KR100320905B1 - 캔디다 유틸리스의 형질전환계와 이를 이용한 이종유전자의 발현 - Google Patents

캔디다 유틸리스의 형질전환계와 이를 이용한 이종유전자의 발현 Download PDF

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마나배게이사꾸
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Abstract

본 발명은 캔디다 유틸리스 효모의 재현가능한 형질전환계, 이 형질전환계에서 이종 유전자를 발현하는 방법, 이 형질전환계에서 사용될 수 있는 벡터와 그 발현방법, 및 신규한 DNA 군에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 캔디다 유틸리스에서 이종 유전자를 발현하기 위한 방법은 약제 내성 마커, 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA에 상동인 서열 및 이종 유전자를 포함하는 벡터로 캔디다 유틸리스를 형질전환하고, 이 형질전환체를 배앙하여 상기 이종 유전자의 발현 생성물을 단리하는 것으로 이루어진다.

Description

캔디다 유틸리스의 형질전환계와 이를 이용한 이종 유전자의 발현{TRANSFORMATION SYSTEMS FOR THE YEAST CANDIDA UTILIS AND THE EXPRESSION OF HETEROLOGOUS GENES THEREWITH}
본 발명은 캔디다 유틸리스(Candida utilis)의 재현가능한 형질전환계에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 재조합 DNA를 이용한 캔디다 유틸리스 효모의 형질전환 및 이 방법으로 얻어진 신규한 형질전환체 내에서의 이종 유전자의 발현에 관한 것이다. 본 발명은 또한 형질전환을 위한 선택 마커(marker) 유전자로서 사용될 수 있는 신규한 DNA서열과, 이종 유전자를 발현하기 위한 프로모터 또는 터미네이터로서 사용될 수 있는 신규한 DNA서열에 관한 것이다. 본 발명은 효모 염색체 내로 이종 유전자를 효율적으로 삽입하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 캔디다 유틸리스 내에서 형질전환 효율을 강화하는 특성뿐만 아니라 자율적인 복제능을 가지는 DNA단편과, 염색체 내에 선택성이 없는 마커 유전자를 가지는 DNA단편을 삽입하는 방법과 프로모터 활성을 가지는 DNA서열을 얻는 방법에 관한 것이다.
유전자 조작 기술의 발전은 미생물을 이용하여 유용한 단백질을 대량으로 생산할 수 있게 하였다.Escherichia coli또는Bacillus subtilis등의 원핵생물은 이를 위한 숙주로서 용이하게 이용될 수 있는데, 특히E.coli는 가장 빈번하게 숙주로 이용된다. 그러나,E.coli에서 제조된 단백질은 종종 불용성 형태로 유도되어 분비될 때 글라이코실레이트될 수 없어서, 이러한 단백질은 다양한 요구를 만족하지 못하였다. 또한, 이렇게 제조된 단백질을 의약으로 사용하려고 할 경우,E.coli에 의해 생산된 발열성 독성인자를 제거하여야만 한다.
상기한 원핵생물계를 이용하는 것과 비교할 때, 유용한 단백질을 제조하는 숙주로서 효모 등의 진핵생물을 이용하는 것은 이점이 있다. 먼저, 사카로마이세스(Saccharomyces)속은 알코올 등의 발효 제품의 제조에 오랫동안 사용되어 왔고, 효모 캔디다 유틸리스는 사료의 제조에 사용되어 왔기 때문에 사카로마이세스속 또는 캔디다 유틸리스 효모는 안전성이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 효모는 일반적으로 박테리아 보다 더 높은 세포 밀도에서 배양될 수 있을 뿐만 아니라 연속적 배양도 가능하다. 효모는 배지에 단백질을 분비하고 분비된 단백질은 글라이코실레이션에 의해 변성된다. 따라서, 효모를 이용하여 단백질을 제조하는 것은 상기한 변성이 단백질의 활성에 중요할 경우 가치가 있다.
사카로마이세스속으로 분류되는 효모는 매우 광범위하게 연구되어 이들에 대한 유전정보가 축적되어 있다. 효모는 다양한 물질을 제조하기 위한 숙주로서 연구되어 왔다. 또한, 사카로마이세스속 뿐만 아니라, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Candida 속 등의 일부 효모를 형질전환하는 기술이 개발되어 이들 효모는 유용한 물질을 제조하기 위한 숙주로서 현재 시험되고 있다. 이들 중에서, 캔디다속에 속하는 효모는 특히 탄소원의 광역한 동화영역등의 사카로마이세스속의 효모에 발견되지 않는 실제 사용하는데 있어서 유리한 특성을 가진다. 따라서, 캔디다속의 효모는 재조합 DNA기술에 의해 유용한 물질을 제조하는데 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
캔디다속의 효모 중에서, 캔디다 유틸리스는 자일로스 등의 펜토스에 대하여 우수한 동화능을 가진다. 또한, 사카로마이세스속의 효모와는 상이한 캔디다 유틸리스는 호기성 조건하의 배양에서 에탄올을 제조하지 않으므로 성장이 억제되지 않는다. 그러므로, 세포의 고밀도 하에서 캔디다 유틸리스의 연속 배양에 의해 효율적으로 세포를 제조할 수 있다. 따라서, 단백질원으로서 캔디다 유틸리스가 주목되었고, 다량의 펜토스를 포함하는 활엽수의 당화액(糖化液) 또는 아황산 폐액을 이용하여 효모 세포의 산업적 제조가 실시되었다.Saccharomyces cerevisiae와Saccharomyces fragilis뿐만 아니라, 캔디다 유틸리스도 미국 FDA(Food and Drug Administration)에 의해 식품 첨가물로서 안전하게 사용될 수 있는 효모로 인정되었다. 실제로, 캔디다 유틸리스는 독일, 미국, 대만 및 브라질을 포함한 많은 나라에서 사료로써 사용되고 있어서, 그 안전성이 확인되었다고 할 수 있다.
미생물성 단백질로서 캔디다 유틸리스의 용도 이외에 캔디다 유틸리스는 펜토스나 자일로스를 발효시키는 미생물 균주로서 또는 에틸아세테이트, L-글루타민, 글루타티오닌, 인버타제 등을 제조하기 위한 미생물 균주로서 산업계에서 널리 사용되어 왔다.
그러나, 이제까지 유용한 효모, 캔디다 유틸리스의 형질전환에 성공하였거나, 이를 입증하는 어떠한 보고도 없었다. 형질전환의 실패는 적절한 영양 요구성 등과 같은 선택적 마커가 니트로소구아니딘 또는 에틸 메탄술폰산 등의 종래의 돌연변이원을 이용한 돌연변이 처리에 의해 유발된 돌연변이 균주를 얻는데 있어서의 극도의 곤란함 때문인 것으로 생각된다. 이러한 어려움은 캔디다 유틸리스가 2배체 이상의 배수체이기 때문일 수 있다. 이는 다른 효모에서 형질전환용 선택 마커로서 자주 사용되는 캔디다 유틸리스의 ADE1과 LEU2와 같은 유전자의 클로닝은 보고되어 있으나(Nishiya등, 일본 공개특허 제66089/1992호; Kobayashi등, 일본 특허공고 제42673/1989호), 해당하는 유전자 내에 돌연변이를 가지는 캔디다 유틸리스 숙주 균주가 기재되어 있지 않은 것으로부터 추측할 수 있다. 이것은 영양요구성의 상보 유전자를 숙주 균주에 삽입하여 직접적으로 형질전환체를 선별하는 다양한 효모에서 형질전환계의 개발에 사용되는 종래의 기술을 캔디다 유틸리스에 거의 적용할 수 없다는 것을 의미한다.
또한, 캔디다 유틸리스는 배수성이 높고 포자형성능이 없어서 그 유전적 성질이 완전하게 밝혀지지 않았다. 그러므로, 형질전환의 조건과 벡터계에 의해 만족되는 조건이 알려지지 않은채 남아 있어서 숙주/벡터계를 구축하는 것이 매우 어려움을 추측할 수 있다.
Ho 등은 캔디다 유틸리스에 관하여 약제 내성 마커를 이용한 예비 형질전환 시험을 기재하고 있다(Ho,N.W.Y.등, Biotechnology and Bioengineering Symp., No. 14, 295-301, 1984). 이 보고는, 형질전환 실험 조건, 또는 형질전환의 확인에 필요한 약제 내성 형질전환체에 대한 써던 블로트 분석 등의 실험 데이타가 기재되어 있지 않기 때문에 불완전한 것이다.
따라서, 캔디다 유틸리스와 관련한 재현가능한 형질전환계와 이 형질전환계를 이용한 유용한 물질의 제조기술을 구축하는 것이 필요하다.
본 발명자들은 캔디다 유틸리스로부터 재현성 있게 형질전환체를 얻었고, 상기 형질전환체에서 이종 유전자의 발현에 대한 다양한 정보를 성공적으로 얻었다. 본 발명은 이러한 정보에 근거하였다.
본 발명의 목적은 캔디다 유틸리스의 재현가능한 형질전환계를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 선택 마커, 플라스미드가 염색체 내에 삽입된 목적 서열 및 이종 유전자의 발현에 필요한 프로모터 및 터미네이터 등의 신규한 DNA서열로서 캔디다 유틸리스 형질전환계에 유용한 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 캔디다 유틸리스 내에서 이종 유전자를 발현할 수 있게 하는 벡터계를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이종 유전자의 다중 복제물을 안정하게 삽입시킬 수 있는 숙주/벡터계를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 캔디다 유틸리스 내에서 이종 유전자를 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 자율적 복제능과 형질전환 효율을 증강하는 기능을 가지는 DNA단편, 이 단편을 포함하는 플라스미드 벡터, 이 플라스미드 벡터를 이용하여 염색체 내에 선택적 마커 유전자가 없는 DNA단편을 삽입하는 방법 및 프로모터 활성을 가지는 DNA서열과 이렇게 하여 얻어진 프로모터 활성을 가지는 신규한 DNA서열을 얻는 방법에 제공하는 것이다.
도 1은 포스포글리세레이트 카이네이즈(PGK) 유전자를 포함하는 플라스미드의 제한효소 지도와 DNA염기 서열을 결정하는 방법 및 PCR에 의해 프로모터와 터미네이터 단편을 얻는 방법을 나타낸 것이다.
도 2는 PGK 터미네이터를 포함하는 DNA단편의 DNA서열을 나타낸 것이다.
도 3은 PGK 프로모터를 포함하는 DNA단편의 DNA서열을 나타낸 것이다.
도 4는 PGK 유전자 프로모터와 터미네이터를 이용하여 발현벡터 플라스미드를 구성하는 다이아그램을 나타낸 것이다.
도 5는 리보좀 DNA를 포함하는 플라스미드의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.
도 6은 리보좀 DNA의 구조, DNA서열을 결정하는 전략 및 서브클론된 플라스미드의 구조를 나타낸 것으로, 제6(a)도는 플라스미드 pCRE1, pCRE2, PCRE3, pCRX1, pCRX2, pCRX3 및 pCRX4의 구조를 나타낸 것이고, 제6(b)도는 캔디다 유틸리스의 리보좀 DNA를 포함하는 약 13.5kb의 DNA단편의 제한효소 지도이다.
도 7은 ura3 유전자를 포함하는 플라스미드의 제한효소 지도와 상기 플라스미드의Saccharomyces cerevisiaeURA3-돌연변이에 대한 상보능을 나타낸 것이다.
도 8은 URA3 유전자의 DNA서열을 결정하는 전략과 그의 제한효소 지도이다.
도 9는 URA3 유전자를 포함하는 DNA단편의 DNA서열을 나타낸 것이다.
도 10은 URA3 유전자의 DNA서열로부터 추정된 아미노산 서열과 이것을 코드하는 DNA의 DNA서열을 나타낸 것이다.
도 11은 도 10의 계속으로, URA3 유전자의 DNA서열로부터 추정된 아미노산 서열과 이것을 코드하는 DNA의 DNA서열이다.
도 12는 L41 유전자를 포함하는 플라스미드의 제한효소 지도와 DNA서열을 결정하는 전략을 나타낸 것이다.
도 13은 L41 유전자를 포함하는 DNA단편의 DNA서열을 나타낸 것이다.
도 14는 L41 유전자의 DNA서열로부터 추정된 아미노산 서열과 이것을 코드하는 DNA의 DNA서열을 나타낸 것이다.
도 15는 플라스미드 pCLBS10과 pCLBS12의 구조를 나타낸 것이다.
도 16은 플라스미드 pCLRE2,pCLRE3,pCRX1 및 pCLRX2의 구조를 나타낸 것이다.
도 17은 다양한 전기 펄스 조건 하에서의 생균율과 ATCC 9950의 형질전환체 수를 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 플라스미드 pCLRE2로 형질전환된 ATCC 9950 DNA의 써던 블로트 분석결과의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다.
도 19는 플라스미드 pCLRE2로 형질전환된 ATCC 9266, 9256 및 9950의 DNA의써던 블로트 분석결과의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다.
도 20은 플라스미드 pCLRE4,pCLRE5, pCLRE6 및 pCLRE7의 구조를 나타낸 것이다.
도 21은 플라스미드 pCLRE4,pCLRE5, pCLRE6 및 pCLRE7으로 형질전환된 ATCC 9950 DNA의 써던 블로트 분석결과의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다..
도 22는 플라스미드 pCLURA1으로 형질전환된 ATCC 9950 DNA의 써던 블로트 분석결과의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다.
도 23은 플라스미드 pCLSTA1과 pCLRSTA1의 구조를 나타낸 것이다.
도 24는 플라스미드 pCLRSTA1으로 형질전환된 ATCC 9950 균주 배양물의 상징액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 플라스미드 pCLLAR1과 pCLRLAC1의 구조를 나타낸 것이다.
도 26은 플라스미드 pCLAPH1과 pCLARPH1의 구조를 나타낸 것이다.
도 27은 상이한 약제 내성 마커들(CYHr: 시클로헥시미드 내성; G418r: G418 내성)로 선택된 플라스미드 pCLRAPH1으로 형질전환된 ATCC 9950 균주의 DNA의 써던 블로트 분석결과의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다.
도 28은 플라스미드 pCRE8,pCRAPH2,pCRAPH3,pCRAPH4,pCRAPH5 및 pCRAPH6의 구조를 나타낸 것이다.
도 29는 글리세로알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAP) 유전자를 포함하는 플라스미드의 제한효소 지도, DNA염기 서열을 결정하는 전략 및 PCR을 이용하여 프로모터와 터미네이터 단편을 얻는 방법을 나타낸 것이다.
도 30은 GAP 유전자 프로모터를 포함하는 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 31은 GAP 유전자 터미네이터를 포함하는 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 32는 GAP 유전자 프로모터와 터미네이터를 이용한 발현벡터 플라스미드의 구성을 나타낸 것이다.
도 33은 원형질막 프로톤 ATP아제(PMA) 유전자를 포함하는 플라스미드의 제한효소 지도, DNA염기 서열을 결정하는 전략 및 PCR을 이용하여 프로모터와 터미네이터 단편을 얻는 방법을 나타낸 것이다.
도 34는 PMA 유전자 프로모터를 포함하는 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 35는 PMA 유전자 터미네이터를 포함하는 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 36은 PMA 유전자 프로모터와 터미네이터를 이용한 발현벡터 플라스미드의 구성을 나타낸 것이다.
도 37은 ARS를 포함하는 DNA단편의 클로닝 벡터 pGKAPH2의 구조를 나타낸 것이다.
도 38은 ARS를 포함하는 6종의 플라스미드 삽입 DNA단편의 제한효소 지도이다.
도 39는 플라스미드 pCARS6와, 이 플라스미드의 서브클론된 삽입 DNA단편인 4종의 플라스미드 삽입 DNA단편의 제한효소 지도이다.
도 40은 플라스미드 pCARS7과, 이 플라스미드의 서브클론된 삽입 DNA단편인 5종의 플라스미드 삽입 DNA단편의 제한효소 지도이다.
도 41은 플라스미드 pCARS6-2가 삽입된 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 42는 플라스미드 pCARS6-2가 삽입된 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 제 41도의 염기 서열의 계속이다.
도 43은 플라스미드 pCARS7-6이 삽입된 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 44는 플라스미드 pCARS7-6이 삽입된 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 제 43도의 염기 서열의 계속이다.
도 45는 플라스미드 pCARS6 또는 pCARS7으로 형질전환된 ATCC 9950 균주의 DNA(1)과 플라스미드 pCLAC1으로 형질전환된 ATCC 9950 규준의 DNA(2)를 써던 블로트 분석한 결과의 전기영동 패턴이다.
도 46는 ATCC 9950, ATCC 9226, ATCC 9256, KP-2059P 및 S288C 균주의 DNA를 CUARS1(1)과 CUARS2 [(2)와 (3)]을 프로브로 하여 써던 블로트 분석한 결과의 전기영동 패턴이다.
도 47은 프로모터 클로닝 벡터 pPCV2의 구조를 나타낸 것이다.
도 48은 플라스미드 pPCRV19의 프로모터 활성을 가지는 DNA단편의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 49는 플라스미드 pGKHPT1의 구조를 나타낸 것이다.
도 50은 동시 형질전환 방법에 의해 형질전환된 ATCC 9950 균주 내의 DNA를 PCR 분석한 결과의 전기영동 패턴이다.
본 발명에 따른 신규한 DNA서열로는 캔디다 유틸리스의 리보좀 단백질 L41을 코드하는 유전자와 그의 프로모터 및 터미네이터 서열; 시클로헥시미드 내성 L41 유전자, 포스포글리세레이트 카이네이즈(PGK) 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열; 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제(GAP) 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열; 원형질막 프로톤 ATP아제(PMA) 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열; URA3 유전자 및 그의 프로모터와 터미네이터 서열; 자율 복제능을 가지는 2개의 DNA단편; 프로모터 활성을 가지는 서열 및 캔디다 유틸리스의 rRNA를 코드하는 리보좀 RNA 유전자를 들 수 있다.
본 발명에 따른 캔디다 유틸리스의 형질전환계에 사용될 수 있는 벡터는 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA에 상동인 서열과 선택 마커 유전자를 포함하는데, 상기에서 이종 유전자는 상동 재조합에 의해 염색체 DNA로 삽입될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 캔디다 유틸리스 내에서 자율 복제능을 가지는 DNA서열과 선택 마커 유전자를 포함하는데, 상기에서 캔디다 유틸리스는 고빈도로 형질전환된다.
또한, 본 발명에 따른 캔디다 유틸리스의 형질전화계에 사용될 수 있는 벡터는 비선택 마커 유전자와 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA에 상동인 서열을 포함하는데, 상기에서 이종 유전자는 동종 재조합에 의해 염색체 DNA에 삽입될 수 있다. 이 플라스미드는 자율 복제능이 있는 DNA서열과 선택 마커 유전자로 이루어진 플라스미드와 함께 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 캔디다 유틸리스의 형질전환계에서 사용될 수 있는 선택 마커 유전자는 캔디다 유틸리스에서 작용할 수 있는 약제 내성 마커, 바람직하게는 시클로헥시미드에 대한 내성을 주는 L41 유전자, G-418에 대한 내성을 주는 유전자 또는 하이그로마이신 B에 대한 내성을 주는 유전자 등이다.
또한, 본 발명에 따라 캔디다 유틸리스 내에서 이종 유전자를 발현하는 방법은 본 발명에 따른 이종 유전자를 포함하는 벡터로 캔디다 유틸리스를 형질전환하고, 얻어진 형질전환체를 배양하여 단리하고, 배양물에서 이종 유전자의 발현생성물을 정제하는 것으로 이루어진다.
또한, 본 발명에 따른 캔디다 유틸리스의 형질전환체는 본 발명에 따른 신규한 DNA군, 벡터계 등의 기능적 조합에 의해 얻어지는 것이다.
캔디다 유틸리스 효모
본 발명에 따른 형질전환계가 적용될 수 있는 캔디다 유틸리스의 구체적인 균주로는, 예를들면 ATCC 9256(IFO 0626), ATCC 9226(IFO 1086), ATCC 9950(IFO 0988), IFO 0396, IFO 0619, IFO 0639, KP-2059P 등이 있다.
캔디다 유틸리스는 그 규준에 따라 전기영동 패턴이 다르고 염색체 길이에서 다형성을 나타낸다는 보고가 있다[Stoltenburg et al., Curr. Genet., 22, 441-446(1992)]. 본 발명에 따른 형질전환계는 그의 다형성 때문에 적용이 제한될 것으로 예상되었다. 그러나, 하기한 실시예에서 사용된 3종의 균주의 염색체 다형성은 서로 상이하였으나, 형질전환체가 얻어졌고 3종의 균주 각각으로 이종 유전자의 발현을 확인하였다. 따라서, 이 분야에 사람들이라면 본 발명에 따른 형질전환계가 캔디다 유틸리스 전체에 적용될수 있음을 예측할 수 있을 것이다.
형질전환계
생물의 형질전환계를 개발하기 위해서는 일반적으로 다음 3가지 요소가 요구된다: (a)형질전환계를 선별하기 위한 선택 마커 유전자와 형질전환체 선택방법, (b)플라스미드 DNA가 숙주 세포 내에서 핵외 유전자로서 존재하는데 필요한 자율 복제 DNA서열(ARS), 또는 염색체 내에 플라스미드를 효율적으로 삽입하는데 필요한적절한 염색체 DNA의 상동 서열(즉, 플라스미드 DNA를 삽입하기 위한 목표의 확립), 및 (c)핵외 DNA를 흡수할 수 있는 숙주 세포를 제조하는 방법. 형질전환체를 얻는데는 상기한 3가지 요소 모두가 필요하다. 따라서, 유전정보가 거의 없는 캔디다 유틸리스의 형질전환계를 확립하기 위해서는 상기한 요소 모두를 시험하고 개발하는 것이 필수적이다.
(a)선택 마커 유전자와 형질전환체의 선별
변이 처리에 의하여 얻어진 영양요구체로서 숙주 균주를 이용할 경우, 형질전환체를 선별하기 위해서 영양요구체에 대한 상보 유전자를 선택 마커 유전자로서 사용할 수 있다. 이 경우, 영양이 없는 최소 배지에서 직접 형질전환체를 선별할 수 있다. 그러나, 캔디다 유틸리스의 경우에는 영양요구체 등과 같은 적절한 선택 표지가 첨가된 변이 균주를 얻는 것이 매우 어렵기 때문에 선택 마커로서 영양요구성 상보 유전자를 가지는 형질전환계를 개발하는 것이 불가능하다.
본 발명자들은, 캔디다 유틸리스가 항생물질 G418, 하이그로마이신 B 또는시클로헥시미드의 약제에 민감하여 이러한 약제를 배지에 첨가하여 미생물의 성장을 억제할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기한 약제들에 대한 내성을 주는 유전자를 이용하고자 하였다.
그리하여 G418에 내성인 유전자(아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자) 또는 하이그로마이신 B에 내성인 유전자(하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자) 등의 다른 생물로부터 유도된 유전자를 사용하였을 때, 캔디다 유틸리스에서 작용하여 유전자의 발현을 보장하는 전사 프로모터와 터미네이터 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
Candida albicans와 같은 캔디다 속의 효모중 일부가 일부 코돈을 다른 생물과는 다른 방법으로 번역한다는 보고가 있다(Ohama et al., Nucleic Acids Res., 21, 4039-4045, 1993). 그러므로, 선택 마커 유전자로서 사용된 이종 유전자는 숙주내에서 기능을 가지는 단백질로 항상 번역되지 않는다. 한편, 시클로헥시미드에 대한 감수성은 리보좀 단백질인 L41 단백질의 +56위치의 아미노산에 의해 결정된다는 매우 흥미로운 사실이 보고 되었다(Kawai et al., J. Bacteriol., 174, 254-262, 1992).
본 발명자들은 시클로헥시미드에 민감한 캔디다 유틸리스의 L41 단백질의 유전자를 얻어 이 유전자를 부위특이적 변이방법에 의해 시클로헥시미드 내성 유전자로 변환하여 선택 마커 유전자로 사용하였다. 이 유전자를 숙주로부터 유도하여 유전자 자체의 시퀀스를 직접 발현의 프로모터와 터미네이터 서열로 사용하였다. 그러므로, 이러한 구현예는 유전자가 발현에 확실히 참여할 수 있다는 점에서 매우유리하다.
그러므로, 본 발명에 따른 캔디다 유틸리스의 형질전환계에 사용되는 선택 마커인 약제 내성 유전자 마커는 시클로헥시미드 내성 L41 유전자가 바람직하다. 프로모터 및 터미네이터 서열과 L41 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기 서열을 제 13도(서열번호 5)에 기재하였고, 염기 서열에서 추정된 아미노산 서열을 제 14도(서열번호 6)에 기재하였다. 시클로헥시미드 내성 L41 유전자는 1644번째 뉴클레오티드 C가 A로 전환된 제13도에 기재한 서열을 가지는데 그 결과 제 14도에 기재된 서열에서 56번째 아미노산 Pro는 Gln으로 전환되었다.
본 발명에 따른 형질전환계에서 사용될 수 있는 또다른 바람직한 약제 내성 유전자 마커는 항생물질 G418에 내성을 주는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APT) 유전자이다. 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APT) 유전자로는 트랜스포손(Transposon) Tn903과 Tn5에서 유도된 2개의 APT 유전자가 이 분야에 이미 알려져 있으므로 이들 중 하나를 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 형질전환계에서는 또한 항생물질 하이그로마이신 B에 대한 내성을 주는E.coli에서 유도된 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자를 사용할 수 있다. G418 내성 유전자 또는 하이그로마이신 내성 유전자 등의 이종 유전자인 경우에는 유전적 발현을 위해 캔디다 유틸리스 내에서 기능하는 전사 프로모터와 터미네이터가 각각 바람직하게는 이종 유전자의 5'-상부와 3'-하부에서 결합된다.
전사의 프로모터와 터미네이터 서열은 캔디다 유틸리스 유전자에서 유도되는 것이 바람직하다. 포스포글리세레이트 카이네이즈(PGK) 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열, 글리세로알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAP) 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열 및 원형질막 프로톤 ATP아제(PMA) 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열을 하기한 캔디다 유틸리스에서 사용할 수 있다. 또한, 하기한 프로모터의 클로닝을 위한 벡터로 얻어진 프로모터 활성을 가지는 DNA서열을 사용할 수 있다.
상기한 형질전환계에서 사용될 수 있는 다른 프로모터와 터미네이터 서열로는 사카로마이세스속 효모에서 ADH,ENO,GAL,SUC 등과 같은 이미 알려진 유전자의 캔디다 유틸리스에 있어서의 동종 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열을 들 수 있다.
또한, 형질전환체의 선택 마커로서 사용될 수 있는 박테리아로부터 유도된 약제 내성 유전자로는 상기한 G418-내성 유전자와 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 이외에도, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자(클로람페니콜 내성)(Hadfield, C. et al., Gene, 45, 149-158 (1986)), 블래스티시딘 데아미나제 (블래스티시딘 내성(Izumi, M. et al., Exp. Cell Res., 197, 229-223 (1991)), 및 플레오마이신 내성 유전자(Wenzel, T. J. et al., Yeast, 8, 667-668 (1992)) 등의 항생물질 내성 유전자를 들 수 있다. 또한, 디하이드로포레이트 리덕타제 유전자 (메토트랙세이트 내성)(Miyajima, A. et al., Mol. Cell Bio1., 4, 407-414(1984) ), 효모에서 유도된 우성 유전자인 메틸 설포메투론 내성 유전자(Casye, G.P. et al., J. Inst. Brew., 94, 93-97 (1989)), CUP1 유전자(구리 내성) (Henderson, R. C. A. et al., Current Genet., 9, 133-138(1985)), 및 CYH2 유전자(시클로헥시미드 내성)(Delgado, M. et al., EBC Congress, 23, 281-288(1991))등의 이미 알려진 약제 내성 유전자를 들 수 있다. 박테리아나 트랜스포손 등의 이종 생물체로부터 유도된 마커 유전자를 사용할 경우에는 상기한 캔디다 유틸리스에서 작용하는 프로모터와 터미네이터 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
(b)플라스미드 DNA를 삽입하기 위한 대상의 확립
상기한 바와 같이, 시클로헥시미드 내성 L41 유전자와 같은 적용가능한 선택 마커는 본 발명에 따라 구축되었기 때문에 상기한 서열 뿐만 아니라 캔디다 유틸리스로부터 유도된 다양한 서열을 목적 서열로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리보좀 RNA를 코드하는 유전자인 rRNA 유전자(rDNA), URA3 유전자, L41 유전자 및 PGK 유전자가 염색체에 플라스미드를 삽입하는데 필요한 적절한 염색체 DNA단편으로 사용되는 것이 바람직한 것을 발견하였다.
rRNA 유전자에 대하여는 100 카피 이상의 rDNA가 사카로마이세스 세리비제의 염색체 상에 세로로 1열이 되게 존재하여 그 반복 단위 중에 자율 복제 서열 (ARS)이 반복단위로 존재한다고 보고되어 있다(Saffer Miller, JR. Molec. Cell. Bio1., 6, 1148-1157(1986)). 또한, 삽입 형태의 형질전환 빈도는 rDNA영역을 플라스미드를 삽입하기 위한 대상으로 사용하여 증가시킬수 있다고 보고되었다 (Lopes, et al., Gene, 79, 199-206 (1989)).
본 발명자들은 rDNA가 캔디다 유틸리스의 염색체 상에 반복적으로 존재하는것을 발견하였다. 이는 캔디다 유틸리스의 rDNA가 삽입을 위한 목적 서열로 빈도높게 사용될 수 있음을 나타내는 것으로, 실제로 캔디다 유틸리스의 형질전환계에서 rDNA는 재조합 대상으로 유리하게 사용되었다.
흥미롭게도, rRNA 유전자, URA3 유전자, L41 유전자 또는 PGK 유전자 등의 캔디다 유틸리스의 염색체를 대상으로 하여 캔디다 유틸리스 효모를 하기한 본 발명에 따른 벡터계로 형질전환하였을 때 DNA단편이 염색체에 삽입되어 안전하게 효모에 유지되는 것이 관찰되었다. 그러므로, 이종 유전자가 자율적으로 복제하는 염색체외의 플라스미드로 유지되는 경우에 이종 유전자의 불안정성이라는 문제를 배제할 수 있다.
형질전환체에 의해 삽입된 DNA단편의 형태를 상세히 분석한 결과, DNA단편이 상동 재조합에 의해 주로 캔디다 유틸리스의 염색체로 삽입되는 것이 발견되었다. 이것은 숙주의 염색체 목적 서열에 상동성을 가지는 DNA서열을 포함하는 DNA분자는 어떠한 대상 염색체에도 삽입될 수 있음을 의미한다.
구체적으로는, DNA단편을 포함하는 벡터가 목적 서열에 상동인 DNA서열 내의 적당한 제한부위에서 분해되어 선형의 플라스미드 DNA로 될 경우 캔디다 유틸리스의 염색체 상의 어떠한 목적 서열에도 DNA단편을 조립할 수 있다. 이 경우, 선택 마커로서 시클로헥시미드 내성 L41 유전자를 사용하면 다수의 플라스미스 분자가 동시에 삽입된 형질전환체가 하기한 바와 같이 효율적으로 선별된다.
또한, 선형 DNA단편을 선택 마커가 염색체 목적 서열에 대하여 상동성을 가지는 DNA서열 내에 포함된 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 이 구현예의 형질전환에서 플라스미드는 염색체상의 상동인유전자를 치환하는 형태로 삽입된다. 따라서, 삽입된 DNA단편의 하부와 상부에서 목적 서열의 반복 서열은 생성되지 않는다. 삽입된 DNA는 매우 높은 안정성을 가질 것으로 기대된다.
또한, 본 발명은 다른 다수개의 유전자 뿐만 아니라 1세포당 2카피만이 존재하는 URA3 유전자, L41 유전자 및 PGK 유전자를 DNA단편을 삽입하기 위한 대상으로 사용할 수 있음을 보여준다. 일반적으로, 효모의 rRNA 유전자는 18S, 5.8S, 25S 및 5S의 rRNA 유전자를 포함하는 반복 DNA단위 1배체당 100 카피 이상을 포함한다 (Schweizer, E. et al., J. Mol. Biol., 40, 251-277 (1969)). 따라서, 재조합 목적 서열로서 rDNA를 이용하는 것은 (1)형질전환의 빈도가 증가할 것으로 기대되고 (2)삽입에 의한 목적 서열 내의 변화가 무시될 수 있다는 점에서 다른 유전자 서열을 이용하는 것보다 유리하다. 본 발명자들은 rRNA 유전자가 캔디다 유틸리스에서 약 13.5kb DNA서열의 반복 단위 내에 세로로 반복적으로 존재하며(이하에 상세히 기재), 세포당 2카피를 가지는 L41 유전자를 대상으로 하는 경우와 비교하여 재조합 목적 서열로 rDNA 서열을 사용하여 형질전환 빈도를 10 내지 약 50배 증가시키는 것을 발견하였다. 또한, rDNA 위치의 DNA단편은 높은 안정성을 가지면 rDNA 서열은 삽입을 위한 우수한 대상임을 알았다.
본 발명에서 DNA단편을 삽입하기 위한 목적 서열로서 rDNA서열을 사용하는 것은 형질전환 빈도를 증가시키는 효과를 유발하고 시험된 효모의 처리 조건중에서 적당한 형질전환 조건을 발견하는데 중요한 역할을 한다. 그러나, 흥미롭게도 rDNA 영역의 일부가 형질전환의 대상으로 사용될 경우 형질전환의 빈도가 급격히감소되는 것을 발견하였다. 이것은 어떠한 rDNA단편도 항상 플라스미드를 효율적으로 삽입하기 위한 대상으로 사용될 수는 없음을 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 다수개의 플라스미드가 삽입된 형질전환체는 선택 마커로서 시클로헥시미드 내성 L41 유전자를 사용하여 효율적으로 제조할 수 있다. 그 이유는 다음과 같이 생각된다. 내인성 시클로헥시미드 감수성 L41 단백질은 시클로헥시미드 내성 L41 유전자를 포함하는 DNA단편의 다수개의 카피가 삽입될 경우에만 해당 내성 단백질에 의해 치환된다. 그리고 나서, 시클로헥시미드에 의해 작용이 억제되지 않는 리보좀 분자 비율이 증가된다. 따라서, 형질전환체는 시클로헥시미드를 포함하는 배지에서 성장할 수 있는 것이다. 이 경우에 삽입을 위한 대상 부위로는 기본적으로 URA3 유전자 위치, L41 유전자 위치 등의 캔디다 유틸리스의 염색체로부터 유도된 DNA 서열 중 하나를 사용할 수 있다. 이것은 또한 흥미롭게도 목적 서열이 기타 유전자 부위인 경우와 비교하였을 때, 특히 rRNA 유전자 위치를 삽입을 위한 목적 서열로 사용하여 다수의 DNA단편이 삽입되는 경향이 있음을 나타낸다.
(c)형질전환 방법
세포외 DNA를 쉽게 얻을 수 있는 숙주 세포를 제조하는 형질전환 방법으로는, 프로토플라스트 방법, 리튬 아세테이트 방법, 전기 펄스 방법 및 이들을 변형한 방법과 같은 사카로마이세스 세리비제에 대한 일반적인 형질전환방법이 이용될 수 있다. 프로토플라스트 방법이 널리 이용되지만 조작이 다소 복잡하고 약제 내성에 기초한 형질전환체의 선별에 있어서 비형질전환체로서 바탕 콜로니가 발생하는 문제가 있다.
본 발명자들은 시클로헥시미드 내성 L41 유전자와 상기한 rDNA단편을 조합한 플라스미드로 캔디다 유틸리스의 형질전환을 시도하기 위하여 리튬 아세테이트 방법과 전기 펄스법을 이용하여 형질전환체를 재현성 있게 얻을 수 있는 조건을 발견하였다.
형질전환은 전기 펄스법에 의해 실시되는 것이 바람직하다. 미생물 세포를 대수증식기까지 성장시킨후, 세척하여 1M 소르비톨에 현탁하였다. 전기 펄스 조건은 시간 상수값(전압을 최대값의 약 37까지 감소하는 동안의 시간)을 약 10 내지 20밀리세컨드로 하고 펄스 후 생존하는 세포율을 약 10 내지 40로 하였다. 예를들어, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기한 시간 상수값과 생존 세포율은 25㎌의 전기 용량, 600 내지 1000Ω의 저항 및 3.75 내지 5㎸/㎝의 전압의 조건하에서 얻어졌고, DNA 1㎍당 약 500 내지 1,400의 형질전환체를 얻었다.
전기 펄스를 가한후, 1M 소르비톨을 포함하는 YPD 배지를 균액에 첨가하여 이 혼합물을 진탕배양하는 것이 바람직한 것을 발견하였다. 또한, 배양하지 않은 균주를 직접 시클로헥시미드를 포함하는 선택 플레이트에 도포하면 어떤 경우에는 콜로니가 얻어지지 않았다. 배양시간은 약 4 내지 6시간이 적당하고 균주가 더 배양될 경우 형질전환체의 증식을 무시할 수 없게 될 수 있다. 또한, DNA와 균주 세포가 접촉할 때 연어 정액 DNA와 같은 캐리어 DNA를 첨가하거나 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 형질전환 빈도를 증가시키는 것이 본 발명에 따른 형질전환에 바람직하였다.
리튬 아세테이트 방법(Ito et al., J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983))은 그 간편성과 용이성 때문에 사카로마이세스속 효모의 형질전환에 주로 사용되었고, 이 방법의 다양한 변형이 알려져 있다. 본 발명자들은 이 방법으로 캔디다 유틸리스를 형질전환할 수 있는지 확인하였다. 구체적으로는, 에탄올을 첨가하는 변형된 리튬 방법(Soni et al., Current Genet., 24, 455-459 (1993))으로 캔디다 유틸리스를 형질전환하는 것이 바람직하였다. 균주를 수집할 때의 세포 밀도, 리튬 농도, 폴리에틸렌 글리콜의 종류와 농도 및, 담체 DNA의 종류, 형태 또는 양 등의 상이한 조건을 이용하여 리튬 아세테이트 방법에 의한 캔디다 유틸리스의 형질전환을 위한 최적 조건을 결정할 수 있고 형질전환 빈도를 증가시킬 수 있다. (a)본 발명에 따른 선택 마커 유전자와 (b)삽입 대상이 정의되었기 때문에 상기한 방법은 당업자에 의해 예측될 수 있다.
본 발명자들은 사카로마이세스 세리비제에서 작용하는 캔디다 유틸리스로부터 유도된 8개의 ARS 서열과 사카로마이세스 세리비제에서 작용하는 G418 내성 유전자 발현 유니트를 조합한 플라스미드로 형질전환을 시도하였으나, 형질전환체는 얻어지지 않았다. 그 결과, Ho 등에 의해 기재된 캔디다 유틸리스의 형질전환 방법(Ho, N.W.Y. et al.)의 재현성은 불확실하다고 할 수 있다.
발현 벡터계와 이종 유전자의 발현
본 발명에 따르면, 캔디다 유틸리스의 형질전환에 사용될 수 있는 발현계가 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예는 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA에 상동인 서열(이하, "상동 DNA 서열"이라 함)을 포함하고, 이 부위에서 상동 재조합에 의해 염색체 내로 플라스미드 DNA를 삽입되게 할 수 있고, 또한 형질전환체 선별을 위한 선택 마커를 포함하는 플라스미드 DNA이다.
바람직하게는 상동 DNA 서열은 rRNA 유전자, URA3 유전자, L41 유전자, PGK 유전자, GAP 유전자 및 PMA 유전자이며, 이들은 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA에서 유도되는 것이 바람직하다. 사용되는 서열에 따라 염색체의 원하는 위치에 이종 유전자를 삽입할 수 있다. 플라스미드는 플라스미드 분자의 상동 DNA 서열 내에서 적당한 제한 부위에서의 분해에 의해 선형 형태로 사용된다. 그 결과, 플라스미드 DNA단편은 상동 재조합에 의해 캔디다 유틸리스의 염색체로 삽입된다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 플라스미드 DNA 내에 마커 유전자와 이종 유전자를 포함하는 DNA 서열은 상동 DNA 서열 간의 양쪽 말단에 삽입된다. 이 경우에서는, 플라스미드 DNA를 제한 효소로 상동 DNA 서열에서 절단하여 그 단편의 양 말단에 마커 유전자, 이종 유전자 및 상동 DNA 서열을 포함하는 DNA단편을 얻는다. 이렇게 얻어진 DNA 단편은 상동 재조합에 의해 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA로 삽입될 수 있다.
상기에서, "얻어진 DNA 단편이 상동 재조합에 의해 캔디다 유틸리스의 염색체에 삽입된다"는 것은, DNA 단편이 캔디다 유틸리스의 염색체에 삽입되는 한 삽입에 대한 그 구현예는 제한되지 않지만 적어도 다음과 같은 2개의 구현예를 포함한다는 의미이다. 즉, (1)캔디다 유틸리스 염색체의 DNA서열과 DNA단편의 양 말단에 있는 상동 DNA서열 부분의 상동 재조합을 유발하여 분해된 부분에 DNA단편이 "삽입"된 염색체 DNA내에 조립하는 구현예, 또는 (2)캔디다 유틸리스 염색체의 DNA서열과, 플라스미드 DNA단편의 양 말단에 제공된 상동 DNA서열과의 상동 재조합에 의해 플라스미드 DNA단편으로 캔디다 유틸리스 염색체 일부를 "치환"하여 염색체 DNA에 삽입되는 구현예를 일컫는다. 구현예(2)에 있어서, 목적 서열의 반복 서열은 삽입된 양 말단에 생성되지 않기 때문에 조립된 DNA단편은 안정하게 염색체 내에 존재할 것으로 기대된다.
선택 마커 유전자로는 상기한 약제 내성 마커를 사용하는 것이 바람직한데, 더욱 바람직한 약제 내성 마커로는 시클로헥시미드 내성 L41 유전자와 같이 시클로헥시미드에 대한 내성을 줄 수 있는 유전자, 박테리아 트랜스포손 Tn903에서 유도된 APT유전자와 같은 항생물질 G418에 대한 내성을 주는 유전자 및 항생물질 하이그로마이신 B 내성 유전자 등이 있다. 선택 마커 유전자를 미생물로부터 유도할 경우, 발현을 확실히 하기 위해 캔디다 유틸리스에서 작용하는 프로모터에 선택 마커 유전자를 결찰하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 구현예에 따른 벡터는 캔디다 유틸리스 염색체 DNA와 상동인 서열(상동 DNA서열)을 포함하고, 이 부분에서 상동 재조합에 의해 플라스미드 DNA를 염색체에 조립할 수 있으나, 형질전환체 선별을 위한 선택 마커를 갖지 않는 플라스미드 DNA이다. 플라스미드 분자의 상동 DNA서열 내에서 적당한 제한 부위에서의 분해에 의해 플라스미드는 선형으로 이용된다.
상기한 구현예의 플라스미드에 있어서는, 플라스미드를 구성하여 이종 유전자를 포함하는 DNA서열을 상동 DNA서열 사이의 양 말단에 삽입한다. 양 말단에 상동 DNA서열을 가지는 DNA단편은 제한 효소르 상동 DNA서열에서 플라스미드 DNA를 절단하여 얻어진다. 이 DNA단편은 상동 재조합에 의해 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA에 조립된다.
선형의 DNA단편은 마커 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 경우와 마찬가지로 상동 재조합에 의해 캔디다 유틸리스의 염색체 내에 조립된다. 또한, 상기한 구현예의 플라스미드에 있어서는 조립된 DNA단편이 상기한 구현예(2)에 따른 조립에 의해 염색체 내에 안정하게 존재할 것으로 기대된다.
상동 DNA서열로는 바람직하게는 rRNA 유전자, URA3 유전자, L41 유전자, PGK 유전자, GAP 유전자 및 PMA 유전자 등이 있다. 상기한 유전자들은 바람직하게는 캔디다 유틸리스 염색체 DNA에서 유도된다. 또한, 이용된 서열에 따라 염색체 상에서 원하는 부분에 외래 DNA단편을 조립할 수 있다.
상기 벡터는 하기한 자율 복제 서열을 포함하는 DNA서열과 선택 마커 유전자를 가지는 플라스미드를 이용한 동시 형질전환에 이용된다. 삽입된 자율 복제 플라스미드를 가지게 하여 선별된 형질전환체 중에서 염색체 내에 선택 마커 유전자가 없는 DNA단편이 조립된 균주를 2차적으로 선별할 수 있다. 선별된 균주 내에 존재하는 플라스미드는 비선택 조건하에서 균주를 배양하여 제거할 수 있다. 그 결과, 염색체 상에 삽입된 DNA단편 만이 유지된 균주를 얻을 수 있다. 이러한 방법으로, 예를들면 이종 유전자만을 유지하고 미생물에서 유도된 약제 내성 유전자와 같은 여분의 서열이 없는 균주를 성장시킬 수 있다.
또한, 자율 복제 서열을 포함하는 DNA서열과 선택 마커 유전자로 이루어진 플라스미드는 캔디다 유틸리스의 형질전환 벡터로 사용될 수 있다. 이 플라스미드는 비선택 조건하에서 박테리아를 배양하므로써 제거되는 경향이 있으나, 하기한 바와 같이 안정성을 증가시키기 위한 DNA단편이 얻어지므로 플라스미드는 DNA단편과의 조합에 벡터로서 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터를 이종 유전자와 결합하여 이종 유전자를 가지는 벡터를 형성할 수 있다. 이 벡터로 캔디다 유틸리스를 형질전환하여 이종 유전자를 캔디다 유틸리스를 형질전환하여 이종 유전자를 캔디다 유틸리스 염색체에 안정하게 조립시킬 수 있다. 이렇게 얻어진 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하여 배양물을 얻고 이종 유전자의 발현 생성물을 단리하여 발현 생성물에 적당한 방법에 의해 정제한다. 즉, 이종 유전자를 캔디다 유틸리스에서 발현할 수 있다. 캔디다 유틸리스에서 이종 유전자를 발현하는 방법이 제공된다. 여기에서, 이종 유전자란 일반적으로 숙주인 캔디다 유틸리스의 염색체상에 원래 존재하지 않는 유전자 또는 그의 일부인 DNA를 의미한다.
이종 유전자는, 바람직하게는 이종 유전자의 발현을 독립적으로 조절하는 조절 영역과 결합하거나, 또는 형질전환 과정에서 파괴되는 유전자의 조절 영역 영향하에서 이종 유전자를 발현한다. 이러한 서열은 캔디다 유틸리스에서 작용하여야 하고, 바람직하게는 예를들면 하기한 본 발명에 따른 PGK 유전자, GAP 유전자, PMA 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열, 및 하기한 프로모터를 클로닝하기 위한 벡터에 의해 얻어진 프로모터 활성을 가지는 DNA서열등이 있다.
하기한 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 글루코아밀라제 유전자, 아미노글리시코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자, β-갈락토시다제 유전자 또는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 등의 이종유전자는 본 발명에 따른 포스포글리세레이트 카이네이즈 유전자의 프로모터 서열과 터미네이터 서열을 이용하여 성공적으로 발현되었다. 또한, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자는 원형질막 프로톤 ATP아제 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열뿐만 아니라 글리세로알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열을 이용하여 성공적으로 발현되었다. 이러한 이종 단백질 중에서 글루코아밀라제는 분비 단백질이며 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제와 β-갈락토시다제는 균체내 효소이다. 이것은 균체내 효소나 분비 단백질 중 어떠한 이종 단밸직도 캔디다 유틸리스에서 제조될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 글루코아미라제는 고농도로 분비, 발현되므로, 캔디다 유틸리스가 이종 단백질을 다량 제조하는 우수한 숙주라고 말할 수 있다.
Candida maltosa, 또는Candida albicans등의 캔디다속 중 일부는 코돈의 일부를 다른 생물과는 상이한 방법으로 번역한다고 보고되었다(Ohama et al., Nucleic Acids Res., 21, 4039-4045 (1993)). 이것은 숙주인Candida maltosa에서 발현된E.coli로부터 유도된 β-갈락토시다제 유전자의 발현 생성물이 활성을 나타내지 않았기 때문이라고 생각된다. 하기한 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 캔디다 유틸리스에서 제조된,E.coli로부터 유도된 β-갈락토시다제 유전자는 그 활성을 유지하였다. 이것은 캔디다 유틸리스가 정상 코돈을 인지하며 캔디다 유틸리스가 이종 폴리펩티드를 제조하는 바람직한 숙주임을 나타낸다.
또한, 캔디다 유틸리스에서 이종 유전자를 발현하여 캔디다 유틸리스의 성질을 변성할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따르면 신규한 캔디다 유틸리스를 제조하는 방법이 제공된다. 예를들면, 그 산업적 이용성을 증가시키기 위해 캔디다 유틸리스의 발효특성을 개선할 수 있다. 특히, 글루코아밀라제 유전자를 발현하기 위해 변성된 캔디다 유틸리스는 더 확대된 전분 분해능을 갖게 되는데, 즉 그의 탄소원역이 확장된다.
본 발명에 따른 벡터는 캔디다 유틸리스 이외의 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 캔디다 유틸리스 이외의 세포를 숙주로 할 경우, 실제 형질전환에 적당한 DNA단편을 선별하는 것이 바람직하다. 이 DNA단편으로는, 예를들면E.coli경우에 pBluescript 또는 pUC19 등의 박테리아 플라스미드 DNA가 있다. 사카로마이세스속 효모의 경우에 상기 DNA단편으로는 YEp13 또는 YCp50(Methods in Enzymology, 194, 195-230, Academic Press(1991))등의 효모-E.coli셔틀 벡터가 있다.
캔디다 유틸리스 효모에서 자율 복제능을 가지는 DNA서열의 클로닝방법
본 발명에 따르면, 캔디다 유틸리스에서 자율 복제능을 가지는 DNA서열의 클로닝 방법이 제공된다. 사용되는 DNA는 다른 어떠한 생물에서도 유도될 수 있는데, 바람직하게는 캔디다 유틸리스에서 유도된다. 이 방법을 위한 벡터로는 약제 내성 마커 유전자를 포함하는 벡터가 사용될 수 있는데, 바람직한 예로는 캔디다 유틸리스에서 작용하는 프로모터와 터미네이터에 의해 발현된 G418 내성 유전자인 APT유전자를 포함하는 벡터가 있다. 구체적으로는, PGK 유전자 프로모터에 의해 발현된 APT 유전자를 가지는 플라스미드를 벡터로 사용하여 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA라이브러리를 제조하고 캔디다 유틸리스는 이 라이브러리 DNA로 형질전환된다. 전체 DNA는 G418에 대한 내성에 기초하여 선별된 형질전환 효모로부터 추출된다.E.coli는 이 DNA로 형질전환되므로 염색체외 인자로 형질전환 효모 내에 존재하는 플라스미드 DNA를 회수할 수 있다. 자율 복제 서열(ARS)인 작용 서열은 플라스미드 DNA에 삽입된 캔디다 유틸리스로부터 유도된 염색체 DNA단편으로부터 단리된다.
놀라웁게도, 약제에 대한 내성 마커로서 시클로헥시미드 내성 L41 유전자를 포함하는 플라스미드를 벡터로 사용할 경우 자율 복제능을 가지는 어떠한 DNA서열도 복제될 수 있다. 다시 말하면, 이 플라스미드가 캔디다 유틸리스 염색체 DNA라이브러리를 제조하기 위해 사용되어 캔디다 유틸리스가 이 라이브러리 DNA로 형질전환되는 경우에 조차도 시클로헥시미드 내성 형질전환체는 얻어지지 않았다. 이는 캔디다 유틸리스의 ARS가 이것을 포함하는 플라스미드의 세포 당 낮은 수의 카피를 필요로 하는 시클로헥시미드 내성 L41 유전자와 결합하는 경우일지라도 형질전환체가 선별될수 없음을 나타낸다. 또한, 이것은 이렇게 얻어진 ARS와 시클로헥시미드 내성 L41 유전자를 포함하는 플라스미드로 캔디다 유틸리스를 형질전환하여서도 어떠한 형질전환체도 얻어지지 않은 사실로부터 확인되었다. 하기한 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 분리된 ARS를 포함하는 DNA서열의 성질을 상세히 분석하여 ARS를 포함하는 플라스미드가 캔디다 유틸리스에서 세포당 약 1 카피만 존재하는 것이 확인되었다. 또한, 이렇게 분리된 ARS는 이것을 포함하는 플라스미드가 불안정한 특징을 가진다. 캔디다 유틸리스를 비선택 조건하에서 약 2.5 내지 3,5세대동안 서브배양하였을 때, 상기 플라스미드를 포함하는 박테리아의 비율은 전체 박테리아 수의 20 내지 30%로 낮아졌다.
캔디다 유틸리스에서 프로모터 활성을 가지는 DNA서열을 분리하는 방법
캔디다 유틸리스 내에서 전사 프로모터 활성을 가지는 DNA서열을 클로닝하는 방법은 상기한 자율 복제능을 가지는 DNA서열을 이용하여 제공된다. 이러한 벡터로는, 자율 복제능을 가지는 DNA서열 이외에 전사에 대한 프로모터 서열이 없는 약제 내성 마커 유전자를 사용할 수 있다. G418 내성 유전자인 APT 유전자를 포함하는 벡터를 사용할 수 있다. 사용된 DNA는 모든 생물체에서 유도될 수 있는데, 바람직하기로는 캔디다 유틸리스에서 유도된다. 또한, 이 DNA를 변환하기 위한 라이브러리는 제한 효소 또는 DNA아제를 이용한 효소처리, 또는 초음파를 이용한 기계적 전단에 의해 제조하는 것이 필요하다. 바람직하기로는, 4 염기를 인식할 수 있고 둔단을 생성하는 AluⅠ, HaeⅢ 및 RsaⅠ의 3개 효소의 조합물을 염색체 DNA의 부분 분해에 사용한다. 상기한 효소 조합물을 이용하여 더 많은 염색체 영역이 라이브러리에서 클론된다.
더욱 구체적으로는, 캔디다 유틸리스 염색체 DNA라이브러리는 상기한 제한 효소로 부분적으로 분해된 약 0.8 내지 1.8kb의 DNA단편이 프로모터 서열이 없는 APT 유전자의 5' 쪽에 결합되는 종래의 방법에 의해 제조된다. 캔디다 유틸리스는 이 라이브러리 DNA에 의해 형질전환된다. 프로모터 활성을 가지는 DNA서열이 APT 유전자의 바로 앞에서 클론된 플라스미드를 이용하여 형질전환된 효모는 G418 내성을 나타낸다. 그러므로, 전체 DNA를 G418 내성형질전환체에서 추출하여E.coli를 형질전환하여 프로모터 활성을 가지는 DNA서열을 효율적으로 분리한다. 이 경우, 플레이트에 포함된 G418의 농도을 증가시키거나, 또는 플레이트 상에서 비교적 큰 콜로니를 형성하는 균주를 선별하여 더 높은 전사 활성을 가지는 프로모터 서열을 단리할 수 있다. 상기한 바와 같이 캔디다 유틸리스 내에서 ARS를 포함하는 플라스미드의 카피 수는 1 정도이기 때문에 높은 활성을 가지는 프로모터 서열을 분리하는데 있어서 본 발명에 따른 방법이 유리하다.
캔디다 유틸리스 중의 기타 작용 유전자를 단리하는 방법
캔디다 유틸리스에서 프로모터 활성을 가지는 DNA를 분리하는 본 발명에 따른 방법은 또한 ARS를 포함하는 플라스미드의 안정성을 개선하는 작용을 가지는 DNA서열을 단리하는 방법을 제공한다. 캔디다 유틸리스 내의 ARS를 포함하는 플라스미드의 존재 형태는 낮은 안정성을 가지며, 비선택 조건하의 3 내지 4세대 동안의 서브배양에서 플라스미드를 보유하는 세포가 전체 세포의 20 내지 30%로 감소되는 것을 특징으로 한다. 그러므로, 선택 약제를 포함하는 플레이트에서, 약제 내성 ARS 플라스미드를 보유하는 균주는 약제 내성 유전자가 염색체 상에 조립된 균주와 비교하여 세포당 카피수가 동일하여도 약간 더 작은 콜로니를 형성한다. 본 발명에 있어서, 비교적 큰 콜로니를 형성하는 균주는 높은 활성을 가지는 프로모터 서열을 분리하기 위해 선별되므로, 하기한 실시예에 기재된 바와 같이 프로모터 활성을 가지는 분리된 DNA의 일부는 플라스미드의 안정성을 개선할 수 있는 작용을 가진다. 이 분야의 사람들이라면 이러한 형질전환계를 이용하여 동원체 서열등의 다양한 작용을 가지는 DNA서열을 얻을 수 있음을 예측할 수 있을 것이다.
약제 내성 마커 유전자가 없는 형질전환체의 제조방법
약제 내성 마커 유전자가 없는 형질전환체를 제조하는 또다른 방법은 본 발명에 따른 자율 복제능을 가지는 상기한 DNA서열을 이용하여 제공된다. 구체적으로, 약제 내성 마커 유전자가 없는 형질전환체는 다음 방법에 의해 얻어질 수 있다. 먼저, 형질전환체를 선별하기 위한 선택 마커 유전자가 없고 염색체 DNA(상동 DNA서열)에 상동인 서열을 포함하는 플라스미드 DNA는 상기 상동 DNA서열 내의 적당한 제한 효소부위에서 선형으로 분해된다. 얻어진 선형 플라스미드 DNA는 캔디다 유틸리스 염색체의 상동 DNA서열상에 조립될 수 있다. 이 선형 플라스미드 DNA는 ARS를 포함하는 DNA서열과 효모의 형질전환을 위한 선택 마커 유전자를 가지는 플라스미드와 함께 사용된다. 다음으로 ARS를 포함하는 플라스미드를 삽입하여 선별된 형질전환체 중에서, 동시에 형질전환에 이용되는 DNA단편이 염색체에 조립된 균주는 DNA내에 포함된 이종 유전자의 발현을 시도하거나, 또는 PCR 또는 써던분석에 의한 DNA단편의 삽입을 확인하여 선별된다. 또한, 선별된 균주 내에 존재하는 자율적으로 복제되는 플라스미드는 비선택 조건하에서 박테리아를 배양하여 용이하게 제거될 수 있다. 그러므로, 선택 마커 유전자가 없고 염색체 상에 삽입된 DNA단편만이 있는 균주를 얻을 수 있다.
캔디다 유틸리스 염색체의 부위 특이적 돌연변이
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 캔디다 유틸리스 염색체의 부위 특이적돌연변이가 제공된다. 이 방법에 있어서는, 선택 마커 유전자가 목적 유전자에 삽입되어 그 작용을 상실한 유전자 단편화 카세트를 염색체 목적 유전자의 치환체로 이용한다. 이 카세트는 그 양쪽 말단에 염색체 목적 유전자에 상동인 DNA서열 (상동 DNA서열)과 이들 사이에 1 이상의 선택 마커 유전자를 포함하는 선형 DNA구조를 가진다. 삽입될 수 있는 DNA단편이 염색체에서와 같은 방향을 가지는 것이 중요하다. 효모를 이 카세트로 형질전환할 경우, 그 양 말단에 존재하는 삽입가능한 마커 유전자와 DNA서열은 숙주에 조립된다. 형질전환의 결과, 조립 부위의 목적 유전자는 분해되어 신규한 특성을 가지는 효모균주가 얻어진다. 선택 마커 유전자로는 약제 내성 유전자가 바람직하고, 이 유전자가 분해된 형질전환체는 약제에 대한 내성에 의해 선별될 수 있다. 이 유전자 변성의 대상일 수 있는 유전자는 캔디다 유틸리스 염색체에서 유도된 유전자가 바람직하다. 구체적으로는, URAR3, ADE1, ADE2, 또는 HIS4 유전자가 있으나, 여기에 제한되지는 않는다.
예를들면, 캔디다 유틸리스 URA3를 시클로헥시미드 내성 L41 유전자 등의 선택 마커 유전자에 의해 분절하여 그 작용을 중지시켜서 형질전환에 사용한다. 이렇게 얻어진 시클로헥시미드 내성 형질전환체는 염색체 상에 2개의 URA3 유전자를 가지며 이 2개 유전자중 하나는 분해된다. 또한, URA3 유전자 2개가 모두 분해된 균주는 URA3 유전자 중 하나가 G418 내성 유전자와 같은 다른 선택 마커 유전자로 분절된 URA3 유전자 단편으로 분해된 균주를 형질전환하여 얻어진다. ura3 변이주는 우라실 생합성의 중간체의 독성 유사체인 5-플루오로트산(5-FOA)에 내성을 가지게 된다고 알려져 있다. 따라서, 2개 모두 그 작용을 상실한 URA3 유전자를 가지며 2개의 URA3 유전자 중 하나가 분해된 균주의 유전자 치환에 의해 얻어진 ura3변이주를 5-FOA 내성 균주로서 얻을 수 있다. 이 ura3 변이주를 숙주로서 이용하여 약제 내성 유전자 마커가 아닌 선택 마커 유전자로서 URA3 유전자를 가지는 형질전환체를 얻을 수 있다. 또한, 이렇게 하여 얻어진 영양요구성 변이주는 화학적 돌연변이법에 의해 제조된 균주와는 달리 기타 유전자 위치에서 발생할 수 있는 2차 돌연변이의 영향을 거의 받지 않는 이점이 있다.
L41 유전자
본 발명에 따르면, 캔디다 유틸리스의 리보좀 단백질 L41, 이것을 코드하는 유전자, 및 그의 프로모터와 터미네이터 시퀀스가 제공된다.
본 발명에 따른 캔디다 유틸리스 L41 단백질은 도 14(서열번호 6)에 기재된 아미노산 서열을 가진다. 그러므로, 본 발명에 따른 L41 유전자는 도 14에 기재된 아미노산 서열을 코드한다. 또한, 이 유전자와 그 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함하는 구체적인 DNA서열을 도 13(서열번호 5)에 기재하였다.
또한, 본 발명에 따르면 56번째 아미노산 잔기가 프롤린에서 글루타민으로 변환된 돌연변이 L41 유전자를 코드하는 시클로헥시미드 내성 L41 단백질이 제공된다. 시클로헥시미드 내성 L41 유전자는 캔디다 유틸리스의 형질전환을 위한 선택 마커로서 뿐만 아니라 사카로마이세스속의 효모 등과 같은 다른 효모의 형질전환을 위한 선택 마커 유전자로 사용될수 있다. 또한, 이 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열을 이종 유전자의 발현에 사용할 수 있음은 의심의 여지가 없다.
PGK 유전자
본 발명에 따르면 PGK 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열이 제공된다.
이 프로모터 서열의 구체적인 예로는 도 3(서열번호 2)에 기재된 946 내지 1346 뉴클레오티드의 DNA서열과 프로모터 활성을 가지는 그의 부분 서열을 들 수 있다.
상기 터미네이터 서열의 바람직한 구체예로는 도 2(서열번호 1)에 기재된 DNA서열과 터미네이터 활성을 가지는 그의 부분 서열을 들 수 있다.
캔디다 유틸리스에서 사용될 수 있는 발현 벡터는 이 프로모터와 터미네이터 서열을 적당한 플라스미드 벡터에 삽입하여 얻어진다. 플라스미드 벡터의 예로는, pBluescript 및 pUC19 등의 종래의 E.coli플라스미드와, 시클로헥시미드 내성 L41 유전자 등의 선택 마커 유전자와 필요하다면 염색체 목적 유전자에 상동인 DNA서열을 포함하는 효모-E.coli셔틀 플라스미드를 들 수 있다. 이 분야의 사람들이라면 이러한 서열이 다른 숙주 세포, 특히 사카로마이세스속의 효모에서 프로모터 또는 터미네이터로 사용될 수 있음을 예측할 수 있을 것이다.
PGK 유전자는 해당(解糖)과정의 효소를 코드하는 유전자이며 캔디다 유틸리스에서 해당 과정의 효소를 코드하는 기타 유전자와 함께 다량으로 발현된다. 하기한 실시예에서는 제조된 발현벡터를 이용하여 이 프로모터를 글루코아밀라제 유전자, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 또는 β-갈락토시다제 유전자 등의 이종 유전자의 발현에서 유리하게 사용할 수 있는 것으로 나타났다.
또한, 이 분야에 숙련된 사람들에게는 본 발명에 따른 PGK 유전자 프로모터와 터미네이터 서열에 결합된 유전자의 발현량이 감소되지 않으면 이 발현 벡터는 상기 서열의 일부를 결손시켜 소형화할 수 있다는 것은 자명한 것이다.
GAP 유전자
본 발명에 따르면, GAP 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열이 제공된다.
이 프로모터 서열의 구체적인 예로는 도 30(서열번호 7)에 기재된 DNA서열과 프로모터 활성을 가지는 그의 부분서열을 들수 있다.
상기 터미네이터 서열의 바람직한 구체예로는 도 31(서열번호 8)에 기재된 염기 서열과 터미네이터 활성을 가지는 그의 부분서열을 들수 있다.
캔디다 유틸리스에서 사용될 수 있는 발현 벡터는 이 프로모터와 터미네이터 서열을 적당한 플라스미드 벡터에 삽입하여 얻어진다. 플라스미드 벡터의 예로는, pBluescript 및 pUC19 등의 종래의E.coli플라스미드와, 시클로헥시미드 내성 L41 유전자 등의 선택 마커 유전자와 필요하다면 염색체 목적 유전자에 상동인 DNA서열을 포함하는 효모-E.coli셔틀 플라스미드를 들수 있다. 이 분야의 사람들이라면 이러한 서열이 다른 숙주 세포, 특히 사카로마이세스속의 효모에서 프로모터 또는 터미네이터로 사용될 수 있음을 예측할 수 있을 것이다.
GAP 유전자는 해당 과정의 효소를 코드하는 유전자이며 캔디다 유틸리스에서 해당 과정의 효소를 코드하는 기타 유전자와 함께 다량으로 발현된다. 따라서, 강력한 프로모터를 가질 것으로 기대된다. 하기한 실시예에서는 제조된 발현 벡터를 이용하여 이 프로모터를 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 등의 이종 유전자의 발현에서 유리하게 사용할 수 있는 것으로 나타났다.
또한, 이 분야에 숙련된 사람들에게는 본 발명에 따른 GAP 유전자 프로모터와 터미네이터 서열에 결합된 유전자의 발현량이 감소되지 않으면 이 발현 벡터는 상기 서열의 일부를 결손시켜 소형화할 수 있다는 것은 자명한 것이다.
PMA 유전자
본 발명에 따르면, PMA 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열이 제공된다.
이 프로모터 서열의 구체적인 예로는 도 34(서열번호 9)에 기재된 DNA서열과 프로모터 활성을 가지는 그의 부분 서열을 들수 있다.
상기 터미네이터 서열의 바람직한 구체예로는 도 35(서열번호 10)에 기재된 DNA서열과 터미네이터 활성을 가지는 그의 부분 서열을 들 수 있다.
캔디다 유틸리스에서 사용될 수 있는 발현 벡터는 이 프로모터와 터미네이터 서열을 적당한 플라스미드 벡터에 삽입하여 얻어진다. 플라스미드 벡터의 예로는, pBluescript 및 pUC19 등의 종래의E.coli플라스미드와, 시클로헥시미드 내성 L41 유전자 등의 선택 마커 유전자와 필요하다면 염색체 목적 유전자에 상동인 DNA서열을 포함하는 효모-E.coli셔틀 플라스미드를 들 수 있다. 이 분야의 사람들이라면 이러한 서열이 다른 숙주 세포, 특히 사카로마이세스속의 효모에서 프로모터 또는 터미네이터로 사용될 수 있음을 예측할 수 있을 것이다.
PMA 유전자는 원형질막 효소를 코드하는 유전자이며 사카로마이세스속 호모에서는 원형질막 단백질의 약 10%를 이루는 주요 단백질인 것으로 알려져 있다. 그러므로, PMA 유전자가 강력한 프로모터를 가질 것으로 기대된다. 하기한 실시예에서는 제조된 발현 벡터를 이용하여 이 프로모터를 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 등의 이종 유전자의 발현에서 유리하게 사용할 수 있는 것으로 나타났다.
또한, 이 분야에 숙련된 사람들에게는 본 발명에 따른 PMA 유전자 프로모터와 터미네이터 서열에 결합된 유전자의 발현량이 감소되지 않으면 이 발현 벡터는 상기 서열의 일부를 결손시켜 소형화할 수 있다는 것은 자명한 것이다.
프로모터 활성을 가지는 DNA서열
본 발명에 따르면, 프로모터 활성을 가지는 DNA서열이 제공된다. 이 DNA서열은 자율적으로 복제될 수 있는 DNA서열과 전사 프로모터 서열을 가지지 않는 약제 내성 마커 유전자로 이루어진 벡터를 이용하여 단리된다. 프로모터 활성을 가지는 DNA서열의 구체적인 예로는 바람직하게는 도 48(서열번호 13)에 기재된 DNA서열과 프로모터 활성을 가지는 그의 부분 서열을 들수 있다. 또한, 하기한 실시예에 기재된 바와 같이, 프로모터 활성을 가지는 도 48의 DNA서열 이외에 8개의 DNA서열이 얻어졌다. 또한, 프로모터 활성을 가지는 DNA서열은 전사 프로모터 서열을 가지지 않는 약제 내성 유전자를 하이그로마아신 B 내성 유전자 등의 기타 유전자로 치환하여 단리될 수 있다. 또한, 형질전환체를 선별하기 위한 플레이트에 포함된 당 또는 기타 배지 성분 등의 선별 조건을 변화하여 특이적 조건하에서 전사 활성이 유도된 프로모터를 얻을 수 있다. 상기한 바는 이 분야의 사람들이라면 본 발명을 참조하여 쉽게 이해될 수 있는 것이다.
캔디다 유틸리스에서 사용될 수 있는 발현 벡터는 이 프로모터와 터미네이터 서열을 적당한 플라스미드 벡터에 삽입하여 얻어진다. 플라스미드 벡터의 예로는, pBluescript 및 pUC19 등의 종래의E.coli플라스미드와, 시클로헥시미드 내성 L41 유전자 등의 선택 마커 유전자와 필요하다면 염색체 목적 유전자에 상동인 DNA서열을 포함하는 효모-E.coli셔틀 플라스미드를 들 수 있다. 이 분야의 사람들이라면 이러한 서열이 다른 숙주 세포, 특히 사카로마이세스속의 효모에서 프로모터 또는 터미네이터로 사용될 수 있음을 예측할 수 있을 것이다.
하기한 실시예에서는 제조된 발현 벡터를 이용하여 이 프로모터를 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 등의 이종 유전자의 발현에서 유리하게 사용할 수 있다는 것이 증명되었다.
또한, 이 분야에 숙련된 사람들에게는 본 발명에 따른 프로모터 서열에 결합된 유전자의 발현량이 감소되지 않으면 이 발현 벡터는 상기 서열의 일부를 결손시켜 소형화할 수 있다는 것은 자명한 것이다.
rRNA 유전자
본 발명에 따르면, 캔디다 유틸리스의 rRNA 유전자를 포함하는 약 13.5kb의 DNA단편과 이 단편의 반복 단위를 포함하는 DNA서열이 제공된다.
약 13.5kb의 이 단편을 도 (6b)의 제한효소 지도에 표시하였다. 이 DNA서열 내에서 18S,5.8S 및 25S rRNA 유전자의 위치를 도 6(b)에 나타내었다.
이 rRNA 유전자의 일부 영역을 목적 서열로 이용하여 DNA단편의 염색체 내로의 다중 카피 조립을 효율적으로 달성할 수 있다. 약 13.5kb의 DNA단편을 4개로 분할하여 얻어진 4개의 단편으로 플라스미드를 구성하여 형질전환에 이용하였다. 흥미롭게도, 이렇게 얻어진 형질전환 빈도가 조립을 위한 목적 서열로 이용되는 영역에 따라 상이한 것으로 관찰되었다. 18S rRNA 유전자를 포함하는 2.4kb EcoRI단편을 포함하는 플라스미드 pCLRE5에서는 형질전환 빈도가 낮은 반면, 18S rRNA 유전자의 3'쪽 일부와 5.85 rRNA 유전자, 및 25S rRNA 유전자의 5'쪽 일부를 포함하는 3.5kb EcoRI 단편을 포함하는 플라스미드 pCLRE4, 25S rRNA 유전자를 포함하는 3kb EcoRI 단편을 포함하는 플라스미드 pCLRE6 및 18S rRNA 유전자의 5'쪽 일부를 포함하는 4.7kb의 EcoRI단편을 포함하는 pCLRE7에서는 고빈도로 형질전환체가 얻어졌다.
URA3 유전자
본 발명에 따르면, 사카로마이세스 세리비제의 ura3변이에 상보하는 캔디다 유틸리스의 URA3 유전자가 제공된다. 이 유전자는 상기한 바와 같이 DNA단편의 조립 목표로 사용될 수 있고 염색체 URA3 유전자를 분쇄하여 ura3 변이체를 제조하는데 사용될 수 있다. 이 ura3 변이체를 숙주로 이용하여 선택 마커 유전자가 약제 내성 유전자 마커가 아닌 URA3 유전자를 가지는 형질전환체를 얻을 수 있다. 또한, 이 유전자의 프로모터와 터미네이터 서열을 이종 유전자의 발현에 사용할 수 있다는 것은 자명한 것이다.
URA3 유전자는 도 10과 도 11에 나타낸 아미노산 서열(서열번호 4)을 코드한다. 상기 URA3 유전자로는 도 9에 기재한 DNA서열(서열번호 3)을 포함하거나, 또는 사카로마이세스 세리비제의 ura3 변이를 상보하는 작용을 가지는 그의 부분 서열을 가지는 유전자를 들 수 있다.
자율적으로 복제가능한 DNA서열(ARS)
본 발명에 따르면, 캔디다 유틸리스 내에서 상기 DNA서열을 포함하는 벡터를 에피좀 플라스미드로서 가지고 숙주의 형질전환 빈도를 상승시킬 수 있는 자율적으로 복제될 수 있는 DNA서열이 제공된다. 이 DNA단편은 어떠한 생물에서도 유도될 수 있으며, 바람직하기로는 캔디다 유틸리스에서 유도되는 것이다. ARS의 바람직한 구체적인 예로는 도 41과 도 42에 기재된 DNA서열(서열번호 11)과 도 43 및 도 44에 기재된 DNA서열(서열번호 12) 및 자율적으로 복제될 수 있는 이들의 부분 서열을 들 수 있다.
하기한 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 빈도가 감소함에도 불구하고 단축된 DNA단편을 가지는 플라스미드로 캔디다 유틸리스를 형질전환할 수 있다.
캔디다 유틸리스에서 플라스미드로 존재할 수 있는 벡터는 ARS와 적당한 선택 마커 유전자를 이용하여 제공된다. 또한, 프로모터 활성을 가지는 DNA서열과 기타 작용을 가지는 DNA서열은 벡터를 이용하여 단리된다. 선택 마커 유전자를 포함하지 않고 이종 유전자를 포함하는 DNA단편 만을 염색체 상에 가지는 형질전환체 효모는 캔디다 유틸리스 염색체 DNA에 상동인 서열(상동 DNA서열)을 포함하고 형질전환에서 형질전환체를 선별하기 위한 선택 마커 유전자가 없는 플라스미드 뿐만 아니라 ARS와 적당한 마커 유전자를 포함하는 플라스미드를 이용하여 제조될 수 있다.
실시예
본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하였으나, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 않는다.
본 발명에 있어서, 유전자의 제한효소 지도 중의 제한효소 부위는 다음 약자들로 표시되었다.
Aa;AatⅡ,Af;AfⅢ,Al;AflⅢ,Ap;ApaⅠ,B;BamHⅠ,Bg;BglⅡ,C;ClaⅠ,E;EcoRⅠ,RⅤ;EcoRⅤ,H;HindⅢ,Hp;HpaⅠ,K;KpnⅠ,P;PstⅠ,Pv;PvuⅡ,S;SalⅠ,Se;SpeⅠ,Sm;SmaⅠ,Sc;SacⅠ,ScⅡ;SacⅡ,Sp;SphⅠ,X;XbaⅠ,Xh;XhoⅠ
이하의 실시예에서 사용된 방법은 다음과 같다.
1)ExoⅢ뉴클레아제와 녹두(mung bean)-뉴클레아제를 이용한 결실 변이처리와 DNA서열의 결정
10㎍의 플라스미드를 적절한 제한효소로 분해한 후, 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전하여 DNA를 회수하였다. 이 DNA를 100㎕의 ExoⅢ완충액(50mM트리스-HCl, pH0.8, 100mM NaCl, 5mM MgCl2, 10M2-머캡토에탄올)에 용해하고 ExoⅢ뉴클레아제 180 유니트를 첨가한 후, 이 혼합물을 37℃로 유지하였다. 이 혼합물을 매분 10㎕씩 취하여 2개씩 모아서 20㎕의 MB완충액(40mM 아세트산나트륨, 100mM NaCl, 2mM ZnCl2, 10%글리세롤, pH4.5)이 들어 있는 빙냉한 튜브에 옮겼다. 효소를 불활성하기 위해 얻어진 5개의 튜브를 65℃에서 10분 동안 유지한 후, 5 유니트의 녹두-뉴클레아제를 첨가하고, 이 혼합물을 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후에 결실정도가 다른 5개의 DNA단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 수집하였다. 수집된 DNA단편을 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 만들고 16℃에서 하룻밤 동안 결찰한 후 E.coli의 형질전환에 사용하였다.
얻어진 플라스미드의 삽입 단편에 대하여 형광 프라이머 사이클 시퀀스 키트(Applied Biosystems사 제품)를 이용하여 서열화 반응을 실시하였고, 그 DNA서열은 자동 DNA시퀀서로 결정하였다.
2)혼성화
아가로스 겔 전기영동을 실시한 후, 첨부된 사용법에 따라 Hibond N+필터(Amersham사 제품)에 DNA를 알칼리 트랜스퍼하여 써던 혼성화에 사용하기 위한 필터를 제조하였다.
DNA가 고정된 필터를 65℃에서 2시간 동안 혼성화 용액(6×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.2SDS, 20㎍/㎖ 연어 정액 DNA)중에서 예비 혼성화하였다. Megaprime DNA표지화 시스템과 [α-32P]dCTP(110 TPq/mmol)를 이용하여 표지된 프로브 DNA를 상기 혼성화 용액에 첨가하고 65℃에서 2시간 동안 세척하고 오토래디오그래피를 실시하여 시그널을 검출하였다.
3)배지의 조성
효모를 배양하기 위한 YPD배지의 조성은 1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤 및 2% 글루코스를 포함한다. 플레이트 형태인 경우에 상기 배지에 아가 2%를 첨가한다. SD 배지의 조성은 0.67%의 아미노산이 없는 효모 질소 베이스와 2% 글루코스를 포함한다. 사용되는 효모의 영양요구성에 따라 배지에 아미노산을 첨가하였다. 플레이트 형태인 경우에 상기 배지에 2%의 아가를 첨가하였다.
4)효소 처리
제한효소 반응, 클레노우 효소 및 T4 DNA리가제 등의 효소를 이용한 DNA의 처리는 제조업자 또는 Molecular Cloning, 2판, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)에 기재된 방법에 따른 조건하에서 실시되었다.
실시예 1: 캔디다 유틸리스 염색체 DNA의 제조
캔디다 유틸리스 염색체 DNA의 추출은 다음 방법에 의해 실시되었다. 캔디다 유틸리스의 ATCC9950 균주를 30㎖의 YPD 배지에 접종하여 30℃에서 정상기 초기까지 배양하였다. 원심분리하여 세포를 수집하고 멸균수로 세척한 후, 다시 원심분리하여 세포를 수집하였다. 얻어진 박테리아 세포를 3㎖의 자이몰라제 완충액(0.9M 소르비톨, 0.1M EDTA, 50mM DTT, pH7.5)에 현탁한 후, 25㎎/㎖의 자이몰라제 100T를 포함하는 0.9M 소르비톨 200㎕를 첨가하고 이 혼합물을 37℃에서 항온처리하였다. 현미경으로 원형질체의 생성을 확인한 후, 원형질체를 원심분리하여 회수하였다. 3㎖의 용균 완충액(50mM 트리스-HCl, 50mM EDTA, pH8.0)을 첨가하여 상기 원형질체를 이 완충액 중에 서서히, 충분하게 현탁한 후, 0.3㎖의 10% SDS를 첨가하고 이 혼합물을 65℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 그리고 나서, 1㎖의 5M아세트산칼륨 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 빙냉하에서 1시간 동안 방치하였다. 원심분리하여 DNA를 침전물을 제거하고, 4㎖의 차가운 에탄올을 첨가한 후, 이 혼합물을 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전물을 50% 에탄올로 세척하고, 건조하여 3㎖의 RNA아제 A 완충액(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, 50㎍/㎖ RNA아제 A, pH7.5)에 용해하여 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 최종적으로, 3㎖의 2-프로판올을 첨가하고 이 혼합물을 원심분리하여 상징액을 제거하였다. 얻어진 침전물을 50% 2-프로판올로 세척하고 건조하였다. 침전물을 0.5㎖의 TE 완충액에 용해하여 캔디다 유틸리스 염색체 DNA샘플로 사용하였다.
실시예 2: 포스포글리세레이트 카이네이즈(PGK) 유전자의 클로닝
얻어진 캔디다 유틸리스 염색체 DNA를 제한효소 Sau3AI으로 부분적으로 분해한 후, 분해된 혼합물을 0.8M NaCl, 20mM 트리스-HCl, 10mM EDTA(pH8.0)을 포함하는 10 내지 50%의 슈크로스 밀도 그래디언트 상에 적층하여 120,000×g에서 14시간 동안 원심분리하여 DNA단편을 분획화하였다. 이 단편 중에서 10 내지 20kb의 염색체 DNA단편을 BamHI으로 분해된 탈인산화된 λ-파지 벡터 DASHTMⅡ(Stratagene Cloning Systems)와 하룻밤동안 결찰한 후, 시험관 내에서 패키지하여 캔디다 유틸리스 게놈 DNA라이브러리를 구성하였다.
캔디다 유틸리스의 PGK 유전자를 다른 생물의 기지의 PGK 유전자를 프로브로 사용하여 혼성화 방법으로 클론하였다. 구체적으로는, Molecular Cloning, 2판, Sambrook et al., Cold Spring Harbor laboratory Press(1989)에 기재된 방법에 따라 상기한 DNA라이브러리의 파지 DNA약 20,000 플라크가 흡착된 필터를 제조하였다. 다음으로, 사카로마이세스 세리비제의 PGK 유전자를 포함하는 DNA단편을 PGK 유전자를 가지는 플라스미드 pST2(Yamano et al., Journal of Biotechnology, 32, 165-171(1994))로부터 2kb의 ClaI 단편으로 절단하였다. 이 단편을32P로 표지화하여 혼성화의 프로브로 사용하였다. 그결과, 4개의 양성 플라크가 클론되었다. 이들 플라크 각각에서 제조된 파지 DNA를 다양한 제한효소로 분해하여 상기한 바와 동일한 프로브를 이용하여 써던 블로트 분석을 실시한 결과, 이 프로브로 혼성화된 2.6kb EcoRI 단편 및 2.5kb SalI 단편을 단리하였다.
실시예 3: PGK 유전자를 포함하는 단편의 DNA서열 결정 및 구조 유전자와 조절영역의 특성화
단리된 2.6kb EcoRI 단편을 플라스미드 벡터 Bluescript ⅡSK+의 EcoRI 부위에 삽입하여 벡터에 대한 삽입 단편의 방향성이 상호 역방향인 플라스미드 pPGKE1 및 pPGKE2를 제조하였다. 2.6kb의 SalI 단편을 벡터 Bluescript ⅡSK+의 SalI 부위에 삽입하여 벡터에 대한 삽입 단편의 방향성이 상호 역방향인 플라스미드 pPGKS1 및 pPGKS2를 제조하였다(도 1).
상기 플라스미드 pPGKE1과 pPGKE2로부터 HindⅢ,KpnI 또는 SalI 부위 등의 제한효소 부위에서 결실 변이체를 제조하거나, 또는 ExoⅢ 뉴클레아제와 녹두 뉴클레아제를 이용하여 결실 변이체를 제조하여 다양한 결실 변이를 가지는 플라스미드를 얻어서 2530 bp의 EcoRI 단편의 DNA서열을 결정하였다.
구조 유전자가 기대되는 영역을 분석한 결과, 1248 bp의 오픈 리딩 프레임이 확인되었다. 사카로마이세스 세리비제의 PGK 유전자에 대한 상동성은 상기 오픈 리딩 프레임의 DNA서열에서 추정된 아미노산 서열에 대하여 시험되었다. 이들 서열은 서로 86.8의 상동성을 나타내었으므로 단리된 유전자는 캔디다 유틸리스의 PGK 유전자로 결론지어졌다.
EcoRI 단편은 유전자 발현의 조절 영역으로서 개시 코돈 ATG의 상부 401 bp의 단편과 종료 코돈 TAA의 하부 880 bp의 단편을 포함하였다. 전사 터미네이터를 포함하는 것으로 추측되는 종료 코돈 TAA 다음의 뉴클레오티드와 EcoRI 부위 사이의 880 bp 단편의 DNA서열을 도 2에 나타내었다. 또한, 플라스미드 pPGKS1과 pPGKS2로부터 ExoⅢ 뉴클레아제와 녹두 뉴클레아제를 이용하여 결실변이체를 제조하여 결실 변이를 가지는 플라스미드를 얻어서 HindⅢ 부위와 EcoRI 부위 사이의 DNA 서열을 결정하였다(도 1). 전사 프로모터를 포함하는 것으로 추정되는 HindⅢ 부위와 개시 코돈 ATG 직전 뉴클레오티드 간의 1346 bp 단편의 서열을 도 3에 기재하였다.
실시예 4: PGK 유전자 프로모터와 터미네이터를 이용한 발현 벡터의 구성
캔디다 유틸리스에서 이종 유전자를 발현하기 위해서는 캔디다 유틸리스에서 작용하는 유전자 발현 구조, 즉 전사 프로모터와 터미네이터가 필요하다. 그러므로, 다중 클로닝 부위를 가지는 발현벡터는 캔디다 유틸리스의 PGK 유전자 프로모터와 터미네이터 사이에서 제조되었다.
먼저, 프로모터 또는 터미네이터를 포함하는 단편을 폴리머라제 체인 반응(PCR)에 의해 제조하였다.
프로모터로서는, 개시 코돈의 2.3kb 상부에 위치하는 Sall 부위에서 개시 코돈 ATG 직전의 뉴클레오티드까지의 단편을 플라스미드 pPGKS1을 주형으로 하여 제조하였다. Xbal 부위가 프로모터 단편의 3'-말단의 개시 코돈 바로 앞에 위치하는 다음 서열을 이용하여 프라이머를 합성하였다.
5'-GGTCGACATATCGTGGTAAGCGCCTTGTCA-3' (서열번호 14)
5'-TTCTAGACTTTATCCGCCAGTATGTTAGTC-3' (서열번호 15)
또한, 터미네이터로서는 플라스미드 pPGKE1을 주형으로 하여 종료 코돈의 직후 뉴클레오티드에서 880 bp 하부의 EcoRI 부위까지의 단편을 제조하였다. KpnI 부위가 터미네이터 단편의 5'말단의 종료 코돈의 직후에 위치하는 다음 서열을 이용하여 프라미어를 합성하였다.
5-'GGGTACCTAACTGCAAGCTACTTTGTAATTAAC-3' (서열번호 16)
5'-GGAATTCAACATGAATGACACGACGAAGGT-3' (서열번호 17)
PfuDNA 폴리머라제(Stratagene Cloning Systems)와 첨부된 완충액을 이용하여 PCR 과정을 30회 실시하였다.
PCR 과정에 의해 합성된 프로모터와 터미네이터 단편을 Sall과 XbaI 또는 KpnI과 EcorI 각각으로 분해하였다. 이 단편을 pUC19의 SalI-XbaI 부위와 KpnI-EcorI 부위에 차례로 결합하였다(도 4). 상기 플라스미드의 터미네이터 3'말단의 EcorI 부위를 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성하고 NotI 링커(5'-AGCGGCCGCT-3', 서열번호 18)와 결찰한 후, 이 플라스미드를 PstI으로 분해하여 약 0.9kb의, PstI-NotI 단편을 제조하였다. 이 단편과 플라스미드 pPGKS1으로부터 잘라낸 1.2kb의 HindⅢ-PstI 단편을 pBluescript SK-의 HindⅢ 부위와 NotI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pPGKPT2를 구성하였다. 또한, pPGKPT2를 BglⅡ로 분해하여 클레노우 효소로 처리하고 다시 고리화하여 터미네이터 단편 내에서 BglⅡ를 제거하여 프라스미드 pPGKPT3를 구성하였다. pPGKPT3의 HindⅢ 부위를 크레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성한 후, 이 단편을 NotI링커(5'-AGCGGCCGCT-3', 서열번호 18)와 결찰하여 플라스미드 pPGKPT4를 구성하였다. 이 플라스미드 pPGKPT4를 KpnI으로 부분적으로 분해하고, 프로모터 상부의 KpnI 부위를 결실하여 플라스미드 pPGKPT5를 구성하였다(도 4).
실시예 5: rDNA의 단리
실시예 2에 기재된 슈크로스 밀도 그래디언트 원심분리에 의해 얻어진 캔디다 유킬리스 ATCC9950의 게놈 DNA의 5 내지 10kb의 Sau3AI으로 부분적으로 분해된 DNA 단편 400ng과, BamHI으로 분해되어 탈인산화된 벡터 플라스미드 pBR322 200ng을 T4 DNA 리가제와 하룻밤동안 결찰하였다. E.coli DH5를 상기 DNA 용액으로 형질전환하여 캔디다 유틸리스 게놈 DNA 라이브러리를 구성하였다.
Molecular Cloning, 2판, Sambrook rt al., p.12, 21-23, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)에 기재된 방법에 따라 약 10,000 콜로니에 대하여 필터를 제조하고, 프로브로서 사카로마이세스 세리비제 18S rDNA 유전자를 포함하는 1.8kb의 32p로 표지된 HindⅢ-EcoRI 단편으로 선별하였다. 프로브로서 사용된 rDNA 단편은 프로브로서 5.8S rDNA 유전자의 5'-말단의 4 내지 42의 뉴클레오티드 단편에 해당하는 32p-표지된 올리고머를 이용하여 사카로마이세스 세리비제 S28 8C[α, suc2, mal, gal2, CUP1]의 게놈 DNA 라이브러리로부터 얻어진 플라스미드로부터 제조하였다(Sone 등, 일본 특허공고 제14865/1994).
그 결과, 200개 이상의 양성 클론을 얻었다. 7개의 클론, pCR1, pCR4, pCR5, pCR6, pCR7, pCR8 및 pCR9으로부터 플라스미드의 제한효소 지도를 구성하였고, 비교를 위하여 정렬하였다. 양 말단의 제한효소 지도가 일치되었다(도 5). 이러한 사실로부터 캔디다 유킬리스의 rDNA 유전자를 포함하는 영역이 약 13kb의 반복 구조를 가지는 것을 발견하였다.
상기한 플라스미드로부터, EcoRI 또는 XbaI으로분해하여 절단된 단편을 pBluescript SK-에 서브클론하여 플라스미드 pCRE1, pCRE2, pCRE3, pCRE4, pCRX1, pCRX2, pCRX3 및 pCRX4를 구성하였다(도 6(a)). 또한, 상기 플라스미드들을 다양한 제한효소로 분해하여 다시 고리화하여 여러가지 결실 플라스미드를 구성하였다. 상기한 플라스미들의 삽입 단편에 대하여 DNA 서열을 결정하고 DNA 서열이 결정된 영역을 도면에서 화살표로 표시하였다. DNA 서열 분석 결과, 18S, 5.8S 25S 및 rDNA 유전자와 높은 상동성을 가지는 영역이 존재하는 것이 확인되었다. 그러므로, 3개의 rDNA 유전자의 위치와 전사방향이 결정되었다(도 6(b)).
실시예 6: 오로티딘-5'-포스페이트 데카복실라제 유전자(URA3 유전자)의 클로닝
실시예 2에 기재된 슈크로스 밀도 그래디언트 원심분리에 의해 얻어진 캔디다 유틸리스 ATCC9950 게놈 DNA의 5 내지 10kb의 Sau3AI으로 부분적으로 분해된 DNA 단편 100 ng과, BamHI으로 분해되어 탈인산화된 벡터 플라스미드 YEp13 100 ng(Mrthods in Enzymol., 194, 195-230, 1991)을 T4 DNA 리가제와 하룻밤동안 결찰하였다. E.coli DH5를 상기 DNA 용액으로 형질전환하여 게놈 DNA라이브러리를 구성하였다. 이 형질전환체에서 플라스미드 혼합물을 추출한 후, ura3-균주인 사카로마이세스 세리비제 YPH500(αhis3, trp1, leu2, ade2, lys1, ura3)(Stratagene Cloning Systems)을 플라스미드 DNA 혼합물을 형질존환하여 성장시에 우라실을 필요로 하지 않는 형질전환체를 최소 배지에서 선별하였다. 사카로마이세스 세리비제의 형질전환은 리튬 방법(methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course manual - Rose M.D. et al., p122-123, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1990))에 따라 실시되었다.
상기한 방법으로 10 ㎍의 DNA로부터 5개의 uRA+ 균주를 얻었다. Methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course manual - Rose M.D. et al., p130, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1990))에 기재된 방법에 따라 상기한 형질전환체 각각에서 플라스미드 DNA를 제조하였다. 이 DNA로 E.coli를 형질전환하고 플라스미드 DNA를 제조하였다. YEp13의 BamHI 부위에 6.1kb의 삽입물을 포함하는 플라스미드 pCURA3-3와 8.1kb의 삽입물을 포함하는 pCURA3-5 각각에 대하여 제한효소 지도를 구성하였다. 이 지도를 도 7에 나타내었다.
실시예 7: URA3 유전자 영역의 특성화 및 DNA 서열의 결정
URA3 유전자 영역을 특성화하기 위하여 플라스미드 pCURA3-5로부터 플라스미드 pCURA3-5 및 pCURA3-5에 공통인 영역을 포함하는 5kb의 EcoRI 단편을 잘라내어 플라스미드 pRS314(Stratagene Cloning Systems)의 EcoRI 부위에 결찰하여 플라스미드 pURAE1을 제조하였다(도 7). 이 플라스미드를 이용하여 리튬 방법에 의해 YPH 500균주를 형질전환하였다. 그 결과, URA+ 형질전환체가 고빈도로 얻어졌다. 이것은 URA3 유전자가 5kb의 EcoRI 단편 내에 존재하며 유전자 1 카피가 사카로마이세스 세리비제의 ura3-돌연변이에 상보할 수 있음을 나타낸다.
또한, 플라스미드 pURAE1을 XhoI 또는 PstI으로 분해하고 T4 리가제 반응에의해 다시 고리화하여 플라스미드 pURAE1ΔXho와 pURAE1ΔPst를 얻었다.
또한, 플라스미드 pURAE1으로부터 잘라낸 3.5kb의 EcoRI-ClaI 단편과 2.3kb의 HindⅢ 단편을 EcoRI 부위와 ClaI 부위 사이에, 또는 pRS314의 HindⅢ 부위에 각각 삽입하여 플라스미드 pURAEC1과 pURAH1을 제조하였다(도 7).
상기한 5개의 플라스미드를 이용하여 YPH 500 균주를 리튬 방법에 의하여 형질전환하여 ura3-돌연변이의 상보능을 시험하여 이 단편들이 URA3 유전자를 포함하는지를 시험하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이러한 결과는 URA3 유전자가 EcoRI과 HindⅢ 사이의 2.3kb 영역에 위치한다는 사실을 증명하는 것이다.
또한, URA3 유전자를 포함하는 2.3kb의 HindⅢ 단편을 플라스미드 pBluescript SK의 HindⅢ 부위에 결찰하여 플라스미드 pURAH2를 제조하였다. ExoⅢ 뉴클레아제와 녹두 뉴클레아제를 이용하여 삽입된 단편의 양 말단에서 결실 돌연변이를 실시하여 결실 돌연변이를 가지는 플라스미드를 제조하고 그 DNA 서열을 결정하였다. DNA 서열과 서열 전략에 의해 명료화된 제한효소 지도를 도 8에 기재하였다. 얻어진 2330 bp의 DNA 서열을 도 9에 기재하였고, 267개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드의 추정된 아미노산 서열을 도 10와 도 11에 나타내었다.
폴리펩티드의 아미노산 서열을 다른 효모의 URA3 단백질과 비교한 결과, 에를 들면, Saccharomyces cerevisiae에 대하여는 73.4, Kluyveromyces lactis에 대하여는 76.3 및 Candida albicans에 대하여는 75.1의 높은 상동성을 나타내었다.
실시예 8: L41 유전자의 클로닝과 L41유전자를 포함하는 DNA 단편의 DNA 서열 결정
실시예 5에서 제조된 라이브러리의 약 30,000 콜로니에 대하여 Molecular Cloning, 2판, Sambrook et al., p.12, 21-23, cold Spring Harbor Laboratory (1989)에 기재된 방법에 따라 필터를 제조하여 프로브로서 Candida maltosa L41 유전자, RIM-C를 포함하는 1.1kb의 32p로 표지된 XbaI-Sau3AI 단편으로 선별하였다(Kawai et al., J. Bacteriol., 174, 254-262 (1992)).
5개의 양성 클론이 얻어졌다. pCL41-1, pCL41-2 및 pCL41-5의 3개 클론에 대한 제한효소 지도를 구성하여 각각을 비교하였다. 이들 클론은 공통적으로 4kb의 EcoRI 단편을 포함하였다(도 12). 이 플라스미드 DNA에 대한 써던 혼성화 분석은 Candida maltos의 L41 유전자에 대하여 상동성을 나타내는 영역이 4kb의 EcoRI 단편 내의 1.4kb ClaI-PstI 단편 내에 존재하는 것을 나타내었다.
4kb의 EcoRI 단편을 pBluescript SK-의 EcoRI 부위에 삽입하여 삽입 단편이 서로 반대방향인 플라스미드 PCLE1과 pCLE2를 제조하였다. BamHI 부위에서 SacI 부위까지의 2086 bp의 DNA 서열을 결정하기 위해서 2개의 플라스미드로부터 EcoRI 단편 내에 부위를 가지는 HindⅢ, XhoI 또는 ClaI으로 결실 변이체를 제조하거나 ExoⅢ 뉴클레아제와 녹두 뉴클레아제로 결실변이체를 제조하여 결실변이를 가지는 다양한 플라스미드를 얻었다(도 13).
써던 분석에서는 367bp의 인트론이 삽입된 318bp의 오픈 리딩 프레임이 L41 구조 유전자가 존재하는 것으로 추정되는 영역에 존재하는 것으로 나타났다(도 12 및 도 14). 인트론인 것으로 추정되는 영역의 5' 및 3'말단과 3'말단의 근처에서 인트론에 공통하는 서열, GTATGT--TACTAAC--AG가 관찰되었다. 또한, 이 서열은 다른 효모의 6개의 L41 유전자(Kawai et al., J.Bacteriol., 174, 254-262(1992); Pozo et al., Eur. J. Biochem.,213, 849-857 (1993))와 마찬가지로 개시 코돈의 바로 뒤에 위치하였다. 캔디다 유틸리스 L41 폴리펩티드의 추정된 아미노산 서열을 다른 효모의 L41 단백질과 비교한 결과, 사카로마이세스 세리비제 L41에 대하여는 93.4%, Candida tropicalis L41에 대하여는 89.6%, Candida maitosa L41에 대하여는 85.8%의 높은 상동성을 나타내었다.
실시예 9: 부위 특이적 돌연변이에 의한 시클로헥시미드 내성 L41 유전자의 제조
시클로헥시미드 내성 효모의 L41 단백질의 56번 아미노산은 글루타민인 반면, 시클로헥시미드 감수성 효모의 L41 단백질에서 해당 위치는 프롤린이다. 효모의 시클로헥시미드에 대한 감수성은 L41 단백질의 아미노산 잔기에 의해 결정된다고 보고되었다(Kawai et al., J. Bacteriol., 174, 254-262 (1992)). 또한, 시클로헥시미드 감수성 캔디다 유틸리스의 L41 단백질의 56번 아미노산은 시클로헥시미드 감수성 사카로마이세스 세리비제와 같이 프롤린이다. 부위 특이적 돌연변이에 의하여 L41 유전자의 56번의 프롤린을 코드하는 코돈을 글루타민 코돈으로 변화하여 이 유전자가 코드하는 L41 단백질을 시클로헥시미드 내성 단백질로 변환하여 형질전환의 선택 마커로서 사용하였다.
먼저, pCLE1으로부터 얻어진 2.1kb의 BamHI-SacI 단편을 pUC18의 BamHI과 SacI 사이에 삽입하여 플라스미드 pCLBS1을 제조하였다(도 15).
플라스미드 pCLE1을 AflⅡ로 분해하고, 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성한 후, XhoI으로 분해하여 얻어진 0.6kb의 단편을 pBluescript SK-의 SmaI과 XhoI 부위 사이에 삽입하여 pCLAX1을 제조하였다. 이 플라스미드에서 AflⅡ 부위를 0.6kb 단편의 AflⅡ 둔단과 벡터의 SmaI 말단을 결찰하여 재생하였다. 단일 가닥 DNA는 헬퍼 파아지를 이용하여 pCLXA1으로부터 제조하였고 돌연변이 플라스미드는 합성된 올리고뉴클레오티드 5'-TTG TGG AAA ACT TGC TTG GTT TGA-3'와 Sculptor In Vitro mutagenesis Kit (Amersham사 제품)을 이용하여 제조되었다. 얻어진 후보 플라스미드에 대하여 0.6kb의 삽입 단편의 DNA 서열을 결정하였고, 56번 프롤린 코돈 CCA로 변이된 것을 제외하고 DNA 서열 내에서는 변이가 발견되지 않는 플라스미드 pCLAX20을 얻었다.
pCLAX20으로부터 0.6kb의 삽입 단편을 ClaI-AflⅡ 단편으로서 절단하여 플라스미드 pCLBS1을 ClaI과 AflⅡ로 분해하여 얻어진 4.4kb의 단편과 결찰하여 변이된 L41 유전자를 포함하는 플라스미드 pCLBS10을 구성하였다.
플라스미드 pCLBS10을 BamHI과 SphI으로 분해하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 둔단을 형성한 후, NotI 링커(5'-AGCGGCCGCT-3')를 삽입하여 플라스미드 pCLBS12를 제조하였다(도 15).
얻어진 변이된 L41 유전자가 효모에 시클로헥시미드에 대한 내성을 제공하는지를 시험하였다. 플라스미드 pCLBS10으로부터 얻어진 변이된 L41 유전자를 포함하는 2.1kb의 BamHI-SacI 단편을 YEp 벡터인 YEp 13k(Sone et al., Appl. Environ Microbiol., 54, 38-42 (1988))의 BamHI SacI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pYECL10을 제조하였다. 한편, pCLBS1으로부터 얻어진 야생형 L41 유전자를 포함하는 2.1kb의 BamHI-SacI 단편을 YEp 13k에 클론하여 대조용으로서 플라스미드 pYECL1을 제조하였다.
사카로마이세스 균주 YPH 500을 상기한 플라스미드를 이용하여 Methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose M.D. et al., p.122-123, Cold Spring harbor Laboratory Press, NY (1990)에 기재된 리튬 아세테이트 방법에 따라 형질전환하였다. 로이신 비요구성 균주를 형질전환체로 선별하였다. 이들 형질전환체를 시클로헥시미드를 포함하는 YPD 플레이트에서 배양하였다. 그 결과, pYECL10을 가지는 균주는 시클로헥시미드를 포함하는 YPD 플레이트에서 성장하였다. 반면, pYECL1을 가지는 균주는 시클로헥시미드를 포함하는 YPD 플레이트에서 성장하지 아ㅎ났다. 따라서, 제조된 변이된 L41 유전자는 시클로헥시미드 감수성 효모에 대한 내성을 제공하는 것이 입증되었다.
실시예 10: 형질전환용 플라스미드의 구성과 캔디다 유틸리스의 형질전환 조건의 결정
먼저, 사카로마이세스 세리비제에서 작용하는 것이 입증된 G418-내성 유전자(아미노글리코시드 포스토트랜스퍼라제(APT) 유전자)의 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 이용하여 캔디다 유틸리스 ATC9950 균주의 형질전환을 시험하였다. 상기 발현 카세트는 1.0kb의 글리세로알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 유전자의 프로모터 영역과 0.4kb의 포스포글리세레이트 카이네이즈 유전자의 터미네이터 영역(Yamano et al., J. Biotechnol., 32, 165-171 (1994)) 사이에 플라스미드 pUC4K(Pharmacia)로부터의 XhoI-PstI 단편으로서 절단된 1.1kb의 G418 내성 유전자를 결찰하고 둔단을 가지는 것으로 전환하여 제조되었다. 플라스미드로서는, (1) 상기 카세트가 YEp 벡터인 YEp13 K에 결찰된 플라스미드; (2) 실시예 2에 기재된 캔디다 유틸리스 ATCC9950 균주의 San3AI으로 부분적으로 분해된 염색체 DNA 단편(5 내지 10kb)이 상기 발현 카세트가 플라스미드 pBluescript SK-에 결찰된 플라스미드 pGPDAPH1의 BamHI 부위에 삽입된 DNA 라이브러리; 및 (3) 사카로마이세스 세리비제에서 작용하는 ARS pGPDAPH1 플라스미드가 사용되었다. (3)의 플라스미드는 (2)의 라이브러리를 이용하여 사카로마이세스 세리비제 YPH 500 균주의 형질전환에 의해 얻어진 효모 콜로니로부터 단리되었다. 상기한 플라스미드 또는 라이브러리 DNA를 이용하여 저항과 다양한 조합을 이용한 전기 펄스법 또는 리튬 아세테이트 방법에 의해 캔디다 유틸리스 ATCC 9950의 형질전환을 실시하였다. 그러나, G418에 대한 내성을 나타내는 콜로니는 얻어지지 않았다.
다음 단계로, EcoRI 또는 XbaI을 이용하여 실시예 5에 기재된 플라스미드 pCRE2, pCRE3, pCRX1 및 pCRX2(도 6)로부터 잘라낸 4개의 rDNA 단편을 실시예 9에 기재된 플라스미드 pCLBS10(도 15)의 EcoRI 부위 또는 XbaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCLRE2, pCLRE3, pCLRX1 및 pCLRX2를 구성하였다.
선택 마커로서 시클로헥시미드 내성 유전자를 가지는 4개의 플라스미드와, 플라스미드 pCLBS10의 BamHI 부위에 캔디다 유틸리스 ATCC9950 균주의 염색체 DNA의 Sau3AI으로 부분적으로 분해된 DNA 단편(5 내지 10 db)을 삽입하여 제조된 라이브러리 DNA를 이용하여 다양한 저항과 전압으로의 전기 펄스법 또는 리튬 아세테이트법에 의해 캔디다 우틸리스 ATCC9950의 형질전환을 실시하였다. 그러나, 이들 플라스미드를 원형으로 사용할 경우, 형질전환체는 얻어지지 않았다. 상기한 형질전환 실험에 있어서, 시클로헥시미드에 대하여 약한 내성을 나타내거나 또는 G418에 대하여 내성을 나타내는 의사(擬似) 내성콜로니의 출현이 관찰되었다. 상기한 의사 내성 콜로니는 G418 또는 시클로헥시미드 등의 항생물질을 첨가한 플레이트에서 형질전환체를 선택하는 경우 종종 관찰되며, 선택 마커의 약제 내성 유전자의 존재에 상관없이 자발적으로 내성을 획득하는 콜로니이다.
상기 실험에서, 시클로헥시미드를 형질전환체의 선별에 사용할 경우, 의사 내성 콜로니의 출현은 플레이트 내의 시클로헥시미드의 농도를 40㎍/㎖로 고정하고 28℃, 그러나 30℃를 넘지 않는 온도에서 이 플레이트를 항온처리하여 억제되었다. 그러므로, 염색체 내로의 DNA의 조립을 촉진하기 위하여, 플라스미드 DNA의 rDNA 유전자 영역 내의 제한효소 부위에서 BglⅡ, EcoRV 및 BglⅡ 각각으로 분해된 플라스미드 pCLRE2, pCLRX1 및 pCLRX2를 이용하여 형질전환실험을 실시하였다. 그 결과, 전기 용량 25㎌, 저항 600Ω 및 전압 5KV/㎝의 조건 하에서 BglⅡ로 분해된 플라스미드 pCLRE2 및 pCLRX2를 이용하여 시클로헥시미드 내성 클론을 성공적으로 얻었다. 이러한 내성 균주는 플라스미드 DNA를 첨가하지 않은 대조 실험에서 드물게 얻어진 미소한 의사 내성 균주보다 그 크기가 분명히 더 크고, 실시예 12에 기재된 써던 분석 결과로부터 형질전환체임이 입증되었다.
최적의 형질전환 조건을 차기 위해서, 저항과 전압의 다양한 조합과 2.5㎌ 의 고정된 전기용량의 조건 하에서 BglⅡ 분해된 플라스미드 pCLRE2를 이용하여 전기 펄스 실험을 실시하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었으며, 도 17에는 펄스 후의 생균율과 얻어진 시클로헥시미드 내성 형질전환체수가 기재되었다.
상기 결과로부터, 25㎌의 전기 용량과, 600, 800 또는 1,000Ω의 저항 및 3.75 또는 5KV/㎝의 전압하에서 DNA 1㎍ 당 약 500 내지 1400 세포의 고빈도로 형질전환체가 얻어지는 것을 발견하였다. 이러한 조건 하에서 펄스 후 생균율은 약 10 내지 40%였다. 저항이 200 또는 400Ω인 조건 하에서 생균율은 40% 이하였으나 고빈도의 형질전환은 얻어지지 않았다. 200 또는 400Ω의 저항에서 시간 상수(전압이 최대값의 약 37%까지 감쇠하는 동안에 필요한 시간)는 10 밀리초 이하의 범위였다. 또한, 저항이 600, 80 또는 1000Ω이고 펄스 후 생균율이 약 10 내지 40%인조건하에서, 시간 상수는 약 10 내지 20 밀리초의 범위였다. 이러한 결과는, 펄스 후 생균율이 약 10 내지 40%이고, 시간 상수가 10 밀리초 이상이 되도록 전기 펄스를 세포에 가하는 것이 형질전환 빈도를 높이는데 중요한 것임을 나타낸다.
또한, 전기 펄스를 가한 후, 상기 세포 용액에 1M 소르비톨을 포함하는 YPD 배지를 첨가하여 진탕배양하는 것이 바람직하다. 세포를 배양하지 않고 시클로헥시미드를 포함하는 선택 플레이트에 직접 도포하면 콜로니는 얻어지지 않는다.
또한, 생균수와 형질전환체 수의 변화를 시간의 경과에 따라 시험하였고, 그 증가율을 비교하여 최적 배양 시간을 결정하였다.
그 결과, 배양시간 6시간까지는 형질전환체의 증가율이 생균수의 증가율보다 더 높지만, 배양한 지 6시간 이후에는 생균수와 형질전환체수가 동일한 비율로 증가하는 것을 발견하였다. 그러므로, 배양시간은 6시간이 최적인 것으로 나타났다.
전기 펄스에 의한 캔디다 유틸리스 ATCC 9950 균주를 형질전환하는 표준 방법을 실시예 11에 기재하였다.
실시예 11: 전기 펄스에 의한 캔디다 유킬리스 ATCC 9950 균주의 형질전환 방법
YPD 플레이트에서 배양한 콜로니를 5㎖의 YPD 액체 배지에서 약 8시간 동안 30℃에서 진탕배양한 후, OD600= 0.024의 농도로 200㎖의 YPD 액체 배지에 접종하고 30℃에서 약 16시간 동안 진탕배양하였다. 상기 세포를 대수성 장기(OD600= 2.5)까지 생육시킨 후, 이들을 1400×g에서 5분 동안 원심분리하여 회수하였다. 이 세포를 빙냉한 멸균수 100㎖로 1회, 빙냉한 멸균수 40㎖로 1회, 빙냉한 1M 소르비톨 40㎖로 1회 세척하였다. 이 세포를 1M 소르비톨 10㎖에 현탁한 후, 멸균한 폴리프로필렌 튜브에 옮겨서 1100×g에서 5분 동안 다시 원심분리하였다. 상징액을 제거하고, 세포를 최종 세포액의 부피가 2.5㎖가 되도록 빙냉한 1M 소르비톨에 현탁하였다.
Gene Pulser(Bio-rad사 제품)로 전기 펄스에 의한 형질전환 실험을 실시하였다. 세포액 50㎕를 DNA 샘플 5㎕와 혼합한 후, 이 혼합물을 0.2㎝의 1회용 큐벳에 담아서 적당한 조건하에서 전기 펄스를 주었다. 펄스를 가한 후, 1M 소르비톨을 포함하는 빙냉한 YPD 배지 1㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 멸균한 폴리프로필렌 튜브에 옮겨서 30℃에서 약 6시간 동안 진탕배양하였다. 배양후, 상기 세포 혼합물을 시클로헥시미드 40㎍/㎖를 포함하는 YPD선택 배지에 도포하여 28℃에서 3일 또는 4일 동안 유지하여 형질전환체의 콜로니를 얻었다.
실시예 12:써던 분석에 의한 형질전환체 내의 플라스미드 DNA의 검출
실시예 10에서 얻어진 시클로헥시미드 내성 콜로니 중 7개를 써던 블로트 방법으로 분석하여 이들 클론이 플라스미드 DNA를 포함하는지를 시험하였다. 염색체 DNA를 Methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose M.D. et al., p131-132, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY에 따라 제조하였다. 제조된 DNA를 EcoRV 또는 SalⅠ으로 분해하여 L41 유전자(도 12)를 포함하는 1.8kb의 32p로 표지된 BamHⅠ-HindⅢ단편을 프로브로서 혼성화하였다(도 18).
그 결과, 내인성 L41유전자에서 유도된 5kb의 밴드 이외에 20kb이상의 밴드를 EcoRV로의 분해에 의해 검출하였다. EcoRV는 rDNA유전자 위치를 절단하지만 pCLRE2는 절단하지 않는다. 그러므로, 이 플라스미드의 염색체 내로의 조립으로 인하여 약 20KB이상의 밴드가 검출되는 것으로 생각된다. 실시예 15의 써던 분석에서는 캔디다 유틸리스 1세포 중에 L41 유전자 2카피가 존재하는 것이 증명되었다. 덴시토미터 분석 결과에 따르면, 조립된 플라스미드 DNA의 카피수는 약6(레인7) 내지 15카피(레인2)의 범위인 것으로 나타났다.
한편, SalⅠ은 한 위치에서 플라스미드 pCLRE2를 절단한다. 염색체 DNA를 SalⅠ으로 분해할 경우, 내인성 L41 유전자에서 유도된 7.5kb의 밴드 이외에 플라스미드 pCKRE2의 길이에 해당하는 8.5kb의 밴드가 검출되었다. 이 8.5kb의 밴드는 염색체 내에 다수의 플라스미드의 세로 조립으로 인하여 이웃한 플라스미드의 SalⅠ분해에 의해 생성되는 것으로 생각되었다.
또한, 써던 분석을 10개 이상의 시클로헥시미드 내성균주에 대하여 실시하여 플라스미드 DNA가 클론들 모두에 존재하는 것을 확인하였다. 실시예 10의 형질전환 실험에서 얻어진 시클로헥시미드 내성 균주가 형질전환체임이 입증되었다.
싱시예13:기타 캔디다 유틸리스 균주의 형질전환
캔디다 유틸리스 균주에 따라 상이한 염색체 전기영동 패턴을 가지며 염색체 길이의 다형성을 나타낸다고 보고되었다(Stoltenburg et al., Curr. Genet., 22, 441-446(1992)). 균주에 따라 유전적 성질이나 형질전환 빈도에 있어서 차이가 있을 것으로 예측되므로 ATTCC9950 균주이외에 ATCC 9226 과 ATCC 9256에 대하여 실시예 11에 기재된 전기 펄스법에 의한 형질전환을 시험하였다.
전기 용량 25㎌, 저항 1000Ω 및 전압 2.5내지 6.25KV/㎝의 조건하에서 펄스를 가하였다. 플라스미드 DNA로서, BalⅡ로 분해된 pCLRE2 2㎍을 사용하였다.
그 결과를 표1에 기재하였다. 균주에 따라 형질전환 빈도가 상이한 반면, 시클로헥시미드 내성 콜로니가 모든 균주에서 얻어졌다.
플라스미드 pCLRE2를 이용한 형질전환
전압조건(KV/㎝) DNA 2㎍ 당 형질전환체 수
ATCC9226 ATCC9256
2.50 22 0
3.75 145 8
5.00 128 18
6.25 94 7
대조용으로서 ATCC 9950에서 유도된 2개의 시클로헥시미드 내성 균주 뿐만 아니라 전체 8개의 시클로헥시미드 내성 균주, 즉 ATCC9226균주로부터 유도된 4개의 균조와 ATCC 9256에서 유도된 4개의 균주에 대하여 염색체 DNA를 제조하여 BalHⅡ로 분해하였다. L41 유전자를 포함하는 1.8kb의 32p로 표지된 BamHⅠ-HindⅡ단편(도 12)을 프로브로 하여 상기 DNA의 써던 분석을 실시하였다.
그 결과를 도 19에 나타내었다. 어떠한 균주에 있어서도 염색체 상의 내인성 L41 유전자로부터 유도된 5.4kb의 밴드 이외에 플라스미드 DNA로부터 유도된 밴드가 관찰되었다. 이것은 상기한 내성 균주가 플라스미드 DNA를 보유하는 형질전환체임을 나타낸다.
ATCC 9226과 ATCC 9256 균주에서 유도된 형질전환체 일부에 있어서, 플라스미드 DNA와 같은 크기를 가지는 8.4kb의 밴드 이외에 더 큰 분자량의 밴드가 관찰되었다(레인2 내지 4 및 7). 이것은 플라스미드 상의 rDNA 서열이 조립대상인 염색체 상의 rDNA서열과 일치하지 않을 경우, 때때로 염색체에 조립되는 플라스미드 DNA 분자 말단에서 BGLⅡ부위가 결실되는 것을 나타낸다.
실시예 15의 써던 분석에 의하여 캔디다 유틸리스 1 세포당 L41 유전자 카피수가 2개임이 입증되었다. 조립된 플라스미드의 카피수는 5.4kb의 밴드가 2카피의 L41 유전자에 해당한다는 가정하에 밴드의 강도를 비교하여 계산되었다. 밴드의 밀도는 Imaging Analyzer BAS 2000(Fuji Film사 제품)으로 측정하였다.
그 결과, 플라스미드 pCLRE2의 카피수는 ATCC9256 균주에서는 7(레인1) 내지 25카피(레인3)이고 ATCC9226 균주에서는 3(레인 5) 내지 11 카피(레인 6)인 것으로 계산되었다. 한편, ATCC9950 균주의 카파수는 11카피(레인 9와 10)로 계산되었다.
이러한 결과는 형질전환체가 ATCC9950 균주 뿐만 아니라 ATCC9226 균쥬와 ATCC9256 균주에 있어서도 시클로헥시미드 내성 L41유전자를 이용하여 얻어질수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 14:리튬 아세테이트 방법 및 이들을 변형한 방법에 의한 캔디다 유틸리스의 형질전환
리튬 아세테이트 방법(Ito et al., Bacteriol., 153, 163-168(1983))은 실시가 간편하고 용이하기 때문에 사카로마이세스 속의 효모를 형질전환하는데 널리 사용되어 왔다. 따라서, BalⅡ에 의해 선형으로 분해된 플라스미드 pCLRE2를 이용하여 캔디다 유틸리스 ATCC9950 균주를 리튬 아세테이트 방법 및 에탄올 또는 DMSO를 첨가하는 변형된 리튬 아세테이트 방법(Soni et al., Current Cenet 24, 455-459(1993))에 따라 형질전환하는 것을 시험하였다. 변형된 리튬 아세테이트 방법에 있어서는, 열쇼크를 가한지 10분 후에 세포 현탁액에 에탄올을 첨가하여 최종 농돌ㄹ 10%로 하고, 이 혼합물을 다시 10분동안 보온하였다. 또한, DMSO는 최종 농도가 10%가 되도록 폴리에틸렌 글리콜 용액과 함께 세포현탁액에 첨가하였다. 이 세포들을 YPD 용액에 현탁하여 30℃에서 4시간 동안 진탕배양한 후, 시클로헥시미드를 포함하는 선택 플레이트에 도포하여 28℃에서 6일 동안 항온처리하였다.
그 결과, 에탄올 DNA를 첨가하는 변형된 리튬 아세테이트 방법에 의하여 플라스미드 DNA의 DNA 2㎍으로 시클로헥시미드 내성 균주 5 콜로니를 얻었다. 실시예 13에 기재된 방법에 따라 2개의 클론에 대하여 제조된 염색체 DNA를 이용하여 써던 분석을 실시하였다. 플라스미드에서 유도된 밴드를 관찰하여 이 클론들이 형질전환체임을 확인하였다. 이러한 결과는 혈질전환의 빈도는 전기 펄스법에 비교하여 다소 낮지만 리튬 아세테이트로 처리된 캔디다 유틸리스가 DNA를 조립하는 능력이 있음을 나타내는 것이다.
Soni등에 기재된 방법에 따라 실험하였으나, 처리조건을 재시험하여 형질전환 빈도를 개선할 수 있다.
실시예 15:상이한 rDNA 유전자 영역을 대상으로 하는 형질전환
1)플라스미드의 구성
실시예9에 기재된 플라스미드 pCLBS12(도 15)의 EcoRⅠ부위에 pCRE2(도 6)로부터 얻어진 3.5kb의 EcoRⅠ단편과 pCRE3(도 6)로부터 얻어진 2.4kb의 EcoRⅠ단편을 삽입하여 pCLRE4와 pCLRE5를 구성하였다.
또한, 7.5kb의 rDNA를 포함하는 EcoRⅠ단편이 클론된 pCRE1(도 6)에서 절단된 3kb의 EcoRⅠ-XbaⅠ단편과 4.5kb의 EcoRⅠ-XbaⅠ단편을 각각 pBluescript SK-의 EcoRⅠ과 XbaⅠ부위 사이에 결찰하였다. 각 플라스미드의 XbaⅠ부위를 EcoRⅠ링커 (5'-CCAAGCTTGG-3')삽입하여 EcoRⅠ부위로 전환하여 플라스미드 pCRE6와 pCRE7을 구성하였다. 상기 플라스미드 pCRE6와 pCRE7각각에서 절단된 3kb와 4.5kb의 EcoRⅠ단편을 플라스미드 pCLBS12의 EcoRⅠ부위에 삽입하여 플라스미드 pCLRE6와 pCLRE7 각각을 구성하였다.
플라스미드 pCLRE4,pCLRE5,pCLRE6 및 pCLRE7의 구조를 도 20에 나타내었다.
2)형질전환
플라스미드 pCLRE4,pCLRE5,pCLRE6 및 pCLRE7 각각을 제한효소를 이용하여 선형 DNA로 분해하였다. ATCC9950 균주를 실시예 11에 기재된 전기 펄스법에 의해 DNA 1㎍으로 형질전환하였다. 전기 용량 25㎌, 전압 5KV/㎝및 저항 800Ω의 조건하엣 펄스 후 18시간 동안 배양하여 형질전환하였다. rDNA 단편에서 발견되는 부위를 자를 수 있는 제한 효소를 사용하였다. 즉, 플라스미드 pCLRE4는 BglⅡ로, pCLRE5는 BamHⅠ 또는 Xbal으로, pCLRE6는 BamHⅠ 또는 XbaⅠ으로, pCLRE6는 BamHⅠ으로, pCLRE7은 ApaⅠ 또는 EcoRV로 각각 분해하였다. 또한, 플라스미드 pCLRE7을 L41 유전자의 ClaⅠ부위에서 분해하여 조립된 목적 유전자의 차이에 따른 형질전환 빈도 차이을 비교하였다.
2회의 실험을 실시하여 그 결과를 표2에 기재하였다.
플라스미드 pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 및 pCLRE7에 의한 형질전환
플라스미드 DNA 1㎍당 형질전환체 수
1차 2차
pCLRE4(BglⅡ) 786 593
pCLRE4(ClaⅠ) 87 11
pCLRE5(BamHⅠ) 0 0
pCLRE5(XbaⅠ) 1 18
pCLRE6(BamHⅠ) 301 775
pCLRE7(ApaⅠ) 409 754
pCLRE7(EcoRV) 577 640
플라스미드 pCLRE4, pCLRE6 또는 pCLRE7의 rDNA 단편 내에서 분해된 경우 높은 형질전환 빈도가 입증되었고, 어떠한 플라스미드에서도 DNA 1㎍ 당 수백개의 형질전환체가 얻어졌다. 한편, BamHⅠ 또는 XblⅠ으로 플라스미드 pCLRE5를 분해하여 다른 플라스미드의 경우와 비교하였을 때 형질전환 빈도가 매우 낮았다. 이것은 rDNA영역에서 조차도 형질전환 대상으로 사용되는 단편에 따라 형질전환 빈도가 매우 상이함을 나타낸다.
또한, 플라스미드 pCLRE4를 L41유전자의 ClaⅠ부위에서 분해하였을 때, 형질전환빈도는 rDNA 내의 BgLⅡ부위에서 분해와 비교하여 약 1/10 내지 1/50의 범위였다. 또한, 하기한 써던 분석은 플라스미드 분자가 ClaⅠ부위에서 분해되었을 때 L41 유전자 내에 조립되었고 BglⅡ부위에서 분해되었을 때는 rDNA위치에 조립되는 것으로 나타났다.
상기한 결과로부터 대상으로서 염색체 내에 다수개의 카피를 가지는 rDNA를 이용하여 고빈도의 형질전환을 유도할 수 있음을 알수 있다.
3)써던분석
BgLⅡ 또는 ClaⅠ으로 분해된 pCLRE4, XbaⅠ으로 분해된 pCLRE5, BamHⅠ으로 분해된 pLSRE6 및 ApaⅠ으로 분해된 pCLRE7으로 시클로헥시미드 내성 균주를 제조하였다. 각 플라스미드에 대하여 4개의 균주를 얻었다. 이 균주들로부터 염색체 DNA를 제조하였다. 제조된 DNA 샘플을 BglⅡ 또는, BglⅡ와 NotⅠ으로 분해하고 L41유전자로 부터 유도된 5.4kb의 밴드 이외에 플라스미드 DNA 분자 내의 BglⅡ부위에서의 절단에 의해 얻어진 플라스미드 DNA 와 동일한 크기를 가지는 8.4kb의 밴드가 관찰되었다(도 21(1), 레인1 내지 8). 또한, ClaⅠ으로 분해된 플라스미드가 조립된 균주에서는 상기한 2개의 밴드 이외에 7.4kb와 6.4kb의 밴드가 관찰되었다(레인 1 내지 4). 상기한 2개의 밴드는, 염색체 L41유전자 위치들 중 하나에서의 플라스미드의 삼입에 의해 생성된, 조립된 플라스미드 분자의 양 말단에 위치하는 플라스미드 분자 내의 BglⅡ부위와, L41유전자의 BglⅡ부위로 부터 생성된다. 이것은 플라스미드 분자가 상동성 재조합에 의해 L41유전자 위치에 조립된 것을 나타내며, ClaⅠ부위에서 분해된 경우에는 플라스미드 분자가 L41유전자 위치에 조립되고 BglⅡ부위에서 분해된 경우에는 rDNA위치에 각각 조립되는 것을 나타낸다. 이것은 플라스미드를 조립하는 위치가 절단부위에 따라 선별될 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 레인 1 내지 4에서 5.4kb, 7.4kb 및 6.4kb의 밴드가 거의 동일한 밀도를 가지므로, 염색체 내의 L41유전자 1카피의 존재가 입증되었다.
플라스미드 pCLRE5, pCLRE6 및 pCLRE7이 조립된 균주에서 BglⅡ와 NotⅠ분해에 의해 내인성 L41유전자에서 유도된 5.4kb의 밴드 이외에 염색체 내에 조립된 플라스미드로 부터 유도된 수개의 밴드가 관찰되었다.(도 21(2)). 이들 중에서 상기 플라스미드들과 동일한 크기를 가지는 밴드가 관찰되었는데, 즉 pCLRE5에 대하여는 7.3kb의 밴드(레인 1내지 4), pCLRE6에 대하여는 8.0kb의 밴드(레인 5 내지 8), 그리고 pCLRE7에 대하여는 9.4mb의 밴드(레인9 내지12)가 관찰되었다. 이 밴드들은 상기 플라스미드들 내에 하나의 절단 부위만을 가지는 NotⅠ으로의 분해에 의해 세로로 조립된 근접 플라스미드로부터 생성된다. 또한, pCLRE5에서는 7kb의 밴드(레인 1 내지 4)가, pCLRE6에서는 6.9kb의 밴드(레인 5 내지 8)가 pCLRE7에서는 11kb의 밴드(레인 9 내지 12)가 관찰되었다. 이러한 크기는 플라스미드 DNA가 rDNA 위치에 상동 재조합에 의해 조립되는 경우에 BglⅡ+NotⅠ분해에 의해 얻어진 rDNA 위치 내의 BglⅡ부위에서 플라스미드 DNA내의 NotⅠ부위까지의 단편의 길이와 동일하다. 이것은 플라스미드 DNA가 상동 재조합에 의해 염색체 내의 절단부위에 조립되었음을 나타낸다.
도 21(1)의 레인 1 내지 4의 5.4kb밴드가 L41유전자의 1카피에 해당하고, 도 21(1)의 레인 5내지 8과 도 21(2)의 레인 1 내지 12의 5.4.kb밴드가 L41유전자의 2카피에 해당한다는 가정하에 밴드의 농도를 비교하여 조립된 플라스미드의 카피수를 구하였다. 밴드의 농도는 Imaging Analyer BAS200(FujiFilm사 제품)로 측정하였다.
이것은 플라스미드 pCLRE4의 3 카피(레인 4) 내지 5 카피(레인 1과 3) 가 L41 유전자 위치에 삽입되었고 2 카피(레인 8) 내지 8 카피(레인 5)는 rDNA 위치에 삽입되었음을 나타내는 것이다. 이 결과로부터 플라스미드 DNA가 rDNA위치에 조립되는 경우 카피수가 높은 균주가 선별되는 경향이 관찰되엇다. 또한, 플라스미드 pCLRE4가 rDNA 위치에 조립된 실시예 12의 균주에서는 조립된 플라스미드 DNA의 카피수가 6 내지 15 카피이지만, 플라스미드 pCLRE2가 URA3 유전자 위치에 조립된 실시예 16의 균주에 있어서는 조립된 플라스미드 DNA의 수가 3내지 4카피였다.
이것은 플라스미드 pCLRE4에 대하여는 3 (도 21(2), 레인4) 내지 5(레인2) 카피, pCLRE6에 대하여는 3 (레인 8) 내지 6 (레인 5와 6) 카피, 그리고, pCLRE7에 대하여는 3 (레인 12) 내지 5 (레인 9) 카피가 각각 조립되었음을 나타낸다.
실시예 16: URA 3 유전자 위치로의 플라스미드의 조립
URA3 유전자를 포함하는 5 kb의 EcoRI 단편(도 7)을 플라스미드 pCLBS 12의 EcoRI 부위(도 15)에 삽입하여 플라스미드 pCLURA1을 구성하였다. 이 플라스미드 URA3 유전자 위치의 PstI 부위에서 절단하였다. 실시예 11에 기재된 전기 펄스법에 따라 상기 플라스미드로 ATCC9950 균주를 형질전환하였다. 전기 용량 25 ㎌, 저항 800 Ω 및 전압 5 KV/cm의 조건하에서 펄스를 가하여, DNA 1 ㎍ 당 40개의 시클로헥시미드 내성 콜로니를 얻었다.
얻어진 시클로헥시미드 내성 균주 중 4개의 콜로니에 대하여 염색체 DNA를 제조하였다. 제조된 DNA를 Bg1Ⅱ 또는, SalI+NotI으로 분해하여 써던 분석을 실시하였다. Bg1Ⅱ로 분해된 DNA에 대하여는 L41 유전자를 포함하는 1.8 kb의 BamHI-HindⅢ 단편(도 12)이, SalI+NotI으로 분해된 DNA에 대하여는 URA3유전자를 포함하는 2.3 kb의 HindⅢ-EcoRI 단편(도 8)이 32p로 표지하여 프로브로서 사용되었다.
그 결과를 도 22에 나타내었다. 모균주 ATCC9950에 있어서는, URA3 유전자를 SalI+NotI으로 분해된 DNA에 대한 프로브로서 사용할 경우, 내인성 URA3 유전자로부터 유도된 13 kb의 밴드가 관찰되었다(도 22(1), 레인 1). 한편, 내성 균주에 있어서는, 13 kb의 밴드 이외에 세로로 조립된 다수의 플라스미드의 NotI 분해에 의해 생성된 10 kb의 밴드와, 염색체 상의 URA3 유전자중 하나에 플라스미드를 삽입하여 생성된 8.4 kb와 14 kb의 밴드가 관찰되었다(레인 2 내지 5). 이러한 2개의 밴드는, 조립된 플라스미드 분자의 양 말단의 플라스미드 분자 내의 NotI 부위; 및 URA3 유전자 영역의 SalI 부위의 존재에 의하여 생성된다. 이것은 플라스미드 분자가 상동 재조합에 의해 URA3 유전자 위치에 조립되었음을 나타낸다.
또한, 형질전환체에 있어서 내인성 URA3 유전자에서 유도된 13 kb의 밴드와 염색체 내에 조립된 플라스미드 분자로부터 유도된 8.4 kb와 14 kb의 밴드는 거의 동일한 농도를 가진다. 이것은 URA3 유전자의 카피수가 LA1 유전자와 같이 세포 당 2 카피이며, 형질전환체 중 1카피는 플라스미드의 삽입에 의해 분쇄되었음을 나타낸다. 4개의 밴드(14 kb, 13kb, 10kb 및 8.4 kb)를 비교한 결과, 조립된 플라스미드의 수는 3 카피(레인 3과 5)또는 4 카피(레인 2및 4)였다.
L41 유전자가 BalⅡ로 분해된 DNA에 대한 프로브로서 사용될 경우, 모균주인 ATCC9950내에서 내인성 L41 유전자에서 유도된 5.4 kb의 밴드가 관찰되었다. 5.4 kb의 밴드 이외에, 플라스미드 DNA와 동일한 크기를 가지는 10 kb의 밴드가 내성 균주에서 관찰되었다(레인 2 내지 5).
실시예 17: 캔디다 유틸리스 내에서의 이종 유전자인 글루코아밀라제 유전자의 발현
(1) 글루코아밀라제 유전자(STAI 유전자)의 발현을 위한 플라스미드의 구성
STAI 유전자를 발현하기 위한 플라스미드를 도 23의 방법에 따라 구성하였다.
먼저,Saccharomyces diastaticus 5106-9A (leu2, arg4, STAI) (Yamashita and Fukui, Agric, Biol, Chem., 47, 2689-2692)의 게놈 DNA 라이브러리로부터 다음 방법에 따라 상기 STAI 유전자를 클론하였다. 5106-9A 세포로부터 염색체 DNA를 제조하여 Sau3AI으로 부분적으로 분해하고 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 약 20 내지 30 kb의 DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편과 BamHI으로 분해한 후 탈인산화된 λ-파아지 벡터 EMBL3(Stratagene Cloning Systmes)를 T4리가제로 결찰하였다. 결찰된 혼합물을 GigapackⅡ Gold Packaging Extract (Stratagene Cloning Systmes)를 이용하여 시험관 내에서 패키지하여 염색체 DNA의 게놈 DNA 라이브러리를 구성하였다.
STAI 유전자의 알려진 DNA 서열(Yamashita et al., J. Bacteriol., 161, 567-573, 1985)에 기초하여 합성된 다음의 2개의 올리고뉴클레오티드를 T4 카이네이즈에 의해 그 말단을 32p-표지하여 약 20,000플라크의 게놈 DNA 라이브러리를 선별하기 위한 프로브로서 사용하였다. 그 결과, 2개의 프로브 모두에 대하여 양성인 클론을 얻었다.
5'-ACCACTATTACCACTACGGTTTGCTCTACA-3' (서열번호 19)
5'-GACACATCTCTGACGAGCATGACTTGGTTG-3'(서열번호 20)
이 STAI 유전자를 포함하는 파아지 클론으로부터 STAI 유전자를 포함하는 4 kb의 BglⅡ-HpaI 단편을 pUC19의 BamHI과 HindⅢ 사이에 클론하여 플라스미드 pUSTAl을 구성하였다(도 23).
이어서, 플라스미드 pUSTAl을 개시 코돈 ATG의 5 bp 하부에 존재하는 StuI 부위에서 절단하고, XbaI 부위와 개시 코돈을 포함하는 다음 합성 어댑터(서열번호 21)를 결찰하였다.
5'-CTAGATGGTAGG-3'
3'-TACCATCC-3'
SalI으로 플라스미드를 부분적으로 분해하여 2.7 kb의 XbaI-SalI 단편으로서 STA 유전자를 얻었다.
다음으로, pUC12를 PstI과 HindⅢ로 분해하여 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고 BglⅡ 링커를 결찰하여 플라스미드 pUC12BglⅡ를 구성하였다. STAl 유전자를 포함하는 2.7 kb의 XbaI-SalⅡ 단편을 플라스미드 pUC12BglⅡ의 XbaI 과 SalⅡ 사이에 삽입하여 플라스미드 pUSTA2를 구성하였다.
2.7 kb의 XbaI-BglⅡ 단편을 플라스미드 STA2로부터 절단하여 발현벡터 pPGKPT4의 XbaI과 BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pGKSTAl을 구성하였다.
또한, PGK 유전자 프로모터, STAI 유전자 및 PGK 터미네이터를 포함하는 4.9 kb의 NotI 단편을 플라스미드 pGKSTA1으로부터 절단하였다. 이 단편을 플라스미드 pCLBS12의 NotI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCLSTA1을 구성하고, 플라스미드 pCLRE4의 NotI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCLRSTA1각각 구성하였다.
(2) 캔디다 유틸리스의 형질전환과 글루코아밀라제의 발현
ATCC9950, ATCC9226 및 ATCC9256 균주를 BglⅡ로 분해된 플라스미드 pCLRSTA1을 이용하여 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 따라 형질전환하였다. 전기 용량 25 ㎌, 저항 1000 Ω 및 전압 3.75 또는 6.25 KV/cm의 조건 하에서 자극을 가하였다.
균주에 따라 빈도는 상이하였으나 어떠한 균주에서도 시클로헥시미드 내성 콜리니가 얻어졌다.
기질로서 전분(3% 가용성 전분(Katayama사 제품), 2% 폴리펩톤, 1% 효모추출물, 3.3.X 10-3 % 브로모크레졸 퍼플, 2% 박토 아가)을 포함하는 플레이트에서 각각의 형질전환체중 2개의 균주에 대하여 글루코아밀라제 활성을 시험 하였다. 그 결과, 3개의 균주로부터 유도된 형질전환체 모두에 대하여 분비된 글루코아밀라제로 인한 할로(halo)가 관찰되었다. 그러므로, 유전자의 발현을 확인하였다. 또한, ATCC9950 균주는 AflⅡ로 분해된 플라스미드 pCLSTAl으로 형질전환되었다. L41 유전자 위치에 조립된 글루코아밀라제 유전자의 발현을 다시 시험하였을 때 할로의 생성이 관찰되었다.
다음으로, 상기한 형질전환제의 글루코아밀라제 활성을 측정하였다. 이 세포를 YPD 액체 배지에서 하룻밤 동안 배양하여 그 상징액을 정제되지 않은 효소액으로 이용하였다. 이 반응은 정제되지 않은 효소액 400 ㎕와 0.5% 가용성 전분 및 100mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)를 포함하는 반응용액 500 ㎕ 중에서 20분 동안 50℃에서 실시되었다. 반응 후, 효소를 100℃에서 5분 동안 열처리하여 불활성화하고 생성된 글루코스의 농도를 시판되는 키트(Glucose B-Test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) 로 측정하였다.
상기 반응조건 하에서 단리된 클루코스의 양이 100 ㎕ 일 때의 글루코아밀라제의 활성을 1 유니트로 하였다. 배양물의 상징액 1 ㎖ 당 활성값을 표 3에 기재하였다.
플라스미드 pCLSTA1 또는 pCLRSTA1으로 형질전환된 캔디다 유틸리스의 글루코아밀라아제 활성
플라스미드 글루코아밀라제 활성(유니트/㎖)
ATCC 9256 ATCC 9266 ATCC 9950
pCLRSTA1(Bg1Ⅱ) 11.3 7.9 8.3
pCLRSTA1(Bg1Ⅱ) 10.5 6.6 8.5
pCLSTA1(Af1Ⅱ) - - 7.6
pCLSTA1(Af1Ⅱ) - - 8.8
-DNA 0.0 0.0 0.0
활성은 2개의 독립된 형질전환 균주에 대하여 측정되었다.
─ : 측정 안됨.
이것은 글루코아밀라제는 Saccharomyces diastaticus에서 유도된 이종 단백질이지만 글루코아밀라제 단백질의 시그널 서열이 인지되어 효소가 ATCC9950, ATCC9226, 및 ATCC9256 균주에서 배지로 분비되었음을 나타내는 것이다.
또한, BglⅡ로 분해된 플라스미드 pCLSTAl 또는 AflⅡ로 분해된 플라스미드 pCLSTAl 각각으로 형질전환된 2개의 ATCC9950 균주를 40 ㎍/㎖의 시클로헥시미드와 5% 글루코스를 포함하는 YPD 액체 배지 중에서 4일 동안 30℃에서 배양하였다. 배양된 배지 10 ㎕를 4내지 20%의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기
영동을 실시하여 배양물 중의 단백질을 분석하였다(도 24). 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 대조용으로, BglⅡ로 분해된 플라스미드 pCLRE2로 형질전환된 균주의 배양 배지를 분석하였다(레인 1). 글루코아밀라제에 해당하는 약 100 kDa의 단백질이 각 배양물에 관찰되었고, 단백질의 양은 염색된 밴드의 농도로부터 약 2 내지 5 ㎍으로 측정되었다. 이것은 글루코아밀라제 유전자가 높은 수준으로 발현되어 배지 내로 분비되었음을 나타낸다. 또한, 캔디다 유틸리스가 분비 단백질을 제조하기 위한 적당한 숙주/벡터 시스템으로 사용될 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 18: 캔디다 유틸리스에서 이종 유전자(lacZ 유전자)의 발현
(1) lacZ 유전자를 발현하기 위한 플라스미드의 구성
도 25에 예시한 방법에 따라 lacZ 유전자를 발현하기 위한 플라스미드를 구성하였다.
먼저, β-갈락토시다제를 코드하는 lacZ 유전자를 플라스미드 pMC1871 (Pharmacia사 제품)로부터 3.1kb의 BamHI 단편으로 절단하였다. 이 단편을 플라스미드 YEp13K(Sone et al., Appl. Environ. Microbiol., 54, 38-42 (1988))의 BglⅡ 부위에 결찰하여 유전자의 5'쪽에 HindⅡ 부위를 가지는 플라스미드 pZ4를 선별하였다.
개시 코돈 ATG를 가지는 lacZ 유전자를 상기 플라스미드로부터 3.1 kb의 HindⅢ-XhoI 단편으로 절단하였다. 이 단편을 pBluescript SK- 의 HindⅢ와 XhoI 사이에 결찰하여 플라스미드 pLACZ1을 구성하였다.
이 플라스미드를 HindⅢ+XbaI으로 분해하고, 클레노우 효소로 처리한 후, 다시 고리화하여 플라스미드 pLACZ2를 구성하였다.
다음으로, lacZ 유전자를 상기 플라스미드로부터 3.1 kb의 XbaI-KpnI 단편으로 절단하여 플라스미드 pPGKPT5(도 4)의 XbaI 과 KpnI 부위에 결찰하여 플라스미드 pPGKLAC1을 구성하였다.
또한, PGK 유전자 프로모터, lacZ 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 5.4kb 의 NotI 단편을 플라스미드 pGKLAC1으로부터 절단하여 플라스미드 pCLBS 12의 NotI 부위와 플라스미드 pCLRE4 의 NotI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCLLAC1과 pCLRLAC1 각각을 구성하였다.
(2) 캔디다 유틸리스의 형질전환과 β-갈략토시다제 활성의 확인
ATCC9950 균주를 Bg1Ⅱ로 분해된 플라스미드 pCLRLAC1 또는 Af1Ⅱ로 분해된 플라스미드 pCLLAC1을 이용하여 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 의해 형질전환하였다. 형질전환된 각각의 ATCC9950 균주중 2주를 5 ㎖의 YPD 액체 배지에서 대수 성장기(OD600 = 약 2 내지 3)까지 6시간동안 배양하였다. β-갈락토시다제의 활성을 Methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose, M.D. et al., p155-159, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990)에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 구체적으로는 수집된 세포를 Z 완충액 1 ㎖ 중에 현탁하고 클로로포름 3방울과 0.1의 SDS 2 방울을 첨가하여 10초동안 보텍스 진탕하였다. 28℃에서 5분 동안 항온처리한 후, ONPG 용액 0.2 ㎖를 첨가하여 이 혼합물을 다시 10분 동안 항온처리한 후, ONPG 용액 0.2 ㎖를 첨가하여 이 혼합물을 다시 10분 동안 항온처리하였다. 다음으로, Na2 CO3 용액 0.5 ㎖를 첨가하여 반응을 중지하였다. OD420을 측정한 후, β-갈락토시다제 활성을 계산식에 따라 계산하였다. 오르토-니트로페놀이 28℃에서 1분동안 1nm이 제조될 때의 β-갈락토시다제의 활성을 1 유니트로 하였다. OD600 당 얻어진 세포의 활성을 표 4에 기재하였다.
플라스미드 pCLLAC1 또는 pCLRLAC1으로 형질전환된 ATCC9950 균주의 β-갈락토시다제 활성
플라스미드 β-갈락토시다제 활성(유니트/OD600)
pCLLAC1(Af1Ⅱ) 6.4
pCLLAC1(Af1Ⅱ) 6.7
pCLRLAC1(Bg1Ⅱ) 6.8
pCLRLAC1(Bg1Ⅱ) 7.0
-DNA 0.1
이 결과로부터, 플라스미드 pCLRLAC1 또는 pCLLAC1으로 형질전환된 ATCC 9950 균주 2개가 모두 활성을 나타내었고,E.coli로부터 유도된 lacZ 유전자가 캔디다 유틸리스에서 발현되었으며 활성 β-갈락토시다제가 생산되었음을 확인하였다.Condida maltosa또는 C.albicans(Ohama et al., Nucleic Acids Res., 21, 4039-4045, 1993) 등의 캔디다속의 일부 효모에서 루이신 코돈 CUG가 세린으로 번역되므로E.coli로부터 유도된 lacZ 유전자는 활성 β-갈락토시다제로 번역되지않는다고 알려져 있다(Sugiyama et al., Yeast, 11, 43-52, 1995). 이 실시예에서는 활성 β-갈락토시다제가 캔디다 유틸리스에서 제조되었으며, 실시예 17에서는 글루코아밀라제가 다량 제조되는 것으로 나타났다. 따라서, 캔디다 유틸리스는 이종 유전자를 발현하는 숙주로 사용될수 있을 것으로 기대된다.
실시예 19: 캔디다 유틸리스에서 이종 유전자(APT)의 발현
(1) APT 유전자를 발현하기 위한 플라스미드의 구성
도 26에 예시한 방법에 따라 APT 유전자를 발현하기 위한 플라스미드를 구성하였다.
먼저, 트랜스포손 Tn903으로부터 유도된 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APT 유전자)를 포함하는 플라스미드 pUC4K (Pharmacia사 제품)로부터 1.1 kb 의 XhoI-PstI 단편을 절단하고 pUC19의 SalI 과 PstI 사이에 삽입하여 플라스미드 pAPH1을 구성하였다.
플라스미드 pAPH1을 PstI으로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 둔단을 형성한 후, BglⅡ 링커(5'-CAGATCTG-3')를 삽입하여 플라스미드 pAPH2를 구성하였다.
다음으로, APT 유전자를 상기 플라스미드 pAPH2로부터 1.1 kb의 XbaI-BglⅡ 단편으로 절단하여 발현벡터 pPGKPT4(도 4)의 XbaI 과 BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pGKAPH1을 구성하였다.
또한, PGK 유전자 프로모터, APT 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 3.3 kb의 NotI 단편을 플라스미드 pGKAPH1으로부터 절단하였다. 이 단편을 플라스미드 pCLBS12와 pCLRE4의 NotI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCLAPH1과 pCLRAPH1 각각을 구성하였다.
(2) 캔디다 유틸리스의 형질전환과 G418에 대한 내성 확인
ATCC9950, ATCC9226 및 ATCC9256 균주를 BglⅡ로 분해된 플라스미드
pCLRAPH1을 이용하여 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 따라 형질전환하였다. 전기용량 25 ㎌, 저항 1000 Ω 및 전압 3.75 또는 6.25 KV/cm의 조건하에서 자극을 가하였다.
그 결과, 균주에 따라 빈도는 상이하였으나 어떠한 균주에서도 시클로헥시미드 내성 콜로니가 얻어졌다. 다양한 농도가 G418을 포함하는 YPD 플레이트에서 각각의 형질전환체중 2개의 균주에 대하여 세포의 생육을 시험하였다. 그 결과, 캔디다 유틸리스의 3균주 모두에 대하여 형질변환체의 생육이 시험하였다. 그 결과, 캔디다 유틸리스의 3균주 모두에 대하여 형질변환체의 생육이 확인되었고, 또한 APT 유전자가 이들 형질전환체에서 발현된 것으로 나타났다.
또한, ATCC9950 균주를 AflⅡ로 분해된 플라스미드 pCLAPH1으로 형질전환하여 L41 유전자 위치에 조립된 유전자의 발현을 시험하였다. 그 결과, 이 균주에 대하여 형질전환체의 생육이 확인되었으며, L41 유전자 위치에 조립된 APT 유전자에서 발현이 확인되었다.
(3) 조립된 플라스미드의 안정성
Bg1Ⅱ로 분해된 플라스미드 pCLRAPH1 또는 AflⅡ로 분해된 플라스미드 pCLAPH1 각각으로 형질전환된 2개의 ATCC9950 균주에 대하여 조립된 플라스미드 DNA의 안정성을 다음 방법으로 시험하였다. 먼저, 형질전환체를 시클로 헥시미드 40 ㎍/㎖를 포함하는 YPD 액체 배지 5㎖에서 정상기까지 배양하였다. 이때의 세대수를 0으로 하였다. 다음으로, 세포 배양물 5 ㎕를 YPD 액체 배지 5㎖에 접종하여 정상기까지 배양하였다. 이때의 세대수를 10으로 하였다. 이 과정을 반복하여 세포를 20번째 세대까지 배양하였다. 희석된 세포 현탁액을 YPD 플레이트과 시클로헥시미드 40 ㎍/㎖를 포함하는 YPD 플레이트에 도포한 후, 이 플레이트를 30℃에서 2일 동안 배양하여 콜로니 수를 세어서 플라스미드의 안전성을 계산하였다.
그 결과를 표 5에 기재하였다.
ATCC9950의 염색체 내에 조립된 플라스미드 DNA의 안정성
플라스미드 보유율()
pCLRAPH1(Bg1Ⅱ) 91.3
pCLRAPH1(Bg1Ⅱ) 87.8
pCLAPH1(Af1Ⅱ) 99.5
pCLAPH1(Af1Ⅱ) 98.6
그 결과로부터 rDNA 위치와 L41 유전자 위치에 조립된 DNA 단편이 안정한 것을 확인하였다.
실시예 20: 선택 마커로서 G418에 대한 내성을 이용하는 캔디다 유틸리스 형질전환체의 선별
플라스미드 pCLRAPH1은 형질전환체에 대한 선택 마커로서 시클로헥시미드에 대한 내성을 주는 변이된 L41 유전자와 G418에 대한 내성을 주는 APT 유전자를 포함한다. APT 유전자가 PGK 유전자 프로모터에 의해 발현되는 것을 확인하였기 때문에 G418에 대한 내성에 의한 형질전환체의 직접 선택을 시험하였다.
플라스미드 pCLRAPH1 을 BglⅡ로 분해하여 선형의 플라스미드를 제조하였다. ATCC9950 균주를 실시예 11의 전기 자극법에 의해 선형화된 상기 플라스미드를 이용하여 형질전환하였다. 전기용량 25 ㎌, 저항 1000 Ω 및 전압 5 KV/cm의 조건 하에서 자극을 가하였다. 이 세포를 1M 소르비톨을 포함하는 YPD 배지에서 6 시간동안 배양하고 시클로헥시미드를 포함하는 YPD 플레이트와 G418 150 ㎍/㎖를 포함하는 YPD 플레이트에 도포하였다.
그 결과를 도 6에 기재하였다.
상이한 약제 내성 마커에 의한 플라스미드 pCLRAPH1으로 형질전환된 ATCC9950의 선별
플라스미드 G418 시클로헥시미드
1000Ω 800Ω 1000Ω 800Ω
pCLRAPH1 100 111 7 18
-DNA 0 - 0 -
* DNA 0.1㎍당 형질변환체의 수
* G418과 시클로헥시미드의 농도는 각각 150 및 40㎍/㎖로 고정하였다.
* - : 측정되지 않음.
상기한 결과로 부터, G418에 대한 내성에 의해 선별된 콜로니의 수가 시클로헥시미드 내성에 의해 선별된 것보다 10 배 더 큰것을 알 수 있다.
G418 내성에 의해 선별된 4개의 콜로니와 시클로헥시미드 내성에 의해 선별된 4개의 콜로니에 대하여 염색체 DNA를 제조하였다. 제조된 DNA를 BglⅡ+NotI으로 분해하여 L41 유전자를 포함하는 1.8 kb의 32p로 표지된 BamHI-HindⅢ 단편을 프로브로 하여 써던 분석을 실시하였다(도 27). 그 결과 내인성 L41 유전자로부터 유도된 5.4 kb의 밴드 이외에 상기 플라스미드에서 유도된 4.4 kb의 밴드가 관찰되었다. 밴드의 농도를 Imaging Anayzer BAS 2000 (Fuji Film사 제품)으로 측정하였다. 이 플라스미드에서 유도된 밴드와 내인성 141 유전자(2 카피/세포)에서 유도된 밴드를 비교하여 조립된 플라스미드의 카피수를 계산하였다. 그 결과, 시클로헥시미드 내성에 의해 선별된 균주 내에 플라스미드가 4(레인 2) 내지 7 카피(레인 5)가 존재하는 것으로 나타났다. 또한, G418 내성에 의해 선별된 4개의 균주 모두에서 플라스미드는 1 카피(레인 6내지 9)가 존재하는 것으로 계산되었다. 이러한 결과는, 형질전환체를 선별하기 위한 마커로서 변이된 L41 유전자를 사용할 경우 다수의 플라스미드가 조립된 균주가 쉽게 얻어질 수 있는 반면, 형질전환 빈도는 낮아지게 되는 것을 나타낸다.
다음으로, 플라스미드 pGKAPH1을 Not1으로 분해하여 2개의 단편을 제조하였다. 즉, 이플라스미드를 PGK 유전자 프로모터, APT 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 단편과 벡터 단편으로 분할하였다. 이 단편들을 이용하여 ATCC9950 균주를 형질전환하였다. 전기용량 25 ㎌, 저항 1000 Ω 및 전압 5 KV/cm의 조건하에서 자극을 가하였다. 형질전환체를 G418 200 ㎍/㎖를 포함하는 YPD 플레이트에서 선별할 경우, DNA 1㎍에 대하여 156개의 형질전환체를 얻었다. 이러한 결과는, 캔디다 유틸리스 내에서 BglⅡ로의 분해에 의해 선형화된 플라스미드 pCLRAPH1을 이용한 유전자 삽입 형질전환 이외에 유전자를 치환하는 형질전환이 일어난 것을 나타낸다. 또한, 형질전환의 빈도가 비교적 높기 때문에, 유전자 치환에 의한 형질전환과이 효과적으로 발생된 것으로 나타났다.
실시예 21: PGK 유전자 프로모터의 단축과 최소 작용 영역의 확인
실시예 17 내지 20에서 사용된 PGK 유전자 프로모터를 프로모터의 최소작용 영역을 확인하기 위한 단축화를 시험하였다.
먼저, 길이가 다른 PGK 유전자 프로모터, APT 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 5개의 단편을 실시예 19에 기재된 플라스미드 pGKAPH1의 PGK 유전자 프로모터 단편의 제한효소 부위를 이용하여 제조하였다. 즉, 플라스미드 pGKAPH1을 NotI, SacI, EcoRI + SacI 또는 PstI + SacI으로 분해하여 4개의 단편을 제조하였다. 플라스미드 pGKAPH1을 SphI으로 분해하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 둔단을 형성하였다. BamHI 링커 (5'-CCGGATCCGG-3' : 서열번호 22)를 부가하고 BamHI 및 NotI으로 분해하여 다른 단편을 얻었다.
실시예 5의 플라스미드 pCRE2를 분해하여 얻어진 0.7 kb 와 5.8 kb의단편중 5.8 kb의 단편을 결찰하여 다시 고리화하여 플라스미드 pCRE8(도 28)을 제조하였다. 이 플라스미드 pCRE8 을 NotI, BamHI + NotI, SacI, EcoRI + SacI 또는 PstI + SacI으로 분해하고 상기한 단편들과 결찰하여 플라스미드 pCRE8(도 28)을 제조하였다. 이 플라스미드 pCRE8을 NotI, BamHI + NotI, SacI, EcoRI + SacI 또는 PstI+SacI으로 분해하고 상기한 단편들과 결찰하여 플라스미드 pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4, pCRAPH5 및 pCRAPH6를 구성하였다(도 28). 각각의 플라스미드에 포함된 PGK 유전자 프로모터 단편의 길이는 pCRAPH2에서는 1.35kb, pCRAPH3에서는 0.83kb, pCRAPH4에서는 0.46kb, pCRAPH5에서는 0.40kb, pCRAPH6에서는 0.16kb이었다.
구성된 플라스미드 pCRAPH2, 3, 4, 5 및 6 각각을 BglⅡ로 분해하여 선형화 한 후, 실시예 11의 전기 자극법에 따라 ATCC9950의 형질전환에 사용하였다.전기 용량 25 ㎌, 저항 1000 Ω및 전압 5KV/cm의 조건 하에서 자극을 가하였다.
형질전환체를 G418 200 ㎍/㎖를 포함하는 YPD 플레이트에서 선별하였다. 플라스미드 pCRAPH2, 3, 4 및 5를 사용할 경우, 각 플라스미드로 DNA 1㎍에 대하여 약 300개의 형질전환체를 얻었다. 그러나, 플라스미드는 pCRAPH6를 사용한 경우에는 형질전환체는 얻어지지 않았다. 이러한 결과는 PGK 유전자의 개시 코돈 ATG 바로 앞의 뉴클로레오티드에서 5' 말단의 상부 169bp의 PstI 부위까지의 영역을 포함하는 단편은 전사 프로모터로서의 작용을 가지지 않지만, 401bp 상부의 EcoRI 부위까지를 포함하면서 더 긴 영역을 포함하는 단편은 전사 포로모터로서 작용한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 도 3에 나타낸 PGK 유전자 프로모터를 포함하는 1346 bp의 서열에 있어서, 946번째 EcoRI 부위에서 ATG 바로 앞의 1346번째 뉴클레오티드까지의 401bp 서열은 프로모터 작용에 필요한 서열을 포함한다.
실시예 22: 글리세로알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAP) 유전자의 클로닝과 GAP 유전자를 포함하는 DNA 단편의 DNA 서열의 결정
캔디다 유틸리스 내에서 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP) 유전자의 클로닝은 DNA 라이브러리로서 실시예 2에서 구성된 캔디다 유틸리스의 게놈 DNA 라이브러리를 이용하여 프로브로서 다른 생물체의 기지의 GAP 유전자를 사용하는 혼성화 방법에 의해 실시되었다. 약 20, 000 플라크의 상기 라이브러리의 파지 DNA가 흡착된 필터를 Molecular Cloning, 2판, p2, 95-121, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 한편, 사카로마이세스 세리비제의 GAP 유전자를 포함하는 2.1 kb의 HindⅢ 단편을 보유하는 pUC18(Yamanto et al., Journal of Biotechnology, 32, 165-171, 1994)의 유도 플라스미드로부터 GAP 유전자의 대부분을 차지하는 단편으로서 약 1 kb의 AsuⅡ-AflⅡ 단편을 절단하였다. 이 단편을 32p로 표지화하고, 표지된 단편을 프로브로 이용하여 혼성화하였다. 3개의 양성 플라크를 단리하였다. 상기한 플라크 중 하나로 제조된 파아지 DNA를 서브클론하여 파아지 DNA에 포함된 6.5 kb의 EcoRI 단편을 단리하였다. 그런 다음, 이 단편을 플라스미드 벡터 pBlue-script ⅡSK+의 EcoRI 부위에 삽입하여 플라스미드 pGAP1 과 2를 구성하였다(도 29).
6.5kb의 단리된 EcoRI 단편을 제한효소 HindⅢ, ClaI, SmaI 또는 SpeI 만으로 분해하거나 또는 이들의 조합에 의해 분해하고, 생성된 단편들에 대하여 사카로마이세스 세리비제의 GAP 유전자를 프로브로 하여 써던 혼성화를 실시하였다. 3.8 kb의 HindⅢ-SpeI 단편으로 강한 혼성화가 관찰되었다. 상기한 3.8 kb의 HindⅢ-SpeI부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pGAP1RHK pGAP2를 각각 제조하였다. 상기 플라스미드에 대하여 HindⅢ, ClaI 또는 SmaI 등의 제한효소 부위에서 결실이 발생한 변이체를 제조하고 ExoⅢ 및 녹두 뉴클레아제로 연속적인 결실 변이체를 제조하여 다양한 결실 돌연변이를 가지는 플라스미드를 제조하고, 3749 bp의 HindⅢ-SpeI단편의 서열을 결정하였다(도 29).
예상된 구조 유전자 영역을 분석한 결과, 1005 bp의오픈 리딩 프레임이 관찰되었다. 이 프레임으로부터 추정된 유전자 생성물의 아미노산 서열과 관련하여, 사카로마이세스 세리비제의 GAP 유전자 생성물에 대한 상동성이 시험되었다. 이들의 서열은 각각에 대항여 79.6%의 상동성을 나타내었으므로 단리된 유전자가 캔디다 유틸리스의 GAP 유전자 생성물에 대한 상동성이 시험되었다. 이들의 서열은 각각에 대하여 79.6%의 상동성을 나타내었으므로 단리된 유전자가 캔디다 유틸리스의 GAP 유전자인 것으로 결론지어졌다. 또한, 이 단편은 조절영역으로 개시 코돈의 상부 975 bp의 서열과 종료 코돈 하부 1769bp의 서열을 포함한다. 전사 프로모터를 포함하는 것으로 추정되는 HindⅢ 부위에서 개시 코돈 ATG의 바로 앞까지의 975 bp의 서열을 도 30에 나타내었다. 또한, 전사 터미네이터를 포함하는 것으로 추정되는 종료 코돈 TAA 바로 뒤에서 AflⅡ 부위까지의 802 bp 서열을 도 31에 나타내었다.
실시예 23: GAP 유전자의 프로모터와 터미네이터를 이용한 발현벡터의 구성
캔디다 유틸리스의 GAP 유전자 조절 영역으로부터 PCR 방법에 의해 프로모터 또는 터미네이터 중 하나를 포함하는 DNA 단편을 얻었다(도 29).
플라스미드 pGAP1을 주형으로 이용하여 HindⅢ 부위에서 개시 코돈 ATG바로 앞까지의 단편을 프로모터로서 얻었다. 프라이머로는 다음의 2개 서열이 이용되었다.
5'-CCAAGCTTCACGCCAGCACTCAAATCTGCCC-3' (서열번호 23)
5'-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3' (서열번호 24)
프로모터는 3' 하부쪽의 개시 코돈 바로 앞에 XbaI 부위가 위치하도록 합성 되었다.
또한, 플라스미드 pGAP1을 주형으로 이용하여 종료 코돈의 바로 뒤에서 SpeI 부위까지의 단편을 터미네이터로서 얻었다. 프라이머로는 다음의 2개 서열이 이용되었다.
5'-GGGATCCATTGRTATGACTTTTATTTATGGG-3' (서열번호 25)
5'-GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3' (서열번호 26)
터미네이터는 5'쪽의 종료 코돈 바로 뒤에 BamHI 부위가 위치하도록 합성되었다.
Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene사 제품)로 PCR 방법을 30회 실시하였다.
PCR 방법에 의해 합성된 프로모터 단편을 HindⅢ와 XbaI으로 분해하고, pUC19 벡터의 HindⅢ와 XbaI의 부위에 삽입하여 플라스미드 pUGpro를 구성하였다(도 32). 한편, 터미네이터 단편을 종료 코돈의 약 0.8 kb 하부의 AflⅢ 부위에서 분해하여 클레노우 효소로 처리하여 DNA에서 둔단을 형성하고 BamHI으로 분해하였다. 얻어진 0.8 kb의 단편을 pUC19 벡터의 BamHI과 SmaI 부위의 사이에 삽입하여 플라스미드 pUGter을 구성하였다(도 32).
플라스미드 pUGter의 GAP 터미네이터 하부 말단의 EcoRI 부위를 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성한 후, NotI 링커(5'AGCGGCCGCT3' : 서열번호 18)를 단리하여 pUGterN을 구성하였다. 다음으로, 플라스미드 pUGpro로부터 0.95 kb의 GAP 프로모터 단편을 HindⅢ와 XbaI으로 절단하여 pUGterN의 HindⅢ와 XbaI 부위 사이에 삽입하여 발현 플라스미드 pGAPPT1을 구성하였다. 또한, 상기 프로모터의 상부 말단의 HindⅢ 부위를 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성하고, NotI 링커(5'AGCGGCCGCT3': 서열번호 18)를 연결하여 플라스미드 pGAPPT2를 구성하였다(도 32).
구성된 발현 플라스미드 pGAPPT2가 캔디다 유틸리스에서 실제적으로 작용하는지를 확인하기 위하여 실시예 19의 플라스미드 pAPH2로부터 XbaI과 BglⅡ로 절단된 1.1 kb의 APT 유전자 단편을 플라스미드 pGAPPT2의 XbaI과 BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pGAPAPH1을 구성하였다(도 32).
구성된 플라스미드 pGAPAPH1을 NotI으로 분해한 후, 전기용량 25 ㎌, 저항 1000Ω 및 전압 5KV/cm의 자극 조건하에서 전기 자극법에 의해 ATCC9950 균주의 형질전환에 사용하였다. 형질전환체를 G418 200 ㎍/㎖를 포함하는 YPD 플레이트에서 선별하였다. DNA 0.1 ㎍으로 약 40개의 형질전환체가 얻어졌다.
이 결과는 GAP 유전자의 프로모터와 터미네이터가 활성인 것을 나타낸다.
실시예 24: 원형질막 프로톤 ATP아제(PMA) 유전자의 클로닝과 PMA 유전자를 포함하는 DNA 단편의 DNA 서열 결정
실시예 2에서 구성된 캔디다 유틸리스의 게놈 DNA 라이브러리와 다른 생물체의 기지의 PMA 유전자 일부를 프로브로 이용한 혼성화 방법으로 캔디다 유틸리스의 원형질막 프로톤 ATP아제(PMA) 유전자를 클로닝하였다. 약 20,000플라크의 상기 유전자 라이브러리의 파지 DNA가 흡착된 필터를 Molecular Cloning, 2판, p2 95-121, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 사카로마이세스 세리비제의 PMA1 유전자의 DNA 서열로부터 합성된 다음 2개의 프라이머(Serrano et al., Nature 319, 689-693 (1986))를 이용하여 사카로마이세스 세리비제 AH22 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR 법에 의해 PMA1 구조 유전자 5' 말단의 +1 내지 +1027(개시 코돈 ATG의 A 를 +1로 하였다.)에 해당하는 약 1 kb의 영역을 증폭하였다 :
5'-ATGACTGATACATCATCCTCTTCATC-3' (서열번호 27)
5'-TAACGACAGCTGGCAAACCGACTGGGAC-3' (서열번호 28)
염색체 DNA를 Methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual -Rose, M.D. et al., p126-127, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990)에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 얻어진 단편을 32p로 표지하고, 표지된 단편을 프로브로 하여 혼성화하였다. 그 결과, 4개의 양성 플라크를 얻었다. 4개의 양성 플라크중 하나의 파아지 DNA에 대하여 삽입 DNA를 XbaI으로 분해하여 10 kb, 4 kb, 2.8 kb 및 2.6 kb 의 XbaI 단편을 단리하였다.
절단된 4개의 단편을 선별에 사용되는 사카로마이세스 세리비제의 약 1 kb의 PMA1 유전자 단편을 프로브로 혼성화할 경우, 프로브는 2.6 kb의 XbaI 단편과 혼성화되었다. 이 단편을 플라스미드 벡터 pBluescript ⅡSK+의 XbaI 부위에 삽입하여 서로 반대방향으로 삽입되는 플라스미드 pPMAF1과 pPMAF2를 제조하였다(도 33).
상기 플라스미드에 대하여 BamHI, ClaI 또는 EcoRI 등의 제한효소 부위에서의 결실 변이체를 제조하고, 결실변이체를 엑소뉴클레아제 Ⅲ와 녹두 뉴클레아제로 제조하여 다양한 결실 돌연변이를 가지는 플라스미드를 제조하고 양말단으로부터 매 1 kb의 DNA 서열을 결정하였다(도 33). 예상된 구조 유전자 영역을 분석하여, 사카로마이세스 세리비제의 PMA1 구조 유전자의 5' 말단 영역에 대하여 약 50 %의 상동성을 나타내는 352 bp의 오픈 리딩 프레임이 도 33중 좌측의 XbaI 부위에서 EcoRV 부위까지의 영역을 포함하는 1 kb의 서열에서 관찰되었다. 다른 쪽의 XbaI 부위에서 BamHI 부위를 포함하는 안쪽까지의 영역을 포함하는 약 0.8 kb의 서열 내에서 사카로마이세스 세리비제의 PMA1 유전자의 +1292에서 +2046(개시 코돈 ATG의 A를 +1로 하였다)까지의 범위에 대하여 70 %의 상동성을 나타내는 754 bp의 오픈 리딩 프레임이 관찰되었다. 이 결과로부터 단리된 유전자가 캔디다 유틸리스의 PMA 유전자인 것으로 판단되었다. 또한, 2.6 kb의 XbaI 단편은 개시 코돈 ATG 하부 599 bp의 서열을 포함하였다. 전사 프로모터를 포함하는 것으로 예상되는 599 bp 단편의 서열을 도 34에 기재하였다.
전사 터미네이터에 대하여는, 동일한 파아지 DNA로 부터 XbaI으로 절단된 다른 3개의 단편(10 kb, 4 kb 및 2.8 kb)을 서브클론하고, 이들의 DNA 서열을 양말단쪽에서 결정하여 사카로마이세스 세리비제 PMA1 유전자의 3'쪽 영역과의 상동성을 시험하였다. 그 결과, 2.8 kb의 XbaI 단편의 한 쪽에 상기한 PMA1 유전자의 3' 말단쪽과 높은 상동성을 나타내는 영역이 존재하는 것으로 나타났다. XbaI 단편을 플라스미드 벡터 pBluescript ⅡSK+의 XbaI 부위에 삽입하여 단편들이 서로 반대 방향으로 삽입된 플라스미드 pPMAL1과 pPMAL2를 제조하였다(도 33). 상기한 플라스미드들을 KpnI으로 분해하거나 또는 엑소뉴클레아제 Ⅲ 및 녹두 뉴클레아제를 이용하여 다양한 결실 돌연변이를 가지는 플라스미드들을 제조하고, XbaI 부위에서 KpnI 부위까지의 1.9 kb의 DNA 서열을 결정하였다(도 33). 이 DNA 서열은 사카로마이세스 세리비제의 PMA1 유전자의 +2041에서 +2757(개시 코돈 ATG의 A를 +1로 하였다.)까지의 범위와 종료 코돈 TAA의 하부 1188bp의 서열에 대하여 약 82%의 상동성을 가지는 717bp의 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 전사 터미네이터를 포함할 것으로 기대되는 종료 코돈 TAA 직후에서 KpnI 부위까지의 1188bp의 서열을 도 35에 나타내었다.
실시예 25: PMA 유전자의 프로모터와 터미네이터를 이용한 발현벡터의 구성
캔디다 유틸리스의 PMA 유전자 조절 영역으로부터 PCR 방법에 의해 프로모터 또는 터미네이터 중 하나를 포함하는 DNA 단편을 얻었다(도 33).
플라스미드 pPMAF1을 주형으로 이용하여 Xbal 부위의 하부 20bp의 위치에서 개시 코돈 ATG 바로 앞까지의 단편을 프로모터로서 얻었다. 프라이머로는 다음의 2개의 DNA 서열이 이용되었다.
5′-GGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGA-3′(서열번호 29)
5′-TTCTAGACTATATCAATGGTTAGTATCACGTG-3′(서열번호 30)
프로모터는 5′상부쪽 말단에는 Not1을 주형으로 이용하여 종료 코돈 TAA의 바로 뒤에서 종료 코돈의 403 bp 하부까지의 단편을 터미네이터로서 얻었다. 프라이머로는 다음의 2개의 DNA 서열이 이용되었다.
5′-CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3′(서열번호 31)
5′-GGGCGGCCGCACTCGCTGATCGAAA-3′(서열번호 32)
터미네이터는 5′상부쪽의 종료 코돈 바로 뒤에 Kpn1부위가 위치하고 3′하부 말단에 Not1 부위가 위치하도록 합성되었다.
Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene사 제품)로 PCR 방법을 30회 실시하였다. PCR 방법에 의해 합성된 프로모터 단편을 NotI과 Xbal으로 분해하고, pBlue-script ⅡSK+벡터의 NotI의 부위에 삽입하여 플라스미드 pBMpro를 구성하였다. 한편, 터미네이터 단편을 pBluescript ⅡSK+의 KpnI 부위와 NotI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pBMter을 구성하였다. 플라스미드 pBMter로부터 얻어진 0.4 kb의 KpnI-NotI 단편을, 플라스미드 pUC19의 EcoRI 부위를 클레노우 효소로 처리한 후 NotI 링커(5′AGCGGCCGC3′:서열번호 18)를 연결하여 구성된 플라스미드 pUC19N의 KpnI과 NotIQNDNLDP 삽입하여 플라스미드 pUMter을 구성하였다(도 36)
XbaI과 NotI으로 플라스미드 pUMter을 분해하여 얻어진 0.4kb의 터미네이터 단편과 NotI과 Xbal으로 플라스미드 pBMpro를 분해하여 얻어진 0.65kb의 프로모터 단편을 NotI으로 실시예 4에서 구성된 플라스미드 pPGKPT5를 분해하여 얻어진 2.9kb의 단편과 결찰하여 플라스미드 pMAPH1을 구성하였다(도 1).
구성된 발현 플라스미드 pMAPH1이 캔디다 유틸리스에서 실제적으로 작용하는지를 확인하기 위하여 실시예 19의 플라스미드 pAPH2로부터 XbaI과 Bg1Ⅱ로 절단된1.1 kb의 APT유전자 단편을 플라스미드 pMAPH1의 Xbal과 BamHIQNDNLDP 삽입하여 플라스미드 pMAAPH1을 구성하였다(도 36).
구성된 플라스미드 pMAAPH1을 NotI으로 분해한 구, 전기용량 25μF, 저항 1000Ω 및 전압 5KV/cm의 자극 조건 하에서 전기 자극법에 의해 ATCC9950 균주의 형질전환에 사용하였다.
형질전환체를 G418 200㎍/㎖를 포함하는 YPD 플레이트에서 선별하였다. DNA 0.1 ㎍으로 약 40개의 형질전환체가 얻어졌다. 이 결과는 GAP 유전자의 프로모터와 터미네이터가 활성인 것을 나타낸다.
실시예 26: 자율 복제 서열(ARS)을 포함하는 DNA 단편의 클로닝
PGK 유전자의 프로모터, APT 유전자 터미네이터를 포함하는 3.3 kb의 NotI 단편을 실시예19에서 구성된 플라스미드 pGKAPH1으로부터 절단하여 플라스미드 pBluescript ⅡSK-(Stratagene)의 NotI 부위에 삽입하여 플라스미드 pGKAPH2를 구성하였다(도 37). 다음으로, BamHI으로 분해되어 탈인산화된 플라스미드 pGKAPH2 200ng과 실시예 2에서 얻어진 캔디다 유틸리스 ATCC9950 균주의 게놈 DNAFMF Sau3AI으로 부분적으로 분해하여 얻어진 3 내지 7 kb의 단편 200 ng을 T4 DNA 리가제를 이용하여 결찰하였다. E.coli DH5를 DNA 용액을 이용하여 형질전환하고, 플라스미드 DNA 혼합물을 게놈 DNA 라이브로리로부터 얻어진 약 30,000개의 형질전환체로부터 추출하였다. ATCC9950 균주를 각각의 라이브러리에서 제조된 DNA 3㎍을 이용하여 전기 용량 25㎌, 저항 800 또는 1,000Ω 및 전압 3.75 또는 5 KV/cm의 4가지 조건하에서 실시예 11의 전기 자극법에 따라 형질전환하였다. 7개의 시클로헥시미드 내성 콜로니를 얻었다. 이들 내성 균주를 G418 400 ㎍/㎖를 포함하는 YPC 배지에서 배양하였다. 전체 DNAFMF 세포로부터 제조하여 E. coli DH5를 형질전환하였다. 효모의 염색체 DNAFMF Methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose, M.D. et al., p131-132, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY에 기재된 방법에 따라 제조하였다. E.coli로부터 수집된 7개의 플라스미드 DNA(pCARS1, pCARS4, pCARS5, pCARS6, pCARS7, pCARS8, 및 pCARS10)를 다양한 제한효소로 분해한 결과, 이 플라스미드 DNA 모두가 5 내지 7 kb의 삽입물을 포함하는 것으로 나타났다. 또한, ATCC9950 균주를 전기 자극법에 의해 상기 플라스미드 DNA로 형질전환할 경우, G418 내성 형질전환체가 플라스미드 DNA 모두에 대하여 얻어졌다. 이 결과로부터 자율 복제능을 가지는 DNA 서열이 상기한 플라스미드에서 클론되었음이 확인되었다. 각종 제한효소 분해를 이용한 분석에 의하면, 상기 플라스미드 중 pCARS7과 pCARS8은 동일한 삽입물을 포함하였다. 이러한 결과는 자율 복제능을 가지는 6개의 DNA 단편이 캔디다 유틸리스 내에서 클론되었음을 나타내는 것이다.
또한, 실시예 9에 기재된 플라스미드 pCLBS10(도 15)을 벡터로 하여 캔디다 유틸리스의 게놈 DNA 라이브러리를 제조하였다. 플라스미드 pGKAPH2에 대하여 구성된 라이브러리와 함께 상기 라이브러리를 이용하여 캔디다 유틸리스를 형질전환하였다. 그러나, 시클로헥시미드 내성 형질전환체는 전혀 얻어지지 않았다. 이러한 결과는, 캔디다 유틸리스 ARS의 특징으로, 이것을 포함하는 플라스미드의 카피수는 세포당 소수이고, ARS가 형질전환체를 선별하는데 수개의 카피를 필요로 하는 시클로헥시미드 내성 L41 유전자로 이용되는 경우 형질전환체를 선별할 수 없다는 것을 나타낸다.
실시예 27: 자율 복제 서열(ARS)을 포함하는 DNA 단편의 단축
실시예 26에서 클론된 자율 복제 DNA 서열을 포함하는 7개의 플라스미드 중에서 고빈도로 캔디다 유틸리스를 성공적으로 형질전환한 3개의 플라스미드 (pCARSS, pCARS6 및 pCARS7)을 상세히 분석하였다.
실시예 19에서 제조된 염색체가 조립된 플라스미드 pCLRAPH1의 Bg1Ⅱ로 분해된 DNA를 대조로 하여 상기한 3개 플라스미드에 의한 효모의 형질전환 빈도를 시험하였다. 자극 조건을 전기용량 25㎌, 저항 1000Ω 및 전압 5 KV/cm로 하여 ATCC9950 균주를 DNA 0.1㎍으로 형질전환하였다. 자극 후에 4시간동안 배양하고, 그 결과를 표 7에 기재하였다.
각종 ARS 플라스미드를 이용한 형질전환 빈도
플라스미드 콜로니 수
pCARS5 16540
pCARS6 9500
pCARS7 4700
pCLRAPH1 400
주 1) : 플라스미드 DNA 1㎍당 형질전환체 수
2) : pCLRAPH1은 사용전에 Bg1Ⅱ로 분해되었다.
상기한 결과는, 대상으로서 rDNA를 이용한 DNA의 조립보다 약 10 내지 40배 더 높은 형질전환 빈도가 ARS를 포함하는 플라스미드를 이용하여 얻어지는 것을 나타낸다.
상기한 플라스미드 pCARS5, pCARS6 및 pCARS7을 NotI으로 분해하고 T4 DNA 리가제를 이용하여 다시 고리화하여, PGK 유전자 프로모터, APT 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 3.3 kb의 NotI 단편이 결실된 플라스미드 pCARS50, pCARS60 및 pCARS70을 구성하였다. 새롭게 얻어진 3종류의 플라스미드에 대하여 각종 제한효소 분해를 이용하여 그 삽입물의 길이를 시험하였다. 그 결과, 상기 플라스미드 모두는 약5 내지 6kb 길이의 삽입물을 가져서 자율 복제능을 가지는 영역이 더욱 제한되었다. 플라스미드 pCARS50, pCARS60 및 pCARS70 각각을 Sau3AI으로 분해하여 1 내지 3.5 kb의 단편을 수집하고, BamHI으로 분해한 후 T4 DNA 리가제로 탈인산화된 플라스미드 pGKAPH2에 결찰하였다. E.coli DH5를 3개의 DNA 용액 각각으로 형질전환하고, 2,500 내지 6,000개의 형질전환체로부터 플라스미드 DNA 혼합물을 추출하여 DNA 라이브러리를 제조하였다. 상기 DNA 5 ㎍을 이용하여 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 따라 ATCC9950 균주를 다시 형질전환하여 G418 내성 형질전환체를 얻었다.
얻어진 G418 내성 콜로니들은 다양한 크기를 가졌으며, 3개의 라이브러리 각각에서 비교적 큰 콜로니를 형성한 5개의 형질전환체를 G418 200㎍/㎖를 포함하는 YPD 배지에서 다시 배양하였다. 얻어진 세포로부터 전체 DNA를 제조하였고, 이 DNA를 이용하여 E.coli DH5를 형질전환하였다. G418 내성 균주중 일부에서는 E.coli의 형질전환체가 전혀 얻어지지 않았다. 또한, ATCC9950 균주를 회수된 상기 플라스미드를 이용하여 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 의해 다시 형질전환하였을때, 일부 플라스미드는 원래의 플라스미드 pCARS5, pCARS6 및 pCARS7과 비교하여 매우 낮은 형질전환 빈도를 나타내므로 제외되었다. 최종적으로, 단축된 DNA 단편을 포함하고 모(母) 플라스미드와 유사한 형질전환 빈도를 가지는 플라스미드가 pCARS50, pCARS60 및 pCARS70 각각에서 얻어졌다. pCARS50에서 유도된 플라스미드를 pCARS5-2로, pCARS60에서 유도된 플라스미드를 pCARS6-2로, pCARS70에서 유도된 플라스미드를 pCARS7-2라고 하였다. 얻어진 6개의 플라스미드 내의 자율 복제 서열을 포함하는 염색체 DNA서열의 제한효소 지도를 도 38에 나타내었다.
단축된 염색체 DNA 단편을 가지는 3개의 플라스미드, pCARS5-2, pCARS6-2 및 pCARS7-2로부터 더욱 단축된 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 구성하여 이들의 형질전환 빈도를 시험하였다. 이 방법으로 구성된 일부 플라스미드의 부분 DNA 서열을 결정한 경로가, 도 38의 pCARS 5 내의 Bg1Ⅱ 부위의 좌측 약 700 bp 영역은 pCARS6-2 내의 EcoRI 부위의 좌측 약 700 bp 영역에 대하여 90%이상의 상동성을 나타내었다. 이러한 결과는, pCARS5와 pCARS6의 삽입 DNA 단편이 상이한 제한효소 지도를 가지지만, 각각 상동 염색체 또는 반복 서열로부터 유도되는 것을 나타내는 것이다. 따라서, pCARS6와 pCARS7의 삽입 DNA 단편에 대하여 이하에서와 같은 분석이 실시되었다. pCARS6에 포함된 자율 복제 서열을 CUARS1이라 하였고, pCARS7에 포함된 자율 복제 서열을 CUARS2라 하였다.
실시예 28: pCARS6와 pCARS7에 삽입된 DNA 단편의 단축, 형질전환 빈도 및 플라스미드 안정성
(1) pCARS6에 삽입된 DNA 단편의 단축과 형질전환 빈도
플라스미드 pCARS6-2에 클론되어 Sau3AI으로 부분적으로 분해된 DNA 단편은 약 1.9 kb이다. 그러므로, 자율적으로 복제가능한 영역을 더욱 제한하기 위해 pCARS6-2의 삽입 단편 일부를 포함하는 3개의 플라스미드를 구성하였다. 상기한 플라스미드들은 다음과 같은 방법으로 구성되었다.
APT 유전자 발현 카세트를 포함하는 3.3 kb의 NotI 단편을 pCARS6-2에서 제거하여 pCARS6-20을 구성하였다. 이 플라스미드 pCARS6-2을 Af1Ⅱ와 XbaI으로 분해하고, 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성한 후, T4 DNA 리가제로 다시 고리화하여 플라스미드 pCARS6-210을 구성하였다. 이 플라스미드를 플라스미드 pGKAPH3로부터 절단된 단축된 PGK 유전자 프로모터에 의해 APT 유전자 발현 카세트를 포함하는 2.3 kb의 NotI 단편과 결찰하여 플라스미드 pCARS6-21을 구성하였다. 상기 플라스미드 pGKAPH3는 실시예 19에서 구성된 플라스미드 pGKAPH1의 프로모터 단편 내의 EcoRI 부위를 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성한 후, NotI 링커(5'-AGCGGCCGCT-3': 서열번호 18)를 결찰하여 구성하였다. pCARS6-20과 pCARS6-21 각각을 HindⅡ로 분해하고 T4 DNA 리가제로 다시 고리화한 후, 상기한 바와 같은 방법으로 단축된 PGK 유전자 프로모터에 의해 APT 유전자 발현 카세트를 포함하는 2.3 kb의 NotⅠ단편에 결찰하여 플라스미드 pCARS6-22와 pCARS6-23을 구성하였다. 상기한 5개의 플라스미드에 포함된 삽입 DNA 단편의 제한효소 지도를 도 39에 기재하였다.
DNA 1㎍을 사용하는 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 따라 전기용량 25 ㎌, 저항 1000Ω 및 전압 5 KV/cm의 자극 조건 하에서 상기에서 구성된 플라스미드 각각으로 ATCC9950 균주를 형질전환하였다. 자극 후에 다시 4시간 동안 배양하고, 그 결과를 표 8에 기재하였다.
pCARS6로부터 유도된 다양한 플라스미드의 형질전환 빈도와 안정성 플라스미드 DNA 1㎍ 당 형질전환체수
플라스미드 콜로니 수 ()
pCARS6 1093 (100)
pCARS6-2 710 (65)
pCARS6-21 137 (13)
pCARS6-22 253 (23)
pCARS6-23 25 (2)
주 1 : 상기한 데이타는 2회 실험의 평균값이다.
플라스미드 안정성
플라스미드 ()
pCARS6 21.4
pCARS6-2 31.9
pCARS6-21 29.9
pCARS6-22 11.0
pCARS6-23 3.9
주 : 세대수는 2.5 내지 3.5이다.
효모에서 각 플라스미드의 안정성을 다음과 같이 시험하였다. 얻어진 G418 내성 콜로니를 4 ㎖의 YPD 배지에 접종하여 30℃에서 8시간 동안 진탕배양하였다. YPD 플레이트에 상기 세포를 도포하였다. 2일 동안 배양한 후, 플라스미드의 보유율을 계산하기 위해 각각의 콜로니 수를 비교하였다. 그 결과를 표 8에 기재하였다. 세포를 2.5 내지 3.5회로 분할하여 배양물의 흡광도를 나타내었다. 이러한 결과는, pCARS6-21의 안정성은 pCARS6-2와 유사하였으나, pCARS6-2의 삽입 DNA 단편이 좌우 양쪽에서 단축된 플라스미드 pCARS6-21와 pCARS6-22의 형질전환 빈도가 크게 감소된 것을 나타낸다. 또한, 삽입 DNA 단편이 0.6 kb까지 단축된 pCARS6-23에 대하여는 pCARS6를 이용한 형질전환 빈도와 비교하여 1/50까지 형질전환 빈도가 감소되었다. 이러한 결과는 pCARS6에 포함된 CUARS1은, pCARS6-2의 약 1.9 kb의 DNA 단편 보다 단축화되는 것이 어려움을 나타낸다.
(2) pCARS6 삽입 DNA 단편의 단축 및 형질전환 빈도
플라스미드 pCARS7-2에 클론되어 Sau3AI으로 부분적으로 분해된 DNA 단편의 길이는 약 3.5 kb이다. 그러므로, 자율적으로 복제가능한 영역을 더욱 제한하기 위해 pCARS7-2의 삽입 단편 일부를 포함하는 5개의 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 구성하였다.
APT 유전자 발현 카세트를 포함하는 3.3 kb의 NotI 단편을 플라스미드 pCARS7-2로부터 제거하여 플라스미드 pCARS7-20을 구성하고, 이 플라스미드 pCARS7-20을 Xbal으로 분해하고, T4 DNA 리가제로 다시 고리화한 후, APT 유전자 발현 카세트를 포함하는 2.3 kb의 NotI 단편에 결찰하여 플라스미드 pCARS7-4를 구성하였다.
또한, pCARS7-20으로부터 약 1.8 kb의 EcoRV-HindIⅡ 단편, 약 1.3 kb의 XbaI-HindIⅡ 단편, 및 약 1.8 kb의 HindIⅡ-Bg1Ⅱ 단편을 절단하여 EcoRV와 HindIⅡ, XbaI과 HindIⅡ 또는 HindIⅡ와 BamI 각각으로 분해된 pBluescript ⅡSK-(Stratagene)에 결찰하였다. 다음으로, 단축된 PGK 유전자 프로모터에 의해 APT 유전자 발현 카세트를 포함하는 2.3 kb의 NotI 단편을 상기 플라스미드와 결찰하여 pCARS7-6, pCARS7-7 및 pCARS7-8을 구성하였다. 상기한 6개 플라스미드에 포함된 삽입 DNA 단편의 제한효소 지도를 도 40에 기재하였다.
DNA 1㎍을 사용하는 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 따라 전기용량 25 ㎌, 저항 1000Ω 및 전압 5KV/cm의 자극 조건 하에서 상기에서 구성된 플라스미드 각각으로 ATCC9950 균주를 형질전환하였다. 자극 후에 다시 4시간 동안 배양하고, 그 결과를 표 9에 기재하였다.
pCARS7으로부터 유도된 다양한 플라스미드의 형질전환 빈도와 안정성 플라스미드 DNA 1 ㎍ 당 형질전환체수
플라스미드 콜로니 수 ()
pCARS7 1833 100
pCARS7-2 1273 69
pCARS7-4 0 0
pCARS7-6 598 33
pCARS7-7 *280 15
pCARS7-8 5 0.2
주 1 : 상기한 데이타는 2회 실험의 평균값이다.
주 2 : ＊는 매우 작은 크기의 콜로니를 나타낸다.
플라스미드 안정성
플라스미드 ()
pCARS7 23.0
pCARS7-2 34.9
pCARS7-6 18.6
pCARS7-7 11.4
pCARS7-8 7.0
주 : 세대수는 2.5 내지 3.5이다.
효모에서 각 효소의 안정성을 다음과 같이 시험하였다. 얻어진 G418 내성콜로니를 4㎖의 YPD 배지에 접종하여 30℃에서 8시간 동안 진탕배양하였다. YPD플레이트와 G418을 포함하는 YPD플레이트에 상기 세포를 도포하였다. 2일 동안 배양한 후, 플라스미드의 보유율을 계산하기 위해 각각의 콜로니 수를 비교하였다. 그 결과를 표 9에 기재하였다. 세포는 2.5 내지 3.5회로 분할하여 배양물의 흡광도를 나타내었다. 이러한 결과는, 플라스미드 pCARS7-2와 pCARS7-6을 이용한 형질전환 빈도가 pCARS7과 비교하여 각각 약 70%와 30%까지 감소된 것을 나타낸다. 그러나, 안정성은 그렇게까지 저하되지 않았다. 더욱 단축된 DNA 단편을 포함하는 플라스미드 pCARS7-7은 pCARS7-6과 비교하여 1/2의 형질전환 빈도를 나타내면서 매우 작은 크기의 콜로니를 생성하고 안정성이 불량하였다(표 9). 한편, pCARS7-8로의 형질전환 빈도는 불량하였고, pCARS7-4에 의해서는 형질전환체가 얻어지지 않았다. 이러한 결과는 pCARS7에 포함된 CUARS2가 pCARS7-6의 ,1.8 kb의 DNA 단편으로 단축되지만 형질전환빈도는 감소됨을 나타낸다.
ARS의 단축과 관련한 상기한 2개의 결과는 캔디다 유틸리스의 ARS가 자율 복제능을 가지는데는 비교적 긴 영역이 필요하다는 것을 나타낸다. 이것은 매우 흥미있는 특징으로, 사카로마이세스 속 효모의 약 200 bp의 ARS가 그 작용을 나타내는 것과는 다른 것이다(Newlon, C.R. and Theis, J. Current Opinion in Genetics and Development, 3, 752-758, 1993).
실시예 29: pCARS6-2와 pCARS7-6의 자율 복제 서열을 포함하는 DNA 단편의 DNA 서열 결정과 써던 분석
(1) 자율 복제 서열을 포함하는 DNA 단편의 DNA 서열 결정
pCARS6와 pCARS7에서, ARS, CURS1, 및 CUARS2를 포함하는 DNA 단편의 DNA 서열을 결정하였다. CUARS1을 포함하는 DNA로서 pCARS6-2의 삽입 DNA 단편의 DNA 서열은 도 41와 도 42에, pCARS7-2의 삽입 DNA 단편의 DNA 서열은 도 43와 도 44에 기재하였다. pCARS6-2의 삽입 DNA 단편은 1921 bp이고 전체 염기에 대한 A + P의 비율은 70.8 %였다. 이러한 결과는 어떠한 DNA 단편도 A + P의 비율이 매우 높은 것을 나타낸다.
컴퓨터 분석 결과, ARS에서 일반적으로 관찰되는 11 bp의 서열(T/A)TTAA(C/T)(A/G)TTT(T/A)(Newlon, C.R. and Theis, J. Current Opinion in Genetics and Development,3,752-758,1993)와 비교하여, pCARS6-2에 9개의 컨센서스 유사서열(컨센서스 서열과 1개의 염기가 상이한)이 존재하였고, pCARS7-6에는 13개의 컨센선스 유사 서열이 존재하였으며, 그중 5개는 서로 중복되었다(도 41 내지 도 44)
(2) 써던 분석에 의한 카피수의 계산
캔디다 유틸리스 세포 내의 ARS를 포함하는 플라스미드의 카피수를 계산하기 위해서 pCARS6 또는 pCARS7으로 형질전환된 캔디다 유틸리스 효모로부터 제조된 DNA에 대하여 써던 분석을 실시하였다(도 45-1). 또한, PGK 유전자를 카피수를 계산하기 위한 내부 기준으로 사용하였기 때문에 PGK 유전자의 카피수를 계산하기 위한 써던 분석을 실시하였다(도 45-2)
PGK 유전자의 카피수를 계산하기 위한 써던 분석은 실시예 18에 기재된 플라스미드 pCLLAC1을 PGK 프로모터 내의 SphI 부위에서 분해한 후, 이 플라스미드로 형질전환된 2개의 ATCC9950 균주로부터 제조된 DNA와, 대조용으로서 모균주로부터 제조된 DNA로 실시되었다. 실시예 4에 기재된 pGKPT4에서 절단된 PGK 프로모터를 포함하는 0.4 kb의 EcoRI-XbaI 절ㅍㄴ을 Sa1I + NotI으로 분해된 DNA에 대한 프로브로서 사용할 경우, 내인성 PGK 유전자로부터 유도된 3.2 kb의 밴드가 모균주인 ATCC9950에서 관찰되었다(도 45-2, 레인 1). 한편, PGK 프로모터 내의 SphI 부위로 분해된 pCLLAC1이 조립된 균주에서는 상기한 3.2 kb의 밴드 이외에 세로로 조립된 다수의 플라스미드가 NotI으로 분해되어 생성된 5.4 kb의 밴드와, 염색체 PGK 유전자중 하나가 플라스미드의 삽입에 의해 분쇄되어 생성된 6.4 kb와 2.1 kb의 2개의 밴드가 검출되었다(레인 2와 3). 상기한 6.4 kb와 2.1 kb의 밴드는 조립된 플라스미드 분자의 양쪽에 위치하는 플라스미드 분자 내의 NotI 부위와 PGK 유전자 영역 내의 Sa1I 부위로부터 생성되므로 플라스미드 분자는 상동 재조합에 의해 PGK 유전자 위치에 조립된 것으로 나타났다.
상기한 밴드들의 농도를 Imaging Analyzer(Fuji Film사 제품)로 측정한 결과, 내인성 PGK 유전자에서 유도된 3.2 kb의 밴드와 염색체에 조립된 플라스미드 분자의 양 말단에 위치하는 플라스미드로부터 유도된 6.4 kb와 2.1 kb의 밴드는 형질전환체 내에서 거의 동일한 농도를 가졌다. 그러므로, PGK 유전자는 세포당 2카피가 존재하고, 형질전환체에서 2카피중 하나는 플라스미드 DNA의 삽입에 의해 분쇄되었다. 또한, 플라스미드의 세로 조립에 의하여 5.4 kb의 밴드와, 6.4 kb및 2.1kb의 밴드 농도를 비교한 결과, 조립된 플라스미드는 약 4카피를 가지는 것으로 나타났다.
pCARS6와 pCARS7으로 형질전환된 ATCC9950 균주로부터 제조된 DNA를 EcoRV + NotI으로 분해하고, 실시예 4에 기재된 pGKPT4로부터 절단된 PGK 터미네이터를 포함하는 0.9 kb의 XbaI-NotI 단편을 프로브로 하여 써던 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 45-1에 기재하였다. 모균주 ATCC9950에서는 내인성 PGK 유전자에서 유도된 약 7 kb의 밴드가 관찰되었다(도 45-1, 레인 3). 형질전환체에서는 약 7 kb의 밴드 이외에 플라스미드로부터 유도된 3.3 kb의 밴드가 관찰되었다. 7kb 밴드와 3.3 kb 밴드의 밀도를 비교하여, 7 kb의 밴드가 PGK 유전자 2 카피에 해당하고, pCARS6와 pCARS7의 카피수는 1(레인 4)과 0.4카피(레인 2)라는 가정하에 계산되었다. 세포를 배양하는 동안 플라스미드 분자의 탈락으로 인하여, pCARS7 내의 카피수는 1 미만일 수 있다. 이 결과로부터, CUARS를 포함하는 플라스미드는 세포당 약 1카피를 가지는 것으로 생각된다.
(3) 염색체 상의 ARS의 존재 형태
HindIⅡ로 분해된 ATCC9950, 9226, 9256 및 KP-2059와 사카로마이세스 세리비제 S288C 균주의 다양한 염색체 DNA에 대하여 써던 분석을 실시하였다. CUARS1으로서 Xbal과 HindIⅡ로 pCARS6-22를 분해하여 얻어진 1.3 kb의 단편(도 39); 및 CUARS2로서 pCARS7-6의 1.8 kb의 EcoRV-HindIⅡ 단편(도 40) 각각을 프로브로 하여 혼성화를 실시하였다(도 46). CUARS1과 관련하여는, pCARS6의 제한효소 지도로부터 예상되는 2 kb의 주 밴드 이외에, pCARS5의 제한효소 지도로부터 예상되는 HindIⅡ 단편과 같은 길이를 가지는 1.6 kb의 밴드가 관찰되었다(도 46-1). 또한, CUARS2와 관련하여는, pCARS7의 제한효소 지도로부터 예상되는 2.5 kb의 주 밴드 이외에, 높은 상동성을 가지는 DNA 서열이 캔디다 유틸리스의 염색체 상에 약 10카피, 사카로마이세스 효소에 많은 카피가 존재하였다(도 46-2). 이러한 결과로부터, CUARS2가 광범위하게 보존되는 서열임을 알 수 있다. 또한, 혹독한 세척 조건(0.1 × SSC, 65℃)으로 주요한 밴드 이외의 시그널은 거의 관찰되지 않았다(도 46-2).
또한, 상기한 ARS 서열이 염색체 DNA로부터 유도되는지를 실험하기 위해서 자극 필드 겔 전기영동법에 의해 분리된 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA에 대하여 써던 분석을 실시하였다. ATCC9950 균주의 DNA는 7개의 밴드로 분리 되었는데, CUARS1은 큰쪽에서 6번째 염색체에, CUARS2는 3번째 염색체에 각각 위치하였다. 그 결과, 클론된 ARS 서열은 염색체에서 유래하는 것이 밝혀졌다. 또한, pCARS5의 삽입 DNA 단편은 CUARS1과 같은 방법으로 6번째 염색체에 위치하는 것으로 나타났다. 실시예 27에 기재된 서열 분석으로도 나타난 바와 같이 상기 pCARS5와 pCARS6에 클론된 ARS가 상동 염색체 유래인 가능성을 지지하는 결과였다.
실시예 30: ARS를 이용한 프로모터 활성을 가지는 DNA단편의 클로닝
(1) 프로모터 클로닝 백터의 구성
실시예 28에서 구성된 플라스미드 pCARS6-20으로부터 자율적으로 복제가능한 서열을 포함하는 DNA를 1.9 kb의 SacI-SmaI 단편으로 절단하였다. 이 단편을 플라스미드 pAPHI(실시예 19)과 결찰하고, EcoRI으로 분해한 후, 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성하고, 다시 SacI으로 분해하여 플라스미드 pPCV1을 구성하였다. 이어서, pPCV1을 BamHI으로 분해하고 클레노우 효소로 처리하여 둔단을 형성한 후, HpaI 링커(5´GTTAAC3´)를 결찰하여 플라스미드 pPCV2를 구성하였다(도 47).
(2) 라이브러리의 구성과 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편의 클로닝
캔디다 유틸리스 ATCC9950의 염색체 DNA를 제한효소 RsaI, HaeIⅡ 및 AluI으로 동시에 부분적으로 분해하였다. 이 DNA단편을 1%의 아가로스 겔로 전기영동하여 0.9 내지 1.8 kb의 단편을 회수하였다. 부분적으로 분해된 DNA 단편과 HpaI으로 분해되어 탈인산화된 플라스미드 pPCV2를 T4 DNA 리가제로 결찰하였다. E.coli DH5를 DNA 용액으로 형질전환하고, 얻어진 약 100,000개의 형질전환체로부터 플라스미드 DNA 혼합물을 추출하여 게놈 DNA 라이브러리를 제조하였다. 이 라이브러리로부터 제조된 DNA를 이용하여, 전기 용량 25 ㎌, 저항 1000 Ω 및 전압 5 KV/cm의 자극 조건 하에서 전기 자극법에 의해 ATCC9950 균주를 형질전환하였다. DNA는 자극당 20 내지 25 ㎍이 사용되었다. 형질전환체를 G418 200 ㎍/㎖를 포함하는 YPD 플레이트에서 선별하였다. 형질전환을 반복 실시하여 DNA 280 ㎍으로 전체 380개의 형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체 중에서 비교적 큰 콜로니가 생성된 84개의 균주를 G418 1 ㎎/㎖를 포함하는 YPD 플레이트에서 배양하였다. 우수한 성장을 나타낸 12개의 균주를 G418 1 ㎎/㎖를 포함하는 YPD 배지에서 배양하여 이 세포에서 전체 DNA를 제조하여 E.coli DH5를 형질전환하였다.
제한효소 분해에 의해, E.coli로부터 회수된 12개의 플라스미드 DNA, 즉 pPCV1, 3, 9, 14, 19, 33, 51, 55, 57, 62, 64 및 78 모두가 0.9 내지 1.8 kb의 삽입 DNA 단편을 포함하는 것으로 나타났다. 또한, 프로모터 활성을 가지는 서열을 포함하는 DNA 단편을 XbaI으로 절단하여 pBluescript ⅡSK-(Stratagene)에 결찰하여 플라스미드를 구성하였다. 플라스미드의 부분 DNA 서열을 삽입 DNA 단편의 양쪽에서 시작하여 결정하였다. 그 결과, pPCV33과 pPCV78, 또는 pPCV14, pPCV51 및 pPCV55가 동일한 DNA 단편을 가지는 것으로 나타났다. 그러므로, 최종적으로 프로모터 활성을 가지는 9개의 DNA 단편이 클론되었다.
ATCC9950 균주를 전기 자극법에 의하여 9개의 플라스미드, pPCV1, 3, 9, 14, 19, 33, 57, 62 및 64로 형질전환하였을 때, 플라스미드 DNA 모두에 대하여 DNA 1㎍ 당 G418 내성 콜로니 6,000 내지 10,000개가 얻어졌다. 또한, 상기한 9개의 플라스미드와 대조용으로 사용된 pCARS6-2로 얻어진 10개의 G418 내성균주중 2균주를 포함하는 20개의 클론을 5 ㎖의 YPD 액체 배지에서 하룻밤동안 배양한 후, YPD 플레이트 상에서 단일 콜로니로 분리하였다. 각각의 20개 클론중 10개의 콜로니를 G418을 포함하는 YPD 플레이트에서 배양하여 플라스미드의 보유율을 평가하였다. 그 결과, pCARS6-2는 5%의 플라스미드 보유율을 가지는 반면, 다른 플라스미드는 모두 보유율이 증가되었다. 이 플라스미드들 중에서 특히 pPCV1, pPCV19 및 pPCV64는 80 내지 85%의 높은 보유율을 나타내었다. 따라서, 이것은 얻어진 프로모터 활성을 가지는 서열을 포함하는 DNA 단편이 플라스미드의 안정성을 증가시키는 작용을 가지는 것을 나타낸다.
(3) 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편의 DNA 서열 결정
얻어진 프로모터 활성을 가지는 9개의 DNA 단편 중에서 플라스미드 pPCV19에의 삽입 DNA 단편에 대하여, 다양한 결실 돌연변이를 가지는 플라스미드를 ExoIⅡ 뉴클레아제와 녹두 뉴클레아제를 이용한 결실에 의해 제조하여 삽입 DNA 단편의 양쪽으로부터의 DNA 서열을 결정하였다. pPCV 19의 1054 bp의 삽입 DNA 단편에 대하여 결정된 DNA 서열을 도 48에 기재하였다.
실시예 31: 하이그로마이신 B 내성 유전자를 발현하기 위한 플라스미드의 구성 및 이를 이용한 효모의 동시 형질전환체의 선별
(1) 하이그로마이신 B 내성 유전자를 발현하기 위한 플라스미드의 구성과 그 작용의 확인
플라스미드 pBIB-HYG(Becker, D., Nucl.Acids Res.,18,203,1990)를 주형로 이용하여, HPT 유전자의 이미 알려진 DNA 서열(Gritz, L. and Davis, J. Gene, 25, 179-188, 1993)에 따라 제조된 2개의 프라이머로 PCR에 의해 하이그로 마이신 B 포스포트랜스퍼라재(HPT)를 얻었다. 프라이머로는 다음 DNA 서열이 사용되었다.
5`-GGTCTAGATATGAAAAAGCCTGAAC-3`(서열번호 33)
5`-GGAGATCTATTCCTTTGCCCTCGGA-3`(서열번호 34)
5`쪽의 개시 코돈 바로 앞에 위치하는 XbaI 부위와 3` 말단 종료 코돈 바로 뒤에 위치하는 Bg1Ⅱ부위를 가지도록 합성하였다. 합성된 HPT 유전자 단편을 XbaⅠ 과 Bg1Ⅱ로 분해하여 실시예 4에 기재된 발현 벡터 pGKPT4(도 4)의 XbaⅠ 부위와 BamHⅠ부위에 삽입하여 플라스미드 pGKHPT1을 구성하였다(도 49). PGK유전자 프로모터, HPT유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 3.3kb의 NotⅠ단편을 pGKHPT1으로부터 절단하였다. 플라스미드 pAHG1은 실시예 30에 기재된 플라스미드 pPCV14의 NotⅠ부위에 NotⅠ단편을 삽입하여 구성하였다. 구성된 HPT유전자 발현 카세트가 작용하는지를 확인하기 위하여 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 의해 플라스미드 pAHG1으로 ATCC9950을 형질전환하였다. G418에 대한 내성으로 선별된 형질전환체를 하이그로마이신 B200,400 및 800 ㎍/ml을 포함하는 YPD액체 배지에서 배양하였으나, 대조용으로 사용된 야생형 균주를 어떠한 배지에서도 성장되지 않았으며 하이그로마이신 B에 대한 내성을 나타내었다.
플라스미드 pGKHPT1을 NOTⅠ으로 분해하여 PGK 유전자 프로모터, HPT 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 단편과 벡터 단편으로 분할한 후, 이들을 상기 ATCC9950 균주의 형질전환에 사용하였다. 실시예11에 기재된 전기 자극법에 의해 형질전환을 실시하여 하이그로마이신 B 800 ㎍/ml를 포함하는 YPD 플레이트에서 형질전환체를 선별하였다. 그 결과, DNA 1㎍당 168개의 하이그로마이신 B 내성 콜로니를 얻었다. 이것을 대조용으로 사용된 NotⅠ으로 분해된 플라스미드 pGK APH1에 의한 형질전환 빈도, DNA ㎍당 156콜로니와 거의 동일한 것이다. 그러므로, 이러한 결과는 하이그로마이신 B 내성 유전자가 G418 내성 유전자와 같이 캔디다 유틸리스의 형질전환체를 직접 선별하는데 사용될수 있음을 나타내는 것이다.
(2) 효모의 동시 형질전환
실시예 30에서 얻어진 ARS를 포함하는 플라스미드 pPCV64 0.1㎍과 NoTⅠ으로 분해되는 PGK 유전자 프로모터, HPT 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 단편과 벡터 단편으로 분할된 플라스미드 pPGKHPT1 1㎍ 또는 10 ㎍을 혼합하여 실시예 11에 기재된 전기 자극법에 의해 ATCC9950 균주의 형질전환에 사용하였다.
전기용량 25uF, 저항 600, 800 또는 1000Ω 및 전압 3.75 또는 5KV/cm를 자극 조건으로 하고, 2종의 DNA 혼합물에 대하여 6가지의 자극 조건으로 실시하였다. G 418 200㎍/ml를 포함하는 YPD 플레이트에서 형질전환체를 선별하여 각 조건 하에서 pPCV64DNA 0.1㎍을 사용하여 약 2,000 내지 7,000개의 형질 전환체를 얻었다. 각 조건하에서 얻어진 500 내지 2,000개의 G418 내성 콜로니를 하이그로마이신 B 800㎍/ml 을 포함하는 YPD 플레이트에서 반복 배양하였다. G418 내성 콜로니들에 대한 하이그로마이신 B 내성 콜로니들의 비율은 자극 조건 간에는 크게 다르지 않았고 약 1내지 2% 범위였다. 또한, G418 내성 균주와 하이그로마이신 B 내성 균주를 YPD 액체 배지에서 하룻밤 동안 배양하여 플라스미드로서 존재하는 pPVC64를 제거하여 G418 감수성이 되는 균주를 얻었다. 40개의 균주를 시험한 결과, 10개의 G418 감수성 및 하이그로마이신 B 내성균주를 얻었다. 이 균주들에서는, PGK 유전자 프로모터, HPT 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 단편이 염색체 상에 보유되는 것으로 예상되었다. 염색체 DNA를 상기한 10개의 균주로부터 제조하여 상기 염색체에 HPT 유전자 발현 카세트가 조립되었는지를 PCR로 시험하였다.
이를 위한 프라이머로서는, HPT 유전자 발현에 사용되는 PGK 유전자 프로모터 단편의 5`말단 바깥쪽 DNA 서열에 기초하여 합성된 프라이머 1;
프라이머 1 : 5`CAAGTTGATCCTTCTCCGGA3`(서열번호35)
HPT 유전자 내부서열에 기초하여 합성된 프라이머 2; 및
프라이머 2: 5`GAAACTTCTCGACAGACGTC3`(서열번호 36)
HPT 유전자 발현에 사용된 PGK 유전자 터미네이터 단편 내의 서열에 기초하여 합성된 프라이머 3가 사용되었다.
프라이머 3 : 5`CATCGGGTAAGGTCTACATG3`(서열번호 37)
PCR을 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 5분 동안의 조건하에서 30회 실시하였다. 그 결과를 도 50에 나타내었다. 도 50(1)는 프라이머 1과 3을 이용한 PCR반응 생성물의 전기 영동을 예시한 것이다. 내인성 PGK 유전자로 인한 2.7kb의 증식 단편이 각 샘플에서 관찰되었고, 샘플 번호 3,5,7,9 및 10에서는 2.6kb의 단편이 관찰되었다. 2.2kb의 단편은 형질전환에 사용되는 PGK 유전자 프로모터, HPT 유전자 및 PGK 유전자 터미네이터를 포함하는 단편으로 2개의 내인성 PGK 유전자 중 하나가 치환되었기 때문인 것으로 생각된다. 또한, 프라이머 1과 2를 이용한 동이한 DNA 샘플의 PCR 결과를 도 50(2)에 나타내었다. 2.6kb단편이 관찰된 5개의 샘플에서 1.4kb의 증식 단편이 관찰되었고, 이 5개의 클론에서 내인성 PGK 유전자가 상동 재조합에 의해 HPT 유전자로 치환되었다.

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  21. 캔디다 유틸리스의 형질전환법으로,
    캔디다 유틸리스 염색체 유래의 염기서열과 형질전환체 선택을 위한 약제내성 마커 유전자를 코드하는 염기서열과, 그리고 경우에 따라서 이종 유전자를 코드하는 염기서열을 포함하는 것으로 이루어지는 벡터를 준비하고,
    이 벡터를 상기 캔디다 유틸리스 염색체 유래의 염기 서열내에 있어서 제한효소 절단을 하여 직쇄상으로 하고,
    이 직쇄상으로 한 벡터로 캔디다 유틸리스를 형질전환하고,
    형질전환체를 상기 약제내성 마커 유전자의 발현에 의해 선택하는 것으로 이루어지고,
    상기 벡터가 캔디다 유틸리스 염색체에 보유되는 것을 특징으로 하는 캔디다 유틸리스의 형질전환법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 약제내성 마커 유전자와 경우에 따라서 이종유전자를 포함한 염기서열이 그 양단에 있어서 상기 캔디다 유틸리스 염색체 유래의 염기서열에 끼여져 있는 것을 특징으로 하는 형질전환법.
  23. 캔디다 유틸리스의 형질전환법으로,
    캔디다 유틸리스내에서 자율복제능을 갖는 DNA 단편 및 약제내성 마커 유전자를 포함하는 것으로 이루어지는 플라스미드와 캔디다 유틸리스의 염색체 유래의 염기서열을 양말단에 부가시킨 외래 DNA 단편으로 캔디다 유틸리스를 동시형질전환하고,
    형질전환체를 상기 플라스미드의 약제내성에 의해 선택하고, 다시 캔디다 유틸리스의 염색체 유래의 염기서열을 양말단에 갖는 DNA 단편이 염색체 상에 조립된 형질전환체를 선택하는 것으로 이루어지는 캔디다 유틸리스 효모의 형질전환법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 외래 DNA 단편이 이종유전자를 코드하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환법.
  25. 캔디다 유틸리스의 형질전환법으로,
    캔디다 유틸리스내에서 자율복제능을 갖는 DNA 단편 및 약제내성 마커 유전자를 포함하는 것으로 이루어지는 플라스미드와 캔디다 유틸리스의 염색체 유래의 염기서열을 양말단에 부가시킨 외래 DNA 단편으로 캔디다 유틸리스를 동시형질전환하고,
    형질전환체를 상기 플라스미의 약제내성에 의해 선택하고, 다시 캔디다 유틸리스의 염색체 유래의 염기서열을 양말단에 갖는 DNA 단편이 염색체 상에 조립된 형질전환체를 선택하고, 또한 비선택적 조건하에서 배양해서 상기 플라스미드를 탈락시키는 것에 의해, 외래 DNA 단편을 포함하지만 약제내성 마커 유전자를 포함하진 않는 형질전환체를 취득하는 것으로 이루어지는 캔디다 유틸리스의 형질전환법.
  26. 제 25항에 있어서, 외래 DNA 단편이 이종유전자를 코드하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환법.
  27. 제 23항 내지 제 26항중 어느 한 항에 있어서, 캔디다 유틸리스내에서 자율복제능을 갖는 DNA 단편이 도41 및 42에 기재된 염기서열(서열번호: 11), 도43 및 44에 기재된 염기서열 (서열번호: 12), 또는 자율복제능을 갖는 그것의 어느 부분 서열을 포함하는 것으로 이루어지고 적어도 1.8kb 길이의 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 형질전환법.
  28. 제 21항 내지 제 26항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캔디다 유틸리스 염색체 유래의 염기서열이 하기의 (a) ∼ (f)중 어느 것인 것을 특징으로 하는 형질전환법:
    (a) L41 유전자 또는 그 일부를 코드하는 염기서열,
    (b) rRNA 유전자 또는 그 일부를 코드하는 염기서열,
    (c) URA3 유전자 또는 그 일부를 코드하는 염기서열,
    (d) PGK 유전자 또는 그 일부를 코드하는 염기서열,
    (e) GAP 유전자 또는 그 일부를 코드하는 염기서열, 또는
    (f) PMA 유전자 또는 그 일부를 코드하는 염기서열.
  29. 제 21항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제내성 마커 유전자가 시클로헥시미드 내성을 부여하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환법.
  30. 제 29항에 있어서, 시클로헥시미드 내성을 부여하는 유전자가 시클로헥시미드 내성형 L41 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환법.
  31. 제 30항에 있어서, 시클로헥시미드 내성형 L41 유전자 도14에 기재된 아미노산 서열 56번의 프롤린이 글루타민으로 치환된 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환법.
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  35. 제 21항 내지 제 26항중 어느 한 항에 있어서, 약제내성 마커 유전자가 캔디다 유틸리스에서 기능하는 프로모터로 발현시킨 것을 특징으로 하는 형질전환법.
  36. 제 35항에 있어서, 캔디다 유틸리스에서 기능하는 프로모터 서열이 하기 (a) 내지 (c)중 어느 것인 것을 특징으로 하는 형질전환법:
    (a) 도3에 기재된 염기서열 (서열번호: 2)의 범위내에서 적어도 946번 ∼ 1346번까지의 서열을 포함하는 프로모터 서열,
    (b) 도30에 기재된 염기서열 (서열번호: 7)을 포함하는 프로모터 서열, 또는
    (c) 도34에 기재된 염기서열 (서열번호: 9)를 포함하는 프로모터 서열.
  37. 제 35항에 있어서, 약제내성 마커 유전자가 G418 내성 유전자 또는 하이그로마이신 B 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환법.
  38. 제 21항, 제 22항, 제 24항 및 제 26항중 어느 한 항에 있어서, 캔디다 유틸리스에서 기능하는 프로모터 서열과 경우에 따라서는 캔디다 유틸리스에서 기능하는 터미네이터 서열을 상기 이종유전자를 발현하여 얻을 수 있도록 배치하는 것을 더 포함하는 것으로 이루어지는 형질전환법.
  39. 제 38항에 있어서, 캔디다 유틸리스에서 기능하는 프로모터 서열이 하기 (a) ∼ (c)의 어는 것인 것을 특징으로 하는 형질전환법:
    (a) 도3에 기재된 염기서열 (서열번호: 2)의 범위내에서 적어도 946번 ∼ 1346번까지의 서열을 포함하는 서열,
    (b) 도30에 기재된 염기서열 (서열번호: 7)을 포함하는 서열, 또는
    (c) 도34에 기재된 염기서열 (서열번호: 9)를 포함하는 서열.
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  48. 제 38항에 있어서, 캔디다 유틸리스에서 기능하는 터미네이터 서열이 하기 (a) ∼ (c)의 어는 것인 것을 특징으로 하는 형질전환법:
    (a) 도2에 기재된 염기서열 (서열번호: 1)을 포함하는 서열,
    (b) 도31에 기재된 염기서열 (서열번호: 8)을 포함하는 서열, 또는
    (c) 도35에 기재된 염기서열 (서열번호: 10)를 포함하는 서열.
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  52. 캔디다 유틸리스내에서 자율복제능을 갖는 DNA 단편과 전사를 위한 프로모터 서열을 가지고 있지 않는 약제내성 유전자를 포함하는 플라스미드에, 약제내성 유전자의 5'측에 삽입을 위해 DNA 제한효소 부분분해 절단을 해서 클로닝한 DNA 라이브러리를 제조하고, 이 DNA 라이브러리로 캔디다 유틸리스를 형질전환하고, 해당 약제내성으로 되는 형질전환체를 선택하고, 그 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 추출한 플라스미드로부터 그것에 포함된 캔디다 유틸리스 효모 내에서 기능하는 전사 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편을 단리하는 것으로 이루어지는 캔디다 유틸리스에서 기능하는 프로모터의 단리방법.
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  58. 제 1항, 제 2항, 제 4항 및 제 6항중 어느 한 항에 따른 형질전환법에 의해 얻어지는 캔디다 유틸리스의 형질전환체를 배양하여 이종유전자를 발현시키고, 이 이종유전자에 의해 코드되는 펩티드를 단리하여 정제하는 것으로 이루어지는 펩티드 생산방법.
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  61. 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA 제한효소 분해 단편과 약제 내성 마커 유전자를 갖는 플라스미드에 클로닝한 DNA 라이브러리를 제작하고, 이 라이브러리에서 캔디다 유틸리스를 형질전환하고, 해당 약제 내성이 되는 형질전환체를 선택하고, 그 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 추출한 플라스미드로부터 그곳에 포함되는 캔디다 유틸리스 효모내에서 기능하는 전사 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편을 단리하는 것으로 이루어지는 캔디다 유틸리스에서 자율복제능을 갖는 DNA 단편의 단리방법.
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