JP2002539794A - マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド - Google Patents
マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチドInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、特徴づけられたフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの、該真菌のゲノム内へのランダム挿入による、真菌における突然変異体のコレクションの生成を可能にする効率的突然変異誘発のための新規手段に関する。本発明はまた、得られた突然変異体に関する。
Description
【０００１】 本発明は、新規ポリヌクレオチド、および真菌における挿入突然変異誘発およ
び遺伝子標識のためのこれらのポリヌクレオチドの用途に関する。本発明はまた
、これらの真菌のゲノム内へのフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のインパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンのラン
ダム挿入により得られた真菌突然変異体のコレクションに関する。これらの突然
変異体のコレクションは、真菌における遺伝子の機能を研究するための有効な遺
伝的手段の１つである。
び遺伝子標識のためのこれらのポリヌクレオチドの用途に関する。本発明はまた
、これらの真菌のゲノム内へのフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のインパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンのラン
ダム挿入により得られた真菌突然変異体のコレクションに関する。これらの突然
変異体のコレクションは、真菌における遺伝子の機能を研究するための有効な遺
伝的手段の１つである。
【０００２】 トランスポゾンは、２つのＤＮＡ配列間を移動しうる可動性遺伝子因子として
定義されうる。それらは遺伝子（エキソン、イントロン、調節領域）内に挿入さ
れうるため、それらは突然変異の原因となりうる。このため、それらは、ゲノム
内に寄生体として存在して該ゲノムの進化に寄与する。トランスポゾンは、それ
らの増幅様態に応じて２つのグループに分類されている（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，１
９８９；Ｃａｐｙら，１９９８）。
定義されうる。それらは遺伝子（エキソン、イントロン、調節領域）内に挿入さ
れうるため、それらは突然変異の原因となりうる。このため、それらは、ゲノム
内に寄生体として存在して該ゲノムの進化に寄与する。トランスポゾンは、それ
らの増幅様態に応じて２つのグループに分類されている（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，１
９８９；Ｃａｐｙら，１９９８）。
【０００３】 ・クラスＩ因子（レトロ因子（ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ））は、逆転写酵
素によりＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ中間体を介して転位する。このクラスは、
ＬＴＲ（長末端反復配列）に隣接していることも隣接していないこともあるレト
ロトランスポゾンまたはレトロ因子に細分される。該ＬＴＲレトロ因子としては
、ｇｙｐｓｙファミリーの因子、およびｃｏｐｉａファミリーの因子が挙げられ
る。それらは、レトロウイルスのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子に相同でｐｏｌ遺伝
子の種々の機能的ドメインの体制が異なる遺伝子を有する。また、ｇｙｐｓｙフ
ァミリーは、レトロウイルスにおいてその感染に寄与するｅｎｖに相同な遺伝子
を有する。非ＬＴＲレトロ要素のなかでは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子ならびに
ポリＡ配列を有するＬＩＮＥが区別され、また、ポリＡテイルも有するがｇａｇ
およびｐｏｌ配列を欠くＳＩＮＥが区別される。それは、先のＬＩＮＥ因子に由
来すると考えられる（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，１９９２；ＯｋａｄａおよびＨａｍａ
ｄａ，１９９７）。
素によりＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ中間体を介して転位する。このクラスは、
ＬＴＲ（長末端反復配列）に隣接していることも隣接していないこともあるレト
ロトランスポゾンまたはレトロ因子に細分される。該ＬＴＲレトロ因子としては
、ｇｙｐｓｙファミリーの因子、およびｃｏｐｉａファミリーの因子が挙げられ
る。それらは、レトロウイルスのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子に相同でｐｏｌ遺伝
子の種々の機能的ドメインの体制が異なる遺伝子を有する。また、ｇｙｐｓｙフ
ァミリーは、レトロウイルスにおいてその感染に寄与するｅｎｖに相同な遺伝子
を有する。非ＬＴＲレトロ要素のなかでは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子ならびに
ポリＡ配列を有するＬＩＮＥが区別され、また、ポリＡテイルも有するがｇａｇ
およびｐｏｌ配列を欠くＳＩＮＥが区別される。それは、先のＬＩＮＥ因子に由
来すると考えられる（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，１９９２；ＯｋａｄａおよびＨａｍａ
ｄａ，１９９７）。
【０００４】 ・クラスＩＩ因子は、トランスポゾンＤＮＡ配列の切除および再挿入のメカニ
ズムを介して転位する。その全体的構造は、該因子の転位に必要なトランスポザ
ーゼをコードするオープンリーディングフレームに隣接する２つの逆方向反復配
列（ＩＴＲ）よりなる。これらの因子は、そのトランスポザーゼおよび／または
ＩＴＲの配列相同性に基づき、まとめていくつかのスーパーファミリーに分類さ
れており、それらには、Ｔｃ１／マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）因子のスーパーフ
ァミリー（Ｄｏａｋら，１９９４）、Ｆｏｔ１／Ｐｏｇｏ要素のスーパーファミ
リー（Ｃａｐｙら，１９９８；ＳｍｉｔおよびＲｉｇｇｓ，１９９６）、ｈＡＴ
因子のスーパーファミリー（Ｃａｌｖｉら，１９９１）、Ｐ因子のスーパーファ
ミリー（Ｋｉｄｗｅｌｌ，１９９４）またはＣＡＣＴＡ因子のスーパーファミリ
ー（Ｇｉｅｒｌ １９９６）が含まれる。
ズムを介して転位する。その全体的構造は、該因子の転位に必要なトランスポザ
ーゼをコードするオープンリーディングフレームに隣接する２つの逆方向反復配
列（ＩＴＲ）よりなる。これらの因子は、そのトランスポザーゼおよび／または
ＩＴＲの配列相同性に基づき、まとめていくつかのスーパーファミリーに分類さ
れており、それらには、Ｔｃ１／マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）因子のスーパーフ
ァミリー（Ｄｏａｋら，１９９４）、Ｆｏｔ１／Ｐｏｇｏ要素のスーパーファミ
リー（Ｃａｐｙら，１９９８；ＳｍｉｔおよびＲｉｇｇｓ，１９９６）、ｈＡＴ
因子のスーパーファミリー（Ｃａｌｖｉら，１９９１）、Ｐ因子のスーパーファ
ミリー（Ｋｉｄｗｅｌｌ，１９９４）またはＣＡＣＴＡ因子のスーパーファミリ
ー（Ｇｉｅｒｌ １９９６）が含まれる。
【０００５】 真菌トランスポゾンの同定および研究は、特に、挿入突然変異誘発のための手
段を開発しようとする場合（Ｂｒｏｗｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．１：３９０−４，１９９８）、さらにまた、これらの真菌のゲノムを研
究しようとする場合（Ｄｏｂｉｎｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，１：３４８−３６５２，１９９３）に、非常に重要である。
段を開発しようとする場合（Ｂｒｏｗｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．１：３９０−４，１９９８）、さらにまた、これらの真菌のゲノムを研
究しようとする場合（Ｄｏｂｉｎｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，１：３４８−３６５２，１９９３）に、非常に重要である。
【０００６】 したがって、真菌のゲノムにおいてトランスポゾンを同定するためには、種々
の方法が実施されている。第１および第２の方法は、既に特徴づけられている因
子から導かれた知見を利用するものである。これは、高度に保存されたドメイン
（例えば、ＬＴＲレトロ因子逆転写酵素のもの）に由来するオリゴヌクレオチド
を使用するサザンハイブリダイゼーション実験または増幅において使用する異種
プローブの使用を含む。第３の方法は、反復ＤＮＡ配列を特徴づけることにある
。この場合、ゲノムＤＮＡとリボソームプローブとの間のディファレンシャルハ
イブリダイゼーションが必要である。このようにして、マグナポルセ・グリセア
（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ゲノムにおいて、Ｆｏｔ１ファミリ
ーのトランスポゾンが同定されている（Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ３１：３６１−３６９，１９９７；Ｆａｒｍａｎら，Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５１：６７５−６８１ １９９６；Ｋａｃｈｒｏ
ｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４５：３３９−３４８，１９９４
）。最後の方法は、前記の３つの方法とは異なり、機能的および活性な因子の同
定を可能にする。これは、トランスポゾン捕捉（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｔｒａ
ｐ）である。この方法はマーカー遺伝子の不活性化を用いるものであり、この方
法においては、該因子の挿入により生じた突然変異が陽性スクリーニングにより
同定されうる。このようにして、ａｍ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子
は、ニューロスパラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）におい
てＴａｄレトロ因子（これは、ＬＩＮＥ型のものである）を、この遺伝子内への
その再挿入後に特徴づけることを可能にした（ＫｉｎｓｅｙおよびＨｅｌｂｅｒ
，１９８９）。また、トランスポゾンを捕捉するために、アスペルギルス・ニデ
ュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｎｉａＤ（硝酸レダ
クターゼ）遺伝子が使用されている。特に、この遺伝子を不活性化する突然変異
はクロラート耐性を付与する。このようにして、フザリウム・オキシスポラム（
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，Ｇｅｎｅｔｉ
ｃａ ９３：４９−５９，１１９４）およびアスペルギルス（米国特許第５，９
８５，５７０号）において種々のトランスポゾンが同定されている。フザリウム
・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のクラスＩＩ
因子であるＦｏｔ１は、ｎｉａＤ遺伝子の不活性化を用いて同定された最初のト
ランスポゾンであった（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９９２）。また、フザリウム・
オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）におけるｎｉａＤ遺
伝子の使用は、Ｔｃ１／マリナー型因子のスーパーファミリーに属するインパラ
（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンを捕捉することを可能にした（Ｌｉｎｇｉｎら
，１９９５）。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ
ｒｕｍ）においては、種々のインパラトランスポゾンスーパーファミリーが同定
されている（Ｈｕｎ−Ｖａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５９：
３５４−３６２，１９９８）。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においては、インパラ因子の転位が研究されている。与
えられた遺伝子のイントロンまたはプロモーター内にインパラトランスポゾンが
組込まれた場合には、それはついで、この遺伝子の発現を不活性化しうる。一方
、インパラトランスポゾンの転位後、該遺伝子は再活性化され、これは、該転位
事象の陽性対照を構成する。該転位を同定するためのそのような方法が、アスペ
ルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の
硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）遺伝子のプロモーター調節配列内に組込まれたイ
ンパラトランスポゾンを含む構築物を使用して、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
）において行われている（Ｈｕａ−Ｖａｎ，１９９８）。
の方法が実施されている。第１および第２の方法は、既に特徴づけられている因
子から導かれた知見を利用するものである。これは、高度に保存されたドメイン
（例えば、ＬＴＲレトロ因子逆転写酵素のもの）に由来するオリゴヌクレオチド
を使用するサザンハイブリダイゼーション実験または増幅において使用する異種
プローブの使用を含む。第３の方法は、反復ＤＮＡ配列を特徴づけることにある
。この場合、ゲノムＤＮＡとリボソームプローブとの間のディファレンシャルハ
イブリダイゼーションが必要である。このようにして、マグナポルセ・グリセア
（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ゲノムにおいて、Ｆｏｔ１ファミリ
ーのトランスポゾンが同定されている（Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ３１：３６１−３６９，１９９７；Ｆａｒｍａｎら，Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５１：６７５−６８１ １９９６；Ｋａｃｈｒｏ
ｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４５：３３９−３４８，１９９４
）。最後の方法は、前記の３つの方法とは異なり、機能的および活性な因子の同
定を可能にする。これは、トランスポゾン捕捉（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｔｒａ
ｐ）である。この方法はマーカー遺伝子の不活性化を用いるものであり、この方
法においては、該因子の挿入により生じた突然変異が陽性スクリーニングにより
同定されうる。このようにして、ａｍ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子
は、ニューロスパラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）におい
てＴａｄレトロ因子（これは、ＬＩＮＥ型のものである）を、この遺伝子内への
その再挿入後に特徴づけることを可能にした（ＫｉｎｓｅｙおよびＨｅｌｂｅｒ
，１９８９）。また、トランスポゾンを捕捉するために、アスペルギルス・ニデ
ュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｎｉａＤ（硝酸レダ
クターゼ）遺伝子が使用されている。特に、この遺伝子を不活性化する突然変異
はクロラート耐性を付与する。このようにして、フザリウム・オキシスポラム（
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，Ｇｅｎｅｔｉ
ｃａ ９３：４９−５９，１１９４）およびアスペルギルス（米国特許第５，９
８５，５７０号）において種々のトランスポゾンが同定されている。フザリウム
・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のクラスＩＩ
因子であるＦｏｔ１は、ｎｉａＤ遺伝子の不活性化を用いて同定された最初のト
ランスポゾンであった（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９９２）。また、フザリウム・
オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）におけるｎｉａＤ遺
伝子の使用は、Ｔｃ１／マリナー型因子のスーパーファミリーに属するインパラ
（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンを捕捉することを可能にした（Ｌｉｎｇｉｎら
，１９９５）。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ
ｒｕｍ）においては、種々のインパラトランスポゾンスーパーファミリーが同定
されている（Ｈｕｎ−Ｖａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５９：
３５４−３６２，１９９８）。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においては、インパラ因子の転位が研究されている。与
えられた遺伝子のイントロンまたはプロモーター内にインパラトランスポゾンが
組込まれた場合には、それはついで、この遺伝子の発現を不活性化しうる。一方
、インパラトランスポゾンの転位後、該遺伝子は再活性化され、これは、該転位
事象の陽性対照を構成する。該転位を同定するためのそのような方法が、アスペ
ルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の
硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）遺伝子のプロモーター調節配列内に組込まれたイ
ンパラトランスポゾンを含む構築物を使用して、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
）において行われている（Ｈｕａ−Ｖａｎ，１９９８）。
【０００７】 現在のところ、他の真菌、より詳しくはマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａ
ｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）においてｐＮｉ１６０プラスミドのｎｉａＤ／イ
ンパラ遺伝子構築物（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）を使用してインパラの転位を
証明することは、挿入突然変異誘発手段の開発に不適合な非常に低い比率で可能
であるにすぎない。これらの観察は、ｐＮｉ１６０プラスミドのｎｉａＤ／イン
パラ構築物（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）、より詳しくはインパラトランスポゾ
ン自体が、他の真菌、特にエム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）において機能的
でないことを示唆している。
ｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）においてｐＮｉ１６０プラスミドのｎｉａＤ／イ
ンパラ遺伝子構築物（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）を使用してインパラの転位を
証明することは、挿入突然変異誘発手段の開発に不適合な非常に低い比率で可能
であるにすぎない。これらの観察は、ｐＮｉ１６０プラスミドのｎｉａＤ／イン
パラ構築物（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）、より詳しくはインパラトランスポゾ
ン自体が、他の真菌、特にエム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）において機能的
でないことを示唆している。
【０００８】 真菌ゲノム（より詳しくは病原性糸状菌のゲノム）における挿入突然変異体の
コレクションを作製するためのそのような手段は、それらのゲノムの研究および
それらの遺伝子の機能の研究に今や不可欠である。ヒトまたは動物における真菌
性病態の治療用または農業用に使用されうる新規抗真菌化合物を見出すためには
、真菌遺伝子の機能の分析が不可欠である。
コレクションを作製するためのそのような手段は、それらのゲノムの研究および
それらの遺伝子の機能の研究に今や不可欠である。ヒトまたは動物における真菌
性病態の治療用または農業用に使用されうる新規抗真菌化合物を見出すためには
、真菌遺伝子の機能の分析が不可欠である。
【０００９】 本発明は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ
）において機能的でありインパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマ
ーカー遺伝子を含んでなる新規ポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレ
オチドは、挿入突然変異誘発手段の開発に適した転位率で、真菌におけるインパ
ラ因子の転位を示すことを可能にする。したがって、本発明の対象はまた、真菌
突然変異体の製造方法であって、そのゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入
することによる製造方法、および関心のある表現型に関連した真菌遺伝子を同定
するための方法である。最後に、本発明は、真菌挿入突然変異体のコレクション
およびその用途に関する。
）において機能的でありインパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマ
ーカー遺伝子を含んでなる新規ポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレ
オチドは、挿入突然変異誘発手段の開発に適した転位率で、真菌におけるインパ
ラ因子の転位を示すことを可能にする。したがって、本発明の対象はまた、真菌
突然変異体の製造方法であって、そのゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入
することによる製造方法、および関心のある表現型に関連した真菌遺伝子を同定
するための方法である。最後に、本発明は、真菌挿入突然変異体のコレクション
およびその用途に関する。
【００１０】 （発明の記載） ポリヌクレオチド したがって、本発明は、インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの挿入によ
り不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、マグナポ
ルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であ
り該マーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結されたプロモーター調節配列を
転写の方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド、特に、単離または精製さ
れたポリヌクレオチドに関する。
り不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、マグナポ
ルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であ
り該マーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結されたプロモーター調節配列を
転写の方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド、特に、単離または精製さ
れたポリヌクレオチドに関する。
【００１１】 本発明のポリヌクレオチドでの真菌の形質転換および該トランスポゾンの切除
は、該マーカー遺伝子の発現につながる。したがって、該マーカー遺伝子の発現
の検出は、該転位事象のモニターおよび該挿入突然変異体の選択を可能にする。
該突然変異体の選択は、第１マーカーとは異なる第２マーカー遺伝子で該トラン
スポゾンを標識することにより改良されうる。この第２マーカー遺伝子は、該真
菌のゲノム内への該トランスポゾンの再挿入のモニターを可能にする。したがっ
て、本発明の対象はまた、インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、前
記のポリヌクレオチドである。
は、該マーカー遺伝子の発現につながる。したがって、該マーカー遺伝子の発現
の検出は、該転位事象のモニターおよび該挿入突然変異体の選択を可能にする。
該突然変異体の選択は、第１マーカーとは異なる第２マーカー遺伝子で該トラン
スポゾンを標識することにより改良されうる。この第２マーカー遺伝子は、該真
菌のゲノム内への該トランスポゾンの再挿入のモニターを可能にする。したがっ
て、本発明の対象はまた、インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、前
記のポリヌクレオチドである。
【００１２】 使用するマーカー遺伝子は、簡便なスクリーニングによる転位事象の選択に適
したものである。本発明においては、表現型スクリーニングで真菌内での発現が
検出されうる任意のマーカー遺伝子を使用することができる。「マーカー遺伝子
」なる語は、異なる起源の遺伝要素を含むキメラ遺伝子をも意味すると理解され
る。したがって、本発明のマーカー遺伝子は、真菌由来のプロモーター配列と、
真菌由来でないマーカー遺伝子のコード配列との両方を有しうる。
したものである。本発明においては、表現型スクリーニングで真菌内での発現が
検出されうる任意のマーカー遺伝子を使用することができる。「マーカー遺伝子
」なる語は、異なる起源の遺伝要素を含むキメラ遺伝子をも意味すると理解され
る。したがって、本発明のマーカー遺伝子は、真菌由来のプロモーター配列と、
真菌由来でないマーカー遺伝子のコード配列との両方を有しうる。
【００１３】 本発明においては、「マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇ
ｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列」なる表現は、あるコ
ード配列に機能的に連結されたポリヌクレオチドのうち、マグナポルセ・グリセ
ア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における該コード配列の発現を可
能にする任意のポリヌクレオチドを意味すると意図される。プロモーター配列が
マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機
能的であるか否かを判定することを可能にする技術は、当業者に公知である。例
えば、潜在的プロモーター配列とレポーター遺伝子とを転写の方向に含むポリヌ
クレオチドでマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）を形質転換することがで
きる。該ポリヌクレオチドで形質転換された真菌における該レポーター遺伝子の
発現のモニターは、このプロモーター配列がマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔ
ｈｅ）において機能的であるか否かの判定を可能にする。したがって、マグナポ
ルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における機能を判定
するために、任意のプロモーター配列を試験することができる。該プロモーター
調節配列は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ
）由来の遺伝子のプロモーター調節配列であることが可能であり、あるいは別の
真菌、さらに詳しくは別の糸状菌に由来することが可能である。マグナポルセ・
グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロ
モーター調節配列は、真菌ｎｉａ（硝酸レダクターゼ）またはｇｐｄ遺伝子のプ
ロモーター調節配列よりなることが有利である。好ましくは、マグナポルセ・グ
リセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモ
ーター調節配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）または
ｇｐｄＡ遺伝子（Ｐｕｎｔら，１９９０）の、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒ
ｔｈｅ）において機能的なプロモーター調節配列よりなる。マグナポルセ（Ｍａ
ｇｎａｐｏｒｔｈｅ）において機能的であるためには、アスペルギルス・ニデュ
ランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子の
プロモーター調節配列は、好ましくは、３３７ｂｐより長く、０．４ｋｂより長
く、０．５ｋｂより長く、０．６ｋｂより長く、０．７ｋｂより長く、０．８ｋ
ｂより長く、０．９ｋｂより長く、より好ましくは、約１ｋｂより長いか又はそ
れに等しい。本発明の好ましい実施形態においては、マグナポルセ・グリセア（
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調
節配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕ
ｌａｎｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ５８２９１；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら，Ｇｅｎｅ
９０：１８１−１９２，１９９０；Ｐｕｎｔら，１９９５）由来のｎｉａＤお
よびｎｉｉＡ遺伝子の遺伝子間断片に相当する１．３ｋｂのポリヌクレオチドよ
りなる。それ自体は機能的ではないが、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐ
ｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のゲノム内のマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａ
ｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）プロモーターの下流へのランダムな組込みにより
該マーカー遺伝子の発現を可能にする部分的機能的調節配列は、本発明において
は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）におい
て機能的な調節配列ではないと理解される。
ｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列」なる表現は、あるコ
ード配列に機能的に連結されたポリヌクレオチドのうち、マグナポルセ・グリセ
ア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における該コード配列の発現を可
能にする任意のポリヌクレオチドを意味すると意図される。プロモーター配列が
マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機
能的であるか否かを判定することを可能にする技術は、当業者に公知である。例
えば、潜在的プロモーター配列とレポーター遺伝子とを転写の方向に含むポリヌ
クレオチドでマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）を形質転換することがで
きる。該ポリヌクレオチドで形質転換された真菌における該レポーター遺伝子の
発現のモニターは、このプロモーター配列がマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔ
ｈｅ）において機能的であるか否かの判定を可能にする。したがって、マグナポ
ルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における機能を判定
するために、任意のプロモーター配列を試験することができる。該プロモーター
調節配列は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ
）由来の遺伝子のプロモーター調節配列であることが可能であり、あるいは別の
真菌、さらに詳しくは別の糸状菌に由来することが可能である。マグナポルセ・
グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロ
モーター調節配列は、真菌ｎｉａ（硝酸レダクターゼ）またはｇｐｄ遺伝子のプ
ロモーター調節配列よりなることが有利である。好ましくは、マグナポルセ・グ
リセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモ
ーター調節配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）または
ｇｐｄＡ遺伝子（Ｐｕｎｔら，１９９０）の、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒ
ｔｈｅ）において機能的なプロモーター調節配列よりなる。マグナポルセ（Ｍａ
ｇｎａｐｏｒｔｈｅ）において機能的であるためには、アスペルギルス・ニデュ
ランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子の
プロモーター調節配列は、好ましくは、３３７ｂｐより長く、０．４ｋｂより長
く、０．５ｋｂより長く、０．６ｋｂより長く、０．７ｋｂより長く、０．８ｋ
ｂより長く、０．９ｋｂより長く、より好ましくは、約１ｋｂより長いか又はそ
れに等しい。本発明の好ましい実施形態においては、マグナポルセ・グリセア（
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調
節配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕ
ｌａｎｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ５８２９１；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら，Ｇｅｎｅ
９０：１８１−１９２，１９９０；Ｐｕｎｔら，１９９５）由来のｎｉａＤお
よびｎｉｉＡ遺伝子の遺伝子間断片に相当する１．３ｋｂのポリヌクレオチドよ
りなる。それ自体は機能的ではないが、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐ
ｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のゲノム内のマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａ
ｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）プロモーターの下流へのランダムな組込みにより
該マーカー遺伝子の発現を可能にする部分的機能的調節配列は、本発明において
は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）におい
て機能的な調節配列ではないと理解される。
【００１４】 本発明の好ましい実施形態においては、該マーカー遺伝子のコード配列は、発
現が容易に測定されるレポーター遺伝子、特にＧＵＳ（米国特許第５，２６８，
４６３号、米国特許第５，５９９，６７０号）またはＧＦＰ（米国特許第５，４
９１，０８４号、米国特許第５，７４１，６６８号）のコード配列、抗生物質ま
たは除草剤に対する耐性に関する遺伝子、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子（
ｈｐｈ：Ｐｕｎｔら，１９８７）、フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ：Ｄｒｏ
ｃｏｕｒｔ，１９９０）、除草剤ビアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）耐性遺伝
子（Ｂａｒ：ＰａｌｌおよびＢｒｕｎｅｌｌｉ，１９９３）またはスルホニル尿
素耐性遺伝子（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）のコード配列から選ばれる。本
発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該マーカー遺伝子は、真菌にお
いて機能的である、酵素をコードする遺伝子の配列から選ばれる。好ましくは、
該マーカー遺伝子は硝酸レダクターゼ遺伝子である。本発明の断片がｎｉａ−真
菌内に組込まれた場合、この構築物で形質転換された株は突然変異体表現型を維
持する。最少培地（唯一の窒素源としてのＮａＮＯ３）上のｎｉａ＋コロニーの
出現は、ｎｉａＤ遺伝子の発現を可能にするインパラトランスポゾンの切除を示
す。これらのｎｉａ＋復帰突然変異体は、ｎｉａ−コロニーの低く平らな表現型
とは異なるそれらの密集性かつ気生性（ａｅｒｉａｌ）の表現型により、この培
地上で選択されうる。マーカーとしてのｎｉａＤ遺伝子の使用は、ｎｉａ−真菌
の使用を要する。ｎｉａ−真菌の同定方法は当業者によく知られている。特に、
Ｄａｂｏｕｓｓｉら（１９８９）により記載されている方法が挙げられる。
現が容易に測定されるレポーター遺伝子、特にＧＵＳ（米国特許第５，２６８，
４６３号、米国特許第５，５９９，６７０号）またはＧＦＰ（米国特許第５，４
９１，０８４号、米国特許第５，７４１，６６８号）のコード配列、抗生物質ま
たは除草剤に対する耐性に関する遺伝子、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子（
ｈｐｈ：Ｐｕｎｔら，１９８７）、フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ：Ｄｒｏ
ｃｏｕｒｔ，１９９０）、除草剤ビアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）耐性遺伝
子（Ｂａｒ：ＰａｌｌおよびＢｒｕｎｅｌｌｉ，１９９３）またはスルホニル尿
素耐性遺伝子（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）のコード配列から選ばれる。本
発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該マーカー遺伝子は、真菌にお
いて機能的である、酵素をコードする遺伝子の配列から選ばれる。好ましくは、
該マーカー遺伝子は硝酸レダクターゼ遺伝子である。本発明の断片がｎｉａ−真
菌内に組込まれた場合、この構築物で形質転換された株は突然変異体表現型を維
持する。最少培地（唯一の窒素源としてのＮａＮＯ３）上のｎｉａ＋コロニーの
出現は、ｎｉａＤ遺伝子の発現を可能にするインパラトランスポゾンの切除を示
す。これらのｎｉａ＋復帰突然変異体は、ｎｉａ−コロニーの低く平らな表現型
とは異なるそれらの密集性かつ気生性（ａｅｒｉａｌ）の表現型により、この培
地上で選択されうる。マーカーとしてのｎｉａＤ遺伝子の使用は、ｎｉａ−真菌
の使用を要する。ｎｉａ−真菌の同定方法は当業者によく知られている。特に、
Ｄａｂｏｕｓｓｉら（１９８９）により記載されている方法が挙げられる。
【００１５】 本発明のポリヌクレオチドは、インパラトランスポゾン（Ｌａｎｇｉｎら，１
９９５；Ｈｕａ−Ｖａｎら，１９９８）の挿入により不活性化された前記のマー
カー遺伝子を含む。該インパラトランスポゾンは、逆方向反復配列（ＩＴＲ）に
隣接した機能的トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを
含む。それは、ＴＡジヌクレオチドにおいて挿入され、これは重複状態となる。
インパラの切除は曖昧なものであり、ごく一般的には、該挿入中に重複したＴＡ
ジヌクレオチドに加えて、該因子の左または右末端に対応する３ヌクレオチドの
足跡（フットプリント）を残す。したがって、切除後に残存フットプリントが該
マーカー遺伝子の発現を妨げないよう、該マーカー遺伝子内への該インパラトラ
ンスポゾンの挿入点が選択される必要がある。好ましくは、該インパラトランス
ポゾンは、該プロモーター配列内または該マーカー遺伝子のイントロン内に挿入
される。インパラのいくつかのコピーがフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）において同定されており、それらの配列の比較
は、種々の長さおよび配列のＩＴＲを有する３つのサブファミリーを定めること
を可能にした（Ｈｕａ−Ｖａｎら，１９９８）。好ましい実施形態においては、
本発明のポリヌクレオチドは、インパラ１６０トランスポゾンを含む。該インパ
ラ１６０因子は１ ２８０ｂｐを含み、それは、３４０アミノ酸のトランスポザ
ーゼをコードするオープンリーディングフレームを囲む２７ｂｐの２つの逆方向
反復配列に隣接する（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５；Ｇｅｎｂａｎｋ Ｓ７５１０
６）。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、アスペルギ
ルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉ
ａＤ遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギルス・ニデュランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子の１．３
ｋｂのプロモーターと、該ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター内に挿入されたインパ
ラ１６０トランスポゾンとを含む。本発明の特に有利な実施形態においては、本
発明のポリヌクレオチドはｐＮｉＬ１６０プラスミドを含む。これらの構築物を
使用して、ｎｉａ−真菌を形質転換し、インパラ因子の転位から得られた挿入突
然変異体を、それらのｎｉａ＋表現型に関して最少培地上で選択する。もう１つ
の好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ハイグロマイシ
ンに耐性に関するｈｐｈ遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギ
ルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｇｐ
ｄ遺伝子のプロモーターと、該ｇｐｄ遺伝子のプロモーター内に挿入されたイン
パラ１６０トランスポゾンとを含む。これらのポリヌクレオチドを使用して、真
菌を形質転換し、該インパラ因子の転位から得られたハイグロマイシン耐性挿入
突然変異体を選択する。
９９５；Ｈｕａ−Ｖａｎら，１９９８）の挿入により不活性化された前記のマー
カー遺伝子を含む。該インパラトランスポゾンは、逆方向反復配列（ＩＴＲ）に
隣接した機能的トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを
含む。それは、ＴＡジヌクレオチドにおいて挿入され、これは重複状態となる。
インパラの切除は曖昧なものであり、ごく一般的には、該挿入中に重複したＴＡ
ジヌクレオチドに加えて、該因子の左または右末端に対応する３ヌクレオチドの
足跡（フットプリント）を残す。したがって、切除後に残存フットプリントが該
マーカー遺伝子の発現を妨げないよう、該マーカー遺伝子内への該インパラトラ
ンスポゾンの挿入点が選択される必要がある。好ましくは、該インパラトランス
ポゾンは、該プロモーター配列内または該マーカー遺伝子のイントロン内に挿入
される。インパラのいくつかのコピーがフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）において同定されており、それらの配列の比較
は、種々の長さおよび配列のＩＴＲを有する３つのサブファミリーを定めること
を可能にした（Ｈｕａ−Ｖａｎら，１９９８）。好ましい実施形態においては、
本発明のポリヌクレオチドは、インパラ１６０トランスポゾンを含む。該インパ
ラ１６０因子は１ ２８０ｂｐを含み、それは、３４０アミノ酸のトランスポザ
ーゼをコードするオープンリーディングフレームを囲む２７ｂｐの２つの逆方向
反復配列に隣接する（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５；Ｇｅｎｂａｎｋ Ｓ７５１０
６）。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、アスペルギ
ルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉ
ａＤ遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギルス・ニデュランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子の１．３
ｋｂのプロモーターと、該ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター内に挿入されたインパ
ラ１６０トランスポゾンとを含む。本発明の特に有利な実施形態においては、本
発明のポリヌクレオチドはｐＮｉＬ１６０プラスミドを含む。これらの構築物を
使用して、ｎｉａ−真菌を形質転換し、インパラ因子の転位から得られた挿入突
然変異体を、それらのｎｉａ＋表現型に関して最少培地上で選択する。もう１つ
の好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ハイグロマイシ
ンに耐性に関するｈｐｈ遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギ
ルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｇｐ
ｄ遺伝子のプロモーターと、該ｇｐｄ遺伝子のプロモーター内に挿入されたイン
パラ１６０トランスポゾンとを含む。これらのポリヌクレオチドを使用して、真
菌を形質転換し、該インパラ因子の転位から得られたハイグロマイシン耐性挿入
突然変異体を選択する。
【００１６】 本発明の構築物および方法においては、任意のインパラトランスポゾンを使用
することができる。「インパラトランスポゾン」なる語は修飾インパラトランス
ポゾンをも意味すると理解される。これらの修飾としては、特に、インパラトラ
ンスポゾン内へのマーカー遺伝子またはアクチベーター配列の挿入、または欠損
インパラトランスポゾンを得るためのトランスポザーゼの不活性化が挙げられる
。これらの修飾トランスポゾンの構築では、当業者によく知られた通常の分子生
物学技術を用いる。
することができる。「インパラトランスポゾン」なる語は修飾インパラトランス
ポゾンをも意味すると理解される。これらの修飾としては、特に、インパラトラ
ンスポゾン内へのマーカー遺伝子またはアクチベーター配列の挿入、または欠損
インパラトランスポゾンを得るためのトランスポザーゼの不活性化が挙げられる
。これらの修飾トランスポゾンの構築では、当業者によく知られた通常の分子生
物学技術を用いる。
【００１７】 本発明のポリヌクレオチドは、真菌の挿入突然変異体を得るために優先的に用
いられる。遺伝子内へのインパラトランスポゾンの挿入は、一般には、この遺伝
子の全体的または部分的不活性化を引き起こす。一方、アクチベーター配列を含
むインパラトランスポゾンの使用は、過剰発現突然変異体を得ることを可能にす
る。したがって、該トランスポゾン修飾では、挿入突然変異誘発の種々の方法を
用いることができる（Ｂａｎｃｒｏｆｔら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３
３：４４９−４６１，１９９２；ＢａｎｃｒｏｆｔおよびＤｅａｎら，Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：６５-６７，１９９３；Ｌｏｎｇら，ＰＮＡＳ
９０：１０３７０−１０３７４，１９９３）。
いられる。遺伝子内へのインパラトランスポゾンの挿入は、一般には、この遺伝
子の全体的または部分的不活性化を引き起こす。一方、アクチベーター配列を含
むインパラトランスポゾンの使用は、過剰発現突然変異体を得ることを可能にす
る。したがって、該トランスポゾン修飾では、挿入突然変異誘発の種々の方法を
用いることができる（Ｂａｎｃｒｏｆｔら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３
３：４４９−４６１，１９９２；ＢａｎｃｒｏｆｔおよびＤｅａｎら，Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：６５-６７，１９９３；Ｌｏｎｇら，ＰＮＡＳ
９０：１０３７０−１０３７４，１９９３）。
【００１８】 したがって、本発明はまた、トランスポザーゼの機能に影響を及ぼすことなく
転位性因子の２つのＩＴＲの間にマーカー遺伝子が挿入されて自律的標識因子を
有することが可能となったインパラトランスポゾンを含む前記のポリヌクレオチ
ドに関する。また、本発明の好ましい実施形態において該トランスポゾンを標識
するためには、インパラトランスポゾンの切除を観察するために使用することが
予想されるすべてのマーカー遺伝子を使用することができる。好ましくは、該マ
ーカー遺伝子は、該トランスポザーゼをコードする配列の下流、かつ、左ＬＴＲ
の上流（ＮｈｅＩ部位において）に挿入される。インパラトランスポゾン内への
マーカー遺伝子の挿入は、該挿入突然変異体の、より良好な選択を可能にする。
別法として、トランケート化マーカー遺伝子をインパラトランスポゾン内に挿入
することができる。プロモーターを欠くマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリ
ヌクレオチドをプロモータートラップとして使用することを可能にする。トラン
ケート化プロモーターを含むマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリヌクレオチ
ドをアクチベーター配列用のトラップとして使用することを可能にする。
転位性因子の２つのＩＴＲの間にマーカー遺伝子が挿入されて自律的標識因子を
有することが可能となったインパラトランスポゾンを含む前記のポリヌクレオチ
ドに関する。また、本発明の好ましい実施形態において該トランスポゾンを標識
するためには、インパラトランスポゾンの切除を観察するために使用することが
予想されるすべてのマーカー遺伝子を使用することができる。好ましくは、該マ
ーカー遺伝子は、該トランスポザーゼをコードする配列の下流、かつ、左ＬＴＲ
の上流（ＮｈｅＩ部位において）に挿入される。インパラトランスポゾン内への
マーカー遺伝子の挿入は、該挿入突然変異体の、より良好な選択を可能にする。
別法として、トランケート化マーカー遺伝子をインパラトランスポゾン内に挿入
することができる。プロモーターを欠くマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリ
ヌクレオチドをプロモータートラップとして使用することを可能にする。トラン
ケート化プロモーターを含むマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリヌクレオチ
ドをアクチベーター配列用のトラップとして使用することを可能にする。
【００１９】 最後に、本発明は、欠損インパラトランスポゾン（すなわち、特に、突然変異
により、または欠失により、またはマーカー遺伝子の挿入により、またはマーカ
ー遺伝子での置換により、インパラ因子のトランスポザーゼが不活性化されてい
るトランスポゾン）を含む前記のポリヌクレオチドに関する。この欠損インパラ
因子の転位は、本発明の挿入突然変異誘発においては、より容易に制御される。
トランスポザーゼが不活性化された欠損インパラ因子の構築には、当業者に公知
の通常の分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を用いる。本発明の
１つの実施形態においては、インパラ因子のトランスポザーゼをコードするオー
プンリーディングフレームを、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈ
ｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーターの制御下で発現されるマ
ーカー遺伝子で置換する。該トランスポザーゼのコード配列は、例えば、真菌に
おいて機能的である異種プロモーターの制御下で発現される、ハイグロマイシン
耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子またはＧＦＰ遺伝子で置換することができ
る。該欠損インパラトランスポゾンはこれらの挿入配列（ＩＴＲ）を維持し、し
たがって、その転位は、例えば複製型プラスミド上に配置されたトランスポザー
ゼを利用してトランスで活性化されうる。
により、または欠失により、またはマーカー遺伝子の挿入により、またはマーカ
ー遺伝子での置換により、インパラ因子のトランスポザーゼが不活性化されてい
るトランスポゾン）を含む前記のポリヌクレオチドに関する。この欠損インパラ
因子の転位は、本発明の挿入突然変異誘発においては、より容易に制御される。
トランスポザーゼが不活性化された欠損インパラ因子の構築には、当業者に公知
の通常の分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を用いる。本発明の
１つの実施形態においては、インパラ因子のトランスポザーゼをコードするオー
プンリーディングフレームを、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈ
ｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーターの制御下で発現されるマ
ーカー遺伝子で置換する。該トランスポザーゼのコード配列は、例えば、真菌に
おいて機能的である異種プロモーターの制御下で発現される、ハイグロマイシン
耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子またはＧＦＰ遺伝子で置換することができ
る。該欠損インパラトランスポゾンはこれらの挿入配列（ＩＴＲ）を維持し、し
たがって、その転位は、例えば複製型プラスミド上に配置されたトランスポザー
ゼを利用してトランスで活性化されうる。
【００２０】 本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、ベクター内に挿入される。このベ
クターは、例えば細菌などの宿主生物を形質転換するために及びこの宿主生物内
で本発明のポリヌクレオチドを複製するために使用することができる。好ましく
は、本発明のポリヌクレオチドは、真菌を形質転換するためにベクター内に挿入
される。これらのベクターは、これらのポリヌクレオチドを複製するために又は
該ポリヌクレオチドを真菌のゲノム内に組込むために使用される。ポリヌクレオ
チドの複製および宿主生物内へのその組込みを可能にするベクターは、当業者に
よく知られている。
クターは、例えば細菌などの宿主生物を形質転換するために及びこの宿主生物内
で本発明のポリヌクレオチドを複製するために使用することができる。好ましく
は、本発明のポリヌクレオチドは、真菌を形質転換するためにベクター内に挿入
される。これらのベクターは、これらのポリヌクレオチドを複製するために又は
該ポリヌクレオチドを真菌のゲノム内に組込むために使用される。ポリヌクレオ
チドの複製および宿主生物内へのその組込みを可能にするベクターは、当業者に
よく知られている。
【００２１】 挿入突然変異誘発および遺伝的標識 本発明はまた、真菌の挿入突然変異体を製造するための及びこれらの真菌のゲ
ノムを研究するための、前記のポリヌクレオチドの用途に関する。
ノムを研究するための、前記のポリヌクレオチドの用途に関する。
【００２２】 したがって、本発明の対象はまた、真菌の挿入突然変異体の製造方法であって
、 ・マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内への
その再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性化
された該マーカー遺伝子を含む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し
、 ・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造
方法である。
、 ・マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内への
その再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性化
された該マーカー遺伝子を含む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し
、 ・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造
方法である。
【００２３】 本発明の方法においては、該インパラトランスポゾンを修飾すること、特に、
マーカー遺伝子または活性化配列の挿入によりそれを修飾することが可能である
と理解される。好ましい実施形態においては、該インパラトランスポゾンは、マ
ーカー遺伝子を含み、それらの２つのマーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体
を選択する。
マーカー遺伝子または活性化配列の挿入によりそれを修飾することが可能である
と理解される。好ましい実施形態においては、該インパラトランスポゾンは、マ
ーカー遺伝子を含み、それらの２つのマーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体
を選択する。
【００２４】 本発明のポリヌクレオチドで任意の真菌を形質転換して、この真菌の挿入突然
変異体を製造することができる。特に、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類が挙げ
られる。好ましくは、本発明は、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、ア
スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、
クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃ
ｅｐｓ）、コレトトリチュム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウドンコ病菌
（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、コタマカビ（Ｍｙｃ
ｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、シ
ュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ピレノフ
ォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、リンコスポリウム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ）、スクレロティニイア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、スタゴノスポラ（
Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）およびウスチラ
ゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の真菌に関する。また、ゲウマンノマイセス（Ｇａｅ
ｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ）、プシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃ
ｔｏｎｉａ）属の真菌が挙げられる。好ましくは、本発明は、マグナポルセ（Ｍ
ａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真
菌に関する。より好ましくは、本発明は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔ
ｒｙｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇ
ｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌ
ｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）およびスタゴノスポラ・ノドラム（Ｓｔ
ａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｎｏｄｏｒｕｍ）種の真菌に関する。より一層好ましく
は、本発明はマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ
）に関する。
変異体を製造することができる。特に、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類が挙げ
られる。好ましくは、本発明は、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、ア
スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、
クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃ
ｅｐｓ）、コレトトリチュム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウドンコ病菌
（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、コタマカビ（Ｍｙｃ
ｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、シ
ュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ピレノフ
ォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、リンコスポリウム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ）、スクレロティニイア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、スタゴノスポラ（
Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）およびウスチラ
ゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の真菌に関する。また、ゲウマンノマイセス（Ｇａｅ
ｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ）、プシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃ
ｔｏｎｉａ）属の真菌が挙げられる。好ましくは、本発明は、マグナポルセ（Ｍ
ａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真
菌に関する。より好ましくは、本発明は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔ
ｒｙｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇ
ｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌ
ｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）およびスタゴノスポラ・ノドラム（Ｓｔ
ａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｎｏｄｏｒｕｍ）種の真菌に関する。より一層好ましく
は、本発明はマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ
）に関する。
【００２５】 真菌を形質転換するための技術は当業者によく知られている。特に、ＰＥＧを
使用するプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、アグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）での形質転換（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔら，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：８３９−８４２，１９９８）ま
たはパーティクル銃を使用する射撃の方法（Ｃｈａｕｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：２０５−２０７，２０００）が挙げられる。
使用するプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、アグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）での形質転換（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔら，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：８３９−８４２，１９９８）ま
たはパーティクル銃を使用する射撃の方法（Ｃｈａｕｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：２０５−２０７，２０００）が挙げられる。
【００２６】 ついで、インパラ因子の転位から生じた挿入突然変異体を同定または選択する
ために、マーカー遺伝子の発現に関して形質転換体をスクリーニングする。本発
明のポリヌクレオチドのマーカー遺伝子は、表現型スクリーニングにより挿入突
然変異体を同定または選択することを可能にする。例えば、このスクリーニング
は、抗生物質に対する耐性、化合物に対する耐性、またはレポーター遺伝子の発
現レベルの測定によるものでありうる。種々のマーカー遺伝子が、前記において
更に詳しく説明されている。ｎｉａ−真菌におけるマーカー遺伝子としてｎｉａ
Ｄ遺伝子を使用する場合には、唯一の窒素源としてＮａＮＯ３を含有する最少培
地上で、該挿入突然変異体を、それらの密集性かつ気生性の外観により選択する
。
ために、マーカー遺伝子の発現に関して形質転換体をスクリーニングする。本発
明のポリヌクレオチドのマーカー遺伝子は、表現型スクリーニングにより挿入突
然変異体を同定または選択することを可能にする。例えば、このスクリーニング
は、抗生物質に対する耐性、化合物に対する耐性、またはレポーター遺伝子の発
現レベルの測定によるものでありうる。種々のマーカー遺伝子が、前記において
更に詳しく説明されている。ｎｉａ−真菌におけるマーカー遺伝子としてｎｉａ
Ｄ遺伝子を使用する場合には、唯一の窒素源としてＮａＮＯ３を含有する最少培
地上で、該挿入突然変異体を、それらの密集性かつ気生性の外観により選択する
。
【００２７】 このようにして得られた挿入突然変異体を分析するためには、新たな転位を避
けるためにトランスポゾンを安定化させるのが有利かもしれない。該転位因子の
転位率に近い又はそれ未満の相補点（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において該突然変
異体を試験する場合には、該トランスポゾンの新たな再挿入のこの制御は無視さ
れうる。該トランスポゾンの切除を制御するために、２成分系を調製することが
できる（Ｈｕｎ−Ｖａｎ，１９９８；ＫｅｍｐｋｅｎおよびＫｕｃｋ，１９９８
）。後者は、トランスポザーゼが特に突然変異により又は欠失により又はマーカ
ー遺伝子での置換により不活性化された欠損インパラ因子の構築を含む。この場
合、該欠損インパラトランスポゾンは、発現が厳密に制御されており該インパラ
因子の安定化を可能にするトランスポザーゼを用いて可動される。
けるためにトランスポゾンを安定化させるのが有利かもしれない。該転位因子の
転位率に近い又はそれ未満の相補点（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において該突然変
異体を試験する場合には、該トランスポゾンの新たな再挿入のこの制御は無視さ
れうる。該トランスポゾンの切除を制御するために、２成分系を調製することが
できる（Ｈｕｎ−Ｖａｎ，１９９８；ＫｅｍｐｋｅｎおよびＫｕｃｋ，１９９８
）。後者は、トランスポザーゼが特に突然変異により又は欠失により又はマーカ
ー遺伝子での置換により不活性化された欠損インパラ因子の構築を含む。この場
合、該欠損インパラトランスポゾンは、発現が厳密に制御されており該インパラ
因子の安定化を可能にするトランスポザーゼを用いて可動される。
【００２８】 したがって、本発明の対象はまた、真菌の挿入突然変異体の製造方法であって
、 ・欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含
む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、 ・該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入お
よびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用い
て、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、 ・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造
方法である。
、 ・欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含
む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、 ・該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入お
よびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用い
て、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、 ・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造
方法である。
【００２９】 真菌におけるインパラ因子トランスポザーゼ遺伝子などの遺伝子の発現の制御
を可能にする方法は、当業者によく知られている。特定の実施形態においては、
該真菌を２つのポリヌクレオチドで形質転換する。その第１ポリヌクレオチドは
該欠損インパラトランスポゾンを含み、第２ポリヌクレオチドは、インパラ因子
トランスポザーゼのコード配列を、それ自身のプロモーターの制御下または異種
プロモーターの制御下で含む。該トランスポザーゼのコード配列は、複製型プラ
スミド上または組込みプラスミド上に配置することができる。該トランスポザー
ゼの発現を制御するために、後者を、誘導プロモーターの制御下に配置すること
ができる。該トランスポザーゼの発現の誘導は、該欠損インパラ因子の転位およ
び挿入突然変異体の調製を可能にし、ついで、該トランスポザーゼがもはや発現
されなくなった際に該トランスポゾンは安定化される。本発明の方法においては
、真菌において機能的である任意の誘導プロモーターを使用することができる。
特に、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来
の硝酸レダクターゼ遺伝子のプロモーターを使用することができる。特に、この
プロモーターは、唯一の窒素源としての硝酸塩の存在下の最少培地上でのｎｉａ
遺伝子の発現を可能にし、一方、この遺伝子の発現は、アンモニウムの存在下で
は完全に抑制される（ＬａｕおよびＨａｍｍｅｒ，１９９６）。あるいは、該ト
ランスポザーゼを、例えば、選択マーカーを保持する複製型プラスミド（このプ
ラスミドは、選択圧が存在しない場合には維持されない）上に配置する。この場
合、該トランスポザーゼは、構成プロモーターまたはそれ自身のプロモーターの
制御下で発現されうる。選択圧の存在下、該複製型プラスミドの維持は該トラン
スポザーゼの発現を可能にし、今度はこれが、インパラ因子の転位および挿入突
然変異体の産生を可能にする。複製型プラスミドの維持を可能にする選択圧の不
存在下では、該トランスポザーゼは失われ、該トランスポゾンは該突然変異体内
で安定化される。そのようなプラスミドの製造に必要な手段は当業者によく知ら
れている。例えば、該トランスポザーゼを、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）
由来のテロメア末端を含有するｐＦＡＣ１複製型ベクター（Ｂａｒｒｅａｕら，
１９９８）内に配置することができる。
を可能にする方法は、当業者によく知られている。特定の実施形態においては、
該真菌を２つのポリヌクレオチドで形質転換する。その第１ポリヌクレオチドは
該欠損インパラトランスポゾンを含み、第２ポリヌクレオチドは、インパラ因子
トランスポザーゼのコード配列を、それ自身のプロモーターの制御下または異種
プロモーターの制御下で含む。該トランスポザーゼのコード配列は、複製型プラ
スミド上または組込みプラスミド上に配置することができる。該トランスポザー
ゼの発現を制御するために、後者を、誘導プロモーターの制御下に配置すること
ができる。該トランスポザーゼの発現の誘導は、該欠損インパラ因子の転位およ
び挿入突然変異体の調製を可能にし、ついで、該トランスポザーゼがもはや発現
されなくなった際に該トランスポゾンは安定化される。本発明の方法においては
、真菌において機能的である任意の誘導プロモーターを使用することができる。
特に、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来
の硝酸レダクターゼ遺伝子のプロモーターを使用することができる。特に、この
プロモーターは、唯一の窒素源としての硝酸塩の存在下の最少培地上でのｎｉａ
遺伝子の発現を可能にし、一方、この遺伝子の発現は、アンモニウムの存在下で
は完全に抑制される（ＬａｕおよびＨａｍｍｅｒ，１９９６）。あるいは、該ト
ランスポザーゼを、例えば、選択マーカーを保持する複製型プラスミド（このプ
ラスミドは、選択圧が存在しない場合には維持されない）上に配置する。この場
合、該トランスポザーゼは、構成プロモーターまたはそれ自身のプロモーターの
制御下で発現されうる。選択圧の存在下、該複製型プラスミドの維持は該トラン
スポザーゼの発現を可能にし、今度はこれが、インパラ因子の転位および挿入突
然変異体の産生を可能にする。複製型プラスミドの維持を可能にする選択圧の不
存在下では、該トランスポザーゼは失われ、該トランスポゾンは該突然変異体内
で安定化される。そのようなプラスミドの製造に必要な手段は当業者によく知ら
れている。例えば、該トランスポザーゼを、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）
由来のテロメア末端を含有するｐＦＡＣ１複製型ベクター（Ｂａｒｒｅａｕら，
１９９８）内に配置することができる。
【００３０】 挿入突然変異誘発は、関心のある新規遺伝子を同定するための及びそれらの機
能を研究するための非常に有効な手段である。好ましい実施形態においては、挿
入突然変異体のコレクションを、関心のある表現型に関してスクリーニングする
。本発明の挿入突然変異体においては、任意の検出可能な表現型が探索されうる
。特に、真菌の生物学、生理学、発生および生化学に関する表現型が挙げられる
。好ましくは、病原性真菌の挿入突然変異体が調製され、これらの突然変異体に
おいて探索される表現型はこれらの真菌の病原性に関するものである。該表現型
スクリーニングは、該真菌の直接的観察、酵素活性の測定、殺真菌剤に対する感
受性の測定、または該真菌のビルレンスの研究に基づくものでありうる。関心の
ある表現型を有する挿入突然変異体を同定したら、インパラトランスポゾンが内
部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する。該インパラ因子の挿入によりこの
ようにして標識された関心のある遺伝子は、当業者によく知られた分子生物学的
技術を用いて単離する。用いる技術としては、特に、ポリヌクレオチドの一方の
末端の配列のみが既知の場合に該ポリヌクレオチドの増幅を可能にする増幅技術
が挙げられる（この場合、該トランスポゾンの配列は該ゲノム内に組込まれる）
。これらの技術には、特に、逆ＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
１２０：６２１−６２３，１９８８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ７：７６２−７６９，１９８９）、ベクトレットＰＣＲ（Ａｒｎｏｌｄ
およびＨｏｄｇｓｏｎ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：３９−４２，
１９９１）およびパンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）ＰＣＲ（Ｊｏｎｅｓ ａ
ｎｄ Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．２：１９
７−２０３，１９９３）が含まれる。これらの技術は、真菌のゲノム内のインパ
ラトランスポゾンに隣接する配列の増幅、クローニングおよび配列決定を可能に
する。ついでこれらの隣接配列を使用して、該トランスポゾンの挿入により不活
性化された全遺伝子を単離する。
能を研究するための非常に有効な手段である。好ましい実施形態においては、挿
入突然変異体のコレクションを、関心のある表現型に関してスクリーニングする
。本発明の挿入突然変異体においては、任意の検出可能な表現型が探索されうる
。特に、真菌の生物学、生理学、発生および生化学に関する表現型が挙げられる
。好ましくは、病原性真菌の挿入突然変異体が調製され、これらの突然変異体に
おいて探索される表現型はこれらの真菌の病原性に関するものである。該表現型
スクリーニングは、該真菌の直接的観察、酵素活性の測定、殺真菌剤に対する感
受性の測定、または該真菌のビルレンスの研究に基づくものでありうる。関心の
ある表現型を有する挿入突然変異体を同定したら、インパラトランスポゾンが内
部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する。該インパラ因子の挿入によりこの
ようにして標識された関心のある遺伝子は、当業者によく知られた分子生物学的
技術を用いて単離する。用いる技術としては、特に、ポリヌクレオチドの一方の
末端の配列のみが既知の場合に該ポリヌクレオチドの増幅を可能にする増幅技術
が挙げられる（この場合、該トランスポゾンの配列は該ゲノム内に組込まれる）
。これらの技術には、特に、逆ＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
１２０：６２１−６２３，１９８８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ７：７６２−７６９，１９８９）、ベクトレットＰＣＲ（Ａｒｎｏｌｄ
およびＨｏｄｇｓｏｎ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：３９−４２，
１９９１）およびパンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）ＰＣＲ（Ｊｏｎｅｓ ａ
ｎｄ Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．２：１９
７−２０３，１９９３）が含まれる。これらの技術は、真菌のゲノム内のインパ
ラトランスポゾンに隣接する配列の増幅、クローニングおよび配列決定を可能に
する。ついでこれらの隣接配列を使用して、該トランスポゾンの挿入により不活
性化された全遺伝子を単離する。
【００３１】 したがって、本発明は、真菌における検出可能な表現型に関連した遺伝子の同
定方法であって、 ・前記の製造方法の１つに従い、該真菌のゲノム内にインパラトランスポゾンを
挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、 ・この検出可能な表現型を有する少なくとも１つの挿入突然変異体を選択し、 ・該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する工
程を含んでなる方法に関する。
定方法であって、 ・前記の製造方法の１つに従い、該真菌のゲノム内にインパラトランスポゾンを
挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、 ・この検出可能な表現型を有する少なくとも１つの挿入突然変異体を選択し、 ・該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する工
程を含んでなる方法に関する。
【００３２】 宿主生物 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主生物に関する
。本発明における「宿主生物」なる語は、特に、任意の単細胞生物または多細胞
生物（これは下等または高等生物でありうる）を意味し、特に、細菌および真菌
から選ばれると意図される。該細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）から選ばれるのが好都合である。好ましい実施形態においては、本発明は、
本発明のポリヌクレオチドで形質転換された真菌に関する。好ましくは、該真菌
は、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類から選ばれる。好ましくは、該真菌は、ア
ルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コレトトリチュム（Ｃｏ
ｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウドンコ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、コタマカビ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、エキビ
ョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、シュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、
リンコスポリウム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スクレロティニイア（Ｓ
ｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベン
ツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）およびウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の真菌か
ら選ばれる。また、ゲウマンノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘ
ルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、プシニア（Ｐｕｃ
ｃｉｎｉａ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属の真菌が挙げら
れる。好ましくは、該真菌は、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）および
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）から選ばれる。より好ましくは、該真
菌は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａ
ｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕ
ｌａｎｓ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エリ
シフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスフェレラ
・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、
ペニシリウム・ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎ
ｉｃｕｌｏｓｕｍ）およびスタゴノスポラ・ノドラム（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒ
ａ ｎｏｄｏｒｕｍ）種から選ばれる。特に有利な態様においては、該宿主生物
はマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）である。
。本発明における「宿主生物」なる語は、特に、任意の単細胞生物または多細胞
生物（これは下等または高等生物でありうる）を意味し、特に、細菌および真菌
から選ばれると意図される。該細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）から選ばれるのが好都合である。好ましい実施形態においては、本発明は、
本発明のポリヌクレオチドで形質転換された真菌に関する。好ましくは、該真菌
は、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類から選ばれる。好ましくは、該真菌は、ア
ルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コレトトリチュム（Ｃｏ
ｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウドンコ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、コタマカビ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、エキビ
ョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、シュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、
リンコスポリウム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スクレロティニイア（Ｓ
ｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベン
ツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）およびウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の真菌か
ら選ばれる。また、ゲウマンノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘ
ルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、プシニア（Ｐｕｃ
ｃｉｎｉａ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属の真菌が挙げら
れる。好ましくは、該真菌は、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）および
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）から選ばれる。より好ましくは、該真
菌は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａ
ｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕ
ｌａｎｓ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エリ
シフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスフェレラ
・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、
ペニシリウム・ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎ
ｉｃｕｌｏｓｕｍ）およびスタゴノスポラ・ノドラム（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒ
ａ ｎｏｄｏｒｕｍ）種から選ばれる。特に有利な態様においては、該宿主生物
はマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）である。
【００３３】 該ポリヌクレオチドは、該真菌のゲノム内に組込まれたり、あるいは複製型プ
ラスミド上に配置されうる。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオ
チドがゲノム内に組込まれた真菌に関する。本発明はまた、該インパラトランス
ポゾンがゲノム内に組込まれたマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）または
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突
然変異体に関する。
ラスミド上に配置されうる。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオ
チドがゲノム内に組込まれた真菌に関する。本発明はまた、該インパラトランス
ポゾンがゲノム内に組込まれたマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）または
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突
然変異体に関する。
【００３４】 該真菌のゲノム内へのインパラの再挿入は、この真菌の挿入突然変異体のコレ
クションの生成を可能にする。このようにして得られた突然変異体を、糸状菌の
ゲノムの研究に使用することができる。
クションの生成を可能にする。このようにして得られた突然変異体を、糸状菌の
ゲノムの研究に使用することができる。
【００３５】 後記実施例は、本発明を例示しうるが、本発明の範囲を限定するものではない
。これらの後記実施例に記載の方法または操作は、例示として記載されており、
同じ結果を得るために利用されうる種々の方法から選ばれる１つの選択肢に相当
する。この選択肢は、結果の質に関連したものではなく、そのため、当業者は、
同じ結果を得るために任意の適当な方法を用いることができる。ＤＮＡ断片を操
作するための方法のほとんどは、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” 第１巻および第２巻，Ａｕｓｕｂｅ
ｌ Ｆ．Ｍ．ら又はＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に記載されている。
。これらの後記実施例に記載の方法または操作は、例示として記載されており、
同じ結果を得るために利用されうる種々の方法から選ばれる１つの選択肢に相当
する。この選択肢は、結果の質に関連したものではなく、そのため、当業者は、
同じ結果を得るために任意の適当な方法を用いることができる。ＤＮＡ断片を操
作するための方法のほとんどは、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” 第１巻および第２巻，Ａｕｓｕｂｅ
ｌ Ｆ．Ｍ．ら又はＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に記載されている。
【００３６】 （図面の記載） 図１：ｐＮｉ１６０プラスミドのマッピング。
【００３７】 図２：ｐＮｉＬ１６０プラスミド（Ａ）およびｐＡＮ３０１プラスミド（Ｂ）
の、それを構築するために用いたマッピング。
の、それを構築するために用いたマッピング。
【００３８】 図３：ｐＮｉ１６０およびｐＣＢ１１７９ベクターを使用してＢａｍＨＩ Ｒ
ＥＭＩにより得られた同時形質転換体の分子分析。該同時形質転換体ＤＮＡを抽
出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上に
ローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレ
ン上へのトランスファーの後、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．
７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイ
ゼーションにより該ＤＮＡ断片が示される。
ＥＭＩにより得られた同時形質転換体の分子分析。該同時形質転換体ＤＮＡを抽
出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上に
ローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレ
ン上へのトランスファーの後、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．
７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイ
ゼーションにより該ＤＮＡ断片が示される。
【００３９】 図４：ｎｉａ＋復帰突然変異体Ｃ１４−１およびＣ１４−２の分子分析。該復
帰突然変異体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の
１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジ
ティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、サザンハイブリダイゼー
ションにより該ＤＮＡ断片が示される。
帰突然変異体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の
１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジ
ティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、サザンハイブリダイゼー
ションにより該ＤＮＡ断片が示される。
【００４０】 Ａ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片
に相当する（レーン１）またはインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに
相当する（レーン２）放射性プローブを使用したＣ１４−１復帰突然変異体の分
析。
に相当する（レーン１）またはインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに
相当する（レーン２）放射性プローブを使用したＣ１４−１復帰突然変異体の分
析。
【００４１】 Ｂ：ｎｉａ＋単胞子を単離することにより精製された後のＣ１４−１およびＣ
１４−２復帰突然変異体の分析。Ｃ１４−１復帰突然変異体（レーン３および４
）およびＣ１４−２復帰突然変異体（レーン５および６）のプロフィールをＣ１
４ｎｉａ−同時形質転換体由来のプロフィール（レーン１および２）と比較する
。使用したプローブは、インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当す
る。
１４−２復帰突然変異体の分析。Ｃ１４−１復帰突然変異体（レーン３および４
）およびＣ１４−２復帰突然変異体（レーン５および６）のプロフィールをＣ１
４ｎｉａ−同時形質転換体由来のプロフィール（レーン１および２）と比較する
。使用したプローブは、インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当す
る。
【００４２】 図５：ｐＮｉＬ１６０ベクターを保持する２つの同時形質転換体に由来するｎ
ｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。該同時形質転換体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングす
る（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトラン
スファーの後、Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放
射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、Ｂ：ｐＡＮ３０１
中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プ
ローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される
。レーン１：同時形質転換体８のＤＮＡ；レーン２〜７：同時形質転換体８の復
帰突然変異体のＤＮＡ；レーン８：同時形質転換体６のＤＮＡ；レーン９〜１１
：同時形質転換体６の復帰突然変異体のＤＮＡ。
ｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。該同時形質転換体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングす
る（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトラン
スファーの後、Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放
射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、Ｂ：ｐＡＮ３０１
中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プ
ローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される
。レーン１：同時形質転換体８のＤＮＡ；レーン２〜７：同時形質転換体８の復
帰突然変異体のＤＮＡ；レーン８：同時形質転換体６のＤＮＡ；レーン９〜１１
：同時形質転換体６の復帰突然変異体のＤＮＡ。
【００４３】 図６：非病原性復帰突然変異体Ｒｅｖ７７におけるインパラの挿入により遮断
されたＯＲＦの概要図。
されたＯＲＦの概要図。
【００４４】 図７：ｐＣＩＴｎプラスミドのマッピング。
【００４５】 図８：ｐＮｉＨＹＧ構築物を保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ
＋復帰突然変異体の分子分析。３つの別個の復帰突然変異体のＤＮＡ（レーン１
〜３）を抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロー
スゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロ
ンメンブレン上へのトランスファーの後、Ａ：インパラトランスポザーゼをコー
ドするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーション
により、Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｉ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより
、該ＤＮＡ断片が示される。星印の位置は転位性因子の再挿入を示す。
＋復帰突然変異体の分子分析。３つの別個の復帰突然変異体のＤＮＡ（レーン１
〜３）を抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロー
スゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロ
ンメンブレン上へのトランスファーの後、Ａ：インパラトランスポザーゼをコー
ドするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーション
により、Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｉ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより
、該ＤＮＡ断片が示される。星印の位置は転位性因子の再挿入を示す。
【００４６】 図９：ｐＨＩＮプラスミドのマッピング。
【００４７】 図１０：ｐＥＯ６プラスミドのマッピング。
【００４８】 図１１：ｐＨＮｉＬプラスミドのマッピング。
【００４９】 図１２：ｐＢＮｉＬプラスミドのマッピング。
【００５０】 図１３：ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドのマッピング。
【００５１】 図１４：該２成分系を用いた形質転換後に得られたＤ１同時形質転換体に由来
するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。該復帰突然変異体ＤＮＡ（レーン１〜
４）のＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％ア
ガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブ
ナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、ｈｐｈ遺伝子から増幅された断
片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該
ＤＮＡ断片が示される。
するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。該復帰突然変異体ＤＮＡ（レーン１〜
４）のＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％ア
ガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブ
ナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、ｈｐｈ遺伝子から増幅された断
片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該
ＤＮＡ断片が示される。
【００５２】 （実施例） 実施例１ インパラの自律性コピーでの挿入突然変異誘発 １．入手可能な構築物 ｐＮｉ１６０プラスミドは、ＡＴＧコドンから１０ｐｂの位置に、アスペルギ
ルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉ
ａＤ遺伝子のプロモーター領域内に組込まれたインパラ１６０のコピーを含有す
る。その構築物は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９
９２）を含有するｐＡＮ３０１プラスミド（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）
で形質転換されたフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐ
ｏｒｕｍ）のＦ２４株において得られたトランスポゾン捕捉に由来する。ｎｉａ
Ｄ遺伝子の自然突然変異の選択は、ｐＡＮ３０１の単一のコピーを保持するＴＲ
７形質転換体における１．３ｋｂの挿入の特徴づけを可能にする。この挿入は、
ｐＡＮ３０１の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ領域内に存在し、その効果
は、４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の生成にある。部分ゲノムライブラリーを構築し、
ｐＡＮ３０１由来の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片でスクリーニングした後（Ｌａ
ｎｇｉｎら，１９９５）、この断片をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニン
グした。それと平行して、該ｎｉａＤ遺伝子の下流に位置する７．８ｋｂ Ｎｄ
ｅＩ断片、そしてまた、該ｎｉａＤ遺伝子のプロモーターの大部分に相当する１
ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を欠失させることにより、ｐ１１ΔＮｄｅＩ
プラスミドをｐＡＮ３０１から構築した（Ｌａｎｇｉｎら，１９９０）。インパ
ラ１６０因子および硝酸レダクターゼの２．７ｋｂの断片を含む４ｋｂの断片で
、ｐ１１ΔＮｄｅＩ中に存在する２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を置換することに
より、この場合は０．３ｋｂ長であるｎｉａＤ遺伝子のプロモーター領域内に該
因子が挿入されたｐＮｉ１６０プラスミドが得られうる（図１）。
ルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉ
ａＤ遺伝子のプロモーター領域内に組込まれたインパラ１６０のコピーを含有す
る。その構築物は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９
９２）を含有するｐＡＮ３０１プラスミド（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）
で形質転換されたフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐ
ｏｒｕｍ）のＦ２４株において得られたトランスポゾン捕捉に由来する。ｎｉａ
Ｄ遺伝子の自然突然変異の選択は、ｐＡＮ３０１の単一のコピーを保持するＴＲ
７形質転換体における１．３ｋｂの挿入の特徴づけを可能にする。この挿入は、
ｐＡＮ３０１の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ領域内に存在し、その効果
は、４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の生成にある。部分ゲノムライブラリーを構築し、
ｐＡＮ３０１由来の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片でスクリーニングした後（Ｌａ
ｎｇｉｎら，１９９５）、この断片をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニン
グした。それと平行して、該ｎｉａＤ遺伝子の下流に位置する７．８ｋｂ Ｎｄ
ｅＩ断片、そしてまた、該ｎｉａＤ遺伝子のプロモーターの大部分に相当する１
ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を欠失させることにより、ｐ１１ΔＮｄｅＩ
プラスミドをｐＡＮ３０１から構築した（Ｌａｎｇｉｎら，１９９０）。インパ
ラ１６０因子および硝酸レダクターゼの２．７ｋｂの断片を含む４ｋｂの断片で
、ｐ１１ΔＮｄｅＩ中に存在する２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を置換することに
より、この場合は０．３ｋｂ長であるｎｉａＤ遺伝子のプロモーター領域内に該
因子が挿入されたｐＮｉ１６０プラスミドが得られうる（図１）。
【００５３】 ２．調製した構築物 ｐＮｉＬ１６０プラスミドは、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子のプ
ロモーターの１ｋｂの断片の付加によりｐＮｉ１６０プラスミドから誘導される
。これを行なうために、１．３ｋｂのｎｉａＤプロモーターを含有するｐＡＮ３
０１プラスミドを、この遺伝子の下流に存在する７．８ｋｂのＮｄｅＩ断片から
欠失させて、中間体プラスミドｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩを得た。ついで、その１
ｋｂのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片を、該１ｋｂの断片と同じｎｉａＤ遺伝子部分
とインパラ１６０因子とを含有しｐＮｉ１６０プラスミドに由来する２．３ｋｂ
のＢａｍＨｉ−ＡｐａＩ断片で置換した（図２）。
ロモーターの１ｋｂの断片の付加によりｐＮｉ１６０プラスミドから誘導される
。これを行なうために、１．３ｋｂのｎｉａＤプロモーターを含有するｐＡＮ３
０１プラスミドを、この遺伝子の下流に存在する７．８ｋｂのＮｄｅＩ断片から
欠失させて、中間体プラスミドｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩを得た。ついで、その１
ｋｂのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片を、該１ｋｂの断片と同じｎｉａＤ遺伝子部分
とインパラ１６０因子とを含有しｐＮｉ１６０プラスミドに由来する２．３ｋｂ
のＢａｍＨｉ−ＡｐａＩ断片で置換した（図２）。
【００５４】 ３．マグナポルセ・グリセアの形質転換 マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のＧ１１
．１７４株は、ｎｉａ−表現型をもたらす硝酸レダクターゼ遺伝子内の点突然変
異を有する。この株の製造は、Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９８９の文献に記載され
ている。それを、米粉に基づく固形培地上で継代培養し、それにより、該真菌か
ら分生子が収穫されうる。Ｔａｎａｋａ（Ｏｕら，１９８５）の培地Ｂに基づき
調製したＴＮＫＹＥ液体培地は、Ｓｗｅｉｇａｒｄら（１９９０）およびＳｗｅ
ｉｇａｒｄら（１９９２）に記載のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出する
ための又はプロトプラストを得るための菌糸の収穫を可能にしうる。酵母エキス
を欠くＴＮＫ寒天培地（超高純度アガロース、８ｇ．１−１）（ＭＮＯ３培地）
は、ｎｉａ＋ Ｇ１１．２５株からｎｉａ− Ｇ１１．１７４株を識別するのを
可能にする。前者は、低く平らで糸状の表現型を有するが、後者は密集性かつ気
生性である。
．１７４株は、ｎｉａ−表現型をもたらす硝酸レダクターゼ遺伝子内の点突然変
異を有する。この株の製造は、Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９８９の文献に記載され
ている。それを、米粉に基づく固形培地上で継代培養し、それにより、該真菌か
ら分生子が収穫されうる。Ｔａｎａｋａ（Ｏｕら，１９８５）の培地Ｂに基づき
調製したＴＮＫＹＥ液体培地は、Ｓｗｅｉｇａｒｄら（１９９０）およびＳｗｅ
ｉｇａｒｄら（１９９２）に記載のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出する
ための又はプロトプラストを得るための菌糸の収穫を可能にしうる。酵母エキス
を欠くＴＮＫ寒天培地（超高純度アガロース、８ｇ．１−１）（ＭＮＯ３培地）
は、ｎｉａ＋ Ｇ１１．２５株からｎｉａ− Ｇ１１．１７４株を識別するのを
可能にする。前者は、低く平らで糸状の表現型を有するが、後者は密集性かつ気
生性である。
【００５５】 ３．１ ｐＮｉ１６０プラスミドでの形質転換 Ｇ１１．１７４株のプロトプラストを、ｐＮｉ１６０プラスミド（インパラ１
６０を導入するもの）と、ハイグロマイシン耐性を付与するｐＣＢ１１７９プラ
スミド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）とで同時形質転換した。該形質転換方
法はＳｗｅｉｇａｒｄら，１９９２に記載されており、４単位のＢａｍＨＩ酵素
（ＲＥＭＩ：制限酵素媒介組込み；Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９８）および１μ
ｇの各プラスミドの存在下で行なった。該プロトプラストは、グルコースがスク
ロース（４００μｇ．１−１）で置換され２４０μｇ．１−１の比率のハイグロ
マイシンで補足されたＴＮＫＹＥ培地上で選択される。該同時形質転換体を選択
するために、この抗生物質に耐性なコロニーを、それらのゲノムＤＮＡの抽出後
、インパラトランスポゾンに特異的であり５７３ｂｐの増幅産物を与えるＳＰＥ
５（５’ＡＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧ３’）およびＳＰＥ３（５
’ＴＣＣＧＧＧＣＣＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧ３’）プライマーを使用する増幅
により分析した。該同時形質転換体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＡＮ３０１
中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片（２．７ｋｂプロー
ブ）をプローブとして使用するサザンブロット（図３）で分析した（Ｍａｌａｒ
ｄｉｅｒら，１９８９）。この研究は、ｐＮｉ１６０を介して導入されたアスペ
ルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の
実質的にすべてのｎｉａ遺伝子に相当する少なくとも１つの４ｋｂバンドを有す
る３５個の形質転換体の選択を可能にした。これらの同時形質転換体を、米粉に
基づく固形培地上で１０〜１４日培養し、該胞子を水中に収穫した。計数後、そ
れらを、ディッシュ当たり胞子１０５〜１０６個の比率でＭＮＯ３寒天培地上に
播いた。ｎｉａ＋復帰形質転換体を選択するためのこの工程を再現する実験を行
なった。こうして、本発明者らは、野生型（Ｇ１１．２５）胞子１０個をｎｉａ
− Ｇ１１．１７４突然変異体の胞子１０６と混合し２６℃で１４日間インキュ
ベートした場合に、該ＭＮＯ３培地がｎｉａ＋コロニーの検出を可能にすること
を観察した。２６℃で１ヵ月培養した後、１個の同時形質転換体（同時形質転換
体Ｃ１４）だけが、気生性表現型を有する２個のコロニー（Ｃ１４−１およびＣ
１４−２）を得ることを可能にした。これらの復帰突然変異体コロニーを回収し
、ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター内のインパラ１６０挿入部位を囲むＣ１（５’
ＣＧＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＴ３’）およびｎｉａＸ（５’ＣＴＡＧＡ
ＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＧ３’）プライマーを使用するＰＣＲにより分析した
。２００ｂｐの産物の増幅は、該トランスポゾンの切除が生じた核の存在を示し
ている。均一なコロニーを得るために、Ｃ１４−１およびＣ１４−２復帰突然変
異体の分生子を双眼顕微鏡下で単離し、別々に培養した。インパラのＯＲＦに相
当するプローブを使用したサザンブロットによるその分析により、それらの２つ
の復帰突然変異体における該因子の再挿入が示されうる（図４）。ｐＧＥＭ−Ｔ
イージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に２００ｂｐのＰＣＲ産物をクローニン
グした後、該トランスポゾンの切除により残されたフットプリントを配列決定し
た。Ｃ１４−１復帰突然変異体のフットプリントはＣＴＧＴＡであり、Ｃ１４−
２のフットプリントはＣＡＧＴＡである。これらのフットプリントは、フザリウ
ム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においてインパ
ラが切除された場合にごく一般的に残されるフットプリント（Ｌａｎｇｉｎら，
１９９５）と同一である。ＭＮＯ３寒天培地上での培養においては、これらの復
帰突然変異体は、Ｇ１１．１７４株とＧ１１．２５株との間の中間的な表現型を
有し、このことは、ｐＮｉ１６０構築物中に存在するｎｉａＤ遺伝子がＧ１１．
１７４株の突然変異の最適な相補を許容しないことを示唆している。この仮定を
試験するために、この株由来のプロトプラストを、ｐＣＢ１１７９（３μｇ）の
存在下および１．３ｋｂのプロモーターの制御下でｎｉａＤ遺伝子を含有するｐ
ＡＮ３０１ΔＮｄｅＩ（３μｇ）ベクターまたはｐＡＮ３０１（３μｇ）ベクタ
ーで形質転換した。グルコースがスクロース（４００μｇ．ｌ−１）で置換され
ハイグロマイシン（２４０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＭＮＯ３培地上で該プ
ロトプラストをプレーティングし、３０℃で１０日間インキュベートした後、ｎ
ｉａ＋表現型を有するコロニーが出現する。一方、０．３ｋｂのプロモーター断
片の制御下（ｐＮｉ１６０の場合と同様）でｎｉａＤ遺伝子を含有するｐ１１Δ
ＮｄｅＩベクターを使用した場合には、相補性は認められなかった。
６０を導入するもの）と、ハイグロマイシン耐性を付与するｐＣＢ１１７９プラ
スミド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）とで同時形質転換した。該形質転換方
法はＳｗｅｉｇａｒｄら，１９９２に記載されており、４単位のＢａｍＨＩ酵素
（ＲＥＭＩ：制限酵素媒介組込み；Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９８）および１μ
ｇの各プラスミドの存在下で行なった。該プロトプラストは、グルコースがスク
ロース（４００μｇ．１−１）で置換され２４０μｇ．１−１の比率のハイグロ
マイシンで補足されたＴＮＫＹＥ培地上で選択される。該同時形質転換体を選択
するために、この抗生物質に耐性なコロニーを、それらのゲノムＤＮＡの抽出後
、インパラトランスポゾンに特異的であり５７３ｂｐの増幅産物を与えるＳＰＥ
５（５’ＡＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧ３’）およびＳＰＥ３（５
’ＴＣＣＧＧＧＣＣＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧ３’）プライマーを使用する増幅
により分析した。該同時形質転換体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＡＮ３０１
中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片（２．７ｋｂプロー
ブ）をプローブとして使用するサザンブロット（図３）で分析した（Ｍａｌａｒ
ｄｉｅｒら，１９８９）。この研究は、ｐＮｉ１６０を介して導入されたアスペ
ルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の
実質的にすべてのｎｉａ遺伝子に相当する少なくとも１つの４ｋｂバンドを有す
る３５個の形質転換体の選択を可能にした。これらの同時形質転換体を、米粉に
基づく固形培地上で１０〜１４日培養し、該胞子を水中に収穫した。計数後、そ
れらを、ディッシュ当たり胞子１０５〜１０６個の比率でＭＮＯ３寒天培地上に
播いた。ｎｉａ＋復帰形質転換体を選択するためのこの工程を再現する実験を行
なった。こうして、本発明者らは、野生型（Ｇ１１．２５）胞子１０個をｎｉａ
− Ｇ１１．１７４突然変異体の胞子１０６と混合し２６℃で１４日間インキュ
ベートした場合に、該ＭＮＯ３培地がｎｉａ＋コロニーの検出を可能にすること
を観察した。２６℃で１ヵ月培養した後、１個の同時形質転換体（同時形質転換
体Ｃ１４）だけが、気生性表現型を有する２個のコロニー（Ｃ１４−１およびＣ
１４−２）を得ることを可能にした。これらの復帰突然変異体コロニーを回収し
、ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター内のインパラ１６０挿入部位を囲むＣ１（５’
ＣＧＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＴ３’）およびｎｉａＸ（５’ＣＴＡＧＡ
ＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＧ３’）プライマーを使用するＰＣＲにより分析した
。２００ｂｐの産物の増幅は、該トランスポゾンの切除が生じた核の存在を示し
ている。均一なコロニーを得るために、Ｃ１４−１およびＣ１４−２復帰突然変
異体の分生子を双眼顕微鏡下で単離し、別々に培養した。インパラのＯＲＦに相
当するプローブを使用したサザンブロットによるその分析により、それらの２つ
の復帰突然変異体における該因子の再挿入が示されうる（図４）。ｐＧＥＭ−Ｔ
イージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に２００ｂｐのＰＣＲ産物をクローニン
グした後、該トランスポゾンの切除により残されたフットプリントを配列決定し
た。Ｃ１４−１復帰突然変異体のフットプリントはＣＴＧＴＡであり、Ｃ１４−
２のフットプリントはＣＡＧＴＡである。これらのフットプリントは、フザリウ
ム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においてインパ
ラが切除された場合にごく一般的に残されるフットプリント（Ｌａｎｇｉｎら，
１９９５）と同一である。ＭＮＯ３寒天培地上での培養においては、これらの復
帰突然変異体は、Ｇ１１．１７４株とＧ１１．２５株との間の中間的な表現型を
有し、このことは、ｐＮｉ１６０構築物中に存在するｎｉａＤ遺伝子がＧ１１．
１７４株の突然変異の最適な相補を許容しないことを示唆している。この仮定を
試験するために、この株由来のプロトプラストを、ｐＣＢ１１７９（３μｇ）の
存在下および１．３ｋｂのプロモーターの制御下でｎｉａＤ遺伝子を含有するｐ
ＡＮ３０１ΔＮｄｅＩ（３μｇ）ベクターまたはｐＡＮ３０１（３μｇ）ベクタ
ーで形質転換した。グルコースがスクロース（４００μｇ．ｌ−１）で置換され
ハイグロマイシン（２４０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＭＮＯ３培地上で該プ
ロトプラストをプレーティングし、３０℃で１０日間インキュベートした後、ｎ
ｉａ＋表現型を有するコロニーが出現する。一方、０．３ｋｂのプロモーター断
片の制御下（ｐＮｉ１６０の場合と同様）でｎｉａＤ遺伝子を含有するｐ１１Δ
ＮｄｅＩベクターを使用した場合には、相補性は認められなかった。
【００５６】 これらの実験は、ｐＮｉ１６０中に存在するトランケート化プロモーターがＧ
１１．１７４株の突然変異を相補しえないことを示している。この構築物での２
つの復帰突然変異体（Ｃ１４−１およびＣ１４−２）の選択は、該０．３ｋｂ
プロモーター断片の固有活性によるものではなく、Ｃ１４同時形質転換体におい
ては、アクチベーター配列から利益が得られる領域内にｎｉａＤ遺伝子が挿入さ
れたと考えられるのではないかと説明されうる。このことは、マグナポルセ・グ
リセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のゲノム内のアクチベーター
領域を検出するためにｐ１１ΔＮｄｅＩを使用しうることを示唆している。
１１．１７４株の突然変異を相補しえないことを示している。この構築物での２
つの復帰突然変異体（Ｃ１４−１およびＣ１４−２）の選択は、該０．３ｋｂ
プロモーター断片の固有活性によるものではなく、Ｃ１４同時形質転換体におい
ては、アクチベーター配列から利益が得られる領域内にｎｉａＤ遺伝子が挿入さ
れたと考えられるのではないかと説明されうる。このことは、マグナポルセ・グ
リセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のゲノム内のアクチベーター
領域を検出するためにｐ１１ΔＮｄｅＩを使用しうることを示唆している。
【００５７】 ３．２ ｐＮｉＬ１６０（本発明のもの）での形質転換 Ｇ１１．１７４株由来のプロトプラストを、４０単位のＮｄｅＩ酵素の存在下
、１．３ｋｂの全プロモーターの制御下でｎｉａＤ遺伝子を含有する新規構築物
ｐＮｉＬ１６０（１μｇ）およびｐＣＢ１１７９（１μｇ）で同時形質転換した
。該同時形質転換体を、ＳＰＥ５およびＳＰＥ３プライマーを使用する増幅によ
りスクリーニングし、ついで米培地上に播いて分生子を得た。復帰突然変異体を
同定するために、後者をＭＮＯ３培地（ディッシュ当たり胞子約１０５〜１０６ 個）上でプレーティングした。１９個の同時形質転換体に関して行なった実験は
、それらの場合の１００％において復帰突然変異体を得ることを可能にした。い
くつかは、２６℃で１０日の培養から生じた。復帰突然変異体の数は、考慮され
る同時形質転換体に応じて２〜８３の様々な数となる。８個の異なる同時形質転
換体に属する５３個の復帰突然変異体を、インパラの全コード領域に相当するプ
ローブを使用するサザンブロットにより分析した。図５は、９個の無作為に選ば
れた復帰突然変異体におけるインパラトランスポゾンの移動度を示す。この実験
から得られたエム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）におけるインパラ再挿入の割
合（％）は７４％に達する。これらの再挿入体のうち、それらの９５％は異なる
。より詳しくは、再挿入体のすべてが異なる１００％の再挿入を与える同時形質
転換体を同定した。
、１．３ｋｂの全プロモーターの制御下でｎｉａＤ遺伝子を含有する新規構築物
ｐＮｉＬ１６０（１μｇ）およびｐＣＢ１１７９（１μｇ）で同時形質転換した
。該同時形質転換体を、ＳＰＥ５およびＳＰＥ３プライマーを使用する増幅によ
りスクリーニングし、ついで米培地上に播いて分生子を得た。復帰突然変異体を
同定するために、後者をＭＮＯ３培地（ディッシュ当たり胞子約１０５〜１０６ 個）上でプレーティングした。１９個の同時形質転換体に関して行なった実験は
、それらの場合の１００％において復帰突然変異体を得ることを可能にした。い
くつかは、２６℃で１０日の培養から生じた。復帰突然変異体の数は、考慮され
る同時形質転換体に応じて２〜８３の様々な数となる。８個の異なる同時形質転
換体に属する５３個の復帰突然変異体を、インパラの全コード領域に相当するプ
ローブを使用するサザンブロットにより分析した。図５は、９個の無作為に選ば
れた復帰突然変異体におけるインパラトランスポゾンの移動度を示す。この実験
から得られたエム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）におけるインパラ再挿入の割
合（％）は７４％に達する。これらの再挿入体のうち、それらの９５％は異なる
。より詳しくは、再挿入体のすべてが異なる１００％の再挿入を与える同時形質
転換体を同定した。
【００５８】 これらの結果は、ｐＮｉＬ１６０構築物が、ｐＮｉ１６０とは異なり、該トラ
ンスポゾンの新規挿入を有する多数の復帰突然変異体がマグナポルセ・グリセア
（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において選択されることを可能にす
ることを示している。
ンスポゾンの新規挿入を有する多数の復帰突然変異体がマグナポルセ・グリセア
（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において選択されることを可能にす
ることを示している。
【００５９】 実施例ＩＩ マグナポルセ・グリセアにおける挿入突然変異体の製造 ｐＮＬｉ１６０プラスミドの単一のコピーを保持する同時形質転換体６（ＣＴ
ＲＦ６）から得られた１８個のｎｉａ＋復帰突然変異体のサザンブロット分析は
、それらの１００％が、該ゲノム内に再挿入されたインパラを有することを示し
た。３５０個のｎｉａ＋復帰突然変異体のコレクションを得るために、この同時
形質転換体を選択した。該同時形質転換体を米培地上で１４日間培養する。該胞
子を、ペトリ皿当たり３ｍｌの蒸留水中に収穫し、菌糸残渣の除去のために半融
ガラス上で濾過して、ディッシュ（１２×１２ｃｍの形態）当たり胞子１０６個
の比率でＮａＮＯ３培地上にプレーティングする。該ディッシュを２６℃でイン
キュベートする。１６〜２１日後にｎｉａ＋復帰突然変異体が出現する。それら
をＮａＮＯ３培地上で継代培養し、１４日間培養し、該胞子を寒天−水培地（Ｈ
２０中の２％アガロース）上にプレーティングする。２６℃で８時間後、各復帰
突然変異体からの１個の胞子を個々にＮａＮＯ３培地上で継代培養して、該復帰
突然変異体を精製し、そのｎｉａ＋表現型を確認する。
ＲＦ６）から得られた１８個のｎｉａ＋復帰突然変異体のサザンブロット分析は
、それらの１００％が、該ゲノム内に再挿入されたインパラを有することを示し
た。３５０個のｎｉａ＋復帰突然変異体のコレクションを得るために、この同時
形質転換体を選択した。該同時形質転換体を米培地上で１４日間培養する。該胞
子を、ペトリ皿当たり３ｍｌの蒸留水中に収穫し、菌糸残渣の除去のために半融
ガラス上で濾過して、ディッシュ（１２×１２ｃｍの形態）当たり胞子１０６個
の比率でＮａＮＯ３培地上にプレーティングする。該ディッシュを２６℃でイン
キュベートする。１６〜２１日後にｎｉａ＋復帰突然変異体が出現する。それら
をＮａＮＯ３培地上で継代培養し、１４日間培養し、該胞子を寒天−水培地（Ｈ
２０中の２％アガロース）上にプレーティングする。２６℃で８時間後、各復帰
突然変異体からの１個の胞子を個々にＮａＮＯ３培地上で継代培養して、該復帰
突然変異体を精製し、そのｎｉａ＋表現型を確認する。
【００６０】 実施例ＩＩＩ インパラトランスポゾンを保持する挿入突然変異体の特徴づけ ＣＴＲＦ６から生成した３５０個の復帰突然変異体の観察は、ＣＴＲＦ６ほど
には有意でない成長および該同時形質転換体の灰色とは異なる暗褐色を米培地お
よびＮａＮＯ３培地上で示す復帰突然変異体（Ｒｅｖ２）の検出を可能にした。
インパラ挿入に隣接する配列を特徴づけるために、３μｇのＲｅｖ２ゲノムＤＮ
ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、逆ＰＣＲにより分析した。消化後、該ＤＮＡをフ
ェノール／クロロホルム抽出工程に付し、ついで７．５Ｍ酢酸アンモニウムで沈
殿させる。このようにして得られたペレットを４０μｌのＭｉｌｌｉＱ水中に採
取する。８μｌの消化ＤＮＡ上で連結を行ない、該ＤＮＡを、前記のとおりに、
フェノール／クロロホルム抽出に付し、７．５Ｍ酢酸アンモニウムで沈殿させる
。該ＤＮＡを１０μｌ中に採取し、それらのすべてを、インパラトランスポゾン
の配列上で選択される及び発散的に位置するＩｍｐＥ５’（５’ＧＧＣＡＴＴＧ
ＡＡＡＡＣＧＣＧＧＴＣＣＣ３’）およびＩｍｐＥ３’（５’ＣＡＧＣＡＧＣＡ
ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣ３’）プライマーを使用するＰＣＲ工程に使用する。
該ＩＰＣＲ産物の配列決定は、オープンリーディングフレーム内の重複したＴＡ
ジヌクレオチドにおいて該トランスポゾンが挿入されうことを示すことを可能に
した。ｔｂｌａｓｔｘプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）を使用して
データバンクを調べることにより、この突然変異配列とＤＮＡ修復に関与するタ
ンパク質ファミリーとの間で、さらに詳しくは、サッカロミセス・セレビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭＬＨ１タンパク質（
Ｐｒｏｌｌａら，１９９４）に対して、非常に強い相同性が示された。
には有意でない成長および該同時形質転換体の灰色とは異なる暗褐色を米培地お
よびＮａＮＯ３培地上で示す復帰突然変異体（Ｒｅｖ２）の検出を可能にした。
インパラ挿入に隣接する配列を特徴づけるために、３μｇのＲｅｖ２ゲノムＤＮ
ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、逆ＰＣＲにより分析した。消化後、該ＤＮＡをフ
ェノール／クロロホルム抽出工程に付し、ついで７．５Ｍ酢酸アンモニウムで沈
殿させる。このようにして得られたペレットを４０μｌのＭｉｌｌｉＱ水中に採
取する。８μｌの消化ＤＮＡ上で連結を行ない、該ＤＮＡを、前記のとおりに、
フェノール／クロロホルム抽出に付し、７．５Ｍ酢酸アンモニウムで沈殿させる
。該ＤＮＡを１０μｌ中に採取し、それらのすべてを、インパラトランスポゾン
の配列上で選択される及び発散的に位置するＩｍｐＥ５’（５’ＧＧＣＡＴＴＧ
ＡＡＡＡＣＧＣＧＧＴＣＣＣ３’）およびＩｍｐＥ３’（５’ＣＡＧＣＡＧＣＡ
ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣ３’）プライマーを使用するＰＣＲ工程に使用する。
該ＩＰＣＲ産物の配列決定は、オープンリーディングフレーム内の重複したＴＡ
ジヌクレオチドにおいて該トランスポゾンが挿入されうことを示すことを可能に
した。ｔｂｌａｓｔｘプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）を使用して
データバンクを調べることにより、この突然変異配列とＤＮＡ修復に関与するタ
ンパク質ファミリーとの間で、さらに詳しくは、サッカロミセス・セレビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭＬＨ１タンパク質（
Ｐｒｏｌｌａら，１９９４）に対して、非常に強い相同性が示された。
【００６１】 それと平行して、病原性突然変異体に関して探索するために、該コレクション
の３５０個の復帰突然変異体を米葉および大麦葉上で試験した。該復帰突然変異
体を米培地上で１４日間培養する。生成した胞子を、３ｍｌの水の存在下、菌糸
を擦り取ることにより収穫し、ついでＴｈｏｍａｓセル下で計数する。該胞子懸
濁液を１０５胞子／ｍｌにまで調節し、キネチン（エタノール中の２ｍｇ／ｍｌ
のストック溶液の１ｍｌ／ｌ）で補足された寒天培地（１％寒天）上に生存条件
中で配置された数片の米（品種Ｓａｒｉｃｅｌｔｉｋ）の葉および大麦（品種Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ）の葉上に、原綿の芽（ｃｏｔｔｏｎ ｗｏｏｌ ｂｕｄ）を使用
して塗布する。２６℃で４日間インキュベートした後、該徴候を、野生型Ｇ１１
．１７４株で生じた徴候と比較する。復帰突然変異体７７は非病原性であること
が判明した。この突然変異体中のインパラ挿入に隣接した配列を、ＢａｍＨＩで
の該ゲノムＤＮＡの消化の後、前記の条件下、逆ＰＣＲにより回収した。回収さ
れた産物は、この場合もまた、オープンリーディングフレーム内に位置する重複
したＴＡジヌクレオチドにおける該トランスポゾンの挿入を証明した。この産物
の配列で該データバンクを調べたところ、有意な相同性は示されなかった。この
産物を使用して、エム・グリセエア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）コスミドライブラリー
をプローブした。該増幅産物にハイブリダイズするコスミドをクローニングし、
マッピングし、部分的に配列決定した。したがって、考慮するリーディングフレ
ームに応じて２つの潜在的ＯＲＦ（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）内にインパラトラ
ンスポゾンは挿入されるらしい（図６）。このコスミドのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断
片を、ビアロフォス耐性を付与するＢａｒ遺伝子を保持するｐＣＢ１５３１ベク
ター（ｐＣＢ１５３１＊ベクター）（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）内にサブ
クローニングした。Ｒｅｖ７７プロトプラストを得、３μｇのｐＣＢ１５３１＊ プラスミドまたは対照としての３μｇのｐＣＢ１５３１プラスミドで形質転換し
、ビアロフォス（３０〜４０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＴＮＫＹＥショ糖（
４００ｇ．１−１）培地上に配置した。該耐性コロニーを、ビアラフォス（３０
μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＴＮＫＹＥグルコース上で培養し、米培地上で１
４日間、胞子形成させる。該胞子を収穫し、該懸濁液を胞子１０５個．ｍｌ−１ で補正し、ついで、前記のとおりにそれらの病原性に関して試験する。予想どお
り、ｐＣＢ１５３１を保持する形質転換体は、Ｒｅｖ７７と同様に、非病原性の
ままであり、一方、ｐＣＢ１５３１＊を保持するコロニーは再び病原性となる。
これらの結果は、インパラトランスポゾンが、エム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅ
ａ）の感染力に関与する遺伝子を標識することを可能にしたことを示している。
の３５０個の復帰突然変異体を米葉および大麦葉上で試験した。該復帰突然変異
体を米培地上で１４日間培養する。生成した胞子を、３ｍｌの水の存在下、菌糸
を擦り取ることにより収穫し、ついでＴｈｏｍａｓセル下で計数する。該胞子懸
濁液を１０５胞子／ｍｌにまで調節し、キネチン（エタノール中の２ｍｇ／ｍｌ
のストック溶液の１ｍｌ／ｌ）で補足された寒天培地（１％寒天）上に生存条件
中で配置された数片の米（品種Ｓａｒｉｃｅｌｔｉｋ）の葉および大麦（品種Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ）の葉上に、原綿の芽（ｃｏｔｔｏｎ ｗｏｏｌ ｂｕｄ）を使用
して塗布する。２６℃で４日間インキュベートした後、該徴候を、野生型Ｇ１１
．１７４株で生じた徴候と比較する。復帰突然変異体７７は非病原性であること
が判明した。この突然変異体中のインパラ挿入に隣接した配列を、ＢａｍＨＩで
の該ゲノムＤＮＡの消化の後、前記の条件下、逆ＰＣＲにより回収した。回収さ
れた産物は、この場合もまた、オープンリーディングフレーム内に位置する重複
したＴＡジヌクレオチドにおける該トランスポゾンの挿入を証明した。この産物
の配列で該データバンクを調べたところ、有意な相同性は示されなかった。この
産物を使用して、エム・グリセエア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）コスミドライブラリー
をプローブした。該増幅産物にハイブリダイズするコスミドをクローニングし、
マッピングし、部分的に配列決定した。したがって、考慮するリーディングフレ
ームに応じて２つの潜在的ＯＲＦ（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）内にインパラトラ
ンスポゾンは挿入されるらしい（図６）。このコスミドのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断
片を、ビアロフォス耐性を付与するＢａｒ遺伝子を保持するｐＣＢ１５３１ベク
ター（ｐＣＢ１５３１＊ベクター）（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）内にサブ
クローニングした。Ｒｅｖ７７プロトプラストを得、３μｇのｐＣＢ１５３１＊ プラスミドまたは対照としての３μｇのｐＣＢ１５３１プラスミドで形質転換し
、ビアロフォス（３０〜４０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＴＮＫＹＥショ糖（
４００ｇ．１−１）培地上に配置した。該耐性コロニーを、ビアラフォス（３０
μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＴＮＫＹＥグルコース上で培養し、米培地上で１
４日間、胞子形成させる。該胞子を収穫し、該懸濁液を胞子１０５個．ｍｌ−１ で補正し、ついで、前記のとおりにそれらの病原性に関して試験する。予想どお
り、ｐＣＢ１５３１を保持する形質転換体は、Ｒｅｖ７７と同様に、非病原性の
ままであり、一方、ｐＣＢ１５３１＊を保持するコロニーは再び病原性となる。
これらの結果は、インパラトランスポゾンが、エム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅ
ａ）の感染力に関与する遺伝子を標識することを可能にしたことを示している。
【００６２】 実施例ＩＶ ｇｐｄ遺伝子のプロモーター内へのインパラトランスポゾンの組込み ハイグロマイシンに対する耐性に関する遺伝子（ｈｐｈ）の発現を制御するプ
ロモーター内へのインパラのクローニングを可能にするプラスミドを構築した。
ｐＡＮ７．１ベクター（Ｐｕｎｔら，１９８７）のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
二重消化は、ｇｐｄ遺伝子のその１３７塩基対から欠失したプロモーターおよび
ＴｒｐＣ遺伝子のターミネーターおよびｈｐｈ遺伝子のコード領域をコードする
全ＯＲＦを含有する３９８８ｂｐ断片の遊離を可能にする。この断片の付着末端
を、ＤＮＡポリメラーゼの作用により平滑末端内に形質転換した。ついでこの断
片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−プラスミドに由来し複製起点およびアン
ピシリン耐性遺伝子を保持する２．５ｋｂのＰｖｕＩＩ断片に連結した。それか
ら得られたプラスミドは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ
ｇｒｉｓｅａ）において、ハイグロマイシン耐性形質転換体を得ることを可能に
する。ｐＣＩＴｎ（図７）として公知のこのベクターは、インパラまたは他の任
意のトランスポゾンがクローニングされうる、転写＋１点の３０ｂｐ上流に位置
する唯一のＰｖｕＩＩ部位を有する。
ロモーター内へのインパラのクローニングを可能にするプラスミドを構築した。
ｐＡＮ７．１ベクター（Ｐｕｎｔら，１９８７）のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
二重消化は、ｇｐｄ遺伝子のその１３７塩基対から欠失したプロモーターおよび
ＴｒｐＣ遺伝子のターミネーターおよびｈｐｈ遺伝子のコード領域をコードする
全ＯＲＦを含有する３９８８ｂｐ断片の遊離を可能にする。この断片の付着末端
を、ＤＮＡポリメラーゼの作用により平滑末端内に形質転換した。ついでこの断
片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−プラスミドに由来し複製起点およびアン
ピシリン耐性遺伝子を保持する２．５ｋｂのＰｖｕＩＩ断片に連結した。それか
ら得られたプラスミドは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ
ｇｒｉｓｅａ）において、ハイグロマイシン耐性形質転換体を得ることを可能に
する。ｐＣＩＴｎ（図７）として公知のこのベクターは、インパラまたは他の任
意のトランスポゾンがクローニングされうる、転写＋１点の３０ｂｐ上流に位置
する唯一のＰｖｕＩＩ部位を有する。
【００６３】 実施例Ｖ 自律的および標識コピーでの挿入突然変異誘発 インパラトランスポゾンが再挿入された復帰突然変異体を表現型スクリーニン
グにより選択するのを可能にする自律的因子を得るために、トランスポザーゼを
コードするリーディングフレームの終結コドンの下流の該因子の２つのＩＴＲの
間にハイグロマイシン耐性遺伝子をクローニングした。これを行なうために、該
ハイグロマイシン耐性カセットを、ＳａｌＩ消化によりｐＣＢ１００４プラスミ
ド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）から回収し、該末端をクレノウでの処理に
より平滑化した。このカセットを、ＮｈｅＩ部位で線状化されクレノウで処理さ
れたｐＮｉ１６０プラスミドに連結する。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよ
びＡｐａＩ酵素で消化する。修飾されたインパラトランスポゾンを含有する２２
８５ｂｐの断片を回収し、これらの同じ酵素で消化されたｐＡＮ３０１ΔＮｄｅ
Ｉの７３９７ｂｐの断片に連結する。これは、ｎｉａＤの転写の方向（ｐＮｉＨ
ＹＧプラスミド）または逆方向（ｐＮｉＧＹＨプラスミド）に挿入された、ハイ
グロマイシン耐性カセットで標識されたインパラトランスポゾンが硝酸レダクタ
ーゼ開始コドンの８ｂｐ上流に挿入された１．３ｋｂ長のｎｉａＤプロモーター
を保持する９６８２ｂｐのプラスミドを与える。
グにより選択するのを可能にする自律的因子を得るために、トランスポザーゼを
コードするリーディングフレームの終結コドンの下流の該因子の２つのＩＴＲの
間にハイグロマイシン耐性遺伝子をクローニングした。これを行なうために、該
ハイグロマイシン耐性カセットを、ＳａｌＩ消化によりｐＣＢ１００４プラスミ
ド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）から回収し、該末端をクレノウでの処理に
より平滑化した。このカセットを、ＮｈｅＩ部位で線状化されクレノウで処理さ
れたｐＮｉ１６０プラスミドに連結する。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよ
びＡｐａＩ酵素で消化する。修飾されたインパラトランスポゾンを含有する２２
８５ｂｐの断片を回収し、これらの同じ酵素で消化されたｐＡＮ３０１ΔＮｄｅ
Ｉの７３９７ｂｐの断片に連結する。これは、ｎｉａＤの転写の方向（ｐＮｉＨ
ＹＧプラスミド）または逆方向（ｐＮｉＧＹＨプラスミド）に挿入された、ハイ
グロマイシン耐性カセットで標識されたインパラトランスポゾンが硝酸レダクタ
ーゼ開始コドンの８ｂｐ上流に挿入された１．３ｋｂ長のｎｉａＤプロモーター
を保持する９６８２ｂｐのプラスミドを与える。
【００６４】 エム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）のＧ１１．１７４株由来のプロトプラス
トを３μｇのｐＮｉＨＹＧプラスミドまたは３μｇのｐＮｉＧＹＨプラスミドで
形質転換した。これらの形質転換体について、既に記載されている条件下でｎｉ
ａ＋復帰突然変異体の選択を行なった。サザンブロットによる同じ同時形質転換
体の３個のｎｉａ＋復帰突然変異体の分析は、このようにして標識されたインパ
ラトランスポゾンが自律性のままであること、すなわち、それが、ｎｉａＤ遺伝
子から独立して存在し該ゲノム内に再挿入されうることを示している（図８）。
トを３μｇのｐＮｉＨＹＧプラスミドまたは３μｇのｐＮｉＧＹＨプラスミドで
形質転換した。これらの形質転換体について、既に記載されている条件下でｎｉ
ａ＋復帰突然変異体の選択を行なった。サザンブロットによる同じ同時形質転換
体の３個のｎｉａ＋復帰突然変異体の分析は、このようにして標識されたインパ
ラトランスポゾンが自律性のままであること、すなわち、それが、ｎｉａＤ遺伝
子から独立して存在し該ゲノム内に再挿入されうることを示している（図８）。
【００６５】 実施例ＶＩ インパラの欠損および可動性コピーでの挿入突然変異誘発 ２成分突然変異誘発系を利用するためには、該転位性因子がトランスで活性化
されうることを示すことが必要である。このためには、まず、該トランスポザー
ゼを構成的プロモーターの制御下に配置する。ついで、該欠損因子の安定化は、
構成的プロモーターまたはそれ自体のプロモーターの制御下でトランスポザーゼ
を保持する複製型プラスミドまたはトランスポザーゼの発現を制御する誘導プロ
モーターの使用を要する。硝酸レダクターゼをコードするマグナポルセ・グリセ
ア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）遺伝子のプロモーターの、誘導プ
ロモーターとしての使用が特に示されているようである。ＬａｕおよびＨａｍｅ
ｒ（１９９６）は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉ
ｓｅａ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子を含有するクローンに相当するプローブ
を使用するノーザンハイブリダイゼーションにより、それが、唯一の窒素源とし
ての硝酸塩の存在下では発現され、一方、それがグルタミンの存在下では完全に
抑制されることを示している。マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈ
ｅ ｇｒｉｓｅａ）由来のｎｉａ遺伝子のプロモーターの制御下にインパラトラ
ンスポザーゼを配置することにより、該酵素が合成され、ついで、該欠損因子が
、該復帰突然変異体の選択のための条件下（ＭＮＯ３培地）で切除され、豊富な
培地（アンモニウムまたはグルタミンの存在下）上でそれを培養した場合に該復
帰突然変異体が得られたら、その産生が抑制されうるはずである。
されうることを示すことが必要である。このためには、まず、該トランスポザー
ゼを構成的プロモーターの制御下に配置する。ついで、該欠損因子の安定化は、
構成的プロモーターまたはそれ自体のプロモーターの制御下でトランスポザーゼ
を保持する複製型プラスミドまたはトランスポザーゼの発現を制御する誘導プロ
モーターの使用を要する。硝酸レダクターゼをコードするマグナポルセ・グリセ
ア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）遺伝子のプロモーターの、誘導プ
ロモーターとしての使用が特に示されているようである。ＬａｕおよびＨａｍｅ
ｒ（１９９６）は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉ
ｓｅａ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子を含有するクローンに相当するプローブ
を使用するノーザンハイブリダイゼーションにより、それが、唯一の窒素源とし
ての硝酸塩の存在下では発現され、一方、それがグルタミンの存在下では完全に
抑制されることを示している。マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈ
ｅ ｇｒｉｓｅａ）由来のｎｉａ遺伝子のプロモーターの制御下にインパラトラ
ンスポザーゼを配置することにより、該酵素が合成され、ついで、該欠損因子が
、該復帰突然変異体の選択のための条件下（ＭＮＯ３培地）で切除され、豊富な
培地（アンモニウムまたはグルタミンの存在下）上でそれを培養した場合に該復
帰突然変異体が得られたら、その産生が抑制されうるはずである。
【００６６】 １．入手可能な構築物 ｐＨＩＮプラスミドはｐＮｉ１６０から誘導される。そのプラスミドにおいて
は、インパラ因子にコードされたトランスポザーゼが、アスペルギルス・ニデュ
ランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＴｒｐＣ遺伝子の
制御下のハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ遺伝子）で置換されている。その
構築はＨｕａ−Ｖａｎ，１９９８に記載されている。該トランスポゾンのＩＴＲ
中のｈｐｈ遺伝子の存在は、得られた復帰突然変異体のゲノム内への該欠損因子
の組込みを保証しうる。
は、インパラ因子にコードされたトランスポザーゼが、アスペルギルス・ニデュ
ランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＴｒｐＣ遺伝子の
制御下のハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ遺伝子）で置換されている。その
構築はＨｕａ−Ｖａｎ，１９９８に記載されている。該トランスポゾンのＩＴＲ
中のｈｐｈ遺伝子の存在は、得られた復帰突然変異体のゲノム内への該欠損因子
の組込みを保証しうる。
【００６７】 ｐＥＯ６プラスミドは、ＮｃｏＩ部位を含有するプライマーを使用するＰＣＲ
により得られたインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦで、β−グルクロ
ニダーゼをコードするＯＲＦを置換した後に、ｐＮＯＭ１０２プラスミドから誘
導される。このプラスミドは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の構成的ｇｐｄプロモーターおよびＴｒｐＣ
ターミネーターの制御下でのトランスポザーゼの発現を可能にする（図１０）。
により得られたインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦで、β−グルクロ
ニダーゼをコードするＯＲＦを置換した後に、ｐＮＯＭ１０２プラスミドから誘
導される。このプラスミドは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の構成的ｇｐｄプロモーターおよびＴｒｐＣ
ターミネーターの制御下でのトランスポザーゼの発現を可能にする（図１０）。
【００６８】 ２．調製する構築物 ｐＨＮｉＬプラスミドはｐＨＩＮプラスミドから誘導される。それは、ｈｐｈ
で標識された欠損インパラコピーを導入するｐＨＩＮ由来の２．８ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ−ＡｐａＩ断片でｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩの１ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ
断片を置換することにより構築した。ｐＮｉＬ１６０の場合と同様に、硝酸レダ
クターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）は、その１．３ｋｂ長のプロモーターの制御下にあ
る（図１１）。本発明者らの結果によれば、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎ
ａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における硝酸レダクターゼ活性を回復させるこ
とにより該欠損因子の切除を選択するためにはこのプラスミドを構築することが
必要である。
で標識された欠損インパラコピーを導入するｐＨＩＮ由来の２．８ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ−ＡｐａＩ断片でｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩの１ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ
断片を置換することにより構築した。ｐＮｉＬ１６０の場合と同様に、硝酸レダ
クターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）は、その１．３ｋｂ長のプロモーターの制御下にあ
る（図１１）。本発明者らの結果によれば、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎ
ａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における硝酸レダクターゼ活性を回復させるこ
とにより該欠損因子の切除を選択するためにはこのプラスミドを構築することが
必要である。
【００６９】 また、ｐＢＮｉＬプラスミドは、この場合にはＢａｒ遺伝子で標識された欠損
因子を含有する。このベクターを構築するためには、ｎｉａＤ遺伝子の配列に隣
接するインパラトランスポゾンを含有するｐＮｉＬ１６０のＢａｍＨＩ／Ｎｃｏ
Ｉ断片（２４７２ｂｐ）を、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＡｆｌＩＩＩ断片（２２
９８ｂｐ）であって該プラスミドの複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを保持
するものに連結する。インパラトランスポザーゼの一部に対応する８９１ｂｐの
ＸｈｏＩ／ＳｔｙＩ断片をこのプラスミド上で欠失させる。このようにして線
状化された該プラスミドの末端をクレノウで平滑化し、ｐＣＢ１６３５プラスミ
ド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）のＳａｌＩ消化およびクレノウにより得ら
れたビアラフォス耐性遺伝子（Ｔｒｐｃプロモーター：：Ｂａｒ，９４０ｂｐ）
に連結する。それから得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで消化し
、ｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩプラスミドの７３９７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ断
片に連結する。これにより、該トランスポゾンが欠損性でありＢａｒ遺伝子で標
識されておりｎｉａＤ遺伝子のプロモーター（１．３ｋｂ）内に挿入されたｐＢ
ＮｉＬプラスミドが得られる（図１２）。
因子を含有する。このベクターを構築するためには、ｎｉａＤ遺伝子の配列に隣
接するインパラトランスポゾンを含有するｐＮｉＬ１６０のＢａｍＨＩ／Ｎｃｏ
Ｉ断片（２４７２ｂｐ）を、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＡｆｌＩＩＩ断片（２２
９８ｂｐ）であって該プラスミドの複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを保持
するものに連結する。インパラトランスポザーゼの一部に対応する８９１ｂｐの
ＸｈｏＩ／ＳｔｙＩ断片をこのプラスミド上で欠失させる。このようにして線
状化された該プラスミドの末端をクレノウで平滑化し、ｐＣＢ１６３５プラスミ
ド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）のＳａｌＩ消化およびクレノウにより得ら
れたビアラフォス耐性遺伝子（Ｔｒｐｃプロモーター：：Ｂａｒ，９４０ｂｐ）
に連結する。それから得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで消化し
、ｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩプラスミドの７３９７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ断
片に連結する。これにより、該トランスポゾンが欠損性でありＢａｒ遺伝子で標
識されておりｎｉａＤ遺伝子のプロモーター（１．３ｋｂ）内に挿入されたｐＢ
ＮｉＬプラスミドが得られる（図１２）。
【００７０】 ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドはインパラトランスポゾンをその右ＩＴＲ内に保持
しており、それはもはや転位できず該トランスポザーゼ源のままである。該因子
をＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ二重消化によりｐＮｉ１６０プラスミドから切除し、該
末端をクレノウで平滑化し、該断片をｐＦＡＣ１のＢｇｌＩＩ部位においてクロ
ーニングする（図１３）。
しており、それはもはや転位できず該トランスポザーゼ源のままである。該因子
をＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ二重消化によりｐＮｉ１６０プラスミドから切除し、該
末端をクレノウで平滑化し、該断片をｐＦＡＣ１のＢｇｌＩＩ部位においてクロ
ーニングする（図１３）。
【００７１】 ３．マグナポルセ・グリセアにおけるこれらのプラスミドの用途 マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）Ｇ１１．
１７４由来のプロトプラストをｐＨＮｉＬプラスミドで形質転換するか、または
ｐＨＮｉＬおよびｐＥＯ６プラスミドで同時形質転換した。該形質転換方法はＳ
ｗｅｉｇａｒｄら（１９９２）に記載されており、１μｇの各プラスミドで行な
った。該プロトプラストを、グルコースがスクロース（４００μｇ．１−１）で
置換され２４０μｇ．ｍｌ−１の比率でハイグロマイシンで補足されたＴＮＫＹ
Ｅ培地上で選択する。該ｐＨＮｉＬ形質転換体を、該欠損因子中の該耐性マーカ
ーの存在に基づき直接的に選択する。該同時形質転換体を、それらのゲノムＤＮ
Ａの抽出後、ＩＶ．３に記載のＳＰＥ５プライマーを使用する増幅によりハイグ
ロマイシン耐性コロニーから単離する。１２個のハイグロマイシン耐性コロニー
上で行なったこの研究は、ｐＥＯ６を同様に保持する４個のコロニーの単離を可
能にした。米粉に基づく固形培地上での胞子形成後、ＩＶ．３に記載のとおりに
ｎｉａ＋復帰突然変異体を選択するために、これらの同時形質転換体の及びｐＨ
ＮｉＬを保持する６個の形質転換体の胞子（１０５〜１０６個）をＭＮＯ３培地
上でプレーティングした。ｐＨＮｉＬを保持する６個の形質転換体はいずれも、
そのような復帰突然変異体を与えなかった。これは、マグナポルセ・グリセア（
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に内因性のインパラの欠損コピーが、
トランスポゾンにより可動しえないことを示している。それらの４個のｐＨＮｉ
Ｌ／ｐＥＯ６同時形質転換体のうちの２個が気生性コロニーを与える（同時形質
転換体Ｄ１およびＤ９）。Ｄ１同時形質転換体由来の６個の復帰突然変異体のゲ
ノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｈｙｇ１（５’ＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣ
ＣＧＣＧＡＣＧ３’）およびｈｙｇ４（５’ＣＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＡＧ
ＣＴＧＣ３’）プライマーの使用により得られたｈｐｈ遺伝子由来の８６８ｂｐ
のプローブでハイブリダイズさせた後の該復帰突然変異体のサザン分析は、それ
らの４個に関する該欠損因子の再挿入の特徴づけを可能にする（図１４）。後者
のうちの２個の復帰突然変異体は、該因子の２個の挿入を含有する。この分析は
、トランスで与えられたインパラトランスポザーゼにより該欠損因子がマグナポ
ルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において可動されう
ることを示しうる。
１７４由来のプロトプラストをｐＨＮｉＬプラスミドで形質転換するか、または
ｐＨＮｉＬおよびｐＥＯ６プラスミドで同時形質転換した。該形質転換方法はＳ
ｗｅｉｇａｒｄら（１９９２）に記載されており、１μｇの各プラスミドで行な
った。該プロトプラストを、グルコースがスクロース（４００μｇ．１−１）で
置換され２４０μｇ．ｍｌ−１の比率でハイグロマイシンで補足されたＴＮＫＹ
Ｅ培地上で選択する。該ｐＨＮｉＬ形質転換体を、該欠損因子中の該耐性マーカ
ーの存在に基づき直接的に選択する。該同時形質転換体を、それらのゲノムＤＮ
Ａの抽出後、ＩＶ．３に記載のＳＰＥ５プライマーを使用する増幅によりハイグ
ロマイシン耐性コロニーから単離する。１２個のハイグロマイシン耐性コロニー
上で行なったこの研究は、ｐＥＯ６を同様に保持する４個のコロニーの単離を可
能にした。米粉に基づく固形培地上での胞子形成後、ＩＶ．３に記載のとおりに
ｎｉａ＋復帰突然変異体を選択するために、これらの同時形質転換体の及びｐＨ
ＮｉＬを保持する６個の形質転換体の胞子（１０５〜１０６個）をＭＮＯ３培地
上でプレーティングした。ｐＨＮｉＬを保持する６個の形質転換体はいずれも、
そのような復帰突然変異体を与えなかった。これは、マグナポルセ・グリセア（
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に内因性のインパラの欠損コピーが、
トランスポゾンにより可動しえないことを示している。それらの４個のｐＨＮｉ
Ｌ／ｐＥＯ６同時形質転換体のうちの２個が気生性コロニーを与える（同時形質
転換体Ｄ１およびＤ９）。Ｄ１同時形質転換体由来の６個の復帰突然変異体のゲ
ノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｈｙｇ１（５’ＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣ
ＣＧＣＧＡＣＧ３’）およびｈｙｇ４（５’ＣＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＡＧ
ＣＴＧＣ３’）プライマーの使用により得られたｈｐｈ遺伝子由来の８６８ｂｐ
のプローブでハイブリダイズさせた後の該復帰突然変異体のサザン分析は、それ
らの４個に関する該欠損因子の再挿入の特徴づけを可能にする（図１４）。後者
のうちの２個の復帰突然変異体は、該因子の２個の挿入を含有する。この分析は
、トランスで与えられたインパラトランスポザーゼにより該欠損因子がマグナポ
ルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において可動されう
ることを示しうる。
【００７２】 ４．他の構築物 第１に、それは、インパラトランスポザーゼが、マグナポルセ・グリセア（Ｍ
ａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）においてクローニングされたｎｉａ遺伝
子のプロモーターの制御下にあるプラスミド（ｐＮｉａＩ）を構築することを含
む。このプラスミドは、ｐＨＩＮＬと共に又はそれに由来する他の任意のプラス
ミド（該欠損因子の挿入により不活性化されたアスペルギルス・ニデュランス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤプロモーターが、
該復帰突然変異体の選択に使用するマーカー遺伝子の発現を制御するもの）と共
に使用される。該同時形質転換体の選択を促進するために、該因子の欠損コピー
を保持するプラスミド中に存在するものとは異なる耐性マーカーをｐＮｉａＩに
付加すべきである。
ａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）においてクローニングされたｎｉａ遺伝
子のプロモーターの制御下にあるプラスミド（ｐＮｉａＩ）を構築することを含
む。このプラスミドは、ｐＨＩＮＬと共に又はそれに由来する他の任意のプラス
ミド（該欠損因子の挿入により不活性化されたアスペルギルス・ニデュランス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤプロモーターが、
該復帰突然変異体の選択に使用するマーカー遺伝子の発現を制御するもの）と共
に使用される。該同時形質転換体の選択を促進するために、該因子の欠損コピー
を保持するプラスミド中に存在するものとは異なる耐性マーカーをｐＮｉａＩに
付加すべきである。
【００７３】 第２に、該トランスポザーゼは、構成的プロモーターの制御下、より厳密には
、ｇｐｄＡ遺伝子のプロモーターの制御下、該欠損因子中またはｐＨＮｉＬプラ
スミド中に存在するものとは異なる選択マーカーを保持するｐＦＡＣ１ベクター
中にクローニングすることができる。
、ｇｐｄＡ遺伝子のプロモーターの制御下、該欠損因子中またはｐＨＮｉＬプラ
スミド中に存在するものとは異なる選択マーカーを保持するｐＦＡＣ１ベクター
中にクローニングすることができる。
【００７４】
【表１】
【図１】 ｐＮｉ１６０プラスミドのマッピング。
【図２】 ｐＮｉＬ１６０プラスミド（Ａ）およびｐＡＮ３０１プラスミド（Ｂ）の、そ
れを構築するために用いたマッピング。
れを構築するために用いたマッピング。
【図３】 ｐＮｉ１６０およびｐＣＢ１１７９ベクターを使用してＢａｍＨＩ ＲＥＭＩ
により得られた同時形質転換体の分子分析。
により得られた同時形質転換体の分子分析。
【図４】 ｎｉａ＋復帰突然変異体Ｃ１４−１およびＣ１４−２の分子分析。 Ａ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片
に相当する（レーン１）またはインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに
相当する（レーン２）放射性プローブを使用したＣ１４−１復帰突然変異体の分
析。 Ｂ：ｎｉａ＋単胞子を単離することにより精製された後のＣ１４−１およびＣ
１４−２復帰突然変異体の分析。
に相当する（レーン１）またはインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに
相当する（レーン２）放射性プローブを使用したＣ１４−１復帰突然変異体の分
析。 Ｂ：ｎｉａ＋単胞子を単離することにより精製された後のＣ１４−１およびＣ
１４−２復帰突然変異体の分析。
【図５】 ｐＮｉＬ１６０ベクターを保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋
復帰突然変異体の分子分析。 Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブ
に対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。 Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片
に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該Ｄ
ＮＡ断片が示される。
復帰突然変異体の分子分析。 Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブ
に対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。 Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片
に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該Ｄ
ＮＡ断片が示される。
【図６】 非病原性復帰突然変異体Ｒｅｖ７７におけるインパラの挿入により遮断された
ＯＲＦの概要図。
ＯＲＦの概要図。
【図７】 ｐＣＩＴｎプラスミドのマッピング。
【図８】 ｐＮｉＨＹＧ構築物を保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰
突然変異体の分子分析。 Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブ
に対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。 Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片
に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該Ｄ
ＮＡ断片が示される。
突然変異体の分子分析。 Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブ
に対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。 Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片
に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該Ｄ
ＮＡ断片が示される。
【図９】 ｐＨＩＮプラスミドのマッピング。
【図１０】 ｐＥＯ６プラスミドのマッピング。
【図１１】 ｐＨＮｉＬプラスミドのマッピング。
【図１２】 ｐＢＮｉＬプラスミドのマッピング。
【図１３】 ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドのマッピング。
【図１４】 該２成分系を用いた形質転換後に得られたＤ１同時形質転換体に由来するｎｉ
ａ＋復帰突然変異体の分子分析。
ａ＋復帰突然変異体の分子分析。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:80） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルブラン，マルク−アンリ フランス国、エフ−69002・リヨン、リ ユ・ドウ・ブレスト、62 (72)発明者 ダブスイ，マリ−ジヨゼ フランス国、エフ−91440・ビユル−スユ ール−イベツト、リユ・デユ・ボー・スイ ツト、31 Ｆターム(参考） 4B024 AA07 AA20 BA08 BA11 BA80 CA04 DA11 EA04 FA02 FA10 GA11 4B065 AA57X AA57Y AA60Y AA65Y AA67Y AB01 AC10 AC20 BA02 CA23 CA60
Claims (19)
- 【請求項１】 インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの挿入により不活
性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、マグナポルセ・
グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であり該マ
ーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結されたプロモーター調節配列を転写の
方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 該プロモーター調節配列が、マグナポルセ・グリセア（Ｍａ
ｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）または別の真菌、特に糸状菌由来の遺伝子
のプロモーター調節配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 該プロモーター調節配列が真菌性ｎｉａＤまたはｇｐｄＡ遺
伝子のプロモーター調節配列よりなる、請求項１および２のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 該プロモーター調節配列が、マグナポルセ・グリセア（Ｍａ
ｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的である、アスペルギルス・
ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺
伝子のプロモーター調節配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター調節配列が０．４ｋｂ
を超える長さである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 マーカー遺伝子のコード配列が、レポーター遺伝子、特にＧ
ＵＳまたはＧＦＰのコード配列、抗生物質または除草剤に対する耐性に関する遺
伝子、特にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）、フレオマイシン耐性遺伝子
（ｂｌｅ）または除草剤ビアラフォス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、またはスルホニル
尿素耐性遺伝子のコード配列から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 該マーカー遺伝子が、真菌において機能的である酵素、特に
硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）またはニトリラーゼをコードする遺伝子から選ば
れる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 該マーカー遺伝子が、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子である
、請求項７に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項９】 該インパラトランスポゾンが、前記請求項のいずれか１項に
記載のポリヌクレオチドのプロモーター調節配列内に組込まれている、請求項１
〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０】 該インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、請求
項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項１１】 該インパラトランスポゾンが欠損性である、請求項１〜１
０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項１２】 真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、 ａ）マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内へ
のその再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性
化された該マーカー遺伝子を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌ
クレオチドで該真菌を形質転換し、 ｂ）該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製
造方法。 - 【請求項１３】 真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、 ａ）請求項１１に記載の欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化され
たマーカー遺伝子を含むポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、 ｂ）該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入
およびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用
いて、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、 ｃ）該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製
造方法。 - 【請求項１４】 真菌における検出可能な表現型に関連した遺伝子の同定方
法であって、 ａ）請求項１２または１３に記載の製造方法の１つに従い、該真菌のゲノム内に
インパラトランスポゾンを挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、 ｂ）前記の検出可能な表現型を有する少なくとも１つの挿入突然変異体を選択し
、 ｃ）該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する
工程を含んでなる方法。 - 【請求項１５】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
で形質転換された宿主生物。 - 【請求項１６】 該宿主生物が真菌である、請求項１５に記載の宿主生物。
- 【請求項１７】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
がゲノム内に組込まれている真菌。 - 【請求項１８】 該マーカー遺伝子が真菌硝酸レダクターゼ遺伝子であり、
該真菌がｎｉａ−である、請求項１７に記載の真菌。 - 【請求項１９】 インパラトランスポゾンがゲノム内に組込まれた、マグナ
ポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ）属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突然変異体。
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|---|---|---|---|
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