JP2003174879A - キャンディダ・ユティリス酵母由来の制御配列 - Google Patents

キャンディダ・ユティリス酵母由来の制御配列

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 キャンディダ・ユティリス形質転換系で利用
可能であり、異種遺伝子の発現に必要な制御配列の提
供。 【解決手段】 キャンディダ・ユティリスのグリセロア
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝
子のプロモーター配列およびターミネーター配列。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、キャンディダ・ユティリスに関する再現性の
ある形質転換系に関し、より具体的には、組換えＤＮＡ
による酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換、およ
びその結果得られた新規な形質転換体における異種遺伝
子の発現に関する。また、本発明は、形質転換において
選択マーカー遺伝子として利用可能な新規ＤＮＡ配列、
異種遺伝子の発現のためのプロモーター、およびターミ
ネーターとして利用可能な新規ＤＮＡ配列にも関する。
さらに、本発明は、酵母染色体への異種遺伝子の効率的
な組み込み法にも関する。
【０００２】また、さらに本発明はキャンディダ・ユテ
ィリスにおいて自律複製機能を有し、形質転換効率を上
げる機能を持つＤＮＡ断片、およびそれを利用した、選
択マーカー遺伝子を含まないＤＮＡ断片を染色体に組み
込む方法、ならびにプロモーター活性を有するＤＮＡ配
列の取得法にも関する。
【０００３】背景技術 遺伝子組換え技術の発展は、微生物を利用して有用な蛋
白質を大量に製造することを可能にしてきた。このため
の宿主として大腸菌や枯草菌などの原核生物の系は簡便
であり、特に大腸菌は最も頻繁に利用される宿主であ
る。しかし、大腸菌で生産される蛋白質は不溶性となる
ことが多く、また分泌させても糖鎖付加を受けないなど
の制約から、多様なニーズを十分に満足するものではな
い。また、生産された有用蛋白質を医薬品として用いる
場合には、大腸菌の生産する発熱性毒性因子の除去が問
題となる。
【０００４】これら原核生物の系に対して、真核生物で
ある酵母を組換えＤＮＡによる有用蛋白質生産の宿主と
して使用することは以下の点で魅力的である。まず、酵
母のうちサッカロマイセス属酵母は古くから酒類など発
酵性食品の生産に利用されてきており、またキャンディ
ダ・ユティリス酵母は食飼料用に生産されていることか
ら、これらの酵母については安全性が高いことが知られ
ている。さらに、酵母は一般に細菌よりも高い細胞密度
で培養することができ、かつ連続培養も可能である。ま
た、酵母は蛋白質を培地中に分泌し、分泌された蛋白質
は糖鎖による修飾を受ける。このため、酵母による蛋白
質の生産は、このような修飾が生物活性に重要である場
合に価値がある。
【０００５】酵母のうち、今日まで最も良く研究されて
遺伝学的知見が蓄積している酵母にはサッカロマイセス
属酵母があり、この酵母は種々の物質生産の宿主として
検討がなされている。また、近年、サッカロマイセス属
酵母以外の酵母としてピキア属酵母、ハンセヌラ属酵
母、クルイベロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母な
どいくつかの種について、それらを形質転換する手法が
開発され、有用物質生産の宿主として検討されている。
このうち、キャンディダ属酵母は、特に、炭素資化域が
広いなど、サッカロミセス属酵母にない特性を有し実用
上有利である。このことから、キャンディダ属酵母は組
換えＤＮＡによる有用物質の生産にとってその利用が期
待される。
【０００６】キャンディダ属酵母のなかでもキャンディ
ダ・ユティリス(Candida utilis)は、キシロースを始め
とするペントースに対する優れた資化性を示す。また、
サッカロマイセス酵母と異なり、好気的条件下での培養
でエタノールを生成せず、それによる増殖阻害も受けな
いことから、高密度での連続培養による効率的な菌体製
造が可能である。従って、かつて蛋白質源として注目さ
れ、ペントースを多く含む広葉樹の糖化液や亜硫酸パル
プ廃液を糖源とした菌体の工業生産が実施されたことが
ある。また、この酵母はアメリカＦＤＡ（Food and Dru
g Administration）により、サッカロマイセス・セレビ
シエ、サッカロマイセス・フラジリスとともに、食品添
加物として安全に使用できる酵母として認められてい
る。実際にキャンディダ・ユティリスは現在でもドイツ
を始めとしてアメリカや台湾、ブラジルなど世界各国で
生産され、食飼料として使用されており、安全性につい
てはすでに確認されているといえる。
【０００７】以上のような微生物蛋白質としての利用以
外にも、キャンディダ・ユティリスは、ペントースやキ
シロースの発酵株、エチルアセテート、Ｌ−グルタミ
ン、グルタチオン、インベルターゼ等の生産株として広
く産業界で利用されてきた。
【０００８】しかしながら、今日までこのように有用な
キャンディダ・ユティリスの形質転換に成功し、それを
証明した報告はない。これは、キャンディダ・ユティリ
スが２倍体以上の倍数体であり、従来のニトロソグアニ
ジンやエチルメタンスルホン酸などの変異源を用いた突
然変異誘起処理によって適当な栄養要求性などの選択符
号が付加された変異株の取得が著しく困難であったこと
による、と考えられる。このことは、過去においてキャ
ンディダ・ユティリスのＡＤＥ１やＬＥＵ２など、他の
酵母で形質転換の選択マーカーとして頻繁に使用される
遺伝子が取得されながら（西矢ら、特開平４−６６０８
９号公報、小林ら、特公平１−４２６７３号公報）、対
応する遺伝子に変異をもつキャンディダ・ユティリス宿
主株が得られたという報告が現在までなかったことから
も推察することができる。すなわち、キャンディダ・ユ
ティリスには、栄養要求性株を宿主としてその栄養要求
性を相補する遺伝子を導入し形質転換体を直接選択する
という、従来より各種酵母における形質転換系の開発に
用いられてきた手法の適用ができなかったのである。
【０００９】さらに、キャンディダ・ユティリスは、そ
の倍数性が高く、胞子形成しないため遺伝学的特性が未
だ十分に明らかにされていない。そのため、形質転換条
件、さらにはベクター系が満たすべき条件も不明であ
り、その宿主／ベクター系の確立も極めて困難なもので
あることが予想される。
【００１０】なお、キャンディダ・ユティリスに関する
薬剤耐性マーカーを用いた予備的な形質転換の検討例
は、ホーらにより紹介されている(HO, N.W.Y. et. al.B
iotechnology and Bioengineering Symp. No.14, 295-3
01,1984 ) 。しかしながら、この報告においては、形質
転換実験の条件、形質転換体であると主張する薬剤耐性
株についてその証明に不可欠なサザン解析などのデータ
が開示されておらず、不十分な報告である。
【００１１】このことから、依然として、キャンディダ
・ユティリスに関する再現性ある形質転換系、さらにそ
れを利用した有用物質の生産技術の確立が望まれている
といえる。
【００１２】
【発明の概要】本発明者らは、今般、キャンディダ・ユ
ティリス酵母から再現性よく形質転換体を取得すること
に成功し、形質転換体における異種遺伝子の発現につい
て種々の知見を得た。本発明はこれらの知見に基づくも
のである。
【００１３】従って、本発明は、キャンディダ・ユティ
リスの再現性のある形質転換系の提供をその目的として
いる。
【００１４】また本発明は、キャンディダ・ユティリス
形質転換系で利用可能な、選択マーカーとなる遺伝子、
プラスミドが染色体への組み込まれる際のターゲット配
列となる遺伝子、異種遺伝子の発現に必要なプロモータ
ー、ターミネーターなど新規ＤＮＡ配列の提供をその目
的としている。
【００１５】さらに本発明は、キャンディダ・ユティリ
スにおける異種遺伝子の発現を可能にするベクター系の
提供をその目的としている。
【００１６】また本発明は、異種遺伝子を染色体に複数
コピーでかつ安定に組み込ませることのできる宿主／ベ
クター系の提供をその目的としている。
【００１７】さらにまた本発明は、キャンディダ・ユテ
ィリスにおける異種遺伝子の発現法の提供をその目的と
している。
【００１８】また、さらに本発明はキャンディダ・ユテ
ィリスで自律複製機能を有し、形質転換効率を上げる機
能を持つＤＮＡ断片、およびそれを含むプラスミドベク
ター、その利用による選択マーカー遺伝子を含まないＤ
ＮＡ断片を染色体に組み込む方法、ならびにプロモータ
ー活性を有するＤＮＡ配列の取得法、それにより得られ
たプロモーター活性を有する新規ＤＮＡ配列の提供をそ
の目的としている。
【００１９】本発明による新規ＤＮＡ配列群は、キャン
ディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１をコ
ードする遺伝子、ならびにそのプロモーターおよびター
ミネーター配列；シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝
子；ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプ
ロモーターおよびターミネーター配列；グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸- デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子
のプロモーターおよびターミネーター配列；原形質膜プ
ロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のプロモーターお
よびターミネーター配列；ＵＲＡ３遺伝子、ならびにそ
のプロモーターおよびターミネーター配列；二種類の自
律複製能を有するＤＮＡ断片；プロモーター活性を有す
るＤＮＡ断片の配列；そして、キャンディダ・ユティリ
スのリボソームＲＮＡをコードするｒＲＮＡ遺伝子であ
る。
【００２０】本発明によるキャンディダ・ユティリスの
形質転換系で利用可能なベクターは、キャンディダ・ユ
ティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列と、選択マーカー
遺伝子とを含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子
をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込む
ことができるもの、あるいは、キャンディダ・ユティリ
スで自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー
遺伝子とを含んでなり、高い頻度でキャンディダ・ユテ
ィリスを形質転換できるもの、である。
【００２１】また、本発明によるキャンディダ・ユティ
リスの形質転換系で利用可能なベクターは、選択マーカ
ー遺伝子を含まず、キャンディダ・ユティリスの染色体
ＤＮＡと相同な配列を含んでなり、相同組換えによって
異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡ
に組み込むことができるもの、である。このプラスミド
は、この自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マー
カー遺伝子とを含んでなるプラスミドと同時に形質転換
に用いることができる。
【００２２】さらにまた、本発明によるキャンディダ・
ユティリスの形質転換系で利用可能な選択マーカー遺伝
子は、キャンディダ・ユティリスで機能し得る薬剤耐性
マーカー、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺
伝子、Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子、またはハイグロ
マイシンＢ耐性を付与する遺伝子である。
【００２３】さらに、本発明によるキャンディダ・ユテ
ィリスにおける異種遺伝子の発現法は、異種遺伝子を含
む前記本発明によるベクターでキャンディダ・ユティリ
スを形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養
物から異種遺伝子の発現産物を単離、精製することを含
んでなるものである。
【００２４】そして、本発明によるキャンディダ・ユテ
ィリスの形質転換系とは、これらの本発明による新規Ｄ
ＮＡ群、ベクター系などの機能的組み合わせによって得
られるものである。
【００２５】
【発明の具体的説明】キャンディダ・ユティリス酵母 本発明による形質転換系が適用されるキャンディダ・ユ
ティリスの具体的菌株としては、例えばＡＴＣＣ９２５
６（ＩＦＯ ０６２６）、ＡＴＣＣ９２２６（ＩＦＯ
１０８６）、ＡＴＣＣ９９５０（ＩＦＯ ０９８８）、
ＩＦＯ ０３９６、ＩＦＯ ０６１９、ＩＦＯ ０６３
９、ＫＰ−２０５９Ｐ株などが挙げられる。
【００２６】なお、キャンディダ・ユティリスは株によ
ってその染色体泳動パターンが異なり、染色体の長さの
多型性を示すことが報告されている(Stoltenburg et. a
l. Curr. Genet. 22 441-446(1992) ）。従って、本発
明による形質転換系はその多型性に起因して適用が制限
されることが予想された。しかし、後記する実施例にお
いて使用した３株についてはそれぞれ染色体多型が認め
られたものの、いずれについても形質転換体が得られ、
また異種遺伝子の発現も確認できた。このことから、本
発明による形質転換系がキャンディダ・ユティリス全般
について適用可能であることは、当業者にとって容易に
推測できるものと考える。
【００２７】形質転換系 一般に生物の形質転換系を開発するためには、（ａ）形
質転換体を選別するための選択マーカー遺伝子および形
質転換体の選択方法、（ｂ）プラスミドＤＮＡが宿主細
胞内で核外遺伝子として存在するために必要な自律複製
能を有するＤＮＡ配列（ＡＲＳ）、またはプラスミドを
効率的に染色体に組み込ませるために必要な適当な染色
体ＤＮＡ相同配列（すなわち、プラスミドＤＮＡの組み
込みターゲットの確立）、さらに、（ｃ）宿主細胞を細
胞外ＤＮＡを取り込み可能な状態にする処理方法、の３
つの要素が必要となり、これら３つの要素がそろって形
質転換体を取得することが可能となる。したがって、遺
伝学的な情報がほとんど得られていないキャンディダ・
ユティリスの形質転換系の確立にあたっては、これらす
べての要素について検討し、開発することが必要不可欠
であった。
【００２８】（ａ）選択マーカー遺伝子および形質転換
体の選択 形質転換体を選別するための選択マーカー遺伝子として
は、変異処理により栄養要求性となった宿主株が利用で
きる場合、その栄養要求性を相補する遺伝子を選択マー
カー遺伝子として用いることができる。この場合、培地
から当該栄養素を除いた最少培地で形質転換体を直接選
択することが可能である。しかし、キャンディダ・ユテ
ィリスの場合には、前記したように、適当な栄養要求性
などの選択符号が付加された変異株の取得が著しく困難
であり、栄養要求性の相補遺伝子を選択マーカーとした
形質転換システムの開発が不可能であった。
【００２９】発明者らは、キャンディダ・ユティリス
が、抗生物質Ｇ４１８やハイグロマイシンＢ、シクロヘ
キシミドなどに感受性であり、培地中にそれらの薬剤を
添加することによって菌の生育を抑えることが可能であ
ることを見出した。そこで、形質転換体選択マーカー遺
伝子として、それらの薬剤に耐性を与える遺伝子を利用
することを試みることとした。
【００３０】ここでＧ４１８耐性遺伝子（アミノグリコ
シドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）やハイグロマ
イシンＢ耐性遺伝子（ハイグロマイシンＢホスフォトラ
ンスフェラーゼ遺伝子）などの、他の生物由来の遺伝子
を利用する場合、遺伝子の発現を確実にするためにキャ
ンディダ・ユティリスで機能する転写のプロモーターお
よびターミネーター配列を利用するのが好ましい。
【００３１】キャンディダ・アルビカンスなどの一部の
キャンディダ属酵母においては、一部コドンの翻訳のさ
れ方が他の生物とは異なっていることも報告されており
(Ohama et. al. Nucleic Acids Res. 21 4039 - 4045 1
993)、異種遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合に
は、それが宿主内で機能を持つ蛋白質に翻訳されるとい
う保証はない。一方で、シクロヘキシミドに対する感受
性はリボソーム蛋白質であるＬ４１蛋白質の５６番目残
基により決定されるという興味深い事実が報告されてい
る（Kawai et. al. J Bacteriol. 174 254-262 (1992)
）。
【００３２】そこで本発明者らは、シクロヘキシミドに
感受性であるキャンディダ・ユティリスのＬ４１蛋白質
の遺伝子を取得し、それを部位特異的変異法によりシク
ロヘキシミド耐性型に変換して選択マーカー遺伝子と
し、それを利用した。ここで、この遺伝子は宿主由来で
あるため、発現のプロモーターおよびターミネーター配
列はその遺伝子自身の配列をそのまま用いることとし
た。よって本態様は、遺伝子の確実な発現が期待できる
点で極めて有利である。
【００３３】従って、本発明によるキャンディダ・ユテ
ィリスの形質転換系において用いられる選択マーカーと
しての薬剤耐性遺伝子マーカーは、好ましくはシクロヘ
キシミド耐性型Ｌ４１遺伝子である。Ｌ４１遺伝子、な
らびにプロモーターおよびターミネーター配列を含んだ
ＤＮＡ断片の塩基配列は図１３（配列番号：５）に示さ
れる通りであり、さらにその塩基配列から推定されるア
ミノ酸配列は図１４（配列番号：６）に示される通りで
ある。また、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子は、
図１３に示される配列の１６４４番目のヌクレオチドＣ
がＡに変換されたものであり、その結果、図１４に示さ
れる配列の５６番目のアミノ酸はＰｒｏがＧｌｎに置換
される。
【００３４】また、本発明による形質転換系における他
の好ましい薬剤耐性遺伝子マーカーとして、抗生物質Ｇ
４１８に対する耐性を付与するアミノグリコシドホスフ
ォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子もまた使用でき
る。アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝
子にはトランスポゾンＴｎ９０３とトランスポゾンＴｎ
５由来の２種類が知られており、いずれの遺伝子も本発
明において使用可能である。また、抗生物質ハイグロマ
イシンＢに対する耐性を付与する大腸菌由来のハイグロ
マイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子もまた本
発明による形質転換系において使用できる。このＧ４１
８耐性遺伝子やハイグロマイシンＢ耐性遺伝子など異種
遺伝子の場合は、遺伝子発現のためにキャンディダ・ユ
ティリスで機能する転写のプロモーターおよびターミネ
ーター配列をそれぞれ異種遺伝子の５´上流と３´下流
とに組み込むのが好ましい。
【００３５】この転写のプロモーターおよびターミネー
ター配列としては、キャンディダ・ユティリスの遺伝子
由来であるのがより好ましく、例えば、後記するキャン
ディダ・ユティリスのホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐ
ＧＫ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配
列；グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター
配列；および原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）
遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列などが
利用出来る。また、後述するプロモータークローニング
用ベクターにより取得されるプロモーター活性を有する
ＤＮＡ配列なども利用できる。
【００３６】また、上記系において利用可能な他のプロ
モーターおよびターミネーター配列の例としては、サッ
カロマイセス酵母で公知のＡＤＨ、ＥＮＯ、ＧＡＬ、Ｓ
ＵＣなどの遺伝子のキャンディダ・ユティリスにおける
相同遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列な
どを挙げることができる。
【００３７】さらに、形質転換体の選択マーカーとして
利用可能な細菌由来の薬剤耐性遺伝子としては、前記し
たＧ４１８耐性遺伝子およびハイグロマイシンＢホスフ
ォトランスフェラーゼ遺伝子のほかに、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（クロラムフ
ェニコール耐性)(Hadfield, C. et.al. Gene, 45, 149-
158(1986))、ブラストサイジンデアミナーゼ（ブラスト
サイジン耐性）（Izumi, M. et. al. Exp. Cell Res.,
197, 229-233 （1991) ）、フレオマイシン耐性遺伝子
（Wenzel, T.J.et. al. Yeast, 8, 667-668 (1992) ）
などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。この他に、デ
ィハイドロフォレートレダクターゼ遺伝子（メトトレキ
セート耐性） （Miyajima, A. et. al. Mol. Cell Bio
l. 4, 407-414 (1984)）や、酵母由来の優性遺伝子スル
ホメツロンメチル耐性遺伝子（Casey, G.P. et. al. J.
Inst. Brew. 94, 93-97 (1988)）、CUP1遺伝子（銅耐
性）(Henderson，R.C.A. et. al. Current Genet. 9,
133-138 (1985)）、CYH2遺伝子（シクロヘキシミド耐
性）（Delgado, M. et．al. EBC congress, 23, 281-28
8 (1991)）など、公知の薬剤耐性遺伝子も利用できる。
このうちマーカー遺伝子が細菌やトランスポゾンの遺伝
子など異種生物由来である場合には、上記したようなキ
ャンディダ・ユティリス内で機能するプロモーター、お
よびターミネーター配列を利用するのが好ましい。
【００３８】（ｂ）プラスミドＤＮＡの組み込みターゲ
ットの確立 シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子をはじめとする利
用可能な選択マーカーが前記のように本発明によって確
立されたことから、これらの配列に限らずキャンディダ
・ユティリス染色体由来の種々の配列がターゲット配列
としての利用可能であることが期待される。
【００３９】本発明の好ましい態様によれば、プラスミ
ドを染色体に組み込ませるために必要な適当な染色体Ｄ
ＮＡ断片として、リボソームＲＮＡをコードする遺伝子
であるｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）、ＵＲＡ３遺伝子、
Ｌ４１遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子を好ましく使用する
ことができることが見出された。
【００４０】ｒＲＮＡ遺伝子については、サッカロマイ
セス・セレビシエにおいてｒＤＮＡが染色体上にタンデ
ムに１００コピー以上存在し、その反復単位のなかに自
律複製配列（ＡＲＳ）が存在することが報告されている
（Saffer &Miller, JR. Molec. Cell. Biol. 6, 1148-1
157, (1986) ）。また、このｒＤＮＡ領域をプラスミド
組み込みの ターゲットとすることにより、組み込みの
形質転換頻度を高くできることが報告されている（Lope
s, et. al. Gene 79, 199-206 (1989) ）。
【００４１】本発明者らは、キャンディダ・ユティリス
においてもｒＤＮＡが染色体上に反復して存在すること
を見出した。これにより、サッカロマイセス・セレビシ
エ同様、キャンディダ・ユティリスのｒＤＮＡ配列は、
高頻度組み込みのためのターゲット配列としての利用が
可能であることが示唆され、事実、キャンディダ・ユテ
ィリスの形質転換系において組換えターゲットとして有
利に利用することができた。
【００４２】興味あることに、ｒＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ
３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子などのキ
ャンディダ・ユティリス染色体をターゲットとし、後記
する本発明によるベクター系を用いて、キャンディダ・
ユディリス酵母を形質転換すると、ＤＮＡ断片が染色体
上に組み込まれ、酵母に安定に保持されることが観察さ
れた。従って、このターゲットとベクター系との組み合
わせにより、異種遺伝子が自律複製を続ける染色体外プ
ラスミドとして保持される場合の外来遺伝子の不安定性
の問題を排除することができる。
【００４３】本発明において、形質転換体により組み込
まれたＤＮＡ断片の存在様態を詳しく解析した結果、Ｄ
ＮＡ断片のキャンディダ・ユティリス染色体への組み込
みは主に相同組換えによって起きることが明らかとなっ
た。これは、宿主染色体ターゲット配列に対するホモロ
ジーを有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であれば、そ
れを任意の染色体ターゲットに組み込むことが可能であ
ることを意味する。
【００４４】具体的には、ターゲット配列に対するホモ
ロジーを有するＤＮＡ配列を、その相同ＤＮＡ配列内の
適当な制限酵素サイトで分解して直鎖状としたプラスミ
ドＤＮＡをベクターとして使用し、あるＤＮＡ断片をキ
ャンディダ・ユティリス染色体のターゲット配列上に組
み込むことができる。この場合、選択マーカーをシクロ
ヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子にすることにより、後述
するように複数のプラスミド分子が同時に組み込まれた
形質転換体が効率的に選択される。
【００４５】また、染色体ターゲット配列に対するホモ
ロジーを有するＤＮＡ配列の内部に選択マーカー遺伝子
を含んだ形態の線状ＤＮＡ断片を用いることも可能であ
る。
【００４６】本発明による本態様の形質転換において、
プラスミドは、染色体上の相同な遺伝子と置き換わる形
で挿入される。このため、挿入されたＤＮＡ断片の前後
には、ターゲット配列の反復配列が形成されず、よっ
て、組み込まれたＤＮＡのより高い安定性が期待され
る。
【００４７】ここで、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、
ＰＧＫ遺伝子などは、他の多くの遺伝子と同様に１細胞
あたり２コピーしか存在しない遺伝子であるが、ＤＮＡ
断片組み込みのターゲットとして用いることが可能であ
ることが本発明によって示された。また、一般に酵母の
ｒＲＮＡ遺伝子は１８Ｓ、５．８Ｓ、２５Ｓ、５Ｓの各
ｒＲＮＡ遺伝子を含む反復ＤＮＡ単位が１倍体あたり１
００コピー以上存在する（Schweizer, E. et. al. J. M
ol. Biol. 40, 261-277 (1969)）。そこで、このｒＤＮ
Ａを組換えのターゲット配列としての利用には、他の遺
伝子配列を利用した場合と比較して、（１）形質転換頻
度が上昇することが期待される、（２）組み込みによる
ターゲット配列の変化は無視できる、などの利点があ
る。発明者らは、キャンディダユティリスにおいてもｒ
ＲＮＡ遺伝子が、約１３．５ｋｂのＤＮＡ配列を反復単
位としてタンデムに反復して存在していること、を明ら
かにするとともに（詳細後記）、ｒＤＮＡ配列を組換え
のターゲット配列とすることで、細胞あたり２コピー存
在するＬ４１遺伝子をターゲットとするよりも形質転換
頻度が１０倍から５０倍程度高くなることを明らかにし
た。また、ｒＤＮＡ座に組み込まれたＤＮＡ断片の安定
性も高く、ｒＤＮＡ配列は優れた組み込みターゲットで
あることが明らかとなった。
【００４８】本発明においてＤＮＡ断片組み込みのター
ゲット配列としてｒＤＮＡ配列を用いたことは、このよ
うに形質転換頻度を高める効果をもたらし、酵母の処理
条件を検討してそのなかから適切な形質転換条件を発見
するうえで重要な役割を果たした。しかし、興味あるこ
とに、ｒＤＮＡの領域によっては形質転換のターゲット
として用いた場合に形質転換頻度が著しく低くなること
が明らかにされ、ｒＤＮＡ断片であればどこでも効率的
なプラスミドの組み込みターゲットとして利用できるも
のではないことが示唆された。
【００４９】さらに本発明の好ましい態様によれば、シ
クロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を選択マーカーとす
ることにより、プラスミドが複数個組み込まれた形質転
換体を効率的に取得できる。この理由は次のように考え
られる。すなわち、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝
子を含むＤＮＡ断片が複数コピー組み込まれた場合にの
み、内在性のシクロヘキシミド感受性型Ｌ４１蛋白質が
耐性型のものに置き換えられ、シクロヘキシミドによる
機能阻害を受けないリボソーム分子の割合が増える。こ
れによって、形質転換体がシクロヘキシミドを含む培地
で生育できることとなると考えられる。この場合の組み
込みのターゲット部位としてはＵＲＡ３遺伝子座、Ｌ４
１遺伝子座などのキャンディダ・ユティリス染色体由来
のＤＮＡ配列であれば基本的にいずれの配列も利用でき
る。また、興味深いことに、このうち特にｒＲＮＡ遺伝
子座をその組み込みのターゲット配列とすることによっ
て、他遺伝子座をターゲット配列とした場合に比較して
ＤＮＡ断片がより多く組み込まれる傾向があることが示
された。
【００５０】（ｃ）形質転換方法 形質転換方法、すなわち宿主細胞を細胞外ＤＮＡを取り
込み可能な状態にする処理方法としては、プロトプラス
ト法、酢酸リチウム法、電気パルス法、およびそれらの
改変法などの、サッカロマイセス・セレビシエの形質転
換に従来用いられている方法の利用が考えられる。この
うちプロトプラスト法は広く使用されている形質転換法
であるが、操作がやや煩雑であり、薬剤耐性で形質転換
体を選択する際には、非形質転換体であるバックグラン
ドコロニーの出現がしばしば問題となる。
【００５１】そこで本発明者らは、酢酸リチウム法なら
びに電気パルス法を用いて、先に述べたシクロヘキシミ
ド耐性Ｌ４１遺伝子とｒＤＮＡ断片を組み合わせたプラ
スミドによって、キャンディダ・ユティリスの形質転換
を試み、再現性良く形質転換体を得ることのできる条件
を見出した。
【００５２】キャンディダ・ユティリスの形質転換は、
電気パルス法によるのが好ましい。菌体を対数増殖期に
まで増殖させた後、洗浄して１Ｍソルビトールに懸濁す
る。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値（電圧
が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が約１
０から２０ミリ秒であり、パルス後の生菌率が約１０−
４０％となる条件であれば良い。例えば、本発明の好ま
しい態様によれば、電気容量が２５μＦ、抵抗値が６０
０〜１０００オーム、電圧が３．７５〜５ＫＶ／ｃｍの
条件で、上記のタイムコンスタント値と生菌率が得ら
れ、１μｇＤＮＡあたり約５００〜１４００個の形質転
換体が得られることが示された。
【００５３】また、電気パルスを加えた後、菌液に１Ｍ
ソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え３０℃で振盪培養
することが好ましく、培養せずに菌を直接シクロヘキシ
ミドを含む選択プレートに塗布するとコロニーが得られ
ない場合があることが見出だされた。また、培養時間は
４〜６時間程度が適当であり、その後は形質転換体の増
殖が無視できなくなる。このほか、ＤＮＡと菌体を接触
する際にサーモンスパームＤＮＡなどのキャリアＤＮＡ
を添加することやポリエチレングリコールを添加するこ
となどによって形質転換頻度を高めることも本発明によ
る形質転換系にあっても好ましい。
【００５４】また、酢酸リチウム法(Ito et al. J. Bac
teriol. 153, 163-168 1983)はその簡便さから広くサッ
カロミセス属酵母の形質転換に用いられており、さまざ
まな改良法が報告されている。これらの方法を用いても
キャンディダ・ユティリスの形質転換が可能であること
が確認された。特に、エタノールを添加するリチウム法
変法(Soni et. al. Current Genet. 1993 24, 455-459)
によってキャンディダ・ユティリスの形質転換が好まし
く可能である。また、集菌時の菌体密度、リチウムの濃
度、ポリエチレングリコールの種類と濃度、キャリアＤ
ＮＡの種類、形態、量など異なる条件を試みることによ
り、酢酸リチウム法によるキャンディダユティリスの形
質転換の至適条件を決定して、形質転換頻度を高めるこ
とが可能である。上記した本発明による（ａ）選択マー
カー遺伝子および（ｂ）組み込みターゲットが確定され
たことから、これらは当業者にとり容易であると考え
る。
【００５５】なお、形質転換条件を見出す過程で、サッ
カロマイセス・セレビシエで機能するキャンディダ・ユ
ティリス由来ＡＲＳ配列８種類と、同じくサッカロマイ
セス・セレビシエで機能するＧ４１８耐性遺伝子発現ユ
ニットとを組み合わせたプラスミドを用いて形質転換を
試みたが、形質転換体は取得できなかった。この結果は
ホーらによるキャンディダユティリスの形質転換の報告
(HO, N.W.Y．et. al.前掲）の再現性を疑わせるもので
あるといえる。
【００５６】発現ベクター系および異種遺伝子の発現 本発明によれば、キャンディダ・ユティリスの形質転換
に使用される発現ベクター系が提供される。
【００５７】本発明によるベクターの一つの態様は、キ
ャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列（以
下、「相同ＤＮＡ配列」ということがある）を含み、こ
の部分において相同組換えを起こすことにより、プラス
ミドＤＮＡを染色体に組み込むことを可能にし、かつ形
質転換体の選別を可能とする選択マーカー遺伝子を含ん
でなる、プラスミドＤＮＡである。
【００５８】ここで、相同ＤＮＡ配列とは好ましくはｒ
ＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、ＰＧＫ
遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＭＡ遺伝子などが挙げられ、
それらはキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ由来の
ものであることが好ましい。用いる配列に依存して染色
体上の任意の位置に異種遺伝子を組み込むことが可能で
ある。このプラスミドは、プラスミド分子内の相同ＤＮ
Ａ配列内の適当な制限酵素サイトでの分解によりプラス
ミドＤＮＡを直鎖状として使用される。その結果、プラ
スミドＤＮＡ断片はキャンディダ・ユディリス染色体に
相同組換えにより組み込まれる。
【００５９】さらに本発明の好ましい態様によれば、こ
のプラスミドＤＮＡ中で、マーカー遺伝子および異種遺
伝子を含むＤＮＡ配列は、その両端において前記相同Ｄ
ＮＡ配列に挟まれてなる。この態様では、このプラスミ
ドＤＮＡを相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断し、相
同ＤＮＡ配列をその両端に有するマーカー遺伝子および
異種遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る。こうして得たＤＮ
Ａ断片も、また、相同組換えによりキャンディダ・ユデ
ィリス染色体ＤＮＡに相同組換えにより組み込まれ得る
ものである。
【００６０】なお、本明細書において、「ＤＮＡ断片
（または配列）が、キャンディダ・ユディリス染色体に
相同組換えにより組み込まれる」とは、ＤＮＡ断片がキ
ャンディダ・ユディリス染色体に組み込まれる限りにお
いて、その組み込みの態様は限定されないが、少なくと
も次の二つの態様を含む意味に用いることとする。すな
わち、（１）キャンディダ・ユディリス染色体のＤＮＡ
配列と、ＤＮＡ断片の両端にある相同ＤＮＡ配列部分と
が相同組換えを生じ、開裂部分にＤＮＡ断片が”挿入”
されて染色体ＤＮＡに組み込まれる態様、および（２）
キャンディダ・ユディリス染色体のＤＮＡ配列と、ＤＮ
Ａ断片の両端にある相同ＤＮＡ配列との相同組換えによ
って、プラスミドＤＮＡ断片がキャンディダ・ユディリ
ス染色体の一部と”置換”されて染色体ＤＮＡに組み込
まれる態様のいずれも少なくとも意味するものとする。
（２）の態様においては、挿入されたＤＮＡ断片の前後
に、ターゲット配列の反復配列が形成されないため、組
み込まれたＤＮＡ断片が安定に染色体に存在することが
期待される。
【００６１】また、選択マーカー遺伝子としては前記し
た薬剤耐性マーカーを利用するのが好ましく、より好ま
しい薬剤耐性マーカーとしては、シクロヘキシミド耐性
を付与する遺伝子、例えばシクロヘキシミド耐性型Ｌ４
１遺伝子；抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子、例
えばバクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のＡＰＴ
遺伝子；抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子などが
挙げられる。これら選択マーカー遺伝子が微生物由来で
ある場合は、それらの発現を確かなものとするためにキ
ャンディダ・ユティリスで機能するプロモーターに連結
することが好ましい。
【００６２】また、本発明のもう一つの態様によるベク
ターは、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同
な配列（相同ＤＮＡ配列）を含み、この部分において相
同組換えを起こすことにより、プラスミドＤＮＡを染色
体に組み込むことを可能とするものであり、一方で形質
転換体選択のための選択マーカー遺伝子を持たないプラ
スミドＤＮＡである。このプラスミドは、プラスミド分
子中の相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトでの分
解により直鎖状とし使用される。
【００６３】また、この態様のプラスミドにおいても、
このプラスミドＤＮＡは、異種遺伝子を含むＤＮＡ配列
が、その両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてな
るよう構成されてよい。そして、このプラスミドＤＮＡ
を相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断することによっ
て、相同ＤＮＡ配列をその両端に有するＤＮＡ断片が得
られる。こうして得られたＤＮＡ断片も相同組換えによ
りキャンディダ・ユディリス染色体ＤＮＡに相同組換え
により組み込まれうるものである。
【００６４】これら直鎖状とされたＤＮＡ断片は、上記
した選択マーカー遺伝子を含んでなるプラスミドＤＮＡ
の場合と同様に、キャンディダ・ユディリス染色体に相
同組換えにより組み込まれる。本態様のプラスミドにお
いても、上記（２）の態様による組み込みにすること
で、組み込まれたＤＮＡ断片が安定に染色体に存在する
ことが期待される。
【００６５】ここで、相同ＤＮＡ配列とは好ましくはｒ
ＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、ＰＧＫ
遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＭＡ遺伝子などが挙げられ
る。それらはキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ由
来のものであることが好ましい。また、用いる配列に依
存して染色体上の任意の位置に外来ＤＮＡ断片を組み込
むことが可能である。
【００６６】このベクターは、後述する自律複製配列を
含むＤＮＡ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミ
ドと同時に形質転換に用いられる。すなわち、自律複製
能を有するプラスミドが導入されたことにより選択され
る形質転換体のなかから、さらに選択マーカー遺伝子を
持たないＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれた株を二次
的に選択することが可能である。選択された株に存在す
るプラスミドは、その後非選択条件下で菌を培養するこ
とによって脱落させることが可能であり、結果として、
挿入ＤＮＡ断片だけを染色体上に保持する株を取得する
ことができる。この手法を用いることにより、例えば異
種遺伝子のみを保持し、微生物由来の薬剤耐性遺伝子の
ように余分な配列を含まない株を育種することが可能に
なる。
【００６７】またさらに、この自律複製配列を含むＤＮ
Ａ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミド自体
も、キャンディダ・ユティリス酵母形質転換用のベクタ
ーとして利用可能である。このプラスミドは非選択条件
下で菌を培養することによって脱落しやすい特徴をもつ
が、安定性を高めるＤＮＡ断片が後述するように取得で
き、このＤＮＡ断片と組み合わせてベクターとして利用
することが可能である。
【００６８】これら本発明によるベクターに異種遺伝子
を連結して、異種遺伝子を保持したベクターとすること
ができる。このベクターによってキャンディダ・ユティ
リスを形質転換すると、それらの異種遺伝子をキャンデ
ィダ・ユティリス染色体に安定に組み込むことが可能で
ある。こうして得られた形質転換体を適当な培地中で培
養し、該培養物から異種遺伝子の発現産物を、その発現
産物に適した方法で単離、精製することによって、異種
遺伝子をキャンディダ・ユティリスで発現させることが
できる。すなわち、キャンディダ・ユティリスにおける
異種遺伝子の発現法が提供される。ここで、異種遺伝子
とは通常は宿主のキャンディダユティリス染色体上に本
来存在しない遺伝子またはその一部のＤＮＡを意味する
ものとする。
【００６９】異種遺伝子は、好ましくは、その異種遺伝
子の発現を独立して制御する調節領域と組み合わせる
か、または、形質転換の過程で破壊された遺伝子自身の
調節領域の影響下にその異種遺伝子を発現させる。その
ような配列はキャンディダ・ユティリスで機能する必要
があり、その好ましい具体例としては後記する本発明に
よるＰＧＫ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、およびＰＭＡ遺伝子
のプロモーター配列およびターミネーター配列、さらに
は後述するプロモータークローニング用ベクターにより
取得されるプロモーター活性を有するＤＮＡ配列が挙げ
られる。
【００７０】後記する実施例から明らかなように、本発
明により、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモ
ーター配列およびターミネーター配列を用いて、グルコ
アミラーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスフォトランス
フェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ハイ
グロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子など
の異種遺伝子の発現に成功した。また、さらにグリセロ
アルデヒド- ３- リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロ
モーターおよびターミネーター配列、ならびに原形質膜
プロトンＡＴＰａｓｅ遺伝子のプロモーターおよびター
ミネーター配列を用いて、アミノグリコシドホスフォト
ランスフェラーゼ遺伝子の発現にも成功した。これらの
異種タンパク質のうち、グルコアミラーゼは分泌蛋白質
であり、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ
やβ−ガラクトシダーゼは菌体内酵素である。このこと
は、本発明によるキャンディダ・ユティリスでの異種蛋
白質の生産は、それが菌体内あるいは分泌蛋白質いずれ
であっても可能であることを意味する。さらに、グルコ
アミラーゼについてはその高レベルの分泌発現が認めら
れ、キャンディダ・ユティリスが異種蛋白質の高生産の
ための優れた宿主となりうることが明らかにされたとい
える。
【００７１】さらにキャンディダ・マルトーサ、アルビ
カンスなど一部のキャンディダ属酵母においては、一部
コドンの翻訳のされ方が他の生物とは異なっていること
も報告されている(Ohama et. al. Nucleic Acids Res.
21 4039 - 4045(1993)) 。キャンディダ・マルトーサを
宿主として得られた大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子の発現産物が活性を示さないことは、そのためで
あるとされている。後記実施例から明らかなように、キ
ャンディダ・ユティリスで産生された、大腸菌由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子産物はその活性を保持してい
た。このことは、キャンディダ・ユティリスが正常なコ
ドン認識をすることを示しており、これはキャンディダ
・ユティリスが異種ポリペプチド生産において好ましい
宿主であることを示している。
【００７２】また、キャンディダ・ユティリスで異種遺
伝子を発現することによってキャンディダ・ユティリス
の性質を改変することができる。従って、本発明によれ
ば、新たなキャンディダ・ユティリス株の作出法が提供
される。例えばその発酵特性を改良し、工業的有用性を
増大することが可能である。特にグルコアミラーゼ遺伝
子を発現するキャンディダユティリス株は、澱粉資化性
が付与されることにより利用可能な炭素源スペクトルが
拡大されたといえる。
【００７３】さらに、本発明によるベクターは、キャン
ディダ・ユティリス以外の細胞の形質転換に利用するこ
とも可能である。キャンディダ・ユティリス以外の細胞
を宿主とする場合、形質転換の実施に際して適当なＤＮ
Ａ断片を選択するのが好ましい。そのようなＤＮＡ断片
としては、大腸菌の場合、例えばpBluescript やｐＵＣ
１９のような細菌のプラスミドＤＮＡが挙げられる。ま
た、サッカロマイセス属酵母の場合、例えばＹＥｐ１
３、ＹＣｐ５０（Methods in Enzymology, 194,p195-23
0, Academic Press(1991)) などの酵母−大腸菌シャト
ルベクターが挙げられる。
【００７４】キャンディダ・ユティリス酵母内で自律複
製能を有するＤＮＡ配列のクローニング法 さらに本発明によれば、キャンディダ・ユティリス酵母
内で自律複製能を持つＤＮＡ配列をクローン化する手法
が提供される。使用するＤＮＡはいかなる生物種由来の
ものであってもよいが、キャンディダ・ユティリス由来
であるのが好ましい。また、このためのベクターとして
は、薬剤耐性マーカー遺伝子を含むものが利用でき、好
ましくはキャンディダユティリスで機能するプロモータ
ーとターミネーターとにより発現するＧ４１８耐性遺伝
子であるＡＰＴ遺伝子を含むベクターを用いることがで
きる。具体的には、ＰＧＫ遺伝子プロモーターで発現す
るＡＰＴ遺伝子を有するプラスミドをベクターとして用
いて、キャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライ
ブラリーを作製し、このライブラリーＤＮＡでキャンデ
ィダ・ユティリスを形質転換する。そして、例えばＧ４
１８耐性で選択される形質転換体酵母から全ＤＮＡを抽
出して、大腸菌を形質転換することにより、形質転換酵
母体で、染色体外因子として存在していたプラスミドＤ
ＮＡを回収することができる。このプラスミドＤＮＡに
挿入されたキャンディダ・ユティリス由来の染色体ＤＮ
Ａ断片から、自律複製配列（ＡＲＳ）としての機能配列
を分離することができる。
【００７５】驚くべきことに、薬剤耐性マーカーとして
シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含むプラスミド
をベクターとした場合は、自律複製能を持つＤＮＡ配列
をクローン化することはできなかった。すなわち、この
プラスミドを用いてキャンディダ・ユティリス酵母染色
体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーＤＮ
Ａでキャンディダ・ユティリスを形質転換しても、シク
ロヘキシミド耐性の形質転換体は得られなかった。これ
は、キャンディダ・ユティリスのＡＲＳの特徴として、
それを含むプラスミドの細胞あたりのコピー数が低く、
形質転換体を選択するために数コピー必要なシクロヘキ
シミド耐性型Ｌ４１遺伝子と組み合わせても形質転換体
を選択できないことを示唆している。これは後に、取得
したＡＲＳとシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子とを
含むプラスミドによってキャンディダ・ユティリスの形
質転換を行っても、形質転換体が得られなかったことか
らも確認された。後記する実施例に示されるように、分
離したＡＲＳを含むＤＮＡ配列の性質を詳しく解析する
ことにより、ＡＲＳを有するプラスミドはキャンディダ
・ユティリス酵母内で１細胞あたり約１コピーしか存在
しないことが明らかにされた。この他に、分離したＡＲ
Ｓの特徴として、それを含むプラスミドが不安定である
ことがあげられる。非選択条件下で約２．５〜３．５世
代培養することにより、プラスミドを保持する菌の割合
は全体の２０〜３０％にまで低下していた。
【００７６】キャンディダ・ユティリス酵母内でプロモ
ーター活性を有するＤＮＡ配列の分離法 前記の自律複製能を有するＤＮＡ配列の利用により、キ
ャンディダ・ユティリスにおいて転写のプロモーター活
性を有するＤＮＡ配列のクローン化法が提供される。こ
のためのベクターとしては、自律複製能を有するＤＮＡ
配列の他に、転写のためのプロモーター配列を持たない
薬剤耐性マーカー遺伝子を含むものであれば用いること
ができ、好ましくはＧ４１８耐性遺伝子であるＡＰＴ遺
伝子を含むものを用いることができる。また、使用する
ＤＮＡはいかなる生物種由来であってもよいが、キャン
ディダ・ユティリス由来であるのが好ましい。また、ラ
イブラリー作成のためにＤＮＡは制限酵素やＤＮＡアー
ゼなどの酵素処理あるいは超音波などの機械的剪断によ
り低分子化する必要があるが、好ましくは、４塩基認識
でかつ平滑末端を生じる３種類の制限酵素AluI、HaeII
I、RsaIを組み合わせて染色体ＤＮＡの部分分解に使用
する。これにより、より多くの染色体領域がライブラリ
ーにクローン化されるからである。
【００７７】より具体的には、プロモーター配列を含ま
ないＡＰＴ遺伝子の５’側に、前記の制限酵素により部
分分解した約０. ８〜１. ８ｋｂのＤＮＡ断片を連結し
てキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラ
リーを通常法によって作製する。そして、このライブラ
リーＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換す
る。プロモーター活性を有するＤＮＡ配列がＡＰＴ遺伝
子の直前にクローン化されたプラスミドにより形質転換
された酵母はＧ４１８耐性となる。よって、Ｇ４１８耐
性を示す形質転換体から全ＤＮＡを抽出して、大腸菌を
形質転換することにより、プロモーター活性を有するＤ
ＮＡ配列を効率的に分離することができる。この際、プ
レートに含まれるＧ４１８濃度を高くする、またはプレ
ート上で比較的大きなコロニーを形成する株を選択する
ことによって、より転写活性の高いプロモーター配列を
分離することが可能である。本発明によるこの方法は、
前述したようにキャンディダ・ユティリスにおけるＡＲ
Ｓを含むプラスミドのコピー数は細胞あたり１コピー程
度であるため、活性の高いプロモーター配列を分離する
のに好都合であるといえる。
【００７８】キャンディダ・ユティリスのその他機能遺
伝子の分離法 また、前述の本発明によるキャンディダ・ユティリス酵
母内でプロモーター活性をするＤＮＡを分離する方法
は、同時に、ＡＲＳを含んだプラスミドの安定性を高め
る機能を有するＤＮＡ配列の分離法を提供する。キャン
ディダ・ユティリスにおけるＡＲＳを含むプラスミドの
存在様式のひとつの特徴として、その安定性が低く、非
選択条件下で約３〜４世代培養することにより、プラス
ミドを保持する菌体の割合が全体の２０〜３０％にまで
低下する。このため、選択薬剤を含むプレート上におい
ては、薬剤耐性遺伝子を持つＡＲＳプラスミドを保持す
る株は、薬剤耐性遺伝子が染色体上に組み込まれた株と
比較して、細胞あたりのコピー数が同じであってもやや
小さいコロニーを形成する。本発明においては、活性の
高いプロモーター配列を分離するために比較的大きなコ
ロニーを形成する株を選択したために、後記する実施例
で示すように分離されたプロモーター活性を有するＤＮ
Ａ配列のなかには、同時に、プラスミドの安定性を改善
し、より安定にする機能を持つＤＮＡ配列も取得するこ
とができた。またさらに、当業者にとり、この形質転換
系を利用することによって、このほかセントロメア配列
など種々の機能を有するＤＮＡ配列の取得が可能である
ことは容易に想到可能と考える。
【００７９】薬剤耐性マーカー遺伝子を含まない形質転
換体の作出法 前述の本発明による自律複製能を有するＤＮＡ配列の利
用により、更に、薬剤耐性マーカー遺伝子を含まない形
質転換体の作出法が提供される。具体的には、薬剤耐性
マーカー遺伝子を含まない形質転換体は、以下の手順に
より取得可能である。始めに前記の形質転換体選択のた
めの選択マーカー遺伝子を持たず、染色体ＤＮＡと相同
な配列（相同ＤＮＡ配列）を含むプラスミドＤＮＡを、
この相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトで分解す
ることにより直鎖状とする。これにより、この直鎖状プ
ラスミドＤＮＡはキャンディダ・ユティリス染色体の相
同ＤＮＡ配列上に組み込まれる得るものとなる。その
後、この直鎖状プラスミドＤＮＡを、ＡＲＳを含むＤＮ
Ａ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミドと同時
に酵母の形質転換に用いる。次にＡＲＳを含むプラスミ
ドが導入されたことにより選択される形質転換体のなか
から、同時に形質転換に用いたＤＮＡ断片が染色体上に
組み込まれた株を、ＤＮＡ断片に含まれる異種遺伝子な
どの発現をみるか、またはＰＣＲ、サザン解析などでＤ
ＮＡ断片の組み込みを確認することなどして、二次的に
選択する。さらに選択された株に存在する自律複製能プ
ラスミドは、非選択条件下で菌を培養することによって
容易に脱落させることが可能である。これにより、選択
マーカー遺伝子を保持せず、挿入ＤＮＡ断片だけを染色
体上に保持する株を取得することが可能である。
【００８０】キャンディダ・ユティリス染色体の部位特
異的変異法 本発明の別の態様によれば、キャンディダ・ユティリス
染色体の部位特異的変異法が提供される。この方法は、
選択マーカー遺伝子をターゲット遺伝子に挿入して機能
を失わせた遺伝子分断カセットを、染色体のターゲット
遺伝子の置換体として使用することに基づく。このカセ
ットは、その両端に染色体ターゲット遺伝子に相同で組
換え可能なＤＮＡ配列（相同ＤＮＡ配列）を含み、かつ
それらの間に少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含
んでなる、線状ＤＮＡ構造をなすものである。このうち
挿入可能なＤＮＡ断片は、それが染色体上に存在すると
きと同じ方向であることが重要である。このカセットを
用いて酵母を形質転換することにより、このマーカー遺
伝子とその両側に存在する挿入可能なＤＮＡ配列とが宿
主に取り込まれる。この形質転換の結果として、組み込
み部位のターゲット遺伝子が破壊され、新規な形質を有
する酵母株が得られる。選択マーカー遺伝子は好ましく
は薬剤耐性遺伝子であり、遺伝子が破壊された形質転換
体は薬剤耐性により選択できる。遺伝子修飾のターゲッ
トになりうる遺伝子は、キャンディダ・ユティリス染色
体由来の遺伝子であるのが好ましい。具体的にはＵＲＡ
３、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４遺伝子などが挙げら
れるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】例えば、キャンディダ・ユティリスＵＲＡ
３遺伝子を、シクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子などの
選択マーカー遺伝子により分断して、機能を持たない遺
伝子とした後、形質転換に用いる。得られたシクロヘキ
シミド耐性の形質転換体は、染色体上のＵＲＡ３遺伝子
２個のうち１個が破壊されている。続いてＧ４１８耐性
遺伝子など他の選択マーカー遺伝子により分断されたＵ
ＲＡ３遺伝子断片を用いて、１個のＵＲＡ３遺伝子が破
壊された前記株を形質転換することにより、ＵＲＡ３遺
伝子が２個とも破壊された株を得ることができる。ｕｒ
ａ３変異株はウラシル生合成経路中間体の毒性類似体で
ある５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に耐性とな
ることが知られている。よって、２個のうち１個のＵＲ
Ａ３遺伝子が破壊された株を遺伝子置換することで得ら
れた、ＵＲＡ３遺伝子が２個とも機能を失ったｕｒａ３
変異株を、５−ＦＯＡ耐性株として取得することも可能
である。これによって得られるｕｒａ３変異株を宿主と
して用いることにより、ＵＲＡ３遺伝子を選択マーカー
遺伝子とした、薬剤耐性遺伝子マーカーによらない形質
転換体取得も可能になる。さらにこうして得られる栄養
要求性変異株は化学的突然変異法により作製された株の
ように、その他の遺伝子座に生じうる二次突然変異の影
響を受ける可能性がきわめて低いという利点を有する。
【００８２】Ｌ４１遺伝子 本発明によれば、キャンディダ・ユティリスのリボソー
ム構成蛋白質Ｌ４１、ならびに、それをコードする遺伝
子、そのプロモーター、およびターミネーター配列が提
供される。
【００８３】本発明によるキャンディダ・ユティリスの
蛋白質Ｌ４１は、具体的には図１４に記載のアミノ酸配
列（配列番号：６）を有するものである。従って、本発
明によるＬ４１遺伝子は、図１４に記載のアミノ酸配列
をコードするものである。さらに、この遺伝子と、その
プロモーター、およびターミネーター配列とを含んでな
る塩基配列の具体例は、図１３（配列番号：５）に示さ
れる塩基配列である。
【００８４】また、さらに本発明によれば、部位特異的
変異作製法により、56番目のアミノ酸残基がプロリンか
らグルタミンに変換されたシクロヘキシミド耐性型Ｌ４
１蛋白質をコードする変異型Ｌ４１遺伝子が提供され
る。このシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子は、前記
したように、キャンディダ・ユティリスの形質転換の選
択マーカー遺伝子として有用であるほか、他の酵母、た
とえばサッカロマイセス属酵母の形質転換マーカー遺伝
子としても使用できる。また、さらにこの遺伝子のプロ
モーター、ターミネーター配列は異種遺伝子の発現にも
使用可能であるのは言うまでもない。
【００８５】ＰＧＫ遺伝子 本発明によれば、また、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター配
列、およびターミネーター配列が提供される。
【００８６】プロモーター配列の好ましい具体例として
は、図３に記載の塩基配列（配列番号：２）の内、少な
くとも９４６番〜１３４６番までの配列を有する配列、
およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げ
られる。
【００８７】また、ターミネーター配列の好ましい具体
例としては、図２に記載の塩基配列（配列番号：１）、
およびターミネーター活性を保持するその部分配列が挙
げられる。
【００８８】このプロモーター配列とターミネーター配
列とを適当なプラスミドベクターに接続することによ
り、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクタ
ーを得ることができる。このためのプラスミドベクター
としてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プ
ラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝
子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染
色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列
とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用でき
る。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵
母、においても、プロモーター、またはターミネーター
として利用することも可能であることは当業者に明らか
であると考える。
【００８９】ＰＧＫ遺伝子は解糖系酵素の遺伝子であ
り、その他の解糖系酵素の遺伝子と共にキャンディダ・
ユティリスで大量に発現していることから、強力なプロ
モーターであることが期待される。後記する実施例で
は、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるグ
ルコアミラーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスフォトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子など
の発現に、このプロモーターが有利に利用できることが
明らかにされている。
【００９０】また、本発明によるＰＧＫ遺伝子プロモー
ター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発
現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させること
によって、発現ベクターを小型化することも可能である
ことは当業者に自明の事項であろう。
【００９１】ＧＡＰ遺伝子 本発明によれば、ＧＡＰ遺伝子のプロモーター配列およ
びターミネーター配列が提供される。
【００９２】プロモーター配列の好ましい具体例として
は、図３０に記載の塩基配列（配列番号：７）、および
プロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられ
る。
【００９３】また、ターミネーター配列の好ましい具体
例としては、図３１に記載の塩基配列（配列番号：
８）、およびターミネーター活性を保持するその部分配
列が挙げられる。
【００９４】このプロモーター配列とターミネーター配
列とを適当なプラスミドベクターに接続することによ
り、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクタ
ーを得ることができる。このためのプラスミドベクター
としてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プ
ラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝
子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染
色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列
とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用でき
る。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵
母、においても、プロモーター、またはターミネーター
として利用することも可能であることは当業者に明らか
であると考える。
【００９５】ＧＡＰ遺伝子は解糖系酵素の遺伝子であ
り、その他の解糖系酵素の遺伝子と共にキャンディダ・
ユティリスで大量に発現していることから、強力なプロ
モーターを有することが期待される。後記する実施例で
は、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるア
ミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発
現に、このプロモーターが有利に利用できることが明ら
かにされている。
【００９６】また、本発明によるＧＡＰ遺伝子プロモー
ター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発
現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させること
によって、発現ベクターを小型化することも可能である
ことは当業者に自明の事項であろう。
【００９７】ＰＭＡ遺伝子 本発明によれば、ＰＭＡ遺伝子のプロモーター配列、お
よびターミネーター配列が提供される。
【００９８】プロモーター配列の好ましい具体例として
は、図３４に記載の塩基配列（配列番号：９）、および
プロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられ
る。
【００９９】また、ターミネーター配列の好ましい具体
例としては、図３５に記載の塩基配列（配列番号：１
０）、およびターミネーター活性を保持するその部分配
列が挙げられる。
【０１００】このプロモーター配列とターミネーター配
列とを適当なプラスミドベクターに接続することによ
り、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクタ
ーを得ることができる。このためのプラスミドベクター
としてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プ
ラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝
子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染
色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列
とを含む酵母ー大腸菌シャトルプラスミドが利用でき
る。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵
母、においても、プロモーター、またはターミネーター
として利用することも可能であることは当業者に明らか
であると考える。
【０１０１】ＰＭＡ遺伝子は原形質膜酵素の遺伝子であ
り、サッカロマイセス酵母においては原形質膜タンパク
質の約１０％を占めている主要タンパク質であることが
知られている。従って、このＰＭＡ遺伝子は、強力なプ
ロモーターを有していることが期待される。後記する実
施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子で
あるアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝
子の発現に、このプロモーターが有利に利用できること
が明らかにされている。
【０１０２】また、本発明によるＰＭＡ遺伝子プロモー
ター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発
現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させること
によって、発現ベクターを小型化することも可能である
ことは当業者に自明の事項であろう。
【０１０３】プロモーター活性を有するＤＮＡ配列 本発明によれば、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列
が提供される。このＤＮＡ配列は、自律複製能を有する
ＤＮＡ配列と、転写のためのプロモーター配列を持たな
い薬剤耐性マーカー遺伝子とを含んでなるベクターを利
用して分離される。プロモーター活性を有するＤＮＡ配
列の好ましい具体例としては、図４８に記載の塩基配列
（配列番号：１３）、およびプロモーター活性を保持す
るその部分配列が挙げられる。また、後記する実施例で
詳述するように、このベクターを利用して、図４８に記
載の塩基配列が明らかにされたプロモーター活性を有す
るＤＮＡ配列以外に、８種類のＤＮＡ配列が取得され
た。この転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤
耐性遺伝子を例えばハイグロマイシンＢ耐性遺伝子など
他の遺伝子に置き換えることによっても同様に、プロモ
ーター活性を有するＤＮＡ配列を分離できる。また、さ
らに形質転換体を選択するプレートに含まれる糖の種類
や、その他の培地組成など選択条件を変更することによ
り、ある特異的な条件下で転写活性が誘導されるプロモ
ーターを取得することが可能である。これらのことは、
本明細書の開示を参照すれば、当業者に容易に理解され
る事項であろう。
【０１０４】このプロモーター配列を適当なターミネー
ター配列とともに適当なプラスミドベクターに接続する
ことによりキャンディダ・ユティリスで利用可能な発現
ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベ
クターとしてはpBluescript、ｐＵＣ１９など公知の大
腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４
１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応
じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮ
Ａ配列とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用
できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属
酵母、においても、プロモーターとして利用することも
可能であることは当業者に明らかであると考える。
【０１０５】後記する実施例では、作製した発現ベクタ
ーを用いて異種遺伝子であるアミノグリコシドホスフォ
トランスフェラーゼ遺伝子の発現に、このプロモーター
が有利に利用できることが明らかにされている。
【０１０６】また、本発明によるプロモーター配列に連
結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部
を欠損させることによって、発現ベクターを小型化する
ことも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【０１０７】ｒＲＮＡ遺伝子 本発明によれば、さらに、キャンディダユティリスのｒ
ＲＮＡ遺伝子を含んでなる、約１３．５ｋｂのＤＮＡ断
片、およびその断片が反復されてなるＤＮＡ配列が提供
される。
【０１０８】この約１３．５ｋｂの断片は、図６（ｂ）
に示される制限酵素地図で表されるものである。このＤ
ＮＡ配列のうち１８Ｓ、５．８Ｓ、２５Ｓ ｒＲＮＡ遺
伝子の位置は図６（ｂ）に示される通りであった。
【０１０９】このｒＲＮＡ遺伝子の一部の領域をＤＮＡ
断片の染色体組み込みのためのターゲット配列として用
いることにより、効率的で多コピーの組み込みが達成さ
れる。この約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片を４個の断片に
分けてプラスミドを構築し、それぞれ、形質転換に用い
たところ、興味あることに、組み込みターゲット配列と
して使用する領域によって、得られる形質転換頻度に差
が認められた。すなわち、図２０の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺
伝子の３´側一部と５．８５ｒＲＮＡ遺伝子、さらに２
５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５´側一部を含む３．５ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＲＥ４、または
２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３´側一部を含む３ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＲＥ６と１８Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の５´側一部を含む４．７ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＥ７では、高頻度で形
質転換体が得られたが、一方、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
を含む２．４ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣ
ＬＲＥ５では得られる形質転換頻度が低かった。
【０１１０】ＵＲＡ３遺伝子 本発明によれば、さらにまた、サッカロミセス・セレビ
シエ酵母のｕｒａ３変異を相補する、キャンディダ・ユ
ティリスのＵＲＡ３遺伝子が提供される。この遺伝子
は、前記したように、ＤＮＡ断片の組み込みターゲット
として用いられるほか、染色体ＵＲＡ３遺伝子の遺伝子
破壊によるｕｒａ３変異株の作出に使用できる。これに
よって得られるｕｒａ３変異株を宿主として用いること
により、ＵＲＡ３遺伝子を選択マーカー遺伝子とした薬
剤耐性遺伝子マーカーによらない形質転換体の取得も可
能になる。また、さらにこの遺伝子のプロモーターおよ
びターミネーター配列は、異種遺伝子の発現にも使用可
能であるのは言うまでもない。
【０１１１】具体的なＵＲＡ３遺伝子は、図１０および
図１１に示されるアミノ酸配列（配列番号：４）をコー
ドするものである。好ましいＵＲＡ３遺伝子は図９に示
される塩基配列（配列番号：３）を有するもの、または
サッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補
する機能を保持するその部分配列を有するものである。
【０１１２】自律複製能を有するＤＮＡ配列（ＡＲＳ） 本発明によれば、自律複製機能を有するＤＮＡ配列であ
って、キャンディダ・ユティリス内で、当該ＤＮＡ配列
を含むベクターを、染色体外要素としてのプラスミドと
して保持させ、宿主の形質転換頻度を上昇させることが
できるＤＮＡ配列が提供される。このＤＮＡ断片として
はどのような生物由来でも良いが、好ましくはキャンデ
ィダ・ユティリス由来である。ＡＲＳの好ましい具体例
としては、図４１および図４２に記載の塩基配列（配列
番号：１１）、あるいは図４３および図４４に記載の塩
基配列（配列番号１２）、および自律複製機能を有する
その部分配列が挙げられる。後記する実施例から明らか
なように、短縮化したＤＮＡ断片を含むプラスミドによ
っても、頻度は低下するものの、キャンディダ・ユティ
リス酵母を形質転換することができる。
【０１１３】このＡＲＳと、適当な選択マーカー遺伝子
とを使用することにより、キャンディダ・ユティリス内
においてプラスミドとして存在し得るベクターが提供さ
れる。さらに、このベクターを利用することにより、プ
ロモーター活性を有するＤＮＡ配列や、その他の機能を
有するＤＮＡ配列を分離することが可能である。また、
キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列
（相同ＤＮＡ配列）を含み、かつ特に形質転換体を選択
するための選択マーカー遺伝子を持たないプラスミドＤ
ＮＡとともに、ＡＲＳと適当な選択マーカー遺伝子とを
含むプラスミドを形質転換に用いることにより、選択マ
ーカー遺伝子を含まず、異種遺伝子を含むＤＮＡ断片の
みを染色体上に保持する形質転換酵母の作出が可能であ
る。
【０１１４】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるも
のではない。
【０１１５】なお、各種遺伝子の制限酵素地図における
制限酵素サイトについては以下の略号で示してある。
【０１１６】Ａａ；ＡａｔII、Ａｆ；ＡｆlII 、Ａｌ；
ＡｆｌIII 、Ａｐ；ＡｐａＩ、Ｂ；ＢａｍＨＩ、Ｂｇ；
ＢｇｌII、Ｃ；ＣｌａＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、ＲＶ；Ｅｃ
ｏＲＶ、Ｈ； ＨｉｎｄIII 、Ｈｐ；ＨｐａＩ、Ｋ；Ｋ
ｐｎＩ、Ｐ；ＰｓｔＩ、Ｐｖ；ＰｖｕII、Ｓ；Ｓａｌ
Ｉ、Ｓｅ；ＳｐｅＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｃ；Ｓａｃ
Ｉ、ＳｃII； ＳａｃII、Ｓｐ；ＳｐｈＩ、Ｘ；Ｘｂａ
Ｉ、およびＸｈ；ＸｈｏＩである。
【０１１７】また、以下に記載する実施例において共通
に使用される方法は以下のとおりである。
【０１１８】１）ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビ
ーンヌクレアーゼを用いた欠失変異処理とＤＮＡ配列の
決定 プラスミド１０μｇを適当な制限酵素消化した後、フェ
ノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により
ＤＮＡを回収した。ＤＮＡを１００μｌのＥｘｏIII 緩
衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１０
０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ ２
−メルカプトエタノール) に溶解し、１８０ユニットの
ＥｘｏIII ヌクレアーゼを加え、３７℃で保温した。１
分ごとに１０μｌをサンプリングし、２サンプル分ずつ
まとめて、２０μｌのＭＢバッファー（４０ｍＭ Ｎａ
−Acetate, １００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＺｎＣｌ
2，１０％グリセロール ｐＨ４．５）の入った氷冷し
たチューブに移した。得られた５本のチューブを６５℃
１０分間保温して酵素を失活させた後、５ユニットのマ
ングビーンヌクレアーゼを加えて、３７℃で３０分間反
応した。反応後、アガロースゲル電気泳動により欠失の
程度が異なる５種類のＤＮＡ断片を回収した。回収した
ＤＮＡはクレノウ酵素で末端を平滑化し、１６℃で一晩
ライゲーション反応した後、大腸菌を形質転換した。
【０１１９】得られた種々のプラスミドの挿入断片につ
いて、アプライドバイオシステムズ（株）の蛍光プライ
マーサイクルシークエンスキットを用いてシークエンス
反応を行い、自動ＤＮＡシークエンサーを用いてＤＮＡ
配列を決定した。
【０１２０】２）ハイブリダイゼーション ＤＮＡはアガロースゲル電気泳動後、ハイボンドＮ＋フ
ィルター（Amersham）に、添付のプロトコールにしたが
ってアルカリトランスファーして、サザンハイブリダイ
ゼーション用のフィルターを作製した。
【０１２１】ＤＮＡが固定化されたフィルターは、ハイ
ブリダイゼーション溶液（６ｘＳＳＣ，５ｘDenhardt S
olution,０．２％ ＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌ Salmon
sperm ＤＮＡ）中で６５℃、２時間プレハイブリダイゼ
ーションを行った。次にMegaprime ＤＮＡ labelling
systems （Amersham）と［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１１０
ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）とを用いて標識化したプローブＤＮ
Ａを、ハイブリダイゼーション溶液に加え、６５℃で１
６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイ
ゼーション後、フィルターは１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤ
Ｓ中で、６５℃、２時間洗浄した後、オートラジオグラ
フィーに供してシグナルを検出した。
【０１２２】３）培地組成 酵母を培養するためのＹＰＤ培地の組成は１％酵母エキ
ス、２％バクトペプトン、２％グルコースであり、プレ
ートの場合は寒天を２％になるように加えた。ＳＤ培地
の組成は、０．６７％アミノ酸不含イーストニトロジェ
ンベース、２％グルコースであり、使用した酵母の栄養
要求性に応じて、アミノ酸を添加した。プレートの場合
は寒天を２％になるように加えた。
【０１２３】４）酵素処理 制限酵素反応、クレノウ酵素処理、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
反応など、種々の酵素による反応は、メーカーの推奨す
る反応条件、あるいはMolecular Cloning 2ndedition S
ambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989) に記載の方法に従って行った。
【０１２４】実施例１：キャンディダユティリス染色体
ＤＮＡの調製 キャンディダ・ユティリス(Candida utilis)の染色体Ｄ
ＮＡ抽出は、以下に示す方法で行った。３０ｍｌのＹＰ
Ｄ培地に、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０
株を植菌し、３０℃で定常期初期になるまで培養した。
遠心分離により菌体を集めて滅菌水で洗浄した後、再度
遠心分離により集菌した。菌体は３ｍｌのザイモリアー
ゼバッファー（０．９Ｍソルビトール、０．１Ｍ ＥＤ
ＴＡ、５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）に懸濁した後、
２５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ１００Ｔを含む０．９
Ｍソルビトールを２００μｌを加え、３７℃で振とう保
温した。顕微鏡下でプロトプラスト化を確認した後、遠
心分離してプロトプラスト化した菌を回収した。３ｍｌ
の溶菌バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０
ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、穏やかに、かつ
十分に懸濁してから０．３ｍｌの１０％ＳＤＳを混合
し、６５℃で一夜保温した。続いて１ｍｌの５Ｍ酢酸カ
リウム液を加え、氷上で１時間放置した。その後遠心分
離により凝集物を除き、４ｍｌの冷却したエタノールを
加え、遠心分離してＤＮＡ等を沈殿させた。沈殿は５０
％のエタノールで洗浄し、乾燥した後、３ｍｌのＲＮａ
ｓｅ Ａバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、ｐ
Ｈ７．５）に溶解して、３７℃で３０分保温した。最後
に３ｍｌの２−プロパノールを加え、遠心分離して上清
を除いた後、沈殿を５０％の２−プロパノールで洗浄
し、乾燥させた。この沈殿を０．５ｍｌのＴＥバッファ
ーに溶解したものをキャンディダ・ユティリス染色体Ｄ
ＮＡ試料とした。
【０１２５】実施例２：ホスホグリセリン酸キナーゼ
（ＰＧＫ）遺伝子のクローニング キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩで部分消化した後、０．８Ｍ ＮａＣｌ、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）を含む１０−５０％ショ糖密度勾配に重層し
て、120,000 x ｇ、１４時間の遠心分離によりＤＮＡ断
片を分画した。このうち１０〜２０ｋｂの染色体ＤＮＡ
断片と、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したλファー
ジベクターDASHTMII（Stratagene Cloning Systems)と
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。続いてGi
gapackII Gold Packaging Extract(Stratagene Cloning
Systems) を用いてインビトロパッケージングし、キャ
ンディダユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを構築し
た。
【０１２６】キャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子
のクローニングは、他生物の既知のＰＧＫ遺伝子をプロ
ーブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。
すなわち、Molecular Cloning 2nd edition Sambrook
et. al. p2.108-121,Cold Spring Harbor Laboratory
(1989) に記載された方法に従い、上記のＤＮＡライブ
ラリーの約20,000プラークのファージＤＮＡを吸着させ
たフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セ
レビシエのＰＧＫ遺伝子を保持するプラスミドｐＳＴ２
（Yamano et. al. Journal of Biotechnology.32, 165-
171(1994)) からＰＧＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、２
ｋｂのＣｌａＩ断片として切り出した。この断片を32Ｐ
標識して、これをプローブとしてハイブリダイゼーショ
ンを行った。その結果４つの陽性プラークが分離でき
た。更にこれらプラークから調製したファージＤＮＡに
ついてさまざまな制限酵素で消化後、同じプローブを用
いてサザン解析を行った。その結果、プローブにハイブ
リダイズした２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片と２．５ｋｂ
ＳａｌＩ断片を単離した。
【０１２７】実施例３：ＰＧＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片
の塩基配列決定と、構造遺伝子及び制御領域の特定 単離した２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドベ
クターBluescriptIISK+ のＥｃｏＲＩサイトに組み込
み、ベクターに対する挿入断片の方向性が互いに逆向き
のプラスミドｐＰＧＫＥ１、ｐＰＧＫＥ２を作製した。
また、２．５ｋｂＳａｌＩ断片を同様にベクターBluesc
riptIISK+ のＳａｌＩサイトに組み込み、ベクターに対
する挿入断片の方向性が互いに逆向きのプラスミドｐＰ
ＧＫＳ１、ｐＰＧＫＳ２を作製した（図１）。
【０１２８】このうち、プラスミドｐＰＧＫＥ１、ｐＰ
ＧＫＥ２の２種のプラスミドについて、ＨｉｎｄIII 、
ＫｐｎＩ、ＳａｌＩなどの制限酵素サイトでの欠失変異
体の作製や、ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビーン
ヌクレアーゼを用いて欠失変異体を作製することによ
り、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、２５３
０ｂｐからなるＥｃｏＲＩ断片の配列を決定した。
【０１２９】予想される構造遺伝子領域の解析を行った
ところ、１２４８ｂｐからなるオープンリーディングフ
レームが存在し、そこから推定される遺伝子産物のアミ
ノ酸配列についてサッカロマイセス・セレビシエのＰＧ
Ｋ遺伝子に対するホモロジーを調べた。両配列は互いに
８６．８％のホモロジーを示したことから、単離した遺
伝子がキャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子である
と断定した。
【０１３０】またこのＥｃｏＲＩ断片には、遺伝子制御
領域については、開始コドンＡＴＧの上流４０１ｂｐ、
終止コドンＴＡＡの下流８８０ｂｐが含まれていた。こ
のうち、転写のターミネーターを含むと推測される終止
コドンＴＡＡの直後からＥｃｏＲＩサイトまでの８８０
ｂｐの配列は図２に示される通りであった。またさら
に、プラスミドｐＰＧＫＳ１、ｐＰＧＫＳ２について
も、ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレア
ーゼを用いた欠失変異体作製により種々の欠失変異をも
つプラスミドを作製し、ＨｉｎｄIII サイトからＥｃｏ
ＲＩサイトまでの塩基配列を決定した（図１）。転写の
プロモーターを含むと推測されるＨｉｎｄIII サイトか
ら開始コドンＡＴＧの直前までの１３４６ｂｐの配列は
図３に示される通りであった。
【０１３１】実施例４：ＰＧＫ遺伝子プロモーターとタ
ーミネーターとを使った発現ベクターの構築 キャンディダ・ユティリス内で異種遺伝子を発現させる
ためには、キャンディダ・ユティリス内で機能する遺伝
子発現因子、転写プロモーター及びターミネーターが必
要となる。そこで、キャンディダ・ユティリスのＰＧＫ
遺伝子プロモーターと、ターミネーターとの間に、マル
チクローニングサイトを持つ発現ベクタープラスミドを
作製した。
【０１３２】まず、Polymerase Chain Reaction （ＰＣ
Ｒ）によリ、プロモーターとターミネーターとを含む断
片をそれぞれ取得した（図１）。
【０１３３】プロモーターとしては、プラスミドｐＰＧ
ＫＳ１を鋳型として、開始コドンの２．３ｋｂ上流に位
置するＳａｌＩサイトから開始コドンＡＴＧ直前までの
断片を取得した。プライマーとして、 5'-GGTCGACATATCGTGGTAAGCGCCTTGTCA-3' （配列番号：１４） 5'-TTCTAGACTTTATCCGCCAGTATGTTAGTC-3' （配列番号：１５） を用い、３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩ部位をも
つ様にデザインして合成した。
【０１３４】次に、ターミネーターとしては、プラスミ
ドｐＰＧＫＥ１を鋳型として、終止コドン直後から８８
０ｂｐ下流のＥｃｏＲＩサイトまでの断片を取得した。
プライマーとして、 5'-GGGTACCTAACTGCAAGCTACTTTGTAATTAAC-3' （配列番号：１６） 5'-GGAATTCAACATGAATGACACGACGAAGGT-3' （配列番号：１７） を用い、５’上流側終止コドン直後にＫｐｎＩサイトを
もつ様にデザインし合成した。
【０１３５】ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼ（Stratagene Cloning Systems）を使い、添付のバ
ッファーを使用して、３０サイクル行った。
【０１３６】ＰＣＲ合成したプロモーター及びターミネ
ーター断片は、それぞれＳａｌＩとＸｂａＩ、またはＫ
ｐｎＩとＥｃｏＲＩで消化した。その断片を、ｐＵＣ１
９のＳａｌＩ−ＸｂａＩサイトとＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ
サイトとに順に組み込み、プラスミドｐＰＧＫＰＴ１を
構築した（図４）。続いて、ターミネーター下流末端の
ＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化した
後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１
８）を連結してから、ＰｓｔＩ消化により約０．９ｋｂ
のＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片を切り出した。この断片を、
プラスミドｐＰＧＫＳ１から切り出した１．２ｋｂＨｉ
ｎｄIII −ＰｓｔＩ断片と共に、pBluescriptSK-のＨｉ
ｎｄIII サイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入して、プ
ラスミドｐＰＧＫＰＴ２を構築した。さらに、ｐＰＧＫ
ＰＴ２をＢｇｌII消化して、クレノウ酵素処理、そして
再環状化することにより、ターミネーター断片中のＢｇ
ｌIIサイトを除去して、プラスミドｐＰＧＫＰＴ３を構
築した。続いてｐＰＧＫＰＴ３のＨｉｎｄIII サイトを
クレノウ酵素処理により平滑化した後、ＮｏｔＩリンカ
ー（5'AGCGGCCGCT3'：配列番号：１８）を連結して、プ
ラスミドｐＰＧＫＰＴ４を構築した。また、プラスミド
ｐＰＧＫＰＴ４をＫｐｎＩで部分消化して、プロモータ
ー上流のＫｐｎＩサイトを欠失させて、プラスミドｐＰ
ＧＫＰＴ５を構築した（図４）。
【０１３７】実施例５：ｒＲＮＡ遺伝子の単離 実施例２に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られ
た、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０のゲノ
ムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片のうち、５〜１０
ｋｂの分画のＤＮＡ断片４００ｎｇと、ＢａｍＨＩ消化
した後脱リン酸化したベクタープラスミドｐＢＲ３２
２、２００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連
結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転
換して、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブ
ラリーを完成した。
【０１３８】このうち約10,000コロニーについて、 Mol
ecular Cloning 2nd edition Sambrook et. al. p12.
21-23, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に従っ
てフィルターを作製し、サッカロミセス・セレビシエの
１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む１．８ｋｂのＨｉｎｄII
I −ＥｃｏＲＩ断片を32Ｐ標識し、これをプローブとし
てスクリーニングを行った。このプローブとして用いた
ｒＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８
８Ｃ［α，ｓｕｃ２，ｍａｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１］よ
り作製した染色体ＤＮＡライブラリーから、５．８Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の５´末端の４〜３２番目の塩基に対応
するオリゴマーを32Ｐ標識したものをプローブとして取
得したものである（曽根ら、特公平６−１４８６５号公
報）。
【０１３９】その結果、２００個以上のポジティブクロ
ーンが得られた。このうち７個のクローンｐＣＲ１、ｐ
ＣＲ４、ｐＣＲ５、ｐＣＲ６、ｐＣＲ７、ｐＣＲ８、お
よびｐＣＲ９についてプラスミドの制限酵素地図を作製
し、整列させ比較したところ、両端の制限酵素地図が一
致した（図５）。このことから、キャンディダ・ユティ
リスのｒＲＮＡ遺伝子を含む領域が、約１３ｋｂからな
る繰り返し構造をとっていることが明らかとなった。
【０１４０】これらのプラスミドより、ＥｃｏＲＩまた
はＸｂａＩ消化により切り出される断片をpBluescriptS
K-にサブクローン化して、プラスミドｐＣＲＥ１、ｐＣ
ＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、ｐＣＲＸ２、ｐＣＲ
Ｘ３、およびｐＣＲＸ４を構築した（図６（ａ））。さ
らに、これらのプラスミドをさまざまな制限酵素により
消化した後、再環状化することにより、各種の欠失プラ
スミドを構築した。これらプラスミドの挿入断片につい
て図６に矢印で示した領域について塩基配列を決定した
ところ、１８Ｓ、５．８Ｓ、および２５Ｓ ｒＲＮＡ遺
伝子に高いホモロジーを示す領域が認められ、これによ
って３つのｒＲＮＡ遺伝子の存在位置、転写方向などが
明らかとなった（図６（ｂ））。
【０１４１】実施例６：オルチジン−５´−フォスフェ
ート デカルボキシラーゼ遺伝子（ＵＲＡ３遺伝子）の
単離 実施例２に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られ
た、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０のゲノ
ムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片の内、５〜１０ｋ
ｂの分画のＤＮＡ断片１００ｎｇと、ＢａｍＨＩ消化し
た後脱リン酸化したベクタープラスミドＹＥｐ１３(Met
hods in Enzymol. 194, 195-230, 1991)１００ｎｇと
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。このＤＮ
Ａ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、染色体Ｄ
ＮＡライブラリーを作製した。形質転換体よりプラスミ
ド混合物を抽出後、得られたＤＮＡでｕｒａ３−株であ
るサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ５００（αｈｉ
ｓ３，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ａｄｅ２，ｌｙｓ２，ｕｒ
ａ３）(Stratagene Cloning Systems)を形質転換し、最
少培地で生育するウラシル非要求性の形質転換株を選択
した。サッカロマイセス・セレビシエ株の形質転換はMe
thods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manu
al - Rose M.D et al.P122-123Cold Spring Harbor Lab
oratory PressNY (1990) 記載のリチウム法に従った。
【０１４２】この方法により１０μｇのＤＮＡから、５
株のＵｒａ+ 株が得られた。これら形質転換株より、Me
thods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manu
al -Rose M.D et al. P130 Cold Spring Harbor Labora
tory Press NY (1990)記載の方法に従いプラスミドＤＮ
Ａを調製した。これで大腸菌を形質転換してプラスミド
ＤＮＡを回収した。これらのプラスミドＤＮＡのうち、
ＹＥｐ１３のＢａｍＨＩ部位に６．１ｋｂのインサート
を含むプラスミドｐＣＵＲＡ３−３と、８．１ｋｂのイ
ンサートを含むｐＣＵＲＡ３−５とについて、制限酵素
地図を作製した。その地図は図７に示される通りであ
る。
【０１４３】実施例７：ＵＲＡ３遺伝子領域の特定化と
塩基配列の決定 ＵＲＡ３遺伝子領域を特定化するために、プラスミドｐ
ＣＵＲＡ３−３とｐＣＵＲＡ３−５に共通する領域を含
む５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＣＵＲＡ３
−５より切り出し、プラスミドｐＲＳ３１４（Stratage
ne Cloning Systems) のＥｃｏＲＩ部位に連結して、プ
ラスミドｐＵＲＡＥ１を作製した（図７）。このプラス
ミドでＹＰＨ５００株をリチウム法により形質転換した
ところ、高頻度でＵＲＡ+ の形質転換体が得られた。こ
れより、この５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片中にＵＲＡ３遺伝
子が存在し、１コピーでサッカロマイセス・セレビシエ
のｕｒａ３- 変異を相補することが明らかにされた。
【０１４４】次に、プラスミドｐＵＲＡＥ１をＸｈｏ
Ｉ、またはＰｓｔＩ消化して、再びＴ４リガーゼ反応に
より再環状化することにより、プラスミドｐＵＲＡＥ１
ΔＸｈｏ、およびｐＵＲＡＥ１ΔＰｓｔを得た。
【０１４５】さらにプラスミドｐＵＲＡＥ１より切り出
された３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片、および
２．３ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を、それぞれプラスミド
ｐＲＳ３１４のＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ間、およびＨｉｎ
ｄIII 部位に挿入して、プラスミドｐＵＲＡＥＣ１、お
よびｐＵＲＡＨ１を作製した（図７）。
【０１４６】以上、５種類のプラスミドを用いてＹＰＨ
５００株をリチウム法により形質転換し、ｕｒａ３- 変
異の相補能を調べることにより、これらの断片がＵＲＡ
３遺伝子を含むかどうかを調べた。その結果は、図７に
示される通りであった。これより、ＵＲＡ３遺伝子をＥ
ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 間の２．３ｋｂに限定すること
ができた。
【０１４７】さらにＵＲＡ３遺伝子を含む２．３ｋｂの
ＨｉｎｄIII 断片を、プラスミドpBluescript SK- のＨ
ｉｎｄIII 部位に連結して、プラスミドｐＵＲＡＨ２を
作製した。つぎに挿入断片の両側からＥｘｏIII ヌクレ
アーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変
異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作
製し、塩基配列を決定した。そのシークエンスストラテ
ジーと塩基配列の解析から明らかにされた制限酵素地図
は、図８に示される通りであった。また、得られた２３
３０ｂｐからなるＤＮＡ配列は図９に、また推定される
２６７アミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配
列は図１０および図１１に示される通りである。
【０１４８】推定されたポリペプチドのアミノ酸配列を
他の酵母のＵＲＡ３蛋白質と比較したところ、サッカロ
マイセス・セレビシエとでは７３．４％、クルイベロマ
イセス・ラクティスとでは７６．３％、キャンディダ・
アルビカンスでは７５．１％と、高い相同性を示した。
【０１４９】実施例８：Ｌ４１遺伝子のクローニングと
Ｌ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定 実施例５で作製したライブラリーの約30,000コロニーに
ついて、Molecular Cloning 2nd edition p12.21-23,Co
ld Spring Harbor Laboratory (1989) に従ってフィル
ターを作製し、32Ｐ標識したキャンディダ・マルトーサ
のＬ４１遺伝子ＲＩＭ−Ｃを含む、１．１ｋｂのＸｂａ
Ｉ−Ｓａｕ３ＡＩ断片（KAWAI et. al.J Bacteriol. 17
4, 254-262 (1992)）をプローブとしてスクリーニング
を行った。
【０１５０】その結果、５個のポジティブクローンが得
られ、このうち３個のクローンｐＣＬ４１−１、ｐＣＬ
４１−２、およびｐＣＬ４１−５について制限酵素地図
を作製し、それを比較したところ、これらのクローンが
４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を共有することが示された（図
１２）。さらにこれらプラスミドＤＮＡのサザンハイブ
リダイゼーション解析により、キャンディダ・マルトー
サのＬ４１遺伝子に相同性を示す領域が、この４ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片内の１．４ｋｂＣｌａＩ−ＰｓｔＩ断片
内にあることが示された。
【０１５１】そこで４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、pBlues
cript SK- のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、挿入断片が互
いに逆向きのプラスミドｐＣＬＥ１、およびｐＣＬＥ２
を作製した。この２種のプラスミドについてＥｃｏＲＩ
断片内にサイトをもつＨｉｎｄIII 、ＸｈｏＩ、Ｃｌａ
Ｉなどによる欠失変異体の作製や、ＥｘｏIII ヌクレア
ーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異
体の作製により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作
製し、ＢａｍＨＩサイトからＳａｃＩサイトまでの２０
８６ｂｐからなるＤＮＡ配列を決定した（図１３）。
【０１５２】この配列を解析すると、サザン解析により
Ｌ４１造遺伝子が存在すると推定された領域に３６７ｂ
ｐのイントロンで分断された３１８ｂｐからなるオープ
ンリーディングフレームが存在した（図１２および図１
４）。イントロンと推定された領域の５´と３´端およ
び３´端近傍にはイントロンに共通する配列GTATGT--TA
CTAAC--AG が認められた。また、その位置も報告されて
いる他の酵母由来の６種類のＬ４１遺伝子（KAWAI et.
al. J Bacteriol. 174, 254-262 (1992)、POZOet. al.
Eur. J. Biochem. 213, 849-857 (1993) ）と同様、開
始コドンの直後に存在していた。キャンディダ・ユティ
リスＬ４１ポリペプチドの推定されるアミノ酸配列を他
のいくつかのＬ４１蛋白質と比較したところ、サッカロ
マイセス・セレビシエＬ４１ａとの間では９３．４％、
キャンディダ・トロピカリスＬ４１との間では８９．６
％、キャンディダ・マルトーサのＬ４１との間では８
５．８％と、高い相同性を示した。
【０１５３】実施例９ 部位特異的変異法によるシクロ
ヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子の作製 シクロヘキシミド耐性を示す酵母のＬ４１蛋白質の５６
番目のアミノ酸はグルタミンであり、一方、シクロヘキ
シミド感受性酵母のＬ４１蛋白質においてはこの位置の
アミノ酸はプロリンである。そしてこのアミノ酸残基が
そのＬ４１蛋白質をもつ酵母のシクロヘキシミドに対す
る感受性を決定していると報告されている（KAWAI et.
al. J Bacteriol. 174 254-262 (1992) ）。ここで、シ
クロヘキシミド感受性であるキャンディダ・ユティリス
のＬ４１蛋白質の５６番目のアミノ酸はシクロヘキシミ
ド感受性のサッカロマイセスセレビシエと同様にプロリ
ンであった。そこで、部位特異的突然変異導入によりＬ
４１遺伝子の５６番目のプロリンをコードするコドンを
グルタミンコドンに変更することによって、この遺伝子
がコードするＬ４１蛋白質をシクロヘキシミド耐性型へ
と変換し、形質転換の選択マーカーとして利用した。
【０１５４】まず、プラスミドｐＣＬＥ１から得られる
２．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をｐＵＣ１８の
ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩサイト間に挿入して、プラスミド
ｐＣＬＢＳ１を作製した（図１５）。
【０１５５】また、プラスミドｐＣＬＥ１をＡｆｌII消
化し、クレノウ酵素処理により平滑化した後、さらにＸ
ｈｏＩ消化することによって得られる０．６ｋｂの断片
を、pBluescript SK- のＳｍａＩとＸｈｏＩ間に挿入し
て、ｐＣＬＡＸ１を作製した。このプラスミドにおいて
は、０．６ｋｂ断片の平滑化されたＡｆｌII末端とベク
ターのＳｍａＩ末端とのライゲーションにより、Ａｆｌ
II切断部位が再生される。ヘルパーファージを用いてｐ
ＣＬＸＡ１から一本鎖ＤＮＡを調製し、合成した変異用
オリゴヌクレオチド5'TTG TGG AAA ACT TGC TTG GTT TG
A3' を用いて、Sculptorインビトロミュータジェネシス
キット(Amersham)により、変異プラスミドを作製した。
得られた候補プラスミドについて０．６ｋｂ挿入断片の
全塩基配列を決定し、５６番目のプロリンをコードする
コドンCCA がグルタミンのコドンCAA に変異され、その
他の配列に変異のないプラスミドｐＣＬＡＸ２０を得
た。ｐＣＬＡＸ２０から０．６ｋｂの挿入断片をＣｌａ
Ｉ−ＡｆｌII断片として切り出し、これと、プラスミド
ｐＣＬＢＳ１をＣｌａＩとＡｆｌIIと消化して得られる
４．４ｋｂの断片とライゲーションして、変異型Ｌ４１
遺伝子を含むプラスミドｐＣＬＢＳ１０を構築した。
【０１５６】また、プラスミドｐＣＬＢＳ１０をＢａｍ
ＨＩとＳｐｈＩとで消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理により平滑末端とした後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGC
GGCCGCT3')を挿入して、プラスミドｐＣＬＢＳ１２を構
築した（図１５）。
【０１５７】次に、作成した変異型Ｌ４１遺伝子が酵母
にシクロヘキシミド耐性を付与するかどうかを調べた。
ＹＥｐ型ベクターであるＹＥｐ１３Ｋ（Sone et. al. A
ppl.Environ. Microbiol. 54, 38-42 (1988)）のＢａｍ
ＨＩ−ＳａｃＩサイト間に、プラスミドｐＣＬＢＳ１０
から得られる２．１ｋｂの変異型Ｌ４１遺伝子を含むＢ
ａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を挿入して、プラスミドｐＹＥ
ＣＬ１０を作製した。一方、コントロールとしてｐＣＬ
ＢＳ１から得られる２．１ｋｂの野生型Ｌ４１遺伝子を
含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をＹＥｐ１３Ｋにクロー
ン化したプラスミドｐＹＥＣＬ１を作製した。
【０１５８】これらのプラスミドを用いてサッカロミセ
ス酵母ＹＰＨ５００株をMethods inYeast Genetics - A
laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P122-1
23Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) 記
載の酢酸リチウム法に従って形質転換した。形質転換体
として、ロイシン非要求性になった株を選択した。これ
らの形質転換体についてシクロヘキシミドを含むＹＰＤ
プレートでの生育を調べたところ、ｐＹＥＣＬ１０を保
持する株は、５０および１００μｇ／ｍｌのシクロヘキ
シミドを含むＹＰＤプレートで増殖することが示され
た。一方、ｐＹＥＣＬ１を保持する株は同濃度のシクロ
ヘキシミドを含むプレート上ではまったく増殖しなかっ
た。これによって、作成した変異型Ｌ４１遺伝子がシク
ロヘキシミド感受性酵母に耐性を付与することが示され
た。
【０１５９】実施例１０：形質転換用プラスミドの構築
とキャンディダユティリス形質転換条件の決定 始めにサッカロマイセス・セレビシエで機能することが
既に明らかにされているＧ４１８耐性遺伝子（アミノグ
リコシドフォスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝
子）の発現カセットを含むプラスミドを用いて、キャン
ディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試
みた。この発現カセットは、Yamanoらの記載した１．０
ｋｂのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子のプロモーター領域、０．４ｋｂのホスホグリ
セレートキナーゼ遺伝子のターミネーター領域 （Yama
no et al. J. Biotechnol. 32, 165-171(1994)）の間
に、プラスミドｐＵＣ４Ｋ (Pharmacia)からＸｈｏＩ−
ＰｓｔＩ断片として切り出される、１．１ｋｂＧ４１８
耐性遺伝子を平滑末端化して連結して作製したものであ
る。このプラスミドとしては、(1) 上記発現カセットを
ＹＥｐ型ベクターＹＥｐ１３Ｋ（Sone et.al. Appl. En
v. Microbiol., 54, 38-42 (1998) ）連結したプラスミ
ド、および(2) 上記発現カセットをプラスミドpBluescr
ipt SK- に連結したプラスミドｐＧＰＤＡＰＨ１のＢａ
ｍＨＩサイトに実施例２に記載のキャンディダ・ユティ
リスＡＴＣＣ９９５０株のＳａｎ３ＡＩ部分消化染色体
ＤＮＡ断片（５−１０ｋｂ）を挿入したＤＮＡライブラ
リー、さらに(3) サッカロマイセス・セレビシエで機能
するＡＲＳ配列を含むｐＧＰＤＡＰＨ１プラスミドの８
種類を用いた。(3) のプラスミドは、(2) のライブラリ
ーでサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ５００を形質
転換して得られた酵母コロニーから単離したプラスミド
である。これらのプラスミドあるいはライブラリーＤＮ
Ａを用いて抵抗値、電圧をさまざまに組み合わせた電気
パルス法、あるいは酢酸リチウム法によりキャンディダ
・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。
しかしなから、Ｇ４１８耐性を示すコロニーは得られな
かった。
【０１６０】次に、実施例９記載のプラスミドｐＣＬＢ
Ｓ１０（図１５）のＥｃｏＲＩサイトとＸｂａＩサイト
に、実施例５で示したプラスミドｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ
３、ｐＣＲＸ１、およびｐＣＲＸ２（図６）からそれぞ
れＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩにより切り出される４種類
のｒＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＣＬＲＥ２、
ｐＣＬＲＥ３、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２を構
築した（図１６）。
【０１６１】これらシクロヘキシミド耐性遺伝子を選択
マーカーとするプラスミド４種類、およびプラスミドｐ
ＣＬＢＳ１０のＢａｍＨＩ部位に、キャンディダ・ユテ
ィリスＡＴＣＣ９９５０株の染色体ＤＮＡのＳａｕ３Ａ
Ｉ部分消化ＤＮＡ断片（５−１０ｋｂ）を挿入して作製
したライブラリーＤＮＡを用いて、抵抗値、電圧をさま
ざまに組み合わせた電気パルス法、あるいは酢酸リチウ
ム法により、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５
０株の形質転換を試みた。しかしながら、これらのプラ
スミドを閉環状のまま用いた場合は形質転換体は得られ
なかった。この形質転換実験において、弱いシクロヘキ
シミド耐性、またはＧ４１８耐性を示す偽耐性コロニー
の出現が観察された。この偽耐性コロニーとは、低濃度
のＧ４１８やシクロヘキシミドなど抗生物質を添加した
プレートで形質転換体を選択する場合にしばしば観察さ
れる、選択マーカーの薬剤耐性遺伝子の存在によらず自
発的に耐性を獲得するコロニーである。
【０１６２】この実験のなかで、シクロヘキシミドを形
質転換体の選択に用いる場合、ＹＰＤプレートのシクロ
ヘキシミド濃度を４０μｇ／ｍｌとすること、そしてプ
レートのインキュベーション温度を３０℃ではなく２８
℃とすることで、偽耐性コロニーの出現を抑えられるこ
とがわかった。そこで、プラスミドＤＮＡの染色体への
組み込みを促進するために、プラスミドｐＣＬＲＥ２、
ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２について、ＤＮＡの
ｒＲＮＡ遺伝子領域内の制限酵素サイトのそれぞれＢｇ
ｌII、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌIIでプラスミドを消化してか
ら、形質転換実験に用いた。その結果、ＢｇｌII消化し
たプラスミドｐＣＬＲＥ２およびｐＣＬＲＸ２につい
て、電気容量を２５μＦとし、抵抗値を６００オーム、
電圧を５ＫＶ／ｃｍとすることにより、シクロヘキシミ
ド耐性株を得ることができた。これらの耐性株は、プラ
スミドＤＮＡを添加しないコントロール実験でまれに得
られる微小な偽耐性株に比べて明らかにサイズが大き
く、また実施例１２に示すサザン解析により形質転換体
であることが明らかにされた。
【０１６３】次に形質転換の最適条件を見いだすため
に、ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＥ２を用い
て、電気容量を２５μＦに固定し、抵抗値、電圧をさま
ざまに組み合わせて電気パルスの最適条件を検討した。
結果は図１７に示される通りであった。図には、パルス
後の生菌率と、得られたシクロヘキシミド耐性株数とが
示されている。
【０１６４】この結果から、電気容量が２５μＦで抵抗
値が６００、８００、または１０００オーム、電圧が
３．７５、または５ＫＶ／ｃｍの条件で、１μｇＤＮＡ
あたり約５００−１４００個という高い頻度で形質転換
体が得られることが分かった。これらの条件下でのパル
ス後の生菌率は約１０−４０％であった。また、抵抗値
が２００、または４００オームでも生菌率が４０％以下
になる条件はあるが、高い形質転換頻度は得られなかっ
た。抵抗値が２００、または４００オームではタイムコ
ンスタント （電圧が最大値の約３７％にまで減衰する
までの時間）が１０ミリ秒以下であり、６００、８０
０、または１０００オームで、パルス後の生菌率が約１
０−４０％となる条件では、タイムコンスタントが約１
０から２０ミリ秒であった。以上のことから、パルス後
の生菌率が約１０−４０％となり、かつタイムコンスタ
ントが１０ミリ秒以上である電気パルスを菌に与えるこ
とが高い形質転換頻度を得るために重要であることが示
唆された。
【０１６５】また、電気パルスを加えた後、菌液に１Ｍ
ソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え、３０℃で振盪培
養することが好ましく、培養せずに菌を直接シクロヘキ
シミドを含む選択プレートに塗布するとコロニーが得ら
れなかった。
【０１６６】また、生菌数と形質転換体数の変化を経時
的に調べてそれらの増加率を比較することにより、最適
培養時間を決定した。
【０１６７】その結果、培養時間が６時間までは形質転
換体の増加が生菌数の増加率を上回るが、それ以後は生
菌数と形質転換体数が同じ割合で増加することが明らか
にされ、培養時間は６時間が最適であることが示され
た。
【０１６８】キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５
０株の電気パルスによる標準的な形質転換法は実施例１
１に示される通りである。
【０１６９】実施例１１：電気パルスによるキャンディ
ダ・ユティリス株の形質転換法 ＹＰＤプレート上のコロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培
地で、３０℃、約８時間振盪培養した後、２００ｍｌの
ＹＰＤ液体培地にＯＤ600 ＝0.0024になるよう植菌して
３０℃振盪培養する。約１６時間後、対数増殖期（ＯＤ
600 ＝２．５）にまで菌体が増殖した後、1400 x gで５
分間の遠心分離により集菌する。菌体は１００ｍｌの氷
冷した滅菌水で１回、続いて４０ｍｌの氷冷した滅菌水
で１回洗浄した後、氷冷した１Ｍソルビトール４０ｍｌ
で１回洗浄する。菌体を１０ｍｌの１Ｍソルビトールに
懸濁した後、滅菌ポリプロピレンチューブに移し、再度
1100 x gで５分間の遠心分離により集菌する。上清を除
いた後、最終菌体液量が２．５ｍｌになるよう氷冷した
１Ｍソルビトールに懸濁する。
【０１７０】電気パルスによる形質転換実験はバイオラ
ッド社のジーンパルサーを用いて行なう。５０μｌの菌
液と５μｌのＤＮＡ試料とを混合した後、０．２ｃｍの
ディスポーザブルキュベットに入れ、適当な条件の電気
パルスを加える。パルス後、１ｍｌの氷冷した１Ｍソル
ビトールを含むＹＰＤ培地を加え、滅菌ポリプロピレン
チューブに移した後、３０℃で約６時間振盪培養する。
培養後、菌液を４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含
むＹＰＤ選択培地に塗布した後、プレートを２８℃で３
−４日保温して、形質転換体コロニーを得る。
【０１７１】実施例１２：サザン解析による形質転換体
におけるプラスミドの検出 実施例１０で得られたシクロヘキシミド耐性株のうち７
個についてサザン解析を行い、これらのクローンがプラ
スミドＤＮＡを保持するかどうかを調べた。染色体ＤＮ
Ａの調製は、Methods in Yeast Genetics - A laborato
ry Course Manual - Rose M.D et al. P131-132 Cold S
pring Harbor Laboratory Press NYに記載の方法に従っ
た。調製したＤＮＡはＥｃｏＲＶあるいはＳａｌＩによ
り消化し、32Ｐ標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂ
のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブ
としてハイブリダイゼーションを行った（図１８）。
【０１７２】この結果、ＥｃｏＲＶ消化により、内在性
のＬ４１遺伝子に由来する５ｋｂのバンドのほかに、２
０ｋｂ以上のバンドが検出された。ＥｃｏＲＶはｒＲＮ
Ａ遺伝子座を切断するが、プラスミドｐＣＬＲＥ２はＥ
ｃｏＲＶで切断されないことから、プラスミドが染色体
に組み込まれたことにより、この２０ｋｂ以上のバンド
が検出されたものと考えられた。また、キャンディダ・
ユティリス１細胞あたりのＬ４１遺伝子のコピー数が２
であることは実施例１５のサザン解析により示されてい
るので、デンシトメーターによるスキャニングの結果か
ら組み込まれたプラスミドＤＮＡのコピー数は、およ
そ、６コピー（レーン７）から１５コピー（レーン２）
であることが示された。
【０１７３】一方、ＳａｌＩはプラスミドｐＣＬＲＥ２
を１箇所消化するが、染色体ＤＮＡをＳａｌＩ消化した
場合、内在性のＬ４１遺伝子に由来する７．５ｋｂのバ
ンドのほかにプラスミドｐＣＬＲＥ２の長さに相当する
８．５ｋｂのバンドが検出された。これは、プラスミド
が染色体に複数個タンデムに組み込まれたことにより、
ＳａｌＩ消化によってとなりあうプラスミドから生じた
ものであると考えられた。
【０１７４】このほか１０個以上のシクロヘキシミド耐
性株についてサザン解析を行なったところ、すべてのク
ローンでプラスミドＤＮＡの存在が確認され、実施例１
０の形質転換実験で得られたシクロヘキシミド耐性株が
形質転換体であることが証明された。
【０１７５】実施例１３：その他のキャンディダ・ユテ
ィリス株の形質転換 キャンディダ・ユティリスは株によってその染色体泳動
パターンが異なり、染色体の長さの多型性を示すことが
報告されている(Stoltenburg et. al. Curr. Genet. 22
441-446(1992)) 。よって、株による遺伝的性質や、そ
れによる形質転換頻度の違いも予想されることから、Ａ
ＴＣＣ９９５０株以外にも、ＡＴＣＣ９２２６株、ＡＴ
ＣＣ９２５６株について実施例１１に示した電気パルス
法による形質転換を試みた。
【０１７６】パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値
を１０００オームとし、電圧を２．５−６．２５ＫＶ／
ｃｍとして行った。プラスミドＤＮＡはＢｇｌII消化し
たｐＣＬＲＥ２を２μｇ用いた。
【０１７７】その結果は表１に示される通りであった。
株によって頻度の差は認められたもののいずれの株でも
シクロヘキシミド耐性コロニーが得られた。
【０１７８】 表１：プラスミドｐＣＬＲＥ２による形質転換 電圧条件 ＤＮＡ２μｇ当たりの形質転換体数 （ＫＶ／ｃｍ） ＡＴＣＣ９２２６ ＡＴＣＣ９２５６ ２．５０ ２２ ０ ３．７５ １４５ ８ ５．００ １２８ １８ ６．２５ ９４ ７ そこで、得られたＡＴＣＣ９２２６株、ならびにＡＴＣ
Ｃ９２５６株由来のシクロヘキシミド耐性株それぞれ４
株づつ計８株、および対照としてＡＴＣＣ９９５０株由
来のシクロヘキシミド耐性株２株について、染色体ＤＮ
Ａを調製してＢｇｌII消化した後、32Ｐ標識したＬ４１
遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断
片（図１２）をプローブとして、サザン解析を行った。
【０１７９】結果は図１９に示される通りであった。い
ずれの株においても染色体上のＬ４１遺伝子に由来する
５．４ｋｂのバンドの他に、プラスミドＤＮＡ由来のバ
ンドが認められた。これより、これら耐性株がプラスミ
ドＤＮＡを保持する形質転換体であることが示された。
【０１８０】また、ＡＴＣＣ９２２６株とＡＴＣＣ９２
５６株由来の形質転換体については、クローンによって
プラスミドＤＮＡサイズと同じ８．４ｋｂのバンド以外
に高分子側にバンドが認められた（レーン２−４、およ
び７）。これは、プラスミド上のｒＤＮＡ配列が組み込
みターゲットである染色体上のｒＤＮＡ配列と異なる場
合、染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡ分子末端の
ＢｇｌII部位が欠失することがあることを示している。
【０１８１】キャンディダ・ユティリス１細胞あたりの
Ｌ４１遺伝子のコピー数が２であることは実施例１５の
サザン解析により示されているので、５．４ｋｂのバン
ドが２コピーのＬ４１遺伝子に対応するものとして、バ
ンドの強さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー
数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザー
ＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いて測定した。
【０１８２】その結果、プラスミドｐＣＬＲＥ２のコピ
ー数は、ＡＴＣＣ９２５６株では７コピー（レーン１）
から２５コピー（レーン３）であり、ＡＴＣＣ９２２６
株では３コピー（レーン５）から１１コピー（レーン
６）であった。一方、ＡＴＣＣ９９５０株ではそれぞれ
１１コピー（レーン９、および１０）と計算された。
【０１８３】以上の結果は、ＡＴＣＣ９９５０株以外の
ＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２５６株につい
ても、シクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子を用いて形質
転換体が取得可能であることを示し、プラスミドは複数
個同時に染色体に組み込まれたことが示された。
【０１８４】実施例１４：酢酸リチウム法、およびその
変法によるキャンディダ・ユティリスの形質転換 酢酸リチウム法（Ito et al. J. Bacteriol. 153, 163-
168 (1983)）はその簡便さから広くサッカロミセス属酵
母の形質転換に用いられている。そこで、ＢｇｌII消化
により直鎖状にしたプラスミドｐＣＬＲＥ２を用いて、
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を酢酸リ
チウム法、およびエタノールまたはＤＭＳＯを添加する
酢酸リチウム法変法(Soni et. al. Current Genet.1993
24, 455-459) に従って形質転換することを試みた。酢
酸リチウム法変法ではエタノールはヒートショック開始
１０分後に終濃度１０％になるように菌液に添加し、さ
らに１０分間保温した。また、ＤＭＳＯはポリエチレン
グリコール液と同時に終濃度１０％になるように菌液に
添加した。処理した菌体はＹＰＤ溶液に懸濁して、３０
℃４時間の振盪培養を行なってからシクロヘキシミドを
含む選択プレートに塗布し、２８℃で６日間保温した。
【０１８５】その結果、エタノールＤＮＡを添加するリ
チウム法変法によりプラスミドＤＮＡ ２μｇＤＮＡに
ついてシクロヘキシミド耐性株が５個得られた。このう
ち２つのクローンについて染色体ＤＮＡを調製して実施
例１３記載の方法でサザン解析を行ったところ、プラス
ミド由来のバンドが検出され、これらが形質転換体であ
ることが示された。この結果から、形質転換頻度は電気
パルス法に比較してかなり低いが、酢酸リチウムによっ
て処理されたキャンディダユティリスもＤＮＡを取り込
むことが可能であることが示された。
【０１８６】本実験ではSoniらの報告にしたがって実験
を行なったが、さらに処理条件を検討することにより形
質転換頻度を高めることも可能である。
【０１８７】実施例１５：異なるｒＲＮＡ遺伝子領域を
ターゲットとした形質転換 １）プラスミドの構築 実施例９に記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１２（図１５）
のＥｃｏＲＩサイトに、ｐＣＲＥ２（図６）から得られ
る３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入することによりｐ
ＣＬＲＥ４を、ｐＣＲＥ３（図６）から得られる２．４
ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入することによりｐＣＬＲＥ
５をそれぞれ構築した。
【０１８８】また、７．５ｋｂのｒＤＮＡを含むＥｃｏ
ＲＩ断片がクローン化されたｐＣＲＥ１（図６）から切
り出される３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片と、４．
５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片とを、pBluescript
SK- のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ間に連結した後、それぞれ
のプラスミドのＸｂａＩサイトをＥｃｏＲＩリンカー
(5'CCAAGCTTGG3')の挿入によりＥｃｏＲＩサイトに変換
して、プラスミドｐＣＲＥ６とｐＣＲＥ７とを構築し
た。これらのプラスミドｐＣＲＥ６とｐＣＲＥ７とから
それそれ切り出した３ｋｂと４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断
片をプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＥｃｏＲＩサイトに挿
入することにより、プラスミドｐＣＬＲＥ６とｐＣＬＲ
Ｅ７を構築した。
【０１８９】構築したプラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬ
ＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７の構造は図
２０に示される通りである。
【０１９０】２）形質転換 作製したプラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣ
ＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７は制限酵素で消化して直
鎖状ＤＮＡとした後、各１μｇのＤＮＡを用いて実施例
１１に示した電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株を
形質転換した。パルス条件は、電気容量を２５μＦ、電
圧を５ＫＶ／ｃｍ、抵抗値を８００オームとし、パルス
後の培養時間は１８時間とした。プラスミドの消化に用
いた制限酵素はｒＲＮＡ遺伝子断片内にその切断サイト
がある酵素で、ｐＣＬＲＥ４はＢｇｌII、ｐＣＬＲＥ５
はＢａｍＨＩまたはＸｂａＩ、ｐＣＬＲＥ６はＢａｍＨ
Ｉ、そしてｐＣＬＲＥ７はＡｐａＩ、またはＥｃｏＲＶ
でそれぞれ消化した。プラスミドｐＣＬＲＥ４について
はＬ４１遺伝子内のＣｌａＩサイトにおいても消化し
て、組み込みのターゲット遺伝子の違いによる形質転換
頻度の差を比較した。実験は２回行った。その結果は、
表２に示される通りであった。
【０１９１】 表２： プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐ ＣＬＲＥ７による形質転換 プラスミド ＤＮＡ１μｇあたりの形質転換体数 １回目 ２回目 ｐＣＬＲＥ４（ＢｇｌII） ７８６ ５９３ ｐＣＬＲＥ４（ＣｌａＩ） ８７ １１ ｐＣＬＲＥ５（ＢａｍＨＩ） ０ ０ ｐＣＬＲＥ５（ＸｂａＩ） １ １８ ｐＣＬＲＥ６（ＢａｍＨＩ） ３０１ ７７５ ｐＣＬＲＥ７（ＡｐａＩ） ４０９ ７５４ ｐＣＬＲＥ７（ＥｃｏＲＶ） ５７７ ６４０ プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬ
ＲＥ７のｒＲＮＡ遺伝子断片内で消化した場合はいずれ
も１μｇＤＮＡあたり数百個と、高い形質転換頻度を示
した。一方、プラスミドｐＣＬＲＥ５は、ＢａｍＨＩ、
またはＸｂａＩどちらで消化した場合も、他のプラスミ
ドを用いた場合に比較して形質転換頻度は非常に低かっ
た。この結果は、ｒＲＮＡ遺伝子領域でも形質転換のタ
ーゲットとして用いる断片により、形質転換頻度が大き
く異なることを示している。
【０１９２】また、プラスミドｐＣＬＲＥ４について、
Ｌ４１遺伝子内のＣｌａＩサイトで消化した場合、その
形質転換頻度はｒＲＮＡ遺伝子内のＢｇｌIIサイトで消
化した場合に比較して、約１０分の１から５０分の１程
度であった。また、以下に記載したサザン解析により、
プラスミド分子はＣｌａＩサイトで消化した場合にはＬ
４１遺伝子座に、ＢｇｌIIサイトで消化した場合にはｒ
ＲＮＡ遺伝子座に、それぞれ組み込まれたことが示され
た。
【０１９３】以上より、染色体でのコピー数が多いｒＲ
ＮＡ遺伝子をターゲット配列として用いることによっ
て、高い形質転換頻度が得られることが明らかとなっ
た。
【０１９４】３）サザン解析 ＢｇｌIIまたはＣｌａＩ消化したｐＣＬＲＥ４、Ｘｂａ
Ｉ消化したｐＣＬＲＥ５、ＢａｍＨＩ消化したｐＣＬＲ
Ｅ６、そしてＡｐａＩ消化したｐＣＬＲＥ７を用いて得
られたシクロヘキシミド耐性株それぞれ４株ずつについ
て、染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡはＢｇｌ
II、またはＢｇｌIIおよびＮｏｔＩにより消化し、32Ｐ
標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−
ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブとして、サザン
解析を行った（図２１）。
【０１９５】プラスミドｐＣＬＲＥ４が組み込まれた株
では、ＢｇｌII消化によって、内在性のＬ４１遺伝子に
由来する５．４ｋｂのバンドのほかに、プラスミドＤＮ
Ａ分子内ＢｇｌIIサイトでの切断によりプラスミドＤＮ
Ａと同じサイズの８．４ｋｂのバンドが認められた（図
２１ （１）、レーン１−８）。また、ＣｌａＩ消化し
たプラスミドが組み込まれた株の場合は、これら２つの
バンドの他に、７．４ｋｂと６．４ｋｂのバンドが認め
られた（レーン１−４）。これら２つのバンドは、染色
体上のＬ４１遺伝子のうち１個がプラスミドの挿入によ
り分断されたことにより、組み込まれたプラスミド分子
の両末端に位置するプラスミド分子内のＢｇｌIIサイト
とＬ４１遺伝子領域内のＢｇｌIIサイトとから生ずるも
のであることから、プラスミド分子が相同組換えにより
Ｌ４１遺伝子座に組み込まれたことが示された。このこ
とから、プラスミド分子は、ＣｌａＩサイトで切断され
た場合にはＬ４１遺伝子座に、ＢｇｌIIサイトで切断さ
れた場合にはｒＲＮＡ遺伝子座に、それぞれ組み込まれ
たことが示された。これにより、切断サイトを変更する
ことでプラスミドの組み込み場所をコントロールするこ
とが可能であることが示された。また、レーン１−４で
は５．４ｋｂ、７．４ｋｂ、および６．４ｋｂのバンド
の濃さがほぼ同じであったことから、染色体にはＬ４１
遺伝子が２コピー存在することが明らかにされた。
【０１９６】プラスミドｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、
およびｐＣＬＲＥ７が組み込まれた株では、ＢｇｌII＋
ＮｏｔＩ消化により、内在性のＬ４１遺伝子に由来する
５．４ｋｂのバンドのほかに、染色体に組み込まれたプ
ラスミド由来のいくつかのバンドが認められた（図２１
（２））。このうちサイズが各プラスミドと同一である
バンド、すなわちｐＣＬＲＥ５では７．３ｋｂ（レーン
１−４）、ｐＣＬＲＥ６では８．０ｋｂ（レーン５−
８）、そしてｐＣＬＲＥ７では９．４ｋｂのバンド（レ
ーン９−１２）は、プラスミドが染色体にタンデムに組
み込まれることにより、プラスミド内に１箇所サイトが
あるＮｏｔＩ消化によって隣り合うプラスミドから生じ
たバンドである。また、それ以外にもｐＣＬＲＥ５では
７ｋｂ（レーン１−４）、ｐＣＬＲＥ６では６．９ｋｂ
（レーン５−８）、そしてｐＣＬＲＥ７では１１ｋｂ
（レーン９−１２）のバンドが認められた。これらのサ
イズはプラスミドＤＮＡがｒＲＮＡ遺伝子座に相同組換
えにより組み込まれた場合にＢｇｌII＋ＮｏｔＩ消化に
よりｒＲＮＡ遺伝子座内のＢｇｌIIサイトとプラスミド
ＤＮＡ内のＮｏｔＩサイトとから得られる断片の長さに
一致する。これより、プラスミドＤＮＡが切断された部
位で相同組換えにより染色体に組み込まれたことが示さ
れた。
【０１９７】図２１（１）のレーン１−４の５．４ｋｂ
のバンドが１コピーのＬ４１遺伝子、レーン５−８およ
び図２１ （２）のレーン１−１２の５．４ｋｂバンド
が２コピーのＬ４１遺伝子に対応するものとして、各バ
ンドの濃さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー
数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザー
ＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いて測定した。
【０１９８】その結果、プラスミドｐＣＬＲＥ４は、Ｌ
４１遺伝子座には３コピー（レーン４）から５コピー
（レーン１、および３）、ｒＲＮＡ遺伝子座には２コピ
ー（レーン８）から８コピー（レーン５）挿入されたこ
とが示された。この結果から、プラスミドＤＮＡがｒＲ
ＮＡ遺伝子座に組み込まれた場合、組み込まれたプラス
ミド分子のコピー数が高い株が選択される傾向が認めら
れた。これは、実施例１２においてプラスミドｐＣＬＲ
Ｅ２がｒＲＮＡ遺伝子座に組み込まれた株ではプラスミ
ドＤＮＡのコピー数がおよそ６コピーから１５コピーで
あるが、実施例１６のＵＲＡ３遺伝子座へ組み込まれた
プラスミドＤＮＡの場合はコピー数がおよそ３コピーか
ら４コピーであったことからも示唆される。
【０１９９】また、プラスミドｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲ
Ｅ６、およびｐＣＬＲＥ７についてはそれぞれ３コピー
（図２１ （２）、レーン４）から５コピー（レーン
２）、３コピー（レーン８）から６コピー（レーン５、
および６）、３コピー（レーン１２）から５コピー（レ
ーン９）組み込まれたことが示された。
【０２００】実施例１６：ＵＲＡ３遺伝子座へのプラス
ミドの組み込み プラスミドｐＣＬＢＳ１２（図１５）のＥｃｏＲＩサイ
トに、ＵＲＡ３遺伝子を含む５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
（図７）を挿入して、プラスミドｐＣＬＵＲＡ１を構築
した。このプラスミドをＵＲＡ３遺伝子座内のＰｓｔＩ
サイトで切断し、このプラスミドを用いて実施例１１記
載の電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株の形質転換
を試みた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を
８００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。これ
により１μｇＤＮＡあたりシクロヘキシミド耐性コロニ
ーが４０個得られた。
【０２０１】得られたシクロヘキシミド耐性株４株につ
いて染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡはＢｇｌ
II、またはＳａｌＩ＋ＮｏｔＩにより消化し、サザン解
析に供した。ＢｇｌII消化したＤＮＡについてはＬ４１
遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断
片（図１２）を、ＳａｌＩ＋ＮｏｔＩ消化したＤＮＡに
ついてはＵＲＡ３遺伝子を含む２．３ｋｂのＨｉｎｄII
I −ＥｃｏＲＩ断片（図８）を、それぞれ32Ｐ標識して
プローブとした。
【０２０２】その結果は、図２２に示される通りであっ
た。
【０２０３】ＳａｌＩ＋ＮｏｔＩ消化したＤＮＡについ
てＵＲＡ３遺伝子をプローブとした場合、親株のＡＴＣ
Ｃ９９５０株では内在性ＵＲＡ３遺伝子由来の１３Ｋｂ
のバンドが認められた（図２２（１）、レーン１）。一
方、耐性株ではこの１３ｋｂのバンドのほかに、タンデ
ムに複数個組み込まれたプラスミドからＮｏｔＩ消化に
より生じる１０ｋｂのバンドと、染色体上のＵＲＡ３遺
伝子のうち１個がプラスミドの挿入により分断されて生
じる８．４ｋｂと１４ｋｂの２本のバンドが検出された
（レーン２−５）。これら２本のバンドは、組み込まれ
たプラスミド分子の両末端に位置するプラスミド分子内
のＮｏｔＩサイトとＵＲＡ３遺伝子領域内のＳａｌＩサ
イトとから生ずるものであることから、プラスミド分子
が相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子座に組み込まれたこ
とが示された。
【０２０４】また、形質転換体では内在性ＵＲＡ３遺伝
子由来の１３ｋｂのバンドと染色体に組み込まれたプラ
スミド分子の両末端のプラスミド由来の８．４ｋｂと１
４ｋｂのバンドの濃さがほぼ一致することから、ＵＲＡ
３遺伝子もＬ４１遺伝子同様、細胞あたり２コピー存在
し、形質転換体ではそのうち１コピーがプラスミドＤＮ
Ａの挿入により分断されたことが示された。また、これ
らの４本のバンド（１４ｋｂ、１３ｋｂ、１０ｋｂ、お
よび８．４ｋｂ）の濃さの比較から、組み込まれたプラ
スミドのコピー数は３コピー（レーン３、および５）か
ら４コピー（レーン２、および４）であることが示され
た。
【０２０５】また、ＢｇｌII消化したＤＮＡについてＬ
４１遺伝子をプローブとした場合、親株のＡＴＣＣ９９
５０株では内在性のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂ
のバンドが認められたが（図２２（２）、レーン１）、
耐性株ではこのバンドのほかにプラスミドＤＮＡと同じ
サイズの１０ｋｂのバンドが認められた（レーン２−
５）。
【０２０６】実施例１７：キャンディダ・ユティリスで
の異種遺伝子（グルコアミラーゼ遺伝子）の発現 （１）グルコアミラーゼ遺伝子（ＳＴＡ１遺伝子）発現
用プラスミドの構築 ＳＴＡ１遺伝子発現用プラスミドを図２３に示されるよ
うに構築した。
【０２０７】まず、ＳＴＡ１遺伝子をサッカロマイセス
・ディアスタティカス５１０６−９Ａ（ａ ｌｅｕ２，
ａｒｇ４，ＳＴＡ１）(Yamashita and Fukui Agric.Bio
l.Chem. 47，2689-2692)の染色体ＤＮＡライブラリーよ
りクローニングした。これは、以下に示した操作により
行った。
【０２０８】５１０６−９Ａ菌体から染色体ＤＮＡを調
製してＳａｕ３ＡＩにより部分消化した後、アガロース
ゲル電気泳動により約２０−３０ｋｂのＤＮＡ断片を調
製した。このＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩ消化した後脱リ
ン酸化したλファージベクターＥＭＢＬ３（Stratagene
Cloning Systems）とを、Ｔ４リガーゼにより連結し
た。それを、GigapackII Gold Packaging Extract （St
ratageneCloning Systems ）を用いて、インビトロパッ
ケージングし、染色体ＤＮＡの遺伝子ＤＮＡライブラリ
ーを構築した。
【０２０９】発表済みのＳＴＡ１遺伝子の塩基配列(Yam
ashita et. al. J Bacteriol. 161,567-573 1985)に基
づいて合成した２種類のオリゴヌクレオチド5'ACCACTAT
TACCACTACGGTTTGCTCTACA3'（配列番号：１９)、および5'
GACACATCTCTGAGCAGCATGACTTGGTTG3'（配列番号２０）を
Ｔ４キナーゼにより32Ｐ末端標識したものをプローブと
して用いて、この染色体ＤＮＡライブラリー約20,000プ
ラークをスクリーニングした。この結果、２種のプロー
ブどちらにもポジティブシグナルを与えるクローン１個
を得た。
【０２１０】このＳＴＡ１遺伝子を含むファージクロー
ンより、ＳＴＡ１遺伝子を含む４ｋｂのＢｇｌII−Ｈｐ
ａＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩとＨｉｎｃII間にク
ローン化して、プラスミドｐＵＳＴＡ１（図２３）を構
築した。
【０２１１】続いて、ｐＵＳＴＡ１をＳＴＡ１遺伝子の
開始コドンATG の５bp下流に存在するＳｔｕＩサイトで
切断した後、ＸｂａＩサイトおよび開始コドンを含む合
成アダプター（配列番号：２１）：5'-CTAGATGGTAGG-3'
3'-TACCATCC-5' を付加した。その後、さらにＳａｌ
Ｉで部分消化することにより、ＳＴＡ１遺伝子を２．７
ｋｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片として得た。
【０２１２】次に、ｐＵＣ１２をＰｓｔＩとＨｉｎｄII
I で消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｂ
ｇｌIIリンカーを付加して構築したプラスミドｐＵＣ１
２ＢｇｌIIの、ＸｂａＩとＳａｌＩと間にＳＴＡ１遺伝
子を含む２．７ｋｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片を挿入し
て、プラスミドｐＵＳＴＡ２を構築した。
【０２１３】このｐＵＳＴＡ２から２．７ｋｂのＸｂａ
Ｉ−ＢｇｌII断片を切り出し、これを、発現ベクターｐ
ＰＧＫＰＴ４のＸｂａＩとＢａｍＨＩサイト間に挿入し
て、プラスミドｐＧＫＳＴＡ１を構築した。
【０２１４】さらにｐＧＫＳＴＡ１からＰＧＫ遺伝子プ
ロモーターと、ＳＴＡ１遺伝子と、さらにＰＧＫ遺伝子
ターミネーターとを含む４．９ｋｂのＮｏｔＩ断片を切
り出し、この断片を、プラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏ
ｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＳＴＡ１を、プ
ラスミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラ
スミドｐＣＬＲＳＴＡ１を、それぞれ構築した。
【０２１５】（２）キャンディダ・ユティリスの形質転
換とグルコアミラーゼ発現 ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＳＴＡ１を用い
て、ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、および
ＡＴＣＣ９２５６株の形質転換を、実施例１１記載の電
気パルス法で行った。パルス条件は電気容量を２５μ
Ｆ、抵抗値を１０００オーム、電圧を３．７５ＫＶ／ｃ
ｍ、または６．２５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２１６】株によって頻度の差は認められたもののい
ずれの株でもシクロヘキシミド耐性コロニーが得られ
た。
【０２１７】このうちそれぞれ２株ずつについて基質で
あるスターチが入ったプレート（３％ Soluble starch
(Katayama)、２％ polypeptone 、１％ Yeast extrac
t、３．３×１０-3％ Bromocresol purple、２％ Bac
to agar）上でグルコアミラーゼ活性を調べた。その結
果、３種の株由来の形質転換体すべてについて分泌され
たグルコアミラーゼによるハローが観察され、遺伝子の
発現が確認された。また、ＡｆｌII消化したプラスミド
ｐＣＬＳＴＡ１を用いてＡＴＣＣ９９５０株を形質転換
した。この形質転換体について、Ｌ４１遺伝子座に組み
込まれたグルコアミラーゼ遺伝子の発現も調べたとこ
ろ、同様にハローの形成が確認された。
【０２１８】さらにこれら形質転換体のグルコアミラー
ゼ活性を測定した。このため、菌体をＹＰＤ液体培地で
一晩培養して、その上清を粗酵素液とした。反応は、４
００μｌの粗酵素液と、０．５％の可溶性でんぷん、１
００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む５００μ
ｌの反応液で、５０℃、２０分間行った。反応後１００
℃、５分間の熱処理で酵素を失活した後、遊離したグル
コース濃度を市販のキット（グルコースB-テスト（和光
純薬））を用いて測定した。
【０２１９】グルコアミラーゼ活性は当反応条件下で遊
離するグルコースの量が１００μｇである時、その活性
を１ユニットとし表した。培養上清１ｍｌあたりの活性
値は表３に示される通りであった。
【０２２０】 表３：プラスミドｐＣＬＳＴＡ１およびｐＣＬＲＳＴＡ１によって形質転換さ れたキャンディダ・ユティリス酵母のグルコアミラーゼ活性 グルコアミラーゼ活性（units/ml） プラスミド ATCC9256 ATCC9266 ATCC9950 ｐＣＬＲＳＴＡ１（ＢｇｌII） １１．３ ７．９ ８．３ ｐＣＬＲＳＴＡ１（ＢｇｌII） １０．５ ６．６ ８．５ ｐＣＬＳＴＡ１（ＡｆｌII） − − ７．６ ｐＣＬＳＴＡ１（ＡｆｌII） − − ８．８ −ＤＮＡ ０．０ ０．０ ０．０ 活性はそれぞれ独立した形質転換体２株について測定し
た。 −：測定せず この結果から、調べたキャンディダユティリスＡＴＣＣ
９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２
５６株において、サッカロマイセス・ディアスタティカ
ス由来の異種蛋白質であるグルコアミラーゼの分泌シグ
ナル配列が認識され、グルコアミラーゼが培地中に分泌
されることが明らかにされた。
【０２２１】さらに、ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣ
ＬＳＴＡ１、またはＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬ
ＳＴＡ１で形質転換したＡＴＣＣ９９５０株をそれぞれ
２株ずつ４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドと５％グル
コースを含むＹＰＤ液体培地で３０℃４日間培養した。
その後、それらの菌体培養液１０μｌを４−２０％ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、培養液中の
蛋白質を分析した（図２４）。ゲルはクマシーブリリア
ントブルーにより染色した。また、対照としてＢｇｌII
消化したプラスミドｐＣＬＲＥ２で形質転換した株の培
養液を分析した（レーン１）。その結果、いずれの培養
液においてもグルコアミラーゼに相当する約１００ｋＤ
ａの蛋白質が認められ、蛋白量は、染色されたバンドの
濃さから約２〜５μｇに相当すると判断された。このこ
とから、グルコアミラーゼ遺伝子が高いレベルで発現
し、培養液中に分泌されたことが示された。以上の結果
から、分泌蛋白質生産用の好適な宿主／ベクター系とし
てキャンディダ・ユティリスが使用できることが明らか
となった。
【０２２２】実施例１８：キャンディダユティリスでの
異種遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）の発現 （１）ｌａｃＺ遺伝子発現用プラスミドの構築 ｌａｃＺ遺伝子発現用プラスミドを図２５に示されるよ
うに構築した。
【０２２３】まず、プラスミドｐＭＣ１８７１（Pharma
cia ）より、βガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ
遺伝子を３．１ｋｂのＢａｍＨＩ断片として切り出し
た。この断片を、プラスミドＹＥｐ１３Ｋ（ Sone et.
al. Appl. Environ. Microbiol. 54, 38-42 (1988)）の
ＢｇｌIIサイトに連結し、遺伝子の5'側にＨｉｎｄIII
サイトのあるプラスミドｐＺ４を選択した。
【０２２４】このプラスミドから開始コドンATG を有す
るｌａｃＺ遺伝子を、３．１ｋｂのＨｉｎｄIII −Ｘｈ
ｏI 断片として切り出した。この断片を、pBluescript
SK-のＨｉｎｄIII とＸｈｏＩサイト間に連結して、プ
ラスミドｐＬＡＣＺ１を構築した。
【０２２５】このプラスミドをＨｉｎｄIII ＋ＸｂａＩ
消化し、クレノウ処理した後、再環状化してプラスミド
ｐＬＡＣＺ２を構築した。
【０２２６】さらに、このプラスミドからｌａｃＺ遺伝
子を３．１ｋｂのＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片として切り出
し、これをプラスミドｐＰＧＫＰＴ５（図４）のＸｂａ
ＩとＫｐｎＩ間に連結して、プラスミドｐＧＫＬＡＣ１
を構築した。
【０２２７】さらにｐＧＫＬＡＣ１からＰＧＫ遺伝子プ
ロモーターと、ｌａｃＺ遺伝子と、さらにＰＧＫ遺伝子
ターミネーターとを含む５．４ｋｂのＮｏｔＩ断片を切
り出し、これをプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏｔＩサ
イトに挿入して、プラスミドｐＣＬＬＡＣ１を、またプ
ラスミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラ
スミドｐＣＬＲＬＡＣ１を、それぞれ構築した。
【０２２８】（２）キャンディダ・ユティリスの形質転
換とβガラクトシダーゼ活性確認 ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＬＡＣ１、または
ＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＬＡＣ１を用いて実
施例１１記載の電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株
を形質転換した。形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株，
それぞれ２株を、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で６時間、対
数増殖期（ＯＤ600 が約２から３）まで培養した。βガ
ラクトシダーゼ活性はMethods in Yeast Genetics - A
laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P155-15
9 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) に
記載の方法に従って測定した。すなわち、集菌した菌体
を１ｍｌのＺバッファーに懸濁した後、クロロホルム液
を３滴、０．１％ＳＤＳを２滴加えて、１０秒ボルテッ
クスした。２８℃で５分間インキュベートした後、０．
２ｍｌのＯＮＰＧ液を加え、さらに１０分間インキュベ
ートした。その後、０．５ｍｌのＮａ2 ＣＯ3 液を添加
して反応を停止した。ＯＤ420 を測定した後、計算式に
従ってβガラクトシダーゼ活性を求めた。βガラクトシ
ダーゼ活性は２８℃で１分あたり１ｎｍｏｌのオルトニ
トロフェノールを生成する活性を１ユニットとした。得
られた菌体１ＯＤ600 当たりの活性値は表４に示される
通りであった。
【０２２９】 表４：プラスミドｐＣＬＬＡＣ１およびｐＣＬＲＬＡＣ１によって形質転換さ れたＡＴＣＣ９９５０株のβ−ガラクトシダーゼ活性 β−ガラクトシダーゼ活性 プラスミド （units ／ＯＤ600 ） ｐＣＬＬＡＣ１（ＡｆｌII） ６．４ ｐＣＬＬＡＣ１（ＡｆｌII） ６．７ ｐＣＬＲＬＡＣ１（ＢｇｌII） ６．８ ｐＣＬＲＬＡＣ１（ＢｇｌII） ７．０ −ＤＮＡ ０．１ その結果、プラスミドｐＣＬＲＬＡＣ１およびプラスミ
ドｐＣＬＬＡＣ１のいずれで形質転換されたＡＴＣＣ９
９５０株もそれぞれ活性を示し、大腸菌由来のｌａｃＺ
遺伝子がキャンディダユティリスで発現して、活性のあ
るβガラクトシダーゼが生産されることが示された。キ
ャンディダ・マルトーサやアルビカンスなど一部のキャ
ンディダ属酵母では、ロイシンコドンのCUG がセリンに
翻訳されるため(Ohama et. al. Nucleic Acids Res. 21
4039 - 4045 1993)、大腸菌由来ｌａｃＺ遺伝子が、活
性をもつβガラクトシダーゼに翻訳されないことが知ら
れている（Sugiyama et.al. Yeast 11, 43-52 (199
5)）。本実施例では、キャンディダ・ユティリスで活性
のある大腸菌βガラクトシダーゼが生産されることが明
らかにされ、また実施例１７で示したようにグルコアミ
ラーゼが高生産されることからも、キャンディダ・ユテ
ィリスが異種遺伝子発現用の宿主として使用できること
が示されたと考える。
【０２３０】実施例１９：キャンディダ・ユティリスで
の異種遺伝子（ＡＰＴ遺伝子）の発現 （１）ＡＰＴ遺伝子発現用プラスミドの構築 ＡＰＴ遺伝子発現用プラスミドを図２６に示されるよう
に構築した。
【０２３１】まず、トランスポゾンＴｎ９０３由来のア
ミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ
遺伝子) を含むプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Pharmacia ）か
ら１．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ断片を切り出し、こ
れをｐＵＣ１９のＳａｌＩとＰｓｔＩ間に挿入して、プ
ラスミドｐＡＰＨ１を構築した。
【０２３２】続いてｐＡＰＨ１をＰｓｔＩ消化した後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、ＢｇｌII
リンカー(5'CAGATCTG3')を挿入して、プラスミドｐＡＰ
Ｈ２を構築した。
【０２３３】さらに、ｐＡＰＨ２よりＡＰＴ遺伝子を
１．１ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌII断片として切り出し、
これを発現ベクターｐＰＧＫＰＴ４（図４）のＸｂａＩ
とＢａｍＨＩサイト間に挿入して、プラスミドｐＧＫＡ
ＰＨ１を構築した。
【０２３４】さらにｐＧＫＡＰＨ１からＰＧＫ遺伝子プ
ロモーターと、ＡＰＴ遺伝子、そしてＰＧＫ遺伝子ター
ミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出
し、これをプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏｔＩサイト
に挿入して、プラスミドｐＣＬＡＰＨ１を、またプラス
ミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミ
ドｐＣＬＲＡＰＨ１を、それぞれ構築した。
【０２３５】（２）キャンディダ・ユティリスの形質転
換とＧ４１８耐性の確認 ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１を用い
て、ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、および
ＡＴＣＣ９２５６株の形質転換を試みた。形質転換は実
施例１１記載の電気パルス法で行った。パルス条件は電
気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を
３．７５ＫＶ／ｃｍ、または６．２５ＫＶ／ｃｍとして
行った。
【０２３６】その結果、株によって頻度の差は認められ
たもののいずれの株でもシクロヘキシミド耐性コロニー
が得られた。このうちそれぞれ２株ずつについて、異な
る濃度のＧ４１８を含むＹＰＤプレート上で菌の増殖を
調べた。その結果、３種のキャンディダ・ユティリス株
すべてについて形質転換体の増殖が確認され、これらの
形質転換体においてＡＰＴ遺伝子が発現したことが確認
された。
【０２３７】また、ＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬ
ＡＰＨ１を用いてＡＴＣＣ９９５０株を形質転換し、Ｌ
４１遺伝子座に組み込まれた遺伝子の発現についても調
べた。その結果、同様に形質転換体の増殖が確認され、
Ｌ４１遺伝子座に組み込まれたＡＰＴ遺伝子についても
その発現が確認された。
【０２３８】（３）組み込まれたプラスミドの安定性 ＢｇｌII消化されたプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１、また
はＡｆｌII消化されたプラスミドｐＣＬＡＰＨ１で形質
転換されたＡＴＣＣ９９５０株、それぞれ２株ずつにつ
いて、組み込まれたプラスミドＤＮＡの安定性を次のよ
うに調べた。まず、形質転換体を４０μｇ／ｍｌのシク
ロヘキシミドを含む５ｍｌのＹＰＤ液体培地で定常期ま
で培養し、このときの世代数を０とした。次に、このう
ち５μｌを５ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌して定常期ま
で培養し、このときの世代数を１０と計算した。この操
作を繰り返して２０世代まで菌を培養した。プラスミド
保持率は、菌液を希釈後、ＹＰＤプレートと４０μｇ／
mlのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートとにそれぞ
れ塗布して、３０℃で２日培養後、生じたコロニー数を
調べた。結果は表５に示される通りであった。
【０２３９】表５：ＡＴＣＣ９９５０染色体に組み込ま
れたプラスミドＤＮＡの安定性 プラスミド 保持率（％） ｐＣＬＲＡＰＨ１（ＢｇｌII） ９１．３ ｐＣＬＲＡＰＨ１（ＢｇｌII） ８７．８ ｐＣＬＡＰＨ１（ＡｆｌII） ９９．５ｐＣＬＡＰＨ１（ＡｆｌII） ９８．６ この結果から、ｒＲＮＡ遺伝子座、Ｌ４１遺伝子座に挿
入されたＤＮＡ断片は安定であることが確認された。
【０２４０】実施例２０：Ｇ４１８耐性を選択マーカー
としたキャンディダ・ユティリス形質転換体の取得 プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１は、形質転換体選択マーカ
ーとしてシクロヘキシミド耐性を付与する変異型Ｌ４１
遺伝子と、Ｇ４１８耐性を付与するＡＰＴ遺伝子を含ん
でいる。実施例１９に記載した実験によりＡＰＴ遺伝子
がＰＧＫ遺伝子プロモーターにより発現することが確認
されたので、形質転換体のＧ４１８耐性による直接選択
を試みた。
【０２４１】まず、プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１をＢｇ
ｌIIにより消化し、直鎖状にした。これを用いて、実施
例１１記載の電気パルス法によって、ＡＴＣＣ９９５０
株を形質転換した。パルス条件は電気容量を２５μＦ、
抵抗値を１０００オーム、または８００オーム、電圧を
５ＫＶ／ｃｍとして行った。菌体は１Ｍソルビトールを
含むＹＰＤ培地で６時間培養した後、４０μｇ／ｍｌの
シクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートと、１５０μｇ
／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートとにそれぞれ塗
布した。結果は表６に示される通りであった。
【０２４２】 表６：プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１によるＡＴＣＣ９９５０形質転換体の異な る薬剤耐性マーカーによる選択 Ｇ４１８ シクロヘキシミド プラスミド 1000Ω 800Ω 1000Ω 800Ω ｐＣＬＲＡＰＨ１（ＢｇｌII） １００ １１１ ７ １８ −ＤＮＡ ０ − ０ − ＊ＤＮＡ０．１μｇ当たりの形質転換体数 ＊Ｇ４１８およびシクロヘキシミドの濃度はそれぞれ１５０μｇ／ｍｌ および４０μｇ／ｍｌとした −：測定せず この結果より、Ｇ４１８耐性で選択されるコロニーの数
がシクロヘキシミド耐性コロニー数に比較して１０倍程
度多いことが分かる。
【０２４３】Ｇ４１８耐性で選択した４個のコロニー
と、シクロヘキシミド耐性で選択した４個のコロニーと
について、染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡは
ＢｇｌII＋ＮｏｔＩにより消化した後、32Ｐ標識したＬ
４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄII
I 断片（図１２）をプローブとして、サザン解析を行っ
た（図２７）。その結果、内在性Ｌ４１遺伝子に由来す
る５．４ｋｂのバンドのほかに、プラスミドに由来する
４．４ｋｂのバンドが認められた。イメージングアナラ
イザーＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いてバンドの
強度を測定し、プラスミド由来のバンドと内在性Ｌ４１
遺伝子（２コピー／細胞）のバンドの比較から、組み込
まれたプラスミドのコピー数を求めた。その結果、シク
ロヘキシミド耐性で選択された株ではプラスミドが４
（レーン２）から７コピー（レーン５）存在することが
示された。一方、Ｇ４１８耐性で選択した株では４株と
もコピー数が１ （レーン６−９）であると計算され
た。この結果より、変異型Ｌ４１遺伝子を選択マーカー
として形質転換体を選択することによって形質転換の頻
度は低くなるものの、プラスミドが複数個組み込まれた
株を容易に取得できることが示された。
【０２４４】また、ｐＧＫＡＰＨ１をＮｏｔＩ消化し
て、二つの断片に分けた。すなわち、ＰＧＫ遺伝子プロ
モーター、ＡＰＴ遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子ターミネ
ーターを含む断片と、ベクター断片とに分けた。その
後、これらをＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に用いた。
パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オ
ーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。２００μｇ／
ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで形質転換体を選
択したところ、１μｇＤＮＡあたり１５６個の形質転換
体が得られた。この結果は、キャンディダ．ユティリス
酵母においては、ＢｇｌII消化により直鎖状にしたプラ
スミドｐＣＬＲＡＰＨ１による遺伝子挿入型の形質転換
に加え、遺伝子置換型の形質転換も起きることを示す。
また、その形質転換頻度も比較的高く、遺伝子置換型の
形質転換も効率良く起きることが明らかにされた。
【０２４５】実施例２１：ＰＧＫ遺伝子プロモーターの
短縮化と最小機能領域の同定 実施例１７−２０で使用したＰＧＫ遺伝子プロモーター
を短縮化し、プロモーターの最小機能領域の同定を試み
た。
【０２４６】実施例１９記載のプラスミドｐＧＫＡＰＨ
１のＰＧＫ遺伝子プロモーター断片内部に存在する制限
酵素サイトを利用して、長さの異なるＰＧＫ遺伝子プロ
モーターとＡＰＴ遺伝子、さらにＰＧＫ遺伝子ターミネ
ーターとを含む断片を５種類取得した。すなわちｐＧＫ
ＡＰＨ１をＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ＋Ｓａｃ
Ｉ、またはＰｓｔＩ＋ＳａｃＩ消化して４種類の断片を
得た。また、ｐＧＫＡＰＨ１をＳｐｈＩ消化してからＴ
４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理によって平滑末
端とし、さらにＢａｍＨＩリンカー（5´CCGGATCCGG3
´：配列番号：２２）を付加した後、ＢａｍＨＩとＮｏ
ｔＩ消化することにより、さらに１種類の断片を得た。
【０２４７】また、実施例５記載のプラスミドｐＣＲＥ
２をＨｉｎｄIII 消化して得られる０．７ｋｂと５．８
ｋｂの断片のうち、５．８ｋｂの断片をライゲーション
により再環状化して、プラスミドｐＣＲＥ８を構築した
（図２８）。このプラスミドｐＣＲＥ８をＮｏｔＩ、Ｂ
ａｍＨＩ＋ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ＋Ｓａｃ
Ｉ、またはＰｓｔＩ＋ＳａｃＩ消化したのち、それぞれ
と上記の各種断片をライゲーションして、プラスミドｐ
ＣＲＡＰＨ２、ｐＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ４、ｐＣ
ＲＡＰＨ５、およびｐＣＲＡＰＨ６を構築した（図２
８）。それぞれのプラスミドに含まれるＰＧＫ遺伝子プ
ロモーター断片の長さは、ｐＣＲＡＰＨ２では１．３５
ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ３では０．８３ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ
４では０．４６ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ５では０．４０ｋ
ｂ、そしてｐＣＲＡＰＨ６では０．１６ｋｂであった。
【０２４８】構築したプラスミドｐＣＲＡＰＨ２、３、
４、５、および６をＢｇｌII消化により直鎖状にした
後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に使用した。形質転
換は実施例１１記載の電気パルス法で行った。パルス条
件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電
圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２４９】形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ
４１８を含むＹＰＤプレートで行った。その結果、プラ
スミドｐＣＲＡＰＨ２、ｐＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ
４、およびｐＣＲＡＰＨ５を用いた場合、それぞれ１μ
ｇＤＮＡあたり３００個程度の形質転換体が得られた
が、一方プラスミドｐＣＲＡＰＨ６では形質転換体が得
られなかった。この結果は、ＰＧＫ遺伝子の開始コドン
ＡＴＧの直前から、５’上流１６９ｂｐのＰｓｔＩサイ
トまでを含む断片は転写のプロモーターとしての機能を
有しておらず、一方、４０１ｂｐ上流のＥｃｏＲＩサイ
トまでを含む断片、およびさらに長い領域を含む断片は
転写のプロモーターとして機能することを示している。
これより、図３に示されるＰＧＫ遺伝子のプロモーター
を含む１３４６ｂｐの配列のうち、９４６番目のＥｃｏ
ＲＩサイトからＡＴＧ直前の１３４６番目塩基までの４
０１ｂｐの配列にプロモーターの機能を示すために必要
な配列が含まれることが明らかにされた。
【０２５０】実施例２２：グリセロアルデヒド-3- リン
酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のクローニングと
ＧＡＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定 キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド-3- リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のクローニング
は、遺伝子ライブラリーとして実施例２で構築したキャ
ンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを用
い、他生物の既知のＧＡＰ遺伝子をプローブとしたハイ
ブリダイゼーション法を用いて行った。Molecular Clon
ing 2nd edition p2.95-121,Cold Spring HarborLabora
tory (1989) に記載された方法に従い、上記の遺伝子ラ
イブラリーの約20,000プラークのファージＤＮＡを吸着
させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス
・セレビシエのＧＡＰ遺伝子を含む2.1 ｋｂのＨｉｎｄ
III 断片を保持するｐＵＣ18プラスミド（Yamano et a
l. Journal of Biotechnology 32, 165- 171 (1994)）
から、ＧＡＰ遺伝子の大部分を占めるＤＮＡ断片として
約1 ｋｂのＡｓｕII- ＡｆｌII断片を切り出した。この
断片を32Ｐ標識して、これをプローブとしてハイブリダ
イゼーションを行った。その結果3 つの陽性プラークが
分離できた。更にこれらプラークの1 つのファージＤＮ
Ａについてサブクローニングを行い、このファージＤＮ
Ａに含まれていた6.5 ｋｂＥｃｏＲＩ断片を単離し、プ
ラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＥ
ｃｏＲＩサイトに組込み、プラスミドｐＧＡＰ１および
２を構築した（図２９）。
【０２５１】制限酵素ＨｉｎｄIII 、ＣｌａＩ、Ｓｍａ
Ｉ、あるいはＳｐｅＩを単独もしくは複数使用して、単
離した6.5 ｋｂＥｃｏＲＩ断片を消化し、生じた断片に
対してサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＰ遺伝子を
プローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。その結果、３．８ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｅＩ断
片に強くハイブリダイズした。そこで、３．８ｋｂ Ｈ
ｉｎｄIII −ＳｐｅＩ断片をプラスミドベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
IIＫＳ＋のＨｉｎｄIII サイトとＳｐｅＩサイトとの間
にそれぞれ組み込み、プラスミドｐＧAPＨ１、ｐＧAPＨ
２を作製した。これらプラスミドについて、ＨｉｎｄII
I 、ＣｌａＩ、ＳｍａＩ等の制限酵素サイトでの欠失変
異体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビー
ンヌクレアーゼを用いた連続した欠失変異体を作製する
ことにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製
し、３７４９ｂｐからなるＨｉｎｄIII −ＳｐｅＩ 断
片の配列を決定した（図２９）。
【０２５２】予想される構造遺伝子領域の解析を行った
ところ、１００５ｂｐからなるオープンリーディングフ
レームが存在し、そこから推定される遺伝子産物のアミ
ノ酸配列についてサッカロマイセス・セレビシエのＧＡ
Ｐ遺伝子産物に対するホモロジーを調べた。両配列は互
いに７９．６％ホモロジーを示したことから、単離した
遺伝子がキャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子であ
ると断定した。また制御領域については、開始コドンの
上流９７５ｂｐ、終止コドンの下流１７６９ｂｐが含ま
れていた。このうち、転写のプロモーターを含むと推測
されるＨｉｎｄIII サイトから開始コドンＡＴＧの直前
までの９７５ｂｐの配列は図３０に、転写のターミネー
ターを含むと推測される終止コドンＴＡＡの直後からＡ
ｆｌIIIサイトまでの８０２ｂｐの配列は図３１に示さ
れる通りであった。
【０２５３】実施例２３：ＧＡＰ遺伝子のプロモーター
とターミネーターとを使った発現ベクターの構築 キャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子制御領域から
プロモーターとターミネーターを含むＤＮＡ断片をそれ
ぞれPCR 法を用いて取得した（図２９）。
【０２５４】プロモーターとしては、プラスミドｐＧＡ
Ｐ１を鋳型として、開始コドンの上流９７５ｂｐに位置
するＨｉｎｄIII サイトから開始コドンＡＴＧ直前まで
の断片を取得した。プライマーとして、 5'-CCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTGCCC-3' （配列番号：２３） 5'-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3' （配列番号：２４） の２つを用い、３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩ部
位をもつ様にデザインして合成した。
【０２５５】次に、ターミネーターとして、プラスミド
ｐＧＡＰ１を鋳型として、終止コドン直後からＳｐｅＩ
サイトまでの断片を取得した。プライマーとしては、 5'-GGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGGG-3' （配列番号：２５） 5'-GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3' （配列番号：２６） を用い、５’側終止コドン直後にはＢａｍＨＩサイトを
もつ様にデザインし合成した。
【０２５６】ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って３０サイクル
で行った。ＰＣＲ合成したプロモーター断片をＨｉｎｄ
IIIとＸｂａＩとで消化し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉ
ｎｄIII サイトとＸｂａＩサイトとの間に組み込み、プ
ラスミドｐＵＧｐｒｏを構築した（図３２）。一方、タ
ーミネーター断片は、終止コドンの約０．８ｋｂ下流の
ＡｆｌIII サイトで消化し、クレノウ酵素でＤＮＡ末端
の平滑化を行った後、ＢａｍＨＩで消化した。得られた
０．８ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターのＢａｍ
ＨＩサイトとＳｍａＩサイトの間に組み込み、プラスミ
ドｐＵＧｔｅｒを構築した（図３２）。
【０２５７】プラスミドｐＵＧｔｅｒのＧＡＰターミネ
ーターの下流末端のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処
理により平滑化した後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGC
T3´:配列番号：１８）を連結して、プラスミドｐＵＧ
ｔｅｒＮを構築した。次に、プラスミドｐＵＧｐｒｏか
ら０．９５ｋｂのG ＡＰプロモーター断片をＨｉｎｄII
I とＸｂａＩとで切り出し、プラスミドｐＵＧｔｅｒＮ
のＨｉｎｄIII サイトとＸｂａＩサイトとの間に挿入し
て、発現プラスミドｐＧＡＰＰＴ１を構築した。さら
に、プロモーターの上流末端のＨｉｎｄIII サイトをク
レノウ酵素処理により平滑化し、ＮｏｔＩリンカー(5'A
GCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結して、プラスミ
ドｐＧＡＰＰＴ２を構築した（図３２）。
【０２５８】さらに構築した発現プラスミドｐＧＡＰＰ
Ｔ２が実際にキャンディダ・ユティリス内で機能するか
否かを確認するために、プラスミドｐＧＡＰＰＴ２のＸ
ｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間に実施例１９記載
のプラスミドｐＡＰＨ２からＸｂａＩとＢｇｌIIによっ
て切り出される１．１ｋｂのＡＰＴ遺伝子断片を組み込
み、プラスミドｐＧＡＰＡＰＨ１を構築した（図３
２）。
【０２５９】構築したプラスミドｐＧＡＰＡＰＨ１をＮ
ｏｔＩで消化した後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に
使用した。形質転換は電気パルス法で、パルス条件を電
気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５
ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２６０】形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ
４１８を含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのＤＮ
Ａを使用して約４０個程度の形質転換体が得られた。こ
れにより、ＧＡＰ遺伝子のプロモーター、ターミネータ
ーが機能することが確認された。
【０２６１】実施例２４：原形質膜プロトンＡＴＰａｓ
ｅ（ＰＭＡ）遺伝子のクローニングとＰＭＡ遺伝子を含
むＤＮＡ断片の塩基配列決定 キャンディダ・ユティリスの原形質膜プロトンＡＴＰａ
ｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のクローニングは、ＰＧＫ遺伝子
やＰＭＡ遺伝子の場合と同様に、実施例２で構築したキ
ャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを用
い、他生物の既知のＰＭＡ遺伝子の一部分をプローブと
したハイブリダイゼーション法を用いて行った。Molecu
lar Cloning 2nd edition p2.95-121,ColdSpring Harbo
r Laboratory (1989) に記載された方法に従い、上記
した遺伝子ライブラリーの約２０．０００プラークのフ
ァージＤＮＡを吸着させたフィルターを作製した。次
に、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の
塩基配列（Serrano et al. Nature 319, 689-693 (198
6) ）をもとに合成した２つのプライマー： 5'-ATGACTGATACATCATCCTCTTCATC-3' （配列番号：２７） 5'-TAACGACAGCTGGCAAACCGACTGGGAC-3' （配列番号：２８） を用い、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（Ａ
ＴＣＣ ３８６２６）の染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐ
ＣＲ法でＰＭＡ１構造遺伝子の５’末端＋１から＋１０
２７（開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）に対応する
約１ｋｂの領域を増幅した。染色体ＤＮＡはMethods in
Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Ros
e M.D et al. P126-127 Cold Spring Harbor Laborator
y PressNY (1990) 記載の方法に従って調製した。取得
した断片は32Ｐ標識して、プローブとしてハイブリダイ
ゼーションを行った。その結果、得られた４つの陽性プ
ラークのうち１つのファージＤＮＡについてインサート
ＤＮＡをＸｂａＩ消化して、１０ｋｂ、４ｋｂ、２．８
ｋｂ、２．６ｋｂの４つのＸｂａＩ断片を単離した。
【０２６２】単離した４つの断片に対し、スクーリーニ
ングに用いたサッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１
遺伝子の約１ｋｂ断片をプローブとしてサザンハイブリ
ダイゼーションを行ったところ、２．６ｋｂのＸｂａＩ
断片にハイブリダイズした。そこで、この断片をプラス
ミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＸｂａ
Ｉサイトに組み込み、インサートの方向性が互いに逆の
プラスミドｐＰＭＡＦ１、ｐＰＭＡＦ２を作製した（図
３３）。
【０２６３】これらプラスミドについて、ＢａｍＨＩ、
ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素サイトでの欠失変異
体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビーン
ヌクレアーゼを用いた欠失変異体を作製することによ
り、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、両末端
から約１ｋｂずつの塩基配列を決定した（図３３）。予
想される構造遺伝子領域の解析を行ったところ、図３３
中左側のＸｂａＩサイトからＥｃｏＲＶサイトを含む約
１ｋｂ内に、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１
構造遺伝子の５’末端領域と約５０％のホモロジーを示
す３５２ｂｐのオープンリーディングフレームが存在し
た。もう一方側のＸｂａＩサイトからＢａｍＨＩサイト
を含む約０．８ｋｂ内には、サッカロマイセス・セレビ
シエのＰＭＡ１遺伝子の＋１２９２番目から＋２０４６
番目までの範囲 （開始コドンＡＴＧのＡを＋１とす
る）と約７０％のホモロジーを示す７５４ｂｐのオープ
ンリーディングフレームが存在することが分かった。こ
の結果から、単離した遺伝子がキャンディダ・ユティリ
スのＰＭＡ遺伝子であると判断した。また、この２．６
ｋｂのＸｂａＩ断片には、開始コドンＡＴＧの上流５９
９ｂｐが含まれていた。転写のプロモーターを含むと推
測されるこの５９９ｂｐの配列は図３４に示される通り
であった。
【０２６４】転写のターミネーターについては、同じフ
ァージＤＮＡからＸｂａＩで切り出される他の３つの断
片（１０ｋｂ、４ｋｂ、および２．８ｋｂ）をサブクロ
ーニングし、それぞれ両末端側から塩基配列決定を行
い、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の
３’側領域とのホモロジーを調べた。その結果、２．８
ｋｂのＸｂａＩ断片の片側に上記のＰＭＡ１遺伝子の
３’末端側と高いホモロジーを示す領域が存在すること
が示された。このＸｂａＩ断片をプラスミドベクターｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＸｂａＩサイトに組み
込み、インサートの方向性が互いに逆のプラスミドｐＰ
ＭＡＬ１およびｐＰＭＡＬ２を作製した（図３３）。こ
れらプラスミドについて、ＫｐｎＩ消化による欠失変異
体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビーン
ヌクレアーゼを用いた欠失変異体を作製することによ
り、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、Ｘｂａ
ＩサイトからＫｐｎＩサイトまでの１．９ｋｂの塩基配
列を決定した（図３３）。この塩基配列には、サッカロ
マイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の＋２０４１番
目から＋２７５７番目までの範囲（開始コドンＡＴＧの
Ａを＋１とする）と約８２％のホモロジーを示す７１７
ｂｐのオープンリーディングフレームと、終止コドンＴ
ＡＡの３’下流１１８８ｂｐが含まれていた。転写のタ
ーミネーターを含むと推測される終止コドンＴＡＡ直後
からＫｐｎＩサイトまでの１１８８ｂｐの配列は図３５
に示される通りであった。
【０２６５】実施例２５：ＰＭＡ遺伝子のプロモーター
とターミネーターとを使った発現ベクターの構築 先ず、キャンディダ・ユティリスのＰＭＡ遺伝子制御領
域からプロモーターまたはターミネーターを含むＤＮＡ
断片をそれぞれＰＣＲ法を用いて取得した（図３３）。
【０２６６】プロモーターとして、プラスミドｐＰＭＡ
Ｆ１を鋳型として、ＸｂａＩサイト下流２０ｂｐの位置
から開始コドンＡＴＧ直前までの断片を取得した。プラ
イマーとして、 5'-GGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGA-3' （配列番号：２９） 5'-TTCTAGACTATATCAATGGTTAGTATCACGTG-3' （配列番号：３０） の２つを用い、５’上流側末端にはＮｏｔＩサイト、
３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩサイトをもつ様に
デザインして合成した。
【０２６７】ターミネーターとして、プラスミドｐＰＭ
ＡＬ１を鋳型として、終止コドンＴＡＡ直後から終止コ
ドン４０３ｂｐ下流までの断片を取得した。プライマー
として、 5'-CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3' （配列番号：３１） 5'-GGGCGGCCGCACTCGCTGATCGAAA-3' （配列番号：３２） を用い、５’上流側終止コドン直後にはＫｐｎＩサイ
ト、３’下流側末端にはＮｏｔＩサイトをもつ様にデザ
インし合成した。
【０２６８】ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って３０サイクルで
行った。ＰＣＲ合成したプロモーター断片をＮｏｔＩと
ＸｂａＩとで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋
ベクターのＮｏｔＩサイトとＸｂａＩサイトの間に組み
込み、プラスミドｐＢＭｐｒｏを構築した。一方、ター
ミネーター断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋の
ＫｐｎＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に組み込み、プ
ラスミドｐＢＭｔｅｒを構築した。プラスミドｐＢＭｔ
ｅｒから得られる０．４ｋｂのＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ断片
を、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理
により平滑化し、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:
配列番号：１８）を連結して構築したプラスミドｐＵＣ
１９ＮのＫｐｎＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に組み
込み、プラスミドｐＵＭｔｅｒを構築した（図３６）。
【０２６９】次に、プラスミドｐＵＭｔｅｒからＸｂａ
ＩとＮｏｔＩとの消化で得られる０．４ｋｂのターミネ
ーター断片と、プラスミドｐＢＭｐｒｏからＮｏｔＩと
ＸｂａＩの消化で得られる０．６５ｋｂのプロモーター
断片とを、実施例４で構築したプラスミドｐＰＧＫＰＴ
５をＮｏｔＩ消化して得られる２．９ｋｂの断片に組み
込み、プラスミドｐＭＡＰＨ１を構築した（図３６）。
【０２７０】さらに構築した発現プラスミドｐＭＡＰＨ
１が実際にキャンディダ・ユティリス内で機能するか否
かを確認するために、プラスミｐＭＡＰＨ１のＸｂａＩ
サイトとＢａｍＨＩサイトとの間に実施例１９記載のプ
ラスミドｐＡＰＨ２からＸｂａＩとＢｇｌIIによって切
り出される１．１ｋｂのＡＰＴ遺伝子断片を組み込み、
プラスミドｐＭＡＡＰＨ１を構築した（図３６）。
【０２７１】構築したプラスミドｐＭＡＡＰＨ１をＮｏ
ｔＩ消化した後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に使用
した。形質転換は電気パルス法で、パルス条件を電気容
量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ
／ｃｍとして行った。
【０２７２】形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ
４１８を含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのＤＮ
Ａを用いて約４０個程度の形質転換体が得られた。これ
により、ＰＭＡ遺伝子のプロモーターおよびターミネー
ターが機能するものであることが確認された。
【０２７３】実施例２６：自律複製機能を有する配列
（ＡＲＳ）を含むＤＮＡ断片のクローン化 実施例１９で構築したプラスミドｐＧＫＡＰＨ１から、
ＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＡＰＴ遺伝子と、そして
ＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏ
ｔＩ断片を切り出し、これをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔIIＳＫ−(Stratagene)のＮｏｔＩサイトに挿入
して、プラスミドｐＧＫＡＰＨ２を構築した（図３
７）。ＢａｍＨＩ消化して脱リン酸化したプラスミドｐ
ＧＫＡＰＨ２、２００ｎｇと、実施例２で得られたキャ
ンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０の３−７ｋｂの
ゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片２００ｎｇと
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡ溶
液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、得られた約３
００００個の形質転換体よりプラスミドＤＮＡ混合物を
抽出して染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。このラ
イブラリーから調製したＤＮＡを用い、実施例１１記載
の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換
を試みた。パルス条件は電気容量を２５μＦとし、抵抗
値は８００オームまたは１０００オーム、電圧は３．７
５ＫＶ／ｃｍまたは５ＫＶ／ｃｍとして計４通りとし、
それぞれＤＮＡを３μｇ使用して行った。これによりＧ
４１８耐性を示すコロニーが計７株得られた。これら耐
性株を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で
培養し、菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ５を形
質転換した。酵母染色体ＤＮＡの調製は、Methods in Y
east Genetics - A laboratory Course Manual - Rose
M.D et al. P131-132 Cold Spring Harbor Laboratory
Press NYに記載の方法に従った。大腸菌から回収された
７種類のプラスミドＤＮＡ（ｐＣＡＲＳ１、ｐＣＡＲＳ
４、ｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、ｐＣＡＲＳ７、ｐＣ
ＡＲＳ８、およびｐＣＡＲＳ１０）はいずれも５−７ｋ
ｂのインサートを含むことが各種制限酵素消化により明
らかにされ、また、これらプラスミドＤＮＡを用いてＡ
ＴＣＣ９９５０株の形質転換を電気パルス法により試み
たところ、いずれのプラスミドＤＮＡについてもＧ４１
８耐性の形質転換体が得られた。このことから、これら
プラスミド中に自律複製機能を有するＤＮＡ配列がクロ
ーン化されていることが確認された。各種制限酵素消化
による解析により、これらのプラスミドのうちｐＣＡＲ
Ｓ７とｐＣＡＲＳ８とが同一のインサートを含むプラス
ミドであることが明らかにされた。これらの結果より、
キャンディダ・ユティリス酵母内で自律複製機能を有す
るＤＮＡ断片が６種類クローニングされたことが明らか
にされた。
【０２７４】また、実施例９記載のプラスミドｐＣＬＢ
Ｓ１０（図１５）をベクターとしてキャンディダ・ユテ
ィリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、プラス
ミドｐＧＫＡＰＨ２ライオブラリーと同時に形質転換を
行った。しかしながら、シクロヘキシミド耐性の形質転
換体は全く得られなかった。この結果から、キャンディ
ダ・ユティリスのＡＲＳの特徴として、それを含むプラ
スミドの細胞あたりのコピー数が低く、形質転換体を選
択するために数コピー必要なシクロヘキシミド耐性型Ｌ
４１遺伝子と組み合わせた場合形質転換体を選択できな
いことが示唆された。
【０２７５】実施例２７：自律複製機能を有する配列
（ＡＲＳ）を含むＤＮＡ断片の短縮化 実施例２６でクローニングされた自律複製機能を有する
ＤＮＡ断片を含むプラスミド７種類のうち、高頻度でキ
ャンディダ・ユティリス酵母を形質転換することができ
たプラスミド３種類（ｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、お
よびｐＣＡＲＳ７）について、さらに詳しい解析を行っ
た。
【０２７６】まず、これら３種のプラスミドによる酵母
形質転換頻度を実施例１９で作成した染色体組み込み型
プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１をＢｇｌII消化したＤＮＡ
をコントロールとして調べた。パルス条件は電気容量を
２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃ
ｍとし、ＤＮＡを０．１μｇ用いてＡＴＣＣ９９５０株
の形質転換を行った。電気パルス後の培養は４時間行っ
た。その結果は表７に示される通りであった。
【０２７７】表７ 各種ＡＲＳプラスミドの形質転換頻
度 プラスミド コロニー数 ｐＣＡＲＳ５ １６４５０ ｐＣＡＲＳ６ ９５００ ｐＣＡＲＳ７ ４７００ｐＣＬＲＡＰＨ１ ４００ 注１）１μｇプラスミドＤＮＡあたりの形質転換体数 注２）ｐＣＬＲＡＰＨ１はＢｇIII で分解して用いた この結果より、ＡＲＳを含んだプラスミドを用いること
により、ｒＤＮＡをターゲットとしたＤＮＡの組込みよ
りさらに１０倍から４０倍程度高い形質転換頻度が得ら
れることが示された。
【０２７８】また、これらプラスミドｐＣＡＲＳ５、ｐ
ＣＡＲＳ６、およびｐＣＡＲＳ７をＮｏｔＩ消化し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼにより再び環状化することにより、Ｐ
ＧＫ遺伝子プロモーター、ＡＰＴ遺伝子、およびＰＧＫ
遺伝子ターミネーターを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片
を除去したプラスミドｐＣＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６
０、およびｐＣＡＲＳ７０を構築した。新たに得られた
３種類のプラスミドについて種々の制限酵素消化により
インサートの長さを調べたところ、インサートの長さが
いずれも約５−６ｋｂであったため、自律複製機能を有
する領域をさらに限定することとした。そのためにｐＣ
ＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６０、およびｐＣＡＲＳ７０そ
れぞれをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、１−３．５ｋｂの
サイズの断片を回収して、ＢａｍＨＩ消化後、脱リン酸
化したプラスミドｐＧＫＡＰＨ２とＴ４ＤＮＡリガーゼ
により連結した。これらの３種類のＤＮＡ溶液を用いて
大腸菌ＤＨ５を形質転換して、それぞれ得られた２，５
００−６，０００個の形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
混合物を抽出して、ＤＮＡライブラリーを作製した。こ
れらＤＮＡ５μｇずつを用いて実施例１１記載の電気パ
ルス法により再びＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を行
い、Ｇ４１８耐性形質転換体を得た。
【０２７９】得られたＧ４１８耐性のコロニーはさまざ
まな大きさからなっていたが、３種類のライブラリーに
ついて比較的大きなコロニーを形成した株それぞれ５株
を２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で培養
した。得られた菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ
５を形質転換した。一部のＧ４１８耐性株については大
腸菌形質転換体が得られなかった。また、これら回収さ
れたプラスミドを用いて実施例１１記載の電気パルス法
により再びＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を行ったとこ
ろ、それらのうち一部は、元のプラスミドドｐＣＡＲＳ
５、ｐＣＡＲＳ６、およびｐＣＡＲＳ７と比較して形質
転換頻度が大幅に低かったため除外した。最終的にｐＣ
ＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６０、ｐＣＡＲＳ７０いずれに
ついても短縮化されたＤＮＡ断片を含み、かつ形質転換
頻度が親プラスミドと同程度であるプラスミドが１種類
ずつ得られた。そしてｐＣＡＲＳ５０由来のプラスミド
をｐＣＡＲＳ５−２と、ｐＣＡＲＳ６０由来のプラスミ
ドをｐＣＡＲＳ６−２と、そしてｐＣＡＲＳ７０由来の
プラスミドをｐＣＡＲ７−２と、それぞれ命名した。得
られた６種類のプラスミド中の、自律複製機能を有する
配列を含む染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図は図３８に
示される通りであった。
【０２８０】これらのプラスミドのうち染色体ＤＮＡ断
片の短縮化された３種類のプラスミドｐＣＡＲＳ５−
２、ｐＣＡＲＳ６−２、およびｐＣＡＲ７−２につい
て、さらに挿入ＤＮＡ断片を短縮化したプラスミドを構
築し、形質転換頻度を調べた（実施例２８）。しかし、
この過程で構築した一部のプラスミドについて部分塩基
配列を決定したところ、図３８においてｐＣＡＲＳ５の
ＢｇｌIIサイトより左側の領域約７００ｂｐが、ｐＣＡ
ＲＳ６−２のＥｃｏＲＩサイトより左側の領域約７００
ｂｐと９０％以上の相同性を示した。この結果から、ｐ
ＣＡＲＳ５とｐＣＡＲＳ６の挿入ＤＮＡ断片は互いに制
限酵素地図は一致しないものの、それぞれ相同染色体ま
たは反復配列から由来することが推察されたため、以後
の解析はｐＣＡＲＳ６とｐＣＡＲＳ７挿入ＤＮＡ断片と
について行うこととした。また、ｐＣＡＲＳ６に含まれ
るＡＲＳ活性を持つ配列をＣＵＡＲＳ１と、ｐＣＡＲＳ
７に含まれるＡＲＳ活性を持つ配列をＣＵＡＲＳ２と、
それぞれ命名した。
【０２８１】実施例２８：ｐＣＡＲＳ６、ｐＣＡＲＳ７
挿入ＤＮＡ断片の短縮化と形質転換頻度とプラスミド安
定性 （１）ｐＣＡＲＳ６挿入ＤＮＡ断片の短縮化と形質転換
頻度 プラスミドｐＣＡＲＳ６−２にクローン化されたＳａｕ
３ＡＩ部分消化ＤＮＡ断片は約１．９ｋｂであった。よ
って、自律複製能を有する領域をさらに限定するため
に、ｐＣＡＲＳ６−２のインサート断片の一部を含む３
種類のプラスミドを構築した。これらのプラスミドは以
下のように構築した。
【０２８２】ｐＣＡＲＳ６−２からＡＰＴ遺伝子発現カ
セットを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を除去して、ｐ
ＣＡＲＳ６−２０を構築した。ｐＣＡＲＳ６−２０をＡ
ｆｌIIとＸｂａＩとで消化した後、クレノウ酵素で末端
を平滑化してＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環状化してプ
ラスミドｐＣＡＲＳ６−２１０を構築した。このプラス
ミドに、実施例１９で構築したプラスミドｐＧＫＡＰＨ
１のプロモーター断片内のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ
酵素処理により平滑化し、その後ＮｏｔＩリンカー（5'
AGCGGCCGCT3'：配列番号：１８）を連結して構築したプ
ラスミドｐＧＫＡＰＨ３から切り出される短縮化された
ＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＡＰＴ遺伝子発現カセ
ットを含む２．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することに
よって、ｐＣＡＲＳ６−２１を構築した。また、ｐＣＡ
ＲＳ６−２０とｐＣＡＲＳ６−２１をそれぞれＨｉｎｄ
III 消化してＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環状化した
後、同様にＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＡＰＴ遺伝
子発現カセットを含む２．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結
することによって、ｐＣＡＲＳ６−２２およびｐＣＡＲ
Ｓ６−２３を構築した。これら５種類のプラスミドに含
まれる挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図は図３９に示され
る通りであった。
【０２８３】次に構築した各プラスミドを用いて、実施
例１１記載の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株
の形質転換実験を行なった。パルス条件は電気容量を２
５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍ
とし、ＤＮＡは１μｇ用いて行った。電気パルス後の培
養は４時間行った。その結果は表８に示される通りであ
った。
【０２８４】 表８ ｐＣＡＲＳ６由来各種プラスミドの形質転換頻度と安定性１μｇプラスミドＤＮＡあたりの形質転換体数 プラスミドの安定性 プラスミド コロニー数 （％） プラスミド ％ ｐＣＡＲＳ６ １０９３ （１００） ｐＣＡＲＳ６ ２１．４ ｐＣＡＲＳ６−２ ７１０ （６５） ｐＣＡＲＳ６−２ ３１．９ ｐＣＡＲＳ６−２１ １３７ （１３） ｐＣＡＲＳ６−２１ ２９．０ ｐＣＡＲＳ６−２２ ２５３ （２３） ｐＣＡＲＳ６−２２ １１．０ｐＣＡＲＳ６−２３ ２５ （２） ｐＣＡＲＳ６−２３ ３．９ 注1)値は２回の形質転換実験の平均値を示す。 注）世代数は２．５〜３．５ 世代の間 また、各プラスミドの酵母内安定性を次のように調べ
た。得られたＧ４１８耐性のコロニーを４ｍｌのＹＰＤ
培地に植菌し、３０℃で８時間振とう培養した。その
後、ＹＰＤプレートと、Ｇ４１８を含むＹＰＤプレート
とに菌をそれぞれ塗布して、２日後生じたコロニー数を
比較することにより、プラスミドの保持率を求めた。結
果は表８に示される通りであった。この間、菌は２．５
−３．５回分裂したことが培養液の吸光度を調べること
により示された。この結果から、ｐＣＡＲＳ６−２の挿
入ＤＮＡ断片を左右両側よりそれぞれ短縮化したプラス
ミドｐＣＡＲＳ６−２１およびｐＣＡＲＳ６−２２のう
ち、ｐＣＡＲＳ６−２１の安定性はｐＣＡＲＳ６−２と
同程度であったが、どちらも形質転換頻度が大きく低下
することが示された。また、挿入ＤＮＡ断片を０．６ｋ
ｂｐまで短くしたＣＡＲＳ６−２３では形質転換頻度は
さらに低下し、ｐＣＡＲＳ６の５０分の１以下に低下す
ることが示された。これらの結果から、ｐＣＡＲＳ６に
含まれるＣＵＡＲＳ１は、ｐＣＡＲＳ６−２の約１．９
ｋｂ長さのＤＮＡ断片より短縮化することが困難である
ことが示唆された。
【０２８５】（２）ｐＣＡＲＳ７挿入ＤＮＡ断片の短縮
化と形質転換頻度 プラスミドｐＣＡＲＳ７−２にクローン化されたＳａｕ
３ＡＩ部分消化ＤＮＡ断片は約３．５ｋｂであった。よ
って、自律複製能を有する領域をさらに限定するため
に、ｐＣＡＲＳ７−２のインサート断片の一部を含む５
種類のプラスミドを構築した。これらのプラスミドは以
下のように構築した。
【０２８６】ｐＣＡＲＳ７−２から、ＡＰＴ遺伝子発現
カセットを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を除去したプ
ラスミドｐＣＡＲＳ７−２０を構築した。このｐＣＡＲ
Ｓ７−２０をＸｂａＩ消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによ
り再環状化し、その後２．３ｋｂのＡＰＴ遺伝子発現カ
セットを含むＮｏｔＩ断片を連結することによりｐＣＡ
ＲＳ７−４を構築した。
【０２８７】また、ｐＣＡＲＳ７−２０より、約１．８
ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄIII 断片、約１．３ｋｂの
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片、および約１．８ｋｂのＨ
ｉｎｄIII −ＢｇｌII断片を切り出し、それぞれ、Ｅｃ
ｏＲＶおよびＨｉｎｄIII 、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄII
I 、ならびにＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで消化した
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ−(Stratagene)に連結し
た。その後、短縮化されたＰＧＫ遺伝子プロモーターに
よるＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む２．３ｋｂのＮｏ
ｔＩ断片を連結することによりｐＣＡＲＳ７−６、ｐＣ
ＡＲＳ７−７、およびｐＣＡＲＳ７−８を構築した。こ
れら６種類のプラスミドに含まれる挿入ＤＮＡ断片の制
限酵素地図は図４０に示される通りであった。
【０２８８】構築した各プラスミドを用いて、実施例１
１記載の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株の形
質転換実験を行なった。パルス条件は電気容量を２５μ
Ｆ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍと
し、ＤＮＡを１μｇ用いて行った。電気パルス後の培養
は４時間行った。その結果を表９に示した。
【０２８９】 表９ ｐＣＡＲＳ７由来各種プラスミドの形質転換頻度と安定性１μｇプラスミドＤＮＡあたりの形質転換体数 プラスミドの安定性 プラスミド コロニー数 （％） プラスミド ％ ｐＣＡＲＳ７ １８３３ （１００） ｐＣＡＲＳ７ ２３．０ ｐＣＡＲＳ７−２ １２７３ （６９） ｐＣＡＲＳ７−２ ３４．９ ｐＣＡＲＳ７−４ ０ （０） ｐＣＡＲＳ７−６ １８．６ ｐＣＡＲＳ７−６ ５９８ （３３） ｐＣＡＲＳ７−７ １１．４ ｐＣＡＲＳ７−７ ＊２８０ （１５） ｐＣＡＲＳ７−８ ７．０ｐＣＡＲＳ７−８ ５ （０．２） 注1)値は２回の形質転換実験の平均値を示す。 注）世代数は２．５〜３．５ 注2)＊はコロニーの大きさが非常に小さい。 世代の間 また、各プラスミドの酵母内安定性を次のように調べ
た。得られたＧ４１８耐性のコロニーを４ｍｌのＹＰＤ
培地に植菌し、３０℃で８時間振とう培養した。その
後、ＹＰＤプレートと、Ｇ４１８を含むＹＰＤプレート
とに菌をそれぞれ塗布して、２日後生じたコロニー数を
比較することにより、プラスミドの保持率を求めた（表
９）。この間、菌は２．５−３．５回分裂したことが培
養液の吸光度変化を調べることにより示された。これら
の結果から、ｐＣＡＲＳ７−２またはｐＣＡＲＳ７−６
による形質転換頻度は、ｐＣＡＲＳ７のそれと比較し
て、それぞれ約７０％、および約３０％程度に低下し
た。しかし、安定性はそれほど悪化していないことが示
された。さらにＤＮＡ断片を短くしたｐＣＡＲＳ７−７
については、ｐＣＡＲＳ７−６の２分の１程度の形質転
換頻度を示したものの、生じたコロニーは微小であり、
また、安定性も悪かった（表９）。一方、ｐＣＡＲＳ７
−８については頻度が悪く、ｐＣＡＲＳ７−４について
は全く形質転換体が得られなかった。これらの結果か
ら、ｐＣＡＲＳ７に含まれるＣＵＡＲＳ２については、
形質転換頻度はやや低下するものの、ｐＣＡＲＳ７−６
の１．８ｋｂにまで短縮化できることが示された。
【０２９０】これら２つのＡＲＳの短縮化に関する結果
は、キャンディダ・ユティリス酵母のＡＲＳが自律複製
能を示すには約２ｋｂ程度のかなり長い領域が必要であ
ることを意味している。これはサッカロマイセス酵母の
ＡＲＳが約２００ｂｐで機能する事実（Newlon, C.R an
d Theis,J. Current Opinion in Genetics and Develop
ment1993 3, 752-758 ）と異なっており、興味深い特徴
であるといえる。
【０２９１】実施例２９：ｐＣＡＲＳ６−２およびｐＣ
ＡＲＳ７−６の自律複製機能を有する配列を含むＤＮＡ
断片の塩基配列決定とサザン解析 （１）自律複製機能を有する配列を含むＤＮＡ断片の塩
基配列決定 ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７中の、ＡＲＳ、ＣＵＡ
ＲＳ１、およびＣＵＡＲＳ２を含むＤＮＡ断片につい
て、それぞれの塩基配列を決定した。ＣＵＡＲＳ１を含
むＤＮＡとしてはｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片に
ついて、ＣＵＡＲＳ２を含むＤＮＡとしてはｐＣＡＲＳ
７−６の挿入ＤＮＡ断片について、それぞれ挿入ＤＮＡ
断片の両側からＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビ
ーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々
の欠失変異をもつプラスミドを作製して塩基配列を決定
した。決定したｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片の塩
基配列は図４１と４２とに、ｐＣＡＲＳ７−２の挿入Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列は図４３と４４とに示される通りで
あった。このうちｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片は
１９２１ｂｐからなりＡ+ Ｔの全塩基に対する割合は６
９．５％であり、ｐＣＡＲＳ７−２の挿入ＤＮＡ断片は
１７８８ｂｐからなりＡ+ Ｔの全塩基に対する割合は７
０．８％であり、いずれのＤＮＡも非常にＡ+ Ｔの割合
が高いことが示された。
【０２９２】コンピューターによる解析により、ＡＲＳ
に認められる１１ｂｐの共通配列（Ｔ／Ａ）ＴＴＴＡ
（Ｃ／Ｔ） （Ａ／Ｇ）ＴＴＴ（Ｔ／Ａ）（Newlon, C.
R andTheis,J. Current Opinion in Genetics and Deve
lopment1993 3, 752-758 ）と比べると、一塩基ずつ異
なる配列が、ｐＣＡＲＳ６−２では９個分散して存在し
ていること、また、ｐＣＡＲＳ７−６では１３個存在
し、そのうち５個が互いに重なり合いながら存在してい
ることが示された（図４１〜図４４）。
【０２９３】（２）サザン解析によるコピー数算定 キャンディダ・ユティリス酵母細胞内において、ＡＲＳ
を含むプラスミドが何コピー存在するかを調べるため
に、ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７で形質転換したキ
ャンディダ・ユティリス酵母から調製したＤＮＡについ
てサザン解析を行った（図４５−１）。また、コピー数
算定のための内部標準としてＰＧＫ遺伝子を用いること
としたので、ＰＧＫ遺伝子コピー数算定のためのサザン
解析も行った（図４５−２）。
【０２９４】ＰＧＫ遺伝子コピー数算定のためのサザン
解析は、実施例１８記載のプラスミド、ｐＣＬＬＡＣ１
をＰＧＫプロモーター内のＳｐｈＩサイトで消化した
後、このプラスミドで形質転換したＡＴＣＣ９９５０
株、２株と、対照として親株とからそれぞれ調製したＤ
ＮＡについて行った。ＳａｌＩ+ ＮｏｔＩ消化したＤＮ
Ａについて実施例４記載のｐＧＫＰＴ４から切り出され
るＰＧＫプロモーターを含む０．４ｋｂのＥｃｏＲＩ-
ＸｂａＩ断片をプローブとした場合、親株のＡＴＣＣ９
９５０株では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の３．２ｋｂのバ
ンドが認められた（図４５- ２、レーン１）。一方、Ｐ
ＧＫプロモーター内のＳｐｈＩサイトで消化したｐＣＬ
ＬＡＣ１を組み込んだ株ではこの３．２ｋｂのバンドの
ほかに、タンデムに複数個組み込まれたプラスミドから
ＮｏｔＩ消化により生じる５．４ｋｂのバンドと、染色
体上のＰＧＫ遺伝子のうち１個がプラスミドの挿入によ
り分断されて生じる６．４ｋｂおよび２．１ｋｂの２本
のバンドが検出された（レーン２、３）。これら６．４
ｋｂおよび２．１ｋｂの２本のバンドは、組み込まれた
プラスミド分子の両末端に位置するプラスミド分子内の
ＮｏｔＩサイトとＰＧＫ遺伝子領域内のＳａｌＩサイト
とから生ずるものであることから、プラスミド分子が相
同組換えによりＰＧＫ遺伝子座に組み込まれたことが示
された。
【０２９５】イメージングアナライザーＢＡＳ２０００
（FUJIFILM）を用いて各バンドの強度を測定したとこ
ろ、形質転換体では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の３．２ｋ
ｂのバンドと、染色体に組み込まれたプラスミド分子の
両末端のプラスミド由来の６．４ｋｂおよび２．１ｋｂ
のバンドの濃さがほぼ一致することから、ＰＧＫ遺伝子
は細胞あたり２コピー存在し、形質転換体ではそのうち
１コピーがプラスミドＤＮＡの挿入により分断されたこ
とが示された。また、プラスミドのタンデム組み込みに
よる５．４ｋｂのバンドと６．４ｋｂと２．１ｋｂのバ
ンドの濃さの比較から、組み込まれたプラスミドのコピ
ー数は約４コピーであることが示された。
【０２９６】ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７で形質転
換したＡＴＣＣ９９５０株ＤＮＡをＥｃｏＲＶ+ Ｎｏｔ
Ｉ消化し、実施例４記載のｐＧＫＰＴ４から切り出され
るＰＧＫターミネーターを含む０．９ｋｂＸｂａＩ- Ｎ
ｏｔＩ断片をプローブとしてサザン解析を行った。その
結果は図４５−１に示される通りであった。親株のＡＴ
ＣＣ９９５０株では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の約７ｋｂ
のバンドが認められた（図４５−１、レーン３）形質転
換体においては約７ｋｂのバンドの他にプラスミド由来
の３．３ｋｂのバンドが認められた。７ｋｂと３．３ｋ
ｂのバンドの濃さの比較から、ＰＧＫ遺伝子由来のバン
ドを２コピーとすると、ｐＣＡＲＳ６のコピー数は１
（レーン１）、ｐＣＡＲＳ７のコピー数は０．４（レー
ン２）と計算された。ｐＣＡＲＳ７のコピー数が１以下
となったのは、菌培養時のプラスミド分子の脱落による
ものと考えられる。この結果から、ＣＵＡＲＳを含むプ
ラスミドは細胞あたり、１コピー程度存在すると考えら
れた。
【０２９７】（３） 染色体上でのＡＲＳの存在様式 ＨｉｎｄIII 消化したＡＴＣＣ９９５０株、９２２６
株、９２５６株、ＫＰ−２０５９Ｐ株、およびサッカロ
マイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の各種染色体ＤＮＡ
に対して、サザン解析を行った。プローブとして、ＣＵ
ＡＲＳ１としてｐＣＡＲＳ６- ２２の１．３ｋｂ挿入Ｄ
ＮＡ断片をＸｂａＩとＨｉｎｄIII により切り出した断
片（図３９）を、ＣＵＡＲＳ２としてｐＣＡＲＳ７−６
の１．８ｋｂＥｃｏＲＶ- ＨｉｎｄIII 断片（図４０）
を、それぞれ用いてハイブリダイゼーションを行った
（図４６）。ＣＵＡＲＳ１については、ｐＣＡＲＳ６の
制限酵素地図から予想される２ｋｂの主要なバンド以外
にｐＣＡＲＳ５の制限酵素地図から予想されるＨｉｎｄ
III 断片の長さに一致する１．６ｋｂのバンドが認めら
れた（図４６−１）。一方、ＣＵＡＲＳ２についてはｐ
ＣＡＲＳ７の制限酵素地図から予想される２．５ｋｂの
主要なバンド以外にホモロジーの高いＤＮＡ配列がキャ
ンディダ・ユティリス酵母染色体上に１０コピー程度存
在すると共に、サッカロマイセス酵母にも多数存在する
ことが示された（図４６−２）。この結果から、ＣＵＡ
ＲＳ２は広く保存された配列である可能性が示唆され
た。また、洗浄条件を厳しくすることにより（０．１ｘ
ＳＳＣ ６５℃）主要なバンド以外のシグナルはほとん
ど認められなくなった（図４６−２）。
【０２９８】また、これらのＡＲＳが染色体ＤＮＡ由来
であるかどうかを調べるために、パルスフィールドゲル
電気泳動法で分離したキャンディダ・ユティリス染色体
ＤＮＡに対してサザン解析を行った。ＡＴＣＣ９９５０
株のＤＮＡは７本に分れたが、ＣＵＡＲＳ１は大きいほ
うから６番目の染色体に、ＣＵＡＲＳ２は３番目の染色
体にそれぞれ位置することが明らかにされ、クローン化
したＡＲＳは染色体由来であることが明らかにされた。
また、ｐＣＡＲＳ５の挿入ＤＮＡ断片についてはＣＵＡ
ＲＳ１と同様に６番目の染色体に位置することが示され
た。実施例２７記載のシークエンス解析からも示唆され
たように、これらｐＣＡＲＳ５とｐＣＡＲＳ６にクロー
ン化されたＡＲＳは相同染色体由来である可能性を支持
する結果となった。
【０２９９】実施例３０：ＡＲＳを利用したプロモータ
ー活性を有するＤＮＡ断片のクローニング （１）プロモーター検索ベクターの構築 実施例２８で構築したプラスミドｐＣＡＲＳ６−２０よ
り、自律複製能を有する配列を含むＤＮＡを１．９ｋｂ
のＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片として切り出した。この断片
をＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化し
た後、さらにＳａｃＩ消化したプラスミドｐＡＰＨ１
（実施例１９）と連結してプラスミドｐＰＣＶ１を構築
した。続いてｐＰＣＶ１をＢａｍＨＩ消化してクレノウ
酵素処理により平滑化した後、ＨｐａＩリンカー(5'GTT
AAC3')を挿入して、プラスミドｐＰＣＶ２を構築した
（図４７）。
【０３００】（２）ライブラリーの構築とプロモーター
活性を有するＤＮＡ断片のクローニング キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０の染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素ＲｓａＩ、ＨａｅIII 、およびＡｌｕＩ
により、同時に部分消化した。その後、ＤＮＡ断片を１
％のアガロースゲルで電気泳動することにより分画し、
０．９−１．８ｋｂの長さの断片を回収した。この部分
消化ＤＮＡ断片と、ＨｐａＩ消化して脱リン酸化したプ
ラスミドｐＰＣＶ２とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連
結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転
換して、得られた約１００，０００個の形質転換体より
プラスミドＤＮＡ混合物を抽出して染色体ＤＮＡライブ
ラリーを作製した。このライブラリーから調製したＤＮ
Ａを用いて実施例１１記載の電気パルス法によりＡＴＣ
Ｃ９９５０株の形質転換を試みた。パルス条件は電気容
量を２５μＦ、抵抗値は１０００オーム、電圧は５ＫＶ
／ｃｍとし、ＤＮＡは１回のパルスあたり２０−２５μ
ｇを使用して行った。形質転換体の選択は２００μｇ／
ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、形質転換
実験を繰り返すことにより、２８０μｇのＤＮＡを使用
して合計３８０個の形質転換体を取得した。これらの形
質転換体のうち比較的大きなコロニーを形成した８４株
について、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレー
トでの増殖を調べた。このうち、増殖の良かった株１２
株を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で培養
し、菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ５を形質転
換した。
【０３０１】大腸菌から回収された１２種類のプラスミ
ドＤＮＡ、すなわちｐＰＣＶ１、３、９、１４、１９、
３３、５１、５５、５７、６２、６４、および７８は、
いずれも０．９−１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を含むこ
とが制限酵素消化により明らかにされた。次に、プロモ
ーター活性を有する配列を含むＤＮＡ断片をＸｂａＩ消
化により切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ−(S
tratagene)に連結して得られたプラスミドについて、そ
れらの挿入ＤＮＡ断片の両側から一部塩基配列を決定し
た。その結果、ｐＰＣＶ３３およびｐＰＣＶ７８、なら
びにｐＰＣＶ１４、ｐＰＣＶ５１、およびｐＰＣＶ５５
が、それぞれ同一のＤＮＡ断片を含むことが明らかとな
った。よって、最終的に９種類のプロモーター活性を有
するＤＮＡ断片がクローン化されたことが示された。
【０３０２】また、これら９種類のプラスミドｐＰＣＶ
１、３、９、１４、１９、３３、５７、６２、および６
４を用いてＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を電気パルス
法により試みたところ、いずれのプラスミドＤＮＡにつ
いても１μｇＤＮＡあたり６，０００から１０，０００
個のＧ４１８耐性コロニーが得られた。さらに、これら
９種類のプラスミドと、対照として用いたｐＣＡＲＳ６
−２とにより得られた１０種類のＧ４１８耐性株２株ず
つの計２０クローンについて、５ｍｌのＹＰＤ液体培地
で一晩培養した後、ＹＰＤプレート上で単一コロニーに
した。これら２０クローンのおのおの１０コロニーずつ
をＧ４１８を含むＹＰＤプレート上での生育を調べるこ
とにより、プラスミドの保持率を調べた。その結果、ｐ
ＣＡＲＳ６−２のプラスミド保持率は５％であったのに
対し、その他すべてのプラスミドについて保持率が高ま
っていた。このうち特にプラスミドｐＰＣＶ１、ｐＰＣ
Ｖ１９、およびｐＰＣＶ６４については、プラスミド保
持率が８０−８５％と高く、取得されたプロモーター活
性を有する配列を含むＤＮＡ断片が、プラスミドの安定
性を高める機能を有していることが示唆された。
【０３０３】（３）プラスミドｐＰＣＶプロモーター活
性を有するＤＮＡ断片の塩基配列決定 取得された９種類のプロモーター活性を有するＤＮＡ断
片のうち、プラスミドｐＰＣＶ１９の挿入ＤＮＡ断片に
ついて、挿入ＤＮＡ断片の両側からＥｘｏIIIヌクレア
ーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異
作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製
して塩基配列を決定した。決定した１０５４ｂｐからな
るｐＰＣＶ１９の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は図４８に
示される通りであった。
【０３０４】実施例３１：ハイグロマイシンＢ耐性遺伝
子発現用プラスミドの構築とそれを利用した酵母の共形
質転換体の選択 （１）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子発現用プラスミド
の構築とその機能確認 ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰ
Ｔ）遺伝子は、プラスミドｐＢＩＢ−ＨＹＧ（Becker
D. Nucl. Asids Res.18,203 (1990)）を鋳型として、す
でに明らかにされているＨＰＴ遺伝子の塩基配列情報
（Gritz L. and Davis J. Gene 25, 179-188 （1983)
）に基づき作成した２種類のプライマーを用いてＰＣ
Ｒにより取得した。プライマーとして、 5'-GGTCTAGATATGAAAAAGCCTGAAC-3' （配列番号：３３） 5'-GGAGATCTATTCCTTTGCCCTCGGA-3' （配列番号：３４） を用いて、５’側末端開始コドン直前にＸｂａＩサイ
ト、３’側末端終止コドン直後にＢｇｌIIサイトをもつ
様にデザインして合成した。合成したＨＰＴ遺伝子断片
はＸｂａＩとＢｇｌIIとで消化後、実施例４記載の発現
ベクターｐＰＧＫＰＴ４（図４）のＸｂａＩサイトとＢ
ａｍＨＩサイトと間に挿入して、プラスミドｐＧＫＨＰ
Ｔ１を構築した（図４９）。
【０３０５】さらにｐＧＫＨＰＴ１からＰＧＫ遺伝子プ
ロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子タ
ーミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り
出し、これを実施例３０記載のプラスミドｐＰＣＶ１４
のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＡＨＧ１を
構築した。
【０３０６】構築したＨＰＴ遺伝子発現カセットが機能
するかどうか確認するために、プラスミドｐＡＨＧ１に
よりＡＴＣＣ９９５０株を実施例１１記載の電気パルス
法により形質転換した。Ｇ４１８耐性で選択した形質転
換体は、２００、４００、および８００μｇ／ｍｌの濃
度のハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ液体培地で増殖し
たが、対照として用いた野生株はいずれの培地でも増殖
せず、ハイグロマイシンＢ耐性を示すことが明らかにさ
れた。
【０３０７】また、プラスミドｐＧＫＨＰＴ１をＮｏｔ
Ｉ消化して、ＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝
子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片
と、ベクター断片とに分けた後、ＡＴＣＣ９９５０株の
形質転換に用いた。形質転換は実施例１１記載の電気パ
ルス法により行い、形質転換体の選択は８００μｇ／ｍ
ｌのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤプレートで行っ
た。その結果、１μｇＤＮＡあたり１６８個のハイグロ
マイシンＢ耐性コロニーが得られた。これは対照として
用いたＮｏｔＩ消化プラスミドｐＧＫＡＰＨ１による形
質転換頻度、１μｇＤＮＡあたり１５６個とほぼ同じで
あり、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子はＧ４１８耐性遺
伝子同様、キャンディダ・ユティリス形質転換体の直接
選択に用いることができることが示された。
【０３０８】（２）酵母の共形質転換の実施 実施例３０で取得したＡＲＳを含むプラスミドｐＰＣＶ
６４の０．１μｇと、ＮｏｔＩ消化してＰＧＫ遺伝子プ
ロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子タ
ーミネーターとを含む断片とベクター断片とに分けたプ
ラスミドｐＰＧＫＨＰＴ１の１μｇまたは１０μｇとを
混合して、ＡＴＣＣ９９５０株の実施例１１記載の電気
パルス法により形質転換に用いた。
【０３０９】パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値
は６００、８００、または１０００オーム、電圧は３．
７５ＫＶ／ｃｍまたは５ＫＶ／ｃｍとして、ＤＮＡ混合
物２種類に対してそれぞれ６通りのパルス条件で行っ
た。形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を
含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのｐＰＣＶ６４
ＤＮＡ当たり、それぞれの条件で約２，０００から７，
０００個の形質転換体を取得した。それぞれの条件で得
られたＧ４１８耐性コロニー５００から２０００個を８
００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤプレ
ートにレプリカした。その結果、得られたＧ４１８耐性
コロニーのうちハイグロマイシンＢ耐性を示すコロニー
の割合はそれぞれのパルス条件で大きな差はなく、約１
−２％であることが示された。つぎに、このＧ４１８耐
性でかつハイグロマイシンＢ耐性を示した株についてＹ
ＰＤ液体培地で一晩培養することによって、プラスミド
として存在するｐＰＣＶ６４が脱落してＧ４１８感受性
となった株の取得を試みた。４０株について調べたとこ
ろ、このうち１０株についてＧ４１８感受性でかつハイ
グロマイシンＢ耐性を示す株が得られた。これらの株に
おいてはＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子
と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片が
染色体上に保持されていることが期待された。そこでこ
の１０株より染色体ＤＮＡを調製した後、ＨＰＴ遺伝子
発現カセットが染色体上に相同組換えにより組み込まれ
たかどうかをＰＣＲにより調べた。
【０３１０】このためのプライマーとして、ＨＰＴ遺伝
子発現に用いたＰＧＫ遺伝子プロモーター断片の５’端
外側の塩基配列をもとに合成した、プライマー１；5'CA
AGTTGATCCTTCTCCGGA3' （配列番号：３５）及
び、ＨＰＴ遺伝子内部の配列をもとに合成した、プライ
マー２；5'GAAACTTCTCGACAGACGTC3' （配列番
号：３６）及び、ＨＰＴ遺伝子発現に用いたＰＧＫ遺伝
子ターミネーター断片内の配列をもとに合成した プライマー３；5'CATCGGGTAAGGTCTACATG3' （配
列番号：３７）の合計３種類のプライマーを使用した。
【０３１１】ＰＣＲの条件は、９５℃１分、５５℃１
分、７２℃５分とし、３０サイクル行った。その結果は
図５０に示される通りであった。図５０（１）はプライ
マー１とプライマー３とを用いたＰＣＲ反応産物の電気
泳動図である。この結果より、すべてのサンプルについ
て内在性のＰＧＫ遺伝子による２．７ｋｂの増幅断片が
認められたほか、Ｎｏ．３、５、７、９、および１０の
５つのサンプルについては２．６ｋｂの断片が認められ
た。これは形質転換に用いたＰＧＫ遺伝子プロモーター
と、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネータ
ーとを含む断片によって、内在性の２個のＰＧＫ遺伝子
のうち１個が置き換えられたことにより生じたと考えら
れた。さらに、同じＤＮＡサンプルについてプライマー
１とプライマー２とを用いてＰＣＲを行った結果は図５
０（２）に示される通りであった。その結果より、２．
６ｋｂの断片が認められた５個のサンプルについて１．
４ｋｂの増幅断片が認められ、これら５クローンに関し
ては相同組換えによって、内在性ＰＧＫ遺伝子がＨＰＴ
遺伝子に置き換えられたことが示された。
【０３１２】本明細書に開示される発明は下記の通りで
ある。
【０３１３】（１） キャンディダ・ユティリスのリボ
ソーム構成蛋白質Ｌ４１をコードする遺伝子配列を含ん
でなる、ＤＮＡ配列。
【０３１４】（２） キャンディダ・ユティリスのリボ
ソーム構成蛋白質Ｌ４１が図１４に記載のアミノ酸配列
（配列番号：６）を有するものである、（１）記載のＤ
ＮＡ配列。
【０３１５】（３） プロモーター配列、およびターミ
ネーター配列をさらに含んでなる、（１）または（２）
記載のＤＮＡ配列。
【０３１６】（４） 図１３に記載の塩基配列（配列番
号：５）を有する、（３）記載のＤＮＡ配列。
【０３１７】（５） 図１４に記載のアミノ酸配列（配
列番号：６）の５６番目のプロリンがグルタミンに置換
されたアミノ酸配列を有する蛋白質であって、酵母にシ
クロヘキシミド耐性を付与するシクロヘキシミド耐性型
Ｌ４１蛋白質をコードする遺伝子配列を含んでなる、Ｄ
ＮＡ配列。
【０３１８】（６） （５）記載のＤＮＡ配列を含んで
なる、プラスミド。
【０３１９】（７） 図６（ｂ）の制限酵素地図で表さ
れる、キャンディダ・ユティリスのｒＲＮＡ遺伝子群を
含んでなる、約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片およびその部
分ＤＮＡ配列。
【０３２０】（８） （７）記載の約１３．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片を反復して含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３２１】（９） （７）記載のＤＮＡ配列を含んで
なる、プラスミド。
【０３２２】（１０） サッカロミセス・セレビシエ酵
母のｕｒａ３変異を相補する、キャンディダ・ユティリ
ス由来のオルチジン−５´−フォスフェートデカルボキ
シラーゼ（ＵＲＡ３）蛋白質をコードする遺伝子配列を
含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３２３】（１１） キャンディダ・ユティリス由来
のＵＲＡ３蛋白質が図１０および図１１に記載のアミノ
酸配列（配列番号：４）である、（１０）記載のＤＮＡ
配列。
【０３２４】（１２） 図９に記載の塩基配列（配列番
号：３）、またはサッカロミセス・セレビシエ酵母のｕ
ｒａ３変異を相補する機能を保持するその部分配列を含
んでなる、（１１）記載のＤＮＡ配列。
【０３２５】（１３） （１２）記載のＤＮＡ配列を含
んでなる、プラスミド。
【０３２６】（１４） キャンディダ・ユティリスのホ
スホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子プロモータ
ー配列。
【０３２７】（１５） 図３に記載の塩基配列（配列番
号：２）のうち少なくとも９４６番〜１３４６番までの
配列を有する配列、またはＰＧＫ遺伝子プロモーター活
性を有するその部分配列を含んでなる、（１４）記載の
ＰＧＫ遺伝子プロモーター配列。
【０３２８】（１６） キャンディダ・ユティリスのＰ
ＧＫ遺伝子ターミネーター配列。
【０３２９】（１７） 図２に記載の塩基配列（配列番
号：１）、またはＰＧＫ遺伝子ターミネーター活性を有
するその部分配列を含んでなる、（１６）記載のＰＧＫ
遺伝子ターミネーター配列。
【０３３０】（１８） （１４）または（１５）記載の
ＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、（１６）または（１
７）記載のＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列とを含んで
なる、遺伝子発現ユニット。
【０３３１】（１９） （１８）記載の遺伝子発現ユニ
ットを含んでなる、プラスミド。
【０３３２】（２０） プラスミドｐＰＧＫＰＴ３、ｐ
ＰＧＫＰＴ４、またはｐＰＧＫＰＴ５である、（１９）
記載のプラスミド。
【０３３３】（２１） （１４）または（１５）記載の
ＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連
結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３３４】（２２） （１４）または（１５）記載の
ＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連
結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連
結されてなる（１６）または（１７）記載のＰＧＫ遺伝
子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３３５】（２３） キャンディダ・ユティリスのグ
リセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
Ｐ）遺伝子プロモーター配列。
【０３３６】（２４） 図３０に記載の塩基配列（配列
番号：７）、またはＧＡＰ遺伝子プロモーター活性を有
するその部分配列を含んでなる、（２３）記載のＧＡＰ
遺伝子プロモーター配列。
【０３３７】（２５） キャンディダ・ユティリスのＧ
ＡＰ遺伝子ターミネーター配列。
【０３３８】（２６） 図３１に記載の塩基配列（配列
番号：８）、またはＧＡＰ遺伝子ターミネーター活性を
有するその部分配列を含んでなる、（２５）記載のＧＡ
Ｐ遺伝子ターミネーター配列。
【０３３９】（２７） （２３）または（２４）記載の
ＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、（２５）または（２
６）記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列とを含んで
なる、遺伝子発現ユニット。
【０３４０】（２８） （２７）記載の遺伝子発現ユニ
ットを含んでなる、プラスミド。
【０３４１】（２９） プラスミドｐＧＡＰＰＴ１また
はｐＧＡＰＰＴ２である、（２６）記載のプラスミド。
【０３４２】（３０） （２３）または（２４）記載の
ＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連
結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３４３】（３１） （２３）または（２４）記載の
ＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連
結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連
結されてなる（２５）または（２６）記載のＧＡＰ遺伝
子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３４４】（３２） キャンディダ・ユティリスの原
形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子プロモー
ター配列。
【０３４５】（３３） 図３４に記載の塩基（配列配列
番号：９）、またはＰＭＡ遺伝子プロモーター活性を有
するその部分配列を含んでなる、（３２）記載のＰＭＡ
遺伝子プロモーター配列。
【０３４６】（３４） キャンディダ・ユティリスのＰ
ＭＡ遺伝子ターミネーター配列。
【０３４７】（３５） 図３５に記載の塩基配列（配列
番号：１０）、またはＰＭＡ遺伝子ターミネーター活性
を有するその部分配列を含んでなる、（３４）記載のＰ
ＭＡ遺伝子ターミネーター配列。
【０３４８】（３６） （３２）または（３３）記載の
ＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、（３４）または（３
５）記載のＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列とを含んで
なる、遺伝子発現ユニット。
【０３４９】（３７） （３６）記載の遺伝子発現ユニ
ットを含んでなる、プラスミド。
【０３５０】（３８） プラスミドｐＭＡＰＴ１であ
る、（３７）記載のプラスミド。
【０３５１】（３９） （３２）または（３３）記載の
ＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連
結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３５２】（４０） （３２）または（３３）記載の
ＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連
結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連
結されてなる（３４）または（３５）記載のＰＭＡ遺伝
子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３５３】（４１） （２１）、（２２）、（３
０）、（３１）、（３９）、（４０）のいずれか一項記
載のＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換し、該形質転換細
胞を培養して異種遺伝子を発現させることを含んでな
る、異種遺伝子の発現法。
【０３５４】（４２） 宿主細胞が酵母である、（４
１）記載の異種遺伝子の発現法。
【０３５５】（４３） 宿主細胞がキャンディダ・ユテ
ィリスである、（４２）記載の異種遺伝子の発現法。
【０３５６】（４４） キャンディダ・ユティリスの染
色体ＤＮＡと相同な配列（「相同ＤＮＡ配列」）と、形
質転換体選択のためのマーカー遺伝子と、そして場合に
よって異種遺伝子とを含んでなるベクターであって、前
記相同ＤＮＡ配列内において制限酵素切断され直鎖状と
されて、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ
・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、
ベクター。
【０３５７】（４５） 前記マーカー遺伝子と、場合に
よって前記異種遺伝子とを含んだＤＮＡ配列が、その両
端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなり、該相同
ＤＮＡ配列において制限酵素切断され直鎖状とされて、
相同組換えによって前記ＤＮＡ配列をキャンディダ・ユ
ティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、（４
４）記載のベクター。
【０３５８】（４６） 前記相同ＤＮＡ配列が、（１）
〜（５）いずれか一項記載のｒＲＮＡ遺伝子配列または
その一部のＤＮＡ配列を含んでなるものである、（４
４）また（４５）記載のベクター。
【０３５９】（４７） 前記相同ＤＮＡ配列が、（７）
〜（８）いずれか一項記載のＵＲＡ３遺伝子配列または
その一部のＤＮＡ配列を含んでなるもの、である、（４
４）または（４５）記載のベクター。
【０３６０】（４８） 前記相同ＤＮＡ配列が、（１
０）〜（１２）いずれか一項記載のＬ４１遺伝子配列ま
たはその一部のＤＮＡ配列を含んでなるものである、
（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６１】（４９） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＰＧＫ
遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または
（４５）記載のベクター。
【０３６２】（５０） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＧＡＰ
遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または
（４５）記載のベクター。
【０３６３】（５１） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＰＭＡ
遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または
（４５）記載のベクター。
【０３６４】（５２） マーカー遺伝子が薬剤耐性マー
カー遺伝子である、（４４）〜（５１）いずれか一項に
記載のベクター。
【０３６５】（５３） 薬剤耐性マーカー遺伝子がシク
ロヘキシミド耐性を付与する遺伝子である、（５２）記
載のベクター。
【０３６６】（５４） シクロヘキシミド耐性を付与す
る遺伝子がシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子であ
る、（５３）記載のベクター。
【０３６７】（５５） シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１
遺伝子として、（５）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、
（５４）記載のベクター。
【０３６８】（５６） キャンディダ・ユティリスで機
能するプロモーターで発現する薬剤耐性マーカー遺伝子
を含んでなる、（５２）記載のベクター。
【０３６９】（５７） 薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生
物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子である、（５６）記
載のベクター。
【０３７０】（５８） 抗生物質Ｇ４１８耐性を付与す
る遺伝子が、バクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来
のアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ
（ＡＰＴ）遺伝子である、（５７）記載のベクター。
【０３７１】（５９） 薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生
物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子である、
（５６）記載のベクター。
【０３７２】（６０） 抗生物質ハイグロマイシンＢ耐
性を付与する遺伝子が、大腸菌プラスミド由来のハイグ
ロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝
子である、（５９）記載のベクター。
【０３７３】（６１） キャンディダ・ユティリスで機
能するプロモーター配列と、該プロモーター配列により
発現する異種遺伝子を含んでなり、場合によってさらに
ターミネーター配列を含んでなる、（４４）〜（６０）
いずれか一項のベクター。
【０３７４】（６２） プロモーター配列またはターミ
ネーター配列がキャンディダ・ユティリス由来のもので
ある、（６１）記載のベクター。
【０３７５】（６３） プロモーター配列が（１４）、
（１５）、（２３）、（２４）、（３２）、（３３）い
ずれか一項に記載のプロモーター配列であり、ターミネ
ーター配列が（１６）、（１７）、（２５）、（２
６）、（３４）、（３５）いずれか一項に記載のターミ
ネーター配列である、（６２）記載のベクター。
【０３７６】（６４） （４４）〜（６３）いずれか一
項に記載のベクターでキャンディダ・ユティリスを形質
転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択することを
含んでなる、キャンディダ・ユティリスの形質転換法。
【０３７７】（６５） （４４）〜（６３）いずれか一
項記載のベクターのＤＮＡ配列がキャンディダ・ユティ
リスの染色体に保持される、（６４）記載の形質転換
法。
【０３７８】（６６） ベクターＤＮＡ配列がキャンデ
ィダ・ユティリスの染色体に多コピーで導入される、
（６５）記載の形質転換法。
【０３７９】（６７） マーカー遺伝子としてのシクロ
ヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含んでなるベクターを
用いる、（６６）記載の形質転換法。
【０３８０】（６８） ｒＲＮＡ遺伝子配列を含んでな
るベクターを用い、その結果高頻度で形質転換体が得ら
れる、（６７）記載の形質転換法。
【０３８１】（６９） ベクターのマーカー遺伝子がシ
クロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子であるベクターを用
いる（６８）記載の形質転換法。
【０３８２】（７０） ベクターＤＮＡ配列が相同組換
えによって染色体に導入される、（６４）〜（６９）い
ずれか一項記載の形質転換法。
【０３８３】（７１） ベクターＤＮＡ配列がＵＲＡ３
遺伝子座、Ｌ４１遺伝子座、ＰＧＫ遺伝子座、ＧＡＰ遺
伝子座、またはＰＭＡ遺伝子座に保持される（７０）記
載の形質転換法。
【０３８４】（７２） キャンディダ・ユティリスがＡ
ＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９
９５０からなる群から選択されるものである、（６４）
〜（７１）いずれか一項記載の形質転換法。
【０３８５】（７３） 電気パルス法による、（６４）
〜（７２）いずれか一項に記載の形質転換法。
【０３８６】（７４） 電気パルス条件が、菌生存率が
１０〜４０％であり、タイムコンスタントが１０〜２０
ミリ秒である、（７３）記載の形質転換法。
【０３８７】（７５） 自律複製機能を有するＤＮＡ断
片であって、キャンディダ・ユティリス内で、当該ＤＮ
Ａ断片を含むベクターを、染色体外要素であるプラスミ
ドとして保持させ、宿主の形質転換頻度を増加させるこ
とができる、ＤＮＡ断片。
【０３８８】（７６） 前記自律複製ＤＮＡ断片が酵母
由来である、（７５）記載のＤＮＡ断片。
【０３８９】（７７） 前記酵母がキャンディダ・ユテ
ィリスである、（７６）記載のＤＮＡ断片。
【０３９０】（７８） 前記自律複製ＤＮＡ断片が図４
１および４２に記載の塩基配列（配列番号：１１）、ま
たは自律複製機能を有するその部分配列を含んでなる、
ＤＮＡ断片。
【０３９１】（７９） 前記自律複製ＤＮＡ断片が図４
３および４４に記載の塩基配列（配列番号：１２）、ま
たは自律複製機能を有するその部分配列を含んでなる、
ＤＮＡ断片。
【０３９２】（８０） キャンディダ・ユティリスを形
質転換でき、さらに（７５）〜（７９）いずれか一項に
記載のＤＮＡ断片を含んでなり、キャンディダ・ユティ
リス内でプラスミドとして存在し得る、ベクター。
【０３９３】（８１） 選択マーカー遺伝子として（５
６）〜（６０）いずれか一項に記載の薬剤耐性遺伝子を
含んでなる、（８０）記載のベクター。
【０３９４】（８２） キャンディダ・ユティリス酵母
の形質転換法であって、（７５）〜（７９）いずれか一
項に記載の自律複製能を有するＤＮＡ断片および選択マ
ーカー遺伝子を含んでなるプラスミドと、キャンディダ
・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同なＤＮＡ配列（「相
同ＤＮＡ配列」）を両末端に有するＤＮＡ断片とでキャ
ンディダ・ユティリス酵母を同時に形質転換し、該酵母
のうち前記プラスミドによって形質転換された形質転換
体を選択し、さらに相同なＤＮＡ配列を有する断片が染
色体上に組み込まれた形質転換体を選択することからな
る、形質転換法。
【０３９５】（８３） （８２）で得られる形質転換体
を、さらに非選択条件下で培養して前記プラスミドを脱
落させることにより、外来ＤＮＡ断片を含むが、選択マ
ーカー遺伝子を含まない株を選択する方法。
【０３９６】（８４） 前記プラスミドが（８１）記載
のベクターである、（８２）記載の形質転換法。
【０３９７】（８５） 相同ＤＮＡ配列を両末端に有す
るＤＮＡ断片が異種遺伝子を含むものである、（８２）
の形質転換法。
【０３９８】（８６） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列
と、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な
配列（「相同ＤＮＡ配列」）とを含んでなり、かつマー
カー遺伝子を含まないベクターであって、前記異種遺伝
子を含むＤＮＡ配列がその両端において前記相同ＤＮＡ
配列に挟まれてなり、前記相同ＤＮＡ配列において制限
酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって前記
異種遺伝子を含むＤＮＡ配列をキャンディダ・ユティリ
スの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、ベクター。
【０３９９】（８７） 相同ＤＮＡ配列が、（１）〜
（５）いずれか一項に記載のｒＲＮＡ遺伝子配列、
（７）〜（８）いずれか一項に記載のＰＭＡ遺伝子配列
のＵＲＡ３遺伝子配列、（１０）〜（１２）いずれか一
項に記載のＬ４１遺伝子配列、ＰＧＫ遺伝子配列、ＧＡ
Ｐ遺伝子配列、またはＰＭＡ遺伝子配列のうちいずれ
か、またはそれらの部分ＤＮＡ配列から選択される、
（８６）記載のベクター。
【０４００】（８８） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列で
形質転換された、キャンディダ・ユティリス形質転換
体。
【０４０１】（８９） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列が
（４４）〜（６３）いずれか一項に記載のベクターであ
る、（８８）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換
体。
【０４０２】（９０） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列が
（８６）または（８７）記載のベクターである、（８
８）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０３】（９１） 選択マーカー遺伝子を含まな
い、（９０）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換
体。
【０４０４】（９２） キャンディダ・ユティリスがＡ
ＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９
９５０からなる群から選択されるものである、（８８）
〜（９１）いずれか一項に記載のキャンディダ・ユティ
リス形質転換体。
【０４０５】（９３） 異種遺伝子によりコードされる
ペプチドの製造法であって、（８８）〜（９２）いずれ
か一項に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体を
培養し、該培養物から異種遺伝子の発現産物を単離、精
製することを含んでなる、方法。
【０４０６】（９４） 選択マーカー遺伝子として、転
写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性遺伝子
を含んでなり、キャンディダ・ユティリス酵母内で、プ
ラスミドとして存在しうる、（８１）記載のプラスミ
ド。
【０４０７】（９５） 薬剤耐性遺伝子がＧ４１８耐性
を与えるバクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のＡ
ＰＴ遺伝子である、（９４）記載のプラスミド。
【０４０８】（９６） プラスミドｐＰＣＶ２である、
（９５）記載のプラスミド。
【０４０９】（９７） （９４）〜（９６）いずれか一
項に記載のプラスミドの薬剤耐性遺伝子の５’側にＤＮ
Ａの制限酵素部分分解断片をクローン化したＤＮＡライ
ブラリーによって、キャンディダ・ユティリスを形質転
換し、当該薬剤耐性となる形質転換体を選択し、その形
質転換体から回収されるプラスミドＤＮＡからキャンデ
ィダ・ユティリス酵母内で機能する転写プロモーター活
性を有するＤＮＡ断片を単離する、転写プロモーター活
性を有するＤＮＡの単離方法。
【０４１０】（９８） 制限酵素で部分分解されたＤＮ
Ａがキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡであ
る、（９７）記載の方法。
【０４１１】（９９） （９７）または（９８）記載の
方法により単離され得る、キャンディダ・ユティリス酵
母内で転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片。
【０４１２】（１００） ＤＮＡ断片が制限酵素Ａｌｕ
Ｉ、ＨａｅIII 、またはＲｓａＩ、もしくはその組み合
わせの制限酵素分解により染色体から切り出され、かつ
０．８〜１．８ｋｂの長さを有する、（９９）記載のＤ
ＮＡ断片。
【０４１３】（１０１） 図４８に記載の塩基配列（配
列番号：１３）、またはキャンディダ・ユティリス酵母
内で転写プロモーター活性を有するその部分配列を含ん
でなる、ＤＮＡ断片。
【０４１４】（１０２） （９９）〜（１０１）いずれ
か１つに記載のプロモーター配列と、その下流に連結さ
れてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０４１５】（１０３） （１０２）記載のＤＮＡ配列
で宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を培養して
異種遺伝子を発現させることを含んでなる、異種遺伝子
の発現法。
【０４１６】（１０４） 宿主細胞がキャンディダ・ユ
ティリスである、（１０３）記載の異種遺伝子の発現
法。
【０４１７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> Regulatory sequences from Candida utilis yeast <130> 139498 <140> <141> 2002-11-15 <150> JP 529524/1995 <151> 1994-05-25 <160> 37 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 880 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 1 CTGCAAGCTA CTTTGTAATT AAACAAATAA CGGGATTATA TGTCAATATC ATTATGATTA 60 TTTAGGAAAA CATGTAGACC TTACCCGATG CACCTCCACC AACAAGCCAA TTCTGGGTGG 120 GATGGAAGTT ACACACTGCT GGTACGTTGG TCACCAGTGG GTTTGACAAA TGTGCCAGCT 180 GATGACCATC TCGGTCGTAG ACGTCAAAGT ACTTGTTCAT ATTGGCAATG ACAAACTTTT 240 CTTTATCCGG GGTATATTGC TGCCACCTTG CCTTCAAAAT GGATACCCAT CTTCCCGTTT 300 GACAGTTGTG TTTGATACGA TGACTTGGGG TCAAATCACC TTCAATAGCG AAGTTCTTAG 360 GTTTAGTGCT GATGTCCTCA CCAAGATTGA AGATGTTAAC TGTGTCATCG TAACCGTTAC 420 AAACAAGGTC ACCAGATCTA TTCCAATCCA CGATGGAAAC TGACAATCTT GAATCATAGA 480 CGCCAACAGT GTGAAGAGTC TCCAGGTTAT CATCCCATTC ATCCCAATCA CACGTAGTTA 540 CTGTTCTTAG ATCCCAAACC TTCAAAGTTC GATCCAATGA GGCAGTAGCA ATCTGGTTCT 600 TATTCATCGG ATTGGTAGTG AATCCACCAA TCTTTTTATT CGACAATCTC AAAACTTGTC 660 TTCTTGAGTG ATCGCCTGCT CTTAGGTCAA TTCTGCTGAA TTGTCCTTGC ATTGTTGTGT 720 AGTACATTTC ATTGTCGTTG TTGTAATTTA TGTCAGTGAT ACCGACGTCA AAGTCGTTGA 780 TGAATAACTG TGAGGACTTC ATGGAGCGTA GATCAATTGA GCGAATGGAC CCATCATACG 840 ATGCACTGTA GACCTTCGTC GTGTCATTCA TGTTGAATTC <210> 2 <211> 1346 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 2 AAGCTTTTGT CTTTTAGGAG CCTTCTTTTC ACCCTGGCTT TCTTCAGACT CCACGCCTCT 60 CGCCCGTTTG TTGTTGATCT TCTTCTGTTG CTTCTTCGTG AGCTTACCAG TATCCAGATG 120 CGTTGTCAGG GCAAGAGGGT CATGTTCAAG CTCCTCTTTC ACTTTCAGTC CAATACGTTT 180 CCAGGCAGGG ATGTGTTCGC TCATCGTTCC AGACTCGAGT GGTGAAAACT ATGGCAACCT 240 CTACTTCCTT TCCAAACACA CAGCGTGCTT TGTAGTGTGT GCCTAAGAGC TGAATTTTTT 300 TTCCTTCCAT GCTGCGCTGC GATGAGCTCT GCCCGCCCGC AGCCTCGGAG GCTAGCGACG 360 TATAAAAAAG GCCTGTGAAA ATTTTATCCT CCTCCTTAAC GACCCTTCTT TCTCTTCTTC 420 ACATTCAAAA ACTTCAAGCA GCTGTCTCTG TTCCTTTGCT GTGTTCTACC ATTGGATATT 480 CCCATTCCCC GTGGAGAACC GAACTGGAGT CTAGCAGCAT GCGAGATCAA TATTACACGG 540 TTTGAGTCTG ATACGCTTGA GCAGCCATTT TTTGGCTTCT CCTGGTGTGT ATCCAGATAT 600 AGAAGTTCGT ATACATTTCC CATAGCGATT GTAAAATGAT TCTGCAATGG AACCATCCGT 660 AATTGTAGGC CTGCTGAGAT GGCACTCGCA ATGCCTCTGT GTCTGGTTTT TTGCCTTCTC 720 CGTCCATCAG CACCAGTGGC TTCTTAGGGC ATAACGAGAC GGCTCCTTGG TGAAAGATGC 780 CCTGCTCCGT CTGTCTGCCT GTTGCTACAA CCACTGCGTA GTCAGATGAC CCGGTCTGTG 840 TGCTGTGGAA TCACCGGGAG CGAAATTCCG GTTTCGCTGG CAGATGAGCT CATCAACCAC 900 ATCAACTGGA GCAACCTCAC CAGAGGACAC GTAACCTGCC CGGTTGAATT CTGTCAAACC 960 GTACATCACA CAACAACAGC AGCAGCAACA ACAACAACGT CAGTTGTCGT TCGCATGGCG 1020 ACGTTACCTA ACGGCACCAA CATCGTCTCG TCCTCGCCAA TGCCTGTTTC CCCTACCCGG 1080 AGTGGCCCGG CCCACCTGTC GTTCTTTTTT CGTCAATTGT GTCCAGCTGG TGCCATCACC 1140 ATATGTTCAA GTGCGTGGCC TGTACTAGCG CAGTCTGCTG CAGTATAAAA GGGATTGCTG 1200 AGGCCCCCTT TAGCGTTTCC AATTAACAAT TGATTCCCTT TTCCCCATAG TCCGTTTGTA 1260 CTACATCCTA CATAACAAAA GTGAGTGTTA CAAGACAAGT GTGGCGGTCA ATTGGATCAT 1320 TTGGACTAAC ATACTGGCGG ATAAAG <210> 3 <211> 2330 <212> DNA <213> Candida utilis <220> <221> CDS <222> (1259)..(2059) <400> 3 AAGCTTATGG AGGAGATTGG GAAGATTGAA CGAGGTGAGA TGGACACGTT GCTGATTGAC 60 GAGATCGGCA AGAAGGAGGC ACCTGTGGTG AAACCACTTA CACCCGACGT GGATAGTAAT 120 GTAACAGGGG AACCGACTGG ACATAGTTCT ACGACACCAC CACCGGTGGA ACAGGACTCG 180 AGCACAACCA CGAGGAAGAG AGCACAAGAC GATGGTGAGG AAAACACAAG GAAGAAGCCC 240 AAGGTTGAGG CAGAGAAAAA GGCAGAGCAA GAGGCAGAGA AAGAGGCAGA GAAAGAGGCA 300 GAGAAAGAGG CAGAGCAAGA GGCAGAGAAA GAGGCTCCGC GTGCAGTGCC GAACAAGAGA 360 CTACAACACA TTGCTACTCC TCTCATCGAG AGCATCTCGT CATACAAGTA CGCCTCAGCG 420 TTTCTACACC CTGTTAACGA GTCCAGTGCA CCCAACTATT ACTCTCTGAT CAAGAAACCA 480 AGGGATCTGA AGACCATCAA ACAGATGGTC AAGGACGGAC GTATACAGAC CAATCTTGAG 540 CTGGAGAGGG AGATCTTGCT GATGTTTGCC AATGCCATCA TGTACAACAA GACCGGGACG 600 GATATCTACG AGTGGACCAA GGAGATGCAG CCGGAAGTTG ACAAGCTCAT CGAGCTGTTT 660 AACGAGAGTA AATAGGATAC AGGCTAGAGA TCAAAAGAAG AATAGAAACA GCTCGATAAA 720 ACGGTATTGT AAGTGGTATG TACAAAGGGG TGTGTCTTGC TCAACGTCTT TGCATCTGCT 780 GAGTCAAAGC AGCGTTCTGC TCTTGGAATC TAAGACCGAC TCTTTCCGAA TGCTTGAGGA 840 ACTTTTCAGA GCACTTCAAC ACACAGGATT CCTCCTTTGA TGATAGCTTT TCAGAGGTGA 900 AGTCGTTGAC ACAGTCGCTG AAACAACGCT CAACGAGGTT GGAATAAAGA CGCATAAAGT 960 CCTTCATCTG CTTCTGCTCA ACAAGCTGCT GGAACTGCTG CTGCTCTTTT GGGTTCAATT 1020 GGTCCATCCT TGCTACTTTT CCGCCTAGTT TCGATTCCGA TTCTGATAGA GAAGCCCAGC 1080 TATGAATGGA AGAAATTTTT CACTTTTGTA TGTCCTTTTT TTCACGCTTC GTTGCTTCGG 1140 ACAAAAAAAT AGTGGAGGCA CTCGGTGGAG GGAAGCTATC CTCGAGATGA AAAATTTCAA 1200 GCTCATCTCA TCGTCCAAGT GGGACAGCAA GCTGAGGCTT CTGAAGAGGT TGAGGAAA 1258 ATG GTC ACC ACG TTA TCG TAC ACA GAG AGG GCA TCG CAG CAC CCT TCG 1306 Met Val Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser Gln His Pro Ser 1 5 10 15 CCA CTT GCT AAG CGT CTG TTT TCG CTT ATG GAG TCC AAG AAG ACG AAC 1354 Pro Leu Ala Lys Arg Leu Phe Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn 20 25 30 CTG TGT GCC AGT GTC GAT GTT CGT ACC ACA GAG GAG TTG CTC AAG CTC 1402 Leu Cys Ala Ser Val Asp Val Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu 35 40 45 GTT GAT ACG CTT GGT CCT TAT ATC TGT CTG TTG AAG ACG CAT ATT GAT 1450 Val Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Ile Cys Leu Leu Lys Thr His Ile Asp 50 55 60 ATC ATT GAT GAC TTC TCT ATG GAG TCT ACT GTG GCT CCA CTG TTG GAG 1498 Ile Ile Asp Asp Phe Ser Met Glu Ser Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu 65 70 75 80 CTT TCA AAG AAG CAC AAT TTC CTC ATC TTT GAG GAC CGT AAG TTT GCT 1548 Leu Ser Lys Lys His Asn Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala 85 90 95 GAT ATC GGC AAC ACC GTC AAG GCA CAG TAC GCC GGT GGT GCG TTC AAG 1594 Asp Ile Gly Asn Thr Val Lys Ala Gln Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys 100 105 110 ATT GCG CAA TGG GCA GAT ATC ACC AAC GCC CAC GGT GTC ACC GGT GCA 1642 Ile Ala Gln Trp Ala Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Ala 115 120 125 GGT ATC GTC AAG GGG TTG AAG GAG GCT GCA CAG GAA ACC ACG GAT GAG 1690 Gly Ile Val Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gln Glu Thr Thr Asp Glu 130 135 140 145 CCA AGA GGG CTG TTG ATG CTT GCG GAG CTG AGC TCC AAG GGC TCC TTG 1738 Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Leu 150 155 160 GCC CAC GGG ACA TAT ACC GAG GAG ACC GTG GAG ATT GCC AAA ACT GAT 1786 Ala His Gly Thr Tyr Thr Glu Glu Thr Val Glu Ile Ala Lys Thr Asp 165 170 175 AAG GAC TTT TGT ATT GGA TTC ATC GCA CAG AGA GAC ATG GGT GGC AGA 1834 Lys Asp Phe Cys Ile Gly Phe Ile Ala Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg 180 185 190 GAA GAT GGG TTC GAC TGG ATC ATC ATG ACA CCA GGC GTG GGA CTC GAC 1882 Glu Asp Gly Phe Asp Trp Ile Ile Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp 195 200 205 GAT AAG GGC GAC TCC CTG GGC CAA CAG TAC AGA ACT GTC GAT GAG GTT 1930 Asp Lys Gly Asp Ser Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val 210 215 220 225 GTC AGT GGT GGC TCT GAC ATC ATC ATC GTT GGT AGA GGC TTG TTT GGA 1978 Val Ser Gly Gly Ser Asp Ile Ile Ile Val Gly Arg Gly Leu Phe Gly 230 235 240 AAG GGA AGA GAT CCA ACA GTG GAA GGT GAG CGT TAT AGA AAA GCA GGC 2026 Lys Gly Arg Asp Pro Thr Val Glu Gly Glu Arg Tyr Arg Lys Ala Gly 245 250 255 TGG GAT GCT TAT CTC AAG AGA TGC TCA GCT CAA 2059 Trp Asp Ala Tyr Leu Lys Arg Cys Ser Ala Gln 260 265 T AAGCGTTGAG CTCTGGCTTG TATAGGTTCA CTTGTATAAA 2100 ATGTTCATTA CTGTTTTCGG AAGTTGTAGA TTGCCATTTT TGCGCAAATT GACGCCAGTC 2160 TTTTTTTGCG CCAAATGTCA GTTTTTTTGC GCCAAAATTT ACTTCATCTT ATACAACTGC 2220 AAAAACCATC CAATCCAATC CAGAAAGGAC TGATCAATGG TGGTGATTGA CTCAAGTTCT 2280 GATGCTACAC AACAGACAGA GCTCTCTAAA AAGAATTCGA TATCAAGCTT <210> 4 <211> 267 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 4 Met Val Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser Gln His Pro Ser 1 5 10 15 Pro Leu Ala Lys Arg Leu Phe Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn 20 25 30 Leu Cys Ala Ser Val Asp Val Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu 35 40 45 Val Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Ile Cys Leu Leu Lys Thr His Ile Asp 50 55 60 Ile Ile Asp Asp Phe Ser Met Glu Ser Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu 65 70 75 80 Leu Ser Lys Lys His Asn Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala 85 90 95 Asp Ile Gly Asn Thr Val Lys Ala Gln Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys 100 105 110 Ile Ala Gln Trp Ala Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Ala 115 120 125 Gly Ile Val Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gln Glu Thr Thr Asp Glu 130 135 140 145 Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Leu 150 155 160 Ala His Gly Thr Tyr Thr Glu Glu Thr Val Glu Ile Ala Lys Thr Asp 165 170 175 Lys Asp Phe Cys Ile Gly Phe Ile Ala Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg 180 185 190 Glu Asp Gly Phe Asp Trp Ile Ile Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp 195 200 205 Asp Lys Gly Asp Ser Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val 210 215 220 225 Val Ser Gly Gly Ser Asp Ile Ile Ile Val Gly Arg Gly Leu Phe Gly 230 235 240 Lys Gly Arg Asp Pro Thr Val Glu Gly Glu Arg Tyr Arg Lys Ala Gly 245 250 255 Trp Asp Ala Tyr Leu Lys Arg Cys Ser Ala Gln 260 265 <210> 5 <211> 2086 <212> DNA <213> Candida utilis <220> <221> CDS <222> (1111)..(1114) <220> <221> CDS <222> (1484)..(1795) <400> 5 GGATCCAATC GTTGAAAGTG ATCAAGCTGA TTACAAAAGT AAGTATGAAA AGAGCCAATG 60 TTGAGAGTCT CAGGAACCAC ATCGACTTCT TCGTGCCATC CTCCCACATT CTGAAGCCCA 120 AGAACCCACA AATCATCAAA CACCAACACG ATGCGGACGC CAACCCGAGT TGTAACGCCA 180 CAAAGTACGG GTACGACCCT GTTCCAGGAG GGCTCACGCC GCAATCAACA ACCAAAGTCG 240 CCACGATCAA CGCCAGTATC AAGTAAAAGA AGAATAGCAT CTCCAGTCTT CCGATAGCTG 300 TGTACTTCGA TCTGACGTTG TAGATGATGA TGATCATGAT CACGAGGGCA CCAATGTTGA 360 CAAAGGCGTT ACCAATCTGG AATATCACGG TATTGGCAAC GTCTATCGGA CGGGCGTAGC 420 ACTCAGGGAT GATCCCTTCG TTCAGGTGCG TGAACTGCTC GTTCGTCGTT GCCTTCACAA 480 CCTGGCACAA CGGGAGCGGC GTGTTGTGGC ATAGCGAGTT GAAATCACCG AATGCCATTG 540 TGTTTTATCG TTAGGGAGAC CTGTTTGAAG CTGACAGCGG GATGAAGATG AGGAAGGAGA 600 GCACAACAGC TGAGCGGAAG TCTCTGTGAT GCTTGGTGGA CCGGGTGTAG GTGGAATCTC 660 CCTGGTGAGC GTACTTGCAA CGGTGCTCAG CGACTTCTTC TCGAGAGGAA ACGTAAACAA 720 AGAGGTTTCA ATGTTGATGT TGATGTGTAT TTTTGTTACA AAAGCAGAAA TTGTAAACAA 780 AAAGGTATAA TTAGGGCTCT GGTGTAATGA TGGGCACGTG ACGTTACCGT GCTGGTCGAT 840 TTTAGGGCTA TTGGTTCGCG TCCCGCTGGT GTCCGGGTTA GCGTGTCAAT GTGGCGCCTC 900 CCGATTATTA CATAAGAAAA CACCCACCCA CGCAACACCT GGTGTCTGGA TGTTGACGCT 960 TTGTATGCGT GTGTGTGTTT TTTCTTCCGT CTTGTTGGGC CACTCTGCGC GAGCGTTGGC 1020 GACTCACCGG TGAAATTTAT CGAAAACTTT CAGGCTCAGG CCCTTTTCAA CACTACCCTT 1080 TGAGATCACA TCAAGCAGTA ATCAAACACA 1110 ATG G GTATGT GGGAAACGAC 1130 Met Val 1 GACGTGTGCG GTGTGTGAAT GCCATTAGTG GGATATGTGG TAGTCTCGAG CGTGGATATT 1190 ATCGATAGGG ATGGTGCTTG TTCTATACGT CTTGCTGGGA AGGAAGAAAG CGATGAAGTA 1250 TGTGGGAAGA AGGGGTGGTT TAAGAGAGGA AGTAGACATG TAACAAGTGT GTTCAGAGAA 1310 CAAGGACGGA AATATCACCT ATATGACGTA CACATCACGA ACTGCTCCTG GAGGAAGCGA 1370 CAAGATGAAT ATCAACAGGC ATCATCATAT CTCTACAATG GCTCGTTCCC AAAGCACACG 1430 CACAAACAAA TCCGAGACTT TTGTACTAAC AGCTGTATCT CTGACAAATA G TT AAC 1486 Asn GTT CCA AAG ACC AGA AGA ACC TAC TGT AAG GGT AAG GAG TGC AGA AAG 1534 Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Tyr Cys Lys Gly Lys Glu Cys Arg Lys 5 10 15 CAC ACT CAA CAC AAG GTT ACC CAG TAC AAG GCT GGT AAG GCT TCC CTC 1582 His Thr Gln His Lys Val Thr Gln Tyr Lys Ala Gly Lys Ala Ser Leu 20 25 30 35 TTT GCC CAG GGT AAG CGT CGT TAT GAC CGT AAG CAA TCC GGT TAC GGT 1630 Phe Ala Gln Gly Lys Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gln Ser Gly Tyr Gly 40 45 50 GGT CAA ACC AAG CCA GTT TTC CAC AAA AAG GCT AAA ACC ACC AAG AAG 1678 Gly Gln Thr Lys Pro Val Phe His Lys Lys Ala Lys Thr Thr Lys Lys 55 60 65 GTT GTT TTG CGT TTG GAG TGT GTT GTC TGC AAG ACC AAG GCC CAA TTG 1726 Val Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Val Cys Lys Thr Lys Ala Gln Leu 70 75 80 GCT TTG AAG CGT TGT AAG CAC TTC GAG TTG GGT GGT GAC AAG AAG CAA 1774 Ala Leu Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp Lys Lys Gln 85 90 95 AAG GGT CAA GCT TTG CAA TTC TAAGCTTAAGACAAT TGTTGAAAGT TTTATTATTA 1830 Lys Gly Gln Ala Leu Gln Phe 100 105 TCACTACACT GTGTTTTTGA TGTCATCTAA TGTAAAAGCG TTTATATTAC CACTTGGTTC 1890 GGTATCCTGT AGAAGAATAC GGCCTGTAGC GTAGCATTCC CACAGGAGGA TCACAGCAAC 1950 ATAGACCAAA CAATGTCACG CACGGGGATC GAACGCGGAA CCAAACCTCT CCCTCCTCCC 2010 CCTTTCACCG CGGTTATTTT GTTATGGGCA CACACAGGGG AAGGAAAAAA ATGCACACAC 2070 GCACAAAAGC GAGCTC <210> 6 <211> 106 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 6 Met Val Asn Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Tyr Cys Lys Gly Lys Glu 1 5 10 15 Cys Arg Lys His Thr Gln His Lys Val Thr Gln Tyr Lys Ala Gly Lys 20 25 30 Ala Ser Leu Phe Ala Gln Gly Lys Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gln Ser 35 40 45 Gly Tyr Gly Gly Gln Thr Lys Pro Val Phe His Lys Lys Ala Lys Thr 50 55 60 Thr Lys Lys Val Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Val Cys Lys Thr Lys 65 70 75 80 Ala Gln Leu Ala Leu Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp 85 90 95 Lys Lys Gln Lys Gly Gln Ala Leu Gln Phe 100 105 <210> 7 <211> 975 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 7 AAGCTTACAG CGAGCACTCA AATCTGCCCT CCGAGCCCTC CGGCCCTCTC TTCAACAAAC 60 TCGCGCTGCA CTTCGTCGTC AGTGGTGCCA ATCACCCAAC GTGGAGGTAT CAAGAGGTGC 120 TCCAGCCCAC AAAGCGACAT CAAAGACAAC AACCCTGCCG GCCTACGTCC TACACACCCT 180 GGTGATCGCA GACATTGTAC AAGGTGCCAC GCAATAACCT ACAGGCACCG CACATGACGA 240 TGGCCTTGGT TGTGCAACCA GTGACTTCCA CGGTCCACGC AGCAACATGA ACCACACCAC 300 CCAGAATCGA TGCGCGCAAC AACAGTTGTT CCGGTTCACT CAGCCCCACA GCGAGTCGCT 360 GGCAGAACAC GAGCCTGAGG GCGGAAAGAG GGTAGAGGAA AGCGCAAGGA CAGGGGACAA 420 CCTGGCCCAA TTGATGTCAT ATAAACCCTC TCGATCAATT GAGCACACTC ATCCGCCAAT 480 TGACCCCTGT TCGCAGCTCC ACGCCCCATG TTCCTCGTCC CTGGTGTAGC TTCTCCCCTA 540 AATTCCAGCG CTTGGTTCCG CCCTCCCTGT CTCCCGGGTT TAACGAACGT GTGTACCATC 600 TGATGGTAAT CCGCTCCCGT CCGCGCAACA CAACTCACAA GCAGATCACA CCTGTACACG 660 CCGCTGCTGA TGCGCCCAAT TTAATTTTTT TTCTCTCAAT GTAGGGGAGA AGCCTTGGGA 720 GCTCCCGACT CCCAGTTGGG CACAGCTGCC ACCTCATGAC TTTTCCTGTG TGTGCCTGTC 780 TGACGTTACG TGTGATGTAG TGGCCCCCGT TCGGTGTGTT TTCGCCTGTT GCGCTGTGCC 840 CCCCTTAAAA GTATAAAAGG AAGTGCAATT GCTGTTTGTG TTGATTGTTG ATCCTTGTTT 900 CCTCTGTTTC CTCCTCATCA CACAAGAAAG GTTTCTTCTT TCCAACAGAT ACAAAACACA 960 CTTACAAACA ACATA <210> 8 <211> 802 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 8 ATTGTATGAC TTTTATTTAT GGGATTACGT TATAAATTAT GATCCTCATG GATTATCTTA 60 TTAAGTCTCC ATCTTGTAGC TTGTAATATG ATGAACACTC GTGAGTTTTC CAGGTAATTC 120 ACCGTGCCTC GTCCATGCAC TTTTATCAGC CTCGACGTCA TACATTGCAT GGTGAGTAAC 180 TGGAAAACGG CTTTTTACGT TCTGTTGTAT ATGGCTAAAC GCTTCTATGG CACGGCGCTA 240 TTAACCTGTC TGACATTTCA ACCTGGTGTT GATGGCTTAA ACGATAATAC GGTGAGATAT 300 ATAGCTAACA GAATGGGGGT GACGCACTGA TTCCACTGTA TATATAGGCG ATATGTGTTG 360 TTGGATGGAC GTTTCTTTGT CTCCTGATCC ACAATAGTAG CTCAGCTCCG TGCCAACTGG 420 TTCGCTGGTA CGATAGTGAG GGATGAATGA AACCTTTTCG TTTTCTTCTG CGCTTCCACG 480 GAACTGTGTA GATTTCTCTC GTGAATAGCG AGTTAAGCCA CGAGTGGGGT CTGCAATTGA 540 AGGTGTGATA CCAGAGTCAA AAGTTTGGAT GTGATGGAAA CTTCAAAGGC TTCTCGGTGG 600 TATATCAAAC GATTCACAGA GGTAGAAGCG GATCTTGAAG GCCAGAATAT GCATTAAAAC 660 CAGCGTATAT CAGTTTTGCT TTCCCAGAGA GGACTTTTGC ATTATTCTTC AGCTTTATCC 720 CTGGATTTTG GGAGATGAAA CATTGACAAA GCTGGTTCGT GATCCTAAAT ACTTGCCTAC 780 TGACTCCTGA GGTATTACAC GT <210> 9 <211> 599 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 9 TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCG 60 GTGTTTTGGG CAGTGGGACC AAATCGATGC CCATGTTGTT TTTTTGTATT TTCGCAACTT 120 TTTCCCCATT CGGTCATACC GAAGGCGGTT CAAGCCTGCA AGAGACAACA ACTATGGCTG 180 CTGTTCTTGG AATGAAAATA AACGCATTTG GAAGTTTTGC AGCCAAAACA GGATGCGTTT 240 TCGCCATTTC GGTGCGGCAT TTCCGGTTTC AGATTTTCGC GAAATTTGTT TTTCCCATCA 300 AATCTGCAAA TTTCGGAAAC GGGCCGCGCT GATTGGCTGC GTCCTGAAGC GGCAATTTTT 360 CTCCCTCTCG TTTGTTGATA CAACCAAGAA TTTCTTTTCG TGCTCTGCGC CAGCGCTATC 420 CAAATGTTTA TAAATCTTGA TGTGATTTCC CGTTTTCTGT CCTTGCTCAT TCTGTCTCTC 480 TGTTGAACCA TTGTTGTTTT ACGAACTCAA GGTCCAATTG GAACAGTATG TGCACTGCCA 540 ATGGAGCATT GAAAGGGTTA TTCGATGTCG TCACCACGTG ATACTAACCA TTGATATAG <210> 10 <211> 1188 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 10 GCCGCTAATA CCCCTTAGGT TTTCGTTTCA TACATAGAGT GGTTGTTGTT TAACATTTTA 60 TCGTGATTAA TTTTTAATCG AGTAATATAT TATTGGAAAA GTTTTTAGAC TTTGAAGCGT 120 AGTATCGGTG GCTTTGCGGA GCTTAGCGCT GTGTCCTTTC TCCGTTGTTT ATGGAGTGTT 180 GATGTTTTGT GATTTACAGC GATGTCCGGG TTTTTGTGTA CACGCTGCCC TTGAACCAAA 240 AAAAAAGCTG CTGGGAATCG ATCGAGGGAA AAAACATCAC CAAAAAAAAA ACAAACAGCA 300 GAAAGTAAAC AAACAACATT ACAAACAACA ACATCACACA GCGGCACGCT TTAAACCAGG 360 GCGGTAGTGA CGTGACTTGC TTGTTTTCGA TCAGCGAGTG CGGTGTTATC GATATCTTCG 420 AATCTGCTTA TAGTTCAAGA ACGCCTGGAT CCCAAGCGTA GTGAAGTGTT CTCTTTTGTT 480 TACTTTCTGT TTTGTATATT AGTTCGGAAC CCATTAGAAA AGGTTCATCT CTGAGATAAA 540 GAGCAAAGAC GCACGAGACA ATCAATCATT TGAGATGGGA TCAGTATCAG CGGAGAGTGC 600 TGATAAGATT GAGGAGAACA GAGCAACTGG GGCTTGTTTG GACATTCTCT CACCACCAAA 660 GCCTTCGTCA ACGTCCACAC CACCTACAGC GACTGCTGGT GCCATTGGCG GGTCTGGTAA 720 TGAAACCAGT GACAGCTTCA ATCCTTTTGA GAAGGACTCA CTGGATGAAT CTGCTTCGGT 780 GTTATCCACA AAGCAACTGC TTGCTGAGGG ACAGGGATCA AATGCCCTGC CATCTGAACT 840 CGTTGATATC AACTTGGCGA TTAGCGCTCT TAACTTGGAC TTTGACGGTC AAAAACGTGG 900 ACAAACTACA GCCACTACAG AGCCAGTAGG TGTTTTGAAA GATGGTGCCG AACCTAGTGC 960 TACAGGATCA GACGACCACC CGCCACCAGC TCTGTATCCA CCAGGTATGA TCCCACAGCA 1020 CATGCCATTT TTCCCGCTAA ACGAATTTGG ACAGCCAATG CATGCACCAT TCCCTGGAGA 1080 CCATCCACAT AGTCCAATCC CGTGGGATTC CAAACCTGGA CAGACTCCTT TTGGTTTAAT 1140 GGGATCTCAT GGCCCAAATA TGGATGGGTT ACGCTCACAA ATGGTACC <210> 11 <211> 1921 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 11 GATCATGTTT CGTACAAAAC ACCGCCACTC CGTTATGAGA AAGTCATAGT TATATTTCGG 60 GGAAACTTAT GTTGCTTGCA AGGAATAATA GACAGACAAA TGTTTTACGA AACTGAAGGA 120 TTAATACAAT TGATGCAAAA AAACAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAACA 180 AAAACACAAA AACACAAAGA AAAAAAACAC AAAGAAAAAA AACACAGAAC ATCCAAAACA 240 AAACAACAAT ATATATATAT TTGCTAATAC CATCACCCTC CCTCATACAA AAAAAAAAAG 300 AAAATGGAAG GAGCACGTAT ATCTTTTCTA TGATCTTTGG ATATGGAATA GATAAGCAAC 360 CCCTCTAGTG AAGTACACAT CAAGATACTT GGGGAGCAAA CTGAGAGCAC ATGATATACA 420 CGAAAGCCAC CATATATCAT ATATAAAAAT ATGAAACATG AAAAGTTATT CATCTGTTGG 480 ATTCACTTTT ATATGTTTTC ATGCATTGTC TACTCTATGC CTCTGTCTTT TCTCTGTTCC 540 TTTACACTCC TCTATTATCA AATTGAGTGT TTCATTTATC AAAGAAGTTT GAGCTGGATC 600 AGAACTTTAG ATATTCATTC CTGTTTTCGA TATATCTATA CGATGTTCTA ATATCCACTC 660 TCACTACCAT TGTTAAAAAA AGTTAAAATT ATAGCTGTGT GCCTTAAGGG AATAAAGGAA 720 ATGGATCTTT TGAATGTTAA AAAACGAGAT ACTCTTTTGT AAACCAGAAA ACGATTTTCA 780 AAACACAAAT TGGTGAATGT CACCAAGCAA AAATTGTATC CTAAAAAAAA TAAATTTATG 840 AACTAAATTA TCTCTGAACA GACATTTAGT CAACCTTTTC TCCTTGCTCC TCGGTCAAAG 900 GTTTTTCGTA TAGATATATA TACGGGTTGC TTTTTTGTTT CCACTCGTCT AATCGAGTTT 960 CGATATCAAT GGAGATTTAT TCTTTGGCTT TGATTCCATA ATAATCCATA TCCTAATAAA 1020 ACACTTTGAA GCGAATTGAA ACCCCAATAT CTTTCTGGCC ATTAAAACAT TTATAAAGTA 1080 CTGGATGTTT AAAGAGCTTT GAGAATTGCC TAGCTTCAAA ATATATTTGT CTCCAATTAT 1140 GATTTTGTAT TTTCCTTTCT TTGTTTTCTG TAGTTATTTA AAATAAGTTC ACTACGTTGT 1200 TTTTTGAGGA ACCGTTACTC TATTTACTCA AATTTATTAT CAAAATGTTT TTTTTTCGTT 1260 TGATTTATTC AAATGCTGTC GATATGTCCC AGAAATATCA TACAATTCAA ATTTCTAAAG 1320 CCAGCGTTTA TTATAAAGCT TTGAGTTCTT TCGACTTAAT TACATGTATG TAGCTCAAAC 1380 CAAAGTTACT CTATAATTAT AAAAAGACTA TGAACCAATT CAAGAATTCC CCATTTCCAG 1440 CAAATTTAGT ATAGCTCAAA TTCACACTGT CATATGCAAA AACCTAAATA AGCAGATCAT 1500 TGTAAAGAGC CGGCAGTTGT ATATTCCAGT GGGGCTGAAC TTGTGGTTAG GATTCACAGA 1560 CATCTTGTTG TCGGATTTCT ATTGATAGAA GCTGTGCCAT TGAAAATGGA AATATAAAAT 1620 GGTATTGGGT TGATCATATA TGAATTTCTT ATTACTCATA ATAATAGGAG AAATCATCGA 1680 ACATGGAACA TAGATGCTAA TTAAGGTACG TACAGCATCC TGTTCAATAT TTCAACTTTT 1740 TAAGTATTAA ATTAGTGAAG AAATGTATTA TGAACCATTG TTCAATAATT CTAATGTGTT 1800 TTTTGTGGTT TTTTTTTTGG CTTTTGGGAC ATTGTAATTT TTACTCATTT ATTCGATGTC 1860 TCTTCAGGTT TTTGTGTTTT TTTTTTTTGT GTTTAAATCT TCGCGGAATT GAGATAAGAT 1920 C 1921 <210> 12 <211> 1798 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 12 AAGCTTATAG AATTTGAAGA TATAAAAACA CAACAAAGCT ATGAAAGCAA TGAGGGGACG 60 ATTTGATGAA CAGAAGGAGC TATTCCCATT AATTTAATAT CTACCAATAG ATATGTCAGT 120 CAAACATGTC AGAAGTCATA CTCACTAATT ATATGAGCGG GTGCGTTAGA TATTTATATG 180 AGTTTGCATC TTTCTACATG GGGCTTTCAA GTAACTGGAA GTAATACAAC TTTTGTTTAA 240 GTTGATAAAA ACAAAAAACA AAAAAACAAA AAACAAAAAA ACAAAAATAA AAAAAAAAAA 300 AAACAAAAAA AAAAAAACAC ACACGCACAC ACACACATAT ACAAACACAT ACAAAAAACT 360 TATCATAATT AAGATAAATG AAAGCTATCT AAAATTTCCA GACATTTTCT GAAAAAGTGG 420 CTGCCAGCTT TATTGCTTTG CTTTAAATTT ATAAAGAAAA CTTCTTTGAA ATCGAATATG 480 AAACAAGAGG AAACGGATGA AAGGATAAAA CACAAATACA GGAAAACATT ATTACAAATA 540 AAGCACCTGT AAGAGATAAA TTTGTTACAT TTAAAGGATT CTACTTACAT ATACAGAGAA 600 AGCAATTTCA TAGACATAGG GTCTACCGAA CAGTCTTGAT ATTTCAGACT AGTATTTTTG 660 TTGTATTATG GGGCTTGGTC GGTATGTTAG TAAAAAGTTC ATTTTAAAAT TTTCCAAGAA 720 GTGTTTTTAT TGCAGAAAAA TATCCGTGGT TCAAGAGATA ATGGGCTGTA AATTTGTTTT 780 GTACCAAAAA TATCTTAATT AATACAAAGA ATACCTTTTA TGAAGGTAGA TCAAGATCTT 840 AAATTTCATT ACTCAGAAAT GAATATACTT GAAACTTCCG AAATACTATG TTATGGGGAA 900 CAAATAAGAG GAGCCATTTC ATATTTATTT TGGAAAGATC GTTTTCTATG CGCAGTTGTT 960 GGAATAGCGA TATTATCATG ACCTTATATT CAGTCAGAGA AAATAGGGTA CGAATTTGAA 1020 AACAATGTTT CAGCTTCAAA GAGGACCTTT AAACGGTCAG GCAAAAGTTG AGGTGTCAGT 1080 GTGTATAAAA ATGTTCAATT CATTTTTGGT TGAAAGATGC TTTAAAAGGT TGGTGCAAAG 1140 AATCATATAT GTGTATTGGC TAGTTAAAAG TTGCTTTATT AAAAATATAT GCAAACTAAA 1200 TTGTCTATAC GATTGATAAG GTGAAACTTA GATAAACAAT GAAAAAGGAA GGTGCTTTGA 1260 AAACCGACCA GCTTCAAATA AATATGTAAC TATTTTTATG GATGTGAAAA TTAAATGTTG 1320 TCGAATCTGC TGTTTCTAGA TTTGTAGATG AAAATGTTGA CGTGAGAGTT TTCATTTGTT 1380 TGTATTTTAT ATTATGCTTT GATTACTACT CATAGCTTGG GTTTAGCATG GCCTGAGTAA 1440 GTAGGAAGAT CCAATAAATT GACTGTTGTC GTTTTGAAAT TAAATACTGA AATGAATAAA 1500 AGTTTGACGA GAAAAGACCT GAAATATATA AAAATGTTTT GTATTATTTA AGTCGGTTAC 1560 ATTCTCTCAC TTTATTGTAA CAACCATTAT AGTGATGGGG AAAAAATAAA ACATAAGCCA 1620 CATAAGGAGA TATTGTTCTT TATTGAAAGG ATGGAATCAT TTTCTGGAAA TGTCAAAAAT 1680 TAAATATTAC TTGGTTTTTG ATGAATTGTA GAAGAAAAAG TAAATGCTGC TATTCTCTTT 1740 CTTTACATTT TCCATGTTTC CTGATTCTGG CTATGTCACT TTAAGTTGTT GAGATATC 1798 <210> 13 <211> 1054 <212> DNA <213> Candida utilis <400> 13 CCACATTTGT TGTACGAGAA GGGCCAACGA CAGCTCTCTT CGAGGAAGAC TTGGAGATAA 60 GCCTTGCTTG ATTTGTAATC TTCAAGAGAG AGCTCTTTGT AGCTTGTCTT GTTGAGTGTC 120 TGAGAAGCAT TTGTGCAATG AATATGGGAG AGATGAGATG AGTAGAGAGC AGCACAAGTG 180 GAATCAAATC ACAATAACAA CTTTAGCCAC AGGGAGGTTA AAAGAGGAGA AGAAGGAGTC 240 CTTTCCAATT GTGGCTAGTG CAGAAGAGAA AATTTGCTTG CTACAATCGT GGTGTGTATG 300 CAAACCCGTT GTAAAGGTGG TGTCTTTGTA TATGTAGGGT GTGTGGCTTC GTCTCGAGAA 360 AGCACATAAG CTGTGGCGCA CTTTCTCGGG TAAGTGATTT AATTGCACGT GATCTCAATT 420 TCTTTTTTTG AAGCCACTAA AGCTTACGTA AGCGACCACG GATCTGGTGT TGGGATGTTT 480 TGGTTTTGGG AGGGGCAGGG GGTTTACATG TTGGCTTTAT CGATTGCGGC GCTTTGTGTT 540 TGGGGGTGTA TGCCCTAGCG ACCCTGTGGG CCACTGCCCA GGTGCCCAGG TGCGACCAGG 600 AAAAAAATTT CTTCATCGCT AGAGCTTTCT TCAACCCCCT TTCTTTCCTA ATTCTTTTCA 660 ACTAACAACA AATAAACACA GTAACAAGAT GTCATCTGAC CTTTCAGACG TTAGACTCTT 720 TGTCAGACCA CTTCCATTCG ATGTTAACGA AGAGGACTTG AAGAGCTTCT TCTCCCCTAT 780 TGGTGAAATC ACCGATTTCA TCGTTGCTAG AGGTTATGCC TTTGTTGAAT ACGCTAATGC 840 AGATTTGGCA AGACAAGCCA TCGCTGAATT GCACCAAAAG CCGTTCGGTG ATGTTCCATT 900 ATCCTTGGAG TACGCTAAGG CTCAAAAGCC AAGATTCAGA CTTCTTGTTT CTAACATGCC 960 AGAAGGTGCT GAGTGGCAAG ATCTGAAAGA TTTTGCTCTC CAAAAGGGAT TCGAAGTTAC 1020 CTACGCCAAC GTTTTCCAAA GAGAGAACAA CGGT <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 14 ggtcgacata tcgtggtaag cgccttgtca 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 15 ttctagactt tatccgccag tatgttagtc 30 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 16 gggtacctaa ctgcaagcta ctttgtaatt aac 33 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 17 ggaattcaac atgaatgaca cgacgaaggt 30 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 18 agcggccgct 10 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 19 accactatta ccactacggt ttgctctaca 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 20 gacacatctc tgagcagcat gacttggttg 30 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 21 ctagatggta gg 12 <210> 22 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 22 ccggatccgg 10 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 23 ccaagcttac agcgagcact caaatctgcc c 31 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 24 cctctagata tgttgtttgt aagtgtgttt tgtatc 36 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 25 gggatccatt gtatgacttt tatttatggg 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 26 ggactagtga gatgactcta ggcatcttct 30 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 27 atgactgata catcatcctc ttcatc 26 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 28 taacgacagc tggcaaaccg actgggac 28 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 29 ggcggccgca attaaccctc actaaaggga acga 34 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 30 ttctagacta tatcaatggt tagtatcacg tg 32 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 31 ccggtaccta agccgctaat acccc 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 32 gggcggccgc actcgctgat cgaaa 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 33 ggtctagata tgaaaaagcc tgaac 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 34 ggagatctat tcctttgccc tcgga 25 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 35 caagttgatc cttctccgga 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 36 gaaacttctc gacagacgtc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 37 catcgggtaa ggtctacatg 20
【図面の簡単な説明】
【図１】ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子
を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定
のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモーター、タ
ーミネーター各断片の取得法を示す図である。
【図２】ＰＧＫ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片
の塩基配列を表す図である。
【図３】ＰＧＫ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片の
塩基配列を表す図である。
【図４】ＰＧＫ遺伝子プロモーター、およびターミネー
ターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明図
である。
【図５】リボソームＤＮＡを含むプラスミドの制限酵素
地図である。
【図６】リボソームＤＮＡの構造と、ＤＮＡ塩基配列決
定のストラテジーおよびサブクローニングされたプラス
ミドの構造を表す図であって、図６（ａ）はプラスミド
ｐＣＲＥ１、ｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、ｐ
ＣＲＸ２、ｐＣＲＸ３、およびｐＣＲＸ４プラスミドの
構造を表し、図６（ｂ）はキャンディダ・ユティリスの
リボソームＤＮＡを含んだ約１３．５ｋｂのＤＮＡフラ
グメントの制限酵素地図である。
【図７】ＵＲＡ３遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地
図と、それらプラスミドのサッカロマイセス・セレビシ
エｕｒａ３−変異の相補能を表す図である。
【図８】ＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定のストラ
テジーと、制限酵素地図である。
【図９】ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を
表す図である。
【図１０】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列から推定されるア
ミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列を
表す図である。
【図１１】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列から推定されるア
ミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列で
あって、図１０の続きの配列を表す図である。
【図１２】Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地
図と、ＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーを示す図であ
る。
【図１３】Ｌ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を
表す図である。
【図１４】Ｌ４１遺伝子の塩基配列から推定されるアミ
ノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列を表
す図である。
【図１５】プラスミドｐＣＬＢＳ１０、およびｐＣＬＢ
Ｓ１２の構築の説明図である。
【図１６】プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＥ３、ｐ
ＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２の構築を表す図であ
る。
【図１７】さまざまな電気パルス条件でのＡＴＣＣ９９
５０生菌率、および形質転換体数を調べた結果を表す図
である。
【図１８】プラスミドｐＣＬＲＥ２によって形質転換さ
れたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティン
グ解析の結果を表す電気泳動図である。
【図１９】プラスミドｐＣＬＲＥ２によって形質転換さ
れたＡＴＣＣ９２２６株、ＡＴＣＣ９２５６株、および
ＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解
析の結果を表す電気泳動図である。
【図２０】プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐ
ＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７の構築を表す図であ
る。
【図２１】プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐ
ＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７によって形質転換され
たＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング
解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２２】プラスミドｐＣＬＵＲＡ１によって形質転換
されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティ
ング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２３】プラスミドｐＣＬＳＴＡ１、およびｐＣＬＲ
ＳＴＡ１の構築の説明図である。
【図２４】プラスミドｐＣＬＲＳＴＡ１により形質転換
されたＡＴＣＣ９９５０株の培養上清をＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表わす電気泳
動図である。
【図２５】プラスミドｐＣＬＬＡＣ１、およびｐＣＬＲ
ＬＡＣ１の構築の説明図である。
【図２６】プラスミドｐＣＬＡＰＨ１、およびｐＣＬＲ
ＡＰＨ１の構築の説明図である。
【図２７】異なる薬剤耐性マーカー（ＣＹＨｒ：シクロ
ヘキシミド耐性、Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８耐性）により選
択されたプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１によるＡＴＣＣ９
９５０株形質転換体のＤＮＡのサザンブロッティング解
析の結果を表す電気泳動図である。
【図２８】プラスミドｐＣＲＥ８、ｐＣＲＡＰＨ２、ｐ
ＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ４、ｐＣＲＡＰＨ５、およ
びｐＣＲＡＰＨ６の構造を示した図である。
【図２９】グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地
図とＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー、およびＰＣＲ
によるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を
示す図である。
【図３０】ＧＡＰ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片
の塩基配列を表す図である。
【図３１】ＧＡＰ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断
片の塩基配列を表す図である。
【図３２】ＧＡＰ遺伝子プロモーター、およびターミネ
ーターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明
図である。
【図３３】原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺
伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列
決定のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモータ
ー、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
【図３４】ＰＭＡ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片
の塩基配列を表す図である。
【図３５】ＰＭＡ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断
片の塩基配列を表す図である。
【図３６】ＰＭＡ遺伝子プロモーター、およびターミネ
ーターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明
図である。
【図３７】ＡＲＳを含むＤＮＡ断片のクローニングベク
ターｐＧＫＡＰＨ２の構造を示す図である。
【図３８】ＡＲＳを含むプラスミド６種類の挿入ＤＮＡ
断片の制限酵素地図を示した図である。
【図３９】プラスミドｐＣＡＲＳ６とその挿入ＤＮＡ断
片がサブクローン化された４種類のプラスミドの挿入Ｄ
ＮＡ断片の制限酵素地図を示した図である。
【図４０】プラスミドｐＣＡＲＳ７とその挿入ＤＮＡ断
片がサブクローン化された５種類のプラスミドの挿入Ｄ
ＮＡ断片の制限酵素地図を示した図である。
【図４１】プラスミドｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断
片の塩基配列を表す図である。
【図４２】プラスミドｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断
片の塩基配列を表す図であって、図４１の続きの配列を
表す図である。
【図４３】プラスミドｐＣＡＲＳ７−６の挿入ＤＮＡ断
片の塩基配列を表す図である。
【図４４】プラスミドｐＣＡＲＳ７−６の挿入ＤＮＡ断
片の塩基配列を表す図であって、図４３の続きの配列を
表す図である。
【図４５】プラスミドｐＣＡＲＳ６あるいはｐＣＡＲＳ
７によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡ
（１）あるいはプラスミドｐＣＬＡＣ１によって形質転
換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡ（２）のサザンブ
ロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図４６】ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、
ＡＴＣＣ９２５６株、ＫＰ−２０５９Ｐ株、そしてＳ２
８８Ｃ株のＤＮＡについてＣＵＡＲＳ１（１）、ＣＵＡ
ＲＳ２｛（２）および（３）｝をプローブとしたサザン
ブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図４７】プロモータークローニングベクターｐＰＣＶ
２の構築の説明図である。
【図４８】プラスミドｐＰＣＲＶ１９のプロモーター活
性を示すＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４９】プラスミドｐＧＫＨＰＴ１の構築の説明図で
ある。
【図５０】共形質転換法により形質転換されたＡＴＣＣ
９９５０株ＤＮＡのＰＣＲ解析の結果を表す電気泳動図
である。
フロントページの続き (72)発明者 三 沢 典 彦 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒 麟麦酒株式会社基盤技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 DA12 EA04 FA02 FA07 GA11 HA20

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】キャンディダ・ユティリスのグリセロアル
    デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子
    プロモーター。
  2. 【請求項２】配列番号：７の塩基配列、またはＧＡＰ遺
    伝子プロモーター活性を有するその部分配列を含んでな
    る、請求項１記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター。
  3. 【請求項３】キャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子
    ターミネーター。
  4. 【請求項４】配列番号：８の塩基配列、またはＧＡＰ遺
    伝子ターミネーター活性を有するその部分配列を含んで
    なる、請求項３記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター。
  5. 【請求項５】請求項１または２記載のＧＡＰ遺伝子プロ
    モーターと、請求項３または４記載のＧＡＰ遺伝子ター
    ミネーターとを含んでなる、遺伝子発現ユニット。
  6. 【請求項６】請求項５記載の遺伝子発現ユニットを含ん
    でなる、プラスミド。
  7. 【請求項７】プラスミドｐＧＡＰＰＴ１またはｐＧＡＰ
    ＰＴ２である、請求項４記載のプラスミド。
  8. 【請求項８】請求項１または２記載のＧＡＰ遺伝子プロ
    モーターと、その下流に連結されてなる異種遺伝子とを
    含んでなる、ＤＮＡ。
  9. 【請求項９】請求項１または２記載のＧＡＰ遺伝子プロ
    モーターと、その下流に連結されてなる異種遺伝子と、
    その異種遺伝子の下流に連結されてなる請求項３または
    ４記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列とを含んでな
    る、ＤＮＡ。
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