JPH07502163A - 植物の栄養価改良用のプログラム可能水準の必須アミノ酸類を含有する規定された構造を有する合成貯蔵蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

１８、宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であり、そして 調節配列がバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーターシス テムからである、請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。 １９　請求の範囲第１−７項のポリペプチドを発現する植物。 ２０　植物がトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ダイス（ｓｏｙｂｅａｎ）、ブラシカ （Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（Ｂ、　ｎａｐｕｓ、　Ｂ、　ｃａｍｐｉｓｔｒｉｓ、 　Ｂ、　ｏｌｅｒａｃｅａ）　、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、イネ（ｒｉｃｅ） 、ポテト（ｐｏｔａｔｏ）、飼料草（ｆｏｒａｇｅ　ｇｒａｓｓｅｓ）、および 小麦（ｗｈｅａｔ）からなる群から選択される、請求の範囲第１９項に記載の植 物。 ２１、請求の範囲第２０項に記載の植物から得られる種子。 ２２、請求の範囲第１−７項のポリペプチドを発現する種子。 ２３、原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、請求の 範囲第１−７項の合成ポリペプチドを発現する原核生物。 ２４　ａ、最終使用者の栄養条件に関する供給作物植物の不足を算定し、ｂ１段 段階で同定されたアミノ酸不足を補正するためのポリペプチドをコードづける核 酸フラグメントを合成し、Ｃ９段階すで合成された核酸を植物組織中での発現お よび局在用の調節配列と組み合わせ、 ｄ植物細胞を段階Ｃの生成物で転換させ、ｅ１段段階の転換された植物細胞から 植物を再生させて成熟植物を得て、ｆ８段段階からの植物の種子をアミノ酸水準 の希望変動員にスクリーニングする ことを含んでなる、最終使用者の栄養条件に応じて植物中の必須アミノ酸の含有 量を変化させる方法。 明細書 名称 植物の栄養価改良用のプログラム可能水準の必須アミノ酸類を含有する規定され た構造を有する合成貯蔵蛋白質発明の背景 家畜、家禽、水中培養物およびベットを含む世界的な動物用飼料市場は４億７５ ００万メートルトンである。米国では、１億８０００万メートルトンが消費され ており、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ、）が全Ｋ（７）約６７％とみな され、そしてダイス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｗａｘ　Ｌ、　）ひきわりが約１０％と みなされる。トウモロコシおよびダイス製品は国際取引の主要部分でもある。 多くの穀類から得られる人間用食料および動物用飼料は、動物食料において必要 な１０種の必須アミノ酸ｉ（システィン、イソロイシン、リジン、メチオニン、 フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、およびバリン）の一部が欠けている 。多くの動物食料条件に関しては、トウモロコシではりシンが最大制限アミノ酸 であり、その次がトリプトファン並びに硫黄アミノ酸類であるメチオニンおよび システィンである。動物飼料中でのトウモロコンを補充するためのりシンおよび トリプトファンに富んでいるダイスひきわりの有用性は、マメの低い硫黄アミノ 酸含有量により限定される。ダイスひきわりを使用してトウモロコシのりシン水 準を補充する時には、ダイズ中のメチオニンの低い水準のために配合飼料が元の トウモロコシよりもａ（い水準のメチオニンを有するようになる。その結果とし て、トウモロフンおよびダイスの飼料配合物は典型的には依然としてメチオニン を添１１１１物として含むこととなる。鶏の初期配給飼料の典型的組呟が表１に 示されている［ポウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）他、（１９７６）　、Ｐｏｕｌｔ、　 ５ｃｉｅｎｃｅ、５５ｉ　５０２−５０９３゜黄色トウモロコシ　５７．２５％ ダイズひきわり（４９％蛋白質）　２９．００魚可溶物　０．６５ 小麦中級品　２．５０ 脱ラクトース処理された乳漿　１．５０脱水されたコスタル・バーミュダグラス 　５．００（Ｃｏｓｔａｌ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ）鉱物　０．２５ ビタミン　０・２５ 動物性脂肪　０．２５ ＤＬ−メチオニン　０．１０ 塩化コリン　０．１０ 従って、一定作物および特定最終用途に関して植物種子内の特定アミノ酸類の水 準を増加させる機能があると、混合または単独穀類飼料に精製されたアミノ酸類 を補充するという必要性がな（なるであろう。さらに、家禽および白部（飼料中 で使用されるダイス蛋白質の７８％とみなされるダイスひきわりの二種の最大消 費動物）のメチオニン必要量［ウィルコックス（１４１ＣＯＸ）、（１９８７） 、アグロノミ−（Ａｇｒｏｎｏｍｙ）、１６：８２３］）は動物の年令により減 少する［エンスミンガ−（Ｅｎｓｍｉｎｇｅｒ）他、（１９７８）、飼料および 栄養（Ｆｅｅｄｓ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、ザ・エンスミンガー・パブ リッシング・カンパニー、クロヴイス、ＣＡＩ。従ってダイスまたはトウモロコ シ中の必須アミノ酸含有量を調節可能な方法で改良する能力は非常に望ましい。 この問題の解決法は、作物不足を補充するように適合できるあらゆる年令のあら ゆる動物に飼料供給する際に使用するためのある種の合成蛋白質の設計である。 種子のアミノ酸含有量は主として、種子開発中に合成されそして発芽後の主要養 分貯蔵として作用する貯蔵蛋白質により、決めらする。種子中の蛋白質の量は穀 物中の乾燥重量である約１０％からマメの乾燥重量である２０−４０％に変動す る。多くの種子では、貯蔵蛋白質は合計蛋白質の５０％以上とみなされる。それ らの多い量のために、単離される第一の植物蛋白質は植物種子貯蔵蛋白質である 。しかしながら、やっと最近になってこれらの蛋白質の一部のアミノ酸配列が分 子遺伝技術の使用で決められた。これらの技術は種子−特異的発現およびこれら の蛋白質の細胞内標的を調節する遺伝信号に関する情報も提供する。 植物蛋白質の平均的リジン含有量と比べてリジンに富んだ植物種子貯蔵蛋白質は 同定されていないが、多数の硫黄に富んだ種子貯蔵蛋白質は同定されそしてそれ らの対応する遺伝子が単離されている。１１％のメチオニンおよび５％のシステ ィンを含有する１５ｋＤｚｅｉｎ蛋白質に関するトウモロコノ中の遺伝子［ペダ ーセン（Ｐｅｄｅｒｓｓｅｎ）他、（１９８５）　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、、２６１　：６２７９−６２８４］並びに２３％メチオニンおよび３％シス ティンを含有するＩＱｋ［）ｚｅｉｎ蛋白質に関する遺伝子が単離されている［ キリハラ（Ｋｉｒｉｈａｒａ）他、（１９８８）、Ｇｅｎｅ、７１　：　３５９ −３７０１．８％および１６％のシスティンを含有する２Ｓアルブミンに関する ブラジル・ナツツからの遺伝子が単離されている［アルテンバラ／’（Ａｌｔｅ ｎｂａｃｈ）他、（１９８７）　、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、８　： 　２３９−２５０３゜最後に、１９％メチオニンおよび１０％システィンを含有 する１ＱｋＤ種子プロラミンをコードづけする遺伝子カイネカラ単離されティる ［マスムラ（Ｍａｓｕｍｕｒａ）他、（１９８９）、円ａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、、１２　：１２３−１３０１゜植物栽培者は以前から作物植物中の蛋白質 の實および量を改良するｔこめの自然発生性変動の使用に興味を有する［ジュー チャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）、（１９７８）、＾ｄｖ、　ＥＸＩ）１Ｍｅｄｉ ｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１０５　：　２８１−３００］。比較的 高水準のリシン（７０％増加）およびトリプトラン（１００％増加）を含有する トウモロコシ系統が同定されている［メルフ（Ｍｅｒｔｚ）、（１９６４）、サ イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１４５　：　２７９およびネルラン（Ｎｅｌｓｏ ｎ）、（１９６５）、サイエンス、１５０　：１４６９−７０］。しかしながら 、突然変異遺伝子であるｏｐａｑｕｅ−２を加えるこれらの系統は劣悪な農業的 性！（疾病および有害生物に対する敏感性の増加、８−１４％の収率減少、低い ケルネル重量、比較的遅０乾燥、フレーキンググリッドの比較的低い乾燥粉砕収 率、および貯蔵問題の増加）を示し、そして商業的に有用ではない［ドイチェル （Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）、（１９７８）、＾ｄｖ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１０５　：　２８１−３００〕。ｏｐａｑｕｅ −２系統の耕種掌性を改良するためのさらなる増殖には複雑な遺伝パターンを有 する数種の修飾因子が含まれるｔこめ、複雑となる［ヴアサル（Ｖａｓａｌ）、 　Ｓ、　Ｋ、、（１９７４）、シンポジウム議事録。７０年代における世界的な トウモロコシ改良および（ｊＭＭＹＴの役割。センドロインターナジオナル・デ ・メジョラミエントデ・メイズ・イ・トリボ。エル・バタン、メキシコ］。困難 さにもか力＼わらず、ｏｐａｑｕｅ−２突然変異体を用いて操作するいくつかの 研究が続けられてきている。ｏ　ｐ　ａ　ｑ　ｕ　ｅ　−：２およびｓｕｇａｒ ｙ−２遺伝子並びに関連修飾因子を使用するＣＩＭＩｖｉＹＴで増殖されたクォ リティ・プロティン・ノイズ（ＱＰＭ）は堅い胚乳並びに粒中の高水準のりシン およびトリプトファンを有する［ヴアサル他、クォリティ・プロティン・メイズ 。ナショナル・アカデミ−・プレス、ワシントンＤ、Ｃ，］。ＱＰＭは遺伝的に 複雑であり、そして現存する系統は米国で使用されているｄｅｂｔ性物質に容易 に適用されない。これらの要素が米国のトウモロコシ栽培者によるＱＰＭの適用 を妨害している。 伝統的な植物細胞により作物の硫黄アミノ酸含有量を改良するという研究は研究 室規模では成功性が限定され、そして商業的規模では成功していない。抑制濃度 のりシンおよびスレオニンの存在下で成長を選択することにより、高められた全 粒メチオニン濃度を有する突然変異体トウモロコシ系統が栽培中に成長トウモロ コシ細胞から単離された［フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）他、（１９８５） 　、Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｗ、、６２：２１３−２１８］。しかしながら、農業 的に許容可能な栽培種（ｃｕｌｔｉｖａｒｓ）はこれまでにこの系統から誘導さ れていない。 ノイズ蛋白質中のメチオニン水準を増加させるために計画された伝統的な栽培研 究はノイズ中の全体的な蛋白質性質を増加させる研究と比べて限定されている［ アートン（Ｂｕｒｔｏｎ）、１９８４、世界的ノイズ研究会１ＩＩＩｆｉ事録、 ３６１−３６８頁（１９８４年１１２８−１７日）］。 代謝可能なメチオニン同族体であるエチオニンの存在下での成長に関する選択に より、増加した細胞内４度のメチオニンを有するノイズ細胞系統が単離されたが ［マディソノ（Ｍａｄｉｓｏｎ）他、（１９８８）、プラント・セル・レボーツ （Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）、７　：　４７２−４７６１　、植 物はこれらの系統から再生されなかった。 組み換えＤＮＡ技術は作物植物のアミノ酸組成を変える可能性を供するものであ る。特に有用な技術は、（ａ）分子クローニング方法および遺伝子の試験管内取 り扱い方法［サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、（１９８９）、分子クロー ニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｆｎｇ：　ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、２版、コールド・スプリング・ノ１−ノく −・ラボラトリ−・ブレス］、（ｂ）農業的に重要な作物植物、例えばノイズ［ チー（Ｃｈｅｅ）他、（１９８９）、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、９１　： 　１２１２−１２１８　；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）他、（１９８９）、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　Ｕ、Ｓ、＾１．８６　：　７５００ −７５０４　：ヒンチベＨｉｎｃｈｅｅ）他、（１９８９）、／＜イオテクノロ ジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６：９１５−９２２、ＥＰＯ公報０３０ １　７４９　Ａ２］　、ナタネ種子［デブロ＝ｙり（Ｄｅ　ＢＬｏｃｋ）他、（ １９８９）　、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、９１　：　６９４−７０１］　 、およびトウモロコシ［ゴルドンーカム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｉ）他、（１９ ９０）、プラント・セル（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ）、２　：　６０３−６１８　 ；フロンム（Ｆｒｏｍｉ）他、（１９９０）、バイオテクノロジー、８　：　８ ３３−８３９］中への転換（こよる遺伝子の導入、並びに（Ｃ）トランスジエニ ・ツク植物中に導入された遺伝子の種子−特異的発現［ゴールドベルブ（Ｇｏｌ ｄｂｅｒｇ）他、（１９８９）、セル（Ｃｅｌｌ）、５６　：　１４９−１６０ ）：　ｌ−ンブソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）他、　（１９８９）、バイオエッセイ ズ（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ）、１０　：１０８−１１３］である。これらの技術を 使用して増加したりシンおよび硫黄アミノ酸含有量を有する作物植物を開発する ためには、適するアミノ酸類１こ富んｔご商業的に重要な遺伝子生成物を得るか または開発することが必須である。 例えばトウモロコシおよびノイズの如き農業的に重要な作物を転換させることは 最近になって可能になったため、トランスジェニック植物中での種子貯蔵蛋白質 遺伝子の発現がモデル植物システムであるタバコまたはペチュニアで報告されて いる。一般的には双子葉種子貯蔵蛋白質遺伝子は種子−特異的方法で転換された 双子葉植物中で発現された。さらに、遺伝子発現の一時的および空間的調節も保 たれた。トランスジェニック植物生成物はある場合には正確に処理されそして適 当なマルチマー形４ｍＷさｔＬ６と示されティる。［ビーチ−（Ｂｅａｃｈｙ） 他、（１９８５）、ＥＭＢＯＪ、、４　：　３０４７−３０５３　；セングブタ ーゴパラン（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ）他、（１９８５）　、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２　：　３３２０−３３ ２４．バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）他、（１９８８）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５　：　４５８−４６２、エリス（Ｅｌｌｉｓ）他、（１９ ８８）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、１０　：　２０３−２１４　：ナ イトウ（Ｎａｉｔｏ）他、（１９８８）　、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、 、１１　：１０９−１２３　；ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）他、（１９８８）　 、ＰｌａｎｔＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、１１　ニア１７−７２９；アルテンバッハ（ Ａｌｔｅｎｂａｃｈ）他、（１９８９）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、 １３：５１３−５２２１゜ 貯蔵蛋白質は一般的にはＮ−末端信号ペプチド類またはカルボキシ−末端配列、 例えば５ＥＫＤＥＬ、の処理により亜細胞局所に樟的化される［ベドナレケト（ Ｂｅｄｎａｒｅｋｅｔ）（ｔ！！、（１９９０）　、ザ・プラント・セル（Ｔｈ ｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ）、２　：１１４５−１１５５　；ムンロ（Ｍｕｎｒ ｏ）他、（１９８７）、セル、４８　：　８９９−９０７　：ペル／Ｘム（Ｐｅ ｌｈａｍ）他、（１９８８）　、ＥＭＢＯＪ、、７・９１３−９１８：ペルハム 他、ＥＩＩＢＯＪ、７　：　１７５７−１７６２　：イノハラ（［ｎｎｈａｒａ ）他、（１９８９）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８６：３５６４　３５６８；へｙセ（Ｈｅｓｓ ｅ）他、（１９８９）　、ＥＭＢＯＪ、、８　：　２４５３−２４６１１゜合成 貯蔵蛋白質の適切な局在化および安定性のためにこれらの信号を加入させるキメ ラ遺伝子を作成することが必要であると証されている。 種子中で機能する調節信号を葉の中で機能する信号で置換することにより、植物 の葉の中の種子貯蔵蛋白質の発現が行われる（ロートン（Ｌａｗｔｏｎ）池、（ １９８７Ｌ円ａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、９　：　３１５−３２４　；シエ ルンタナ−（Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ）他、（１９８Ｂ）、ＥＭＢＯＪ、、７ 　：１２４９−１２５５］。単子葉種子貯蔵蛋白質遺伝子は非常に低い水準で発 現され［ンエルンタナー他、（１９８８）　、ＥＭＢＯＪ、、７　：１２４９− １２５５］、そしである場合には、転換された双子葉植物中で非一種子−特異的 方法で発現される［ウェン（Ｕｅｎｇ）他、（１９８８）　、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ ｙｓｉ。 １９．８６　：　１．２８１−１２８５１゜単子葉調整領域（プロモーターおよ び転写ターミネータ−）の双子葉種子−特異的調整領域による置換はある場合に は蛋白質の低水準の種子−特異的発現をもたらすしウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉ ａｍｓｏｎ）池、　（１９Ｆ３８）　、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、８８　 ：　１００２−１００７１゜他の場合には、単子葉蛋白質の高水準の種子−特異 的発現が見いだされており、そして単子葉先駆体の信号配列も正確に処理された ［＋７フン他、（１９８７）　、Ｆ、１ｌＢＯＪ、、６：３２１３−３２２１］ 。 種子のりシンおよび硫黄アミノ酸含有量を増加させるためには、リジン並びに硫 黄−含有アミノ酸類であるメチオニンおよびシスティンに富んだ蛋白質をコード づけする遺伝子または遺伝子類を得ることが必須である。メチオニンは多くの動 物によりシスティンに転化可能であるがシスティンはメチオニンに転化できない ため、メチオニンの方がシスティンより好ましい。導入される蛋白質が標的作物 植物と相容性であることが望ましい。リシンおよび硫黄アミノ酸含有量を最大に し、それにより最終使用者の要望を満たすために植物に要求される発現水準を最 小にする遺伝子を選択することが望ましい。この理由のために、当技術の専門家 は天然遺伝子およびそれらのポリペプチド生成物に制限されるものではない。 ジャイネス（Ｊａｙｎｅｓ）他は既知の蛋白質と比べて高められた水準のりシン 、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびイソロイシンを有する合成 ポリペプチドを用いて研究した［ＷＯ３９１０４３７１］。 これらの合成遺伝子は、必須アミノ酸用の高い割合（２５−６０％）のコドンを 含有する小さいオリゴデオキシ−ヌクレオチド類の混合物の不規則的連結反応に より製造された。このようにして製造された蛋白質は不均質でありそして構造を 規定するために折りたたまれない。限定された発現（合計植物蛋白質の０．０２ −０．３５％）がポテト中で示されている［ヤン（Ｙａｎｇ）他、（１９８９Ｌ プラント・サイエンス（Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ）、６４：９９−１１１］ 。 他の研究者はりシンまたはメチオニン含有量を増加させるためのアミノ酸類の添 加または置換により天然蛋白質を修飾した［デクラーク（ＤｅＣＩｅｒｃｑ）他 、ＥＰ　０　３１８　３４１　Ａｌ１．デクラーク他は、タバコ、アラビドプシ ス（＾ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、およびブランカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物中で 修飾された貯蔵蛋白質遺伝子を発現できることを示した。しかしながら、彼らの 研究は標的遺伝子生成物中に挿入しようとする適切なアミノ酸類に富んだ配列の 設計に関してはほとんど指針を与えていない。彼らは、分子の安定性は影響を受 けてはならないことおよびメチオニンの長い伸びは螺旋構造を破壊するアミノ酸 類により中断すべきであることだけを観察した。さらに、標的中に挿入された特 異的なポリペプチド配列は非反復的に規定された安定構造を適用させるように設 計されていなかった。 種子中の遺伝子生成物の安定性の重要性は規定された構造のポリペプチドの必要 性を指示するが、現存するアミノ酸組成を補充しそして最終使用者の条件を満た すために必要なことは最終的な遺伝子生成物の安定性を犠牲にすることなく変化 に適応する融通性のあるシステムの重要性であると強調している。 発明の要旨 出願人は、植物および微生物中での合成種子貯蔵蛋白質類（ＳＳＰＳ）の設計お よび発現により天然産出植物蛋白質の制限を克服しそして人間および動物の栄養 条件を満たす融通性を供するような発明を提供するものである。 種子貯蔵蛋白質調整配列および必須アミノ酸類に富んだ適当な蛋白質コードづけ 配列を含むキメラ遺伝子のトランスジェニック作物植物中への導入が、作物植物 からの種子の栄養性質を改良する方法である。これらの配列は安定性を改良する 特定の三次元構造をもたらすアミノ酸配列をコードづけするように設計できる。 種子の必須アミノ酸含有量の増加は、（ａ）一部は使用されるｍＲＮＡおよび標 的信号の特異性発現、翻訳性および安定性に依存する転換された作物中のキメラ 遺伝子の発現水準、（ｂ）種子貯蔵蛋白質コードづけ領域中の指定されたアミノ 酸残基の百分率、（ｃ）一部はそれの適切な処理、細胞内標的、比較的高い桁の 構造への組み立て、および乾燥に耐える能力に依存する転換された作物植物の種 子中での導入された蛋白質の安定性、並びに（ｄ）導入された蛋白質と転換され た作物の天然種子蛋白質との相容性、により決められるであろう。 本発明は、標的植物を転換させることができる遺伝子配列およびプロモーターを 供することによりリジンおよびメチオニン含有量の高い蛋白質を過剰発現させる 方法を提供するものである。本発明の特別な一面はそれぞれが同一であるかまた は異なるｎ個の７種の単位（ｄｅｆｇａｂＣ）を含んでなる合成ポリペプチドで あり、ここでｎは少なくとも４であり、 ａおよびｄは独立してＭｅ　ｔ、ＬｅｕＳＶａ　Ｌ　Ｉ　ｌ　ｅおよびＴｈｒか らなる群から選択され、 ｅおよびｇは独立して酸／塩基対であるＧｌｕ／Ｌｙｓ。 Ｌｙｓ／ＧｌｕＳＡｒｇ／Ｇｌ　ｕ、Ａｒｇ／Ａｓｐ、Ｉ、ｙｓ／Ａｓｐ。 Ｇｌｕ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／ＡｒｇおよびＡｓｐ／Ｌｙｓからなる群から選択され 、 ｂ、ｃおよびｆは独立してＧｌｙまたはＰｒｏ以外のアミノ酸であり、そしてそ れぞれの７種中のす、ｃおよびｆの少なくとも２個のアミノ酸はＧｌｕ、Ｌｙｓ ＳＡｓｐ、ＡｒｇＳＨｉｓＳＴｈｒ、Ｓｅｒ。 Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｉｎ、ＣｙｓおよびＡｌａからなる群から選択される。 さらに、本発明のこの面はＭｃｌおよびＬｅｕからなる群から独立して選択され るａ＋ｄを有することしてき、またはｅおよびｇが独立してＬＶＳ／Ｇｌｕもし くはＧｌｕ／１．ｙｓであるかまたはｂＳｃ、およびｆがｆが荷電されたアミノ 酸であるならしもしくはＣは逆の電荷を有するように選択される。 その他に、本発明の別の面はさらに ｎが少なくとも４であり、 ａおよびｄが独立してＭｅｔおよびＬｅｕからなる群から選択され、ｅおよびｇ が独立してＬｙｓ／ＧｌｕまたはＧｌｕ／Ｌｙｓであり、そして ｂＳｃおよびｆは独立してＧｌｙまたはＰｒｏ以外のアミノ酸であり、そしてそ れぞれの７種中のす、ｃおよびｆの少な（とも２個のアミノ酸はＧｌｕ、Ｌｙｓ 、Ａｓｐ、ＡｒｇＳＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ。 Ａｓｎ、Ａｌａ、ＧｉｎおよびＣｙｓからなる群から選択され、そしてｆが荷電 したアミノ酸であるならｂまたはＣが逆の電荷を有するようにす、ｃおよびｆｆ Ｊ＜選択される という条件にも従う。 本発明を構成する特異的な７種の単位は下記のものである本発明の別の面は、配 列同定番号・１．２．３．４．５．６．７および８３からなる群から選択される 合成ポリペプチドである。 本発明の他の面は、本発明の調節配列と転換された宿主細胞が希望する蛋白質を 発現するように調節配列と操作可能式に結合されている希望する蛋白質をコード づけするＤＮＡ配列とを含んでなるキメラ遺伝子である。好適な宿主細胞が真核 細胞でありそしてトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）、ブラ シカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（Ｂ、　ｎａｐｕｓ、　Ｂ、　ｃａａ＋ｐｉｓｔｒ ｉｓＳＢ。 ｏ１ｅｒａｃ６ａ）　、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、イネ（ｒｉｃｅ）、ポテト （ｐｏｔａｔｏ）、飼料草（ｆｏｒａｇｅ　ｇｒａｓｓＣｓ）、および小麦（ｗ ｈｅａｔ）からなる群から選択される時には、好適な調節配列は植物種子中で活 性であるものでありそしてそれらにはダイズクニッットリブシンインヒビター、 グリシニン、β−コングリシニン、レクチン、ビーンレクチン、ファセオリン、 トウモロコシＩＱｋＤゼイン、２７ｋＤゼイン、１９ｋＤゼイン、グロブリン１ 、およびグロブリン２をコードづけするものが包含される。好適な宿主が大腸菌 （Ｅ、　ｃｏｌｉ）である時には、好適な調節配列はバクテリオファージエフプ ロモーターシステムおよび翻訳開始配列である。 本発明の他の面は、転換された宿生細胞が希望する蛋白質を発現するように本発 明のキメラ遺伝子で転換された宿主細胞である。本発明のさらに別の面は、転換 された植物が希望する蛋白質を発現するように本発明のキメラ遺伝子で転換され た植物である。そのように転換された植物の種子も本発明の一態様とみなされる 。 本発明の最後の面は、ａ、最終使用者の栄養条件に関する供給作物植物の不足を 算定し、 ｂ０段段階で同定されたアミノ酸石足を補正するためのポリペプチドをコードづ けする核酸フラグメントを合成し、Ｃ１段階すで合成された核酸を植物組織中で の発現および局在用の調節配列と組み合わせ、 ｄ、植物細胞を段階Ｃの生成物を用いて転換させ、ｅ１段段階の転換された植物 細胞から植物を再生させて成熟植物を得て、ｆ４段段階からの植物の種子をアミ ノ酸水準の希望変動量にスクリーニングする ことを含んでなる、最終使用者の栄養条件に応じて植物中の必須アミノ酸の含有 量を変化させる方法である。 本発明を下記の詳細な記載、添付図面および本出願の一部を形成する配列記載か らさらに完全に理解することができる。配列記載は、引用することにより本発明 の一部となるヌクレイツク・アシズ・リサーチ（ＮｕｃＩｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１３　：　３０２１−３０３０（１９８５）およびザ・バ イオケミカル・ジャーナル（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ ）、２１９　：　３４５−３７３　（１９８４）中に記載されているＩｕＰΔＣ −ＩＵＢ樟準に従いヌクレオチド配列文字に関しては１文字コードをそしてアミ ノ酸類に関しては３文字コードを含む。アミノ酸残基は糸種状コイル参考文献の 規則に従い標識づけされている。特許、現在出願継続中の米国出願、本出願の出 願日に公知であった池の開示はここでは引用することにより本発明に含まれる。 図面および配列記載の簡単な説明 図１は、側面および上面からのアルファ螺旋を示す。 図２は、アルファ螺旋状の糸種状コイル構造の末端図（図２ａ）および側面図（ 図２ｂ）を示す。 図３は、同様な形を強調するロイシンおよびメチオニンの化学的構造を示す。 図４は、化学的に合成されそして同定された糸種状コイルポリペプチド類の２セ ツトの末端図を示す。ＣＳＰシリーズは図４ａに示されておりそしてＳＳＰシリ ーズは図４ｂに示されている。 図５は、ＳＳＰ遺伝子配列の構成および発現における使用のためのベクター（ｐ ＳＫ５）の製造方法を記載している。 図６は、塩基遺伝子配列の非反復Ｅａｒ１部位中へのオリゴヌクレオチド配列の 挿入方法を示す。 図７は、プラスミドｐ　Ｓ　Ｋ　６を製造するためのｐ　Ｓ　Ｋ　５のＮｃｏＩ ／ＥｃｏＲ１部位中への塩基遺伝子オリゴヌクレオチドの挿入を示す。この塩基 遺伝子配列゛は図６中の如く種々のＳＳＰコードづけ領域を非反復Ｅａｒ１部位 に挿入してクローニングされた挙げられている部分を製造するために使用された 。 図８は、図９中の重複方式で使用するための非−繰り返し遺伝子配列を製造する ために使用された６３ｂｐ　ｒ部分」オリゴヌクレオチドの挿入を示す。 図９　（ａ十ｂ）は、イン−フレーム融合を使用して非−繰り返し遺伝子を増殖 させるための方法を示す。 図１０は、植物中のＳＳＰ類の発現用キメラ遺伝子の構成を示す。 図１１は、種子特異的プロモーターおよび３′配列カセットを含むベクターを示 す。ＳＳＰ配列はこれらのベクター中に図１０の如＜Ｎｅ。 ｒおよびＡｓｐ７１８部位を用いて挿入される。 図１２は、植物組織のアグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）転換 における使用のための二次ベクターであるｐＺＳ９７ｊ：たはｐＺＳ９７にへの キメラＳＳＰ遺伝子の移動を示す。 図１３は、イネ・プロトプラスト中の５ｓｐ−３−５蛋白質の発現用に使用され る構成体を記載する。ＨＰＨ５０８プロモーターはトウモロコシから誘導された 化学的に誘導可能なプロモーターである。 配列同定番号：１−７および８３は、生体内での発現に適するＳＳＰポリペプチ ド配列である。 配列同定番号＝８および３１は、生体内での発現に適さないＳＳＰポリペプチド 配列である。 配列同定番号＋６０−８２は、生体内での発現に適するＳＳＰポリペプチド配列 の特定の請求されている態様である。 配列同定番号：　９−３０、および３２−５９．８４−１０５，１１０−１１２ は、明細書中に引用されておりそして請求されている本発明の開発において使用 された核酸フラグメントおよびそれらがコードづけする蛋白質を表す。 定義 この開示の概念では、多（の語が使用される。ここで使用される「核酸」という 語は、糖、燐酸塩、およびプリンまたはピリミジンのいずれかを含有する単量体 類（ヌクレオチド類）を含んでなる一本鎖または二本鎖であり得る大きい分子を 称する。「核酸フラグメン日は一定の核酸分子の一部である。比較的高等な植物 では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が遺伝的物質であるが、リポ核酸（ＲＮＡ） はＤＮＡ中の情報の蛋白質への移動に含まれる。「ゲノム」は有機体の各細胞中 に含まれる遺伝的物質の完全体である。「ヌクレオチド配列」という語は゛、場 合によりＤＮＡまたはＲＮＡ重合体中に加えることができる合成性の非−天然ま たは変更ヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本もしくは二本鎖であり得る ＤＮＡまたはＲＮＡの重合体を称する。 ここで使用される「均質な」という語は２個の核酸分子のヌクレオチド配列の間 または２個の蛋白質分子のアミノ酸配列の間の補充性を称する。そのような均質 性の推定は当技術の専門家に良く理解されているような緊縮性条件下でＤＮＡ− ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド化［ハメス（ｎａｍｅｓ）およびヒギ ンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）、編集、（１９８５）、核酸ハイブリッド化（Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｔｄｉｓａｔｔｏｎ）、ＩＲＬプレス、オックスフ ォード、英国］または２個の核酸もしくは蛋白質の間の配列同様性の比較により なされる。 ここで使用される「実質的に均質な」は均質な配列に関するものより少ないハイ ブリッド化緊縮性条件を必要とする核酸分子を称しており、そしてまたコードづ けされたアミノ酸中で変化を起こさない塩基変化を含んでいてもよくまたは１個 以上のアミノ酸を変更できるがＤＮＡ配列によりコードづけされた蛋白質の機能 的性質は変更しないようなコードづけＤＮＡ配列も称する。従って、ここに記載 されている核酸フラグメントは核酸フラグメントの欠失、転位、不規則的または 調節された突然変位から誘導されたヌクレオチド塩基の可能な変種を含む分子も 包括しており、そしてＤＮＡ配列が実質的に均質である限り、場合により起きる ヌクレオチド配列誤差でさえ包括している。 「遺伝子」は、コードづけ領域の前（５′非−コードづけ）および後（３′非− コードづけ）の調節配列を含む特異的蛋白質を発現する核酸フラグメントを称す る。［天ＭＪｉｌｉ子は、それ自身の調節配列を有する天然で見いだされる遺伝 子をｆ！トする。「キメラ」遺伝子は、不均質な調節およびコードづけ配列を含 む遺伝子を称する。「外部」遺伝子は、通常は宿主有機体中には見られないが遺 伝子移動により導入される遺伝子を称する。 「コードづけ配列」は、特異的蛋白質をコードづけそして非−コードづけ配列を 除外するＤＮＡ配列を称する。それは「非中断コードづけ配列」すなわち例えば ｃＤＮＡ中の如くイントロンの欠失を構成するか、またはそれは適当な切片結合 により結合された１個以上のイントロンを含むこともできる。「イントロン」は 、−次転写中で転写されるが細胞内でのＲＮＡの分割および再連結反応により除 去されて蛋白質中に翻訳できる成熟ｍＲＮＡを製造するＲＮＡの配列である。 「開始コドン」および「終結コドン」は、蛋白質合成（ｍＲＮＡ翻訳）のそれぞ れ開始および鎖終結を指定するコードづけ配列中の３個の隣接ヌクレオチドの単 位を称する。「解放読み取りフレーム」は、コードづけ配列の翻訳開始および終 結コドンの間でコードづけされたアミノ酸配列を称する。 ｒＲＮΔＲＮＡは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼで触媒作用を受ける転写か ら生ずる生成物を称する。ＲＮＡ転写がＤＮＡ配列の完全な補充コピーである時 には、それは−次転写と称されるか、またはそれ（ま−次転写の転写後処理から 誘導されるＲＮＡ配列であってもよくそしてそれは成熟ＲＮＡと称される。「メ ツセージＲＮＡＪ　（ｍＲＮＡ）は、イントロンがなくそして細胞により蛋白質 中に翻訳できるＲＮＡと称される。 ここで使用される「適当な調節配列」はコードづけ配列の上流（５′）内および ／または下流（３′）におかれたヌクレオチド配列を称しており、それらはでき れば細胞の蛋白質生合成器官と共にコードづけ配列の転写および／または発現を 調節する。「適当な調節配列」には、プロモーター、エンハンサ−１翻訳リーダ ー配列、３′非−コードづけ配列が包含される。 「プロモーター」は一般的にはそれのコードづけ配列の上流（５′）の遺伝子内 のＤＮＡ配列を称しており、それはＲＮＡポリメラーゼおよび適当な転写用に必 要な池の因子に関する認識を与えることによりコードづけ配列の発現を調節する 。プロモーターは、生理学的または成長条件に応じて転写開始の有効性を調節す る蛋白質因子の結合に含まれるＤＮＡ配列を含有することもできる。それはまた エンハンサ−要素を含有することもできる。 「エンハンサ−」はプロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列である。 それはプロモーターの先天性要素であってもまたはプロモーターの水準および／ または組織−特異性を強化するために挿入された不均質要素であってもよい。こ こで使用される「器官−特異的］または「成長−特異的」プロモーターは、それ ぞれほとんど例えば葉もしくは種子の如き特異的器官中だけにおけるまたは例え ば早期もしくは晩期の胚形成中の如き器官内での特異的成長段階における遺伝子 発現を指定するものである。 ここで使用される「発現」という語は、遺伝子によりコードづけされた蛋白質生 成物の製造を意味するように意図される。「遺伝子生成物」は、遺伝子配列に対 応するｍＲＮＡの翻訳により製造される蛋白質を称する。「過剰発現」は、正常 なまたは転換されていない有機体中の蛋白質の製造水準を越えるトランス／エニ ノク有１１１体中の遺伝子生成物の製造を称する。 ［３′非−コードづけ配列」は、転写終結信号、ポリアデニル化信号およびｍＲ ＮＡ処理または遺伝子発現可能な他の調節信号を含有する遺伝子のＤＮＡ配列部 分を称する。ポリアデニル化信号は一般的には、ｍＲＮ八先へ体の３′端部に対 するポリアデニル酸系統の付加に影響を与えることにより特徴づけられている。 「翻訳リーダー配列」は、プロモーターとＲＮＡ中に転写されるコードづけ配列 との間の遺伝子のＤＮＡ配列部分を称しており、そして翻訳開始コドンの完全に 処理されたｍＲＮＡ上流（５′）中に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮ八 への一次転写の処理、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を与えるかもしれな い。 「信号ペプチド」はポリペプチドのアミノ末端延長を称しており、それはポリペ プチドと一緒に翻訳されて先駆体ペプチドを生成しそしてそれは分泌経路中に入 るために必要である。「信号配列」という語は、信号ペプチドをコードづけする ヌクレオチド配列を称する。 「分子内局在配列」は、分子内標的信号をコードづけするヌクレオチド配列を称 する。「分子内標的信号」は、蛋白質と一緒に翻訳されそしてそれを特定の亜細 胞区分に指定するアミノ酸配列である。［小胞体（ＥＲ）停止一時信号」はポリ ペプチドのカルボキシ−末端延長を称しており、それはポリペプチドと一緒に翻 訳されそしてＥＲ中に保有しようとする分泌経路に入る蛋白質を生ずる。ｒＥＲ 停止一時配列」は、ＥＲ標的信号をコードづけするヌクレオチド配列を称する。 他の細胞内標的配列は、種子および／または葉の中で活性な標的信号並びに液胞 をコードづけする。 「転換」はここでは、宿主有機体のゲノムおよびそれの遺伝的に安定なインへり タンス中への外部遺伝子の移動を称する。植物転換方法の例には、アグロバクテ リウム−介在転換および粒子−加速または「遺伝子銃」転換技術が包含される。 「飼料草」はここでは、動物用の飼料として使用される草を称する。「宿主細胞 」は、本発明のキメラ遺伝子で転換される植物、動物または微生物細胞を称する 。 「アミノ酸類」はここでは天然産出しアミノ酸類（アラニン、アルギニン、アス パラギン酸、アスパラギン、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン 、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、フェ ニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン ）を称する。「必須アミノ酸類」は、動物により合成されることができないアミ ノ酸類である。ここで使用される「ポリペプチド」または「蛋白質」は、アミド 結合（ペプチド結合としても知られる）により線状に結合された単量体類（アミ ノ酸類）からなる分子を称する。 「合成蛋白質」はここでは、天然に生ずることが知られていないアミノ酸配列か らなる蛋白質を称する。アミノ酸配列は天然産出蛋白質との共通性から誘導する こともでき、または全く新らしくてもよい。 「−次配列」は、分子の構造にかかわらずポリペプチド鎖中のアミノ酸類の連結 順序を称する。−次配列は簡単にはポリペプチド鎖のアミノ末端からカルボキシ 末端に記載される。 「二次配列」はここでは、側鎖同定または構造における変動にかかわらずポリペ プチド鎖の物理化学的に好ましい規則的骨格配置を称する。 ここで使用される［アルファｆｆｌ／ｌＪは、１個の螺旋当たり約３．６個の残 基を有する右巻き螺旋を称するっ　「両ｉ媒性」はここでは、螺旋の一面が優勢 的に疎水性でありそして池の側面が優勢的に親水性であるような螺旋構造のポリ ペプチドを称する。 「糸種状コイル」はここでは、互いに巻かれて左巻き超螺旋を形成する２個の平 行な右巻きアルファ螺旋の集合体を称する。 ここで論じられている「塩架橋」は、吸引性静電的相互作用が２対のポリペプチ ド鎖の間または１個の鎖と他の鎖との間に保たれている空間中に配置されるよう な変更されたアミノ酸側鎖の酸−塩基対を称する。 「宿主細胞」は、導入される遺伝物質で転換される植物または動物の細胞を意味 する。 本発明の概念では、必須アミノ酸に「富んだ」蛋白質は天然蛋白質の平均的混合 物に関して見いだされたものより高い百分率のアミノ酸を含有するものである。 詳細な記載 ＳＳＰポリペプチド配列の設計 本発明の一面は、生体内で発現して合成種子貯蔵蛋白質として機能するポリペプ チド類の設計である。ポリペプチド類は、１個のアミノ酸のα−カルボキシル基 が鎖中の次のアミノ酸のα−アミノ基と共有結合されているアミノ酸類の線状重 合体である。鎖中の残基間のそして周囲溶媒との非−共有相互作用が分子の最終 的構造を決める。当技術の専門家は、静電力、疎水性相互作用、および安定な折 りたたまれたポリペプチド鎖の設計における個々のアミノ酸残基の構造的嗜好性 を考慮すべきである［例えば、クレイトン（Ｃｒｉｇｈｔｏｎ）、（１９８４） 　、蛋白質、構造および分子性性質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｒ’ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、ＷＨ，フリーマ ン・アンド・カンバリー、ニューヨーク、１３３−１９７頁、またはシュルツ（ Ｓｃｈｕｌｚ）他、（１９７９）、蛋白質構造の原則（Ｔ’ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ 　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）、スプリンゲル・フェルラグ、 ニューヨーク、２７−４５頁を参照のこと】。多くの相互作用およびそれらの複 雑性のために、設計工程をできれば天然蛋白質モデルの使用により補助すること が示唆されている。 本発明で具体化された合成貯蔵蛋白質（ＳＳＰ類）を選択して、リジン、メチオ ニン、またはトリプトファンが平均水準と比べて富んでいるという可能性を有す るポリペプチド類にする（表２参照）［シュルツ、（１９７９）、蛋白質構造の 原則、スブリンゲル・フェルラグ、ニューヨーク、２頁；ブライト（Ｂｒｉｇｈ ｔ）他、（１９８３）　、ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖ。 Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、１１４９−９３、およびスミス（Ｓｗｉｔｈ）他、編集 、（１９７８）、クイズ。化学および技術（Ｓｏｙｂｅａｎｓ：　Ｃｈｅ＋ａｉ ｓｔｒｙ　ａｎｄ　ＴｅｃｈｎｏＬｏｇｙ）、１巻・ザ・ＡＶＩ・パブリッシン グ・カンパニー、ウェストボート、バクテリアまたは植物から得られた蛋白質の 平均アミノ酸含有量木腸摩　トウモロコシ　！歪ス　ＳＳＰ類リシリシン　７． ０　３．５２　６．４　４３％までメチオニン　３．８　２．０４　１．６　４ ３％までトリプトファン　１．０　０．９４　１．２　１４％までリジンは生理 学的ｐＨにおいて荷電されたアミノ酸であり、従って蛋白質分子の表面上で最も しばしばｑいだされている［チョチア（Ｃｈｏｔｉａ）、（１９７６）、ジャー ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１０５　：　ｌ−１１Ｉ］　、リジン含有量を最 大にするために、出願人は本発明でに体化された高い表面一対一容量比を有する 分子形を選択する。変法では、はとんどの蛋白質に共通な球形を伸ばして棒状に 伸びた構造を形成するか才たは体形成を平らにしてディスク状構造とする。出願 人は前者の立体配置を選択しており、その理由は繊維質蛋白質種には長い棒状蛋 白質に関する数種の天然モデルがあるからである［クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔ ｏｎ）、（１９８４）、蛋白質構造の原則、スブリンゲル・フェルラグ、ニュー ヨーク、２７−４５頁］。 糸種状コイルが繊維質蛋白質種の良く研究されている副群を構成している［ツー エン（Ｃｏｈｅｎ）他、（１９８６）　、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓ ｃｉ、、１１：２４５−２４８参照］。天然の例は、α−ケラチン類、バラミオ ンン、ライト・メロミオシンおよびトロポミオシン中で見られる。これらの蛋白 質分子は、左巻き超コイル中で互いの周りを巻かれている２個の平行なアルファ 螺旋からなっている。この超コイルの繰り返し距離は（個別螺旋の１回の回転当 たり５．４人の繰り返し距離と比べて）１４０人である。超コイルは２個の個別 アルファ螺旋の軸の間にわずかなゆがみ（１０’）を生ずる。 糸種状コイル中には、１回の個別螺旋当たり３．５個の残基があり、超螺旋軸に 関して正確に７個の残基周期性を生ずる（図１参照）。従ってポリペプチド中の ７番目毎のアミノ酸が螺旋軸に関して等しい位置を占める。図１および２ａに示 されているように、出願人は本発明のこの７種の単位中の７位置を（ｄｅｆｇａ ｂｃ）と称する。これにより、糸種状コイル記述において簡単さが得られる。 ７種のうちのａおよびｄアミノ酸類は一次配列中の４．３繰り返しパターンの後 にありそして個別アルファ螺旋の一面上に落ちている（図１参照）。アルファ螺 旋の一面上のアミノ酸が全て非−極性であるなら、螺旋面は疎水性でありそして 例えば他の同様な螺旋の非−極性面の如き他の疎水性表面と関連するであろう。 ２個の螺旋が二量体してそれらの疎水面が互いに整列された時に、糸種コイル構 造が生ずる（図２ａ参照）。 成分アルファ螺旋（ｂ、ｃ、ｅＳｆ、ｇ）の外面上のアミノ酸は、球状蛋白質中 の露呈されそして埋められた残基型の予期されたパターンに従い、天然の糸種状 コイル中では一般的に極性である［シュルツ他、（１９７９Ｌ蛋白質構造の原則 、スブリンゲル・フェルラグ、ニューヨーク、１２頁：タルポット（Ｔａｌｂｏ ｔ）他、（１９８２）、＾ｃｃ、　Ｃｈｅｗ、　Ｒｅｓ、、１５　：　２２４− ２３０　；ホラジス（Ｈｏｄｇｅｓ）他、（１９８１）、ジャーナル°オブ・バ イオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５６　：１２１４−１２２４］　ｏ’荷電されたアミ ノ酸類は時々反対側の鏡上で位置Ｃおよびｇ′または位置ｇおよびｅ′の間で塩 架橋を生じることが見いだされている（図２ａ参照）。 従って、図１に示されているような２個の両親媒性螺旋はａ、　ａ’、ｄｌおよ びｄ′残基の間の疎水性相互作用の組み合わせによりモしてｅとｇ′および／ま たはｇとｅ′残基の間の塩架橋により一緒に保たれる。 超コイル中の疎水性残基の充填が鎖を「登録状態」に保つ。２．３個だけの成分 アルファ螺旋鎖を含む短いポリペプチド類に関しては、螺旋軸の間の１０°のひ ずみは無視することができ、そして２本の鎖が平行処理される（図２ａ中に示さ れている）。 多くの合成糸穂状コイルが文献中に報告されている（ラウ（Ｌａｕ）他、（１９ ８４）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５９：１３２５ ３−１３２６１：ボッジス（ＩＪＬ、（１９８９）、サイエンス、２４３　：　 ６２２−６２８　：　ｔ＊イル（０’Ｎｅ１ｌ）他、（１９９ｏ）、サイエンス 、２５０　：　６４６−６５１］。これらのポリペプチド類は寸法が種々である が、ラウ池は糸種状コイル構造を製造するための二量体には２９個のアミノ酸で 充分であることを見いだした［ラウ他、（１９８４）、ジャーナル・オブ・バイ オロジカル・ケミストリー、２５９　：　１３２５３−１３２６１］。出願人は 、本発明におけるポリペプチドは構造的安定性の理由のために２８−残基以上の 鎖として構成した。 ロイシンジッパ−として知られるある種のＤＮＡは、二量体構造中の蛋白質の組 み立て品を生ずる糸種状コイル構造を製造する領域（一般的には長さが２８〜３ ５個の残基）を含有する［オシエア（０’　５ｈｅａ）他、（１９８９）、サイ エンス、２４３＋５３８１゜これらの蛋白質の配列分析は、６位置はほとんど常 にロイシン残基により占められていることを示す。この位置は好適にはトロポミ オシン中でロイシンにより占められている［ホラジス他、（１９８１）　、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５６　：１２１４−１２２４］。これらのロイシ ンジッパ−配列中の８個のｅ、ｇ、ｅ’、およびｇ′位置はしばしば荷電された 残基である。しかしながら、天然の蛋白質配列は１個の分子中で２個より多い内 部螺旋環架橋をほとんど製造することはない。 本発明のポリペプチド類は水性環境下で糸種状コイル特徴を伴い二量体するよう に設計されている。出願人は、糸種状コイル構造を安定化するために疎水性相互 作用および静電的相互作用の組み合わせを使用した。 はとんどの非極性残基は、螺旋の軸に平行な疎水性縞を生成するａおよび５位置 に制限されている。これが二量体面である。出願人は、この面に沿う大きくかさ のあるアミノ酸類を避けて二量体に伴う立体障害を最少にしそして安定な糸種状 コイル構造の生成を促進する。 位置ａおよびｄにおけるメチオニンはロイシンジッパ−副群において糸種状コイ ルを不安定化させることを示唆する文献中の最近の報告［ランドシュルツ（Ｌａ ｎｄｓｃｈｕｌｚ）他、（１９８９）、サイエンス、２４３　：　１６８１−１ ６８８およびツー（Ｉｌｕ）他、（１９９０）、サイエンス、２５０　：１４０ ０−１４０３］にもかがゎらず、出願人はｓｓｐポリペプチドの疎水性面上のロ イシンをメチオニン残基で置換することを選択した。 メチオニンおよびロイシンは分子形では同様である（図３）。出願人は、疎水性 忌中のメチオニンにより引き起こされる糸種状コイルの不安定化は、塩架橋（ｅ −ｇ′およびｇ−ｅ’）の生成が螺旋中で全ての可能位置において（すなわち１ 回の７種当たり２回）起きている配列で補われるようであることを示した。 リジンおよびメチオニンに富んだポリペプチドを製造するという目標と相客する 程度まで、出願人はポリペプチド中の均衡がとれていない電荷を最少にさせる。 これは、ポリペプチドが生体内で発現された時に合成貯蔵蛋白質と他の植物蛋白 質の間の望ましくない相互作用を避けるのを助ける。 本発明のポリペプチド類は、−次配列に対する最少制限で、規定された構造的に 安定な構造であるアルファ螺旋糸種状コイルに瞬間的に折りたたまれる。これに より、合成貯蔵蛋白質を個別の最終使用者の条件に沿って注文製作することがで きる。アミノ酸は７残基に対して１回までの頻度です、ｃ、および１位置を使用 して７種の繰り返し単位で加えることができる。出願人は、本光明の合成貯蔵蛋 白質中に４３％までのイソロイシン、ロイシン、リンノ、メチオニン、スレオニ ン、およびバリン群からの必須アミノ酸を加えることができそして１４％までの フエニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン群からの必須アミノ酸を加 えることができると、述べる（表２参照）。 ＳＳＰポリペプチド配列の合成および物理的特性下記のポリペプチドをカルボキ シ末端からアミノ末端までミリケン／バイオサーチペプチド合成器でＰＡＬ”樹 脂を固体担体としてそして結合反応用の標準的な９−フルオレニルメチルオキシ −カルボニル（ＦｍＯＣ）化学物質を用いて合成した。粗製ペプチド類をトリフ ルオロ酢酸を用いて樹脂から分解させ、モして逆相高圧液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）により均質となるまで精製した。精製されたペプチドを合成蛋白質 検出試薬としてそして抗体を滴定するための標準として使用される抗体発生にお ける抗原として使用した。ペプチドは下記の物理化学的技術を使用して同定され た。本発明で具体化された合成貯蔵蛋白質は全て生体内で安定な二量体を製造す ることが予期される（表３および４参照）。 ５５Ｐ＋１１１４　８ＥＥ鵡■司εＥ野ボ晴εＥゆア、。αや（ト）配列同定番 号７ＳＳＰ−３−５（Ａ／ＥＩ　ＭＥＥＫＬＫＭＥＥＫＬＫＡＭＥＥＫＬＫＡＭ ＥＥＫＬＫＡにＥＫＬ幻ψ口ＥにＸに伍ＥＫＭＫＥ避Ｅ幻侶ス　配列１’ｉ？Ｉ 定Ｗ４ｔ：１１２合成されたペプチド類の一部には、トウモロコシおよびダイズ から得られる動物飼料中のアミノ酸を制限するトリプトファンが包含される（表 ２）。セットは、正味の正電荷を有するペプチドも包含する。これらのペプチド 類は本発明で具体化されたｓｓＰポリペプチド種のわずかな好適例である。 水溶液中でアルファ螺旋構造を形成するが生体内での発現には適さなかった２種 のペプチド類を合成した（表４）。 皇Ａ 生体内での発現に適さない糸種状コイル合成ペプチド類の例これらのペプチド類 は上記の合成貯蔵蛋白質の多くの特徴を有する。 しかしながら、それらは疎水性表面上にかさばるアミノ酸（トリプトファン）を 含有しておりそして位置ｅとｇ′またはｇとｅ′の間の塩架橋は存在しない。環 状の二色性測定は、これらの配列が水溶液中でアルファ螺旋となり、数種の可能 な構造の１種が平行な糸種状コイルであり、それらは二本糸種状コイル、三本お よび四本平行コイルを形成できることを示している［モネラ（Ｍｏｎｅｒａ）、 ポスター（ｐｏｓｔｅｒ）、「抗−平行糸穂状コイルの生成および安定性（Ｆｏ ｒＩｌｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ ｌｌｅｌＣｏｉ　１ｅｄ−Ｃｏｉ　Ｉｓ月、１９９２年６月９日、蛋白質技術会 Ｊ−１９９２、モントレオール、ケベック、カナダ、アルバー（＾１ｂｅｒ）、 発表、「ＧｃＮ４０イシンジベツクである２−襟準平行糸種状コイルのＸ線構造 （Ｘ−Ｒａｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＧＣＮ４　Ｌｅｕｃｉｎｅ　Ｚｉｐ ｐｅｃ、　ａ　２−５ｔａｎｄａｒｄ　Ｐａｒａｌｌｅｌ　Ｃｏ１１■ ｄ−Ｃｏｉｌ）Ｊ、１９９２年６月９［Ｊ、Ｉ白質技術会議−１９９２、モント レオール、ケベック、カナダ］−これは、ｓｓＰ蛋白質が生体内での発現用に適 していることを示唆しており、自己−会合定数は細胞成分類に関するペプチド単 量［の親ｔｏカより大きくなければならない。 ここで論じられているポリペプチド鎖はＬ−アミノ酸類からなっており、そして 光学的に活性である。さらに、溶液中のペプチドにより製造される二次構造も偏 光性である。溶液中のポリペプチドの環状二色性（ＣＤ）スペクトルを使用して 、ペプチド試料中のアルファ螺旋、ベータシート、および不規則的コイル構造の 百分率を推定できるしアドラー、（１９７３）　、１ｌｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌ、、２７　：　６７５−７３５１．出願人はこれらの技術を使用して化学 的に合成されたい（つかの例示的ペプチド類を同定して、それらが上記の如く水 溶液中で構造的に安定な糸種状コイルであることを確認した（実施例２）。 分析用超遠心［チェルヴエン力（Ｃｈｅｒｖｅｎｋａ）、　Ｃ，Ｈ，、（１９７ ３）、分析用超遠心方法の手引（＾Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏ ｒ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、３９ −６４頁］を使用して分子形に関係なくそして蛋白質の部分的な比容量の知識だ けを必要として溶液中の蛋白質の分子量を決めることができる。部分的な比容量 はアミノ酸組成を基にして概算できる［Ｅｊ、コーン（Ｃｏｈｎ）およびＪ、Ｔ 、１ドサル（Ｅｄｓａｌｌ）、［蛋白質、アミノ酸およびペプチド（Ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ、＾ｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ、３７０頁、 フォノ・ノストランドーレインホルド、プリンストン、ＮＪ。 １９４３］。出願人はこの技術を使用して本発明を具体化する合成貯蔵蛋白質族 の５６アミノ酸例である５ＳＰ−３−５（Ａ／Ｅ）（配列同定番号：１１２）を 同定した。実施例２に記載されている如く、３種の濃度においてそれぞれ２種の 回転速度（２８，ＯＯＯおよび４０．０００ｒｐｍ）並びに２種の温度（４℃お よび２０℃）において試験した。単量体は検出されなかった。これらの結果は、 この蛋白質が溶液中の安定な二量体および四量体の非平衡混合物であることを示 している。 生体内実験は以上で研究された単独成分水溶液よりはるかに複雑である。膜の存 在下で、水性環境からペプチドの疎水性面を除去するための二種の可能な機構が ある；１）膜との相互作用および２）糸種状コイルを製造する二量体。臨界圧力 値はペプチドを膜のような脂質一層中に挿入するのに必要なエネルギーがペプチ ドの疎水性表面を水性溶媒から脂質に移す際に得られる自由エネルギーと等しい ような表面圧力を表す。 この技術は、それらの二量体親和力に反する膜に対する種々のペプチドの相対的 親和力の測定法である。合成ペプチドによる挿入の臨界圧力を使用して、異なる ペプチドが１−バルミトイル、２−オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＧ） 一層とそして結論として同様な脂質からなる天然産出膜と相互作用する傾向を比 較した。 出願人は、大腸菌中のＳＳＰ配列または塩基性ＳＳＰ配列の組み合わせの間には 意義ある差がないことを観察した（下記の実施例６を参照のこと）。しかしなが ら、ペプチド類であるＣＤＰＩおよびＣＤＰ２　（表４）は大腸菌中では良く出 現することができない。出願人は、ポリペプチドが合成されると、それがバクテ リア細胞膜と相互作用して細胞溶解を生じると推測する。Ｃ８Ｐシリーズのペプ チドは水溶液中では試験管内で糸種状コイル構造を形成するようであるが（ＣＤ により測定される）、それらはＣ３ＰＩおよび／またはＣ３Ｐ２の存在下でＰＯ ＰＧ一層の表面張力における変化の測定により測定された膜表面に対する高い親 和力を有していた。 Ｃ８Ｐペプチドの疎水性面上のそれぞれ４個の疎水性残基のうちの２個はトリプ トファンである。これらの残基はかさばっておりそして二量体で２個のポリペプ チド鎖間て望ましくない立体相互作用を引き起こすことがある。また、Ｃ８Ｐシ リーズではｅ−ｇ′およびｅ′−ｇ対は全て正に荷電されたりシン残基であり、 ポリペプチド鎖間で不快な静電的相互作用を生ずる。ポリペプチドのＣ８Ｐシリ ーズは本発明の合成貯蔵蛋白質のセットの構成員ではないが、それらの性質は合 成貯蔵蛋白質に関する許容可能な構造の規定原理を制定する際に重要である。 本発明の好適な面であるＳＳＰシリーズはｃＳＰシリーズと、それらの−次配列 に関する２種の重要な制限により、区別される。ＳＳＰシリーズでは、Ｍｅ　ｔ ％ＬｅｕＳ　ｒ　Ｉ　ｅ、Ｖａ　ｌまたはＴｈｒだけが疎水性芯の中に位置する 。また、Ｃ８Ｐシリーズとは対照的に、ＳＳＰＳウシリーズ中、ｇ、ｅ’、およ びｇ′位置は吸引性静電的相互作用がＳＳＰ二量体中の２個のポリペプチド鎖間 のこれらの位置で常に起きるように制限されている。これらの差のために、ｓｓ ｐシリーズポリペプチドの方がＣ８Ｐシリーズペプチドより二量体としてさらに 安定性がある。 ペプチドを二量体状態で安定化させる螺旋内静電的相互作用はＳＳＰ構造中に存 在するがポリペプチドのＣ８Ｐシリーズには存在しない（それぞれ５ＳＰ４を示 す図４ｂおよびＣ５ＰＩを示す図４８を参照のこと）。 従って、Ｃ８Ｐシリーズは安定な両親媒性の螺旋に折りたたまれるが、鎖内の力 は二量体構造を膜または膜のような脂質一層の存在下で保つのに充分なほど強く ない。Ｃ８Ｐンリーズベブチドの疎水性面と他の疎水性分子との開の相互作用は 二量体生成と有効に競合する。ＨＩＶおよびインフルエンザ誘導されたペプチド 配列の研究は、３０ｍＮ／’Ｍより大きいＰＯＰＧ一層中への挿入用の臨界圧力 を有する融合ペプチドだけが試験管内で合成（モデル）脂質二層の中断を誘発す るようであることを示した［ラフアルスキー（Ｒａｆａｌｓｋｉ）他、（１９９ ０）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ論１ｓｔｒｙｙ）、２９　：　７９１ ７−７９２２］　。Ｃ３Ｐシリーズ−ペプチドはＰＯＰＧ一層中への挿入用に４ ５ｍＮ／Ｍの臨界圧力を有する。それとは対照的に、１個の７種当たり２個の螺 旋内填架橋により安定化されたＳＳＰシリーズペプチドは他の疎水性表面と相互 作用するよりむしろ二量体しそしてＰＯＰＧ一層中への３０ｍＮ／Ｍの臨界圧力 を有する。 従って、本発明に記載されている新規な合成貯蔵蛋白質は可能な糸種状コイルポ リペプチドの特別なサブセットを表すものである。水溶液中で両親媒性のアルフ ァ螺旋構造に適合するポリペプチドの必ずしも全てが、ポリペプチドのＣ８Ｐシ リーズで示されているようにここに記載されている用途に適するわけではない。 出願人の研究から得られた下記の原則は出願人が発明として請求するＳＳＰポリ ペプチドを規定するものである。 合成ポリペプチドはそれぞれが同一であるかまたは異なるｎ個の７種の単位（ｄ ｅｆｇａｂｃ）を含んでおり、ここでｎは少な（とも４であり、 ａおよびｄは独立してＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉ　ｌｅおよびＴｈｒからなる 群から選択され、 ｅおよびｇは独立して酸／塩基対であるＧｌｕ／Ｌｙｓ。 Ｌｙｓ／Ｇｌ　ｕ、Ａｒｇ／Ｇ　ｌ　ｕ、Ａｒｇ／Ａｓｐ、Ｌｙｓ／Ａｓｐ。 Ｇ　ｌ　ｕ／Ａ　ｒ　ｇ、　Ａｓ　ｐ／Ａ　ｒ　ｇおよびＡｓｐ／Ｌｙｓからな る群から選択され、 ｂＳｃおよびｆは独立してＧ　Ｉ　＞−またはＰｒｏ以外のアミノ酸であり、そ してそれぞれの７種中のす、ｃおよび「の少なくとも２個のアミノ酸はＧｌｕ、 Ｌｙｓ％Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ。 Ａｓｎ、Ｇｉｎ、ＣｙｓおよびＡ４ａからなる群から選択される。 大腸菌発現ベクターの構成 出願人は図５に示されている方法を設計して適切な遺伝子配列を構成して大腸菌 中で上記のポリペプチドを製造した（実施例５も参照のこと）。 この方法は、Ｅａｒｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有しない大腸菌中での遺 伝子生成物の発現用ベクターを必要とした。他の条件は、ベクターがバクテリオ ファージエフプロモーター、翻訳リーダー配列、大腸菌中の高水準発現用の転写 ターミネータ−１および下記の遺伝子配列の挿入用の適当なりローニング部位を 含有するものであった。出願人は選択可能なマーカーとしてほとんどの発現ベク ターに担持されているアンピシリン抵抗よりむしろテトラサイクリン抵抗を好ん だ。テトラサイクリン抵抗マーカーを担持するプラスミドはプラスミド維持に関 する選択圧力を保つことが比較的容易であるため、それはブロス培地中で細胞力 １ら比較的少なく損失されるようである。 ベクターｐＳＫ５は図５に示されている数段階で構成される。（１）プラスミド ｐｓＫ１は会合されたＥａｒ■部位を含むｐＢＲ３２２のアンピシリン遺伝子領 域の自然欠失である。（２）プラスミドｐｓＫ２１ｔポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ Ｒ）（セツス・コーポレーション、エメリーヴイル、ＣＡ）　、塩基２３５３に おけるＥａｒ１部位を除いた部位におけるプライマー５Ｍ７０　（配列同定番号 ＝９）および５Ｍ７１（配列同定番号＝１０）を使用する全体的ｐｓＫ１プラス ミドの増殖により得られた。（３）プラスミドｐＳＫ３は、ＥｃｏＲＴを用いる 切断、該部位へのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントの充填およびベク ターの再連結反応によりｐＳＫ２の塩基１におけるＥｃｏＲＩ部を除去すること により、製造された。（４）　ｐＥＴ−３ａの誘導体であるｐＢＴ４３０［ロー ゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）他、（１９８７）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、５ ６　：１２５−１３５１では、ＡＴＧ翻訳開始部位におけるＮｄｅ１部位を試験 管内突然変異生成によりＮｃｏ１部位に変更した。プラスミドｐＢＴ４３０から のＴ７プロモーター／ターミネータ−配列をＰＣＨにより増殖し、クレノー酵素 の充填により平滑末端とし、キナーゼ処理し、そしてｐＳＫ３のｐｖｕｌｒ部位 中に連結反応させてｐＳＫ５を製造した。制限エンドヌクレアーゼ消化分析およ びＤＮＡ配列分析でｐ　ＳＫ５中のＰＣＲフラグメントの配向性および一体性を 確認した。 糸種状フィル合成貯蔵蛋白賃用のペプチド配列を基にする遺伝子配列の数社 上記のポリペプチドを生体内で製造するために、出願人はポリペプチド類である ５ＳＰ５．７．８．９．１０および１１（配列同定番号；２．３．４．５、およ び６）のセットをコードづけするＤＮＡ配列を設計した。植物および大腸菌中で の翻訳用コドンをこれらの好適種から選択した。ＤＮＡ配列はＡＢＩＤＮＡ合成 器を用いてオリゴヌクレオチドとして製造しそして図６に示されている如くプラ スミドベクター中に挿入した。 ■、　これらの遺伝子をコードづけするための最初の方法は下記の如くであった ・ベクターｐＳＫ５をＮｃｏ　＋およびＥｃｏＲＩを用いて完全に分解させ、キ ナーゼ処理されたオリゴヌクレオチド５Ｍ８０　（配列同定番号：１４）および Ｓ’Ｍ８１（配！７１１同定番号：１３）と混合しそして連結反応させた。この 連結反軸、からプラスミドｐＳＫ６が製造され、それはオリゴヌクレオチド５Ｍ ８０（配列同定番号、１４）および５Ｍ８１（配列同定番号：１３）の「塩基遺 伝子」配列を含有していた。この「塩基遺伝子ｊ用のオリゴヌクレオチド挿入部 が１４個のアミノ酸（ＳＳＰ配列の２個の繰り返し、配列同定番号：１１１）を コードづけした。 さらに、「塩基遺伝子」配列は非反復Ｅａｒ１部位を有しており、その中に種々 の遺伝子配列の繰り返し単位を挿入できた。Ｅａｒｌ制限エンドヌクレアーゼは 、ＤＮＡ上での切断部位が上部鏡上の認識部位の４個の塩基５′および底の鏡上 の認識部位の１個の塩基であり、特定配列用の特異的な５′突出が残るという点 で異常である：ＡＲ１ １配列同定番号、１３のヌクレオチド類２１−３１三の特徴により、この部位を 一方向だけで挿入するための適切な突出配列を有するオリゴヌクレオチドが可能 となる。図６中の代表的な配列用の２１−塩基オリゴヌクレオチドを連結反応さ せてマルチマー配列を得て、それを次に塩基遺伝子のＥａｒ１部位中に直接的に 連結反応させた。 ２１−塩基オリゴヌクレオチドセットの大きいマルチマー（＞８ｎ）である５Ｍ ８４／５Ｍ８５　（配列同定番号：１５／１６）（ＳＳＰ５）および５Ｍ８２／ ５Ｍ８３　（配列同定番号：１７／１８）（ＳＳＰ７）を１８％ポリアクリルア ミドゲルから単離した。液体オリゴヌクレオチドはこれらのゲル上でマルチマー 形のはしご配列を示した。８ｎ（１６８ｂｐ）より大きい帯をゲルから切断し、 溶離し、そしてエタノール沈澱により精製した。これらのゲル−精製されたオリ ゴヌクレオチドマルチマーをＥａｒｌ消化されたｐＳＫ５ベクターと連結反応さ せた。テトラサイクリン−抵抗性転換物質を制限−消化分析および二本鎖捕獲に よりスクリーニングした。はとんどの挿入部は２ｎ　（４２ｂｐ）以上であった が、５ｎ　（１０５ｂｐ）より大きい挿入部を有するクローンは単離されなかっ た。 使用された挿入オリゴヌクレオチドのマルチマー形を富ませる他の方法は、ＨＰ ＬＣによる連結反応されたマルチマー形の精製であった。この方法はＤＮＡフラ グメントを寸法を基にしてＤＥＡＥ−ＮＰＲイオン交換カラム上でＮａＣｌ勾配 を用いて分離した。連結反応したオリゴヌクレオチドセット５Ｍ８２／８３（配 列同定番号：１７／１８）（ＳＳＰ　７）　、３Ｍ８４／８５　（配列同定番号 ：１５／１６）（ＳＳＰ５）、５Ｍ８６／８７　（配列同定番号：　１９／２０ ）（ＳＳＰ８）　、５Ｍ８８／８９（配列同定番号：２１／２２）（ＳＳＰ９） 、５Ｍ９０／９１（配列同定番号：　２３／２４）（ＳＳＰＩＯ）　、５Ｍ９２ ／９３　（配列同定番号：２５／２６）（ＳＳＰＩＩ）をカラム上に注ぎ、溶離 し、部分を集めそしてＤＮＡ寸法標準に関する既知の保有時間を基にして貯蔵し た。 ５ｎ　（１２６ｂｐ）以上のオリゴヌクレオチドセットのマルチマー形を精製し そして寸法をポリアクリルアミドゲル上で確認した。精製されたオリゴヌクレオ チドをＥａｒｒ／ｒｌ化されたｐＳＫ６中に連結反応させ、そしてテトラサイク リン−抵抗１′１転換物質を大腸菌菌株ＤＨ５α中で選択した。クローンを制限 消化および捕獲にょリスクリーニングした。ゲル精製と同様に、はとんどのクロ ーンは２ｎ　（４２ｂｐ）以上の挿入部を有したが長さが６ｎ（１２６１＋ｐ） より大きい挿入部はなかった。この工程から出願人は以上に記載されている試験 ポリペプチド配列のそれぞれをコードづけする遺伝子配列を得た（配列同定番号 ＝２−７および表５では、配列をフランキングする最初および最後の５ＳＰ５の ７種が塩基遺伝子配列を表す。挿入配列は下線が引かれている。文字「■４」を 含むクローン番号がＨＰ　Ｌ　Ｃ−精製されたオリゴヌクレオチドを指定してい る。クローン８２−４中の最初の塩基遺伝子繰り返しの損失はベクターｐＳＫ６ がｒｅｃＡ−菌株に移される前の塩基遺伝子繰り返し５゜５の同族組み換えから 生ずると信じられている。 上記の遺伝子構成方法により、Ｅａｒ１部位中への種々の２１ｂｐオリゴヌクレ オチドの挿入部を単に変えることにより遺伝子配列の混合を有利に行える。Ｅａ ｒｌ酵素は認識部位で分解しないため、該部位は分解点における挿入部にかかわ らず無傷のままである。従って、上記の如く「第一回」で精製した遺伝子配列を 延長することもできそしてポリペプチド配列をいずれかの順序でその後のＥａｒ １分解部位中へのオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメント挿入により組み 合わすことができる。これらの挿入遺伝子（ｅｘ：８４個の塩基＝４）の比較的 長いオリゴヌクレオチド型を合成して比較的長い遺伝子配列を製造することが有 利であるかもしれない。一方、遺伝子部分を増殖させるための他の方法を使用し て比較的長い遺伝子配列を構成することもできる［ケンペ（Ｋｅｍｐｅ）他、（ １９８５）、ジーン、３９　：　２３９−２４５］。 出願人は、塩基遺伝子の２０繰り返しを用いてでもＤＮＡの小部分が大腸菌菌株 ＪＭ１０３　（ｒｅｃ＋）中に保たれている時にはある場合には欠失されたこと に注目した。これは均質な組み換えによるものかもしれなかった。この可能性を 除くために、出願人は日常的に挿入構成体をｒｅｃＡ−大腸菌菌株ＤＨ５ａ　［ ５ｕｐＥ４４　ｄｅｌ　ＩａｃＵ１６９、　（ｐｈｉ　８０　ＩａｃＺ　ｄｅｌ 　Ｍ１５）　ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡ１ｇｙｒ１９６　ｔｈｉｌ　ｒｅｌＡ１］に 転換させた。これらの繰り返し配列は組み換えに向いているアグロバクテリウム および植物細胞中に転換された時に同様な問題を生ずるため、ＤＮＡ配列を再設 計して繰り返しを少なくしそしてその結果両組み換え性を小さくした。このため には、出願人は別のコドンを使用し、および／または数種のポリペプチド配列と 混合した。出願人はこれらのオリゴヌクレオチドを８４量体として合成して、比 較的長い初期遺伝子配列を確保した。 ＭＥＥＫ）４ＫＡＭＥＥ）ＣＭ　に Ｍ　ＥＥ　に　ＬＸＡＭＥＥＫＬＸ Ｈｒ、ＥＫ　Ｌ　ＫＸＭＥＥＫＬＫ これらのオリゴヌクレオチドをキナーゼ処理し、そしてクローン８２−４（配列 同定番号　４４）および８４−８３　（配列同定番号　４６）のＥａｒ１部位中 に連結反応させてそれぞれクローン２−９（ポリペプチド配列＝ＳＳＰ７．７． ７．７．７．７．８．９．８．９．．５Ｘ配列同定番号：５７）、クローン３− ５ポリペプチド配列＝ＳＳＰ７．７．７．７．７．７゜５．５）配列同定番号　 ９１）および５−１（ポリペプチド配列＝ＳＳＰ！５．５．５．７．７．７．７ ．５）　（配列同定番号：５９）を製造した。これらの設置と同＋１　ｆＬ配列 を使用してポリペプチドのいずれかまたはここに開示されているポリペプチドの いずれかの組み合わせをコードづけする遺伝子を構成するために使用できた。コ ードづけ領域の長さは塩基遺伝子のＥａｒ１部位中への一連の該オリゴヌクレオ チド配列の挿入により増加させることができた。一方、その後の７種のコードづ け単位用の非反復部位を有する異なる塩基遺伝子の挿入によりコードづけ配列を 構成することもできる。そのような遺伝子はｐｓＫ５のＮｃｏｌ／Ｅｃ。 ＲＩ部位または数百側の塩基配列を生成するｐＳＫ５のＥａｒＩ部位中に一緒に 連結反応させることができる長い（９−１０ｂ）突出端部を有する一連のオリゴ ヌクレオチドを生成させることによっても、そのような遺伝子を構成することが できた。 Ｉｌ、ＳＳＰ遺伝子の第二の生成法はＤＮＡおよびアミノ酸配列中にさらに多い 変動性を加えるように設計された。これらの配列は、バクテリアまたは植物細胞 中の遺伝子の均質な組み換えまたは欠失または転位を刺激するかもしれないＤＮ Ａ水準における正確な配列の繰り返しを避けるように設計された。また、ダイス 、トウモロコシおよび大腸菌中で好ましいことが知られているコドンが選択され た［カンブベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）他、（１９９Ｑ）、円ａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ ｏｌ、、９２：１−１１１．さらに、出願人は植物細胞中の外部遺伝子の発現に 関する公開されたデータを基にしたｍＲＮＡの安定性を最大にする遺伝子配列を 設計した［ペルラフ（Ｐｅｒｌａｋ）、　Ｆ、　Ｊ　、　、フックス（Ｆｕｃｈ ｓ）、　Ｒ，Ａ、、ＰＮＡＳ、８８．３３２４−３３２８　（１９９１）］。全 てのＤＮＡ配列はすでに略記されているパラメーターと合致するアミノ酸配列を コードづけする。 遺伝子配列のこの第二の生成構成方法は図８および９に記載されている。第一段 階はベクター１）ＳＫ５のＮｃｏ　ｌ／ＥｃｏＲ１部位中ヘノ１６個のアミノ酸 類の塩基遺伝子をコードづけするオリゴヌクレオチド配列５Ｍ１０７／１０８　 （配列同定　９２／９３）の挿入であワた。この塩基遺伝子の特徴には、６３個 の塩基対１１繰り返しｒ部分」をその後に挿入ための非反復Ｅａｒ１部位および 図９に記載されている如き「部分」を重複可能にする遺伝子の３′端部における 非反復Ｂｓｐｌ−１１部位が含まれる。粗製「部分」オリゴヌクレオチドセット ５Ｍｌｌ０／１１１　（配列同定番号：９４／９５）、５Ｍ１１２／１１３　（ 配列同定番号：９８／９９Ｌ　５Ｍ１１４／１１５　（配列同定番号：１０２／ １０３）をアニーリングし、モしてＥａｒ１部位中に連結反応させて３種の別個 のクロー：ｚ：ｐＳＫｓｅｇ３、ｐｓＫｓｅｇ４およびｐｓＫｓｅｇ５を製造し た。これらの「部分」クローン中では、ＤＮＡ配列はコドン使用およびアミノ酸 配列条件の限度内ではできるだけ非−繰り返し性である。出願人は、図９に記載 されておりそして実施例５に記されている増殖方式を使用して３種の遺伝子部分 を結合させることにより１０７アミノ酸遺伝子配列を構成した。生じたクローン はｐＳＫｓｅｇ５３４と指定された。 表６は、植物中への転換用に選択されたこれらの数種のクローニング方式から誘 導されたクローンによりコードづけされた蛋白質の相対的アミノ酸含有量のまと めである。 大腸菌中のＳＳＰポリペプチドの発現 上記の如（して構成されたＳＳＰ配列を大腸菌中でバクテリオファージＴ７ＲＮ Ａポリメラーゼ／Ｔ７プロモーターシステムを使用して発現させた［スツジエル （Ｓｔｕｄｉｅｒ）他、（１９９０Ｌメソツズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ）、１８５　：　６０−８９１．菌株Ｂ Ｌ２１　（ＤＥ３）［ｈｓｄＳ　ｇａｌ　（ｌａｍｂｄａ　ｃＩｔｓ８５７　１ ｎｄｊ　Ｓａｍ７　ｎ１ｎ５　１ａｃ　ＵＶ５−Ｔ７　ｇｅｎｅｌ）］中で、Ｔ ７ポリメラーゼを１ａｃＺプロモーターの調節下で配列をコードづけするポリメ ラーゼの染色体コピーから製造した。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ ）の添加によるＩａｃＺプロモーターの抑制解除が細胞中でのＴ７ＲＮＡポリメ ラーゼの発現を誘発させた。菌株ＤＨ５αまたは８ＭＳ１７４　［ｒｅｃＡ　ｈ ｓｄＲｒｉｆＲ］中では、配列をコードづけする内因性Ｔ７ボリメラーゼはない 。バクテリオファージＩ　ａｍｂｄａＣＥ６の感染によりＴ７ポリメラーゼ遺伝 子および遺伝子生成物をこれらの細胞に分配させることができた。このファージ はＴ７ボリメラーゼ遺伝子を担持しており、そしてこれらの菌株の感染を可能に するが両者の菌株上では非−溶解性である。誘導工程はスチジエル他［（１９８ ６）　、Ｊ、　ｌ１ｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１８９　：１１３−１３０］により記 載されているようなものであった。 Ｔ７プロモーター配列から下流に位置するＳＳＰコードづけ配列を含有するプラ スミドを担持する細胞をＩＰＴＧを用いてまたは晩期対数増殖期中に］ａｍｂｄ ａＣＥ６ファージの添加により誘導した。出願人は、得られた培養物の濁り度は 誘導１＆に水準をはずれるかまたはわずかに低下する傾向があるが、遺伝子生成 物の誘導で溶解性活性の兆候はなかつた。３ｓＳメチオニンを使用する生体内標 識づけ実験のために誘導から１〜３時間後に試料を採取した。ｓｓＰ蛋白質の高 いメチオニン含有量およびＴ７プロモーターからの過剰発現のために、出願人は これらのポリペプチドを細胞中の他の蛋白質より多い量の標識づけメチオニンを 加えるであろうことを予測した。１ＭＳ標識づけ実験はスチジエル他［（１９８ ６）　、Ｊ、１ｌｏ１．Ｂｉｏｌ、１８９　：１１３−１３０１により記載され ているようなものであった。標識づけされていない細胞試料を誘導から１〜３時 間後に採取し、そして遠心により１０倍に濃縮した。 細胞抽出物からの標識づけされていないおよび標識づけされた蛋白質の両試料を １８％（７５：１アクリルアミド：ビス）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で 分離した。クーマシーブルーを用いるゲルの染色で誘導された培養試料中で製造 された追加蛋白質を出現させたが、誘導されなかった培養中ではそうではなかっ た。これらの蛋白質は上記の合成遺伝子のそれぞれに対して予期された概略寸法 のものであった。これらのアルファー螺旋蛋白質は球状蛋白質寸法標準から予期 されたものより速くゲル上で走行する傾向があった。さらに、ゲル中での特定ポ リペプチドの泳動速度に対する配列の影響が少しあった。３ｓｓメチオニンで標 識づけされた蛋白質をゲルのオートラジオグラフィにより可視化した。 予期された如（、ＳＳＰ蛋白蛋白内因性大腸菌蛋白質の背景水準よりはるかに高 く標識づけられていた。同様なゲルシステム中で走行した試験管内合成ペプチド の染色を基にして、出願人はこれらのペプチドの製造が約４０ｍｇ／Ｌの誘導さ れた培養物であると推定した。 蛋白質遺伝子生成物の寸法およびｊｓ３メチオニンを用いるそれらの強い標識づ けを使用して特定のポリペプチド生成物を同定した。さらに、これらのゲルのウ ェスタン・プロットを試験管内合成ポリペプチドであるＳ　Ｓ　Ｐ（５）４　（ 配列同定番号、２）もしくは５ＳＰ（７）４　（配列同定番号−３）に対して高 くされた抗体とまたは抗体ＧＳＴ−３ＳＰ−３−５と反応させた。ホースラディ ツシュペルオキシダーゼおよび化学蛍光検出システム（アメルシャム）と共役さ れた二次抗体を使用して、抗体−反応性蛋白質を検出した。変性されていない化 学的に合成されたドツト・プロットを用いる抗−３ＳＰ抗体の特異性の試験は、 抗−８ＳＰ抗体は種々のＳＳＰ配列と交差反応することを示している。しかしな がら、ペプチドがゲルシステム中で変性される時には、抗体の反応はさらに特異 的である。特定のＳＳＰポリペプチドに対して高くされた抗体は大腸菌培養物中 で誘導されたＳＳＰポリペプチドと特異的に反応する。すなわち、抗−３ＳＰ５ は５ＳＰ５配列を含有する蛋白質と反応し、そして抗−３ＳＰ７は５ＳＰ７配列 を含有する蛋白質と反応する。これらの相互反応の特異性が誘導された蛋白質の 配列を確認した。 合成貯蔵蛋白質は大腸菌中で遺伝子融合生成物として発現することもできる。フ ァーマンアｐＧＥＸ”システムを使用して、グルタチオン−５−１−ランスフェ ラーゼおよび５ＳＰ−３−５からなる融合蛋白質を製造した。この融合蛋白質を 親和クロマトグラフィーにより精製しそして兎を免疫処理するために使用した。 抗−ＧＳＴ−３ＳＰ−３−５抗体を含有する生じた血清を５ＳＰ−３−５１白質 を発現するトランスジエニ・ツク細胞の別の研究用検出試薬として使用した（配 列同定番号：９１）。 本発明を使用して、大腸菌または池の転換された微生物の発酵により必須アミノ 酸に富んだＳＳＰポリペプチドまたは合計蛋白質を製造した。 本発明のＤＮＡ配列はプロモーター配列、翻訳リーダー配列および３′非コード づけ配列を含む適当な調節配列と操作可能式に結合させることができる。キメラ 遺伝子を次に転換により微生物中に加えそして転換された微生物をキメラ遺伝子 の高い発現をもたらす条件下で成長させることができる。必須アミノ酸に富んだ 蛋白質を含有する細胞を集め、蛋白質を抽出しそして精製することができる。希 望により、例えばグルタチオン−８−トランスフェラーゼの如き蛋白質担体を使 用してＳＳＰポリペプチドの精製を簡単にすることができる。スロンビンまたは 因子Ｘのための認識部位が担体蛋白質と合成ポリペプチドとの間に含まれている なら（ｐＧＥＸＴ１″システムの場合の如き）　、ｓｓｐポリペプチドを担体蛋 白質から容易に分離することができる。 一方、精製方法が蛋白質の物理的性質を基にしてもよくまたは（融合蛋白質の場 合には）親和力を基にしていてもよい。蛋白質は多くの天然産出蛋白質と比べて 小さい。それらは変性剤を単に除去することにより変性剤の溶液から容易に再び 折りたたまれる。ＳＳＰの一精製方法は、細胞を６Ｍ尿素中に溶解させ、ゲル濾 過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラ フィーを使用して蛋白質混合物を分離し、そして！＆後に尿素を透析により除去 する方法である。 蛋白質の他の利用可能な性質はそれらのりシン含有量である。正に荷電されたＳ ＳＰに関しては、アニオン交換引脂を使用してほとんどの蛋白質を粗製混合物か らＳＳＰを結合させずに除去できる。 植物中のＳＳＰの発現 ＳＳＰ遺伝子のコードづけ配シリの発現用に好適な種類の異種宿主は、真咳宿主 、特に高等植物の細胞、である。高等植物およびそれらから誘導される種子の中 で特に好適なものは、ダイス、ナタネ種子（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ、　Ｂ 、　ｃａ＋ａｐｉｓｔｒｉｓ）　、ヒマワリ（ｌｌｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎ ｕｓ）、ワタ（ＧｏｓｓｙｐｉｕＩｌｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバ コ（ＮＬｃｏｔｉａｎａ　ｔｏｂａｃｕ＋ｓ）、アルファルファ　（Ｍｅｄｉｃ ａｇｏ　５ａｔｉｖａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｓｐ）　、大麦（Ｈｏｒｄ ｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）、カラスムギ（＾ｖｅｎａ　５ａｔｉｖａ、　Ｌ）、 モロコシ（Ｓｏｒｇｈ＋ｕｓ　ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ　５ａｔｉ ｖａ）、および飼料草（ｆｏｒａｇｅ　ｇｒａｓｓｅｓ）である。植物中での発 現は該植物中で機能する調節配列を使用するであろう。 植物中の外部遺伝子の発現は良く制定されている［デ・ブラエレ（ＤｅＢｌａｅ ｒｅ）他、（１９８７）、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｉｏｌ、、１５３　：　２７７ −２９１１゜コードつけ配列の発現を推進させるために選択されるプロモーター は、それが梠望する宿主組織中のＳＳＰ用の翻訳可能なｍＲＮＡの水準を増加さ せることにより本発明を行うのに充分な転写活性を有する限り、厳密なものでは ない。全ての植物器官における発現用そして特に葉の中の発現用に好適なプロモ ーターには、カリフラワーモザイクウィルス［オデウ（Ｏｄｅｌｌ）他、（１９ ８５Ｌネーチヤー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３１３：８１０−８１２；フル（Ｉｌｕ ｌｌ）他、（１９８７）、ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、８６　：　４８ ２−４９：３］、リブロース１．５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ［モレ リ（ＭｏｒｅｌＨ）他、（１９８５）、ネーチャー、３１５：２００：プログリ −（Ｒｒｏｇｌ　ｉｅ）他、（１９８４）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２ ２４；８３８；へレラーエステレラ（ｌｌｅｒｅｒｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ　ｌａ） 他、（１９８４）、ネーチャー、３１０：１１５；コルッジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ） 他、（１９８４）　、ＥＭＢＯＪ、、３　：１６７１　；ファシオッチ（Ｆａｃ ｉｏｔｔｉ）他、（１９８５）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ １ｏｇｙ）、３：２４１］、トウモロコシゼイン蛋白質［７ツケ（Ｍａｔｚｋｅ ）他、（１９８４）　、ＥＭＢＯＪ、、３：１５２５］、並びにクロロフィルａ 　／　ｂ結合用蛋白質［ランパ（Ｌａｍｐａ）他、（１９８６）、ネーチャー、 ３１６　：　７５０−７５２］並びに化学的に誘導可能なブ０％−ター１ｎ・２ −２　［ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１２１０］およびそれの誘導体類が包含される。 プロモーターの選択は発現が望まれる植物の特異的器官により推進されるであろ う。好適なプロモーターが種子中での蛋白質特異性の発現を可能にする。種子は 植物性蛋白質の一次原料であるため、この用途は特に有用である。また、種子− 特異的プロモーターには多くの植物中で合計種子蛋白質の５０％より多い種子貯 蔵蛋白質のプロモーターが包含されるが、それらに限定されるものではない。種 子貯蔵蛋白質は厳密に規制されており、種子中ではほとんど高度に器官−特異的 および段階−特異的方法でのみ発現する［ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）他、（１ ９８４）、Ａ曲。 Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｉ’ｈｙｓｉｏ１．．３５　：１９１−２２１　；ゴー ルドベルブ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）他、（１９８９）、セル（Ｃｅｌｌ）、５６　 ：１４９−１６０　；　）ンブソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）他、（１９８９）、バ イオエッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ）、１０：１０８−１１３］。さらに、異 なる種子貯蔵蛋白質を種子成長の異なる段階で発現させることもできる。 トランスジェニック双子葉植物中での種子貯蔵蛋白質の種子−特異的発現に関す る多くの例が最近出ている。これらには、ビーンのβ−ファセオリン［セングブ ターゴバラン（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ）他、（１９８５）、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ＾、８２：　３３２０−３３２ ４　、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）　他、（ｌ　９８８）　、　ｌ’ｌ　ａｎｔ 　Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ、　、　１１　二　７１７−７２９〕、ビーンのレクチン［ ヴエルケル（Ｖｏｅｌｋｅｒ）他、（１９８７）、ＥＭＢＯＪ、、６　：　３５ ７１−３５７７］　、ダイスのレクチン［オカムｏ　（ＯｋａＩｌｕｒｏ）他、 （１９８６）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８３ 　：　８２４０−８２４４］、ダイズクニッットリプシンインヒビター［プレッ ツーグラウ（１’ｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ）他、（１９８９）、プラント・セル（Ｐ ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ）、１；０９５−１１０９１　、ダイスのβ−コングリシニ ンしビーチ−（Ｂｅｓｃｈｙ）池、（１９８５）　、ＥＭＢＯＪ、、４　：　３ ０４７−３０５３　；バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）他、（１９８８）　、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８５：４５８−４６２；チェノ （Ｃｈｅｎ）他、（１９８８）　、　ＥＭＢＯＪ、、７　＋　２９７−３０２； チェン他、　（１９８９）　、Ｄｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、、１０：１１２−１２２ ；ナイトウ（Ｎａｉｔｏ）＊、　（１９８８）　、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、、１１　：１０９−１２３１、ピーのピシリンしヒギンズ他、（１９８８ ）　、Ｐｌａｎｔ　ｌ１ｏｌ。 Ｂｉｏｌ、、１１　：　６８３−６９５］　、ピーのコンビシリン［ニュービギ ン（Ｎｅｗｂｉｇｉｎ）他、（１９９０）、円ａｎｔａ、１８０：４６１１、ピ ーのレグミン［シルサト（Ｓｈｉｒｓａｔ）他、（１９８９）　、　Ｍｏｌ、　 Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１５：３２６］、ナタネ種子のナビン［ラドケ （Ｒａｄｋｅ）他、（１９８８）、Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、７ ５　：　６８５　６９４］のための双子葉植物からの遺伝子並びに例えばトウモ ロコシ１５ｋＤゼイン［ホフマン他、（１９８７）　、ＥＭＢＯＪ、６　：　３ ２１３−３２２１　；シエルンタナ−（Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ）他、（１９ ８８）　、ＥＭＢＯＪ、７　：１２４９−１２５３　＋ウィリアムソン（Ｗｊ　 ｌｌｉａｍｓｏｎ）他、（１９８８）　、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、８８ 　：　１００２−１００７］　、大麦のβ−ホルデイン［マリス（Ｍａｒｒｉｓ ）他、（１９８８）、円ａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１０　：　３５９−３６ ６］および小麦のグルテニン〔コロット（Ｃｏｌｏｔ）池、（１９８７）　、Ｉ ＪＢＯＪ、、６　：　３５５９−３５６４］の如き単子葉植物からの遺伝子が包 含される。さらに、キメラ遺伝子構成中で異種コードづけ配列と操作可能式に結 合されている種子−特異的遺伝子のプロモーターはトランスジェニック植物中で それらの一次的および空間的発現パターンも保有している。そのような例には、 アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびＢ、ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕ ｓ）種子中のエンケファリンペプチドを発現させるためのアラビドプシス・タリ アナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）　２　Ｓ種子貯蔵蛋白質遺 伝子プロモーター［ヴアンデケルコーヴ（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ）他、 （１９８９）、バイオ／テクノロジー、７・９２９−９３２１　、ルシフェラー ゼを発現させるビーンのレクチンおよびビーンのβ−ファセオリンプロモーター ［リッグス（Ｒｉｇｇｓ）他、（１９８９）　、Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、６３　 ：　４７−５７］　、並びにクロルアンフェニコールアセチルトランスフェラー ゼを発現させる小麦グルテニンプロモーター［コロット他、（１９８７）　、Ｅ ＭＢＯＪ、、６　：　３５５９−３５６４〕が包含される。 本発明で特に有用な用途は例えばクニッットリブシンインヒビター［ジョフク（ Ｊｏｆｕｋｕ）他、（１９８９）　、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、１　：１０９５− １１０９：ペレツーグラウ（Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ）他、（１９８９）　、Ｔ’ １ａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、１：１０９５−１１０９１　、グリシニン（ネイルソン（ Ｎｅｔｌｓｏｎ）他、（１９８９）　、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、１　：３１３− ３２８１　、β−コングリシニン［ハラダ（Ｈａｒａｄａ）他、（１９８９）　 、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、１：４１５−４２５１用の如き数種の広く同定されて いるダイス種子貯蔵蛋白質からの異種プロモーターであろう。クイズβ−コング リシニン貯蔵蛋白質のα′−およびβ−亜単位のための遺伝子のプロモーターが ダイス種子開発の中期ないし晩期におけるトランスジェニック植物子葉中での発 現において特に有用であろう［ブラチー（Ｂｒａｃｈｙ）他、（１９８５）　、 ＥＭＢＯＪ、、４：３０４７−３０５３　：パーカー他、（１９８８）　、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８５　：　４５８−４６２ 　；チェン他、（１９８８）　、ＥＭＢＯＪ、、７　：　２９７−３０２　；チ ェン他、（１９８９）　、Ｄｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、、１０：１１２−１２２：ナ イトウ他、（１９８８）　、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１１：１０９ −１２３］。これは、ａ））ランスジェニック種子中のそれらの発現に対する位 置影響が非常に少なく、モしてｂ）２種のプロモーターが異なる一時的調節を示 し、α′−亜単億単位遺伝子−亜単位遺伝子のものより２．３日前に発現する。 本発明での特別な使用は、数種の広く特徴づけられているトウモロコシ種子貯蔵 蛋白質蛋白質遺伝子、例えば１０ｋＤゼイン［キリハラ（Ｋｉｒｉｈａｒａ）池 、（１９８８Ｌ　ジーン、７１　：　３５９−３７０１．２７ｋＤゼイン［プラ ト（Ｐｒａｔ）他、（１９８７Ｌ　ジーン、５２：５１−４９；ガラルド（Ｇａ ｌｌａｒｄｏ）他、（１９８８）　、Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、５４：２１１−２ ８１、および１９ｋＤゼイン［マークス（Ｍａｒｋｓ）他、（１９８５）、Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｆｆｉ、２６０　：１６４５１−１６４５９１であろう。トウ モロコシ中のこれらのプロモーターの相対的活性は知られており［コドリック（ Ｋｏｄｒｙｃｋ）他、（１９８９）　、Ｉ’１ａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、１　：１０５ −１１４１、トウモロコシ用のキメラ遺伝子構成における使用のためのプロモー ターを選択するための基礎を与える。トウモロコシのグロブリン１またはグロブ リン２遺伝子用のプロモーターを使用して特異的にトウモロコシ種子の胚中のＳ ＳＰ遺伝子配列を発現することもできる［ペランゲル（Ｂｅｌａｎｇｅｒ）他、 （１９８９）　、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、９１　：　６３６−６４３１ ゜植物中でのこれらの遺伝子の発現を最大にすることに関しても、ｍＲＮＡ安定 性および翻訳性を促進させるための遺伝子配列の設計に対する注意深い配慮が必 要である。出願人は植物およびバクテリア中での発現に関して好適なコドンを使 用して遺伝子配列を構成した。トウモロコシおよびダイズ用には、コドンＸＵＡ およびＸＣＧが使用された［カンブベル他、（１９９０）　、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、、９２　：　１−１１１　、同様な塩基の繰り返しくＡＡＡＡ、Ｔ ＴＴＴ、ＣＣＣＣ，ＧＧＧＧ、ｆｘど）、ポリへ十認識配列（ＡＡＴＴＡＡ）お よびｍＲＮＡ不安定性を引き起こすと考えられている特異的配列（ＡＡＣＣＡＡ 、ＡＴＴＴＡ）（ベルラフ（Ｐｅｒｌａｋ）他、（１９９１）、ＰＮＡＳ、８８ ：３３２４−３３２８）は避けられた。Ｇ／Ｃ−Ａ／Ｔ含有量はできるだけ５０ １５０に調節された。 ＳＳＰｍＲＮＡの適当な水準には異なるプロモーターを使用して異なるキメラ遺 伝子を必要となるかもしれない。そのようなキメラ遺伝子は単独発現ベクターと 一緒にまたはその後に１個より多いベクターを用いて宿主植物中に移すことがで きる。 プロモーター構成中へのエンハンサ−またはエンハンサ一様要素の導入はＳＳＰ 遺伝子の一次転写の水準を増加させるであろう。これらの要素には、例えば３５ Ｓプロモーター中で見いだされるようなウィルスエンハンサ−［オデル（Ｏｄｅ ｌｌ）他、（１９８８）　、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１０　：　２ ６３−２７２１　、オピン遺伝子からのエンハンサ−［フロンム（Ｆｒｏａ＋ｍ ）他、（１９８９）　、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ、　１　：　９７７　９８４］　、 または本発明の核酸フラグメントと操作可能式に結合されてプロモーター中に入 れられた時に転写増加をもたらす他の源からのエンハンサ−が包含される。 特に重要なものは、構成プロモーターに対して４０倍の種子−特異的増強を与え ることができるβ−コングリシニンのα′−亜単億単位めの遺伝子から単離され るＤＮＡ配列要素である［チェン他、（１９８８）、ＥＩＩＢＯＪ、、７　：　 ２９７−３０２、チェン他、（１９８９）　、Ｄｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、、１０： １１２−１２２１゜当技術の専門家はこの要素を容易に単離しそしてそれをいず れかの遺伝子のプロモーター領域内に挿入して、トランスジェニック植物中でプ ロモーターを用いて種子−特異的な発現増加を得ることができる。β−フングリ シニン遺伝子とは異なる時間に発現される種子−特異的遺伝子中へのプロモータ ーの挿入が種子成長中の比較的長い期間にわたり発現をもたらすであろう。 転写終結信号、ポリアデニル化信号およびＳＳＰコードづけ領域の適切な発現用 に必要な他の調節配列を供することができる３′非−コードづけ領域を使用して 、本発明を行うことができる。これはいずれかの源からの３′末端配列を含んで おり、使用される配列が操作可能式に結合されるプロモーター／ＳＳＰコードつ け領域組み合わせの適切な発現のためにそれの核酸配列内で必要な調節情報を与 える。個々の例には、トウモロコシからの１０ｋＤゼイン遺伝子の先天的３′端 部、いずれかの貯蔵蛋白質遺伝子からの３′端部、例えばクイズβ−コングリシ ニン遺伝子またはビーンファセオリン遺伝子の３′端部、ウィルス遺伝子、例え ば３５Ｓもしくは１９Ｓカリフラワーモザイクウイルス転写物質、からの３′端 部、オビン合成遺伝子からの３′端部、またはりブロース１゜５−ビホスフエー トカルボキシラーゼもしくはクロロフィルａ／ｂ結合用蛋白質が包含される。異 なる３′非コードづけ領域の有用性は当技術において教示されている［例えば、 インゲルブレヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ）他、（１９８９）　、Ｐｌａｎｔ 　Ｃｅ１ｌ、１　：　６７１−６８０１゜希望により本発明を行うための蛋白質 の適切な発現用に必要なら、細胞内局在信号をコードづけするＤＮＡ配列をＳＳ Ｐコードづけ配列に加えることができる。例えば、１０ｋＤゼイン遺伝子の単子 葉信号配列をトウモロコシまたは他の単子葉転換物質中で使用することができ、 モしてビーンのファセオルス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒ ｉｓ）からのファセオリンのβ亜単位からの信号配列またはダイズからのβ−コ ングリシニンのα′亜単位からの信号配列［ドイル（Ｄｏｙｌｅ）他、（１９８ ６）、Ｊ。 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６１　：　９２２８−９２３８１を双子葉転換剤中 で使用できる。ホフマン池［（１９８７）　、ＥｉｌＢＯＪ、、６：３２１３− ３２２１］は、１５ｋＤゼインの単子葉先駆体の信号配列が蛋白質を分泌経路中 に指定しそしてトランスジェニックタバコ種子中で正確に処理されたことを示し た。しかしながら、蛋白質はトウモロコシの場合のように小胞体内に保たれてシ ゛）なかった。蛋白質を小胞体中に保つためには、停止通過配列（ｓｔｏｐ　ｔ ｒａｎｓｉｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）を加えることが必要かもしれない。 蛋白質のカルボキシル末端におけるアミノ酸配列［１ｙｓ−ａｓｐ−ｇｌｕ−１ ｅｕ］をコードづけするＤＮＡ配列の添加が蛋白質を小胞体の管腔中に保つこと は当技術で知られている［ムンロ（Ｍｕｎｒｏ）他、（１９８７）　、Ｃｅ１ｌ 、４８　：　８９９−９０７　；ペルハム（Ｐｅｌｈａｍ）他、（１９８８）、 ＥＭＢＯＪ、、７：９１３−９１８；ベルハム他、（１９８８）、ＥＭＢＯＪ、 、７　：１７５７−１７６２　；イノハラ（Ｉｎｏｈａｒａ）ｉｌｌ、（１９８ ９）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８６ 　：　３５６４−３５６８　；ヘツセ（Ｈｅｓｓｅ）他、（１９８９）　、ＥＭ ＢＯＪ、、８　：　２４５３−２４６１１　。ある植物種子においては、貯蔵蛋 白質を細胞の液胞中に入れた。本発明のある種の態様を行うために、液胞標的配 列を加えることによりこれらの植物の液胞にＳＳＰ蛋白質を指定することが必要 となるかもしれない。液胞標識配列として作用する短いアミノ酸領域を子葉の蛋 白質貯蔵液胞を集積するビーンのフィトマグルチニンから同定する［タグエ（Ｔ ａｇｕｅ）他、（１９９０）　、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、２　：　５３３−５４ ６］　、大麦のレクチンをトランスジェニックタバコ中の液胞に指定するために 必要なカルボキシ−末端アミノ酸配列も記載されている［ベドナレク（Ｂｅｄｎ ａｒｅｋ）他、（１９９０）　、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ、２　：１１４５−１１５ ５１．出願人のデータは、標的信号はタバコ種子またはイネのプロトプラスト中 のＳＳＰ蛋白質の集積を必要としないことを示唆している。 植物中でのＳＳＰの発現のためのキメラ遺伝子の構成転換された植物の種子中の 必須アミノ酸類における相当な増加には、種子−特異的方法で高水準のＳＳＰの 発現を必要とする。植物中の合成貯蔵蛋白質配列の発現は、ＳＳＰコードづけ配 列をカリフラワーモザイクウィルスからの３５Ｓブロモ−クーに結合させそして ツバリンシンターゼ（ＮＯ５）遺伝子からの３′配列を加えることにより、最初 に行われた。このクローニング方法は図１０に示されている。プラスミドｐＭ） １４０はβ−グルクロニダーゼ（ＤＵＳ）遺伝子コードづけ配列を含有する。Ｓ ＳＰ配列は、ＧＵＳ遺伝子配列を除去しそしてそれらを５ＳＰＮｃｏＩ／Ａｓｐ ７１８フラグメントで置換することにより、Ｎｃ。 Ｉ／Δ５ｐ７１８部位に挿入された。植物中でのＳＳＰ配列の翻訳効率を研究し そして植物細胞中のＳＳＰ蛋白質の安定性および局在を観察するための初期転換 実験用に、構成３５Ｓプロモーターを介してＳＳＰ蛋白質を発現するトランスジ ェニックタバコ植物を製造した。 図１１に示されている如（同様な方法を使用して、５ＳＰ−３−５（配列同定番 号−〇〇）またはＳＳＰｓｅｇ５３４　（配列同定番号：１０４）遺伝子配列を ファセオリンプロモーターおよび３′配列（ＣＷ１０８、ＭＬ１１３）またはフ ングリシニンプロモーターおよびファセオリン３′配列（ＣＷＩＯ９）を含有す るベクター中に挿入した。プロモーター／Ｓ　Ｓ　Ｐコードづけ領域／３′配列 を３５Ｓプロモータークローンを用いるようにして二次ベクターに移した。これ らのクローンを次の転換において使用してタバコ植物を製造した。 高等植物の細胞の種々の転換方法は出願人の発明における使用のために利用する ことができる（ＥＰＯ０２９５９５９Ａ２および０１３８３４１　Ａｌ）。その ような方法にはアグロバクテリウム種のＴｉおよびＲｉプラスミドを基にした転 換ベクターに基づくものが包含される。特に好適なものはこれらのベクターの二 次型である［ベヴアン（Ｂｅｖａｎ）、（１９８４）　、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ 、　Ｒｅｓ、、１２：８７１１−８７２０１゜Ｔｉ−誘導されたベクターは単子 葉および双子葉植物を含む種々の高等植物、例えばダイズ、ワタおよびナタネ、 を転換させた［パッシオッチ（Ｐａｃｃｉｏｔｔｉ）他、（１９８５）、バイオ ／テクノロジー、３：２４１；ビルジ（Ｂｙｒｎｅ）他、（１９８７）　、Ｐｌ ａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、組織および器官培養”（Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）、８：３；スクハピンダ（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ）他、（１ ９８７）　、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｒｉｏｔ、、８＋２０９−２１６；ロルッ （Ｌｏｒｚ）他、（１９８５）　、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、１９９ ：１７８；ポジックス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、（１９８５）　、Ｍｏ１．　Ｇｅ ｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、１９９４１８３］。 図１２は、キメラ遺伝子を二次ベクターに移すための方法を示す。出願人は３５ Ｓ：　：ＳＳＰ：　：ＮＯＳキメラ遺伝子構成体をｐｓｓＰプラスミドからＤＮ Ａを５ａｌｌを用いて消化することにより分解した。２゜２ｋｂフラグメントを 個別に、アグロバクテリウム・ツメファシェンス−介在植物転換のための二次Ｔ ｉプラスミドベクターシステムの一部である５ａｉｌ−消化した二次ベクターＤ 　Ｚ　Ｓ　９７　Ｋ中に連結反応させた。 ベクターは、（１）転換された植物細胞用の選択的マーカーとしてのキメラ遺伝 子ツバリンシンターゼプロモーター／ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ 遺伝子（ｎｏｓ　：ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ）［ベヴアン他、（１９８３）、ネーチャー 、３０４　：１８４−１８６１、（２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左および 右境界［ベヴアン、（１９８４）　、Ｎｕｃｌ。 ＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、、１２：８７１１−８７２０１　、（３）　ＥｃｏＲｌ、 ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩおよび５ａｉｌ用の非反復制限エンドヌクレアーゼを有す る大腸菌１ａｃＺα−補充部分［ヴイエリア（Ｖｉｅｒｉａ）他、（１９８２） 、ジーン、１９　：　２５９−２６７］、（４）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ）プラスミドｐＶｓ１［イトウ（Ｉｔｏｈ）他、　（１９８４）、プ ラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、１１　：　２０６−２２０１　、並びに５）Ａ、 ツメファシェンスの転換用の選択的マーカーとしてのＴｎ５からのバクテリア性 ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子［ベルブ（Ｂｅｒｇ）他、（１ ９７５）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ１． ７２　：　３６２８−３６３２］またはβ−ラクタマーゼを含有する。 キメラＳＳＰ遺伝子を含有する二次ベクターを二親交配［ルヴキン（Ｒｕｖｋｊ ｎ）他、（１９８１）、ネーチャー、２８９　：　８５−８８１によりアグロバ クテリウム菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４　［ホ・ソケマ（１１ｏｃｋｅ ｍａ）他、（１９８３）、ネーチャー、３０’３’］　１７９−１８０］に移し た。アグロバクテリウム転換物質を使用してタバコの葉のディスクラ１ｌｌｌｌ 　した［ホルンユＣ１１ｏｒｓｃｈ）ｊｔ！！、（１９８５）、サイエンス、２ ２７　：１２２９−１２３１］。転換された植物をカナマイシンまたはカルベニ シリンを含有する選択的媒体中で再生させた。 他の転換方法、例えば外部ＤＮＡ構成体の直接吸収［ＥＰＯＯ２９５９５９Ａ２ 参照］、電気穿孔法しフロンム他、（１９８６）　、ネーチャー、（ロンドン’ ）　、３１９　：、７９１］または核酸構成体でコーティングされた金属粒子を 用いる高速弾道衝撃［クライン（Ｋｌｉｎｅ）他、（１９８７）、ネーチャー、 （ロンドン）、３２７：７０、および米国特許４、９４５．０５０］を当技術の 専門家により利用することができる。 転換された細胞を当技術の専門家により理解されている方法で再生することがで きる。これに関して特に重要なものは外部遺伝子を商業的に重要な作物、例えば ナタネ種子［デブロック他、Ｍａｎｔ　ｌ’ｈｙｓｉｏ１．．９１：　６９４− ７０１］　、ヒマワリ［工ヴエレット（Ｅｖ６ｒｅｔｔ）他、（１９８７）、バ イオ／テクノロジー、５　：１２０１］　、ダイズ［マックケーブ（ＭｃＣａｂ ｅ）他、（１９８８）、バイオ／テクノロジー、６　：　９１５　；チー（Ｃｈ ｅｅ）他、（１９８９）、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ１９．９１　：１２１２− １２１８　；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）他、（１９８９）　、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａ１１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳ＾、８６　：　７５００−７５０４、Ｅ ＰＯＯ３０１７４９Δ２］、並びにトウモロコシ［ゴルドンーカム（Ｇｏｒｄｏ ｎ−Ｋａｍｍ）他、（１９９０）、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、２：６０３−６１８ ；フロンム他、（１９９０）、バイオテクノロジー、８　：　８３３−８３９］ 　、中に移すために最近記載されている方法である。 トランスジェニック植物中のＳＳＰの分析種々の植物プロモーター／ＳＳＰ遺伝 子配列を含有するトランスジェニックタバコ植物をアグロバクテリウム介在転換 を用いて製造した。出願人はこれらの植物を、遺伝子の存在に関してはＰＣＲに より、遺伝子のコピー数に関してはサザン・プロット・ハイブリッド化により、 遺伝子の転写に関してはノーザン・プロット・ハイブリッド化により、そして蛋 白質の集積に関しては実施例９に記載されている如きウェスタン・プロットによ り、分析した。このデータのまとめは表７および８に示されている。 出願人は、３５Ｓプロモーター／５ＳＰ３−５／ＮＯ３３’遺伝子配列を担持す るトランスジェニック植物を詳細に分析した。ＰＣＲ製造フラグメントおよび植 物ＤＮＡの制限消化分析がノーザン・プロ１．トで可視化されたｍＲＮＡ種の寸 法と組み合わされて、５ＳＰ３−５遺伝子配列（配列同定番号：９０）はそれの 繰り返し性質にもかかわらず植物細胞中で安定性であることを示唆している。ウ ェスタン・ブロツ＋データからすると、５ＳＰ−３−５蛋白質（配列同定番号： ９１）は葉の組織中で合計細胞蛋白質の０．５％までの水準で発現する。３５Ｓ プロモーターからの葉の中の発現水準は遺伝子コピーの数およびｍＲＮＡの定常 水準に正比例する。３５Ｓプロモーターからの種子中の５ＳＰ−３−５蛋白質（ 配列同定番号−９１）の発現は約０．０１％に制限される。３５Ｓプロモーター は種子中では劣悪に発現することが知られているため、この発見は種子中での蛋 白質の不安定性を示唆するものではない。 ファセオリンプロモーター／５ＳＰ−３−５コードつけ領域およびファセオリン ３′配列を担持するトランスジエニ・ノクタノ（コ植物の分析は、５ＳＰ−３− ５遺伝子配列（配列同定番号：９０）が安定でありそして遺伝子生成物の発現が ｍＲＮＡ水準に比例することを示した。これらの植物中では、種子中の蛋白質の 集積水準は合計種子蛋白質の１−２％であると推定される。−次転換物質からの 種子のアミノ酸分析は、出願人がＳＳＰ配列をコードづけする遺伝子の導入によ りタンくコ種子のりシン含有量を変えた。トウモロコシ種子中のこのＳＳＰ発現 の水準はりシン酸およびメチオニン含有量における相当な増加をもたらすであろ う。 実施例 本発明は下記の実施例でさらに明らかにされるが、そこでは断らない限り全ての 部数および百分率は重量によるものでありそして度数は摂氏である。これらの実 施例は本発明の好適態様を示しているが説明用にのみ示されていることを理解す べきである。上記の論議およびこれらの実施例から、当技術の専門家は本発明の 本質的特徴を確認することができ、そして本発明の精神および範囲から逸脱しな い限り種々の変更および改変を行ってそれを種々の用途および条件に適合させる ことができる。ここで出願人により引用されている全ての刊行物はそれらの内容 が参照により本発明に加えられる。 実施例１ 糸種状コイルペプチド類の化学的合成 表３および４に記載されているペプチド類をミリケン９０５０固相ペプチド合成 器で製造業者により示唆されている標準的処方を用いて合成した。位置２１にア ラニンを含有するペプチド類に関しては、ペプチドはその位置で二重結合されて いた。 カラムに、４１Ｉ量当量のガラスピーズ（シグマ）と混合された０、１ｍｅｑの ９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ＰＡＬ１樹脂（ミリケ ン／バイオサーチ）を充填した。下記のアミノ酸の保護されたＦｍｏｃｍ導体類 （ミリケン／バイオサーチ）が使用された：Ｆｍｏ　ｃ−Ｌ−Ａ　Ｉ　ａ−０− ペンタフルオロフェニルエステル、Ｆｍ。 ｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｎ−ターシャリーーブトキシーカルボニル）−〇−ペンタフル オロフェニルエステル、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅ　ｔ−ペンタフルオロフェニルエス テル、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（０−ｔ−ブチル）−０−ペンタフルオロフェニル エステル、Ｆ’ｍｏ　ｃ−Ｌ−Ｔ　ｒ　ｐ−０−ペンタフルオロフェニルエステ ル。ある場合には、３００ｍｇのへキサフルオロ燐酸２−（ＩＨ−ペンシートリ アシリ−１−ル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）が使 用された。 ５６アミノ酸ペプチドである５ＳＰ−３−５の同族体（１個のアミノ酸変更：Ａ ｌａからＧｌｕ） をミリケン／バイオサーチ合成器で合成した。上記と同じ保護されたＦｍｏｃア ミノ酸類が使用された。合成プログラムを改変して無水酢酸、ピリジン、および ４−ジメチルアミノピリジンのジメチルホルムアミド中溶液とのそれぞれの結合 反応後に、未反応のペプチド鎮をアセチル化した。最初のアラニンは二重結合さ れた。全ての結合時間を製造業者の示唆より２〜３倍長くした。 それぞれの合成の完了後に、粗い半融ガラス漏斗中でのメタノール洗浄により樹 脂をカラムから除去した。物質をメタノールおよび次にジエチルエーテルで良く 洗浄した。樹脂からのペプチドの分割のために、それを２０ｍＬの丸底フラスコ 中に入れた。５ｍＬの分割溶液［４，５、ｍＬのトリフルオロ酢酸、０．２５ｍ Ｌのチオアニソール、０．１５ｍＬのエタンジオール、０．１ｍＬのアニソール ］を加えた。フラスコに栓をし、そして回転振盪器上で２０Ｏｒｐｍで２時間に わたり室温において賑った。樹脂を次に粗い半融ガラスフリットを通して１２５ ｍＬのエルリンマイヤーフラスコ中に濾過した。樹脂を３．５ｍＬのトリフルオ ロ酢酸で洗浄し、そして洗浄液を濾液と一緒にした。窒素流を使用して濾液の量 を５ｍＬに減らした。氷冷ジエチルエーテルを加えてペプチドを沈澱させた（約 ２０〜３０ｍＬ）。ペプチドを微細半融ガラスフリットを通して濾過しそして冷 たいジエチルエーテルで洗浄した。次にこの物質を蒸留水中に溶解させ、モして 逆相ＨＰＬＣによるさらなる精製後に凍結乾燥した。 分離はＶ　Ｙ　Ｄ　Ａ　ＣＣ４またはＣ＋ａ半調整（１ｃｍ直径）または調整（ １インチ直径）カラム上で約４ｍＬ／分／ｃｍ”の流速で２種の緩衝システムし 緩衝液Ａ：水（ミリキュー）中の０．１％トリフルオロ酢酸（ビエース）；緩衝 液Ｂ：９０％のアセトニトリル（ＪＴベーカー）、１０％の水、０．１％のトリ フルオロ酢酸］を用いて行われた。勾配はペプチド配列により変動したが、典型 的には３０％緩衝液Ｂ近くから始まり緩衝液Ｂを０．２５％／分の割合で線状に 増加させた。溶離液を２２０ｎｍで監視しそして主要ピークを集めた。集められ た物質を凍結乾燥しそして４″において乾燥貯蔵した。精製された物質を急速原 子衝撃質量分光計、アミノ酸組成、並びにある場合には合成物質の同定および純 度を確認するための蛋白質配列により分析した。 実施例２ 合成ペプチド類の物理的特性 表面圧力をデノイ方法しアダムソン（＾ｄａｍｓｏｎ）、（１９７６）、ザ・フ ィジカル・ケミストリー・オブ・サーフェセズ（Ｔｈｅ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　５ｕｒｆａｃｅｓ）、３版、ジョーン・ウィリー・ア ンド・サンプ、ニューヨーク〕によりフィッシャー・オートテンジオマド・モデ ル２１５を使用して測定した。一層挿入実験用には、１−バルミトイル、２−オ レイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＧ）をポリテトラフルオロエチレンビーカ ー中に含まれているクロロホルム溶液（濃度約０．１ｍｇ／ｍｌ）から１０．５ ｍＬのＨＥＰＥＳ／ＭＥＳ／クエン酸塩−緩衝食塩水［５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ ｍＭのＭＥＳ、、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２５ｍＭの塩化ナトリウム、 ｐＨ７，４１上に延ばした。生じたＰＯＰＧ一層の表面積は約５ｃｍ”であった 。表面張力を測定し、そしてガラス毛管を表面を通して引っ張りあらかじめ延ば された一層部分を除去することにより種々の希望値に調節した。希望値が達成さ れた時に、一層の除去を最少にするように注意を払いながら上記の緩衝液中に溶 解されている０、１ｍＬのペプチドの１ｍｇ／ｍＬ溶液を皮下注射器を用いて表 面下に注射し、そして約１０分間の観察時間にオ）たり変化が明白にならなくな るまで表面張力を監視した。 この方法を多数の異なる初期脂質一層表面張力に関して繰り返し、それには脂質 の不存在下における測定および緩衝液だけの表面張力を測定するためのペプチド 注射なしの測定も含まれた。データ計算は後者の値を全ての他の測定された値か ら引算して定義されている「表面圧力」値を与えることを含んでいた。ペプチド の注射により引き起こされる表面圧力の変化を初期表面圧力および０表面圧力変 化−２の外挿法により測定された臨界挿入圧力に対してプロットした。これらの 臨界圧力値を使用して種々のペプチド類がＰ　ＯＰ　Ｇ一層と相互作用する傾向 および推測によると同様な脂質からなる天然産出膜を比較した。Ｃ８Ｐペプチド 類は４５上３ｍＮ／Ｍの臨界圧力を有すると見いだされたが、ＳＳＰＳジペプチ ド類０上３ｍＮ／Ｍの臨界圧力よりはるかに低い臨界圧力を有すると見いだされ た。 合成ペプチド５ＳＰ−３−５（Ａ／Ｅ）（配列同定番号：１１２）をベックマン モデルＥ超遠心器を用いる分析用超遠心および屈折率検出により同定した。ペプ チドを３種の濃度：　０．４ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、および３．５ｍｇ ／ｍＬの燐酸塩緩衝液［５０ｍｎの燐酸ナトリウム、ｐ）（７，０，１，５０ｍ ＭのＮａＣ１］中に溶解させた。これらの濃度のそれぞれに関して、実験を２種 の回転速度回転（２８，０００ｒｐｍおよび４０．００Ｏｒｐｍ）および２種の 温度（４℃および２０”Ｃ）において行った。全ての実験の結果は、溶液中の２ 種の非相互転化種である二量体および四量体により、最も良く合致した。単量体 は検出されなかった。これらの発見は、これらの配列が水溶液中および生体内で 生理学的条件下で安定な二量体構造（糸種状コイル）をとれるという出願人の主 張を支持するものである。 実施例３ 合成されたペプチド類に対する抗体の製造（実施例１）中に記載されている精製 された試験管内合成ペプチド類を水中に１ｍｇ／ｍＬで溶解させた。ペプチド類 を変性させるために、１．０ｍＬのこの溶液を１０μＬの１０％ドデシル硫酸ナ トリウム（ＳＤＳ、ＢＲＬ、ガイサーズベルグ、ＭＤ）と混合しそして１０分間 にわたり６５°に１０分間加熱した。１ｍＬのペプチド溶液（変性されたまたは 先天的調合物）を１００μＬの７５ｇｇ／ｍＬのキーホール・リンベット・ヘモ シアニン（シグマ）、３０μＬの開けたての２５％グルタルアルデヒド（シグマ ）および１．０ｍＬの燐酸塩緩衝食塩水［ＰＢＳ：８、ＯｇのＮａＣｌ／Ｌ、０ ．２ＨのＫＣＩ／Ｌ、１．４４ｇのＮａｔＨＰＯ４／Ｌ−０，２４ｇのＫＨ！Ｐ Ｏ４／ＬＳｐＨ７，２］と混合した。混合物を３時間にわたり室温においてテー ブル・トップ・ロッカー上でそのまま振動させた。混合物を２．３秒間にわたり 超音波処理して凝集剤を破壊し、そして４°における２回のＩＬのＰＢＳ変化で 一夜透析した（分子量遮断：１０，０００）。調合物をデンバー、ＰＡのハゼル トン研究所に兎への挿入のために送った。兎血清を、２週間基準で集めた。抗原 の複数回の注射後に生じた抗体を含有する血清を使用して試験管内および生体内 （実施例６）合成ペプチド類に対する特異性を試験した。 この工程から誘導された抗体を、ＢＲＬドツト・プロット装置を用いてニトロセ ルロース膜に移された試験管内合成ペプチド類と反応させることにより特異性に 関して試験した。ペプチド類をトリス緩衝食塩水［ＴＢＳ：２５ｍＭのトリスＣ １、ｐＨ８，０，８，０ｇのＮａＣｌ／Ｌ、０゜２ｇのＫＣＩ／Ｌ］中で希釈し て、１０ｇｇ／μし、１μｇ／μＬまたは０．１μｇ／μＬの溶液を与えた。２ ００マイクロリツトルのそれぞれの希釈液を製造業者の仕様書に従いドツト・プ ロット装置を用いて膜に適用した。一連の希釈度の変性されていない（先天的） ＳＳＰ（５）４（配列同定番号：　２）　、５ＳＰ（７）４　（配列同定番号＝ ３）、５ＳＰ（８）４（配列同定番号・４）　、５ＳＰ（９）４（配列同定番号 ＝５）、Ｓ　Ｓ　Ｐ（１０）４（配列同定番号二６）、または５ＳＰ（１１）４ （配列同定番号ニア）ペプチド類を複数回でニトロセルロース膜上に充填し、膜 を次に片に切断し、そして変性されたまたは先天的５ＳＰ（５）４もしくは５Ｓ Ｐ（７）４ペプチド類に対して高くされた抗体と１　：　５００の血清希釈度で 反応させた。アルカリ性ホスファターゼ（パイオーラド、リッチモンド、ＣＡ） と共役されている第二の山羊抗−兎抗体を燐酸５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルｐ−１ルイジン塩およびニトロブルー塩化テトラゾ奮功ムと共に使用し て第一の兎抗−ペプチド抗体反応を製造業者により記載されている如くして可視 化した。これらの相互作用がら、全ての他の先天的ペプチド類と交差反応されて おりそして１μｇ程度の少量が検出されたペプチド類５ＳＰ（５）、（配列同定 番号：２）または５ＳＰ（７）４（配列同定番号：３）の先天的（糸種状コイル ）構造に対して抗体が製造されたことが測定された。抗体がそれら自身の相手ペ プチド類と反応してｏ、ｏｉμｇのペプチドまで検出された。全てのペプチド類 に対する交差反応性は、変性されたペプチド類である５ｓＰ（５）４　（配列同 定番号、２）およびＳ　Ｓ　Ｐ　（７）４　（配列同定１ｔ’ｔ　：　３　）　 ニ対して高くされた抗体と相互反応した時には少ながった。 １ｔｔｇｔｊ、料ノヘブチド類Ｓ　Ｓ　Ｐ（５，７，８，９，１０マタｌｔｌ　 １）４を充填緩衝液（４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、０．１Ｍのトリス ｐＨ８，０，４％のβ−メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノール ブルー）中で変性させ、２分間にわたり沸騰させ、そして１２×１０Ｘ０．０７ ５ｃｍの１８％ポリアクリルアミドＳＤＳ変性用ゲル（アクリルアミド：ビス− アクリルアミド＝５０：０．６６）　［ラエンリ、英国（１９７０Ｌネーチヤー 、２２７：６８０］上に充填した。試料をゲルを通して１５０ボルトにおいて２ ．５時間にわたり電気泳動させた。ウェスタン・プロットを下記の如くして行っ た。ペプチド類を次にゲルから２．４ｇのトリス塩基、１１．２５　ｇ（１）り ’Ｊ　シン、Ｉｇ（７）ＳＤＳ、２００ｍＬのメタノール／リットルの緩衝液を 含有する緩衝液中の０゜２ミクロンのニトロセルロース膜（バイオラド）にヘフ ァー・トランスプロット装置を用いて３ｏボルトにおいて３０分間そして次に８ ０ポルトにおいて３０分間にわたり移した。プロットを空気乾燥した。２回のプ ロットを次に抗−変性５ＳＰ（５）４抗体または抗−変性５ｓＰ（７）４　＜配 列同定番号：３）抗体と１：５００の血清希釈度で反応さゼた。アルカリ性ホス ファターゼと共役されている第二の抗体並びにその後の燐酸５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリルｐ−トルイジン塩およびニトロブルー塩化テトラゾリウム を用いる可視化により、抗５ｓＰ（５）４抗体を有する１μｇの５ＳＰ（５）４ ペプチドと１μｇｏ）ｓ　Ｓ　Ｐ（７，８，９，１０、または１１）４ペプチド 類との非交差反応が示された。１／ＩＺ　ｇノｓ　Ｓ　Ｐ（５）４および５ＳＰ （７）４ペプチド類は１μｇの５ＳＰ（８，９，１０，１１）４ペプチド類との 非交差反応を有する抗−Ｓ　Ｓ　Ｐ（７）４抗体で可視化できた。 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよび５ＳＰ３−５遺伝子生成物の融合 蛋白質がファーマンア”ｐＧＥＸ　ＧＳＴ遺伝子融合システム（モレキュラー・ バイオロジー、２巻、１６．７．１−８頁、（１９８９）、ジョーン・ウィリー ・アンド・サンズ）の使用により製造された。 融合蛋白質を親和クロマトグラフィーによりグルタチオンアガロース（シグマ） またはグルタチオンアガロ−ス（ファーマシア）ビーズ上で精製し、セントリコ ン１０”（アミコン）フィルター上で濃縮し、そして次にさらなる精製用にＳＤ Ｓポリアクリルアミド電気泳動（１５％アクリルアミド、１９：１アクリルアミ ド／ビス−アクリルアミド）にがけた。ゲルをクーマシー・ブルーで３０分間染 色し、５０％メタノール、１０％酢酸中で脱色し、そして蛋白質帯をアミコン７ ″センチルター・マイクロエレクトロエル−ター（ボール（Ｐａｕｌ）Ｔ、、マ ッダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）Ｉｉｉ集、微細配列用の蛋白質およびペプチ ド精製の実際的指針（＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏ ｓｅｑｕｅｎ■ ｉｎｇ）、アカデミ・ツク・プレス・インコーホレーテッド、ニューヨーク、１ ９８９）を用いて電気溶離した。同じ方法で製造されそして実験された第二のゲ ルを非酢酸含有染料［蒸留水中の９部の５０％メタノール中の０．１％クーマシ ー・ブルー０２５０　（、バイオラド）および１部のセルバ・ブルー（セルバ、 ウェストブリー、ニューヨーク］中で１−２時間にわたり染色した。ＧＳＴ−３ ＳＰ３−５帯が裸で見えるまでゲルを２０％メタノール、３％グリセロール中で ０．５−１時間にわたり簡単に脱色した。この帯をゲルから切除しそして電気溶 離された物質と共にハゼルトン研究所にニューシーラント兎の免疫化における抗 原としての使用のために送った。合計１ｍｇの抗原を使用した（ゲル中０．８ｍ ｇ。 溶液中０．２ｍｇ）。試験血液はハゼルトン研究所から３週間毎に供給された。 ５ＳＰ−３−５遺伝子を含有する細胞からの大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１）抽出物の ウェスタン・プロットによりＴ７プロモーター（実施例６）の対照下で蛋白質お よび血清の異なる希釈度において概略滴定値を試験した。唯一のアミノ酸変化を 有する５ＳＰ−３−５（配列同定番号：９１）に対応する既知量の化学的に合成 された蛋白質（配列同定番号：１１２）（実施例１参照）をゲル上に充填してウ ェスタン・プロット処方において抗体を用いて検出した。初期免疫化から１８週 間後に得られた試験血液を使用して、出願人は２μｇの化学的に合成されたペプ チドを抗体の１　：　４０００希釈度および希釈された血清と一緒のプロットの 一夜培養において検出することができた。この血清を使用してトランスジェニッ ク植物（実施例９）における５ＳＰ−３−５（配列同定番号＝９１）発現の水準 を測定しそしてイネ・プロトプラスト（実施例１０）中での放射標識づけされた ５ＳＰ−３−５蛋白質（配列同定番号・９１）の同定を確認した。 以下の実施例５に記載されている合成遺伝子の構成および発現を促進させるため には、下記の性状を有するプラスミドベクターを構成することが必要であった。 ｌＪａ　ｒ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位がないため、実施例５中の配列の挿 入で非反復部位を製造する。 ２、テトラサイクリン抵抗をコードづけして、毒性蛋白質の成長および発現中の プラスミドの損失を避ける。 ３、大腸菌中への挿入配列の発現用のＴ７プロモーターおよびターミネータ一部 分を含むプラスミドｐＢＴ４３０からの約２９０ｂｐを含有する。 ４、Ｔ７プロモーターの後の適切な位置に非反復ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ制限 エンドヌクレアーゼ認識部位を含有しており、実施例５中のオリゴヌクレオチド 配列の挿入を可能にする。 性状１および２を得るために、出願人はアンピシリン遺伝子および該遺伝子近く のＥａｒ１部位が欠失されているｐＢＲ３２２の自然突然変異体であるプラスミ ドｐｓＫ１を使用した（図５参照）。プラスミドｐＳＫＩはテトラサイクリン抵 抗遺伝子、塩基１における非反１ＪＪＥｃｏＲＩ制限部位および塩基２３５３に おける１個のＥａｒ１部位を保有していた。ｐｓＫｌの塩基２３５３におけるＥ ａｒｌを除去するために、鋳型としてｐｓＫｌを使用してポリメラーゼ鎖反応（ ＰＣＲ）を行った。 約１０フエントモルのｐｓＫｌをＡＢ１１３０６Ｂ　ＤＮＡ合成器で製造業者の 工程を用いて合成されたそれぞれ１μｇのオリゴヌクレオチドと混合した。 ５Ｍ７０　５’−ＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣ３’　配列同定番 号：９５Ｍ７１　Ｓ’−τへ丁ＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＣ入ＴＣＴＧＴＧＣ− ３’配列量定番号＝１０ｐｓＫ１鋳型上でのこれらのオリゴヌクレオチドのブラ イミング部位は図５に記載されている。パーキン−エルマー・セッス・キット（ エメリーヴイル、ＣＡ）を用いて販売者の指示に従い同一会社により製造された サーモサイクラ−上でＰＣＲを行った。２５回のサイクルは９５゜における１分 間、４２°における２分間、および７２°における１２分間であった。オリゴヌ クレオチドを、Ｅａｒ１部位の周りの３０ｂフラグメントを除外した全ｐ　Ｓ　 Ｋ　１プラスミドの複製をブライミングするように、設計した（図５参照）。１ ０マイクロリツトルの１００μＬ反応生成物を１％アガロースゲル上で実験しそ して臭化エチジウムで染色すると複製プラスミドの予期された寸法に対応する約 ３．Ｏｋｂの帯が現れた。 ＰＣＲ反応混合物の残り（９０ｕ　Ｌ）を２０μＬの２．５ｍＭのトリ燐酸デオ キシヌクレオチド（ｄＡＴＰＳｄＴＴＰ、、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）と混合 し、３０単位のクレノー酵素を加え、そして混合物を３７°において３０分間そ して次に６５°において１０分間培養した。クレノー酵素を使用してＰＣＲによ り出現した不完全な端部中に充填した。 ＤＮＡをエタノール沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥し、そ して水中に再懸濁させた。ＤＮＡを次に１ｍＭのＡＴＰの存在下でキナーゼ緩衝 液中でＴ４　ＤＮＡで処理した。この混合物を３７″において３０分間そし６５ ″において１０分間培養した。１０μＬのキナーゼ処理された調合物に、２μＩ ２の５ｘ連結反応緩衝液および１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えた。連結反 応は１５°において１６時間にわたり行われた。連結反応後に、ＤＮＡを半分に 分割し、そして半分をＥａｒｌ酵素で消化した。クレノー、キナーゼ、連結反応 および制限エンドヌクレアーゼ反応をザムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）池［モ レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、２版、（１９ ８９）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・ブレス］中に記載さ れている如くして行った。クレノー、キナーゼ、リガーゼおよびほとんどの制限 エンドヌクレアーゼはＢＲＬか、ら購入された。一部の制限エンドヌクレアーゼ はＮＥＮバイオラプス（ベヴアリー、ＭΔ）またはベーリンガー・マンハイム（ インディアナポリス、ＩＮ）から購入された。連結反応されたＤＮＡ試料の両者 を別個にコンピテントＪＭ１０３　［５ｕｐＥ　ｔｈｉ　ｄｅｌ　（Ｉａｃ−ｐ ｒｏＡＢ）Ｆ’　［ｔ　ｒａＤ３６　ｐｏｒＡＢ、１ａｃｌｑ　１ａｃＺ　ｄｅ ｌ　Ｍ１５］制限マイナス］細胞にサムブルーフ他［モレキュラー・クローニン グ、ア・ラボラトリ−・マニュアル、２版、（１９８９）、コールド・スプリン グ・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス］中に記載されている如きＣａＣＬ方法を 用いて転換させ、そして１２．５μｇ　／　ｍＬのテトラサイクリンを含有する 媒体上においた。Ｅａｒｌ消化を用いてまたは用いずに同数の転換物を回収し、 それはＥａｒ１部位がこれらの構成体から除去されたことを示唆していた。サム ブルーフ他［モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル、２ 版、（１９８９）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス］ 中に記載されている如きアルカリ性溶解ミニブレップ工程によりＤＮＡを製造す ることによりクローンをスフ１ノーニングし、その後に制限エンドヌクレアーゼ 消化分析を行った。テトラサイクリン抵抗性でありモしてＥａｒ１部位を含有し ていない１個のクローンを選択した。プラスミドをＥｃｏＲＩで完全に消化し、 端部にクレノーを充填しそして連結反応させることにより、ｐＳＫ２の残りのＥ ｃｏＲ１部位を破壊した。Ｅｃ。 ＲＩ部位を含有していないクローンは消化されたｐ　Ｓ　Ｋ　３であった。 上記の性状３および４を得るために、プラスミドｐＢＴ４３０からのバクテリオ ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター／ターミネータ一部分をＰＣＲに より増幅させた。プラスミドｐＢＴ４３０はｐＥＴ−３ａの誘導体であった［ロ ーゼンベルグ他、（１９８７Ｌジーン、５６　：１２５−１３５１゜Ｔ７プロモ ーター／ターミネータ−配列をｐＢＴ３２２のＢａｍＨ１部位にクローニングし てプラスミドｐＥＴ−３ａを製造した。プラスミドｐＥＴ−３ａのＡＴＧ翻訳開 始におけるＮｄｅ１部位をオリゴヌクレオチド命令突然変異形成を用いてＮｄｅ １部位に転化させることによりプラスミドｐ　Ｂｒ３３０を構成した。この領域 である５’ＣＡＴＡＴＧＧ中のｐＥＴ−３ＨのＤＮＡ配列をｐＢ７４３０中で５ ’−ＣＣＣＡＴＧＧに変化させた。オリゴヌクレオチドブライマーである５Ｍ７ ８　（配列同定番号・１１）および５Ｍ７９　（配列同定番号：１２）は、Ｔ７ プロモーター／ターミネータ−配列にあたるｐＢＴ４３０からの３００ｂフラグ メントをブライミングするように設計されていた（図５参照）。 ５８７８５’−ＴＴＣＡＴＣＧＡＴＡＧＧＣＧＡＣＣＡＣ八ＣＣＣＧＴＣＣ−３ −配り１１同へ番号：１１５８７９　５’−人入ＴＡＴＣＧＡＴＧＣＣ入ＣＧへ ＴＧＣＧ丁ＣＣＧＧＣＧ−３嘩　配グ１１同定番号°１２ＰＣＲ反応は前記の如 くしてｐＢＴ４３０を鋳型として用いて行われ、そして３ｏｏｂｐフラグメント を出現させた。フラグメントの端部をクレノー酵素を用いて充填しそして上記の 如くキナーゼ処理した。プラスミドｐｓＫ３からのＤＮＡをＰｖｕ　Ｉ　Ｉ酵素 を用いて完全に消化しそして次に牛の腸のアルカリ性ホファターゼ（ベーリンゲ ル・マンハイム）で処理して５′ホスフエートを除去した。工程はサムブルーフ 他［モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル、２版、（１ ９８９Ｌコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・ブレス］中に記載さ れている如くであった。切断されそしてホファターゼ処理されたｐＳＫ３　ＤＮ Ａをエタノール沈澱により精製し、そして一部をＴ７プロモーター配列を含有す るＰＣＲ出現フラグメントとの連結反応において使用した。連結反応混合物をＪ Ｍ１０３　［５ｕｐＥ　ｔｈｉ　ｄｅｌ　（Ｉａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’　［ｔｒ ａＤ３６　ｐｏｒＡＢ、１ａｃｌｑ　ＩａｃＺ　ｄｅｌ　Ｍ１５］制限マイナス ］に転換させ、そしてテトラサイクリン抵抗性コロニーをスクリーニングした。 プラスミドＤＮＡをアルカリ性溶解ミニブレツブ方法により製造し、そして制限 エンドヌクレアーゼ分析を行ってＰＣＲ生成物の挿入および配向を検出した。２ 個のクローンを配列分析用に選択したニブラスミドｐ　Ｓ　Ｋ　５は図５に示さ れている配向中にフラグメントを有していた。アルカリ性の変性された二本鎖Ｄ ＮＡ上でシークエナーゼ’Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳバイオケミカル・コ ーポレーション）を用いて配列分析を行い、そして製造業者の示唆した処方はｐ 、ｓ　Ｋ　５はＴ７プロモーター／ターミネータ−配列内にＰＣＲ複製誤差を有 していないことを示した。 発現ベクターｐＳＫ５中の合成遺伝子の構成■。 （ａ）ＥａｒＩ部位を基にした繰り返し合成遺伝子配列の構成方法は図６に記載 されている。第一段階は１４個のアミノ酸の塩基遺伝子をコードづけするオリゴ ヌクレオチド配列の挿入であった。このオリゴヌクレオチド挿入は１個以上の７ 種の繰り返しをコードづけするオリゴヌクレオチドをその後に挿入するための非 反復ＥａｒＩ制限部位を含有しており、そして植物ベクターへの遺伝子配列の転 換中で使用するための非反復Ａｓｐ７１８制限部位を加えていた。オリゴヌクレ オチドセットの突出端部により、ベクターｐＳＫ５の非反ｆＪ（Ｎｃａｌおよび ＥｃｏＲ１部位中への挿入が可能となった。 （配列同定番号１１１） ５Ｍｌｌｉ　ＡＴＧｋｋＧＧＣＧＴＧＡＴＫ４ｎロエ−３’　（配列同定番号、 １３）ＳＨ８Ｑ　τ＾ＣＴＴＣＣＧＣＡＣＴＡＴ匡↓工匡ニム駄５′（配列同定 番号：１４）プラスミドｐ　Ｓ　Ｋ　５からのＤＮＡｆｅＮｃｏｌおよびＥｃｏ ＲＴ制限エンドヌクレオチドを用いて完全に消化しそしてアガロースゲル電気泳 動により精製した。精製されたＤＮＡ　（０，１μｇ）を１μｇの各オリゴヌク レオチドＳ〜■８０（配列同定番号：１４）および５Ｍ８１（配列同定番号、１ ３）と混合しそして連結反応させた。連結反応混合物を大腸ｒｒ＜ｍ株ＪＭ１０ ３　［５ｕｐＥ　ｔｈｉ　ｄｅｌ　（Ｉａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’　［ｔ　ｒａＤ ３６　ｐｏｒＡＢ、１ａｃｌｑ　ＩａｃＺ　ｄｅｌ　Ｍ１５］制限マイナス〕に 転換させそしてテトラサイクリン抵抗性転換物を急速プラスミドＤＮＡブレツブ によりスクリーニングし、その後に制限消化分析を行った。オリゴヌクレオチド の適切な挿入を示すそれぞれ１個のＥａｒＩ、Ｎｃｏｌ、Ａｓｐ７１８およびＥ ｃｏＲ１部位を有するクローンを選択した。このクローンはｐＳＫ６と指定され た（図７）。Ｔ７プロモーターの次のＤＮＡの領域の配列により、予期された配 列のオリゴヌクレオチドの挿入が確認された。 （ｂ）塩基遺伝子の非反復ＥａｒＩ部位に直接的に連結反応させられるオリゴヌ クレオチド対を製造することにより反復性の７種のコードづけ配列を上記の（ａ ）の塩基遺伝子構成体に加えた。オリゴヌクレオチド類である５Ｍ８４　（配列 同定番号：１５）および５Ｍ８５　（配列同定番号−１６）が５ＳＰ５の７種の 反復をコードづけしている。オリゴヌクレオチド５Ｍ８２（配列同定番号：１７ ）および５Ｍ８３　（配列同定番号＝１８）は５ＳＰ７の７種の反復をコードづ けしている。 ５ＳＰＳ　Ｍ　Ｅ　ｔ　Ｋ　Ｍ　Ｋ　Ａ　（配列同定番号・６２）５Ｍ８４　５ ｌ−ＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣ−３’　（配列同定番号＝１ ５）ｓＭｓｓ　３＋−ＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＭ：ＴＴＣＣＡＣＴ入−５’　（ 配列同定番号、１６）ＳｉＦ２　Ｍ　Ｅ　Ｅ　Ｋ　Ｌ　Ｋ　＾　（配列同定番号 Ｇｌ）１１Ｍ８２　５’−Ｇ入τＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣ−１・ 　（配列同定番号−１７）オリゴヌクレオチドセットを連結反応させそして精製 して発現ベクター中に挿入するための複数の７種の反復をフードづけするＤＮＡ フラグメントを得た。合計で約２μｇのそれぞれのセットからのオリゴヌクレオ チドをキナーゼ処理し、そして室温において２時間にわたり連結反応させた。オ リゴヌクレオチドの連結反応されたマルチマーを１８％の非変性２０Ｘ２０Ｘ０ ．０１５ｃｍポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス−アクリルアミド ＝１９：１）上で分離した。帯を含有するポリアクリルアミドの小片を微細片に 切断し、１．０ｍＬの０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭのＥＤＴＡ　（＋）８ ７．５）を加え、そして管を３７°において一夜回転させることにより、ゲル上 で１６８ｂｐ　（８ｎ）以上として分離されたマルチマー形を精製した。ポリア クリルアミドを遠心により回転させ、１μｇのｔＲＮＡを上澄み液に加え、ＤＮ Ａフラグメントを２容量のエタノールを用いて一７０″において沈澱させ、７０ ％エタノールで洗浄し、乾燥し、そして１０μＬの水中に再懸濁させｔこ。 １０マイクログラムのｐｓＫ６　ＤＮＡをＥａｒｌ酵素を用いて完全に消化し、 そして牛の腸のアルカリ性ホスファターゼで処理した。切断およびホスファター ゼ処理されたベクター］）ＮＡを低融点アガロースゲル中での電気泳動後に帯状 ＤＮＡを切断し、アガロースゲルを５５’において凍結乾燥し、そしてＮＡＣ３ ＰＲＥＰＡＣ”カラム（Ｂ　ＲＬ）上で製造業者が示唆した処方に従い精製する ことにより、単離した。約０１μｇの精製されたＥａｒｌ消化およびホスファタ ーゼ処理されたｐＳＫ６　ＤＮＡを５μＬのゲル精製されたマルチマー性オリゴ ヌクレオチドセットと混合しそして連結反応させた。連結反応させた混合物を大 腸菌菌株ＪＭ１０３　［５ｕｐＥ　ｔｈｉ　ｄｅｌ　（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ ’　［ｔｒａＤ３６　ｐｏｒＡＢ、Ｉａｃｌｑ　ＩａｃＺ　ｄｅｌ　Ｍ１５］制 限マイナス］に転換させそしてテトラサイクリン抵抗性転換物を選択した。急速 プラスミドＤＮＡブレツブによりスクリーニングし、その後に制限消化分析を行 った。プラスミドＤＮＡをＡｓｐ７１８およびＢｇｌｌｌを用いて消化しその後 にフラグメントを１８％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離することにより 、制限エンドヌクレオチド分析を一般的に行った。臭化エチジウムを用いるフラ グメントの可視化は、塩基遺伝子部分だけが存在している時に１５０ｂｐのフラ グメントが製造されたことを示していた。オリゴヌクレオチドフラグメントの挿 入はこの寸法を２１個の塩基の反復により増加させた。このスクリーニングから 、数個のクローンを大腸菌中でのコードづけされた配列のＤＮＡ配列分析および 発現用に選択した（実施例６参照）。 Ｃ２０３４５，７，７，７，７，７，５３５Ｃ３０３６５，７，７，７，７，５ ３７Ｃ１６３８５，５，５，５３９ Ｃ２０４０５，５，５，５，５４１ Ｃ３３４２５，５，５，５４３ それぞれの構成体の配列をフランキングする最初および最後の５Ｓ２５の７種は 上記の（ａ）部の塩基遺伝子からである。挿入部は下線により示されている。 （Ｃ）オリゴヌクレオチドのオリゴマー形のゲル精製は予期された比較的長い（ すなわち、〉８ｎ）挿入部を与えなかったため、出願人は挿入構成体のその後の 回のためには異なる工程を使用した。この一連の構成体に関しては、それぞれ５ ＳＰ８．９．１０および１１アミノ酸配列をコードづけするさらに４個のオリゴ ヌクレオチドのセットを製造した。 ５ｓｐｅ　Ｍ　乞　ｔ＊ｓ、＊ｙ　（配ツ１１同定番号−６４）５Ｍｌ１６　５ ’−Ｇ＾丁圀八へＧ騙ＡＡαゴＧＡＡＧＡＡ−３１（配列同定番号＝１９）５Ｍ ｌ１７　３’−ＣＣＴＣＣＴＣ買ＣばτｃｒｒｃｔＡ−ｓ１（配ダ１１同定番号 ＝２０）５５Ｐ９　Ｍ　！　）：　Ｋ　Ｌ　Ｋ　Ｗ　（配列同定番号；６７）５ ８８８　Ｓ’−Ｇ入τφ＾ＧＧ騙戚テＧｋｋＧＴＧ−３嘲　（配列同定番号：２ １）。 ５Ｍ８９　３’−ＣＩＪＣＣＴＣＴ？ＣＧｋＣ？ＴＣＡＣＣＴＡ−５’　（配列 同定番号＝２２）ｓｓｐｚｏ　ＭＥ　Ｅ　Ｋ　ＨＫ　Ｋ　（配列同定番号・６５ ）３Ｍ９０　Ｓ’−ＧＮＴＧＧＡＧＧ）＋ＧＡＡＧＮＴＧ）Ｊｌ＋ＧＭ−３’　 （配グｔ１「）定１（号：２３）９Ｍ９１　３１−　ＣＣＴＣＣ〒ＣττＣ丁Ａ Ｃ？丁ｅｙｔｃｔＡ−ｓ′　（配ダ曾１同定１１号：２４）ＳＳＰｌＩＭ　Ｅ　 Ｅ　Ｋ　ＨＫ　％４　（配置１１１同定番号、６８）５？！９２　５　’−ＧＡ ＴＧＧ＾ＧＧＡＧ紡ＧＡ冗Ｍ−丁Ｇ−３１（配列同定番号：２５）５８９３　３ ’−ＣＣＸＣＣＴＣＴＴＣＴｋＣＴＴＣｋＣＣＴｋ−５直配列同定番号、２Ｇ） 下記のＨＰＬＣ工程を使用して、上記の（ｂ）部に記載されている如くしてオリ ゴヌクレオチドをキナーゼ処理しそして連結反応させた後にオリゴヌクレオチド セットのマルチマー形を精製した。クロマトグラフィー処理をヒユーレット・バ ノカード・リキッド・クロマトグラフ・インスツルメント、モデル１０９０Ｍの 上で行った。流出液吸収を２６０ｎｍにおいて監視した。連結反応させたオリゴ ヌクレオチドを１２，０００ｘｇにおいて５分間遠心し、そして０．５μインラ イン・フィルター（スペルコ）が備えられている２、５μＴＳＫＤＥΔＥ−ＮＰ Ｒイオン交換カラム（３５ｃｍｘ４．６ｍｍ内径）上に注いだ。オリゴヌクレオ チドを長さ基準で勾配溶離および２緩衝移動相を用いて分離した［緩衝液Ａ＋２ ５ｍＭのトリス−ＣＩ、ｐＨ９，０、および緩衝液Ｂ；緩衝液Ａ＋ＩＭのＮａＣ ｌ］。緩衝液ＡおよびＢの両者を使用前に０．２μフイルター中に通した。下記 の勾配プログラムを毎分１ｍＬの流速で３０″において使用した： 時間　にＡ　％Ｂ 最初　７５　２５ ０．５分　５５　４５ ５分　５０　５０ ２０分　３８　６２ ２３分　０　１００ ３０分　０　１００ ３１分　７５　２５ 留分（５００μＬ）を３分および９分の間で集めた。１２０ｂｐおよび２０００ ｂｐの間の長さに相当する留分をプラスミドＤＮＡの制限消化の対照分離から測 定する際に貯蔵した。 ４．５ｍＬのそれぞれのオリゴヌクレオチド用の貯蔵留分を１０μｇのｔＲＮＡ および９．０ｍＬのエタノールを加えることにより沈澱させ、７０％エタノール で２回洗浄しそして５０μＬの水中に再懸濁させた。 １０マイクロリツトルの再懸濁させたＩ（ＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを０． １μｇのＥａｒｌ切断および上記のホスファターゼ処理されたｐＳＫ６ＤＮＡに 加え、そして−夜にわたり１５６において連結反応させた。キナーゼ処理されそ して自己一連結反応されたがゲルまたはＨＰＬＣにより精製されていない全部で ６個のオリゴヌクレオチドセットもｐＳＫ６ベクターとの別の連結反応において 使用された。連結反応混合物を大腸菌菌株ＤＨ５ａ　［５ｕｐＥ　ｄｅｌ　Ｉａ ｃＵ１６９　（ｐｈｉ　８０　１ａｃＺ　ｄｅｌ　Ｈ１５）　ｈｓｄＲ１７ｒｅ ｃＡｌ　ｇｙｒ１９６ｔｈ　ｉ　１　ｒｅ　ＩＡＩ］制限マイナス］に転換させ そしてテトラサイクリン抵抗性コロニーを選択した。出願人はＤＨ５α［５ｕｐ Ｅ　ｄｅｌｌａｃＵ１６９　（ｐｈｉ　８０　］ａｃＺ　ｄｅｌ　Ｈ１５）　ｈ ｓｄＲ１７ｒｅｃＡｌ　ｇｙｒ１９６　ｔｈｉｌ　ｒｅｌＡ１］菌株を全ての配 列作業用に選択して使用したが、その理由はこの菌株が非常に高い転換速度を有 しておりそしてｒｅｃＡ−であるからである。ｒｅｃＡ−フェノタイプはこれら の反復ＤＮＡ構成体が同族組み換え用の代用品であり、マルチマー配列の欠失を もたらすかもしれない関連事項を除く。 クローンを上記の（ｂ）中に記載されている如くスクリーニングした。 数個のクローンを選択して、６個のオリゴヌクレオチドセットのそれぞれの挿入 を表した。 表１０ ７種による配列 ８４−Ｈ３４６５，５，５，５４７ ８４−Ｈ２３４８５，８，８，５４９ ８８−２５０５，９，９，９，５５１ ９０−Ｈ８５２５，１０，１０，１０，５５３９２−２５４５，１１，１１，５ ５５ ご表３を参照のこと 配列をフランキングする最初および最後の５ＳＰ５の７種が塩基遺伝子配列を表 す。挿入配列は下線が引かれている。文字ｒＨＪを含むクローン番号がＨＰＬＣ −精製されたオリゴヌクレオチドを指定している。 クローン８２−４中の最初の塩基遺伝子反復の損失はベクターｐＳＫ６がｒｅｃ Ａ−菌株に移される前の塩基遺伝子反復５．５の間の同族組み換えから生ずるこ とがある。ＨＰ　Ｌ　Ｃ工種はオリゴヌクレオチド上１．トの比較的長いマルチ マー形の塩基遺伝子への挿入は促進しないが、連結反応されたオリゴヌクレオチ ドの有効な精製として作用した。 （ｄ）ＳＳＰ配列の混合物をコードづけしそしてできる限り多くのコドン利用を 多様化するオリゴヌクレオチドを設計した。これを行って、合成遺伝子が植物中 で転換された時に再組み合わせによる反復挿入部の欠失の可能性を減少させそし て構成された遺伝子部分の長さを延長させた。 これらのオリゴヌクレオチドは７種のコードづけ単位（２８個のアミノ酸残基） の４個の反復をコードづけし、そしてこれまでに構成されたクローンのいずれか の非圧１１Ｅａｒ１部位に挿入することができる。５Ｍ９６および５Ｍ９７が５ ＳＰ（５’）４（配列同定番号＝２）をコードづけし、５Ｍ９８および５Ｍ９９ が５ＳＰ（７）４（配列同定番号：３）をコードづけし、そして５Ｍ１００およ び５Ｍｌ０Ｉが５ＳＰ８．９．８．９（配列同定番号：８３）をコードづけした 。 ）ＩＥＥｊｃＭＸ入ＭＥＥＫＭＸ 入　Ｍ　ｔｒ、ｘ　Ｍ　ｘｘ　Ｍ　ｘｔｘ　Ｍ　ｘ　八　（配列同定番号：２） ＣＧＡＴＡＣＣＴＣＣ？？Ｔ？ＣＴＡＣＴ？？ＣＧＣＴＡＣＣ？ＣＣＴＣ？ＴＴ ＴＩＣＣＧＣＴＡ−５’　（配列同定番号−８９）ＡＭＥＥＫＬＫＡＨＥＩＩＩ ＩＩ：ＬＸ　＾　（配列同定番号＝３）ＣＧ＆ＴＡＣＣ？ＴＣＴ？Ｔ？ＣＧＪｕ Ｔ？ＴＣＧＣＡＴＣＣＴｌ：Ｃ？ｃｍ？ＧＡＣＴＴＣＣＧｅＴ＆−５’　（配列 同定番号＝２８）！ＩＭＥＥＫ！、ＫＫＭＥＥ？ＣＩ、ＫＷ　（配列同定番号・ ８３）クローン８２−４および８４−８３　（上記Ｃ参照）からのＤＮＡをＥａ ｒｌ酵素を用いて完全に消化し、ホスファターゼで処理し、そしてゲル精製した 。約０２μｇのこのＤＮＡを１．０μｇのあらかじめキナーゼ処理されたオリゴ ヌクレオチド用・ソト５Ｍ９６および５Ｍ９７．５Ｍ９８および５Ｍ９９または Ｓ　Ｍ　１００および５Ｍｌ０Ｉのそれぞれと混合した。ＤＮＡおよびオリゴヌ クレオチドを一夜にわたり連結反応させそして次に連結反応混合物を大腸菌菌株 ＤＨ５αに転換させた。テトラサイクリン−抵抗性コロニーを（ｂ）および（Ｃ ）に記載されている如くオリゴヌクレオチド挿入の存在に関してスクリーニング した。制限工／ドヌクレアーゼ消化ノくターンを基にした配列分析用１ニクロー ンを選ｔＲしｔこ。 表１０ ７種による配列 クローン＃　配列同定番号：　アミノ酸反復（Ｓ　Ｓ　Ｐ）’　配列同定番号。 ２−９　５６　７．７．７．７．７．７．８．９．８．９．５　５７３−５　９ ０　７．７．７．７．７．７．５．５　９１５−１　５８　５．５．５．７．７ ．７．７．５　５９１表３を参照のこと 挿入されたオリゴヌクレオチド部分は下線が引かれている。 クローン２−９は、オリゴヌクレオチド５Ｍ１００（配列同定番号＝２９）およ びクローン８２−４　（上記の（ｃ）を参照のこと）のＥａｒ１部位中に連結反 応された５Ｍｌ０Ｉ（配列同定番号＝３０）から誘導された。クローン３−５（ 配列同定番号＝９０）は、クローン８２−４（配列同定番号：４４）のＥａｒＩ 部位中へのオリゴヌクレオチドセット５Ｍ９６　（配列同定番号、８８）および ５Ｍ９７（配列同定番号：８９）の最初の２２個の塩基の挿入から誘導された。 この部分的挿入はこれらの高度に反復性のオリゴの不適切なアニーリングを反映 することもある。クローン５−１（配列同定番号＝５８）は、クローン８４−８ ３（配列同定番号：４６）のＥａｒ１部位中に連結反応されたオリゴヌクレオチ ド５Ｍ９８（配列同定番号＝２７）および５Ｍ９９（配列同定番号：２８）から 誘導された（上記（ｃ）部を参照のこと）。 Ｉ （ａ）合成遺伝子配列の第二の構成方法はＤＮＡおよびアミノ酸配列の両者にさ らに融通性を与えることができる。この方法は図８および９に記載されている。 第一段階は、元のベクターｐｓＫ５中への１６＠のアミ、ノ酸の塩基遺伝子をコ ードづけするオリゴヌクレオチド配列の挿入であフた。このオリゴヌクレオチド 挿入は、１個以上の７種の反復をコードづけるオリゴヌクレオチドのその後の挿 入における使用に関するこれまでの塩基遺伝子構成中の如（非反復ＥａｒＩ部位 中に含まれていた。 塩基遺伝子は３′末端においてＢｓｐ８１部位も含んでいた。この分割部位の突 出端部はＮｃｏ　Ｉ突出端部を用いる「イン・フレーム」蛋白質融合を可能にす るように設計されている。従って、遺伝子部分は図９に記載されている重複方式 を用いて増殖させることができる。オリゴヌクレオチドセットの突出端部がベク ターｐＳＫ５の非圧１１ＮｃｏｌおよびＥｃｏＲ１部位中への挿入を可能にした 。 （配列同定番号：１１３） ＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＮＴＡＧＧ？ＡＣＣＧ−３’　（配列同定 番号°９２）オリゴヌクレオチドセットは上記のＩ　（ａ）中に記載されている 如くしてｐＳＫ５ベクター中に挿入された。生じたプラスミドはｐ　Ｓ　Ｋ　３ ４と指定された。 （ｂ）３５個のアミノ酸１部分」をコードづけするオリゴヌクレオチドセントを

【　（ｂ）中に記されている如き工程を用いてｐＳ　Ｋ　３４塩基遺伝子の非反 復ＥａｒＴ部位中に連結反応させた。この場合、オリゴヌクレオチドはゲルまた はＨＰＬＣ精製されておらず、単にアニーリングされており、そして連結反応に おいて使用された。下記のオリゴヌクレオチドセットが使用された： ｃｔｔＧｘＧＧ黒ｃｘｔＧＡＡＧＭ−３’　（配列同定番号；９４）Ｇυ（τＣ ０−買Ｃ丁入ＣＴＴＣπα話−５＋　（配列同定番号：９５）ＧＡＡＣ丁ＣＣτ ＣＴ買τ＾ＣＴ？Ｃτ丁ＣＧλ−５・　（配７１１同定番号・９９）ＧＩＣＴＴ ＴＣＴＣＣＴＴＴｋＣＴＴＣＴＴＣＧＡ　（配列同定番号：１０３）クローンを 制限消化による挿入部分の存在に関してスクリーニングし、その後に６％アクリ ルアミドゲル上でフラグメントを分離した。オリゴヌクレオチドの正確な挿入は ＤＮＡ配列分析により確認された。それぞれ部分３．４および５を含有するクロ ーンは、ｐＳＫｓｅｇ３、ｐ　Ｓ　Ｋｓｅｇ４、およびｐＳＫｓｅｇ５と指定さ れた。 これらの「部分」クローンを図９に記載されている如くして重複方式で使用した 。１０μｇのブラスミ’ＦｐＳＫｓｅｇ３をＮｈｅｌおよびＢｓｐＨＩを用いて 完全に消化し、そしてホヮットマンペーパー技術ヲ使用して１５０３ｂｐフラグ メントをアガロースゲルから単離した（実施例７ｔＪｕ）。１０μｇのプラスミ ドｐｓＫｓｅｇ４をＮｈｅｌおよびＮｃｏｌを用いて完全に消化し、そして２１ ０９ｂｐ帯ゲルを単離した。 等量のこれらのフラグメントを連結反応させ、そして組み換え体をテトラセイク リン上で選択した。クローンを制限消化によりスクリーニングしそしてそれらの 配列を確認した。生じたプラスミドはｐＳＫｓｅｇ３４と指定された。　゛ ｐＳＫｓｅｇ３４およびｐｓＩ＜ｓｅｇ５プラスミドＤＮＡを上記と同様な方法 で消化し、フラグメントを単離しそして連結反応させて、部分３および４と融合 された部分５をコードづけするＤＮＡ配列を含有するプラスミドを作成した。こ の構成体はｐＳＫｓｅｇ５３４と指定されそして下記のアミノ酸配列をコードづ けする：ｔｔｔｙｙｖｙｘ−ｃｏｏｇ　（配列同定番号：　Ｌ（１５）実施例６ 大腸菌中の合成遺伝子配列からの蛋白質の発現実施例５に記載されている合成遺 伝子によりコードづけされたポリペプチド類の発現を検出するために、プラスミ ドＤＮＡをＤＨ５α［５Ｕ１）Ｅ４４　ｄｅｌ　ＩａｃＵ１６９　（ｐｈｉ　８ ０　１ａｃＺ　ｄｅｌ　Ｍ２Ｓ）　ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡｌ　ｅｎｄＡｌ　ｇｙ ｒ１９６　ｔｈｉｌｒｅｌＡ１］細胞中に保つかまたは大腸菌菌株１（ＭＳ１． ７４　［ｒｅｃＡｈｓｄＲｒｉｆＲ］またはＢＬ２１　（ＤＥ３）［ｈｓｄＳ　 ｇａｌ　（１Ｂｍｂｄａ　ｃｌｔｓ８５７　１ｎｄｉ　Ｓａｍ７　ｎ１ｎ５　１ ａｃ　ＵＶ５−Ｔ７　ｇｅｎｅｌｌ中に転換させた。ＤＨ５α［５ｕｐＥ４４　 ｄｅｌ　１ａｃＵ１６９　（ｐｈｉ　８０　１ａｃＺ　ｄｅｌ　Ｍ１５）ｈｓｄ Ｒ１７ｒｅｃＡｌ　ｅｎｃｌＡｌ　ｇｙｒ１９６　ｔｈｉｌ　ｒｅｌＡ１］また は８ＭＳ１７４　［ｒｅｃＡ　ｈｓｄＲｒｉ　ｆＲ］細胞中では、Ｔ７ボリメラ ーゼの添加による蛋白質の発現は０．３の感染多重度におけるラムダ相ＣＥ６を 用いる晩期対数増殖期の挿入により得られた。ＢＬ２１　（ＤＥ３）［ｈｓｄＳ 　ｇａｌ　（ｌａｍｂｄａ　ｃｌｔｓ８５７　１ｎｄｉ　Ｓａｍ７　ｎ１ｎ５　 １ａｃ　ＵＶ５−Ｔ７　ｇｅｎｅｌ］細胞では、Ｔ７ボリメラーゼ遺伝子生成物 をイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（ＢＲＬ）を添加するＩａｃＺプ ロモーターの抑制解除により発現させた。両者の工程ともスッジエル他［（１９ ８６）、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１８９　：１１３−１３０１により記載 されている如くして製造された。 導入から１〜３時間後に、誘導された細胞の試料を集めそして遠心により１０倍 に濃縮し、そして溶解緩衝液［１００ｍＭのＮａＣ］、５０ｍＭのトリスｐＨ８ ，０，１ｍＭのＥＤＴＡ］中に再懸濁させた。濃縮された細胞の試料（１０μＬ ）を等量のＳＤＳ染料緩衝液中で数分間沸騰させることにより溶解させ、次に実 施例３に記載されている如くして１８％ポリアクリルアミドＳＤＳ変性ゲル上に 充填した。一方、１００μＬ試料を誘導された培養物から取り出し、Ｍ９最少培 地中に再懸濁させモしてｓｓＳメチオニンで標識づけした。標識づけ工程はスッ ジェル他［（１９８６）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１８９：１１３−１３ ０］により記載されている如くして行われた。これらのポリペプチド類は高い百 分率のメチオニンを有するため、それらは大腸菌細胞中の他の蛋白質より良好に 標識づけされるであろうと予期された。１０分後に、標識づけされた細胞を遠心 により１０倍に濃縮した。濃縮した細胞を標識づけされなかった試料と共に溶解 させモして５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填した。 ゲルを固定しそして５０％トリクロロ酢酸、１０％酢酸、０．１％クーマン−ブ ルー中で３０分間染色し、次に５０％メタノール、１０％酢酸中で３０分間脱色 し、その後に５％メタノール、７％酢酸中で一夜脱色した。固定されそして脱色 されたゲルを真空乾燥し、そして標識づけされた蛋白質を含有するゲルをＸ線フ ィルム付きのフィルムカセット中に一夜にわたる露光のために入れた。 クーマツ−染色すると、ポリペプチド遺伝子生成物は比較的小さい（く８ｎ）遺 伝子構成体のほとんどに関して可視化された。ゲル上で可視的な７，０００ダル トンより小さい分子量を有する大腸菌蛋白質はなかった。このことがこれらの＜ ６．０００ダルトンのポリペプチド遺伝子生成物の可視化を促進した。それらは 推定４０ｍｇ／Ｌの元の誘導された細胞培養物までを発現した。誘導されたポリ ペプチド類は３１１８メチオニン標識づけされた試料のオートラジオグラフ上の 強く標識づけされた帯としても見られた。ＳＳＰポリペプチド類はこのゲルシス テムにおける球状寸法標準により予期されたものより幾分速く走る傾向がある。 それぞれの過剰発現したポリペプチド帯の寸法は実施例５で測定された個々の遺 伝子配列と比例していた。 ！−１ヱ Ｄ１６　３８　３．４６４　３９ ８２−４　４４　５．９５４　４５ ８４−Ｈａ　４６　３．４６４　４７ ８ｇ−Ｈ２３４Ｂ　３．５４２　４９ ８Ｂ−２５０４，６２２５１ ９０−Ｈａ　５２　４．５０２　５３ ９２−２　５４　３．６９５　５５ ２−９　５６　９．６９１　５７ ３−５　９０　６．８２０　９１ Ｓ−１５８６，８５６５９ ｓｅｇ　３　Ｂ４　４．４６６　８５ ｓｅｇ　４　９６　４．４６６　９１ ｓｅｑ　５　１００　４．４６６　１０１會ｓｅｇ　３４　Ｂ６　８．９３２　 ８７二とＬΣヒーー」旦４　１３．３９８−−一−−−二胆ｓ−−傘これらの蛋 白質は大腸菌中で発現に関して試験されなかつｔ二。 過剰製造されたポリペプチド類の一部の同定をウェスタン・プロ・ソト方法およ び実施例３に記載されている如き抗−８ＳＰ抗体との反応により確認した。ホー スラディツシュペルオキシダーゼと共役した第二抗体の使用および化学蛍光可視 化により、比較的大きい感度で検出が行われた。この工程は製造業者の指示（ア メルシャム）に従い行われた。抗−３ＳＰ（５）４および抗−５ＳＰ（７）４抗 体は他の大腸菌蛋白質（〜７０００−８．０００ダルトン）と相互作用するが、 それらを使用して比較的小さい分子量の誘発さ、わ、たポリペプチド生成物を検 出できる。抗−８ＳＰ（５）４は例えば８４−３　（配列同定番号：４７）およ び５−１（配列同定番号・５９）の如き５ＳＰ５繰り返しを含有する遺伝子から のほとんどのポリペプチド類と反応するが例えば８２−４　（配列同定番号：４ ５）および３−５（配列同定番号：９１）の如き５ＳＰ７繰り返し配列だけを含 有する遺伝子からのポリペプチド類とは反応しなかった。抗−３ＳＰ（７）４は クローン８２−４　（配列同定番号：４５）および３−５（配列同定番号：９１ ）（はとんど５ＳＰ７繰り返りからのポリペプチドと反応したが、５ＳＰ７繰り 返しが５ＳＰ５繰り返し内に含まれているクローン５−１（配列同定番号：５９ ）からのポリペプチドとは比較的良くなく反応した。 実施例３に記載されている抗ＧＳＴ　５ＳＰ−３−５抗体を使用してバクテリア 誘導試料中で５ＳＰ−３−５蛋白質（配列同定番号：９１）を検出した。出願人 は１　：　１００に希釈された誘導試料中で蛋白質を検出した（約２０ｎｇの蛋 白質）。この抗体の特異性を全ての他の合成蛋白質類の誘導試料に対して試験し た（表５参照）。それはクローン８６−８２３（配列同定番号：４９）および８ ８−２　（配列同定番号：５１）からの蛋白質との限定された交差反応性、クロ ーンＤ１６（配列同定番号：３９）および８４−Ｈａ　（配列同定番号＝４７） からの蛋白質との比較的大きい反応性、並びにクローン８２−４　（配列同定番 号：４５）（クローン３−５（配列同定番号：９１）の先駆体）からの蛋白質と の強い反応性を有していた。 実施例７ 植物中の合成遺伝子生成物発現用のキメラ遺伝子の構成植物の葉細胞中で実施例 ６に記載されている合成遺伝子生成物を発現させるために、配列を大腸菌発現ベ クターｐＳＫ６またはｐＳＫ３４からプラスミドｐＭＨ４０に移した（図１０参 照）。プラスミドｐＭＨ４０は、カリフラワーモザイクウィルスからの３５３５ ’プロモーター配列、クロロフィルａ　／　ｂ結合用蛋白質遺伝子からの５′翻 訳リーダー配列、ｂ−グルクロニダーゼ（ＧｔＪＳ）遺伝子用のコードつけ領域 、およびＮ０８３’非−コードづけ配列を含有している。このプラスミドはＡＴ Ｇ翻訳開始コドンに非反復Ｎｃｏｌ制限部位をそして翻訳停止コドンに非圧ｉＪ ［Ａｓｐ７１８部位３′を有するように設計されていた。 ＧＵＳ遺伝子コードづけ配列を合成貯蔵蛋白質遺伝子配列で置換するために、１ ０μｇのｐＭＨ４０ＤＮＡをＡｓｐ７１８およびＮｃｏｌ制限エンドヌクレアー ゼを用いて完全に消化した。消化生成物を１．０％アガロースゲル上で１５ボル トにおける一夜の電気泳動により分離した。３５ＳプロモーターおよびＮ０５３ ’配列を含有する５、０８０ｂ。 ベクターフラグメントをＧＵＳコードづけ領域を含有する比較的小さいフラグメ ントから分離した。アガロースを帯の前で切断し、ホヮットマン３ＭＭ紙の１０ １０Ｘ５片をアガロース中に挿入し、そしてフラグメントを紙の中で電気泳動さ せることにより、５．０８０ｂｐフラグメントを集めた〔ニリントン、（１９９ ０）、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ）、１８：１７１．フラグメントおよび緩衝液を遠心により紙から回 転除去し、そして１０ｍｇのｔＲＮＡ、１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２ ００μＬのエタノールを加えることにより〜１００μＬ中のＤＮＡを沈澱させた 。沈澱したＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、そして真空下で乾燥した。フラ グメントＤＮＡを２０μＬの水中に再懸濁させそして一部を連結反応における使 用のために１０倍に希釈した。 クローン８２−４．８４−８３．８６−４４２３．８８−２、および９Ｏ−Ｈ８ ，３−５およびｐＳＫ５３４のそれぞれからのプラスミドＤＮＡ　（１０ｍｇ） をＡｓｐ７１８およびＮｃｏｌ制限エンドヌクレアーゼを用いて完全に消化した 。消化生成物を実施例５に記載されている如くして１８％ポリアクリル１ミド非 変性ゲル上で分離した。希望するフラグメントを含有するゲル切片をゲルから切 断しそしてゲル切片を１％アガロースゲル中に挿入しそして１００ポルトにおい て２０分間にわたり電気泳動させることにより精製した。ＤＮＡフラグメントを ホヮットマン３ＭＭ紙の１０１０Ｘ５片上で集め、緩衝液およびフラグメントを 遠心により回転させ、そしてＤＮＡをエタノールで沈澱させた。フラグメントを ６μＬの水中に再懸濁させた。１マイクロリツトルの希釈された上記のｐＭＨ４ ０フラグメント、２μＬの５×連結反応緩衝液および工μＬのＴ４　ＤＮＡリガ ーゼを加えた。混合物を１５°において一夜連結反応させた。 連結反応混合物を大腸菌菌株［５ｕｐＥ４４　ｄｅ　ｌ　Ｉ　ａｃＵ１６９（ｐ ｈｉ　ｓｏ　ＩａｃＺ　ｄｅｌ　Ｍ２Ｓ）　ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡｌｅｎｄＡｌ 　ｇｙｒ１９６　ｔｈｉｌ　ｒｅｌＡ１］中に転換させそしてアンピリシリン− 抵抗性コロニーを選択した。クローンを急速プラスミドＤＮＡの制限エンドヌク レアーゼ消化分析およびＤＮＡ配列化によりスクリーニングした。ＤＮＡ　（３ ５ＳプロモーターとＮｏ　Ｓ　３’配列の間に挿入された合成遺伝子配列を含有 するクローンから）を５ａｌＩエンドヌクレアーゼを用いて完全に消化した。３ ５Ｓプロモーター：二合成遺伝子：：ＮＯ３３’配列は〜２１００ｂＳａ　Ｉ　 Ｔフラグメント上に含まれていた。このフラグメントを実施例７に記載されてい る如（してホヮットマン３ＭＭ紙上で１％アガロースゲルから単離した。 種子中でＳＳＰを高水準で発現させるために、同じコードづけ領域を上記と同様 な工程により種子プロモーターベクターＣＷ１０８、ＣＷＩ０９またはＭＬ１１ ３に移した（図１１）。ベクターＣＷ１０８およびＭＬ１１３は、ビーンのファ セ第１ルプロモーター（塩基＋１力＼ら塩基−４９４まで）およびビーンのファ セオリン遺伝子からの３′配列の１１９１個の塩基を含有している。これらのベ クターは非圧ＩＮｃｏＩおよびＡｓｐ７１８部位中へのコードづけ配列の直接的 クローニングを可能にするように設計されていた。これらのベクターは５′およ び３′端部に部位（Ｈｉｎｄｌｌｌまたは５ａｌＩ）も供しており、適当な二次 ベクターへの直接的なプロモーター／コードづけ領域／３′配列の移動を可能に している。 実施例８ ＳＳＰキメラ遺伝子を用いるりＩくコの転換二次ベクターであるｐＺＳ９７また はＩ）　Ｚ　Ｓ　９７　Ｋを使用してキメラ遺伝子を植物に移した。両方の二次 ベクターであるｐＺＳ９７およびｐＺＳ９７Ｋ（図１２）はアグロバクテリウム ・ツメファシェンスの二次Ｔｉプラスミドベクターシステム［ベヴアン、（１９ ８４）　、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、１２：８７１１−８７２９］の一 部である。ベクター（ま、（１）キメラ遺伝子ツバリンシンセターゼニーネオマ イシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｏｓ　：　：ＮＰＴＩ　Ｉ）（１）転換さ れｔこ植物細胞用の選択可能なマーカーとしてキメラ遺伝子ノ、（リンシンター ゼ：：ネオマイシンフオルフオトランスフエラーゼ（ｎｏｓ　：　：ＮＰＴＩＩ ）［ベヴアン他、（１９８３）、ネーチャー、３０４　：１８４−１８６１、（ ２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左および右境界［ベヴアン、（１９８４）　 、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、１２：８７１１−８７２］、（３）ポリ リンカー領域中に非反復５ａｉ１部位（ｐＳＫ９７Ｋ）または非反復Ｈｉｎｄｌ １１部位（ｐＺＳ９７）を有する大腸菌１ａｃＺａ−補充部分［ヴイエリング（ Ｖｉｅｒｉｎｇ）他、（１９８２）、ジーン、１９　：　２５９−２６７１、（ ４）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドｐＶＳ１　［イトウ （Ｉｔｏｈ）他、　（１９８４）、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、１１−２０ ６−２２０］　、並びに（５）転換されたＡ、ツメファシェンス用の選択可能な マーカーとしてのＴｎ５からのバクテリア性ネオマイシンフォスフオドランスフ ェラーゼ遺伝子［ベルブ（Ｂｅｒｇ）他、（１９７５）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、ｕ、ｓ、Ａ、７２−３６２８−３６３２］　（ｐＺ Ｓ９７Ｋ）またはバクテリア性β−ラクタマーゼ遺伝子（ｐＺＳ９７）を含有し ている。 プラスミドｐＺＳ９７Ｋ　ＤＮＡを５ａｌｌ酵素を用いて完全に消化し、そして 消化したプラスミドを実施例７に記載されている如くゲル精製した。５ａｌＩ消 化したｐＺ３９７Ｋ　ＤＮＡを実施例７からの単離されたキメラ遺伝子フラグメ ントと混合しそして１５°において一夜にわたり連結反応させた。連結反応混合 物をＤＨ５α［５ｕｐＥ４４　ｄｅｌ　１ａｃＵ１６９　（ｐｈｉ　ｓｏ　Ｉａ ｃＺ　ｄｅｌ　Ｍ２Ｓ）ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡｌ　ｅｎｃｌＡｌ　ｇｙｒ１９６ 　ｔｈｉｌ　ｒｅｌＡ１］またはＨＭＳ１７４　［ｒｅｃＡ　ｈｓｄＲｒ　ｉ　 ｆＲ］細胞中に転換させ、そしてカナマイシン抵抗性コロニーを選択した。カナ マイシン抵抗性コロニーからのプラスミドＤＮＡ類を制限消化分析およびキメラ 遺伝子の存在に関するＤＮＡ配列化によりスクリーニングした。 プラスミドｐＺＳ９７ＤＮＡをＨｉｎｄｌｌＴ酵素を用いて完全に消化し、そし て消化したプラスミドを実施例７に記載されている如（ゲル精製した。Ｈｉｎｄ ｌｌｌ消化されたｐＺＳ９７ＤＮＡを実施例７からの単離されたキメラ遺伝子７ ラクメントと混合し、連結反応させ、上記の如く転換しそしてコロニーをアンピ シリン上で選択した。 キメラ遺伝子を含有する二次ベクターを二親交配［ルヴキン（Ｒｕｖｋｉｎ）他 、（１９８１）、ネーチャー、２８９　：　８５−８８１によりカナマイシンま たはカルベニシリン抵抗性を選択するアグロバクテリウム株ＬＢΔ４４０４／ｐ ＡＬ４４０４　［ホッケマ（ｌＩｏｃｋｅ＋ａａ）他、（１９８３）、ネーチャ ー、３０３　：１７９−１８０１に移した。二次ベクターを含有するアグロバク テリウムの培養物を使用してタバコの葉のディスクに移した［ホルシュ（１１ｏ ｒｓｃｈ）他、（１９８５）、サイエンス、２２７　：　１２２９−１２３１］ 。Ｉ・ランスジェニック植物をカナマイシンを含有誓る選択的媒体中で再生し、 そして実施例９に記載されている如くしてドランスゲンの存在に関してスクリー ニングした。 実施ｆｌＩ９ トランスジェニック・タバコ植物の分析り葉からの核酸の分析 ３５５プロモーター並びにクローンであｍ５ｓ−Ｈ２ａ　（配列同定番号：４８ ）、８８−２（配列同定番号：　５’Ｏ）　、９０−’Ｈ８（配列同定番号・５ ２）および３．−５（配列同定番号：９０）を含有する植物からの葉を使用して ＤＮＡおよびＲＮＡ抽出物を製造した。これらの抽出物をＰＣＲ、サザンおよび ノーザン・プロット分析用に使用した。長さが１０ｃｍの葉から誘導された２グ ラムの葉の組織をドライアイス上に液□体窒素を含有する乳鉢の中に入れた。組 織を粉砕して微細粉末とした。 この粉末を殺菌性の５９ｍＬポリエチレン遠心管の中の１０ｍＬの抽出緩衝液［ ５０ｍＭのトリス、ｐＨ９，０，１０ｍＭのＥＤＴＡ、２％のＳＤＳ］に５０℃ において加えた。・５ミリグラムのプロテナーゼＫを加え、そして混合物を場合 により混合しながら５０℃において１０分間培養した。溶液をフェノール；クロ ロホルム：イソアミルアルコール［２５：２４：１１で２回そしてクロロホルム ：イソアミルアルコールで２回抽出した。水層を０．３Ｍ酢酸ナトリウムとし、 そして２．５容量のエタノールを用いて沈澱させた。核酸を含有するペレットを ７０％エタノールで洗浄しそして真空乾燥した。ペレットを１０．０ｍＬの水中 に再暢濁させ、等量の４Ｍ・ＬｉＣ＋、と混合し、そして氷上で１時間に−わた り放置して沈澱させた。沈澱したＲＮＡを１．０．０００ｒｐｍにおける２５分 間の４℃の遠心により集め、５．０ｍｌの水中に再懸濁させ、そして上記の如＜ ＬｉＣｌ２を用いて２回以上再沈澱させた。第三の沈澱後に、溶液を領３Ｍ酢酸 ナトリウムとし、そして２．５容量のエタノールで洗浄し、遠心し、そしてノザ ーン・プロット分析における使用のために、再懸濁させた。ＤＮＡを含有する元 の上澄み液をドライアイス上で１容量のイソプロパツールを用いて沈澱させ、遠 心により集め、７０％エタノールで洗浄し、そしてＰＣＲおよびサザン・プロッ ト分析における使用のために再懸濁させた。 ＩＩ種子からのＲＮＡの抽出 種子組織中のＳＳＰの発現を分析するために、開花後１４日間にわたり集められ た２００ｍｇの種子を液体窒素下で乳鉢および乳棒を用いて微細粉末に粉砕する ことによりＲＮＡを抽出した。次に３ｍＬのフェノール・クロロホルム：イソア ミルアルコール（２５：　２４　：　１）および４．５ｍＬの抽出緩衝液［ＩＭ のトリスｐＨ９，０，１％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプト−エタノール］を加 えることにより、粉末を２回抽出した。１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよ び２．５容量のエタノールを加えることにより、上澄み液中の核酸を沈澱させた 。沈澱を遠心により集め、８０％エタノールで洗浄し、そして空気乾燥した。ペ レットを次に４ｍＬの水中に再懸濁させ、そして１ｍＬのｌＱＭＬｉｃ］ｚを加 えた。ＲＮＡを４°において１時間にわたり沈澱させ：遠心により集め、そして ペレットを５００μＬのＨ，Ｏ中に再懸濁させた。 ＩＨ，植物ＤＮＡのＰＣＲ分析 トランスジェニック・タバコ植物中のＳＳＰ遺伝子配列の存在を確認するために 、抽出されたＤＮＡをポリメラーゼ鎖反応における鋳型として使用した。特異的 プロモーターおよびトランスゲンの３′配列とアニーリングしたオリゴヌクレオ チドブライマーを１吏用した。オリゴヌクレオチドブライマーは下記の如くであ った：３５５　プロそ一ター配列に関して： ３５５１　５°−茸丁ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣへ（Ｇ−３°　（配列同定番号＋　 ｌ０Ｇ）ＮＯ５３’配列に関して にｌｕｓ　Ｓ’−Ａｊ心λＧλＧ貼ττＧ八へ八へ−３（配列同定番号１０７） フ７セオリノプロモーター配列に関して５Ｍ１２４　Ｓ’−ＧτＡＣτＡＣＴＡ ＣＴＣＴＡＣτ入Ｃ丁−３＋　（配列同定１＃号・１０８）ファセオリン３′配 列に関して ５Ｈ１２５Ｓ’−Ｇ＾ｗｔｃ丁τ入Ｃ八ＣＣＴへＣＡＴＧＣ：Ａ−３１（配列同 定“番号　１０９）β−コ／グリ／ニンプロモーター配列に関して５Ｍ１２６　 Ｓ’−Ｃ入τＣ晶ＧＡＡＣＣＡＧ７τＣＡＡτ＾−３，（配列同定番号：１１０ ）ＰＣＲ反応混合物は０．１−０．３μｇの各プライマー、１μｇの植物ＤＮＡ 、４ｕＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰＳ、５ｔｔｌ−の１．　ＯＸ反応緩１ｒｉｌ（ ８００ｍＭのトリスｐＨ９，０，２００ｍＭ（’）（ＮＨ４）２ｓＯ４，１５ｍ ＭのＭｇ　Ｃ’　Ｉ　ｚ）　、１　ｍＬのパーフェクト・マツチ７１１（ストラ トゲン、う・ジョラ、ＣΔ）および４９μＬの最終容量とするためのＨ，Ｏを含 んでいた。９５°における５分間にわたる初期変性後に、１μＬのＴ　Ａ　Ｑ　 ”ポリメラーゼをそれぞれの反応に加え、そして下記のサイクルプログラムを行 った＝４０サイクルに関して９５″における１分間、４２″′における１分間、 および７２°における３分間。ＰＣＲ出現ＤＮＡフラグメントを１，２％アガロ ースゲル上で分離し、そして臭化エチジウムを用いて可視化した。出現した帯は 構成によりＳＳＰゴードづけ領域より１００〜２００個の塩基だけ長かった。正 しいＰＣＲフラグメントを有する植物はトランスゲンに関して陽性であると指定 された（表７および８を参照のこと）。 ＩＶ、植物ＤＮＡのサザン・プロット分析ＰＣＲ陽性植物から誘導されたＤＮＡ を、１０μｇをＢａｍＨＩまたはＡｓｐ７１８を用いて完全に消化し、フラグメ ントを１．０％アガロースゲル上で分離し、２０ＸＳＳＣ［マニアチス］を使用 してＤＮＡをＨｙｂｏｎｄＭ膜に移しそしてプロットをトランスゲンに適するジ ゴキシゲニンで標識づけされたＤＮＡフラグメントを用いてノｓイブリ・ソド化 することにより、さらに分析した。プロット工程、プローブフラグメントのジゴ キシゲニン標識づけ、／％イブリッド化および洗浄条件、並びに信号の抗体可視 化はゲニウスＴＭプロ、ソト・キ、ソト（Ｕ　Ｓ　Ｂ）に関して記載されていた 。３５Ｓ：５ＳＰ３＝５：Ｎｏ５３’トランスジエニツク植物に関するサザン・ プロット分析は表７にまとめられている。 ■、植物ＲＮＡのノザーン・プロット分析上記の如くして単離されたＲＮＡを、 ５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム中３％ホルムアルデヒド、Ｑ、１ｍ’Ｍのエチレン ジアミン四酢酸ナトリウムを含有する１％アガロースゲル上で分離した。分離さ れたＲＮＡを２ＱＸ　ＳＳＣを用いてゼタプローブＴ″膜に移し、プロットを適 当なｓａｐ桝識づけされたＤＮＡプローブフラグメント（プローブフラグメント はプロモーター、ＳＳＰコードづけ領域および３’ＤＮＡ配列を含む）を用いて ４５°においてハイブリッド化し、２ｘ　ｓｓｃで３回、２５６の０．１％ＳＤ Ｓ、次１．−０．　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃテ３回、５５’（７）０．１９６３ＤＳ で洗浄し、そしてプロットをオートラジオグラフにかけた。ＳＳＰ　ＲＮＡメツ セージの相対的水準は表７および８にまとめられている。 ｖｔ、　ｔ−ランスジェニック・タバコ葉の中のＳＳＰ蛋白質の発現３５Ｓプロ モーターおよび５ＳＰ−３−５に関する遺伝子を含有する植物からの葉を使用し て蛋白質抽出物を製造した。蛋白質抽出物は長さがｌＱｃｍの葉から製造された 。中央脈を除去し、そして組織を片に切断しそして重量測定した。抽出緩衝液（ １ｍＬ／ｇの組織）　：　［５０ｍＭのトリス・Ｃ１，１ｍＭのＥＤＴＡ、５Ｑ ｍＭのＮａＣ１、ｐ）１７゜５］を氷上の小さい乳鉢中の組織に加えた。滑らか なペーストが得られるまで、組織を約１０分間にわたり粉砕した。さらに１ｍＬ の抽出緩衝液を１グラムの組織に加え、そして粉砕をさらに５分間続けた。スラ リーをエツペンドルフ遠心管に移し、そして１０．ＯＯＯｒｐｍにおいて１５分 間にわたり４℃で回転させた。上澄み液を新しい管に移し、凍結し、そしてエノ ペンドルフ遠心機中で５分間にわたり全速で再回転させた。試料中の蛋白質の濃 度をバイオラド蛋白質検定および標準としての牛血清アルブミンを用いて測定し た。上澄み液を希釈し、２Ｘ　ＳＤＳ染料１ｉｔＷＲ液（エンプロチク）と混合 し、そして２分間沸騰させ、その後に１μｇを１７〜２７％勾配５ｔ）Ｓゲル上 に充填した。ゲルを０．２ミクロンのニトロセルロース（バイオラド）上でプロ ットし、そして抗−ＧＳＴ−３ＳＰ−３−５との反応により現像し、その後に実 施例５に論じられている如くして化学蛍光検出（アメルシャム）を行った。葉の 組織のウェスタン分析の結果は表７に示されている。 ウェスタン・プロットデータから、５ＳＰ−３−５蛋白質（配列同定番号・９１ ）が葉の組織中で合計細胞蛋白質の０．５％までの水準で発現していることは明 白である。３５Ｓプロモーターからの葉の中の発現水準は遺伝子コピーの数およ びｍＲＮＡの定常水準と正比例している。 ３５Ｓプロモーターからの種子中の５ＳＰ−３−５蛋白質（配列同定番号：９１ ）の発現は約０．０１％に限定される。３５Ｓプロモーターは種子中では劣悪に 発現することが知られているため、この発見は種子中の蛋白質の不安定性を示唆 するものではない。 ＶＩｌ、タバコ種子中でのＳＳＰ類の発現トランスジェニック・タバコ植物から 収穫された乾燥種子を室温において乳鉢および乳棒中で合計で４容量の抽出緩衝 液［１２，５ｍＭのホウ酸ナトリウム、ｐＨ１０，０，１％のＳＤＳ、２％の２ −メルカプトエタノール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド］と 共に粉砕した。粉砕は２容量の緩衝液を用いて開始された。ペーストが得られた 後に、さらにフェニルメチルスルホニルフルオライドを加えて最終濃度を２ｍＭ としそして最終的な２容量の緩衝液を加えた。生じたスラリーを凍結させそして 次にエッペンドルフ遠心機中で１５分間にわたり４℃において遠心した。上澄み 液を他の管に取り出しそして標準として牛血清アルブミンを用いるバイオラド・ ラボラトリーズ（ハーキュルス、ＣＡ）蛋白質検定を使用して濃度を測定した。 試料を希釈し、ＳＤＳゲル充填緩衝液を加え、そして電気泳動をダイイチ中間ゲ ル（１０−２０％アクリルアミド）上で行った。ニトロセルロースへの移動は実 施例５の如くして行われ、そしてポリクローン性兎の抗−ＧＳＴ−ＳＳＰ３−５ 血清を用いて合成貯蔵蛋白質を検出した。これらの植物のウェスタン分析の結果 は表８に示されている。 これらの植物の種子に対してアミノ酸分析を行った。１５個の成熟種子を熱分解 ガラス試験管中に１００μＬの６ＮＨＣ＋、（二重蒸留された、５ｍＬのＶ４Ｃ ＯＲアンプル）、０．４％のメルカプトエタノールと共に入れた。懸濁液をアル ゴンでガス抜きし、そして管をアルゴン下で封印した。試料を１１０−１２５℃ において２０−２４時間にわたり培養した。管を割り、内容物を乾燥し、そして ５０μＬ当たり２０モルのノルロイシンを含有する５００μＬの希釈緩衝液（ペ ックマン）中に再懸濁させた。５０ｍＬをイオン交換アミノ酸分析カラムが備え られているベックマンシステム６３００アミノ酸分析器上に注いだ。製造業者の 推奨に従い分析を行った。１８個のアミノ酸が分析された。リシンが分析された 合計アミノ酸の百分率として発現された。結果は表８に示されている。 フェセオリンプロモーター／５ＳＰ−３−５コードづけ領域およびファセオリン ３′配列を有するトランスジェニック・タバコ植物の分析は、５ＳＰ−３−５遺 伝子配列（配列同定番号：９０）が安定でありそして遺伝子生成物の発現がｍＲ ＮＡ水準に補正されたことを示した。これらの植物中では、種子中の蛋白質の集 積水準は合計種子蛋白質の１−２％であると推定される。コーン種ｒ中のＳ　Ｓ 　Ｉ）発現のこの水準はリシンおよびメチオニン含有量における泪当な増加をも たらすであろう。 実施例１０ イネ・プロトプラスト中の合成貯蔵蛋白質の発現プラスミド５０８／５Ｋ２９の 構成 イネ・プロトプラストを用いる一時的発現検定における使用のために、５ｓｐ− ３−５遺伝子を化学的に誘導可能なモノコト・プロモーターＨＰＨ５０８［国際 特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１２１０．国際公告番号ＷＯ９０／１１３６１］ と一緒にした（図１３参照）。化学的に誘導可能なプロモーターは出願人が化学 的誘導剤の添加により発現を最高にできるように選択された。 プラスミドｐΔ２４の構成は国際特許出願＃ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１２１０およ び国際公告＃ＷＯ９０／１１３６１中に記載されている。プラスミドｐ△２４を 制限エンドヌクレアーゼ類である５ｎａＢＩおよびＨｐａｌを用いて完全に消化 した。消化生成物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。７６ｂｐＳｎ ａＢＩ／Ｈｐａ　Ｉフラグメントをゲルから切除しそして一夜にわたり３７℃に おいて溶離緩衝液［マニアチス参考文献］中で振ることによりポリアクリルアミ ドがら溶離した。 プラスミドｐ△２４の他の部分試料を制限エンドヌクレアーゼＨｐａｌを用いて 完全に消化しそして牛の腸のアルカリ性ホスファターゼ（べ−リンガ−）で処理 した。ホスファターゼ処理された）（ｐａｌ消化プラスミドおよび７６ｂｐＳｎ ａＢＩ／Ｈｐａ　Ｉフラグメントを１６℃において一夜にわたり一緒に連結反応 させた。連結反応を蒸留水で１：４に希釈し、そして２μＬを使用してコンピテ ントＨＢＩＯＩ細胞（ＢＲＬ）を転換させた。アンピシリン抵抗性転換物をＨｐ ａｌ酵素を用いる制限エンドヌクレアーゼ消化分析によりスクリーニングした。 Ｉｎ２−２誘導可能要素のｐ△２４突然変異の２個のコピーを含有するこのプラ スミドはｐＨＰＨ５０８／ＧＵＳと指定された。 ｐＨＰＨ５０８／ＧＵＳからのプロモーターフラグメントをプラスミドから３２ ５ｂｐＳｐｅ　Ｉ／Ｎｃｏ　Ｉフラグメントとして切除しそして上記の如くポリ アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。３５Ｓプロモーターの後に５ＳＰ −３−５を含有するプラスミドｐＳＫ２９　（実施例７中に記載されている如く 構成された）も同様にＳｐｅ　ＩおよびＮＣ０１制限エンドヌクレアーゼを用い て完全に消化して３５Ｓプロモーターフラグメントを除去し、そして牛の腸のア ルカリ性ホスファターゼ（ベーリンゲル）で処理した。ホスファターゼ処理され たプラスミドおよび３２５ｂｐＳｐｅ　Ｉ／Ｈｐａ　Ｉフラグメントを１６℃に おいて一夜にわたり一緒に連結反応させた。連結反応を蒸留水で１・４に希釈し 、そして２μＬを使用してコンピテントＨＢＩＯＩ細胞（ＢＲＬ）を転換させた 。アンピシリン抵抗性転換物をＨｐａｌ酵素を用いる制限エンドヌクレアーゼ消 化分析によりスクリーニングした。３２５ｂｐプロモーター挿入を含有する生じ たプラスミドはｐＨＰＨ５０８／５Ｋ２９と指定された（図１３参照）。 イネ・プロトプラストの製造 やく−誘導カルスから開始されたイネ懸濁液培養を、１ｍｇ／ｍＬの２．４−ジ クロロフェノキシ酢酸および３％（重量／容量）スクロース、ｐＨ５，８を含有 するチュー（Ｃｈｕ）Ｉｔ！！［Ｓｃｉ　５ｉｎｉｃａ　１８　：　６５９−６ ６８］により記載されている如き新しい液体Ｎ６媒体での１：４希釈比における 弱い継代培養により、保ったつ継代培養から４−６日後に、懸濁液培養からプロ トプラストを製造した。約１５ｇの組織を４ｍＬ／ｇの組織の酵素溶液［２％（ 重量／容量）のセルラーゼ「オノズカＪＲＳおよび０．５％（重量／容量）のマ セロザイムＲ１０（両者ともヤクルト・ホンシャ、ニシノミャ、日本製）、１３ ％（重量／容量）のマンニトール、０．４６３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ｚＳＯ＜、２ ．８３　ｇ／ＬのＫＮＯｓ。 ０．４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４，０，１８５ｇ／ＬのＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ＜・７Ｈ１０ ，０，１６６ｇ／ＬのＣａＣＩｚ・ＨｔＯ−３，３ｍｇ／ＬのＭ　ｎ　Ｓ　Ｏａ 、１　、５　ｍ　ｇ　／　ＬのＺｎ５Ｃ）４’７Ｈ２０，１、６ｍ　ｇ　／　Ｌ のＨｓ　Ｂ　Ｏｓ、８００μｇ／ＬのＫｌ、ｐＨ５，８（０，３Ｍクエン酸を用 いるｐＨ）］と殺菌性ペトリ皿中で混合し、そして−夜そのままにした。懸濁液 を次に充分量（７）Ｋ５．８媒体［１４０ｍＭｃ）ＮａＣＩ、３．６ｍＭのＫＣ Ｉ、０．７５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ１０％　５ｍＭのグルコース、１２５ ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５，８］で洗浄されている殺菌性の９０ミクロンメツシ ュフィルター中に通して濾液の最終的容量を１００ｍＬとした。 溶液を殺菌性の５０ｍＬパイレックス８管に移し、そしてテーブルトップＩＥＣ 振盪パケット遠心機中で５０Ｏｒｐｍ　（５０ｇ）において１０俯轍にわたり遠 心した。上澄み液を２５ｍＬピペットで取り出し、そしてプロトプラストを３５ ｍＬのに５．８媒体中に再懸濁させた。５００ｒｐｍにおける１０分間の遠心後 に、上澄み液を再び取り出し、そしてプロトプラストを１４０ｇ／Ｌのスクロー スを含有する３５ｍＬのＮ６媒体中に再懸濁させた。５００ｒｐｍにおける２０ 分間の遠心後に、プロトプラストが浮遊層を生成しそして廃棄可能なプラスチッ クピペットを用いて管の頂部から除去された。２容量のに５．８媒体を加えそし て最終的収量（プロトプラスト／　ｍ　Ｌ　）をフックスーローゼンクール・ヘ モサイトメーターを用いて測定した。 イネ・プロトプラストの転換および標識づけ１００万個のプロトプラストを合成 貯蔵蛋白質５ＳＰ−３−５遺伝子および化学的に誘導可能なモノコトプロモータ ーＨＰＨ５０８を含有する５μｇのプラスミドｐＨＰＨ５０８／５Ｋ２０を用い て転換させた。 複数のプロトプラスト部分試料（それぞれ１００万個の細胞）を殺菌性のポリス チレンファルコン２０５４管（１２Ｘ７５ｍｍ）中で５０ｇ（５００ｒｐｍ）に おいて５分間にわたり静かに遠心した。上澄み液を廃棄し、そして細胞を静かに 混合してそれらを残りの液体中に再懸濁させた。 １００万個のプロトプラスト当たり５μＬのＴＥ　［１０ｍＭのトリス・ＣＩ、 １ｍＭのＥＤＴＡＳｐ）（８，０１中の５μｇの転換用ＤＮＡを加えた。管を静 かに振って細胞をＤＮＡ溶液中に分散させ、そして４０％のＰＥ０１５４０　（ ポリサイエンセス・インコーホレーテッド、ワリントン、ＰＡ）を含有するＱ、 １ｍＬの溶液および３ｍＭのＣａＣＩｚを加えた。生じたプロトプラスト細胞懸 濁液を静かに混合しそして室温において１分間にわたり培養した。次に２００μ ｇ／ｍＬのＮ−（アミノカルボニル）−２−クロロベンゼンスルホンアミドを含 有する１ｍＬのに５．８溶液を加えてＰＥＧを希釈しモしてＨＰＨ５０８プロモ ーターを誘導させた。溶液は５０μＣＩ／ｍＬの３５３−メチオニンにューイン グランド・ヌクレアー）も含有しており、５ＳＰ−３−５蛋白質をそれが合成さ れた時に標識づけした。同一方法でｐＨＰＨ５０８／ＧＵＳを用いて転換された 対照プロトプラストをプロトプラスト生存率の測定値として使用した。バクテリ ア性紀現システムを用いると、出願人は５ＳＰ−３−５蛋白質の高いメチオニン 含有量を予期して、それがイネ・プロトプラスト中の他の蛋白質より良好に標識 づけする。 転換されたプロトプラストを暗所で２５−２６℃において一夜そのまま培養し、 そして翌日にメチオニンを加えて１ｍＭの最終的濃度とした。 ＧｔＪＳ検定を対照管に対して行い、そして部分試料を次の７２時間にわたるゲ ル電気泳動による分析用に試料管から取り出した。それぞれの部分試料は１００ μしてあった。部分試料を回転させ、Ｋ５．８＋１ｍＭのメチオニンで３回洗浄 し、そして５ｏμＬの溶解緩衝液［５０ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ７，０，１ ０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトン Ｘ−１００，０，１％（７）Ｎ−ラウリルサルコシン］中に再懸濁させた。再懸 濁されたプロトプラストを１分間にわたり撹拌しそしてエッペンドルフ遠心機中 で１２．ＯＯＯｒｐｍにおいて遠心して屑を除去した。ゲル充填緩衝液（２Ｘ− エンプロチク）をプロトプラスト試料と１：１混合し、そして１０〜２ｏμＬを １０−２０％ダイイチ中間ゲルの各レーンに充填した。ゲル緩衝液はトリス−ト リシンＳＤＳ　（エンプロチク）であり、そしてゲルを１５０ボルトにおいて１ ．３時間にわたり走行させた。エンライトニングＴ１′にューイングランド・ヌ クレアー）を用いて製造業者の指示に従い蛍光グラフィを行った。ゲルを０．２ ミクロンのニトロセルロースシート（バイオラド）上で乾燥し、そしてコダック Ｘ−オマトＲＰ５フィルムに３０分間ないし数日間にわたり呈した。５ＳＰ−３ −５の同定性をＲ１値および実施例３で論じられている抗ＧＳＴ−３ＳＰ−３− ５血清を用いる免疫沈澱により確認した。 免疫沈澱は、４０μＬの溶解されたプロトプラストを１０容量（４００μＬ）Ｃ ７）ＴＮＥＴ緩衝液［５０ｍＭのトリス・ｃｌ、ｐＨ７，５，１５０ｍＭのＮａ Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％トリトンＸ　１００］で希釈することにより、行 われた。試料をエツペンドルフ遠心機中で全速で５分間にわたり回転させて屑を 除去した。ＧＳＴ−５ＳＰ−３−５で免疫化された兎からの血清（実施例３）を 加え（５μＬ−２０μＬ）、そして試料を３７℃において１時間ないし一夜にわ たり培養した。死滅黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　Ａｕｒｅｕ ｓ）　（カリバイオケム）細胞を加え［５μＬの１０％懸濁液］、そして試料を ４℃において１５分間ないし１時間にわたり培ｙした。試料をエッペンドルフ遠 心機中で５分間にわたり全速回転させることによりＴＮＥＴ緩衝液＋４０％（重 量／容量）スクロース＋０．１％（重量／容量）ドデシル硫酸ナトリウムのり・ ソシジンを通してペレット化した。ペレットを再懸濁させそしてＴＮＴ１１１１ ｊ液［５０ｍＭのトリス・ＣＩ、ｐＨ７，５，１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のト リトンＸ１００］中で３回洗浄し、そして最後に１２０ｍＭのトリス・Ｃ１、ｐ Ｈ６，８で１回洗浄し、染料緩衝液（エンプロチク）中に再懸濁させ、モしてＳ ＤＳポリアクリルアミドゲル上に充填した。 これらの実験は、５ＳＰ−３−５蛋白質が胚形成性懸濁液培養物から誘導された イネ細胞中で安定であることを示している。、（ルスチェイス実験は、蛋白質減 成に関する半減期が５ＳＰ−３−５蛋白質に関しては背景イネ蛋白質に関するの と大体同じであることを示した。 配列リスト （１）一般的情報； （ｉ）出願人：　サヴエリオ・カール・ファルコシャロンＪ、キーラー ジャネットＡ、ライス （ｉｉ）発明の名称　植物の栄養値改良用のプログラム可能水準の必須アミノ酸 類を含有する規定された構造を有する合成貯蔵蛋白質 （ｉｉｉ）配列の数＝　１１３ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）受信人：　Ｅ、１．デュポン・デ・ネモアス・アンド・カンパニー （Ｂ）街路：　１００７　マーケットストリート（Ｃ）市：　ウィルミントン （Ｄ）州：　プラウエア （Ｅ）国：　米国 （Ｆ）ジップ：　１９８９８ （ｖ）コンピューター読み取り形： （Ａ）メディウム型：　フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター二　マツキン トラシュ（Ｃ）操作システム：　マツキントラシュ・システム、６．０（Ｄ）ソ フトウェア・　マンキントラシュ・ワード、４．０（ｖｉ）最近の出願データ： （Ａ）出願番号・ ＣＢ）出願臼： （Ｃ）分類。 （ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：　０７／７４３．００６（Ｂ）出願臼＋　１９９１年８月９日 （ｖｆｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：　リンダ・アクサメシー・フロイド（Ｂ）登録番号＋　３３．６９ ２ （Ｃ）照合／ドケット番号：ＢＢ−１０３１（ｉｘ）電信情報： （Δ）電話：　（３０２）９９２−４９２９（Ｂ）テレファ・ソクス−（３０２ ）８９２−７９４９（Ｃ）テレックス＋　８３５４２０ （２）配列同定番号：１に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝２８債のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）！Ｒ：未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／ａ；蛋白質 （Ｂ）位置：１．．２Ｂ （Ｄ）他の情＠：／標識−名称 ／注−”（’３３Ｐ　４）４” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝１＝ＬｅｕＧｌｕＧｌｕＬｙｓＬｅｕＬｙｓ ＡｌａＬｓｕＧｌｕＧｌｕＬｙｓＬａｕＬｙコ入１ａＬｅｕＧｌｕｘ　Ｓ　１０ 　１ｓ （２）配列同定番号：２に関する情報：（ｉ）配列特性・ （Ａ）長さ：２８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：蛋白質 （Ｂ）位置：１．．２Ｂ ＣＤ）他の情報：／操識−名称 ／注−“″（ＳＳＰ　５）４” （ｘｌ）配列記載二配列同定番号：２：Ｎｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｈｅ ｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｓ＠ｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｎｅｔ　Ｌｙｓ　入ユ ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ１　Ｓ　１０　１ｓ （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２８個のアミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖　未知 （Ｄ）トポロジー・未知 （１１）分子型　蛋白質 （１ｘ）特徴： （Ａ）名称／ｌｉ！、蛋白質 （Ｂ）位置：１．．２８ （Ｄ）他の情報：／標識−名称− （ｘｉ）配列記載・配列同定番号：３：（２）配列同定番号：４に関する情報： （ｉ）配列特性： （１１）分子型：蛋白質 （１ｘ）特徴。 （Ａ）名称／鍵：蛋白質 （Ｂ）位＃：１．．２Ｂ （Ｄ）他の情報二／漂識−名称 ／注−″’（ＳＳＰ　８）４−゛ （ｘｉ）配列記載−配列同定番号：４：（２）配列同定番号：５に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ７２８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ロ）分子型：蛋白質 （ＩＸ）特徴： （Ａ）名称／鍵　蛋白質 （Ｂ）位置＋１．．２８ （Ｄ）他の情報・／標識−名称　゛　□／注−”（ＳＳＰ　９）４” （ｘｌ）配列記載：配列同定番号＝５＝ＮｅｔＧｌｕＧｌｕ’ＬｙコＬｅｕＬｙ ｓＴｒｐＭｅｔＧｌｕＧｌｕＬｙｓＬｅｕＬｙｓτ卯ＭｅｔＧｌｕ１　５　１Ｑ 　１５ （２）配列同定番号：６に関する１＊報・（１）配列特性。 （Ａ）長さ７２８個のアミノ酸 （Ａ）名称／鍵、蛋白質 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （１１）分子型：蛋白質 （１ｘ）特ｇＬ： （Ａ）名称／鍵：蛋白質 （Ｂ）位置：１．．２８ （ｘｉ）配列記載：配列同定番号二６：（２）配列同定番号ニアに関する情報工 （ｉ）配列特性二 （Ａ）長さ＝２８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）ｉ＋１：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （１１）分子型：蛋白質 （１ｘ）特徴： （Ｂ）位置：１．．２８ （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／　＠Ｉ　：　ｒｎ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置：１．．２４ （Ｄ）他の情報：／生成物−゛合成オリゴヌクレオチド”／ＩＩ準−名称一“５ Ｍ７１” （χ１）配列記載：配列同定番号：ｌＯ：ＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＣＡ ＴＣＴ　Ｇ’ｒＧＣ”（２）配列同定番号：ｌｌに関する情報：（ｉ）配列特性 。 （Ａ）長さ７２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （ｉ宜）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （Ｂ）位置：１２７ （Ｄ）他の情報、／生成カー゛合成オリゴヌクレオチド゛。 ／標準−名称一”５Ｍ７８” （！ｉ）配列記１Ｒ：配列同定書号：１１：（２）配列同定番号＝１２に関する 情報；（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ７２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位ｌＩＩ：１．．２７ （Ｄ）他の情報二／生成物−゛合成オリゴヌクレオチド”／標準　名称−”５Ｍ ７９°′ （ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝１２＋λλτＡＴＣＧＡＴＧ　ＣＣＡＣＧＡ ＴＧＣＧ　ＴＣＣＧＧＣＧ　２７（２）配列同定番号：１３に関する情報：（ｉ ）配列特性： （Ａ）長さ２５５個の塩基対 （Ｂ）型・核酸 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／！：ｍ１ｓｃ　＊微 ＣＢ）位置：ｔ、、５Ｓ （Ｄ）他の情報：／生成物−″合成オリゴヌクレオチド”／標準−名称一”５Ｍ ８Ｆ （ｘｌ）配列記載：配列同定番号；１３；Ｃ入τＧＧＡＧＧＡＧ　入へＧＡＴＧ 入＾ＧＯＣＧ八へＧＧ入ＡＧλ　ＧλλＧ入τＧ入＾Ｇ　ＧＣＧτＧ八τ八Ｇへ 　へ丁ＡＣＣＧ　５５（２）配列同定番号：１４に関する情報：（ｊ）配列特性 ： （Ａ）長さ；５５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｉｌｌニ一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （＋１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／ｆｆｌ：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置・ｌ　、、５５ （Ｄ）他の情報：／生Ｆｉ物−“合成オリゴヌクレオチド″゛／ｆｆ準　名称− ＝ｓＭ　８０” （Ｘυ配列記ＩＩｉ、：配列同定番号、１４：入へ丁τｃｃ、：、ｒＡｃ　ｃτ 入τこλＣＧ、：Ｃ７丁ＣＡ？Ｃ？ＴＣＴ　Ｃ？ＴＣＣＡＴＣＧＣＣＴ丁ＣＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＴＣ５５（２）配列同定番号：１５に関する情報：（ｉ）配列特 性： （Ａ）長さ＝２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎮ニ一本 （Ｄ）トポロジー；線状 （ｉｉ）分子を：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／値：ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：　ｌ　、、２１ （Ｄ）他の情報：／生成物−゛合成オリゴヌクレオチド″／標準−名称−″’Ｓ Ｍ　８４” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：１５：Ｇ入τＧＧへＧＧλＧ　入ＡＧλＴＧ 入λＧＧ　Ｃ２１（２）配列同定番号：１６に関する情報：（１）配列特性 （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型・核酸 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置１．．２１ （Ｄ）他の情＠：／生成物−゛′合成オリゴヌクレオチド”／標準−名称讃”５ Ｍ８５” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝１６＝Ａτｃｃｃｃ丁丁Ｃ入　丁ＣＴＴＣＴ ＣＣＴＣＣ２１（２）配列同定番号：１７に関する情報：（ｉ）配列特性； （Ａ）長さ＝２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名称／　ｍ：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴ＣＢ）位置１．．２＋ （Ｄ）他の情報：／生成物−゛″合成オリゴヌクレオチドパ／標準−名称−”５ Ｍ８２” （×１）配列記＊：配列同定番号、１７：Ｇλ丁ＧＧ入ＧＧＡＧ　入λＧＣＴＧ λＡＧＧ　Ｃ２１（２）配列同定番号；１８に関するｔｉＩｉ−報（１）配列特 性： （Ａ）長さ２２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴； （Ａ）名称／鍵：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：１．．２１ （Ｄ）他の情報：／生成物−゛°合成オリゴヌクレオチド゛／標準−名称−”５ Ｍ８３” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：１８：λτＣＧＣＣＴτＣ入　ＧＣττＣτ ＣＣＴＣＣ２１（２）配列同定番号：１９に関する情Ｉｌ：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ４２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ＩＸ）特徴。 （Ａ）名称／　ｆｓ：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置＋１．．２＋ ＣＤ）他の情報二／生成物−゛′合成オリゴヌクレオチド゛／１ｉｉｊｉ準−名 称−”５Ｍ８６” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：１９：　゛。ＴＧＧＡＧＧＡＧや。。ア。い 。１□　′１（２）配列同定番号；２０に関する情報二（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ２２１個の塩基対 （Ｂ）型：核は （目）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （１χ）特徴・ （Ａ）名称／鍵：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴ＣＢ）位置：１．２１ （Ｄ）他の惰Ｆｌ／生成物−゛合成オリゴヌクレオチド″／漂鵡−名称−”５Ｍ ８７” （Ｘｌ）配列記載、配列同定番号−２０゜（２）配列同定番号、２１に関する情 報・（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ、２１個の塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：ｍｉ　ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：　ｌ　、、２１ （Ｄ）他の情報：／生成物−′合成オリゴヌクレオチド゛′／標準−名称−”５ Ｍ８Ｂ” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：２１：Ｇ入τＧＧλＧＧλＧ　ＡＡＧＣＴＧ 入入ＧＴ　Ｇ　２１（２）配列同定番号：２２に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ２２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖・一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （Ｂ）　位１ｉ！　二　１．．２１ （Ｄ）他の情報−／生成物−゛′合成オリゴヌクレオチド゛′／標準−名称＝” ５Ｍ８９” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：２２：入子ＣＣｋＣＴＴＣλ　ＧＣＴＴＣＴ ＣＣＴＣＣ２１（２）配列同定番号＝２３に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位１１：１．．２１ ＣＤ）他の情報：／生成物−″゛合成オリゴヌクレオチド゛。 ／漂準−名称−″’５Ｍ９０” （ｘｉ）配列記載、配列同定番号二２３゜ＧＡτＣ；ＧＡにＧＡＧ　入ＡＧＡＴ ＧλλＧＡ　入　２１（２）配列同定番号：２４に関する情報：（ｉ）配列特性 ： （Ａ）長さ・２１個の塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖・一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴； （Ｂ）位置：１．．２１ （Ｄ）他の情報：／生成物−′″合成オリゴヌクレオチド−／標準−名称一”５ Ｍ９１” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：２４：入ＴＣ了τＣＴＴＣ入　ＴＣＴＴＣτ ＣＣＴＣＣ２１（２）配列同定番号：２５に関する情ｌａ：（ｉ）配列特性。 （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖・一本 （Ｄ）トポロジー−線状 （１１）分子型：ＤＮ八（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位ｔ：１．．２１ （Ｄ）他の情報・／生成物−″゛合成オリゴヌクレオチド゛′／標準−名称−” ５Ｍ９２” （χＩ）配列記載・配列同定番号・２５゜ＧＡＴＧＧλＧＧ；ＩＧ　入ＡＧＡＴ ＧλＡＧτ　Ｇ　２１（２）配列同定番号：２６に関する情報：（ｉ）配列特性 ： （Ａ）長さ＝２１個の塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （Ｂ）位置１．．２１ （Ｄ）他の情報：／生成物−゛′合成オリゴヌクレオチド゛′／漂準−名称−” ５Ｍ９３” （ｘｌ）配列記載：配列同定番号：２６：（２）配列同定番号、２７に関する情 報：（１）配列特性・ （Ａ）長さ、８４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （１１）分子型　ＤＮＡ　（ゲノム） （Ｉχ）特徴・ （Ａ）名称／ｇ１：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：１．．８４ （Ｄ）他の情報：／生成物−゛合成オリゴヌクレオチド″／標準−名称−”５Ｍ ９８” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：２７：（２）配列同定番号：２８に関する情 報：（１）配列特性。 （Ａ）長さ：８４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （目）分子型・ＤＮＡ　（ゲノム） （１χ）特徴： （Ａ）名称／鍵：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置：１．．８４ （Ｄ）他の情報：／生成物＝゛合成オリゴヌクレオチド″゛／標準−名称−”５ Ｍ９９” （Ｘｌ）配列記載：配列同定番号、２８：（２）配列同定番号：２９に関する情 ・報：（１）配列特性： （Ａ）長さ＝８４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （１ｘ）特徴： （Ａ）名称／ｉｉ：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置−１、，８４ ＣＤ）他の情報・／生成物−′合成オリゴヌクレオチドパ／標準−名称網”５Ｍ １００” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：２９：（２）配列同定番号・３０に関する情 Ｉａ＝（ｉ）配列特性− （Ａ）長さ：８４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｉｌｌニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （目）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置：１．．８４ （Ｄ）他の情報：／生成物−“合成オリゴヌクレオチド゛′／標準−名称網”５ Ｍｌ０１” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号；３０：＾丁ＣＣＡＴｆＴＡＡ　ＧＣＴＴＴＴ ＣＣ？ＣＣＴＭＴＴＴＴＴＧ　ｋＧＴｔＴｃＴｃｃＴ　ＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴ　 ＣｋＧＣＴＴＴＴＣＴ@Ｃ０ τＣＣ３１テ（：？？Ｃτ　テλ入ＧＣＴＴ丁τＣＣτｃｃ　”（２）配列同定 番号：３１に関する一情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３０個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （１１）分子型：蛋白質 （ｉｘ）特徴： （八）名称／鍵：蛋白質 （Ｂ）位置：１．．３０ （Ｄ）他の情報、／標識−名称 ／注−″’Ｃ３Ｐ２” （ｘｌ）配列記載：配列同定番号：３１：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　τ：ＴＩ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｍｅ：　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅ＋： 　１ａｙｓ　Ｌｙｓ　kＹ３ （２）配列同定番号：３２に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ；１６０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）原株源； （Ｂ）菌株二大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞を：ＤＨ５アル７７ （ｖｉｉ）即時型Ｗ、： （Ａ）名称／鍵−ＣＤＳ （Ｂ）位置１．、Ｉ５］ （Ｄ）他の情報　／機能−゛台成貯蔵蛋白質パ／生成物＝゛蛋白質゛ ／遺伝子−”ｓｓｐ” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝３２；（２）配列同定番号・３３に関する情 報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝４９個のアミノ酸 （ｉｉ）分子型；蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：３３：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｉｕ　Ｌｙ３　Ｍ ａｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｈａｔ　Ｇｉｕ　（ｊｉｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 Ｊｕａ　ｓｅｔ　Ｇ上O ”　Ｓ　１０　１５ Ｇｉｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　入１ａＨれ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｃ ｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｌ−１ｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ２０　ス５　３０ ＬｅｕＬｙｓλｌａＭｅｔＧｌｕＧｉｕＬｙｓＬ、ｅｕＬｙｓＡｌａＭｅｔＧｌ °Ｇ１°ＬｙｓＭｅｔＬｙｓ人工ａ （２）配列同定番号・３４に関する情＠：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ２１６０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）！ｌｌＩ：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）原株ｇＡ： （Ｂ）菌株：大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型：ＤＨ５アルファ （ｖｉｉ）即時型ＩＷ！： （Ｂ）クローン二０２０ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：ＣＤ５ （Ｂ）位１１ｉ：　２．、ｌ　５１ （Ｄ）他の情報：／機能−゛合成貯蔵蛋白質゛／生成物−゛蛋白質゛ ／遺伝子−ＩＩ　５Ｓｐ＝＝ ／標準−名称−′５．７．７．７．７．７．５”（ｘｌ）配列記載・配列同定番 号・３４（２）配列同定番号＝３５に関する情報：（ｉ）配列特性： ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｄ）トボロジ−二線状 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号＝３５：Ｈｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍ ｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｉａ　青ｓ＋：　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｃｕ　Ｌｙｓ　 入１ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌ■ ｌ　Ｓ　１０　１５ ＧＬｕＬｙｓＬｅｕＬｙｓＡｌａＨ＠５ＧｉｕＧｉｕＬｙｓＬ＠ｕＬｙｓ＾工ａ ＭｅｔＧｌｕＧｌｕＬｙｓＬｅｕＬｙｓ人１ａＨｅｔＧ工ｕＧＬｕＬｙｓＬｅｕ Ｌｙｓ＾１ａｓｅｔＧｌｕＧｌｕＬｙａＨａｔＬｙｓ（２）配列同定番号：３６ に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝１３９個の塩基対 （Ｂ）型・核酸　２ （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子型：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｖｌ）原株源： （Ｂ）菌株二大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型：ＤＨ５アルファ （ｖｉｉ）即時型源： （Ｂ）クローン二〇３゜ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵・ＣＤ５ （Ｂ）位置＋２．．１３０ （Ｄ）他の情報：／機能−゛″合成貯蔵蛋白質゛′／生成物−″゛蛋白質パ ／遺伝子−”ｓｓｐ” ／標準−名称一”５．７．７．７．７．５”（×１）配列記載：配列同定番号、 ３６・（２）配列同定番号＝３７に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝４２個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：３７：Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　入 １ａ　Ｈｅｃ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｍｅｔ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＬａｕＬｙ５ＡｌａＭｅｔＧｌｕＧｌｕＬＹ３）ｌｅｔＬ Ｙ３人ユａ（２）配列同定番号＝３８に関する情報：（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ一９７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）Ｍ：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （目）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）原株源・ （Ｂ）菌株二大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型＋ＤＨ５アルファ （Ｖ口）即時型源： （Ｂ）クローン・Ｄ１６ （ｉｘ）特徴； （Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：２．．８Ｂ （Ｄ）他の情報：／機能−″合成貯蔵蛋白質”／生成物−゛蛋白質” ／遺伝子−゛″ｓｓｐ’″ ／ｉｊｉ準−名称−″’５．５．５．５”（ｘｉ）配列記載：配列同定番号：３ ８：（２）配列同定番号：３９に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ１２８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型　蛋白質 （ｘｌ）配列記載・配列同定番号、３９（２）配列同定番号：４０に関する情゛ 報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）原株ｇＡ： （Ｂ）菌株：大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型・Ｄ）１５アルフア （Ｖ口）即時型源： （Ｂ）クローン：Ｄ２０ （１ｘ）特！＝ （Ａ）名称／＠：ＣＤ５ （Ｂ）位ｉｔ：２．．１０９ （Ｄ）他の情報、／機能−″′合成貯蔵蛋白質゛。 ／生成物−′蛋白質゛′ ／遺伝子−″’ｓｓｐ” ／標準　名称−”　５　、５　、５　、５　、５　”（ｘｉ）配列記載：配列同 定番号＝４０：（２）配列同定番号：４１に関する情報：（ｉ）配列特性― （Ａ）長さ：３５個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、線状 （ロ）分子型・蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号：４１：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙ５　Ｈ ｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｍｅ＋：　Ｇｉｕ　Ｇｌｕ　ＩＹ３　Ｈｅｔ　ＬＹＩ　 Ａｌａ　ｓｅｔ　Ｇｌ■ Ｉ　Ｓ　１０　１５ Ｇｌｕ　ＬＹ５　）ｌｅｔ　Ｌｙｓ　八ｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙ５ 　Ｎｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｈｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙ■ とｅｔＬｙコλｉａ （２）配列同定番号、４２に関する情報（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝９７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 、（Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）原株源】 （Ｂ）菌株二大腸菌（１：、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞Ｗ：Ｄ）（５アルフア （ｖｉｉ）即時型源： （Ｂ）クローン】Ｄ３３ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／＠ｌ：ＣＤ５ （、Ｂ）位置：２．．８８ ＣＤ）他の情報：／機能−゛合成貯蔵蛋白質゛′／生成物−゛蛋白質″ ／遺伝子−”ｓｓｐ” ／漂準−名称一”　５　、５　、５　、５　”（ｘｉ）配列記載：配列同定番号 ＝４２：ｃｃ　９７ （２）配列同定番号：４３に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ２２８個の・アミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝４３：Ｍ＠ｔ　Ｇｌｕ　Ｇｉｕ　Ｌ、Ｙ３　 Ｆ、ｅｃ　Ｌｖｓ　λｌａ　ｓｅｔ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ｌ％ｆ５　ｓｅｔ　１− ％Ｉ３　人１ａ　Ｍｅ煤@Ｇｌｕ ｌ　Ｓ　１０　１５ Ｇｉｕ　Ｌｙｓ　Ｉｎｃ　Ｌｙｓ　Ｕａ　Ｍｅｔ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　！、ｙｓ　 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ＾１ｍ（２）配列同定番号＝４４に関する情報。 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝１６０個の塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）ｗＡ：二本 （Ｄ）トポロジー−線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）遼株源二 （Ｂ）１１株、大腸＋１（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型＋ＤＩ（５アルフア （ｖｉｉ）即吟型源： （Ｂ）クローン：８２−４ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５ （Ｂ）位［：２．、ｌ　５１ ＣＤ）他の情報、／＊能四″゛合成貯蔵蛋白質゛／生成物−゛蛋白質゛′ ／遺伝子−”　ｓ　ｓ　ｐ〜 ／標準−名称一”　？　、７．７．７．７．７．５″（ｘｉ）配列記載：配列同 定番号：４４：（２）配列同定番号：４５に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４９側のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号＝４５＝Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｉｕ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｈｅ’：、Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 入１ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌ■ −１ｓ　ｘｏ　＝ｓ ＧｌｕＬｙ３１ｚｕＬｙｓ入１ａ）ｌｅｔＧｌｕＧｌｕＬｙｓＬｅｕＬｙｓλｌ ａＭａｔＧｌｕＧｌｕＬｙａｔａｕ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｈｅ＝　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ 　Ｌｙｓ（２）配列同定番号：４６に関する情報：（１）配列特性： （Δ）長さ：９７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （目）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）原株源： （Ｂ）菌株二大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞を：ＤＨ５アルファ （ｖｉｉ）即時型源： （Ｂ）クローン：８４−Ｈ３ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／＠：ＣＤ５ （Ｂ）位置：２．．８８ （Ｄ）他の情＠：／機能−パ合成貯蔵蛋白質゛′／生成物−″′蛋白質″ ／遺伝子−・・ｓｓｐ・・ ／標準−名称一”　５　、５　、５　、５　”（ｘｉ）配列記載：配列同定番号 ：４６：（２）配列同定番号、４７に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝２８個のアミノ酸 （Ｂ）型；アミノ酸 （ｐ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号；４７：Ｍａｔ　Ｇ１１ｌ　Ｇ１％ｌ　Ｌｙｓ 　Ｍａｃ　Ｌｙｓ　八Ｌｍ　）４ｅｔ　Ｇｉｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙ ｓ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　fｌｕ ｌ　５　１０　１５ （２）配列同定番号：４８に関する情報：（１）配列特性： （Ａ）長さ２９７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー、線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）　Ｋ株源。 （Ｂ）菌株、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型：ＤＨ５アルファ （ｖｉｉ）即時型源。 （Ｂ）クローン：８６−Ｈ２３ （１ｘ）特徴： Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｖｓ　Ｍｅｔ　ＬＹ５　人ｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｃｕ　Ｌｖｓ　Ｌｖｓ　Ｍｅｔ　Ｃ１ｔ{ （Ａ）名称／鍵：ＣＤ５ （Ｂ）位置：２．．８８ （Ｄ）他の情＠：／機能−“合成貯蔵蛋白質°′／生成物−“蛋白質” ／遺伝子−”　ｓ　ｓ　ｐ　” ／標準−名称−”５．８．８．５” （ｘｌ）配列記載：配列同定番号＝４８＝（２）配列同定番号＋４９に関する情 報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝２８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子聾：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：４９：（ｘｉ）配列記載：配列同定番号：５ ’Ｑ：１　５　ｉｏ　１５ Ｇｌｕ　ＬＹ５　ＬＡｕ　！−ｙ３　１−ＹＳ　Ｍｅｔ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙ ３　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａユａ（２）配列同定番号；５２に関する情報：（ｉ）配 列特性： （Ａ）長さ：１．１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー、線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲ、ツム） （ｖｉ）　ｊＫ株源： ＣＢ）Ｍ株二大腸１１（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）ｍ胞型＋Ｄ）（５フル７ｙ （Ｖ口）即時型源： （Ｂ）クローン、９Ｏ−）（８ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵−ＣＤＳ （Ｂ）位置：２．．１０９ ＣＤ）他の情報：／機能−″゛合成貯蔵蛋白質パ／生成物−′蛋白質パ ／遺伝子−”ｓｓｐ” ／標準−名称−゛″５．１０．＋　０．１０．５”（ｘｉ）配列記１２＝配列同 定番号：５２：ＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＧＣＧ　 ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　大入Ｇ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　大入Ｇ　入τＧ４も （２）配列同定番号、５３に関する情報：（ｉ）配列特性； （Ａ）長さ一３Ｓ個のアミノ酸　・ （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号；５３゜Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＬＹ５　Ｍ ｅｔ　Ｌｙｓλｌａ　Ｍｅｔ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　１４ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｅ　Ｈａｔ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１ｓ Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｎｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ（２）配列同定番号 ＝５４に関する情＠：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：９７（１の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖；二本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型−ＤＮＡ　（ゲノム） （ｖｌ）原株源： （Ｂ）８株−大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型：ＤＨ５アルファ （ｖｉｉ）即時型源： （Ｂ）クローン、９２−２ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称７＠：ＣＤ５ （Ｂ）位置−２，，８８ ＣＤ）他の情報、／機能−パ合成貯蔵蛋白質パ／生成物−″′蛋白質″ ／遺伝子−”ｓｓｐ” ／標準　名称−”５．１１．１１．５”（ｘｌ）配列記＠：配列同定番号：５４ ：（２）配列同定番号＝５５に関する情報＝（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝２８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載、配列同定番号：５５：（２）配列同定番号：５６に関する情 報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝２４３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖　二本 （Ｄ）トボロジー二線状 （、ｉ）分子！：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）厚味源： ＣＢ）菌株−大腸菌（Ｅ、　ｃ口１ｉ）ＣＣ’）細胞型：ＤＨ５アルファ （ｖｉｉ）即時製源： （Ｂ）クローン：２−９ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５ ＣＢ）位置：２．．２３５ （Ｄ）他の情報：／機能−パ合成貯蔵蛋白ｊｔ″／生成物−゛蛋白質゛′ ／遺伝子−ｕ、、ｐ＋ｒ （ｘｉ）配列記載　配列同定番号：５６・（２）配列同定番号；５７に関する情 報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さニア７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子型：！白質 Ｍｅｔ　Ｇｉｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙ３Ａｌａ　Ｈｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ入１ａ　ｓｅｅ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１ｓ Ｇｌｕ　ＬｙＳ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｓｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＬｙｓ　Ｈｅｔ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　）ｌｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　 Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　１−ｙｓ　Ｌｙｊ　Ｍ■■ （２）配列同定番号：５８に関する情報：（１）配列特性二 （Ａ）長さ：１７５個の塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖二二本 （Ｄ）トポロジー、線状 （１１）分子型　ＤＮＡ　（ゲノム） （ｖｌ）厚味源： （Ｃ）細胞型・ＤＨ５アルファ （Ｖ口）即時型源： （Ｂ）クローン　５−１ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）名称／ｆ！ａ：ＣＤ５ （Ｂ）位置：２．、ｌ７２ （Ｄ）他の情Ｍ　／櫟能−″合成貯蔵蛋白質゛／生成物−゛蛋白質゛′ ／遺伝子零″’ｓｓｐ” ／標準−名称一”５．５．５．７．７．７．７．５”（ｘｌ）配列記載：配列同 定番号：５８：（２）配列同定番号：５９に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ・５６個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列記載・配列同定番号：５９：＋４ｅｔ　ＧＬｕ　０１℃　Ｌｙｓ　 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　＾１纏　Ｍｅｔ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　ＬｙＳ　 入１ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌ■ ｌ　５　１０　１５ Ｇｌｕ　Ｌｙａ　Ｍ＠ｔ　１＋ｙｓ　Ａｌａ　Ｈａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ 　Ｌ４ｕ　Ｌｙａ　人工ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｉｕ　Ｌｙ■ ｂＣｕ　Ｌｙｓ　＾ｉｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＬｙＳ　Ｌｅｕ　Ｌｙａ　 入１ａ　１４ｃｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｙ■ （２）配列同定番号：６０に関する情報：（１）配列特性： （Ａ）長さニア個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｌχ）特徴： （Ａ）名称／鍵：蛋白質 （Ｂ）位置：１．．７ （Ｄ）他の情報：／標識−名称 ／注−″’５ｓｐ４” （χ１）配列記載：配列同定番号二〇〇二（２）配列同定番号：６１に関する情 ＠：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さニア個のアミノ酸 ＣＢ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ロ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記＊：配列同定番号：６１：（２）配列同定番号：６２に関する情 報＝（１）配列特性： （Ａ）長さニア個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ロ）分子型・蛋白質 （Ｘｌ）配列記載：配列同定番号：６２Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅ ｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ（２）配列同定番号＝６３に関する情報−（ｉ）配列特性： （ｉ】）分子型：蛋白質 （Ｘｉ）配列記載：配列同定番号：６７：（２）配列同定番号：６８に関する情 報：（１）配列特性： （Ａ）長さ２７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー・未知 （ロ）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号：６８：（２）配列同定番号：６９に関する情 ５＝（１）配列特性。 （Ａ）長さニア個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖・未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｉｉ）分子型二蛋白質 （ｘｉ）配列記載、配列同定番号：６９、Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ｌｙｓ　Ａ１ｍ（２）配列同定番号ニア０に関する情報：（ｉ）配列特性 ： （Ａ）長さニア個のアミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （１１）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号ニア０：（２）配列同定番号ニア１に関する情 ＠＝（１）配列特性： （Ａ）長さニア個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）　ｌ：ポロジー：未知 （ｉｉ）分子型、蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号ニア１：（２）配列同定番号・７２に関する情 報：（１）配列特性： （Ａ）長さニア個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （１１）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号、７２：（２）配列同定番号・７３に関する情 報・（１）配列特性− （Ａ）長さ、７個のアミノ酸 （Ｂ）塁二アミノ酸 （Ｃ）鎖、未知 （Ｄ）トポロジー　未知 （１１）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載　配列同定番号、７３゜（２）配列同定番号　７４に関する情 報＝（１）配列特性 （Ａ）長さニア個のアミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖二未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号ニア４：（２）配列同定番号＝７５に関する情 報＝（１）配列特性： （Ａ）長さ、７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （１１）分子型：蛋白質 （Ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝７５゜（２）配列同定番号＝７６に関する情 報：（１）配列特性。 （Ａ）長さ。７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖；未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｉｉ）分利１蛋白質 （ｘｉ）配列記１！：配列同定番号ニア６：Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　 Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ（２）配列同定番号＝７７に関する惰＠：（ｉ）配列特 性： （Ａ）長さ１７個のアミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）１−ポロジー：未知 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号ニア７：Ｈ＋Ｊ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍ ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ（２）配列同定番号、７８に関する情＠：（ｉ）配列特性 ： （Ａ）長さニア個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （１１）分子型：蛋白質 ’：ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝７８：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　入ｓｐ　Ｌｙｓ　 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔ：ＰＩ３ （２）配列同定番号ニア９に関する情＠：（１）配列特性： （Ａ）長さニア個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖二未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号ニア９：（２）配列同定番号二８０に関する情 ＠ｌ：（ｉ）配列特性、 （Ａ）長さ、７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （１１）分子型：蛋白質 （χＩ）配列記１ａ、：配列同定番号＝８０＝Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ（２）配列同定番号−８１に関する情報：（ｉ）配列 特性： （Ａ）長さ＝７個のアミノ酸 （Ｂ）型；アミノ酸 （Ｃ）ｉｌｌ：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子塁：蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号＝８１：（２）配列同定番号：８２に関する情 報＝（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ；７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）Ｍ：未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （１１）分子型・蛋白質 （ｘｌ）配列記載；配列同定番号・８２：（２）配列同定番号二８３に関する情 報−′（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ２２８個のアミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー−未知 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝８３：（２）配列同定番号＝８４に関する情 ＠：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１３０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ロ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）原株源： （Ｂ）菌株、大腸Ｗ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型・ＤＨ５アルファ （ｖｉｉ）即時型源： （Ｂ）クローン：部分３　［ｓｅｇ３〕（ｉｘ）特徴； （Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５ ＣＢ）位置：３．．１１６ （Ｄ）他の情報、／＠能−゛合成貯蔵蛋白質゛′／生成物−゛蛋白質“ ／遺伝子−ＩＩ　ＳＳｐ′１ ／標準−名称＝　”ＳＳＰ−ｓｅｇ３”（×１）配列記載：配列同定番号二８４ ：（２）配列同定番号・８５に関する情ＩＩＪ：（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ、３７個のアミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：８５：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｈ ＠ｔ　Ｌｙ３　Ｌｙｓ　ｔ４ｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｈａｔ　Ｌｙｓ　入 １ａ　Ｍａｔ　Ｇｌｕｌ　５　’１０　１ｓ Ａｓｐ　Ｌｙ５　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙａ　 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＨｅｔ　Ｌｙｓ　Ｖ ａ工Ｍ＠ｔ　ｔ、ｙｓ（２）配列同定番号＝８６に関する情報：（１）配列特性 ； （Ａ）長さ：２３３個の塩基対 （Ｂ）型−核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）　ＩＭＥ株源： （Ｂ）菌株・大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型・ＤＨ５アルファ （Ｖ目）即時型源： （Ｂ）クローン：部分３４　［ｓｅｇ３４］（１ｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：ＣＤ５ （Ｂ）位置：３．．２２１ （Ｄ）他の情Ｉａ：／機能−゛合成貯蔵蛋白質″／生成物−゛蛋白質゛′ ／遺伝子−・・ｓｓｐ” ／Ｓ準−名称一”　Ｓ　Ｓ　Ｐ　−ｓ　ｅ　ｇ　３４　”（ｘｌ）配列記載：配 列同定番号＝８６＝（２）配列同定番号：８７に関する情報：（１）配列特性： （Ａ）長さニア２個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝８７＝ＧｌｕＬｙｓＨｅｔＬＹＳＴｒＰＬｅ ｕＧｉｕＧｌｕＬｙｓＭｌｌｔＬＹ５１−ｙ３１４ｕＧｉｕＧｌｕＬｙ３Ｈｅｔ 　Ｌｙｓ　Ｖａｎ　Ｍｅセ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ 　ｋｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　ＬｙコＡｌａ　Ｈｅｔ　Ｇｌｕ　入 ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｈｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍ ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＳｏ　５５　ｇＧ ＧｌｕＧｌｕＬｙｓＭｅｔＬｙｓＶａ１Ｍ＠ｔＬｙｓ（２）配列同定番号　８８ に関する情報。 （１）配列特性： （Ａ）長さ、８４個の塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）Ｍニ一本 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｉｉ）分子Ｗ：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：　ｍ　ｉ　３　（−特徴（Ｂ）位置：１．．８４ （Ｄ）他の情報：／生成物−゛′合成オリゴヌクレオチド”／ｌＩＫ準−名称一 “”５Ｍ９６” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：８８；（２）配列同定番号二８９に関する情 報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ二８４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖、一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （Ｉ×）特徴： （Ａ）名称／　ｉｉ　：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位１：１．．８４ （Ｄ）他の情報・／生成物−パ合成オリゴヌクレオチド″／標準−名称ジ“ＳＭ 　９７” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：８９：ｋＴｃＧｃｃｒＴｃλ　ＴＴＴＴＣＴ ＣＣＴＣＣＡＴＣＧＣＴτＴＣ入τｃ！Ｔ丁ＴｅＣ？　Ｃ仁へｉ入Ｇｃ丁？？Ｃ 入Ｔ？ｔｒＣｒＣＣＧB 丁ＣＣＡ丁ＣＧＣＣτ　τＣ入入子？τττＣＣＴＣＣ８４（２）配列同定番号 ：９０に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ一１８７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 ＣＣ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ）原株源・ ＣＢ）ＩＩ株二人腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型：ＤＨ５アルファ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／＃！：ＣＤ５ （Ｂ）位ｆｔ：３．．１７３ （Ｄ）他の情報・／機能−″゛合成貯蔵蛋白質°゛／生成物−゛蛋白質゛ ／遺伝子−Ｉ＋、、ｐ・・ ／標準−名称−゛″５ＳＰ−３−５・・（χ１）配列記載、配列同定番号：９０ ゜（２）配列同定番号：９１に関する情報＝（１）配列特性。 （Ａ）長さ＝５６個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （目）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載・配列同定番号８９１：Ｌ＠ｕＬｙコ入１ａ）ｌｅｔＧｌｕＧ ｌｕＬｙｓＬｅｕｌ−ｙＳ人１ａＭｅｔＧｌｕＧｌｕ！、ｙａＭｅｔＬｙｓ（２ ）配列同定番号：９２！こ関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖】一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （１ｘ）特徴・ （Ａ）名称／　ｍ　：　ｍ　ｉ　Ｓ　Ｃ−特徴（Ｂ）位（ｉｃ：１．．６１ （Ｄ）他の情報；／生成物−゛合成オＩＪゴヌクレオチド″／標準−名称−”Ｓ Ｍ　Ｉ　Ｏ７” （ｘｉ）配列記１１１ｔ：配列同定番号：９２：（２）配列同定番号；９３に関 する情報：（１）配列特性： （Ａ）長さ２６１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 ＣＣ＞１１４ニ一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：ｍ１ｓｃ　特徴 （Ｂ）位置：１．．６１ （Ｄ）他の情報、／生成物−″′合成オリゴヌクレオチドパ／標準−名称−”５ Ｍ１０６” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号＝９３：（２）配列同定番号：９４に関する情 報：（ｉ）配列特性。 （Ａ）長さ７６３個の塩基対 （Ｂ）　ｆｆｉ・核酸 （Ｃ）ｕ４ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （目）分子型＋ＤＮＡ（ゲノム） （五Ｘ）特徴 （Ｂ）位１１：１．．６３ ＣＤ）　他の情報：／生成物−“合成オリゴヌクレオチド”／１ｌｌｉ準　名称 −”５Ｍｌｌ０” （ｘ’ｉ）配列記載：配列同定番号：９４゜ＧＣＴＧＧ入ＡＧｉｕ　ＡＡＧＡＴ Ｇ入λＧＧ　ＣＴ入ＴＧＧＡＧＧＡ　ＣＡ入ＧλＴＧＡＡＡ　ＴＧＧＣ？τＧ八 ＧＧ　大へ入五Ｇ＾τＧ■■@６０ ＧＡＡ　６３ （２）配列同定番号＝９５に関する情報：（ｉ）配列特性。 （Ａ）長さ７６３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴。 （Ａ）名称／！：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位５１Ｅ：］、、６３ （Ｄ）　他の情報、／生成物−゛合成オリゴヌクレオチド゛／標準−名称−”Ｓ ＭＩＩＩ” （ｘｉ）配列記＊：配列同定番号＝９５＝（２）配列同定番号：９６に関する情 報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長き：１３０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｉｌｌ二二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （目）分子型：ＤＮＡＣゲノム） （■１）原株源・ （Ｂ）菌株　大Ｉｌ！ｍ１（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型：ＤＨ５アルファ （１ｘ）特徴 （Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５ （Ｂ）位置　３４．１１６ （Ｄ）他の情報：／機能−゛合成貯蔵蛋白質′。 ／生成物−″゛蛋白質゛′ ／遺伝子−″’ｓｓｐ” ／［準−名称−”　Ｓ　Ｓ　Ｐ　−ｓ　ｅ　ｇ　４　”（Ｘυ配列記載：配列同 定番号＝９６゜（２）配列同定番号：９７に関する情報：（１）配列特性： （Ａ）長さ＝３７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列記載：配列同定番号：９７：（２）配列同定番号　９８に関する情 報：（１）配列特性− （Ａ）長さ７６２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）Ｌｌｉｌ＋一本 （Ｄ）トポロジー−線状 （貨）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／ｉｌｌ：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：１．．６２ ＣＤ）他の情報：／生成物−゛°合成オリゴヌクレオチドパ／ｌ！ｌＩ準−名称 −゛″５Ｍ１１２”（ｘｉ）配列記載：配列同定番号：９８；（２）配列同定番 号、９９に関する情報：（ｉ）配列特性； （Ａ）長さ：６２個の塩基対 （Ｂ）型−核酸 （Ｃ）鎖・一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型・ＤＮＡ　（ゲノム） （１ｘ）特徴・ （Ａ）名称／　ｅｌｌ　：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置：１．．６２ （Ｄ）他の情報：／生成物〜″合成オリゴヌクレオチド゛／標準−名称−”５Ｍ ｌｌ３” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：　９−９　：（２）配列同定番号：　１００ に関する情報。 （１）配列特性： （Ａ）長さ：１３０（ｉの塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （目）分子型：ＤＮｋＣゲ／ム） （ｖｉ）原株Ｒ： （Ｂ）菌二人大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型：ＤＨ５アルファ （１ｘ）特？ｉ＆： （Ａ）名称／ｌ・ＣＤ５ （Ｂ）位１ｔ：３．．ｌｌ６ ＣＤ）他の情報：／機能−゛合成貯蔵蛋白質・′／生成物−″゛蛋蛋白″ ／遺伝子−”ｓｓｐ” ／標準−名称−”ＳＳＰ−ｓｅｇ５” （ｘｌ）配列記載：配列同定番号：１００：（２）配列同定番号：ｌＯ１に関す る情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型、蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：１０１：ｓ＠ｔＧｌｕＧｌｕＬｙｓＭｅｔＬ ｙｓＬ１１５ｂ叱ｕＬｙｓＧｌｕＧｌｕｓｅｔλＡｌｌＬｙｓＭｅｔＬＹ！１人 ｓｐＧｌｕＭｅｔ１７＋ＬｙｓＬｅｕＬｙｓＧｌｕＧｌｕＨｅｔＬｙｓＬｙｓＬ ｅｕＧｌｕＧｌｕＬｙｓＭｅｔ　ＬＹツＶａｌ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ（２）配列同定 番号、１０２に関する情報・（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ２６３個の塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）＃Ａニ一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置：１．．６３ ＣＤ）他の情報：／生成物−パ合成オリゴヌクレオチド゛′／探準−名称−”５ Ｍ１１４” （ｘｌ）配列記載：配列同定番号：１０２：（２）配列同定番号、】０３に関す る情報：（ｉ）配列特性− （Ａ）長さ、６３個の塩基対 ＣＢ）型、核酸 （ｉｉ）分子型・ＤＮＡ　（ゲノム） （ＩＸ）特徴・ （Ａ）名称／ｍ：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：１．．６３ （Ｄ）他の情報：／生成物−”合成オリゴヌクレオチド”／標準　名称筒″’５ Ｍ１１５” （ｘｌ）配列記載：配列同定番号：１０３：（２）配列同定番号：１０４に関す る情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３４０個の塩基対 ＣＢ）型　核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー、線状 （１１）分子型：ＤＮＡＣゲノム） （ｖｌ）厚株源 （Ｂ）菌株、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）（Ｃ）細胞型：ＤＨ５アルファ （Ｖ目）即時型源・ （Ｂ）クローン二部分５３４　［ｓｅｇ５３４］（１ｘ）特徴： （Ａ）名称／＠：ＣＤ５ （Ｂ）位置：３．．３２６ （Ｄ）他の情報：／機能−゛′合成貯蔵蛋白質”／生成物−“蛋白質” ／遺伝子−”ｓｓｐ” ／標準−名称一”５ＳＰ−５３４” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：１０４：（２）配列同定番号：１ｏ５に関す る情報：（１）配列特性： （Ａ）長さ＝１０７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：１０５：ＭｅｔＧｌｕＧｌｕＬｙｓＭｅｔｌ −ｙＳＬｙｓＬ色ｕＬＹ５ＧｌｕＧ工ｕＨａｔＡユａＬｙｓＭｅｔＬｙｓＡｓｐ 　Ｇｌｕ　Ｍｅｔτｒｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｓれＬｙ ｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｒａｙｓＭｅｔ　Ｌｙｓ　ｖａｎ　Ｍｅ ｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙ５　Ｈｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌ ｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ人ｉｎ　Ｈｅｔ　Ｇｉｕ　ＡツＰ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ 　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｈｅｔ：　Ｌｙｓ　Ｌｙ ｓ　Ｌ＊■ ｓ０　５５　１１゜ Ｌｙｓ　Ｈｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　入ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　 Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＭｅｔＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＬＹ９　）！＠ｌセＬｙｓ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓユ ００　１０５ （２）配列同定番号・１０６に関する情報：（１）配列特性。 （Ａ）長さ・１６個の塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）Ｕ、一本 （Ｄ）トポロジー・線状 （ロ）分子型　ＤＮＡ　（ゲノム） （Ｂ）位置　１．．１６ （Ｄ）他の情報：／機能−”　Ｐ　ＣＲプライマー・・／生成物−′″合成オリ ゴヌクレオチド″′／漂準−名称−”　３５５ビ′ （ｘｉ）配列記載：配列同定番号二ｌ−０６：丁τＴＧＧＡＧＧＡＧ　ＧＡＣ＋ 　ＣＧ　１６（２）配列同定番号：　１０７に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ７１６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （Ｂ）位置１．、＋６ （Ｄ）他の情報・／機能−”　Ｐ　ＣＲプライマー′″／生成物−″合成オリゴ ヌクレオチドパ／標準−名称−”ＭＥＨＩ５” （ｘｉ）配列記載・配列同定番号：１０７・（２）配列同定番号＝１０８に関す る情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ＝１９個の塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　一本 （Ｄ）トボロジー二線状 （ｉｉ）分子型＝ＤＮＡ　（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置：１．．１９ ＣＤ）他の情＠　：　／Ｉ！能−”　Ｐ　ＣＢプライマー″／生成物−゛合成オ リゴヌクレオチド゛′／標準−名称−″’５Ｍ１２４” （ｘｉ）配列記載：配列同定省号：１０８：ＧＴλＣ丁ＡＣＴｋＣτＣτ八Ｃへ ＡＣＴ　１９（２）配列同定番号＝１０９に関する情報：（１）配列特性： （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子型・ＤＮＡ　（ゲノム） （１ｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵・ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置：　］　、、２１ （Ｄ）他の情報、／機能−″’ＰＣＲプライマーパ／生成物−″′合成オリゴヌ クレオチド゛′／［準−名称−”５Ｍ１２５” （ｘｉ）配列記載、配列同定番号：１０９：ＧλＧＣＴＣＴＴｈＣＡＣＣＴＡＣ ｋＴＧＣＡ　２１（２）配列同定番号：１１０に関する情報；（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２ｏ個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／鍵：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ−特徴（Ｂ）位置：１．．２０ ＣＤ）他の情Ｉａ：／機能−”ＰＣＲプ？イ”ｆ−”／生成物−′合成オリゴヌ クレオチド゛′／凛準−名称−”５Ｍ１２６” （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：ｌｌＯ：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ　１４個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ厳 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （五ｉ）分子型：蛋白質 （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／４１：蛋白質 ＣＢ）位置：１．．１４ （Ｄ）他の情報：／標識−名称 ／注−゛塩基遺伝子［（Ｓ　Ｓ　Ｐ　５）２］　”／標準−名称−′″５Ｍ１２ ５″ （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：ｌｌｌ：Ｈａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉ−ｙ３ 　Ｈａｔ　ＬｙＢ　入１ｍ　ｋ４ａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　１ａｙｓ　Ｍａｔ　Ｌ ｙｓ　λ１暑（２）配列同定番号＝１１２に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：５６個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー二未知 （１１）分子型・蛋白質 （１ｘ）特徴・ （Ａ）名称／鍵：蛋白質 （Ｂ）位置：１．．５６ （Ｄ）他の情報：／標識−名称 ／注＝″’Ｓ　Ｓ　Ｐ　−３−５（Ａ／Ｅ）”／漂準−名称一”５Ｍ１２５°゛ （ｘｉ）配列記載：配列同定番号：ｌ１２：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　八ｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 入１ａ　Ｍｅｔ　ＧｌｕＩ　Ｓ　１０　１５ Ｇλｕ　Ｌｙｓ　Ｌｃｕ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｈｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｊ　 Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａ１ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ−Ｇｌｕ　ＬｙｓＬｅｕＬｙｓλｉｎ ＭｅｔＧｌｕＧｌｕＬｙｓＬｅｕＬｙｓ入ユａＭｅｔＧｌｕＧｌｕＬｙｓＭｅｔ Ｌｙｓ（２）配列同定番号＝１１３に関する情報：（ｉ）配列特性・ （Ａ）長さ：１６個のアミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子型、蛋白質 （ＩＸ）特徴二 （Ａ）名称／鍵：蛋白質 （Ｂ）位置・１．．１６ （Ｄ）他の情報、／標識−名称 ／注＝゛ｐＳＫ３４塩基遺伝子゛′ （Ｘｌ）配列記載：配列同定番号・１１３：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ｔ４ｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　 Ｖａｌ　Ｍｅｔ　ＬｙｓＬ　Ｓ　１０　ｉｓ ＦＩＧ、２Ａ ポテンシャル静電的相互作用 ポテンシャル静電的相互作用 ＦＩＧ、４Ａ ＦＩＧ、４Ｂ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、９Ａ ＦＩＧ、１ｉ ｎｄＩＩＩ　（３９９） ｆ’　７１８１ す ＣＷ１ ８７ア ＨｌｎｄＩＩＩ　（２１０Ｂ） どコ警′：：゛ （８９Ｂ） ７１８工 補正書の写しくＵ訳文）提出書　（特許法第１８４条８）平Ｉｔ！、６年２月９ 日　鳴

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．それぞれが同一であるかまたは異なるｎ個の７種の単位（ｄｅｆｇａｂｃ） ［ここで ｎは少なくとも４であり、 ａおよびｄは独立してＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＩＩｅおよびＴｈｒからなる群 から選択され、 ｅおよびｇは独立して酸／塩基対であるＧｌｕ／Ｌｙｓ、Ｌｙｓ／Ｇｌｕ、Ａｒ ｇ／Ｇｌｕ、Ａｒｇ／Ａｓｐ、Ｌｙｓ／Ａｓｐ、Ｇｌｕ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｒ ｇおよびＡｓｐ／Ｌｙｓからなる群から選択され、 ｂ、ｃおよびｆは独立してＧｌｙまたはＰｒｏ以外のアミノ酸であり、そしてそ れぞれの７種の中のｂ、ｃおよびｆの少なくとも２個のアミノ酸はＧｌｕ、Ｌｙ ｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎおよび Ｃｙｓからなる群から選択される］を含んでなる合成ポリペプチド。
2. ２．ａおよびｄが独立してＭｅｔおよびＬｅｕからなる群から選択される、請求 の範囲第１項に記載のポリペプチド。
3. ３．ｅおよびｇが独立してＬｙｓ／ＧｌｕまたはＧｌｕ／Ｌｙｓである、請求の 範囲第１項に記載のポリペプチド。
4. ４．ｆが荷電したアミノ酸であるならｂまたはｃが逆の電荷を有するようにｂ、 ｃおよびｆが選択される、請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
5. ５．それぞれが同一であるかまたは異なるｎ個の７種の単位（ｄｅｆｇａｂｃ） ［ここで ｒは少なくとも４であり、 ａおよびｄは独立してＭｅｔおよびＬｅｕからなる群から選択され、ｅおよびｇ は独立してＧｌｕ／ＬｙｓまたはＬｙｓ／Ｇｌｕであり、そして、 ｂ、ｃおよびｆは独立してＧｌｙまたはＰｒｏ以外のアミノ酸であり、そしてそ れぞれの７種の中のｂ、ｃおよびｆの少なくとも２個のアミノ酸はＧｌｕ、Ｌｙ ｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎおよび Ｃｙｓからなる群から選択され、そしてｆが荷電したアミノ酸であるならｂまた はｃが逆の電荷を有するようにｂ、ｃおよびｆが選択される］ を含んでなる合成ポリペプチド。
6. ６．７種が ＬＥＥＫＬＫＡ（配列同定番号：６０）　ＬＫＥＥＬＫＡ（配列同定番号：６９ ）１ＥＥＸＬＫＡ（配列同定番号：６１）　ＭＫＥＥＬＫＡ（配列同定番号：７ ０）ＭＥＥＫＭＫＡ（配列同定番号：６２）　ＭＫＥＥＭＫＡ（配列同定番号： ７１）ＬＥＥＸＬＫＫ（配列同定番号：６３）　ＬＫＥＥＬＫＫ（配列同定番号 ：７２）ＭＥＥＫＬＫＫ（配列同定番号：６４）　ＭＫＥＥＬＫＫ（配列同定番 号：７３）ＭＥＥＫＭＫＫ（配列同定番号：６５）　ＭＫＥＥＭＫＫ（配列同定 番号：７４）ＬＥＥＫＬＫＷ（配列同定番号：６６）　ＬＫＥＥＬＫＷ（配列同 定番号：７５）ＭＥＥＫＬＫＷ（配列同定番号：６７）　ＭＫＥＥＬＫＷ（配列 同定番号：７６）ＭＥＥＫＭＫＷ（配列同定番号：６８）　ＭＫＥＥＭＫＷ（配 列同定番号：７７）ＭＥＤＫＭＫＷ（配列同定番号：７８）　ＬＥＥＫＭＫＶ（ 配列同定番号：８１）ＬＫＥＥＭＡＫ（配列同定番号：７９）　ＬＫＥＥＭＫＫ （配列同定番号：８０）ＭＫＤＥＭＷＫ（配列同定番号：８２）からなる群から 選択される、ｎ個の７種の合成ポリペプチド。
7. ７．配列同定番号：１、２、３、４、５、６、７および８３からなる群から選択 される、合成ポリペプチド。
8. ８．請求の範囲第１−７項のポリペプチドをコードづける、核酸フラグメント。
9. ９．適当な調節配列と操作可能式に結合されている請求の範囲第８項に記載の核 酸を含んでなる、転換された宿主細胞中で発現可能なキメラ遺伝子。
10. １０．さらに分子内局在配列と操作可能式に結合されている、請求の範囲第９項 に記載のキメラ遺伝子。
11. １１．転換された宿主細胞が植物細胞でありそして調節配列が種子中で活性でお る、請求の範囲第９項に記載のキメラ遺伝子。
12. １２．種子中で活性な調節配列がダイズクニッツトリプシンインヒビター、グリ シニン、β−コングリシニン、レクチン、ビーンレクチン、ファセオリン、トウ モロコシ１０ｋＤゼイン、２７ｋＤゼイン、１９ｋＤゼイン、グロブリン１、お よびグロブリン２からなる群から選択される、請求の範囲第１１項に記載のキメ ラ遺伝子。
13. １３．転換可能な植物宿主細胞がトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ダイズ（ｓｏｙｂ ｅａｎ）、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｉ ｓｔｒｉｓ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、イネ（ｒｉ ｃｅ）、ポテト（ｐｏｔａｔｏ）、飼料草（ｆｏｒａｇｅｇｒａｓｓｅｓ）、お よび小麦（ｗｈｅａｔ）からなる群から選択される、請求の範囲第１１項に記載 のキメラ遺伝子。
14. １４．転換された宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であり 、そして調節配列がバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７ブロモー ターシステムからである、請求の範囲第５項に記載のキメラ遺伝子。
15. １５．請求の範囲第９項に記載のキメラ遺伝子で転換された宿主細胞。
16. １６．宿主細胞が植物細胞であり、そして調節配列が種子中で活性である、請求 の範囲第１５項に記載の宿主細胞。
17. １７．宿主細胞がトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）、ブラ シカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｉｓｔｒｉｓ、Ｂ ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、イネ（ｒｉｃｅ）、ポテト （ｐｏｔａｔｏ）、飼料草（ｆｏｒａｇｅｇｒａｓｓｅｓ）、および小麦（ｗｈ ｅａｔ）からなる群から選択される、請求の範囲第１５項に記載の宿主細胞。
18. １８．宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であり、そして調 節配列がバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーターシステ ムからである、請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。
19. １９．請求の範囲第１−７項のポリペプチドを発現する植物。
20. ２０．植物がトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）、ブラシカ （Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｉｓｔｒｉｓ、Ｂ．ｏ ｌｅｒａｃｅａ）、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、イネ（ｒｉｃｅ）、ポテト（ｐ ｏｔａｔｏ）、飼料草（ｆｏｒａｇｅｇｒａｓｓｅｓ）、および小麦（ｗｈｅａ ｔ）からなる群から選択される、請求の範囲第１９項に記載の植物。
21. ２１．請求の範囲第２０項に記載の植物から得られる種子。
22. ２２．請求の範囲第１−７項のポリペプチドを発現する種子。
23. ２３．原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である、請求の範 囲第１−７項の合成ポリペプチドを発現する原核生物。
24. ２４．ａ．最終使用者の栄養条件に関する供給作物植物の不足を算定し、ｂ．段 階ａで同定されたアミノ酸不足を補正するためのポリペプチドをコードづける核 酸フラグメントを合成し、ｃ．段階ｂで合成された核酸を植物組織中での発現お よび局在用の調節配列と組み合わせ、 ｄ．植物細胞を段階ｃの生成物で転換させ、ｅ．段階ｄの転換された植物細胞か ら植物を再生させて成熟植物を得て、ｆ．段階ｅからの植物の種子をアミノ酸水 準の希望変動量にスクリーニングする ことを含んでなる、最終使用者の栄養条件に応じて植物中の必須アミノ酸の含有 量を変化させる方法。