2 (de) | 2005-03-03 |
FI944841A (fi) | 1994-12-14 |
EP0636179B1 (en) | 2004-09-22 |
EP0636179A1 (en) | 1995-02-01 |
CA2118113A1 (en) | 1993-10-28 |
WO1993021320A1 (en) | 1993-10-28 |
NO323038B1 (no) | 2006-12-27 |
FI944841A0 (fi) | 1994-10-14 |
DK0636179T3 (da) | 2004-12-20 |
JPH07507199A (ja) | 1995-08-10 |
CA2118113C (en) | 2002-01-08 |
ATE277180T1 (de) | 2004-10-15 |
NO943914D0 (no) | 1994-10-14 |
JP3639592B2 (ja) | 2005-04-20 |
NO943914L (no) | 1994-12-09 |
KR950700992A (ko) | 1995-02-20 |
AU1583292A (en) | 1993-11-18 |
DE69233416D1 (de) | 2004-10-28 |
ES2227511T3 (es) | 2005-04-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI120266B (fi) | Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa | |
US5650554A (en) | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants | |
US5948682A (en) | Preparation of heterologous proteins on oil bodies | |
US5487991A (en) | Process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants | |
FI120314B (fi) | Öljyonteloproteiini-cis-elementit säätelysignaaleina | |
JP3232068B2 (ja) | 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法 | |
US6753167B2 (en) | Preparation of heterologous proteins on oil bodies | |
Saalbach et al. | A chimeric gene encoding the methionine-rich 2S albumin of the Brazil nut (Bertlrolletia excelsa HBK) is stably expressed and inherited in transgenic grain legumes | |
US6777591B1 (en) | Legume-like storage protein promoter isolated from flax and methods of expressing proteins in plant seeds using the promoter | |
ZA200103557B (en) | Novel expression cassette for expressing genes in plant seed. | |
US6288304B1 (en) | Expression of somatotropin in plant seeds | |
KR20050024419A (ko) | 식물 소포체 파생적 단백질체들 내의 축적에 의한 펩티드및 단백질들의 생산 | |
CA1337048C (en) | Process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants | |
JPH04229182A (ja) | 新規シグナル配列 | |
US5670635A (en) | Seed storage protein with nutritionally balanced amino acid composition | |
EP0319353B1 (en) | A process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants | |
RU2201449C2 (ru) | Слитый полипептид, способный к целенаправленному переносу к масляному телу, химерная днк-контрукция, экспрессирующая кассета | |
AU678136C (en) | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants | |
JP3927975B2 (ja) | 植物中の高価値ペプチドの担体用の油体タンパク質 | |
US20040117874A1 (en) | Methods for accumulating translocated proteins | |
EP0723019A1 (en) | A process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants | |
KR100333315B1 (ko) | 식물에서 가치있는 펩타이드의 운반체인 기름체 단백질 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: SEMBIOSYS GENETICS INC. |
|
FG | Patent granted |
Ref document number: 120266 Country of ref document: FI |
|
MM | Patent lapsed |