DE60222914T2

DE60222914T2 - Systeme zur stellengerichteten in-vivo-mutagenese mit oligonukleotiden

Info

Publication number: DE60222914T2
Application number: DE60222914T
Authority: DE
Inventors: Francesca Durham STORICI; Michael A. Chapel Hill RESNICK; Lysle Kevin San Marcos LEWIS
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2022-07-27
Also published as: ATE375388T1; EP1421187B1; US7314712B2; EP1421187A4; JP2005500841A; AU2002319696B2; WO2003012036A2; DE60222914D1; EP1421187A2; WO2003012036A3; US20040171154A1; CA2455013A1

Description

Gebiet
Diese Offenlegung befasst sich mit Methoden der zielgerichteten (ortsspezifischen) in vivo-Mutagenese, insbesondere der durch Oligonukleotide vermittelten Mutagenese. Sie befasst sich ferner mit Methoden der zielgerichteten (ortsspezifischen) in vivo-Mutagenese, die durch in vivo eingebrachte Doppelstrangbrüche ausgelöst und durch Oligonukleotide vermittelt wurde.
Hintergrund der Offenlegung
Die Genomsequenzierung bietet in Verbindung mit den artübergreifenden Gemeinsamkeiten genetischer Funktionen zwei Möglichkeiten, die Gene höherer Organismen zu charakterisieren: Durch Analyse ortsspezifischer Veränderungen an homologen Genen in Modellsystemen und durch Analyse der Gene höherer Eukaryoten, die in Modellorganismen kloniert wurden. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae hat sich als ideal für viele artübergreifende Studien erwiesen. Der wachsende Umfang an Erkenntnis und an technischem Wissen, der ihr Genom zu dem am besten charakterisierten der Eukaryoten gemacht hat (Dujon, Trends Genet. 12, 263–270, 1996; Hieter et al., Nat. Genet. 13, 253–255, 1996; Resnick and Cox, Mutat. Res. 451, 1–11, 2000; Shashikant et al., Gene 223, 9–20,1998), ermöglicht auch die experimentelle Manipulation großer, heterogener genomischer DNS-Fragmente, die in künstlichen Hefechromosomen (YAC) kloniert wurden (Anand, Trends Biotechnol. 10, 35–40, 1992: Larionov et al., Proc. Natl. Acad_Sci. USA 94, 7384–7387, 1997; Brown et al., Trends Biotechnol. 18.218–23,2000).
Wenngleich es möglich ist, in Hefezellen natürliche Chromosome oder YAC ohne irgendwelche Rückstände heterologer Sequenzen zu modifizieren, haben die gegenwärtigen Systeme eine begrenzte Flexibilität und sind mühselig. Null-Mutationen in Hefe erfolgen z. B. für gewöhnlich durch Genaustausch („gene replacement") in der Weise, dass ein Markierungsgen die Sequenz ersetzt, die deletiert wird (Wach et al., Yeast 10, 1793–1808, 1994). Marker-Recycling-Verfahren, die auf homologer oder ortsspezifischer Rekombination oder Religation von DNS-Enden beruhen, hinterlassen außerdem heterologes Material an dem deletierten Locus, z. B. hisG (Alani et al., Genetics 116, ti41-S45, 25 1987), FRT (Storici et al., Yeast 15, 271–283, 1999), loxP (Delneri et al., Gene 252, 121–135, 2000), oder I-Scel-Sequenzen (Fairhead et al., Yeast 12, 1439–1457, 1996). Um Sequenzmodifikationen zu erzielen, ohne dass heterologes Material entsteht, ist Subklonieren und in vitro-Mutagenese erforderlich (Scherer and Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4949–4955, 1979; Barton et al, Nucleic Acids Res. 18, 7349–7355, 1990). Auf PCR beruhende Verfahren, die kein Klonieren mit einbeziehen, sind ineffizient oder erfordern mehrere Reaktionsschritte, was das Risiko weiterer Mutationen erhöht (Langle-Rouault and Jacobs, Nucleic Acids Res. 23, 3079–3081, 1995: Erdeniz et al., Genome Res. 7, 1174–1183, 1997). Ein alternativer Ansatz wurde an Hefe für das CYC1-Gen vorgezeigt, die auf Transformation mit einem Oligonukleotid beruht (Moerschell et al., Proc. Natl. Acad_Sci. USA 85, 524–528, 1988), aber die Methode ist beschränkt auf die Erzeugung von Mutanten mit einem wählbaren Phänotyp und scheint zielabhängig zu sein (Kmiec, "Targeted Gene Repair" [≈"„Gezielte Genreparatur"] [Leitartikel], Gene Ther. 6, 1–3, 1999). Im Zusammenhang mit Gap-Repair können Oligonukleotide auch zur Modifizierung von Plasmiden in Hefezellen eingesetzt werden (Duno et al., Nucleic Acids Res. 27:e1, 1999), allerdings ist diese Vorgehensweise durch die Verfügbarkeit von Restriktionsschnittstellen beschränkt.
Zhi-Wei Li et al. haben in einem Artikel mit dem Titel "Generation of mice with a 200-kb amyloid precursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediated site specific recombination in embryonic stem cells" in der Fachzeitschrift Proc. Natl. Acad. Sci. USA[Vol. 93; pp6158-6162; June 96] eine Strategie angewendet, die die Insertion von loxP-Sequenzen oberhalb und unterhalb des Bereichs, der durch homologe Rekombination deletiert werden soll und eine durch Insertion eines Cre-Expression-Vektors in die embryonale Mäusestammzelle bewirkte Exzision des loxP-flankierten Bereichs umfasst.
In der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0919619 wird die Genexpression einer endogenen Nukleinsäuresequenz (I) in einer eukaryotischen Zelle durch homologe Rekombination (HR) entweder einer Steuersequenz für die heterologe Genexpression (heterologous expression control sequence, HEC) und/oder eines Verstärkergens (amplification gene, AG) oder mindestens einer Nukleinsäuresequenz (A), die an ein Aktivierungsprotein (AP) gebunden ist, abgeändert. Die Zielzellen werden mit einem Vektor transfiziert, zu dem (1) mindestens eine HEC und ein AG, ein Markierungsgen für die positive Selektion (SMGP), mindestens zwei. Zielsequenzen (target sequence, TS) für eine ortsspezifische Rekombinase (site specific recombinase, SSR), flankierende HEC, AG und SMGP und flankierende HEC, AG, SMGP und TS, DNS-Sequenzen, die homolog zu einem Bereich des Zellgenoms sind, in dem HR auftreten kann; oder (2) mindestens eine (A), SMGP und flankierende DNS-Sequenzen wie oben gehören. Transfizierte Zellen werden kultiviert, um das Auftreten von HR zu ermöglichen.
WO 90/14092 ist eine Darlegung der Verwendung eines Einzelstrang-Oligonukleotids zur ortsspezifischen Modifikation in Säugetierzellen, um Gene zu verändern, durch die Proteine von Interesse kodiert werden.
WO 96/41008 ist eine Darlegung von Methoden, Zusammenstellungen und Werkzeugen zur Herbeiführung von homologen Rekombinationen, bei denen in einem Fall die Methode zwei eingeführte DNS verwendet, genau gesagt, ein mutagenes, gebundenes Einzelstrang-Oligonukleotid mit der Fähigkeit, sich insbesondere an Doppelstrang-DNS anzubinden und eine Triple-Helix zu bilden, und ein Spender-DNS-Fragment mit der Fähigkeit, sich einer homologen Rekombination mit der DNS zu unterziehen, auf die das Oligonukleotid angesetzt ist.
Elodie Biet et al. haben in einem Artikel mit dem Titel "Stimulation of RecA-mediated D-loop formation by oligonucleotide (0007J W096/41 directed triple-helix formation; guided homologous recombination (GOREe)", in der Fachzeitschrift Biochemistry (2001, 40: 1779–1786) gezeigt, dass ein Triple-Helix-bildendes Oligonukleotid die Effizienz der D-loop-Bildung steigert und dass das RecA-Protein ebenfalls die Triple-Helix-Bildung beschleunigt.
Zusammenfassung der Offenlegung
Diese Offenlegung bietet einfache und effektive Methoden an, die gereinigte und ungereinigte Oligonukleotide verwenden, um gezielte Mutationen in vivo herbeizuführen, z. B. in chromosomaler Hefe-DNS, in der Art, dass nach Abschluss der Mutagenese keine heterologe Sequenz zurückbleibt. Spezielle Methoden bieten gezielte Mutagenese an, einschließlich einzelner oder mehrfacher Punktmutationen, kurzer Deletionen oder kurzen Insertionen. Des Weiteren werden Methoden angeboten für umfassendere Deletionen präziser Nukleinsäuresequenzen. Eine Vielzahl einzelner und komplementärer Oligonukleotide wurde untersucht, und Parameter, die die ortsspezifische Mutagenese beeinflussen (z. B. die Oligonukleotid-Länge), werden beschrieben. Des Weiteren werden Methoden angeboten, die mehrere Mutationen in Folge sowie Zufallsmutagenese in einem bestimmten Bereich ermöglichen. Die Vorgehensweisen bei der Mutagenese können bei allen Organismen angewendet werden, bei denen homologe Rekombination ausgeführt wird oder ausgeführt werden kann.
Die in zwei Schritten ohne Klonierung ausgeführten Methoden erzeugen in vivo mutierte Produkte, die ausschließlich die gewünschten Mutationen aufweisen, wie z. B. einzelner oder mehrfacher Basenaustausch, oder eine kleine oder große Deletion. Delitto perfetto (ein Begriff, der verwendet wird, um die „vollkommene Deletion" zu kennzeichnen) Mutagenese ist äußerst vielseitig. Sie ermöglicht mehrfache Durchläufe von gezielten oder zufälligen Änderungen innerhalb eines bestimmten Fensters von 200 bp oder mehr. Da Hefe gewöhnlich für das zufällige und gezielte Klonieren von genomischer DNS höherer Eukaryoten, wie z. B. YAC, verwendet wird, bietet diese Strategie auch eine effiziente Möglichkeit, um präzise Änderungen an Säugetier- und anderen heterologen DNS-Sequenzen herbeizuführen.
Diese Offenlegung bietet des Weiteren Werkzeuge an, einschließlich spezieller Kassetten oder Klassen von Kassetten, die die Anwendbarkeit von delitto perfetto-Systemen auf praktisch alle Hefestämme ausdehnen, unabhängig von ihrem genetischen Hintergrund. Spezielle Ausführungsformen umfassen die Erzeugung großer chromosomaler Deletionen, bis zu 16 kb mit hoher Präzision. Ein Satz von vier alternativen speziellen CORE-Kassetten wird dargestellt, der verwendet werden kann, um das System für alle haploiden Hefestämme anwendbar zu machen, einschließlich nicht-auxotropher Wildtyp-Stämme.
Zusätzlich zu den gewöhnlichen URA3KI, G418 und Hygromycin-Resistenzgenen wurde ein neuartiger Gegenselektionsmarker entwickelt und dargestellt basierend auf dem menschlichen p53-Allel V122A. Das delitto perfetto-Mutagenesesystem kann sowohl in diploiden als auch in haploiden Stämmen verwendet werden. Die geänderte Transaktivationsspezifität dieses Allels verhindert ein Wachstum, wenn es überexprimiert wurde, ohne die Genom-Aktivität zu beeinflussen.
Zusätzlich präsentiert diese Offenlegung Modifikationen des delitto perfetto-Systems, die eine dramatisch verbesserte Rekombinationseffizienz bieten, in einigen Ausführungen eine mehr als 1000-fache Steigerung der Effizienz. Diese Ausführungen, die Methoden benutzen, die allgemein als delitto perfetto-DSB bezeichnet werden, machen sich den Einsatz von eingeführten ortsspezifischen DSB (Doppelstrangbrüche) in das Genom zunutze, um die gezielte Oligonukleotid-Mutagenese zu verstärken. Spezielle Beispiele für die DSB-verstärkte delitto perfetto-Mutagenese erfordern nicht und beinhalten nicht den Gebrauch eines Gegenselektionsmarkers.
Die obigen und andere Besonderheiten und Vorzüge werden offenkundiger werden durch die nachfolgende detaillierte Beschreibung mehrerer Ausführungen, die mit Verweisen auf die zugehörigen Abbildungen erfolgen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist eine schematische Darstellung, die zwei Ausführungsformen des delitto perfetto-Systems veranschaulicht, die integrative rekombinante Oligonukleotide (integrative recombinant oligonucleotides, IROs) verwenden. Eine Ausführung veranschaulicht die Deletion einer Sequenz, und die andere veranschaulicht die Herbeiführung einer spezifischen Punktmutation.
In Schritt 1 wird bei beiden Systemen eine CORE(COunterselectable REporter)-Kassette mit KIURA3 (Gegenselektionsmarker) und kanMX4 (Reportergen) mit üblichen DNA-Targeting-Verfahren in eine DNS-Sequenz eingeführt. Bei diesen Ausführungen erfolgt die Insertion an einer beliebigen Stelle der Sequenz, die zur Deletion vorgesehen ist, oder die in der Nähe einer Stelle ist, wo eine spezielle Mutation herbeigeführt werden soll.
In Schritt 2 führt die Transformation von Zellen, die die CORE-Kassette mit IRO enthalten, zu einem Verlust der CORE-Kassette und (1) Deletion des gewünschten Bereichs oder (2) zur Einführung der gewünschten Mutation(*). Generische DNS-Sequenzen werden durch getüpfelte oder gestreifte Kästchen angezeigt. Bei den dargestellten Ausführungen liegt eine kurze Überlappung der IRO vor.
2 veranschaulicht verschiedene spezifische Änderungen, die in den angezeigten Sequenzen durch Transformation mit IRO hervorgerufen werden.
Zielorte innerhalb von MLP2 (A), POL30 (B), TRP5 (C), SIR2 (D, E), RAD50 (F) und MRE11 (G) werden zusammen mit ihrer Wildtyp-Nukleotid- und Aminosäuresequenz gezeigt. Sternchen (*) kennzeichnen Stoppcodons. DNS-Sequenzänderungen und die entsprechenden Aminosäure-Substitutionen werden in Fettschrift unter den Pfeilen gezeigt. Vertikale gestrichelte Linien zeigen in jeder Sequenz die Position an, wo die CORE-Kassette eingebracht wurde, um die angezeigte Mutation durchzuführen. Die kleinen Zahlen über jeder natürlichen DNS-Sequenz entsprechen der Nukleotid-Position relativ zu der Stelle, an der die CORE-Kassette eingefügt wurde.
3 zeigt die Struktur verschiedener Typen von IRO, die einzeln oder paarweise eingesetzt wurden, um in vivo-Mutationen zu erzeugen, wie sie in den Beispielen beschrieben werden und außerdem die relative Transformationseffizienz der veranschaulichten Systeme.
Die IRO a und b überlappen sich um 20 Basen an ihren 3'-Enden, während sich c und d um 20 Basen an ihren 5'-Enden überlappen; e und f, e1 und f1 und e2 und f2 überlappen sich vollständig. Die IRO-Paare e + j und f + i überlappen sich nicht. Die Längen der IRO-Nukleotide werden links angegeben.
Die waagerecht gestrichelten Linien zeigen eine in vitro-Verlängerung des a + b Oligonukleotidpaares mit pfx-Polymerase. Die senkrechte gestrichelte Linie trennt die Sequenzen innerhalb von IRO, die homolog zu den jeweiligen Bereichen oberhalb und unterhalb der CORE-Kassetten-Insertionssstelle sind (und zeigt dadurch an, wo die CORE-Kassette vor ihrem Verlust zu finden war).
Eine qualitative Zusammenfassung der Transformationseffizienzen wird rechts von den verschiedenen IRO wiedergegeben; ++, + und – zeigen jeweils eine hohe, mäßige oder sehr niedrige Effizienz an.
4 zeigt die spezifischen Häufigkeiten von 5-FOA^RG418^S-Klonen pro 10⁷ Zellen bei Transformationsversuchen mit Einzel-IRO (A) oder mit Paaren von IRO in dem Strang BY4742-TRP5-CORE und dem isogen rad52-Strang. Vertikale Balken geben die 95%-Zuverlässigkeitsintervalle von 3 bis 6 Bestimmungen wieder.
Die Typen der analysierten IRO werden unter dem jeweiligen Balken angegeben (IRO sind so wie in 3 veranschaulicht). Pfx zeigt an, dass die Oligonukleotide vor der Transformation einer in vitro-Verlängerung ausgesetzt waren, und rad52 kennzeichnet solche Resultate, die mit dem rad52-Strang erzielt wurden. Die Menge an jeweils eingesetzten Oligonukleotiden betrug 0,5 nmoles, sofern nicht anders angegeben (2x oder 10x). Unter jedem Balken befindet sich die mittlere Anzahl von 5-FOA^RG418^S-Klonen in 10⁷ Zellen, gefolgt von dem mittleren Wert für die Trp⁺-Klone und schließlich von dem Prozentgehalt von Trp⁺ unter den 5-FOA^RG418^S-Klonen. Abkürzungen: n. c., negative control (keine IRO-DNS); NA, not applicable.
Unter den G418^S-Integranten war der Anteil der Trp⁺-Klone hoch, was andeutet, dass zusätzliche, TRP5 inaktivierende Punktmutationen selten vorkamen. Fünf zufällige Trp⁺-Klone für jeden verwendeten IRO-Typ wurden geprüft und wiesen die erwarteten BamHI-Banden auf, was zeigt, dass die gewünschte Mutation erfolgreich in dem TRP5-Gen eingebracht worden war. Von neun Trp^– G418^S-Klonen, die nach Zufall für die Sequenzierung ausgewählt worden waren, wiesen alle eine Rasterschub-Mutation auf, die auf den IRO-Bereich begrenzt war.
5 gibt schematisch drei Ausführungsbeispiele der delitto perfetto-Mutagenesestrategie wieder und veranschaulicht einen Teil der vielseitigen Möglichkeiten der Technik zur schnellen Erzeugung einer Vielfalt von Mutationen.
5A zeigt eine Ausführung, bei der die komplementären 95-mere e + f einen mittleren Bereich von 15 nt aufweisen, der für ortsspezifische Mutationen verwendet werden kann. 40 nt an jedem Ende der IRO (oberhalb und unterhalb der CORE-Kassetten-Insertionsstelle) bleiben in bestimmten Ausführungen zwecks effizienter homologer Integration unverändert.
5B zeigt eine Ausführung, bei der die mit Pfx gefüllten 80-mere a + b einen 60 nt Bereich aufweisen, der mutagenisiert werden kann. Von diesen 60 nt können 20 nt zu beiden Seiten der Überlappung ebenfalls für eine zufällige Mutagenese eingerichtet werden. Wie in 5A, bleiben in bestimmten Ausführungen 40 nt an jedem Ende zwecks effizienter homologer Integration unverändert.
5C veranschaulicht eine Ausführung, bei der ortsspezifische Mutationen bis zu 100 bp oberhalb und unterhalb der CORE-Kassetten-Insertionsstelle mit verschiedenen Paaren von 80–100-meren (hier als m + n Pfx bezeichnet, analog zu a + b Pfx oder zu e + f) eingebracht werden können, ohne die eingesetzte CORE-Kassette zu versetzen.
Die Zeichnung zeigt ein Beispiel von Oligonukleotiden, die für die Einführung einer Mutation (*) 100 bp oberhalb der CORE-Kassetten-Insertionsstelle mit den IRO m + n Pfx gestaltet wurden. Die Effizienz der Mutagenese kann sinken, indem die Mutationsstelle in der IRO-Sequenz näher zum 5'-Ende platziert wird, da ein IRO-Rekombinationsereignis, das zur Exzision des CORE führt, ohne Einbeziehung der Mutation in der IRO stattfinden könnte.
6 veranschaulicht ein Beispiel für eine Strategie für gezielte, ortsspezifische in vivo-Mutationen über den DNS-bindenden Bereich von p53.
Sieben isogene Stränge werden erzeugt, jeder mit einer an einer verschiedenen Stelle innerhalb des DNS-bindenden Bereichs von p53 eingefügten CORE-Kassette. Der Aufbau von Strang 1 (6A), Strang 2 (6B) und Strang 7 (6C) wird dargestellt.
Die p53-Mutationen können einfach dadurch erzeugt werden, dass Oligonukleotide gestaltet werden, die die gewünschte Mutation enthalten. Die Transformation mit 20 bp, die sich mit Oligonukleotiden überlappen, die homolog sind zu einem Bereich, der die CORE-Kassette umgibt, führt zur Entfernung der CORE-Kassette und zur Erzeugung einer ortsspezifischen (gezielten) Änderung. Eine Mutation kann 45 Basenpaare oberhalb und unterhalb eines jeden CORE-Kassetten-Insertionspunktes gestaltet werden. Die speziellen dargestellten Ausführungsformen zeigen die Einführung einer Mutation unterhalb einer CORE-Kassette, die bei Nukleotid 315 (Strang 1, 6A), Nukleotid 410 (Strang 2, 6B) bzw. Nukleotid 685 (Strang 7, 6C) eingefügt wurde.
7 veranschaulicht eine Ausführung des delitto perfetto-DSB-Systems, die integrative rekombinante Oligonukleotide (IRO) verwendet, um Mutationen herbeizuführen.
Die DSB-CORE-Kassette enthält die COunterselectable und REporter-Gene und dazu die I-Scel-Endonuklease unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters, wie dem dargestellten GAL1/10-Promoter. Die Exprimierung von I-Scel führt zu einem Doppelstrangbruch (DSB) in genau der Zielsequenz, die auch in der Kassette enthalten ist.

Schritt 1: Eine DSB-CORE-Kassette wird mit üblichen DNA-Targeting-Verfahren an einer gewünschten Stelle eingefügt. Die Einfügestelle befindet sich irgendwo in der Sequenz, die zur Deletion ausgewählt wurde oder in der Nähe einer Stelle, an der eine spezifische Mutation oder mehrfache Mutationen ausgelöst werden sollen. Die DSB-CORE-Kassette enthält folgendes: i) Gal1/10-Promoter, der mit I-Scel zum offenen Leseraster (Gal1/10::I-Scel) vereint wurde. I-Scel erzeugt einen DSB an einer Schnittstelle, die in der Kassette enthalten ist. Jeder induzierbare (d. h. an/aus) Promoter kann verwendet werden, und jedes DSB-ortsspezifische Schneideenzym kann in die DSB-CORE-Kassette aufgenommen werden, vorausgesetzt, dass die einzige DNS-Sequenz, an der in der Zelle geschnitten wird, in der Kassette vorhanden ist. ii) I-Scel-Schneidestelle (oder eine andere einzigartige Schneidestelle, die das Ziel eines ortsspezifischen DSB-Schneideenzyms ist), platziert an einem Ende der Kassette oder im Innern. iii) COunterselectable und REporter-Gene (z. B. das Gegenselektionsgen KI-URA3 + das kanMX4-Reportergen)
Schritt 2: Unmittelbar vor der Transformation mit IRO, werden die Zellen in Gegenwart von Galaktose gezüchtet, was eine Exprimierung von I-Scel-Endonuklease induziert. Das Enzym zielt seinen einzelnen Ort in der Kassette an und erzeugt einen DSB.
Schritt 3: Transformation von Zellen mit IRO führt zum Verlust der Kassette, zur Erzeugung der gewünschten Mutation(en) oder zur Deletion des gewünschten Bereichs. Das Oligonukleotid-Targeting in der Nachbarschaft von DSB (delitto perfetto-DSB-Verfahren) wird um das 1000-fache erhöht, im Vergleich zu oligonukleotid-vermittelten Änderungen ohne DSB (delitto perfetto-Verfahren).

8 zeigt schematische Darstellungen der Ausführungsformen der delitto perfetto-DSB-Mutagenesestrategie, und veranschaulicht einige der vielseitigen Möglichkeiten dieser Technik zur schnellen Erzeugung vielfältiger Mutationen.
Die Zeichnung zeigt ein Beispiel von Oligonukleotiden, die für die Einführung einer Mutation (*) 100 bp oberhalb der CORE-DSB-Einfügestelle mit den IRO m + n Pfx gestaltet wurden. RE-DSB können anstelle von CORE-DSB verwendet werden. Die Effizienz der Mutagenese durch IRO, die CORE-DSB oder RE-DSB nach DSB-Induktion ersetzen, ist tausendmal höher, als ohne DSB-Induktion (d. h., wenn lediglich die CORE-Kassette verwendet wird).
9 veranschaulicht eine Beispielstrategie für das ortsspezifische in vivo-Targeting von Mutationen innerhalb des DNS-bindenden Bereichs von p53 unter Verwendung von CORE-DSB. RE-DSB kann anstelle von CORE-DSB verwendet werden. Da die Effizienz von IRO-Targeting bei Verwendung des delitto perfetto-DSB-Ansatzes sehr hoch ist, können die CORE-DSB- oder RE-DSB-Kassetten in größeren Abständen platziert werden, bis zu 200 bp auseinander.
Fünf isogene Stränge werden erzeugt, jeder mit einer CORE-DSB- oder RE-DSB-Kassette, die an jeweils verschiedenen Stellen innerhalb des DNS-bindenden Bereichs von p53 eingefügt werden. Der Aufbau von Strang 1 (9A), Strang 2 (9B) und Strang 4 (9C) wird dargestellt.
Die p53-Mutationen können einfach dadurch erzeugt werden, dass Oligonukleotide gestaltet werden, die die gewünschte Mutation enthalten. Die Transformation mit 20 bp, die sich mit Oligonukleotiden überlappen, welche homolog sind zu einem Bereich, der die CORE-DSB- oder RE-DSB-Kassette einschließt, führt zur Entfernung der Kassette und zur Erzeugung einer ortsspezifischen (gezielten) Änderung. Eine Mutation kann 100 Basenpaare oberhalb und unterhalb eines jeden CORE-Kassetten-Insertionspunktes gestaltet werden. Die spezifischen dargestellten Ausführungsformen zeigen die Einführung einer Mutation oberhalb einer CORE-DSB-Kassette, die bei Nukleotid 315 (Strang 1, 9A), Nukleotid 515 (Strang 2, 9B) bzw. Nukleotid 915 (Strang 4, 9C) eingefügt wurde.
KURZE BESCHREIBUNG DER SEQUENZAUFLISTUNG
Die Nuklein- und Aminossäuresequenzen, die in der beiliegenden Sequenzliste aufgeführt werden, werden unter Verwendung von üblichen Zeichenabkürzungen für Nukleotidbasen dargestellt, so wie in 37 C. F. R. 1.822. Von jeder Nukleinsäuresequenz wird nur ein Strang dargestellt, aber der komplementäre Strang ist als in den Verweis auf den dargestellten Strang mit inbegriffen zu verstehen. In der begleitenden Sequenzliste sind:
SEQ ID NR: 1 und 2 sind die Sequenzen, die in Beispiel 1 für die Amplifikation der CORE-Kassette (die kanMX4 bzw. die KIURA3-Seite) verwendet werden.
SEQ ID NR: 3–12 Oligonukleotidprimer, die bei der ersten Insertion der CORE-Kassette in die Gene MLP2, P0L30, TRP5 and SIR2 verwendet werden. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als MLP2.G (SEQ ID NO: 3); MLP2.0 (SEQ ID NO: 4); PCNA.G (SEQ ID NO: 5); PCNA.U (SEQ ID NO: 6); TRP5.G (SEQ ID NO: 7); TRP5.U (SEQ ID NO: 8); 4U SIR2.G (SEQ ID NO: 9); SIR2.U1 (SEQ ID NO: 10); SIR2.G2 (SEQ ID NO: 11); and SIR2.U2 (SEQ ID NO: 12).
SEQ ID NR: 13 ein K2 interner Primer in der CORE-Kassette innerhalb von kanMX4.
SEQ ID NR: 14 ein URA3.2 interner Primer in der CORE-Kassette innerhalb von KIURA3.
SEQ ID NR: 15–26 sind Primer, die verwendet werden, um die CORE-Insertion zu verifizieren. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als MLP2.1 (SEQ ID NO: 15); MLP2.2 (SEQ ID NO: 16); MLP2.3 (SEQ ID NO: 17); MLP2.4 (SEQ ID NO: 18); PCNA. 4.0 3 (SEQ ID NO: 19); PCNA.4 (SEQ ID NO: 20); TRP5.1 (SEQ ID NO: 21); TRP5.2 (SEQ ID NO: 22); SIR2.1 (SEQ ID NO: 23); SW2.2 (SEQ 10 NO: 24); SIR2.3 (SEQ ID NO: 25); und SIR2.4 (SEQ ID NO: 26).
SEQ ID NR: 27–50 IRO, die verwendet werden, um die spezifischen Änderungen durchzuführen, die in den Beispielen beschrieben werden. Im Text wird auf diese Sequenzen als MLP2a (SEQ ID NO: 27); MLP2.b (SEQ ID NO: 28); PCNA.a (SEQ ID NO: 29); PCNA.b (SEQ ID NO: 30); TRP5.a (SEQ ID NO: 31); TRP5.b (SEQ ID NO: 32); TRP5.c (SEQ ID NO: 33); TRP5.d (SEQ ID NO: 34); TRP5.e (SEQ ID NO: 35); TRP5.1 (SEQ 10 NO: 36); TRP5.e1 (SEQ ID NO: 37); TRP5.f1 (SEQ ID NO: 38); TRP5.c2 (SEQ 10 NO: 39); TRP5.f2 (SEQ ID NO: 40); TRP5.1 (SEQ ID NO: 41); TRP5.) (SEQ ID NO: 42); 270a (SEQ ID NO: 43); 270b (SEQ ID NO: 44); 270e (SEQ ID NO: 45); 2701 (SEQ ID N0:46); 345a (SEQ ID NO: 47); 345b (SEQ ID NO: 48); 364a (SEQ ID NO: 49); und 364b (SEQ ID NO: 50) verwiesen.
SEQ ID NR: 51–54 sind Oligonukleotidprimer, die verwendet werden, um die Deletion von RAD52.-RAD52.1ILEU2.2 und 55 RAD52.4/LEU2.1 zu verifizieren. Im Text wird auf diese Sequenzen als RAD52.1 (SEQ ID NO: 51); RAD52.4 (SEQ ID NO: 52); LEU2.1 (SEQ ID NO: 53); und LEU2.2 (SEQ ID NO: 54) verwiesen.
SEQ ID NR: 55–58 sind Oligonukleotide (IRO), die verwendet werden, um große chromosomale Deletionen (bis zu 16 kb) in der Nähe der TRB5-Sequenz auf Chromosom VII herbeizuführen. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als 1Stu.a (SEQ 10 NO: 55); 1Stu.b (SEQ ID NO: 56); 2Stu.a (SEQ ID NO: 57); und 2Stu.b (SEQ 10 NO: 58).
SEQ ID NR: 59 und 60 sind Oligonukleotide, die verwendet wurden, um die großen Deletionen zu prüfen. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als CGR1.1 (SEQ ID NO: 59) and STT3.1 (SEQ ID NO: 60).
SEQ ID NR: 61 und 62 sind Primer, die verwendet werden, um die Insertion von CORE-Kassetten in die Zielgene durchzuführen. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als TRP5.1 (SEQ ID NO: 61) and TRP5.11 (SEQ ID NO: 62).
SEQ ID NR: 63 und 64 sind Primer, die für die PCR-Amplifizierung der Scel-Gene unter dem Gal1/10-Promoter verwendet werden. Beide Primer haben eine Bg/II-Sequenz am 5'-Ende um die Klonierung des PCR-Produktes oberhalb der CORE-Kassetten zu ermöglichen.
SEQ ID NR: 65-68 sind Oligonukleotidprimer, die für die Insertion von CORE-DSB-Kassetten in das TRP5-Gen verwendet werden. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als TRP5.ScelI (SEQ ID NO: 65); TSce.IU (SEQ ID NO: 66); TecS.IU (SEQ 10 ID NO: 67); und TScecS.11 (SEQ ID NO: 68).
SEQ ID NR: 69 ist die GAL1/10-Sequenz, die bei bestimmten Ausführungen oberhalb des I-Scel-Gens eingefügt wird.
SEQ ID NR: 70-73 sind Primer, die für die erste Insertion der kurzen CORE-DSB-Kassette in das TRP5-Gen verwendet werden. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als TRP5.IK (SEQ ID NO: 70); TSce.IK (SEQ ID NO: 71); TecS.IK (SEQ ID NO: 72); and TScecS11 (SEQ ID NO: 73).
SEQ ID NR: 74–77 sind interne Primer in den CORE-UK- und/oder CORE-UH- und/oder CORE-Kp53 und/oder COREHp53-Kassetten. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als K1 (SEQ ID NO: 74); URA3.1 (SEQ ID NO: 75); H1 (SEQ ID NO: 76); and p7 (SEQ ID NO: 77).
SEQ ID NR: 78 ist ein interner Primer in der CORE-DBS-Kassette innerhalb von I-Scel.
SEQ ID NR: 79 ist ein interner Primer in der RE-DBS-Kassette innerhalb von HygroR.
SEQ ID NR: 80–83 sind Primer, die verwendet wurden, um die CORE-DSB-Insertion am TRP5-Locus zu deletieren und die gewünschte Änderung herbeizuführen. Im Text wird auf diese Sequenzen verwiesen als TRPS.e3 (SEQ ID NO: 80); TRP5.13 (SEQ ID NO: 81); TRP5.e4 (SEQ ID NO: 82); and TRPS.f4 (SEQ ID NO: 83).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
I. Abkürzungen

5-FOA:: (5-fluoroorotic acid), 5-Fluoroorotsäure
CORE:: Kassette, die einen COunterselectable Marker und ein REportergen enthält.
CORE-DSB:: CORE-Kassette, die zusätzlich eine DSB-Schnittstelle enthält, sowie eine Sequenz, die für eine Endonuklease kodiert, welche an der DSB-Schnittstelle schneiden kann.
RE-DSB:: CORE-DSB ohne den Gegenselektionsmarker.
DNA:: (deoxyribonucleic acid) Desoxyrobonukleinsäure (DNS)
DSB:: Doppelstrangbruch
G418^R: : Geneticinresistenz-Markergen
GAL:: Galaktose
HygroR:: Hygromicinresistenz-Markergen
IRO:: Integrative rekombinante Oligonukleotide
I-Scel:: Saccharomyces cerevisiae mitochondriales Intron-kodiertes Endonukleasegen
PCR:: (polymerase chain reaction) Polymerase-Kettenreaktion
ORF:: (open reading frame) offener Leseraster (OLR)
YAC:: (yeast artificial chromosome) künstliches Hefechromosom.

II. Begriffe
Sofern nicht in anderer Weise gekennzeichnet, werden technische Begriffe gemäß konventionellem Gebrauch verwendet. Definitionen der üblichen Begriffe der Molekularbiologie können in Benjamin Lewin, Genes V, herausgegeben von Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (Hrsg.). The Encyclopedia of Molecular Biology, herausgegeben von Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); und Robert A Meyers (Hrsg.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, herausgegeben von VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) gefunden werden.
Um die Begutachtung der verschiedenen Ausführungen der Erfindung zu erleichtern, werden die folgenden Erklärungen spezifischer Begriffe zur Verfügung gestellt:

Analogon, Derivat oder Mimetik: Ein Analogon ist ein Molekül, das sich in seiner chemischen Struktur von einer Vorläuferkomponente unterscheidet, z. B. von einem Homologon (das sich durch eine Größenordnung in der chemischen Struktur unterscheidet, wie z. B. die unterschiedliche Länge von Alkylketten), einem Molekülfragment, einer Struktur, die bei einer oder mehreren funktionalen Gruppen abweicht und/oder einer Änderung der Ionisation. Strukturelle Analogons werden häufig über die Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung (QSAR) gefunden, mit Methoden, wie sie in Remington (The Science and Practice of Pharmacology, 19th Edition (1995), chapter 28) dargelegt werden. Ein Derivat ist ein biologisch aktives Molekül, das sich von einer Grundstruktur ableitet. Ein mimetisches Molekül ist ein Biomolekül, das die Aktivität eines anderen biologisch aktiven Moleküls nachahmt. Biologisch aktive Moleküle können beide chemischen Strukturen einbeziehen (z. B. Peptid- oder Proteineinheiten), die die biologischen Aktivitäten von vorhandenen Komponenten nachahmen.
Tier: Lebende mehrzellige Wirbeltier-Organismen, eine Kategorie, die beispielsweise Säugetiere (z. B. Primaten) und Vögel umfasst, wie auch einzellige und mikroskopische Tiere (z. B. Nematoden). Der Begriff Säugetiere schließt sowohl menschliche als auch nicht-menschliche Säugetiere mit ein. In gleicher Weise schließt der Begriff „Subjekt" sowohl menschliche als auch tierische Subjekte mit ein.
Antisense, Sense und Antigen: Doppelsträngige DNS (dsDNS) hat zwei Stränge, einen 5'- > 3'-Strang (Plusstrang) und einen 3'- > 5'-Strang (Minusstrang). Weil RNS-Polymerase die Nukleinsäuren in einer 5'- > 3'-Richtung zuführt, dient der Minusstrang der DNS während der Transkription als Schablone für die RNS. Daher erhält die gebildete RNS eine zum Minusstrang komplementäre Sequenz (allerdings wird die Base Uricil durch Thymin ersetzt). Antisense-Moleküle sind Moleküle, die spezifisch hybridisierbar oder spezifisch komplementär entweder zur RNS oder zum Plusstrang der DNS sind. Sense-Moleküle sind Moleküle, die spezifisch hybridisierbar oder spezifisch komplementär entweder zur RNS oder zum Minusstrang der DNS sind. Antigen-Moleküle sind entweder antisense oder sense-Moleküle, die die DNS anzielen.
Bindung/stabile Bindung: Ein Oligonukleotid ist an eine Ziel-Nukleinsäure gebunden oder fest gebunden, wenn eine genügende Anzahl der Oligonukleotide Basenpaare bildet oder an ihrer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert wird, um eine Erkennung dieser Bindung zu ermöglichen. Eine Bindung kann anhand von physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Ziel-Oligonukleotidkomplexes entdeckt werden. Die Bindung zwischen einem Ziel und einem Oligonukleotid kann durch jede in Fachkreisen bekannte Methode erkannt werden, einschließlich funktionaler und physikalischer Bindungsanalysen. Eine Bindung kann funktional dadurch entdeckt werden, dass bestimmt wird, ob eine Bindung einen beobachtbaren Einfluss auf einen biosynthetischen Prozess hat, wie die Exprimierung eines Gens, DNS-Replikation, Transkription oder Translation.

Physikalische Methoden, um die Bindung von komplementären Strängen von DNS und RNS aufzudecken sind in der Fachwelt gut bekannt. Dazu gehören Methoden wie DNase I oder Chemical Footprinting, Gelshift, und Affinity-Cleavage (Affinitätsspaltung), Northern-Blotting, Dot-Blotting und Untersuchungsverfahren mit Lichtabsorption. Eine Methode, z. B., die weit verbreitet, weil einfach und zuverlässig ist, beruht auf der Beobachtung der Änderung der Lichtabsorption einer Lösung, die ein Oligonukleotid (oder ein Analogon) enthält und eine Ziel-Nukleinsäure bei 220 bis 300 nm, während die Temperatur langsam erhöht wird. Wenn das Oligonukleotid oder das Analogon an das Ziel gebunden ist, erfolgt bei einer charakteristischen Temperatur ein plötzlicher Anstieg der Lichtabsorption, wenn das Oligonukleotid (oder Analogon) und das Ziel sich von einander lösen oder „schmelzen"
Die Bindung zwischen einem Oligomer und seiner Ziel-Nukleinsäure wird häufig charakterisiert durch die Temperatur (T_m) bei der 50% des Oligomers von seinem Ziel abgeschmolzen ist. Höhere T_m weisen auf einen stärkeren und stabileren Komplex hin, verglichen mit einem Komplex mit niedrigerer T_m.
Kassette: Eine Nukleinsäuresequenz, die wenigsten einen Selektionsmarker kodiert, die in das Genom einer Zelle oder in ein Plasmid eingeführt werden kann, z. B. in eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle. In einer Ausführung gehört zu der Kassette ein Reportergen, nämlich eine Nukleinsäuresequenz, die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum an eine Wirtszelle weitergibt, in die die Nukleinsäure übertragen wird. Beispiele für antibiotische Resistenzgene sind, unter anderen, Gene, die Resistenz verschaffen gegenüber: Kanamycin, Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Hygromycin und Zeocin.
Zu den am häufigsten verwendeten Hefe-Markergenen gehören URA3, LYS2, TRP1, LEU2, HIS3, ADE2, G418^R. Zu den wenig häufig verwendeten Hefe-Markergenen gehören CYH2^S und CAN1^S (die die Empfindlichkeit gegenüber Cycloheximid bzw. Canavanin bestimmen), KIURA3 (von Kluyveromyces lactis und homolog zu S. cerevisiae URA3, die beide die Resistenz gegenüber 5-FOA bestimmen); HygromycinB^R (das die Resistenz gegenüber Hygromycin bestimmt) und NAT^R (Nourseothricin) (bestimmt die Resistenz gegenüber Nourseothricin).
Zu den Gegenselektionsmarkergenen (Markergene, für die es ein System gibt, in dem ein Verlust des Markergens zur Wahl steht) gehören URA3, KIURA3 CYH2, CAN1, TRP1 und LYS2. In bestimmten Ausführungen sind die Gegenselektionsmarker URA3 und KIURA3 besonders vorteilhaft, weil die Mehrzahl der Hefestränge eine Mutation im URA3-Gen aufweist (ura^–Stränge), und die Häufigkeit spontaner Umkehrungen niedrig ist. KIURA3 ist URA3 vorzuziehen, weil es URA3 in S. cerevisiae ersetzen kann, sich aber zugleich genügend unterscheidet, um die Möglichkeit einer Genkonversion mit der chromosomalen Kopie von URA3 in ura^–Strängen zu verringern.
Andere negativ selektierbare Markergene sind toxische Genprodukte, die, wenn sie exprimiert oder überexprimiert sind, das Wachstum der Wirtszelle verhindern und/oder sie töten. Zu dieser Klasse von negativ selektierbaren Markergenen gehören Restriktionsenzyme wie EcoR1 ((Lewis et al., Mol Cell. Biol. 18: 1891–1902, 1998) und Pvull, sowie das Gen, das p53 kodiert und toxische Versionen des p53-Gens (Inga and Resnick, Oncogene 20: 3409–3419, 2001) von Menschen und anderen Säugetieren. Diese negativ selektierbaren Gene werden gewöhnlich unter Kontrolle eines in hohem Maße einstellbaren Promoters verwendet (der ein niedriges Grundniveau und ein hohes induzierbares Niveau bietet). In einigen Ausführungen kann das exprimierte Pvull-Gen Modifikationen aufweisen, entweder in der Kodierungssequenz oder in einem GAL1- oder einem anderem induzierbaren Promoter, der verwendet wird, um die Exprimierung (Expression) des Gens zu betreiben. Dieses sind jeweils Beispiele von Markergenen, die eine Gegenselektion in einem weiten Feld von biologischen Systemen anbieten, für die mehr gebräuchliche negativ selektierbare Markergene vielleicht nicht verfügbar oder ungeeignet sind. Diese negativ selektierbaren Markergene werden daher als „universell" oder „generisch" angesehen, in sofern, als sie nicht von der Spezies oder dem genetischen Hintergrund der Wirtszelle abhängen (bzw. nur indirekt oder geringfügig abhängig sind).
Die folgenden Markergene werden auch als heterologe Marker in Hefe betrachtet, da die beteiligte genetische Sequenz nicht natürlich in S. cerevisiae vorkommt, sondern von einer anderen Spezies zugeführt wurde: KIURA3, G418^R, Hygromycin^R, NAT^R und p53.
Ein spezielles Beispiel für eine Kassette ist eine CORE-Kassette, die sowohl ein COunterselectable Markergen als auch ein REportergen enthält. Andere spezielle Beispiele sind RE-Kassetten (die ein Reportergen enthalten, aber kein negativ selektierbares Markergen), CORE-DSB-Kassetten (enthalten ein negativ selektierbares Markergen, ein Reportergen, eine Doppelstrangbruch-Stelle und eine Sequenz, die ein Doppelstrangbruch-Enzym mit spezifischer Aktivität für diese Stelle kodiert) und RE-DSB-Kassetten (ähnlich wie CORE-DSB-Kassetten, aber ohne ein negativ selektierbares Markergen). Außerdem werden Kassetten zur Verwendung für eine delitto perfetto-Mutagenese betrachtet, bei denen die Funktion des Doppelstrangbruch-Enzyms nicht durch die Kassette selbst kodiert ist, sondern der Zelle exogen hinzugefügt wird, üblicher Weise nach Insertion der Kassette und vor (oder gleichzeitig mit) der Transformation mit IRO.
cDNS (complementary DNA, komplementäre DNS): Ein DNS-Abschnitt ohne interne, nicht-kodierende Sequenzen (Introns) und regelnde Sequenzen, die die Transkription bestimmen. cDNS kann im Labor durch umgekehrte Transkription von aus Zellen extrahierter messenger-RNS synthetisiert werden.
Deletion: Die Entfernung einer Sequenz der DNS, wobei die Bereiche zu beiden Seiten der entfernten Sequenz zusammengefügt werden. Entsprechend ist eine Deletion in einem Protein die Entfernung einer Aminosäuresequenz des Proteins oder Peptids. Deletionen können recht kurz sein, z. B. nur eine oder wenige Nukleinsäuren bis zu 10, 15, 20, 25, 30, 50, 80 oder 100 Nukleinsäuren oder länger, und können ziemlich lang sein. In besonderen Ausführungen können lange Deletionen mindestens 500 Nukleinsäuren, mindestens 750, mindestens 1000, mindestens 2500, mindestens 3000, mindestens 5000, mindestens 8000, mindestens 10.000 oder mehr Nukleinsäuren lang sein. Besonders lange Deletionen können über 10.000 Nukleinsäuren umfassen, z. B. 15.000, 20.000, 30.000 lang oder länger.
DNA (desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure, DNS): DNS ist ein langes Kettenpolymer, das das genetische Material der meisten lebenden Organismen enthält (einige Viren haben Gene, die aus Ribonukleinsäure, RNS, bestehen). Die Wiederholungseinheiten in DNS-Polymeren sind vier verschiedene Nukleotide, von denen ein Bestandteil jeweils eine der vier Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin ist, die an einen Desoxyribosezucker gebunden ist, an den eine Phosphatgruppe geknüpft ist. Nukleotid-Tripletts in DNS-Molekülen, als Codon bezeichnet, kodieren die Aminosäuren in einem Polypeptid. Der Begriff Codon wird auch für die entsprechenden (und komplementären) Sequenzen von drei Nukleotiden in der mRNS verwendet, in die die DNS-Sequenz transkribiert wird.
Sofern nicht in anderer Weise spezifiziert, soll jeder Verweis auf ein DNS-Molekül das komplementäre Gegenstück dieses DNS-Moleküls mit einbeziehen. Außer wenn Einsträngigkeit durch den Text vorgegeben ist, sind DNS-Moleküle, auch wenn sie nur als einzelner Strang dargestellt werden, als zwei Stränge eines doppelsträngigen DNS-Moleküls zu verstehen.
Doppelstrangbruch: Brüche, die zwischen den DNS-Kettengliedern beider Stränge an etwa derselben Stelle auftreten, werden als Doppelstrangbrüche bezeichnet.
Endonuklease: Ein Enzym, das die internen Phosphordiester-Bindungen in einem DNS-Molekül spaltet.
Heterolog: Eine Sequenz, die normaler Weise (d. h. in einer Wildtyp-Sequenz) direkt an eine zweite Sequenz grenzt. In einer Ausführung stammt die Sequenz von einer anderen genetischen Quelle, etwa einem Virus oder einem anderen Organismus, als die zweite Sequenz.
Homing-Endonukleasen: Ortsspezifische Endonukleasen, die von Introns oder Inteinen kodiert wurden, um die Zielsuche eines genetischen Elements bei Insertion in ein intronloses oder inteinloses Allel zu fördern. Es sind doppelsträngige DNS, die große, asymmetrische Erkennungssequenzen (recognition sites) (12–40 Basenpaare) haben und Kodierungssequenzen, die gewöhnlich in ihre Introns oder Inteine eingebettet sind. Die Introns werden aus Vorläufer-RNS herausgespleißt, während die Inteine aus Vorläuferproteinen herausgespleißt werden. Bei der Benennung von Homing-Endonukleasen werden ähnliche Konventionen befolgt, wie bei Restriktionsendonukleasen, wobei Intron-kodierende Endonukleasen das Prefix „I-" tragen und Intein-Endonukleasen das Prefix „PI-".
Die Erkennungssequenzen der Homing-Endonukleasen sind äußerst selten. Zum Beispiel erfolgt eine 18 Basenpaar-Erkennung nur einmal unter 7 × 10¹⁰ Basenpaaren mit zufälliger Sequenz. Das entspricht nur einer Stelle in 20 Genomen von Säugetiergröße. Allerdings tolerieren Homing-Endonukleasen, anders als übliche Restriktionsnukleasen, eine gewisse Sequenz-Degenerierung in ihrer Erkennungssequenz. Das führt dazu, dass die bei ihnen beobachtete Sequenzspezifität sich typischer Weise im Bereich von 10–12 Basenpaaren bewegt. Homing-Endonukleasen haben keine streng definierten Erkennungssequenzen, so wie es bei Restriktionsenzymen der Fall ist. Das heißt, die Änderung einzelner Basen verhindert nicht die Spaltung, sondern verringert ihre Effizienz in unterschiedlichem Ausmaß. Die genaue Größe der benötigten Basis ist allgemein nicht bekannt.
Die Homing-Enzyme, die den Bewegungsprozess auslösen, können in Familien gruppiert werden, die miteinander und mit einigen freien, intergenischen Endonukleasen strukturelle und funktionale Eigenschaften gemein haben. An mehreren von Introns und Inteinen aus den drei biologischen Reichen kodierten Endonukleasen wurde gezeigt, dass sie das Homing ihrer jeweiligen genetischen Elemente in allelische intronlose und inteinlose Sequenzen fördern (Belfort & Roberts, Nucleic Acids Research, 25: 3379–3388, 1997). Beispiele von Homing-Endonukleasen: I-Crel, I-Ppol, I-Scel, I-Ceul, PI-Pspi, PI-Scel. Unter den Homing-Endonukleasen befindet sich VDE der Saccharomyces.
Hybridisierung: Poly- und Oligonukleotide und deren Analogons hybridisieren durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Basen. Dazu gehören Watson-Crick-, Hoogsteen- oder umgekehrte Hoogsteen-Wasserstoffbrücken. Allgemein bestehen Nukleinsäuren aus Stickstoffbasen, die entweder Pyrimidine sind (Cytosin (C), Uracil (U) und Thymin (T)) oder Purine (Adenin (A) und Guanin (G)). Diese Stickstoffbasen bilden Wasserstoffbrücken zwischen einem Pyrimidin und einem Purin, und die Bindung des Pyrimidins mit dem Purin wird als Basenpaarung bezeichnet. Genauer gesagt, A bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit T oder U und G verbindet sich mit C. „Komplementär" bezieht sich auf die Basenpaarung, die zwischen zwei bestimmten Nukleinsäuresequenzen oder zwischen zwei bestimmten Bereichen derselben Nukleinsäuresequenz stattfindet.
„Spezifisch hybridisierbar" und „spezifisch komplementär" sind Begriffe, die einen genügenden Grad an Komplementarität kennzeichnen, so dass eine stabile und spezifische Bindung zwischen dem Poly- oder Oligonukleotid (oder seinem Analogon) und dem DNS- oder RNS-Zielmolekül stattfindet. Das Poly- oder Oligonukleotid (oder sein Analogon) muss nicht zu 100% komplementär zu seiner Zielsequenz sein, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Ein Nukleotidmolekül oder dessen Analogon ist spezifisch hybridisierbar, wenn seine Bindung an ein DNS- oder RNS-Zielmolekül mit hinreichenden Grad an Komplementarität stattfindet, um eine nicht-spezifische Binding des Nukleotids oder Analogons an nicht-Zielsequenzen zu vermeiden, unter Bedingungen, unter denen eine spezifische Bindung erwünscht ist, z. B. unter den physiologischen Bedingungen bei in vivo-Untersuchungen oder -Systemen. Eine solche Bindung wird als spezifische Hybridisierung bezeichnet.
Hybridisierungsbedingungen, die zu einem besonderen Grad an Stringenz führen, werden in Abhängigkeit von der Art der gewählten Hybridisierungsmethode sowie der Zusammensetzung und Länge der hybridisierenden Nukleinsäuresequenzen variieren. Allgemein wird die Hybridisierungstemperatur und die Ionenstärke (insbesondere die Na⁺-Konzentration) des Hybridisierungspuffers die Hybridisierungsstringenz bestimmen, obwohl die Spülzeiten ebenfalls die Stringenz beeinflussen. Berechnungen in Bezug auf Hybridisierungsbedingungen, die zum Erreichen von bestimmten Stringenzgraden erforderlich sind, werden von Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, diskutiert, darin Kapitel 9 und 11, die hier als Referenz aufgenommen wurden.
Zur Veranschaulichung wird die Hybridisierung allgemein in vitro in einer Lösung mit hoher Ionenstärke durchgeführt, z. B. 6 × SSC, bei einer Temperatur, die 20–25°C unter der Schmelztemperatur, T_m, unten beschrieben, liegt. Zum Beispiel wird bei Southern-Hybridisierungsexperimenten, bei denen das DNS-Zielmolekül auf dem Southern-Blot 10 ng DNS oder mehr enthält, die Hybridisierung typischer Weise 6–8 Std. lang durchgeführt, unter Verwendung von 1–2 ng/ml einer radiomarkierten Poly- oder Oligonukleotidprobe (mit einer spezifischen Aktivität von z. B. 109 CPM/μg oder höher). Im Anschluss an die Hybridisierung wird der Nitrozellulose-Filter (Southern-Blot) gewaschen, um die Hintergrundhybridisierung zu entfernen, ein spezifisches Hybridisierungssignal aber zu behalten.
Der Begriff T_m steht für die Temperatur, oberhalb der bei gegebener Ionenstärke das Probe-Nukleinsäuremolekül nicht mit seinem DNS-Zielmolekül hybridisieren wird. Die T_m eines solchen Hybridmoleküls kann anhand der folgenden Gleichung ermittelt werden: Tm = 81,5°C – 16,6(log10[Na+] + 0,41(%G + C) – 0,63(%Formamid) – (600/l)
Wobei l die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist.
Diese Gleichung ist gültig für Na⁺-Konzentrationen im Bereich von 0,01 M bis 0,4 M und ist weniger genau für Berechnungen von T_m in Lösungen mit höherem [Na⁺]-Wert. Die Gleichung ist außerdem in erster Linie gültig für DNS, deren G + C-Gehalt im Bereich von 30% bis 70% ist, und sie trifft für Hybride zu, die eine größere Länge als 100 Nukleotide aufweisen (das Verhalten von Oligonukleotid-Proben wird im Detail in Kapitel 11 von Sambrook et al., 1989, beschrieben). So kann beispielshalber für eine 150 Basenpaar-DNS-Probe mit einem hypothetischen GC-Gehalt von 45% eine Berechnung der Hybridisierungsbedingungen, die für eine bestimmte Stringenz erforderlich sind, wie folgt durchgeführt werden:
Für diese Beispiel wird angenommen, dass der Filter im Anschluss an die Hybridisierung in einer 0,3 × SSC-Lösung gewaschen wird, demnach

[Na⁺]: = 0,045 M
%GC: = 45%
Formamidkonzentration: = 0
l: = 150 Basenpaare Tm = 81,5 – 16,6(log10[Na+] + (0,41 × 45) – 0,63(%Formamid) – (600/150)und damit T_m = 74,4°C.

Die T_m von doppelsträngiger DNS sinkt um 1–1,5°C je 1% Abnahme an Homologie (Bonner et al. J.
MoL. BioI. 81: 123–135, 1973). Daher wird bei dem hier gegebenen Beispiel das Waschen des Filters in 0,3 × SSC bei 59,4–64,4°C eine Hybridisierungsstringenz entsprechend 90% erzeugen; das heißt, DNS-Moleküle mit einer Sequenzabweichung von mehr als 10% gegenüber der Ziel-cDNS werden nicht hybridisieren. Alternativ dazu wird das Waschen des hybridisierten Filters in 0,3 × SSC bei einer Temperatur von 65,4–68,4°C eine Hybridisierungsstringenz von 94% erbringen, das heißt, DNS-Moleküle mit mehr als 6% Sequenzabweichung gegenüber dem Ziel-cDNS-Molekül werden nicht hybridisieren. Die obigen Beispiele dienen ausschließlich der theoretischen Veranschaulichung. Jemand, der mit der Technik vertraut ist, wird ermessen können, dass andere Hybridisierungstechniken angewendet werden können, und dass Abweichungen in den experimentellen Bedingungen andere Berechnungen der Stringenz erfordern.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind unter „stringenten Bedingungen" solche Bedingungen zu verstehen, unter denen die Hybridisierung nur eintritt, wenn es weniger als 25% Nichtübereinstimmung zwischen der Hybridisierungsprobe und der Zielsequenz gibt. „Stringente Bedingungen" können zur genaueren Unterscheidung in gesonderte Stufen der Stringenz aufgeteilt werden. Daher sind, wie hier zur Anwendung kommt, „mäßig stringente" Bedingungen solche, unter denen DNS-Moleküle mit mehr als 25% Sequenzabweichung (auch als „Nichtübereinstimmung" bezeichnet) nicht hybridisieren werden; „durchschnittlich stringente" Bedingungen sind solche, unter denen DNS-Moleküle mit mehr als 15% Nichtübereinstimmung nicht hybridisieren werden und „hoch stringente" Bedingungen sind solche, unter denen DNS-Sequenzen mit mehr als 10% Nichtübereinstimmung nicht hybridisieren werden. „Sehr hoch stringente" Bedingungen sind solche, unter denen DNS-Sequenzen mit mehr als 6% Nichtübereinstimmung nicht hybridisieren werden.
In vitro-Amplifikation: Eine Technik, die die Anzahl der Kopien eines Nukleinsäuremoleküls in einer Probe oder einem Prüfmuster. Ein Beispiel für eine in vitro-Amplifikation ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der ein Nukleinsäuremolekül (wie es etwa in einer biologischen Probe enthalten ist, die von einem Subjekt genommen wurde) mit einem Oligonukleotidprimer-Paar unter solchen Bedingungen zusammengebracht wird, die die Hybridisierung der Primer zu einer Nukleinsäureschablone in der Probe ermöglichen. Die Primer werden unter geeigneten Bedingungen verlängert, von der Schablone abgelöst und dann wieder hybridisiert, verlängert und abgelöst, um die Anzahl der Kopien der Nukleinsäure zu vergrößern.
Das Produkt der in vitro-Amplifikation kann charakterisiert werden durch Elektrophorese, Restriktionsendonuklease-Spaltungsmuster, Oligonukleotid-Hybridisierung oder Ligation und/oder Nukleinsäuresequenzierung unter Verwendung von Standardmethoden.
Andere Beispiele für in vitro-Amplifikationstechniken sind Strand Displacement Amplification (siehe U.S. Patent No. 5,744,311 ), Transcription-free Isothermal Amplification (siehe U.S. Patent No. 6,033,881 ), Repair Chain Reaction Amplification (siehe WO 90/01069 ), Ligase Chain Reaction Amplification (siehe ER-A-320 308 ), Gap Filling Ligase Chain Reaction Amplification (siehe U.S. Patent No. 5,427,930 ); Coupled Ligase Detection und PCR (siehe U.S Patent No. 6,027,889 ) und NASBA^TM RNA Transcription-free Amplification (siehe U.S. Patent No. 6,025,134 ).
Induzierer: Ein kleines Molekül, das die Gen-Transkription durch Bindung an ein Regulatorprotein auslöst.
Induzierbarer Promoter: Ein Promoter-System, das verwendet werden kann, um die Menge und den Zeitverlauf der Proteinexprimierung zu regulieren. Anders als ein konstitutiver Promoter ist ein induzierbarer Promoter nicht ständig aktiv. Einige induzierbare Promoter werden durch physikalische Stimulatoren aktiviert, wie z. B. der Hitzeschock-Promoter. Andere werden durch chemische Stimulatoren aktiviert, wie z. B. IPTG, Tetracyclin (Tet) oder Galaktose. Induzierbare Promoter oder Genschalter werden benutzt, um die Genexprimierung sowohl auf räumlicher als auch auf zeitlicher Ebene zu regulieren.
Dadurch, dass sie es ermöglichen, den Zeitpunkt und/oder den Ort von Genexprimierungen genau zu regulieren, können Genschalter oder induzierbare Promoter schädliche und/oder unnormale Wirkungen durch Überexprimierung oder nicht ortsbestimmten Genexprimierung kontrollieren. Daher würde bei einem typischen induzierbaren Promoters bei nicht vorhandenem Induzierer nur eine geringe oder keine Genexpression stattfinden, während in Gegenwart des Induzierers die Genexprimierung hoch sein sollte (d. h. aus/an). Eine Anzahl regulierbarer Genexprimierungssysteme wurde entwickelt, einschließlich solcher, die durch Wärme ((Ainley and Key, Plant Mol. Biol., 14: 949–967, 1990; Holtorf et al., Plant Mol. Biol. 29: 637–646, 1995), Krankheitserreger (PR1-a; Williams et al., Biotechnology 10: 540–543, t992; Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 48: 89–108, 1997), Herbizid-Safener (In2-2. GST-27; De Veylder et al., Plant Cell Physiol. 38: 568–577, 1997), Licht (Kuhlemeier et al., Plant Cell 1: 471–478, 1989), Verletzung (Firek et al., Plant Mol. Biol. 22: 129–212. 1993), Ethanol (Salter et al., Plant J. 16: 127–132, 1998), Phytohormone (Li et al., Plant Cell 3: 1167–1175, 1991), Steroide (Aoyama and Chua, Plant J., 11: 605–612, 1997) und Tetrazykline (Gatz et al., Plant J. 2: 397–404, 1992; Weinmann et al., Plant J., 5: 559–569, 1994; Sommer et al., Plant Cell Rep. 17: 891–896, 1998) (from Granger & Cyr, Plant Cell Reports 20: 227–234, 2001). reguliert werden.
Es folgen Beispiele für spezielle Typen von induzierbaren Promoter sowie Beispiele für ihre Verwendung:

Steroid-induzierbare Exprimierung: Das Labor von Keith Yamamoto hat ein induzierbares System in Hefe entwickelt, ähnlich dem Ecdyson-System, über das wir im Zusammenhang mit Säugetierzellen gesprochen haben. Sie platzierten das Glucocorticoid-Rezeptorgen von Ratten hinter den konstitutiven GPD-Promoter, um den Ratten-Glucocorticoid-Rezeptor in Hefe zu exprimieren. Ein zweiter Vektor wurde erstellt mit drei Glucocorticoid-Response-Elementen oberhalb des CYC1-Gen Minimal-Promoters. Beide Vektoren waren High-copy-Vektoren. Dieses System funktioniert gut bei dosierungsabhängiger Exprimierung, wenn dem Medium ein Steroidhormon zugegeben wird. Die Reaktionszeit ist hoch mit t_1/2 von 7–9 Minuten nach Hormonzugabe.
Kupfer-induzierbare Exprimierung: Der CUP1-Promoter kann verwendet werden, um ein Gen induzierbar für Kupfer- oder Silberionen zu machen. Ein Gen, beispielsweise, das von CUP1 reguliert wird, sollte in dem Maß über Kontrolle verfügen, wie der Exprimierungsgrad durch das Kupfer in dem Medium bedingt wird. Kupfer ist giftig, und jeder Strang sollte überprüft werden, um festzustellen, inwieweit er Kupfer toleriert, bevor man ein CUP1-Gebilde erzeugt.
Hitzeschock-Exprimierung: In dem Sie die UAS von einem Hitzeschockgen vor den CYC1-Minimal-Promoter platzieren, können Sie YFG (Ihr Lieblingsgen) unter Hitzeschock-Induktion stellen. Dies ist eine besondere Anforderung, die gewöhnlich bei der Untersuchung von Hitzeschock-Reaktionen angewendet wird.
GAL1-10-Promoter: Dieser Promoter ist in hohem Maße durch Galaktose regulierbar, in der Weise, dass es eine Grundstufe mit Glukose gibt, aber eine mehr als 100-fache Steigerung, wenn die Zellen in ein Galaktose-Medium gegeben werden.
Hefe-GAL-Gene bilden eines der am intensivsten studierten Modellsysteme für die eukaryotische Genregulierung. Durch die Wirkung des Aktivators Gal4p werden die strukturellen Gene, z. B. Gal1 und Gal10, in Galaktose zu einer sehr hochstufigen Exprimierung induziert. Gal4p bindet die Aktivierungssequenzen (UASG), die oberhalb der GAL-Gene liegen und aktiviert die Transkription in einem Prozess, der von gen-proximalen TATA-Elementen abhängt und zahlreiche Koaktivatoren und allgemeine Transkriptionsfaktoren, einschließlich TBP, einbezieht. Die Aktivierungsfunktion von Gal4p wird durch Gal80p moduliert, einem Inhibierungsregulator der sich spezifisch an den Aktivierungsbereich von Gal4p bindet und dadurch die Genaktivierung in nicht-Galaktose Kohlenstoffquellen verhindert.
Induktion: Die Eigenschaft von Bakterien (oder Hefe oder anderen Organismen), bestimmte Enzyme nur dann zu synthetisieren, wenn ihr Substrat vorhanden ist. Auf die Genexprimierung angewendet, bedeutet dies das Anschalten der Transkription als Ergebnis der Interaktion des Induzierers mit dem Regulatorprotein.
Isoliert: Eine isolierte biologische Komponente (wie z. B. eine Nukleinsäure, ein Peptid oder ein Protein) wurde von anderen biologischen Komponenten in der Zelle des Organismus, in dem die Komponente in natürlicher Weise vorkommt, d. h. andere chromosomale und außerchromosomale DNS und RNS sowie Protein, substanziell getrennt, davon getrennt erzeugt oder durch Reinigung entfernt.
Nukleinsäure: Eine Sequenz, die aus Nukleotiden zusammengesetzt ist, einschließlich der Nukleotide, die in DNS und RNS gefunden werden.
Nukleotid: Dieser Begriff umfasst, ist aber nicht beschränkt auf ein Monomer, zu dem eine Base gehört, die mit einem Zucker verbunden ist, z. B. ein Pyrimidin, Purin oder ein synthetisches Analogon davon, oder eine Base, die mit einer Aminosäure verbunden ist, wie in einer Peptidnukleinsäure (PNA). Ein Nukleotid ist ein Monomer in einem Polynukleotid. Eine Nukleotidsequenz verweist auf die Basensequenz in einem Polynukleotid.
Oligonukleotid: Eine lineare Polynukleotidsequenz mit einer Länge von gewöhnlich bis zu 200 Nukleotidbasen, z. B. ein Polynukleotid (wie eine DNS oder RNS), das mindesten sechs Nukleotide, z. B. mindestens 15, 20, 50, 100 oder sogar 200 Nukleotide lang ist. In bestimmten Ausführungen ist vorgesehen, dass Oligonukleotide mehr als 200 Nukleotide lang sein können, z. B. 220, 250, 270, 290, 300, 350, 400 oder mehr Nukleotide.
Funktionell gebunden: Eine erste Nukleinsäuresequenz ist funktionell an eine zweite Nukleinsäuresequenz gebunden, wenn die erste Nukleinsäuresequenz in eine funktionelle Beziehung mit der zweiten Nukleinsäuresequenz versetzt wurde. Zum Beispiel ist ein Promoter funktionell an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn der Promoter die Transkription oder Exprimierung der Kodierungssequenz beeinflusst. Allgemein sind funktionell gebundene DNS-Sequenzen zusammenhängend, und, wenn es erforderlich ist, zwei Proteinkodierungsbereiche zu verbinden, im selben Leseraster.
ORF (open reading frame, offener Leseraster, OLR): Eine Reihe von Nukleotid-Tripletts (Codons), die Aminosäuren kodieren. Diese Sequenzen können gewöhnlich in ein Peptid übertragen werden.
Ortholog: Zwei Nukleotidsequenzen sind Orthologe von einander, wenn sie dieselbe Vorfahrenssequenz teilen und voneinander abgewichen sind, als eine Spezies mit dieser Vorfahrenssequenz sich in zwei Spezies geteilt hat. Orthologe Sequenzen sind auch homologe Sequenzen.
Polynukleotid: Eine lineare Nukleinsäuresequenz von beliebiger Länge. Demnach umfasst ein Polynukleotid Moleküle, die mindestens 15, 20, 50, 100, 200, 250, 300, 400 (z. B.. Oligonukleotide) oder mehr (Nukleotide lang) sind, und umfasst ebenfalls Nukleotide, so lang wie eine cDNA voller Länge, Gene und Chromosomen.
Peptidnukleinsäure (PNA): Ein Oligonukleotidanalogon mit einem Backbone, das aus Monomeren besteht, die durch Amid-(Peptid-)Bindungen verbunden sind, wie z. B. Aminosäuremonomere, verbunden durch Peptidbindungen.
Sonden und Primer: Eine Sonde besteht aus einer isolierten Nukleinsäure, die an ein nachweisbares Marker- oder Reportermolekül gekoppelt ist. Typische Marker umfassen radioaktive Isotope, Liganden, chemiluminiszente Agenzien und Enzyme. Methoden zur Markierung und Richtlinien zur Wahl von geeigneten Markern für verschiedene Zwecke werden z. B. erörtert in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley-Intersciences (1987).
Primer: Primer sind kurze Nukleinsäuren, beispielsweise DNS-Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 6 Nukleotiden und/oder nicht länger als 10, 20, 50, 100 oder 200 Nukleotide in Länge, obwohl sie in einigen Ausführungsbeispielen länger sind. Primer können an einen komplementären Ziel-DNS-Strang durch Nukleinsäurehybridisierung angelagert werden, so dass sie ein Hybrid zwischen dem Primer und dem Ziel-DNS-Strang bilden, und anschließend entlang des Ziel-DNS-Strangs durch ein DNS-Polymeraseenyzm verlängert werden. Primerpaare können zur Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz verwendet werden, z. B. durch PCR oder andere im Fachgebiet bekannte Nukleinsäureamplifizierungsmethoden.

Methoden zur Herstellung und Verwendung von Sonden und Primern sind beispielsweise beschreiben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley-Intersciences (1987) und Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Amplifications, 1990, Innis et al. (Hrsg), 21–27, Academic Press Inc., San Diego, California. PCR-Primerpaare können von einer bekannten Sequenz abgeleitet werden, beispielsweise unter Verwendung von Computerprogrammen, die für diesen Zweck bestimmt sind, wie z. B. Primer (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Die hier bekannt gegebenen Sonden und Primer bestehen aus mindestens 10 Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz, obwohl eine kürzere Nukleinsäuresequenz als Sonde oder Primer verwendet werden kann, wenn sie durch im Fachgebiet wohlbekannte Methoden unter stringenten Bedingungen spezifisch mit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert. Die Offenlegung umfasst demnach isolierte Nukleinsäuremoleküle, die spezifische Längen der offengelegten Sequenzen umfassen. Einem Fachmann ist ersichtlich, dass die Spezifität einer bestimmten Sonde oder eines Primers mit seiner Länge zunimmt. Demnach wird beispielsweise ein Primer, der 20 aufeinander folgende Nukleotide einer Sequenz umfasst, sich mit einer höheren Spezifität an eine Zielsequenz (die beispielsweise in einer genomischen DNS-Bibliothek enthalten ist) anlagern, als ein entsprechender Primer von nur 15 Nukleotiden. Um die Spezifität zu verbessern, können längere Sonden und Primer verwendet werden, beispielsweise Sonden und Primer, die mindestens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oder mehr aufeinander folgende Nukleotide aus einem beliebigen Bereich einer Zielsequenz enthalten.
Wenn auf eine Sonde oder einen Primer Bezug genommen wird, weist der Begriff „spezifisch für (eine Zielsequenz)" daraufhin, dass die Sonde oder der Primer unter stringenten Bedingungen im Wesentlichen nur mit der Zielsequenz in einer gegebenen Probe, welche die Zielsequenz umfasst, hybridisiert.
Promoter: Ein Bereich von Nukleinsäure-Kontrollsequenzen, welche die Transkription einer Nukleinsäure steuern. Ein Promoter umfasst notwendige Nukleinsäuresequenzen in der Nähe der Startstelle der Transkription, wie z. B. ein TATA-Element im Fall eines Polymerase II-Typ-Promoters. In einem Ausführungsbeispiel umfasst ein Promoter einen Enhancer. In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst ein Promotor ein Repressorelement. In diesen Ausführungsbeispielen wird ein chimärer Promoter erzeugt (eine Promoter/Enhancer-Chimäre beziehungsweise eine Promoter/Repressor-Chimäre). Enhancer- und Repressorelemente können angrenzend an den oder distal zum Promoter gelegen sein und können bis zu mehrere tausend Basenpaare von der Startstelle der Transkription entfernt gelegen sein. Beispiele für Promoter, die in der vorliegenden Bekanntgabe verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, den SV40-Promoter, den CMV-Enhancer-Promoter, den CMV-Enhancer/β-Actin-Promoter und den gewebespezifischen Probasin-Promoter.
Andere Promotersequenzen, die zur Konstruktion der Nukleinsäuren und Ausübung der hier bekannt gegebenen Methoden verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das Lac-System, das Trp-System, das Tac-System, das Trc-System, Hauptoperator- und Promoterregionen des Lambda-Phagen, die Kontrollregion des Fd-Coat-Proteins, die frühen und späten Promotoren aus SV40, aus Polyoma-, Adenovirus, Retrovirus, Baculovirus und Simian Virus stammende Promotoren, den Promoter für 3-Phosphoglyceratkinase, die Promotoren der sauren Phosphatase aus Hefe, den Promoter der alpha-Paarungsfaktoren aus Hefe, beliebige retrovirale LTR-Promoteren, wie z. B. den RSV-Promoter; induzierbare Promotoren, wie den MMTV-Promoter; den Metallothionein-Promoter; Hitzeschock-Promotoren; den Albumin-Promoter; den Histon-Promoter, den α-Actin-Promoter, TK-Promotoren; B19-Parvovirus-Promotoren; den späten SV10-Promoter; den ApoAI-Promoter und Kombinationen hiervon.
In einem Ausführungsbeispiel ist ein Promoter ein starker Promoter, der die Transkription von RNS auf hohe Niveaus treibt, beispielsweise auf solche Niveaus, dass die transkriptionelle Aktivität des Promoters im Allgemeinen ungefähr 25% der gesamten transkriptionellen Aktivität der Zelle ausmacht. Die Stärke eines Promoters ist oftmals gewebsspezifisch und kann demnach von einem Zelltyp zum anderen variieren. CMV ist beispielsweise ein klassischer starker Promoter, da er hohe Niveaus an transkriptioneller Aktivität in vielen Zelltypen hervorruft. Beispiele für starke Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: CMV; CMV/Huhn β-Actin; Elongationsfaktoren 1A und 2A; SV40; RSV und den MoLV LTR.
In einem anderen Ausführungsbeispiel ist ein Promoter ein gewebespezifischer Promoter, der die Transkription in einem einzigen Zelltyp oder einer begrenzten Auswahl von Geweben treibt. Bespiele für gewebespezifische Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Probasin (der Exprimierung in Prostatazellen treibt), einen Immunglobulin-Promoter; einen Whey Acidic Protein-Promoter; einen Casein-Promoter; Glial Fibrillary Acidic Protein-Promoter; Albumin-Promoter; β-Globin-Promoter; und den MMTV-Promoter.
In noch einem weiteren Beispiel, ist ein Promoter ein hormonresponsiver Promoter, der Transkription nur betreibt, wenn er einem Hormon ausgesetzt ist. Beispiele für hormonresponsive Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Probasin, (der auf Testosteron und andere Androgene anspricht); MMTV-Promoter, (der auf Dexamethason, Estrogen und Androgene anspricht); und den Whey Acidic Protein-Promoter sowie den Casein-Promoter, (die auf Estrogen ansprechen).
Zur Exprimierung von Hefegenen in Hefe steht eine Vielzahl von Promotoren für verschiedene Zwecke zur Auswahl. Die folgenden sind als Beispiele angegeben und sollen in keiner Weise einschränkend sein:

Der Gal1, 10-Promoter: Dieser Promoter ist durch Galaktose induzierbar. Es ist häufig nützlich, wenn man in der Lage ist, die Exprimierung „seines" Genes an- und abzustellen, so dass man die zeitabhängigen Auswirkungen der Exprimierung verfolgen kann. Der Gal-Promoter ist geringfügig „leaky" (d. h. er verursacht eine geringfügige Basalexpression in Abwesenheit von Galaktose, Anm. d. Ü) und ist somit geeignet, wenn es nicht entscheidend ist, dass in der Abwesenheit von Galaktose absolut keine Exprimierung des Passenger-Gens auftritt. Das Gal 1-Gen und das Gal 10-Gen grenzen aneinander an und werden in entgegengesetzte Richtungen von derselben Promoterregion transkribiert. Die regulatorische Region, welche die UAS-Sequenzen enthält, kann auf einem DdI-Sau3A-Fragment ausgeschnitten werden und upstream von jedem beliebigen anderen Gen platziert werden, um (auf dieses) Galaktose-induzierbare Exprimierung und Glukose-Repression zu übertragen.
PGK, GPD und ADH1-Promoter: Dies sind konstitutive Hochexpression-Promotoren. PGK = Phosphoglyceratkinase, GPD = Glycaraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, ADH1 = Alkoholdehydrogenase.
ADH2-Promoter: Dieses Gen ist Glukose-repressierbar und es wird stark transkribiert auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen (ähnlich wie GAL 1, 10, nur nicht durch Galaktose induzierbar).
CUP1-Promoter: Dies ist der Methallothionein-Gen-Promoter. Er wird durch zum Medium hinzugegebene Kupfer- oder Silberionen aktiviert. Das CUP-Gen ist eines der wenigen Hefegene, das in Hefe in mehr als einer Kopie vorliegt. In Abhängigkeit vom Stamm können bis zu acht Kopien dieses Gens vorhanden sein.
PHO5-Promoter: Dieser Promoter stammt von einem Gen, das eine saure Phosphatase codiert. Es wird dadurch induziert, dass wenig oder kein Phosphat im Medium vorhanden ist. Die Phosphatase wird sekretiert mit der Aussicht, dass es in der Lage sein wird, Phosphat aus der Umgebung freizusetzen. Wenn Phosphat vorhanden ist, findet sich keine PHO5 message (mRNA). Wenn es fehlt, wird es (PHO5) stark induziert.
Protein: Ein biologisches Molekül, das von einem Gen exprimiert wird und aus Aminosäuren besteht.
Protein: Ein biologisches Molekül, das durch ein Gen exprimiert wird und aus Aminosäuren besteht.
Gereinigt: Der Ausdruck gereinigt erfordert keine absolute Reinheit; er ist vielmehr als relativer Ausdruck zu verstehen. Daher ist beispielsweise ein gereinigtes Proteinpräparat (oder Nukleinsäurepräparat) ein Präparat in dem das Protein (oder die Nukleinsäure) reiner als das Molekül in seiner natürlichen Umgebung innerhalb einer Zelle (oder einem anderen Produktionsgefäß) ist. In einem Ausführungsbeispiel wird ein Präparat eines Moleküls soweit gereinigt, dass das Molekül mindestens 50%, beispielsweise mindestens 70% des Gesamtinhaltes stellt.

Zufallsoligonukleotide: Ein Oligonukleotid mit einer Zufallssequenz (siehe z. B. US Patent Nr. 5043272 und Nr. 5106727 , in welchen die Nutzung von Zufallsoligonukleotiden für das Priming von in vitro Amplifikationsreaktionen dargestellt wird).
Die Sequenzen von Zufallsoligonukleotiden mögen im streng mathematischen Sinne nicht zufällig sein. Beispielsweise sind chemisch synthetisierte Oligonukleotide nur so weit zufällig, wie es die physikalische und chemische Effizienz des Syntheseverfahrens ermöglichen und basiert auf der Wahl des Syntheseverfahrens. Oligonukleotide mit definierten Sequenzen erfüllen die Definition von zufällig, wenn unter den Reaktionsbedingungen die Position der Anlagerung an das Template unbestimmt ist. Außerdem können Zufallsoligonukleotide nur über einen Teil ihrer Länge „zufällig" sein, insofern als ein Nukleinsäurerest in der Sequenz oder ein Teil der Sequenz vor der Synthese des Primers identifiziert und definiert werden kann.
Zufallsolegonukleotide können nach bekannten Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden hergestellt werden; Zufälligkeit der Sequenz kann durch das Bereitstellen einer Mischung von Nukleinsäureresten im Reaktionsgemisch bei einem oder mehreren Zugabeschritten (um eine Mischung von Oligonukleotiden mit Zufallssequenz in dieser Position zu erzeugen) herbeigeführt werden. Dementsprechend kann ein Oligonukleotid, das über seine gesamte Länge zufällig ist, durch sequentielles Einfügen von Nukleinsäureresten aus einer Mischung von jeweils 25% dATP, dCTP, dGTP und dTTP zur Ausbildung eines Oligonukleotids, hergestellt werden. Andere Verhältnisse der dNTPs können verwendet werden (z. B. mehr oder weniger eines der dNTPs, wobei die anderen Verhältnisse so angepasst werden, dass die Summe 100% ergibt).
Der Begriff „Zufallsoligonukleotide" beinhaltet ausdrücklich eine Sammlung von individuellen Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Sequenzen, was beispielsweise durch die generische Formel 5'-XXXXX-3' angezeigt werden kann, wobei X einen Nukleotidrest bezeichnet, der dem Oligonukleotid aus einer Mischung mit einem definierbaren Prozentanteil eines jeden dNTP zugegeben wurde. Enthält die Mischung beispielsweise jeweils 25% dATP, dCTP, dGTP und dTTP, enthielte das bezeichnete Oligonukleotid eine Mischung an Oligonukleotiden, die eine Wahrscheinlichkeit von ungefähr 25% aufweisen, an jeder Position A, C, G oder T zu haben.
Dieser Begriff beinhaltet auch eine Mischung an Oligonukleotiden mit der generischen Formel 5'-nnnXnn-3', wobei X auf gleiche Weise definiert ist, wie in der ersten Formel, und n ein bekanntes Nukleotid (z. B. A, C, G oder T) bezeichnet.
Rekombinant: Eine rekombinante Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die natürlich nicht vorkommt, oder mit einer Sequenz, die durch artifizielle Kombination von zwei ansonsten separaten Sequenzsegmenten hergestellt wurde. Diese artifizielle Kombination wird häufig durch chemische Synthese oder häufiger durch artifizielle Manipulierung von isolierten Nukleinsäuresegmenten, z. B. durch Gentechnik wie z. B. durch Sambrook et al. (In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschrieben, erreicht.
Restriktionsendonukleasen: Enzyme, die spezifische Nukleotidsequenzen erkennen und beide Stränge der DNS, die diese Sequenz enthält, spaltet.
Sequenzidentität: Die Identität zweier oder mehrer Nukleinsäuresequenzen oder zweier oder mehrerer Aminosäuresequenzen wird als Identität der Sequenzen ausgedrückt. Sequenzidentität kann als prozentuale Identität (oder Ähnlichkeit oder Homologie) gemessen werden; je größer die Prozentzahl, desto näher sind die Sequenzen daran, identisch zu sein. Homologe oder Orthologe von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen weisen einen relativ hohen Grad an Sequenzidentität bei Alignment durch Standardmethoden auf. Diese Homologie ist signifikant, wenn orthologe Proteine oder cDNA von eng miteinander verwandeten Arten (z. B. Sequenzen des Menschen und des Affen) abstammen im Vergleich zu entfernt verwandten Arten (z. B. Sequenzen des Menschen und des C. elegans).
Methoden des Sequenzalignments zu Vergleichzwecken entsprechen dem allgemeinen Stand der Technik. Diverse Programme und Alignmentalgorithmen werden beschrieben in: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. BioI. 48: 443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73: 237–44, 1988; Riggins & Sharp, CABIOS 5: 151–3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881–90, 1988; Huang et al. Computer Appls. Biosc. 8, 155–65, 1992; und Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24: 307–31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–10, 1990 bietet eine detaillierte Betrachtung von Methoden des Sequenzalignments und Homologieberechnungen.
Das NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403:10, 1990) ist von verschiedenen Quellen erhältlich, darunter auch vom National Center for Biological Information (NCBI, National Library of Medicine Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894) und im Internet, für die Benutzung in Verbindung mit den Analyseprogrammen BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN und TBLASTX. Zusätzliche Informationen können auf der NCBI Webseite gefunden werden.
Für den Vergleich von Aminosäuresequenzen mit mehr als ungefähr 30 Aminosäuren wird die BLAST 2 Sequences Funktion unter Verwendung der Standardmatrix BLOSUM62 mit Standardparametern (Strafe von 11 für die Existenz einer Lücke und eine Strafe von 1 pro Aminosäure der Lücke) eingesetzt. Wenn kurze Peptide (weniger als 30 Aminosäuren) aligniert werden sollen, sollte das Alignment unter Nutzung der BLAST 2 Sequences Funktion unter Verwendung der PAM30 Matrix mit Standardparametern (Strafe für eine offene Lücke von 9 und für Erweiterung der Lücke von 1) durchgeführt werden. Proteine mit noch höherer Identität zur Referenzsequenz werden eine steigende Identität anzeigen, wenn sie durch diese Methoden bewertet werden, wie beispielsweise mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% Sequenzidentität, wenn Gapped BLASTP in Verbindung mit Datenbanken wie z. B. die nr, pat oder SwissProt Datenbank, verwendet wird. Queries die mit dem BLASTP Programm behandelt werden, werden mit DUST (Hancock & Armstrong, Comput. Appl. Biosc. 10: 67–70, 1994) gefiltert. Andere Programme nutzen SEG.
Wenn weniger als die ganze Sequenz auf Sequenzidentität verglichen wird, weisen Homologe typischerweise mindestens 75% Sequenzidentität über kurze Intervalle von 10–20 Aminosäuren auf und können Sequenzidentitäten von 85%, 90%, 95%, 98% oder mehr haben, abhänging von ihrer Identität zur Referenzsequenz. Verfahren für die Bestimmung von Sequenzidentitäten über solch kurze Intervalle sind auf der NCBI Webseite beschrieben.
Der Fachmann wird erkennen, dass diese Bandbreite von Sequenzidentitäten nur eine Orientierungshilfe darstellt; es ist durchaus möglich, dass signifikante Homologe erhalten werden, die ausserhalb dieses Bereiches fallen.
Ortsspezifische Endonuklease: Ein Enzym, das einen DSB ortsspezifisch in einem Nukleinsäuremolekül erzeugt. Beispielhalber ist Hefe HO eine Endonuklease, die für den Paarungstypwechsel der Hefe benötigt wird. Die HO Endonuklease spaltet die DNS am Paarungstyp-Lokus, MAT, der den Paarungstyp der Zelle bestimmt (entweder a oder α). Der DSB bewirkt eine Genkonversion, das sich unter Verwendung zweier Donorsequenzen, HML und HMR genannt, ereignet und zum unidirektionalen Übergang der Information des Paarungstyps von HML oder HMR zu MAT führt. Das HO-Gen kodiert für eine Endonuklease, die eine Konsenssequenz von 24 bp erkennt und eine 4 bp versetzte Spaltung innerhalb dieser Sequenz vornimmt.
Transduziert und Transfektiert: Ein Virus oder Vektor transduziert oder transfektiert eine Zelle, wenn er Nukleinsäure in die Zelle transferiert. Eine Zelle ist „transfektiert" durch eine in die Zelle transduzierte Nukleinsäure, wenn die DNS stabil durch die Zelle repliziert wird, entweder durch Integration der Nukleinsäure in das Genom der Zelle oder durch episomale Replikation.
Transformiert: Eine transformierte Zelle ist eine Zelle, in die ein Nukleinsäuremolekül durch molekularbiologische Methoden eingesetzt wurde. Der Begriff Transformation, wie er hier verwendet wird, umfasst alle Verfahren, mit denen ein Nukleinsäuremolekül in solch eine Zelle integriert werden kann, einschließlich Transfektierung mit viralen Vektoren, Transformation mit Plasmidvektoren und Integration von nackter DNS durch Elektroporation, Lipofektion und durch Beschleunigung mit einer Genkanone.
Vektor: Ein Nukleinsäuremolekül, wie es in die Wirtszelle übertragen wird und dabei eine transformierte Wirtszelle erzeugt. Ein Vektor kann Nukleinsäuresequenzen enthalten, die es ihm erlauben, sich in der Wirtszelle zu replizieren, wie beispielsweise einen Replikationsursprung. Der Vektor kann außerdem ein oder mehrere selektierbare Markierungsgene oder andere, dem Stand der Technik entsprechende genetische Elemente enthalten.
Soweit nicht anderweitig erklärt, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie ein Durchschnittsfachmann des Fachgebietes dieser Offenlegung kennt. Es ist beabsichtigt, dass die Singularbegriffe "ein", "eine", "der", "die" und "das", den Plural mit einschließen, solange der Zusammenhang es nicht anders fordert. Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass alle Größen von Nukleinsäuren und Aminosäuren, alle Molekulargewichte und alle Werte für Molekülmassen angegeben für Nukleinsäuren oder Polypeptide nur Näherungswerte sind und nur zur Veranschaulichung dienen. Auch wenn Verfahren und Materialen ähnlich oder äquivalent den hier beschriebenen zum Anwenden oder Testen der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Alle hier erwähnten Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen sind durch vollständige Referenzangaben inkorporiert. Im Falle eines Konflikts, sind die vorliegenden Angaben, einschließlich der Begriffserklärung, bindend. Die Materialien, Verfahren und Beispiele dienen ausschließlich der Veranschaulichung und sind in keiner Weise limitierend.
III. Überblick über einige Ausführungsbeispiele
Ein erstes Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zur Einführung einer Mutation in eine doppelsträngige Target-Nukleinsäuresequenz einer Zelle, wobei die doppelsträngige Nukleinsäuresequenz einen ersten und zweiten Strang aufweist und das Verfahren die Einführung einer doppelsträngigen Nukleinsäure-Kassette in eine Target-Nukleinsäuresequenz an einer Insertionsstelle beinhaltet; wobei die Kassette eine RE-Kassette ist mit einem ersten Teil, der homolog ist zu der Nukleinsäuresequenz auf der einen Seite von der Insertionsstelle und einem zweiten Teil, der homolog ist zu der Nukleinsäuresequenz auf der anderen Seite von der Insertionsstelle; und einer Nukleinsäuresequenz zwischen dem ersten und zweiten Teil, die für einen Reporter kodiert und die Zelle mit einem ersten Oligonukleotid transformiert; das eine Nukleinsäuresequenz enthält, die homolog ist zu einem Strang (dem gewählten Strang) der Target-Nukleinsäuresequenz an einer Stelle auf der ersten Seite von der Insertionsstelle; und eine Nukleinsäuresequenz, die homolog ist zu dem gleichen Strang der Target-Nukleinsäuresequenz an einer Stelle auf der zweiten Seite von der Insertionsstelle und mindestens ein Nukleotid enthält, das sich von dem gewählten Strang der Target-Nukleinsäuresequenz unterscheidet; und für den Verlust der Nukleinsäuresequenz selektiert, die für den Reporter kodiert; wobei der Verlust der Nukleinsäuresequenz, die für den Reporter kodiert, den Einbau einer Oligonukleotidsequenz anzeigt, die mindestens ein Nukleotid enthält, das sich von der Target-Nukleinsäuresequenz unterscheidet,.
Ein zweites Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zur Einführung einer Mutation in eine doppelsträngige Target-Nukleinsäuresequenz einer Zelle, wobei die doppelsträngige Nukleinsäurekassette weiterhin eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für einen Gegenselektionsmarker zwischen dem ersten und zweiten Teil kodiert und als CORE-Kassette bezeichnet wird, und wobei das Verfahren weiterhin nach Verlust der Nukleinsäuresequenz, die für den Gegenselektionsmarker kodiert, und der Nukleinsäuresequenz, die für das Reportergen kodiert, selektiert, wobei Verlust der Nukleinsäuresequenz, die für den Gegenselektionsmarker kodiert, und der Nukleinsäuresequenz, die für das Reportergen kodiert, den Einbau der Oligonukleotidsequenz, die das mindestens eine Nukleotid enthält, das sich von dem gewählten Strang der Target-Nukleinsäuresequenz unterscheidet, anzeigt. Wahlweise enthält die doppelsträngige Nukleinsäurekassette in bestimmten Ausführungsbeispielen weiterhin eine Nukleinsäuresequenz, die eine Doppelstrangbruch-Erkennungsstelle und einen induzierbaren Promoter, der funktionsfähig mit der Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die für das Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, aufweist und diese Kassette als RE-CORE-Kassette bezeichnet wird.
Noch ein Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zur Einführung einer Mutation in eine doppelsträngige Target-Nukleinsäuresequenz einer Zelle, wobei die doppelsträngige Nukleinsäurekassette weiterhin eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Doppelstrangbruch-Erkennungsstelle, eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, das die Doppelstrangbruch-Erkennungsstelle erkennt, und einen induzierbaren Promoter, der funktionsbereit mit der Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die für das Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, aufweist und diese Kassette als RE-DSB-Kassette bezeichnet wird.
In spezifischen Ausführungsbeispielen, die in der Kassette eine Doppelstrangbruchstelle und eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, haben, beinhaltet das Verfahren weiterhin Induzierung der Exprimierung des Doppelstrangbruch-Enzyms, was einen Doppelstrangbruch in der Kassette stimuliert, deren Doppelstrangbruch wiederum Rekombination stimuliert.
In speziellen Beispielen der vorliegenden Verfahren beinhaltet die Oligonukleotidsequenz mehr als ein Nukleotid, das sich von der Target-Nukleinsäuresequenz unterscheidet. In bestimmten Beispielen geschieht die Transformation der Zelle mit dem ersten Oligonukleotid vor der Selektion für den Verlust sowohl der Nukleinsäuresequenz, die für den Gegenselektionsmarker kodiert, als auch der Nukleinsäuresequenz, die für das Reportergen kodiert.
Außerdem werden Verfahren bereitgestellt, die weiterhin die Transformation der Zelle mit einem zweiten Oligonukleotid (beispielsweise konkurrierend mit der Transformation der Zelle mit dem zweiten Oligonukleotid) beinhaltet, das mindestens teilweise zum ersten Oligonukleotid komplementär ist. In speziellen Beispielen weist das zweite Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz auf, die zur Target-Nukleinsäuresequenz an einer Stelle auf der ersten Seite von der Insertionsstelle homolog ist. In anderen Beispielen weist das zweite Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz auf, die zur Target-Nukleinsäuresequenz an einer Stelle auf der zweiten Seite von der Insertionsstelle homolog ist. In noch anderen Beispielen weist das zweite Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz auf, die zur Target-Nukleinsäuresequenz an einer Stelle auf der ersten Seite von der Insertionsstelle homolog ist; und eine Nukleinsäuresequenz, die zur Target-Nukleinsäuresequenz an einer Stelle auf der zweiten Seite von der Insertionsstelle homolog ist.
In verschiedenen Ausführungsbeispielen enthält das erste und/oder zweite Oligonukleotid wenigstens einen zufälligen Austausch eines Nukleotids im Vergleich zur Target-Nukleinsäuresequenz und wahlweise mehrere. In bestimmten Ausführungsbeispielen ist das zweite Oligonukleotid zum ersten Oligonukleotid vollständig komplementär. In anderen Ausführungsbeispielen sind die 3'-Enden der beiden Oligonukleotide komplementär, allerdings fehlt dem ersten Oligonukleotid Homologie zur zweiten Seite der Insertionsstelle und dem zweiten Oligonukleotid fehlt Homologie zur ersten Seite der Insertionsstelle. In noch weiteren Ausführungsbeispielen sind die 3'-Enden der beiden Oligonukleotide komplementär, allerdings fehlt dem zweiten Oligonukleotid Homologie zur zweiten Seite der Insertionsstelle und dem ersten Oligonukleotid fehlt Homologie zur ersten Seite der Insertionsstelle. In noch weiteren Ausführungsbeispielen sind die 5'-Enden der beiden Oligonukleotide komplementär, allerdings fehlt dem ersten Oligonukleotid Homologie zur zweiten Seite der Insertionsstelle und dem zweiten Oligonukleotid fehlt Homologie zur ersten Seite der Insertionsstelle. Alternativ sind in bestimmten Ausführungsbeispielen die 5'-Enden der beiden Oligonukleotide komplementär, allerdings fehlt dem zweiten Oligonukleotid Homologie zur zweiten Seite der Insertionsstelle und dem ersten Oligonukleotid fehlt Homologie zur ersten Seite der Insertionsstelle.
Außerdem werden Verfahren bereitgestellt, die die CORE-Kassette und die CORE-DSB-Kassette nutzen, wobei der Gegenselektionsmarker KIURA3, URA3, TRP5, TRP1 oder ein für ein Toxin kodierendes Gen ist. In spezifischen Beispielen solcher Methoden ist der Gegenselektionsmarker ein für ein Toxin kodierendes Gen und das Toxin ist ein induzierbares Restriktionsenzym oder ein induzierbares p53 Gen. Wahlweise ist das induzierbare p53 Gen eine toxische Variante.
In einigen Ausführungsbeispielen kodiert der Reporter für ein Polypeptid, das der Zelle antibiotische Resistenz verleiht. Das Antibiotikum ist G418, Hygromycin, Kanamycin, Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Zeocin, Nourseothricin, Cycloheximid oder Canavanin in speziellen Beispielen.
Außerdem sind hier Verfahren beschrieben, in denen der Reporter für ein Polypeptid eines Aminosäure- oder Nukleotid-Syntheseweges kodiert. Das Polypeptid ist LEU2, TRP5, TRP1, LYS2, HIS3 oder ADE2 in speziellen Beispielen.
Das Oligonukleotid in den verschiedenen Verfahren kann von beliebiger Länge sein, beispielsweise mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide oder mindestens 80 Nukleotide in Länge.
Außerdem sind hier Verfahren beschrieben, in denen das erste und zweite Oligonukleotid jeweils mindestens 30 Nukleotide lang ist. In anderen Methoden ist das erste und zweite Oligonukleotid jeweils mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide oder mindestens 80 Nukleotide lang.
In bestimmten Ausführungsbeispielen sind das erste und zweite Oligonukleotid von unterschiedlicher Länge.
In bestimmten Ausführungsbeispielen besteht der Überlappungsbereich am 3'-Ende des Oligonukleotids aus mindestens 10 Basenpaaren; in anderen besteht der Überlappungsbereich am 3'-Ende aus mindestens 15 Basenpaaren. In speziellen Beispielen solcher Verfahren kann das 3'-Ende des ersten und zweiten Nukleotids durch in vitro Polymerisation verlängert werden.
Außerdem werden Verfahren bereitgestellt, bei denen sich mindestens ein Oligonukleotid von der Target-Nukleinsäuresequenz durch mehr als ein Nukleotid unterscheidet. In anderen Beispielen unterscheiden sich beide Oligonukleotide von der Target-Nukleinsäuresequenz durch mindestens ein einzelnes Nukleotid. In speziellen Beispielen ist mindestens ein Nukleotid innerhalb des Überlappungsbereichs zwischen dem ersten und zweiten Oligonuldeotid unterschiedlich, während in anderen Beispielen mindestens ein Nukleotid außerhalb des Überlappungsbereichs zwischen dem ersten und zweiten Oligonukleotid unterschiedlich ist. In einigen Beispielen gibt es Unterschiede sowohl innerhalb als auch außerhalb des Überlappungsbereichs.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zur Deletion einer doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz (beispielsweise von ungefähr 1 bp bis zu ungefähr 16000 bp in Länge) aus einer Zelle, wobei die doppelsträngige Target-Nukleinsäuresequenz einen ersten und zweiten Strang aufweist, und die Methode die Einfügung einer doppelsträngigen Nukleinsäuresequenz-Kassette in eine Target-Nukleinsäuresequenz an einer Insertionsstelle beinhaltet, wobei die Kassette eine RE-Kassette ist und eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die für einen Reporter kodiert und zwischen dem ersten und zweiten Teil der RE-Kassette lokalisiert ist; zur Transformierung der Zelle mit einem ersten Oligonukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz beinhaltet, die zum ersten Strang der Nukleinsäure in Richtung des 5'-Endes der interessierenden Nukleinsäure homolog ist; und eine Sequenz, die zum ersten Strang der Nukleinsäure in Richtung des 3'-Endes der interessierenden Nukleinsäure homolog ist; und für den Verlust der Sequenz, die für ein Reportergen kodiert, selektiert, wobei der Verlust der Nukleinsäuresequenz, die für das Reportergen kodiert, aus der doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz die Deletion der doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz anzeigt.
Noch ein weiteres bereitgestelltes Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zur Deletion einer doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz aus einer Zelle, wobei die doppelsträngige Nukleinsäure-Kassette weiterhin eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für einen Gegenselektionsmarker kodiert, und zwischen dem ersten und zweiten Teil lokalisiert ist, wobei die Kassette als CORE-Kassette bezeichnet wird, und wobei das Verfahren weiterhin eine Selektion für den Verlust sowohl der Nukleinsäuresequenz, die für den Gegenselektionsmarker kodiert, als auch der Nukleinsäuresequenz, die für den Reporter kodiert, beinhaltet, wobei der Verlust sowohl der Nukleinsäuresequenz, die für den Gegenselektionsmarker kodiert, als auch der Nukleinsäuresequenz, die für den Reporter kodiert, die Deletion der doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz anzeigt.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zur Deletion einer doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz aus einer Zelle, wobei die doppelsträngige Nukleinsäure-Kassette weiterhin eine Doppelstrangbruch-Erkennungsstelle, eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, das die Doppelstrangbruch-Erkennungsstelle erkennt, und einen induzierbaren Promoter, der funktionell mit der Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die für das Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, aufweist und diese Kassette als RE-DSB-Kassette bezeichnet wird.
In einem weiteren bereitgestellten Verfahren zur Deletion einer doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz aus einer Zelle, beinhaltet die doppelsträngige Nukleinsäure-Kassette weiterhin eine Doppelstrangbruch-Erkennungsstelle, eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, das die Doppelstrangbruch-Erkennungsstelle erkennt, und einen induzierbaren Promoter, der funktionell mit der Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die für das Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, wobei die Kassette als CORE-DSB-Kassette bezeichnet wird.
in speziellen Ausführungsbeispielen, die in der Kassette eine Doppelstrangbruchstelle und eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Doppelstrangbruch-Enzym kodiert, aufweisen, beinhaltet das Verfahren weiterhin Induzierung der Exprimierung des Doppelstrangbruch-Enzyms, was einen Doppelstrangbruch in der Kassette stimuliert, deren Doppelstrangbruch wiederum Rekombination stimuliert.
In speziellen Beispielen der bereitgestellten Verfahren für die Deletion einer doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz, ist der erste Teil der Kassette homolog zu einer Nukleinsäuresequenz auf der ersten Seite von der Insertionsstelle; und der zweite Teil der Kassette ist homolog zu einer zweiten Nukleinsäuresequenz auf der zweiten Seite von der Insertionsstelle.
Noch weitere Beispiele dieser Verfahren schließen weiterhin Transformation der Zelle mit einem zweiten Oligonukleotid ein, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die homolog ist zum zweiten Strang einer Nukleinsäure auf der 5'-Seite der doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz; wobei die Sequenz des ersten Oligonukleotids homolog ist zu mindestens 10 Nukleotiden am 3'-Ende der Sequenz des zweiten Oligonukleotids. In noch weiteren Beispielen ist die Sequenz des ersten Oligonukleotids homolog zu mindestens 15 Nukleotiden am 3'-Ende der Sequenz des zweiten Oligonukleotids.
In noch weiteren Beispielen beinhaltet das zweite Oligonukleotid weiterhin eine Sequenz, die zum zweiten Strang einer Nukleinsäure auf der 3'-Seite von der interessierenden Nukleinsäuresequenz homolog ist.
sIn speziellen Beispielen ist das zweite Oligonukleotid vollständig komplementär zum ersten Oligonuldeotid.
Für spezielle Beispiele dieser Ausführungsbeispiele, die einen Gegenselektionsmarker aufweisen oder benötigen, ist der Gegenselektionsmarker KIURA3, URA3, TRP5, TRP1 oder ein Gen, das für ein Toxin kodiert. In speziellen Beispielen ist der Gegenselektionsmarker ein Gen, das für ein Toxin kodiert, und das Toxin ist ein induzierbares Restriktionsenzym oder ein induzierbares p53 Gen. Beispielsweise ist das induzierbare p53 Gen in einigen Fällen eine toxische Variante.
In noch einem Ausführungsbeispiel eines Verfahrens für die Deletion einer doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz, kodiert der Reporter für ein Polypeptid, das der Zelle antibiotische Resistenz verleiht, wobei das Antibiotikum beispielsweise G418, Hygromycin, Kanamycin, Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Zeocin, Nourseothricin, Cycloheximid oder Canavanin ist. In anderen Ausführungsbeispielen kodiert der Reporter alternativ für ein Polypeptid eines Aminosäure- oder Nukleinsäure-Syntheseweges. Das Polypeptid ist beispielsweise LEU2, TRP5, TRP1, LYS2, HIS3 oder ADE2 in speziellen Beispielen.
In speziellen Beispielen der Verfahren für die Deletion einer doppelsträngigen Target-Nukleinsäuresequenz ist das Oligonukleotid mindestens 30 Nukleotide lang, beispielsweise mindestens 40, mindestens 50 oder mindestens 80 Nukleotide lang. In anderen speziellen Beispielen sind das erste und zweite Oligonukleotid jeweils mindestens 20 Nukleotide lang, beispielsweise mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50 oder mindestens 80 Nukleotide lang.
In weiteren Ausführungsbeispielen sind das erste und zweite Oligonukleotid von unterschiedlicher Länge. In noch weiteren Ausführungsbeispielen dieser Verfahren sind das erste und zweite Oligonukleotid mindestens 20 Nukleotide lang, wobei der Überlappunsbereich am 3'-Ende mindestens 10 Basenpaare ist, oder das erste und zweite Oligonukleotid sind mindestens 40 Nukleotide lang, wobei der Überlappunsbereich am 3'-Ende mindestens 15 Basenpaare ist.
In speziellen Verfahrensbeispielen kann das 3'-Ende des ersten und zweiten Oligonukleotids durch in vitro Polymerisation verlängert werden.
In Beispielen der bereitgestellten Verfahren ist die Zelle eine Zelle eines Organismus', in dem homologe Rekombination erreicht werden kann. Beispielsweise ist die Zelle eine Pilzzelle (beispielsweise eine Hefezelle), eine Bakterienzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Tierzelle (z. B. die Zelle eines Huhns). Wahlweise können diese Zellen ein menschliches Chromosom oder ein Fragment eines solchen enthalten. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird ein Verfahren für die Beurteilung einer Mutation in einer Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, um festzustellen, ob die Mutation die Funktion oder das Exprimierungsmuster der Nukleinsäure beeinflusst, wobei das Verfahren ein hier beschriebenes delitto perfetto Mutagenese-Verfahren enthält. Ein weiteres Verfahren ist ein Verfahren für die Analyse einer Reihe von Mutationen in einer Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren die Ausführung des Verfahrens für die Beurteilung einer Mutation in einer Nukleinsäuresequenz einschließt, um festzustellen, ob die Mutation die Funktion oder das Exprimierungsmuster der Nukleinsäuresequenz in der Mehrheit der Fälle beeinflusst, wobei mindestens zwei unterschiedliche Mutationen in die Nukleinsäuresequenz eingefügt werden; und für die Analyse der Funktion und des Exprimierungsmusters der Nukleinsäure, wodurch eine Reihe von Mutationen in der Nukleinsäuresequenz analysiert wird.
In Beispielen dieser Verfahren ist die Nukleinsäuresequenz eine Säugetiersequenz. In anderen Beispielen kodiert die Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid. In noch weiteren Beispielen beinhaltet das Verfahren die Beurteilung der Funktion des Polypeptids.
Wahlweise werden die beschriebenen Verfahren in einer haploiden Hefezelle oder einer diploiden Hefezelle durchgeführt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird ein beschriebenes Verfahren als Diagnosemethode benutzt, wobei eine Reihe von Stammkulturen oder Zelllinien hergestellt wird, jede mit der Kassette an einer anderen Stelle innerhalb des Gens, so dass die Mutationen überall innerhalb des Gens eingefügt und die biologischen Auswirkungen beurteilt werden können.
Noch ein weiteres Ausführungsbeispiel ist ein Verfahren zur Analyse von Defekten in p53, wobei ein mutiertes p53-Protein in Hefe in einer Weise exprimiert wird, dass der Einfluss des Defekts in diesem mutierten p53-Protein beurteilt werden kann. Wahlweise beinhaltet solch ein Verfahren die Beurteilung des Defektes im mutierten p53-Protein.
Noch weitere Ausführungsbeispiele sind CORE-Kassetten-Konstrukte, RE-DSB-Kassetten-Konstrukte oder ein CORE-DSB-Kassetten-Konstrukt für die Verwendung bei der delitto perfetto Mutagenese.
In weiteren Ausführungsbeispielen werden integrative rekombinante Oligonukleotide (IRO) für die Verwendung bei der delitto perfetto Mutagenese bereitgestellt.
Noch ein weiteres Ausführungsbeispiel ist ein Kit für die Ausführung einer in vivo Mutagenese oder Deletion einer Nukleinsäuresequenz, das eine Menge eines CORE-Kassetten-Konstrukts, eines RE-DSB-Kassetten-Konstrukts oder eines CORE-DSB-Kassetten-Konstrukts und eine Menge eines integrativen rekombinanten Oligonukleotids enthält.
IV. Delitto Perfetto Mutagenese
Diese Offenlegung stellt Systeme der Mutagenese bereit, die auf der Transformation mit Oligonukleotiden basieren, deren Systeme eine schnelle Erzeugung von ortsspezifischen oder zufälligen Mutationen in DNS ermöglichen. In bestimmten Ausführungsbeispielen wird die Mutagenese in der Hefe Saccharomyces cerevisiae durchgeführt.
Die zweistufigen Verfahren ohne Klonierung erzeugen mutierte Produkte in vivo mit ausschließlich der gewünschten Mutation, wie beispielsweise Änderung einer einzigen oder mehrerer Basen, eine Insertion oder eine kurze oder lange Deletion. Die delitto perfetto Mutagenese ist äußerst vielseitig. Sie ermöglicht mehrere Runden spezifischer oder zufälliger Änderungen in einem spezifischen Intervall von bis zu 200 bp und in einigen Ausführungsbeispielen sogar längere Intervalle von bis zu 220, 250, 270, 290, 300, 350, 400 oder mehr Nukleotiden.
Der delitto perfetto Prozess, der mindestens teilweise vom RAD52-Weg abhängig ist, ist nicht durch die Verteilung der natürlich vorkommenden Restriktionsstellen beschränkt und benötigt minimale DNS-Sequenzierung. Da Hefe im Allgemeinen für zufällige und selektive Klonierung von genomischer DNS höherer Eukaryoten wie beispielsweise YAC verwendet wird, bietet diese Strategie außerdem einen effizienten Weg für die Erzeugung präziser Änderungen innerhalb von Säugetier-DNS-Sequenzen.
Das Mutagenese System wird hier allgemein als delitto perfetto bezeichnet (Italienisch: bedeutet perfekter Mord, wird aber als Idiom für perfekte Deletion verwendet), da die Einfügung der gewünschten Mutation die komplette Entfernung einer Marker-Kassette (der CORE-Kassette), die vorhergehend in den Target-Lokus eingefügt wurde, einbezieht.
Wie in 1 gezeigt, ist der erste Schritt die Einfügung einer CORE-Kassette, die einen Gegenselektionsmarker (COunterselectable marker) (z. B. KIURA3) und ein Reportergen (REporter gene) (z. B. kanMX4) in der Nähe der Stelle, an der eine oder mehrere Mutationen erwünscht sind, enthält. Die Einfügung der CORE-Kassette unter Verwendung des hochkompetenten homologen Rekombinationssystems der Hefe (Fincham, Microbio. Rev. 53, 148–70, 1989 [veröffentlichtes Erratum erscheint in Microbiol. Rev. 55(2):334, 1991] ist der Schlüssel zum delitto perfetto Mutagenese-Verfahrens.
Transformation der Zellen, die eine CORE-Kassette mit einem oder zwei integrativen rekombinanten Oligonukleotiden (Integrative Recombinant Oligonucleotides, IROs) enthalten, führt zur Entfernung der CORE-Kassette. Gegenselektion auf Verlust des Gegenselektionsmarkers, beispielsweise des KIURA3 Markers, gefolgt durch Prüfung auf gleichzeitigen Verlust des Reporters (z. B. des kanMX4 Markers), bietet Selektion auf die gewünschten Änderungen und minimiert falsche Positive. Die Art der resultierenden Mutation wird vorgegeben durch das/die IRO, die bei der Entfernung der CORE-Kassette verwendet werden. Spezielle Ausführungsbeispiele sind im Folgenden ausführlicher beschrieben und bestimmte Ausführungsbeispiele sind in den Beispielen veranschaulicht.
Während zusätzliche Mutationen mit den verschiedenen Änderungen der Target-Nukleinsäure unter Verwendung der delitto perfetto Mutagenese in Verbindung gebracht werden können, sind diese immer auf die IRO Bereiche beschränkt (solche Bereiche der Target-Nukleinsäure, die zu dem/den IRO(s) homolog sind).
Gerichtete Punktmutagenese
Um gerichtete Punktmutationen durch die delitto perfetto Mutagenese zu erzeugen, enthalten eines oder beide der für die Transformation der Zellen verwendeten IROs die gewünschte(n) Mutation(en). Ein Ausführungsbeispiel ist veranschaulicht in 1 durch das rechte Paar der dargestellten Oligonukleotide. Eine Punktmutation ist angezeigt durch den Stern; in dem veranschaulichten Ausführungsbeispiel besteht diese Mutation in beiden Oligonukleotiden (und befindet sich daher im Überlappungsbereich oder Komplimentaritätsbereich zwischen den Oligonukleotiden).
In anderen Ausführungsbeispielen befindet sich die Mutation in einem der Überhänge des Oligonukleotidenpaares. Siehe beispielsweise das Ausführungsbeispiel veranschaulicht in 5C, welches die Veränderung eines einzigen Nukleotids in der Target-Nukleinsäuresequenz 40 Nukleotiden außerhalb des überlappenden Teils des Oligonukleotidenpaares bewirkt.
Je näher am Ende des IROs sich die Mutation befindet, desto höher die Chancen, dass das transformierende rekombinatorische Ereignis „in" der Mutation auftritt, was eine Zelle hervorbringt, die die CORE-Kassette verloren hat, ohne die gewünschte Punktmutation einzufügen. In bestimmten Ausführungsbeispielen sind die Mutationen mindestens 20 Nukleotide, beispielsweise mindestens 40 Nukleotide, vom Ende eines IRO entfernt. Diese Position erlaubt genügend Nukleinsäuresequenz, in der die homologe Rekombination auftreten kann, ohne die Punktmutation auszuschließen.
Es ist außerdem möglich, mehr als eine Punktmutation gleichzeitig in eine Target-Nukleinsäuresequenz einzubringen, indem IRO genutzt werden, die mehr als eine Änderung einer Nukleinsäure im Vergleich zur Target-Nukleinsäuresequenz enthalten. In bestimmten Ausführungsbeispielen sind diese Mehrfachmutationen mindestens 20 Nukleotide, beispielsweise mindestens 40 Nukleotide, vom Ende eines IRO entfernt.
Zufallsmutagenese
Wie in 5B schematisch dargestellt, kann die delitto perfetto Methode auch für die Zufallsmutagenese direkt im Genom verwendet werden. Oligonukleotide mit degenerierter (d. h. zufälliger) Sequenz sind käuflich erhältlich, z. B. von Invitrogen oder anderen Anbietern von Oligonukleotiden. Die Bereiche der IRO, die sich nicht im Überlappungsbereich befinden, können für die zufällige Mutagenese gestaltet werden, einfach durch Erzeugen (z. B. durch Bestellen bei einem Anbieter) eines Zufallsoligonukleotids, das eine Sequenz mit einer oder mehreren mehrdeutigen Basen (Beispiel: N = A + C + T + G, R = A + G, etc.) enthält. Diese Methode kann dazu genutzt werden, gleichzeitig einige oder viele unterschiedliche Mutanten in einem definierten DNS-Bereich zu erzeugen.
Beispielhaft können Methoden der Zufallsmutagenese auf beispielsweise Struktur-Funktionssanalysen, insbesondere für Mehrfachmutationen und Mutationen in Schlüsselbereichen einer Sequenz, wie beispielsweise in speziellen Proteinmotiven (die normalerweise kurz sind) oder in Schleifen (die typischerweise ungefähr 10 bis 20 Aminosäuren lang sind), angewendet werden.
Deletionsmutagenese
Das delitto perfetto Mutagenese-System kann auch zur Deletion von Sequenzen aus einer Nukleinsäure genutzt werden. Solche Deletionen können kurz (d. h., einige bis mehrere Nukleotide, wie beispielsweise ein Teil einer Kodierungssequenz oder einer Regulationssequenz) oder länger (d. h., ein vollständiges Gen oder Teil eines Chromosoms) sein. Die Deletion einer relativ langen Nukleinsäuresequenz ist schematisch in 1 durch das linke Oligonukleotidenpaar dargestellt. In dem dargestellten Ausführungsbeispiel wurden die IRO so kreiert, dass sie eine Nukleinsäuresequenz sowohl oberhalb als auch unterhalb der eingefügten CORE-Kassette (gekennzeichnet durch die schraffierten und breit gestrichelten Kästchen auf der Gensequenz und den Primern) enthalten. Wenn die IROs die homologe Rekombination und den Verlust der CORE-Kassette ermöglichen, findet die Rekombination weit außerhalb der CORE-Kassette statt und der gesamte Nukleinsäure-Bereich von innerhalb der schraffierten Fläche bis in die breit gestrichelte Fläche geht verloren.
In anderen Ausführungsbeispielen trägt eines der IRO (oder beide) eine kurze Deletionsmutation von beispielsweise 15 Nukleinsäuren. Dies ermöglicht das Einfüngen von kurzen Deletionen unter Verwendung eines Mechanismus', der im Wesentlichen dem für die Punktmutation beobachteten Mechanismus der oben beschriebenen Ausführungsbeispiele ähnlich ist.
Deletion Mutagenese von essentiellen Genen
Gleichermaßen kann die delitto perfetto Mutagenese zur Deletion von Genen, die essentiell für die Zelle sind, in denen die Mutagenese durchgeführt wird, genutzt werden. In diesem Ausführungsbeispiel wird eine Kopie des essentiellen Gens in eine Zelle, beispielsweise ein Plasmid, transformiert. Diese Plasmidkopie des Gens stellt die Funktion (in einigen Beispielen kontrolliert durch Induzierbarkeit oder Hemmbarkeit) bereit, während die andere (z. B. Genom-)Kopie beliebig unter Verwendung der delitto perfetto Mutagenese mutiert werden kann. Ein Beispiel für die Mutagenese von essentiellen Genen wird im Folgenden aufgeführt.
Generelle Mutagenese von essentiellen Genen
Mutationen in essentiellen Genen können außerdem durch Verwendung der delitto perfetto Mutagenese, z. B. durch Einfügen der CORE-Kassette oberhalb des Stopp-Kodons des gewünschten essentiellen Gens und unter Verwendung von Oligonukleotiden oder größeren PCR-Produkten, um nicht-letale Mutationen zu erzeugen, erzielt werden.
Delitto perfetto-Mutagenese von auf YACs kodierten Genen
Die Sequenzierung der Genome von mehreren höheren Eukaryoten, einschließlich des Menschen, hat einen Bedarf für die funktionelle Evaluation einer großen Anzahl von Genen erzeugt. Die Durchführbarkeit der Charakterisierung großer, komplexer DNS-Moleküle wird jedoch eingeschränkt durch die Schwierigkeit, geeignete, spezifische Mutationen zu erzeugen. Ein Nachteil von derzeitigen Systemen zur Modifizierung großer DNS-Moleküle besteht darin, dass sie alle eine In-vitro-Mutagenese erfordern, die auf die arbeitsintensive Subklonierung der zu mutagenisierenden Region angewiesen ist. Siehe beispielsweise Barton et al., Nucleic Acids Res. 18, 7349–7355, 1990; McCormick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10147–10151, 1995; Peterson et al., Trends Genet. 13: 61–66, 1997; Boren et al., Genome Res. 6: 1123–1130, 1996; Callow et al., Nucleic Acids Res. 22: 4348–4349, 1994; Tucker and Burke, Nucleic Acids Res. 24: 3467–3468, 1996; und Nefedov et al., Nucleic Acids Res. 28: E79, 2000.
Die offen gelegten Mutagenese-Methoden weiten die Möglichkeiten für eine funktionelle Analyse von Säuger-DNS, oder jeglicher Nukleinsäuresequenz (z. B. einer genomischen Sequenz), die in ein YAC kloniert wurde, aus. Hefe hat sich als ideal für die Isolation und Übertragung von spezifischen chromosomalen Regionen und Genen aus höheren Eukaryoten erwiesen. Beispielsweise kann TAR (Transformations-assoziierte Rekombinations)-Klonierung (Larionov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 491–496, 1996) zur Isolierung von funktionellen humanen Genen, wie z. B. BRCA1, BRCA2 und HPRT (Larionov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7384–7387, 1997; Kouprina et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4469–4474, 1998) verwendet werden. Die delitto perfetto-Methoden stellen ein zweckdienliches Instrument zur Modifizierung TAR-klonierter Gene zur Verfügung.
Delitto perfetto zur Charakterisierung von Proteindomänen
Das delitto perfetto-Mutageneseverfahren kann angewendet werden, um spezifische Motive oder Domänen von Proteinen zu charakterisieren. Dies könnte besonders interessant sein für Untersuchungen von Genen, die mit humanen Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Die Hefe S. cerevisiae ist eines der meist verwendeten Modellsysteme zur Untersuchung und Analyse der Funktion von exprimierten heterologen Genen. Mehrere Assays sind in Hefe entwickelt worden, um Proteinfunktion zu charakterisieren und den Effekt von definierten Proteinmodifikationen zu analysieren, einschließlich des ADE2-Farb-Assays für p53-Mutanten (Flaman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3963–3967, 1995), des Wachstums-Assays für p53-Mutanten (Inga et al., Oncogene 20: 501–513, 2001), des Wachstums-Assays für humane FEN-Mutanten (Greene et al., Hum. Mol. Genet. 8: 2263–2273, 1999); ein hsRPB4/7-abhängiger Hefe-Assay auf Transaktivierung durch das EWS-Onkogen (Zhou and Lee, Oncogene 20: 1519–1524, 2001); ein zellbasierter Screen in Hefe zur Identifizierung neuer Inhibitoren von Poly(ADP-Ribose)-Polymerase/parp1 und parp2 (Perkins et al., Cancer Res., 61: 4175–4183, 2001); Hefebasierte Transkriptionsassays zur funktionellen Analyse von humanen, C-terminalen BRCA1-Missense-Mutationen, die in Familien mit familiärer Häufung von Brust- und Eierstockkrebs identifiziert wurden (Vallon-Christersson et al., Hum. Mol. Genet. 10: 353–360, 2001).
Angepasste genetische Hintergründe von Hefe für delitto perfetto-Mutagenese
Spezifische mutierte Hefestämme, wie z. B. jene, die Mutationen in einem Rekombinationssystem oder ein Rekombinationssystem unterbrechende Mutationen tragen, können verwendet werden, um das Targeting (den gezielten Einbau) von Genen im delitto perfetto-Mutagenesesystem zu verbessern. Spezifische Beispiele umfassen hpr1-, hpr5- und rsc1-Mutanten in Hefe; siehe beispielsweise Aguilera und Klein, Genetics 119: 779–790, 1988; Aguilera und Klein, Mol. Cell. Biol. 10: 1439–1459, 1990; Schneiter et al., Mol. Cell. Biol. 19: 3415–3422. 1999; Gallardo und Aguilera, Genetics, 157: 79–89, 2001; Cairns et al., Mol. Cell 4: 715–723, 1999; und Goodwin and Nicolas, Gene 268: 1–7, 2001. Von diesen Mutanten nimmt man insbesondere an, dass sie sowohl zu gesteigerter spontaner Rekombination als auch einem verbesserten Targeting der CORE-Kassette führen. Von diesen Mutanten, zusammen mit Mutationen in Genen, die Nukleasen ( z. B. die exo1 oder mre11-Nukleasen; Tiskoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7487–7492, 1997; Tran et al., Mol. Cell. Biol. 19: 2000–2007, 1999; Bressan et al., Mol. Cell. Biol. 19: 7681–7687, 1999; und Symington et al., Nuc. Acids Res. 28: 4649–4659, 2000), einschließlich der spezifischen mre11D16A-Mutante, wird ebenfalls. erwartet, dass sie zu einer verbesserten Effizienz des IRO-Targeting führen. Es wird beispielsweise erwartet, dass IROs in den Nuklease-Mutanten stabiler sind.
Obwohl die angeführten Beispiele aus dem Hefe-System stammen, finden sich ähnliche Beispiele für Mutationen, die vorteilhaft für delitto perfetto-Mutagenese sind, in anderen Organismen, beispielsweise Mutanten im recBC- Gen von E. coli.
Mutagenese in Diploider Hefe
Das delitto perfetto-System kann sowohl in diploiden als auch in haploiden Hefestämmen angewendet werden. Beispielsweise wird die CORE-Kassette in einem diploiden Stamm in eines der Homologenpaare inseriert, im Wesentlichen wie für die Insertion in einen haploiden Stamm erläutert. Die Transformation dieses Stammes mit einem oder einem Paar von IRO führt zu dem Verlust der CORE-Kassette und dem entsprechenden Austausch innerhalb des Genoms. Aufgrund von Rekombination während der Zellteilung kann vor der Transformation mit dem/n IRO ein erheblicher Hintergrund von homozygoten CORE-Kassetten-Deletionen vorhanden sein. Die Effizienz des Targeting ist jedoch ausreichend hoch (vergleichbar zu Haploiden) um die delitto perfetto-Strategie in Diploiden lohnenswert zu machen. Des Weiteren wird erwartet, dass die Verwendung von oben beschriebenen Targeting-Mutanten, insbesondere der Nuklease-Mutanten, die relative Häufigkeit von delitto perfetto-Ereignissen im Vergleich zu dem Hintergrund von CORE-Kassette-negativen Zellen heraufsetzt.
Delitto perfetto in anderen Spezies
Obwohl mehrere der Ausführungsbeispiele in einem Hefe (S. cerevisiae)-System bekannt gegeben werden, glaubt man, dass die Methoden der delitto perfetto-Mutagenese in sämtlichen biologischen Organismen funktionieren, die ein funktionsfähiges Rekombinationssystem besitzen, selbst wenn das Rekombinationssystem nicht so kompetent ist wie in Hefe. Andere Zellen oder Zelltypen, die ein funktionsfähiges homologes Rekombinationssystem besitzen, umfassen Bakterien, wie z. B. Bacillus subtilis und E. coli (das RecE RecT-rekombinationskompetent ist; Muyrers et al., EMBO rep. 1: 239–243, 2000); Protozoa (z. B. Plasmodium, Toxoplasma); andere Hefen (z. B. Schizosaccharomyces pombe); filamentöse Pilze (z. B. Ashbya gossypii); Pflanzen, beispielsweise das Moos Physcomitrella patens (Schaefer und Zryd, Plant J. 11: 1195–1206, 1997); und tierische Zellen, wie z. B. Säugerzellen und Huhn-DT40-Zellen (Dieken et al., Nat. Genet. 12: 174–182, 1996). Die Anwendung in DT40-Zellen ist besonders nützlich, da Zelllinien mit spezifischen humanen Chromosomen zur Verfügung stehen (Koi et al., Cytogenet. Cell Genet. 76: 72–76, 1997). Es ist auch möglich Säugerzellen zu verwenden, da einige Zelllinien höhere Rekombinationsraten aufweisen (siehe, z. B. Bunz et al., Science 282: 1497–1501, 1998).
In Hefe verwendete Plasmide können leicht in E. coli überführt werden. Alternativ glaubt man, dass das System in verschiedenen anderen zur Rekombination befähigten Organismen, wie z. B. E. coli und Hühnerzellen anwendbar ist, die jeweils (genetisch) modifiziert sein können, so dass sie humane Chromosome oder Teile davon enthalten.
Herstellung von Oligonukleotiden
In-vitro-Methoden zur Herstellung von Oligonukleotiden sind dem durchschnittlichen Fachmann wohlbekannt; derartige konventionelle Methoden können zur Herstellung von IRO für die bekannt gegebenen Methoden verwendet werden. Die gebräuchlichste Methode zur In-vitro-Synthese von Oligonukleotiden ist die Phosphoramidit-Methode, die von Letsinger entworfen, und von Caruthers weiterentwickelt wurde (Caruthers et al., Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides, in Methods Enzymol. 154: 287–313, 1987). Dabei handelt es sich um eine nicht-wässrige Festphasen-Reaktion, die schrittweise durchgeführt wird, wobei ein einzelnes Nukleotid (oder modifiziertes Nukleotid) an ein wachsendes Oligonukleotid angefügt wird. Die einzelnen Nukleotide werden in Form von reaktiven 3'-Phosphoramidit-Derivaten angefügt. Siehe auch Gait (Hrsg.). Oligonucleotide synthesis. A practical approach. IRL Press, 1984.
Im Allgemeinen laufen die Synthesereaktionen wie folgt ab: Zuerst wird eine Dimethoxytrityl- oder äquivalente Schutzgruppe am 5'-Ende der wachsenden Nukleotidkette durch Säurebehandlung entfernt. (Die wachsende Kette ist an ihrem 3'-Ende an einen festen Träger, wie z. B. ein Silikonkügelchen, gebunden). Das neu freigewordene 5'-Ende der Oligonukleotidkette wird an das 3'-Phosphoramiditderivat des nächsten Nukleotids, das an die Kette angefügt werden soll, gekoppelt, unter Verwendung des Kopplungsreagenz Tetrazol. Die Kopplungsreaktion läuft normalerweise mit einer Effizienz von annähernd 99% ab; jegliche noch unreagiert vorhandene 5'-Enden werden durch Acetylierung blockiert, um ihren Anbau in nachfolgenden Kopplungen zu blockieren. Schließlich wird die durch den Kopplungsschritt erzeugte Phosphit-Triester-Gruppierung zum Phosphotriester oxidiert, was eine Kette ergibt, die um einen Nukleotidrest verlängert wurde. Dieser Prozess wird wiederholt, wobei ein Rest pro Zyklus angefügt wird. Siehe beispielsweise U.S.-Patente Nr. 4 415 732 , 4 458 066 , 4 500 707 , 4 973 679 und 5 132 418 . Oligonukleotid-Synthesizer, die diese oder ähnliche Methoden einsetzen, sind kommerziell erhältlich (z. B. der PolyPlex Oligonukleotid-Synthesizer von Gene Machines, San Carlos, Kalifornien). Zusätzlich führen viele Firmen derartige Synthesen aus (z. B. Sigma-Genosys, Texas, Operon Technologies, Kalifornien; Integrated DNA Technologies, Iowa; und TriLink BioTechnologies, California).
Modifizierte Oligonukleotide können im Wesentlichen wie oben für nicht modifizierte Oligonukleotide beschrieben in ein Oligonukleotid eingebaut werden.
Random-Primer können unter Verwendung von bekannten chemischen Syntheseverfahren generiert werden; die Zufälligkeit der Sequenz kann eingeführt werden, indem in einem oder mehreren der Additionsschritte im Reaktionsgemisch ein Gemisch aus Nukleinsäureresten bereit gestellt wird (um eine Gemisch aus Oligonukleotiden mit zufälliger Sequenz zu erzeugen). Siehe beispielsweise U.S.-Patente Nr. 5 043 272 und 5 106 727 . Ein Random-Primer-Präparat (das ein Gemisch verschiedener Oligonukleotide, jedes mit einer bestimmten Sequenz, darstellt) kann erzeugt werden, indem der Reihe nach Nukleinsäurereste aus einem Gemisch von beispielsweise jeweils 25% dATP, dCTP, dGTP und dTTP, (oder einem modifizierten dNTP, wie z. B. aa-dUTP), eingebaut werden. Es können andere Verhältnisse von dNTPs verwendet werden (z. B. mehr oder weniger von einem jeden dNTP, unter Anpassung der anderen Anteile, so dass die Gesamtmenge 100% beträgt). Ebenso kann bei der Synthese eines Random-Primers der Synthesizer so programmiert werden, dass er ein oder mehrere bekannte Reste (wie z. B. ein oder mehrere spezifische Nukleotidreste oder modifizierte Nukleotidreste) an einer definierten Stelle des Primers einbaut. Beispielsweise kann sich eine definierte Sequenz in der Mitte des Primers befinden (siehe 5B), der allein oder in Verbindung mit einem zweiten Primer (mit zufälligen Sequenzen zum 5'- und 3'-Ende hin) verwendet wird, oder eine Kombination aus diesen.
Derzeit sind Oligonukleotide mit bis zu ungefähr 125 Nukleotiden in geeigneter Weise kommerziell erhältlich; jenseits dieser Länge sinken Effizienz und Reinigung. Wenn die erhältliche Größe der für In-vitro-Synthese geeigneten Oligonukleotide zunimmt, wird die Anwendbarkeit der delitto perfetto-Mutagenese bezüglich der Größe des Fensters, das für die Mutations-Modifikation zur Verfügung steht, zunehmen.
Anwendungen von delitto perfetto-Mutagenesetechniken
Zusätzliche Anwendungen der delitto perfetto-Mutagenese umfassen gezielte Veränderungen im Genom verschiedener Organismen, einschließlich Hefe; die Modifizierung großer humaner Gene, die beispielsweise in Hefe als YACs kloniert sind und die nach der Mutagenese leicht in andere Spezies (z. B. E. coli oder humane Zellen) übertragen werden könnten; sowie größere Fenster für ortsspezifische Mutagenese, wenn die Syntheselänge für Oligonukleotide in zunehmendem Maße erreichbar wird.
V. Delitto perfetto-DSB-Mutagenese
Die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele stellen Methoden zur gezielten Modifizierung des Genoms von Saccharomyces cerevisiae zur Verfügung, beispielsweise durch homologe Rekombination und Oligonukleotide. Die Fähigkeit, spezifische Veränderungen direkt in das Genom einzubringen, sodass keine Spur des Targeting-Materials zurückbleibt, ist im Allgemeinen ein arbeitsaufwendiger Mehrschritt-Prozess mit Einschränkungen bezüglich der Art der Veränderungen. Des Weiteren können die ortsspezifische Mutagenese und die funktionelle Analyse von Veränderungen arbeitsintensiv und wenig effizient sein. Das oben beschriebene delitto perfetto-Verfahren gestattet die Generierung von Produkten, die nur die gewünschte Mutation, wie z. B. einen einzelnen oder multiplen Basenaustausch, eine Insertion, eine kleine oder große Deletion, tragen. Es besteht ein eindeutiger Bedarf für eine allgemeine Verwendung dieser Technik, die a) Unabhängigkeit von dem genetischen Hintergrund eines Stamms, b) die Möglichkeit umfangreiche genomische Umlagerungen zu erreichen, c) Modifikationen in essenziellen Genen, sogar in Genen, welche die homologe Rekombination beeinflussen und d) die Möglichkeit einer höheren Effizienz gestatten würde.
Das delitto perfetto-DSB-System ist ein weiteres Ausführungsbeispiel für das delitto perfetto-Verfahren, das für eine dramatische Zunahme der Effizienz sorgt, bei einer mehr als 1000-fachen Zunahme der Mutationseffizienz. Dies führt zu einer erheblich größeren Einsatzflexibilität und Hochdurchsatz-Generierung genetischer Veränderungen unter Verwendung dieses Ausführungsbeispiels. Dieses neuartige System entstammt der Kombination der folgenden Faktoren: der Generierung eines einzigartigen Doppelstrangbruchs (DSB) im Genom um das Targeting zu stimulieren, die Verwendung eines Endonukleaseenzyms, das einen Doppelstrangbruch an einer einzigartigen kurzen DNS-Schnittstelle generiert und die Möglichkeit, das Endonukleaseenzym unter Verwendung eines induzierbaren Promotors an- und abzuschalten.
Zusätzlich zu seiner Bedeutung als ein fundamentaler biologischer Prozess, bildet die DSB-vermittelte Rekombination die Grundlage für genetische Modifizierung in Hefe und anderen Eukaryoten (eine Übersicht gibt Paques und Haber, Microbiology and Molecular Biology Reviews 1999, 63: 349–404). Die Reparatur von DSB in S. cerevisiae scheint vorwiegend durch Rekombination zwischen den gebrochenen Enden eines DNS-Moleküls und intakten homologen Sequenzen stattzufinden. DSB stimulieren die homologe Rekombination in hohem Maße: DSB sind die einzigen Auslöser für Rekombination in meiotischen Zellen und sind ein wichtiger Faktor bei der Rekombination in mitotischen Zellen. DSB können als eine Folge von ionisierender Strahlung auftreten, durch mechanischen Stress, durch Replikation eines Chromosoms mit Einzelstrangbruch oder durch in vivo exprimierte Endonukleasen.
In mitotischen Zellen kann die Initiierung der Rekombination durch die Induktion einer ortsspezifischen Endonuklease erreicht werden. Zwei solcher Systeme wurden in Hefe entwickelt. Die HO-Endonuklease erkennt eine degenerierte Zielsequenz von 22 bp und schneidet normalerweise nur an einer Stelle im gesamten Hefe-Genom, dem Paarungstyp (MAT)-Locus. Konstrukte in denen das HO-Gen mit einem Galaktose-induzierbaren Promoter fusioniert ist, haben es möglich gemacht, HO einfach durch die Zugabe von Galaktose zu exprimieren.
Eine zweite Endonuklease ist I-SceI, normalerweise nur in Hefe-Mitochondrien codiert und exprimiert, um die Bewegung eines mobilen Introns zu erleichtern (Schnittstelle unten dargestellt). Eine synthetische Version dieses Gens, bei dem Codons, deren Verwendung in Mitochondrien und Zytoplasma unterschiedlich ist, ausgetauscht wurden, wurde konstruiert, wiederum unter der Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promoters (Plessis et al., Genetics 130: 451– 460, 1992). Eine 45–90-minütige Induktion von entweder HO oder I-SceI führt zur Spaltung eines signifikanten Anteils der Zielstellen. I-SceI-Schnittstelle:
Verwendung einer CORE-DSB-Kassette zur delitto perfetto-DSB-Mutagenese
Dieses Ausführungsbeispiel stellt gewisse Vorteile gegenüber dem delitto perfetto-Ausführungsbeispiel zur Verfügung, bei einer mehr als 1000-fachen Zunahme der Effizienz. Somit stellen die delitto perfetto-DSB-Ausführungsbeispiele größere Einsatzflexibilität zur Verfügung und gestatten einen höheren Durchsatz bei der Generierung genetischer Veränderungen. Dieses Ausführungsbeispiel basiert auf der Einführung eines einzigen DSBs innerhalb einer CORE-Kassette in der Zielregion zum Zeitpunkt der Transformation unter Verwendung eines streng regulierbaren In-vivo-Systems (siehe 7). Durch die Verwendung diese neuartigen Systems haben wir ermittelt, dass Oligonukleotidmodifikationen in bis zu 5% aller Zellen erzeugt werden können, ein extrem hocheffizienter Prozess. Da dieses System für die Generation von multiplen Mutationen in 200 bp- oder größeren Fenstern sorgt, ist es nützlich für die Modifizierung von Genen und Proteinen, die von Bedeutung für die Gesundheit sind, und für die Generierung von Diversität innerhalb von Proteinen.
Das delitto perfetto-DSB-System verbessert in hohem Maße die Möglichkeiten zur schnellen Modifizierung von Genen und DNS, zur Diversifizierung von Genen, Veränderung von Genen in diploiden Zellen, zur Verwendung von Targeting-Kassetten, die nicht auf Gegenselektion angewiesen sind (z. B. RE-DSB, wie unten beschrieben), In-vivo-Modifizierung von essentiellen Genen, Manipulation von großen chromosomalen Regionen und Genmodifizierung in rekombinationsdefizienten Zellen.
Die Nützlichkeit des Systems erstreckt sich auf alle Eigenschaften des delitto perfetto-Systems, einschließlich (folgender): es erfordert keine Subklonierung, es ist nicht angewiesen auf den Bedarf für einzigartige Restriktionsschnittstellen und es erfordert keine Resequenzierung von großen DNS-Regionen, nachdem eine Modifikation eingeführt wurde. Nur die den Oligonukleotiden entsprechende Region muss sequenziert werden. Das System könnte in anderen Organismen, in denen Rekombination kompetent ist, verwendet werden, beispielsweise in Huhn-DT40-Zellen, die zur Untersuchung von humanen Chromosomen verwendet werden, oder in Zellen wie z. B. humanen (Zellen), in denen DSBs Rekombination stimulieren können. Dies könnte einen vielfältigen gesundheitlichen Nutzen haben, insbesondere auf dem Gebiet der Gentherapie und des Proteindesigns.
Verkürzte CORE-DSB-Kassetten (ohne Gegenselektion). RE-DSB-Mutagenese
In einem anderen Ausführungsbeispiel kann aufgrund der hoch effizienten Mutagenese, die aus der Verwendung des DSB-Systems resultiert, der Gegenselektionsmarker in der Kassette ausgelassen werden.
Da das Mutageneseverfahren, das die CORE-DSB(-Kassette) nutzt, in hohem Maße, zwischen 2 und 5%, effizient ist, ist es möglich, die Klone, welche die gewünschte Veränderung im Genom enthalten, direkt auf einem nicht selektiven Medium (YPD-Platte) ohne die Verwendung des Gegenselektionsmarkers zu isolieren. In diesem Fall kann das delitto perfetto-Verfahren mit einer CORE-DSB-Kassette ausgeführt werden, welcher der Gegenselektionsmarker fehlt, bezeichnet als RE-DSB (beispielsweise GAL1/10::I-SceI + kanMX4 oder + HygroR).
Von außen zugegebenes DSB-Enzym
In einem weiteren Ausführungsbeispiel enthält die CORE-DSB-Kassette keine Sequenz, die ein Doppelstrangbruch erzeugendes Enzym codiert; anstelle dessen wird die Doppelstrangbruch-Funktion durch die Zugabe von exogenem Doppelstrangbruch erzeugendem Enzym zu den Zellen zur Verfügung gestellt, nachdem die CORE-DSB-Kassette (oder RE-DSB-Kassette) in die Zielsequenz integriert worden ist. Das Verfahren, bei dem zur Induktion von Rekombination ein externes Enzym zuzugeben wird, um an einer in vivo einzigartigen Schnittstelle zu schneiden, ist in verschiedenen Säuger-Systemen verwendet worden, einschließlich der Verwendung von I-SceI. Siehe beispielsweise Lin et al., (Mol. Cell. Biol. 19: 8353–60, 1999) und Johnson und Jasin (Biochem. Soc. Trans. 29: 196–201, 2001).
Generierung von Mutationen in diploiden Organismen
Das hier beschriebene delitto perfetto-DSB-Verfahren stellt verbesserte Möglichkeiten zur Verfügung, Mutagenese in diploider Hefe zu erreichen. Normalerweise werden Mutationen in diploiden Organismen oft maskiert, weil sie rezessiv und demnach nicht nachweisbar sind. Das delitto perfetto-DSB-System sorgt für die Erkennung einer Mutationsveränderung aufgrund des Verlusts der Kassette und ermöglicht demnach die Identifizierung und Isolierung von diploiden Klonen mit der gewünschten Veränderung. Obwohl auch der Verlust der Heterozygotie auftreten kann, ist die Häufigkeit der gezielten Veränderungen ausreichend hoch, so dass sie in einer relativ kleinen Zahl von Klonen identifiziert werden können, wie z. B. 1 in 50, 1 in 100 oder 1 in 200.
Generierung von Diversität innerhalb von Proteinen
Das delitto perfetto-System ermöglicht sehr effizientes, durch Oligonukleotide vermitteltes Targeting. Die Möglichkeit, eine außerordentlich große Zahl von gezielt veränderten Klonen zu erhalten kann verwendet werden, um beispielsweise multiple Varianten eines Proteinprodukts eines interessierende Gens zu erzeugen. Diese Diversität von Proteinprodukten kann erhalten werden, wenn das interessierende Gen in das Hefe-Genom (oder in ein anderes Genom in dem homologe Rekombination ebenfalls kompetent ist) integriert wird oder in ein Plasmid kloniert wird. Die Insertion der COR-DSB- oder RE-DSB-Kassette innerhalb des Gens am gewünschten Locus, gefolgt von der Induktion des DSB, gestattet die schnelle Erzeugung vieler Varianten, nach Transformation mit IROs, die für die Random-Mutagenese entworfen wurden. Dies stellt die Möglichkeit von mindestens einem bis hin zu vielen Veränderungen pro IRO-Targeting-Ereignis zur Verfügung, was somit Möglichkeiten zur Diversifizierung von Genen (oder Proteinprodukten) zur Verfügung stellt.
Von diesem Verfahren zur direkten Random-Mutagenese von Genen in vivo unter Verwendung von IROs wird erwartet, dass es sehr viel effizienter ist als In-vitro-Verfahren zur Random-Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden. Wenn das Gen in einen Multicopy-Vektor (wie z. B. den Hefe 2μ-Vektor) kloniert ist, kann die Zahl der erzeugten Varianten des Gens bis zu 1000-fach, beispielsweise 100-fach, 250-fach oder 500-fach höher (wie unten beschrieben) sein als bei Verwendung eines Single-Copy-Vektors oder eines genomischen Locus. Man glaubt beispielsweise, dass bis zu 10⁸ unterschiedliche Varianten durch ein einziges Transformationsereignis erhalten werden können. In einigen Ausführungsbeispielen wird das Random-Mutagenese-Verfahren durchgeführt, um eine bestimmte Variante des abgeleiteten Proteins zu isolieren, die einen selektierbaren Phänotyp verursacht.
Generierung von intrazellulären Plasmidvarianten durch Oligonukleotid-Gap-Repair eines in vivo linearisierten Multicopy-Vektors
Die CORE-DSB- oder RE-DSB-Kassette kann in vitro an eine gewünschte Stelle innerhalb eines gewünschten Gens auf einem Multicopy-Vektor (beispielsweise YEps (episomale Hefeplasmide), 2-micron (2μ)-Derivat-Vektoren für die Hefe Saccharomyces cerevisiae) kloniert werden. Der YEp-Vekor, der die CORE-DSB- oder die RE-DSB(-Kassette) enthält, wird durch Standardverfahren in Hefezellen transformiert. Im Innern der Hefezellen wird die Kopienzahl von jedem YEp-Plasmid spontan auf 50–100 oder mehr Kopien pro Zelle erhöht.
Unmittelbar vor der Transformation mit IRO werden die Zellen in der Gegenwart des Induktors (d. h. Galaktose) kultiviert, was die ortsspezifische Endonuklease-Exprimierung (d. h. I-SceI) induziert. Das Enzym greift auf jedem YEp-Vektor seine einzigartige Schnittstelle in der Kassette an und generiert einen DSB, womit es sämtliche Vektoren in jeder Zelle linearisiert. IRO werden für die Random-Mutagenese wie hier beschrieben gestaltet.
Zellen werden mit IRO transformiert und auf die Anwesenheit des Plasmids selektiert. Transformation von Zellen mit IROs führte zur Zirkularisierung der Vektoren, dem Verlust der Kassette und der Erzeugung der Random-Mutation (theoretisch wird in jedem Vektor eine unterschiedliche Mutation erzeugt). Da jede Zelle mehrere Vektoren enthält, sollte jede Zelle viele verschiedene Varianten desselben Gens enthalten.
Dieses Verfahren könnte nützlich sein, um die Zahl der Genvarianten, die durch Random-Mutagenese erhalten werden, um zusätzlich 10- bis 100-fach oder mehr zu erhöhen.
Gesteigerte Effizienz von PCR-Targeting und Modifizierung von essenziellen Genen
Das delitto perfetto-DSB-Mutagenese-Verfahren unter Verwendung der CORE-DSB oder der RE-DSB-(Kassette) nutzt IROs zur Einführung von Genom-Modifikationen. Dasselbe Verfahren kann jedoch ebenfalls angewandt werden unter Verwendung eines PCR-Produkts (anstelle von IRO), das zuvor durch Random-Mutagenese oder ortsspezifische Mutagenese in vitro oder in vivo modifiziert wurde. Die Effizienz des direkten PCR-Targeting in das Genom in vivo ist nach DSB-Induktion ebenfalls ungefähr 1000-fach erhöht.
Dies kann direkt für alle nicht essenziellen Gene angewandt werden und sogar für essenzielle Gene, wenn die Kassette unmittelbar nach dem Stopcodon des Gens inseriert wird.
Beispielsweise kann eine CORE-DSB- oder RE-DSB-Kassette unmittelbar nach dem Stopcodon eines gewählten essenziellen Gens inseriert werden, ohne das Gen zu unterbrechen. Nach der Induktion des DSB, kann ein modifiziertes PCR- Produkt des gewählten Gens die Kassette und die Wildtyp-Kopie des Gens ersetzen, wobei am selben Locus eine modifizierte Version des Gens zurückgelassen wird. IRO können ebenfalls verwendet werden, aber in diesem Fall kann nur der 3'-Teil des Gens (der Teil nahe der Kassette) modifiziert werden.
Cotransformation von Oligonukleotiden und einem Vektor
Die extrem hoch effiziente Transformation, die mit delitto perfetto-DSB und Oligonukleotiden erzeugt wird, eröffnet die Möglichkeit Cotransformationsexperimente effizient durchzuführen: (durch) Transformation von IROs und einem Plasmid in einem Schritt. Dies gestattet die Koinzidenz-Modifikation eines Gens zusammen mit der spezifischen Expression eines anderen Gens. Beispielsweise könnte ein Gen auf einem Plasmid letal sein und ein anderes Gen könnte sich derart auf die Letalität auswirken, dass die Deletion des einflussnehmenden Gens das Überleben ermöglicht. Demnach könnte man einen Satz von Mutationen in der Nähe einer CORE-DSB-Stelle in dem einflussnehmenden Gen derart erzeugen, dass die Mutanten das Überleben mit dem letalen Gen ermöglichen. Es könnte ebenfalls möglich sein, das Gen für das DSB erzeugende Enzym auf einem Plasmid einzubinden, so dass die Schnitte mm Zeitpunkt der IRO- und Plasmid-Transformation erzeugt werden.
DSB-basierte Mutagenese in Niedrig-Rekombination-Stämmen und -Zellen
Wie hier erörtert, war im delitto perfetto-System die Integration von IROs (ob den Zellen einzeln oder als Paar dargeboten), welche die Original-CORE-Kassette ersetzen, auf das RAD52-Gen angewiesen und schien zum Teil auf Rad50 und MRE11 angewiesen zu sein. Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden, dass, sobald eine CORE-DSB- (oder RE-DSB)-Kassette in das Genom eingebracht wird, das DSB-verbesserte Verfahren sogar in Abwesenheit eines in hohem Maße effizienten Rekombinationssystems verwendet werden kann.
Zum Beispiel könnte man ein Rekombinationsgen zum Ziel nehmen, d. h., das Rekombinationsgen inaktivieren und Mutationen darin erzeugen. Da die Induktion eines DSB in der integrierten Kassette unter Verwendung von IRO extrem effizientes Targeting zur Folge hat, ist die Veränderung der Targeting-Effizienz nachweisbar, sogar in Abwesenheit eines in hohem Maße effizienten Rekombinationssystems, beispielsweise in einer genetischen Situation mit einem RAD52-null Gen (siehe z. B. Beispiel 8).
Umlagerungen auf Genomebene
Die Verwendung der delitto perfetto-Mutagenese (mit oder ohne DSB) gestattet die Generierung von weitreichenden genomischen Umlagerungen. Zum Beispiel umfassten derartige Umlagerungen umfangreiche Deletionen, wie z. B. jene, die hier unter Verwendung einer delitto perfetto-CORE-Kassette für bis zu 16 kb aufgezeigt werden. Da die Verwendung der CORE-DSB- oder der RE-DSB-(Kassette) für eine ungefähr 1000-fach höhere Targeting-Effizienz sorgt, können umfangreiche Deletionen wie diese, und umfangreicher, mit einer sehr hohen Effizienz erreicht werden. Wesentlich umfangreichere Deletionen (z. B. bis zu 100 kb) werden in Erwägung gezogen und es wird erwartet, dass sie unter Verwendung von CORE-DSB- oder RE-DSB-basierter Mutagenese effizient erzeugt werden können. Dies könnte beispielsweise Anwendungen bei der Modifizierung von YAC-Klonen finden.
Andere Arten von erwogenen Umlagerungen umfassen die Chromosomen-Zirkularisierung. Zuvor wurde dies durch Transformation mit linearisierten Plasmiden mit zu den Enden eines Chromosoms homologen Regionen erreicht, ein in hohem Maß uneffizientes Verfahren (Bennet et al., Mol. Cell. Biology, 12: 5359–5373, 2001). Eine Kassette kann in der Nähe einer Telomer-Region eines gewählten Chromosoms integriert werden. Dann können IROs (einzeln oder als Paar) entworfen werden, die am 5'-Ende eine zur Downstream-Region des linken Telomers homologe Sequenz enthalten und am 3'-Ende eine zur Upstream-Region des rechten Telomers homologe Sequenz. Die Zugabe der IRO zur Zelle wird die Eliminierung der Kassette und der beiden Telomere verursachen, somit wird das Chromosom zirkularisiert werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1: Ortsspezifische delitto perfetto-Mutagenese
Das delitto perfetto-Verfahren gestattet genomische Modifikationen ohne die Erhaltung von heterologer Sequenz (1). Da die Integration der CORE-Kassette einfache, direkte integrative Transformationsprozeduren (Wach et al., Yeast 10: 1793–1808, 1994) nutzt und der Mutations-Austausch die Transformation mit leicht zu entwerfenden Oligonukleotiden umfasst, sorgt dieses System für die schnelle Erzeugung einer Vielfalt von genetischen Veränderungen, wie unten erörtert. Im Unterschied zu anderen Systemen ist diese ortsspezifische In-vivo-Mutagenesestrategie vielseitig in Bezug auf chromosomale Veränderung, da viele Arten von Modifikation in der nahegelegenen Region generiert werden können, sobald eine CORE-Kassette inseriert ist.
Dieses Beispiel liefert eine Beschreibung von mehreren Sequenzmodifikationen, die unter Verwendung des delitto perfetto-In-vivo-Mutagenesesystems erzeugt wurden.
Experimentelle Protokolle
Sofern nicht anders angegeben wurden genetische Manipulationen gemäß Standardmethoden ausgeführt (Sambrook et al., (Hrsg.). Molecular Cloning: A laboratory manual. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Hefestämme und Wachstumsbedingungen. Verwendete Hefestämme waren:
BY4742 (MATα, his3Δ1, leu2 Δ 0, lys2 Δ 0, ura3 Δ 0 Brachmann et al., Yeast 14: 115–132, 1998), VL6α (MATα, met14, lys2-801, his3-Δ 200, trp1-Δ 63, ura3-52, ade2-101; Lewis et al., Mol. Cell. Biol. 18: 1891–1902, 1998) und E133 (S1-Al2: MATα, ade5-1, lys2-12A, trp1-289, his7-2, leu2-3, 112, ura3-52; Tran et al., Mol. Cell. Biol. 17: 2859–2865, 1997).
Zellen wurden in Standardmedien – reichem (YPD), Glyzerin-(YPG) und synthetischem Minimalmedium – ohne Uracil (SD Ura^–), Leucin (SD Leu^–) oder Tryptophan (SD Trp^–) kultiviert (Sherman et al., (Hrsg.) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986). Geneticin (G418)-resistente Zellen wurden auf YPD-Platten, die 200 μg/ml G418 (Gibco BRL, Grand Island, New York) enthielten, kultiviert (Wach et al., Yeast 10: 1793–1808, 1994). Ura^–-Zellen wurden auf synthetischem Komplettmedium selektiert, das 5-Fluororotsäure (5-FOA) (Toronto Research Chemicals Inc., North York, Ontario, Kanada) in einer Konzentration von 1 mg/ml enthielt (Boeke et al., Mol. Gen. Genet. 197: 345–346, 1984).
Plasmide. Das Plasmid pCORE wurde durch Klonierung eines 1,5 kb BamHI-HindI-Fragments, welches das kanMX4-Gen (Wach et al., Yeast 10: 1793–1808, 1994) enthielt, in die BamHI-SspI-Schnittstellen von pFA6aKIURA3 (Delneri et al., Yeast 15: 1681–1689, 1999) konstruiert.
Plasmid pBL230 (Ayyagari et al., Mol. Cell. Biol. 15: 4420–4429, 1995) beherbergt genomische DNS, die das POL30-Gen enthält (von 195 bp oberhalb des ATG bis 170 bp unterhalb von seinem Stopcodon).
Die Deletion von RAD52 wurde unter Verwendung von Plasmid pΔ52Leu (Lewis et al., Mol. Cell. Biol. 18: 1891–1902, 1998), geschnitten mit APAI und NotI, erzeugt.
pLKL67Y wurde durch Klonierung eines 1,2 kb URA3-Fragments aus pRS315 + URA3 in die XhoI-SacI-Schnittstellen der Multiplen Restriktionsschnittstelle des Centromer-Vektors pRS313 (Sikorski und Hieter, Genetics 122: 19–27, 1989) erzeugt
Hefetransformation. Transformation von Hefe mit zirkulären Plasmiden, linearen Doppelstrang-DNS-Molekülen, oder Oligonukleotiden wurde gemäß eines hoch effizienten Lithiumacetat-Protokolls durchgeführt wie zuvor beschrieben (Gietz. „High efficiency transformation with lithium acetate." in Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach. (Hrsg. Johnson) IRL Press, Oxford, UK, 121–134, 1994).
PCR Amplifikation und Sequenzanalyse. Die kanMX4- und KIURA3-CORE-Kassette wurde als ein 3,2 kb DNS-Fragment aus pCORE amplifiziert unter Verwendung von Taq-DNS-Polymerase (Roche, Indianapolis, Indiana) mit 32 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 56°C und 3 Minuten, 20 Sekunden bei 72°C. Zur Integration der CORE-Kassette in chromosomale Loci wurden chimäre 70-mere entworfen, die aus 50 Nukleotiden bestanden, die homolog zu der geeigneten flankierenden Region des genomischen Ziellocus waren und 20 Nukleotiden, hier dargestellt, welche die Amplifikation der CORE-Kassette gestatten: 5'-...GAGCTCGTTTTCGACACTGG-3' für die kanMK4-Stelle (SEQ ID Nr. 1) und 5'-...TCCTTACCATTAAGTTGATC-3' für die KIURA3-Stelle (SEQ ID Nr. 2).
Amplifikation unter Verwendung dieser 70-mere lieferte PCR-Produkte mit jeweils 50 Nukleotiden oberhalb und unterhalb von der chromosomalen Sequenz, welche die CORE-Kassette selbst flankieren.
Um Klone mit korrekter Integration der CORE-Kassette zu identifizieren wurde Kolonie-PCR (Huxley et al., Trends Genet. 6: 236, 1990) durchgeführt unter Verwendung von Primern, die zum Annealing oberhalb und unterhalb des Integrationslocus und innerhalb der CORE-Kassette entworfen wurden.
PCR-Fragmente (ungefähr 0,5 kb) für die neuen Mutanten-Konstrukte wurden, zusammen mit den entsprechenden Wildtyploci, durch Phenol-Chloroform-Extraktion aufgereinigt, unter Verwendung des QIAquick PCR-Purification-Kits (Qiagen USA, Valencia, Kalifornien) gereinigt und zur DNA-Sequenzierung verwendet. Sequenzierungsreaktionen wurden für beide Stränge unter Verwendung des dRhodamine-Terminator-Cycle-Sequencing-Kits (ABI Prism, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien) durchgeführt und in einer automatischen Sequenzierungsmaschine (ABI377; Applied Biosystems) ausgeführt.
Die anfängliche Insertion der CORE-Kassette in die Gene MLP2, POL30, TRP5 und SIR2 (innerhalb von Codon 270 und zwischen Codon 354 und 355) wurde unter Verwendung der folgenden Primer durchgeführt: MLP2.U/MLP2.G, beziehungsweise PCNA.U/PCNA.G, TRP5.U/TRP5.G, SIR2.U1/SIR2.G1 oder SIR2.U2/SIR2.G2.K2 und URA3.2 sind interne Primer in der CORE-Kassette, innerhalb von kanmX4 beziehungsweise KIURA3.
CORE-Insertion wurde an jedem Locus unter Verwendung der folgenden Primerkombinationen überprüft: MLP2.1/MLP2.2/K2 und MLP2.3/MLP2.4/URA3.2; PCNA.3/PCNA.4, PCNA.3/URA3.2 und PCNA.4/K2; TRP5.1/TRP5.2, TRP5.1/K2 und TRP5.2/URA3.2; SIR2.1/SIR2.4/K2 und SIR2.1/SIR2.4/URA3.2 für die CORE-Insertion in Codon 270 von SIR2; SIR2.2/SIR2.3/K2 und SIR2.2/SIR2.3/URA3.2 für die CORE-Insertion zwischen Codon 354 und 355 von SIR2.
Das Ausschneiden der CORE-Kassette sowie die Sequenzanalyse wurden unter Verwendung der folgenden Primer durchgeführt: MLP2.1/MLP2.4; PCNA3./PCNA.4; TRP5.1/TRP5.2; SIR2.1/SIR2.4 für das Ausschneiden der CORE-Kassette aus Codon 270 von SIR2 und SIR2.3/SIR2.2 für das Ausschneiden der CORE-Kassette zwischen Codon 345 und 364 von SIR2.
Zur Überprüfung der Deletion von RAD52 verwendete Primer: RAD52.1/LEU2.2 und RAD52.4/LEU2.1.
Integratives rekombinantes Oligonukleotid (IRO)-Mutagenese. In dieser Studie verwendete IROs unterscheiden sich in Größe und Orientierung in Bezug auf den CORE-Kassetten-Integrationspunkt.
Oligonukleotide wurden in Transformationsexperimenten als einzelne Spezies oder in Zwei-Spezies-Kombinationen verwendet wie in 3 dargestellt. Zur Verlängerung der Sequenz der 3'-überlappenden IROs (a + b) in vitro enthielt ein 50 μl-Reaktionsmix 0,5 nmol von jedem Primer, 4 Einheiten Platinum Pfx (Gibco BRL), 5 μl 10x Puffer, 1 μl 50 mM MgSO4 und 2 μl 10 mM dNTPs (Roche). Die Verlängerung wurde wie folgt durchgeführt: 1 Minute bei 94°C und 30 Sekunden bis 3 Minuten bei 68°C. Proben wurden mit Ethanol präzipitiert und in 10–20 μl Wasser resuspendiert. Die Verwendung der Taq-Polymerase (Roche) anstelle der Platinum Pfx-Polymerase für diese Verlängerungsreaktionen reduzierte teilweise die Effizienz der Oligonukleotidintegration.
Vor der Zugabe von IRO-DNA zu den Zellen wurden die einzelnen Oligonukleotidspezies oder die Kombinationen zweier Oligonukleotidspezies, mit Ausnahme des Paares, das in vitro mit Pfx-DNA-Polymerase (a + b Pfx) verlängert wurde, bei 100°C für 2 Minuten denaturiert und anschließend auf Eis gestellt um eventuelle Sekundärstrukturen zu reduzieren oder zu eliminieren.
In diesem Beispiel verwendete IROs sind mit Ziffern bezeichnet, welche die DNA-Sequenzen angeben, über die sich das jeweilige Oligonukleotid erstreckt, beginnend mit dem ersten 5'-Nukleotid und abschließend mit der letzten 3'-Base in Bezug auf den in 2 dargestellten CORE-Kassetten-Integrationspunkt.
Zur Deletion von MLP2 verwendete IROs waren MLP2.a (5' –70...–1, +1...+10) und MLP2.b (5' +70...+1, –1...–10).
Zur Generierung der POL30-Deletion verwendete IROs waren PCNA.a (5' –848...–778, +1...+10) und PCNA.b (5' +70...+1, –778...–788).
Zur Generierung der stillen Mutation in Codon 334 von TRP5 verwendete IROs waren TRP5.a (5' –70...–1, +1...+10), TRP5.b (5' +70...+1, –1...–10), TRP5.c (5' +10...+1, –1...–70), TRP5.d (5' –10...–1, +1...+70), TRP5.e (5' –47...–1, +1...+48), TRP5.f (5' +48...+1, –1...–47), TRP5.e1 (5' –40...–1, +1...+41), TRP5.f1 (5' +41...+1, –1...–40), TRP5.e2 (5' –25...–1, +1...+26), TRP5.f2 (5' +26...+1, –1...–25), TRP5.i (5' –127...–47) und TRP5.j (5' +128...+48).
Zur Generierung der G270A-Mutation in SIR2 verwendete IROs waren 270.a (5' –70...–1, +1...+10), 270.b (5' +70...+1, –1...–10), 270.e (5' –48...–1, +1...+47), 270.f (5' +47...+1, –1...–48); Zur Generierung der N345A-Mutation in SIR2 verwendete IROs waren 345.a (5' –85...–1, +1...+10) und 345.b (5' +70...+1, –1...–10).
Zur Generierung der H364Y-Mutation in SIR2 verwendete IROs waren 364.a (5' –70...–1, +1...+10) und 364.b (5' +85...+1, –1...–10).
Zur Generierung der K40A-Mutation in RAD50 verwendete IROs waren RAD50.a (5' –70...–1, +1...+10) und RAD50.b (5' +70...+1, –1...–10).
Zur Generierung der D16A-Mutation in MRE11 verwendete IROs waren MRE.a (5' –69...–1, +1...+11) und MRE.b (5' +71...+1, –1...–9).
Zellen aus jeder Transformation wurden auf einer einzigen YPD-Platte ausgestrichen, bei 30°C inkubiert und am darauffolgenden Tag auf 5-FOA replikaplattiert. Nach drei Tagen wurden Kolonien auf YPD, G418, Trp^–-(für TRP5-Experimente) und YPG (zur Selektion gegen petite-Mutanten)-Platten replikaplattiert.
Ergebnisse
Deletion genomischer Sequenzen
Die delitto perfetto-Strategie wurde benutzt, um das gesamte MLP2-Gen vom Startcodon bis zum Stopcodon zu deletieren (2A), so dass nach Komplettierung des Deletionsprozesses keine heterologe DNS mehr zurück blieb. Die CORE-Kassette wurde mit fachüblichen Techniken über homologe Rekombination in drei allgemein verwendete Hefe-Stammhintergründe eingeführt (BY4742, VL6α und E133), so dass sie dort das MLP2-ORF ersetzte. So wurden Zellen erhalten, die Ura+(5-FOA-sensitiv) und G418-resistent waren.
Zwei 80 Nukleotide (nt) lange IRO (benannt MLP2.a und MLP2.b) wurden mit einer 20 Basen langen Überlappung an ihren 3'-Enden gestaltet. Hybridisierung und In-Vitro-Extension von MLP2.a und MLP2.b ergaben dann ein 140-bp-Doppelstrangmolekül mit 70 bp, die homolog zu den Sequenzen oberhalb und unterhalb der CORE-Kassette liegen. Die Zellen wurden mit diesen Doppelstrangmolekülen transformiert.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, betrug die Frequenz von 5-FOA-resistenten (5-FOA^R) und G418-sensitiven Zellen etwa 100 Transformanten/0,5 nmol zugegebener IRO-DNS (35–45 μg) auf 10⁷ lebende Zellen. Alle G418^S-Klone, die mit Kolonie-PCR getestet wurden, hatten die Kassette verloren und waren ΔMLP2. Da etwa die Hälfte der 5-FOA^R-Klone G418-resistent waren, (vermutlich durch Mutationen der KIURA3-codierenden Sequenz), wurde die G418-Sensitivität als Nachweis für den Verlust der CORE-Kassette verwendet. Drei 5-FOA^R-G418^S BY4742-Isolate wurden sequenziert und jedes enthielt die korrekte Deletion (ΔMLP2). Eines der Isolate hatte eine Punktmutation in der 140-bp-IRO-Region erworben. Tabelle 1. Präzision der gezielten Veränderungen mit delitto perfetto.

^aIn-Vitro-Extension der IRO wird durch Pfx angezeigt. Wenn Pfx nicht erwähnt wird, wurden die IROs direkt zu den Zellen gegeben.
^bZahl der 5-FOA^R-Klone pro 10⁷ lebende Zellen, transformiert mit 0,5 nmol jedes IROs.
^cTransformationsfrequenz: Zahl der G418^S-Klone pro 10⁷ lebende Zellen, pro 0,5 nmol jedes IROs.
^dZahl der Klone mit korrekter Exzision der CORE-Kassette/Zahl der mit Kolonie-PCR überprüften Zufallsstichproben.
^eZahl der Klone mit der gezielten Veränderung/Zahl der sequenzierten oder mit BamHI verdauten Proben.
^fZahl der gezielt veränderten Klone ohne zusätzliche Mutationen/Zahl der sequenzierten Proben.
^gMittelwert aus drei Experimenten. ND: nicht bestimmt.

Deletion essentieller Gene
Als nächstes wurde der delitto perfetto-Ansatz zur Deletion essentieller Gene angewandt, indem die CORE-Kassette unterhalb des Gens eingesetzt wurde. Die CORE-Kassette wurde hinter dem Stop-Codon des POL30-Gens (PCNA) (2B) im Stamm E133 eingesetzt, und eine Wildtypkopie des Gens wurde auf einem Plasmid (pBL230) in die Zelle eingeführt. Dann wurden die Zellen mit den überlappenden IRO PCNA.a und PCNA.b transformiert, die homologe Bereiche oberhalb des Start-Codons des POL30-Gens und unterhalb der CORE-Kassette enthielten.
Von zwölf 5-FOA^R–G418^S Kolonien aus drei Experimenten enthielten neun eine exakte Deletion des chromosomalen POL30-Gens (Tabelle 1). Die gegenüber der oben beschriebenen Ausführungsform mit der MLP2-Deletion verringerte Frequenz der Ersetzung der CORE-Kassette durch IRO ist wahrscheinlich der Kompetition mit der auf dem Plasmid lokalisierten POL30-Kopie bei der Rekombination geschuldet. Der Verlust der CORE-Kassette geschah normalerweise in Zusammenhang mit einer Ersetzung und nicht durch Rekombination mit dem Plasmid.
Die Klone mit Deletion, die so erzeugt wurden, konnten das POL30-Plasmid auch nach über 30 Generationen in nichtselektivem Medium nicht verlieren, wohingegen das Plasmid in Kontrollzellen mit dem chromosomalen Wildtyp-POL30-Gen leicht verloren ging. Ortsspezifische Mutagenese
Die delitto perfetto-Strategie wurde auch zur schnellen Erzeugung von ortsspezifischen Mutationen im Genom verwendet (1). Eine Ausführungsform dieser Methode wurde durch die Einführung einer stummen Mutation in das TRP5-Gen demonstriert, die zu einer neuen BamHI-Schnittstelle führt (2C).
Die CORE-Kassette wurde in das TRP5-Gen von Stamm BY4742 zwischen nt 1002 und 1003 eingesetzt, was zu Trp^–-Zellen führte (BY4742-TRP5-CORE). Diese Zellen wurden mit den zwei 80-nt-IROs TRP5.a und TRP5.b transformiert, die die BamHI-Mutation neben der Insertionsstelle der CORE-Kassette enthielten, und anschließend wurden 5-FOA^R-G418^S Kolonien isoliert (Tabelle 1). Von 50 getesteten Klonen hatten alle die CORE-Kassette verloren und die gezielte Mutation erworben. Von 20 sequenzierten G418^S-Klonen hatten 19 keine zusätzlichen Mutationen.
Folglich können Ausführungen der delitto perfetto-Mutagenesetechnik für die effiziente Herstellung ortsspezifischer Veränderungen benutzt werden unter Verwendung von beispielsweise IRO mit einer 20-bp-Überlappung.
Mehrere Durchgänge der ortsspezifischen Mutagenese
Nach Integration der CORE-Kassette in eine Sequenz können mehrere ortsspezifische Veränderungen hergestellt werden, einfach durch Entwerfen neuer Oligonukleotide und Wiederholen der IRO-Transformationsprozedur. Um dies zu demonstrieren wurde die delitto perfetto-Strategie angewendet für ortsspezifische Veränderungen in den Bereichen um zwei Integrationsstellen der CORE-Kassette (Codon 270 und zwischen den Codons 354 und 355) im SIR2-Gen (2D und 2E). Mutationen befanden sich entweder in den überlappenden Bereichen (IROs 270.a + b) oder nur in je einem Mitglied des jeweiligen Oligonukleotidpaars (345.a + b und 364.a + b).
Nach Hybridisierung und DNS-Synthese (mit Pfx Polymerase) wurden die Stämme mit den IRO-Paaren 270.a + b, 345a. + b bzw. 364.a + b transformiert. Wie erwartet hatten gemäß Kolonie-PCR alle 5-FOA^R-G418^S Klone die CORE-Kassette verloren (Tabelle 1). Die ortsspezifische gezielte Mutagenese war hocheffizient. Bei Anwendung der IROs mit einer Mutation nahe der CORE-Kassette hatten alle Klone die korrekte Veränderung erworben (20/20), wie in Tabelle 1 gezeigt. Bei den IRO mit einer Mutation außerhalb der ursprünglichen Überlappungsregion der Oligonuldeotide hatten über 80% der Klone die korrekte ortsspezifische Veränderung erworben (21/25). Ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung eines einzelnen IRO
Ortsspezifische Mutagenese kann durch direkte Zugabe einzelner Oligonukleotide statt von Oligonukleotidpaaren zu Zellen erreicht werden. Einzelne IRO wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, bei direkter Zugabe zu Zellen ortsspezifische Mutationen zu erzeugen. Der Stamm BY4742-TRP5-CORE wurde mit verschiedenen IRO transformiert (3), die zu der stummen BamHI-Mutation in TRP5 (2C) führen wurden. Die IRO mit Längen von 95 nt (e oder 1) und 81 nt (e1 oder f1), die zu beiden Seiten der Insertionsstelle der CORE-Kassette homologe Regionen enthalten, zeigten bei separater Zugabe eine vergleichbare Effektivität bei der Erzeugung ortspezifischer Mutationen (4A). Die Mindestlänge der homologen Regionen betrug für eine effektive Mutagenese zwischen 25 und 40 nt (vergleiche die 51-mere e2 und f2 mit e1 und f1).
Ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung verschiedener IRO-Paare
Auch Kombinationen verschiedener IRO wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, dieselbe ortsspezifische Mutation herzustellen. Die einzelnen IRO wurden ohne In-Vitro-Hybridisierung oder -Extension direkt zu kompetenten Zellen gegeben. Wie in 4B gezeigt, war die Modifikation durch nicht hybridisierte Paare von IRO mit den Längen 81 oder 95 nt hocheffizient, wenn sie vollständig komplementär zueinander waren; die Häufigkeiten waren sogar noch höher als die für in vitro hybridisierte und verlängerte Oligonukleotide. Wie auch bei den einzelnen IRO betrug die Mindestlänge der homologen Regionen für eine effektive Mutagenese zwischen 25 und 40 nt (e2 + f2 vs. e1 + f1).
Überraschenderweise war auch die Kombination von TRP5.a + b, die nur eine 20-bp-Überlappung am 3'-Ende besitzen, in der Lage, die ortsspezifische Veränderung zu erzielen, mit einer Häufigkeit von etwa einem Sechstel von der mit diesem Oligonukleotidpaar erzielten Häufigkeit, wenn es in vitro hybridisiert und verlängert wurde (TRP5.a + b Pfx). Ein entsprechendes Paar mit entgegengesetzter Polarität, das dadurch die Überlappung an den 5'-Enden hatte (c + d in 3), führte nicht zu Transformanten.
Die nicht überlappenden IRO-Paare TRP5.e + j oder TRP5.f + i zeigten keine Erhöhung der Transformationsrate gegenüber entweder TRP5.e oder TRP5.f allein. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten mit Modifikationen des Codons 270 von SIR2 (siehe 2D) im Stamm BY4742 mit entsprechenden einzelnen und paarweisen IRO (270.a, b, c, d, e, f, f1, e2, f2, j und i).
Das ortsspezifische Targeting durch komplementäre IRO war hocheffizient; nach Positiv-/Negativselektion hatten fast alle der Isolate die CORE-Kassette verloren und die gewünschte Mutation erworben. Die Bestätigung der erfolgreichen Mutagenese wird stark vereinfacht dadurch, dass nur der von den Oligonukleotiden abgedeckte Bereich in einer kleinen Zahl von Proben sequenziert werden muss; Mutationen außerhalb dieses Bereichs wurden nie nachgewiesen. Zum Beispiel wurden bei den Klonen, die auf die Änderungen in TRP5 (A334A-BamHI) und in SIR2 (G270A) sequenziert wurden, bei Verwendung von in vitro verlängerten oder direkt eingesetzten komplementären Oligonukleotiden 5–35% assoziierte Punktmutationen im IRO-Bereich gefunden (Tabelle 1).
Auch wenn es möglich war, ein einzelnes IRO zur Mutagenese zu verwenden, war die Effizienz mit Paaren von überlappenden IROs viel größer. Außerdem stieg die Targeting-Effizienz mit zunehmender Länge der einzelnen und komplementären IRO (4A und 4B). Dies weicht ab von einem früheren Bericht, in dem einzelsträngige Oligonukleotide eingesetzt wurden (Moerschell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 524–528, 1988), aber kein Verfahren mit Gegenselektion, das die Eliminierung eines großen Bereiches (der CORE-Kassette) erfordert. Möglicherweise ist die Abhängigkeit der delitto perfetto-Mutagenese von Rekombinationsvorgängen (siehe unten) für diesen Unterschied verantwortlich.
In bestimmten Ausführungsformen war die Effizienz des delitto perfetto-Systems am höchsten, wenn vollständig komplementäre Oligonukleotide mit einer Länge von ≥ 81 nt benutzt wurden (3 und 4B). Die zwei IRO-Paare, die die höchsten Integrationseffizienzen lieferten, waren die komplementären 95-mere e + f und die verlängerten Oligomere a + b (a + b Pfx), die ein 140 bp langes Doppelstrangmolekül ergeben konnten. IRO, wie e + f, scheinen für das Einführen von spezifischen Punktmutationen an einer beliebigen Stelle innerhalb eines 15-nt-Bereiches am geeignetsten zu sein und können auch zur Herstellung kleiner oder großer Deletionen verwendet werden, wie in den 1 und 5A gezeigt. IRO-Paare, die nicht überlappten, waren nicht effektiver als die jeweiligen einzelnen IRO. DNS-Moleküle mit Überlappungen am 3'-Ende waren mäßig effizient, auch ohne in-vitro-Hybridisierung und -Extension, IRO mit überlappenden 5'-Enden waren dagegen nicht wirksam. Dies deutet daraufhin, dass Einzelstränge mit nur 20 überlappenden Nukleotiden während des Transformationsvorgangs hybridisieren können und zu effizienter ortsspezifischer Mutagenese (ihren können durch einen Prozess, der wahrscheinlich DNS-Synthese beinhaltet. Es ist allerdings auch möglich, dass die hybridisierte Struktur direkt mit chromosomaler DNS interagiert. Es scheint außerdem nur wenig DNS-Abbau in der Zelle zu geben, da geschützte Oligonuldeotide, die an ihren 3'- und 5'-Enden mit Phosphorothioat versehen wurden, die Transformationseffizienz mit IRO-Paaren nicht erhöhten (TRP5a. + b, TRP5.c + d oder TRP5.e + f).
Nach Einsetzen der CORE-Kassette an einer bestimmten Stelle kann die DNS, wie mit den SIR2-N345A- und H364Y-Mutationen gezeigt, mit verschiedenen IRO-Paaren in Entfernungen von mindestens 30 bp oberhalb oder unterhalb der CORE-Kassette modifiziert werden, ohne dass die Kassette verschoben werden muss. Aufgrund der beschriebenen Ergebnisse wird davon ausgegangen, dass spezifische Mutationen bis zu 100 nt von der CORE-Kassette entfernt hergestellt werden können durch Benutzung von 100 nt langen IRO mit einer Überlappung von 20 nt, wie in 5C gezeigt. Dies ist ein signifikanter Vorteil gegenüber anderen Ansätzen zur Untersuchung spezifischer Bereiche, da bei allen anderen Mutageneseverfahren sämtliche Schritte der Herstellung einer ortsspezifischen Mutation von Beginn an wiederholt werden müssen, selbst für weitere Modifikationen des gleichen Aminosäurerests.
Zusätzliche Mutationen der mutierten Klone wurden nie außerhalb der von den IROs abgedeckten Bereiche gefunden. Das Spektrum von zusätzlichen Mutationen innerhalb der von den IRO ersetzten Sequenz bestand zu 70% aus Deletionen und sah wie folgt aus: 46,7% 1-bp-Deletionen, 26,7% 1-bp-Substitutionen, 16,7% 2-bp-Deletionen, 6,6% 1-bp-Deletionen mit 1-bp-Substitutionen und 3,3% Duplikationen eines Teils einer IRO-Sequenz.
Beispiel 2: Targeting durch IRO bei delitto perfetto beinhaltet homologe Rekombination
Da das Gen RAD52 für fast alle Arten der homologen Rekombination wichtig ist, wurde seine Rolle bei der delitto perfetto-Mutagenese untersucht. Wildtyp- und Mutantenstämme (RAD52::LEU2; zwei unabhängige Isolate) wurden entweder mit dem ein Centromer enthaltenden Kontrollplasmid pLKL67Y (das die Gene HIS3 und URA3 enthält) oder den folgenden TRP5-IROs transformiert: (1) a + b Pfx, (2) a + b, (3) c + d, (4) e + f, (5) e und (6) f.
Bei wiederholten Transformationen mit pLKL67Y war die Transformationseffizienz bei den Wildtypzellen etwa 4-mal höher als bei der rad52-Mutante (4,3 × 10⁵/μg vs. ca. 1 × 10⁵/μg), offensichtlich durch die verringerte Plattierungseffizienz der rad52-Mutante. Im rad52-Stamm wurden mit verschiedenen IRO in drei separaten Experimenten keine 5-FOA^R-G418^S-Klone gefunden, selbst wenn die zehnfache Menge an e + f benutzt wurde (4A und 4B). Auch für Modifikationen am Codon 270 von SIR2 (siehe 2D) mit den IROs 270.a + b Pfx, 270.a + b und 270.c + d wurde eine völlige RAD52-Abhängigkeit beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf bin, dass der Oligonukleotidaustausch während der delitto perfetto-Mutagenese durch einen Rekombinationsmechanismus vermittelt wird.
Die Bedeutung der Gene RAD50 und MRE11, die sowohl bei der Rekombination als auch bei der End-zu-End-Verknüpfung von Doppelstrangbrüchen eine Rolle spielen, für die ortsspezifische Mutagenese durch IROs wurde ebenfalls untersucht. Die CORE-Kassette wurde im Stamm VL6α in jedes der beiden Gene eingesetzt, an den in den 2F und G gezeigten Stellen. IRO, die eine AA-CG-Substitution in Codon 40 von RAD50 und eine A-C-Transversion in Codon 16 von MRE11 verursachen, wurden hergestellt. Auch wenn die Effizienz der Entfernung der CORE-Kassette mit den jeweiligen a + b-Pfx-IROs niedrig war, so wurden doch mehrere G418^S-Kolonien erhalten, bei denen die CORE-Kassette korrekt entfernt worden war (Tabelle 1). Sequenzanalyse von RAD50 und MRE11 von drei G418^S-Isolaten zeigte, dass die gewünschten Veränderungen in allen Klonen stattgefunden hatten, und nur ein Isolat (von RAD50) zeigte eine zusätzliche Punktmutation. Der Vorgang der Oligonukleotidintegration ist also bei der benutzten Technik zum Nachweis von Mutationen abhängig von RAD52 (s. im Gegensatz dazu delitto perfetto-DSB weiter unten), die Abhängigkeit von den Genen RAD50 und MRE11 scheint dagegen schwächer zu sein.
Die Integration der IRO, ob separat oder als Paare den Zellen angeboten, war in diesem Beispiel völlig abhängig vom Gen RAD52 und schien teilweise abhängig zu sein von RAD50 und MRE11. Der vergleichsweise moderate Effekt der letzteren Gene passt zu dem geringeren Effekt, den sie auf die Rekombination haben (Lewis and Resnick, Mutat. Res. 451: 71–89, 2000). Obwohl sie bei der DNS-End-zu-End-Verknüpfung eine Rolle spielen sollen, spricht das Fehlen eines Effekts auf die IRO-vermittelte Integration in sir2-Mutanten, die einen Defekt bei der End-zu-End-Verknüpfung haben (Lewis and Resnick, Mutat. Res. 451: 71–89, 2000), dafür, dass ihre Rolle bei delitto perfetto auf die Rekombination beschränkt ist.
Die minimale Länge der homologen Bereiche an den Enden von transformierenden Molekülen in Hefe für eine effiziente Rekombination beträgt etwa 30 bp (Manivasakam et al., Nucleic Acids Res. 23: 2799–2800, 1995). In ähnlicher Weise deuten auch die Ergebnisse mit der delitto perfetto-Mutagenese darauf hin, dass die Mindestlänge der homologen Regionen von IRO zwischen 25 und 40 nt liegen muss.
Im Gegensatz zu den hier beschriebenen Methoden wird das Mutagenesesystem mit chimären RNS-DNS-Oligonukleotiden in höheren Eukaryoten nicht durch homologe Rekombination vermittelt (Cole-Strauss et al., Nucleic Acids Res. 27: 1323–1330, 1999; Yoon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2071–2076, 1996), und auch nicht der Oligonukleotid-Ansatz in Hefe, der von Moerschell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 524–528, 1988, beschrieben wurde (siehe auch Erdeniz et al., Genome Res. 7, 1174–1183, 1997; Yamamoto et al., Yeast 8: 935–948, 1992). Das delitto perfetto-System unterscheidet sich von den zuvor beschriebenen Systemen mindestens dadurch, dass kurze getrennte Nukleinsäurebereiche (durch die CORE-Kassette getrennt) nah zusammen gebracht werden, um sich mit den Oligonukleotidsequenzen zu paaren. Es wird davon ausgegangen, dass dies der Grund dafür ist, dass die Proteine der RAD52-Epistasegruppe erforderlich sind.
Beispiel 3: Ein diagnostisches Werkzeug für die Untersuchung tumorassoziierter p53-Mutationen
Eine Expressionskassette mit der für das humane p53 codierenden Sequenz unter Kontrolle des GAL1-Promotors wird in einen geeigneten chromosomalen Locus (z. B. das LYS2-Gen auf Chromosom III) eines haploiden Hefestamms integriert. Wie in 6 beschrieben, wurden die CORE-Kassetten durch Transformation an sieben verschiedene Stellen der p53-Codesequenz eingesetzt, in Abständen von 95 Nukleotiden über die DNS-bindende Domäne verteilt, von Nukleotid 315 bis Nukleotid 885. So wurde eine Reihe von sieben isogenen Hefestämmen mit je einer CORE-Kassette an den dargestellten Positionen hergestellt. Oligonukleotide mit den gewünschten p53-Mutationen wurden so entworfen, dass sie jeweils die nächstgelegene CORE-Kassette im entsprechenden Stamm ersetzen und so zur jeweiligen ortsspezifischen Mutation führen sollten. Die Veränderungen werden durch In-vitro-Amplifikation (z. B. PCR) und Sequenzanalyse des Bereiches der codierenden p53-Sequenz, der die eingeführte Mutation enthielt, bestätigt.
Die Folgen der entsprechenden Mutationen des humanen p53 können untersucht werden, indem jedes mutierte p53-Molekül exprimiert wird und seine Fähigkeit untersucht wird, Transkription an verschiedenen p53-kontrollierten Elementen, die p53-kontrollierte Genen entsprechen, zu induzieren. Systeme zur Untersuchung der In-vivo-Annität/Spezifität von p53 werden z. B. in Inga et al. (Oncogene 20: 501–513, 2001) und in Inga and Resnick (Oncogene 20: 3409–3419, 2001) beschrieben.
Dies ist eine Demonstration, bei der die CORE-Kassette an Positionen eingesetzt wird, die der Stelle zwischen Aminosäure 26 und Aminosäure 27 in p53 entsprechen. Eine Auswahl von Oligonukleotiden wurde eingesetzt, um verschiedene Mutationen an dieser Stelle oder in der Nähe herzustellen. Unter Benutzung dieser CORE-Kassette und dieser Oligonukleotide wurden Mutationen in Ser 15, 20, 33, 37, 47 und Thr 18 hergestellt, bei denen die Aminosäuren zu Alanin oder Aspartat geändert wurden.
Beispiel 4: Alternative CORE-Kassetten
Im E. coli-Basisvektor pFA6a wurden vier alternative CORE-Kassetten konstruiert, um die Anwendbarkeit des delitto perfetto-Ansatzes auf jeden Hefestamm (auch auf URA⁺- und G418^R-Stämme), einschließlich Wildtypstämme, auszuweiten. Zwei verschiedene heterologe Marker wurden ausgewählt, ein Reporter, der Hygromycin-Resistenz verleiht, und ein neuer Marker zur Gegenselektion, eine Abwandlung des p53-Proteins (V122A). Wenn das abgewandelte p53 unter Kontrolle eines induzierbaren GAL1/10-Promotors stark exprimiert wird, wird das Wachstum der Hefe verhindert. Durch Kombination dieser Marker mit den vorherigen Markern (KIURA3 und kanMX4) wurden vier neue Kassetten hergestellt: CORE-UK (KIURA3 und kanMX4), CORE-UH (KIURA3 und HygroR), CORE-Kp53 (kanMX4 und GAL-p53) und CORE-Hp53 (HygroR und GAL p53). Ähnliche CORE-Kassetten können mit anderen Genen zur positiven und negativen Selektion benutzt werden.
Experimentelle Protokolle
Hefestämme und Wachstumsbedingungen. Es wurden die Hefestämme BY4742 und VL6α benutzt. Die Zellen wurden in fachüblichen Medien mit Glucose (YPD), Glycerin (YPG) und synthetischem Minimalmedium ohne Uracil (SD Ura^–) oder ohne Tryptophan (SD Trp^–) kultiviert. Geneticin-(G418)-resistente Zellen wurden auf YPD-Platten mit 200 μg/ml G418 kultiviert. Hygromycin-resistente Zellen wurden auf YPD-Platten mit 200 μg/ml Hygromycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) kultiviert. Ura^–-Zellen wurden auf synthetischem Komplettmedium mit 5-Fluoroorotsäure (5-FOA) selektiert. Zellen mit verlorener CORE-Kassette, die das p53-Gen enthielt, wurden auf synthetischen Komplettmedien selektiert, die 2% Galaktose statt Glucose enthielten (GAL) (Sherman et al. (eds.) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986).
Plasmide. Die Plasmide mit den neuen CORE-Kassetten wurden wie folgt benannt: pCORE-UK, pCORE-UH, pCORE-Kp53, pCORE-Hp53. Das Plasmid pCORE-UK wurde konstruiert durch Klonieren eines 1,5 kb langen SacI-SmaI-Fragments, das das kanMX4-Gen enthielt (Wach et al., Yeast 10, 1793–1808, 1994), in die SacI-HpaI-Schnittstellen von pFA6aKIURA3 (Delneri et al., Yeast 15: 1681–1689, 1999). Das Plasmid pCORE-UH wurde konstruiert durch Klonieren eines 1,7 kb langen SacI-SmaI-Fragments, das das Hygromycin-Resistenz-(HygroR)-Gen aus dem Vektor pAG32 enthielt (Goldstein and McCusker, Yeast 14, 1541–1553, 1999), in die SacI-HpaI-Schnittstellen von pFA6aKIURA3. pCORE-Kp53 wurde konstruiert durch Klonieren eines 2,1 kb langen EcoRI-SpeI-Fragments, das das p53-V122-Gen unter Kontrolle des GAL1/10-Promotors enthielt (Inga and Resnick, Oncogene 20, 3409–3419, 2001), in die EcoRI-SpeI-Schnittstellen von pFA6akanMX4 (Wach et al., Yeast 10, 1793–1808, 1994). pCORE-Hp53 wurde konstruiert durch Klonieren eines 1,7 kb langen SacI-SmaI-Fragments, das das HygroR-Gen aus dem Vektor pAG32 enthielt, in die SacI-BglII-Schnittstellen von pCORE-Kp53, wodurch das kanMX4-Gen ersetzt wurde.
PCR Amplifikation und Sequenzanalyse. Die CORE-UK-, -UK-, Kp53- und -Hp53-Kassetten wurden von ihren jeweiligen Vektoren als 3,2, 3,5, 3,7 bzw. 4,0 kb. lange DNS-Fragmente unter Verwendung von Taq-DNS-Polymerase (Roche, Indianapolis, IN) amplifiziert, mit 32 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 56°C und 4 Minuten bei 72°C.
Zur Integration der CORE-Kassetten in chromosomale Loci wurden chimäre 70-mere entworfen, die aus 50 Nukleotiden bestanden, die homolog zur den genomischen Ziellocus flankierenden Region waren, und aus 20 Nukleotiden, die hier gezeigt sind und die die Amplifikation aller vier CORE-Kassetten ermöglichen (diese Oligos können nicht zur Amplifikation der ursprünglichen CORE-Kassette verwendet werden):
5'-...TTCGTACGCTGCAGGTCGAC-3' für die KIURA3-Seite in pCORE-UK und
pCORE-UH und für die kanMX4-Seite bzw. die HygroR-Seite in pCORE-Kp53
und pCORE-Hp53 (das gesamte Oligonukleotid wird in SEQ ID NO: 61 gezeigt)
und 5'-...CCGCGCGTTGGCCGATTCAT-3' für die kanMX4-Seite und die HygroR-Seite in pCORE-UK bzw. pCORE-UH, und für die GAL1/10-p53-Seite in pCORE-Kp53 und pCORE-Hp53 (das gesamte Oligonukleotid wird in SEQ ID NO: 62 gezeigt).
Amplifikation mit diesen 70-meren ergab PCR-Produkte mit je 50 Nukleotiden der chromosomalen Sequenzen, die die CORE-Kassetten oberhalb und unterhalb flankierten. Die erste Insertion der CORE-Kassetten in das TRP5-Gen wurde mit den folgenden Primern durchgeführt: TRP5.I/TRP5.II (SEQ ID NOs: 61 und 2). K1 (SEQ ID NO: 74), H1 (SEQ ID NO: 76), URA3.1 (SEQ ID NO: 75) und p7 (SEQ ID NO: 77) sind interne Primer in den CORE-Kassetten, innerhalb von kanMX4, HygroR, KIURA3 bzw. GAL1/10-p53.
Die Insertion der CORE-UK-Kassette am TRP5-Locus wurde mit den folgenden Primer-Kombinationen überprüft: TRP5.1/URA3.1 (SEQ ID NOs: 21 und 75) und TRP5.2/K1 (SEQ ID NOs: 22 und 74). Die Insertion von CORE-UH am TRP5-Locus wurde mit TRP5.1/URA3.1 und TRP5.2/H1 überprüft, die CORE-Kp53-Insertion mit TRP5.1/K1 (SEQ ID NOs: 21 und 74) und TRP5.2/p7 (SEQ ID NOs: 22 and 74); und die CORE-Hp53-Insertion mit TRP5.1/H.1 (SEQ ID NOs: 21 und 76) und TRP5.2/p7 (SEO ID NOs: 22 und 77). Die Überprüfung auf Exzision der CORE-Kassetten und die Sequenzanalyse wurde mit den Primern TRP5.1/TRP5.2 (SEQ ID NOs: 21 und 22) durchgeführt.
Mutagenese mit integrativen rekombinanten Oligonukleotiden (IRO).
Folgende IROs wurden zur Herstellung der stummen Mutation im Codon 334 von TRP5 verwendet: TRP5.e (5' –47...–1, +1...+48; SEQ ID NO: 35), TRP5.f (5' +48...+1, –1...–47; SEQ ID NO: 36).
Zellen aus jeder Transformation wurden auf je eine YPD-Platte ausplattiert, bei 30°C inkubiert und am folgenden Tag auf 5-FOA- oder GAL-Platten Replika-plattiert. Zellen auf GAL-Platten wurden täglich auf frische GAL-Platten Replika-plattiert, um das Hintergrundwachstum zu verringern. Nach drei Tagen wurden die Kolonien von 5-FOA oder GAL auf YPD, G418, Trp^– und YPG-Platten (um gegen petite-Mutanten zu selektieren) Replika-plattiert.
Ergebnisse: Alternative CORE-Kassetten und die Verwendung von p53 als Gegenselektionsmarker

Es wurden vier zusätzliche CORE-Kassetten konstruiert: CORE-UK (KIURA3 und kanMX4), CORE-UH (KIURA3 und HygroR), CORE-Kp53 (kanMX4 und GAL-p53) und CORE-Hp53 (HygroR und GAL p53). Alle Kassetten wurden mit der delitto perfetto-Strategie getestet für die schnelle Herstellung von ortsspezifischen und stummen Mutationen im TRPS-Gen, wo die Mutationen, wie oben beschrieben, eine neue BamHI-Schnittstelle erzeugen. Die CORE-Kassetten wurden in das TRP5-Gen der Stämme BY4742 und VL6α zwischen nt 1002 und nt 1003 eingesetzt, was zu Trp^–-Zellen führte (BY4742-TRP5-CORE und VL6α-TRP5-CORE). Die resultierenden Zellen wurden mit den zwei 95 nt langen Oligonukleotiden TRP5.e und TRP5.f, die die BamHI-Mutation enthielten, transformiert, und anschließend wurden 5-FOA-resistente, G418^S oder Hygro^S Kolonien isoliert (Tabelle 2). Tabelle 2. Wirksamkeit der verschiedenen CORE-Kassetten bei der delitto perfetto-Mutagenese

Stamm^a	Locus	Gezielte Verändrung	Benutzte IRO-Spezien^b	5-FOA^R/ 10⁷ Zellen^c	G418^S/10⁷ Zellen^d
BY4742-UK	TRP5	A334A (BamHI)	TRP5.e + f	315	177
BY4742-UH	TRP5	A334A (BamHI)	TRP5.e + f	259	120
BY4742-Kp53	TRP5	A334A (BamHI)	TRP5.e + f	366	52
BY4742-Hp53	TRP5	A334A (BamHI)	TRP5.e + f	369	53
VL6α-UK	TRP5	A334A (BamHI)	TRP5.e + f	115	33
VL6α-UH	TRP5	A334A (BamHI)	TRP5.e + f	88	30
VL6α-Kp53	TRP5	A334A (BamHI)	TRP5.e + f	59	8
VL6α-Hp53	TRP5	A334A (BamHI)	TRP5.e + f	93	23

^aStämme BY4742 und VL6α mit Integration der verschiedenen CORE-Kassetten CORE-UK, CORE-UH, CORE-Kp53 und CORE-Hp53 in den TRP5-Locus.
^bDie IRO wurden direkt zu den Zellen gegeben.
^cZahl der 5-FOA^R-Klone pro 10⁷ lebende Zellen, transformiert mit 0,5 nmol jedes IRO.
^dTransformationsfrequenz: Zahl der G418^S- oder Hygro^S-Klone pro 10⁷ lebende Zellen, pro 0,5 nmol jedes IRO.

Vier unabhängige G418^S oder Hygro^S Klone von jedem Stamm, die auf das Vorhandensein der BamHI-Schnittstelle getestet wurden, zeigten, dass die Oligos an der richtigen Stelle eingesetzt wurden. Folglich kann das p53-Allel V122A als allgemeiner Marker zur Gegenselektion verwendet werden.
Obwohl hier mit dem CORE-Kassetten-Format gezeigt, könnten die in diesem Beispiel hergestellten Kassetten ebenfalls mit den CORE-DSB- und RE-DSB-Kassetten-Formaten benutzt werden, einfach indem andere Elemente in der Kassette verändert werden. Diese alternativen Ausführungsformen werden hier spezifisch betrachtet und sind dadurch Bestandteil dieser Offenlegung.
Beispiel 5: delitto perfetto-DSB-Mutagenese
Dieses Beispiel zeigt eine typische Beschreibung der delitto perfetto-DSB-Mutagenese, bei der ein induzierbares Doppelstrangbruch-Enzym und eine entsprechende Doppelstrangbruch-Schnittstelle in eine Kassette eingeführt werden, die einen Reporter-Marker (RE-DSB) oder einen Gegenselektions- und einen Reporter-Marker (CORE-DSB) enthält. Induktion und daraus resultierende Exprimierung des Doppelstrangbruch-Enzyms vor der Einführung des IRO stimuliert Doppelstrangbrüche an der entsprechenden Stelle, was zu einer sehr hohen Häufigkeit von IRO-vermittelten Veränderungen führt.
Experimentelle Protokolle
Hefestämme und Wachstumsbedingungen. Es wurden die Hefestämme BY4742 und E133a (S1-Al2: MATα, ade5-1, lys2-12A, trp1-289, his7-2, leu2-3, 112, ura3-52; unveröffentlicht), ein E133-Derivat, benutzt. Die Zellen wurden in fachüblichen Medien mit Glucose (YPD), Glycerin (YPG) und synthetischem Minimalmedium ohne Uracil (SD Ura^–) oder ohne Tryptophan (SD Trp^–) kultiviert. Geneticin-(G418)-resistente Zellen wurden auf YPD-Platten mit 200 μg/ml G418 kultiviert. Hygromycin-resistente Zellen wurden auf YPD-Platten mit 200 μg/ml Hygromycin kultiviert. Ura^–-Zellen wurden auf synthetischem Komplettmedium mit 5-Fluor-Orotsäure (5-FOA) selektiert. Vor der Transformation mit Oligonukleotiden wurden die Zellen in flüssigen synthetischen Komplettmedien kultiviert, die 0,02, 0,2 oder 2% Galaktose statt Glucose enthielten (GAL).
Plasmide. Die Plasmide mit der CORE-DSB-Kassette wurden wie folgt benannt: pCORE-GALSceKU und pCORE-GALSceHU. Die Plasmide pCORE-GALSceKU und pCORE-GALSceHU wurden durch Klonieren eines 1,4 kb langen BglII-Fragments konstruiert, das das I-SceI-Gen unter Kontrolle des GAL1/10-Promotors enthielt, in die BglII-Schnittstelle von pCORE-UK und pCORE-UH. Das 1,4 kb langen BglII-Fragment, das das I-SceI-Gen unter Kontrolle des GAL1/10-Promotors enthielt, wurde durch PCR-Amplifikation aus dem Vektor pWY203 (Galli and Schiestl, Genetics 149, 1235–1250, 1998) mit den folgenden Primern erhalten: Sce.F1 und Sce.R, der die BglII-Schnittstelle enthält.
PCR Amplifikation und Sequenzanalyse. Die RE-DSB-Kassetten aus den Vektoren pCORE-GALSceKU und pCORE-GALSceHU wurden als 2,7 bzw. 3.0 kb lange DNS-Fragmente von ihren entsprechenden Vektoren unter Verwendung von Taq-DNS-Polymerase (Roche, Indianapolis, IN) amplifiziert, mit 32 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 56°C und 3 Minuten bei 72°C.
Zur Integration der kurzen CORE-Kassetten in chromosomale Loci wurden ein chimäres 70-mer und ein chimäres 88-mer, das auch die I-SceI-Schnittstelle enthielt, entworfen, die aus 50 Nukleotiden bestanden, die homolog zur geeigneten den genomischen Ziellocus flankierenden Region waren, sowie aus 20 bzw. 38 Nukleotiden, die hier gezeigt sind und die die Amplifikation aller vier CORE-DSB-Kassetten ermöglichen:
5'-...CATCTGGGCAGATGATGTCG-3' für die kanMX4-Seite oder die HygroR-Seite (das gesamte Oligonukleotid ist gezeigt in SEQ ID NO: 70) und
5'-...TAGGGATAACAGGGTAATTTGGATGGACGCAAAGAAGT-3' für die GAL1/10::I-Scel-Seite (die I-Scel-Schnittstelle ist fett dargestellt) (das gesamte Oligonukleotid ist gezeigt in SEQ ID NO: 65).
Die CORE-DSB-Kassetten aus den Vektoren pCORE-GALSceKU und pCORE-GALSceHU wurden als 4,6 bzw. 4,9 kb lange DNS-Fragmente von ihren entsprechenden Vektoren unter Verwendung von Taq-DNS-Polymerase (Roche, Indianapolis, IN) amplifiziert, mit 32 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 56°C und 4 Minuten und 30 Sekunden bei 72°C.
Zur Integration der CORE-Kassetten in chromosomale Loci wurden ein chimäres 70-mer und ein chimäres 88-mer, das auch die I-SceI-Schnittstelle enthielt, entworfen, die aus 50 Nukleotiden bestanden, die homolog zur geeigneten den genomischen Ziellocus flankierenden Region waren, und aus 20 und 38 Nukleotiden, die hier gezeigt sind und die die Amplifikation aller vier CORE-DSB-Kassetten ermöglichen:
5'-...TTCGTACGCTGCAGGTCGAC-3' für die KIURA3-Seite (das gesamte Oligonukleotid ist gezeigt in SEQ ID NO: 61) und
5'-...TAGGGATAACAGGGTAATTTGGATGGACGCAAAGAAGT-3' fÜr die GAL1/10::I-Scel-Seite (die I-Scel-Schnittstelle ist fett dargestellt) (das gesamte Oligonukleotid ist gezeigt in SEQ ID NO: 65).
Die erste Insertion der RE-DSB-Kassette (I-Scei-Schnittstelle + GAL1-I-SceI + kanMX4 oder I-SceI-Schnittstelle+GAL1-I-SceI + HygroR) in das TRP5-Gen wurde mit den folgenden Primern durchgeführt:
TRP5.IK/TRP5.SceII. Die I-SceI-Schnittstelle kann an beiden Seiten der Kassette platziert werden und in verschiedenen Orientierungen: TSce.IK/TRP5.II oder
TecS.IK/TRPS.II, oder es können zwei invertierte I-SceI-Schnittstellen zusammen an einer Seite der Kassette platziert werden: TRP5.IK/TscecS.II, oder es können zwei I-SceI-Schnittstellen an beiden Seiten der Kassette in direkter (TSce.IK/TRP5.SceII) oder entgegengesetzter Orientierung (TecS.IK/TRP5.SceII) platziert werden, bei beiden Kassetten.
Amplifikation mit diesen Primer ergab PCR-Produkte mit je 50 Nukleotiden der chromosomalen Sequenzen, die die CORE-DSB-Kassetten oberhalb und unterhalb flankierten. K.2, H.2 und Sce.2 sind interne Primer in den RE-DSB-Kassetten, innerhalb von kanMX4, HygroR bzw. GAL1/10I-SceI.
Die Insertion der RE-DSB-Kassette am TRP5-Locus wurde mit den folgenden Primer-Kombinationen überprüft: TRP5.1/K2 oder TRP5.1/H2 und TRP5.2/Sce.2.
Die Exzision der CORE-Kassette wurde mit den folgenden Primern durchgeführt: TRP5.1/TRP5.2.
Mutagenese mit integrativen rekombinanten Oligonukleotiden (IRO).
Folgende IROs wurden verwendet: TRP5.e (5' –47...–1, +1...+48), TRP5.f (5' +48...+1, –1...–47), TRP5.e1 (5' –40...–1, +1...+41), TRP5.f1 (5' +41...+1, –1...–40), TRP5.e2 (5' –25...–1, +1...+26), TRP5.f2 (5' +26...+1, –1...–25), TRP5.e3 (5' –20...–1, +1...+21), TRP5.f3 (5' +21...+1, –1...–20), TRP5.e4 (5' –15...–1, +1...+16), TRP5.f4 (5' +16...+1, –1...–15).
Vor der Transformation wurden die Zellen für 20 Minuten bis 5 Stunden in flüssigem GAL kultiviert, um die Expression der I-SceI-Endonuklease zu induzieren. Das Enzym bindet an seine Schnittstelle in der Kassette und generiert einen DSB. Zellen aus jeder Transformation wurden direkt auf Trp^–-Platten oder auf YPD-Platten ausplattiert und bei 30°C inkubiert.
Die erste Insertion der CORE-DSB-Kassette (I-SceI-Schnittstelle + GAL1-I-SceI + kanMX4 + KIURA3 oder I-SceI-Schnittstelle + GAL1-I-SceI + HygroR + KIURA3) in das TRP5-Gen wurde mit den folgenden Primer durchgeführt: TRP5.I/TRP5.SceII. Die I-SceI-Schnittstelle kann an beiden Seiten der CORE-Kassette platziert werden und in verschiedenen Orientierungen: TSce.IU/TRP5.II oder TecS.IU/TRP5.II, oder es können zwei invertierte I-SceI-Schnittstellen zusammen an einer Seite der CORE-Kassette platziert werden: TRP5.I/TscecS.II, oder es können zwei I-SceI-Schnittstellen an beiden Seiten der Kassette in direkter (TSce.IU/TRP5.SceII) oder entgegengesetzter Orientierung (TecS.IU/TRP5.SceII) platziert werden, bei beiden Kassetten.
Amplifikation mit diesen Primer ergab PCR-Produkte mit je 50 Nukleotiden der chromosomalen Sequenzen, die die CORE-DSB-Kassetten oberhalb und unterhalb flankierten. URA3.1 und Sce.2 sind interne Primer in den CORE-DSB-Kassetten, innerhalb von KIURA3 bzw. GAL1/10I-SceI.
Die Insertion der CORE-DSB-Kassette am TRP5-Locus wurde mit den folgenden Primer-Kombinationen überprüft: TRP5.1/URA3.1 und TRP5.2/Sce.2.
Die Exzision der CORE-Kassetten wurde mit den folgenden Primer durchgeführt: TRP5.1/TRP5.2.
Mutagenese mit integrativen rekombinanten Oligonukleotiden (IRO).
Folgende IRO wurden verwendet: TRP5.e (5' –47...–1, +1...+48), TRP5.f (5' +48...+1, –1...–47), TRP5.e1 (5' –40...–1, +1...+41), TRP5.f1 (5' +41...+1, –1...–40), TRP5.e2 (5' –25...–1, +1...+26), TRP5.f2 (5' +26...+1, –1...–25). Zusätzliche IRO zur Herstellung der stummen Mutation im Codon 334 von TRP5 waren TRP5.e3 (5' –20...–1, +1...+21), TRP5.f3 (5' +21...+1, –1...–20), TRP5.e4 (5' –15...–1, +1...+16), TRP5.f4 (5' +16...+1, –1...–15).
Vor der Transformation wurden die Zellen für 20 Minuten bis 5 Stunden in flüssigem GAL kultiviert, um die Expression der I-SceI-Endonuklease zu induzieren. Das Enzym bindet an seine Schnittstelle in der Kassette und generiert einen DSB. Zellen aus jeder Transformation wurden direkt auf Trp^–-Platten oder auf YPD-Platten ausplattiert, bei 30°C inkubiert und am folgenden Tag auf 5-FOA-Platten Replikaplattiert. Nach drei Tagen wurden die Kolonien von 5-FOA oder GAL auf YPD, G418, Trp^– und YPG-Platten (um gegen petite-Mutanten zu selektieren) Replikaplattiert.
Ergebnisse: delitto perfetto-DSB-System
Die delitto perfetto-DSB-Strategie wurde für ein Hochdurchsatzverfahren zur Erzeugung von ortsspezifischen Mutationen im Genom im TRP5-Locus verwendet, durch die Einführung einer stummen Mutation in das TRP5-Gen, die zu einer neuen BamHI-Schnittstelle führt.

Die RE-DSB- und CORE-DSB-Kassetten wurde in das TRP5-Gen von Stamm BY4742 zwischen nt 1002 und 1003 eingesetzt, was zu Trp^–-Zellen führte (BY4742-TRP5-CORE). Zellen, die RE-DSB enthielten, wurden mit und ohne DSB-Induktion (5 Stunden in GAL 2%) transformiert mit den zwei 96-nt-IROs TRP5.e und TRP5.f oder den 51-meren TRP5.e2 und TRP5.f2 oder den 41-meren TRP5.e3 und TRP5.f3 oder den 31-meren TRP5.e4 und TRP5.f4, die die BamHI-Mutation neben der Insertionsstelle der CORE-Kassette enthielten, und anschließend wurden Trp⁺-Kolonien isoliert (Tabelle 3). Tabelle 3. IRO Mutagenesefrequenz nach DSB Induktion

DSB-Induktion^a	Benutzte IRO-Spezien^b	Trp⁺-Klone^c	Trp⁺-Klone Verd. 10²x	Trp⁺-Klone Verd. 10⁴x	lebende Klone Verd. 10⁵x^f
Keine Induktion	-	0
Keine Induktion	TRP5.e + f	417.25^g	3.75		282.25
Keine Induktion	TRP5.e2 + f2	40			52
Keine Induktion	TRP5.e3 + f3	0			53
Keine Induktion	TRP5.e4 + f4	0			33
Induktion	-	0
Induktion	TRP5.e + f	–10⁶	–10⁴	185.75	480
Induktion	TRP5.e2 + f2	–5000	429.3	3.67	406
Induktion	TRP5.e3 + f3	25.67			332
Induktion	TRP5.e4 + f4	0.3			322

^a„Keine Induktion": Zellen wurden in Glucosemedien kultiviert; „Induktion": Zellen wurden für 5 Stunden in Anwesenheit von 2% Galaktose kultiviert.
^bDie IRO wurden direkt zu den Zellen gegeben.
^cZahl der auf einer Trp^–-Platte gewachsenen Trp⁺-Klone, nach Transformation mit 0,5 nmol jedes IRO.
^dZahl der auf einer Trp^–-Platte nach einer 10²-Verdünnung gewachsenen Trp⁺-Klone, nach Transformation mit 0,5 nmol jedes IRO.
^eZahl der auf einer Trp^–-Platte nach einer 10⁴-Verdünnung gewachsenen Trp⁺-Klone, nach Transformation mit 0,5 nmol jedes IRO. Gesamtzahl der auf einer YPD-Platte nach einer 10⁵-Verdünnung gewachsenen lebenden Trp⁺-Klone, nach Transformation mit 0,5 nmol jedes IRO.
^gMittelwert aus drei bis vier unabhängigen Experimenten.

Direktes Replika-Plattieren der auf YPD gewachsenen Kolonien (rechte Spalte in Tabelle 3) auf Trp^–-Medien zeigte 2 bis 5% Trp⁺-Klone. Dies ist die Targeting-Effizienz mit IRO nach DSB-Induktion.
Beispiel 6: Deletion genomischer Sequenzen
Die delitto perfetto-Strategie (z. B. Beispiel 1) wurde verwendet, um bis zu 16 kb genomischer DNS zu deletieren, so dass nach Komplettierung des Deletionsprozesses keine heterologe DNS mehr zurück blieb. Die ursprüngliche CORE-Kassette wurde mit fachüblichen Techniken über homologe Rekombination wie oben beschrieben in den TRP5-Locus des Stamms BY4742 eingeführt. So wurden Zellen erhalten, die Ura+ (5-FOA-sensitiv) und G418-resistent waren.
Eine Reihe von vier 60-meren (benannt 1Stu.a, 1Stu.b, 2Stu.a und 2Stu.b (SEQ ID NOs:55-58)) mit einer 20 Basen langen Überlappung an ihren 3'-Enden, die eine StuI-Schnittstelle enthielt, wurde entworfen. Hybridisierung und In-Vitro-Extension von 1 Stu.a und 1Stu.b, 1Stu.a und 2Stu.b, 2Stu.a und 1Stu.b, 2Stu.a und 2Stu.b ergab dann ein 100-bp-Doppelstrangmolekül mit je 50 bp, die homolog zu den Sequenzen oberhalb und unterhalb der CORE-Kassette liegen. Zellen wurden mit diesen Doppelstrangmolekülen transformiert und Transformanten mit 5-FOA-Resistenz und G418-Sensitivität wurden wie zuvor beschrieben isoliert. 1 Stu.a und 1Stu.b wurden für eine 16-kb-Deletion, 1Stu.a und 2Stu.b für eine 10,3-kb-Deletion, 2Stu.a und 1Stu.b für eine 8-kb-Deletion, und 2Stu.a und 2Stu.b für eine 3,2-kb-Deletion am TRP5-Locus auf Chromosom VII entworfen.
Die Zahl (aus drei unabhängigen Transformationsexperimenten) der 5-FOA-resistenten (5-FOA^R) und G418-sensitiven (G418^S) Klone für die unterschiedlich großen unter Anwendung von IRO hergestellten Deletionen war: 80,5 für die 3,2-kb-Deletion, 27 für die 8-kb-Deletion, 3,5 für die 10,3-kb-Deletion und 2,5 für die 16-kb-Deletion. Alle G418^S-Klone, die mit Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer CGR1.1 und STT3.1 untersucht wurden, hatten die Kassette verloren und zeigten das korrekte StuI-Restriktionsmuster.
Große Deletionen, die ähnlich den in diesem Beispiel offenbarten sind, können auch mit dem delitto perfetto-DSB-System erzeugt werden.
Beispiel 7: Targeting durch IRO mit dem delitto perfetto-DSB-Ansatz bei stark beeinträchtigter homologer Rekombination (z. B. rad52-null-Hintergrund)
Wie hier besprochen, war im delitto perfetto-System die Integration von IRO (ob einzeln oder paarweise den Zellen angeboten) durch Ersetzen der ursprünglichen CORE-Kassette abhängig vom Gen RAD52 und schien teilweise abhängig zu sein von den Genen RAD50 und MRE11. Es ist jetzt überraschenderweise gefunden worden, dass nach Einsetzen einer CORE-DSB-Kassette (oder RE-DSB-Kassette) ins Genom der DSB-unterstützte Ansatz auch ohne ein hocheffizientes Rekombinationssystem benutzt werden kann.
Da die Induktion eines DSB in der RE-DSB-Kassette zu einem sehr effizienten Targeting mit IROs führt, wurde die Änderung der Targeting-Effizienz bei fehlendem RAD52-Gen untersucht. Wildtyp- und Mutantenstämme (RAD52::LEU2; zwei unabhängige Isolate) wurden entweder mit dem ein Centromer enthaltenden Kontrollplasmid YCp50 (Rose et al., Gene, 60:237–243, 1987) (das das URA3-Gen enthält) oder den folgenden TRP5-IROs transformiert: TRP5.e + f, TRP5.e2 + f2, TRP5.e3 + f3 und TRP5.e4 + f4.

Bei wiederholten Transformationen mit YCp50 war die Transformationseffizienz bei den Wildtypzellen etwa 2–3-mal höher als bei der rad52-Mutante, offensichtlich durch die verringerte Plattierungseffizienz der rad52-Mutante. Ohne DSB-Induktion wurde eine vollständige Abhängigkeit von RAD52 beobachtet. Nach DSB-Induktion war dagegen ein hohes Maß an IRO-Targeting zu beobachten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Oligonukleotidaustausch während der delitto perfetto-DSB-Mutagenese auch in Abwesenheit von RAD52 stattfinden kann, was eine Restaktivität der homologen Rekombination, die unabhängig von der RAD52-Funktion ist, hervorhebt. Tabelle 4. IRO-Targeting-Frequenz nach DSB Induktion in einem rad52-null-Hintergrund

DSB-Induktion^a	Stamm^b	Benutzte IRO-Spezien^c	Trp⁺-Klone^d
Keine Induktion	Δrad52 (1)/(2)	-	0
Keine Induktion	Δrad52 (1)/(2)	TRP5.e + f	0
Keine Induktion	Δrad52 (1)/(2)	TRP5.e2 + f2	0
Keine Induktion	Δrad52 (1)/(2)	TRPS.e3 + t3	0
Keine Induktion	rad52 (1)/(2)	TRP5.e4 + f4	0
Induktion	Δrad52 (1)	-	0
Induktion	Δrad52 (1)	TRP5.e + f	158.67
Induktion	Δrad52 (1)	TRP5.e2 + f2	62.67
Induktion	Δrad52 (1)	TRP5.e3 + f3	2.3
Induktion	Δrad52 (1)	TRPS.e4 + f4	0.67
Induktion	Δrad52 (2)	-	0
Induktion	Δrad52 (2)	TRP5.e +f	242
Induktion	Δrad52 (2)	TRP5.e2 + f2	45.3
Induktion	Δrad52 (2)	TRP5.e3 + f3	0
Induktion	Δrad52 (2)	TRP5.e4 + f4	0

^a„Keine Induktion": Zellen wurden in Glucosemedien kultiviert; „Induktion": Zellen wurden für 5 Stunden in Abwesenheit von 2% Galaktose kultiviert.
^bZwei unabhängige rad52-null-Isolate wurden verwendet: Δrad52 (1) und Δrad52 (2)
^cDie IRO wurden direkt zu den Zellen gegeben.
^dZahl der auf einer Trp^–-Platte gewachsenen Trp⁺-Klone, nach Transformation mit 0,5 nmol jedes IRO. Jeder Wert ist der Mittelwert von drei unabhängigen Transformationsexperimenten.

Beispiel 8: Kits
Die hier dargelegten delitto perfetto- und delitto perfetto-DSB-Mutagenesemethoden, und Komponenten, die für solche Methoden notwendig oder nützlich sind, können zur Verfügung gestellt werden in Form von Kits zur Benutzung bei der Durchführung von In-vivo-Mutagenesereaktionen. In einem solchen Kit wird eine Menge von einer oder mehreren CORE-Kassetten, CORE-DSB-Kassetten, RE-Kassetten und/oder ein oder mehrere IRO in einem oder mehreren Behältnissen zur Verfügung gestellt. Die Nukleinsäuremoleküle können beispielsweise in einer wässrigen Lösung suspendiert oder als gefriergetrocknetes oder lyophilisiertes Pulver zur Verfügung gestellt werden. Optional enthalten die Kits außerdem einen oder mehrere geeignete Hefestämme oder Zellen von anderen Organismen.
Kits gemäß dieser Erfindung können außerdem Anleitungen, üblicherweise schriftliche Anleitungen, enthalten, um den Benutzer bei der Durchführung von In-vivo-Mutagenesereaktionen mit einer CORE-Kassette und/oder einem oder mehreren IRO zu unterstützen. Solche Anleitungen können optional auch auf einem computerlesbaren Medium zur Verfügung gestellt werden.
Das Behältnis oder die Behältnisse, in dem oder in denen die Nukleinsäure(n) zur Verfügung gestellt werden, kann oder können jedes gewöhnliche Behältnis sein, das in der Lage ist, die gelieferte Form zu beinhalten, zum Beispiel Mikrozentrifugenröhrchen, Ampullen oder Flaschen. In einigen Anwendungen können die Nukleinsäuren in bereits abgemessenen Einzelmengen in einzelnen, typischerweise nur einmal zu benutzenden, Röhrchen oder äquivalenten Behältnissen zur Verfügung gestellt werden.
Die Menge von jeder CORE-Kassette oder jedem Oligonukleotid-IRO (oder IRO-Paar), die im Kit zur Verfügung gestellt wird, kann jede geeignete Menge sein, zum Beispiel abhängig vom Markt, auf den das Produkt zielt. Beispielsweise würde bei einer Adaption des Kits für eine Anwendung in der Forschung oder der Klinik die Menge jedes IROs wahrscheinlich so beschaffen sein, dass damit mehrere Transformationsreaktionen durchgeführt werden können.
In ähnlicher Weise stellen in Kits, die Oligonukleotidprimer für eine In-vitro-Amplifikationsreaktion enthalten, die beschriebenen Ausführungsformen Richtlinien für die für eine einzelne Amplifikationsreaktion nützlichen Mengen zur Verfügung. Außerdem ist dem Fachmann die für eine einzelne Amplifikationsreaktion angemessene Menge an Oligonukleotidprimern bekannt. Allgemeine Richtlinien sind zum Beispiel zu finden in Innis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1990), Sambrock et al. (In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) und Ausubel et al. (In: Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. und Wiley Intersciences, 1992).
In einigen Ausführungsformen können die Kits ein oder mehrere Reagenzien enthalten, die zur Durchführung von PCR-Reaktionen notwendig sind, einschließlich beispielsweise DNS-Probenvorbereitungsreagenzien, geeignete Puffer (z. B. Polymerase-Puffer), Salze (z. B. Magnesiumchlorid) und Desoxyribonukleotide (dNTPs). In einigen Ausführungsformen können die Kits ein oder mehrere Reagenzien enthalten, die für das Durchführen von Transformationsreaktionen notwendig sind. Beispielsweise können Kits, die auf die Benutzung mit einem Hefesystem (insbesondere S. cerevisiae) zugeschnitten sind, Lithiumacetat oder andere Puffer oder Reagenzien enthalten, die bei der Transformation von Hefe benutzt werden.
Es kann auch vorteilhaft sein, im Kit eine oder mehrere Nukleinsäuren als Positiv- oder Negativkontrolle zur Benutzung in In-vitro-Amplifikationsreaktionen oder Transformationsreaktionen zur Verfügung zu stellen. Der Entwurf solcher Kontroll-Nukleinsäuremoleküle ist dem Fachmann bekannt. In einigen Ausführungsformen kann ein Kontrollstamm zur Verfügung gestellt werden, zum Beispiel ein Stamm als Negativkontroll-Stamm, der nicht rekombinationskompetent ist (z. B. ein rad52-Hefestamm). In ähnlicher Weise könnte ein typischer Positivkontroll-Stamm in seinem Genom eine CORE-Kassette integriert haben, die die Detektion einer erfolgreichen (oder erfolglosen) IRO-Transformation ermöglicht. Ein Beispiel für einen typischen Positivkontroll-Stamm ist ein Hefestamm (wie z. B. BY4742), der die CORE-Kassette (oder eine CORE-DSB-Kassette oder eine RE-DSB-Kassette, je nach Kit) im mutierten TRP5-Gen trägt, so dass eine Transformation mit den IROs TRP5.e und TRP5.f (wie oben beschrieben) zu Zellen mit einem Trp⁺-Phänotyp führt, die eine stumme Mutation in TRP5 mit einer neuen BamHI-Schnittstelle tragen.
Diese Offenlegung stellt Methoden zur Verfügung für die ortsspezifische und/oder zufällige In-vivo-Mutagenese, einschließlich Punktmutationen, Deletionen, Insertionen und Ersetzungen. Die Offenlegung stellt weiterhin Komponenten, die für solche Mutagenesemethoden notwendig oder nützlich sind, zur Verfügung, und Kits zur Durchführung solcher Methoden. Die genauen Details der beschriebenen Methoden können natürlich abgewandelt und modifiziert werden. Unsere Ansprüche beziehen sich auf alle solchen Modifikationen und Abwandlungen im Rahmen und im Sinne der unten angegebenen Patentansprüche. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Einführung einer Mutation in eine Doppelstrang-Zielnukleinsäuresequenz in einer Zelle, wobei diese Sequenz einen ersten Strang und einen zweiten Strang aufweist, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: – eine Doppelstrang-Nukleinsäurekassette wird an einem Einfügungspunkt eingefügt, wobei die Kassette eine RE-Kassette ist und Folgendes aufweist: – einen ersten Teil, der mit einer Nukleinsäuresequenz auf einer ersten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, – einen zweiten Teil, der mit einer zweiten Nukleinsauresequenz auf einer zweiten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, und – eine Nukleinsäuresequenz, die einen Anzeiger kodiert, der zwischen dem ersten Teil und dem zweiten Teil angeordnet ist, – die Zelle wird mit einem ersten Oligonukleotid umgewandelt, die Folgendes aufweist: – eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem Strang (dem gewählten Strang) der Ziohukieinsäuresequenz an einer Position auf der ersten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, und – eine Nukleinsäuresequenz, die mit demselben Strang der Zielnukleinsäuresequenz an einer Position auf der zweiten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt und die mindestens ein Nukleotid aufweist, das sich von dem gewählten Strang der Zielnukleinsäuresequenz unterscheidet, und – für den Verlust wird diejenige Nukleinsäuresequenz ausgewählt, die das Anzeigergen kodiert, wobei der Verlust der das Anzeigergen kodierenden Nukleinsäuresequenz die Integration der Oligonukleotidsequenz anzeigt, die das – mindestens eine Nukleotid aufweist, das sich von der Zielnukleinsäuresequenz unterscheidet, und wobei das Verfahren kein Therapieverfahren ist, das am menschlichen oder tierischen Körper ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Doppelstrang-Nukleinsäurekassette ferner eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die einen gegenwählbaren Marker kodiert, der zwischen dem ersten Teil und dem zweiten Teil angeordnet ist, wobei die Kassette eine CORE-Kassette ist, und dass für den Verlust sowohl die den gegenwählbaren Marker kodierende Nukleinsäuresequenz als auch die das Anzeigergen kodierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt wird, wobei der Verlust sowohl der den gegenwählbaren Marker kadierenden Nükleinsäuresequenz als auch der das Anzeigergen kodierenden Nukleinsäuresequenz die Integration der Oligonukleinsäuresequenz anzeigt, die das mindestens eine Nukleotid aufweist, das sich von der Zielnukleinsäuresequenz unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Doppeistrang-Nukleinsäurekassette ferner Folgendes aufweist: – eine Nukleinsäuresequenz, die eine doppelstrangige Brucherkennungslage aufweist, – eine Nukleinsäuresequenz, die ein doppelstrangiges Bruchenzym kodiert, das die doppelstrangige Brucherkennungslage erkennt, und – einen anregenden Promotor, der mit der Nukleinsäure betriebsmäßig verbunden ist, die das doppelstrangige Bruchenzym kodiert, wobei die Kassette als RE-DSB-Kassette ausgebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Doppeistrang-Nukleinsäurekassette ferner Folgendes aufweist: – eine Nukleinsäuresequenz, die eine doppelstrangige Brucherkennungslage aufweist, – eine Nukleinsäuresequenz, die ein doppelstrangiges Bruchenzym kodiert, das die doppelstrangige Brucherkennungslage erkennt, und – einen anregenden Promotor, der mit der Nukleinsäure betriebsmäßig verbunden ist, die das doppelstrangige Bruchenzym kodiert, wobei die Kassette als RE-DSB-Kassette ausgebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner folgenden Schritt aufweist: – die Expression des doppelstrangigen Bruchenzyms wird eingeführt, wobei ein doppelstrangiger Bruch in der Kassette stimuliert wird, der die Rekombination stimullert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidsequenz mehr als ein Nukleotid aufweist, das sich von der Zielnukleinsäuresequenz unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung der Zelle mit dem ersten Oligonukleotid vor der Auswahl für den Verlust sowohl der den gegenwählbaren Marker kodierenden Nukleinsäuresequenz als auch der das Anzelgergen kodierenden Nukleinsäuresequenz erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung der Zelle mit einem zweiten Oligonukleotid erfolgt, das mindestens teilweise zum ersten Oligonukleotid komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung der Zelle mit dem ersten Oligonukleotid gleichzeitig mit der Umwandlung der Zelle mit dem zweiten Oligonuklotid erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Oligonukleotid Folgendes aufweist: (1) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Zielnukleinsäuresequenz an einer Position auf der ersten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, (2) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Zielnukleinsäuresequenz an einer Position auf der zweiten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, oder (3) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Zielnukleinsäuresequenz an einer Position auf der ersten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, und eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Zielnukleinsäuresequenz an einer Position auf der zweiten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonukleotid und/oder das zweite Oligonukleotid mindestens eine Nukleotidzufallsänderung im Vergleich mit der Zielnukleinsäuresequenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Oligonukleotid vollständig komplementär zum ersten Oligonuleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die 3'-Enden der beiden Oligonukleotide komplementär zueinander sind, dass aber: (1) dem ersten Oligonukleotid die Übereinstimmung mit der zweiten Seite des Einfügungspunkts fehlt und dem zweiten Oligonukleotid die Übereinstimmung mit der ersten Seite des Einfügungspunkts fehlt und/oder (2) dem zweiten Oligonukleotid die Übereinstimmung mit der zweiten Seite des Einfügungspunkts fehlt und dem ersten Oligonukleotid die Übereinstimmung mit der ersten Seite des Einfügungspunkts fehlt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die 5'-Enden der beiden Oligonukleotide komplementär zueinander sind, dass aber: (1) dem ersten Oligonukleotid die Übereinstimmung mit der zweiten Seite des Einfügungspunkts fehlt und dem zweiten Oligonukleotid die Übereinstimmung mit der ersten Seite des Einfügungspunkts fehlt und/oder (2) dem zweiten Oligonukleotid die Übereinstimmung mit der zweiten Seite des Einfügungspunkts fehlt und dem ersten Oligonukleotid die Übereinstimmung mit der ersten Seite des Einfügungspunkts fehlt.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid jeweils mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide oder mindestens 80 Nukleotide lang sind.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 13. dadurch gekennzeichnet, dass der Überlappungsbereich an den 3'-Enden mindestens zehn Basispaare beträgt.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Überlappungsbereich an den 3'-Enden mindestens fünfzehn Basispaare beträgt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die 3'-Enden des ersten Oligonukleotids und des zweiten Oligonukleotids durch eine in-vitro-Polymerisation verlängerbar sind.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich mindestens ein Oligonukleotid von der Zielnukleinsäuresequenz durch mehr als ein Nukleotid unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sich beide Oligonukleotide von der Zielnukleinsäuresequenz durch mindestens ein einzelnes Nukleotid un terscheiden.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Unterschied in Folgendem besteht: – das Nukleotid ist im Überlappungsbereich zwischen dem ersten Nukleotid und dem zweiten Nukleotid angeordnet, – das Nukleotid ist außerhalb des Überlappungsbereichs zwischen dem ersten Nukleotid und dem zweiten Nukleotid angeordnet,
Verfahren zum Entfernen einer Doppelstrang- aus einer Zelle, wobei diese Sequenz eine ersten Strang und einen zweiten Strang aufweist, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: – eine Doppelstrang-Nukleinsäurekassette wird in einer Zielnukleinsäuresequenz an einem Einfügungspunkt eingefügt, wobei die Kassette eine RE-Kassette ist und Folgendes aufweist: – eine Nukleinsäuresequenz, die einen Anzeiger kodiert, der zwischen dem ersten Teil und dem zweiten Teil der RE-Kassette angeordnet ist, – die Zelle wird mit einem ersten Oligonukleotid umgewandelt, die Folgendes aufweist: – eine Nukleinsäuresequenz, die mit dem ersten Strang einer 5'-Nukleinsäure der interessierenden Nukleinsäure übereinstimmt, – eine Sequenz, die mit dem ersten Strang einer 3'-Nukleinsäure der Interessierenden Nukleinsäure übereinstimmt, und – für den Verlust wird diejenige Nukleinsäuresequenz ausgewählt, die das Anzeigergen kodiert, wobei der Verlust der das Anzeigergen kodierenden Nukleinsäuresequenz aus der doppelstrangigen Zielnukleinsäuresequenz das Entfernen der doppelstrangigen 7-ielnukleinsäuresequenz anzeigt und wobei das Verfahren kein Therapieverfahren ist, das am menschlichen oder tierischen Körper ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Doppelstrang-Nukleinsäurekassette ferner eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die einen gegenwählbaren Marker kodiert, der zwischen dem ersten Teil und dem zweiten Teil angeordnet ist, wobei die Kassette eine CORE-Kassette ist, und dass für den Verlust sowohl die den gegenwählbaren Marker kodierende Nukleinsäuresequenz als auch die das Anzeigergen kodierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt wird, wobei der Verlust sowohl der den gegenwählbaren Marker kodierenden Nukleinsäuresequenz als auch der das Anzeigergen kodierenden Nukleinsäuresequenz die Entfernung der doppelstrangigen Zielnukleinsäuresequenz anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Doppelstrang-Nukleinsäurekassette ferner Folgendes aufweist: – eine Nukleinsäuresequenz, die eine doppelstrangige Brucherkennungslage aufweist, – eine Nukleinsäuresequenz, die ein doppelstrangiges Bruchenzym kodiert, das die doppelstrangige Brucherkennungslage erkennt, und – einen anregenden Promotor, der mit der Nukleinsäure betriebsmäßig verbunden ist, die das doppelstrangige Bruchenzym kodiert, wobei die Kassette als RE-DSB-Kassette ausgebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Doppelstrang-Nukleinsäurekassette ferner Folgendes aufweist – eine Nukleinsäuresequenz, die eine doppelstrangige Brucherkennungslage aufweist, – eine Nukleinsäuresequenz, die ein doppelstrangiges Bruchenzym kodiert, das die doppelstrangige Brucherkennungslage erkennt, und – einen anregenden Promotor, der mit der Nukleinsäure betriebsmäßig verbunden ist, die das doppelstrangige Bruchenzym kodiert, wobei die Kassette als CORE-DSB-Kassette ausgebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner folgenden Schritt aufweist: – die Expression des doppelstrangigen Bruchenzyms wird eingeführt, wobei ein doppelstrangiger Bruch in der Kassette stimuliert wird, der die Rekombination stimuliert.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die entfernte Zielnukleinsäuresequenz eine Länge von 1 bis etwa 16000bp aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass – der erste Teil der Kassette mit einer Nukleinsäuresequenz auf einer ersten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt und – der zweite Teil der Kassette mit einer Nukleinsäuresequenz auf einer zweiten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner den folgenden Schritt aufweist: – die Zelle wird mit einer zweiten Oligonukleinsäure umgewandelt, die Folgendes aufweist: – eine Nukleinsäuresequenz, die mit dem zweiten Strarig einer 5'-Nukleinsäure der doppelstrangigen Zielnukleinsäuresequenz übereinstimmt, wobei die Sequenz des ersten Oligonukleotids mit mindestens zehn Nukleotiden am 3'-Ende der Sequenz des zweiten Oligonukleotids übereinstimmt.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz des ersten Oligonukleotids mit mindestens fünfzehn Nukleotiden am 3'-Ende der Sequenz des zweiten Oligonukleotids übereinstimmt.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Oligonukleotid ferner Folgendes aufweist. – eine Sequenz, die mit dem zweiten Strang einer 3'-Nukleinsäure der interessierenden Nukleinsäuresequenz übereinstimmt.
Verfahren nach Anspruch 29. dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Oligonukleotid zum ersten Oligonukleotid vollständig komplementär ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 4, 22 bis 25 und 29, dadurch gekennzeichnet, dass der gegenwählbare Marker durch KIURA3, URA3, TRP5, TRP1 oder ein Gen gebildet ist, das ein Toxin kodiert.
Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der gegenwählbare Marker ein Gen ist, das ein Toxin kodiert, und dass das Toxin ein anregendes Beschränkungsenzym oder ein anregendes p53-Gen ist.
Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das anregende p53-Gen eine toxische Version ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Anzeiger ein Polypeptid kodiert, das der Zeile einen antibiotischen Widerstand verleiht.
Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum G418, Hygromycin, Kanamycin, Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Zeocin, Nourseothricin, Cycloheximid oder Canavanin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Anzeiger ein Polypeptid von einem Aminosäuren- oder Nukleotidsyntheseweg kodiert.
Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid LEU2, TRP5, TRP1, LYS2, HIS3 oder ASE2 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide oder mindestens 80 Nukleotide lang ist.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid jeweils mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide oder mindestens 80 Nukleotide lang sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8, 13 und 41, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid unterschiedliche Längen aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid jeweils mindestens 20 Nukleotide lang sind und dass der Überlappungsbereich an den 3'-Enden mindestens zehn Basenpaare beträgt.
Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonukleotid und das zweite oligonukleotid jeweils mindestens 40 Nukleotide lang sind und dass der Überlappungsbereich an den 3'-Enden mindestens fünfzehn Basenpaare beträgt.
Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass die 3'-Enden des ersten Oligonukleotids und des zweiten Oligonukleotids durch eine in-vitro-Polymerisation verlängerbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 22 bis 25. dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Zelle eines Organismus ist, in dem eine übereinstimmende Rekombination durchgeführt werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pilzzelle, eine Bazillenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Tier-zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 47. dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pilzzelle ist und dass die Pilzzelle eine Hefepilzzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Tierzelle Ist und dass die Tierzelle eine Kükenzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Kükenzelle ein menschliches Chromosom oder einen Bruchteil davon aufweist.
Verfahren zur Feststellung einer Mutation in einer Nukleinsäuresequenz, um festzustellen, ob die Mutation ein Funktions- oder ein Expressionsmuster der Nukleinsäure beeinflusst, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Verfahren die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 22 bis 25 aufweist.
Verfahren zum Analysieren einer Reihe von Mutationen in einer Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte aufweist; – das Verfahren nach Anspruch 1 wird mehrere Male durchgeführt, wobei mindestens zwei unterschiedliche Mutationen in der Nukleinsäuresequenz eingeführt sind, und – das Funktions- oder ein Expressionsmuster der Nukleinsäure wird analysiert, wobei eine Reihe von Mutationen in der Nukleinsäuresequenz analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 51 oder 52, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz eine Säugetiersequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 51 oder 52, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert.
Verfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Funktion des Polypeptids durchführt.
Verfahren nach Anspruch 51 oder 52, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer Zelle eines haploiden Hefeplizes oder in einer Zelle eines diploiden Hefepilzes durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass es als Diagnostikwerkzeug verwendet wird, wobei eine Reihe von Abstammungs- oder Zelllinien geschaffen wird, von denen jede mit der Kassette an einer unterschiedlichen Position mit einem Gen derart ausgestattet ist, dass die Mutationen irgendwo mit einem Gen und den mit diesem verbundenen, biologischen Folgen eingeführt werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Verfahren ist, das Defekte In p53 analysiert, wobei ein mutiertes p53-Protein in einem Hefepilz derart ausgedrückt wird, dass eine Wirkung eines Defekts in einem mutierten p53-Protein festgestellt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner den Schritt der Feststellung eines Defekts in einem mutierten p53-Protein aufweist.
Verwendung eines integrierten, rekombinierten Oligonukleotids (IRO) im Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 59.
Verwendung einer Ausstattung zur Durchführung einer in-vivo-Mutagenese oder der Entfernung einer Nukleinsäuresequenz in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, - dadurch gekennzeichnet, dass die Ausstattung eine Menge einer CORE-Kassettenkonstruktion, einer RE-DSB-Kassettenkonstruktion oder einer CORE-DSB-Kassettenkonstruktion und eine Menge eines integrierten, rekombinierten Oligonukleotids aufweist.
Verwendung einer CORE-Kassette im Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konstruktion einen ersten Teil, der mit einer Nukleinsäuresequenz auf einer ersten Seite eines Einfügungspunkts übereinstimmt, einen zweiten Teil, der mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz auf einer zweiten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, eine Nukleinsäuresequenz, die einen zwischen dem ersten Tell und dem zweiten Teil angeordneten Anzeiger kodiert, und eine zwischen dem ersten Teil und dem zweiten Teil angeordnete Nukleinsäuresequenz aufweist.
RE-DSB-Kassette zur Verwendung bei einer Mutagenese, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen ersten Teil, der mit einer Nukleinsäuresequenz auf einer ersten Seite eines Einfügungspunkts übereinstimmt, einen zweiten Teil, der mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz auf einer zweiten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, eine Nukleinsäuresequenz, die einen zwischen dem ersten Teil und dem zweiten Teil angeordneten Anzeiger in dieser Nukleinsäurekassette kodiert, aufweist und dass diese Kassette ferner eine Nukleinsäuresequenz, die ein doppelstrangiges Bruchenzym kodiert, das eine doppelstrangige Brucherkennungslage erkennt, und einen anregenden Promotor aufweist, der mit der Nukleinsäure betriebsmäßig verbunden ist, die das doppelstrangige Bruchenzym kodiert.
Verwendung der RE-DSB-Kassette des Anspruchs 63 gemäß dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
RE-DSB-Kassette zur Verwendung bei einer Mutagenese, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen ersten Teil, der mit einer Nukleinsäuresequenz auf einer ersten Selte eines Einfügungspunkts übereinstimmt, einen zweiten Teil, der mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz auf einer zweiten Seite des Einfügungspunkts übereinstimmt, und eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die einen zwischen dem ersten Teil und dem zweiten Teil in dieser Nukleinsäurekassette angeordneten Anzeiger und ein gegenwählbares Markergen in dieser Nukleinsäurekassette kodiert, und dass diese Kassette ferner eine Nukleinsäuresequenz, die ein doppelstrangiges Bruchenzym kodiert, das eine doppelstrangige Brucherkennungslage erkennt, und einen anregenden Promotor aufweist, der mit der Nukleinsäure betriebsmäßig verbunden ist, die das doppelstrangige Bruchenzym kodiert.
Verwendung der CORE-DSB-Kassette des Anspruchs 65 im Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.