PL168529B1

PL168529B1 - Sposób wytwarzania bialka z Theobroma cacao PL PL

Info

Publication number: PL168529B1
Application number: PL91297175A
Authority: PL
Inventors: Margaret E Spencer; Rachel Hodge
Original assignee: Mars Uk Ltd
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1991-06-07
Publication date: 1996-02-29
Also published as: HU216905B; IE74903B1; US5668007A; CA2084058A1; EP0586372A1; FI105204B; NO307834B1; BR9106558A; DE69128647T2; NO924737D0; FI925612A0; PL169138B1; HK168295A; ES2113885T3; PT97897B; DE69128647D1; GB2260327A; WO1991019800A1; ATE161884T1; FI925612A

Abstract

1. Sposób wytwarzania bialka z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragmentu, o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, ze sprzega sie kolejne aminokwasy, przez wytworzenie wiazania peptydowego. 4. Sposób wytwarzania bialka z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragmentu, o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, ze sprzega sie kolejne aminokwasy przez wytworzenie wiazania peptydowego. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białek z Theobroma cacao o masie 23 kDa i 21 kDa lub ich fragmentów.

Ziarna kakaowca (Theobroma cacao) stanowi;.; surowiec do produkcji kakao, czekolady oraz naturalnych kakaowych i czekoladowych esencji smakowo-zapachowych. Jak opisał Rohan (Processing of Raw Cocoa for the Market, FAO/UN (1963)), surowe ziarna kakaowe oddziela się od zebranych owoców kakaowca, z których zwykle usuwa się owocnię, po czym ziarna poddaje się fermentacji trwającej kilka dni, podczas której ziarna ulegają zabiciu, a z liścieni uwalnia się purpurowy barwnik. Podczas fermentacji powstają nieznane związki, które podczas wypalania dają charakterystyczny kakaowy smak i zapach. Rohan sugeruje, że w wytwarzaniu prekursora smaku i zapachu biorą udział polifenole i teobromina. Po zakończeniu fermentacji ziarna suszy się; podczas tego suszenia powstaje charakterystyczne, brązowe zabarwienie, a następnie wysuszone ziarna magazynuje się i wysyła.

Biehl i wsp., 1982 badali rozkład białka podczas beztlenowej inkubacji ziarna kakaowego i zidentyfikowali białka o masie 26 kDa i 44 kDa, które akumulowały się podczas dojrzewania ziaren i ulegały degradacji podczas kiełkowania. Biehl założył, że były to białka zapasowe i sugerował, że te białka mogą być przyczyną powstawania peptydów o specyficznym smaku i zapachu.

Biehl i wsp., 1985 twierdził, że aminokwasy i peptydy są ważne jeśli chodzi o zapach i smak.

Fritz i wsp., 1985, zidentyfikowali polipeptydy o masie 20 kDa i 28 kDa pojawiające się w cytoplazmatycznej frakcji ekstraktów ziarna kakaowego w około 100 dni po zapyleniu. Wydaje się, że białko o masie 20 kDa wykazuje aktywność acylotransferazy glicerylowej.

Pettipher i wsp., 1990 sugerował, że peptydy są istotne dla kakaowego zapachu i smaku i wskazywał na zapasowe białka o masie 48 kDa i 28 kDa.

Pomimo opisanych wyżej wątpliwości w tej dziedzinie wiedzy, dopiero obecnie zidentyfikowano białka rzeczywiście odpowiedzialne za powstawanie smaku i zapachu ziarna kakaowego. Ponadto odkryto, że wbrew przypuszczeniu Fritz’a, jakoby poziomy mRNA ziarna kakaowego są wyjątkowo niskie w porównaniu z innymi roślinami (cytat), możliwe jest stosowanie technik rekombinacji DNA do wytwarzania takich białek.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragmentu, o co najmniej 20 aminokwasach, polegający na tym, że sprzęga się

168 529 kolejne aminokwasy przez wytworzenie wiązaniapeptydowego. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się co najmniej część sekwencji przedstawionej na fig. 2 ponadto korzystnie wytwarza się białko rekombinowane lub jego fragment.

Białko o masie 23 kDa można przetwarzać in vivo, tworząc polipeptyd o masie 21 kDa, dlatego więc drugim przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach i polegający podobnie jak w wyżej opisanym sposobie na tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy przez wytwarzanie wiązania peptydowego korzystnie stosując co najmniej część sekwencji przedstawionej na fig. 2 oraz korzystnie wytwarza się białko rekombinowane lub jego fragment.

Używane tu określenie fragment, stosowane do białek lub peptydów dotyczy fragmentu, w którym występuje wystarczająca liczba reszt aminokwasowych, aby fragment taki był użyteczny. Zwykle w takim fragmencie może występować co najmniej cztery, pięć, sześć lub nawet co najmniej 10 lub 20 aminokwasów. Użyteczne fragmenty to te, które są takie same, podobne, albo równoważne fragmentom wytwarzanym naturalnie w etapie fermentacji podczas obróbki ziarna kakaowego. Uważa się, że takie fragmenty biorą udział w reakcjach Maillard'a podczas wypalania, w których powstaje co najmniej kilka ze składników· smakowo-zapachowych kakao.

Białka wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być białkami syntetycznymi, możnaje syntetyzować chemicznie, lub korzystnie, stosując techniki rekombinacji DNA. Białka tak wytworzone można zatem nazwać rekombinowanymi białkami. Białka rekombinowane mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane: nieglikozylowane białka będą wynikiem ekspresji w układach prokariotycznych.

Theobroma cacao występuje w dwóch podstawowych podgatunkach, Th. cacao i Th. cacao spaerocairpum. O ile białka otrzymywane sposobem według wynalazku mogą pochodzić z tych podgatunków, to wynalazek nie ogranicza się jedynie do wymienionych podgatunków. Na przykład, różne odmiany kakaowca są hybrydami różnych gatunków, przykładem takiej hybrydy jest odmiana trinitario. Białka wytworzone sposobem według wynalazku kodowane są przez kwas nukleinowy, zwłaszcza DNA kodujące wyżej wymienione białka (albo pierwotne produkty translacji, lub procesowane białka lub fragmenty), a mianowicie:

- kwas nukleinowy kodujący białko Th. cacao o masie 23 kDa, lub jego fragment oraz

- kwas nukleinowy kodujący białko Th. cacao o masie 21 kDa, lub jego fragment.

Kwas nukleinowy stanowi na ogół rekombinowany kwas nukleinowy, lecz także wyizolowany kwas nukleinowy. Często, kwas nukleinowy jest wstawiany do wektora (ekspresyjnego łub innego), takiego jak plazmid. Odpowiednie wektory ekspresyjne zawierają odpowiedni promotor, dobrany w zależności od przewidzianego gospodarza ekspresyjnego. Odpowiednim promotorem dla drożdży jest promotor kinazy pirogronianowej (PK), zaś dla bakterii - silny promotor lambda.

Produkt ekspresji może ulegać sekrecji lub nie. Preferuje się produkt ekspresji ulegający sekrecj i, zwłaszcza w eukariotycznych układach ekspresyjnych; w takim przypadku obecna jest odpowiednia sekwencja sygnałowa. Sekwencje sygnałowe pochodzące od gospodarza ekspresyjnego (takie jak z drożdżowego czynnika alfa w przypadku drożdży) mogą okazać się dogodniejsze niż natywne sekwencje sygnałowe kakao. Stwierdzono, że manipulacje genetyczne są korzystniejsze w prokariotach jakkolwiek ekspresja korzystniejsza jest w gospodarzach dopuszczonych do spożycia. Szczególnie preferuje się drożdże Saccharomyces cerevisiae.

cDNA może znaleźć zastosowanie nie tylko do uzyskiwania ekspresji białka, ale także w badaniach polimorfizmu długości fragmentów restIr'kcyjnych (RFLP). Do takich badań wytwarza się cDNA znakowany tak, aby możliwe było jego wykrywanie (na przykład znakowany radiologicznie). W takim przypadku preparuje się DNA roślin uprawnych do analizy i trawi się go za pomocą enzymów restrykcyjnych. W celu odkrycia genetycznych korelacji pomiędzy roślinami uprawnymi stosuje się technikę blottingu Southern ze znakowanym cDNa. Można wówczas wnioskować odnośnie korelacji fenotypowych.

Wynalazek zostanie zilustrowany poniższymi przykładami, które nie ograniczają jego zakresu. Przykłady odnoszą się do załączonych rysunków, na których:

Figura 1 przedstawia mapę klonu cDNA o pełnej długości, hybrydyzującego z sondą oligonukleotydową dla białka o masie 21 kDa, wraz z regionami zsekwencjonowanego DNA;

168 529

Figura 2 przedstawia sekwencję cDNA kodującą białko o masie 21 kDa i przewidywaną sekwencję aminokwasow-ą kodowanego prekursora o masie 23 kDa.

Figura 3 przedstawia porównanie pomiędzy białkiem o masie 21 kDa a inhibitorami trypsyny z innych roślin;

Figura 4 przedstawia mapę plazmidu pJLA502;

Figura 5 przedstawia dwa drożdżowe wektory ekspresyjne stosowane w niniejszym wynalazku, wektor A jest przeznaczony do uzyskiwania ekspresji wewnętrznej, a wektor B - do uzyskiwania ekspresji wraz z sekrecją.

Figura 6a przedstawia, w odniesieniu do wektora A, część genu drożdżowej kinazy pirogronianowej, wskazując miejsce do klonowania w wektorze A oraz zastosowanie łączników Hin-Nco do składania genu dla 21 kDa;

Figura 6b przedstawia, w odniesieniu do wektoraB, część sekwencji sygnałowej drożdżowego czynnika a, wskazując miejsce do klonowania w wektorze B oraz zastosowanie łączników Hin-Nco do wytwarzania fuzji w fazie odczytu; oraz

Figura 7 przedstawia mapę plazmidów pMY9 i pMY10, o których mowa w przykładzie

XVI.

Przykład I. Identyfikacja najważniejszych białek ziarna.

W praktyce nie stosuje się bezpośredniego ekstrahowania białek z ziaren kakao z powodu wysokiej zawartości tłuszczów i polifenoli, dlatego też białka ekstrahowano z proszków acetonowych wytworzonych jak następuje: Dojrzałe ziarna kakaowca z Afryki Zachodniej (Theobroma cacao amelonada) zliofilizowano i wstępnie rozdrobniono w moździerzu za pomocą tłuczka. Lipidy wyekstrahowano metodą ekstrakcji Soxhlet’a eterem dwuetylowym w dwóch czterogodzinnych ekstrakcjach, ziarno suszono i dalej rozdrabniano między ekstrakcjami. Następnie usunięto polifenole i barwniki na drodze kilku ekstrakcji 80% acetonem, 0,1% kwasem tioglikolowym. Masę poekstrakcyjną wysuszono pod próżnią i rozdrobniono na miałki proszek.

Wszystkie białka rozpuszczono przez wymieszanie proszku z buforem ekstrakcyjnym (0,05 M fosforan sodowy, pH 7,2; 0,01 M 2-merkaptoetanol; 1% SDS) w ręcznym homogenizatorze, 5 mg/ml. Zawiesinę ogrzewano w ciągu 5 minut w temperaturze 95°C i odwirowano w temperaturze 18 K w ciągu 20 minut, usuwając w ten sposób substancje nierozpuszczalne. Tak otrzymany klarowny supematant zawiera! około 1 mg/ml całego białka. W wyniku elektroforezy 25 μ! na żelu SDS-PAGE (Laemmli, 1970) otrzymano 3 główne pasma, z których jedno odpowiadało masie 21 kDa 'i zawierało około 30% wszystkich białek. Przypuszcza się, że białko o masie 21 kDa· stanowi podjednośtkę polipeptydową głównego białka zapasowego.

Właściwości polipeptydu zapasowego.

Rozpuszczalność polipeptydu o masie 21 kDa określono wstępnie, wykonując jedno lub dwa szybkie doświadczenia. Dializa roztworu polipeptydu wobec buforu ekstrakcyjnego pozbawionego SDS wykazała nierozpuszczalność pewnych polipeptydów, co oceniono na podstawie ich zdolności do przechodzenia przez 0,22-mikronową błonę, podczas gdy polipeptyd o masie 21 kDa pozostał rozpuszczony. Z proszku acetonowego wyekstrahowano za pomocą wody i rozcieńczonych buforów jedynie polipeptyd o masie 21 kDa, co wskazuje na to, że białko to można zaklasyfikować jako albuminę.

Oczyszczanie głównego polipeptydu.

Polipeptydy o masie 21 kDa oczyszczono w dwóch etapach chromatografii żelowej na kolumnie Superose-12 do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) firmy Pharmacia, lub przez elektroeluowanie pasm otrzymanych w wyniku preparatywnej elektroforezy (Słowa; Superose i Pharmacia są znakami towarowymi). Z 50 mg proszku acetonowego na 1 ml buforu ekstrakcyjnego przygotowano zatężone ekstrakty białkowe, i 1-2 ml ekstraktów naniesionych na żele SDS-PAGE o grubości 2 mm. Po przeprowadzeniu elektroforezy, powierzchnię żelu zabarwiono za pomocą wodnego błękitu Coomassie Blue, i wycięto skalpelem główne pasma. Kawałki żelu poddano 24-godzinnej elektroelucji w torebkach do dializy, w przepływającym buforze do elektroforezy, pod napięciem 15 V, a dializat poddano dalszej dializie wobec 0,1% SDS. Próbki można było zatężyć przez liofilizację.

168 529

Przykład II. Dane odnośnie sekwencji aminokwasowej białka.

Próbki białka (około 10 μg) poddano znanemu sekwencćonowaniu N-końcowych aminokwasów. Dla białka o masie 21 kDa otrzymano sekwencję 12 aminokwasów, i na podstawie tych danych skonstruowano sondę oligonukleotydową (Woods i wsp., 1982; Woods, 1984).

Przykład EL Wytwarzanie przeciwciał przeciwko polipeptydowi o masie 21 kDa.

Wytworzono przeciwciałapoliklonalne przy zastosowaniu metody Catfy’ego i Raykundalia’i (1988). Surowicę podzielono na próbki o objętości 1 ml i przechowywano w temperaturze -20°C.

Określenie właściwości przeciwciał przeciwko polipeptydowi o masie 21 kDa.

Surowicę natychmiast zbadano przy zastosowaniu techniki podwójnej dyfuzji Ochterloney’ego. Antygeny i przeciwciała dyfundują w kierunku do siebie od ścianek wyciętych w żelu agarozowym w buforze sól fizjologiczna - boran. Linie precypitacyjne powstają w miejscach, w których przeciwciało rozpoznaje antygen. Ten test uwidocznił, że wytworzono przeciwciała przeciwko antygenowi jakim było białko o masie 21 ' kDa.

Frakcję gamma-globulinową surowicy oczyszczono częściowo przez wytrącenie 50% siarczanem amonowym, rozpuszczenie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), i chromatograficznie na kolumnie do bibułowej chromatografii jonow ymiennej DE 52, jak opisał Hill, 1984. Frakcje zawierające gamma-globulinę obserwowano przy 280 nm (OD280 wynosząca

1,4 odpowiada 1 mg/ml gamma globuliny) i przechowywano w temperaturze -20°C.

Skuteczne miano przeciwciał zmierzono przy zastosowaniu techniki wykrywania reakcji antygen-przeciwciało przy użyciu przeciwciał związanych z enzymem (ELISA). Studzienki polistyrenowej płytki do mikrooznaczeń pokryto antygenem (10 -1000 ng) i odstawiono na noc w' temperaturze 4°C pokryte buforem węglanowym. Studzienki przemyto za pomocą PBS-Tween i dodano badaną gamma globulinę w stężeniach: 10,1 i 0,1 μ g/ml (rozcieńczenia w przybliżeniu: 1 : 100,1 : 1000 i 1 : 10000). Jako rozcieńczalnik zastosowano PBS-Tween zawierający 2% poliwinylopirolidon (PVP) i 0,2% BSA. W charakterze próbek kontrolnych zastosowano przedtem immunizowaną surowicę tego samego zwierzęcia. Wiązanie zachodziło w temperaturze 37°C w ciągu 3-4 godzin. Studzienki przemyto jak wyżej i dodano drugie przeciwciało (kozia przeciwkrólicza IgG związana z zasadową fosfatazą) w stężeniu 1 (tg/ml, stosując te same warunki, jak w przypadku pierwszego przeciwciała. Studzienki znowu przemyto i dodano substratu zasadowej fosfatazy (p-nitrofenylofosforan, 0,6 mg/ml, w buforze dwuietanol-amma, pH 9,8). W ciągu 30 minut powstawało żółte zabarwienie wskazujące na reakcję dodatnią, po czym reakcję zakończono za pomocą 3 M NaOH. Zabarwienie określono ilościowo przy 405 nm. Więcej szczegółów odnośnie tej metody ujawnia Hill, 1984. Zastosowanie tej metody potwierdziło, że wszystkie przeciwciała mają wysokie miano i że mogą być stosowane w stężeniu 1 |g/ml.

Przykład IV. Izolowanie całego RNA z niedojrzałych ziaren kakowca.

Materiał wyjściowy dla RNA, zawierający dużą ilość mRNA białek zapasowych stanowiły niedojrzałe ziarna kakaowca, w wieku około 130 dni po zapyleniu. ' Wcześniejsza praca sugerowała, że synteza białek zapasowych w tym okresie osiąga swój szczyt (B iehl i wsp., 1982). Ziarna w tym wieku są lekko pofałdowane i bladoróżowo-purpurowe.

Wstępnym warunkiem, jaki musiał spełniać cały preparat RNA z ziaren kakaowca było to, aby: po pierwsze nie zawierał on zanieczyszczeń, co oceniono za pomocą widma UV, zwłaszcza w dalekim UV, gdzie czysty RNA można rozpoznać z dużą dokładnością dzięki głębokiemu skokowi przy 230 nm (stosunek 260 nm : 230 nm wynosi w przybliżeniu 2,0), po drugie, aby był on nieuszkodzony, co oceniono metodą elektroforezy próbek zdenaturowanych termicznie w żelu agarozowym, w wyniku której powinny powstać czyste pasma rRNA. Przy wytwarzaniu nieuszkodzonego RNA niezbędne jest zachowanie absolutnej czystości oraz rygorystycznych środków ostrożności przeciwko RNA-azom, które są powszechnie występującymi i bardzo trwałymi enzymami. Szkło laboratoryjne na ogół wypraża się w wysokich temperaturach, a roztwory i aparaturę poddaje się działaniu inhibitora RNA-azy w postaci eteru dwuetylowego kwasu pirowęglowego (DEPC, 0,1%) przed obróbką w autoklawie.

Zwykle, ekstrakcji roślinnego (i zwierzęcego) RNA dokonuje się przez ekstrahowanie białek za pomocą fenolu/chloroformu w obecności SDS, prowadzące do zniszczenia komple6

168 529 ksów białko-kwas nukleinowy i do hamowania enzymów RNA-az, które występująpowszechnie w materiale roślinnym. Po ekstrakcji fenolem, RNA poddaje się obróbce w gradiencie chlorku cezowego, przed lub po precypitacji etanolem. Tym sposobem wytworzono bardziej lub mniej nieuszkodzony RNA, jednakże był on bardzo zanieczyszczony ciemno-brązowym zabarwieniem prawdopodobnie utlenionymi polifenolami i taninami, które zawsze pozostawały razem z RNA. Wysokie zawartości polifenoli stanowią najważniejszy problem w przypadku tkanek Theobroma.

Z tego powodu zastosowano metodę, w której unika się używania fenolu, a mianowicie metodę Halla i wsp. (1978), która polega na rozbijaniu tkanki w gorącym buforze SDS-boranowym, trawieniu białek proteinazą.K i wybiórczej precypitacji RNA za pomocą LiCl. Sposób ten zapewniał uzyskanie wysokich wydajności stosunkowo czystego, nieuszkodzonego RNA. Ponieważ jednak zanieczyszczenia w dalszym ciągu stanowiły problem, sposób zmodyfikowano przez zastosowanie powtarzających się etapów wytrącania w LiCl, przy czym po każdym etapie osad rozpuszczono w wodzie i klarowano przy użyciu mikrowirówki. W wyniku takiego postępowania otrzymano preparaty RNA o idealnych widmach, które sprawdzały się dobrze w dalszych testach na ich działanie, takich jak translacja in vitro.

Preparowanie mRNA z całego RNA.

Frakcję mRNA oddzielono od całego RNA na drodze chromatografii powinowactwa na małej (1 ml) kolumnie oligo-dT, przy czym mRNA wiązał się z kolumną poprzez swój koniec poli A, RNA (1-2 mg) zdenaturowano przez ogrzewanie w temperaturze 65°C i naniesiono na kolumnę w buforze o wysokiej zawartości soli. Poli A+ eluował wraz z buforem o niskiej zawartości soli i zebrano go przez precypitację etanolem. Sposób ten zasadniczo jest taki, jak opisali Aviv i Leder (1972), a zmodyfikowali Maniatis i wsp. (1982). Z 1 mg całego rNa otrzymano około 10 -20 fig poli A+ RnA (1 - 2%).

Translacja mRNA in vitro.

Dobrym wskaźnikiem czystości i braku uszkodzeń mRNA jest jego zdolność do translacji in vitro. Przy użyciu kolumny oligo-dT dokonuje się selekcji jedynie kwasów mRNA z nieuszkodzonym końcem poli A (koniec 3’), natomiast zdolność wydajnej translacji mają tylko kwasy mRNA posiadające także nieuszkodzony koniec 5’ (początek translacji). Translację in vitro przeprowadzono przy użyciu lizatu z kiełków pszennych, pozbawionego RNA (Amersham International), a syntezę nowo powstającego białka kontrolowano przez włączanie metioniny znakowanej S ³⁵ (Roberts i Paterson, 1973). Początkowo szybkość syntetyzowania nowo-powstającego białka mierzono przez włączanie metioniny^⁵ do substancji, którą można wytrącić za pomocą TCA, zatrzymywanej na sączkach z włókien szklanych (GFc, Whatman). Rzeczywiste produkty translacji badano metodą elektroforezy w żelu SDS-PAGE, żel nasycono fluorem, suszono i badano autoradiograficznie. Preparaty mRNA były zdolne do wydajnej translacji, a uzyskane produkty translacji obejmowały szeroki zakres mas cząsteczkowych, co wskazywało na to, że otrzymano nieuszkodzone kwasy mRNA nawet dla największych białek. Żaden z głównych produktów translacji nie odpowiadał wielkością polipeptydowi o masie 21 kDa zidentyfikowanemu w dojrzałych ziarnach, tak więc stało się oczywiste, że nowo powstający polipeptyd musi ulegać znacznemu procesowaniu, w wyniku którego tworzy się forma dojrzała.

Przykład V. Identyfikacją, prekursora dojrzałego polipeptydu przez immunoprecypitację.

Z uwagi na to, że zapasowy polipeptyd o masie 21 kDa nie był widoczny wśród produktów translacji mRNA z rozwijających się ziaren kakaowca, do identyfikacji prekursorów w mieszaninie translacyjnej zastosowano technikę immunoprecypitacji przeciwciałami swoistymi wobec polipeptydu o masie 21 kDa. Zrobiono tak z dwóch powodów: po pierwsze - w celu potwierdzenia, że odpowiedni mRNA był obecny przed klonowaniem, a po drugie - w celu uzyskania informacji odnośnie przewidywanej wielkości genu kodującego.

Immunoprecypitację przeprowadzono metodą- Cuming’a i wsp., 1986. Produkty translacji in vitro, znakowane S ^3S poddano dysocjacji w SDS i dopuszczono do wiązania się ich ze swoistym przeciwciałem w PBS + 1 % BSA. Następnie mieszaninę przeciwciało-antygen zmieszano z białkiem A-Sepharose i inkubowano na lodzie aby I_gG związała się z białkiem A. Zawiesinę umieszczono w strzykawce jednorazowego użytku o pojemności 1 ml i niezwiązane

168 529 białka usunięto, przemywając PBS + 1% Nonidet P-40. Związane przeciwciało wypłukano 1 M kwasem octowym, a białka wytrącono za pomocą TCA. Kompleks przeciwcialo-antygen zdysocjowano w SDS i poddano elektroforezie SDS-PAGE oraz (luorografii uwidaczniającej, które znakowane antygeny związały się ze swoistymi przeciwciałami.

Wyniki wskazywały na to, że przeciwciało anty-21 kDa wytrącało prekursor o masie 23 kDa. Masa prekursora odpowiadała głównemu pasmu produktów translacji in vitro.

Przykład VI. Syntezy cDNA z preparatów mRNA.

Syntezy cDNA dokonano przy zastosowaniu zestawu firmy Amersham International. Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy, czterech zasad nukleotydowych DNA (aATP, dTTP, dGTP, dCTP i startera oligo-dT. Drugą nić zsyntetyzowano metodą Gubler’a i Hoffman’a (1983), w której nić RNA rozrywa się w wielu miejscach za pomocą RNA-azy H, a pozostałe fragmenty stosuje się do syntezy na drodze wymiany nowej nici DNA, którą to syntezą kieruje enzym polimeraza DNA I E.coli. Wystające końce 3 ’ DNA wypełnia się przy użyciu polimerazy T4. Cały proces kontrolowano przez dodanie do wyjściowej mieszaniny nukleotydów małej ilości dCTP-[P³²] i mierzenie w % włączania znakowanego nukleotydu do DNA. Zakładając, że nukleotydy nieznakowaiie ulegają włączaniu z taką samą szybkością i że cztery zasady ulegają włączaniu równomiernie, można ocenić przebieg syntezy cDNA. Z ląg mRNA zsyntetyzowano w przybliżeniu 140ng cDNA. Produkty analizowano na alkalicznym 1,4% żelu agarozowym tak, jak ujawniono w sposobach Amersham’a. cDNA globiny, który syntetyzowano w zestawie jako kontrolę, przepuszczono przez ten sam żel, który wysuszono i poddano autoradiografii. Masy cząsteczkowe cDNA z kakaowca wahały się w pewnym zakresie, przy czym jest on dłuższy od cDNA globiny zasadniczo o więcej niż 600 bp.

Przykład VII. Klonowanie cDNA w wektorze plazmidowym metodą przyłączania identycznych zasad do końca 3’ cząsteczki DNA (Homopolymer Tailing).

Sposób klonowania cDNA w wektorze plazmidowym polegał na tym, że koniec 3’cDNA przedłużono resztami dC przy użyciu enzymu terminalej transferazy (Boehringer Corporation Ltd) i zhybrydyzowano z plazmidem przeciętym przez Pstl i przedłużonym na końcu 5’ (Maniatis i wsp., 1982, Eschenfeldt i wsp., 1987). Optymalna długość przedłużenia dC wynosi 12 - 20 reszt. Reakcję przedłużania (warunki jak podane przez wytwórców) kontrolowano przy użyciu fragmentu restrykcyjnego o długości 1,5 kb z tępymi końcami, pobierając próbki co pewnien czas i obserwując włączanie małych ilości dCTP znakowanego [P³²]. Próbkę cDNA (70 ng) przedłużono w ustalonych z góry warunkach.

Wektor plazmidowy z przedłużeniem dG (pUC9 z przedłużeniem 3’ -ollgo(dG)) zakupiono w firmie Pharmacia. 15 ng wektora poddano hybrydyzacji z 0,5 - 5 ng cDNA w temperaturze 58°C w ciągu 2 godzin w buforze do hybrydyzacji: 5 raM Tris-HCl, pH 7,6; ImM EDTA, 75 mM NaCl w całkowitej objętości 50 ąl. Mieszaniną poddaną hybrydyzacji stransformowano E.coli RRI (Bethesda. Research Laboratories), a transformanty wyselekcjonowano na agarze-α + 100μ^η1 ampicyliny. Otrzymano okoto 200 taansfomaantów a a 1 ng cDAA. Transformanty utrzymywano przez hodowanie ich w 100 ąl pożywki L, w studzienkach płytki do mikroozaaczeń, dodając 100 ąl 80% glicerolu i przechowując w temperaturze -20°C.

Pewną ilość cDNA przedłużonego o dC wyselekcjonowano w oparciu o wielkość przez elektroforezę w 0,8% żelu agai-Gzowym, wycięcie kawałków żelu z miejsc odpowiadających 0,5, 1,0 i 1,5 kb, wstawienie bibuły DE81 i kontynuowanie elektroforezy do momentu, aż cDNA wniknął na bibułę DE81. Następnie DNA wypłukano z bibuły za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli sposobem Dretzen’a i wsp. (1981).

Przykład VIII. Konstrukcja sond nlinononukleotcdowcph dla genu 21 kDa.

N-koniec polipeptydu o masie 21 kDa określony wyżej w przykładzie II był następujący:

Ala - Asn - Ser - Pro - Leu - Asp - Thr - Asp - Gly - Asp - Glu.

Jego region optymalny do zsyntetyzowania sondy z 17 reszt był następujący:

Asp - Thr - Asp - Gly - Asp - Glu

5’ GAC -ACC - GAC - GGC - GAC - GA 3’

T T T T T

A A

G G

168 529

Skonstruowana 17-merowasondajest przedstawioną poniżej sekwencją: w rzeczywistości stanowi ona mieszaninę 128 różnych odcinków 17-merowych, z których jeden musi być rzeczywistą sekwencją kodującą. Sondę zsyntetyzowano przy użyciu urządzenia Applied Biosystems.

Sondę dla 21 kDa oczyszczono elektroforetycznie na 20% żelu akryloamidowym, a pasma wykrywano przez zacienianie UV i eluowano przy zastosowaniu dializy wobec wody.

Przykład IX. Zastosowanie oligonukleotydów do sondowania biblioteki cDNA.

Sondy oligonukleotydowe znakowano na końcach 5’ za pomocą gamma-[P³²] dATP i enzymem kinazą polinukleotydową (Amersham International). Stosowano metodę Woods’a (1982, 1984) z takim wyjątkiem, że do znakowania około 40 ng sondy w 10 nM MgCL, 100 mMTris-HCllpH 7,6; używano mniejszej ilości izotopu (15 uCi) oraz 20 nM 2-merkapt.oetanolu.

Bibliotekę cDNA namnożono na nylonowych błonach GeneScreen (new England Nuclear) umieszczonych na powierzchni płytek z agarem L+ 100 μg/ml ampicyliny. (Słowo GeneScreen jest znakiem towarowym). Kolonie przeniesiono z płytek do mikrooznaczeń na błony przy użyciu urządzenia z wypustkami 6 x dopasowanego do studzienek połówki płytki do mikrooznaczeń. Kolonie hodowano w ciągu nocy w temperaturze 37°C, zlizowano przy użyciu wodorotlenku sodowego i związano z błonami jak opisał Woods (1982, 1984). Po wysuszeniu płytki przemyto dokładnie w 3 x SSC/0,1% SDS o temperaturze 65°C i poddano hybrydyzacji ze znakowaną sondą przy użyciu urządzenia Hybaid firmy Hybaid Ltd., PO Box 82, Twickenham, Middlesex. (Słowo Hybaid jest znakiem towarowym). Stosowano warunki hybrydyzacji jak opisali Mason i Williams (1985), a Td obliczono dla każdego oligonukleotydu według wzoru:

Td = 4°C na parę zasad GC + 2°C na parę zasad AT (w przypadku pozycji złożonych stosowano najniższą wartość)

Hybrydyzację prowadzono w Td: -5°C. Przemywano w 6 x SSC, 0,1% SDS, początkowo w temperaturze pokojowej w urządzeniu Hybaid, a następnie w temperaturze hybrydyzacji (Td: -5°C) w ciągu kilku godzin i ostatecznie w temperaturze Td w ciągu dokładnie 2 minut. Błony poddano autoradiografii na filmie Fuji X-ray, przeszukując intensywnie w temperaturze -70°C. (Słowo Fuji jest znakiem towarowym). Po 24 - 48 godzinach powstały dodatnie kolonie w postaci wystających kropel na podłożu.

Przykład X. Analiza klonów dodatnich dla polipeptydu 21 kDa.

Za pomocą sondy 21 kDa otrzymano kilka dodatnich klonów, a większość z nich zawierała wstawkę o długości 0,9 kb, co ujawniło się przez trawienie za pomocą Pstl (pierwotne miejsce Pstl wektora przetworzono metodą przyłączania dG/dC (tailing). Wstawki mają taki sam obraz restrykcyjny i są dostatecznie duże, aby kodować prekursor o masie 23 kDa, tak więc jest prawdopodobne, że stanowią one klony o pełnej długości. Mapę wstawki przedstawiono na figurze 1.

Fragment Pstl o długości 0,9 kb oddzielono od wektora przez elektroforezę w żelu agarozowym na bibule DE81 (Dretzen i wsp., 1981), i około 500 ng poddano przemieszczeniu pęknięć przy użyciu zestawu do przemieszczania pęknięć Amersham. Otrzymana sonda wykazywała -4x 107cpm, a 10⁶ cpm zastosowano do dalszego sondowania biblioteki cDNA metodą hybrydyzacji opisaną przez Wahl’a i Berger’a (1987). Stosowano 50% formamid i temperaturę 42°C. Otrzymano nieco więcej niekompletnych klonów dodatnich, które zastosowano w następnym sekwencjonowaniu.

Przykład XI. Sekwencjonowanie sklonowanych wstawek.

Strategia sekwencjonowania polegała na klonowaniu wstawek i klonowaniu odpowiednich ich subklonów w wielokrotnym miejscu do klonowania plazmidów pTZ18R/pTZ18/19R (Pharmacia). Plazmidy te są skonstruowane w oparciu o lepiej znane wektory pUC18/19 (Norrander i wsp., 1983), lecz zawierają jednoniciowy początek replikacji pochodzący z włókienkowategofagafl. Superinfekcja fagami w tej samej grupie indukujejednoniciowąreplikację plazmidu, a pojedyncze nici są upakowywane i w postaci fagów wydzielane do otoczenia. Znanymi sposobami dla fagów M13 (Miller, 1987) można z tych fagów wypreparować DNA i sekwencjonować metodą Sanger’a (1977) przy użyciu odwróconego startera do sekwencjonowania. Stosowany do superinfekcji fag M13KO7 pochodzi od faga M13, ulega słabej replikacji i dlatego nie współzawodniczy z plazmidem, a ponadto zawiera marker selekcyjny w postaci

168 529 oporności na kanamycynę. Dalsze szczegóły sposobów wytwarzania pojedynczych nici z plazmidów pTZ oraz fagów pomocniczych dostarcza firma Pharmacia. Sekwencję DNA zestawiono i przeanalizowano stosując zestaw programów komputerowych Staden’a (Staden, 1986) na komputerze Prime 9955. (Słowo Prime jest znakiem-towarowym).

Przykład XII. Cechy cDNA dla 21 kDa i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa prekursora o masie 23 kDa.

Sekwencję cDNA dla 21 kDa i przewidywaną sekwencję aminokwasową kodowanego prekursora o masie 23 kDa przedstawiono na figurze 2. cDNA ma 91) zasad, wyłączając koniec 3’ poli A. Kodon startu ATG znajduje się w pozycji 21, a po nim następuje otwarta faza odczytu 221 kodonów, zakończona kodonem stopu w pozycji 684. Dalej znajduje się 233-zasadowy region nieulegający translacji, który zawiera stosunkowo dużo AT (60%) i kilka kodonów stopu we wszystkich trzech fazach odczytu. W pozycjach 753 i 88) znajdują się dwa sygnały poliadenylacji (AATAAA) (Proudfoot i Brownlee, 1976). W pozycji 99 znaleziono sekwencję odpowiadającą sondzie oligonukleotydowej, a w pozycji 167 doświadczalnie wykryto miejsce Cla.

Przewidywany polipeptyd prekursora o masie 23 kDa zawiera 221 aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa wynosi 24003. Dojrzały N-koniec znal w pozycji 27, a pierwsze 26 reszt wysoko hydrofobowe, co jest charakterystyczne dla sekwencji sygnałowej rozpoznawanej przez białka odpowiedzialne za translokację nowowyntetyzowanych białek przez błony w procesie podziału (Kreil, 1981). Dojrzałe białko ma 195 reszt i masę cząsteczkową wynoszącą 21223, zgodną z masą uzyskaną na żelach poliakryloamidowych. Skład aminokwasowy dojrzałego białka jest typowy dla białek rozpuszczalnych; - 24% reszt obdarzonych ładunkiem i około 20% reszt hydrofobowych.

Homologie pomiędzy białkiem o masie 21 kDa a innymi znanymi białkami. Poszukiwaniaprowadzone w danych identyfikacyjnych białek (PIR) (National Biomedical

Research Foundation, Washington DC) przy użyciu programu do zestawiania sekwencji FASTP (Lipman i Pearson, 1985) wykazały wysoki stopień homologii pomiędzy białkiem o masie 21 kDa a inhibitorami Kunitz’a proteazy i α-amylazy, znalezionymi w dużych ilościach w nasionach niektórych gatunków, zwłaszcza warzyw strączkowych i zbóż. Przykłady przedstawione na figurze 3 obejmują inhibitor cz-amy laz.y/subt.y! izyny jęczmienia, B-ASI (Svendsen i wsp., 1986), inhibitor α-nmylazy/sbbtylizyn y pseenicy, W-SS ((Maeda, 198(5 ), inhibito r chnmrtrypsyny.

Pscophocarpus tetragonolobus, W-CI (Shibata i wsp., 1988), inhibitor trypsyny Pscophocarpus tetragonolobus W-TI (Yamamoto i wsp., 1983), inhibitor trypsyny soi, S-TI (Koide i Ikenaka, 1973b), inhibitor trypsyny Erythrina latissima, E-TI (Joubert i wsp., 1985).

Wszystkie inhibitory Kunitz’a mają tę samą wielkość i oś wzdłuż całej swojej długości. Tak więc białko o masie 21 kDa musi należeć do tej klasy.

Przykład XIIL Ekspresja polipeptydów o masach 23 kDa i 21 kDa w E.coli.

DNA kodujący polipeptydy o masach 23 kDa i 21 kDa (to jest z hydrofobowym peptydem sygnałowym i bez niego) subklonowano w wektorze ekspresyjnym E.coli, pJLA502 (Schauder i wsp., 1987) sprzedawanym przez Medac GmbH, Postfach 303629, D-7000, Hamburg 36 (patrz figura 4). Wektor zawiera silne promotory lamia, P_L i Pr, sekwencję liderową i miejsce wiążące rybozomy grnu atpE E.coli ulegającego bardzo wydajnej translacji. Zawiera on również represor cI wrażliwy na temperaturę, tak więc ekspresja ulega represji w temperaturze 30°G, a aktywacji w temperaturze 42°C. Wektor posiada miejsce Ncol (zawierające kodon ATG: CCATGG) prawidłowo umiejscowione względem miejsca wiążącego rybozomy; obce sekwencje kodujące łączy się w tym miejscu. Sekwencja kodująca 23 kDa nie posiada miejsca Ncol w początku ATG, tak więc miejsce takie wprowadzono techniką mutagenezy in vitro.

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą zestawu sprzedawanego przez firmę Amersham International metodą Eckstein’a i wsp. (Taylor i wsp., 1985). Po sparowaniu mutagennego startera z jednoniciowym DNA, podczas syntezy drugiej nici w miejscach dCTP włączaniu ulegał alfa-tio-dCTP. Po przedłużeniu i zligowaniu do zamkniętej postaci kolistej, plazmid trawiono enzymem NciI, który nie rozrywa DNA zawierającego tio-dC. Tak więc, jedynie pierwotna nić uległa rozrywaniu i kolejnemu trawieniu egzonukleazą III. Następnie ponownie zsyntetyzowano pierwotną nić, przy czym jako startery służyły pozostałe fragmenty DNA, uzupełniając zmuto10

168 529 waną pozycję w pierwotnej nici. Następnie plazmidami transformowano E.coli i kontrolowano przy zastosowaniu minipreparatów plazmidowych.

Miejsce Ncol wprowadzono do cDNA dla 23 kDa w plazmidzie pMSlOl (w wektorze pTZ19R, tak, że jednoniciowy DNA mógł powstawać z łatwością) przy użyciu startera mutagennego: 5’ ACTTAACCAtGgAGACC 3’, otrzymując plazmid pMS1Ó6. Starter wybrano tak, aby uniknąć znaczącej hybrydyzacji w innych miejscach plazmidu.

Region kodujący 23 kDa klonowano w wektorze ekspresyynym E.coli pJLA502 we fragmencie Ncol-Ecol (PMS107). Następnie region kodujący klonowano znowu w pTZ19 we fragmencie Xhol (w kierunku w górę od Ncol) - EcoRI. Tak powstaje plazmid pTZ-23 kDa (pMS 108) z wyeliminowanym regionem poli G/C, który prawdopodobnie przerywa transkrypcję w wektorze pomiędzy promotorem T7 a regionem kodującym. W wyniku transkrypcji in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7 powstawał w dużych ilościach RNA, który ulegał translacji w kiełkach pszennych dając białko o masie 23 kDa. Dowodzi to, że w plazmidzie obecny jest działający gen, zdolny do wytwarzania białka o przewidywanej wielkości.

Hydrofobową sekwencję sygnałową usunięto z plazmidu pM108 przez delecję przy użyciu mutagennego startera wiążącego się z każdą stronąproponowanej delecji: 5’ TGGAGACTGCCATGGCAAACTCTCCTGTG 3’. Otrzymany plazmid pMS 111 miał zachowane miejsce Ncol w miejscu startu ATG, region kodujący 21 kDa subklonowano w pJLA502 we fragmencie Ncol-BamHI (pMS113).

Dwoma wektorami ekspresyynymi stransformowano E. coli UT580. Stransformowane szczepy hodowano w pożywce L z ampicyliną (100 gg/ml) w temperaturze 30°C do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu (OD610 = 0,5), następnie temperaturę zwiększono do 42°C i co pewien czas pobierano próbki. Próbki rozpuszczono we wrzącym buforze SDS i przepuszczono przez żele SDS-PAGE. Stosowano elektroblotting białek na błonach nitrocelulozowych (Towbin i wsp., 1979) i analizowano metodą Western blotting przy użyciu przeciwciała przeciwko peptydowi o masie 21 kDa wytworzonego jak opisano wyżej w przykładzie III (2 (tg/ml), a w charakterze drugiego przeciwciała stosowano kozią przeciwkróliczą IgG w połączeniu z alkaliczną fosfatazą (Scott i wsp., 1988).

W przypadku wektora pMS 107, przeciwciało wykryło swoiste białko o masie cząsteczkowej wynoszącej około 23 kDa, jednakże obecne były także mniejsze pasma, z których jedno odpowiadało masie 21 kDa, co sugerowało, że E.coli częściowo odszczepiała sygnałową sekwencję hydrofobową. Większą ilość białka obserwowano po 18 godzinach - wynosiła ona co najmniej 1-2 mg/litr. W przypadku próbek kontrolnych zawierających jedynie wektor nie powstawały białka wykrywalne metodą immunologiczną. W przypadku wektora pMS113, uzyskano podobny wynik, z tym jednak wyjątkiem, że obserowano jedynie białko o 'masie 21 kDa: nie było dowodu świadczącego o wyższej ekspresji pod nieobecność sekwencji sygnałowej. Jednakże, w wyniku transformacji tymi wektorami szczepu CAG 629 z defektem proteazy (Dr.

C. A. Gross), w obu przypadkach uzyskano o wiele wyższy poziom ekspresji, rzędu 5 -10 mg/litr.

Przykład XIV. Ekspresja polipeptydów 21/23 kDa w drożdżach. (Saccharomyces cerevisiae)

Zastosowano dwa drożdżowe wektory ekspresyjne, oba oparte o wahadłowy wektor drożdżowo-E.coli zawierający miejsca początku replikacji z drożdży i z E.coli oraz odpowiednie markery selekcyjne (oporność na ampicylinę dla E.coli i auksotrofię leucynową dla drożdży). Oba wektory zawierają drożdżowy promotor kinazy pirogronianowej (PK) i sekwencję liderową oraz posiadają miejsce do klonowania HindIII znajdujące się w kierunku w dół od promotora. Jeden z tych wektorów - wektor A - przeznaczony jest do ekspresji wewnętrznej, a drugi - wektor V - do ekspresji wraz z sekrecją i posiada część sekwencji sygnałowej drożdżowego płciowego czynnika a, położoną w kierunku w dół od promotora oraz miejsce HindIII służące do wytwarzania białek fuzyjnych przy użyciu dołączanych sekwencji kodujących. Wektory te przedstawiono na figurze 5.

Aby wydajnie stosować wektory, pożądane jest wprowadzenie obcego regionu kodującego; w przypadku wektora A - regionu od miejsca do klonowania HindIII do startu ATG, takiego samegojak drożdżowy gen PK, a w przypadku wektora B - reszty sekwencji sygnałowej czynnika a, włącznie z lizyną w punkcie rozszczepienia. W praktyce osiągnięto to przez zsyntetyzowanie

168 529 dwóch kompletów łączników HindIII-NcoI służących do zlikwidowania luki pomiędzy miejscem do klonowania HindIII w wektorze i NcoI w miejscu startu ATG sekwencji kodującej. W przypadku wektora B, w którym sekwencja kodująca ma być złożona z sekwencją sygnałową drożdżowego czynnika a, stosowano region kodujący polipeptyd o masie 21 kDa (to jest z usuniętą sekwencją sygnałową kakaowca). Konstrukcje przedstawiono na figurze 6. Dla ułatwienia konstruowania wektorów drożdżowych najpierw klonowano łączniki HindIII-NcoI w odpowiednich plazmidach pTZ, a potem w wektorach drożdżowych klonowano łączniki wraz z regionem kodującym, we fragmentach HindIII-BamHI.

Drożdżowe plazmidy ekspresyjne przeniesiono do drożdżowych sferoplastów, metodą Johnston;a (1988). Jako gospodarza do transformacji zastosowano szczep AH22 LEU i wyselekcjonowano transformanty na minimalnej pożywce bez leucyny. Transformanty LEU+ występowały w postaci pasm pojedynczych kolonii, które hodowano w 50 ml pożywki YEPD (Johnston, 1988) w temperaturze 28°C w celu zbadania zasięgu i rozkładu obcego białka. Z hodowli zebrano komórki w przedtem zważonych probówkach przy użyciu wirówki i przemyto 10 ml buforu lizującego (200 mM Tris, pH 8,1; 10% glicerol). Substancję komórkową zebrano i zatężono W - 25 razy w minizatężaczu Amicon (Słowo Amicon jest znakiem towarowym). Przemyte komórki zważono i ponownie zawieszono w buforze lizującym z dodatkiem inhibitorów proteazy (1 mM fenylometylosulfonyłofluoru (PMSF); 1 μg/ml trasylolu; 0,5 μg/ml leupeptyny) w stężeniu 1 g/ml. Dodano jedną objętość kulek szklanych przemytych kwasem i rozbijano komórki przez wirowanie trwające 8 minut, stosując jednominutowe impulsy i jednominutowe przerwy, na lodzie. Po sprawdzeniu pod mikroskopem, czy komórki zostały rozbite, mieszaninę odwirowano w ciągu 3 minut z szybkością 7000 obrotów/minutę w celu osadzenia szklanych kulek. Supernatant usunięto do schłodzonej przedtem probówki do wirowania i wirowano w ciągu 1 godziny z szybkością 20000 obrotów/minutę. (Małe próbki można wirować w mikrowirówce, w niskiej temperaturze). Supernatant tworzy rozpuszczalną frakcję. Osad ponownie zawieszono w 1 ml buforu lizującego z dodatkiem 10% SDS i 1% merkaptoetanolu i ogrzewano w temperaturze 90°C w ciągu 10 minut. Po 15-nmnutowym odwirowaniu w mikrowirówce powstał supernatant tworzący jednorodną frakcję.

Próbki każdej frakcji i zatężonej pożywki badano metodą blottingu Western. Plazmid pMS 116, przeznaczony do ekspresji wewnętrznej wytwarzał oba polipeptydy - o masach 23 kDa i 21 kDa w rozpuszczalnej frakcji lizatu komórkowego, a w pożywce znaleziono znaczne ilości (2 - 5 mg/litr) polipeptydu o masie 21 kDa. Tak więc drożdże rozpoznają sekwencję sygnałową kakaowca i transportują białko przez błonę, przy czym w trakcie tego procesu sekwencja sygnałowa ulega odszczepieniu. Miejsce odszczepieniajest prawidłowe, co potwierdza wielkość końcowego białka.

Plazmid pMS 117, przeznaczony do ekspresji z sekrecj ą dawał raczej podobne wyniki, przy czym w pożywce występowała większa ilość polipeptydu o masie 21 kDa. Ani we frakcji rozpuszczalnej, ani w cząsteczkowej nie znaleziono dowodu na obecność nierozszczepionego polipeptydu z przyłączoną sekwencją sygnałową drożdżowego czynnika α.

Przykład XV. Zwiększenie skali produkcji białka o masie 21 kDa w fermentorze o pojemności 5 litrów.

Aby ocenić wydajność wytwarzania na większą skalę białka o masie 21 kDa przez drożdże AH22 zawierające plazmid pMS117, szczep hodowano w bioreaktorze o pojemności 5 litrów firmy Life Technologies Inc. Tak jak w hodowli na małą skalę, stosowano pożywkę YEPD, a jako inokulum użyto 10 ml hodowli w późnej fazie logarytmicznej wzrostu (ODg00 wynosiło 4,0). Szybkość napowietrzania wynosiła 2 litry/minutę, a mieszanina - 350 obrotów/minutę, ponadto dodano 10 ml oleju szafranowego w celu zapobiegania tworzenia się piany w wyniku napowietrzania i mieszania. Komórki przeszły w logarytmiczną fazę wzrostu po 10 godzinach, faza ta zakończyła się po 15 godzinach wraz z zanikiem glukozy i zbieraniem się etanolu. Jednakże wzrost trwał aż do momentu zbierania, które nastąpiło po 60 godzinach wraz z jednoczesnym utlenieniem etanolu. Ostatecznie uzyskano biomasę 28 g/litr mokrej masy i 7,3 g/litr suchej masy. Analiza pożywki metodą blottingu Western wykazała, że białko o masie 21 kDa najpierw powoli ulegało sekrecji do pożywki, jednakże w późnej fazie stałej gromadziło się szybko, a w czasie zbierania ilość białka zwiększyła się do około 20 - 30 mg/litr.

168 529

Pod koniec doświadczenia komórki drożdżowe usunięto z pożywki stosując filtrowanie z poprzecznym przepływem przez 0,2 pm błonę, a składnik białkowe (lub wielocząsteczkowe) pożywki zatężono na drodze filtrowania z poprzecznym przepływem przez błonę do ultrafiltracji oddzielającą masę cząsteczkowy 10 kDa. Stosowano urządzenie do filtrowania z poprzecznym przepływem firmy Sartorius GmbH, Goettingen, RFN. Białko o masie 21 kDa można dalej wstępnie oczyszczać przez wytrącanie 80% siarczanem amonowym, ponowne rozpuszczanie w wodzie i dializę.

Pewne zwiększenie wydajności osiągnięto w procesie z okresowym zasilaniem, w którym poziom glukozy zwiększano do 2% zatężonego roztworu w momencie, gdy spadał on poniżej 0,1%. Przeprowadzono cztery takie zasilania po 16, 23, 34 i 37 godzinach, a wzrost kontynuowano· do 58 godziny. Uzyskano zwiększoną wydajność białka o masie 21 kDa, wynoszącą do 50 mg/litr pod koniec doświadczenia.

Przykład XVI. Ekspresja białka o masie 23 kDa/21 w Hansenula polymorpha.

Metylotroficzne drożdże Hansenula polymorpha jako gospodarz do ekspresji białek heterologicznych mają szereg.·zalet w porównaniu z Saccharomyces cerevisiae (Europejskie zgłoszenie patentowe nr EP-A-0173378 oraz Sudbery i wsp., 1988). Drożdże hoduje się na metanolu, jako jedynym źródle węgla; w tych warunkach enzym oksydaza metanolowa (MOX) może s^^^^n^owić do 40% całego białka komórkowego. Tak więc, promotor MOX jest bardzo silnym promotorem, który można stosować w wektorze do kierowania syntezą białek heterologicznych, przy czym jest on wydajny nawet w postaci pojedynczej kopii. Umożliwia to stosowanie wektorów trwale zintegrowanych. Hansenula może także wzrastać na źródłach o dużej zawartości węgla takich jak glukoza, w którym to przypadku promotor MOX ulega całkowitej represji. To oznacza, że komórki zawierające heterologiczny gen można hodować aż do osiągnięcia wysokiej gęstości na glikozie i indukować wytwarzanie obcego białka przez usunięcie glukozy i dodanie metanolu.

Konstrukcje (pMY10 i pMY9), zawierające gen dla 23 kDa i 21kDa umieszczony pomiędzy promotorem MOX a sekwencją terminacji MOX, wykonano w drożdżowym plazmidzie episomalnym YEp13. Obie zawierały sygnał sekrecji inwertazy, złożony z regionem kodującym genu kakaowca, jak przedstawiono na figurze 7. Tymi konstrukcjami transformowano Hansenula i w obu przypadkach, w warunkach indukujących, następowała sekrecja do pożywki białka 21/23 kDa, jednakże pMY10, zawierający drożdżową a nie roślinną sekwencję sygnałową, był wydajniejszy.

Hansenula stransformowane konstrukcją pMY10 hodowano także na większą skałę w fermentorze, i po indukcji metanolem uzyskano biomasę 45 g/litr suchej masy. Po indukcji, w pożywce występowało białko o masie 21 kDa w ilości dochodzącej do 50 mg/litr.

Szczepy E.coli

RR1- F Vb'Mb ara-14 proA2 leuB6 lacY1 galK2 vpsL20 (str^r) xyl-5 mtl-1 supE44

CAG629 lacam tvpam phOam htpRam mal rpsL lon supCts

UT580 (lac-pro) supE thi hsdD5/F’traD36 proA⁺B⁺ lad lacZ M15

Odnośniki literaturowe

Aviv, H., i Leder, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 - 1412 (1972). Purification of biologically active globin mRNA by chromatography on oligo dT cellulose.

BiehljB., Wewetzer, C., iPassem, D. J. Sci. Food Agric. 33, 1291 - 1304 (1982).Vacuolar (Storage) Proteins of Cocoa Seeds and their Degradation during Germination and Fermentation.

Biehl, B., Brunner, E., Passem, D., Quesnel, V.C. i Adomako, D.J. Sci. Food Agric. 36 583 - 598 (1985). Acidification, Proteolysis and Flavour Potential in Fermenting Cocoa Beans.

Catty, D. i Raykundalia, C. Production oan Quality control of Polyklonal Antibodies, in: Antibodies: A Practical Approach Vol. I, IRL Press (1988)

Cuming, A.C., Williams, R.S., i Cullimore, J.V. Immunology in Plant Science, Wyd.

Wang, T.L., Cambridge University Press, 1986. The use of Antibodies in Molecular Biology.

Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., i Chambon, P. Analytical Biochemistry 112,

295 - 298 (1981). A reliable method for -the recovery of DNA fragments from agarose and acerylamide gels.

168 529

Eschenfeldt, W.H., Puskas, R.S., i Berger, S.L. Methods in Enzymology 152, 337 - 342 (1987). Homopolymeric Tailing.

Fritz i wsp. (J. Food Sei. 50 946 - 950 (1985))

Gubler, U,, i Hoffman, B..T. Gene 25, 263 (1983). A simple and very efficient method for generating cDNA libraries.

Hall, T.C., Ma, Y., Buchbinder, B.U., Pyrne J.W., Sun, S.M., i Bliss, F. A. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 3196 - 3200 (1978). Messenger RNA for G1 protein of French bean seeds: cell-free translation and product characterisa^ion.

Hill, S.A. Method in Plant Virology, Blackwell 1984.

Johnston, J.R., Yeass: Apractical approach, Wyd.: Campbell, I., i Duffus. J.H. IRL Press, 1988, Yeast Genetics, Molecular Aspects.

Joubert, F.J., Henssen, C. i Dowdle, E.B.D. J.Biol. chem. 260, 12948 - 12953 (1985) The complete amino acid sequence of trypsin inhibitor DE-3 from Erythrina latissima seeds.

Koide, T. i Ikenaka, T. Eur. J. Biochem. 32, 417 - 431 (1973b). Amino-acid sequence of the carbocyl-terminal region and the complete amino-acid sequence of the soybean trypsin inhiHitorfKjinit7.

Kreil, G. Annual Rev. Biochem. 50. 317 - 348 (1981). Transfer of proteins across membranes.

Laemmli, U.K. Nature 227,680 (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Lipman, D.J., i Pearson, W.R. Science 227, 1435 - 1441 (1985). Rapid protein sequence similatiry searches.

Maeda, K. Biochim. Biophys. Acta 871, 250 - 256 (1986). The complete amino-acid sequence of the endogenous a-a^^ylase inhibitor in wheat.

Maniatis, T., Fritsch, E.F., i Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1982.

Mason, P.J., i Williams, J.G., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Wyd.: Harnes, B.D., i Higgins, S.J. IRL Press 1985. Hybridisation in the Analysis of Recombinant DNA.

Meinhoth, J., i Wahl, G.M. Analytical Biochemistry 138,267 (1984). Methods of Southern blotting and DNA probing.

Miller, H. Methods in Enzymology 152, 145 - 170 (1987).

Practical Aspects of Preparing Phage and Plasmid DNA: Growth, Maintenance and Storage of Bacteria and Bacteriophage.

Norrander, J., Kempe, T., i Messing, J. Gene 26, 101 (1983). Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagensis.

Pettipher, G.L. Cafe Cacao The XXXIV 23 - 26 (1990). The Extraction and Partial Purification of Cocoa .Storage Proteins.

Proudfoot, M. J., i Brownlee, G.G. Nature 263, 211 - 214 (1976(. 3’ Non-coding region sequences in enkayotic messenger RNA.

Roberts, B.E., i Paterson, B.M. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70, 2330 (1973). Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ.

Sanger, F., Nicklen, S., i Coulson, A.R. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74,5463 - 5467 (1977). DNB sequencing with chain-tenminating inhibitors.

Schauder, B., Blocker, H., Frank, R., i McCarthy, J.E.G. Gene 52, 279 - 283 (1987). Inducible expression vectors incorporating the E.coli aptE translation initiation region.

Scott, R., Jefferson, R., Dury, G., i Jacob, L., Plant Genetic Transformation and Gene Expreśsion: A Laboratory Manual. Wyd.: Draper, J., Scott, R., Armitage, P., Walden, R. Blackwell 1988. Analysis of gene organisation and expression in plants.

Shibata, H., Hara, S. i Ikenaka, T. J, Biochem. (Tokyo) 104, 537 - 543 (1988). Amino-acid sequence of winged bean (Psophocarpus tetragonolobus) chymotrypsin inhibitor, WCI-3.

Staden, R. Nucleic Acids Res. 14, 217 -231 (1986). The current status and portability of our sequence handling soft-ware.

168 529

Sudbery, P.E., Gleeson, M.A. Veale, R.A., Lederboer, A.M., i Zoetmulder, M.C.M. Biochem. Soc. Trans 16 1081 - 103 (1988). Hansenula polymorpha as a novel yeast system for the expression of heterologous genes. .

Svendsen, I., Hejgaard, J. i Mundy, J. Carlsberg. Res. Commun. 51, 43 - 50 (1986). Complete amino-acid sequence of the cz-amykee/siiblilisi ninhibitorfrom bariey.

Taylor, J.W., Ott, J., i Eckstein, F. Nucleic Acids Res. 13, 8765 - 8785 (1985). The rapid generation of oligrnucreoiide-direjted mutations at high frequenjy using pno/pohoronioare-modified DNA.

Towbin, H. Staehelin, T., i Gordon, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,4350 - 4534 (1979). Electrophoretic transfer of proteins from pcdyacryloamide dels to nitrojellulo/e snert/: procedure and some applications.

Von Heije,· G. Eur. J. Biochem 133, 17 - 21 (1983). Patterns of Amino-ajids near Sigsal-Sequence Cleavage Sites.

Wahl, G.M., i Berger, S.L. Methods in Enzymology 152, 415 - 423 (1987). Screening Colonies of P^ues with Radioactive Nucleic Acid Probes.

Woo^s, D.E. Focus (Bethesda Research Labs) 6, 3 (1984).

Oligonucleotide Screening of DNA Li^anes.

Woo^s, D.E., Markham, A.F., Ricker, A.T., Goldberger, G., i Colten, H.R. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 79, 5561 (1982).

Yamamoto, M., Hara, S. i Ikenaka, T. J. Biochem. (Tokyo) 94, 849 - 863 (1983). Aminr-ajid /equenje/ of two trypsin inhibitors from winged bean sred/ (P^li^arpm tetragonolobus).

168 529

FIG. 6A

Gen drożdżowy kinazy pirogronianowej

MetserArg

TTTACAAGACACCAATCAAAACAAATAAAA.CATCATCACAATGTCTAGA

Zmieniona sekwencja w utworzenia miejsca do

V _ MetSerArg _{ce lu} TTTACAAGCTTCCAATCAAAACAAATAAAACATCATCACAATGTCTAGA klonowania Hin +

Łączniki HIN-NCO

AGCTTCCAATCAAAACAAATAAAACATCATCAC

AGGTTAGTTTTGTTTATTTTGTAGTAGTGGTAC

Wektor ekspresyjny A 21 kDa _ ^v MetGluThr

TTTACAAGCTTCCAATCAAAACAAATAAAACATCATCACCATGGAGACC

Hin Nco

FIG. 6B

Sekwencja sygnałowa drożdżowego czynnika oć

231

Met----GluGlyValSerLeuAspLysArgGlu

ATG----GAAGGGGTAAGCTTGGATAAAAGAGAG

Hin

Łącznik HIN-NCO

AGCTTGGATAAAAGAGC

ACCTATTTTCTCGGTAC

Fuzja w fazie odczytu regionu kodującego 21 kDa

Met---GluGlyValSerLeuAspLysArgAlaMetAlaAsn

ATG---GAAGGGGTAAGCTTGGATAAAAGAGCCATGGCAAAC

Hin

Nco

168 529

FIG. 5

168 529

FIG. 4

R‘^rL

RBS Start ί>-GGAGACTGCCATGG 'Χ, 40 zasad w kierunku w górę od apt.

E.coli

168 529

TC-21

BASI

WASI

W-Cl «-ΤΙ

S-Tl

8TI

FIG. 3A

110

120

TC-21

R L

D

N

yJd]n

S

A C

X

U

«

V

T

D G

v7|g e

P

G

P

B-ASI

Η 1

D

S

- Ε I.

A

A G

R

H

V

I

T

G P

v k]- b

P

S

P

«-ASI

ll I

D

S

- B l>

V SJG

R

H

V

I

T

G P

v(r(- b

P

S

P

Q Q E L

W-Cl V-TI S-TI g-TI

V V

V V E

V V E VrV. K

E O eI.GI.L

B

X S@X I GENKDAH-D G[«JL S 8 D B.s[?]Q Fi ΪΡ 130

S G S G KIP

UO

- c S0-	F X	I	Ε X		A	G	V
- Ε N A -	fIr	I	Ε X	Y S G	A	B	V
- Ε H A -	FR	I	B X	Y S‘G	A	E	V
X Β I L V	F K	F	Β X	V S H	S H	I
F D Y L -	F X	F	Β X	V T S	-	X	F

L G Η E Η E Η V

150 F R L L L t L X L V L L

TC-21

B-A3I «-ASI «-CI «-ΤΙ

S-Tl

B-TI |f c p1s<v c o

----r - H

------_A y[ć|q h d y|c[X K R [f cno q Y [c [b g k 160

s c	Τ T L	c	S	0
S C	G D«	C	Q	D
S c	COS	C	0	D
Ε K	D V X	C	D	Q
	- D T	C	X	[fl
λ E	D D X	C	GIB]
- -	11 Β X	C	A S

A l|s d h,e G λ Τ Ε P Y G A Τ Ε P Y

V V Τ 8 Ε H ν v tIdIb m

V ν0Κ®Β

V V Τ g 0 H

Q V V H

S S H

FIG. 3B

168 529

FIG. 2A

FIG.2B

MKTATAVVLLLFAF

CAGCAACATTTCACTTAACCATGAAGACCGCAACAGCCGTAGTTTTACTCCTCTTCGCCT

20 3 0 4Q 50 60

T S KS Y F FG νΑΝΑ^ΑΝ S Ρ V L D T TCACATCAAAATCATATTTCTTTGGGGTAGC-AACGCTGCAAACTCTCCTGTGCTTGACA

80 90 100 110 120

DGDELQTGVQYYVLSSISGA

CTGATGGTGATGAGCTCCAAACTGGGGTTCAATATTACGTCTTGTCATCGATATCGGGTG

130 140 150 160 170 180

GGGGLALGRATGQSCPEIVV

CTGGGGGTGGAGGGCTAGCCCTAGGAAGGGCTACAGGTCAAAGCTGCCCAGAAATTGTTG

190 200 210 220 230 240

QRRSDLDNGTPVIFSNADSK

TCCAAAGACGATCCGACCTTGACAATGGTACTCCTGTAATCTTTTCAAATGCGGATAGCA

250 260 270 280 290 300 ddvvrvstdvniefvpirdr

AAGATGATGTTGTCCGCGTATCTACTGATGTAAACATAGAGTTCGTTCCCATCAGAGACA

310 320 330 340 350 360

LCSTSTVWRLDNYDNSAGKW

GACTCTGCTCAACGTCAACTGTGTGGAGGCTTGACAATTATGACAACTCGGCAGGCAAAT

370 380 390 400 410 420

WVTTDGVKGEPGPNTLCSWF

GGTGGGTGACAACTGATGGGGTTAAAGGTGAACCTGGTCCTAACACTTTGTGCAGTTGGT

430 440 450 460 470 480

KIEKAGVLGYKFRFCPSVCD

TTAAGATTGAGAAGGCCGGAGTACTCGGTTACAAATTCAGGTTCTGTCCTTCTGTCTGTG

490 500 510 520 530 540

SCTTLCSDIGRHŚDDDGQIR

ATTCGTGCACAACTTTATGCAGCGATATTGGAAGACATTCAGATGATGATGGACAAATAC

550 560 570 580 590 600

LALSDNEWAWMFKKASKTIK

GTTTGGCTCTCAGTGACAATGAATGGGCATGGATGTTTAAGAAAGCAAGTAAGACAATAA

610 620 630 640 650 660

QVVNAND *

AACAAGTTGTTAACGCGAACGATTAATTTTAAGTTTAATGTACGAAGTGTACGTCCAAAG 670 680 690 700 710 720

CAGCAATACTAGCCGGTCGTTACTTTCCACTAjAATAA^AGTTAAGTATGTGGTTCCCAGC 730 740 750 760 770 780

CCAGTGTTGTAATGCTATGCCTATGTAGTCAGTGTCTTGTTTGAGGGTGGAGATGCTTAA 790 800 810 820 830 840

AGGGTGTGTCTTCACAGTCCCAGCTTCGTAGTCTTTCAGCTTTATG^ATAAA{rGATTTGC 850 860 870 380 890 900

CTCTTGCCTCTTTTATT

910

168 529

FIG. 7

PROMOTOR P

ΜΟΧ

P Μ Y 9----........1 pmy i o ---LWN-.. i— ::: ,7: · r — klucz sekwencja sygnałowa drożdżowej inwertazy

EZZZ sekwencja sygnałowa kakaowca

Region kodujący 21 kDa

FIG. 1

F-1-1-1-1-1-1-1-1-r

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 kb —ł , T Y - L Ξτί ·-.Τ-·— =3_HS C Sc H₈

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragmentu, o co najmniej 20 aminokAwasach, znamienny tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy, przez wytworzenie wiązania peptydowego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się co najmniej część sekwencji przedstawionej na fig. 2.
3. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że wytwarza się białko lub jego fragment który jest białkiem lub fragmentem rekombinowanym.
4. Sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragmentu, o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy przez wytworzenie wiązania peptydowego.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się co najmniej część sekwencji przedstawionej na fig. 2.
6. Sposób według zastrz. 4, albo 5, znamienny tym, że wytwarza się białko rekombinowane lub jego fragment.