JP2002539794A - マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド - Google Patents
マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチドInfo
- Publication number
- JP2002539794A JP2002539794A JP2000606761A JP2000606761A JP2002539794A JP 2002539794 A JP2002539794 A JP 2002539794A JP 2000606761 A JP2000606761 A JP 2000606761A JP 2000606761 A JP2000606761 A JP 2000606761A JP 2002539794 A JP2002539794 A JP 2002539794A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- impala
- transposon
- fungus
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000282813 Aepyceros melampus Species 0.000 title claims abstract description 122
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 121
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 59
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 59
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 59
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 title abstract description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 title abstract description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 56
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 55
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 65
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 44
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 43
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 claims description 30
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 26
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 23
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims description 22
- 101100505672 Podospora anserina grisea gene Proteins 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 15
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 claims description 15
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 241001344133 Magnaporthe Species 0.000 claims description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 5
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 101150073906 gpdA gene Proteins 0.000 claims description 3
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 claims description 2
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 claims description 2
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 claims 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 abstract description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 85
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 19
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 17
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 16
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 10
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 9
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 8
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 8
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 6
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 5
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 5
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000533281 Stagonospora Species 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 3
- 241000221787 Erysiphe Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000228453 Pyrenophora Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 3
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 229910000473 manganese(VI) oxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 2
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 2
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 2
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 2
- 101100316805 Caenorhabditis elegans spe-5 gene Proteins 0.000 description 2
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M Chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 2
- 241000221760 Claviceps Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000222199 Colletotrichum Species 0.000 description 2
- 241001275954 Cortinarius caperatus Species 0.000 description 2
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 2
- 241000286056 Endoxyla grisea Species 0.000 description 2
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 2
- 241000308375 Graminicola Species 0.000 description 2
- 241000592921 Helminthosporium Species 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241000131448 Mycosphaerella Species 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 description 2
- 241000221300 Puccinia Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 108020003564 Retroelements Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 101100366397 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SPE3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 2
- 241001136494 Talaromyces funiculosus Species 0.000 description 2
- 241000221566 Ustilago Species 0.000 description 2
- 241000317942 Venturia <ichneumonid wasp> Species 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Inorganic materials [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 241001480061 Blumeria graminis Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101100404840 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) niiA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101100321669 Fagopyrum esculentum FA02 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241000315031 Gonatista grisea Species 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101100240535 Lactococcus lactis subsp. cremoris (strain MG1363) niaX gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000013609 MutL Protein Homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010026664 MutL Protein Homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000221945 Podospora Species 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 241000682843 Pseudocercosporella Species 0.000 description 1
- 101001062854 Rattus norvegicus Fatty acid-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 241001361634 Rhizoctonia Species 0.000 description 1
- 241001515786 Rhynchosporium Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000192589 Synechococcus elongatus PCC 7942 Species 0.000 description 1
- 241001360088 Zymoseptoria tritici Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N bensulfuron-methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1CS(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(OC)=CC(OC)=N1 XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 101150084054 grisea gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108091035233 repetitive DNA sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000053632 repetitive DNA sequence Human genes 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Mushroom Cultivation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
び遺伝子標識のためのこれらのポリヌクレオチドの用途に関する。本発明はまた
、これらの真菌のゲノム内へのフザリウム・オキシスポラム(Fusarium
oxysporum)由来のインパラ(Impala)トランスポゾンのラン
ダム挿入により得られた真菌突然変異体のコレクションに関する。これらの突然
変異体のコレクションは、真菌における遺伝子の機能を研究するための有効な遺
伝的手段の1つである。
定義されうる。それらは遺伝子(エキソン、イントロン、調節領域)内に挿入さ
れうるため、それらは突然変異の原因となりうる。このため、それらは、ゲノム
内に寄生体として存在して該ゲノムの進化に寄与する。トランスポゾンは、それ
らの増幅様態に応じて2つのグループに分類されている(Finnegan,1
989;Capyら,1998)。
素によりDNAに逆転写されるRNA中間体を介して転位する。このクラスは、
LTR(長末端反復配列)に隣接していることも隣接していないこともあるレト
ロトランスポゾンまたはレトロ因子に細分される。該LTRレトロ因子としては
、gypsyファミリーの因子、およびcopiaファミリーの因子が挙げられ
る。それらは、レトロウイルスのgagおよびpol遺伝子に相同でpol遺伝
子の種々の機能的ドメインの体制が異なる遺伝子を有する。また、gypsyフ
ァミリーは、レトロウイルスにおいてその感染に寄与するenvに相同な遺伝子
を有する。非LTRレトロ要素のなかでは、gagおよびpol遺伝子ならびに
ポリA配列を有するLINEが区別され、また、ポリAテイルも有するがgag
およびpol配列を欠くSINEが区別される。それは、先のLINE因子に由
来すると考えられる(Eickbush,1992;OkadaおよびHama
da,1997)。
ズムを介して転位する。その全体的構造は、該因子の転位に必要なトランスポザ
ーゼをコードするオープンリーディングフレームに隣接する2つの逆方向反復配
列(ITR)よりなる。これらの因子は、そのトランスポザーゼおよび/または
ITRの配列相同性に基づき、まとめていくつかのスーパーファミリーに分類さ
れており、それらには、Tc1/マリナー(mariner)因子のスーパーフ
ァミリー(Doakら,1994)、Fot1/Pogo要素のスーパーファミ
リー(Capyら,1998;SmitおよびRiggs,1996)、hAT
因子のスーパーファミリー(Calviら,1991)、P因子のスーパーファ
ミリー(Kidwell,1994)またはCACTA因子のスーパーファミリ
ー(Gierl 1996)が含まれる。
段を開発しようとする場合(Brownら,Curr.Opin.Microb
iol.1:390−4,1998)、さらにまた、これらの真菌のゲノムを研
究しようとする場合(Dobinsonら,Trends in Microb
iology,1:348−3652,1993)に、非常に重要である。
の方法が実施されている。第1および第2の方法は、既に特徴づけられている因
子から導かれた知見を利用するものである。これは、高度に保存されたドメイン
(例えば、LTRレトロ因子逆転写酵素のもの)に由来するオリゴヌクレオチド
を使用するサザンハイブリダイゼーション実験または増幅において使用する異種
プローブの使用を含む。第3の方法は、反復DNA配列を特徴づけることにある
。この場合、ゲノムDNAとリボソームプローブとの間のディファレンシャルハ
イブリダイゼーションが必要である。このようにして、マグナポルセ・グリセア
(Magnaporthe grisea)ゲノムにおいて、Fot1ファミリ
ーのトランスポゾンが同定されている(Kachrooら,Current G
enetics 31:361−369,1997;Farmanら,Mol.
Gen.Genetics 251:675−681 1996;Kachro
oら,Mol.Gen.Genetics 245:339−348,1994
)。最後の方法は、前記の3つの方法とは異なり、機能的および活性な因子の同
定を可能にする。これは、トランスポゾン捕捉(transposon tra
p)である。この方法はマーカー遺伝子の不活性化を用いるものであり、この方
法においては、該因子の挿入により生じた突然変異が陽性スクリーニングにより
同定されうる。このようにして、am(グルタミン酸デヒドロゲナーゼ)遺伝子
は、ニューロスパラ・クラッサ(Neurospora crassa)におい
てTadレトロ因子(これは、LINE型のものである)を、この遺伝子内への
その再挿入後に特徴づけることを可能にした(KinseyおよびHelber
,1989)。また、トランスポゾンを捕捉するために、アスペルギルス・ニデ
ュランス(Aspergillus nidulans)のniaD(硝酸レダ
クターゼ)遺伝子が使用されている。特に、この遺伝子を不活性化する突然変異
はクロラート耐性を付与する。このようにして、フザリウム・オキシスポラム(
Fusarium oxysporum)(Daboussiら,Geneti
ca 93:49−59,1194)およびアスペルギルス(米国特許第5,9
85,570号)において種々のトランスポゾンが同定されている。フザリウム
・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)由来のクラスII
因子であるFot1は、niaD遺伝子の不活性化を用いて同定された最初のト
ランスポゾンであった(Daboussiら,1992)。また、フザリウム・
オキシスポラム(Fusarium oxysporum)におけるniaD遺
伝子の使用は、Tc1/マリナー型因子のスーパーファミリーに属するインパラ
(Impala)トランスポゾンを捕捉することを可能にした(Linginら
,1995)。フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxyspo
rum)においては、種々のインパラトランスポゾンスーパーファミリーが同定
されている(Hun−Vanら,Mol.Gen.Genetics 259:
354−362,1998)。フザリウム・オキシスポラム(Fusarium
oxysporum)においては、インパラ因子の転位が研究されている。与
えられた遺伝子のイントロンまたはプロモーター内にインパラトランスポゾンが
組込まれた場合には、それはついで、この遺伝子の発現を不活性化しうる。一方
、インパラトランスポゾンの転位後、該遺伝子は再活性化され、これは、該転位
事象の陽性対照を構成する。該転位を同定するためのそのような方法が、アスペ
ルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)由来の
硝酸レダクターゼ(niaD)遺伝子のプロモーター調節配列内に組込まれたイ
ンパラトランスポゾンを含む構築物を使用して、フザリウム(Fusarium
)において行われている(Hua−Van,1998)。
porthe grisea)においてpNi160プラスミドのniaD/イ
ンパラ遺伝子構築物(Langinら,1995)を使用してインパラの転位を
証明することは、挿入突然変異誘発手段の開発に不適合な非常に低い比率で可能
であるにすぎない。これらの観察は、pNi160プラスミドのniaD/イン
パラ構築物(Langinら,1995)、より詳しくはインパラトランスポゾ
ン自体が、他の真菌、特にエム・グリセア(M.grisea)において機能的
でないことを示唆している。
コレクションを作製するためのそのような手段は、それらのゲノムの研究および
それらの遺伝子の機能の研究に今や不可欠である。ヒトまたは動物における真菌
性病態の治療用または農業用に使用されうる新規抗真菌化合物を見出すためには
、真菌遺伝子の機能の分析が不可欠である。
)において機能的でありインパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマ
ーカー遺伝子を含んでなる新規ポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレ
オチドは、挿入突然変異誘発手段の開発に適した転位率で、真菌におけるインパ
ラ因子の転位を示すことを可能にする。したがって、本発明の対象はまた、真菌
突然変異体の製造方法であって、そのゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入
することによる製造方法、および関心のある表現型に関連した真菌遺伝子を同定
するための方法である。最後に、本発明は、真菌挿入突然変異体のコレクション
およびその用途に関する。
り不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、マグナポ
ルセ・グリセア(Magnaporthe grisea)において機能的であ
り該マーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結されたプロモーター調節配列を
転写の方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド、特に、単離または精製さ
れたポリヌクレオチドに関する。
は、該マーカー遺伝子の発現につながる。したがって、該マーカー遺伝子の発現
の検出は、該転位事象のモニターおよび該挿入突然変異体の選択を可能にする。
該突然変異体の選択は、第1マーカーとは異なる第2マーカー遺伝子で該トラン
スポゾンを標識することにより改良されうる。この第2マーカー遺伝子は、該真
菌のゲノム内への該トランスポゾンの再挿入のモニターを可能にする。したがっ
て、本発明の対象はまた、インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、前
記のポリヌクレオチドである。
したものである。本発明においては、表現型スクリーニングで真菌内での発現が
検出されうる任意のマーカー遺伝子を使用することができる。「マーカー遺伝子
」なる語は、異なる起源の遺伝要素を含むキメラ遺伝子をも意味すると理解され
る。したがって、本発明のマーカー遺伝子は、真菌由来のプロモーター配列と、
真菌由来でないマーカー遺伝子のコード配列との両方を有しうる。
risea)において機能的であるプロモーター調節配列」なる表現は、あるコ
ード配列に機能的に連結されたポリヌクレオチドのうち、マグナポルセ・グリセ
ア(Magnaporthe grisea)における該コード配列の発現を可
能にする任意のポリヌクレオチドを意味すると意図される。プロモーター配列が
マグナポルセ・グリセア(Magnaporthe grisea)において機
能的であるか否かを判定することを可能にする技術は、当業者に公知である。例
えば、潜在的プロモーター配列とレポーター遺伝子とを転写の方向に含むポリヌ
クレオチドでマグナポルセ(Magnaporthe)を形質転換することがで
きる。該ポリヌクレオチドで形質転換された真菌における該レポーター遺伝子の
発現のモニターは、このプロモーター配列がマグナポルセ(Magnaport
he)において機能的であるか否かの判定を可能にする。したがって、マグナポ
ルセ・グリセア(Magnaporthe grisea)における機能を判定
するために、任意のプロモーター配列を試験することができる。該プロモーター
調節配列は、マグナポルセ・グリセア(Magnaporthe grisea
)由来の遺伝子のプロモーター調節配列であることが可能であり、あるいは別の
真菌、さらに詳しくは別の糸状菌に由来することが可能である。マグナポルセ・
グリセア(Magnaporthe grisea)において機能的であるプロ
モーター調節配列は、真菌nia(硝酸レダクターゼ)またはgpd遺伝子のプ
ロモーター調節配列よりなることが有利である。好ましくは、マグナポルセ・グ
リセア(Magnaporthe grisea)において機能的であるプロモ
ーター調節配列は、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus
nidulans)由来のniaD(Malardierら,1989)または
gpdA遺伝子(Puntら,1990)の、マグナポルセ(Magnapor
the)において機能的なプロモーター調節配列よりなる。マグナポルセ(Ma
gnaporthe)において機能的であるためには、アスペルギルス・ニデュ
ランス(Aspergillus nidulans)由来のniaD遺伝子の
プロモーター調節配列は、好ましくは、337bpより長く、0.4kbより長
く、0.5kbより長く、0.6kbより長く、0.7kbより長く、0.8k
bより長く、0.9kbより長く、より好ましくは、約1kbより長いか又はそ
れに等しい。本発明の好ましい実施形態においては、マグナポルセ・グリセア(
Magnaporthe grisea)において機能的であるプロモーター調
節配列は、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidu
lans)(Genbank M58291;Johnstoneら,Gene
90:181−192,1990;Puntら,1995)由来のniaDお
よびniiA遺伝子の遺伝子間断片に相当する1.3kbのポリヌクレオチドよ
りなる。それ自体は機能的ではないが、マグナポルセ・グリセア(Magnap
orthe grisea)のゲノム内のマグナポルセ・グリセア(Magna
porthe grisea)プロモーターの下流へのランダムな組込みにより
該マーカー遺伝子の発現を可能にする部分的機能的調節配列は、本発明において
は、マグナポルセ・グリセア(Magnaporthe grisea)におい
て機能的な調節配列ではないと理解される。
現が容易に測定されるレポーター遺伝子、特にGUS(米国特許第5,268,
463号、米国特許第5,599,670号)またはGFP(米国特許第5,4
91,084号、米国特許第5,741,668号)のコード配列、抗生物質ま
たは除草剤に対する耐性に関する遺伝子、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子(
hph:Puntら,1987)、フレオマイシン耐性遺伝子(ble:Dro
court,1990)、除草剤ビアラフォス(bialaphos)耐性遺伝
子(Bar:PallおよびBrunelli,1993)またはスルホニル尿
素耐性遺伝子(Sweigardら,1997)のコード配列から選ばれる。本
発明のもう1つの好ましい実施形態においては、該マーカー遺伝子は、真菌にお
いて機能的である、酵素をコードする遺伝子の配列から選ばれる。好ましくは、
該マーカー遺伝子は硝酸レダクターゼ遺伝子である。本発明の断片がnia−真
菌内に組込まれた場合、この構築物で形質転換された株は突然変異体表現型を維
持する。最少培地(唯一の窒素源としてのNaNO3)上のnia+コロニーの
出現は、niaD遺伝子の発現を可能にするインパラトランスポゾンの切除を示
す。これらのnia+復帰突然変異体は、nia−コロニーの低く平らな表現型
とは異なるそれらの密集性かつ気生性(aerial)の表現型により、この培
地上で選択されうる。マーカーとしてのniaD遺伝子の使用は、nia−真菌
の使用を要する。nia−真菌の同定方法は当業者によく知られている。特に、
Daboussiら(1989)により記載されている方法が挙げられる。
995;Hua−Vanら,1998)の挿入により不活性化された前記のマー
カー遺伝子を含む。該インパラトランスポゾンは、逆方向反復配列(ITR)に
隣接した機能的トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを
含む。それは、TAジヌクレオチドにおいて挿入され、これは重複状態となる。
インパラの切除は曖昧なものであり、ごく一般的には、該挿入中に重複したTA
ジヌクレオチドに加えて、該因子の左または右末端に対応する3ヌクレオチドの
足跡(フットプリント)を残す。したがって、切除後に残存フットプリントが該
マーカー遺伝子の発現を妨げないよう、該マーカー遺伝子内への該インパラトラ
ンスポゾンの挿入点が選択される必要がある。好ましくは、該インパラトランス
ポゾンは、該プロモーター配列内または該マーカー遺伝子のイントロン内に挿入
される。インパラのいくつかのコピーがフザリウム・オキシスポラム(Fusa
rium oxysporum)において同定されており、それらの配列の比較
は、種々の長さおよび配列のITRを有する3つのサブファミリーを定めること
を可能にした(Hua−Vanら,1998)。好ましい実施形態においては、
本発明のポリヌクレオチドは、インパラ160トランスポゾンを含む。該インパ
ラ160因子は1 280bpを含み、それは、340アミノ酸のトランスポザ
ーゼをコードするオープンリーディングフレームを囲む27bpの2つの逆方向
反復配列に隣接する(Langinら,1995;Genbank S7510
6)。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、アスペルギ
ルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)由来のni
aD遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギルス・ニデュランス
(Aspergillus nidulans)由来のniaD遺伝子の1.3
kbのプロモーターと、該niaD遺伝子のプロモーター内に挿入されたインパ
ラ160トランスポゾンとを含む。本発明の特に有利な実施形態においては、本
発明のポリヌクレオチドはpNiL160プラスミドを含む。これらの構築物を
使用して、nia−真菌を形質転換し、インパラ因子の転位から得られた挿入突
然変異体を、それらのnia+表現型に関して最少培地上で選択する。もう1つ
の好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ハイグロマイシ
ンに耐性に関するhph遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギ
ルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)由来のgp
d遺伝子のプロモーターと、該gpd遺伝子のプロモーター内に挿入されたイン
パラ160トランスポゾンとを含む。これらのポリヌクレオチドを使用して、真
菌を形質転換し、該インパラ因子の転位から得られたハイグロマイシン耐性挿入
突然変異体を選択する。
することができる。「インパラトランスポゾン」なる語は修飾インパラトランス
ポゾンをも意味すると理解される。これらの修飾としては、特に、インパラトラ
ンスポゾン内へのマーカー遺伝子またはアクチベーター配列の挿入、または欠損
インパラトランスポゾンを得るためのトランスポザーゼの不活性化が挙げられる
。これらの修飾トランスポゾンの構築では、当業者によく知られた通常の分子生
物学技術を用いる。
いられる。遺伝子内へのインパラトランスポゾンの挿入は、一般には、この遺伝
子の全体的または部分的不活性化を引き起こす。一方、アクチベーター配列を含
むインパラトランスポゾンの使用は、過剰発現突然変異体を得ることを可能にす
る。したがって、該トランスポゾン修飾では、挿入突然変異誘発の種々の方法を
用いることができる(Bancroftら,Mol.Gen.Genet.23
3:449−461,1992;BancroftおよびDeanら,Mol.
Gen.Genet.240:65-67,1993;Longら,PNAS
90:10370−10374,1993)。
転位性因子の2つのITRの間にマーカー遺伝子が挿入されて自律的標識因子を
有することが可能となったインパラトランスポゾンを含む前記のポリヌクレオチ
ドに関する。また、本発明の好ましい実施形態において該トランスポゾンを標識
するためには、インパラトランスポゾンの切除を観察するために使用することが
予想されるすべてのマーカー遺伝子を使用することができる。好ましくは、該マ
ーカー遺伝子は、該トランスポザーゼをコードする配列の下流、かつ、左LTR
の上流(NheI部位において)に挿入される。インパラトランスポゾン内への
マーカー遺伝子の挿入は、該挿入突然変異体の、より良好な選択を可能にする。
別法として、トランケート化マーカー遺伝子をインパラトランスポゾン内に挿入
することができる。プロモーターを欠くマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリ
ヌクレオチドをプロモータートラップとして使用することを可能にする。トラン
ケート化プロモーターを含むマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリヌクレオチ
ドをアクチベーター配列用のトラップとして使用することを可能にする。
により、または欠失により、またはマーカー遺伝子の挿入により、またはマーカ
ー遺伝子での置換により、インパラ因子のトランスポザーゼが不活性化されてい
るトランスポゾン)を含む前記のポリヌクレオチドに関する。この欠損インパラ
因子の転位は、本発明の挿入突然変異誘発においては、より容易に制御される。
トランスポザーゼが不活性化された欠損インパラ因子の構築には、当業者に公知
の通常の分子生物学技術(Sambrookら,1989)を用いる。本発明の
1つの実施形態においては、インパラ因子のトランスポザーゼをコードするオー
プンリーディングフレームを、マグナポルセ・グリセア(Magnaporth
e grisea)において機能的であるプロモーターの制御下で発現されるマ
ーカー遺伝子で置換する。該トランスポザーゼのコード配列は、例えば、真菌に
おいて機能的である異種プロモーターの制御下で発現される、ハイグロマイシン
耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子またはGFP遺伝子で置換することができ
る。該欠損インパラトランスポゾンはこれらの挿入配列(ITR)を維持し、し
たがって、その転位は、例えば複製型プラスミド上に配置されたトランスポザー
ゼを利用してトランスで活性化されうる。
クターは、例えば細菌などの宿主生物を形質転換するために及びこの宿主生物内
で本発明のポリヌクレオチドを複製するために使用することができる。好ましく
は、本発明のポリヌクレオチドは、真菌を形質転換するためにベクター内に挿入
される。これらのベクターは、これらのポリヌクレオチドを複製するために又は
該ポリヌクレオチドを真菌のゲノム内に組込むために使用される。ポリヌクレオ
チドの複製および宿主生物内へのその組込みを可能にするベクターは、当業者に
よく知られている。
ノムを研究するための、前記のポリヌクレオチドの用途に関する。
、 ・マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内への
その再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性化
された該マーカー遺伝子を含む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し
、 ・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造
方法である。
マーカー遺伝子または活性化配列の挿入によりそれを修飾することが可能である
と理解される。好ましい実施形態においては、該インパラトランスポゾンは、マ
ーカー遺伝子を含み、それらの2つのマーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体
を選択する。
変異体を製造することができる。特に、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類が挙げ
られる。好ましくは、本発明は、アルテルナリア(Alternaria)、ア
スペルギルス(Aspergillus)、ボトリチス(Botrytis)、
クラドスポリウム(Cladosporium)、クラビセプス(Clavic
eps)、コレトトリチュム(Colletotrichum)、ウドンコ病菌
(Erysiphe)、フザリウム(Fusarium)、コタマカビ(Myc
osphaerella)、エキビョウキン(Phytophthora)、シ
ュードセルコスポレラ(Pseudocercosporella)、ピレノフ
ォラ(Pyrenophora)、リンコスポリウム(Rhynchospor
ium)、スクレロティニイア(Sclerotinia)、スタゴノスポラ(
Stagonospora)、ベンツリア(Venturia)およびウスチラ
ゴ(Ustilago)属の真菌に関する。また、ゲウマンノマイセス(Gae
umannomyces)、ヘルミントスポリウム(Helminthospo
rium)、プシニア(Puccinia)およびリゾクトニア(Rhizoc
tonia)属の真菌が挙げられる。好ましくは、本発明は、マグナポルセ(M
agnaporthe)およびペニシリウム(Penicillium)属の真
菌に関する。より好ましくは、本発明は、アスペルギルス・フミガーツス(As
pergillus fumigatus)、アスペルギルス・ニデュランス(
Aspergillus nidulans)、ボトリチス・シネレア(Bot
ryis cinerea)、エリシフェ・グラミニス(Erysiphe g
raminis)、ミコスフェレラ・グラミニコラ(Mycosphaerel
la graminicola)、ペニシリウム・フニクロサム(Penici
llium funiculosum)およびスタゴノスポラ・ノドラム(St
agonospora nodorum)種の真菌に関する。より一層好ましく
は、本発明はマグナポルセ・グリセア(Magnaporthe grisea
)に関する。
使用するプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、アグロバクテリ
ウム(Agrobacterium)での形質転換(De Grootら,Na
ture Biotechnology 16:839−842,1998)ま
たはパーティクル銃を使用する射撃の方法(Chaureら,Nature B
iotechnology 18:205−207,2000)が挙げられる。
ために、マーカー遺伝子の発現に関して形質転換体をスクリーニングする。本発
明のポリヌクレオチドのマーカー遺伝子は、表現型スクリーニングにより挿入突
然変異体を同定または選択することを可能にする。例えば、このスクリーニング
は、抗生物質に対する耐性、化合物に対する耐性、またはレポーター遺伝子の発
現レベルの測定によるものでありうる。種々のマーカー遺伝子が、前記において
更に詳しく説明されている。nia−真菌におけるマーカー遺伝子としてnia
D遺伝子を使用する場合には、唯一の窒素源としてNaNO3を含有する最少培
地上で、該挿入突然変異体を、それらの密集性かつ気生性の外観により選択する
。
けるためにトランスポゾンを安定化させるのが有利かもしれない。該転位因子の
転位率に近い又はそれ未満の相補点(complement)において該突然変
異体を試験する場合には、該トランスポゾンの新たな再挿入のこの制御は無視さ
れうる。該トランスポゾンの切除を制御するために、2成分系を調製することが
できる(Hun−Van,1998;KempkenおよびKuck,1998
)。後者は、トランスポザーゼが特に突然変異により又は欠失により又はマーカ
ー遺伝子での置換により不活性化された欠損インパラ因子の構築を含む。この場
合、該欠損インパラトランスポゾンは、発現が厳密に制御されており該インパラ
因子の安定化を可能にするトランスポザーゼを用いて可動される。
、 ・欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含
む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、 ・該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入お
よびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用い
て、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、 ・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造
方法である。
を可能にする方法は、当業者によく知られている。特定の実施形態においては、
該真菌を2つのポリヌクレオチドで形質転換する。その第1ポリヌクレオチドは
該欠損インパラトランスポゾンを含み、第2ポリヌクレオチドは、インパラ因子
トランスポザーゼのコード配列を、それ自身のプロモーターの制御下または異種
プロモーターの制御下で含む。該トランスポザーゼのコード配列は、複製型プラ
スミド上または組込みプラスミド上に配置することができる。該トランスポザー
ゼの発現を制御するために、後者を、誘導プロモーターの制御下に配置すること
ができる。該トランスポザーゼの発現の誘導は、該欠損インパラ因子の転位およ
び挿入突然変異体の調製を可能にし、ついで、該トランスポザーゼがもはや発現
されなくなった際に該トランスポゾンは安定化される。本発明の方法においては
、真菌において機能的である任意の誘導プロモーターを使用することができる。
特に、マグナポルセ・グリセア(Magnaporthe grisea)由来
の硝酸レダクターゼ遺伝子のプロモーターを使用することができる。特に、この
プロモーターは、唯一の窒素源としての硝酸塩の存在下の最少培地上でのnia
遺伝子の発現を可能にし、一方、この遺伝子の発現は、アンモニウムの存在下で
は完全に抑制される(LauおよびHammer,1996)。あるいは、該ト
ランスポザーゼを、例えば、選択マーカーを保持する複製型プラスミド(このプ
ラスミドは、選択圧が存在しない場合には維持されない)上に配置する。この場
合、該トランスポザーゼは、構成プロモーターまたはそれ自身のプロモーターの
制御下で発現されうる。選択圧の存在下、該複製型プラスミドの維持は該トラン
スポザーゼの発現を可能にし、今度はこれが、インパラ因子の転位および挿入突
然変異体の産生を可能にする。複製型プラスミドの維持を可能にする選択圧の不
存在下では、該トランスポザーゼは失われ、該トランスポゾンは該突然変異体内
で安定化される。そのようなプラスミドの製造に必要な手段は当業者によく知ら
れている。例えば、該トランスポザーゼを、ポドスポラ(Podospora)
由来のテロメア末端を含有するpFAC1複製型ベクター(Barreauら,
1998)内に配置することができる。
能を研究するための非常に有効な手段である。好ましい実施形態においては、挿
入突然変異体のコレクションを、関心のある表現型に関してスクリーニングする
。本発明の挿入突然変異体においては、任意の検出可能な表現型が探索されうる
。特に、真菌の生物学、生理学、発生および生化学に関する表現型が挙げられる
。好ましくは、病原性真菌の挿入突然変異体が調製され、これらの突然変異体に
おいて探索される表現型はこれらの真菌の病原性に関するものである。該表現型
スクリーニングは、該真菌の直接的観察、酵素活性の測定、殺真菌剤に対する感
受性の測定、または該真菌のビルレンスの研究に基づくものでありうる。関心の
ある表現型を有する挿入突然変異体を同定したら、インパラトランスポゾンが内
部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する。該インパラ因子の挿入によりこの
ようにして標識された関心のある遺伝子は、当業者によく知られた分子生物学的
技術を用いて単離する。用いる技術としては、特に、ポリヌクレオチドの一方の
末端の配列のみが既知の場合に該ポリヌクレオチドの増幅を可能にする増幅技術
が挙げられる(この場合、該トランスポゾンの配列は該ゲノム内に組込まれる)
。これらの技術には、特に、逆PCR(Ochmannら,Genetics,
120:621−623,1988;Williams,Biotechniq
ues 7:762−769,1989)、ベクトレットPCR(Arnold
およびHodgson,PCR Methods Appl.1:39−42,
1991)およびパンハンドル(panhandle)PCR(Jones a
nd Winistorfer,PCR Methods Appl.2:19
7−203,1993)が含まれる。これらの技術は、真菌のゲノム内のインパ
ラトランスポゾンに隣接する配列の増幅、クローニングおよび配列決定を可能に
する。ついでこれらの隣接配列を使用して、該トランスポゾンの挿入により不活
性化された全遺伝子を単離する。
定方法であって、 ・前記の製造方法の1つに従い、該真菌のゲノム内にインパラトランスポゾンを
挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、 ・この検出可能な表現型を有する少なくとも1つの挿入突然変異体を選択し、 ・該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する工
程を含んでなる方法に関する。
。本発明における「宿主生物」なる語は、特に、任意の単細胞生物または多細胞
生物(これは下等または高等生物でありうる)を意味し、特に、細菌および真菌
から選ばれると意図される。該細菌は大腸菌(Escherichia col
i)から選ばれるのが好都合である。好ましい実施形態においては、本発明は、
本発明のポリヌクレオチドで形質転換された真菌に関する。好ましくは、該真菌
は、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類から選ばれる。好ましくは、該真菌は、ア
ルテルナリア(Alternaria)、アスペルギルス(Aspergill
us)、ボトリチス(Botrytis)、クラドスポリウム(Cladosp
orium)、クラビセプス(Claviceps)、コレトトリチュム(Co
lletotrichum)、ウドンコ病菌(Erysiphe)、フザリウム
(Fusarium)、コタマカビ(Mycosphaerella)、エキビ
ョウキン(Phytophthora)、シュードセルコスポレラ(Pseud
ocercosporella)、ピレノフォラ(Pyrenophora)、
リンコスポリウム(Rhynchosporium)、スクレロティニイア(S
clerotinia)、スタゴノスポラ(Stagonospora)、ベン
ツリア(Venturia)およびウスチラゴ(Ustilago)属の真菌か
ら選ばれる。また、ゲウマンノマイセス(Gaeumannomyces)、ヘ
ルミントスポリウム(Helminthosporium)、プシニア(Puc
cinia)およびリゾクトニア(Rhizoctonia)属の真菌が挙げら
れる。好ましくは、該真菌は、マグナポルセ(Magnaporthe)および
ペニシリウム(Penicillium)から選ばれる。より好ましくは、該真
菌は、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumiga
tus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidu
lans)、ボトリチス・シネレア(Botryis cinerea)、エリ
シフェ・グラミニス(Erysiphe graminis)、ミコスフェレラ
・グラミニコラ(Mycosphaerella graminicola)、
ペニシリウム・ペニシリウム・フニクロサム(Penicillium fun
iculosum)およびスタゴノスポラ・ノドラム(Stagonospor
a nodorum)種から選ばれる。特に有利な態様においては、該宿主生物
はマグナポルセ・グリセア(Magnaporthe grisea)である。
ラスミド上に配置されうる。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオ
チドがゲノム内に組込まれた真菌に関する。本発明はまた、該インパラトランス
ポゾンがゲノム内に組込まれたマグナポルセ(Magnaporthe)または
ペニシリウム(Penicillium)属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突
然変異体に関する。
クションの生成を可能にする。このようにして得られた突然変異体を、糸状菌の
ゲノムの研究に使用することができる。
。これらの後記実施例に記載の方法または操作は、例示として記載されており、
同じ結果を得るために利用されうる種々の方法から選ばれる1つの選択肢に相当
する。この選択肢は、結果の質に関連したものではなく、そのため、当業者は、
同じ結果を得るために任意の適当な方法を用いることができる。DNA断片を操
作するための方法のほとんどは、“Current Protocols in
Molecular Biology” 第1巻および第2巻,Ausube
l F.M.ら又はSambrookら,1989に記載されている。
の、それを構築するために用いたマッピング。
EMIにより得られた同時形質転換体の分子分析。該同時形質転換体DNAを抽
出し、EcoRIで消化し、1×TAEバッファー中の1%アガロースゲル上に
ローディングする(5μg/レーン)。泳動およびポジティブナイロンメンブレ
ン上へのトランスファーの後、pAN301中に存在するniaD遺伝子の2.
7kb EcoRI断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイ
ゼーションにより該DNA断片が示される。
帰突然変異体DNAを抽出し、EcoRIで消化し、1×TAEバッファー中の
1%アガロースゲル上にローディングする(5μg/レーン)。泳動およびポジ
ティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、サザンハイブリダイゼー
ションにより該DNA断片が示される。
に相当する(レーン1)またはインパラトランスポザーゼをコードするORFに
相当する(レーン2)放射性プローブを使用したC14−1復帰突然変異体の分
析。
14−2復帰突然変異体の分析。C14−1復帰突然変異体(レーン3および4
)およびC14−2復帰突然変異体(レーン5および6)のプロフィールをC1
4nia−同時形質転換体由来のプロフィール(レーン1および2)と比較する
。使用したプローブは、インパラトランスポザーゼをコードするORFに相当す
る。
ia+復帰突然変異体の分子分析。該同時形質転換体DNAを抽出し、EcoR
Iで消化し、1×TAEバッファー中の1%アガロースゲル上にローディングす
る(5μg/レーン)。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトラン
スファーの後、A:インパラトランスポザーゼをコードするORFに相当する放
射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、B:pAN301
中に存在するniaD遺伝子の2.7kb EcoRI断片に相当する放射性プ
ローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該DNA断片が示される
。レーン1:同時形質転換体8のDNA;レーン2〜7:同時形質転換体8の復
帰突然変異体のDNA;レーン8:同時形質転換体6のDNA;レーン9〜11
:同時形質転換体6の復帰突然変異体のDNA。
されたORFの概要図。
+復帰突然変異体の分子分析。3つの別個の復帰突然変異体のDNA(レーン1
〜3)を抽出し、EcoRIで消化し、1×TAEバッファー中の1%アガロー
スゲル上にローディングする(5μg/レーン)。泳動およびポジティブナイロ
ンメンブレン上へのトランスファーの後、A:インパラトランスポザーゼをコー
ドするORFに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーション
により、B:pAN301中に存在するniaD遺伝子の2.7kb EcoR
I断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより
、該DNA断片が示される。星印の位置は転位性因子の再挿入を示す。
するnia+復帰突然変異体の分子分析。該復帰突然変異体DNA(レーン1〜
4)のDNAを抽出し、EcoRIで消化し、1×TAEバッファー中の1%ア
ガロースゲル上にローディングする(5μg/レーン)。泳動およびポジティブ
ナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、hph遺伝子から増幅された断
片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該
DNA断片が示される。
ルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)由来のni
aD遺伝子のプロモーター領域内に組込まれたインパラ160のコピーを含有す
る。その構築物は、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus
nidulans)由来の硝酸レダクターゼ遺伝子(Daboussiら,19
92)を含有するpAN301プラスミド(Malardierら,1989)
で形質転換されたフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysp
orum)のF24株において得られたトランスポゾン捕捉に由来する。nia
D遺伝子の自然突然変異の選択は、pAN301の単一のコピーを保持するTR
7形質転換体における1.3kbの挿入の特徴づけを可能にする。この挿入は、
pAN301の2.7kb EcoRI−EcoRI領域内に存在し、その効果
は、4kbのEcoRI断片の生成にある。部分ゲノムライブラリーを構築し、
pAN301由来の2.7kb EcoRI断片でスクリーニングした後(La
nginら,1995)、この断片をpUC19のEcoRI部位にクローニン
グした。それと平行して、該niaD遺伝子の下流に位置する7.8kb Nd
eI断片、そしてまた、該niaD遺伝子のプロモーターの大部分に相当する1
kb EcoRI−BamHI断片を欠失させることにより、p11ΔNdeI
プラスミドをpAN301から構築した(Langinら,1990)。インパ
ラ160因子および硝酸レダクターゼの2.7kbの断片を含む4kbの断片で
、p11ΔNdeI中に存在する2.7kb EcoRI断片を置換することに
より、この場合は0.3kb長であるniaD遺伝子のプロモーター領域内に該
因子が挿入されたpNi160プラスミドが得られうる(図1)。
ロモーターの1kbの断片の付加によりpNi160プラスミドから誘導される
。これを行なうために、1.3kbのniaDプロモーターを含有するpAN3
01プラスミドを、この遺伝子の下流に存在する7.8kbのNdeI断片から
欠失させて、中間体プラスミドpAN301ΔNdeIを得た。ついで、その1
kbのBamHI−ApaI断片を、該1kbの断片と同じniaD遺伝子部分
とインパラ160因子とを含有しpNi160プラスミドに由来する2.3kb
のBamHi−ApaI断片で置換した(図2)。
.174株は、nia−表現型をもたらす硝酸レダクターゼ遺伝子内の点突然変
異を有する。この株の製造は、Daboussiら,1989の文献に記載され
ている。それを、米粉に基づく固形培地上で継代培養し、それにより、該真菌か
ら分生子が収穫されうる。Tanaka(Ouら,1985)の培地Bに基づき
調製したTNKYE液体培地は、Sweigardら(1990)およびSwe
igardら(1992)に記載のプロトコールに従いゲノムDNAを抽出する
ための又はプロトプラストを得るための菌糸の収穫を可能にしうる。酵母エキス
を欠くTNK寒天培地(超高純度アガロース、8g.1−1)(MNO3培地)
は、nia+ G11.25株からnia− G11.174株を識別するのを
可能にする。前者は、低く平らで糸状の表現型を有するが、後者は密集性かつ気
生性である。
60を導入するもの)と、ハイグロマイシン耐性を付与するpCB1179プラ
スミド(Sweigardら,1997)とで同時形質転換した。該形質転換方
法はSweigardら,1992に記載されており、4単位のBamHI酵素
(REMI:制限酵素媒介組込み;Sweigardら,1998)および1μ
gの各プラスミドの存在下で行なった。該プロトプラストは、グルコースがスク
ロース(400μg.1−1)で置換され240μg.1−1の比率のハイグロ
マイシンで補足されたTNKYE培地上で選択される。該同時形質転換体を選択
するために、この抗生物質に耐性なコロニーを、それらのゲノムDNAの抽出後
、インパラトランスポゾンに特異的であり573bpの増幅産物を与えるSPE
5(5’AGAACACAACCCTGCCACGG3’)およびSPE3(5
’TCCGGGCCGTATGCACAGAG3’)プライマーを使用する増幅
により分析した。該同時形質転換体DNAをEcoRIで消化し、pAN301
中に存在するniaD遺伝子の2.7kb EcoRI断片(2.7kbプロー
ブ)をプローブとして使用するサザンブロット(図3)で分析した(Malar
dierら,1989)。この研究は、pNi160を介して導入されたアスペ
ルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)由来の
実質的にすべてのnia遺伝子に相当する少なくとも1つの4kbバンドを有す
る35個の形質転換体の選択を可能にした。これらの同時形質転換体を、米粉に
基づく固形培地上で10〜14日培養し、該胞子を水中に収穫した。計数後、そ
れらを、ディッシュ当たり胞子105〜106個の比率でMNO3寒天培地上に
播いた。nia+復帰形質転換体を選択するためのこの工程を再現する実験を行
なった。こうして、本発明者らは、野生型(G11.25)胞子10個をnia
− G11.174突然変異体の胞子106と混合し26℃で14日間インキュ
ベートした場合に、該MNO3培地がnia+コロニーの検出を可能にすること
を観察した。26℃で1ヵ月培養した後、1個の同時形質転換体(同時形質転換
体C14)だけが、気生性表現型を有する2個のコロニー(C14−1およびC
14−2)を得ることを可能にした。これらの復帰突然変異体コロニーを回収し
、niaD遺伝子のプロモーター内のインパラ160挿入部位を囲むC1(5’
CGCTGCGAATTCTTCAGT3’)およびniaX(5’CTAGA
CTTAGAACCTCGG3’)プライマーを使用するPCRにより分析した
。200bpの産物の増幅は、該トランスポゾンの切除が生じた核の存在を示し
ている。均一なコロニーを得るために、C14−1およびC14−2復帰突然変
異体の分生子を双眼顕微鏡下で単離し、別々に培養した。インパラのORFに相
当するプローブを使用したサザンブロットによるその分析により、それらの2つ
の復帰突然変異体における該因子の再挿入が示されうる(図4)。pGEM−T
イージーベクター(Promega)内に200bpのPCR産物をクローニン
グした後、該トランスポゾンの切除により残されたフットプリントを配列決定し
た。C14−1復帰突然変異体のフットプリントはCTGTAであり、C14−
2のフットプリントはCAGTAである。これらのフットプリントは、フザリウ
ム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)においてインパ
ラが切除された場合にごく一般的に残されるフットプリント(Langinら,
1995)と同一である。MNO3寒天培地上での培養においては、これらの復
帰突然変異体は、G11.174株とG11.25株との間の中間的な表現型を
有し、このことは、pNi160構築物中に存在するniaD遺伝子がG11.
174株の突然変異の最適な相補を許容しないことを示唆している。この仮定を
試験するために、この株由来のプロトプラストを、pCB1179(3μg)の
存在下および1.3kbのプロモーターの制御下でniaD遺伝子を含有するp
AN301ΔNdeI(3μg)ベクターまたはpAN301(3μg)ベクタ
ーで形質転換した。グルコースがスクロース(400μg.l−1)で置換され
ハイグロマイシン(240μg.ml−1)で補足されたMNO3培地上で該プ
ロトプラストをプレーティングし、30℃で10日間インキュベートした後、n
ia+表現型を有するコロニーが出現する。一方、0.3kbのプロモーター断
片の制御下(pNi160の場合と同様)でniaD遺伝子を含有するp11Δ
NdeIベクターを使用した場合には、相補性は認められなかった。
11.174株の突然変異を相補しえないことを示している。この構築物での2
つの復帰突然変異体(C14−1およびC14−2)の選択は、該0.3kb
プロモーター断片の固有活性によるものではなく、C14同時形質転換体におい
ては、アクチベーター配列から利益が得られる領域内にniaD遺伝子が挿入さ
れたと考えられるのではないかと説明されうる。このことは、マグナポルセ・グ
リセア(Magnaporthe grisea)のゲノム内のアクチベーター
領域を検出するためにp11ΔNdeIを使用しうることを示唆している。
、1.3kbの全プロモーターの制御下でniaD遺伝子を含有する新規構築物
pNiL160(1μg)およびpCB1179(1μg)で同時形質転換した
。該同時形質転換体を、SPE5およびSPE3プライマーを使用する増幅によ
りスクリーニングし、ついで米培地上に播いて分生子を得た。復帰突然変異体を
同定するために、後者をMNO3培地(ディッシュ当たり胞子約105〜106 個)上でプレーティングした。19個の同時形質転換体に関して行なった実験は
、それらの場合の100%において復帰突然変異体を得ることを可能にした。い
くつかは、26℃で10日の培養から生じた。復帰突然変異体の数は、考慮され
る同時形質転換体に応じて2〜83の様々な数となる。8個の異なる同時形質転
換体に属する53個の復帰突然変異体を、インパラの全コード領域に相当するプ
ローブを使用するサザンブロットにより分析した。図5は、9個の無作為に選ば
れた復帰突然変異体におけるインパラトランスポゾンの移動度を示す。この実験
から得られたエム・グリセア(M.grisea)におけるインパラ再挿入の割
合(%)は74%に達する。これらの再挿入体のうち、それらの95%は異なる
。より詳しくは、再挿入体のすべてが異なる100%の再挿入を与える同時形質
転換体を同定した。
ンスポゾンの新規挿入を有する多数の復帰突然変異体がマグナポルセ・グリセア
(Magnaporthe grisea)において選択されることを可能にす
ることを示している。
RF6)から得られた18個のnia+復帰突然変異体のサザンブロット分析は
、それらの100%が、該ゲノム内に再挿入されたインパラを有することを示し
た。350個のnia+復帰突然変異体のコレクションを得るために、この同時
形質転換体を選択した。該同時形質転換体を米培地上で14日間培養する。該胞
子を、ペトリ皿当たり3mlの蒸留水中に収穫し、菌糸残渣の除去のために半融
ガラス上で濾過して、ディッシュ(12×12cmの形態)当たり胞子106個
の比率でNaNO3培地上にプレーティングする。該ディッシュを26℃でイン
キュベートする。16〜21日後にnia+復帰突然変異体が出現する。それら
をNaNO3培地上で継代培養し、14日間培養し、該胞子を寒天−水培地(H
20中の2%アガロース)上にプレーティングする。26℃で8時間後、各復帰
突然変異体からの1個の胞子を個々にNaNO3培地上で継代培養して、該復帰
突然変異体を精製し、そのnia+表現型を確認する。
には有意でない成長および該同時形質転換体の灰色とは異なる暗褐色を米培地お
よびNaNO3培地上で示す復帰突然変異体(Rev2)の検出を可能にした。
インパラ挿入に隣接する配列を特徴づけるために、3μgのRev2ゲノムDN
AをHindIIIで消化し、逆PCRにより分析した。消化後、該DNAをフ
ェノール/クロロホルム抽出工程に付し、ついで7.5M酢酸アンモニウムで沈
殿させる。このようにして得られたペレットを40μlのMilliQ水中に採
取する。8μlの消化DNA上で連結を行ない、該DNAを、前記のとおりに、
フェノール/クロロホルム抽出に付し、7.5M酢酸アンモニウムで沈殿させる
。該DNAを10μl中に採取し、それらのすべてを、インパラトランスポゾン
の配列上で選択される及び発散的に位置するImpE5’(5’GGCATTG
AAAACGCGGTCCC3’)およびImpE3’(5’CAGCAGCA
AAACAGCTGCCC3’)プライマーを使用するPCR工程に使用する。
該IPCR産物の配列決定は、オープンリーディングフレーム内の重複したTA
ジヌクレオチドにおいて該トランスポゾンが挿入されうことを示すことを可能に
した。tblastxプログラム(Altschulら,1990)を使用して
データバンクを調べることにより、この突然変異配列とDNA修復に関与するタ
ンパク質ファミリーとの間で、さらに詳しくは、サッカロミセス・セレビシエ(
Saccharomyces cerevisiae)のMLH1タンパク質(
Prollaら,1994)に対して、非常に強い相同性が示された。
の350個の復帰突然変異体を米葉および大麦葉上で試験した。該復帰突然変異
体を米培地上で14日間培養する。生成した胞子を、3mlの水の存在下、菌糸
を擦り取ることにより収穫し、ついでThomasセル下で計数する。該胞子懸
濁液を105胞子/mlにまで調節し、キネチン(エタノール中の2mg/ml
のストック溶液の1ml/l)で補足された寒天培地(1%寒天)上に生存条件
中で配置された数片の米(品種Sariceltik)の葉および大麦(品種E
xpress)の葉上に、原綿の芽(cotton wool bud)を使用
して塗布する。26℃で4日間インキュベートした後、該徴候を、野生型G11
.174株で生じた徴候と比較する。復帰突然変異体77は非病原性であること
が判明した。この突然変異体中のインパラ挿入に隣接した配列を、BamHIで
の該ゲノムDNAの消化の後、前記の条件下、逆PCRにより回収した。回収さ
れた産物は、この場合もまた、オープンリーディングフレーム内に位置する重複
したTAジヌクレオチドにおける該トランスポゾンの挿入を証明した。この産物
の配列で該データバンクを調べたところ、有意な相同性は示されなかった。この
産物を使用して、エム・グリセエア(M.grisea)コスミドライブラリー
をプローブした。該増幅産物にハイブリダイズするコスミドをクローニングし、
マッピングし、部分的に配列決定した。したがって、考慮するリーディングフレ
ームに応じて2つの潜在的ORF(ORF1およびORF2)内にインパラトラ
ンスポゾンは挿入されるらしい(図6)。このコスミドのSalI/NotI断
片を、ビアロフォス耐性を付与するBar遺伝子を保持するpCB1531ベク
ター(pCB1531*ベクター)(Sweigardら,1997)内にサブ
クローニングした。Rev77プロトプラストを得、3μgのpCB1531* プラスミドまたは対照としての3μgのpCB1531プラスミドで形質転換し
、ビアロフォス(30〜40μg.ml−1)で補足されたTNKYEショ糖(
400g.1−1)培地上に配置した。該耐性コロニーを、ビアラフォス(30
μg.ml−1)で補足されたTNKYEグルコース上で培養し、米培地上で1
4日間、胞子形成させる。該胞子を収穫し、該懸濁液を胞子105個.ml−1 で補正し、ついで、前記のとおりにそれらの病原性に関して試験する。予想どお
り、pCB1531を保持する形質転換体は、Rev77と同様に、非病原性の
ままであり、一方、pCB1531*を保持するコロニーは再び病原性となる。
これらの結果は、インパラトランスポゾンが、エム・グリセア(M.grise
a)の感染力に関与する遺伝子を標識することを可能にしたことを示している。
ロモーター内へのインパラのクローニングを可能にするプラスミドを構築した。
pAN7.1ベクター(Puntら,1987)のBglII−HindIII
二重消化は、gpd遺伝子のその137塩基対から欠失したプロモーターおよび
TrpC遺伝子のターミネーターおよびhph遺伝子のコード領域をコードする
全ORFを含有する3988bp断片の遊離を可能にする。この断片の付着末端
を、DNAポリメラーゼの作用により平滑末端内に形質転換した。ついでこの断
片を、pBluescript SK−プラスミドに由来し複製起点およびアン
ピシリン耐性遺伝子を保持する2.5kbのPvuII断片に連結した。それか
ら得られたプラスミドは、マグナポルセ・グリセア(Magnaporthe
grisea)において、ハイグロマイシン耐性形質転換体を得ることを可能に
する。pCITn(図7)として公知のこのベクターは、インパラまたは他の任
意のトランスポゾンがクローニングされうる、転写+1点の30bp上流に位置
する唯一のPvuII部位を有する。
グにより選択するのを可能にする自律的因子を得るために、トランスポザーゼを
コードするリーディングフレームの終結コドンの下流の該因子の2つのITRの
間にハイグロマイシン耐性遺伝子をクローニングした。これを行なうために、該
ハイグロマイシン耐性カセットを、SalI消化によりpCB1004プラスミ
ド(Sweigardら,1997)から回収し、該末端をクレノウでの処理に
より平滑化した。このカセットを、NheI部位で線状化されクレノウで処理さ
れたpNi160プラスミドに連結する。得られたプラスミドをBamHIおよ
びApaI酵素で消化する。修飾されたインパラトランスポゾンを含有する22
85bpの断片を回収し、これらの同じ酵素で消化されたpAN301ΔNde
Iの7397bpの断片に連結する。これは、niaDの転写の方向(pNiH
YGプラスミド)または逆方向(pNiGYHプラスミド)に挿入された、ハイ
グロマイシン耐性カセットで標識されたインパラトランスポゾンが硝酸レダクタ
ーゼ開始コドンの8bp上流に挿入された1.3kb長のniaDプロモーター
を保持する9682bpのプラスミドを与える。
トを3μgのpNiHYGプラスミドまたは3μgのpNiGYHプラスミドで
形質転換した。これらの形質転換体について、既に記載されている条件下でni
a+復帰突然変異体の選択を行なった。サザンブロットによる同じ同時形質転換
体の3個のnia+復帰突然変異体の分析は、このようにして標識されたインパ
ラトランスポゾンが自律性のままであること、すなわち、それが、niaD遺伝
子から独立して存在し該ゲノム内に再挿入されうることを示している(図8)。
されうることを示すことが必要である。このためには、まず、該トランスポザー
ゼを構成的プロモーターの制御下に配置する。ついで、該欠損因子の安定化は、
構成的プロモーターまたはそれ自体のプロモーターの制御下でトランスポザーゼ
を保持する複製型プラスミドまたはトランスポザーゼの発現を制御する誘導プロ
モーターの使用を要する。硝酸レダクターゼをコードするマグナポルセ・グリセ
ア(Magnaporthe grisea)遺伝子のプロモーターの、誘導プ
ロモーターとしての使用が特に示されているようである。LauおよびHame
r(1996)は、マグナポルセ・グリセア(Magnaporthe gri
sea)由来の硝酸レダクターゼ遺伝子を含有するクローンに相当するプローブ
を使用するノーザンハイブリダイゼーションにより、それが、唯一の窒素源とし
ての硝酸塩の存在下では発現され、一方、それがグルタミンの存在下では完全に
抑制されることを示している。マグナポルセ・グリセア(Magnaporth
e grisea)由来のnia遺伝子のプロモーターの制御下にインパラトラ
ンスポザーゼを配置することにより、該酵素が合成され、ついで、該欠損因子が
、該復帰突然変異体の選択のための条件下(MNO3培地)で切除され、豊富な
培地(アンモニウムまたはグルタミンの存在下)上でそれを培養した場合に該復
帰突然変異体が得られたら、その産生が抑制されうるはずである。
は、インパラ因子にコードされたトランスポザーゼが、アスペルギルス・ニデュ
ランス(Aspergillus nidulans)由来のTrpC遺伝子の
制御下のハイグロマイシン耐性遺伝子(hph遺伝子)で置換されている。その
構築はHua−Van,1998に記載されている。該トランスポゾンのITR
中のhph遺伝子の存在は、得られた復帰突然変異体のゲノム内への該欠損因子
の組込みを保証しうる。
により得られたインパラトランスポザーゼをコードするORFで、β−グルクロ
ニダーゼをコードするORFを置換した後に、pNOM102プラスミドから誘
導される。このプラスミドは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergi
llus nidulans)由来の構成的gpdプロモーターおよびTrpC
ターミネーターの制御下でのトランスポザーゼの発現を可能にする(図10)。
で標識された欠損インパラコピーを導入するpHIN由来の2.8kb Bam
HI−ApaI断片でpAN301ΔNdeIの1kb BamHI−ApaI
断片を置換することにより構築した。pNiL160の場合と同様に、硝酸レダ
クターゼ遺伝子(niaD)は、その1.3kb長のプロモーターの制御下にあ
る(図11)。本発明者らの結果によれば、マグナポルセ・グリセア(Magn
aporthe grisea)における硝酸レダクターゼ活性を回復させるこ
とにより該欠損因子の切除を選択するためにはこのプラスミドを構築することが
必要である。
因子を含有する。このベクターを構築するためには、niaD遺伝子の配列に隣
接するインパラトランスポゾンを含有するpNiL160のBamHI/Nco
I断片(2472bp)を、pUC19のBamHI/AflIII断片(22
98bp)であって該プラスミドの複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを保持
するものに連結する。インパラトランスポザーゼの一部に対応する891bpの
XhoI/StyI断片をこのプラスミド上で欠失させる。このようにして線
状化された該プラスミドの末端をクレノウで平滑化し、pCB1635プラスミ
ド(Sweigardら,1997)のSalI消化およびクレノウにより得ら
れたビアラフォス耐性遺伝子(Trpcプロモーター::Bar,940bp)
に連結する。それから得られたプラスミドをBamHIおよびApaIで消化し
、pAN301ΔNdeIプラスミドの7397bpのBamHI/ApaI断
片に連結する。これにより、該トランスポゾンが欠損性でありBar遺伝子で標
識されておりniaD遺伝子のプロモーター(1.3kb)内に挿入されたpB
NiLプラスミドが得られる(図12)。
しており、それはもはや転位できず該トランスポザーゼ源のままである。該因子
をEcoRI/NheI二重消化によりpNi160プラスミドから切除し、該
末端をクレノウで平滑化し、該断片をpFAC1のBglII部位においてクロ
ーニングする(図13)。
174由来のプロトプラストをpHNiLプラスミドで形質転換するか、または
pHNiLおよびpEO6プラスミドで同時形質転換した。該形質転換方法はS
weigardら(1992)に記載されており、1μgの各プラスミドで行な
った。該プロトプラストを、グルコースがスクロース(400μg.1−1)で
置換され240μg.ml−1の比率でハイグロマイシンで補足されたTNKY
E培地上で選択する。該pHNiL形質転換体を、該欠損因子中の該耐性マーカ
ーの存在に基づき直接的に選択する。該同時形質転換体を、それらのゲノムDN
Aの抽出後、IV.3に記載のSPE5プライマーを使用する増幅によりハイグ
ロマイシン耐性コロニーから単離する。12個のハイグロマイシン耐性コロニー
上で行なったこの研究は、pEO6を同様に保持する4個のコロニーの単離を可
能にした。米粉に基づく固形培地上での胞子形成後、IV.3に記載のとおりに
nia+復帰突然変異体を選択するために、これらの同時形質転換体の及びpH
NiLを保持する6個の形質転換体の胞子(105〜106個)をMNO3培地
上でプレーティングした。pHNiLを保持する6個の形質転換体はいずれも、
そのような復帰突然変異体を与えなかった。これは、マグナポルセ・グリセア(
Magnaporthe grisea)に内因性のインパラの欠損コピーが、
トランスポゾンにより可動しえないことを示している。それらの4個のpHNi
L/pEO6同時形質転換体のうちの2個が気生性コロニーを与える(同時形質
転換体D1およびD9)。D1同時形質転換体由来の6個の復帰突然変異体のゲ
ノムDNAをEcoRIで消化し、hyg1(5’AGCCTGAACTCAC
CGCGACG3’)およびhyg4(5’CGACCCTGCGCCCAAG
CTGC3’)プライマーの使用により得られたhph遺伝子由来の868bp
のプローブでハイブリダイズさせた後の該復帰突然変異体のサザン分析は、それ
らの4個に関する該欠損因子の再挿入の特徴づけを可能にする(図14)。後者
のうちの2個の復帰突然変異体は、該因子の2個の挿入を含有する。この分析は
、トランスで与えられたインパラトランスポザーゼにより該欠損因子がマグナポ
ルセ・グリセア(Magnaporthe grisea)において可動されう
ることを示しうる。
agnaporthe grisea)においてクローニングされたnia遺伝
子のプロモーターの制御下にあるプラスミド(pNiaI)を構築することを含
む。このプラスミドは、pHINLと共に又はそれに由来する他の任意のプラス
ミド(該欠損因子の挿入により不活性化されたアスペルギルス・ニデュランス(
Aspergillus nidulans)由来のniaDプロモーターが、
該復帰突然変異体の選択に使用するマーカー遺伝子の発現を制御するもの)と共
に使用される。該同時形質転換体の選択を促進するために、該因子の欠損コピー
を保持するプラスミド中に存在するものとは異なる耐性マーカーをpNiaIに
付加すべきである。
、gpdA遺伝子のプロモーターの制御下、該欠損因子中またはpHNiLプラ
スミド中に存在するものとは異なる選択マーカーを保持するpFAC1ベクター
中にクローニングすることができる。
れを構築するために用いたマッピング。
により得られた同時形質転換体の分子分析。
に相当する(レーン1)またはインパラトランスポザーゼをコードするORFに
相当する(レーン2)放射性プローブを使用したC14−1復帰突然変異体の分
析。 B:nia+単胞子を単離することにより精製された後のC14−1およびC
14−2復帰突然変異体の分析。
復帰突然変異体の分子分析。 A:インパラトランスポザーゼをコードするORFに相当する放射性プローブ
に対するサザンハイブリダイゼーションにより、該DNA断片が示される。 B:pAN301中に存在するniaD遺伝子の2.7kb EcoRI断片
に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該D
NA断片が示される。
ORFの概要図。
突然変異体の分子分析。 A:インパラトランスポザーゼをコードするORFに相当する放射性プローブ
に対するサザンハイブリダイゼーションにより、該DNA断片が示される。 B:pAN301中に存在するniaD遺伝子の2.7kb EcoRI断片
に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該D
NA断片が示される。
a+復帰突然変異体の分子分析。
Claims (19)
- 【請求項1】 インパラ(Impala)トランスポゾンの挿入により不活
性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、マグナポルセ・
グリセア(Magnaporthe grisea)において機能的であり該マ
ーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結されたプロモーター調節配列を転写の
方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項2】 該プロモーター調節配列が、マグナポルセ・グリセア(Ma
gnaporthe grisea)または別の真菌、特に糸状菌由来の遺伝子
のプロモーター調節配列である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項3】 該プロモーター調節配列が真菌性niaDまたはgpdA遺
伝子のプロモーター調節配列よりなる、請求項1および2のいずれか1項に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 該プロモーター調節配列が、マグナポルセ・グリセア(Ma
gnaporthe grisea)において機能的である、アスペルギルス・
ニデュランス(Aspergillus nidulans)由来のniaD遺
伝子のプロモーター調節配列である、請求項3に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項5】 アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus
nidulans)由来のniaD遺伝子のプロモーター調節配列が0.4kb
を超える長さである、請求項4に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項6】 マーカー遺伝子のコード配列が、レポーター遺伝子、特にG
USまたはGFPのコード配列、抗生物質または除草剤に対する耐性に関する遺
伝子、特にハイグロマイシン耐性遺伝子(hph)、フレオマイシン耐性遺伝子
(ble)または除草剤ビアラフォス耐性遺伝子(Bar)、またはスルホニル
尿素耐性遺伝子のコード配列から選ばれる、請求項1〜5のいずれか1項に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項7】 該マーカー遺伝子が、真菌において機能的である酵素、特に
硝酸レダクターゼ(niaD)またはニトリラーゼをコードする遺伝子から選ば
れる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項8】 該マーカー遺伝子が、アスペルギルス・ニデュランス(As
pergillus nidulans)由来の硝酸レダクターゼ遺伝子である
、請求項7に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項9】 該インパラトランスポゾンが、前記請求項のいずれか1項に
記載のポリヌクレオチドのプロモーター調節配列内に組込まれている、請求項1
〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項10】 該インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、請求
項1〜9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項11】 該インパラトランスポゾンが欠損性である、請求項1〜1
0のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項12】 真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、 a)マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内へ
のその再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性
化された該マーカー遺伝子を含む請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリヌ
クレオチドで該真菌を形質転換し、 b)該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製
造方法。 - 【請求項13】 真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、 a)請求項11に記載の欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化され
たマーカー遺伝子を含むポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、 b)該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入
およびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用
いて、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、 c)該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製
造方法。 - 【請求項14】 真菌における検出可能な表現型に関連した遺伝子の同定方
法であって、 a)請求項12または13に記載の製造方法の1つに従い、該真菌のゲノム内に
インパラトランスポゾンを挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、 b)前記の検出可能な表現型を有する少なくとも1つの挿入突然変異体を選択し
、 c)該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する
工程を含んでなる方法。 - 【請求項15】 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド
で形質転換された宿主生物。 - 【請求項16】 該宿主生物が真菌である、請求項15に記載の宿主生物。
- 【請求項17】 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド
がゲノム内に組込まれている真菌。 - 【請求項18】 該マーカー遺伝子が真菌硝酸レダクターゼ遺伝子であり、
該真菌がnia−である、請求項17に記載の真菌。 - 【請求項19】 インパラトランスポゾンがゲノム内に組込まれた、マグナ
ポルセ(Magnaporthe)またはペニシリウム(Penicilliu
m)属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突然変異体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9903701A FR2791361B1 (fr) | 1999-03-22 | 1999-03-22 | Fragment d'acide nucleique comprenant un gene fonctionnel dans magnaporthe et un transposon impala |
FR99/03701 | 1999-03-22 | ||
PCT/FR2000/000713 WO2000056902A1 (fr) | 1999-03-22 | 2000-03-22 | POLYNUCLEOTIDES POUR LA MUTAGENESE INSERTIONNELLE CHEZ LE CHAMPIGNON COMPRENANT UN GENE FONCTIONNEL DANS MAGNAPORTHE ET UN TRANSPOSON $i(IMPALA) |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010288195A Division JP2011087596A (ja) | 1999-03-22 | 2010-12-24 | マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002539794A true JP2002539794A (ja) | 2002-11-26 |
JP2002539794A5 JP2002539794A5 (ja) | 2011-03-10 |
JP4782288B2 JP4782288B2 (ja) | 2011-09-28 |
Family
ID=9543602
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000606761A Expired - Fee Related JP4782288B2 (ja) | 1999-03-22 | 2000-03-22 | マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド |
JP2010288195A Withdrawn JP2011087596A (ja) | 1999-03-22 | 2010-12-24 | マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010288195A Withdrawn JP2011087596A (ja) | 1999-03-22 | 2010-12-24 | マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6617163B1 (ja) |
EP (1) | EP1163350B1 (ja) |
JP (2) | JP4782288B2 (ja) |
AT (1) | ATE309380T1 (ja) |
AU (1) | AU772711B2 (ja) |
CA (1) | CA2366203A1 (ja) |
DE (1) | DE60023854T2 (ja) |
FR (1) | FR2791361B1 (ja) |
WO (1) | WO2000056902A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001038509A1 (de) * | 1999-11-26 | 2001-05-31 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur mutagenese von nukleotidsequenzen aus pelanzen, algen oder pilzen |
EP2078727A1 (en) | 2002-03-13 | 2009-07-15 | Bayer CropScience SA | Mutagenesis of aspergillus fungi and identification of genes essential for growth |
US20060160223A1 (en) * | 2002-07-05 | 2006-07-20 | Thierry Lacour | Plasmid vectors for transformation of filamentous fungi |
US20050181509A1 (en) * | 2004-02-12 | 2005-08-18 | The Penn State Research Foundation | Dual selection based, targeted gene disruption method for fungi and fungus-like organisms |
US20220119828A1 (en) | 2019-02-22 | 2022-04-21 | Bio Palette Co., Ltd. | Nucleic acid for editing genome of plant cell and use thereof |
CA3209014A1 (en) * | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Nuclear Rna Networks, Inc. | Compositions and methods for modulating gene transcription networks based on shared high identity transposable element remnant sequences and nonprocessive promoter and promoter-proximal transcript |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2627508B1 (fr) * | 1988-02-22 | 1990-10-05 | Eurolysine | Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede |
US5985570A (en) * | 1995-03-21 | 1999-11-16 | Genencor International, Inc. | Identification of and cloning a mobile transposon from Aspergillus |
-
1999
- 1999-03-22 FR FR9903701A patent/FR2791361B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-22 CA CA002366203A patent/CA2366203A1/fr not_active Abandoned
- 2000-03-22 DE DE60023854T patent/DE60023854T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-22 WO PCT/FR2000/000713 patent/WO2000056902A1/fr active IP Right Grant
- 2000-03-22 EP EP00912722A patent/EP1163350B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-22 JP JP2000606761A patent/JP4782288B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-22 AU AU34379/00A patent/AU772711B2/en not_active Ceased
- 2000-03-22 AT AT00912722T patent/ATE309380T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-22 US US09/937,236 patent/US6617163B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-07-08 US US10/614,923 patent/US7393639B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-12-24 JP JP2010288195A patent/JP2011087596A/ja not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6009066095, BioEssays, 199808, Vol.20, p.652−659 * |
JPN6009066100, J. Genet., 199612, Vol.75, No.3, p.325−339 * |
JPN6009066103, Mol. Gen. Genet., 1995, Vol.246, No.1, p.19−28 * |
JPN6009066107, Mol. Plant Microbe Interact., 2001, Vol.14, No.3, p.308−315 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20050260759A1 (en) | 2005-11-24 |
WO2000056902A1 (fr) | 2000-09-28 |
DE60023854T2 (de) | 2006-07-27 |
FR2791361A1 (fr) | 2000-09-29 |
JP2011087596A (ja) | 2011-05-06 |
CA2366203A1 (fr) | 2000-09-28 |
US6617163B1 (en) | 2003-09-09 |
ATE309380T1 (de) | 2005-11-15 |
US7393639B2 (en) | 2008-07-01 |
DE60023854D1 (de) | 2005-12-15 |
EP1163350B1 (fr) | 2005-11-09 |
FR2791361B1 (fr) | 2002-12-06 |
AU772711B2 (en) | 2004-05-06 |
JP4782288B2 (ja) | 2011-09-28 |
EP1163350A1 (fr) | 2001-12-19 |
AU3437900A (en) | 2000-10-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102607893B1 (ko) | 지베렐린 대사의 조작을 통해 저신장 식물의 수확량을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 | |
Le et al. | Two new S‐phase‐specific genes from Saccharomyces cerevisiae | |
Andrianopoulos et al. | Cloning and analysis of the positively acting regulatory gene amdR from Aspergillus nidulans | |
Brookman et al. | Molecular genetics in Aspergillus fumigatus | |
Kang et al. | Molecular analysis of nuc-1+, a gene controlling phosphorus acquisition in Neurospora crassa | |
JP2011087596A (ja) | マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド | |
CN112410234B (zh) | 一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法 | |
US20050164393A1 (en) | Method for identifying genes encoding signal sequences | |
EP0920521A1 (en) | IDENTIFICATION OF AND CLONING A MOBILE TRANSPOSON FROM $i(ASPERGILLUS) | |
US20080172763A1 (en) | Nod-Factor Perception | |
Gatherar et al. | Identification of a novel gene hbrB required for polarised growth in Aspergillus nidulans | |
Li et al. | Mir1 is highly upregulated and localized to nuclei during infectious hyphal growth in the rice blast fungus | |
Yun | Molecular genetics and manipulation of pathogenicity and mating determinants in Mycosphaerella zeae-maydis and Cochliobolus heterostrophus | |
WO1993022422A1 (en) | Genetically engineered eukaryotic organism capable of detecting the expression of heterologous ion channels | |
Riggle et al. | Two transcripts, differing at their 3′ ends, are produced from the Candida albicans SEC14 gene | |
Hughes et al. | Plasmid maintenance functions encoded on Dictyostelium discoideum nuclear plasmid Ddp1 | |
JPH06189769A (ja) | 変異型aox2プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 | |
US20100047838A1 (en) | Yeast genes that affect viral replication | |
Nag et al. | SSP1, a gene necessary for proper completion of meiotic divisions and spore formation in Saccharomyces cerevisiae | |
US20050244861A1 (en) | Nucleic acids essential for expression of hyphal-specific genes and methods for using the same | |
Garfinkel et al. | [23] Ty mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae | |
CN114891800B (zh) | 玉米穗长基因及其应用 | |
JP4920865B2 (ja) | 緑色組織特異的プロモーター | |
CN111295447B (en) | Corn elite event MZIR098 | |
Noble | The BRR genes encode novel factors involved in RNA processing |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091222 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100315 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100323 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100621 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100824 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20101222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101224 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20101224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20101222 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110302 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110602 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110628 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110707 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140715 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |