DE69535326T2

DE69535326T2 - Transformierte linie der hefe candida utilis und die dadurch möglich expression eines heterogens

Info

Publication number: DE69535326T2
Application number: DE69535326T
Authority: DE
Inventors: Kiban Gijutsu Kenkyusho Keiji Yokohama-shi KONDO; Susumu Kajiwara; Kiban Gijutsu Kenkyusho Norihiko Yokohama-shi MISAWA
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1994-05-25
Filing date: 1995-05-25
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2015-05-26
Also published as: US5849524A; EP0717107A4; EP0717107A1; JP3385027B2; NO960247L; CA2168037C; CA2168037A1; FI960331A; AU2537795A; KR100320905B1; JPH08173170A; KR100263962B1; ATE347598T1; JP4623925B2; JP2003144185A; JP4017966B2; WO1995032289A1; FI121013B; FI960331A0; EP1792993A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft reproduzierbare Transformationssysteme von Candida utilis, genauer gesagt die Transformation der Hefe Candida utilis mit rekombinanter DNA und die Expression heterologer Gene bei dadurch erhaltenen neuen Transformanten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch neue DNA-Sequenzen, die als selektierbare Markergene für die Transformation verwendet werden können und neue DNA-Sequenzen, die als Promotoren oder Terminatoren für die Expression heterologer Gene verwendet werden können. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren für die effiziente Integration heterologer Gene in Hefechromosomen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Fragmente mit Eigenschaften einer autonomen Replikation wie auch einer Verstärkung der Transformationseffizienz in Candida utilis, Verfahren zur Integration von DNA-Fragmenten ohne selektierbares Markergen in ein Chromosom und Verfahren für den Erhalt von DNA-Sequenzen mit einer Promotoraktivität.
Stand der Technik
Die Entwicklung von Genmanipulationstechnologien hat es ermöglicht, nützliche Proteine in großer Menge mit Mikroorganismen zu erzeugen. Prokaryonten wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis können inter alia einfach als Wirt hierfür verwendet werden, wobei E. coli besonders häufig als Wirt verwendet wird. Proteine, die in E. coli erzeugt werden, werden jedoch häufig zu unlöslichen Formen führen und können bei der Sekretion nicht glycosyliert werden, so dass diese Proteine für eine Vielzahl von Erfordernissen nicht geeignet sind. Zusätzlich müssen pyrogene toxische Faktoren, die von E. coli erzeugt werden, entfernt werden, wenn die so erzeugten Proteine als Medikamente verwendet werden sollen.
Im Vergleich zu der Verwendung dieser prokaryontischen Systeme ist es interessant, Eukaryonten wie Hefe als Wirt zur Erzeugung nützlicher Proteine zu verwenden. Zunächst war es bekannt, dass Hefen der Gattung Saccharomyces oder die Hefe Candida utilis sehr sicher sind, da Saccharomyces lang für die Erzeugung von Fermentationsprodukten wie alkoholischen Produkten verwendet wurde und die Hefe Candida utilis für die Erzeugung von Futtermitteln verwendet wurde. Weiterhin kann Hefe allgemein mit einer höheren Zelldichte als Bakterien wie auch auf kontinuierliche Weise kultiviert werden. Hefe sezerniert Proteine in ein Medium und das sezernierte Protein wird durch Glycosylierung modifiziert. Die Produktion von Proteinen durch Hefe ist daher wertvoll, wenn eine solche Modifikation für die biologische Aktivität des Proteins wichtig ist.
Die Hefen, die in die Gattung Saccharomyces klassifiziert werden, wurden besonders intensiv untersucht und genetische Informationen über sie wurde angehäuft. Die Hefen wurden als Wirt zur Erzeugung einer Vielzahl von Substanzen untersucht. Weiterhin wurde eine Transformationstechnologie für einige der Hefen zusätzlich zu Saccharomyces, wie z.B. der Gattungen Pichia, Hansenula, Kluyveromyces und Candida entwickelt und diese Hefen werden jetzt als Wirt zur Erzeugung nützlicher Substanzen untersucht. Unter diesen haben die Hefen, die zur Gattung Candida gehören, inter alia Eigenschaften, die für die praktische Verwendung vorteilhaft sind und die bei Hefen der Gattung Saccharomyces nicht angetroffen werden, wie z.B. ein weites anabolisches Spektrum der Kohlenstoffquelle. Es wird daher erwartet, dass eine Hefe der Gattung Candida für die Erzeugung von nützlichen Substanzen mit rekombinanter DNA-Technologie verwendet werden kann.
Unter den Hefen der Gattung Candida hat Candida utilis eine ausgezeichnete anabolische Fähigkeit gegenüber Pentosen wie Xylose. Zusätzlich erzeugt Candida utilis im Unterschied zu Hefen der Gattung Saccharomyces kein Ethanol in Kultur unter aeroben Bedingungen und so wird das Wachstum dadurch nicht inhibiert. Es ist daher möglich, die Zellen effizient durch eine kontinuierliche Kultur von Candida utilis mit hoher Zelldichte zu erzeugen. Daher wurde Candida utilis als Proteinquelle Aufmerksamkeit gezollt und die industrielle Erzeugung der Hefezelle wurde einmal unter Verwendung einer saccharifizierten Flüssigkeit von breitblättrigen Bäumen oder einer Sulfit-Ablauge, der große Mengen Pentosen enthielt, durchgeführt. Die Hefe Candida utilis wie auch Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces fragilis wurden von der U.S.FDA (Food and Drug Administration) als Hefe autorisiert, die sicher als Nahrungsmitteladditiv verwendet werden kann. Tatsächlich wird Candida utilis selbst jetzt bereits in Futterstoffen in vielen Ländern einschließlich Deutschland, den Vereinigten Staaten von Amerika, Taiwan und Brasilien verwendet und es kann daher gesagt werden, dass ihre Sicherheit bestätigt wurde.
Zusätzlich zu der Verwendung von Candida utilis als mikrobielles Protein wurde sie weit verbreitet in der Industrie als mikrobieller Stamm zur Fermentation von Pentosen oder Xylose oder für die Erzeugung von Ethylacetat, L-Glutamin, Glutathion, Invertase oder ähnlichen verwendet.
Bis jetzt wurde jedoch noch kein Erfolg bei der Transformation der nützlichen Hefe Candida utilis beschrieben oder bewiesen. Das Fehlschlagen der Transformation liegt vermutlich an der extremen Schwierigkeit bei dem Erhalt mutierter Stämme, in die ein selektierbarer Marker, wie z.B. ein geeignetes Nährmittelerfordernis durch eine Mutagenesebehandlung mit einem konventionellen Mutagen wie Nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonsäure eingeführt wurde. Diese Schwierigkeit kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass Candida utilis ein Polyploid ist, wie z.B. mindestens ein Diploid. Dies kann auch von der Tatsache deduziert werden, dass kein Candida utilis-Wirtsstamm mit einer Mutation im korrespondierenden Gen beschrieben wurde, obwohl über das Klonieren von Genen wie ADE1 und LEU2 von Candida utilis, die häufig bei anderen Hefen als selektierbare Marker für die Transformation verwendet wurden, berichtet wurde (Nishiya et al., japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 66089/1992; Kobayashi et al., japanische Patentveröffentlichung Nr. 42673/1989). Dies bedeutet, dass es fast unmöglich ist, Candida utilis einem konventionellen Verfahren zur direkten Selektion einer Transformanten durch Einführung eines komplementären Gens für das Nährstofferfordernis eines Wirtsstamms zu unterziehen, wobei diese Technik für die Entwicklung eines Transformationssystems bei einer Vielzahl von Hefen verwendet wurde.
Außerdem hat Candida utilis eine hohe Ploidie und keine sporenbildende Fähigkeit, so dass seine genetischen Eigenschaften nicht vollständig aufgeklärt werden konnten. So verbleiben die Bedingungen der Transformation wie auch die nötigen Bedingungen für ein Vektorsystem unbekannt, so dass es erwartet werden muss, dass es extrem schwierig ist, das Wirt-/Vektorsystem zu etablieren.
Ho et al. offenbaren eine Überprüfung einer vorläufigen Transformation mit einem arzneimittelresistenten Marker im Hinblick auf Candida utilis (Ho, N. W. Y. et al., Biotechnology and Bioengineering Symp., Nr. 14, 295–301, 1984). Dieser Bericht ist unvollständig, da die Bedingungen des Transformationsexperiments oder die experimentellen Daten, wie z.B. eine Southern-Blot-Analyse der arzneimittelresistenten Transformanten, die für die Verifizierung der Transformation benötigt wird, nicht offenbart sind.
Es ist daher immer noch erwünscht, ein reproduzierbares Transformationssystem im Hinblick auf Candida utilis zu etablieren wie auch eine Produktionstechnologie nützlicher Substanzen unter Verwendung des Systems.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben nun erfolgreich Transformanten von der Hefe Candida utilis auf reproduzierbare Weise erhalten und eine Vielzahl von Informationen im Hinblick auf die Expression heterologer Gene in der Transformante. Die vorliegende Erfindung basiert auf dieser Information.
So ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein reproduzierbares Transformationssystem von Candida utilis bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Gene bereitzustellen, die in dem Candida utilis-Transformationssystem als selektierbare Marker nützlich sind, als Zielsequenzen, an denen ein Plasmid in das Chromosom integriert wird und als neue DNA-Sequenzen, wie z.B. Promotor und Terminator, die für die Expression heterologer Gene nötig sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vektorsysteme bereitzustellen, die die Expression heterologer Gene in Candida utilis möglich machen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Wirt-/Vektorsystem bereitzustellen, in das die multiplen Kopien heterologer Gene stabil integriert werden können.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Expression heterologer Gene in Candida utilis.
Zusätzlich ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von DNA-Fragmenten mit einer autonomen Replikationsfähigkeit und einer Funktion zur Verstärkung der Transformationseffizienz, Plasmidvektoren, die die Fragmente enthalten, ein Verfahren zur Integration eines selektierbaren, markergenfreien DNA-Fragments in das Chromosom mit dem Plasmidvektor, wie auch ein Verfahren zum Erhalt von DNA-Sequenzen mit Promotoraktivität und neue DNA-Sequenzen mit der dadurch erhaltenen Promotoraktivität.
Die erfindungsgemäßen neuen DNA-Sequenzen beinhalten ein Gen, das das ribosomale Protein L41 von Candida utilis codiert und seine Promotor- und Terminatorsequenzen; ein Cycloheximidresistenz-L41-Gen; Promotor- und Terminatorsequenzen des Phosphoglyceratkinase-(PGK)-Gens; Promotor- und Terminatorsequenzen des Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-(GAP)-Gens; Promotor- und Terminatorsequenzen des Plasmamembranenprotonen-ATPase-(PMA)-Gens; das URA3-Gen und seine Promotor- und Terminatorsequenzen; zwei DNA-Fragmente mit einer autonomen Replikationsfähigkeit; Sequenzen mit Promotoraktivität und die ribosomalen RNA-Gene, die die rRNAs von Candida utilis codieren.
Der Vektor, der in dem Transformationssystem von Candida utilis gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umfasst eine Sequenz, die zu der chromosomalen DNA von Candida utilis homolog ist und ein selektierbares Markergen, wobei ein heterologes Gen zur Integration in die chromosomale DNA durch homologe Rekombination fähig ist oder umfasst eine DNA-Sequenz mit einer autonomen Replikationsfähigkeit in Candida utilis und ein selektierbares Markergen, wobei Candida utilis mit hoher Frequenz transformiert wird.
Zusätzlich umfasst der Vektor, der in dem Transformationssystem von Candida utilis gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kein selektierbares Markergen und eine Sequenz, homolog zu der chromosomalen DNA von Candida utilis, worin ein heterologes Gen in die chromosomale DNA durch homologe Rekombination integriert werden kann. Das Plasmid kann bei der Transformation zusammen mit einem Plasmid verwendet werden, das eine DNA-Sequenz umfasst, die eine autonome Replikationsfähigkeit und ein selektierbares Markergen aufweist.
Weiterhin ist das selektierbare Markergen, das in dem Transformationssystem von Candida utilis gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ein arzneimittelresistenter Marker, der in Candida utilis wirken kann, vorzugsweise das L41-Gen, das eine Cycloheximidresistenz verleiht, ein Gen, das eine Resistenz gegen G-418 verleiht oder ein Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin B verleiht.
Weiterhin umfasst das Verfahren zur Expression heterologer Gene in Candida utilis gemäß der vorliegenden Erfindung die Transformation von Candida utilis mit dem Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung, enthaltend das heterologe Gen, die Kultivierung der so erhaltenen Transformante, die Isolation und Reinigung des Expressionsprodukts des heterologen Gens aus der Kultur.
Zusätzlich bezieht sich die Transformante von Candida utilis gemäß der vorliegenden Erfindung auf eine solche, die durch funktionelle Kombination der neuen DNA-Gruppe, der Vektorsysteme und ähnlichen gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 illustriert die Restriktionsenzymkarte, die Strategie zur Bestimmung der DNA-Sequenz von Plasmiden, enthaltend das Phosphoglyceratkinase-(PGK)-Gen und ein Verfahren zum Erhalt der Promotor- und Terminatorfragmente durch PCR;
2 illustriert die DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend den PGK-Terminator;
3 illustriert die DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend den PGK-Promotor;
4 illustriert ein Diagramm zur Konstruktion von Expressionsvektorplasmiden mit dem PGK-Gen-Promotor und Terminator;
5 illustriert die Restriktionsenzymkarten von Plasmiden, enthaltend die ribosomale DNA;
6 illustriert die Struktur der ribosomalen DNA, die Strategie zur Bestimmung der DNA-Sequenzierung und die Struktur subklonierter Plasmide, worin 6(a) die Strukturen der Plasmide pCRE1, pCRE2, pCRE3, pCRX1, pCRX2, pCRX3 und pCRX4 illustriert und 6(b) die Restriktionsenzymkarte eines ungefähr 13,5 kb DNA-Fragments illustriert, enthaltend die ribosomale DNA von Candida utilis;
7 illustriert die Restriktionsenzymkarten von Plasmiden, enthaltend das URA3-Gen und die Komplementationsfähigkeit für die Saccharomyces cerevisiae ura3-Mutation dieser Plasmide;
8 illustriert die Strategie für die Bestimmung der DNA-Sequenz des URA3-Gens und die Restriktionsenzymkarte davon;
9 illustriert die DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend das URA3-Gen;
10 illustriert die Aminosäuresequenz, deduziert von der DNA-Sequenz des URA3-Gens und die DNA-Sequenz der DNA, die sie codiert;
11 illustriert die Fortsetzung von 10, wobei es sich um die Aminosäuresequenz handelt, deduziert von der DNA-Sequenz des URA3-Gens und die DNA-Sequenz der DNA, die sie codiert;
12 illustriert die Restriktionsenzymkarten der Plasmide, enthaltend das L41-Gen und die Strategie zur Bestimmung der DNA-Sequenz;
13 illustriert die DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend das L41-Gen;
14 illustriert die Aminosäuresequenz, deduziert von der DNA-Sequenz des L41-Gens und die DNA-Sequenz der DNA, die sie codiert;
15 illustriert die Konstruktion der Plasmide pLCBS10 und pCLBS12;
16 illustriert die Konstruktion der Plasmide pCLRE2, pCLRE3, pCLRX1 und pCLRX2;
17 illustriert die Ergebnisse der Überprüfung des Verhältnisses lebensfähiger Zellen und der Zahl von Transformanten von ATCC 9950 unter einer Vielzahl von elektrischen Pulsbedingungen;
18 illustriert die Elektrophoresemuster der Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse der DNA des ATCC 9950-Stamms, transformiert mit dem Plasmid pCLRE2;
19 illustriert die Elektrophoresemuster der Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse der DNA der ATCC 9226-, ATCC 9256- und ATCC9950-Stämme, transformiert mit dem Plasmid pCLRE2;
20 illustriert die Konstruktion der Plasmide pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 und pCLRE7;
21 illustriert die Elektrophoresemuster der Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse der DNA des ATCC 9950-Stamms, transformiert mit den Plasmiden pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 und pCLRE7;
22 illustriert die Elektrophorsemuster der Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse der DNA des ATCC 9950-Stamms, transformiert mit dem Plasmid pCLURA1;
23 illustriert die Konstruktion der Plasmide pCLSTA1 und pCLRSTA1;
24 illustriert die Ergebnisse einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des Überstands der Kultur des ATCC 9950-Stamms, transformiert mit dem Plasmid pCLRSTA1;
25 illustriert die Konstruktion der Plasmide pCLLAC1 und pCLRLAC1;
26 illustriert die Konstruktion der Plasmide pCLAPH1 und pCLRAPH1;
27 illustriert die Elektrophoresemuster der Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse der DNA des ATCC 9950-Stamms, transformiert mit dem Plasmid pCLRAPH1, selektiert mit unterschiedlichen arzneimittelresistenten Markern (CYH^r: Cycloheximid-resistent; G418^r: G418-resistent);
28 illustriert die Konstruktion der Plasmide pCRE8, pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4, pCRAPH5 und pCRAPH6;
29 illustriert die Restriktionsenzymkarten der Plasmide, enthaltend das Glyceraldehyde-3-phosphat-dehydrogenase-(GAP)-Gen, die Strategie zur Bestimmung der DNA-Sequenz und das Verfahren zum Erhalt der Promotor- und Terminatorfragmente mit PCR;
30 illustriert die DNA-Sequenz des DNA-Fragments, enthaltend den GAP-Gen-Promotor;
31 illustriert die DNA-Sequenz des DNA-Fragments, enthaltend den GAP-Gen-Terminator;
32 illustriert die Konstruktion von Expressionsvektorplasmiden mit dem GAP-Gen-Promotor und Terminator;
33 illustriert die Restriktionsenzymkarte des Plasmids, enthaltend das Plasmamembranprotonen-ATPase-(PMA)-Gen, die Strategie zur Bestimmung der DNA-Sequenz und das Verfahren zum Erhalt der Promotor- und Terminatorfragmente mit PCR;
34 illustriert die DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend den PMA-Gen-Promotor;
35 illustriert die DNA-Sequenz des DNA-Fragments, enthaltend den PMA-Gen-Terminator;
36 illustriert die Konstruktion der Expressionsvektorplasmide mit dem PMA-Gen-Promotor und Terminator;
37 illustriert die Struktur des Vektors pGKAPH2 zur Klonierung von DNA-Fragmenten, enthaltend ARS;
38 illustriert die Restriktionsenzymkarten von sechs Plasmidinsertions-DNA-Fragmenten, enthaltend ARS;
39 illustriert die Restriktionsenzymkarten von Insertions-DNA-Fragmenten des Plasmids pCARS6 und vier Plasmiden, die subklonierte DNA-Fragmente des Plasmids pCARS6 enthalten;
40 illustriert die Restriktionsenzymkarten von Insertions-DNA-Fragmenten des Plasmids pCARS7 und fünf Plasmiden, die subklonierte DNA-Fragmente des Plasmids pCARS7 enthalten;
41 illustriert die DNA-Sequenz eines inserierten DNA-Fragments des Plasmids pCARS6-2;
42 ist die Fortsetzung der DNA-Sequenzen von 41, die die DNA-Sequenz eines inserierten DNA-Fragments des Plasmids pCARS6-2 illustriert;
43 illustriert die DNA-Sequenz eines inserierten DNA-Fragments des Plasmids pCARS7-6;
44 ist die Fortsetzung der DNA-Sequenzen von 43, die die DNA-Sequenz eines inserierten DNA-Fragments des Plasmids pCARS7-6 illustriert;
45 illustriert die Elektrophoresemuster der Ergebnisse einer Southern-Blot-Analyse von DNA (1) des ATCC 9950-Stamms, transformiert mit dem Plasmid pCARS6 oder pCARS7 und der DNA (2) des ATCC 9950-Stamms, transformiert mit dem Plasmid pCLAC1;
46 illustriert die Elektrophoresemuster der Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse der DNA der ATCC9950, ATCC9226, ATCC9256, KP-2059P und S288C-Stämmen mit CUARS1 (1) und CUARS2 {(2) und (3)} als Sonden;
47 illustriert die Konstruktion des Promotor-Klonierungsvektors pPCV2;
48 illustriert die DNA-Sequenz eines DNA-Fragments mit der Promotoraktivität des Plasmids pPCRV19;
49 illustriert die Konstruktion des Plasmids pGKHPT1 und
50 illustriert die Elektrophoresemuster des Ergebnisses der PCR-Analyse von DNA der ATCC 9950-Stämme, transformiert durch das Co-Transformationsverfahren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Hefe Candida utilis
Spezifische Stämme von Candida utilis, auf die das Transformationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung angewandt werden kann, beinhalten beispielsweise ATCC 9256 (IFO 0626), ATCC 9226 (IFO 1086), ATCC 9950 (IFO 0988), IFO 0396, IFO 0619, IFO 0639 und KP-2059P.
Es wurde auch berichtet, dass Elektrophoresemuster von Chromosomen innerhalb der Stämme von Candida utilis variieren und der Polymorphismus zeigt sich in der Länge der Chromosomen [Stoltenburg et al., Curr. Genet., 22, 441–446 (1992)]. Es wurde erwartet, dass das erfindungsgemäße Transformationssystem in seiner Anwendung aufgrund dieses Polymorphismus begrenzt ist. Es wurden jedoch Transformanten erhalten und die Expression von heterologen Genen wurde ebenfalls bestätigt, mit jedem der in den Beispielen, wie unten beschrieben, drei verwendeten Stämme, während ein chromosomaler Polymorphismus bei den drei Stämmen beobachtet wurde. Es würde von einem Fachmann auf dem Gebiet vorhergesagt werden, das das Transformationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung auf Candida utilis im Ganzen anwendbar ist.
Transformationssystem
Um ein Transformationssystem von Organismen zu entwickeln, werden im allgemeinen drei Elemente benötigt, (a) ein selektierbares Markergen, um Transformanten zu selektieren und ein Verfahren zur Selektion der Transformanten, (b) eine autonom replizierbare DNA-Sequenz (ARS), die für die Gegenwart einer Plasmid-DNA als ein Episom in einer Wirtszelle benötigt wird oder die homologe Sequenz einer geeigneten chromosomalen DNA, die benötigt wird, um ein Plasmid effizient in ein Chromosom zu integrieren (d.h. das Etablieren eines Ziels zur Integration der Plasmid-DNA) und (c) ein Verfahren, um eine Wirtszelle zu befähigen, eine extranukleäre DNA aufzunehmen. Alle drei Elemente sind für den Erhalt von Transformanten nötig. Es war daher essenziell, alle diese Elemente zum Etablieren des Transformationssystems von Candida utilis zu überprüfen und zu entwickeln, wobei nur wenige genetische Informationen zur Verfügung standen.
(a) Selektierbare Markergene und Selektion von Transformanten
Wenn ein auxotropher Mutant, erhalten durch eine Mutationsbehandlung, als Wirt verwendet werden kann, kann ein Gen, das die Auxotrophie komplementiert, als selektierbares Markergen verwendet werden, um Transformanten zu selektieren. In diesem Fall ist es möglich, Transformanten direkt in dem Minimalmedium zu selektieren, das von dem Nährstoff frei ist. Im Fall von Candida utilis war es jedoch unmöglich, ein Transformationssystem unter Verwendung eines auxotrophen komplementären Gens als selektierbaren Marker zu entwickeln, da es sehr schwierig ist, einen mutierten Stamm zu erhalten, dem eine geeignet selektive Markierung, wie z.B. eine Auxotrophie, zugefügt worden war.
Die gegenwärtigen Erfinder haben festgestellt, dass Candida utilis gegenüber Arzneimitteln, wie dem Antibiotikum G418, Hygromycin B oder Cycloheximid empfindlich ist und es ist möglich, das Wachstum zu unterdrücken, indem diese Arzneimittel dem Medium zugefügt werden. Die gegenwärtigen Erfinder haben so versucht, ein Gen zu verwenden, das gegenüber diesen Arzneimitteln eine Resistenz verleihen würde.
Wenn so ein Gen verwendet wird, das von einem anderen Organismus abstammt, wie z.B. das G418-Resistenzgen (Aminoglycosidphosphotransferasegen) oder das Hygromycin B-Resistenzgen (Hygromycin-B-Phosphotransferasegen) wird es bevorzugt, transkriptionelle Promotor- und Terminatorsequenzen zu verwenden, die in Candida utilis wirksam sind, um die Expression des Gens sicherzustellen.
Bei einigen der Hefen der Candida-Gattung, wie z.B. Candida albicans, wurde es beschrieben, dass einige der Codons mit einem anderen Modus translatiert werden als bei anderen Organismen (Ohama et al., Nucleic Acids Res., 21, 4039– 4045, 1993). So kann ein heterologes Gen, das als selektierbares Markergen verwendet wird, nicht immer in ein Protein translatiert werden, das seine Funktion im Wirt ausübt. Andererseits wurde die sehr interessante Tatsache beschrieben, dass die Empfindlichkeit gegenüber Cycloheximid durch einen Aminosäurerest an der 56ten-Stellung des ribosomalen L41-Proteins bestimmt wird [Kawai et al., J. Bacteriol., 174, 254–262 (1992)].
Die gegenwärtigen Erfinder haben so ein Gen des L41-Proteins von Candida utilis erhalten, das gegenüber Cycloheximid empfindlich ist, haben das Gen in das Cycloheximidresistenz-Gen durch das ortsspezifische Mutationsverfahren umgewandelt und haben es als selektierbares Markergen verwendet. Da das Gen von dem Wirt abstammte, wurde das Gen direkt mit den eigenen Promotor- und Terminatorsequenzen für die Expression verwendet. Daher ist diese Ausführungsform in dem Punkt sehr vorteilhaft, dass das Gen für die Expression auf sichere Weise vorhersagbar ist.
So ist der Arzneimittelresistenz-Genmarker, der als selektierbarer Marker in dem Transformationssystem von Candida utilis gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, vorzugsweise ein Cycloheximidresistenz-L41-Gen. Die DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend das L41-Gen wie auch die Promotor- und Terminatorsequenzen, sind in 13 dargestellt (SEQ ID NO: 5) und die von der DNA-Sequenz deduzierte Aminosäuresequenz ist in 14 dargestellt (SEQ ID NO: 6). Das Cycloheximidresistenz-L41-Gen hat eine Sequenz, die in 13 dargestellt ist, worin das 1644te Nukleotid C in A umgewandelt wurde und die 56te Aminosäure, Pro, in der in 14 dargestellten Sequenz in Gln umgewandelt ist.
Zusätzlich ist ein anderer bevorzugter Arzneimittelresistenz-Genmarker, der in dem Transformationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, das Aminoglycosidphosphotransferase-(APT)-Gen, das eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 verleiht. Als Aminoglycosidphosphotransferase-(APT)-Gen sind zwei APT-Gene, abstammend von dem Transposon Tn903 und dem Transposon Tn5, auf dem Gebiet bekannt und beide können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es ist auch möglich, das Hygromycin B-Phosphotransferasegen zu verwenden, abstammend von E. coli, das eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Hygromycin B in dem Transformationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung verleiht. Im Fall dieser heterologen Gene, wie z.B. dem G418-Resistenzgen oder einem Hygromycinresistenzgen, werden der transkriptionelle Promotor und Terminator, die in Candida utilis für die genetische Expression wirken, vorzugsweise 5'-stromaufwärts bzw. 3'-stromabwärts vom heterologen Gen integriert.
Die Promotor- und Terminatorsequenzen für die Transkription stammen vorzugsweise von dem Gen von Candida utilis ab. Es ist möglich, die Promotor- und Terminatorsequenzen des Phosphoglyceratkinase-(PGK)-Gens, die Promotor- und Terminatorsequenzen des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase-(GAP)-Gens und die Promotor- und Terminatorsequenzen des Plasmamembranproton-ATPase-(PMA)-Gens in Candida utilis, wie hiernach beschrieben, zu verwenden. Es ist auch möglich, die DNA-Sequenzen mit einer Promotoraktivität zu verwenden, die mit einem Vektor zum Klonieren von Promotoren, wie hiernach beschrieben, erhalten wurde.
Zusätzlich beinhalten die anderen Promotor- und Terminatorsequenzen, die in dem oben beschriebenen System verwendet werden können, Promotor- und Terminatorsequenzen der Gene in Candida utilis, homolog zu wohlbekannten Genen, wie z.B. ADH, ENO, GAL und SUC bei der Hefe der Gattung Saccharomyces.
Weiterhin beinhalten Arzneimittelresistenzgene, abstammend von Bakterien, die als selektierbare Marker für die Transformanten verwendet werden können, zusätzlich zu dem oben beschriebenen G418-Resistenzgen und einem Hygromycin-B-Phosphotransferasegen Antibiotika-Resistenzgene, wie z.B. das Chloramphenicolacetyltransferasegen (Chloramphenicol-Resistenz) (Hadfield, C. et al., Gene, 45, 149–158 (1986)), die Blasticidindeaminase (Blasticidin-Resistenz) (Izumi, M. et al., Exp. Cell Res., 197, 229–233 (1991)) und das Phleomycin-Resistenzgen (Wenzel, T.J. et al., Yeast, 8, 667–668 (1992)). Zusätzlich können wohlbekannte Arzneimittelresistenz-Gene, wie z.B. Dihydrofolat-Reduktasegen (Methotrexat-Resistenz) (Miyajima, A. et al., Mol. Cell Biol., 4, 407–414 (1984)), das Methylsulfometuron-Resistenzgen, das ein dominantes Gen ist, abstammend von Hefe (Casye, G.P. et al., J. Inst. Brew., 94, 93–97 (1988)), das CUP1-Gen (Kupfer-Resistenz) (Henderson, R.C.A. et al., Current Genet., 9, 133–138 (1985)) und das CYH2-Gen (Cycloheximidresistenz) (Delgado, M. et al., EBC Congress, 23, 281–288 (1991)) verwendet werden. Wenn das Markergen von einem heterologen Organismus abstammt, wie z.B. Bakterien oder einem Transposon, wird es bevorzugt, Promotor- und Terminatorsequenzen zu verwenden, die in Candida utilis, wie oben beschrieben, wirken.
(b) Etablieren von Zielen zur Integration von Plasmid-DNA
Wie oben beschrieben, wird es vorhergesagt, dass eine Vielzahl von Sequenzen, abstammend von Candida utilis, zusätzlich zu denjenigen Sequenzen, die oben beschrieben wurden, als Zielsequenzen verwendet werden können, da anwendbare selektierbare Marker, wie z.B. das Cycloheximidresistenz-L41-Gen, gemäß der vorliegenden Erfindung etabliert wurden.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass das Gen, codierend ribosomale RNA (rDNA), das URA3-Gen, das L41-Gen und das PGK-Gen vorzugsweise als geeignete chromosomale DNA-Fragmente verwendet werden können, die zur Integration eines Plasmids in ein Chromosom benötigt werden.
Im Hinblick auf das rRNA-Gen wurde beschrieben, dass 100 Kopien oder mehr rDNA in Tandem auf dem Chromosom von Saccharomyces cerevisiae vorliegen und eine autonom sich replizierende Sequenz (ARS) in der sich wiederholenden Einheit vorliegt (Saffer & Miller, JR. Molec. Cell. Biol., 6, 1148–1157 (1986)). Es wurde auch beschrieben, dass die Frequenz der integrativen Transformation erhöht werden kann, indem die rDNA-Region als Ziel zur Integration eines Plasmids verwendet wird (Lopes, et al., Gene, 79, 199–206 (1989)).
Die gegenwärtigen Erfinder haben festgestellt, dass rDNA wiederholt auf dem Chromosom von Candida utilis vorliegt. Es wurde so angezeigt, dass die rDNA von Candida utilis als Zielsequenz zur Integration mit hoher Frequenz verwendet werden kann und tatsächlich wurde die rDNA vorteilhafterweise als Rekombinationsziel in dem Transformationssystem von Candida utilis verwendet.
Interessanterweise wurde beobachtet, dass, wenn die Hefe Candida utilis mit dem Vektorsystemen gemäß der vorliegenden Erfindung, wie unten beschrieben, transformiert wurde, die auf das Chromosom von Candida utilis abzielen, wie z.B. das rRNA-Gen, das URA3-Gen, das L41-Gen oder das PGK-Gen, ein DNA-Fragment in das Chromosom integriert und in der Hefe stabil zurückgehalten wurde. Es ist so möglich, das Problem einer Instabilität eines heterologen Gens in dem Fall auszuschließen, dass ein heterologes Gen als extrachromosomales Plasmid zurückgehalten wird, das sich autonom repliziert.
Es wurde als Ergebnis der intensiven Analyse der Art und Weise, in der DNA-Fragmente in Transformanten integriert werden, festgestellt, dass die DNA-Fragmente in das Chromosom von Candida utilis im wesentlichen durch homologe Rekombination integriert werden. Dies bedeutet, dass ein DNA-Molekül, enthaltend eine DNA-Sequenz, die zu der chromosomalen Zielsequenz eines Wirts eine Homologie aufweist, in ein chromosomales Ziel integriert werden kann.
Spezifisch ist es möglich, ein DNA-Fragment an jeder Zielsequenz auf dem Chromosom von Candida utilis zu integrieren, wenn der Vektor, enthaltend das DNA-Fragment, an einer geeigneten Restriktionsstelle in der DNA-Sequenz verdaut wird, homolog zu der Zielsequenz, um zu einer linearen Plasmid-DNA zu werden. In diesem Fall werden Transformanten, worin eine Vielzahl von Plasmidmolekülen integriert wurden, gleichzeitig effizient, wie unten beschrieben, selektiert, wenn das Cycloheximidresistenz-L41-Gen als selektierbarer Marker verwendet wird.
Es ist auch möglich, ein lineares DNA-Fragment in der Form zu verwenden, dass ein selektierbarer Marker innerhalb einer DNA-Sequenz mit einer Homologie zu einer chromosomalen Zielsequenz enthalten ist.
Bei der Transformation dieser Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird das DNA-Fragment in das Chromosom inseriert und ersetzt das homologe Gen auf dem Chromosom. So werden auf diese Weise keine sich wiederholenden Sequenzen der Zielsequenz stromaufwärts und stromabwärts von dem inserierten DNA-Fragment gebildet. Es wird erwartet, dass die integrierte DNA eine höhere Stabilität aufweist.
Zusätzlich hat die vorliegende Erfindung gezeigt, dass das URA3-Gen, das L41-Gen und das PGK-Gen, die in nur zwei Kopien pro Zelle vorliegen, wie auch viele andere Gene, als Ziel zur Integration eines DNA-Fragments verwendet werden können. Im allgemeinen enthalten Hefen 100 Kopien oder mehr repetitive DNA-Einheiten, enthaltend rRNA-Gene von 18S, 5,8S, 25S und 5S pro Haploid (Schweizer, E. et al., J. Mol. Biol., 40, 261–277 (1969)). Daher ist die Verwendung der rDNA als Zielsequenz der Rekombination gegenüber der Verwendung anderer Gensequenzen in den folgenden Punkten vorteilhaft, dass nämlich (1) die Frequenz der Transformation erhöht sein sollte und (2) die Veränderung der Zielsequenz durch Integration vernachlässigbar ist. Die gegenwärtigen Erfinder haben gezeigt, dass die rRNA-Gene repetitiv in Tandem in einer sich wiederholenden Einheit von ungefähr 13,5 kb DNA-Sequenz auch in Candida utilis vorliegen (im Detail unten beschrieben) und dass die Transformationsfrequenz um das 10- bis ungefähr 50fache durch Verwendung der rDNA-Sequenz als Zielsequenz der Rekombination im Vergleich mit dem Fall des L41-Gens mit 2 Kopien pro Zelle als Ziel erhöht ist. Es wurde auch gezeigt, dass DNA-Fragmente in dem rDNA-Lokus eine hohe Stabilität aufweisen und die rDNA-Sequenz ein ausgezeichnetes Ziel für die Integration ist.
Die Verwendung der rDNA-Sequenz als Zielsequenz für die Integration eines DNA-Fragments gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine Wirkung zur Erhöhung der Transformationsfrequenz hervorgerufen und spielte eine wichtige Rolle für die Entdeckung einer geeigneten Transformationsbedingung unter den untersuchten Behandlungsbedingungen für Hefe. Es wurde jedoch interessanterweise festgestellt, dass die Transformationsfrequenz sich deutlich vermindert, wenn einige der rDNA-Regionen als Ziel für die Transformation verwendet werden. Es wurde gezeigt, dass nicht jedes der rDNA-Fragmente immer als Ziel für eine effiziente Integration von Plasmiden verwendet werden kann.
Gemäß einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Transformanten mit einer Vielzahl von darin integrierten Plasmiden effizient unter Verwendung des Cycloheximidresistenz-L41-Gens als selektierbaren Marker erhalten werden. Der Grund wird als der Folgende angesehen. Nur wenn eine Vielzahl von Kopien von DNA-Fragmenten, enthaltend die Cycloheximidresistenz-L41-Gene integriert werden, erhöht sich das Verhältnis von Ribosomenmolekülen, worin die endogenen Cycloheximidempfindlichen L41-Proteine durch die korrespondierenden resistenten Proteine ersetzt sind und die im Hinblick auf die Funktionen durch Cycloheximid nicht inhibiert sind. Es wird so angenommen, dass die Tranformante in dem Medium, das Cycloheximid enthält, wachsen kann. Als Zielstelle für die Integration in diesem Fall kann im Grunde irgendeine der Sequenzen verwendet werden, die von dem Chromosom von Candida utilis abstammt, wie z.B. der URA3-Gen-Lokus, der L41-Gen-Lokus oder ähnlichen. Es wurde interessanterweise auch dargestellt, dass mehr DNA-Fragmente zu einer Integration neigen, wenn der rRNA-Gen-Lokus inter alia als Zielsequenz für die Integration verwendet wird, im Vergleich zu anderen Gen-Loki als Zielsequenzen.
(c) Transformationsverfahren
Als Transformationsverfahren, das eine Wirtszelle dazu befähigt, eine extrazelluläre DNA einfach aufzunehmen, können die konventionellen Verfahren der Transformation von Saccharomyces cerevisiae, wie z.B. das Protoplastenverfahren, das Lithiumacetatverfahren, das elektrische Pulsverfahren und Modifikationen davon verwendet werden. Während das Protoplastenverfahren weit verbreitet verwendet wird, ist es in seinem Betrieb recht kompliziert und führt häufig zu Problemen von Hintergrundkolonien als Nicht-Transformanten bei der Selektion von Transformanten, basierend auf einer Arzneimittelresistenz.
Die gegenwärtigen Erfinder haben das Lithiumacetatverfahren und das elektrische Pulsverfahren verwendet, um eine Transformation von Candida utilis mit einem Plasmid als Kombination des Cycloheximidresistenz-L41-Gens und des rDNA-Fragments, wie oben beschrieben, zu versuchen und haben die Bedingungen gefunden, unter denen Transformanten reproduzierbar erhalten werden können.
Die Transformation wird vorzugsweise durch das elektrische Pulsverfahren durchgeführt. Die Zellen werden bis in die logarithmische Phase gezüchtet und dann gewaschen und in 1M Sorbit suspendiert. Die Bedingungen des elektrischen Pulses beinhalten einen zeitkonstanten Wert (Zeitspanne zur Abschwächung der Spannung auf ungefähr 37 % des Maximums) von ungefähr 10 bis 20 Millisekunden und ein lebensfähiges Zellverhältnis nach dem Puls von ungefähr 10 bis 40 %. Es wurde beispielsweise gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass der oben beschriebene Zeitkonstantenwert und das lebensfähige Zellverhältnis unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, eines Widerstands von 600 bis 1.000 Ω und einer Spannung von 3,75 bis 5 KV/cm erhalten wurden und es wurden ungefähr 500 bis 1.400 Transformanten pro 1 μg DNA erhalten.
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass nach Anwendung eines elektrischen Pulses ein YPD-Medium, enthaltend 1 M Sorbit, vorzugsweise der Zelllösung zugefügt wird und die Mischung durch Schüttelkultivierung kultiviert wird. Es wurde auch festgestellt, dass wenn die Zellen ohne Kultivierung direkt auf eine Selektivplatte, enthaltend Cycloheximid, verteilt werden, in einigen Fällen keine Kolonie erhalten wird. Die Kultivierungszeit liegt ungefähr im Bereich von ungefähr 4 bis 6 Stunden und wenn die Zellen weiter kultiviert werden, kann das Wachstum der Transformanten nicht vernachlässigbar sein. Weiterhin wird es bevorzugt, dass die Transformation gemäß der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Transformationsfrequenz durch Zugabe einer Träger-DNA, wie z.B. Lachssperma-DNA, bei Kontakt der DNA und der Zellen oder durch Zugabe von Polyethylenglycol bevorzugt wird.
Das Lithiumacetatverfahren (Ito et al., J. Bacteriol., 153, 163–168, 1983) wurde extensiv bei der Transformation einer Hefe der Gattung Saccharomyces verwendet, da es einfach und unkompliziert durchführbar ist. Außerdem wurde eine Vielzahl von Modifikationen beschrieben. Wir haben bestätigt, dass Candida utilis mit diesen Verfahren transformiert werden kann. Insbesondere wird es bevorzugt, Candida utilis mit dem modifizierten Lithiumverfahren zu transformieren, bei dem Ethanol zugefügt wird (Soni et al., Current Genet., 1993, 24, 455–459). Es ist auch möglich, die optimalen Bedingungen für die Transformation von Candida utilis durch das Lithiumacetatverfahren zu bestimmen und die Transformationsfrequenz zu erhöhen, indem unterschiedliche Bedingungen, wie z.B. die Zelldichte beim Sammeln der Zellen, die Lithiumkonzentrationen, Arten und Konzentrationen von Polyethylenglycol und Arten, Formen oder Mengen der Träger-DNA verwendet werden. Diese Verfahren werden von einem Fachmann auf dem Gebiet vorhergesehen, da (a) die selektierbaren Markergene gemäß der vorliegenden Erfindung und (b) die Integrationsziele so definiert wurden.
Zusätzlich haben wir versucht, eine Transformation mit Plasmiden, enthaltend eine Kombination aus acht ARS-Sequenzen, abstammend von Candida utilis, die in Saccharomyces cerevisiae wirken und einer G418-Resistenzgenexprimierenden Einheit, die in Saccharomyces cerevisiae wirkt, durchzuführen, haben jedoch keine Transformante erhalten. Die Reproduzierbarkeit der Transformation von Candida utilis, wie beschrieben von Ho et al. (Ho, N.W.Y. et al., oben) ist so aufgrund dieses Ergebnisses zweifelhaft.
Expressionsvektorsysteme und Expression heterologer Gene
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Expressionssysteme bereitgestellt, die für die Transformation von Candida utilis verwendet werden können.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Plasmid-DNA, die eine Sequenz umfasst, die zu einer chromosomalen DNA von Candida utilis homolog ist (hiernach bezeichnet als "homologe DNA-Sequenz"), die die Integration der Plasmid-DNA in das Chromosom durch homologe Rekombination an diesem Teil möglich macht und einen selektierbaren Marker für die Selektion der Transformanten.
Die homologe DNA-Sequenz beinhaltet vorzugsweise das rRNA-Gen, das URA3-Gen, das L41-Gen, das PGK-Gen, das GAP-Gen und das PMA-Gen, die vorzugsweise von der chromosomalen DNA von Candida utilis abstammen. Es ist möglich, ein heterologes Gen in eine gewünschte Position eines Chromosoms, abhängig von den verwendeten Sequenzen zu integrieren. Das Plasmid wird in linearer Form durch einen Verdau an einer geeigneten Restriktionsstelle innerhalb der homologen DNA-Sequenz des Plasmidmoleküls verwendet. Im Ergebnis ist das Plasmid-DNA-Fragment in das Chromosom von Candida utilis durch homologe Rekombination integriert.
Zusätzlich wird gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die DNA-Sequenz, enthaltend ein Markergen und ein heterologes Gen, an ihren beiden Enden zwischen der homologen DNA-Sequenz in der Plasmid-DNA inseriert. In dieser Ausführungsform wird die Plasmid-DNA an der homologen DNA-Sequenz mit einem Restriktionsenzym zum Erhalt eines DNA-Fragments, umfassend ein Markergen, ein heterologes Gen und die homologe DNA-Sequenz an beiden Enden des Fragments geschnitten. Das so erhaltene DNA-Fragment kann auch durch homologe Rekombination in die chromosomale DNA von Candida utilis integriert werden.
Die Bezeichnung "das so erhaltene DNA-Fragment wird in das Chromosom von Candida utilis durch homologe Rekombination integriert", wie hier verwendet, bezeichnet eine Bedeutung, die mindestens die beiden folgenden Ausführungsformen enthält, wobei die Ausführungsform zur Integration nicht begrenzt ist, solange das DNA-Fragment in das Chromosom von Candida utilis integriert wird. Das heißt, die Bezeichnung bezieht sich entweder auf die Bedeutung (1) einer Ausführungsform, wobei in eine chromosomale DNA integriert wird, indem eine homologe Rekombination zwischen der DNA-Sequenz des Chromosoms von Candida utilis und homologen DNA-Sequenzteilen an beiden Enden des DNA-Fragments ausgelöst wird, das in den gespaltenen Bereichen "inseriert" wird und (2) einer Ausführungsform, wobei in eine chromosomale DNA durch "Ersatz" eines Teils des Chromosoms von Candida utilis durch das Plasmid-DNA-Fragment durch die homologe Rekombination der DNA-Sequenz des Chromosoms von Candida utilis und den homologen DNA-Sequenzen, vorgesehen an den beiden Enden des Plasmid-DNA-Fragments, integriert wird. Bei der Ausführungsform (2) sollte das integrierte DNA-Fragment stabil im Chromosom vorliegen, da die repetitiven Sequenzen der Zielsequenz an den beiden so inserierten Enden nicht gebildet werden.
Es wird auch bevorzugt, den oben beschriebenen Arzneimittelresistenz-Marker als selektierbares Markergen zu verwenden und noch bevorzugtere Arzneimittelresistenz-Marker beinhalten ein Gen, das eine Resistenz gegenüber Cycloheximid verleiht, wie z.B. das Cycloheximidresistenz-L41-Gen, ein Gen, das eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 verleiht, wie z.B. das APT-Gen, abstammend von dem bakteriellen Transposon Tn903 und das Antibiotika Hygromycin B-Resistenzgen. Wenn das selektierbare Markergen von Mikroorganismen abstammt, wird es bevorzugt, es mit einem Promotor zu ligieren, der in Candida utilis wirkt, um die Expression sicherzustellen.
Der Vektor gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Plasmid-DNA, die eine Sequenz umfasst, die zu einer chromosomalen DNA von Candida utilis homolog ist (homologe DNA-Sequenz), und die die Integration der Plasmid-DNA in das Chromosom durch homologe Rekombination an diesem Teil ermöglicht, jedoch kein selektierbarer Marker für die Selektion von Transformanten. Das Plasmid wird in linearer Form durch Verdau an einer geeigneten Restriktionsstelle innerhalb der homologen DNA-Sequenz des Plasmidmoleküls verwendet.
Bei dem Plasmid dieser Ausführungsform kann das Plasmid so konstruiert werden, dass die DNA-Sequenz, enthaltend ein heterologes Gen, an ihren beiden Enden zwischen den homologen DNA-Sequenzen inseriert ist. Ein DNA-Fragment, das an seinen beiden Enden homologe DNA-Sequenzen aufweist, wird erhalten, indem die Plasmid-DNA an der homologen DNA-Sequenz mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden. Das DNA-Fragment kann auch in die chromosomale DNA von Candida utilis durch homologe Rekombination integriert werden.
Das DNA-Fragment in linearer Form wird in das Chromosom von Candida utilis durch homologe Rekombination auf dieselbe Weise wie im Fall einer Plasmid-DNA, umfassend ein Markergen, integriert. Es wird auch bei dem Plasmid dieser Ausführungsform vorhergesagt, dass das integrierte DNA-Fragment in einem Chromosom durch die gemäß der Ausführungsform (2) oben beschriebene durchgeführte Integration stabil vorliegt.
Die homologe DNA-Sequenz beinhaltet vorzugsweise das rRNA-Gen, das URA3-Gen, das L41-Gen, das PGK-Gen, das GAP-Gen und das PMA-Gen. Diese Gene stammen vorzugsweise von der chromosomalen DNA von Candida utilis ab. Es ist auch möglich, ein Fremd-DNA-Fragment an einer gewünschten Position auf einem Chromosom, abhängig von den verwendeten Sequenzen, zu integrieren.
Der Vektor wird bei der Transformation simultan mit einem Plasmid verwendet, das eine DNA-Sequenz aufweist, die eine autonom sich replizierende Sequenz, wie unten beschrieben, enthält und ein selektierbares Markergen. Es ist möglich, sekundär einen Stamm zu selektieren, wobei das selektierbare Markergen-freie DNA-Fragment in das Chromosom unter Transformanten integriert wurde, die selektiert wurden durch Aufweisen des autonom replizierbaren Plasmids darin. Das in dem selektierten Stamm vorliegende Plasmid kann durch Kultivierung der Zelle unter nicht-selektiven Bedingungen fallen gelassen werden. Im Ergebnis kann ein Stamm, der sich nur das inserierte DNA-Fragment auf dem Chromosom erhält, erhalten werden. Mit dieser Technik wird es möglich, beispielsweise einen Stamm zu züchten, der sich nur ein heterologes Gen erhält und frei von Extrasequenzen ist, wie z.B. einem Arzneimittelresistenz-Gen, das von Mikroorganismen abstammt.
Weiterhin kann ein Plasmid mit einer DNA-Sequenz, enthaltend die sich autonom replizierende Sequenz und ein selektierbares Markergen als Vektor für die Transformation der Hefe Candida utilis verwendet werden. Das Plasmid neigt dazu, durch Kultivierung der Zelle unter nicht-selektiven Bedingungen fallen gelassen zu werden, jedoch kann ein DNA-Fragment zur Erhöhung der Stabilität, wie unten beschrieben, erhalten werden, so dass das Plasmid in Kombination mit dem DNA-Fragment als Vektor verwendet werden kann.
Der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit einem heterologen Gen zur Bildung eines Vektors verbunden werden, der das heterologe Gen darin enthalten aufweist. Durch Transformation von Candida utilis mit dem Vektor kann das heterologe Gen stabil in das Chromosom von Candida utilis integriert werden. Die so erhaltene Transformante kann in einem geeigneten Medium zum Erhalt des Kulturprodukts kultiviert werden, woraus das Expressionsprodukt des heterologen Gens durch ein für das Expressionsprodukt geeignetes Verfahren isoliert und gereinigt wird. Das heißt, das heterologe Gen kann Candida utilis exprimiert werden. Das Verfahren zur Expression eines heterologen Gens in Candida utilis wird bereitgestellt. In diesem Kontext bezieht sich die Bezeichnung heterologes Gen allgemein auf ein Gen oder eine DNA als ein Teil davon, die ursprünglich auf dem Chromosom von Candida utilis als Wirt nicht vorliegt.
Das heterologe Gen wird vorzugsweise mit einem regulatorischen Bereich kombiniert, der unabhängig die Expression des heterologen Gens reguliert oder unter dem Einfluss des regulatorischen Bereichs des Gens, unterbrochen durch den Prozess der Transformation, exprimiert wird. Solche Sequenzen sollten in Candida utilis wirken und beinhalten vorzugsweise beispielsweise die Promotor- und Terminatorsequenz des PGK-Gens, des GAP-Gens und des PMA-Gens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie unten beschrieben und DNA-Sequenzen mit einer Promotoraktivität, erhalten durch einen Vektor zur Klonierung des Promotors, unten beschrieben.
Wie sich aus den unten beschriebenen Beispielen ergibt, wurden heterologe Gene, wie z.B. das Glucoamylasegen, das Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gen, das β-Galactosidase-Gen und das Hygromycin-B-Phosphotransferase-Gen erfolgreich mit der Promotor- und der Terminatorsequenz des Phosphoglycerat-Kinase-Gens gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert. Ein Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gen wurde ebenfalls erfolgreich mit den Promotor- und Terminatorsequenzen des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase-Gens wie auch mit den Promotor- und Terminatorsequenzen des Plasmamembran-Protonen-ATPase-Gens exprimiert. Unter diesen heterologen Proteinen ist Glucoamylase ein sezerniertes Protein und Aminoglycosid-Phosphotransferase und β-Galactosidase sind intrazelluläre Enzyme. Das bedeutet, dass ein heterologes Protein in entweder intrazellulärer oder sezernierter Proteinform in Candida utilis erzeugt werden kann. Weiterhin wird auch eine Glucoamylase mit hohem Niveau sezerniert und exprimiert und es kann festgestellt werden, dass Candida utilis ein exzellenter Wirt für eine hohe Produktion eines heterologen Proteins ist.
Weiterhin wurde beschrieben, dass in einigen Hefen der Gattung Candida, wie z.B. Candida maltosa oder Candida albicans, ein Teil der Codons auf eine unterschiedliche Weise translatiert werden als bei anderen Organismen (Ohama et al., Nucleic Acids Res., 21, 4039–4045 (1993)). Dies wird als der Grund interpretiert, warum das Expressionsprodukt des β-Galactosidasegens, abstammend von E. coli, das in Candida maltosa als Wirt exprimiert wurde, keine Aktivität ausübt. Wie aus den untenstehenden Beispielen deutlich wird, erhielt sich ein β-Galactosidase-Genprodukt, abstammend von E. coli, das in Candida utilis erzeugt wurde, seine Aktivität. Dies zeigt, dass Candida utilis Codons auf normale Weise erkennt und dass Candida utilis ein bevorzugter Wirt bei der Produktion eines heterologen Polypeptids ist.
Es ist auch möglich, die Eigenschaften von Candida utilis durch Expression eines heterologen Gens in Candida utilis zu modifizieren. So wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines neuen Candida utilis-Stamms bereitgestellt. Beispielsweise ist es möglich, seine Fermentationseigenschaften zur Erhöhung seiner gewerblichen Nutzbarkeit zu verbessern. Insbesondere wird ein Candida utilis-Stamm, der zur Expression eines Glucoamylase-Gens modifiziert ist, eine Stärke-verdauende Fähigkeit aufweisen, d.h. sein Kohlenstoffquellenspektrum hat sich erweitert.
Weiterhin kann der erfindungsgemäße Vektor bei der Transformation von anderen Zellen als Candida utilis verwendet werden. Wenn eine andere Zelle als Candida utilis als Wirt verwendet wird, wird vorzugsweise ein DNA-Fragment, das für die Durchführung der Transformation geeignet ist, gewählt. Das DNA-Fragment beinhaltet beispielsweise eine bakterielle Plasmid-DNA, wie z.B. pBluescript oder pUC19 im Fall von E. coli. Das DNA-Fragment beinhaltet beispielsweise im Fall einer Hefe der Gattung Saccharomyces einen Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor, wie z.B. YEp13 oder YCp50 (Methods in Enzymology, 194, S. 195–230, Academic Press (1991)).
Verfahren zum Klonieren von DNA-Sequenzen mit einer autonomen Replikationsfähigkeit in der Hefe Candida utilis
Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Klonieren der DNA-Sequenz mit einer autonomen Replikationsfähigkeit in Candida utilis bereitgestellt. Die verwendete DNA, die von irgendwelchen Organismen abstammen kann, ist vorzugsweise von Candida utilis abgeleitet. Als Vektor für dieses Verfahren kann ein Vektor, enthaltend ein Arzneimittelresistenz-Markergen, verwendet werden. Bevorzugte Beispielen beinhalten einen Vektor, enthaltend das APT-Gen, wobei es sich um ein G418-Resistenzgen handelt und es wird durch einen Promotor und einen Terminator exprimiert, die in Candida utilis wirken. Spezifisch wird ein Plasmid mit dem APT-Gen, das durch den PGK-Gen-Promotor exprimiert wird, als Vektor verwendet, um eine genomische DNA-Bibliothek der Candida utilis-Hefe herzustellen und Candida utilis wird mit der Bibliothek-DNA transformiert. Gesamt-DNA wird aus einer transformierten Hefe extrahiert, gewählt auf der Basis einer Resistenz gegen G418. E. coli wird mit der DNA transformiert, so dass die Plasmid-DNA, die in der transformierten Hefe als extrachromosomaler Faktor vorliegt, gewonnen werden kann. Funktionelle Sequenzen als autonom sich replizierende Sequenz (ARS) werden aus dem chromosomalen DNA-Fragment, abstammend von Candida utilis, inseriert in die Plasmid DNA, isoliert.
Überraschend wurde festgestellt, dass wenn ein Plasmid, enthaltend das Cycloheximidresistenz-L41-Gen als Marker der Resistenz gegen ein Arzneimittel als Vektor verwendet wird, jede DNA-Sequenz mit autonomer Replikationsfähigkeit kloniert werden konnte. Anders ausgedrückt wurde selbst dann, wenn das Plasmid zur Herstellung einer Candida utilis Hefe-genomischen DNA-Bibliothek verwendet wurde und Candida utilis mit der Bibliothek-DNA transformiert wurde, keine Cycloheximidresistente Transformante erhalten. Dies zeigt an, dass die ARS von Candida utilis ein Merkmal zur Erzeugung einer geringen Anzahl von Kopien pro Zelle des Plasmid, dieses enthaltend, aufweist, so dass eine Transformante selbst dann nicht selektiert werden kann, wenn sie mit dem Cycloheximidresistenz-L41-Gen kombiniert wird, das etliche Kopien benötigt, um die Transformante zu selektieren. Dies wurde weiter durch die Tatsache bestätigt, dass keine Transformante erhalten wurde, selbst wenn Candida utilis mit einem Plasmid transformiert wurde, enthaltend das so erhaltene ARS und das Cycloheximidresistenz-L41-Gen. Wie in den Beispielen unten dargestellt, wurde durch intensive Analyse der Eigenschaften der DNA-Sequenz, enthaltend die klonierte ARS verdeutlicht, dass das Plasmid, enthaltend ARS mit nur ungefähr einer Kopie pro Zelle der Candida utilis-Hefe vorliegt. Zusätzlich hatte die so klonierte ARS auch das Merkmal, dass das Plasmid, das sie enthielt, instabil war. Wenn die Candida utilis-Hefe für ungefähr 2,5 bis 3,5 Generationen unter nicht-selektiven Bedingungen kultiviert wurde, erniedrigte sich das Verhältnis von Zellen, die das Plasmid enthielten, auf 20 bis 30 % der Gesamtzahl von Zellen.
Verfahren zur Klonierung von DNA-Sequenzen mit Promotoraktivität in Candida utilis
Das Verfahren zum Klonieren der DNA-Sequenzen mit einer transkriptionellen Promotoraktivität in Candida utilis wird unter Verwendung der DNA-Sequenz mit der obigen autonomen Replikationsfähigkeit bereitgestellt. Als Vektor hierfür kann ein Vektor, der zusätzlich zu der DNA-Sequenz mit der autonomen Replikationsfähigkeit ein Arzneimittelresistenz-Gen aufweist, frei von einer Promotorsequenz für die Transkription, verwendet werden. Ein Vektor, der das APT-Gen enthält, wobei es sich um ein G418-Resistenzgen handelt, kann vorzugsweise verwendet werden. Die verwendete DNA kann von jedem Organismus abstammen, vorzugsweise von Candida utilis. Zusätzlich muss die DNA in kleine Moleküle zur Herstellung einer Bibliothek durch Enzymbehandlungen mit Restriktionsenzymen oder DNAase oder durch mechanisches Scheren mit Ultraschallwellen umgewandelt werden. Eine Kombination der drei Restriktionsenzyme AluI, HaeIII und RsaI, die vier Nukleotide in der Länge erkennen und glatte Enden erzeugen, wird vorzugsweise für einen Teilabbau der chromosomalen DNA verwendet. Bei dieser Kombination werden mehr chromosomale Regionen in der Bibliothek kloniert.
Genauer gesagt wird die Candida utilis Hefe-genomische DNA-Bibliothek durch das konventionelle Verfahren hergestellt, worin ungefähr 0,8 bis 1,8 kb DNA-Fragmente, die teilweise mit den obigen Restriktionsenzymen verdaut wurden, mit der 5'-Seite des promotorsequenzfreien APT-Gens verbunden sind, hergestellt. Weiterhin wird Candida utilis mit der Bibliotheks-DNA transformiert. Die mit dem Plasmid transformierte Hefe, worin die DNA-Sequenz mit einer Promotoraktivität direkt vor dem APT-Gen kloniert wurde, wird G418-resistent. So wird die gesamte DNA aus der G418-resistenten Transformante zur Transformation von E. coli extrahiert und die DNA-Sequenz mit einer Promotoraktivität kann effizient kloniert werden. In diesem Fall können Promotorsequenzen mit höherer transkriptioneller Aktivität isoliert werden, indem die Konzentration von G418, enthalten in der Platte, erhöht wird oder durch Selektion eines Stammes, der relativ große Kolonien auf der Platte gebildet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Abtrennung einer Promotorsequenz mit hoher Aktivität vorteilhaft, da die Zahl der Kopien des Plasmids, enthaltend ARS in Candida utilis ungefähr 1 pro Zelle, wie oben beschrieben, bleibt.
verfahren zur Isolation der anderen funktionellen Gene von Candida utilis
Weiterhin stellt das Verfahren zur Isolation von DNA mit einer Promotoraktivität in Candida utilis gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Isolation von DNA-Sequenzen mit einer Funktion zur Verbesserung der Stabilität des Plasmids, enthaltend ARS, bereit. Eine Ausführungsform des Plasmids, enthaltend ARS in Candida utilis, ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine niedrige Stabilität aufweist und dass sich bei Kultivierung über 3 bis 4 Generationen unter nicht-selektiven Bedingungen die Zellen, die das Plasmid zurückhalten, auf 20 bis 30 % der Gesamtzellen vermindern. Daher bildet auf der Platte, die ein selektives Arzneimittel enthält, ein Stamm, der das ARS-Plasmid zurückhält, enthaltend das Arzneimittelresistenz-Gen, etwas weniger große Kolonien im Vergleich mit einem Stamm bildet, der das Arzneimittelresistenz-Gen auf dem Chromosom integriert aufweist, trotz der Tatsache, dass die Zahl der Kopien pro Zelle dieselbe bleibt. In der vorliegenden Erfindung wurden Stämme, die relativ große Kolonien bildeten, zur Abtrennung von Promotorsequenzen mit hoher Aktivität selektiert, so dass einige der abgetrennten DNA mit Promotoraktivität, wie in den Beispielen unten beschrieben, Funktionen aufweisen, die die Stabilität des Plasmids verbessern können. Weiterhin kann von einem Fachmann auf dem Gebiet vorhergesagt werden, dass es die Verwendung dieses Transformationssystems ermöglicht, DNA-Sequenzen mit einer Varietät von Funktionen zu erhalten, wie z.B. einer Centromersequenz.
Verfahren zur Erzeugung einer Transformante, die von einem Arzneimittelresistenz-Markergen frei ist
Ein anderes Verfahren zur Erzeugung einer Transformante, die von einem Arzneimittelresistenz-Markergen frei ist, wird bereitgestellt, indem die obige DNA-Sequenz mit autonomer Replikationsfähigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Spezifisch kann eine Transformante, die von einem Arzneimittelresistenz-Markergen frei ist, durch das folgende Verfahren erhalten werden. Zunächst wird eine Plasmid-DNA ohne selektierbares Markergen zur Selektion der Transformante und enthaltend eine Sequenz, die zu der chromosomalen DNA homolog ist (homologe DNA-Sequenz) an einer geeigneten Restriktionsenzymstelle in dieser homologen DNA-Sequenz in eine lineare Form verdaut. Diese lineare Plasmid-DNA kann so auf die homologe DNA-Sequenz des Chromosoms von Candida utilis integriert werden. Die lineare Plasmid-DNA wird zusammen mit einem Plasmid verwendet, das eine DNA-Sequenz, enthaltend ein ARS und ein selektierbares Markergen für die Transformation von Hefe aufweist. Unter den Transformanten, die durch die Einführung des Plasmids, enthaltend ARS, selektiert wurden, werden Klone, worin das DNA-Fragment, das für die Transformation verwendet wurde, gleichzeitig in das Chromosom integriert wurde, sekundär selektiert, indem eine Expression heterologer Gene, enthalten auf dem DNA-Fragment, versucht wird oder indem die Integration des DNA-Fragments durch PCR oder Southern-Analyse bestätigt wird. Weiterhin kann das in dem selektierten Stamm vorliegende autonom replizierbare Plasmid einfach durch Kultivierung der Zellen unter nicht-selektiven Bedingungen entfernt werden. Es ist so möglich, einen Stamm zu erhalten, der von einem selektierbaren Markergen frei ist und sich nur das inserierte DNA-Fragment auf dem Chromosom erhält.
Ortsspezifische Mutagenese des Chromosoms von Candida utilis
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine ortsspezifische Mutagenese des Chromosoms von Candida utilis bereitgestellt. Bei diesem Verfahren wurde eine Genfragmentationskassette, worin ein selektierbares Markergen in ein Zielgen inseriert wurde, um die Funktion zu verlieren, als Substituent auf dem chromosomalen Zielgen verwendet. Die Kassette hat eine lineare DNA-Struktur, die an beiden Enden DNA-Sequenzen umfasst, die zu einem chromosomalen Zielgen homolog sind (homologe DNA-Sequenz) und mindestens ein selektierbares Markergen dazwischen. Es ist wichtig, dass das DNA-Fragment, das inseriert werden kann, dieselbe Richtung aufweist wie auf dem Chromosom. Wenn Hefe mit der Kassette transformiert wird, werden das Markergen und die DNA-Sequenzen, die an seinen beiden Seiten vorliegen und inseriert werden können, in den Wirt integriert. Als Ergebnis der Transformation wird das Zielgen an der Integrationsstelle unterbrochen und ein Hefestamm mit einem neuen Charakter erhalten. Das selektierbare Markergen ist vorzugsweise ein Arzneimittelresistenz-Gen und die Transformanten, deren Gene unterbrochen wurden, können durch Resistenz gegenüber dem Arzneimittel selektiert werden. Das Gen, das ein Ziel dieser Genmodifikation sein kann, ist vorzugsweise ein Gen, abstammend von dem Chromosom von Candida utilis. Spezifisch beinhaltet es URA3-, ADE1-, ADE2- oder HIS-Gene, ist jedoch nicht hierauf begrenzt.
Beispielsweise wird das Candida utilis-URA3-Gen mit einem selektierbaren Markergen, wie z.B. dem Cycloheximidresistenz-L41-Gen zur Beendigung seiner Funktion gespalten und dann für die Transformation verwendet. Die so erhaltene Cycloheximidresistente Transformante hat zwei URA3-Gene auf dem Chromosom und eins der beiden Gene wurde unterbrochen. Weiterhin wird ein Stamm, worin beide URA3-Gene unterbrochen wurden, durch Transformation des Stamms, bei dem eins der URA3-Gene unterbrochen wurde, erhalten, mit dem URA3-Genfragment, gespalten mit dem anderen selektierbaren Markergen, wie z.B. einem G418-Resistenzgen. Es ist bekannt, dass die ura3-Variante gegenüber 5-Fluororotsäure (5-FOA) resistent wird, wobei es sich um ein toxisches Analog eines Intermediats im Uracil-Biosyntheseweg handelt. Es ist so möglich (als 5-FOA-resistenten Stamm) die ura3-Mutante zu erhalten (die URA3-Gene aufweist, die beide ihre Funktion verloren haben) durch Gensubstitution des Stamms, worin eins der beiden URA3-Gene unterbrochen wurde. Die ura3-Mutante ermöglicht es, eine Transformante zu erhalten, mit dem URA3-Gen als selektierbares Markergen, wobei es sich nicht um einen Arzneimittelresistenz-Genmarker handelt. Weiterhin hat die so erhaltene auxotrophe Mutante einen Vorteil darin, dass sie kaum durch sekundäre Mutation beeinflusst wird, die in den anderen Genloci durch chemische Mutationsverfahren ausgelöst werden können.
L41-Gen
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden das ribosomale Protein L41 von Candida utilis, ein Gen, das dieses codiert, und seine Promotor- und Terminatorsequenzen bereitgestellt.
Das erfindungsgemäße Protein L41 von Candida utilis hat die in 14 (SEQ ID NO: 6) beschriebene Aminosäuresequenz. So codiert das erfindungsgemäße L41-Gen die in 14 beschriebene Aminosäuresequenz. Weiterhin ist eine spezifische DNA-Sequenz, umfassend dieses Gen, seine Promotor- und Terminatorsequenzen in 13 (SEQ ID NO: 5) dargestellt.
Zusätzlich wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Cycloheximidresistenz-L41-Protein, codierend das mutierte L41-Gen, worin der 56te Aminosäurerest von Prolin zu Glutamin umgewandelt wurde, bereitgestellt. Das Cycloheximidresistenz-L41-Gen kann wie oben beschrieben verwendet werden, nicht nur als selektierbares Markergen für die Transformation von Candida utilis, sondern auch als selektierbares Markergen für die Transformation der anderen Hefen, wie z.B. derjenigen der Saccharomyces-Gattung. Weiterhin ist es nicht nötig festzustellen, dass die Promotor- und Terminatorsequenzen des Gens auch bei der Expression heterologer Gene verwendet werden können.
PGK-Gen
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Promotor- und Terminatorsequenzen des PGK-Gens bereitgestellt.
Spezifische Beispiele der Promotorsequenz beinhalten die Nukleotide 946 bis 1346 der in 3 (SEQ ID NO: 2) dargestellten DNA-Sequenz und ihre Teilsequenzen, die sich die Promotoraktivität erhalten.
Spezifische Beispiele der Terminatorsequenz beinhalten vorzugsweise die in 2 (SEQ ID NO: 1) dargestellte DNA-Sequenz und ihre Teilsequenzen, die sich die Terminatoraktivität behalten.
Ein Expressionsvektor, der in Candida utilis verwendet werden kann, kann erhalten werden, indem die Promotor- und Terminatorsequenzen in einen geeigneten Plasmidvektor inseriert werden. Beispiele für den Plasmidvektor beinhalten wohlbekannte E. coli-Plasmide, wie z.B. pBluescript und pUC19 und ein Hefe-E. coli-Shuttle-Plasmid, umfassend ein selektierbares Markergen, wie z.B. das Cycloheximidresistenz-L41-Gen und falls nötig, eine DNA-Sequenz, die zu einem chromosomalen Zielgen homolog ist. Es würde von einem Fachmann auf dem Gebiet vorhergesagt werden, dass diese Sequenzen als Promotor oder Terminator in anderen Wirtszellen verwendet werden können, insbesondere einer Hefe der Gattung Saccharomyces.
Das PGK-Gen ist ein Gen, codierend das Enzym im glycolytischen Weg und wird in großer Menge zusammen mit den anderen Genen exprimiert, codierend die Enzyme des Glycolysewegs in Candida utilis. So wird erwartet, dass es einen starken Promotor aufweist. Es wird in den Beispielen unten dargestellt, dass der Promotor vorteilhafterweise bei der Expression eines heterologen Gens, wie z.B. des Glucoamylasegens, des Aminoglycosidphosphotransferasegens oder des β-Galactosidasegens unter Verwendung der hergestellten Expressionsvektoren verwendet werden kann.
Weiterhin würde es für einen Fachmann auf dem Gebiet offenbar sein, dass wenn die Expressionsmenge eines mit den PGK-Gen-Promotor- und Terminatorsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung verbundenen Gens nicht vermindert ist, der Expressionsvektor miniaturisiert werden kann, indem ein Teil dieser Sequenzen weggelassen wird.
GAP-Gen
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Promotor- und Terminatorsequenzen des GAP-Gens bereitgestellt.
Spezifische Beispiele der Promotorsequenz beinhalten vorzugsweise die in 30 dargestellte DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 7) und ihre Teilsequenzen, die sich die Promotoraktivität behalten.
Spezifische Beispiele der Terminatorsequenz beinhalten vorzugsweise die in 31 dargestellte DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 8) und ihre Teilsequenzen, die sich die Promotoraktivität behalten.
Ein Expressionsvektor, der in Candida utilis verwendet werden kann, kann erhalten werden, indem die Promotor- und Terminatorsequenzen in einen geeigneten Plasmidvektor inseriert werden. Beispiele für den Plasmidvektor beinhalten wohlbekannte E. coli-Plasmide, wie z.B. pBluescript und pUC19 und ein Hefe-E. coli-Shuttle-Plasmid, umfassend ein selektierbares Markergen, wie z.B. das Cycloheximidresistenz-L41-Gen und falls nötig, eine DNA-Sequenz, die zu einem chromosomalen Zielgen homolog ist. Es würde von einem Fachmann auf dem Gebiet vorhergesagt werden, dass diese Sequenzen als Promotor oder Terminator in anderen Wirtszellen verwendet werden können, insbesondere einer Hefe der Gattung Saccharomyces.
Das GAP-Gen ist ein Gen, codierend das Enzym im glycolytischen Weg und wird in großer Menge zusammen mit den anderen Genen exprimiert, codierend die Enzyme des Glycolysewegs in Candida utilis. So wird erwartet, dass es einen starken Promotor aufweist. Es wird in den Beispielen unten dargestellt, dass der Promotor vorteilhafterweise bei der Expression eines heterologen Gens, wie z.B. des Aminoglycosidphosphotransferasegens unter Verwendung der hergestellten Expressionsvektoren verwendet werden kann.
Weiterhin würde es für einen Fachmann auf dem Gebiet offenbar sein, dass wenn die Expressionsmenge eines mit den GAP-Gen-Promotor- und Terminatorsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung verbundenen Gens nicht vermindert ist, der Expressionsvektor miniaturisiert werden kann, indem ein Teil dieser Sequenzen weggelassen wird.
PMA-Gen
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Promotor- und Terminatorsequenzen des PMA-Gens bereitgestellt.
Spezifische Beispiele der Promotorsequenz beinhalten vorzugsweise die in 34 dargestellte DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 9) und ihre Teilsequenzen, die sich die Promotoraktivität behalten.
Spezifische Beispiele der Terminatorsequenz beinhalten vorzugsweise die in 35 dargestellte DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 10) und ihre Teilsequenzen, die sich die Promotoraktivität behalten.
Ein Expressionsvektor, der in Candida utilis verwendet werden kann, kann erhalten werden, indem die Promotor- und Terminatorsequenzen in einen geeigneten Plasmidvektor inseriert werden. Beispiele für den Plasmidvektor beinhalten wohlbekannte E. coli-Plasmide, wie z.B. pBluescript und pUC19 und ein Hefe-E. coli-Shuttle-Plasmid, umfassend ein selektierbares Markergen, wie z.B. das Cycloheximidresistenz-L41-Gen und falls nötig, eine DNA-Sequenz, die zu einem chromosomalen Zielgen homolog ist. Es würde von einem Fachmann auf dem Gebiet vorhergesagt werden, dass diese Sequenzen als Promotor oder Terminator in anderen Wirtszellen verwendet werden können, insbesondere einer Hefe der Gattung Saccharomyces.
Das PMA-Gen ist ein Gen, codierend das Plamamembranenzym und es ist in Saccharomyces bekanntlich ein primäres Protein, umfassend ca. 10 % der Plamamembranproteine. So wird erwartet, dass es einen starken Promotor aufweist. Es wird in den Beispielen unten dargestellt, dass der Promotor vorteilhafterweise bei der Expression eines heterologen Gens, wie z.B. des Aminoglycosidphosphotransferasegens unter Verwendung der hergestellten Expressionsvektoren verwendet werden kann.
Weiterhin würde es für einen Fachmann auf dem Gebiet offenbar sein, dass wenn die Expressionsmenge eines mit den PMA-Gen-Promotor- und Terminatorsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung verbundenen Gens nicht vermindert ist, der Expressionsvektor miniaturisiert werden kann, indem ein Teil dieser Sequenzen weggelassen wird.
DNA-Sequenzen mit Promotoraktivitäten
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden DNA-Sequenzen mit Promotoraktivitäten bereitgestellt. Die DNA-Sequenzen werden unter Verwendung eines Vektors isoliert, umfassend eine autonom replizierbare DNA-Sequenz und ein Arzneimittelresistenz-Markergen ohne transkriptionelle Promotorsequenz. Spezifische Beispiele für die DNA-Sequenz mit der Promotoraktivität beinhalten vorzugsweise eine DNA-Sequenz, wie dargestellt in 48 (SEQ ID NO: 13) und eine Teilsequenz davon, die sich die Promotoraktivität erhält. Zusätzlich und wie beschrieben in den Beispielen unten, wurden acht DNA-Sequenzen zusätzlich zu der DNA-Sequenz von 48 erhalten, die die Promotoraktivität aufweisen. DNA-Sequenzen mit Promotoraktivitäten können auch isoliert werden, indem das Arzneimittelresistenz-Gen ohne transkriptionelle Promotorsequenz durch die anderen Gene, wie z.B. ein Hygromycin-B-Resistenzgen, ersetzt wird. Zusätzlich ist es auch möglich, einen Promotor zu erhalten, worin die transkriptionelle Aktivität unter spezifischen Bedingungen induziert wird, indem die Selektionsbedingungen verändert werden, wie z.B. Zucker, enthalten in einer Platte zur Selektion von Transformanten oder der anderen Mediumzusammensetzung. Dies würde von einem Fachmann auf dem Gebiet einfach verstanden werden, indem er sich auf die Offenbarung der vorliegenden Beschreibung bezieht.
Ein Expressionsvektor, der in Candida utilis verwendet werden kann, kann durch Insertion der Promotor- und der Terminatorsequenzen in einen geeigneten Plasmidvektor erhalten werden. Beispiele für den Plasmidvektor beinhalten wohlbekannte E. coli-Plasmide, wie z.B. pBluescript und pUC19 und ein Hefe-E. coli-Shuttle-Plasmid, umfassend ein selektierbares Markergen, wie z.B. das Cycloheximidresistenz-L41-Gen und, falls nötig, eine DNA-Sequenz, die zu dem chromosomalen Zielgen homolog ist und diese können verwendet werden. Es würde von einem Fachmann auf dem Gebiet vorhergesagt werden, dass diese Sequenzen als Promotor oder Terminator in anderen Wirtszellen, insbesondere einer Hefe der Saccharomyces-Gattung verwendet werden können.
Es wird in den Beispielen, wie unten beschrieben, belegt, dass der Promotor auf vorteilhafte Weise bei der Expression eines heterologen Gens, wie z.B. einem Aminoglycosidphosphotransferasegen, unter Verwendung eines hergestellten Expressionsvektors verwendet werden kann.
Zusätzlich würde es für einen Fachmann auf dem Gebiet deutlich werden, dass wenn die Expressionsmenge eines mit der Promotorsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung verbundenen Gens nicht vermindert ist, der Expressionsvektor miniaturisiert werden kann, indem ein Teil der Sequenz weggelassen wird.
rRNA-Gen
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein ungefähr 13,5 kb DNA-Fragment, umfassend die rRNA-Gene von Candida utilis und eine DNA-Sequenz, umfassend die Wiederholung des Fragments, bereitgestellt.
Das ungefähr 13,5 kb-Fragment wird durch die in 6(b) dargestellte Restriktionsenzymkarte repräsentiert. Die Stellungen von 18S, 5,8S und 25S rRNA-Genen in der DNA-Sequenz sind in 6(b) dargestellt.
Die multiple-Kopien-Integration eines DNA-Fragments in ein Chromosom wird effizient unter Verwendung einer Teilregion der rRNA-Gene als Zielsequenz bewirkt. Plasmide wurden mit vier Fragmenten konstruiert, die durch Division des ungefähr 13,5 kb DNA-Fragments in vier erhalten wurden und für die Transformation verwendet. Interessanterweise wurde beobachtet, dass die so erhaltenen Transformationshäufigkeiten sich unterschieden, abhängig von der Region, die als Zielsequenz für die Integration verwendet wurde. Während die Transformationsfrequenz bei dem Plasmid pCLRE5, umfassend ein 2,4 kb EcoRI-Fragment, das das 18S rRNA-Gen umfasst, niedrig war, wurden Transformanten mit hohen Frequenzen bei dem Plasmid pCLRE4 erhalten, umfassend ein 3,5 kb EcoRI-Fragment, das einen Teil der 3'-Seite des 18S rRNA-Gens, das 5,85 rRNA-Gen und einen Teil der 5'-Seite des 25S rRNA-Gens umfasst, das Plasmid pCLRE6, umfassend ein 3 kb EcoRI-Fragment, das ein 25S rRNA-Gen umfasst und das Plasmid pCLRE7, umfassend ein 4,7 kb EcoRI-Fragment, das einen Teil der 5'-Seite des 18S rRNA-Gens umfasst.
URA3-Gen
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das URA3-Gen von Candida utilis, das zu der ura3-Mutation einer Saccharomyces cerevisiae Hefe komplementär ist, bereitgestellt. Das Gen kann, wie oben beschrieben, als Integrationsziel für ein DNA-Fragment verwendet werden und ebenfalls bei der Erzeugung einer ura3-Mutante durch Unterbrechung des chromosomalen URA3-Gens. Die ura3-Mutante als Wirt ermöglicht es, eine Transformante zu erhalten, die das URA3-Gen als selektierbares Markergen aufweist, wobei es sich nicht um einen Arzneimittelresistenz-Genmarker handelt. Weiterhin ist offenbar, dass die Promotor- und Terminatorsequenzen des Gens auch für die Expression eines heterologen Gens verwendet werden können.
Das URA3-Gen codiert die in 10 und 11 dargestellte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4). Das URA3-Gen beinhaltet ein Gen, umfassend die in 9 dargestellte DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 3) oder mit Teilsequenzen davon, die sich die Funktion, die die ura3-Mutation der Saccharomyces cerevisiae Hefe komplementiert, erhalten.
Autonom replizierbare DNA-Sequenz (ARS)
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden sich autonom replizierende DNA-Sequenzen, die den Vektor, enthaltend die DNA-Sequenz als episomale Plasmide in Candida utilis erhalten können und die Transformationsfrequenz des Wirts erhöhen, bereitgestellt. Das DNA-Fragment kann von jedem Organismus abstammen, vorzugsweise von Candida utilis. Spezifische Beispiele für ARS beinhalten vorzugsweise die in den 41 und 42 (SEQ ID NO: 11) und den 43 und 44 (SEQ ID NO: 12) dargestellten DNA-Sequenzen und autonom replizierbare Teilsequenzen davon. Wie aus den Beispielen unten deutlich wird, ist es auch möglich, die Candida utilis Hefe mit den Plasmiden mit verkürzten DNA-Fragmenten zu transformieren, trotz der verminderten Frequenz.
Ein Vektor, der als Plasmid in Candida utilis vorliegen kann, wird unter Verwendung von ARS und einem geeigneten selektierbaren Markergen bereitgestellt. Weiterhin werden DNA-Sequenzen mit Promotoraktivitäten und DNA-Sequenzen mit anderen Funktionen unter Verwendung des Vektors isoliert. Es ist auch möglich, eine transformierte Hefe zu erzeugen, die sich nur ein DNA-Fragment erhält, das kein selektierbares Markergen enthält, jedoch ein heterologes Gen auf einem Chromosom, in dem ein Plasmid, enthaltend ARS und ein geeignetes Markergen und ein Plasmid, umfassend eine Sequenz homolog zu der Candida utilis chromosomalen DNA (homologe DNA-Sequenz) und ohne selektierbares Markergen für die Selektion von Transformanten verwendet wird.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin spezifisch unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, ist jedoch nicht auf diese begrenzt.
In dieser Offenbarung werden Restriktionsenzymstellen in den Restriktionsenzymkarten der Gene durch das folgende repräsentiert.
Aa; AatII, Af; AfIII, Al; AflIII, Ap; ApaI, B; BamHI, Bg; BglII,C; ClaI, E; EcoRI, RV; EcoRV, H; HindIII, Hp; HpaI, K; KpnI, P; PstI, Pv; PvuII, S; SalI, Se; SpeI, Sm; SmaI, Sc; SacI, ScII; SacII, Sp; SphI, X; XbaI und Xh; XhoI.
Die in den folgenden Beispielen verwendeten Verfahren sind die folgenden:
1) Deletionsmutationsbehandlung mit ExoIII-Nuklease und Mungobohnennuklease und Bestimmung der DNA-Sequenz
Nachdem ein Plasmid (10 μg) mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut wurde, wurde es mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, um die DNA zu gewinnen. Die DNA wurde in 100 μl einer ExoIII-Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol), 180 Einheiten ExoIII-Nuklease gelöst und die Mischung wurde bei 37°C inkubiert. Ein 10 μl Teil der Mischung wurde jede Minute entnommen und zwei Teile wurden kombiniert und in ein eisgekühltes Röhrchen übertragen, worin 20 μl eines MB-Puffers (40 mM Na-Acetat, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl₂, 10 % Glycerin, pH 4,5) platziert waren. Nachdem so erhaltene fünf Röhrchen bei 65°C für 10 Minuten inkubiert worden waren, um das Enzym zu inaktivieren, wurden fünf Einheiten Mungobohnennuklease hinzugefügt und die Mischung wurde bei 37°C 30 Minuten umgesetzt. Nach der Reaktion wurden fünf DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Deletionsgraden durch Agarosegelelektrophorese gesammelt. Diese gesammelten DNA-Fragmente wurden mit Klenow-Enzym behandelt, um ein glattes Ende zu bilden und bei 16°C über Nacht ligiert und wurden für die Transformation von E. coli verwendet.
Für Insertionsfragmente der so erhaltenen Plasmide wurde die Sequenzierungsreaktion mit einem fluoreszierenden Primer-Cycle-Sequence-Kit (Applied Biosystems, K.K.) durchgeführt und die DNA-Sequenz wurde mit einem automatischen DNA-Sequenzierer bestimmt.
2) Hybridisierung
Nach der Agarosegelelektrophorese wurde die DNA auf einen Hibond-N +-Filter (Amersham) gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll in Alkali übertragen, um einen Filter für die Southern-Hybridisierung herzustellen.
Der Filter, auf dem die DNA fixiert worden war, wurde einer Prähybridisierung in einer Hybridisierungslösung (6 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,2 % SDS, 20 μg/ml Lachssperma-DNA) bei 65°C für 2 Stunden unterworfen. Eine Sonden-DNA, markiert mit den Megaprime-DNA-Markierungssystemen und [α-³²P]dCTP (110 TBq/mmol) wurde der Hybridisierungslösung zugefügt und eine Hybridisierung wurde bei 65°C für 16 Stunden durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde der Filter in 1 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS bei 65°C für 2 Stunden gewaschen und dann einer Autoradiographie unterworfen, um Signale nachzuweisen.
3) Zusammensetzung des Mediums
Die Zusammensetzung des YPD-Mediums für die Kultivierung von Hefe enthält 1 % Hefeextrakt, 2 % Bactopepton und 2 Glucose. Agar wurde in einer Menge von 2 % dem Medium im Fall einer Plattenform zugefügt. Die Zusammensetzung eines SD-Mediums enthält 0,67 % Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren und 2 % Glucose. Aminosäuren wurden dem Medium abhängig von den Ernährungsbedürfnissen der verwendeten Hefe zugefügt. Im Fall einer Plattenform wurde Agar in einer Menge von 2 % dem Medium zugefügt.
4) Behandlung mit Enzym
Die Behandlungen der DNA mit Enzymen, wie z.B. eine Restriktionsenzymreaktion, Klenow-Enzym und T4-DNA-Ligase, wurden unter den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen oder gemäß den Verfahren durchgeführt, die in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben werden.
Beispiel 1: Herstellung einer Candida utilis chromosomalen DNA
Die Extraktion von Candida utilis chromosomaler DNA wurde durch das folgende Verfahren durchgeführt. Der ATCC 9950-Stamm von Candida utilis wurde in 30 ml YPD-Medium inokuliert und bei 30°C in der frühen stationären Phase kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit sterilisiertem Wasser gewaschen und wiederum durch Zentrifugation gesammelt. Nachdem die Zellen in 3 ml Zymolyase-Puffer suspendiert worden waren (0,9 M Sorbit, 0,1 M EDTA, 50 mM DTT, pH 7,5), wurden 200 μl 0,9 M Sorbit, enthaltend 25 mg/ml Zymolyase 100T hinzugefügt und die Mischung unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nachdem die Bildung des Protoplasten durch mikroskopische Beobachtung bestätigt worden war, wurden die Protoplasten durch Zentrifugation gesammelt. Nachdem 3 ml Lysispuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0) zugefügt worden waren und die Protoplasten vorsichtig und ausreichend im Puffer suspendiert worden waren, wurden 0,3 ml 10 % SDS zugefügt und die Mischung bei 65°C über Nacht inkubiert. Dann wurde 1 ml einer 5 M Kaliumacetatlösung hinzugefügt und man ließ die Mischung 1 Stunde auf Eis stehen. Die Präzipitate wurden dann durch Zentrifugation entfernt, 4 ml kalter Ethanol wurde zugefügt und die Mischung wurde zum Präzipitieren von DNA zentrifugiert. Das Präzipitat wurde mit 50 % Ethanol gewaschen, getrocknet, in 3 ml eines RNase A-Puffers (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 50 μg/ml RNase A, pH 7,5) gelöst und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Schließlich wurden 3 ml 2-Propanol zugefügt und die Mischung wurde zur Entfernung des Überstands zentrifugiert. Die so erhaltenen Präzipitate wurden mit 50 % 2-Propanol gewaschen und getrocknet. Das Präzipitat wurde in 0,5 ml eines TE-Puffers gelöst und als Candida utilis chromosomale DNA-Probe verwendet.
Beispiel 2: Klonierung des Phosphoglyceratkinase-(PGK)-Gens
Nach dem Teilverdau der Candida utilis chromosomalen DNA mit einem Restriktionsenzym Sau3AI wurde die verdaute Mischung auf einen 10- bis 50%igen Saccharose-Dichtegradienten geschichtet, enthaltend 0,8 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 8,0) und mit 120.000 × g 14 Stunden zum Fraktionieren der DNA-Fragmente zentrifugiert. Unter diesen Fragmenten wurde ein 10 bis 20 kb chromosomales DNA-Fragment über Nacht mit dem dephosphorylierten λ-Phagenvektor DASHTMII (Stratagene Cloning Systems), der mit BamHI verdaut worden war, ligiert und dann einer in vitro-Verpackung zur Konstruktion einer Candida utilis genomischen DNA-Bibliothek unterworfen.
Das PGK-Gen von Candida utilis wurde durch die Hybridisierung unter Verwendung eines bekannten PGK-Gens des anderen Organismus als Sonde kloniert. Spezifisch wurden Filter, auf denen ungefähr 20.000 Plaques der Phagen-DNA der oben beschriebenen DNA-Bibliothek adsorbiert worden waren, gemäß dem in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschriebenen Verfahren hergestellt. Dann wurde das DNA-Fragment, enthaltend das PGK-Gen von Saccharomyces cerevisiae, als 2 kb ClaI-Fragment aus dem Plasmid pST2 ausgeschnitten, das das PGK-Gen enthält (Yamano et al., Journal of Biotechnology, 32, 165–171 (1994)). Das Fragment wurde dann mit ³²P markiert und als Sonde für die Hybridisierung verwendet. Im Ergebnis wurden vier positive Plaques kloniert. Die Phagen-DNAs, die von jedem dieser Plaques hergestellt worden waren, wurden mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymen verdaut und einer Southern Blot-Analyse unter Verwendung derselben Sonde wie oben unterworfen. Im Ergebnis wurden ein 2,6 kb EcoRI-Fragment und ein 2,5 kb SalI-Fragment, hybridisiert mit der Sonde, isoliert.
Beispiel 3: Bestimmung der DNA-Sequenz eines Fragments, enthaltend das PGK-Gen und Charakterisierung des Strukturgens und der regulatorischen Regionen
Das so isolierte 2,6 kb EcoRI-Fragment wurde in die EcoRI-Stelle eines Plasmidvektors Bluescript IISK+ inseriert, um die Plasmide pPGKE1 und pPGKE2 zu konstruieren, bei denen inserierte Fragmente in ihren Richtungen zum Vektor gegenüberliegen. Das 2,6 kb SalI-Fragment wurde auch in die SalI-Stelle des Vektors Bluescript IISK+ inseriert, um die Plasmide pPGKS1 und pPGKS2 herzustellen, worin die inserierten Fragmente in ihren Richtungen zum Vektor gegenüberliegen (1).
Von den Plasmiden pPGKE1 und pPGKE2 wurden Plasmide mit verschiedenen Deletionsmutationen durch Herstellung von Deletionsmutanten an Restriktionsenzymstellen wie HindIII, KpnI oder SalI erhalten oder durch Herstellung einer Deletionsmutante mit ExoIII-Nuklease und Mungobohnen-Nuklease und die DNA-Sequenz eines 2530 bp EcoRI-Fragments wurde bestimmt.
Die Analyse der Region, an der das Strukturgen erwartet wird, ergab einen 1248 bp offenen Leserahmen. Die Homologie zum PGK-Gen von Saccharomyces cerevisiae wurde mit der Aminosäuresequenz bestimmt, deduziert von der DNA-Sequenz des offenen Leserahmens. Diese Sequenzen zeigten eine Homologie von 86,8 % zueinander, so dass geschlossen werden konnte, dass das isolierte Gen das PGK-Gen von Candida utilis war.
Das EcoRI-Fragment enthielt ein 401 bp-Fragment stromaufwärts vom Initiationscodon ATG und ein 880 bp-Fragment stromabwärts vom Terminationscodon TAA als regulatorische Bereiche der Genexpression. Die DNA-Sequenz des 880 bp-Fragments zwischen dem Nukleotid neben dem Terminationscodon TAA und der EcoRI-Stelle, die einen Transkriptionsterminator enthalten kann, ist in 2 dargestellt. Weiterhin wurden von den Plasmiden pPGKS1 und pPGKS2 Plasmide mit Deletionsmutationen erhalten, indem Deletionsmutanten mit ExoIII-Nuklease und Mungobohnennuklease hergestellt wurden, um die DNA-Sequenz zwischen der HindIII-Stelle und der EcoRI-Stelle zu bestimmen (1). Die Sequenz des 1346 bp-Fragments zwischen der HindIII-Stelle und dem Nukleotid direkt vor dem Initiationscodon ATG, das einen Transkriptionspromotor enthalten kann, ist in 3 dargestellt.
Beispiel 4: Konstruktion von Expressionsvektoren mit dem PGK-Gen-Promotor und Terminator
Um ein heterologes Gen in Candida utilis zu exprimieren, wird eine Genexpressionsmaschinerie, die in Candida utilis wirken kann, d.h. ein Transkriptionspromotor und Terminator, benötigt. Expressionsvektorplasmide mit einer Multiklonierungsstelle wurden so zwischen dem PGK-Gen-Promotor und dem Terminator von Candida utilis hergestellt.
Zunächst wurden Fragmente, enthaltend einen Promotor oder Terminator durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt.
Als Promotor wurde ein Fragment von der SalI-Stelle, lokalisiert 2,3 kb stromaufwärts zum Initiationscodon bis zum Nukleotid direkt vor dem Initiationscodon ATG unter Verwendung des Plasmids PGKS1 als Matrize hergestellt. Die Primer wurden mit den folgenden Sequenzen synthetisiert, worin eine XbaI-Stelle direkt vor dem Initiationscodon am 3'-Ende des Promotorfragments erzeugt wurde.
5'-GGTCGACATATCGTGGTAAGCGCCTTGTCA-3' (SEQ ID NO: 14)
5'-TTCTAGACTTTATCCGCCAGTATGTTAGTC-3' (SEQ ID NO: 15)
Zusätzlich wurde als Terminator ein Fragment von dem Nukleotid nach dem Terminationscodon bis zur EcoRI-Stelle 880 bp stromabwärts unter Verwendung des Plasmids PGKE1 als Matrize hergestellt. Die Primer wurden mit den folgenden Sequenzen synthetisiert, worin eine KpnI-Stelle direkt nach dem Terminationscodon am 5'-Ende des Terminatorfragments erzeugt wurde.
5'-GGGTACCTAACTGCAAGCTACTTTGTAATTAAC-3' (SEQ ID NO: 16)
5'-GGAATTCAACATGAATGACACGACGAAGGT-3' (SEQ ID NO: 17)
Der PCR-Prozess wurde mit 30 Zyklen mit der Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene Cloning Systems) und dem beigefügten Puffer durchgeführt.
Die Promotor- und Terminatorfragmente, die durch das PCR-Verfahren synthetisiert wurden, wurden mit SalI und XbaI bzw. mit KpnI und EcoRI verdaut. Die Fragmente wurden sequenziell in die SalI-XbaI-Stelle und die KpnI-EcoRI-Stelle in pUC19 inkorporiert, um ein Plasmid pPGKPT1 (4) zu konstruieren. Nachdem die EcoRI-Stelle am 3'-Ende des Terminators des Plasmids mit Klenow-Enzym zur Bildung eines glatten Endes behandelt worden war und mit NotI-Linkern (5'-AGCGGCCGCT-3': SEQ ID NO: 18) ligiert wurde, wurde das 0,9 kb PstI-NotI-Fragment durch Verdau des Plasmids mit PstI hergestellt. Das Fragment und das 1,2 kb HindIII-PstI-Fragment, ausgeschnitten aus dem Plasmid pPGKS1, wurde zwischen die HindIII-Stelle und die NotI-Stelle von pBluescript SK- inseriert, um das Plasmid pPGKPT2 zu konstruieren. Weiterhin wurde pPGKPT2 mit BglII verdaut, mit Klenow-Enzym behandelt und wiederum cyclisch gemacht, um die BglII-Stelle in dem Terminatorfragment zu entfernen und ein Plasmid pPGKPT3 zu konstruieren. Nachdem die HindIII-Stelle von pPGKPT3 dann mit Klenow-Enzym zur Bildung glatter Enden behandelt worden war, wurde das Fragment mit NotI-Linkern (5'-AGCGGCCGCT-3': SEQ ID NO: 18) ligiert, um ein Plasmid pPGKPT4 zu erzeugen. Das Plasmid pPGKPT4 wurde teilweise mit KpnI verdaut und KpnI stromaufwärts vom Promotor wurde deletiert, um ein Plasmid pPGKPT5 zu konstruieren (4).
Beispiel 5: Isolation der rDNA
Ein 400 ng Teil von 5 bis 10 kb Sau3AI teilweise verdauten DNA-Fragmenten von Candida utilis ATCC 9950 genomischer DNA, erhalten durch die in Beispiel 2 beschriebene Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation und 200 ng des Vektorplasmids pBR322, verdaut mit BamHI und dephosphoryliert, wurden über Nacht mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5 wurde mit dieser DNA-Lösung transformiert, um eine Candida utilis genomische DNA-Bibliothek zu konstruieren.
Filter wurden für ungefähr 10.000 Kolonien gemäß dem in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Sambrook et al., S. 12, 21–23, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschriebenen Verfahren hergestellt und mit dem 1,8 kb ³²P-markierten HindIII-EcoRI-Fragment, enthaltend das S. cerevisiae 18S rRNA-Gen als Sonde einem Screening unterworfen. Das als Sonde verwendete rDNA-Fragment wurde von einem Plasmid hergestellt, dass von einer genomischen DNA-Bibliothek von Saccharomyces cerevisiae S288C [α, suc2, mal, gal2, CUP1] mit einem ³²P-markierten Oligomer, korrespondierend zu dem Fragment der Nukleotide 4 bis 42 am 5'-Ende des 5,8S rRNA-Gens als Sonde (Sone et al., japanische Patentveröffentlichung Nr. 14865/1994) erhalten wurde.
Über 200 positive Klone wurden erhalten. Restriktionsenzymkarten der Plasmide von sieben Klonen, pCR1, pCR4, pCR5, pCR6, pCR7, pCR8 und pCR9 wurden konstruiert und zum Vergleich ausgerichtet. Die Restriktionsenzymkarten von beiden Enden wurden aufgezeichnet (5). Aus dieser Tatsache wurde festgestellt, dass die Region, enthaltend das rRNA-Gen von Candida utilis, eine ungefähr 13 kb repetitive Struktur aufweist.
Aus diesen Plasmiden wurden Fragmente durch Verdau mit EcoRI oder XbaI ausgeschnitten und in pBluescript SK- subkloniert, um die Plasmide pCRE1, pCRE2, pCRE3, pCRX1, pCRX2, pCRX3 und pCRX4 (6(a)) zu konstruieren. Weiterhin wurden diese Plasmide mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymen verdaut und wiederum cyclisch gemacht, um eine Vielzahl von Deletionsplasmiden zu konstruieren. Die DNA-Sequenzen wurden an den Insertionsfragmenten dieser Plasmide bestimmt und die Regionen, wo die DNA-Sequenz bestimmt wurde, sind in der Figur durch Pfeile dargestellt. Die Analyse der DNA-Sequenzen ergab die Gegenwart der Regionen mit hoher Homologie zu den 18S-, 5,8S- und 25S-rRNA-Genen. So wurde Lokalisierung und transkriptionelle Richtung der drei rRNA-Gene bestimmt (6(b)).
Beispiel 6: Klonierung des Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylas-Gens (URA3-Gen)
Ein 100 ng Teil von 5 bis 10 kb Sau3AI teilverdauten DNA-Fragmenten von Candida utilis ATCC 9950 genomischer DNA, erhalten durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation, wie beschrieben in Beispiel 2 und 100 ng des Vektorplasmids YEp13 (Methods in Enzymol., 194, 195–230, 1991), verdaut mit BamHI und dephosphoryliert, wurden über Nacht mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5 wurde mit dieser DNA-Lösung transformiert, um eine genomische DNA-Bibliothek zu konstruieren. Nachdem die Plasmidmischung von den Transformanten extrahiert worden war, wurde Saccharomyces cerevisiae YPH 500 (αhis3, trp1, leu2, ade2, lys2, ura3) (Stratagene Cloning Systems), wobei es sich um einen ura3-Stamm handelt, mit der Plasmid-DNA-Mischung transformiert und die Transformanten, die für das Wachstum kein Uracil benötigten, wurde auf einem Minimalmedium selektiert. Die Transformation von S. cerevisiae wurde gemäß dem Lithiumverfahren, wie beschrieben in Methods in Yeast Genetics – A Laboratory Course Manual – Rose M.D. et al., S. 122–123, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990), durchgeführt.
Fünf Ura⁺-Stämme wurden durch dieses Verfahren aus 10 μg DNA erhalten. Plasmid-DNA wurde von jeder dieser Transformanten gemäß dem Verfahren, wie beschrieben in Methods in Yeast Genetics – A Laboratory Course Manual – Rose M.D. et al., S. 130, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990) hergestellt. E. coli wurde mit der DNA transformiert und eine Plasmid-DNA wurde hergestellt. Restriktionsenzymkarten wurden mit den Plasmiden pCURA3-3, enthaltend ein 6,1 kb Insert bzw. pCURA3-5, enthaltend ein 8,1 kb Insert, an der BamHI-Stelle von YEp13 konstruiert.
Beispiel 7: Charakterisierung der URA3-Gen-Region und Bestimmung der DNA-Sequenz
Um die URA3-Genregion zu charakterisieren, wurde ein 5 kb EcoRI-Fragment, enthaltend eine Region, die den Plasmiden pCURA3-3 und pCURA3-5 gemein war, aus dem Plasmid pCURA3-5 ausgeschnitten und mit der EcoRI-Stelle eines Plasmids pRS314 (Stratagene Cloning Systems) zur Herstellung eines Plasmids pURAE1 (7) ligiert. Der YPH-500-Stamm wurde mit dem Plasmid durch das Lithiumverfahren transformiert. Im Ergebnis wurden URA+-Transformanten mit hoher Frequenz erhalten. Das zeigt an, dass das URA3-Gen in dem 5 kb EcoRI-Fragment vorliegt und eine Kopie des Gens kann die ura3-Mutation von Saccharomyces cerevisiae komplementieren.
Weiterhin wurde das Plasmid pURAE1 mit XhoI oder PstI verdaut und durch die T4-Ligasereaktion wiederum cyclisch gemacht, um die Plasmide pURAE1ΔXho und pURAE1ΔPst zu ergeben.
Weiterhin wurde das 3,5 kb EcoRI-ClaI-Fragment und das 2,3 kb HindIII-Fragment, ausgeschnitten aus dem Plasmid pURAE1 zwischen EcoRI- und ClaI-Stellen inseriert bzw. an der HindIII-Stelle von pRS314, um die Plasmide pURAEC1 und pURAH1 (7) herzustellen.
Der YPH500-Stamm wurde mit fünf Plasmiden, wie oben beschrieben, durch das Lithiumverfahren transformiert, um die Komplementarität der ura3^–-Mutation zu überprüfen und so zu überprüfen, ob diese Fragmente das URA3-Gen enthalten oder nicht. Das Ergebnis ist in 7 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass das URA3-Gen in der 2,3 kb-Region zwischen EcoRI und HindIII lokalisiert ist.
Weiterhin wurde das 2,3 kb HindIII-Fragment, enthaltend das URA3-Gen, mit der HindIII-Stelle des Plasmids pBluescript SK^– ligiert, um ein Plasmid pURAH2 herzustellen. Durch Deletionsmutation mit ExoIII-Nuklease und Mungobohnennuklease von beiden Enden des inserierten Fragments wurden Plasmide mit Deletionsmutationen hergestellt und die DNA-Sequenz bestimmt. Die Restriktionsenzymkarte, die durch die DNA-Sequenz aufgeklärt wurde und die Sequenzstrategie sind in 8 dargestellt. Die so erhaltene 2330 bp DNA-Sequenz ist in 9 dargestellt und die deduzierte Aminosäuresequenz des Polypeptids, bestehend aus 267 Aminosäureresten in den 10 und 11.
Die Aminosäuresequenz des Polypeptids wurde mit der des URA3-Proteins der anderen Hefen verglichen und zeigte hohe Homologien, beispielsweise 73,4 % zu Saccharomyces cerevisiae, 76,3 % zu Kluyveromyces lactis und 75,1 % zu Candida albicans.
Beispiel 8: Klonierung des L41-Gens und Bestimmung der DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend das L41-Gen
Filter wurden für ungefähr 30.000 Kolonien der in Beispiel 5 hergestellten Bibliothek gemäß dem Verfahren wie beschrieben in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Sambrook et al., S. 12, 21–23, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) hergestellt und mit einem 1,1 kb ³²P-markierten XbaI – Sau3AI-Fragment, enthaltend das Candida maltosa L41-Gen, RIM-C als Sonde (Kawai et al., J. Bacteriol., 174, 254–262 (1992)) einem Screening unterworfen.
Fünf positive Klone wurden auf diese Weise erhalten. Restriktionsenzymkarten der drei Klone pCL41-1, pCL41-2 und pCL41-5 wurden konstruiert und miteinander verglichen. Diese Klone teilen sich ein 4 kb EcoRI-Fragment (12). Eine Southern-Hybridisierungsanalyse dieser Plasmid-DNA hat ergeben, dass eine Region, die eine Homologie zum L41-Gen von Candida maltosa zeigt, in dem 1,4 kb ClaI-PstI-Fragment vorliegt, innerhalb des 4 kb EcoRI-Fragments.
Das 4 kb EcoRI-Fragment wurde in die EcoRI-Stelle von pBluescript SK^– inseriert, um die Plasmide pCLE1 und pCLE2 herzustellen, worin die Fragmente in entgegengesetzter Richtung zueinander inseriert sind. Von diesen beiden Plasmiden wurde eine Vielzahl von Plasmiden mit Deletionsmutationen durch Herstellung von Deletionsmutanten mit HindIII, XhoI oder ClaI mit einer Stelle innerhalb des EcoRI-Fragments oder durch Herstellung von Deletionsmutanten mit ExoIII-Nuklease und Mungobohnennuklease erhalten, um die 2086 bp DNA-Sequenz von der BamHI-Stelle bis zur SacI-Stelle zu bestimmen (13).
Eine Southern-Analyse ergab, dass ein 318 bp offener Leserahmen, unterbrochen durch ein 367 bp Intron, in der Region vorliegt, worin die Gegenwart eines L41-Strukturgens deduziert wird (12 und 14). An den 5'- und 3'-Enden und in der Nachbarschaft des 3'-Endes in der Region, die deduziert ein Intron ist, wurde die Sequenz GTATGT--TACTAAC--AG, die für ein Intron üblich ist, beobachtet. Weiterhin waren die Sequenzen direkt nach dem Initiationscodon lokalisiert, wie auch sechs L41-Gene der anderen Hefen, wie beschrieben von Kawai et al., J. Bacteriol., 174, 254–262 (1992); Pozo et al., Eur. J. Biochem., 213, 849–857 (1993)). Die deduzierte Aminosäuresequenz des Candida utilis L41-Polypeptids wurde mit denjenigen der L41-Proteine einiger anderer Hefen verglichen und zeigte hohe Homologien, beispielsweise 93,4 % zu Saccharomyces cerevisiae L41, 89,6 % zu Candida tropicalis L41 und 85,8 % zu Candida maltosa L41.
Beispiel 9: Herstellung von Cycloheximidresistenz-L41-Gen durch ortsspezifische Mutation
Die Aminosäure an der 56-Position des L41-Proteins einer Cycloheximid-resistenten Hefe ist Glutamin, während die Aminosäure an der korrespondierenden Position in dem L41-Protein einer Cycloheximid-empfindlichen Hefe Prolin ist. Es wurde berichtet, dass die Empfindlichkeit gegenüber Cycloheximid der Hefe durch diesen Aminosäurerest des L41-Proteins bestimmt wird (Kawai et al., J. Bacteriol., 174, 254–262 (1992)). Zusätzlich war die Aminosäure bei 56 des L41-Proteins von Cycloheximid-empfindlichem Candida utilis Prolin, ähnlich wie bei Cycloheximid-empfindlicher Saccharomyces cerevisiae. Das Codon, das das Prolin an der 56ten Position des L41-Gens codierte, wurde in ein Glutamincodon durch ortsspezfische Mutagenese geändert, um das L41-Protein, codiert durch das Gen, in ein Cycloheximidresistentes Protein umzuwandeln, das als selektiver Transformationsmarker verwendet wurde.
Zunächst wurde ein 2,1 kb BamHI-SacI-Fragment, erhalten von dem Plasmid pCLE1, zwischen den BamHI- und SacI-Stellen von pUC18 inseriert, um ein Plasmid pCLBS1 herzustellen (15).
Weiterhin wurde ein 0,6 kb-Fragment, erhalten durch Verdau des Plasmids pCLE1 mit AflII, Behandlung mit Klenow-Enzym zur Bildung glatter Enden und weiterem Verdau mit Xho1 zwischen die SmaI- und XhoI-Stellen von pBluescript SK^– inseriert, um pCLAX1 herzustellen. In diesem Plasmid ist die AflII-Stelle durch Ligation des glatten AflII-Endes des 0,6 kb-Fragments und des SmaI-Endes eines Vektors regeneriert. Eine einzelsträngige DNA wurde aus pCLXA1 mit einem Helferphagen hergestellt und ein mutiertes Plasmid wurde mit einem synthetischen Oligonukleotid
5'-TTG TGG AAA ACT TGC TTG GTT TGA-3' und einem Sculptor In Vitro Mutagenesis Kit (Amersham) hergestellt. Die DNA-Sequenz des 0,6 kb Insertionsfragments des so erhaltenen Kandidatenplasmids wurde bestimmt und ein Plasmid pCLAX20, worin keine Mutation in der DNA-Sequenz angetroffen wurde, außer dass das 56te Prolincodon CCA zu einem Glutamincodon CAA mutiert war, wurde erhalten.
Ein 0,6 kb Insertionsfragment wurde als ClaI-AflII-Fragment aus pCLAX20 ausgeschnitten und mit einem 4,4 kb-Fragment ligiert, erhalten durch Verdau des Plasmids pCLBS1 mit ClaI und AflII, um ein Plasmid pCLBS10, enthaltend ein mutiertes L41-Gen, zu konstruieren.
Das Plasmid pCLBS10 wurde mit BamHI und SphI verdaut, mit T4-DNA-Polymerase zur Bildung glatter Enden behandelt und NotI-Linker (5'-AGCGGCCGCT-3') wurden inseriert, um ein Plasmid pCLBS12 (15) herzustellen.
Es wurde überprüft, ob das so erhaltene mutierte L41-Gen der Hefe eine Resistenz gegenüber Cycloheximid verleiht oder nicht. Ein 2,1 kb BamHI-SacI-Fragment, enthaltend das mutierte L41-Gen, das von dem Plasmid pCLBS10 erhalten wurde, wurde zwischen die BamHI- und SacI-Stellen von YEp13K, einem YEp-Vektor, inseriert (Sone et al., Appl. Environ. Microbiol., 54, 38–42 (1988)), um das Plasmid pYECL10 herzustellen. Andererseits wurde ein 2,1 kb BamHI-SacI-Fragment, enthaltend das Wildtyp-L41-Gen, erhalten von pCLBS1, in YEp13K kloniert, um ein Plasmid pYECL1 als Kontrolle herzustellen.
Ein Saccharomyces-Hefestamm YPH 500 wurde mit diesen Plasmiden gemäß dem in Methods in Yeast Genetics – A Laboratory Course Manual – Rose M.D. et al., S. 122–123, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990) beschriebenen Litiumacetatverfahren transferiert. Leucin nicht-benötigende Stämme wurden als Transformanten selektiert. Diese Transformanten wurden auf einer YPD-Platte, enthaltend Cycloheximid, gezüchtet. Im Ergebnis wuchs der Stamm, der sich pYECL10 erhielt, auf der YPD-Platte, die Cycloheximid enthielt. Demgegenüber wuchs der Stamm, der sich pYECL1 erhielt, auf der YDP-Platte, die Cycloheximid enthielt, nicht. So konnte belegt werden, dass das so hergestellte mutierte L41-Gen eine Resistenz an eine Cycloheximidempfindliche Hefe verlieh.
Beispiel 10: Kanstruktion der Plasmide für die Transformation und Bestimmung der Bedingungen der Transformation bei Candida utilis
Zunächst versuchte man, eine Transformation des Candida utilis ATCC 9950 Stamms mit Plasmiden, die die Expressionskassette eines G418-Resistenzgens (Aminoglycosidphosphotransferase-(APT)-Gen) enthielten, von denen bewiesen wurde, dass sie in Saccharomyces cerevisiae wirken. Die Expressionskassette wurde durch Ligation eines 1,1 kb G418-Resistenzgens, das aus einem XhoI-PstI-Fragment des Plasmids pUC4K (Pharmacia) ausgeschnitten worden war, hergestellt und wurde in ein solches mit glatten Enden zwischen der 1,0 kb Promotorregion des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenasegens und der 0,4 kb Terminatorregion des Phosphoglyceratkinasegens, wie beschrieben von Yamano et al., J. Biotechnol., 32, 165–171 (1994) umgewandelt. Einige Plasmide wurden verwendet, d.h. (1) ein Plasmid, worin die obige Kassette zu YEp13 K als YEp-Vektor ligiert worden war; (2) eine DNA-Bibliothek, worin Sau3AI teilverdaute chromosomale DNA-Fragmente (5 bis 10 kb) des in Beispiel 2 beschriebenen Candida utilis ATCC 9950-Stamms in die BamHI-Stelle des Plasmids pGPDAPH1 inseriert worden waren, konstruiert durch die obige Expressionskassette, ligiert in das Plasmid pBluescript SK^– und (3) acht Plasmide von pGPDAPH1, enthaltend ARS-Sequenzen, die in Saccharomyces cerevisiae wirken. Die Plasmide in (3) wurden aus Hefekolonien isoliert, die durch Transformation vom Stamm Saccharomyces cerevisiae YPH 500 mit der Bibliothek in (2) erhalten wurden. Die Transformation des Candida utilis ATCC 9950-Stamms wurde mit diesen Plasmiden oder Bibliothek-DNA durch das elektrische Pulsverfahren mit verschiedenen Kombinationen eines Widerstands und einer Spannung oder dem Lithiumacetatverfahren durchgeführt. Es wurden jedoch keine Kolonien, die eine Resistenz gegen G418 zeigten, erhalten.
Als nächste Stufe wurden vier rDNA-Fragmente, ausgeschnitten aus den Plasmiden pCRE2, pCRE3, pCRX1 und pCRX2, beschrieben in Beispiel 5 (6) mit EcoRI oder XbaI in die EcoRI-Stelle oder die XbaI-Stelle in dem Plasmid pCLBS10, wie beschrieben in Beispiel 9 (15) inseriert, um die Plasmide pCLRE2, pCLRE3, pCLRX1 und pCLRX2 zu konstruieren.
Die Transformationen des Candida utilis ATCC 9950-Stamms wurden durch das elektrische Pulsverfahren mit verschiedenen Kombinationen von Widerstand und Spannung und dem Lithiumacetatverfahren mit vier Plasmiden mit dem Cycloheximidresistenzgen als selektierbaren Marker und einer Bibliothek-DNA, hergestellt durch Insertion der Sau3AI teilverdauten DNA-Fragmente (5 bis 10 kb) der chromosomalen DNA des Candida utilis ATCC 9950-Stamms in die BamHI-Stelle im Plasmid pCLBS10 durchgeführt. Wenn diese Plasmide jedoch in der cyclischen Form verwendet wurden, wurden keine Transformanten erhalten. Während dieses Transformationsexperiments wurde das Auftreten von pseudoresistenten Kolonien, die eine niedrige Resistenz gegenüber Cycloheximid oder eine Resistenz gegenüber G418 zeigten, beobachtet. Pseudoresistente Kolonien beziehen sich auf solche, die häufig bei einer Selektion von Transformanten auf der Platte mit Antibiotika, wie z.B. G418 oder Cycloheximid hinzugefügt, beobachtet werden und spontan eine Resistenz erwerben, unabhängig von der Gegenwart des Arzneimittelresistenzgens eines selektierbaren Markers.
Wenn Cycloheximid bei der Selektion von Transformanten verwendet wurde, ergab sich bei diesem Experiment, dass das Auftreten pseudoresistenter Kolonien durch Einstellen der Konzentration von Cycloheximid in der Platte auf 40 μg/ml und Inkubation der Platte bei einer Temperatur von 28°C, jedoch nicht 30°C unterdrückt wurde. So wurden die Transformationsexperimente mit den Plasmiden pCLRE2, pCLRX1 und pCLRX2, die durch BglII, EcoRV bzw. BglII verdaut worden waren, an den Restriktionsenzymstellen innerhalb der rDNA-Region der Plasmid-DNA durchgeführt, um die Integration der DNA in das Chromosom zu unterstützen. Als Ergebnis wurden erfolgreich Cycloheximid-resistente Klone mit Verwendung der BglII-verdauten Plasmide pCLRE2 und pCLRX2 unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 600 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm erhalten. Diese resistenten Stämme haben deutlich größere Größen als diejenigen der kleinen pseudoresistenten Stämme, die erhalten wurden, wenn auch nur selten in einem Kontrollexperiment, bei dem keine Plasmid-DNA zugefügt wurde und wurden als Transformanten aus dem Ergebnis der Southern-Analyse, wie dargestellt in Beispiel 12, bereitgestellt.
Um die optimalen Bedingungen für die Transformation festzustellen, wurden elektrische Pulsexperimente mit dem BglII-verdauten Plasmid pCLRE2 unter Bedingungen einer fixierten elektrischen Kapazität bei 25 μF mit verschiedenen Kombinationen von Widerstand und Spannung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 17 dargestellt, worin das lebensfähige Zellverhältnis nach dem Puls und die Zahl der so erhaltenen Cycloheximid-resistenten Transformanten dargestellt sind.
Aus den Ergebnissen wurde festgestellt, dass Transformanten mit hoher Frequenz bei ungefähr 500 bis 1.400 Zellen pro 1 μg DNA bei Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 600, 800 oder 1.000 Ω und einer Spannung von 3,75 oder 5 KV/cm erhalten werden. Das lebensfähige Zellverhältnis nach dem Puls lag bei ungefähr 10 bis 40 % bei diesen Bedingungen. Das lebensfähige Zellverhältnis betrug 40 % oder weniger bei einigen Bedingungen eines Widerstands von 200 oder 400 Ω, jedoch wurden hohe Transformationsfrequenzen nicht erhalten. Bei einem Widerstand von 200 oder 400 Ω lag die Zeitkonstante (die Zeit, die benötigt wird, um die Spannung auf ungefähr 37 % des Maximums zu attenuieren) im Bereich von 10 Millisekunden oder weniger. Weiterhin lag bei Bedingungen eines Widerstands von 600, 800 oder 1.000 Ω und dem lebensfähigen Zellverhältnis nach dem Puls von ungefähr 10 bis 40 %, die Zeitkonstante im Bereich von ungefähr 10 bis 20 Millisekunden. Diese Ergebnisse legten nahe, dass es wichtig ist, um eine hohe Transformationsfrequenz zu erhalten, den elektrischen Puls auf Zellen anzulegen, so dass das lebensfähige Zellverhältnis nach dem Puls im Bereich von ungefähr 10 bis 40 % liegt und die Zeitkonstante im Bereich von 10 Millisekunden oder mehr.
Weiterhin wird es bevorzugt, YPD-Medium, enthaltend 1 M Sorbit, der Zelllösung zuzufügen und dieses unter Schütteln zu kultivieren, nachdem der elektrische Puls angewandt wurde. Wenn die Zellen direkt auf der Selektivplatte, enthaltend Cycloheximid, ohne Kultivierung verteilt wurden, wurden keine Kolonien erhalten.
Zusätzlich wurden die Variationen der Zahl der lebensfähigen Zellen und der Zahl der Transformanten mit dem Zeitverlauf überprüft und die Anstiegsraten wurden verglichen, um die optimale Kultivierungszeit zu bestimmen.
Im Ergebnis wurde festgestellt, dass das Verhältnis von Anstieg von Transformanten höher war als die Zahl der lebensfähigen Zellen während 6 Stunden einer Kultur, dass jedoch die Zahl der lebensfähigen Zellen und die Zahl der Transformanten im selben Verhältnis nach 6 Stunden Kultur anstieg. So ergab es sich, dass eine Kultivierungszeit von 6 Stunden optimal war.
Das Standard-Transformationsverfahren für den Candida utilis ATCC 9950-Stamm durch elektrischen Puls wird in Beispiel 11 beschrieben.
Beispiel 11: Transformationsverfahren für den Candida utilis ATCC 9950-Stamm durch elektrischen Puls
Nachdem die auf einer YPD-Platte gezüchtete Kolonie unter Schütteln in 5 ml YPD-Flüssigmedium bei 30°C ungefähr 8 Stunden kultiviert wurde, wird sie in 200 ml flüssigem YPD-Medium bei einer Konzentration von OD₆₀₀ = 0,0024 inokuliert und unter Schütteln bei 30°C für ungefähr 16 Stunden kultiviert. Nachdem die Zellen auf die logarithmische Wachstumsphase (OD₆₀₀ = 2,5) gezüchtet wurden, werden sie durch Zentrifugation bei 1.400 × g für 5 Minuten gesammelt. Die Zellen werden einmal mit 100 ml eiskaltem sterilisiertem Wasser gewaschen, einmal mit 40 ml eiskaltem sterilisiertem Wasser und einmal mit 40 ml eiskaltem 1 M Sorbit. Nachdem die Zellen in 10 ml 1 M Sorbit suspendiert wurden, werden sie in ein sterilisiertes Polypropylenröhrchen übertragen und wiederum bei 1.100 × g 5 Minuten zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstands werden die Zellen in eiskaltem 1 M Sorbit suspendiert, so dass das Volumen der endgültigen Zelllösung 2,5 ml beträgt.
Das Transformationsexperiment durch elektrischen Puls wird mit einem Gen Pulser (Bio-rad) durchgeführt. Nachdem 50 μl der Zelllösung mit 5 μl DNA-Probe vermischt wurden, wird die Mischung in eine 0,2 cm Wegwerfküvette platziert und der elektrische Puls wird unter geeigneten Bedingungen angelegt. Nach Anlegung des Pulses wird 1 ml eiskaltes YPD-Medium, enthaltend 1 M Sorbit zugefügt und die Mischung wird in ein sterilisiertes Polypropylenröhrchen übertragen und unter Schütteln für ungefähr 6 Stunden bei 30°C kultiviert. Nach der Kultivierung wird die Zellmischung auf ein YPD-selektierbares Medium, enthaltend 40 μg/ml Cycloheximid verteilt und bei 28°C 3 oder 4 Tage gehalten, um die Kolonien der Transformanten zu erhalten.
Beispiel 12: Nachweis der Plasmid-DNA in den Transformanten durch Southern-Analyse
Sieben Stämme unter den in Beispiel 10 erhaltenen Cycloheximid-resistenten Kolonien wurden durch das Southern Blot-Verfahren analysiert um zu überprüfen, ob sich diese Klone die Plasmid-DNA erhielten oder nicht. Chromosomale DNA wurde gemäß den in Methods in Yeast Genetics – A Laboratory Course Manual – Rose M.D. et al., S. 131–132, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY beschriebenen Verfahren hergestellt. Die so hergestellte DNA wurde mit EcoRV oder SalI verdaut und mit einem 1,8 kb ³²P-markierten BamHI-HindIII-Fragment, enthaltend das L41-Gen (12) als Sonde (18) hybridisiert.
Im Ergebnis wurde zusätzlich zu der von dem endogenen L41-Gen abstammenden 5 kb-Bande eine Bande über 20 kb durch Verdau mit EcoRV nachgewiesen. EcoRV schneidet den rDNA-Lokus, jedoch nicht das Plasmid pCLRE2. Es wurde so angenommen, dass der Nachweis der über 20 kb-Bande auf die Integration des Plasmids in das Chromosom zurückzuführen war. Eine Southern-Analyse in Beispiel 15 belegte, dass es 2 Kopien des L41-Gens in einer Zelle von Candida utilis gibt. Unter Betrachtung des Ergebnisses der densitometrischen Analyse ergab sich, dass die Kopienzahl von integrierter Plasmid-DNA im Bereich von ungefähr 6 Kopien (Spur 7) bis 15 Kopien (Spur 2) lag.
Andererseits schneidet SalI das Plasmid pCLRE2 an einer Position. Wenn die chromosomale DNA mit SalI verdaut wurde, wurde eine 8,5 kb-Bande, korrespondierend zu der Länge des Plasmids pCLRE2 zusätzlich zu der 7,5 kb-Bande, abstammend von dem endogenen L41-Gen, nachgewiesen. Die 8,5 kb-Bande wird vermutlich durch den SalI-Verdau von benachbarten Plasmiden aufgrund einer Tandemintegration mehrerer Plasmide in das Chromosom erzeugt.
Wenn eine Southern-Analyse mit 10 oder mehr Cycloheximidresistenten Stämmen durchgeführt wurde, wurde zusätzlich die Gegenwart der Plasmid-DNA bei allen Klonen bestätigt. Die in den Transformationsexperimenten von Beispiel 10 erhaltenen Cycloheximid-resistenten Stämme erwiesen sich damit als Transformanten.
Beispiel 13: Transformation der anderen Candida utilis-Stämme
Es wurde berichtet, dass Candida utilis unterschiedliche chromosomale Elektrophoresemuster aufweist, abhängig von den Stämmen und einen Polymorphismus der chromosomalen Länge zeigt (Stoltenburg et al., Curr. Genet., 22, 441–446 (1992)). Aufgrund der Vorhersage von Unterschieden in genetischen Eigenschaften oder der Transformationsfrequenz, abhängig von den Stämmen, wurde die Transformation durch das elektrische Pulsverfahren, wie beschrieben in Beispiel 11, ebenfalls an dem ATCC 9226- und dem ATCC 9256- zusätzlich zu dem ATCC 9950-Stamm überprüft.
Der Puls wurde unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 2,5 bis 6,25 KV/cm angelegt. Als Plasmid-DNA wurden 2 μg pCLRE2, verdaut mit BglII, verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Während sich die Frequenz, abhängig von dem Stämmen unterschied, wurden Cycloheximid-resistente Kolonien bei allen Stämmen erhalten.
Tabelle 1 Transformation mit dem Plasmid pCLRE2
Im Hinblick auf acht Cycloheximid-resistente Stämme insgesamt, d.h. vier Stämme, abstammend von ATCC 9226 und vier Stämme, abstammend von ATCC 9256, wie auch zwei Cycloheximid-resistente Stämme, abstammend von ATCC 9950 als Kontrollen, wurden chromosomale DNAs hergestellt und mit BglII verdaut. Die Southern-Analyse der DNA wurde mit einem ³²P-markierten 1,8 kb BamHI-HindIII-Fragment, enthaltend das L41-Gen (12) als Sonde, durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 19 dargestellt. Eine von der Plasmid-DNA abstammende Bande wurde zusätzlich zu der 5,4 kb-Bande, abstammend von dem endogenen L41-Gen auf dem Chromosom, in jedem der Stämme beobachtet. Dies zeigt an, dass diese resistenten Stämme Transformanten sind, die sich die Plasmid-DNA erhalten.
Bei einigen der Transformanten, die von dem ATCC 9226- und ATCC 9256-Stamm abstammen, wurden Banden mit einem höheren Molekulargewicht zusätzlich zu der 8,4 kb-Bande beobachtet, mit derselben Größe wie Plasmid-DNA (Spuren 2 bis 4 und 7). Dies zeigt an, dass wenn die rDNA-Sequenz auf dem Plasmid nicht zu der rDNA-Sequenz auf dem Chromosom als Integrationsziel identisch ist, die BglII-Stelle an den Enden des Plasmid-DNA-Moleküls, integriert in das Chromosom, manchmal deletiert ist.
Es wurde durch die Southern-Analyse in Beispiel 15 bewiesen, dass die Kopienzahl des L41-Gens pro Zelle von Candida utilis zwei ist. Die Zahl der Kopien des integrierten Plasmids wurde berechnet, durch Vergleich der Stärke der Banden unter der Annahme, dass die 5,4 kb-Bande zu den zwei Kopie des L41-Gens korrespondiert. Die Dichten der Banden wurden mit einem Imaging Analyzer BAS 2000 (Fuji Film) gemessen.
Im Ergebnis wurde die Zahl der Kopien des Plasmids pCLRE2 als in einem Bereich von 7 Kopien (Spur 1) bis 25 Kopien (Spur 3) im ATCC 9256-Stamm, 3 Kopien (Spur 5) bis 11 Kopien (Spur 6) im ATCC 9226-Stamm liegend, berechnet. Andererseits war die berechnete Zahl der Kopien 11 (Spuren 9 und 10) beim ATCC 9950-Stamm.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass Transformanten mit dem Cycloheximidresistenz-L41-Gen bei ATCC 9226- und ATCC 9256-Stämmen wie auch bei dem ATCC 9950-Stamm erhalten werden können und dass eine Vielzahl von Plasmiden gleichzeitig integriert werden.
Beispiel 14: Transformation von Candida utilis durch das Lithiumacetatverfahren und das modifizierte Verfahren hierfür
Das Lithiumacetatverfahren (Ito et al., J. Bacteriol., 153, 163–168 (1983)) wurde intensiv für die Transformation von Hefen in der Gattung Saccharomyces verwendet, da es einfach und leicht zu betreiben ist. So versuchte man, den Candida utilis ATCC 9950-Stamm mit dem Plasmid pCLRE2 zu transformieren, das so verdaut war, dass es linear war, und zwar mit BglII, unter Verwendung des Lithiumacetatverfahrens und des modifizierten Lithiumacetatverfahrens, worin Ethanol oder DMSO zugefügt wurden (Soni et al., Current Genet., 1993, 24, 455–459). Bei dem modifizierten Lithiumacetatverfahren wurde Ethanol nach 10 Minuten der Initiation eines Hitzeschocks der Zellsuspension zugefügt, so dass die Endkonzentration 10 % ist und die Mischung wurde weiter für 10 Minuten inkubiert. Auch wurde DMSO zusammen mit einer Polyethylenglycollösung der Zellsuspension zugefügt, so dass die Endkonzentration 10 % beträgt. Nachdem die Zellen in YPD-Lösung suspendiert und unter Schütteln für 4 Stunden bei 30°C kultiviert worden waren, wurden Zellen auf der selektierbaren Platte, enthaltend Cycloheximid, verteilt und 6 Tage bei einer Temperatur von 28°C inkubiert.
Im Ergebnis wurden 5 Klone der Cycloheximid-resistenten Stämme mit 2 μg DNA der Plasmid-DNA durch das modifizierte Lithiumacetatverfahren, wobei Ethanol-DNA zugefügt worden war, erhalten. Eine Southern-Analyse wurde mit aus zwei Klonen gemäß den in Beispiel 13 beschriebenen Verfahren hergestellter chromosomaler DNA durchgeführt. Banden, die von den Plasmiden abstammten, wurden beobachtet und diese Klone waren daher erwiesenermaßen Transformanten. Das Ergebnis zeigt, dass Candida utilis, behandelt mit Lithiumacetat, ebenfalls eine Fähigkeit zur Integration von DNA aufweist, obwohl die Transformationsfrequenz im Vergleich mit dem elektrischen Pulsverfahren recht niedrig ist.
Das Experiment wurde gemäß dem von Soni et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt, es ist jedoch auch möglich, die Transformationsfrequenz durch weitere Untersuchung der Behandlungsbedingungen zu verbessern.
Beispiel 15: Transformation mit einem Ziel einer unterschiedlichen rDNA-Region
1) Kontruktion von Plasmiden

pCLRE4 und pCLRE5 wurden durch Insertion des von pCRE2 (6) erhaltenen 3,5 kb EcoRI-Fragments und dem von pCRE3 (6) erhaltenen 2,4 kb EcoRI-Fragment in die EcoRI-Stelle des Plasmids pCLBS12 (15), wie beschrieben in Beispiel 9, konstruiert.

Zusätzlich wurden das 3 kb EcoRI-XbaI-Fragment bzw. das 4,5 kb EcoRI-XbaI-Fragment, ausgeschnitten aus pCRE1 (6), worin ein 7,5 kb EcoRI-Fragment, enthaltend rDNA kloniert war, ligiert und zwar zwischen die jeweiligen EcoRI- und XbaI-Stellen von pBluescriptSK^–. Die XbaI-Stelle von jedem Plasmid wurde in die EcoRI-Stelle durch Insertion von EcoRI-Linkern (5'CCAAGCTTGG3') umgewandelt, um die Plasmide pCRE6 und pCRE7 zu konstruieren. Die aus diesen Plasmiden pCRE6 bzw. pCRE7 ausgeschnittenen 3 kb bzw. 4,5 kb EcoRI-Fragmente wurden in die EcoRI-Stelle eines Plasmids pCLBS12 inseriert, um die Plasmide pCLRE6 bzw. pCLRE7 zu konstruieren.
Die Strukturen der Plasmide pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 und pCLRE7 sind in 20 dargestellt.
2) Transformation
Jedes der Plasmide pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 und pCLRE7, wie hergestellt, wurde mit einem Restriktionsenzym in eine lineare DNA verdaut. Der ATCC 9950-Stamm wurde mit 1 μg der DNA durch das in Beispiel 11 beschriebene elektrische Pulsverfahren transformiert. Die Transformationen wurden unter Pulsbedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einer Spannung von 5 KV/cm und einem Widerstand von 800 Ω mit einer Post-Puls-Kultivierungszeit von 18 Stunden durchgeführt. Restriktionsenzyme, die dazu in der Lage waren, in rDNA-Fragmenten angetroffene Stellen zu schneiden, wurden verwendet. Das heißt, das Plasmid pCLRE4 wurde mit BglII verdaut, pCLRE5 mit BamHI oder XbaI, pCLRE6 mit BamHI und pCLRE7 mit ApaI oder EcoRV. Das Plasmid pCLRE4 wurde auch an einer ClaI-Stelle im L41-Gen verdaut, um den Unterschied der Transformationsfrequenz aufgrund des Unterschieds der integrierten Zielgene zu vergleichen.
Zwei Läufe des Experiments wurden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2 Transformation mit den Plasmiden pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 und pCLRE7
Der Verdau im rDNA-Fragment der Plasmide pCLRE4, pCLRE6 oder pCLRE7 ergab eine hohe Transformationsfrequenz und etliche hundert Transformanten wurden pro 1 μg DNA bei jedem der Plasmide erhalten. Andererseits war bei dem Verdau des Plasmids pCLRE5 mit entweder BamHI oder XbaI die Transformationsfrequenz sehr niedrig im Vergleich zu den anderen Plasmiden. Dies zeigt an, dass die Transformationsfrequenz stark variiert, abhängig von den als Ziel für die Transformation verwendeten Fragmenten, und zwar selbst in der rDNA-Region.
Zusätzlich ergab ein Verdau des Plasmids pCLRE4 an der ClaI-Stelle im L41-Gen eine Transformationsfrequenz von ungefähr 1/10 bis ungefähr 1/50, verglichen mit dem Verdau an der BglII-Stelle in der rDNA. Weiterhin zeigt die unten beschriebene Southern-Analyse, dass das Plasmidmolekül im L41-Gen-Lokus integriert war, wenn es an der ClaI-Stelle verdaut wurde und im rDNA-Lokus, wenn es an der BglII-Stelle verdaut war.
Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass die Verwendung der rDNA mit multiplen Zahlen von Kopien im Chromosom als Ziel zu einer hohen Transformationsfrequenz führt.
3) Southera-Analyse
Cycloheximid-resistente Stämme wurden mit pCLRE4 hergestellt, verdaut mit BglII oder ClaI, pCLRE5, verdaut mit XbaI, pCLRE6, verdaut mit BamHI und pCLRE7, verdaut mit ApaI. Vier Stämme wurden im Hinblick auf jedes Plasmid erhalten. Aus diesen Stämmen wurden chromosomale DNAs hergestellt. Die hergestellten DNA-Proben wurden mit BglII oder mit BglII und NotI verdaut und einer Southern-Analyse mit einem ³²P-markierten 1,8 kb BamHI-HindIII-Fragment, enthaltend das L41-Gen (12) als Sonde (21) unterworfen.
Im Hinblick auf den Stamm, in den das Plasmid pCLRE4 integriert worden war, wurde durch Verdau mit BglII, eine 8,4 kb-Bande mit derselben Größe wie die Plasmid-DNA, erzeugt durch das Schneiden an der BglII-Stelle im Plasmid-DNA-Molekül zusätzlich zu der 5,4 kb-Bande, abstammend von dem endogenen L41-Gen (21(1), Spur 1–8) beobachtet. Weiterhin wurde im Hinblick auf den Stamm, in den das Plasmid, verdaut mit ClaI integriert worden war, 7,4 kb- und 6,4 kb-Banden zusätzlich zu den zwei Banden, wie gerade beschrieben, beobachtet (Spur 1–4). Die beiden Banden wurden aus der Gegenwart der BglII-Stellen in den Plasmid-Molekülen an beiden Enden des integrierten Plasmid-Moleküls erzeugt und erzeugt durch Insertion der Plasmide an einem der chromosomalen L41-Gen-Loki und den BglII-Stellen im L41-Gen. Dies zeigte an, dass die Plasmidmoleküle in den L41-Gen-Lokus durch homologe Rekombination integriert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Plasmidmoleküle in den L41-Gen-Lokus integriert wurden, wenn an der ClaI-Stelle verdaut wurde bzw. in den rDNA-Lokus, wenn an der BglII-Stelle verdaut wurde. Dies zeigt, dass die Positionen zur Integration des Plasmids, abhängig von der Schnittstelle selektiert werden können. Da weiterhin in den Spuren 1 bis 4, 5,4 kb-, 7,4 kb- und 6,4 kb-Banden mit fast derselben Dichte vorlagen, wurde die Gegenwart von 2 Kopien des L41-Gens in dem Chromosom belegt.
In den Stämmen, worin die Plasmide pCLRE5, pCLRE6 und pCLRE7 durch BglII- und NotI-Verdau integriert worden waren, wurden einige Banden, die von den in das Chromosom integrierten Plasmiden abstammten, zusätzlich zu der 5,4 kb-Bande, abstammend von dem endogenen L41-Gen (21(2)) beobachtet. Unter diesen wurden Banden mit derselben Größe wie die Plasmide beobachtet, d.h. die 7,3 kb-Bande für pCLRE5 (Spuren 1–4), die 8,0 kb-Bande für pCLRE6 (Spuren 5–8) und die 9,4 kb-Bande für pCLRE7 (Spuren 9–12). Diese Banden werden von den benachbarten Plasmiden erzeugt, die in Tandem durch Verdau mit NotI integriert wurden, mit nur einer Schnittstelle auf diesem Plasmid. Weiterhin wurden auch die 7 kb-Bande in pCLRE5 (Spuren 1–4), die 6,9 kb-Bande in pCLRE6 (Spuren 5–8) und die 11 kb-Bande in pCLRE7 (Spuren 9–12) beobachtet. Diese Größen sind dieselben wie die Längen des Fragments von der BglII-Stelle im rDNA-Lokus bis zu den NotI-Stellen in den Plasmid-DNAs, erhalten durch BglII + NotI-Verdau, wenn die Plasmid-DNAs in den rDNA-Lokus durch homologe Rekombination integriert wurden. Dies zeigt an, dass die Plasmid-DNAs an den Schnittstellen in das Chromosom durch homologe Rekombination integriert wurden.
Die Zahl der Kopien des integrierten Plasmids wurde durch Vergleich der Dichten der Banden unter der Annahme erhalten, dass die 5,4 kb-Banden in den Spuren 1–4 in 21(1) zu einer Kopie des L41-Gens korrespondierten, die 5,4 kb-Banden in den Spuren 5–8 in 21(1) und in Spuren 1–12 in 21(2) zu zwei Kopien des L41-Gens korrespondierten. Die Dichte der Banden wurde mit einem Imaging Analyzer BAS200 (Fuji Film) gemessen.
Es ergab sich, dass von drei Kopien (Spur 4) bis zu fünf Kopien (Spuren 1 und 3) des Plasmids pCLRE4 in den L41-Gen-Lokus inseriert waren und von zwei Kopien (Spur 8) bis acht Kopien (Spur 5) in den rDNA-Lokus. Aus diesen Ergebnissen wurde beobachtet, dass Stämme, worin die Plasmid-DNAs in den rDNA-Lokus mit höherer Kopiezahl integriert worden waren, zu einer Selektion neigen. Es wird auch durch die Tatsache nahegelegt, dass in den Stämmen von Beispiel 12, worin das Plasmid pCLRE2 in den rDNA-Lokus integriert wurde, die Zahl von Kopien der Plasmid-DNA, die integriert waren, 6 bis 15 war, während bei dem Stamm von Beispiel 16, worin das Plasmid pCLRE2 in den URA3-Gen-Lokus integriert war, die Zahl der Plasmid-DNA, die integriert war, ungefähr 3 bis 4 betrug.
Es ergab sich auch, dass von drei Kopien (21(2), Spur 4) bis fünf Kopien (Spur 2) des Plasmids pCLRE5, von drei Kopien (Spur 8) bis sechs Kopien (Spuren 5 und 6) des Plasmids pCLRE6 bzw. von drei Kopien (Spur 12) bis fünf Kopien (Spur 9) des Plasmids pCLRE7 integriert wurden.
Beispiel 16: Integration des Plasmids in den URA3-Gen-Lokus
Das Plasmid pCLURA1 wurde durch Insertion des 5 kb EcoRI-Fragments, enthaltend das URA3-Gen (7) in die EcoRI-Stelle des Plasmids pCLBS12 (15) konstruiert. Das Plasmid wurde an der PstI-Stelle im URA3-Gen-Lokus geschnitten. Der ATCC 9950-Stamm wurde mit diesem Plasmid gemäß dem elektrischen Pulsverfahren, wie in Beispiel 11 beschrieben, transformiert. Der Puls wurde unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 800 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm angelegt. So wurden hierdurch vierzig Cycloheximid-resistente Kolonien pro 1 μg DNA erhalten.
Chromosomale DNAs wurden für vier Klone unter den so erhaltenen Cycloheximid-resistenten Stämmen hergestellt. Die so hergestellte DNA wurde mit BglII oder mit SalI + NotI verdaut und einer Southern-Analyse unterworfen. Als Sonden wurden das 1,8 kb BamHI-HindIII-Fragment, enthaltend das L41-Gen (dargestellt in 12) für die mit BglII verdaute DNA und das 2,3 kb HindIII-EcoRI-Fragment, enthaltend das URA3-Gen (dargestellt in 8) für die mit SalI + NotI verdaute DNA nach Markierung mit ³²P verwendet.
Die Ergebnisse sind in 22 dargestellt. Im Hinblick auf den Elternstamm ATCC 9950 wurde, wenn das URA3-Gen als Sonde für die mit SalI + NotI verdaute DNA verwendet wurde, eine 13 kb-Bande, abstammend von dem endogenen URA3-Gen beobachtet (22(1), Spur 1). Andererseits wurde im Hinblick auf den resistenten Stamm zusätzlich zu der 13 kb-Bande eine 10 kb-Bande, erzeugt von dem NotI-Verdau von etlichen Plasmiden, die in Tandem integriert waren, 8,4 kb- und 14 kb-Banden, erzeugt durch Insertion der Plasmide an einem der URA3-Gene auf dem Chromosom beobachtet (Spuren 2 bis 5). Diese beiden Banden wurden aus der Gegenwart der NotI-Stellen in den Plasmidmolekülen an beiden Enden des integrierten Plasmidmoleküls erzeugt und der SalI-Stelle in der URA3-Genregion. Dies zeigte an, dass die Plasmidmoleküle durch homologe Rekombination in den URA3-Gen-Lokus integriert wurden.
Weiterhin haben in den Transformanten, die 13 kb-Bande, abstammend von dem endogenen URA3-Gen und die 8,4 kb- und 14 kb-Banden, abstammend von den Plasmidmolekülen, integriert in das Chromosom, fast dieselben Dichten. Dies zeigte, dass die Zahl der Kopien des URA3-Gens zwei Kopien pro Zelle ist, wie beim L41-Gen und dass eine Kopie in den Transformanten durch Insertion der Plasmide unterbrochen wurde. Es ergab sich auch durch Vergleich dieser vier Banden (14 kb, 13 kb, 10 kb und 8,4 kb), dass die Zahl der integrierten Plasmide drei Kopien (Spuren 3 und 5) oder vier Kopien (Spuren 2 und 4) betrug.
Wenn das L41-Gen als Sonde für die mit BglII verdaute DNA verwendet wird, wurde eine 5,4 kb-Bande, abstammend von dem endogenen L41-Gen im Elternstamm ATCC9950 beobachtet. Zusätzlich zu der 5,4 kb-Bande wurde eine 10 kb-Bande mit derselben Größe wie der Plasmid-DNA bei den resistenten Stämmen beobachtet (Spuren 2 bis 5).
Beispiel 17: Expression eines heterologen Gens, Glucoamylasegen, in Candida utilis
(1) Konstruktion von Plasmiden für die Expression des Glucoamylasegens (STA1-Gen)
Ein Plasmid zur Expression des STA1-Gens wurde gemäß den in 23 illustrieren Verfahren konstruiert.
Das STA1-Gen wurde zunächst aus einer genomischen DNA-Bibliothek von Saccharomyces diastaticus 5106-9A (leu2, arg4, STA1) (Yamashita und Fukui, Agric. Biol. Chem., 47, 2689-2692) gemäß dem folgenden Verfahren kloniert. Chromosomale DNA wurde aus der 5106-9A-Zelle hergestellt, teilweise mit Sau3AI verdaut und einer Agarosegelelektrophorese zur Herstellung von ungefähr 20 bis 30 kb DNA-Fragmenten unterworfen. Die DNA-Fragmente und der λ-Phagenvektor EMBL3, verdaut mit BamHI und dann dephosphoryliert (Stratagene Cloning Systems) wurden mit T4-Ligase ligiert. Die ligierte Mischung wurde in vitro mit GigapackII Gold Packaging Extract (Stratagene Cloning Systems) verpackt, um die genomische DNA-Bibliothek der chromosomalen DNA zu konstruieren.
Zwei Oligonukleotide:
5'ACCACTATTACCACTACGGTTTGCTCTACA3' (SEQ ID NO: 19) und
5'GACACATCTCTGACGAGCATGACTTGGTTG3' (SEQ ID NO: 20), die auf der Basis der beschriebenen DNA-Sequenz des STA1-Gens (Yamashita et al., J. Bacteriol., 161, 567–573, 1985) synthetisiert worden waren, wurden mit ³²P an dem Ende mit T4-Kinase markiert und als Sonde für das Screening von ungefähr 20.000 Plaques der genomischen DNA-Bibliothek verwendet. Im Ergebnis wurde ein Klon, der für jede der beiden Sonden positiv war, erhalten.
Von dem Phagenklon, enthaltend das STA1-Gen, wurde ein 4 kb-BglII-HpaI-Fragment, enthaltend das STA1-Gen zwischen BamHI und HindIII von pUC19 kloniert, um das Plasmid pUSTA1 zu konstruieren (23).
Weiterhin wurde das Plasmid pUSTA1 mit einer StuI-Stelle geschnitten, die 5 bp stromabwärts vom Initiationscodon ATG vorlag und dem folgenden synthetischen Adapter (SEQ ID NO: 21), enthaltend eine XbaI-Stelle und ein Initiationscodon:
5'-CTAGATGGTAGG-3'
3'-TACCATCC-5'
wurden ligiert. Dann ergab der Teilverdau des Plasmids mit SalI das STA-Gen als ein 2,7 kb XbaI-SalI-Fragment.
Weiterhin wurde pUC12 mit PstI und HindIII verdaut, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und BglII-Linker wurden ligiert, um ein Plasmid pUC12BglII zu konstruieren. Das 2,7 kb XbaI-SalII-Fragment, enthaltend das STA1-Gen, wurde zwischen XbaI und SalII des Plasmids pUC12BgII inseriert, um ein Plasmid pUSTA2 zu konstruieren.
Das 2,7 kb XbaI-BglII-Fragment wurde aus dem Plasmid STA2 ausgeschnitten und zwischen die XbaI- und BamHI-Stellen des Expressionsvektors pPGKPT4 inseriert, um ein Plasmid pGKSTA1 zu konstruieren.
Weiterhin wurde ein 4,9 kb NotI-Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das STA1-Gen und den PGK-Gen-Terminator aus dem Plasmid pGKSTA1 ausgeschnitten. Das Fragment wurde in die NotI-Stelle des Plasmids pCLBS12 inseriert, um ein Plasmid pCLSTA1 zu konstruieren bzw. in die NotI-Stelle des Plasmids pCLRE4, um ein Plasmid pCLRSTA1 zu konstruieren.
(2) Transformation von Candida utilis und Glucoamylaseexpression
Die ATCC 9950-, ATCC 9226- und ATCC 9256-Stämme wurden mit dem Plasmid pCLRSTA1, verdaut mit BglII, gemäß dem elektrischen Pulsverfahren, wie beschrieben in Beispiel 11, transformiert. Der Puls wurde unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 3,75 KV/cm oder 6,25 KV/cm angelegt.
Cycloheximid-resistente Kolonien wurden in jedem der Stämme erhalten, obwohl sich die Frequenzen je nach Stamm unterschieden.
Die Glucoamylaseaktivität wurde für zwei Stämme von jedem der Transformanten auf einer Platte mit Stärke als Substrat (3 % lösliche Stärke (Katayama), 2 % Polypepton, 1 % Hefeextrakt, 3,3 × 10^–3 % Bromocresolpurpur, 2 % Bacto-Agar) überprüft. Im Ergebnis wurde für alle der Transformanten, die von den drei Stämmen abstammten, Halos aufgrund sezernierter Glucoamylase beobachtet. So wurde die Expression des Gens bestätigt. Zusätzlich wurde der ATCC 9950-Stamm mit einem AflII-verdauten Plasmid pCLSTA1 transformiert. Wenn die Expression des Glucoamylasegens, integriert in den L41-Gen-Lokus, weiter überprüft wurde, wurde ebenfalls die Bildung von Halos beobachtet.
Weiterhin wurden die Glucoamylaseaktivitäten dieser Transformanten gemessen. Die Zellen wurden über Nacht in flüssigem YPD-Medium kultiviert und der Überstand wurde als Rohenzymlösung verwendet. Die Reaktion wurde in 500 μl einer Reaktionslösung durchgeführt, enthaltend 400 μl der Rohenzymlösung, 0,5 % lösliche Stärke und 100 mM Natriumacetat (pH 5,0), bei 50°C für 20 Minuten. Nach der Reaktion wurde das Enzym durch Wärmebehandlung bei 100°C für 5 Minuten inaktiviert und die Glucosekonzentration, die erzeugt wurde, wurde mit einem kommerziell erhältlichen Kit (Glucose B-Test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) bestimmt.
Die Glucoamylaseaktivität wurde als 1 Einheit definiert, wenn die Menge der unter den Reaktionsbedingungen isolierten Glucose 100 μg betrug. Die Aktivitätswerte pro 1 ml Überstand der Kultur sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3 Glucoamylaseaktivitäten der Candida utilis-Hefen, transformiert mit den Plasmiden pCLSTA1 oder pCLRSTA1
Die Aktivitäten wurden an zwei unabhängig transformierten Stämmen gemessen.
-: keine Messung.
Es ergab sich, dass die Signalsequenz des Glucoamylaseproteins erkannt wurde und das Enzym wurde in das Medium bei den ATCC 9950-, 9226- und 9256-Stämmen sezerniert, obwohl Glucoamylase ein von Saccharomyces diastaticus abgeleitetes heterologes Protein ist.
Weiterhin wurden zwei ATCC 9950-Stämme, transformiert mit jedem des Plasmids pCLSTA1, verdaut mit BglII oder des Plasmids pCLSTA1, verdaut mit AflII, in flüssigem YPD-Medium, enthaltend 40 μg/ml Cycloheximid und 5 % Glucose 4 Tage bei 30°C kultiviert. Ein 10 μl-Anteil des kultivierten Mediums wurde auf ein 4 bis 20 % SDS-Polyacrylamidgel gegeben und der entsprechenden Elektrophorese unterzogen, um die Proteine in der Kultur zu analysieren (24). Das Gel wurde mit Coomassie brilliant blue gefärbt. Als Kontrolle wurde Kulturmedium des Stamms, transformiert mit dem BglIIverdauten Plasmid pCLRE2 analysiert (Spur 1). Ein ungefähr 100 kDa-Protein, korrespondierend zur Glucoamylase, wurde in jeder der Kulturen beobachtet und die Proteinmenge wurde auf ungefähr 2 bis 5 μg aus den Dichten der gefärbten Banden geschätzt. Dies zeigt an, dass das Glucoamylasegen in hohem Niveau exprimiert wurde und ins Medium sezerniert wird. Es ergab sich so, dass Candida utilis als geeignetes Wirts-/Vektorsystem zur Erzeugung sekretorischer Proteine verwendet werden kann.
Beispiel 18: Expression eines heterologen Gens (lacZ-Gen) in Candida utilis
(1) Konstruktion von Plasmiden zur Expression des lacZ-Gens
Plasmide zur Expression des lacZ-Gens wurden gemäß dem in 25 illustrierten Verfahren konstruiert.
Zunächst wurde das lacZ-Gen, codierend β-Galactosidase, als 3,1 kb BamHI-Fragment aus dem Plasmid pMC1871 (Pharmacia) ausgeschnitten. Das Fragment wurde in die BglII-Stelle des Plasmids YEp13K (Sone et al., Appl. Environ. Microbiol., 54, 38–42 (1988)) ligiert, um ein Plasmid pZ4 zu selektieren mit einer HindIII-Stelle an der 5'-Seite des Gens.
Ein lacZ-Gen mit einem Initiationscodon ATG wurde als 3,1 kb HindIII-XhoI-Fragment aus dem Plasmid ausgeschnitten. Das Fragment wurde dann zwischen die Stellen von HindIII und XhoI in pBluescript SK^– ligiert, um ein Plasmid pLACZ1 zu konstruieren.
Dieses Plasmid wurde mit HindIII + XbaI verdaut, einer Klenow-Behandlung unterworfen und wiederum cyclisch gemacht, um ein Plasmid pLACZ2 zu konstruieren.
Weiterhin wurde das lacZ-Gen als 3,1 kb XbaI-KpnI-Fragment aus dem Plasmid ausgeschnitten und zwischen den Stellen von XbaI und KpnI in dem Plasmid pPGKPT5 (4) zur Konstruktion eines Plasmids pGKLAC1 ligiert.
Zusätzlich wurde ein 5,4 kb NotI-Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das lacZ-Gen und den PGK-Gen-Terminator aus dem Plasmid pGKLAC1 ausgeschnitten und in die NotI-Stelle des Plasmids pCLBS12 inseriert bzw. die NotI-Stelle des Plasmids pCLRE4, um die Plasmide pCLLAC1 und pCLRLAC1 zu konstruieren.
(2) Transformation von Candida utilis und Bestätigung der β-Galactosidaseaktivität
Der ATCC 9950-Stamm wurde mit dem Plasmid pCLRLAC1, verdaut mit BglII oder dem Plasmid pCLLAC1, verdaut mit AflII, durch das in Beispiel 11 beschriebene elektrische Pulsverfahren transformiert. Zwei Stämme von jedem der transformierten ATCC 9950-Stämme wurden bis zur logarithmischen Wachstumsphase (OD₆₀₀ = ungefähr 2 bis 3) in 5 ml flüssigem YPD-Medium 6 Stunden kultiviert. Die β-Galactosidaseaktivität wurde gemäß den in Methods in Yeast Genetics – A Laboratory Course Manual – Rose, M.D. et al., S. 155–159, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990) beschriebenen Verfahren gemessen. Spezifisch wurden, nachdem die gesammelten Zellen in 1 ml Z-Puffer suspendiert worden waren, 3 Tropfen Chloroform und 2 Tropfen 0,1 % SDS zugefügt und die Mischung 10 Sekunden mit einem Vortex behandelt. Nach Inkubation für 5 Minuten bei 28°C wurden 0,2 ml ONPG-Lösung zugefügt und die Mischung wurde weitere 10 Minuten inkubiert. Dann wurden 0,5 ml Na₂CO₃-Lösung zugefügt, um die Reaktion zu beenden. Nach Messung der OD₄₂₀ wurde die β-Galactosidaseaktivität gemäß der Gleichung berechnet. Die β-Galactosidaseaktivität wurde als 1 Einheit definiert, wenn ortho-Nitrophenol in einer Menge von 1 nmol bei 28°C für 1 Minute erzeugt wird. Die Aktivitäten der erhaltenen Zellen pro OD₆₀₀ sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4 β-Galactosidaseaktivitäten der ATCC 9950-Stämme, transformiert mit den Plasmiden pCLLAC1 oder pCLRLAC1
Aus dem Ergebnis wurde bestätigt, dass beide mit den Plasmiden pCLRLAC1 oder pCLLAC1 transformierten ATCC 9950-Stämme die Aktivität zeigten, was anzeigt, dass das von E. coli abstammende lacZ-Gen exprimiert und aktive β-Galactosidase in Candida utilis erzeugt wurde. Es war bekannt, dass das Leucin-Codon CUG in einigen Hefen der Candida-Gattung, wie z.B. Candida maltosa oder C. albicans, in Serin translatiert wird (Ohama et al., Nucleic Acids Res., 21, 4039–4045, 1993), so das das von E. coli abstammende lacZ-Gen nicht in eine aktive β-Galactosidase translatiert wird (Sugiyama et al., Yeast, 11, 43–52 (1995)). In diesem Beispiel wird aktive β-Galactosidase in Candida utilis erzeugt und es wurde in Beispiel 17 gezeigt, dass Glucoamylase in hoher Menge erzeugt wird. Es wird so angenommen, dass Candida utilis als Wirt zur Expression heterologer Gene verwendet werden kann.
Beispiel 19: Expression eines heterologen Gens (APT-Gen) in Candida utilis
(1) Konstruktion von Plasmiden zur Expression des APT-Gens
Plasmide zur Expression des APT-Gens wurden gemäß dem in 26 illustrierten Verfahren konstruiert.
Zunächst wurde ein 1,1 kb XhoI-PstI-Fragment aus dem Plasmid pUC4K (Pharmacia) ausgeschnitten, enthaltend Aminoglycosidphosphotransferase, abstammend von dem Transposon Tn903 (APT-Gen) und zwischen SalI und PstI von pUC19 inseriert, um ein Plasmid pAPH1 zu konstruieren.
Nachdem das Plasmid pAPH1 mit PstI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase zur Bildung glatter Enden behandelt worden war, wurden BglII-Linker (5'CAGATCTG3') inseriert, um ein Plasmid pAPH2 zu bilden.
Weiterhin wurde das APT-Gen als 1,1 kb XbaI-BglII-Fragment aus dem Plasmid pAPH2 ausgeschnitten und zwischen die XbaI- und BamHI-Stellen des Expressionsvektors pPGKPT4 (4) zur Konstruktion eines Plasmids pGKAPH1 inseriert.
Zusätzlich wurde ein 3,3 kb NotI-Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das APT-Gen und den PGK-Terminator aus dem Plasmid pGKAPH1 ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann in die NotI-Stelle der Plasmide pCLBS12 und pCLRE4 zur Konstruktion der Plasmide pCLAPH1 bzw. pCLRAPH1 inseriert.
(2) Transformation von Candida utilis und Bestätigung einer Resistenz gegen G418
Die ATCC 9950-, ATCC 9226- und ATCC 9256-Stämme wurden mit dem Plasmid pCLRAPH1, verdaut mit BglII gemäß dem in Beispiel 11 beschriebenen elektrischen Pulsverfahren transformiert. Der Puls wurde unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 3,75 KV/cm oder 6,25 KV/cm angelegt.
Als Ergebnis wurden Cycloheximid-resistente Kolonien bei jedem der Stämme erhalten, obwohl sich die Frequenzen je nach Stamm unterschieden. Das Zellwachstum wurde für zwei Stämme von jedem der Transformanten auf YPD-Platten, enthaltend verschiedene G418-Konzentrationen, überprüft. Im Ergebnis wurde das Wachstum der Transformanten für alle drei Stämme von Candida utilis bestätigt und dies zeigt an, dass das APT-Gen in diesen Transformanten exprimiert wird.
Zusätzlich wurde der ATCC 9950-Stamm mit einem AflII-verdauten Plasmid pCLAPH1 transformiert, um die Expression von Genen zu untersuchen, die am L41-Gen-Lokus integriert wurden. Im Ergebnis wurde das Wachstum von Transformanten für den Stamm bestätigt und die Expression wurde ebenfalls an dem APT-Gen, integriert am L41-Gen-Lokus bestätigt.
(3) Stabilität des integrierten Plasmids
Die Stabilität der integrierten Plasmid-DNA wurde in dem folgenden Verfahren für zwei ATCC-9950-Stämme überprüft, die jeweils mit dem Plasmid pCLRAPH1, verdaut mit BglII oder dem Plasmid pCLAPH1, verdaut mit AflII, transformiert waren. Die Transformante wurde zunächst bis zur stationären Phase in 5 ml flüssigem YPD-Medium, enthaltend 40 μg/ml Cycloheximid, kultiviert. Die Generationszahl zu dem Zeitpunkt wurde als null bezeichnet. Dann wurde ein 5 μl Teil der Zellkultur in 5 ml flüssigem YPD-Medium inokuliert und bis zur stationären Phase kultiviert. Die Generationszahl zu diesem Zeitpunkt wurde als zehn bezeichnet. Diese Prozedur wurde wiederholt, um die Zellen bis zur 20ten Generation zu kultivieren. Die Stabilität des Plasmids wurde durch Verteilen der verdünnten Zellsuspension auf einer YPD-Platte und einer YPD-Platte, enthaltend 40 μg/ml Cycloheximid, Kultivierung der Platte für 2 Tage bei 30°C und Zählen der Kolonien berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5 Stability von Plasmid-DNA, integriert in das Chromosom von ATCC 9950
Es wurde aus den Ergebnissen bestätigt, dass die DNA-Fragmente, inseriert in einen rDNA-Lokus und in den L41-Gen-Lokus stabil sind.
Beispiel 20: Selektion von Candida utilis-Transformanten unter Verwendung der G418-Resistenz als selektierbaren Marker
Das Plasmid pCLRAPH1 enthält das mutierte L41-Gen, das eine Resistenz gegenüber Cycloheximid verleiht und das APT-Gen, das eine Resistenz gegenüber G418 verleiht, als selektierbare Marker für die Transformanten. Da bestätigt wurde, dass das APT-Gen durch den PGK-Gen-Promotor exprimiert wird, versuchte man, eine direkte Selektion von Transformanten durch Resistenz gegenüber G418.
Das Plasmid pCLRAPH1 wurde mit BglII zur Bildung eines linearen Plasmids verdaut. Der ATCC 9950-Stamm wurde mit dem linearisierten Plasmid durch das elektrische Pulsverfahren von Beispiel 11 transformiert. Der Puls wurde unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm angelegt. Die Zellen wurden in YPD-Medium, enthaltend 1 M Sorbit, für 6 Stunden kultiviert und auf einer YPD-Platte, enthaltend Cycloheximid und einer YPD-Platte, enthaltend 150 μg/ml G418, kultiviert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6 Selektion von ATCC 9950-Transformanten mit dem Plasmid pCLRAPH1 durch unterschiedliche Arzneimittelresistenzmarker

* Zahl der Transformanten pro 0,1 μg DNA;
* Die Konzentration von G418 und Cycloheximid wurde auf 150 μg/ml bzw. 40 μg/ml eingestellt.
-: Nicht gemessen.

Es wird durch dieses Ergebnis gezeigt, dass die Zahl von Kolonien, selektiert durch Resistenz gegen G418, 10mal größer ist als diejenige, selektiert durch Resistenz gegen Cycloheximid.
Es wurde chromosomale DNA für 4 Kolonien hergestellt, selektiert durch Resistenz gegen G418 und 4 Kolonien, selektiert durch Resistenz gegen Cycloheximid. Die so hergestellte DNA wurde mit BglII + NotI verdaut und einer Southern-Analyse mit dem ³²P-markierten 1,8 kb BamHI-HindIII-Fragment, enthaltend das L41-Gen als Sonde, unterworfen (27). Im Ergebnis wurde eine 4,4 kb-Bande, abstammend von dem Plasmid, zusätzlich zu der 5,4 kb-Bande, abstammend von dem endogenen L41-Gen, beobachtet. Die Dichten der Banden wurden mit einem Imaging Analyzer BAS 2000 (Fuji Film) gemessen. Die Kopienzahl des integrierten Plasmids wurde durch Vergleich der Bande, abstammend von dem Plasmid mit der Bande, abstammend von dem endogenen L41-Gen (2 Kopien/Zelle) berechnet. Es wurde angezeigt, dass die Plasmide von vier (Spur 2) bis sieben Kopien (Spur 5) bei den Stämmen vorlagen, die durch Resistenz gegen Cycloheximid gewählt wurden. Es wurde auch berechnet, dass die Plasmide in einer Kopie (Spuren 6 bis 9) bei allen der vier Stämme vorlagen, gewählt durch Resistenz gegen G418. Diese Ergebnisse zeigen an, dass Stämme, worin eine Vielzahl von Plasmiden integriert wurden, einfach erhalten werden können, während die Transformationsfrequenz niedrig wird, wenn das mutierte L41-Gen als Marker zur Selektion der Transformanten verwendet wurde.
Weiterhin wurde das Plasmid pGKAPH1 mit NotI verdaut und in zwei Fragmente unterteilt. Das heißt, das Plasmid wurde in ein Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das APT-Gen und den PGK-Gen-Terminator und ein Vektor-Fragment unterteilt. Mit diesen Fragmenten wurde der ATCC 9950-Stamm transformiert. Ein Puls wurde unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm angelegt. Wenn Transformanten auf einer YPD-Platte, enthaltend 200 μg/ml G418 selektiert wurden, wurden 156 Transformanten auf der Basis von 1 μg DNA erhalten. Dies zeigt an, dass in der Candida utilis-Hefe die Transformation durch Genersatz ebenfalls beobachtet wird, zusätzlich zu der Transformation durch Geninsertion mit dem Plasmid pCLRAPH1, linearisiert durch Verdau mit BglII. Es ergab sich auch, dass die Transformation durch Genersatz effizient auftritt, da die Transformationsfrequenz relativ hoch lag.
Beispiel 21: Verkürzung des PGK-Gen-Promotors und Identifizierung einer minimalen funktionalen Region
Der in den Beispielen 17 bis 20 verwendete PGK-Gen-Promotor sollte versuchsweise verkürzt werden, um die minimalen funktionellen Regionen des Promotors zu identifizieren.
Zunächst wurden fünf Fragmente, enthaltend unterschiedlich lange PGK-Gen-Promotoren, das APT-Gen und den PGK-Gen-Terminator unter Verwendung der Restriktionsenzymstellen in dem PGK-Gen-Promotorfragment des Plasmids pGKAPH1, beschrieben in Beispiel 19, erhalten. Das heißt, das Plasmid pGKAPH1 wurde mit NotI, SacI, EcoRI + SacI oder PstI + SacI verdaut, um vier Fragmente herzustellen. Das Plasmid pGKAPH1 wurde mit SphI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase zur Bildung glatter Enden behandelt. BamHI-Linker (5'CCGGATCCGG3': SEQ ID NO: 22) wurden hinzugefügt und ein Verdau mit BamHI und NotI wurde durchgeführt, um ein anderes Fragment zu erhalten.
Von den durch Verdau des Plasmids pCRE2, wie beschrieben in Beispiel 5 mit HindIII erhaltenen 0,7 kb- und 5,8 kb-Fragmenten, wurde das 5,8 kb-Fragment durch Ligation wiederum cyclisch gemacht, um ein Plasmid pCRE8 zu bilden (28). Das Plasmid pCRE8 wurde mit NotI, BamHI + NotI, SacI, EcoRI + SacI oder PstI + SacI verdaut, mit den oben beschriebenen Fragmenten zur Konstruktion der Plasmide pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4, pCRAPH5 und pCRAPH6 ligiert (28). Das in jedem der Plasmide enthaltene PGK-Gen-Promotorfragment hatte eine Länge von 1,35 kb in pCRAPH2, 0,83 kb in pCRAPH3, 0,46 kb in pCRAPH4, 0,40 kb in pCRAPH5 und 0,16 kb in pCRAPH6.
Nachdem jedes der Plasmide pCRAPH2, 3, 4, 5 und 6, wie so konstruiert, durch Verdau mit BaglII linearisiert worden war, wurden sie zur Transformation des ATCC 9950-Stamms gemäß dem elektrischen Pulsverfahren, wie beschrieben in Beispiel 11, verwendet. Der Puls wurde unter Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm angelegt.
Transformanten wurden auf einer YPD-Platte, enthaltend 200 μg/ml G418, selektiert. Wenn die Plasmide pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4 und pCRAPH5 verwendet wurden, wurden ungefähr 300 Transformanten erhalten, auf Basis von 1 μg DNA bei jedem Plasmid. Mit dem Plasmid CRAPH6 wurde jedoch keine Transformante erhalten. Dies zeigt an, dass das Fragment, das die Region von dem Nukleotid direkt vor dem Initiationscodon ATG des PGK-Gens bis zur PstI-Stelle bei 169 bp stromaufwärts vom 5'-Ende keine Funktion als transkriptioneller Promotor aufweist, dass jedoch das Fragment, enthaltend bis zur EcoRI-Stelle, 401 bp stromaufwärts und weitere längere Regionen eine Funktion als transkriptioneller Promotor aufweist. Daher enthält in der 1346 bp-Sequenz, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, wie dargestellt in 3, die 401 bp-Sequenz von der 946ten EcoRI-Stelle bis zum 1346ten Nukleotid direkt vor dem ATG eine Sequenz, die für die Promotorfunktion nötig ist.
Beispiel 22: Klonierung des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase-(GAP)-Gens und Sequenzierung der DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend das GAP-Gen
Die Klonierung des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase-(GAP)-Gens in Candida utilis wurde mit der genomischen DNA-Bibliothek von Candida utilis, konstruiert in Beispiel 2, als DNA-Bibliothek durch das Hybridisierungsverfahren mit einem bekannten GAP-Gen von anderen Organismen als Sonde durchgeführt. Filter mit adsorbierter Phagen-DNA von ungefähr 20.000 Plaques der oben beschriebenen Bibliothek darauf wurden gemäß dem in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, S. 2, 95–121, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschriebenen Verfahren hergestellt. Andererseits wurde ein ungefähr 1 kb AsuII-AflII-Fragment aus einem Derivatplasmid von pUC18 ausgeschnitten, das sich ein 2,1 kb HindIII-Fragment erhielt, enthaltend das GAP-Gen von Saccharomyces cerevisiae (Yamano et al., Journal of Biotechnology, 32, 165–171 (1994)) als ein Fragment, umfassend fast das ganze GAP-Gen. Das Fragment wurde mit ³²P-markiert und eine Hybridisierung wurde mit dem markierten Fragment als Sonde durchgeführt. Drei positive Plaques wurden isoliert. Eine Phagen-DNA, hergestellt von einem dieser Plaques, wurde subkloniert und ein 6,5 kb EcoRI- Fragment, enthalten in der Phagen-DNA, wurde isoliert. Das Fragment wurde dann in die EcoRI-Stelle des Plasmidvektors pBluescript IISK+ inseriert, um die Plasmide pGAP1 und 2 zu konstruieren (29).
Das isolierte 6,5 kb EcoRI-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII, ClaI, SmaI oder SpeI allein oder in Kombination verdaut und eine Southern-Hybridisierung wurde an den resultierenden Fragmenten mit dem GAP-Gen von Saccharomyces cerevisiae als Sonde durchgeführt. Eine starke Hybridisierung wurde mit dem 3,8 kb HindIII-SpeI-Fragment beobachtet. Das 3,8 kb HindIII-SpeI-Fragment wurde zwischen den Stellen von HindIII und SpeI der Plasmidvektoren pBluescript IISK+ oder pBluescript IIKS+ inseriert, um die Plasmide pGAP1 bzw. pGAP2 herzustellen. Deletionsmutanten an den Restriktionsenzymstellen wie HindIII, ClaI oder SmaI dieser Plasmide wurden hergestellt und kontinuierliche Deletionsmutanten wurden mit ExoIII und Mungobohnennuklease hergestellt, um Plasmide mit einer Varietät von Deletionsmutationen herzustellen und die Sequenz des 3749 bp HindIII-SpeI-Fragments wurde bestimmt (29).
Wenn die erwartete Strukturgenregion analysiert wurde, wurde ein 1.005 bp offener Leserahmen beobachtet. Im Hinblick auf die Aminosäuresequenz eines Genprodukts, deduziert aus dem Rahmen, wurde die Homologie zu dem GAP-Genprodukt von Saccharomyces cerevisiae überprüft. Diese Sequenzen zeigten 79,6 % Homologie zueinander, so dass das isolierte Gen demzufolge das GAP-Gen von Candida utilis sein musste. Weiterhin enthält das Fragment eine 975 bp Sequenz stromaufwärts vom Initiationscodon und eine 1.769 bp Sequenz stromabwärts vom Terminationscodon als regulatorischen Bereich. Die 975 bp Sequenz, die von der HindIII-Stelle bis zu direkt vor dem Initiationscodon ATG reicht, sollte den transkriptionellen Promotor enthalten und ist in 30 dargestellt. Weiterhin sollte die 802 bp-Sequenz, die sich von direkt hinter dem Terminationscodon TAA zu der AflIII-Stelle erstreckt, den transkriptionellen Terminator erhalten und ist in 31 dargestellt.
Beispiel 23: Konstruktion von Expressionsvektoren mit dem Promotor und Terminator des GAP-Gens
DNA-Fragmente, die entweder den Promotor oder den Terminator enthielten, wurden von den GAP-Gen-regulatorischen Regionen von Candida utilis durch das PCR-Verfahren erhalten (29).
Als Promotor wurde ein Fragment, das sich von der HindIII-Stelle bis zu direkt vor dem Initiationscodon ATG erstreckte, mit dem Plasmid pGAP1 als Matrize erhalten. Als Primer wurden die beiden Sequenzen
5'-CCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTGCCC-3' (SEQ ID NO: 23) und
5'-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3' (SEQ ID NO: 24) verwendet. Der Promotor wurde so synthetisiert, damit er eine XbaI-Stelle enthielt, die direkt vor dem Initiationscodon an der 3'-stromabwärts gelegenen Seite lokalisiert war.
Weiterhin wurde als Terminator ein Fragment von direkt nach dem Terminationscodon bis zur SpeI-Stelle von dem Plasmid pGAP1 als Matrize erhalten. Als Primer wurden die Sequenzen
5'-GGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGGG-3' (SEQ ID NO: 25) und
5'-GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3' (SEQ ID NO: 26) verwendet. Der Terminator wurde so synthetisiert, damit er eine BamHI-Stelle aufwies, die sich direkt nach dem Terminationscodon an der 5'-Seite befand.
Der PCR-Prozess wurde 30 Zyklen mit einer Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Das durch das PCR-Verfahren synthetisierte Promotorfragment wurde mit HindIII und XbaI verdaut, zwischen den Stellen von HindIII und XbaI des pUC19-Vektors inseriert, um ein Plasmid pUGpro zu konstruieren (32). Andererseits wurde das Terminatorfragment an der AflIII-Stelle ungefähr 0,8 kb stromabwärts vom Terminationscodon verdaut, mit Klenow-Enzym behandelt, um glatte Enden zu bilden und mit BamHI verdaut. Das so erhaltene 0,8 kb-Fragment wurde zwischen den BamHI und SmaI-Stelles des pUC19-Vektors inseriert, um ein Plasmid pUGter zu konstruieren (32).
Nachdem die EcoRI-Stelle am stromabwärts gelegenen Ende des GAP-Terminators des Plasmids pUGter mit Klenow-Enzym behandelt worden war, um glatte Enden zu bilden, wurden NotI-Linker (5'AGCGGCCGCT3': SEQ ID NO: 18) isoliert, um ein Plasmid pUGterN zu konstruieren. Weiterhin wurde ein 0,95 kb GAP-Promotorfragment aus dem Plasmid pUGpro mit HindIII und XbaI ausgeschnitten und zwischen den Stellen von HindIII und XbaI des pUGterN inseriert, um das Expressionsplasmid pGAPPT1 zu konstruieren. Weiterhin wurde die HindIII-Stelle am stromaufwärts gelegenen Ende des Promotors mit Klenow-Enzym behandelt, um glatte Enden zu bilden und mit NotI-Linkern ligiert (5'AGCGGCCGCT3': SEQ ID NO: 18), um ein Plasmid pGAPPT2 zu konstruieren (32).
Um zu bestätigen, dass das so konstruierte Expressionsplasmid pGAPPT2 praktisch in Candida utilis wirkt, wurde ein 1,1 kb APT-Genfragment, ausgeschnitten mit XbaI und BglII von dem Plasmid pAPH2, wie beschrieben in Beispiel 19, zwischen den Stellen von XbaI und BamHI des Plasmids pGAPPT2 inseriert, um ein Plasmid pGAPAPH1 zu konstruieren (32).
Nachdem das so konstruierte Plasmid pGAPAPH1 mit NotI verdaut worden war, wurde es für die Transformation des ATCC 9950-Stamms durch das elektrische Pulsverfahren unter Pulsbedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm verwendet. Transformanten wurden auf einer YPD-Platte, enthaltend 200 μg/ml G418, selektiert. Ungefähr 40 Transformanten wurden mit 0,1 μg DNA erhalten. Dies zeigte an, dass Promotor und Terminator des GAP-Gens aktiv waren.
Beispiel 24: Klonierung des Plasma-Membran-Protonen-ATPase-(PMA)-Gans und Sequenzierung der DNA-Sequenz eines DNA-Fragments, enthaltend das PMA-Gen
Die Klonierung des Plasma-Membran-Protonen-ATPase-(PMA)-Gens in Candida utilis wurde durch das Hybridisierungsverfahren unter Verwendung der genomischen DNA-Bibliothek von Candida utilis, konstruiert in Beispiel 2 und einem Teil des bekannten PMA-Gens von anderen Organismen als Sonde durchgeführt. Filter mit adsorbierter Phagen-DNA von ungefähr 20.000 Plaques der obigen Gen-Bibliothek darauf wurden gemäß dem in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, S. 2, 95–121, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschriebenen Verfahren hergestellt. Ein ungefähr 1 kb-Bereich, korrespondierend zu +1 bis +1027 (A des Initiationscodons ATG wird als +1 bezeichnet) des 5'-Endes des PMA1-Strukturgens wurde mit den beiden Primern
5'-ATGACTGATACATCATCCTCTTCATC-3' (SEQ ID NO: 27) und
5'-TAACGACAGCTGGCAAACCGACTGGGAC-3' (SEQ ID NO: 28) amplifiziert, die von der DNA-Sequenz des PMA1-Gens von Saccharomyces cerevisiae synthetisiert worden waren (Serrano et al., Nature 319, 689-693(1986)), mit der chromosomalen DNA des Saccharomyces cerevisiae AH22-Stamms als Matrize gemäß dem PCR-Verfahren. Die chromosomale DNA wurde gemäß dem in Methods in Yeast Genetics – A Laboratory Course Manual – Rose, M.D. et al., S. 126–127, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990) beschriebenen Verfahren hergestellt. Das erhaltene Fragment wurde mit ³²P markiert und die Hybridisierung wurde mit dem markierten Fragment als Sonde durchgeführt. Im Ergebnis wurden vier positive Plaques erhalten. Für eine Phagen-DNA von einem der vier positiven Plaques wurde die Insert-DNA mit XbaI verdaut, um vier 10 kb, 4 kb, 2,8 kb und 2,6 kb XbaI-Fragmente zu isolieren.
Wenn die vier isolierten Fragmente mit einer Sonde von einem ungefähr 1 kb-Fragment des PMA1-Gens von Saccharomyces cerevisiae, verwendet für das Screening, hybridisiert wurden, wurde die Sonde mit einem 2,6 kb XbaI-Fragment hybridisiert. Das Fragment wurde in die XbaI-Stelle des Plasmidvektors pBluescript IISK+ inseriert, um die Plasmide pPMAF1 und pPMAF2 herzustellen, die in entgegengesetzten Richtungen zueinander inseriert wurden (33).
Von diesen Plasmiden wurden Deletionsmutanten an den Restriktionsenzymstellen, wie z.B. BamHI, ClaI oder EcoRI dieser Plasmide hergestellt und Deletionsmutanten wurden mit Exonuklease III und Mungobohnennuklease hergestellt, um Plasmide herzustellen, die eine Variatät von Deletionsmutationen aufwiesen, und um die DNA-Sequenzen von ungefähr 1 kb von beiden Enden zu bestimmen (33). Wenn die erwartete strukturelle Genregion analysiert wurde, wurde ein 352 bp offener Leserahmen, der ungefähr 50 % Homologie zum 5'-terminalen Bereich des PMA1-Strukturgens von Saccharomyces cerevisiae zeigte, beobachtet, innerhalb von einer ungefähr 1 kb Sequenz, enthaltend den Bereich von der XbaI-Stelle bis zur EcoRV-Stelle auf der linken Seite in 33. Innerhalb von einer ungefähr 0,8 kb-Sequenz, enthaltend den Bereich von der Xbal-Stelle an der anderen Seite bis innerhalb einschließlich der BamHI-Stelle, wurde ein 754 bp offener Leserahmen, der 70 % Homologie zu dem Bereich von +1292 bis +2046 (A des Initiationscodons ATG wird als +1 bezeichnet) des PMA1-Gens von Saccharomyces cerevisiae zeigt, beobachtet. Aus diesem Ergebnis wurde geschlossen, dass das isolierte Gen das PMA-Gen von Candida utilis ist. Weiterhin enthielt die 2,6 kb XbaI-Fragment eine 599 bp Sequenz stromaufwärts zum Initiationscodon ATG. Die Sequenz des 599 bp-Fragments, das den transkriptionellen Promotor enthalten sollte, ist in 34 dargestellt.
Im Hinblick auf den transkriptionellen Terminator wurden die verbleibenden drei Fragmente, ausgeschnitten aus derselben Phagen-DNA mit XbaI (10 kb, 4 kb und 2,8 kb) subkloniert und ihre DNA-Sequenzen wurden von den beiden terminalen Seiten her bestimmt, um ihre Homologie zu der Region der 3'-Seite des PMA1-Gens von Saccharomyces cerevisiae zu überprüfen. Es zeigte sich, dass eine Region mit hoher Homologie zur 3'-terminalen Seite des PMA1-Gens auf der einen Seite des 2,8 kb XbaI-Fragments vorliegt. Das XbaI-Fragment wurde in die Xbal-Stelle des Plasmidvektors pBluescriptIISK+ inseriert, um die Plasmide pPMAL1 und pPMAL2 herzustellen, worin das Fragment in entgegengesetzten Richtungen zueinander inseriert war (33). Plasmide mit einer Varietät von Deletionsmutationen wurden von diesen Plasmiden durch Verdau mit KpnI oder durch Verwendung von Exonuklease III und Mungobohnennuklease hergestellt und die 1,9 kb DNA-Sequenz der XbaI-Stelle bis zur KpnI-Stelle wurde bestimmt (33). Diese DNA-Sequenz umfasst einen 717 bp offenen Leserahmen, der eine Homologie von ungefähr 82 % zu dem Bereich von +2041 bis +2757 (A des Initiationscodons ATG wird als +1 bezeichnet) aufweist, und zwar des PMA1-Gens von Saccharomyces cerevisiae und eine 188 bp-Sequenz stromaufwärts des Terminationscodons TAA. Die 1188 bp-Sequenz von direkt nach dem Terminationscodon TAA bis zur KpnI-Stelle, von der erwartet wird, dass sie den transkriptionellen Terminator enthält, ist in 35 dargestellt.
Beispiel 25: Konstruktion eines Expressionsvektors mit dem Promotor und Terminator des PMA-Gens
Zunächst wurden DNA-Fragmente, enthaltend den Promotor oder Terminator, von den PMA-Gen-regulatorischen Regionen von Candida utilis durch das PCR-Verfahren erhalten (33).
Als Promotor wurde ein Fragment von einer Stellung 20 bp stromabwärts von der XbaI-Stelle bis direkt vor das Initiationscodon ATG mit dem Plasmid pPMAF1 als Matrize erhalten. Die beiden DNA-Sequenzen
5'-GGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGA-3' (SEQ ID NO: 29) und
5'-TTCTAGACTATATCAATGGTTAGTATCACGTG-3' (SEQ ID NO: 30) wurden als Primer verwendet. Der Promotor wurde so synthetisiert, dass er eine NotI-Stelle aufwies, die 5'-stromaufwärts lokalisiert war und eine XbaI-Stelle, die direkt vor dem 3'-stromabwärts gelegenen Initiationscodon lokalisiert war.
Als Terminator wurde ein Fragment, das sich von direkt nach dem Terminationscodon TAA bis zu 403 bp stromabwärts vom Terminationscodon erstreckte, mit dem Plasmid pMAL1 als Matrize erhalten. Die DNA-Sequenzen
5'-CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3' (SEQ ID NO: 31) und
5'-GGGCGGCCGCACTCGCTGATCGAAA-3' (SEQ ID NO: 32) wurden als Primer verwendet. Der Terminator wurde so synthetisiert, dass er eine KpnI-Stelle aufwies, die direkt nach dem Terminationscodon an der 5'-stromaufwärts gelegenen Seite gelegen war und eine NotI-Stelle, die am 3'-stromabwärts gelegenen Ende lokalisiert war.
Das PCR-Verfahren wurden mit 30 Zyklen Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Das durch das PCR-Verfahren synthetisierte Promotorfragment wurde mit NotI und XbaI verdaut, zwischen die NotI- und XbaI-Stellen des pBluescriptIISK+-Vektors inseriert, um das Plasmid pBMpro zu konstruieren. Andererseits wurde das Terminatorfragment zwischen die KpnI- und NotI-Stellen von pBluescriptIISK+ inseriert, um ein Plasmid pBMter zu konstruieren. Das 0,4 kb KpnI-NotI-Fragment, erhalten von dem Plasmid pBMter wurde zwischen die Stellen von KpnI und NotI des Plasmids pUC19N inseriert, das konstruiert wurde, indem die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC19 der Klenow-Enzymbehandlung und einer Ligation mit NotI-Linkern unterworfen wurde (5' AGCGGCCGCT 3': SEQ ID NO: 18), um ein Plasmid pBMter zu konstruieren (36).
Das durch Verdau des Plasmids pBMter mit XbaI und NotI erhaltene 0,4 kb Terminatorfragment und das durch Verdau des Plasmids pBMpro mit NotI und XbaI erhaltene 0,65 kb Promotorfragment wurden mit dem 2,9 kb-Fragment ligiert, erhalten durch Verdau des Plasmids pPGKPT5, konstruiert in Beispiel 4 mit NotI, um ein Plasmid pMAPH1 zu konstruieren (1).
Um zu bestätigen, dass das so konstruierte Expressionsplasmid pMAPH1 in Candida utilis praktisch wirkt, wurde das 1,1 kb APT-Genfragment, ausgeschnitten mit XbaI und BglII von dem Plasmid pAPH2, beschrieben in Beispiel 19, zwischen die XbaI- und BamHI-Stellen des Plasmids pMAPH1 inseriert, um ein Plasmid pMAAPH1 zu konstruieren (36).
Nachdem das so konstruierte Plasmid pMAAPH1 mit NotI verdaut worden war, wurde es zur Transformation des ATCC 9950-Stamms durch das elektrische Pulsverfahren unter Pulsbedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm unterzogen.
Transformanten wurden auf einer YPD-Platte, die 200 μg/ml G418 enthielt, selektiert. Ungefähr 40 Transformanten wurden mit 0,1 μg DNA erhalten. Dies zeigt an, dass Promotor und Terminator des GAP-Gens aktiv waren.
Beispiel 26: Klonierung von DNA-Fragmenten, enthaltend sich autonom replizierende Sequenzen (ARS)
Das 3,3 kb NotI-Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor und den PGK-Gen-Terminator, wurde aus dem in Beispiel 19 konstruierten Plasmid pGKAPH1 ausgeschnitten und in die NotI-Stelle des Plasmids pBluescripIISK-(Stratagene) inseriert, um ein Plasmid pGKAPH2 zu konstruieren (37). Dann wurden 200 ng des Plasmids pGKAPH2, das mit BamHI verdaut und dephosphoryliert worden war und 200 ng 3 bis 7 kb-Fragmente, teilweise verdaut mit Sau3AI, der genomischen DNA des Candida utilis ATCC 9950-Stamms, erhalten in Beispiel 2, mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5 wurde mit der DNA-Lösung transformiert und die Plasmid-DNA-Mischungen wurden von ungefähr 30.000 Transformanten, erhalten von der genomischen DNA-Bibliothek, extrahiert. Der ATCC 9950-Stamm wurde mit 3 μg der von der Bibliothek gemäß dem elektrischen Pulsverfahren, beschrieben in Beispiel 11 hergestellten DNA unter den 4 Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 800 Ω oder 1.000 Ω und einer Spannung von 3,75 KV/cm oder 5 KV/cm transformiert. So wurden sieben Cycloheximid-resistente Kolonien erhalten. Diese resistenten Stämme wurden in YPD-Medium, enthaltend 400 μg/ml G418, kultiviert. Gesamt-DNA wurde aus den Zellen hergestellt, um E. coli DH5 zu transformieren. Die chromosomale DNA von Hefe wurde gemäß dem in Methods in Yeast Genetics – A Laboratory Course Manual – Rose, M.D. et al., S. 131–132, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY beschriebenen Verfahren hergestellt. Der Verdau von sieben Plasmid-DNAs (pCARS1, pCARS4, pCARS5, pCARS6, pCARS7, pCARS8 und pCARS10), gesammelt aus E. coli mit verschiedenen Restriktionsenzymen ergab, dass jedes dieser Plasmid-DNAs 5 bis 7 kb Inserts umfasste. Zusätzlich wurden, wenn der ATCC 9950-Stamm mit der Plasmid-DNA durch das elektrische Pulsverfahren transformiert wurde, G418-resistente Transformanten für jede der Plasmid-DNAs erhalten. Es wurde aus diesem Ergebnis bestätigt, dass DNA-Sequenzen mit autonomer Replikationsfähigkeit in diese Plasmide kloniert wurden. Durch Analyse mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymverdaus wurde klar, dass pCARS7 und pCARS8 aus diesen Plasmiden dasselbe Insert umfassen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sechs DNA-Fragmente mit autonomer Replikationsfähigkeit in der Hefe Candida utilis kloniert wurden.
Weiterhin wurde eine genomische DNA-Bibliothek der Hefe Candida utilis mit dem Plasmid pCLBS10 (15) hergestellt, beschrieben in Beispiel 9 als Vektor. Die Hefe Candida utilis wurde mit der Bibliothek zusammen mit der Bibliothek, konstruiert auf dem Plasmid pGKAPH2, transformiert. Jedoch wurde keine Cycloheximid-resistente Transformante erhalten. Dies zeigt, dass als Merkmal der ARS von Candida utilis die Zahl von Kopien des Plasmids, dies enthaltend, pro Zelle gering ist und dass die Transformanten nicht selektiert werden können, wenn die ARS mit einem Cycloheximidresistenz-L41-Gen verwendet werden, das etliche Kopien für die Selektion einer Transformante benötigt.
Beispiel 27: Verkürzung der DNA-Fragmente, enthaltend eine sich autonom replizierende Sequenze (ARS)
Drei Plasmide (pCARS5, pCARS6 und pCARS7), die erfolgreich die Hefe Candida utilis mit hoher Frequenz unter den sieben Plasmiden transformiert hatten, worin autonom sich replizierende DNA-Sequenz kloniert wurden (Beispiel 26), wurden weiter im Detail analysiert.
Die Transformationsfrequenz der Hefe mit diesen drei Plasmiden wurde mit der BglII-verdauten DNA des Chromosomintegrierten Plasmids pCLRAPH1, hergestellt in Beispiel 19, als Kontrolle überprüft. Der ATCC 9950-Stamm wurde mit 0,1 μg DNA bei Pulsbedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm² transformiert. Die Kultivierung nach dem Puls wurde 4 Stunden durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7 Transformationsfrequenzen mit einer Varietät von ARS-Plasmiden

Merke 1): Zahl der Transformanten pro 1 μg Plasmid-DNA.
Merke 2): pCLRAPH1 wurde mit BglII vor der Verwendung verdaut.

Dies zeigt an, dass die Transformationsfrequenz, die ungefähr 10- bis 40fach höher liegt als diejenige einer DNA-Integration mit rDNA als Ziel mit den Plasmiden erhalten wird, die die ARS enthalten.
Zusätzlich wurden diese Plasmide pCARS5, pCARS6 und pCARS7 mit NotI verdaut und wiederum mit T4-DNA-Ligase cyclisch gemacht, um die Plasmide pCARS50, pCARS60 und pCARS70 zu konstruieren, aus denen das 3,3 NotI-Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das APT-Gen und den PGK-Gen-Terminator, deletiert waren. Diese drei neuen Plasmide wurden im Hinblick auf die Länge ihrer Inserts überprüft, und zwar mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymverdaus. So hatten alle diese Plasmide Inserts von ungefähr 5 bis 6 kb, so dass die Regionen mit autonomer Replikationsfähigkeit weiter begrenzt waren. Jedes der Plasmide pCARS50, pCARS60 und pCARS70 wurde teilweise mit Sau3AI verdaut, um 1 bis 3,5 kb-Fragmente zu sammeln, die mit dem Plasmid pGKAPH2 ligiert wurden, das mit BamHI verdaut und mit T4-DNA-Ligase dephosphoryliert worden war. E. coli DH5 wurde mit jeder der drei DNA-Lösungen transformiert und Plasmid-DNA-Mischungen wurden von 2.500 bis 6.000 Transformanten extrahiert, um DNA-Bibliotheken herzustellen. Der ATCC 9950-Stamm wurde wiederum mit 5 μg-Teilen der DNA gemäß dem in Beispiel 11 beschriebenen elektrischen Pulsverfahren transformiert, um G418-resistente Transformanten zu erhalten.
Die so erhaltenen G418-resistenten Kolonien hatten eine Vielzahl von Größen und fünf Transformanten von jeder der drei Bibliotheken, die eine relativ große Kolonie gebildet hatten, wurden weiterhin in YPD-Medium, enthaltend 200 μg/ml G418, kultiviert. Gesamt-DNAs wurden aus den so erhaltenen Zellen hergestellt und E. coli DH5 wurde mit der DNA transformiert. Keine Transformante von E. coli wurde mit einigen der G418-resistenten Stämme erhalten. Wenn außerdem der ATCC 9950-Stamm wiederum mit diesen Plasmiden, gesammelt gemäß dem elektrischen Pulsverfahren, wie beschrieben in Beispiel 11, transformiert wurde, wurden einige dieser Plasmide ausgeschlossen, da sie eine außerordentlich niedrige Transformationsfrequenz im Vergleich mit den ursprünglichen Plasmiden pCARS5, pCARS6 und pCARS7 zeigten. Schließlich wurde ein Plasmid, enthaltend ein verkürztes DNA-Fragment und mit einer ähnlichen Transformationsfrequenz wie derjenigen des Elternplasmids, von jedem der pCARS50, pCARS60 und pCARS70 erhalten. Das von pCARS50 abstammende Plasmid wurde als pCARS5-2 bezeichnet, dasjenige, das von pCARS60 abstammte, als pCARS6-2 und dasjenige, das von pCARS70 abstammte, als pCARS7-2. Die Restriktionsenzymkarten der chromosomalen DNA-Fragmente, enthaltend sich autonom replizierende Sequenzen in diesen so erhaltenen sechs Plasmiden, sind in 38 dargestellt.
Plasmide, die weiter verkürzte DNA-Fragmente enthielten, wurden aus den drei Plasmiden pCARS5-2, pCARS6-2 und pCARS7-2 konstruiert, die die verkürzten chromosomalen DNA-Fragmente aufwiesen, um ihre Transformationsfrequenzen zu überprüfen. Wenn die DNA-Teilsequenzen einiger dieser Plasmide, die in diesem Prozess konstruiert wurden, bestimmt wurden, zeigte die ungefähr 700 bp-Region auf der linken Seite der BglII-Stelle in pCARS5 in 38 eine Homologie von 90 % oder mehr zu der ungefähr 700 bp-Region auf der linken Seite der EcoRI-Stelle in pCARS6-2. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Insertions-DNA-Fragmente von pCARS5 und pCARS6 jeweils von den homologen Chromosomen oder repetitiven Sequenzen abstammten, obwohl sie unterschiedliche Restriktionsenzymkarten aufwiesen. Daher wurde die folgende Analyse an dem Insertions-DNA-Fragment von pCARS6 und pCARS7 durchgeführt. Die in pCARS6 enthaltene, sich autonom replizierende Sequenz wurde als CUARS1 bezeichnet und die in pCARS7 enthaltene, sich autonom replizierende Sequenz als CUARS2.
Beispiel 28: Verkürzung von DNA-Fragmenten, inseriert in pCARS6 und pCARS7 und Transformationsfrequenz und Plasmidstabilität
(1) Verkürzung des in pCARS6 inserierten DNA-Fragments und Transformationsfrequenz
Das in das Plasmid pCARS6-2 klonierte DNA-Fragment, das teilweise mit Sau3AI verdaut worden war, hatte eine Größe von ungefähr 1,9 kb. So wurden drei Plasmide, enthaltend Teile des inserierten Fragments von pCARS6-2 konstruiert, um die sich autonom replizierende Region weiter zu begrenzen. Diese Plasmide wurden durch das folgende Verfahren konstruiert.
Das 3,3 kb NotI-Fragment, enthaltend die APT-Genexpressionskassette, wurde aus pCARS6-2 entfernt, um pCARS6-20 zu konstruieren. Das Plasmid pCARS6-20 wurde mit AflII und XbaI verdaut, mit Klenow-Enzym behandelt, um glatte Enden zu bilden und mit T4-DNA-Ligase wiederum cyclisch gemacht, um ein Plasmid pCARS6-210 zu konstruieren. Das Plasmid wurde mit einem 2,3 kb NotI-Fragment, enthaltend die APT-Gen-Expressionskassette, mit einem verkürzten PGK-Gen-Promotor ligiert, ausgeschnitten aus dem Plasmid pGKAPH3, um das Plasmid pCARS6-12 zu konstruieren. Das Plasmid pGKAPH3 wurde konstruiert, indem die EcoRI-Stelle im Promotorfragment des Plasmids pGKAPH1, konstruiert in Beispiel 19 mit einem Klenow-Enzym zur Bildung glatter Enden behandelt wurde, woran NotI-Linker (5'AGCGGCCGCT3': SEQ ID NO: 18) ligiert wurden. Jedes der Plasmide pCARS6-20 und pCARS6-21 wurde mit HindIII verdaut, mit T4-DNA-Ligase wieder cyclisch gemacht und dann mit dem 2,3 kb NotI-Fragment, enthaltend die APT-Genexpressionskassette, mit dem verkürzten PGK-Gen-Promotor auf dieselbe Weise wie oben zur Konstruktion der Plasmide pCARS6-22 bzw. pCARS6-23 ligiert. Die Restriktionsenzymkarten der Insertions-DNA-Fragmente, enthalten in diesen fünf Plasmiden, sind in 39 dargestellt.
Der ATCC 9950-Stamm wurde mit jedem der so konstruierten Plasmide gemäß dem elektrischen Pulsverfahren, wie beschrieben in Beispiel 11, mit 1 μg DNA unter Pulsbedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm transformiert. Die Kultivierung nach dem Puls wurde 4 Stunden durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8 Transformationsfrequenzen und Stabilitäten einer Vielzahl von Plasmiden, abstammend von pCARS6 Zahl von Transformanten pro 1 μg Plasmid-DNA

Merke 1: Die Daten drücken die durchschnittlichen Werte von doppelten experimentellen Läufen aus.

Stabilität des Plasmids

Merke: Die Generationszahl liegt zwischen 2,5 bis 3,5 Generationen.

Die Stabilität von jedem Plasmid in Hefe wurde gemäß dem folgenden Verfahren überprüft. Die so erhaltenen G418-resistenten Kolonien wurden in 4 ml eines YPD-Mediums inokuliert und unter Schütteln bei 30°C 8 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden auf einer YPD-Platte verteilt und einer YPD-Platte, enthaltend G418. Die Zahlen der Kolonien wurden miteinander nach einer Kultivierung für 2 Tage zur Berechnung der Retentionsrate des Plasmids verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Die Absorption der Kultur zeigte, dass die Zellen sich 2,5- bis 3,5mal geteilt hatten. Es ergab sich auch aus dem Ergebnis, dass von den Plasmiden pCARS6-21 und pCARS6-22, worin das Insertions-DNA-Fragment von pCARS6-2 von beiden Seiten verkürzt wurde, eine große Abnahme der Transformationsfrequenz beobachtet werden konnte, obwohl pCARS6-21 eine ähnliche Stabilität wie pCARS6-2 zeigte. Im Hinblick auf pCARS6-23, worin das Insertions-DNA-Fragment auf 0,6 kb verkürzt worden war, war die Transformationsfrequenz außerdem weiterhin auf 1/50 im Vergleich mit der Transformationsfrequenz von pCARS6 erniedrigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass CUARS1, enthalten in pCARS6 schwieriger zu verkürzen ist, als das ungefähr 1,9 kb DNA-Fragment von pCARS6-2.
(2) Verkürzung des pCARS7-Insertions-DNA-Fragments und Transformationsfrequenz
Das in das Plasmid pCARS7-2 klonierte DNA-Fragment, das teilweise mit Sau3AI verdaut worden war, hatte eine Größe von ungefähr 3,5 kb. Um die sich autonom replizierende Region weiter zu begrenzen, wurden daher fünf Plasmide, enthaltend Teile des pCARS7-2-Insertionsfragments, gemäß dem folgenden Verfahren konstruiert.
Von dem Plasmid pCARS7-2 wurde das 3,3 kb NotI-Fragment, enthaltend die APT-Genexpressionskassette entfernt, um das Plasmid pCARS7-20 zu konstruieren, das dann mit XbaI verdaut wurde, mit T4-DNA-Ligase wiederum cyclisch gemacht wurde und an das 2,3 kb NotI-Fragment, enthaltend die APT-Genexpressionskassette, ligiert wurde, um pCARS7-4 zu konstruieren.
Zusätzlich wurden eine ungefähr 1,8 kb EcoRV-HindIII-Fragment, ein ungefähr 1,3 kb XbaI-HindIII-Fragment und ein ungefähr 1,8 kb HindIII-BglII-Fragment aus pCARS7-20 ausgeschnitten und in pBluescriptIISK-(Stratagene) ligiert, verdaut mit entweder EcoRV und HindIII, XbaI und HindIII bzw. HindIII und BamHI. Das 2,3 kb NotI-Fragment, enthaltend die APT-Genexpressionskassette mit dem verkürzten PGK-Genpromotor, wurde mit dem Plasmid ligiert, um pCARS7-6, pCARS7-7 und pCARS7-8 zu konstruieren. Die Restriktionsenzymkarten der Insertions-DNA-Fragmente, enthalten in diesen sechs Plasmiden, sind in 40 gezeigt.
Der ATCC 9950-Stamm wurde mit jedem der so konstruierten Plasmide gemäß dem elektrischen Pulsverfahren, wie beschrieben in Beispiel 11 mit 1 μg DNA unter Pulsbedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm transformiert. Die Kultivierung nach dem Puls wurde 4 Stunden durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9 Transformationsfrequenzen und Stabilitäten einer Vielzahl von Plasmiden, abstammend von pCARS7 Zahl von Transformanten pro 1 μg Plasmid-DNA

Merke 1: Die Daten drücken die durchschnittlichen Werte von doppelten experimentellen Läufen aus.
Merke 2: * zeigt an, dass die Kolonien sehr kleine Größen hatten.

Stabilität des Plasmids

Merke: Die Generationszahl liegt zwischen 2,5 bis 3,5 Generationen.

Die Stabilität von jedem Enzym in Hefe wurde gemäß dem folgenden Verfahren überprüft. Die G418-resistenten Kolonien, die so erhalten wurden, wurden in 4 ml eines YPD-Mediums inokuliert und unter Schütteln für 8 Stunden bei 30°C kultiviert. Die Zellen wurden auf eine YPD-Platte und eine YPD-Platte, enthaltend G418, verteilt und die Zahl der Kolonien wurde nach einer Kultivierung für 2 Tage miteinander verglichen, um die Retentionsrate des Plasmids zu berechnen (Tabelle 9). Die Absorption der Kultur zeigte, dass sich die Zellen 2,5- bis 3,5mal geteilt hatten. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Transformationsfrequenzen mit den Plasmiden pCARS7-2 und pCARS7-6 sich um ungefähr 70 % und ungefähr 30 % im Vergleich mit derjenigen von pCARS7 verminderten. Die Stabilität war jedoch nicht derartig erniedrigt. Während das Plasmid pCARS7-7, enthaltend ein weiter verkürztes DNA-Fragment, eine Transformationsfrequenz von ungefähr 1/2 im Vergleich mit pCARS7-6 zeigte, erzeugt es Kolonien, die eine sehr geringe Größe aufweisen und zeigte eine schlechte Stabilität (Tabelle 9). Andererseits war die Transformationsfrequenz bei pCARS7-8 gering und es wurde keine Transformante mit pCARS7-4 erhalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass CUARS2, enthalten in pCARS7, auf das 1,8 kb DNA-Fragment von pCARS7-6 verkürzt sein kann, während sich die Transformationsfrequenz verminderte.
Diese beiden Ergebnisse im Hinblick auf die Verkürzung von der ARS zeigen an, dass eine relativ lange Region für die ARS der Hefe Candida utilis für ihre autonome Replikationsfähigkeit notwendig ist. Dies ist ein sehr interessantes Merkmal, das sich von der Tatsache unterscheidet, dass die ungefähr 200 bp ARS einer Hefe der Gattung Saccharomyces ihre Funktion zeigt (Newlon, C.R und Theis, J. Current Opinion in Genetics and Development, 1993, 3, 752–758).
Beispiel 29: Bestimmung der DNA-Sequenzen von DNA-Fragmenten, enthaltend die sich autonom replizierende Sequenz von pCARS6-2 und pCARS7-6 und Southern-Analyse
(1) Bestimmung der DNA-Sequenzen von DNA-Fragmenten, enthaltend sich autonom replizierende Sequenzen
Die DNA-Sequenz der DNA-Fragmente, enthaltend ARS, CUARS1 und CUARS2 in pCARS6 und pCARS7 wurde bestimmt. Plasmide mit einer Vielzahl von Deletionsmutationen wurden durch Deletion mit ExoIII-Nuklease und Mungobohnennuklease von beiden Enden des Insertions-DNA-Fragments von pCARS6-2 hergestellt, als DNA, enthaltend CUARS1 und das Insertions-DNA-Fragment von pCARS7-6 als DNA, enthaltend CUARS2, um die DNA-Sequenzen zu bestimmen. Die DNA-Sequenz des Insertions-DNA-Fragments von pCARS6-2 ist in den 41 und 42 dargestellt und die DNA-Sequenz des Insertions-DNA-Fragments von pCARS7-2 ist in den 43 und 44 dargestellt. Das Insertions-DNA-Fragment von pCARS6-2 umfasst 1921 bp und hatte ein Verhältnis von A + T zu den Gesamtbasen von 69,5 % und das Insertions-DNA-Fragment von pCARS7-2 umfasst 1788 bp und hat ein Verhältnis von A + T zu den Gesamtbasen von 70,8 %. So hat sich gezeigt, dass jedes der DNA-Fragmente ein sehr hohes Verhältnis von A + T aufweist.
Eine Computeranalyse ergab, dass im Vergleich mit der 11 bp-Sequenz (T/A)TTTA(C/T)(A/G)TTT(T/A), die üblicherweise in ARS beobachtet wird (Newlon, C.R. und Theis, J., Current Opinion in Genetics and Development, 1993, 3, 752–758), 9 konsensusähnliche Sequenzen (die sich in einer Base von der Konsensussequenz unterscheiden) in pCARS6-2 vorliegen und ähnlich 13 konsensusähnliche Sequenzen in pCARS7-6 vorliegen, wobei 5 Sequenzen miteinander überlappen (die 41 bis 44).
(2) Berechnung der Zahl von Kopien durch Southern-Analyse
Um die Zahl von Kopien des Plasmids, enthaltend ARS in der Zelle der Hefe Candida utilis zu bewerten, wurde eine Southern-Analyse an der DNA durchgeführt, die aus der Hefe Candida utilis hergestellt wurde, die mit pCARS6 oder pCARS7 transformiert worden war (45–1). Da das PGK-Gen als interner Standard für die Berechnung der Zahl der Kopien verwendet wurde, wurde zusätzlich eine Southern-Analyse zur Berechnung der Zahl von Kopien des PGK-Gens durchgeführt (45–2).
Die Southern-Analyse für die Berechnung der Zahl von Kopien des PGK-Gens wurde mit einer DNA durchgeführt, hergestellt aus 2 Stämmen von ATCC 9950, transformiert mit dem Plasmid pCLLAC1, beschrieben in Beispiel 18, das an der SphI-Stelle im PGK-Promotor verdaut worden war und mit DNA, hergestellt von dem Elternstamm als Kontrolle. Wenn das 0,4 kb EcoRI-XbaI-Fragment, enthaltend den PGK-Promotor, ausgeschnitten aus pGKPT4, beschrieben in Beispiel 4 als Sonde für die DNA, verdaut mit SalI + NotI verwendet wurde, wurde eine 3,2 kb Bande, abstammend von dem endogenen PGK-Gen in dem ATCC 9950-Stamm als Elternstamm beobachtet (45–2, Spur 1). Andererseits wurden bei dem Stamm, in dem pCLLAC1, verdaut mit der SphI-Stelle im PGK-Promotor integriert worden war, zusätzlich zu dieser 3,2 kb-Bande eine 5,4 kb-Bande, erzeugt durch NotI-Verdau von etlichen Plasmiden, integriert in Tandem und zwei Banden von 6,4 kb und 2,1 kb, erzeugt durch Unterbrechung von einem der chromosomalen PGK-Gene durch Insertion der Plasmide nachgewiesen (Spuren 2 und 3). Da diese beiden 6,4 kb- und 2,1 kb-Banden von der NotI-Stelle in dem Plasmidmolekül und der SalI-Stelle im PGK-Genbereich an beiden Seiten des integrierten Plasmidmoleküls erzeugt wurden, zeigte sich, dass das Plasmidmolekül in den PGK-Genlokus durch homologe Rekombination integriert war.
Wenn die Dichten dieser Banden mit einem Imaging Analyzer (Fuji Film) gemessen wurden, hatte die 3,2 kb-Bande, abstammend von dem endogenen PGK-Gen und die 6,4 kb- und 2,1 kb-Banden, abstammend von den Plasmiden an beiden Enden der Plasmidmoleküle, integriert in das Chromosom, fast dieselben Dichten in der Transformante. So zeigte sich, dass es 2 Kopien des PGK-Gens pro Zelle gibt und in der Transformante war eine der 2 Kopien durch Insertion der Plasmid-DNA unterbrochen. Weiterhin ergab sich durch Vergleich der Dichten der 5,4 kb-Bande aufgrund der Tandemintegration des Plasmids und der 6,4 kb- und 2,1 kb-Banden, dass das integrierte Plasmid ungefähr 4 Kopien hatte.
Die aus den ATCC 9950-Stämmen, transformiert mit pCARS6 und pCARS7 hergestellte DNA wurde mit EcoRV + NotI verdaut und eine Southern-Analyse wurde mit dem 0,9 kb XbaI-NotI-Fragment durchgeführt, enthaltend den PGK-Terminator, ausgeschnitten aus pGKPT4, wie beschrieben in Beispiel 4, als Sonde. Das Ergebnis ist in 45–1 dargestellt. In dem Eltern-ATCC 9950-Stamm wurde eine ungefähr 7 kb-Bande, abstammend von dem endogenen PGK-Gen beobachtet (45–1, Spur 3). In der Transformante wurde eine 3,3 kb-Bande, abstammend von dem Plasmid zusätzlich zu der ungefähr 7 kb-Bande beobachtet.
Durch Vergleich der Dichten der 7 kb- und der 3,3 kb-Banden wurde berechnet (unter der Annahme, dass die 7 kb-Bande zu 2 Kopien des PGK-Gens korrespondiert und dass die Kopienzahl von pCARS6 bzw. pCARS7 1 (Spur 4) bzw. 0,4 (Spur 2) war). Aufgrund des Ausfallens des Plasmidmoleküls während der Zellkultur könnte die Zahl der Kopien von pCARS7 weniger als 1 betragen. Aus diesem Ergebnis wurde geschlossen, dass das Plasmid, enthaltend CUARS ungefähr 1 Kopie pro Zelle aufwies.
(3) Existenzmodus von ARS auf dem Chromosom
Eine Southern-Analyse wurde an einer Vielzahl von chromosomalen DNAs von HindIII-verdauten ATCC 9950-, 9226-, 9256- und KP-2059-Stämmen und dem Saccharomyces cerevisiae S288C-Stamm durchgeführt. Mit Sonden: als CUARS1, das 1,3 kb-Fragment, erhalten durch Verdau von pCARS6-22 mit XbaI und HindIII (39) und als CUARS2, das 1,8 kb EcoRV-HindIII Fragment von pCARS7-6 (40) wurde eine Hybridisierung durchgeführt (46). Im Hinblick auf CUARS1 wurde zusätzlich zu einer Haupt-2 kb-Bande, die von der Restriktionsenzymkarte von pCARS6 erwartet wurde, eine 1,6 kb-Bande beobachtet, die dieselbe Länge wie das HindIII-Fragment aufwies, erwartet von der Restriktionsenzymkarte von pCARS5 (46–1). Weiterhin wurde im Hinblick auf CUARS2 zusätzlich zu einer Haupt-2,5 kb-Bande, die von der Restriktionsenzymkarte von pCARS7 erwartet wurde, DNA-Sequenzen mit hoher Homologie gefunden, die mit ungefähr 10 Kopien auf dem Chromosom der Hefe Candida utilis und auch in etlichen Kopien bei Saccharomyces-Hefe (46–2) vorlagen. Durch dieses Ergebnis wird auch nahegelegt, dass CUARS2 eine sehr konservierte Sequenz sein kann. Außerdem wurden unter härteren Waschbedingungen (0,1 × SSC, 65°C) kaum andere Signale als das Hauptsignal beobachtet (46–2).
Weiterhin wurde eine Southern-Analyse an der chromosomalen DNA von Candida utilis, getrennt durch das Pulsfeld-Gelelektrophoreseverfahren, durchgeführt, um zu untersuchen, ob diese ARS-Sequenzen von chromosomaler DNA oder nicht abstammten. Die DNA des ATCC 9950-Stamms wurde in sieben Banden geteilt, worin CUARS1 am 6ten Chromosom von der Spitze und CUARS2 am 3ten Chromosom von der Spitze lokalisiert war. Es ergab sich auch, dass die klonierten ARS-Sequenzen vom Chromosom abstammten. Das Insertions-DNA-Fragment von pCARS5 war auf dem 6ten Chromosom wie CUARS1 lokalisiert. Wie sich aus der Sequenzanalyse, beschrieben in Beispiel 27, ergab, unterstützten diese Ergebnisse die Möglichkeit, dass die in diese pCARS5 und pCARS6 konierte ARS von den homologen Chromosomen abstammen könnte.
Beispiel 30: Klonierung von DNA-Fragmenten mit einer Promotoraktivität unter Verwendung von ARS
(1) Konstruktion eines Promotor-Klonierungsvektors
DNA, enthaltend eine autonom replizierbare Sequenz, wurde als 1,9 kb SacI-SmaI-Fragment aus dem Plasmid pCARS6-20, konstruiert in Beispiel 28, ausgeschnitten. Das Fragment wurde mit dem Plasmid pAPH1 ligiert (Beispiel 19), das mit EcoRI verdaut und mit Klenow-Enzym behandelt wurde, um glatte Enden zu bilden und wurde weiter mit SacI verdaut, um ein Plasmid pPCV1 zu konstruieren. Weiterhin wurde pPCV1 mit BamHI verdaut, mit Klenow-Enzym zur Bildung glatter Enden behandelt und HpaI-Linker (5'GTTAAC3') wurden ligiert, um ein Plasmid pPCV2 zu konstruieren (47).
(2) Konstruktion einer Bibliothek und Klonierung von DNA-Fragmenten mit Promotoraktivität
Chromosomale DNA des Candida utilis ATCC 9950-Stamms wurde teilweise mit den Restriktionsenzymen RsaI, HaeIII und AluI zur selben Zeit verdaut. Dann wurden die DNA-Fragmente einer Elektrophorese mit einem 1%igen Agarosegel unterworfen und die 0,9 bis 1,8 kb langen Fragmente wurden gesammelt. Die teilweise verdauten DNA-Fragmente und das Plasmid pPCV2, verdaut mit HpaI und dephosphoryliert, wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5 wurde mit der DNA-Lösung transformiert und eine Plasmid-DNA-Mischung wurde von ungefähr 100.000 so erhaltenen Transformanten extrahiert, um eine genomische DNA-Bibliothek herzustellen. Der ATCC 9950-Stamm wurde mit der aus dieser Bibliothek hergestellten DNA mit dem elektrischen Pulsverfahren unter Pulsbedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 1.000 Ω und einer Spannung von 5 KV/cm transformiert. Die DNA wurde in einer Menge von 20 bis 25 μg pro Puls verwendet. Transformanten wurden auf einer YPD-Platte, enthaltend 200 μg/ml G418, selektiert. Wiederholte Läufe der Transformation ergaben 380 Transformanten insgesamt mit 280 μg DNA. Unter diesen Transformanten wurden 84 Stämme, bei denen sich relativ große Kolonien gebildet hatten, auf einer YPD-Platte, die 1 mg/ml G418 enthielt, gezüchtet. Zwölf Stämme, die ein gutes Wachstum zeigten, wurden in YPD-Medium, enthaltend 1 mg/ml G418 kultiviert und Gesamt-DNA wurde aus den Zellen hergestellt, um E. coli DH5 zu transformieren.
Durch den Restriktionsenzymverdau ergab sich, dass alle zwölf aus E. coli gewonnenen Plasmid-DNAs, d.h. pPCV1, 3, 9, 14, 19, 33, 51, 55, 57, 62, 64 und 78 0,9 bis 1,8 kb Insertions-DNA-Fragmente enthalten. Weiterhin wurden DNA-Fragmente, enthaltend Sequenzen mit Promotoraktivität mit XbaI ausgeschnitten und mit pBluescriptIISK-(Stratagene) ligiert, um Plasmide zu konstruieren. Teil-DNA-Sequenzen der Plasmide wurden bestimmt, beginnend von den beiden Seiten der Insertions-DNA-Fragmente. Aus dem Ergebnis wurde deutlich, dass pPCV33 und pPCV78 oder pPCV14, pPCV51 und pPCV55 dasselbe DNA-Fragment aufweisen. Daher wurden endgültig neun DNA-Fragmente mit Promotoraktivität kloniert.
Wenn der ATCC 9950-Stamm mit den neun Plasmiden pPCV1, 3, 9, 14, 19, 33, 57, 62 und 64 durch das elektrische Pulsverfahren transformiert wurde, wurden 6.000 bis 10.000 G418-resistente Kolonien pro 1 μg DNA für jede der Plasmid-DNAs erhalten. Weiterhin wurden 20 Klone, umfassend 2 Stämme von 10 G418-resistenten Stämmen, erhalten mit den 9 Plasmiden und pCARS6-2, verwendet als Kontrolle in 5 ml YPD-Medium, über Nacht kultiviert und dann in einzelne Kolonien auf der YPD-Platte getrennt. Zehn Kolonien von jedem der zwanzig Klone wurden auf einer YPD-Platte, enthaltend G418 kultiviert, um die Retentionsrate der Plasmide zu bewerten. Im Ergebnis hatten alle anderen Plasmide eine erhöhte Retentionsrate, während pCARS6-2 eine Plasmid-Retentionsrate von 5 % aufwies. Unter diesen Plasmiden hatten insbesondere pPCV1, pPCV19 und pPCV64 eine hohe Retentionsrate im Bereich von 80 bis 85 %. So wurde gezeigt, dass das DNA-Fragment, enthaltend eine Sequenz, die eine so erhaltene Promotoraktivität aufweist, eine Funktion aufweist, wodurch die Stabilität des Plasmids erhöht wird.
(3) Bestimmung der DNA-Sequenz eines DNA-Fragments mit einer Promotoraktivität
Im Hinblick auf das Insertions-DNA-Fragment des Plasmids pPCV19 unter den neun DNA-Fragmenten mit Promotoraktivität, die so erhalten wurden, wurden Plasmide mit einer Vielzahl von Deletionsmutationen durch Deletion unter Verwendung von ExoIII-Nuklease und Mungobohnennuklease hergestellt, um die DNA-Sequenz von den beiden Seiten des Insertions-DNA-Fragments zu bestimmen. Die bestimmte DNA-Sequenz des 1054 bp Insertions-DNA-Fragments von pPCV19 ist in 48 dargestellt.
Beispiel 31: Konstruktion eines Plasmids zur Expression eines Hygromycin-B-Resistenzgens und Selektion von Co-Transformanten von Hefe unter Verwendung desselben
(1) Konstruktion eines Plasmids zur Expression eines Hygromycin-B-Resistenzgens und Bestätigung seiner Funktion
Das Hygromycin-B-Phosphotransferase-(HPT)-Gen wurde durch PCR mit 2 Primern erhalten, hergestellt gemäß der bereits beschriebenen DNA-Sequenz des HPT-Gens (Gritz, L. und Davis, J., Gen, 25, 179–188 (1983)), wobei das Plasmid pBIB-HYG (Becker, D., Nucl. Acids Res., 18, 203 (1990)) als Matrize verwendet wurde. Als Primer wurden die DNA-Sequenzen
5'-GGTCTAGATATGAAAAAGCCTGAAC-3' (SEQ ID NO: 33) und
5'-GGAGATCTATTCCTTTGCCCTCGGA-3' (SEQ ID NO: 34) verwendet. Die Synthese wurde so durchgeführt, dass man eine Xbal-Stelle, lokalisiert direkt vor dem Initiationscodon an der 5'-Seite und eine BglII-Stelle, lokalisiert direkt nach dem 3'-Ende-Terminationscodon hatte. Das synthetisierte HPT-Gen-Fragment wurde mit XbaI und BglII verdaut, zwischen die XbaI- und BamHI-Stellen des Expressionsvektors pPGKPT4 (4), beschrieben in Beispiel 4 inseriert, um ein Plasmid pGKHPT1 (49) zu konstruieren. Das 3,3 kb NotI-Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das HPT-Gen und den PGK-Gen-Terminator wurde aus pGKHPT1 ausgeschnitten. Das Plasmid pAHG1 wurde konstruiert, indem das NotI-Fragment an der NotI-Stelle des Plasmids pPCV14, beschrieben in Beispiel 30, inseriert wurde. Um zu bestätigen, ob die konstruierte HPT-Genexpressionskassette wirkt oder nicht, wurde der ATCC 9950-Stamm mit dem Plasmid pAHG1 durch das in Beispiel 11 beschriebene elektrische Pulsverfahren transformiert. Transformanten, selektiert durch Resistenz gegenüber G418 wuchsen in einem YPD-Flüssigmedium, enthaltend 200, 400 und 800 μg/ml Hygromycin B, während der als Kontrolle verwendete Wildtypstamm in keinem Medium wuchs und eine Resistenz gegenüber Hygromycin B zeigte.
Nachdem das Plasmid pGKHPT1 in ein Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das HPT-Gen und den PGK-Gen-Terminator und ein Vektorfragment durch Verdau mit NotI geteilt worden war, wurden diese für die Transformation des ATCC 9950-Stamms verwendet. Die Transformation wurde durch das in Beispiel 11 beschriebene elektrische Pulsverfahren durchgeführt und Transformanten wurden auf einer YPD-Platte, enthaltend 800 μg/ml Hygromycin B selektiert. Im Ergebnis wurden 168 Hygromycin-B-resistente Kolonien pro 1 μg DNA erhalten. Dies ist fast dasselbe wie die Transformationsfrequenz mit dem NotI-verdauten Plasmid pGKAPH1, das als Kontrolle verwendet wird, 156 Kolonien pro 1 μg DNA. So zeigt dieses Ergebnis, dass das Hygromycin B-Resistenzgen bei der direkten Selektion von Transformanten von Candida utilis verwendet werden kann, genauso wie das G418-Resistenzgen.
(2) Co-Transformation von Hefe
0,1 μg des Plasmids pPCV64, enthaltend eine ARS, erhalten in Beispiel 30 und 1 μg oder 10 μg des Plasmids pPGKHPT1, geteilt durch NotI-Verdau in das Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das HPT-Gen und den PGK-Gen-Terminator und das Vektor-Fragment wurden vermischt und für die Transformation des ATCC 9950-Stamms durch das in Beispiel 11 beschriebene elektrische Pulsverfahren verwendet.
Der Puls wurde bei Bedingungen einer elektrischen Kapazität von 25 μF, einem Widerstand von 600, 800 oder 1.000 Ω und einer Spannung von 3,75 oder 5 KV/cm verwendet, mit 6 Pulsbedingungen für die 2 DNA-Mischungen. Transformanten wurden auf einer YPD-Platte, enthaltend 200 μg/ml G418, selektiert und ungefähr 2.000 bis 7.000 Transformanten wurden unter jeder Bedingung mit 0,1 μg pPCV64-DNA erhalten. 500 bis 2.000 erhaltene G418-resistente Kolonien, erhalten unter jeder Bedingung wurden auf einer YPD-Platte, enthaltend 800 μg/ml Hygromycin B Replika-kultiviert. Das Verhältnis von Kolonien, die eine Resistenz gegen Hygromycin B zeigten, zu denen, die eine Resistenz gegenüber G418 zeigten, variiert zwischen den Pulsbedingungen nicht sehr stark und verbleibt im Bereich von ungefähr 1 bis 2 %. Weiterhin wurden die G418-resistenten und Hygromycin B-resistenten Stämme über Nacht in einem flüssigen YPD-Medium kultiviert, um Stämme zu erhalten, die durch Ausfall des pPCV64, das als Plasmid vorlag, gegenüber G418 empfindlich geworden waren. Wenn 40 Stämme überprüft wurden, wurden 10 G418-empfindliche und Hygromycin B-resistente Stämme erhalten. Es wurde erwartet, dass bei diesen Stämmen das Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das HPT-Gen und den PGK-Gen-Terminator auf dem Chromosom zurückgehalten wurde. Die chromosomale DNA wurde von diesen 10 Stämmen hergestellt und es wurde durch PCR überprüft, ob die HPT-Genexpressionskassette in das Chromosom integriert worden war oder nicht.
Als Primer wurde hier für

Primer 1 5'CAAGTTGATCCTTCTCCGGA3' (SEQ ID NO: 35) verwendet, synthetisiert auf Basis der DNA-Sequenz außerhalb des 5'-Endes des PGK-Gen-Promotorfragments, verwendet für die HPT-Genexpression,
Primer 2 5'GAAACTTCTCGACAGACGTC3' (SEQ ID NO: 36), synthetisiert auf der Basis der Sequenz innerhalb des HPT-Gens und
Primer 3 5'CATCGGGTAAGGTCTACATG3' (SEQ ID NO: 37), synthetisiert auf der Basis der Sequenz in dem PGK-Gen-Terminatorfragment, verwendet für die HPT-Genexpression.

Die PCR wurde für 30 Zyklen unter Bedingungen von 95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 5 Minuten durchgeführt. Das Ergebnis ist in 50 dargestellt. 50(1) illustriert die Elektrophorese der PCR-Reaktionsprodukte mit dem Primer 1 und Primer 3. Ein 2,7 kb Amplifikationsfragment aufgrund des endogenen PGK-Gens wurde in jeder Probe beobachtet und ein 2,6 kb-Fragment wurde in fünf Proben der Nummern 3, 5, 7, 9 und 10 beobachtet. Das 2,2 kb-Fragment sollte auf einen Ersatz von einem der beiden endogenen PGK-Gene durch das Fragment, enthaltend den PGK-Gen-Promotor, das HPT-Gen und den PGK-Gen-Terminator, verwendet für die Transformation, zurückzuführen sein. Weiterhin ist das Ergebnis der PCR derselben DNA-Probe mit Primer 1 und Primer 2 in 50(2) dargestellt. Ein 1,4 kb Amplifikationsfragment wurde für fünf Proben beobachtet, worin ein 2,6 kb-Fragment beobachtet wurde und bei diesen fünf Klonen war das endogene PGK-Gen durch das HPT-Gen durch homologe Rekombination ersetzt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Sequenz, umfassend eine DNA-Sequenz, die eine Resistenz gegen Cycloheximid an eine Hefe verleiht und ein Cycloheximid-resistentes L41-Protein mit einer Aminosäuresequenz wie dargestellt in 14 (SEQ. ID. NR. 6) kodiert, mit der Maßgabe, dass das Prolin an Stellung 56 durch Glutamin ersetzt ist.
Plasmid, umfassend die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1.
Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 als Arzneimittelresistenz-Markergen bei der Selektion einer transformierten Candida utilis.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die transformierte Candida utilis mit einem zirkulären Integrationsvektor erzeugt wird, umfassend eine Sequenz, die zu einem Teil der chromosomalen DNA von Candida utilis homolog ist („homologe DNA-Sequenz"), und der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 als ein Markergen zur Selektion eines Transformanten und optional einem heterologen Gen und das heterologe Gen in die chromosomale DNA von Candida utilis durch homologe Rekombination inkorporiert wird, wenn der Vektor in der homologen DNA-Sequenz mit einem Restriktionsenzym in eine lineare Form geschnitten und in Candida utilis eingeführt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 4, worin beide Enden einer DNA-Sequenz, umfassend das Markergen und das optionale heterologe Gen, kovalent an die homologe DNA-Sequenz gebunden sind und wobei das heterologe Gen in die chromosomale DNA von Candida utilis durch homologe Rekombination eingebaut wird, wenn der Vektor in der homologen DNA-Sequenz mit einem Restriktionsenzym in eine lineare Form geschnitten wird und in Candida utilis eingeführt wird.