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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Polynukleotide sowie die Verwendung
dieser Polynukleotide für die
Insertionsmutagenese und die Markierung von Genen bei Pilzen. Die
Erfindung betrifft auch Sammlungen von Pilzmutanten, die durch transiente
Insertion des Impala-Transposons aus Fusarium oxysporum in das Genom
dieser Pilze erhalten wurden. Diese Sammlungen von Mutanten sind
ein schlagkräftiges
genetisches Werkzeug für
die Untersuchung der Funktion von Genen bei Pilzen.
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Transposons
können
als bewegliche genetische Elemente, die zwischen zwei DNA-Sequenzen
springen können,
definiert werden. Aufgrund ihrer Fähigkeit, in Gene (Exons, Introns,
regulierende Regionen) integrieren zu können, können sie der Ursprung von Mutationen
sein. Aufgrund dessen nehmen sie an der Evolution von Genomen, die
sie parasitieren, teil. Die Transposons sind gemäß ihrer Vermehrungsweise in
zwei Gruppen eingeteilt worden (Finnegan, 1989; Capy et al., 1998).
- – Elemente
der Klasse I (Retroelemente) transponieren über eine Zwischen-RNA, die
von einer reversen Transkriptase in DNA umgeschrieben wird. Diese
Klasse wird in Retroelemente oder Retrotransposons, die von LTRs
(Long Terminal Repeats) begrenzt werden bzw. nicht begrenzt werden,
unterteilt. Unter den Retroelementen mit LTRs finden sich die Elemente
der gypsy-Familie und der copia-Familie. Sie verfügen über Gene,
die zu den gag- und pol-Genen der Retroviren homolog sind und unterscheiden
sich vom pol-Gen durch den Aufbau der unterschiedlichen funktionellen
Domänen.
Außerdem
weist die gypsy-Familie ein Gen auf, das zu env, welches eine Rolle
bei Infektiösität der Retroviren
spielt, homolog ist. Unter den Retroelementen ohne LTRs unterscheidet
man zwischen LINEs, die gag- und pol-Gene sowie eine Poly-A-Sequenz
aufweisen, und den SINEs, die ebenfalls einen Poly-A-Schwanz aufweisen,
denen jedoch gag- und pol-Sequenzen fehlen; sie sollen angeblich
von älteren
LINEs- Elementen
abstammen (Eickbush, 1992; Okada und Hamada, 1997).
- – Die
Elemente der Klasse II transponieren über einen Mechanismus, bei
dem die DNA-Sequenz des Transposons herausgeschnitten und neu insertiert
wird. Ihre Allgemeinstruktur besteht aus zwei Sequenzen, die in
umgekehrter Orientierung wiederholt sind (ITRs) und die an einem
offenen Leserahmen, der für eine
für die
Transposition des Elements erforderliche Transposane codiert, grenzen.
Diese Elemente wurden entsprechend den Sequenzhomologien ihrer Transposasen
und/oder ITRs in Überfamilien
zusammengefaßt,
nämlich
die der Tc1/mariner-Elemente (Doak et al., 1994), der Fot1/Pogo-Elemente
(Capy et al., 1998; Smit und Riggs, 1996), der hAT-Elemente (Calvi
et al., 1991), der P-Elemente (Kidwell, 1994) oder der CACTA-Elemente
(Gierl 1996).
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Die
Identifikation und Erforschung von Pilztransposons sind von höchstem Interesse,
insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung von Werkzeugen für die Insertionsmutagenese
(Brown et al., Curr. Opin. Microbiol. 1: 390–4, 1998) sowie für die Untersuchung
des Genoms dieser Pilze (Dobinson et al., Trends in Microbiology, 1:
348–3652,
1993).
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Für die Identifikation
von Transposons im Genom von Pilzen hat man daher unterschiedliche
Strategien eingesetzt. Bei der ersten und zweiten macht man sich
die Kenntnisse von den zuvor charakterisierten Elementen zunutze.
Es geht um die Verwendung von heterologen Sonden, die in Southern-Hybridisierungsversuchen
oder Amplifikationen mit Hilfe von Oligonukleotiden, die von stark
konservierten Domänen,
wie der Domäne
der reversen Transkriptase von Retroelementen mit LTRs stammen,
verwendet werden. Die dritte Strategie besteht in der Charakterisierung
von wiederholten DNA-Sequenzen. Hier ist eine unter scheidende Hybridisierung
zwischen genomischer DNA und einer ribosomalen Sonde erforderlich.
So wurden Transposons der Familie Fot1 im Genom von Magnaporthe
grisea (Kachroo et al., Current Genetics 31: 361–369, 1997; Farman et al.,
Mol. Gen. Genetics 251: 675–681,
1996; Kachroo et al., Mol. Gen. Genetics 245: 339–348, 1994) identifiziert.
Mit der letzten Methode können
im Unterschied zu den drei zuvor beschriebenen Methoden funktionelle
aktive Elemente identifiziert werden; es handelt es sich um eine
Transposonfalle. Bei dieser Strategie wird ein Markergen verwendet,
dessen durch Insertion des Elements hervorgerufene Mutation durch
Positiv-Screening identifiziert werden kann. So hat man mit dem
am-Gen (Glutamatdehydrogenase-Gen) das Tad-Retroelement, das den LINE-Typ aufweist,
bei Neurospora crassa, nach seiner erneuten Insertion in dieses
Gen charakterisieren können
(Kinsey und Helber, 1989). Das niaD-Gen (Nitratreduktase-Gen) aus
Aspergillus nidulans wurde ebenfalls zum Einfangen von Transposons
verwendet. Eine Mutation, die dieses Gen inaktiviert, vermittelt
nämlich
eine Chloratresistenz. So wurden unterschiedliche Transposons bei
Fusarium oxysporum (Daboussi et al., Genetica 93: 49–59, 1994)
und bei Aspergillus (
US 5,985,570 )
gefunden. Das Fot1-Element der Klasse II aus Fusarium oxysporum
war das erste Transposon, das aufgrund der Inaktivierung des niaD-Gens identifiziert
wurde (Daboussi et al., 1992). Weiterhin konnte die Verwendung des
niaD-Gens bei Fusarium oxysporum das Impala-Transposon, das zu der Überfamilie
der Elemente des Tc1/mariner-Typs zählt, eingefangen werden (Langin
et al., 1995). Bei Fusarium oxysporum wurden verschiedene Unterfamilien
des Impala-Transposons
identifiziert (Hua-Van et al., Mol. Gen. Genetics 259: 354–362, 1998).
Die Transposition des Impala-Elements wurde an Fusarium oxysporum
untersucht. Wenn das Impala-Transposon in den Promoter oder die
Introns eines bestimmten Gens integriert ist, kann es die Expression
dieses Gens inaktivieren. Nach der Transposition des Impala-Transposons
wird das Gen wiederum aktiviert, was eine positive Kontrolle des
Transpositionsvorgangs darstellt. Solch eine Transpositionsidentifikationsstrategie
wurde bei Fusarium mit einem Konstrukt, das das in die Promoterregulationssequenz
des Nitratreduktasegens (niaD) von Aspergillus nidulans integrierte
Impala-Transposon umfaßt,
angewandt (Hua-Van, 1998).
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Mit
dem Konstrukt niaD/Impala des Plasmids pNi160 (Langin et al., 1995)
konnte die Transposition von Impala in anderen Pilzen, insbesondere
Magnaporthe grisea, nicht oder nur mit einer äußerst niedrigen Ausbeute, die
mit der Entwicklung eines Werkzeugs für die Insertionsmutagenese
nicht vereinbar ist, nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen legen
nahe, daß das
Konstrukt niaD/Impala des Plasmids pNi160 (Langin et al., 1995),
allgemeiner ausgedrückt,
daß das
Impala-Transposon
selbst, nicht in anderen Pilzen, insbesondere M. grisea, funktionsfähig ist.
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Nun
wird aber solch ein Werkzeug, mit dem eine Sammlung von Insertionsmutanten
in dem Genom von Pilzen, insbesondere von pathogenen Fadenpilzen,
erzeugt werden kann, unabdingbar für die Untersuchung ihres Genoms
und die Untersuchung der Funktion ihrer Gene benötigt. Die Funktionsanalyse
von pilzlichen Genen ist für
die Entdeckung von neuen antimykotischen Verbindungen, die für die Behandlung
von Pilzkrankheiten bei der menschlichen oder tierischen Gesundheit
oder für
die Landwirtschaft verwendet werden können, unabdingbar.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Polynukleotide, die ein durch
Insertion eines Impala-Transposons inaktiviertes, in Magnaporthe
grisea funktionsfähiges
Markergen umfassen. Mit diesen Polynukleotiden kann man die Transposition
des Impala-Elements in den Pilzen mit einer Transpositionsrate,
die mit der Entwicklung von Werkzeugen für die Insertionsmutagenese
kompatibel ist, nachweisen. Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur
Herstellung von Pilzmutanten durch Insertion eines Impala-Transposons
in deren Genom sowie Verfahren zur Identifikation eines pilzlichen
Gens, das mit einem interessierenden Phänotyp assoziiert ist. Schließlich betrifft
die Erfindung auch Sammlungen von pilzlichen Insertionsmutanten
und ihre Verwendungen.
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Beschreibung
der Erfindung
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Polynukleotide
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher ein Polynukleotid, insbesondere
ein isoliertes oder aufgereinigtes Polynukleotid, das ein durch
Insertion eines Impala-Transposon inaktiviertes Markergen umfaßt, wobei dieses
Markergen in Transkriptionsrichtung eine in Magnaporthe grisea funktionsfähige Promoterregulationssequenz
in funktioneller Verknüpfung
mit der Codiersequenz dieses Markergens umfaßt.
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Die
Transformation eines Pilzes mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid
und das Herausschneiden des Transposons führen zur Expression des Markergens.
Mit dem Nachweis der Expression des Markergens kann man so die Transpositionsereignisse
verfolgen und die Insertionsmutanten selektieren. Die Selektion
von Mutanten kann durch Markierung des Transposons mit einem zweiten
Markergen, das sich von dem ersten Markergen unterscheidet, verbessert
werden. Mit diesem zweiten Markergen kann man die erneute Insertion
des Transposons in das Genom des Pilzes verfolgen. Die Erfindung
betrifft daher weiterhin wie oben beschriebene Polynukleotide, in
denen das Impala-Transposon
ein Markergen umfaßt.
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Die
verwendeten Markergene eignen sich für die Selektion von Transpositionsereignissen
mittels eines einfachen Screenings. Jegliches Markergen, dessen
Expression in einem Pilz durch phänotypisches Screening nachgewiesen
werden kann, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Unter dem Begriff „Markergen" sind auch chimäre Gene,
die genetische Elemente unterschiedlicher Herkunft umfassen. Bei den
erfindungsgemäßen Markergenen
kann daher eine pilzliche Promotersequenz in Kombination mit einer Codiersequenz
eines Markergens, die nicht aus einem Pilz stammt, vorliegen.
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Unter
einer in Magnaporthe grisea funktionsfähigen Promoterregulationssequenz
versteht man erfindungsgemäß jegliches
Polynukleotid, das die Expression einer Codiersequenz, mit der sie
funktionsfähig
verbunden ist, in Magnaporthe grisea gestattet. Der Fachmann ist
mit den Techniken, mit denen bestimmt werden kann, ob eine Promotersequenz
in Magnaporthe grisea funktionsfähig
ist, vertraut. So kann Magnaporthe zum Beispiel mit einem Polynukleotid
transformiert werden, das in Transkriptionsrichtung eine eventuelle
Promotersequenz und ein Reportergen umfaßt. Durch Verfolgung der Expression
des Reportergens in dem mit diesem Polynukleotid transformierten
Pilz kann man bestimmen, ob diese Promotersequenz in Magnaporthe funktionsfähig ist.
Jegliche Promotersequenz kann auf diese Weise geprüft werden,
um ihre Funktionsfähigkeit in
Magnaporthe grisea zu bestimmen. Bei der Promoterregulationssequenz
kann es sich um eine Promoterregulationssequenz eines Gens von Magnaporthe
grisea handeln oder sie kann von einem anderen Pilz, insbesondere
einem anderen Fadenpilz, stammen. Vorteilhafterweise besteht die
in Magnaporthe grisea funktionsfähige
Promoterregulationssequenz aus der Promoterregulationssequenz eines
pilzlichen nia (Nitratreduktase)- oder gpd-Gens. Vorzugsweise besteht
die in Magnaporthe grisea funktionsfähige Promoterregulationssequenz
aus einer in Magnaporthe grisea funktionsfähigen Promoterregulationssequenz
des niaD-Gens (Malardier
et al., 1989) oder gpdA-Gens aus Aspergillus nidulans (Punt et al.,
1990). Um in Magnaporthe funktionsfähig zu sein, weist die Promoterregulationssequenz
des niaD-Gens von Aspergillus nidulans vorzugsweise eine Größe von über 337
Bp, 0,4 kb, 0,5 kb, 0,6 kb, 0,7 kb, 0,8 kb, 0,9 kb, und stärker bevorzugt
ungefähr
1 kb oder darüber,
auf. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung besteht die in Magnaporthe grisea funktionsfähige Promotersequenz
aus einem 1,3 kb großen
Polynukleotid, das dem Intergenfragment zwischen dem niaD-Gen und
dem niiA-Gen von Aspergillus nidulans (Genbank M58291; Johnstone
et al., Gene 90: 181–192,
1990; Punt et al., 1995) entspricht. Es ist zu beachten, daß eine teilweise
funktionsfähige
Regulationssequenz, die als solche nicht funktionsfähig ist,
deren vorhergehende Integration in das Genom von Magnaporthe grisea
stromaufwärts
eines Promoters von Magnaporthe grisea die Expression des Markergens gestattet,
erfindungsgemäß keine
in Magnaporthe grisea funktionsfähige
Regulationssequenz ist.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung stammt die Codiersequenz des Markergens aus der Reihe
der Sequenzen, die für
ein Reportergen codieren, dessen Expression leicht gemessen werden
kann, insbesondere GUS (US 5 268 463, US 5 599 670) oder GFP (US
5 491 084, US 5 741 668), der Sequenzen, die für ein Gen für Toleranz gegenüber einem
Antibiotikum oder einem Herbizid codieren, wie den Genen für Resistenz
gegen Hygromycin (hph: Punt et al., 1987), gegen Phleomycin (ble:
Drocourt, 1990), gegen das Herbizid Bialaphos (Bar: Pall und Brunelli,
1993), oder einem Gen für
Resistenz gegen Sulfonylharnstoffe (Sweigard et al., 1997). Gemäß einer
anderen bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung stammt das Markergen aus der Reihe der Sequenzen von
Genen, die für
in Pilzen funktionsfähige
Enzyme codieren. Vorteilhaft handelt es sich bei dem Markergen um
das Gen der Nitratreduktase. Wenn man das erfindungsgemäße Gen in
einen nia–-Pilz
integriert, so wird bei dem mit diesem Konstrukt transformierten
Stamm ein mutierter Phänotyp
konserviert. Das Auftreten von nia+-Kolonien auf einem Minimalmedium
(NaNO3 als einzige Stickstoffquelle) zeigt,
daß das
Impala-Transposon herausgeschnitten wurde, was die Expression des
niaD-Gens ermöglicht.
Diese nia+-Revertanten können
aufgrund ihres dichten und luftigen Phänotyps, der sich von dem kurzflorigen
Phänotyp
der nia–-Kolonien
unterscheidet, selektiert werden. Verwendet man das niaD-Gen als Marker,
so ist die Verwendung eines nia–-Pilzes
erforderlich. Der Fachmann ist mit den Verfahren zur Identifikation
von nia–-Pilzen
gut vertraut. Insbesondere zu nennen ist die von Daboussi et al.
(1989) beschriebene Methode.
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Die
erfindungsgemäßen Polynukleotide
umfassen ein wie oben beschriebenes Markergen, das durch die Insertion
eines Impala-Transposons inaktiviert ist (Langin et al., 1995; Hua-Van
et al., 1998). Das Impala-Transposon umfaßt ein offenes Leseraster,
das für
eine von invertierten Sequenzwiederholungen (ITRs) funktionelle
Transposase codiert. Sie integriert an einem TA-Dinukleotid, das
demzufolge dupliziert wird. Das Herausschneiden von Impala erfolgt
ungenau und hinterläßt in den
meisten Fällen
zusätzlich
zu dem bei der Insertion duplizierten TA-Dinukleotid einen „Footprint" von drei Nukleotiden,
die dem linken oder rechten Ende des Elements entsprechen. Die Insertionsstelle
des Impala-Transposons in dem Markergen muß daher so gewählt werden,
daß der
verbleibende „Footprint" nach dem Herausschneiden
nicht die Expression des Markergens behindert. Vorzugweise wird
das Impala-Transposon in die Promotersequenz oder in ein Intron
des Markergens insertiert. Bei Fusarium oxysporum wurden mehrere
Kopien von Impala nachgewiesen, und durch Vergleich ihrer Sequenz
konnte man drei Unterfamilien, die ITRs mit unterschiedlicher Länge und
Sequenz aufweisen, abgrenzen (Hua-Van et al., 1998). In einer bevorzugten
Ausführungsform
umfassen die erfindungsgemäßen Polynukleotide
ein Impala 160 Transposon. Das Impala 160 Element umfaßt 1280
Bp und wird von zwei 27 Bp großen
invertierten wiederholten Sequenzen begrenzt, die ein für eine 340
Aminosäuren
lange Transposase codierendes offenes Leseraster umrahmen (Langin
et al., 1995; Genbank 575106). In einer bevorzugten Ausführungsform
umfassen die erfindungsgemäßen Polynukleotide
den 1,3 kb großen
Promoter des niaD-Gens von Aspergillus nidulans in funktioneller
Verknüpfung
mit der Codiersequenz des niaD-Gens von Aspergillus nidulans und
ein in den Promoter des niaD-Gens insertiertes Impala 160-Transposon. In einer besonders
vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen Polynukleotide das Plasmid
pNiL160. Diese Konstrukte dienen der Transformation eines nia–-Pilzes,
und die aus der Transposition des Impala-Elements hervorgehenden
Insertionsmutanten werden auf einem Minimalmedium auf ihren nia+-Phänotyp selektiert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Polynukleotide
den Promoter des gpd-Gens
von Aspergillus nidulans in funktioneller Verknüpfung mit der Codiersequenz
des hph-Hydromycinresistenzgens und ein in den Promoter des gpd-Gens
insertiertes Impala 160-Transposon. Diese Polynukleotide dienen
der Transformation eines Pilzes und der Selektion der hydromycinresistenten
Insertionsmutanten, die aus der Transposition des Impala-Elements
hervorgehen.
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In
den erfindungsgemäßen Konstrukten
und Verfahren kann jegliches Impala-Transposon verwendet werden.
Unter dem Begriff „Impala-Transposon" sind auch modifizierte
Impala-Transposons zu verstehen. Unter diesen Modifikationen sind
insbesondere die Insertion eines Markergens oder von aktivierenden
Sequenzen in das Impala-Transposon oder auch die Inaktivierung der
Transposase, wodurch man ein defizientes Impala-Transposon erhält, zu verstehen. Für die Konstruktion
von diesen modifizierten Transposons verwendet man fachbekannte
klassisches molekularbiologische Verfahren.
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Die
erfindungsgemäßen Polynukleotide
werden vorzugsweise für
die Herstellung von pilzlichen Insertionsmutanten verwendet. Die
Insertion des Impala-Transposons
in ein Gen führt
im allgemeinen zur vollständigen
oder teilweisen Inaktivierung dieses Gens. Im Gegensatz dazu lassen
sich durch Verwendung eines Impala-Transposons Überexpressionsmutanten erhalten.
Mit den Modifikationen des Transposons lassen sich daher verschiedene
Verfahren der Insertionsmutagenese durchführen (Bancroft et al., Mol.
Gen. Genet. 233: 449–461,
1992; Bancroft et al., Mol. Gen. Genet. 240: 65–67, 1993; Long et al., PNAS
90: 10370–10374, 1993).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein wie oben beschriebenes
Polynukleotid, das ein Impala-Transposon
umfaßt,
in das zwischen die beiden ITRs des transponierbaren Elements ein
Markergen insertiert ist, ohne die Funktionsfähigkeit der Transposase negativ
zu beeinflussen, wodurch man über
ein autonomes markiertes Element verfügt. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung können
zur Markierung dieses Transposons auch alle die Markergene verwendet
werden, deren Verwendung für
die Reparatur der Exzision des Impala-Transposons in Betracht gezogen wird.
Vorzugsweise wird das Markergen stromabwärts von der die Transposase
codierenden Sequenz und stromaufwärts des linken ITR (an der
NheI-Stelle) insertiert. Durch die Insertion eines Markergens in
das Impala-Transposon kann man eine bessere Selektion von Insertionsmutanten
durchführen.
Man kann jedoch ein verkürztes
Markergen in das Impala-Transposon insertieren. Dadurch, daß man ein
promoterfreies Markergen verwendet, kann man die erfindungsgemäßen Polynukleotide
als Promoterfalle verwenden. Dadurch, daß man einen promoterhaltigen
Marker verwendet, kann man die erfindungsgemäßen Polynukleotide als Falle
für eine
Aktivierungssequenz verwenden.
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Schließlich betrifft
die vorliegende Erfindung ein wie oben beschriebenes Polynukleotid,
das ein defizientes Impala-Transposon umfaßt, also ein Transposon, in
dem die Transposase des Impala-Elements inaktiviert wurde, und zwar
insbesondere durch Mutation, durch Deletion, durch Insertion eines
Markergens oder durch Austausch gegen ein Markergen. Die Transposition
dieses defizienten Impala-Elements ist bei den erfindungsgemäßen Verfahren
der Insertionsmutagenese leichter zu kontrollieren. Bei der Konstruktion
eines defizienten Impala-Elements, dessen Transposase inaktiviert
wird, werden fachbekannte klassische molekularbiologische Techniken
verwendet (Sambrook et al., 1989). Bei einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das offene Leseraster, das für die Transposase des Impala-Elements
codiert, durch ein unter der Kontrolle eines in Magnaporthe grisea
funktionsfähigen
Promoters exprimiert. Die Codiersequenz der Transposase kann zum
Beispiel durch das Hydromycinresistenzgen, das Bialaphosresistenzgen
oder das GFP-Gen, das unter der Kontrolle eines in Pilzen funktionsfähigen heterologen
Promoters exprimiert wird, ersetzt werden. Bei dem defizienten Impala-Transposon
sind diese Insertionssequenzen (ITRs) konserviert; die Transposition
dieses Transposons kann daher in Trans durch eine zum Beispiel auf
ein replizierendes Plasmid plazierte Transposase aktiviert werden.
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Die
erfindungsgemäßen Polynukleotide
werden vorzugsweise in einen Vektor insertiert. Dieser Vektor kann
für die
Transformation eines Wirtsorganismus, wie zum Beispiel eines Bakteriums,
und für
die Replikation der erfindungsgemäßen Polynukleotide in diesem
Wirtsorganismus verwendet werden. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Polynukleotide
in einen Vektor für die
Transformation von Pilzen insertiert. Diese Vektoren dienen der
Replikation oder Integration dieser Polynukleotide in das Genom
von Pilzen. Die Vektoren, mit denen Polynukleotide in einem Wirtsorganismus
repliziert bzw. in einen Wirtsorganismus integriert werden können, sind
dem Fachmann gut bekannt.
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Insertionsmutagenese
und genetische Markierung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der oben beschriebenen
Polynukleotide für
die Herstellung von pilzlichen Insertionsmutanten und die Untersuchung
des Genoms dieser Pilze.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung
von Insertionsmutanten von Pilzen, das die folgenden Schritte umfaßt:
- – man
transformiert den Pilz mit einem Polynukleotid, das ein durch Insertion
eines Impala-Transposons inaktiviertes
Markergen umfaßt,
unter Bedingungen, die das Herausschneiden des Impala-Transposons von dem
Markergen und seine erneute Insertion in das Genom des Pilzes gestatten;
- – man
identifiziert die Insertionsmutanten, die das Markergen exprimieren.
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Natürlich kann
in den erfindungsgemäßen Verfahren
das Impala-Transposon modifiziert werden, insbesondere durch die
Insertion eines Markergens oder von Aktivierungssequenzen. In einer
bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
das Impala-Transposon ein Markergen, und man selektiert diejenigen
Insertionsmutanten, die die beiden Markergene exprimieren.
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Jeder
beliebige Pilz kann mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotide transformiert
werden, um Insertionsmutanten dieses Pilzes herzustellen. Insbesondere
sind die Ascomyceten, Basidiomyceten und Oomyceten zu nennen. Vorzugsweise
betrifft die Erfindung die Pilze der Gattungen Alternaria, Aspergillus,
Botrytis, Cladosporium, Claviceps, Colletotrichum, Erysiphe, Fusarium,
Mycosphaerella, Phytophthora, Pseudocercosporella, Pyrenophora,
Rhynchosporium, Sclerotinia, Stagonospora, Venturia und Ustilago.
Ebenfalls zu nennen sind die Pilze der Gattungen Gaeumannomyces,
Helminthosporium, Puccinia und Rhizoctonia. Vorzugsweise betrifft
die Erfindung die Pilze der Gattungen Magnaporthe und Penicillium.
Stärker
bevorzugt betrifft die Erfindung die Pilze der Arten Aspergillus
fumigatus, Aspergillus nidulans, Botrytis cinerea, Erysiphe graminis,
Mycosphaerella graminicola, Penicillium funiculosum und Stagonospora
nodorum. Noch stärker
bevorzugt betrifft die Erfindung Magnaporthe grisea.
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Die
Techniken für
die Transformation von Pilzen sind dem Fachmann gut bekannt. Insbesondere
sind zu nennen die Transformation von Protoplasten mit PEG, die
Elektroporation, die Transformation mit Agrobacterium (DeGroot et
al., Nature Biotechnology 16: 839–842, 1998) oder die Methoden
des Beschusses mit der Genkanone (Chaure et al., Nature Biotechnology
18: 205–207,
2000).
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Die
Transformanten werden anschließend
auf Expression des Markergens gescreent, um diejenigen Insertionsmutanten,
die aus der Transposition des Impala-Elements hervorgehen, zu identifizieren
oder zu selektieren. Mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotidmarkergen
können
Insertionsmutanten mittels Phänotyp-Screening
identifiziert oder selektiert werden. So kann es sich zum Beispiel
bei diesem Screening um eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, eine
Resistenz gegen eine Chemikalie oder um die Bestimmung des Expressionsniveaus
eines Reportergens handeln. Verschiedene Markergene sind oben genauer
beschrieben. Verwendet man das niaD-Gen als Markergen in einem nia–-Pilz,
so werden die Insertionsmutanten aufgrund ihres dichten und in die
Luft ragenden Aussehens auf Minimalmedium, das NaNO3 als
einzige Stickstoffquelle enthält,
selektiert.
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Um
die so erhaltenen Insertionsmutanten zu analysieren, kann es vorteilhaft
sein, das Transposon zu stabilisieren, um jegliche erneute Transposition
zu vermeiden. Diese Verhinderung einer erneuten Reinsertion des
Transposons kann dann vernachlässigt
werden, wenn die Mutanten in einer Anzahl in der Nähe der Transpositionsrate
des Transpositionselements oder darunter getestet werden. Um das
Herausschneiden des Transposons zu verhindern, kann ein 2-Komponenten-System hergestellt
werden (Hua-Van, 1998; Kempken und Kuck, 1998). Dies erfordert die
Konstruktion eines defizienten Impala-Elements, in dem die Transposase insbesondere
durch Mutation, durch Deletion oder durch Austausch gegen ein Markergen
inaktiviert ist. In diesem Fall wird das defiziente Impala-Transposon
durch eine Transposase, deren Expression einer starken Kontrolle
unterliegt, mobilisiert, wodurch das Impala-Element stabilisiert werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung
von Insertionsmutanten von Pilzen, dadurch gekennzeichnet, daß es die
folgenden Schritte umfaßt
- – man
transformiert den Pilz mit einem Polynukleotid, das ein durch Insertion
eines Impala-Transposons inaktiviertes
Markergen umfaßt;
- – man
mobilisiert das defiziente Impala-Transposon mit einer Transposase,
deren Expression unter Bedingungen kontrolliert wird, die das Herausschneiden
des defizienten Impala-Transposons, seine erneute Insertion in das
Genom des Pilzes und seine Stabilisierung in dem Genom des Pilzes
gestatten;
- – man
identifiziert die Insertionsmutanten, die das Markergen exprimieren.
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Die
Verfahren, mit denen die Expression eines Gens wie des Transposase-Gens
des Impala-Elements in Pilzen kontrolliert werden kann, sind dem
Fachmann gut bekannt. Bei einer besonderen Ausführungsform wird der Pilz mit
zwei Polynukleotiden transformiert, wobei das erste Polynukleotid
das defiziente Impala-Transposon umfaßt, während das zweite Polynukleotid
die Codiersequenz für
die Transposase des Impala-Elements unter der Kontrolle ihres eigenen
Promoters oder eines heterologen Promoters umfaßt. Die Codiersequenz für die Transposase
kann auf ein replizierendes Plasmid oder auf ein integrierendes
Plasmid plaziert werden. Um die Expression der Transposase zu kontrollieren,
kann diese unter die Kontrolle eines induzierbaren Promoters gestellt
werden. Die Induktion der Expression der Transposase gestattet die
Transposition des defizienten Impala-Elements und die Herstellung
von Insertionsmutanten, das Transposon ist dann stabilisiert, wenn
die Transposase nicht mehr exprimiert wird. In den erfindungsgemäßen Verfahren
kann jeder beliebige induzierbare, in Pilzen funktionsfähige Promoter
verwendet werden. Insbesondere kann der Promoter des Nitratreduktasegens
von Magnaporthe grisea verwendet werden; dieser Promoter gestattet
nämlich
die Expression des nia-Gens auf einem Minimalmedium in Gegenwart
von Nitrat als einzige Stickstoffquelle, während die Expression dieses
Gens in Gegenwart von Ammonium vollständig unterdrückt ist
(Lau und Hammer, 1996). Man kann jedoch auch die Transposase zum
Beispiel auf ein replizierendes Plasmid, das einen Selektionsmarker
trägt,
plazieren, wobei dieses Plasmid ohne Selektionsdruck nicht erhalten
bleibt. In diesem Fall kann die Transposase unter der Kontrolle
eines konstitutiven Promotors oder ihres eigenen Promoters exprimiert
werden. In Gegenwart eines Selektionsdrucks gestattet die Tatsache,
daß das
replizierende Plasmid erhalten bleibt, die Expression der Transposase,
die wiederum die Transposition des Impala-Elements und die Gewinnung
von Insertionsmutanten gestattet. Ohne Selektionsdruck, der die
Erhaltung des replizierenden Plasmids gestattet, geht die Transposase
verloren und das Transposon wird in den Mutanten stabilisiert. Der Fachmann
ist mit dem für
die Herstellung solch eines Plasmids erforderlichen Mitteln und
Wegen gut vertraut. So kann zum Beispiel die Transposase in den
replizierenden Vektor pFAC1, der Telomerenenden von Podospora enthält, plaziert
werden (Barreau et al., 1998).
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Bei
der Insertionsmutagenese handelt es sich um ein sehr schlagkräftiges Werkzeug
für die
Identifikation von neuen interessierenden Genen und die Untersuchung
ihrer Funktion. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Sammlung
von Insertionsmutanten auf einen interessierenden Phänotyp gescreent.
In den erfindungsgemäßen Insertionsmutanten
kann nach jedem beliebigen nachweisbaren Phänotyp gesucht werden. Insbesondere
sind Phänotypen,
die die Biologie, Physiologie, Entwicklung und Biochemie des Pilzes betreffen,
zu nennen. Vorzugsweise werden Insertionsmutanten von pathogenen
Pilzen hergestellt, und die in diesen Mutanten gesuchten Phänotypen
betreffen die Pathogenität
dieses Pilzes. Das phänotypische
Screening kann auf einer direkten Beobachtung des Pilzes, auf einer
Bestimmung der enzymatischen Aktivität, der Bestimmung einer Empfindlichkeit
gegenüber
einem Fungizid oder auch auf der Untersuchung der Virulenz des Pilzes
beruhen. Wenn eine Insertionsmutante, die einen interessierenden
Phänotyp
aufweist, identifiziert worden ist, so wird das Gen, in das bzw.
in dessen Nähe
das Impala-Transposon integriert hat, isoliert. Das interessierende
Gen, das so durch die Insertion des Impala-Elements markiert worden
ist, wird mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken, die dem
Fachmann gut bekannt sind, isoliert. Unter den verwendeten Techniken
sind insbesondere die Amplifikationstechniken, mit denen ein Polynukleotid
amplifiziert werden kann, wenn nur die Sequenz von einem Ende des
Polynukleotids bekannt ist (in diesem Fall die Sequenz des Transposons,
das in das Genom integriert ist) zu nennen. Diese Techniken umfassen
insbesondere die „inverse PCR" (Ochman et al.,
Genetics, 120: 621–623,
1988; Williams, Biotechniques 7: 762–769, 1989), die „Vectorette-PCR" (Arnold und Hodgson,
PCR Methods Appl. 1: 39–42,
1991) und die „Panhandle-PCR" (Jones und Winistorfer,
PCR Methods Appl. 2: 197–203,
1993). Mit diesen Techniken können
die Sequenzen, die das Impala-Transposon
in dem Genom des Pilzes flankieren, amplifiziert, kloniert und sequenziert
werden. Diese flankierenden Sequenzen werden anschließend dazu
verwendet, um das gesamte, durch die Insertion des Transposons inaktivierte
Gen zu isolieren.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Identifikation
eines Gens, das mit einem in Pilzen nachweisbaren Phänotyp assoziiert
ist, dadurch gekennzeichnet, daß es
die folgenden Schritte umfaßt:
- – man
stellt durch Insertion eines Impala-Transposons in das Genom dieser Pilze
nach einem der oben beschriebenen Verfahren Insertionsmutanten her;
- – man
selektiert mindestens eine Insertionsmutante, die den nachweisbaren
Phänotyp
aufweist;
- – man
isoliert das Gen, in das bzw. in dessen Nähe sich das Impala-Transposon
insertiert hat.
-
Wirtsorganismen
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen Wirtsorganismus, der mit
einem erfindungsgemäßen Polynukleotid
transformiert ist. Unter Wirtsorganismus versteht man erfindungsgemäß insbesondere
jeglichen ein- oder mehrzelligen niederen oder höheren Organismus, der insbesondere
aus den Bakterien und Pilzen ausgewählt ist. Vorteilhafterweise
werden die Bakterien aus Escherichia coli ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung einen mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid
transformierten Pilz. Vorzugsweise wird der Pilz aus den Ascomyceten,
Basidiomyceten und Oomyceten ausgewählt. Vorzugweise werden die
Pilze aus den Pilzen der Gattungen Alternaria, Aspergillus, Botrytis,
Cladosporium, Claviceps, Colletotrichum, Erysiphe, Fusarium, Mycosphaerella,
Phytophthora, Pseudocercosporella, Pyrenophora, Rhynchosporium,
Sclerotinia, Stagonospora, Venturia und Ustilago ausgewählt. Ebenfalls
zu nennen sind die Pilze der Gattungen Gaeumannomyces, Helminthosporium,
Puccinia und Rhizoctonia. Vorzugsweise werden die Pilze aus der
Gruppe Magnaporthe und Penicillium ausgewählt. Vorzugsweise werden die
Gruppe aus den Arten Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans,
Botrytis cinerea, Erysiphe graminis, Mycosphaerella graminicola,
Penicillium funiculosum und Stagonospora nodorum ausgewählt. Ganz
besonders vorzugsweise handelt es sich bei dem Wirtsorganismus um
Magnaporthe grisea.
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Das
Polynukleotid kann in das Genom des Pilzes integriert sein oder
auf ein replizierendes Plasmid plaziert werden. Die vorliegende
Erfindung betrifft daher auch einen Pilz, in dessen Genom ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
integriert ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Insertionsmutanten
von Fadenpilzen, die aus den Pilzen der Gattungen Magnaporthe oder
Penicillium stammen und in deren Genom das Impala-Transposon integriert
ist.
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Aufgrund
der erneuten Insertion von Impala in das Genom des Pilzes kann man
eine Sammlung von Insertionsmutanten dieses Pilzes erzeugen. Die
so erhaltenen Mutanten können
zur Untersuchung des Genoms von Fadenpilzen verwendet werden.
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Die
folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne
jedoch ihren Rahmen einschränken
zu wollen. Alle unten in diesen Beispielen beschriebenen Methoden
oder Vorgehensweisen sind beispielhaft und stellen eine Auswahl
dar, die zwischen den verschiedenen Methoden, die verfügbar sind,
um zu dem gleichen Resultat zu gelangen, getroffen wurde. Diese
Auswahl ist für
die Qualität
des Ergebnisses irrelevant, und der Fachmann kann sich daher einer
beliebigen entsprechenden Vorgehensweise bedienen, um zu dem gleichen
Ergebnis zu gelangen. Die meisten Methoden für das Engineering von DNA-Fragmenten
sind in „Current
Protocols in Molecular Biology" Bd.
1 und 2, Ausubel F. M. et al., oder in Sambrook et al., 1989, beschrieben.
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Beschreibung
der Abbildungen
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1:
Karte des Plasmids pNi160
-
2:
Karte des Plasmids pNiL160(A) und des Plasmids pAN301 (B), das für seine
Konstruktion verwendet wurde.
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3:
Molekulare Analyse von Cotransformanten, die mit BamHI-REMI mit
Hilfe der Vektoren pNi160 und pCB1179 erhalten wurden. Die DNA von
Cotransformanten wird extrahiert, mit EcoRI verdaut und in TAE 1X
Puffer auf 1%iges Agarosegel aufgetragen (5 μg pro Bahn). Nach der Wanderung
und dem Transfer auf eine positive Nylonmembran werden die DNA-Fragmente
durch Southern-Hybridisierung
mit einer radioaktiven Probe, die dem 2,7 kb großen EcoRI-Fragment des in pAN301
vorliegenden niaD-Gens entspricht, nachgewiesen.
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4:
Molekulare Analyse der nia+-Revertanten C14-1 und C14-2. Die DNA
der Revertanten wird extrahiert, mit EcoRI verdaut und in TAE 1X
Puffer auf 1%iges Agarosegel aufgetragen (5 μg pro Bahn). Nach der Wanderung
und dem Transfer auf eine positive Nylonmembran werden die DNA-Fragmente
durch Southern- Hybridisierung
nachgewiesen.
- A: Analyse der Revertante C14-1
mit Hilfe einer radioaktiven Probe, die dem 2,7 kb großen EcoRI-Fragment des in pAN301
vorhandenen niaD-Gens (Bahn 1) oder dem für die Impala-Transposase codierenden ORF
(Bahn 2) entspricht.
- B: Analyse der Revertanten C14-1 und C14-2 nach deren Aufreinigung
durch Isolation von nia+-Monosporen. Die Profile der Revertanten
C14-1 (Bahn 3 und 4) und der Revertanten C14-2 (Bahn 5 und 6) werden mit
dem Profil der ursprünglichen
nia-Cotransformante C14 (Bahn 1 und 2) verglichen. Die verwendete Sonde
entspricht dem für
die Impala-Transposase codierenden ORF.
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5:
Molekulare Analyse von nia+-Revertanten, die von zwei Cotransformanten,
welche den Vektor pNiL160 tragen, abstammen. Die DNA von Cotransformanten
wird extrahiert, mit EcoRI verdaut und in TAE 1X Puffer auf 1%iges
Agarosegel aufgetragen (5 μg
pro Bahn). Nach der Wanderung und dem Transfer auf eine positive
Nylonmembran werden die DNA-Fragmente A: durch Southern-Hybridisierung
mit einer radioaktiven Probe, die dem für die Impala-Transposase codierenden
ORF bzw. B: durch Southern-Hybridisierung mit einer radioaktiven
Probe, die dem 2,7 kb großen
EcoRI-Fragment des in pAN301 vorliegenden niaD-Gens entspricht,
nachgewiesen. Bahn 1: DNA der Cotransformante 8; Bahn 2 bis 7: DNA
von Revertanten der Cotransformante 8; Bahn 8: DNA der Cotransformante
6; Bahn 9 bis 11: DNA von Revertanten der Cotransformante 6.
-
6:
Schematische Darstellung von ORFs, die durch Insertion von Impala
in die nichtpathogene Revertante Rev77 unterbrochen sind.
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7:
Karte des Plasmids pCITn
-
8:
Molekulare Analyse von nia+-Revertanten, die von einer Cotransformante,
welche das Konstrukt pNiHYG trägt,
abstammen. Die DNA von drei unabhängigen Revertanten (Bahn 1
bis 3) wird extrahiert, mit EcoRI verdaut und in TAE 1X Puffer auf
1%iges Agarosegel aufgetragen (5 μg
pro Bahn). Nach der Wanderung und dem Transfer auf eine positive
Nylonmembran werden die DNA-Fragmente
A: durch Southern-Hybridisierung mit einer radioaktiven Probe, die
dem für
die Impala-Transposase codierenden ORF bzw. B: durch Southern-Hybridisierung
mit einer radioaktiven Probe, die dem 2,7 kb großen EcoRI-Fragment des in pAN301 vorliegenden
niaD-Gens entspricht, nachgewiesen.
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Die
Position der Sternchen zeigt die erneute Insertion des transponierbaren
Elements an.
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9:
Karte des Plasmids pHIN
-
10:
Karte des Plasmids pEO6
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11:
Karte des Plasmids pHNiL
-
12:
Karte des Plasmids pBNiL
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13:
Karte des Plasmids pFACImp
-
14:
Molekulare Analyse von nia+-Revertanten, die von der Cotransformante
D1, welche nach Transformation mit dem Zwei-Komponenten-System erhalten
wurde, abstammen. Die DNA von Revertanten (Bahn 1 bis 4) wird extrahiert,
mit EcoRI verdaut und in TAE 1X Puffer auf ein 1%iges Agarosegel
aufgetragen (5 μg
pro Bahn). Nach der Migration und dem Transfer auf eine positive
Nylonmembran werden die DNA-Fragmente durch Southern-Hybridisierung
mit einer radioaktiven Sonde, die einem aus dem Gen hph amplifizierten Fragment
entspricht, nachgewiesen.
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Beispiele
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Beispiel I
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Insertionsmutagenese mit
einer autonomen Kopie von Impala
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1. Verfügbare Konstrukte
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Das
Plasmid pNi160 verfügt über die
Impala 160 Kopie, die in die Promoterregion des niaD-Gens von Aspergillus
nidulans 10 Bp vom ATG-Codon entfernt integriert ist. Ihre Konstruktion
leitet sich von der Transposonfalle ab, die in dem Fusarium oxsporum-Stamm
F24, welcher mit dem das Nitratreduktasegen von Aspergillus nidulans
(Daboussi et al., 1992) transformierten Plasmid pAN301 (Malardier
et al., 1989) hergestellt wurde. Durch Selektion von spontanen Mutationen
im niaD-Gen konnte man die Transformante TR7, die eine einzelne
Kopie von pAN301, eine 1,3 kb große Insertion, trägt, charakterisieren.
Diese Insertion befindet sich in der 2,7 kb großen EcoRI-EcoRI-Region von
pAN301, wodurch ein 4 kb großes
EcoRI-Fragment geschaffen wurde. Dieses Fragment wurde nach Konstruktion
einer partiellen Genbibliothek und durch Musterung mit dem 2,7 kb
großen
EcoRI-Fragment aus pAN301 (Langin, et al., 1995) in die EcoRI-Stelle
von pUC19 kloniert. Parallel dazu wurde das Plasmid p11ΔNdeI ausgehend
von pAN301 konstruiert, und zwar dadurch, daß man ein stromabwärts des
niaD-Gens plaziertes
7,8 kb großes
NdeI-Fragment sowie ein 1 kb großes EcoRI-BamHI-Fragment, das
dem Hauptteil des Promoters des niaD-Gens (Langin, et al., 1990)
entspricht, deletierte. Durch Ersetzen des in p11ΔNdeI vorliegenden
2,7 kb großen
EcoRI-Fragments durch das 4 kb große Fragment, das das 2,7 kb
große
Fragment der Nitratreduktase und das Impala 160 Element enthielt,
konnte das Plasmid pNi160 gewonnen werden, in dem das Element in
die Promoterregion des niaD-Gens, das hier eine Größe von 0,3
kb aufweist (1), insertiert ist.
-
2. Hergestellte
Konstrukte
-
Das
vom Plasmid pNi160 abstammende Plasmid pNiL160 durch Zufügen eines
1 kb großen
Fragments des Promoters des niaD-Gens liegt in pAN301 vor. Zu diesem
Zweck wird das Plasmid pAN301, das 1,3 kb des niaD-Promoters enthält, aus
dem 7,8 kb großen
Fragment NdeI, das stromabwärts
dieses Gens vorliegt, deletiert, wodurch man zu intermediären Plasmid
pAN301ΔNdeI
gelangte. Anschließend
wurde dessen 1 kb großes
BamHI-ApaI-Fragment
durch ein 2,3 kb großes
BamHI-ApaI-Fragment, das aus dem Plasmid pNi160 stammt und den gleichen
Teil des niaD-Gens wie das 1 kb große Fragment sowie das Impala-Element enthält, ersetzt
(2).
-
3. Transformation
von Magnaporthe grisea
-
Der
Magnaporthe grisea Stamm G11.174 weist in dem Gen der Nitratreduktase
eine Punktmutation auf, die für
seinen nia–-Phänotyp verantwortlich
ist. Seine Gewinnung ist in dem Artikel von Daboussi et al., 1989,
beschrieben. Sie wird auf ein festes Medium, dem Reismehl als Grundlage
dient und von dem Konidien des Pilzes geerntet werden können, subkultiviert.
Mit dem gemäß dem Medium
B von Tanaka (Ou et al., 1985) hergestellten TNKYE-Flüssigmedium
kann man Mycelium ernten, um die genomische DNA zu extrahieren oder
gemäß von Sweigard
et al. (1990) und Sweigard et al. (1992) beschriebenen Protokollen
Protoplasten zu gewinnen. Mit TNK-Agarmedium (hochreine Agarose,
8 g·l–1)
ohne Hefeextrakt (MNO3-Medium) läßt sich
zwischen dem nia–-Stamm G11.174 und
dem nia+-Stamm G11.25 unterscheiden; der erste weist einen niedrigen filamentösen Phänotyp auf,
während
der zweite dicht und in die Luft ragend ist.
-
3.1. Transformation mit
dem Plasmid pNi160
-
Protoplasten
des Stamms G11.174 wurden mit dem Plasmid pNi160 (das Impala 160
bereitstellt) und dem Plasmid pCB1179 (Sweigard et al., 1997), das
Hygromycinresistenz vermittelt, cotransformiert. Das Transformationsverfahren
ist bei Sweigard et al., 1992 beschrieben und wurde in Gegenwart
von vier Einheiten BamHI-Enzym (REMI: restriction enzyme mediated
integration; Sweigard et al., 1998) und 1 μg eines jedes Plasmids durchgeführt. Die
Protoplasten werden auf einem TNKYE-Medium, in dem die Glukose durch
Saccharose (400 μg·l–1)
ersetzt worden war und das mit Hygromycin in einer Menge von 240 μg·ml–1 versetzt
worden war, selektiert. Um die Cotransformanten zu selektieren,
wurden die Kolonien, die gegen dieses Antibiotikum resistent waren,
nach Extraktion ihrer genomischen DNA durch Amplifikation mit Hilfe
der für
das Impala-Transposon spezifischen Primer SPE5 (5'AGAACACAACCCTGCCACGG3') und SPE3 (5'TCCGGGCCCTATGCACAGAG3') und zu einem 573
Bp Amplifikationsprodukt führen,
amplifiziert. Die DNA der Cotransformanten wurde mit EcoRI verdaut
und mit einem Southern-Blot (3), bei
dem als Sonde ein 2,7 kb großes
EcoRI-Fragment des niaD-Gens (Sonde von 2,7 kb), das in pAN301 vorliegt
(Malardier et al., 1989) verwendet wurde. Mit dieser Untersuchung
konnten 35 Cotransformanten selektiert werden, die mindestens eine
4 kb große
Bande, die praktisch die Gesamtheit des über pNi160 eingeführten nia-Gens
von Aspergillus nidulans darstellen, aufweisen. Diese Cotransformanten
wurden 10 bis 14 Tage lang auf festem Medium auf Reismehlgrundlage
gezüchtet
und die Sporen in Wasser geerntet. Nach dem Zählen wurden sie in einer Menge
von 105–106-Sporen pro Platten auf MNO3-Agarmedium
gesät.
Es wurden Versuche durchgeführt,
bei denen dieser Schritt der Selektion von nia+-Revertanten wiederhergestellt
wurde. Auf diese Weise haben wir beobachtet, daß man mit dem MNO3-Medium
nia+-Kolonien nachweisen kann, wenn 10 Wildtyp-Sporen (G11.25) 106 Sporen der Mutante nia-G11.174 beigemischt und 14 Tage bei
26°C inkubiert
werden. Nach 1monatiger Kultur bei 26°C konnten mit nur einer Cotransformante
(Cotransformante C14) zwei Kolonien (C14-1 und C14-2), die einen
in die Luft ragenden Phänotyp
aufwiesen, gewonnen werden. Diese Revertantenkolonien wurden gewonnen
und mit Hilfe der Primer C1 (5'CGCTGCGAATTCTTCAGT3') und niaX (5'CTAGACTTAGAACCTCGG3'), die die Insertionsstelle
von Impala 160 in dem Promoter des niaD-Gens umrahmen, analysiert.
Die Amplifikation eines 200 Bp großen Produkts zeigt das Vorhandensein
von Körnern,
in denen ein Herausschneiden des Transposons stattgefunden hat.
Um zu homogenen Kolonien zu gelangen wurden Konidien der Revertanten
C14-1 und C14-2 unter dem Stereomikroskop isoliert und getrennt
gezüchtet.
Dadurch, daß man
sie mittels Southern-Blot mit Hilfe einer Sonde, die dem ORF von
Impala entspricht, analysiert, kann man die Reinsertion des Elements
in die beiden Revertanten nachweisen (4). Der
durch Herausschneiden des Transposons hinterbleibende „Footprint" wurde nach dem Klonieren
des 200 Bp großen PCR-Produkts
in den Vektor pGEM-T-easy (Promega) sequenziert. Der "Footprint" der Revertante C14-1
lautet CTGTA und derjenige von C14-2 CAGTA. Diese „Footprints" sind mit den „Footprint", die von Impala
bei seinem Herausschneiden bei Fusarium oxysporum (Langin et al.,
1995) am häufigsten
hinterlassen werden, identisch. Bei Kultur auf MNO3-Agarmedium
weisen diese Revertanten einen intermediären Phänotyp zwischen dem des Stamms
G11.174 und des Stamms G11.25 auf, was nahelegt, daß mit dem
im Konstrukt pNi160 vorhandenen niaD-Gen keine optimale Komplimentierung
der Mutation des Stamms G11.174 erzielt werden kann. Um diese Hypothese
zu prüfen,
wurden die Protoplasten dieses Stamms mit den Vektoren pAN301 (3 μg) bzw. pAN301ΔNdeI (3 μg), die das
niaD-Gen unter der Kontrolle von 1,3 kb Promoter enthalten sowie
in Gegenwart von pCB1179 (3 μg)
transformiert. Nach dem Ausplattieren der Protoplasten und 10tägiger Inkubation
bei 30°C
auf MNO3-Medium
mit Zusatz von Hygromycin (240 μg·ml–1),
wobei die Glukose durch Saccharose (400 μg·l–1)
ersetzt worden war, erscheinen Kolonien mit einem nia+-Phänotyp. Im
Gegensatz dazu wird keinerlei Komplimentierung beobachtet, wenn
der Vektor p11ΔNdeI,
der das niaD-Gen besitzt, unter der Kontrolle eines 0,3 kb Promoterfragments
(wie bei pNi160) verwendet wurde.
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Diese
Versuche zeigen, daß der
in pNi160 vorliegende verkürzte
Promoter nicht fähig
ist, die Mutation des Stamms G11.174 zu komplimentieren. Die Selektion
von zwei Revertanten (C14-1 und C14-2) mit diesem Konstrukt beruht
nicht auf der intrinsischen Aktivität des 0,3 kb großen Promoterfragments,
sondern läßt sich erklären, wenn
man in Betracht zieht, daß das
niaD-Gen bei der Cotransformante C14 in eine Region, wo im Aktivator
Sequenzen zur Verfügung
stehen, integriert hat. Dies legt nahe, daß p11ΔNdeI verwendet werden könnte, um
Aktivatorregionen im Genom von Magnaporthe grisea nachzuweisen.
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3.2. Transformation mit
pNiL160 (erfindungsgemäß)
-
Protoplasten
des Stamms G11.174 wurden mit dem neuen Konstrukt pNiL160 (1 μg), das das
niaD-Gen unter Kontrolle eines vollständigen 1,3 kb großen Promoters
enthält,
und pCB1179 (1 μg),
in Gegenwart von 40 Einheiten des Enzyms NdeI transformiert. Die
Cotransformanten wurden mittels Amplifikation unter Verwendung der
Primer SPE5 und SPE3 gescreent und anschließend zwecks Gewinnung von Konidien
auf Reismedium ausplattiert. Diese wurden auf MNO3-Medium
ausgestrichen (ungefähr
105–106 Sporen pro Schale), um Revertanten zu identifizieren.
Mit dem an 19 Cotransformanten durchgeführten Versuch konnten in 100%
aller Fälle
Revertanten gewonnen werden; manche erschienen ab 10 Tagen Kultur
bei 26°C.
Die Anzahl der Revertanten schwankt je nach der jeweiligen Cotransformante
zwischen 2 und 83. 53 Revertanten, die zu 8 unterschiedlichen Cotransformanten
gehörten,
wurden mittels Southern-Blot mit einer Sonde, die der gesamten Codierphase
Impala entsprach, analysiert. 5 zeigt
die Mobilität
des impala-Transposon bei 9 zufällig ausgewählten Revertanten.
Der Prozentsatz der Impala-Reinsertionen bei M. grisea, der bei
diesem Versuch erzielt wurde, erreicht 74%. Unter diesen Reinsertionen
sind 95% davon unterschiedlich. Genauer gesagt wurden Cotransformanten,
die 100% Reinsertion ergaben und die alle unterschiedlich waren,
identifiziert.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, daß mit
dem Konstrukt pNiL160 im Gegensatz zu pNi160 bei Magnaporthe grisea
eine Selektion von zahlreichen Revertanten mit einer neuen Insertion
des Transposons durchgeführt werden
kann.
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Beispiel II
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Herstellung
von Insertionsmutanten bei Magnaporthe grisea
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Die
Southern-Blot-Analyse von 18 nia+-Revertanten, die von der Cotransformante
6 (CTRF6), die eine einzelne Kopie des Plasmids pNLi160 trägt, hat
gezeigt, daß 100%
dieser Revertanten Impala in das Genom reinsertiert haben. Diese
Cotransformante wurde gewählt,
um eine Sammlung von 350 nia+-Revertanten zu schaffen. Die Cotransformante
wird 14 Tage lang auf Reismedium gezüchtet. Die Sporen werden in
3 ml destilliertem Wasser pro Petrischale geerntet, zur Entfernung
von Myceltrümmern
auf einer Glasfritte filtriert und auf NaNO3-Medium
in einer Dichte von 106 Sporen pro Schale
(Format 12 × 12
cm) ausgestrichen. Die Schalen werden bei 26°C inkubiert. Die nia+-Revertanten
erscheinen 16 bis 21 Tage später;
sie werden in NaNO3-Medium subkultiviert
und 14 Tage lang gezüchtet
und die Sporen werden auf Agar-Wassermedium (2% Agarose in H2O ausgestrichen).
Nach 8 Stunden bei 26°C
wird eine Spore von jeder Revertante einzeln auf NaNO3-Medium
subkultiviert, um die Revertante zu isolieren und ihren nia+-Phänotyp zu
verifizieren.
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Beispiel III
-
Charakterisierung von
Insertionsmutanten, die das Impala-Transposon tragen
-
Durch
Beobachtung der 350 Revertanten, die ausgehend von CTRF 6 erzeugt
wurde, konnte eine Revertante (Rev2) nachgewiesen werden, die auf
Reismedium und NaNO3-Medium ein weniger
signifikantes Wachstums als CTRF6 sowie eine dunkelbraune Färbung, die
sich von der grauen Farbe der Cotransformante unterschied, aufwies.
Zur Charakterisierung der in die Impala-Insertion flankierenden
Sequenzen wurden 3 μg genomische
DNA von Rev2 mit HindIII verdaut und durch inverse PCR analysiert.
Nach der Verdauung wird die DNA einem Extraktionsschritt mit Phenol/Chloroform
unterworfen und anschließend
mit 7,5 M Ammoniumacetat gefällt.
Das so erhaltene Pellet wird in 40 μl MilliQ-Wasser aufgenommen.
Mit 8 μl
verdauter DNA wird eine Ligation durchgeführt, und die DNA wird anschließend wie
oben mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit 7,5 M Ammoniumacetat
gefällt.
Die DNA wird in 10 μl
aufgenommen und die gesamte DNA wird für einen PCR-Schritt mit Hilfe
der Primer ImpE5' (5'GGCATTGAAAACGCGGTCCC3') und ImpE3' (5'CAGCAGCAAAACAGCTGCCC3'), die auf der Sequenz
des Impala-Transposons gewählt
wurden und die unterschiedlich plaziert sind, verwendet. Mit der
Sequenzierung des IPCR-Produkts konnte gezeigt werden, daß das Transposon
in ein offenes Leseraster bei einem duplizierten TA-Dinukleotid
insertiert ist. Die Abfrage von Datenbanken mit Hilfe des Programms
tblastx (Altschul et al., 1990) hat gezeigt, daß eine sehr starke Homologie
zwischen dieser mutierten Sequenz und einer Proteinfamilie, die
an der DNA-Reparatur beteiligt ist, besteht, insbesondere mit dem
MLH1-Protein von Saccharomyces cerevisiae (Prolla et al., 1994).
-
Parallel
dazu wurden zur Suche nach Pathogenitätsmutanten die 350 Revertanten
der Sammlung an Reisblättern
und Gerstenblättern
geprüft.
Die Revertanten werden 14 Tage lang auf Reismedium gezüchtet. Die
Sporen, die produziert werden, werden dadurch geerntet, daß man das
Mycelium in Gegenwart von 3 ml Wasser abschabt, und werden dann
unter Thomaszelle gezählt.
Die Sporensuspensionen werden auf 105 Sporen/ml
eingestellt und mit einem Wattestäbchen auf Blattstückchen auf
Reis (Sorte Sariceltik) und Gerste (Sorte Express) gestrichen, die
auf Agarmedium (1% Agar) mit einem Zusatz von Kinetin (1 ml/l einer
Vorratslösung zu
2 mg/ml in Ethanol) am Leben erhalten werden. Nach 4tägiger Inkubation
bei 26°C
werden die Symptome mit denjenigen, die von dem Wildstamm G11.174
verursacht werden, verglichen. Es stellt sich heraus, daß die Revertante
77 nichtpathogen ist. Die Sequenzen, die bei dieser Mutante die
Impala-Insertion flankieren, wurden nach Verdauung der genomischen
DNA mit BamHI mittels inverser PCR gewonnen, und zwar unter den oben
beschriebenen Bedingungen. Wiederum bestätigt das gewonnene Produkt
die Insertion des Transposons bei einem duplizierten TA-Dinukleotid,
das in einem offenen Leseraster plaziert ist. Durch Abfrage von Datenbanken
mit der Sequenz dieses Produkts konnte keine signifikante Homologie
festgestellt werden. Dieses Produkt wurde zum Sondieren einer Cosmidbank
von M. grisea verwendet. Ein mit dem amplifizierten Produkt hybridisierendes
Cosmid wurde kloniert, kartiert und ansequenziert. Es scheint, daß das Impala-Transposon
je nach dem in Betracht gezogenen Leseraster (6)
in zwei mögliche
ORFs (ORF1 und ORF2) insertiert ist. Ein SalI/NotI-Fragment dieses
Cosmids wurde in einen Vektor pCB1531 (Vektor pCB1531*), der das Bar-Gen,
das Resistenz gegen Bialaphos vermittelt (Sweigard et al., 1997),
trägt,
subkloniert. Es wurden Protoplasten von Rev77 gewonnen und mit 3 μg Plasmid
pCB1531* oder mit 3 μg
Plasmid pCB1531 als Kontrolle transformiert und auf mit Bialaphos
(30–40 μg·ml–1)
versetztes TNKYE- Saccharose-Medium
(400 g·l–1)
gegeben. Die resistenten Kolonien werden auf mit Bialaphos versetztes
TNKYE-Glukosemedium (30 μg·ml–1)
subkultiviert und anschließend
14 Tage lang auf Reismedium sporulieren gelassen. Die Sporen werden
geerntet, die Suspensionen werden auf 105 Spores·ml–1 eingestellt
und anschließend
wie oben beschrieben auf ihre Pathogenität getestet. Wie erwartet verbleiben
die Transformanten, die pCB1531 tragen, nichtpathogen, wie Rev77,
während
die Kolonien, die pCB1531*, wiederum pathogen werden. Diese Ergebnisse
zeigen, daß mit dem
Impala-Transposon ein neues Gen, das an der Infektiösität von M.
grisea beteiligt ist, markiert werden kann.
-
Beispiel IV
-
Integration
des Impala-Transposons in den Promoter des gpd-Gens
-
Es
wurde ein Plasmid, mit dem Impala in einen Promoter, der die Expression
des Hygromycinresistenzgens (hph) kontrolliert, konstruiert. Mit
Hilfe eines Doppelverdaus mit BglII-HindIII des Vektors pAN7.1 (Punt
et al., 1987) läßt sich
ein 3988 Bp großes
Fragment, das das gesamte ORF, das für die Codierphase des hph-Gens
codiert, sowie den Promoter des gpd-Gens, von dem die ersten 137
Basenpaare deletiert wurden und den Terminator des TrpC-Gens enthält, freigesetzt
werden kann. Die kohäsiven
Enden dieses Fragments wurden durch Einwirkung von DNA-Polymerase
in stumpfe Enden umgewandelt. Dieses Fragment wurde anschließend mit
einem 2,5 kb großen
PvuII-Fragment, das aus dem Plasmid pBluescript SK- stammt und das den
Replikationsursprung sowie das Ampicillinresistenzgen trägt, ligiert.
Mit dem entstandenen Plasmid kann man bei Magnaporthe grisea, hygromycinresistente
Transformanten erhalten. Dieser Vektor, der mit pCITn bezeichnet
wird (7), weist eine singuläre 30 Bp große PvuII-Stelle
stromaufwärts
des Transkriptions punkts +1 auf, in die Impala oder ein beliebig
anderes Transposon kloniert werden kann.
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Beispiel V
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Insertionsmutagenese
mit einer autonomen markierten Kopie
-
Um
ein autonomes Element zu erhalten, mit dem man über ein phänotypisches Screening die Revertanten,
in die das Impala-Transposon integriert hat, selektieren kann, wurde
das Gen für
Hygromycinresistenz zwischen die beiden ITRs des Elements stromabwärts des
Stop-Codons des Leserasters, das für die Transposase codiert,
kloniert. Hierzu wurde die Hygromycinresistenzkassette durch Verdau
mit SalI aus dem pCB1004-Plasmid (Sweigard et al., 1997) gewonnen
und durch Behandlung mit Klenow stumpfendig gemacht. Diese Kassette
wird mit dem Plasmid pNi160, die an der NheI-Stelle linearisiert
und mit Klenow behandelt worden war, ligiert. Das erhaltene Plasmid
wird mit den Enzymen BamHI und ApaI verdaut. Das 2285 Bp große Fragment,
das das modifizierte Impala-Transposon enthält, wird gewonnen und mit dem
7397 Bp großen
Fragment von pAN301ΔNdeI,
das mit den gleichen Enzymen verdaut worden ist, ligiert. Es entsteht
ein 9682 Bp großes
Plasmid, das in dem niaD-Promoter
mit einer Größe von 1,3
kb trägt,
in den 8 Bp stromaufwärts
des Initiationscodons der Nitratreduktase, das mit der Hygromycinresistenz
markierte Impala-Transposon insertiert ist, das in Transkriptionsrichtung
von niaD (Plasmid pNiHYG) oder gegensinnig (Plasmid pNiGYH) insertiert
ist.
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Protoplasten
des Stamms G11.174 von M. grisea wurden mit 3 μg des Plasmids pNiHYG oder 3 μg des Plasmids
pNiGYH transformiert. Die Selektion von nia+-Revertanten wurde an diesen Transformanten
unter den bereits oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die
Southern-Blot-Analyse von drei nia+-Revertanten der gleichen Cotransformante
zeigt, daß das
so markierte Impala-Transposon autonom bleibt, das heißt, daß es fähig ist,
sich aus dem niaD-Gen herauszuschneiden und wieder in das Genom
zu reintegrieren (8).
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Beispiel VI
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Insertionsmutagenese
mit einer defizienten mobilisierbaren Kopie von Impala
-
Um
ein Zwei-Komponenten-Mutagenesesystem ausnützen zu können, muß gezeigt werden, daß das transponierbare
Element in trans aktiviert werden kann. Zu diesem Zweck wird die
Transposase erst unter die Kontrolle eines konstitutiven Promoters
gestellt. Anschließend
macht es die Stabilisierung des defizienten Elements erforderlich,
einen induzierbaren Promoter, der die Expression der Transposase
oder eines replizierenden Plasmids, das die Transposase unter der
Kontrolle ihres eigenen Promoters oder eines konstitutiven Promoters
trägt,
zu verwenden. Besonders angebracht scheint es, den Promoter des
Magnaporthe grisea Gens, das für
die Nitratreduktase codiert, als induzierbaren Promoter zu verwenden.
Lau und Hamer (1996) haben durch Northern-Hybridisierung mit Hilfe einer Sonde,
die einem Klon, der das Nitratreduktasegen von Magnaporthe grisea
besitzt, entspricht, gezeigt, daß es in Gegenwart von Nitrat
als einzige Stickstoffquelle exprimiert wird, während es in Gegenwart von Glutamin
vollständig
suprimiert wird. Dadurch, daß die
Impala-Transposase unter die Kontrolle des nia-Gens von Magnaporthe
grisea gestellt wurde, müßte das
Enzym synthetisiert werden können
und daher das defiziente Element unter den Selektionsbedingungen
der Revertanten (MNO3-Medium) herausgeschnitten
und seine Produktion inhibiert werden können, sobald die Revertante
erhalten worden ist, wenn sie auf reichem Medium (Gegenwart von
Ammonium oder Glutamin) gezüchtet
wird.
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1. Verfügbare Konstrukte
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Das
Plasmid pHIN stammt von pNi160 ab. In diesem ist die von dem Impala-Element
codierte Transposase durch das Hygromycinresistenzgen (hph-Gen)
unter der Kontrolle des TrpC-Gens von Aspergillus nidulans ersetzt
worden (9). Die Konstruktion wird bei
Hua-Van, 1998, beschrieben. Das Vorliegen des hph-Gens in den ITRs
des Transposons ermöglicht
es, sich davon zu überzeugen,
daß das
defiziente Element in das Genom der erhaltenen Revertante integriert
hat.
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Das
Plasmid pEO6 stammt von dem Plasmid pNOM102 nach Substitution des
ORF, das für
die β-Glucuronidase
codiert, durch das ORF, das für
die Impala-Transposase codiert, und mittels PCR mit Hilfe von Primern,
die eine NcoI-Stelle enthalten, erhalten wurde, ab. Mit diesem Plasmid
kann man die Transposase unter der Kontrolle des konstitutiven gpd-Promoters
und des TrpC-Terminators
von Aspergillus nidulans (10) exprimieren.
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2. Hergestellte
Konstrukte
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Das
Plasmid pHNiL stammt von dem Plasmid pHIN ab. Es wurde dadurch konstruiert,
daß man
das 1 kb große
BamHI-Apa2-Fragment von pAN301ΔNdeI
durch das 2,8 kb große
BamHI-ApaI-Fragment, das von pHIN stammte und die defiziente und
mit hph markierte Impala-Kopie einführte, ersetzt. Wie bei pNiL160
befindet sich das Nitratreduktasegen (niaD) unter der Kontrolle
seines 1,3-kb großen
Promoters (11). Gemäß unseren Ergebnissen ist es
erforderlich, dieses Plasmid zu konstruieren, um das Herausschneiden
des defizienten Elements durch Wiederherstellung der Nitratreduktaseaktivität bei Magnaporthe
grisea zu selektieren.
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Das
Plasmid pBNiL weist ebenfalls ein defizientes Element auf, das hier
mit dem Bar-Gen markiert ist. Um diesen Vektor zu konstruieren,
wird das BamHI/NcoI-Fragment
von pNiL160 (2472 Bp), das das Impala-Transposon, das von Sequenzen des niaD-Gens
flankiert ist, enthält,
mit dem BamHI/AflIII-Fragment von pUC19 (2298 Bp), das den Replikationsursprung
des Plasmids und das Ampicillinresistenzgen enthält, ligiert. Auf diesem Plasmid
deletiert man 891 Bp großes
XhoI/StyI-Fragment,
das einem Teil der Impala-Transposase entspricht. Die Enden des
so linearisierten Plasmids werden mittels Klenow stumpfendig gemacht
und mit dem Gen für
Resistenz gegen Bialaphos (Promoter Trpc ::Bar, 940 Bp), das durch
SalI-Verdau des Plasmids pCB1635 (Sweigard et al., 1997) und Einwirkung
von Klenow erhalten wurde, ligiert. Das entstandene Plasmid wird
mit BamHI und ApaI verdaut und mit dem 7397 Bp großen BamHI/ApaI-Fragment
des Plasmids pAN301ΔNdeI
ligiert. Hierdurch erhält
man das Plasmid pBNiL, in dem das Transposon defizient, mit dem Bar-Gen
markiert und in den Promoter (1,3 kb) des niaD-Gens insertiert ist
(12).
-
Das
Plasmid pFACImp trägt
das Impala-Transposon in seinem rechten ITR, sodaß es nicht
mehr transponieren kann, jedoch Ursprung der Transposase bleibt.
Das Element wird aus dem Plasmid pNi160 durch einen Doppelverdau
mit EcoRI/NheI herausgeschnitten, die Enden werden mittels Klenow
stumpfendig gemacht, und das Fragment wird anschließend in
die BglII-Stelle von pFAC1 kloniert (13).
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3. Verwendung
dieser Plasmide bei Magnaporthe grisea
-
Protoplasten
von Magnaporthe grisea G11.174 wurden mit dem Plasmid pHNiL transformiert
bzw. mit den Plasmiden pHNiL und pEO6 cotransformiert. Die Transformationsmethode
ist von Sweigard et al. (1992) beschrieben und wurde mit 1 μg jedes Plasmids
durchgeführt.
Die Protoplasten werden auf einem TNKYE-Medium, in dem die Glukose
durch Saccharose (400 μg·l–1)
ersetzt wurde und das mit Hygromycin in einer Konzentration von
240 μg·ml–1 versetzt
wurde, selektiert. Die pHNiL-Transformanten
werden aufgrund des Vorliegens des Resistenzmarkers in dem defizienten
Element direkt selektiert. Die Cotransformanten werden von den hygromycinresistenten
Kolonien isoliert und zwar nach Extraktion ihrer genomischen DNA
mittels Amplifikation mit Hilfe der unter IV.3 beschriebenen SPE5-Primer.
Mit dieser Untersuchung, die an 12 hygromycinresistenten Kolonien
durchgeführt
wurde, konnten 4 Kolonien, die auch pEO6 trugen, isoliert werden.
Nach Sporulation auf festem Medium auf Reismehlgrundlage wurden
die Sporen (105–106)
dieser Cotransformanten sowie von 6 Transformanten, die pHNiL trugen,
auf MNO3-Medium ausplattiert, um nia+-Revertanten
wie in IV.3 beschrieben zu selektieren. Keine der 6 Transformanten,
die pHNiL trugen, ergab solche Revertanten. Dies zeigt, daß die defiziente
Impala-Kopie nicht durch ein endogen in Magnaporthe grisea vorhandenes Transposon
mobilisiert werden konnte. Unter den 4 Cotransformanten pHNiL/pEO6
ergaben zwei davon in die Luft ragende Kolonien (Cotransformante
D1 und D9). Mittels Southern-Analyse
von 6 Revertanten, die von der Cotransformante D1 stammten, konnte
nach Verdau ihrer genomischen DNA mit EcoRI und Hybridisierung mit einer
868 Bp großen
Sonde des hph-Gens mit Hilfe der Primer hyg1 (5'AGCCTGAACTCACCGCGACG3') und hyg4 (5'CGACCCTGCGCCCAAGCTGC3') die Reinsertion
des defizienten Elements bei 4 dieser Revertanten charakterisiert
werden (14). Von diesen wiesen zwei
Revertanten zwei Insertionen des Elements auf. Mit dieser Analyse
läßt sich
zeigen, daß das
defiziente Element bei Magnaporthe grisea durch die in trans vorliegende
Impala-Transposase mobilisiert werden kann.
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4. Weitere Konstrukte
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Es
geht erstens darum, ein Plasmid zu konstruieren, bei dem die Impala-Transposase
unter der Kontrolle des in Magnaporthe grisea klonierten Promoters
des nia-Gens (pNiaI) steht. Dieses Plasmid wird in Kombination mit
pHINL oder einem beliebigen anderen Plasmid, das davon abstammt,
wo der niaD-Promoter von Aspergillus nidulans, der durch Insertion
des defizienten Elements inaktiviert ist, die Expression von Markergenen,
die für
die Selektion von Revertanten verwendet werden, kontrolliert, verwendet.
Um die Selektion von Cotransformanten zu erleichtern, muß pNiaI-weiter
mit einem Resistenzmarker versehen werden, der sich von demjenigen,
der in dem Plasmid, das die defiziente Kopie des Elements trägt, vorliegt,
unterscheidet.
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Zweitens
kann die Transposase unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters,
genauer ausgedrückt
unter der Kontrolle des Promoters des gpdA-Gens, in den Vektor pFAC1,
der einen Selektionsmarker, der sich von demjenigen, der in dem
defizienten Element oder in dem Plasmid pHNiL vorliegt, unterscheidet, trägt, kloniert
werden.
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-
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