KR100333315B1 - 식물에서 가치있는 펩타이드의 운반체인 기름체 단백질 - Google Patents

식물에서 가치있는 펩타이드의 운반체인 기름체 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종자세포에서 목적 폴리펩타이드를 기름체 단백질과의 융합 단백질로 발현시키기 위한 구조물 및 방법에 관한 것이다. 본 방법에 의해 융합 단백질은 종자 세포의 기름체에 표적된다. 종자 세포를 용혈시킨 후, 예를 들면 분배/기름체의 표면특성을 이용하여 기름체를 다른 세포 물질로부터 쉽게 분리할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들면 그 기름체 단백질에 대한 항체를 이용한 친화력 크로마토그래프 등에 의해 분리될 수 있다. 필요하다면, 예를 들면 기름체 단백질에서 목적 폴리펩타이드의 N-말단 앞에 있는 단백질 분해효소 인식 자리를 인식할 수 있는 단백질 분해효소로 융합단백질을 처리하여 목적 폴리펩타이드를 회수할 수 있다.

Description

식물에서 가치있는 펩타이드의 운반체인 기름체 단백질{OIL-BODY PROTEINS AS CARRIERS OF HIGH-VALUE PEPTIDES IN PLANTS}
본 발명은 제조합 기술에 의해, 숙주 세포의 구성성분으로부터 쉽게 정제되는 목적 유전자의 생산방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 식물, 특히 종자에서, 목적 단백질을 기름체 단백질과 목적 단백질로 이루어지는 키메라 펩타이드로 발현시키는 것에 의해 예시된다.
많은 단백질이 식물에서 발현되었다. 그러나 외래 단백질을 식물에서 발현시키는 것은 일반적으로 가능하나, 그 단백질을 정제하여 얻는데는 제약이 있었다.이러한 제약의 예로는 식물에서 유래된 물질이 실질적으로 포함되지 않은 정제 단백질을 얻기 위한 정제 단계와, 얻어진 재조합 단백질이 완충 수용액에 접하는 경우 얻어진 추출물이 정제 단계에서 잘려진다는 점이 있다.
완두, 평지, 해바라기와 같이 유지종자를 가지는 식물과, 옥수수, 당근 등과 같은 식물은 종자에 트리글리세라이드를 저장한다. 이러한 식물에서 트리글리세라이드는 종자의 수정 및 그 이후의 발아에서 에너지로 사용된다. 트리글리세라이드는 식품 및 식품가공에서 식물성 기름으로 널리 이용되며, 산업계에서도 여러 용도로 사용된다.
트리글리세라이드는 물에 분산되며 수용액의 표면에 뜨거나 액상에서 작은 원형이나 라이포좀을 형성하여 현탁액으로 되므로 분배된다. 이러한 원형은 표면층을 변형시켜 안정화시키지 않으면 자연스럽게 서로 뭉친다. 뭉쳐진 덩어리는 다양한 크기의 원형의 현탁액으로 존재할 수 있다. 종자에 트리글리세라이드가 저장될 때, 종에서 이러한 기름 구는 지방 또는 지방체로 거의 일정한 크기로 완전히 싸여져 있다. 이러한 기름체의 표면에 연관되어, 일반적으로 기름체 단백질이라고 불리는 여러 종류의 단백질이 절반 단위막(half-unit membrane)에 묻혀 있다.
최소한 한 군의 기름체 단백질은 각 종 사이에서 매우 보존된 특성을 가진다. 이 기름체 단백질군은 올레오신(oleosin)이라고 불리운다. 이 단백질의 친수성 N-말단과 C-말단은 매우 분기되어 있으나, 중심부의 친지성 내부영역은 종 사이에 잘 보존되어 있다. 올레오신은 이 중심부의 친지성때문에 주요부분이 기름체에 강하게 연관되어 있다. 따라서, 올레오신과 같은 기름체 단백질이 식물에서 유래된물질로부터 재조합 단백질을 분리하는 수단을 제공함에 의해 재조합 단백질의 생산방법에 유용한지 여부를 결정하는 것은 흥미롭다.
식물에서 외래 (재조합) 펩타이드를 생산하는 것은 강한 구조성(constitutive) 식물 프로모터 (cauliflower mosaic virus-Sijmons et al. (1990) Bio/Technology, 8:217-221)와 외래 단백질의 지정; 기관 특이적 서열과의 전사에서의 융합 (Radke et al. (1988) Theoret. Appl. Genet., 75:685-694); 재조합 단백질 서열이 잘라지는 것이 필요한 번역 단계에서의 융합 (Vander Kerkove et al. (1989) Bio/Technology, 7:929-932)을 포함하는 다양한 접근을 통해 연구되어 왔다. 식물 세포에서 발현된 외래 단백질에는 박테리아에서 유래된 것 (Fraley et al. (1983). Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA, 80:4803-4807), 동물에서 유래된 것 (Misra and Gedamu (1989) Theor. Appl. Genet., 78:161-168) 곰팡이 및 다른 식물에서 유래된 것 (Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 80:4803-4807)이 있다.
보통 인테그레이션의 마커인 몇몇 단백질은 종자 특이적인 것 몇개를 포함하여 조직특이적이다 (Sen Gupta-Gopalan et al. (1985) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 82:3320-3324; Radke et al. (1988) Thero. Appl. Genet., 75:685-694). 이들 보고는 종자 저장 단백질의 프로모터를 종자 특이적 발현을 위한 수단으로 사용하고자 하는 것에 특히 집중되었다. 이러한 시스템을 이용하여 가치 있는 펩타이드 (leu-enkephalin)를 Arabidopsis thaliana와 Brassica napus에서 발현시키는 것이 보고되었다 (Vanderkerkove et al. (1989) Bio/Technology, 7:929-932). 이 펩타이드의 수율은 매우 낮았지만 동물 펩타이드 호르몬이 식물 조직에서 발현될 수 있음을 입증하였다. 옥수수 올레오신 유전자로 형질전환된 Brassic napus의 종자 기름체에서 옥수수 올레오신이 발현되었다. 이 유전자의 발현은 주요 종자 저장 단백질인 내핀 (napin)을 지정하는 Brassica 유전자에서 유래된 조절 요소에 의해 조절되었다. 내핀 유전자의 프로모터/터미네이터에 맞게 정정된, 발현의 일시적인 조절 및 조직 특이성이 보고되었다 (Lee et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1991) 88: 6181-6185).
종자에서 생산되는 기름구는 모두 비슷한 크기이며 이것은 이들이 안정하다는 것을 나타낸다 (Huang A.H.C. (1985) Modern Meths. Plant Analysis. Vol. 1:145-151, Springer-Verlag, Berlin). 더욱 자세한 연구에 의해 이들은 단순히 기름구가 아니라 막으로 둘러 싸인 기름체라는 것을 알게 되었다. 이러한 기름체는 전자 현미경 학자들에 의해 올레오솜, 지방체 및 스페로솜이라고 불리운다 (Gurr MI. (1980) The Biochemistry of Plant, 4:205-248, Acad. Press, Orlando, Fla). 몇 종류의 기름체가 연구되었으며 이들이 전형적인 지질 이중층이 아닌, 안쪽에는 소수성 기를 가지고 바깥쪽에는 친수성기를 가지는 단일 부정형층으로 이루어지는 독특한 절반 단위막(half unit membrane) 으로 피복되어 있음을 알게 되었다 (Huang A.H.C. (1985) Modern Meths. Plant Analysis, Vol. 1:145-151, Springer-Verlag, Berlin).
지질체의 함량을 분석한 걸과 트리글리세라이드와 막 성분외에, 기름체의 표면 또는 내강에 연관되어 있는 몇 종류의 폴리펩타이드/단백질도 있음을 알게 되었다 (Bowman-Vance and Huang (1987) J. Biol. Chem., 262:11275-11279; Murphy et al. (1989) Biochem. J., 258:285-293; Taylor et al. (1990) Planta, 181:18-26). 기름체 단백질은 형태학적으로 분화된 넓은 종 사이에서 동일하였으며 (Moreau et al. (1980) Plant Physiol., 65:1176-1180; Qu et al. (1986) Biochem. J., 235:57-65), 기름체에 유일하게 존재하며 식물 조직의 소기관에서는 발견되지 않았다. Brassica napus (평지)에는 발육 중인 종자의 기름체에 연관된 폴리펩타이드가 최소한 3개 있다 (Taylor et al. (1990), Planta, 181:18-26). 기름체와 연관된 단백질의 수와 크기는 종 마다 다르다. 예를 들면, 옥수수에서는 기름체에서 면역학적으로 구별되는 폴리펩타이드 군이 2 개 있다 (Bowman-Vance and Huang (1988) J.Biol. Chem., 263:1476-1481). 올레오신은 친수성, 소수성 및 친수성 부위가 번갈아 있다 (Bowman-Vance and Huang (1987) J.Biol. Chem., 262:11275-11279). 옥수수, 평지씨 및 당근의 올레오신의 아미노산 서열이 알려져 있다 (각각 Qu and Huang (1990) J. Biol. Chem., 25:2238-2243; Hatzopoulos et al. (1990) Plant Cell, 2:457-467). 평지씨와 같은 유지종자에서는 올레오신이 전체 종자 단백질의 약 8% (Taylor et al. (1990) Planta, 181:18-26) 내지 20% (Murphy et al. (1989) Biochem. J., 258:285-293)를 차지한다. 이러한 수치는 많은 저장 단백질의 수치와 비교될 수 있다.
기름체 단백질을 지정하는 유전자는 옥수수 (Zea mays, Bowman-Vance and Huang (1987) J.Biol. Chem., 262:11275-11279; Qu and Huang (1990) J. Biol. Chem., 25:2238-2243)와 당근 (Hatzopoulos et al. Plant Cell, 2:457-467)에서 보고되었다.
본 발명은 숙주 단백질로부터 쉽게 정제될 수 있는 펩타이드를 생산하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 종자 특이적 기름체 단백질 유전자의 지정서열 또는 최소한 기름체 단백질의 소수성 코어 부분과, 목적 펩타이드의 지정서열로 이루어지는 기름체 특이적 서열을 지정하는 서열을 포함하는 키메라 DNA 구조물을 준비하여, 그 키메라 DNA 구조물을 포함하는 발현 카세트를 준비하는 단계; 게놈 인테그레이션이 가능한 조건에서 숙주 세포를 상기 발현 카세트로 형질전환시키는 단계; 및 목적하는 폴리펩타이드가 올레오신과의 융합단백질로 발현되는 종자를 생산하도록, 얻어진 트랜스제닉 식물을 재배하는 것으로 이루어진다.
목적 폴리펩타이드는 상기 종자 세포에서 기름체를 분리하고, 융합단백질이 해리되도록 기름체를 으깨어 정제할 수 있다. 이렇게 하면 기름체 단백질이 다른 단백질 및 식물에서 유래된 물질로부터 상 분리에 의해 쉽게 분리된다. 선택적으로, 절단자리는 융합 폴리펩타이드가 절단되고 상 분리에 의해 그 펩타이드 부분으로 분리될 수 있도록, 폴리펩타이드의 N-말단 앞에 또 C-말단 뒤에 최소한 하나 있을 수 있다. 따라서, 생산 시스템은 기름체에 대한 기름체 단백질 기능을 제공함에 위해 키메라 펩타이드를 지향시키고, 따라서 목적 폴리펩타이드를 빠르게 분리될 수 있게 한다. 생산 시스템은 약학적, 효소적, 물성적 또는 부착성 특성이 있는 많은 펩타이드 생산에 유용하다.
제 1A 도는 Arabidopsis thaliana에서 얻은 기름체 단백질 유전자 (올레오신)의 뉴클레오타이드 서열과 이것에서 유추된 아미노산 서열 (17kDa)을 나타낸다. 밑줄 그은 부분은 정방향 반복서열 (R1, R2), 역방향 반복서열 (T), CACA, TATA, TAAT 및 폴리아데닐화 신호를 나타낸다. 인트론은 소문자로 나타내었으며, 추정되는 ABA-결합 자리는 굵은 글씨로 나타내었다.
제 1B 도는 단백질에서 보존된 부분과 진화된 부분을 나타내면서, 당근 기름체의 16Kd 단백질 서열, 옥수수 기름체의 18 Kd 및 16 Kd 올레오신 단백질 서열과, Arabidopsis thaliana 의 17 Kd 기름체 단백질의 서열을 비교한 것이다.
제 2 도는 외래 펩타이드를 지정하는 유전자와 기름체 단백질 유전자를 융합하는데 사용되는 구조물이다. IA 는 원하는 펩타이드를 OPB의 C-말단에 융합시킨 것이다. IB는 원하는 펩타이드를 OPB의 N-말단에 융합시킨 것이다. II는 원하는 펩타이드를 기름체 단백질 내로 내부 융합시킨 것이다. III은 원하는 펩타이드를 실질적으로 완전한 두 개의 기름체 단백질 사이에 넣은 사이-이원체 (inter-dimer) 번역상 융합체이다. 그림 (A)의 위쪽에, 원하는 펩타이드를 기름체 단백질에 번역상 융합시키는데 사용되는 DNA 구조물이 보인다. 그림 (B)의 아래쪽에, 유전자 산물의 구조가 나타나 있는데, 번역의 윗부분과 기름체 단백질로의 이동이 보인다. 이 그림에서 중요한 점은 다음과 같다: 왼쪽 아래-오른쪽 위로 빗금쳐진 박스는 OPB의 프로모터 또는 종자 특이적인 다른 프로모터를 나타내고, 오른쪽 아래-왼쪽 위로 빗금쳐진 박스는 원하는 펩타이드의 지정서열을 나타내고, 횐색 박스 부분은 기름체 단백질 지정 서열 또는 기름체 단백질의 보존된 모티프를 기초로 합성된 표적서열을 나타내고, 수직-수평의 빗금쳐진 박스는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 유전자 터미네이터를 나타내고, 빗금쳐진 원은 단백질 분해효소가 인식하는 모티프이고; 꼬여진 선은 기름체 단백질의 자연상태의 C- 또는 N-말단을 나타낸다.
제 3 도는 C-말단 융합 구조물에서의 자세한 배열을 나타낸 것이다. 나타난 배열은 전형적인 기름체 단백질 유전자외 융합 펩타이드의 융합에서 링커로 사용된 콜라게네이즈 인식 모티프로, 식물에서의 클로닝 및 발현을 위하여 NcoI을 사용하여 연결하였다.
제 4 도는 융합 펩타이드 벡터 구조물을 만드는 과정, 이 구조물을 식물에 도입시키는 방법 및 원하는 재조합 펩타이드를 추출하고 분석하는 방법을 도식적으로 나타낸다.
제 5도는 pCGOBPILT 구조물을 개략적으로 나타낸다. 점선 박스는 올레오신 프로모터를, 왼쪽 위-오른쪽 아래로 빗금쳐진 박스는 올레오신 지정서열을, 수평-수직의 빗금쳐진 박스는 인트론을, 점찍힌 박스는 3' 비번역 서열을, 위의 왼쪽-아래의 오른쪽으로 크게 빗금쳐진 부분은 단백질 분해효소 절단 자리 (Xa 인자 또는 트롬빈의 바로 위쪽 서열)을 가지는 인터루킨-1-β 서열을 나타낸다.
제 6 도는 올레고뉴클레오타이드 GVR11를 나타낸다. A. thaliana 올레오신의 3' 지정 서열을 나타내는 제 3A 도에서, Xa/IL-1-β 인자의 지정 서열에 번역상으로 융합되며 종지 서열인 TAA가 그 뒤에 연결된다. 다음의 클로닝을 위하여, PvuI와 SalI 자리를 가진다. PuvI 자리를 만듬으로 인해 알라닌이 하나 더 생긴다. 믿줄 그어진 부분은 제한효소가 인식하는 자리이다. 위에 그어진 선은 A. thaliana 올레오신 서열과 Xa 인자 인식 서열이다. 실제로 잘라지는 부분은 *로 표시하였다. 제 3B 도에 GVR11 서열이 기재되어 있다. A. thaliana 올레오신과 융합시키기 위해, 프라이머 GAV11는 위쪽 선의 서열과 상보적이어야 한다.
제 7 도는 OBPILT의 뉴클레오타이드 서열이다. 믿줄 그어진 부분은 IL-' 의 지정 서열이고, 굵게 표시된 부분은 Xa 인자 인식자리를 지정하는 서열이다. 노팔린 합성효소 터미네이터는 소문자로 표시되어 있다.
본 발명에 따라, 쉽게 정제할 수 있는 펩타이드를 제조하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본 발명의 방법은 기름체와 목적 펩타이드를 제공하기 위한, 올레오신과 같은 기름체 특이적 서열의 충분한 부분을 지정하는 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트를 제조하는 단계; 이 발현벡터로 식물 숙주를 형질전환시키는 단계; 키메릭 단백질이 발현되고 기름체에 이동되도록 트랜스제닉 식물을 재생시키고, 이 식물을 기르는 단계를 포함한다. 목적 펩타이드는 일반적으로 종자에서 발현되지 않거나 기름체에서 발견되지 않는 외래 펩타이드이다. 기름체 단백질을 운반체 (carrier) 또는 표적화 수단으로 사용함으로써 외래 단백질을 간단하게 정제하는 기작을 제공한다. 키메라 단백질은 다량의 세포 단백질로부터 원심분리 또는 부유와 같은 1 단계 처리에 의해 불리된다. 또한 이러한 분리 단계에서 비특이적 단백질 분해효소가 기름체와 접촉하지 못하도록 비특이적 단백질 분해효소를 제거함에 의해 추출시 이 단백질이 분해되는 것이 방지된다. 외래 펩타이드를 지정하는 유전자는 식물, 박테리아, 곰팡이 또는 동물 등 어떠한 원(source)로부터도 얻을 수 있다. 바람직하게는, 키메라 펩타이드는 목적 펩타이드를 올레오신으로부터 잘려지게 하는 자리를 갖는다. 본 발명의 방법은 다양한 펩타이드를 발현시키고 쉽게 정제하는데 이용할 수 있다.
외래, 재조합 단백질을 기름체에 지향시키는 것은 여러가지 이로움을 가진다. 즉, 세포를 용혈시킨 후 원심분리에 의해 다량의 세포 내용물로부터 단백질을 분리할 수 있다. 기름체 분획은 추출물의 표면에 뜬다. 그 단백질은 선택적으로 단백질 분해효소 인식자리를 가지는 펩타이드 링커를 가질 수 있다. 이것은 그 펩타이드를 기름체로부터 해리시킬 수 있게 한다. 단백질은 친지성인 보존 부위 내에 두는 방식으로 재조합 폴리펩타이드에 도입시킬 수 있다. 그 결과 재조합 펩타이드가 기름체 내에 위치하게 되고, 따라서 단백질 분해효소로부터 보호된다.
일반적으로 발현 카세트는 5'-3' 전사방향으로, 기름체 단백질과 연관되어 있는 프로모터 및 엎스트림 부위로 정형화되며 세포에서 키메라 단백질이 발현되도록 하는, 발육 중인 종자에서 발현 가능하며 전사 및 번역 조절 부위, 목적 단백질과 기름체로의 표적화 수단을 제공하는 아미노산 서열로 이루어지는 키메릭 펩타이드의 DNA 지정서열, 및 식물에서 기능을 발휘하는 전사 및 번역 종결 부위를 포함한다. 하나 이상의 인트론이 존재할 수도 있다.
기름체 특이적 서열의 동족체는 기름체 단백질, 특히 올레오신류 단편에서 발견된다. 기름체 특이적 서열은 기름체 단백질에서 얻을 수 있는 서열과 같은 종류로, 목적 단백질을 기름체에 표적시키는데 필요한 충분한 동질성을 갖는다. "얻을 수 있는"이란, 원하는 표적화를 제공하는 천연 기름체 단백질의 아미노산 서열과 충분히 유사한, 자연, 합성 또는 이들의 조합에 의한 아미노산 서열을 의미한다. 특히 중요한 것은 여러 식물 종에서 보존되어 있는, 기름체 단백질의 중심 친지성 부위, 아미노산 수준에서 동질성이 있는 서열 및 그것의 단편이다.
본 발명의, 기름체에 표적화될 수 있는 융합 폴리펩타이드는 다음의 서열로 이루어진다:
aa25는 어떤 아미노산도 가능하며, 바람직하게는 약 3-6개의 탄소를 갖는 중성 지방족 아미노산, 특히 바람직하게는 루신 또는 알라닌이다.aa26는 중성 지방족 아미노산 특히 알라닌이거나, 탄소 수 약 3-4개이며 하이드록시로 치환된 아미노산, 특히 트레오닌 또는 탄소수 5-6개이인 아미노산, 특히 라이신이다.aa31는 탄소 수 약 3-6개이며 치환되지 않은 중성 지방족 아미노산, 특히 알라닌, 발린 또는 루신이거나, 치환되지 않은 방향성 아미노산 특히 페닐알라닌이다.aa33는 탄소 수 약 3-6개이며 치환되지 않은 중성 지방족 아미노산, 특히 알라닌, 발린 또는 루신이거나, 산소로 치환된 지방성 아미노산 특히 트레오닌이다. aa36는 탄소 수 약 3-5개이며 치환되지 않은 중성 지방족 아미노산, 특히 루신이거나, 탄소 수 약 3-4개 이며 산소로 치환된 중성 지방성 아미노산 특히 트레오닌 또는 세린이다. aa37는 치환되지 않은 중성 아미노산, 특히 루신이거나, 황으로 치환된 아미노산 특히 메티오닌이다. aa39는 치환되지 않은 중성 지방족 아미노산, 특히 발린이거나, 치환되지 않은 방향성 아미노산 특히 페닐알라닌이다. aa41치환되지 않거나 산소로 치환된 중성 지방족 아미노산, 특히 알라닌, 루신 또는 세린이다. aa44는 치환되지 않거나 산소로 치환된 중성 지방족 아미노산, 특히 알라닌, 아이소루신 또는 트레오린이다. aa46는 치환되지 않거나 산소로 치환된 중성 지방족 아미노산, 특히 알라닌, 발신 또는 트레오닌이다. aa47는 치환되지 않은 중성 지방족 아미노산, 특히 글리신 또는 알라닌이다. aa59는 치환되지 않은 중성 지방족 또는 방향족 아미노산, 특히 루신 또는 페닐알라닌이다. aa76는 치환되지 않거나 황으로 치환된 중성 지방족 아미노산, 특히 알라닌, 루신 또는 메티오닌이다. aa78는 치환되지 않은 중성 지방족 아미노산, 특히 알라닌이거나, 산소 또는 황으로 치환된 중성 지방족 아미노산 특히 메티오닌 또는 트레오닌이다. aa83는 치환되지 않거나 산소로 치환된 중성 지방족 아미노산, 특히 글리신, 세린 또는 트레오닌이다. aa92는 산소로 치환된 중성 지방족 아미노산, 특히 세린 또는 트레오닌이다. aa96는 황으로 치환된 중성 지방족 아미노산이거나, 특히 시스테인이거나, 중성 방향족 이원환 아미노산 특히 트립토판이다. aa97는 치환되지 않거나 황으로 치환된 중성 지방족 아미노산, 특히 발린, 루신, 아이소루신 또는 메티오닌이다. aa98는 중성 지방족 아미노산이거나 산소로 치환된 방향족 아미노산, 특히 알라닌, 루신 또는 타이로신이다. aa99는 어떠한 아미노산도 가능하며, 특히 라이신, 세린 또는 아스파라진이다. aa100는 산소로 치환된 지방족 또는 방향족 아미노산, 특히 타이로신 또는 트레오닌이다. aa101는 치환되지 않은 지방족 또는 방향족 아미노산, 특히 알라닌, 루신 또는 페닐알라닌이다.
b) 상기 제 1 폴리펩타이드와 융합되며, Arabidopsis 또는 Brassica 에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 제 2 폴리펩타이드.
또한 본 발명은 다음의 폴리펩타이드로 이루어지는 기름체에 표적될 수 있는 융합 단백질을 제공한다:
a) 다음 (1) 및 (2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 펩타이드와,
(1) 다음 아미노산 서열에 포함되는 최소한 8 개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드와
(2) 자연적으로 발생하는 완전한 길이의 당근 16Kd 올레오신 또는 옥수수 18Kd 또는 16Kd 올레오신이 아니라는 가정하에, 상기 (1)의 아미노산을 기초로 설계된 올리고뉴클레오타이드 프로브에 의해 동정되는 DNA 서열에 의해 지정되는 펩타이드 또는 그것의 단편,
b) 상기 제 1 펩타이드와 융합되며, Arabidopsis 또는 Brassica 에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 제 2 펩타이드.
또한 본 발명은
a) 올레오신 또는 기픔체에 표적시키는데 충분한 올레오신의 일부를 지정하는 제 1 DNA 서열과,
b) 제 2 DNA 서열이 지정하는 펩타이드가 Arabidopsis 또는 Brassica 에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아니라는 가정하에 상기 펩타이드를 지정하는 제 2 DNA 서열로 이루어지는, 키메라 DNA 구조물을 제공한다.
또한 본 발명은 전사방향에서,
- 종자에서 DNA 서열이 발현되도록 하는, 종자에서 발현되는 유전자의 번역 개시 자리 쪽으로의 충분한 5' 부위로 이루어지는 조절 DNA 서열,
- a) 올레오신 또는 기름체에 표적시키는데 충분한 올레오신의 일부를 지정하며 하나 이상의 제한 효소 자리를 가지는 제 1 DNA 서열과, b) Arabidopsis 또는 Brassica 에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 펩타이드를 지정하는 제 2 DNA 서열로 이루어지는 키메라 DNA 서열,
- 번역 종결 부위 및 전사 종결 부위를 각 구성성분으로 하여 이루어지며, 상기 구성성분이 작동 가능하도록 연결되어 있고, 상기 키메라 DNA 서열의 발현이 상기 조절 DNA 서열에 의해 조절되는 발현 카세트도 제공한다.
또한 본 발명은
- 종자 세포에서 기름체 단백질 (OBP) 서열이 발현되도록 하는, 번역 개시자리 쪽으로의 충분한 5' 부위를 포함하며, 개시 메티오신 코돈 쪽으로 아주 인접한 5'과 기름체 단백질 유전자의 번역 종결 신호쪽으로의 5' 사이에 하나 이상의 제한효소 자리를 가지는 기름체 단백질 유전자와
- Arabidopsis 또는 Brassica 에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 펩타이드를 지정하며, 상기 기름체 단백질 유전자 리딩 플레임의 제한효소 자리에 삽입된 DNA 서열로 이루어지는 발현 카세트도 제공한다.
또한 본 발명은 Arabidopsis 또는 Brassica 에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 펩타이드를 지정하는, 기름체 단백질 유전자의 리딩 플레임에 삽입된 제 1 DNA 서열로 이루어지며, 상기 기름체 단백질 유전자가 종자에서 상기 유전자의 발현을 위하여 상기 기름체 단백질 유전자의 번역 개시 자리 쪽으로의 5' 조절 부위를 충분히 포함하며, 상기 서열이 상기 조절 부위에 의해 조절되도록 상기 유전자에 삽입된 발현 카세트도 제공한다.
또한 본 발명은, 인테그레이션이 가능한 조건에서 숙주 세포를 발현 카세트로 형질전환시키는 것으로 이루어지는, 종자에서 목적 펩타이드를 발현시키는 방법도 제공하며, 이때 발현 카세트는 전사방향에서, 종자에서 DNA 서열이 발현되도록 하는, 종자에서 발현되는 유전자의 번역 개시 자리 쪽으로의 충분한 5' 부위로 이루어지는 제 1 DNA 서열; 올레오신 또는 기름체로 표적화시키는데 충분한 올레오신의 일부를 지정하며, 리딩 플레임 내에 하나 이상의 자연 또는 합성의 제한효소 자리를 가지는 제 2 DNA 서열; Arabidopsis 또는 Brassica 에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 목적 폴리펩타이드를 지정하는 제 3 DNA 서열; 및 번역 종결 부위 및 전사 종결 부위를 구성성분으로 하여 이루어지며, 상기 구성성분이 작동 가능하도록 연결되어 있고, 상기 제 2 DNA 서열의 종자에서의 발현이 상기 제 1 DNA 서열에 의해 조절된다.
또한 본 발명은 DNA 구조물을 식물세포 게놈에 인테그레이션시키기 위하여 인테그레이션이 가능한 조건에서 숙주 세포를 DNA 구조물로 형질전환시켜고; 상기 목적 폴리펩타이드가 상기 기름체 단백질 유전자의 발현산물과의 융합 단백질로 발현되도록 상기 식물 키우고; 상기 종자 세포의 기름체로부터 상기 융합 단백질을 분리하고; 상기 융합 단백질을 해리시키기 위해 상기 기름체를 분쇄하고; 상기 목적 폴리펩타이드를 정제하는 것으로 이루어지는, 종자에서 정제된 목적 펩타이드를 얻는 방법도 제공하며, 이 때, DNA 구조물은 종자에서 기름체 단백질 유전자가 발현되도록 하는, 상기 기름체 단백질 유전자의 번역 개시 자리 쪽으로의 5' 조절 부위의 충분한 부분을 포함하는 기름체 단백질의 리딩 플레임에 삽입된 목적 폴리펩타이드를 지정하는 제 1 DNA 서열로 이루어지며, 상기 서열은 상기 조절 부위의 조절 하에서 발현되도록 삽입되어 있다.
Arabidopsis thaliana 기름체 단백질에 대해 유추되는 아미노산 서열은 다음과 같다.
25-101 까지의 아미노산은 친지성이 중심부를 포함한다.
몇몇 응용을 위해 표적화 수단으로 특히 흥미를 끄는 것은 기름체로 표적화시키는 다음과 같은 기름체 특이적 서열 또는 그것의 단편이다.
기름체 단백질로의 표적화를 제공할 수 있는 DNA 지정 서열의 원으로는 종자에서 목적 단백질의 발현을 제공하는 Arabidopsis 또는 Brassica napus에서 얻을 수 있는 기름체 단백질유전자가 특히 중요하다 ( Taylor et al. (1990) Planta, 181:18-26).
분리되었거나 분리되는, 원하는 특성을 갖는 다른 기름체 단백질 유전자를 동정하기 위하여, 그 단백질을 부분적으로 서열결정할 수 있으며, 따라서 mRNA를 동정하기 위한 프로브를 설계할 수 있다. 그런 프로브는 식물의 여러 종에서 매우 보존되어 있는 중심 친수성 부분의 지정서열을 표적화하도록 설계되어 있으면 특히 좋다. 결과적으로, 이 부분을 위한 DNA, RNA 프로브는 다른 식물 종에서 기름체 단백질의 지정 서열을 동정하는데 특히 유용하다. mRNA의 양을 늘리기 위하여,cDNA를 제조하고, 그 cDNA 을 기름체를 생산하지 않는 세포에서 얻은 mRNA 또는 cDNA로 빼낼 수 있다. 남은 cDNA는 식물세포에서 얻은 적절한 라이브러리를 이용하여 상보적인 서열을 위한 게놈 생산에 사용된다.
몇몇 경우, 위에서 살펴본 바와 같이, 프로브는 기름체 단백질유전자 프로브 (보존된 부분)을 이용하여 cDNA 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 직접 사용되어 그 프로브에 하이브리드되는 서열을 동정하는데 이용된다. 이 분리는 또한 종자 특이적 cDNA 발현 라이브러리에 대한 표준적인 면역학 스크리닝 기술에 의해서도 수행될 수 있다. 기름체 단백질에 대한 항체는 Taylor et al. (Planta, (1990) 181: 18-26)에 기재된 항체 제조 방법에 의해 얻을 수 있다.
항체를 이용하여 cDNA 발현 라이브러리를 스크리닝하는 것은 Huynh et al. (1985, DNA Cloning Col.1/ a Practical Approach, ed. D.M. Glover, IRL Press, pp.49-78)의 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 서열 확인은 친지성인 중심 부분에서 발견되는 높은 보존성에 의해 가능하다 (제 1 도). 추정되는 클론 및 동질성 연구에 Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1977) 74:5463-5467) 또는 Maxam and Gilbert (1980, Meth. Enzymol., (1980) 65:497-560)의 방법을 이용할 수 있다. 중심의 친지성 서열의 동질성은 분화된 종 사이에서, 아미노산 수준 및 뉴클레오타이드 수준으로, 정상적으로 ≥ 70%이다. 항체를 이용할 수 있다면, Molecular Cloning, (1990) 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, pp. 8-49, 8-51)에 기재된 방법에 따른 종자 mRNA 준비로부터, 서열이 일치한다는 것을 확인하기 위하여 하이브리드-선택 및 번역 실험을 할 수 있다.
종자에서 유래된 cDNA는, 얻을 수 있는 기름체 단백질유전자의 보존된 지정 부위에서 얻은 cDNA 프로브 (예를 들면 Bowman-Vance and Huang, J. Biol. Chem., (1987) 262:11275-11279)를 이용하여 스크리닝할 수 있다. 묘목 cDNA보다 종자 DNA와 더 잘 하이브리디제이션되는 클론을 선택한다. 발육 중인 종자의 기름체와 연관된 특정 cDNA를 동정하기 위하여, 직접 항체 스크리닝법이나 하이브리드-선택 및 번역 방법을 이용하여 스크리닝을 반복한다. 그 특정 cDNA에 상보적인 mRNA는 실험된 다른 조직에는 없다. 이 cDNA를, 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, 이 cDNA에 하이브리드되는 단편을 선택하는데 사용하였다.
종자에서 위의 키메라 유전자를 발현시키기 위하여, 종자에서 특히 발현되는 유전자로 부터 얻을 수 있는, 전사 개시 조절부위와 mRNA가 라이보좀에 결합하게 하여 번역 시작에 관여하는 "라이보좀 결합 자리"인 5' 미번역 서열의 번역 개시 조절부위를 이용할 수 있다. 이러한 유전자의 예에는 내핀과 같은 종자 저장 단백질이 포함된다 (Josefsson et al., J. Biol. Chem., (1987) 262:12196-12201; Scofield S.R. and Crouch M.L. J. Biol. Chem. (1987) 262:12202-12208). 특히, Arabidopsis, 당근 (Hatzopoulos et al., 앞에서와 같음), 옥수수 (Huang et al. 1987, 1990, 앞에서와 같음)의 기름체 단백질에서 얻을 수 있다.
이 부위는 일반적으로 구조 유전자 지정 서열의 번역 개시쪽으로 최소한 100개의 염기쌍, 최대 2.5kb로 이루어진다. 개시 조절 부위의 전사 및 번역 기능 요소는 모두 같은 유전자에서 유래되었거나 얻을 수 있는 것이 바람직하다. "얻을 수 있는"은 키메라 단백질의 지정 DNA 서열의 원하는 전사 특이성을 제공하는 자연상태의 서열과 충분히 유사한 DNA 서열을 의미하며, 자연, 합성 또는 이들의 조합일 수 있다.
전사 수준은 변형된 종자를 얻을 수 있는 RNA양을 제공하기에 충분하여야 한다. "변형된 종자"는 형질전환되지 않은, 즉 게놈에 실험되는 발현 카세트를 갖지 않는, 같은 식물 종의 종자와 구분될 정도로 다른 표현형을 가지는 종자를 뜻한다. 표현형에서 여러 가지 변화가 관심 대상이 된다. 이러한 변환의 예에는 기름체 단백질의 과발현, 또는 기름체에 기름체 단백질의 축적, 세포질에 키메라 단백질의 축적 등이 있다.
목적 폴리펩타이드는 어떤 단백질도 가능하며, 예를 들면 효소, 항응혈제, 신경 펩타이드, 호르몬 또는 부착성 전구체 등이 있다. 단백질의 예에는 인터루킨-1-β, 항응혈제 히루딘, 효소 β-글루쿠로니데이즈 또는 이뮤노글로빈의 VH, VL번역 융합으로 이루어지는 단일 체인 항체 등이 있다.
목적 폴리펩타이드를 지정하는 DNA 서열은 합성된 것, 천연에서 우래된 것, 이들의 조합일 수 있다. 이 DNA의 특성 또는 원(source)에 따라 식물에서 많이 사용되는 코돈으로 DNA 서열을 합성하는 것이 좋다. 식물에서 많이 사용되는 코돈은 숙주 식물로 특히 주목되는 식물에서 가장 많은 양으로 발현되는 단백질에서 빈도수가 가장 높은 코돈으로부터 결정할 수 있다.
사용되는 종결 부위는 많은 경우 종결 부위가 상대적으로 서로 교환될 수 있는 듯 하므로 우선 편리해야 한다. 종결 부위는 전사 개시 부위와 같은 기원이거나, 목적 폴리펩타이드의 지정 DNA 서열과 같은 기원이거나, 다른 기원일 수 있다. 옥토핀 합성효소 및 노팔린 합성효소의 종결 부위와 같은, A. tumefaciens의 Ti 플라즈미드의 종결부위가 편하게 사용될 수 있다.
표적화 서열을 지정하는 DNA 서열을 목적 펩타이드의 지정 서열에 결합시키기 위하여, 말단 융합, 내부 융합, 중합 융합 등 다양한 방법을 이용할 수 있다. 모든 경우, 기름체 단백질의 ORE (open reading frame)를 방해하지 않도록 융합되어야 하며, 번역 종결 신호 또는 결합점 (junction) 부근을 피해야 한다. 다양한 말단 융합과 내부 융합이, 생체내에서 그 구조를 표시함에 의해 제 2 도에 나타나 있다.
설명된 모든 경우에서, 펩타이드를 지정하는 유전자의 라이게이션은 단백질 분해효소가 인식하는 모티프를 가지는 링커를 포함하는 것이 좋다. 이렇게 되면 융합 단백질로 추출된 후, 그 펩타이드를 해리시킬 수 있다. 이용될 수 있는 잠정적 절단 자리는 트롬빈 인식 모티브 (leu-val-pro-arg-gly) (Fujikawa et al., Biochemistry (1972) 11:4892- 4899), Xa 인자 (phe-glu-gly-arg-aa.), 콜라게네이즈 (pro-leu-gly-pro) (Scholtissek and Grosse , Gene (1988) 62:55-64) 등이다.
제한효소 처리, 한쪽 끝을 비우거나 뭉툭한 말단을 만들기 위해 한쪽 끝을 채우는 것, 링커 결합시키기 등과 같은 적절한 조작을 위해, 연결과 라이게이션을 위해 상보적 말단을 갖는 단편이 제공된다. 여러 가지 클로닝 벡터가 사용될 수 있는데, 벡터는 E. Coli에서 기능을 발휘하는 복제 시스템과 형질전환된 세포를 선택할 수 있도록 하는 마커를 가진다. pBR322, PUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184등이 그 예이다. 벡터의 적당한 제한 효소 자리에 서열을 삽입할 수 있으며, 얻어진 플라즈미드로 E.Coli 숙주를 형질전환시키고, 그 E.Coli를 적당한 영양배지에서 길러 세포를 모아 용혈시킨 후 플라즈미드를 회수한다. 서열분석, 제한효소 자리 분석, 전기영동 등으로 분석한다. 각 DNA 조작 후, 마지막 구조물에 사용될 DNA 서열을 제한효소로 처리하고 다음에 연속되는 서열에 결합시킨다. 부분 구조물 각각은 같거나 다른 플라즈미드에 클로닝될 수 있다.
식물 세포 숙주에 DNA를 도입하기 위해 여러 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 담배와 같은 쌍떡잎 식물, Brassica napus와 같은 유질(oleaginous) 종에 Molonet et al. Plant Cell Rep., (1989) 8:238-242; Hinchee et al. Bio/Techbol., (1988) 6:915-922 에 기재된 방법 또는 이분야에서 알려진 기술에 따라 표준 Agrobacterium 벡터를 사용하여 키메라 DNA 구조물을 도입할 수 있다. 예를 들면 식물 세포의 형질전환에 T-DNA을 사용하는 것은 많이 연구되어 있으며, 다음 문헌에 자세히 기재되어 있다: EPA 120,516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Chapter V. Knauf, et al., Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium, In: Moelecular Genetics of the Bacteria. Plant interaction, Puhler, A. ed., Springer-Verlag, NY, 1983, p.245; An et al., embo j. (1985), 4:277-284. 전사 구조물을 식물 세포에 옮기기 위해 A. tumefaciens 또는 A. rhizogenes와 식물을 함께 배양할 수 있다.
Agrobacteria를 이용하여 식물세포를 형질전환시킨 다음, 선별을 위해 적절한 선별 배지에 깔고, 캘러스로 배양시키고, 새순으로 기른 후, 뿌리내리게 하는 배지에서 길러 캘러스에서 식물을 재생시킨다. Agrobacterium 숙주는 T-DNA를 식물세포로 옮겨주는데 필요한 vir 유전자를 가질 것이며, T-DNA는 가질 수도 가지지 않을 수도 있다. 인젝션과 일렉트로포레이션을 위해 무장해제된 Ti-플라즈미드 (종양 유전자 특히 T-DNA 부분이 없는 것)를 식물 세포에 도입시킨다.
Agrobacterium을 사용하지 않는 방법에, 다양한 외떡잎식물과 쌍떡잎 식물에서의 형질전환과 발현을 위해 본 명세서에 기재된 구조물을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 Agrobacterium 형질전환 시스템에서는 다루기 쉽지 않은 종을 위해 특히 유용하다. 유전자 전이를 위한 다른 방법으로는 바이오리스틱스(biolistics) ( Sanford, Trends in Biotech. (1988) 6:299-302), 일레트로포레이션 (Fromm et al. (1985) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 82:5824-5828; Riggs and Bates (1986),Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 83:5602-5606), PEG-매개 DNA 도입(Prtrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet., 199:169-177) 등이 있다.
숙주 세포로는 줄기, 잎, 뿌리 또는 종자 등 식물의 일부에서 유래된, 종자를 가지는 많은 식물, 또는 종에 따라 복제가능한 구조가 사용될 수 있다. 세포는 세포나 잎의 얇은 판과 같은 식물의 일부에서 분리할 수 있다. Brassica napus와 같은 경우, 숙주 세포는 Moloney et al. Plant Cell Rep., (1989) 8:238-242에 기재된 바와 같이 떡잎의 꼭지에서 유래될 것이다. 시판되는 유지 종자를 사용하는 다른예에는 완두에서의 떡잎 형질전환(Hinchee et al. Biotechnology, (1988) 6:915-922), 면화에서의 줄기 형질전환 (Ungeck et al. Biotechonoogy, (1981)5:263 -266)이 있다.
형질전환 후에, 예를 들면 잎의 얇은 판과 같은 세포를 선별배지에서 키운다. 싹이 나타나기 시작하면 싹을 잘라, 뿌리내리는 배지로 옮긴다. 뿌리가 충분히 생기면 땅에 옮겨심는다. 추정되는 형질전환된 식물을 마커로 테스트한다. 원하는 서열이 숙주의 게놈으로 인테그레이션되었는지 알아보기 위해, A. thaliana 올레오신 유전자와 같은 적절한 프로브를 써서 게놈 DNA에 대해 서던 불라팅한다.
보통 발현 카세트는 식물세포에서 선별을 위한 마커에 연결될 것이다. 제초제 내성, 특히 카나마이신, G418, 프레오마이신, 하이그로마이신, 클로람페니콜 등과 같은 항생제에 내성인 것이 편리한다. 사용된 특정 마커는, 도입된 DNA가 없는 세포와 비교하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있게 한다.
위에서 설명한 바와 같이, 발현 카세트에서 융합 펩타이드는 최소한 발육 중인 종자에서 더 잘 발현된다. 따라서, 형질전환된 세포를, 종자를 맺게하기 위해 기존에 알려진 방법에 따라 키운다. 예를 들면, McCormick et al. Plant Cell Reports (1986) 5:81-84 참고할 수 있다. 종자 배와 같이 전사가 기대되는 조직에서 분리한 RNA를 프로브로 사용하여 노던 블라팅 할 수 있다. 전사체의 크기는 융합 단백질 전사체의 예측되는 크기와 비교될 수 있다
그 후, 종자에서 기름체 단백질을 분리하고, 융합 펩타이드가 발현되었는지 알아보기 위한 분석을 수행한다. 분석의 한 예가 PAGE이다.융합 펩타이드는 융합 펩타이드의 올레오신 부분에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 얻어진 융합 펩타이드의 크기는 융합 단백질의 예측되는 크기와 비교될 수 있다.
트랜스제닉 식물의 2 세대 이상을 기르거나 형질전환된 동일한 종과 또는 다른 종과 수분시키고, 원하는 표현 특성이 안정하게 유지되고 유전되는지를 확인하기 위하여 원하는 표현 특성을 갖는 얻어진 하이브리드를 동정한다. 또 목적 펩타이드를 분리하기 위해, 또는 새로운 표현 특성을 가지는 종자를 제공하기 위해 종자를 수확한다.
도입된 특성을 위한 동형 배우자 또는 이형 배우자인 종자로부터 여러가지 방법들, 예를 들면 완충수용액을 이용한 추출액, 분쇄, 마쇄, 또는 종자의 세포를 깨뜨리는 등의 방법에 의해 원하는 단백질을 추출할 수 있다. 추출된 종자는 껍질 등을 제거하는 원심분리나 침강을 거쳐 3 종류의 분획; 침강물 또는 불용성 펠렛, 수용성 상등액, 종자 저장 지방과 기름체로 이루어지는 부유하는 "찌끼(scum)"로 분리할 수 있다. 기름체는 천연 기름체 단백질과 키메라 기름체 단백질 모두를 포함한다. 기름체는 수용성 단백질로부터 분리할 수 있으며, 수용성 완충액에 재현탁시킨다.
단백질 분해효소 인식자리로 이루어지는 링커가 발현 카세트에 들어 있다면, 그 링커 서열의 번역에 의해 제공되는 인식부위를 위해 단백질 분해효소 특이적인 재현탁 완충액을 첨가한다. 이것에 의해 원하는 펩타이드가 수용상으로 해리된다. 2차 원심분리에 의해, 프로세싱된 기름체와 여기에 붙어있는 단백질을 다시 부유시킨다. 목적 펩타이드는 침전되며, 특성 및 용도에 따라 화학적으로 변형시키거나 동결건조시킨다.
어떤 경우에서는, 키메라 단백질을 기름체 단백질에서 분리시킬 필요가 없다. 융합 단백질이 N- 또는 C-말단 융합에 견딜 수 있으며 그 활성을 유지하는 효소인 경우가 그러한 예인데, 이러한 효소는 더이상 절단하거나 정제하지 않고 사용될 수 있다. 키메릭 효소-기름체 단백질을 융합단백질로 기질과 접촉시킨다. 원하는 경우, 키메릭 효소-기름체 단백질을 그 기름체 단백질에 대한 항체가 고 농도로 고정화된 이뮤노어피너티 컬럼을 이용하여 정제할 수 있다 (예를 들면, Taylor et al., (1990) 앞에서와 같음).
본 발명의 또 다른 용도는 다음과 같다. 기름체 단백질은 종자의 총 단백질 중 많은 비율을 차지하므로, 단지 융합 단백질에 원하는 아미노산이 많이 포함되도록 만듦에 의해 종자를 고-라이신, 고-메티오닌과 같은 바람직한 특성을 갖도록 강화시키는 것이 가능하다. 소, 가금류와 같은 가축이나 사람이 직, 간접으로 먹는 시리얼과 곡물을 변형시키는데 이용할 수 있다. 또, 유지 종자를 부수고 추출하는 종래의 방법에서 기름이나 음식의 프로세싱에서 연속적으로 도움을 주는 효소를 융합시키는 것도 가능할 것이다. 이러한 효소의 예에는 종자처리에 사용되어 추출된 트리글리세라이드 또는 단백질 제품의 가치를 높여 주는, 고온에서의 분쇄에서도 활성을 발휘하는 열안정성 지방 변경 효소가 있다. 예를 들면, 살충제 단백질 또는 곰팡이 세포벽 또는 세포막 등 농경에서의 해충에게 특이적인 이뮤노글로빈의 일부를 기름체 단백질에 커플링하여 식물에 대한 특정 식물 해충의 공격을 감소시킬 수 있다.
아래의 예는 설명을 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1. 기름체 단백질과 외래 펩타이드의 말단 융합의 발현
A. C-말단 융합체
5' 에서 번역 개시쪽으로의 최소한 100염기쌍을 포함하는 기름체 단백질 유전자의 게놈 클론을 적당한 박테리아 숙주에서 복제가능한 프라즈미드에 클로닝하였다 (예를 들면 E. Coli을 위한 pBR322 또는 pUC). 유전자의 친수성 C-말단 부분을 지정하는 부위에 제한효소 자리가 있다. 19kDa OBP 에서, 이 부위는 전형적으로 이 클론의 125 코돈에서 끝까지 뻣어있다. 이상적인 제한효소 자리는 1개인 경우지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 이 부위에 알맞은 제한효소 자리가 없으면 위치 특이적 돌연변이로 제한효소 자리를 도입할 수 있다 (Kunkel Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1985) 82:488-492). 이 자리의 도입에서 가장 문제가 되는 것은 이것이 OBP의 번역 종결 신호 쪽으로 5'에 위치해야 한다는 것이다.
이 돌연변이된 클론에, pro-leu-gly-pro (콜라게네이즈 인식자리) 또는 이들의 멀티머와 같이 단백질 분해효소 인식 자리를 지정하는 서열을 가지는 합성 올리고 뉴클레오타이드 어뎁터를 도입할 수 있다.
이렇게 만들어진 어뎁터에 의해: OBP 클론의 3'의 제한효소 자리와 양립할 수 있는, 5'-말단의 4개 염기 오버행 (overhang); 필요하다면 OBP 지정 서열, 단백질 분해효소 인식 자리 및 외래 펩타이드 지정 서열 사이의 전이에서 프래임 쉬프트가 일어나지 않도록 외래 펩타이드 지정 서열과 부가적인 염기에 라이게이션되기 쉽도록 어뎁터의 3'말단의 4개 염기 오버행이 제공된다. 이러한 융합의 전형적인 배열이 제 3 도에 나타나 있다. 본 명세서의 실시예는 당근 OBP의 종결 코돈 근처에 있는 Xhol 자리를 이용한다 (Hataopoulos et al. Plant Cell, (1990) 2:457-467). 이것을 제한효소로 처리하고, 위에서 설명된 두 개의 올리고 뉴클레오타이드로부터 만들어진 어뎁터와 라이게이션시킬 수 있다. 이 어뎁터는 말단에 완전한 XhoI 오버행을 가질 것이며 변역 플래임을 흐트러뜨리지 않을 것이다. 다른쪽 말단은 인위적으로 선택된 (6개 염기에 대한 어떠한 절단이라도 충분함) NcoI 오버행을 형성하나, 원하는 외래 펩타이드의 ATG에 싸여 있다.
최종 라이게이션 산물은 대개 완전한 OBP 유전자, 콜라게네이즈 인식 모티프를 위한 지정 서열과 원하는 펩타이드 지정 서열을 하나의 리딩 프래임에 가질 것이다. 이와 같은 3 부분으로 구성되는 단편을 Agrobacterim 이원 (binary) 플라즈미드로 클로닝시킨다 (Bwvan Nucl. Acid Res., (1984) 12:8711-8721). 이 방법은 외래 DNA로 식물을 형질전환시키는데 많이 이용되므로 (Fraley et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA(1983) 80:4803-4807), Moloney et al. Plant Cell Rep., (1989) 8:238-242 방법 또는 이와 비슷한 방법에 따라 평지씨와 같은 유지식물을 형질전환시키는데 이용될 수 있다. 이 형질전환 실험으로부터 트랜스제닉 식물을 재생시킬 수 있으며, 개화시킬 수 있다. 이 식물을 자가 수분에 의해 종자를 맺도록 할 수 있다.
종자를 60-80일에 걸쳐 성숙시키고 수확한 후 수용성 추출 완충액에서 분쇄한다 (Tayor et al. Planta, (1990) 181:18-26). 얻어진 슬러리를 5000 x g에서 20분 동안 원심분리시켜 표면에 뜨는 찌끼를 회수한 후, 이 찌끼를 콜라게네이즈 분석 완충액에서 심하게 흔들면서 현탁시킨다 (Scholtissek and Grosse, Gene (1988)62:55-64). 콜라게네이즈 5단위를 첨가하고 현탁액을 흔들어주면서 4 시간 동안 둔다. 현탁액을 다시 5000 x g에서 20분 동안 원심분리시켜 표면에 뜨는 찌끼를 제거하고, SDS-PAGE로 수용액 상의 단백질 함량을 분석한다. 원하는 펩타이드 크기와 비슷한 밴드가 있으면 그 단백질을 암모니움 설페이트로 침전시키고 울트라필트레이션이나 냉동건조로 농축한다.
B. N-말단 융합
기름체 단백질의 친수성 N-말단 끝은, 기름체의 바깥 표면에서 외래 펩타이드를 유지되도록 하면서 그 펩타이드를 N-말단에 융합될 수 있게 한다. 이러한 융합 구조는 제 2IB 도에 나타나 있다.
이 구조는 C-말단 융합에서 사용되는 것과 비슷한 출발물질로부터 만들 수 있으나, 기름체 단백질 유전자의 번역 개시쪽에 가까운 편리한 제한효소 자리를 알아내야 한다. 여러 기름체 단백질 유전자에서, 단지 최초 "ATG" 쪽의 5'에 1개의 염기를 바꿈으로써 지정 서열은 변화시키지 않으면서 편리한 제한효소 자리를 만들 수 있다. 지금까지 연구된 기름체 단백질에서, 두번째 아미노산은 코돈이 "G"로 시작하는 알라닌이다.
서열은 다음과 같다:
여기를 A를 C로 바꾸면 Nco1 자리가 생김
"ATG"에 앞의 아데닌에서 하나의 염기를 바꾸면 두 경우에서 모두 NcoI 자리인 ---CCATGG---가 생긴다. 따라서, 이 서열에 또 다른 Nco1 자리가 없다면, Kunkel (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1985) 82:488-492)에 기재된 위치 특이적 돌연변이에 의해 이 염기를 변형할 수 있다.
외래 펩타이드의 지정 서열은 NcoI 자리에 바로 연결될 수 있도록 준비될 것이 요구된다. 이것은 그 외래 펩타이드의 번역 개시 자리 근처에 NcoI 자리를 만들도록 Kunkel 방법에 의한 위치-특이적 돌연변이로 하나 또는 두개의 염기를 변형하여야 할 수도 있다. Nco1과 펴적의 번역 종결자리 근처를 자르는 두번째 효소를 이용하여 이 펩타이드를 클로닝 벡터에서 잘라낸다. 위에서 설명한 방법에 따라 위치 특이적 돌연변이를 이용하여 편리한 자리를 또 도입할 수 있다. Qu and Hung (1990, 앞에서와 같음)는 생체 내에서 단백질 프로세싱 중에 N-말단의 메티오닌이 제거될 수 있으며, 또 이것의 바로 아래쪽 알라닌은 아실화될 수 있다고 제안하였다. 이러한 가능성을 설명하기 위하여, 단백질의 N-말단에 메티오닌-알라닌 서열을 유지할 것이 요구된다. 이것은 Ala 코돈 안에 또는 후에 그것의 지정서열 내로 편리한 제한 효소 자리를 도입하는 여러가지 방법에 의해 가능하다. 예를 들면, 위치 특이적 돌연변이에 의해 그 서열은 다음과 같이 변형될 수 있다:
3'---TC TCA ACA ATG GCA GAA CGA GGC ACT TAT--- 을
3'--- TC TCA ACA ATGGCA TGC CGAGGC GCC TAT---로 돌연변이 시킨다.
Sph1 Nar1
이와 같이 코돈 1 개를 변형시키면 지정 서열에 Sph1 자리가 도입된다. 같은 돌연변이 도중에 도입될 수 있는 두번째 변화는 Nar1 자리인 GGC GCC를 얻기 위해염기 2개를 바꾼다. 이렇게 돌연변이된 유전자를 Sph1와 Nar1로 처리하면 정방향 클로닝 절단을 얻을 수 있는데, 이경우 코돈 3개가 없어진다. 이 자리에 Sph1과 양립할 수 있는CATG--- 서열을 가지는 3' 오버행을 가지고 반대쪽에 GC 5' 오버행을 가지는 어뎁터를 도입할 수 있다. 이 어뎁터의 정확한 서열은 다음과 같다.
Sph1 Nar1
n 회 반복
[ CCG CTC GGT CCG GG
CTACG GGC GAG CCA GGC] CCGC
이 어뎁터는 진단 복적으로 사용될 수 있는 Sph1 및 Nar1 자리를 다시 만든다. Sph1 자리는 플라즈미드와, 목적 펩타이드 서열을 싸고 있는 클론 내부 DNA를 여는데 이용될 수 있다. 클로닝의 방향은 그 플라즈미드의 비 대칭으로 놓여진 어떤 자리와 Nar1 자리를 잘라 분석할 수 있다.
이 N-말단 융합체에서 얻어진 구조물은 제 2 도의 IB의 예와 전형적으로 비슷할 것이다. 이들은 OBP 프로모터 서열, 필요한 경우 자기 자신의 개시 신호로 "ATG"를 가지는, 가치 있는 펩타이드의 지정서열의 OBP 유전자의 첫번째 몇개의 코돈에서 플래임내 융합체 및 상기 OBP 유전자의 나머지와 터미네이터를 가진다.
이렇게 변형된 유전자를 Agrobacterium 이원 플라즈미드에 도입하고 (Bevan, (1984), 앞에서와 같음), Agrobacterium에 넣는다. 형질변환 방법은 위에서 설명한 바와 같다. 가치 있는 펩타이드를 종자에서 회수하는 방법은 "C-말단 융합체"에서와 같다.
C. 내부 번역 융합체
세번째 융합 형태는 가치있는 펩타이드의 지정서열을 OBP 지정서열 내부에 삽입하는 것에 관한 것이다. 이 방법에서의 융합은 N-말단 융합체에서와 같으나, 이 OBP의 잘 보존된 영역은 성숙된 단백질의 표적에 필수적이므로 보존도가 낮은 부분을 변형시킨다.
이러한 융합에서 주요한 다른점은 이 단백질을 해리시키기 위하여 콜라게네이즈 인식 자리를 양옆에 두어야 한다는 것이다. 이것은 지금까지의 표준 콜라게네이즈 링커/어뎁터 시스템 대신 다음과 같은 링커가 필요함을 의미한다.
n 회 반복 n 회 반복
뭉툭함 [CCG CTC GGT CCG 제한효소 [CCG CTC GGT 뭉툭한
말단 1 GGC GAG CCA GGC] 자리 GGC GAG CCA GGC] 말단 2
뭉툭한 말단 1과 2는 어뎁터를 OBP 클론에 정방향으로 클로닝하는데 이용될 수 있다. 제한효소 자리는 적당한 제한호소 자리 또는 링커로 사인 가치있는 펩타이드의 지정서열을 도입하는데 사용될 수 있다. 가치있는 펩타이드의 지정서열에 있는 비대칭적인 제한효소자리와, 콜라게네이즈 인식 모티프 지정서열을 싸고 있는 두 개의 제한효소 자리를 이용하여 방향을 분석할 수 있다.
이 구조물을 Agrobacterium 플라즈미드에 넣고 또 식물에 도입하는 방법은 앞에서 설명한 바와 같다. 가치있는 단백질을 트랜스제닉 식물의 종자로부터 분리하는 방법은 약간 다른데, 기름체를 분리하고 세척한 후 지질층에서 기름체 내부에 숨어 있는 콜라게네이즈 인식 자리에 접근할 수 있도록 하기 위하여 기름체에서 지질을 제거하는 단계가 필요하다. 이 단계는 기름체 단백질를 캐리어로 이용하는 잇점을 감소시킬 수 있으나, 한편으로는 수용성 매질이나 식물 원형질에서 불안정한 단백질 서열을 위해서는 편리하다.
D. 사이-이원체 (inter-dimer) 번역상 융합체
OBP의 전체 지정서열이 반복되는 구조물을 만들 수 있다. 이 구조물로부터 만들어지는 이원체 단백질은 OBP를 기름체에 표적시키는데 필요한 모든 인자를 가지고 있다. 이러한 구조물은 프로모터 부분, 번역 종결 부위를 제외한 OBP의 완전한 또는 거의 완전한 ORF (open reading frame) 및 번역 종결 부위와 터미네이터 부위를 가지는 두번째 OBP의 완전한 ORF를 포함할 것이다.
이 키메라 유전자 구조에서 이 두 복제의 접점 부위에서 유사하지 않는 제한효소 한쌍이 발견되거나 또는 만들어진다. 이들 제한효소 자리는 내부 번역상 융합체에서 설명된 것 같은 링커를 도입하기 위해 사용된다. 이 링커는 콜라게네이즈 인식 모티프 뿐 아니라 가치있는 단백질이 지정서열 내에 있는 내부 제한효소 자리도 가진다. 이 구조물은 제 2 도 III에 나타나 있다. 이 구조물을Agrobacterium 에 도입시키고, 그것을 식물에 도입시키는 방법은 앞에서 설명한 것과 같다. 형질전환된 식물의 종자에서 가치 있는 단백질을 회수하는 것은 C-말단 융합체에서 설명된 방법에 따라 행해진다.
실시예 2. 인터루킨-1-β (IL-1-β) 를 올레오신과의 융합단백질로 식물에 클로닝시키고 발현시키는 방법
A. Arabidopsis thaliana 올레오신 유전자의 클로닝 및 서열결정
Brassica napus 올레오신 유전자 (Murphy et al. (1991) Biochem. Biophys. Acta 1088:86-94)를 사용하여 EMBL3A (Strategy)에서의 A. thaliana (cv. Columbia) 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. A. thaliana의 15kb 게놈 단편을 포함하는 EMBL3A ('2.1)을 분리하였다. 이 올레오신은 15kb 단편 내의 6.6kb KpnI 삽입물 내에서 매핑되었다 (제 5 도). 올레오신 유전자를 포함하는 1.8kb NcoI/KpnI 단편의 끝을 채우고 RFM13mp19의 SmaI 자리에 서브클로닝하였다. 1.8kb 삽입물을 적당한 제한효소로 자르고, 서열결정을 위해 M13mp19에 서브클로닝하였다. A.thaliana 올레오신 유전자의 1800bp 서열을 제 1a 도에 표시하였다. 클로닝은 Sambook et al., (1989) (Molecular Cloning: A laboratory manual 2nd ed. Cold Sprong Haber Laboratory Press) 방법에 의해 수행되었다.
B. IL-1-β을 지정하는 올레고뉴클레오타이드 설계
IL-1-β는 9 개의 아미노산: val-gln-gly-glu-glu-ser-asn-asp-lys 으로 구성된다 (Antoni et al., (1986) J. Immunol. 137:3201-3204). 단백질 분해효소 인자 Xa는 ile-glu-gly-arg 서열을 포함하는 단백질을 자를 수 있는데, 아르기닌 다음을 자른다. 이 서열을 기초로, IL-1-β 지정서열, Xa 인자 절단 자리의 지정서열 및 A.thaliana 올레오신의 3' 지정서열의 18개 올리고뉴클레오다이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다 (GVR11, 제 5 도). B.napus와 A.thaliana의 올레오신에 최적으로 사용될 수 있는 코돈을 이용하여 IL-1-β 지정서열을 설계하였다 (표 1).
1: 제 1 도 참고
2: Lee and Huang (1991) Plant PHysical 96:1395-1397
C. A.thaliana 올레오신-IL-1-β 융합체 제조
서열 5' CACACCAGGAACTCTCTGGTAAGC 3' ( 염기 위치 -838에서 -814) 을 최초로 올리고뉴클레오타이드 GVA10 5' CACTGCAGGAACTCTCTGGTAAGC 3'를 설계하였다. GVR10은 클로닝을 용이하게 하는 PstI 자리를 가진다. GVR10과 GVR11 사이의 부위를, PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 다량화하였다. 반응 혼합물은 16 μl dNTPs (1.25mM), 10 μl 10x PCR 완충액, (100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1% (w/v) 젤라틴), 5 μl GVR11 (20 'M) 1 μl Taq DNA 폴리머레이즈 (1u/μl) 및 64 μl H2O를 함유한다. PCR로 1652개의 뉴클레오타이드인 단일 단편을 얻었다.
D. A.thaliana 올레오신-IL-1-β (OBPIL) 융합체의 클로닝
pBI121 (Clontech Laboratories) 로부터 5' SalI-노팔린 합성효소 (nos)터이네이터-EcoRI 3' 서열을 분리하여 pUC19의 SalI/EcoRI 자리에 클로닝하였다. 이 플라즈미드를 pTerm이라고 하였다. C에 기재된 1652bp의 단편을 분리하여 PstI과 SalI을 처리하고, 이 단편을 pTerm에 클로닝하였다. 얻어진 플라즈미드를 pUCOBPOLT라고 하였다 (제 5 도). 이 플라즈미드를 EcoRI과 PstI으로 잘라 잘려진 pUC19 벡터와 EcoRI-A.thaliana oleosin-IL-1-β-nos-PstI 융합 PstI (OBPILT)를 얻었다. OBPILT의 완전한 서열은 제 7 도에 기재되어 있다. OBPILT을 pBluescript+의 EcoRI/PstI 자리에 서브클로닝하였다. 이 플라즈미드 (pOBPILT)를 PstI와 HindIII로 잘라 얻은 PstI-OBPILT-HindIII 단편을, 선택 마커로 하나의 PstI-HindIII 자리와 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 자리를 가지는 Agrobacterium의 이원 (binary) 플라즈미드 (Bin 19) (Bevan, M., (1984) Nuc1. Acid. Res. 12:871108721)에 서브클로닝시켰다. 얻어진 플라즈미드를 pCGOBPILT 라고 하였다. 대략적인 클로닝 순서를 제 5 도에 기재하였다. 다양한 이원 플라즈미드의 예는 다음과 같다: pGA642 또는 pGA645: An et al. (1985) EMBO. J. 4:277-288; pCGN1558 또는 pCGN1559; MacBride and Summerfeldt (1990) Plant. Molec. Biol. 14:269-276.
F. pCGOBPILT로 Agrobacterium EHA101를 형질변환시킴
LB+100 μl/ml 5ml에 EHA101 콜로니 (Hood et al., (1986) J.Bact. 168:1291-1301) 1 개를 접종시키고 28℃에서 48 시간 배양시켰다. 이 배양액 5ml을LB+100 βl/ml 500ml에 접종하고 28℃에서 배양액이 OC600=0.5가 될 때까지 배양하였다. 세포를 가라앉히고 (10분, 5000xg), 멸균수 500ml에 현탁시킨 후 다시 세포를 가라앉혔다. 세포를 글리세롤을 10% 함유하는 멸균수 3ml에 재현탁시켰다. 세포 40 μl를 에펜롤프 튜브에 넣고, 일렉트로포레이션에 직접 사용하거나, 나중에 사용하기 위하여 -80 ℃에서 저장하였다.
Bowel et al., Nucl. Acid. Res. (1988) 16:6127-6145에 기재된 방법에 따라 일렉트로포레이션을 수행하였다. 펄스 발생기를 시료 쳄버와 평행으로 한 후 25 μF 커페시터, 2.5kV 및 200 ohm에 맞추었다.
G. pCGOBPILT로 Nicotiana tabacum (담배)를 형질변환시킴
pCGOBPILT를 가지는 EHA101를 사용하여 담배 잎 디스크(disc)를 형질변환시켰다. 온실에서 기른 담배에서 8-10 cm 길이의 담배 잎을 따서 70% 에탄올로 20 초간 살균한 후8분 간 10% 표백 (Javex) 하였다. 잎 가장자리와 잎맥을 제거한 후 남아있는 라미나를 5x7mm의 사각형 또는 지름 5mm인 디스크로 잘랐다. 약 30 개의 잎 디스크를 모아 작은 플레이트에 놓았다. 이 디스크에 Agrobacterium 용액을 붓고, 9분 동안 두었다. 멸균한 Whatman 여과지에 이 잎 조각을 붙이고 매질 I (MS, 3% 설탕, 2mg/l 2,4-D)에 넣었다. 48시간 동안 공-배양시켰다. 잎 디스크를 선택배지 (MD, 3% 설탕, 2.5mg/l Ba, 0.1 mg/1 NAA, 500 mg/l 카베니실린, 100 mg/l 카나마이신)에 넣고 3-4 주 두었다. 싹이 나타나기 식작하면 싹을 잘라 뿌리내리기 위한 배지 (MS, 3% 설탕, 0.1mg/l NAA, 500 mg/l 카베니실린, 100 mg/l 카나마이신)에 넣었다. 뿌리가 충분히 생기면 땅에 이식하였다.
H. pCGOBPILT로 B.napus를 형질변환시킴
Moloney et al. Plant Cell Rep., (1989) 8:238-242 방법에 따라 B,napus를 형질전환시켰다. 이 문헌은 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
형질전환 방법
이원 플라즈미드를 가지는 한 개의 Agrobacterium tumefaciens EHA101 를 AB 배지에서 48 시간 배양하였다. 이 시료 50 μl을 적당한 항생제를 함유하는 MG/L 5 ml에 넣고 28℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 현탁액을 10,000 x g로 10분간 원심분리하여 세포를 모아, 설탕 3 %을 함유하는 MS 10 ml (pH 5.8)에 현탁시텼다. 이 현탁액의 얇은 막으로, 5 cm 페트리 디쉬의 기초를 덮었다. 잘려진 각각의 떡잎을 이 플레이트에 넣고, 그 잎이 꼭지의 잘린 표면을 이 박테리아 현탁액에 수 초 동안 담갔다. 이 것을 다시 동일한 MS 플레이트에 담았다. 이 떡잎을 Agrobacterium 과 72 시간 동안 같이 배양하였다. 더이상의 피어9feeder)층은 제공하지 않았다.
공-배양 후에 떡잎을 20 μM 벤질아데닌, 3% 설탕, 0.7% 파이트 아가(phytagar)와 500 mg/l 카베니실린(Pyopen, Ayerst)과 15mg/l 카나미이신 설페이트 (Boehringer-Mannheim)를 함유하며 pH 5.8인 MS 배지에 옮겼다. 잎꼭지를 다시 조심스레 깊이 2 mm의 아가에 묻었다. 플레이팅 밀도는 가 플레이트 마다 10개의 식물체로 하였다. 밀도를 더 높이면 재생율이 낮아진다.
선택 및 식물 재생
식물체를 빛을 비추면서 특정된 온도 하에서 재생배지에서 2-3 주간 유지하였다. 이 기간 동안 상대적으로 캘러스 형성은 적은 약 적반 가량의 식물체에서 많은 싹이 나타났다. 이들 중 얼마는 배양 4 주 쯤에 하얗게 되었다. 남은 초록색 싹은 싹을 더 자라게 하기 위하여 배지 (재생배지에서 벤질아데닌을 뺀 것)에서 더 배양되었다. 이 배지에서 1-2 주 기르면 형성된 싹 크러스터에서 정점에 달하게 된다. 이 싹들을, NS 배지, 3% 설탕, 2 mg/l 인돌 부틸린산, 0.7% 파이트 아가(phytagar)와 500 mg/l 카베니실린(Pyopen, Ayerst)을 함유하는 "뿌리 내리기 위한" 배지에 옮겼다. 선택 마커인 카나마이신을 함유하지 않으 때 뿌리가 훨씬 빨리 자라고, 또 재생단계와 싹 기르는 배지에서의 두 단계의 선택을 거친 후 뿌리기르는 단계에서는 플라즈미드가 거의 빠져나가지 않으므로 카나마이신은 첨가하지 않았다.
I. 담배와 B. napus 게놈에 OBPILT 를 안정하게 병합시 키기.
추정되는 형질전환된 식물에 대해 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 활성을 시험하였다. 이 활성을 나타내는 식물의 게놈 DNA를 분리하고, T-DNA 경계 (OBPOLT와 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 유전자) 사이의 서열이 담배와 B. napus 게놈에 안정하게 인테그레이션되었음을 증명하기 위하여 서던 블라팅하였다. 담배의 서던 블랏에는 A.thalian 올레오신 유전자와 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 유전자를 프로브로 사 용하였다. B. napus의 서던 블랏에는 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 유전자를 프로브로 사용하였다.
J. 담배에서 올레오신-IL-1-β 융합체의 발현
형질전환된 식물과 형질전환되지 않은 식물에서 얻은 발육 중인 배에서 RNA를 분리하여, A.thalian 올레오신 유전자를 프로브로 사용하여 노던 블라팅하였다.모든 실험된 형질전환된 식물에서 850 개의 뉴클레오타이드의 전사체가 검출되었다. 이 전사체의 크기는 올레오신-IL-1-β mRNA의 예상 크기에 상응한다. 형질전환되지 않은 식물에서는 이 전사체가 검출되지 않는다.
K. 올레오신-IL-1-β 단백질의 축척
형질전환된 담배의 종자에서 기름체 단백질을 분리하였다 (Holbrook et al., (1991) Plant Physical 97:1051-1058). PAGE 한 후, 단백질을 젤에서 PVDF 막으로 옮겼다. B.napus의 22kDa 올레오신에 대한 항체를 사용하여 담배에서 올레오신-IL-1-β를 검출하였다. 이 항체는 B.napus와 A.thaliana에서 주요 올레오신을 모두 인식한다. 또 이 항체는 담배 올레오신도 인식한다. 담배 올레오신은 A.thaliana와 B.napus 올레오신과 트기가 다른데, 형질전환된 담배의 종자에서, 항-22 kDa 항체는 형질전환되지 않은 담배에는 없는 20kDa-단백질을 인식한다. 올레오신-IL-1-β의 예상 크기는 20.1 kDa 이다. 결과를 표 2에 정리하였다.
1: 위의 I에서 결정된 안정한 인테그레이션. 올레오신-IL-1-β 융합체의 발현은 앞의 J에서 설명된 것과 같음. 추정되는 올레오신-IL-1-β 융합 단백질의 검출은 앞의 K에서 설명된 것과 같음. NT: 실험되지 않음.
기름체에서 기름체 단백질에 접합된 목적 펩타이드 또는 그것의 충분한 부분의 발현은 목적 펩타이드를 세포성분을 거의 포함하지 않도록 쉽게 정제될 수 있게 한다. 융합 단백질은 정제 후에 절단될 수 있으며, 절단하지 않고 사용할 수도 있다. 본 발명의 방법과 조성물은 목적 펩타이드의 빠르고 간단한 정제방법을 제공한다.
본 명세서에 언급된 출판물 및 특허 출원은 모두 본 명세서의 참고자료로 포함된다.
지금까지 본 발명을 자세히 설명하였다. 이 분야의 전문가 들은 본 발명의사상 및 특허청구범위에서 벗어나지 않으면서 본 발명을 변형할 수 있을 것이다.
본 발명은 종자세포에서 목적 폴리펩타이드를 기름체 단백질과의 융합 단백질로 발현시키기 위한 구조물 및 방법을 제공하는 것이다. 본 방법에 의해 융합 단백질은 종자 세포의 기름체에 표적된다. 종자 세포를 용혈시킨 후, 예를 들면 분배/기름체의 표면특성을 이용하여 기름체를 다른 세포 물질로부터 쉽게 분리할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들면 그 기름체 단백질에 대한 항체를 이용한 친화력 크로마토그래프 등에 의해 분리될 수 있다. 필요하다면, 예를 들면 기름체 단백질에서 목적 폴리펩타이드의 N-말단 앞에 있는 단백질 분해효소 인식 자리를 인식할 수 있는 단백질 분해효소로 융합단백질을 처리하여 목적 폴리펩타이드를 회수할 수 있다.

Claims (34)

  1. a) 다음의 제 1 펩타드; 및
    aa25는 루신 또는 알라닌이고
    aa26는 알라닌, 트레오닌,또는 라이신이고,
    aa31는 알라닌, 발린, 루신 또는 페닐알라닌이고
    aa33는 알라닌, 발린, 루신 또는 트레오닌이고,
    aa36는 루신, 트레오닌 또는 세린이고,
    aa37는 루신 또는 메티오닌이고,
    aa39는 발린 또는 페닐알리닌이고,
    aa41는 알라닌, 루신 또는 세린이고,
    aa44는 알라닌, 이소루신, 또는 트레오닌이고,
    aa46는 알라닌, 발린 또는 트레오닌이고,
    aa47는 글리신 또는 알라닌이고,
    aa59는 루신 또는 페닐알라닌이고,
    aa76는 알라닌, 루신 또는 메티오닌이고,
    aa78는 알라닌, 메티오닌, 또는 트레오닌이고,
    aa83는 세린이고,
    aa92는 세린 또는 트레오닌이고,
    aa96는 트립토판 또는 시스테인이고,
    aa97는 이소루신, 메티오닌, 발린 또는 루신이고,
    aa98는 알라닌, 루신, 또는 타이로신이고,
    aa99는 라이신, 세린 또는 아스파라진이고
    aa100는 타이로신 또는 트레오닌이고,
    aa101는 알라닌, 루신 또는 페닐알라닌임;
    b) 상기 제 1 펩타이드와 융합되어 기름체로 표적되는, 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 제 2펩타이드로
    이루어지며 기름체에 표적화될 수 있는 것이 특징인 융합 폴리펩타이드:
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 2 펩타이드가 이뮤노겐을 제공하는 항원성 아미노산 서열인 것이 특징인 융합 폴리펩티드.
  3. (1) 다음 아미노산 서열로 이루어지는 제 1 펩타이드와;
    b) 상기 제 1 펩타이드와 융합되어 기름체로 표적화되는, 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 제 2펩타이드로 이루어지며, 기름체에 표적화될 수 있는 것이 특징인 융합 폴리펩타이드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 제 1 펩타이드가 다음 아미노산 서열로 이루어지는 융합 폴리펩타이드;
  5. 제 1항의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA로 이루어지는 키메라 DNA 구조물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 키메라 DNA 서열에 작동가능하도록 연결되어 숙주 세포에서 키메라 DNA의 복제를 지시할 수 있는 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 벡터 DNA를 추가로 포함하는 키메라 DNA 구조물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 조절 서열이 추가로 숙주 세포 내에서 상기 키메라 DNA의 발현을 지시할 수 있는 DNA 구조물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 DNA가 cDNA인 키메라 DNA 구조물.
  9. 전사방향으로,
    (1) 종자에서 DNA 서열이 발현되도록, 종자에서 발현되는 유전자의 번역 개시 자리 쪽으로의 5' 부위로 이루어지는 조절 DNA 서열;
    (2) a) 융합 폴리펩타이드를 기름체로 표적화할 수 있는 다음의 펩타이드를 코딩하는 DNA서열을 가지며 하나 이상의 제한 효소 자리를 가지는 제 1 DNA서열과,
    aa25는 루신 또는 알라닌이고
    aa26는 알라닌, 트레오닌,또는 라이신이고,
    aa31는 알라닌, 발린, 루신 또는 페닐알라닌이고
    aa33는 알라닌, 발린, 루신 또는 트레오닌이고,
    aa36는 루신, 트레오닌 또는 세린이고,
    aa37는 루신 또는 메티오닌이고,
    aa39는 발린 또는 페닐알리닌이고,
    aa41는 알라닌, 루신 또는 세린이고,
    aa44는 알라닌, 이소루신, 또는 트레오닌이고,
    aa46는 알라닌, 발린 또는 트레오닌이고,
    aa47는 글리신 또는 알라닌이고,
    aa59는 루신 또는 페닐알라닌이고,
    aa76는 알라닌, 루신 또는 메티오닌이고,
    aa78는 알라닌, 메티오닌, 또는 트레오닌이고,
    aa83는 세린이고,
    aa92는 세린 또는 트레오닌이고,
    aa96는 트립토판 또는 시스테인이고,
    aa97는 이소루신, 메티오닌, 발린 또는 루신이고,
    aa98는 알라닌, 루신, 또는 타이로신이고,
    aa99는 라이신, 세린 또는 아스파라진이고
    aa100는 타이로신 또는 트레오닌이고,
    aa101는 알라닌, 루신 또는 페닐알라닌임;
    b) 상기 제 1 펩타이드와 융합되어 기름체로 표적되는, 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 펩타이드를 코딩하는 제 2 DNA서열로 이루어지는 키메라 DNA서열; 및
    (3) 번역 종결 부위 및 전사 종결 부위를 각 구성성분으로 포함하며,
    각 구성성분들이 작동가능하도록 연결되고 상기 조절 DNA서열에 의해서 키메라 DNA 서열의 발현이 조절되는, 발현카세트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 조절 DNA 서열이 시리얼(cereal)또는 그래인 (grain) 종자 세포에서 발현되는 유전자로부터 유래된 것인 발현 카세트.
  11. 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 조절 DNA 서열과 상기 키메라 DNA의 제 1 DNA 서열이 Arabidopsis thaliana의 게놈으로부터 유래되는 발현 카세트.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 키메라 DNA의 제 1 DNA 서열이 다음 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 지정하는 발현카세트.
  13. (a) 종자 세포에서 기름체 단백질 (OBP) 유전자가 발현되도록 하는 번역 개시 자리 쪽 5' 부위를 포함하며 개시 메티오닌 코돈쪽으로 인접한 5'과 기름체 단백질 유전자의 번역 종결 신호쪽의 5' 사이에 하나 이상의 제한효소 자리를 가지며, 다음의 펩타이드 서열을 코딩하는 DNA를 가지는 기름체 단백질 유전자와;
    aa25는 루신 또는 알라닌이고
    aa26는 알라닌, 트레오닌,또는 라이신이고,
    aa31는 알라닌, 발린, 루신 또는 페닐알라닌이고
    aa33는 알라닌, 발린, 루신 또는 트레오닌이고,
    aa36는 루신, 트레오닌 또는 세린이고,
    aa37는 루신 또는 메티오닌이고,
    aa39는 발린 또는 페닐알리닌이고,
    aa41는 알라닌, 루신 또는 세린이고,
    aa44는 알라닌, 이소루신, 또는 트레오닌이고,
    aa46는 알라닌, 발린 또는 트레오닌이고,
    aa47는 글리신 또는 알라닌이고,
    aa59는 루신 또는 페닐알라닌이고,
    aa76는 알라닌, 루신 또는 메티오닌이고,
    aa78는 알라닌, 메티오닌, 또는 트레오닌이고,
    aa83는 세린이고,
    aa92는 세린 또는 트레오닌이고,
    aa96는 트립토판 또는 시스테인이고,
    aa97는 이소루신, 메티오닌, 발린 또는 루신이고,
    aa98는 알라닌, 루신, 또는 타이로신이고,
    aa99는라이신, 세린 또는 아스파라진이고
    aa100는 타이로신 또는 트레오닌이고,
    aa101는 알라닌, 루신 또는 페닐알라닌이고
    b) 상기 제 1 펩타이드와 융합되어 기름체로 표적되는, 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 펩타이드를 지정하며, 상기 기름체 단백질 유전자의 리딩 프레임내에 제한효소 자리에 삽입된 DNA 서열로 이루어지는, 발현 카세트.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 제한효소 자리가 합성된 제한효소 자리인 발현 카세트.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 제한효소 자리에 삽입된 단백질 분해효소 인식 자리를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 어댑터를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 단백질 분해효소가 콜라게네이즈인 발현 카세트.
  17. 제 1 DNA서열은 Arabidopsis 또는 Brassica에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 펩타이드를 지정하고 리딩 프레임에서 기름체 단백질의 유전자에 삽입되며, 상기 기름체 단백질 유전자는 다음의 펩타이드를 코딩하는 DNA서열을 가지며 종자에서 상기 제 1 DNA의 발현을 위하여 기름체 단백질의 번역개시쪽 5'조절부위의 일부를 포함하며, 제 1 DNA 서열이 상기 기름체 단백질 유전자에 삽입되어 상기 조절부위의 조절하에 발현되는, 발현카세트:
    여기서, 기름체 단백질의 상기 펩타이드는
    aa25는 루신 또는 알라닌이고
    aa26는 알라닌, 트레오닌,또는 라이신이고,
    aa31는 알라닌, 발린, 루신 또는 페닐알라닌이고
    aa33는 알라닌, 발린, 루신 또는 트레오닌이고,
    aa36는 루신, 트레오닌 또는 세린이고,
    aa37는 루신 또는 메티오닌이고,
    aa39는 발린 또는 페닐알리닌이고,
    aa41는 알라닌, 루신 또는 세린이고,
    aa44는 알라닌, 이소루신, 또는 트레오닌이고,
    aa46는 알라닌, 발린 또는 트레오닌이고,
    aa47는 글리신 또는 알라닌이고,
    aa59는 루신 또는 페닐알라닌이고,
    aa76는 알라닌, 루신 또는 메티오닌이고,
    aa78는 알라닌, 메티오닌, 또는 트레오닌이고,
    aa83는 세린이고,
    aa92는 세린 또는 트레오닌이고,
    aa96는 트립토판 또는 시스테인이고,
    aa97는 이소루신, 메티오닌, 발린 또는 루신이고,
    aa98는 알라닌, 루신, 또는 타이로신이고,
    aa99는 라이신, 세린 또는 아스파라진이고
    aa100는 타이로신 또는 트레오닌이고,
    aa101는 알라닌, 루신 또는 페닐알라닌이다.
  18. 제 17 항에 있어서, 추가로 상기 제 1 DNA 서열의 5'쪽에 단백질 분해효소 인식 자리를 지정하는 제 2 DNA 서열을 포함하며, 상기 제 2 DNA 서열이 상기 제 1 DNA 서열 및 상기 기름체 단백질 유전자와 함께 리딩 프레임 내에 존재하는 발현 카세트.
  19. (1) 전사방향으로, 종자에서 DNA 서열이 발현되도록 종자에서 발현되는 유전자의 번역 개시 자리 쪽 5' 부위로 이루어지는 제 1 DNA 서열;
    (2) 다음의 펩타이드를 코딩하며 리딩 프레임 내에 하나 이상의 자연 또는 합성의 제한효소 자리를 가지는 제 2 DNA 서열;
    aa25는 루신 또는 알라닌이고
    aa26는 알라닌, 트레오닌,또는 라이신이고,
    aa31는 알라닌, 발린, 루신 또는 페닐알라닌이고
    aa33는 알라닌, 발린, 루신 또는 트레오닌이고,
    aa36는 루신, 트레오닌 또는 세린이고,
    aa37는 루신 또는 메티오닌이고,
    aa39는 발린 또는 페닐알리닌이고,
    aa41는 알라닌, 루신 또는 세린이고,
    aa44는 알라닌, 이소루신, 또는 트레오닌이고,
    aa46는 알라닌, 발린 또는 트레오닌이고,
    aa47는 글리신 또는 알라닌이고,
    aa59는 루신 또는 페닐알라닌이고,
    aa76는 알라닌, 루신 또는 메티오닌이고,
    aa78는 알라닌, 메티오닌, 또는 트레오닌이고,
    aa83는 세린이고,
    aa92는 세린 또는 트레오닌이고,
    aa96는 트립토판 또는 시스테인이고,
    aa97는 이소루신, 메티오닌, 발린 또는 루신이고,
    aa98는 알라닌, 루신, 또는 타이로신이고,
    aa99는 라이신, 세린 또는 아스파라진이고
    aa100는 타이로신 또는 트레오닌이고,
    aa101는 알라닌, 루신 또는 페닐알라닌이고;
    (3) Arabidopsis 또는 Brassica에서 자연적으로 존재하는 올레오신의 일부가 아닌 펩타이드를 지정하는 제 3 DNA 서열; 및
    (4) 번역 종결 부위 및 전사 종결 부위를 구성성분으로 하며, 상기 구성성분들이 작동 가능하도록 연결되어 있고 종자에서 상기 제 1 DNA 서열에 의해 제 2 DNA 서열의 발현이 조절되는 발현카세트로,
    게놈 인테그레이션이 가능한 조건에서 식물숙주세포를 형질전환시키는 것으로 이루어지는, 종자에서 목적 펩티이드를 발현시키는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 하나 이상의 상기 조절서열과 상기 제 1DNA 서열이 Aribidopsis thaliana의 게놈으로부터 유래되는 발현 카세트.
  21. DNA 구조물로 식물숙주세포를 형질전환시킴으로써 DNA 구조물을 상기 식물세포의 게놈에병합시키고; 식물을 키워 종자를 생산함으로써 목적 펩타이드를 기름체 단백질 유전자의 발현산물과 융합단백질로 발현시키는 것으로 이루어지는, 종자에서 상기 목적 펩타이드를 발현시키는 방법:
    상기 DNA 구조물은 목적 폴리펩타이드를 지정하며 기름체 단백질의 리딩 프레임에 삽입되는 제 1 DNA와, 종자에서 상기 제 1 DNA가 발현되도록 상기 기름체 단백질 유전자의 번역 개시 자리 쪽으로의 5' 조절 부위 부분을 포함하며 다음의 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 가지는 기름체 단백질 유전자로 이루어지며, 상기 제 1 DNA 서열은 상기 조절 부위의 조절 하에서 발현되도록 삽입된다.
    aa25는 루신 또는 알라닌이고
    aa26는 알라닌, 트레오닌,또는 라이신이고,
    aa31는 알라닌, 발린, 루신 또는 페닐알라닌이고
    aa33는 알라닌, 발린, 루신 또는 트레오닌이고,
    aa36는 루신, 트레오닌 또는 세린이고,
    aa37는 루신 또는 메티오닌이고,
    aa39는 발린 또는 페닐알리닌이고,
    aa41는 알라닌, 루신 또는 세린이고,
    aa44는 알라닌, 이소루신, 또는 트레오닌이고,
    aa46는 알라닌, 발린 또는 트레오닌이고,
    aa47는 글리신 또는 알라닌이고,
    aa59는 루신 또는 페닐알라닌이고,
    aa76는 알라닌, 루신 또는 메티오닌이고,
    aa78는 알라닌, 메티오닌, 또는 트레오닌이고,
    aa83는 세린이고,
    aa92는 세린 또는 트레오닌이고,
    aa96는 트립토판 또는 시스테인이고,
    aa97는 이소루신, 메티오닌, 발린 또는 루신이고,
    aa98는 알라닌, 루신, 또는 타이로신이고,
    aa99는 라이신, 세린 또는 아스파라진이고
    aa100는 타이로신 또는 트레오닌이고,
    aa101는 알라닌, 루신 또는 페닐알라닌임.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 종자 세포의 기름체로부터 부터 상기 융합 단백질을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 분리단계가, 상기 종자세포를 용혈시켜 기름체를 해리시키고, 상기 기름체를 분쇄하여 융합 단백질을 해리시키는 것으로 이루어지는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 분리단계가 추가로 상기 융합 단백질에서 목적 폴리펩타이드의 N-말단 앞에 있는 단백질 분해효소 인식자리를 인식할 수 있는 단백질 분해효소를 상기 융합단백질에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 분리단계가 추가로 상기 접촉전에, 기름체 단백질 유전자의 발현 산물과 결합할 수 있는 항체로 이루어지는 고체 지지체에 상기 융합 단백질을 결합시키는 것으로 이루어지는 방법.
  26. (1) DNA 구조물로 식물숙주세포를 형질전환시킴으로써 DNA 구조물을 상기 식물세포의 게놈에 병합시키고;
    여기서, DNA 구조물은 목적 폴리펩타이드를 코딩하며 기름체 단백질의 리딩 프레임에 삽입되는 제 1 DNA와, 종자에서 상기 제 1 DNA가 발현되도록 상기 기름체 단백질 유전자의 번역 개시 자리 쪽으로의 5' 조절 부위 부분을 포함하며 다음의 펩타이드를 코딩하는 DNA서열를 가지는 기름체 단백질 유전자로 이루어지며, 상기 제 1 DNA 서열은 상기 조절 부위의 조절 하에서 발현되도록 삽입됨
    aa25는 루신 또는 알라닌이고
    aa26는 알라닌, 트레오닌,또는 라이신이고,
    aa31는 알라닌, 발린, 루신 또는 페닐알라닌이고
    aa33는 알라닌, 발린, 루신 또는 트레오닌이고,
    aa36는 루신, 트레오닌 또는 세린이고,
    aa37는 루신 또는 메티오닌이고,
    aa39는 발린 또는 페닐알리닌이고,
    aa41는 알라닌, 루신 또는 세린이고,
    aa44는 알라닌, 이소루신, 또는 트레오닌이고,
    aa46는 알라닌, 발린 또는 트레오닌이고,
    aa47는 글리신 또는 알라닌이고,
    aa59는 루신 또는 페닐알라닌이고,
    aa76는 알라닌, 루신 또는 메티오닌이고,
    aa78는 알라닌, 메티오닌, 또는 트레오닌이고,
    aa83는 세린이고,
    aa92는 세린 또는 트레오닌이고,
    aa96는 트립토판 또는 시스테인이고,
    aa97는 이소루신, 메티오닌, 발린 또는 루신이고,
    aa98는 알라닌, 루신, 또는 타이로신이고,
    aa99는 라이신, 세린 또는 아스파라진이고
    aa100는 타이로신 또는 트레오닌이고,
    aa101는 알라닌, 루신 또는 페닐알라닌임.
    (2) 식물을 키위 종자를 생산함으로써 목적 펩타이드를 기름체 단백질 유전자의 발현산물과 융합단백질로 발현시키고;
    (3) 종자세포로 부터 기름체를 분리하고;
    (4) 상기 기름체를 분쇄하여 융합 단백질을 해리시키고;
    (5) 상기 목적 폴리펩티드를 정제하는 것으로 이루어지는, 종자에서 정제된 상기 목적 펩타이드를 얻는 방법;
  27. 삭제
  28. 제 9 항에 따른 발현 카세트를 가지는 식물세포.
  29. 제 9항에 따른 발현 카세트를 가지는 세포로 이루어지며, 떡잎꼭지로부터 무성적으로 번식되는 Brassica 변종식물.
  30. 제 21 항에 의해 얻어지는, 종자에서 목적 폴리펩타이드가 발현되며 떡잎꼭지로부터 무성적으로 번식되는 Brassica 변종식물.
  31. 목적 폴리펩타이드를 제 1항의 융합 폴리펩타이드로 종자에서 발현시키는 것으로 이루어지는, 기름체에서 상기 목적폴리펩타이드를 얻는 방법.
  32. 제 26 항에 있어서, 상기 목적 펩타이드가 식물 게놈에 의해 코딩되는 펩타이드가 아닌 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 목적 펩타이드가 기름체에서 자연적으로 존재하는 펩타이드가 아닌 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 분리가 상기 종자 세포를 용혈시킨 후 기름체 분획을 모으는 것으로 이루어지는 방법.
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