JP4158863B2 - 酵母ベクターおよびそれを用いたタンパク質の製造法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、酵母、特にキャンディダ・ユティリス、の染色体上に多コピーで組込まれ、非選択的培養条件下でも安定に保持されるベクターに関する。本発明は、また、そのベクターを用いた異種遺伝子の発現、特に一本鎖モネリンおよびアミラーゼの高発現、に関し、更には一本鎖モネリンを発現する組換え酵母菌体から一本鎖モネリンを分離精製する方法に関する。
背景技術
組換えDNA技術を用いて遺伝子産物を大量に生産するためには、適切な宿主生物の選択が重要であることはもとより、遺伝子の転写量を増やすこと、翻訳効率を高めること、生成したタンパク質の安定性を高めることなど、遺伝子の発現における様々なステップにおいて工夫すべきポイントがある。このうち、遺伝子の転写量を増やして遺伝子産物の高生産を行うためには、強力な転写プロモーターを用いることが必要不可欠であると同時に、転写プロモーター/ターミネーター配列と発現させる遺伝子からなる遺伝子発現ユニットのコピー数を増加させることにより、総和としての転写量を増やすことも重要である。また、それと同時に菌体内に遺伝子発現ユニットを安定に保持することは工業的スケールで物質生産を行うために非常に重要であり、この点でプラスミド型のベクターは不利であり、安定化は一般にベクターを染色体上に組み込むことによってなされる。
近年、プロモーター領域を短縮化して発現量が低下した遺伝子を形質転換用マーカーとしたベクターをribosomal RNA遺伝子(rDNA)領域に組み込むことにより、ベクターを染色体に数10コピー組み込むことが可能であることがキャンディダ・ユティリス以外のいくつかの酵母種において報告されている(Lopes T.S. et al., Gene 79 199-206(1989)、Bergkamp R. J. M. et al., Curr. Genet. 21 365-370(1992)、Le Dall M. T. et al., Curr Genet. 26 38-44(1994))。
しかし、染色体への多コピー組み込みを得るためにはベクターをribosomal RNA遺伝子領域に組込むことが必須であり、その他の遺伝子座に組み込んだ場合にはベクターのコピー数が高くならないことが示されている(Lopes T.S. et al., Gene 105 83-90(1991))。しかも、組み込まれたベクターは染色体上でタンデムに存在するため、それらの繰り返し配列間での組換えにより、導入した遺伝子の脱落が生じることも報告されている(Lopes T.S. et al.,Yeast 12 467-477(1996))。特に、菌体を非選択条件下で培養する場合や菌体の増殖速度が低い場合(例えば、発現産物が菌体内に大量に存在する場合)には、たとえ低頻度であっても染色体上に組み込まれたベクターが組換えによって脱落すれば、培養を続けることによって、ベクターが脱落した菌体の割合が高くなる。従って、組換え体酵母を非選択培養条件下で培養(特に大量培養)する場合には、組み込まれたベクターの安定保持が非常に重要となる。染色体に組み込むベクターDNAの長さを短くすることによって、染色体上に組み込まれた発現ユニットが安定化することが報告されている(Lopes T.S. et al., Yeast 12 467-477(1996))。
ところで、キシロースを始めとするペントースに対する優れた資化性を示すとともに、FDA(Food and Drug Administration)により、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・フラジリスとともに、キャンディダ・ユティリス(Candida utilis)が、食品添加物として安全に使用できる酵母として認められている。最近、キャンディダ・ユティリスにおいて相同組み換えによる形質転換系が開発され、異種タンパク質生産について報告されている(WO/95/32289号)。しかし、染色体上における多コピー導入および発現ユニットの安定化に関しては更なる改善の余地を残すものであった。
タンパク性甘味物質は、低カロリーで安全性が高いタンパク性甘味剤として、食品添加物、あるいは甘味料として食品、医薬品など、さらには動物飼料としても広く用いられることが期待される。タンパク性甘味物質としてはモネリンやタウマチンが知られている。
このうちタウマチンは食物の嗜好性を増加する能力(すなわち、他の風味を高めたり向上する能力)を有するタンパク質であり、植物Thaumatoccocus daniellii Benthの実の仮種皮から抽出されている。しかし、抽出に附する果実を得るのが極めて困難であることから、市販されてはいるものの植物由来のタウマチンの工業的用途は極めて限られている。また、現在まで多くの微生物宿主において、その生産が試みられてきているが、発現は極めて困難であって生産されたタンパク質も甘味を失っていることが報告されている(Zemanek E. C.and Wasserman B. P. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 35 455-466(1995))。
一方、モネリンは熱帯植物Dioscoreophyllum cumminsiiの実に存在する、重量比で砂糖の2000倍以上の甘味を有するタンパク質であり、そのアミノ酸配列も公知である。このタンパク質は非等価な二つのサブユニット(A,B)から構成されており、その三次元構造も明らかにされている(Hudson G. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 71, 212-220(1976)、Ogata C. et al., Nature 328, 739-742(1987)、van der Wel H. FEBS Letters 21, 88-90(1972)、Morris J.A. et al., Biochim. Biophys. Acta. 261, 114-122(1972)、Bohak Z. et. al., Biochim. Biophys. Acta. 427, 153-170(1976)、Frank G. Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 357, 585-592(1976))。天然モネリンの甘味活性は、酸性pHにおいて熱により容易に失活してしまうが、これを解決するために2本鎖からなるモネリンのサブユニットAのN末端とサブユニットBのC末端を連結して一本のポリペプチド鎖とすることにより、甘味を保持し、かつ耐熱性が向上したタンパク質を作製する試みがされている(特公平2−504028号公報、特開平5−70494号公報、Kim S-H. et al., Protein Engineering, 2 571-575(1989))。この優れた性質を持つ一本鎖化モネリンは、低カロリーで安定性が高いタンパク性甘味剤として、一般の甘味料の代替品として食品添加物、あるいは甘味料として食品に用いられることが期待されている。
しかし、モネリンの微生物における大量生産は本発明者らが知る限り報告されていない。
発明の概要
キャンディダ・ユティリスにおいてシクロヘキシミド耐性型L41遺伝子をマーカー遺伝子として用いた場合、相同組み換えによる宿主へのベクターの組み込み数(コピー数)は従来3〜10個程度(最大で20個程度)であるとされている。今般、本発明者らは、マーカー遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを短縮化することによってコピー数が20〜90個まで上昇することを見いだした。
また、キャンディダ・ユティリス以外の酵母におけるコピー数の増加は、組み込みの標的をrDNA配列とした場合にのみ生ずるとされている。また、組み込みの標的をrDNA配列とした場合であっても発現ユニットの脱落が避けられない。本発明者らは、マーカー遺伝子に連結されたプロモーターを短縮することに加えて、染色体DNAと相同な配列がrDNA配列以外の遺伝子座を標的とすることによって、コピー数の更なる増加(標的がrDNA配列である場合を上回る増加)のみならず染色体上の発現ユニットの安定化が図られることを見い出した。
本発明者らは、また、上記ベクターを用いることにより、タンパク質(特に、一本鎖モネリンやアミラーゼ)の大量発現が可能であること、そして一本鎖モネリン生産菌体から得られた抽出液を加熱処理および/または酸処理することによって、酵母由来の夾雑タンパク質の大部分が不溶性化し沈殿するが一本鎖モネリンは溶液中に残ることを見出した。
本発明者らは、更に、好熱菌スルホロバス・ソルファタリカス由来のアミラーゼ遺伝子のキャンディダ・ユティリスでの発現において、この遺伝子のコドン使用頻度がキャンディダ・ユティリスで最も良く発現されているタンパク質の一つであるグリセルアルデヒド-3リン酸脱水素酵素(GAP)の構造遺伝子と大幅に異なること、アミラーゼ遺伝子の配列を改変することによってアミラーゼの発現量が大幅に増大すること等を見いだした。本発明はこれらの知見に基づくものである。
従って、本発明は、酵母染色体上に多コピーで組み込まれるベクターの提供をその目的とする。本発明は、また、酵母染色体上に多コピーで組み込まれ、かつ染色体上の発現ユニットの安定性が改善されたベクターの提供をその目的とする。
本発明は、上記ベクターによる形質転換方法、上記ベクターにより形質転換された宿主、該宿主を培養することによるタンパク質の製造法、および一本鎖モネリンの精製法の提供をその目的とする。
本発明は、更に、ベクターの染色体への組み込み数および安定性を改善する短縮化プロモーター、並びにキャンディダ・ユティリスで高発現するように改変されたアミラーゼ遺伝子の提供をその目的とする。
本発明によるベクターは、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子と、マーカー遺伝子に作動可能に連結された短縮化プロモーター配列と、キャンディダ・ユティリスの染色体DNAと相同な配列(「相同DNA配列」)と、場合により異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子とを含むベクターであって、前記相同DNA配列内または相同DNA配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体DNAに組み込むことができるもの、である。
本発明によるベクターは、また、シクロヘキシミド耐性を与える遺伝子と、異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合によって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列およびターミネーター配列とを含むベクターであって、
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合によりプロモーターおよびターミネーターとを含むDNA配列が、その両端においてシクロヘキシミド耐性を有する遺伝子に挟まれてなり、
シクロヘキシミド耐性を有する遺伝子配列内または該遺伝子配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体DNAに組み込むことができるもの、である。
【図面の簡単な説明】
図1は、リボソームDNAを含むプラスミドの制限酵素地図である。
図2は、リボソームDNAの構造と、DNA塩基配列決定のストラテジーおよびサブクローニングされたプラスミドの構造を表す図であって、図2(a)はプラスミドpCRE1、pCRE2、pCRE3、pCRX1、pCRX2、pCRX3、およびpCRX4プラスミドの構造を表し、図2(b)はキャンディダ・ユティリスのリボソームDNAを含んだ約13.5kbのDNAフラグメントの制限酵素地図である。
図3は、URA3遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図と、それらプラスミドのサッカロマイセス・セレビシエura3−変異の相補能を表す図である。
図4は、URA3遺伝子のDNA塩基配列決定のストラテジーと、制限酵素地図である。
図5は、URA3遺伝子を含むDNA断片の塩基配列を表す図である。
図6は、URA3遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするDNAの塩基配列を表す図である。
図7は、URA3遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするDNAの塩基配列であって、図6の続きの配列を表す図である。
図8は、L41遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図と、DNA塩基配列決定のストラテジーを示す図である。
図9は、L41遺伝子を含むDNA断片の塩基配列を表す図である。
図10は、L41遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするDNAの塩基配列を表す図である。
図11は、プラスミドpCLBS10、およびpCLBS12の構築の説明図である。
図12は、プラスミドpCLRE2、pCLRE3、pCLRX1、およびpCLRX2の構築を表す図である。
図13は、a:プラスミドpCLRE2の構造を示す図である。
b:プラスミドpCLRE11、pCLRE15、pCLRE16、pCLRE17、pCLRE18、pCLRE19のシクロヘキシミド耐性型L41遺伝子プロモーターの5’側末端の位置を示す図である。
図14は、プラスミドpCLRE11、pCLRE15、pCLRE16、pCLRE17による形質転換体のサザン解析の結果(電気泳動写真)と、組み込まれたベクターのコピー数を表す図である。
図15は、プラスミドpCLR215、pCLR216、pCLR217の構築を表す図である。
図16は、プラスミドpCRAL10、pCRAL11の構築を表す図である。
図17は、プラスミドpURAL10、pURAL11の構築を表す図である。
図18は、プラスミドpCL12の構築を表す図である。
図19は、グリセロアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP)遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とDNA塩基配列決定のストラテジー、およびPCRによるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
図20は、プラスミドpCLRM215、pCLRM216、pCLRM217、pRM10、pRM11、pUM10、pUM11の構築を表す図である。
図21は、(1)プラスミドpCLRE4、pCLRM216、pRM11、pUM11によるキャンディダ・ユティリス形質転換体の可溶性タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表す電気泳動写真である。
(2)プラスミドpCTMNY1によるサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体の可溶性タンパク質をSDS−PAGEで分析した結果を表す電気泳動写真である。
図22は、プラスミドpCLRM216、pRM11、pUM11によるキャンディダ・ユティリス形質転換体を50世代培養した後、それらの可溶性タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表す電気泳動写真である。
図23は、プラスミドpUM11によるキャンディダ・ユティリス形質転換体から調製した可溶性タンパク質を熱処理および酸処理したサンプル、またはさらにカラムで精製したサンプルをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表す電気泳動写真である。
図24は、改変アミラーゼ遺伝子のセグメントA−1およびA−2の合成に用いたプライマーを示す図である。
図25は、改変アミラーゼ遺伝子のセグメントA−3およびA−4の合成に用いたプライマーを示す図である。
図26は、改変アミラーゼ遺伝子のセグメントA−5〜A−7の合成に用いたプライマーを示す図である。
図27は、プラスミドpCRAL11UA、pURAL11UA、およびpCL12UAの構築を示す図である。
図28は、プラスミドpCLRE4、pURAL11UAによって形質転換されたキャンディダ・ユティリス形質転換体の可溶性タンパク質をSDS−PAGEで分析した結果を示す電気泳動写真である。+は熱処理をしたサンプル、−は非熱処理サンプルを示す。
図29は、プラスミドpRALGIF2の構築を表わす図である。
発明の具体的説明
短縮化プロモーター
本発明において、「短縮化プロモーター」とは、その5’側において末端が切り取られたプロモーターであって、発現ベクター中においてマーカー遺伝子のプロモーター配列として存在した場合に、マーカー遺伝子の発現量を低下させることによりベクターの形質転換頻度を減少させ、かつ宿主中のベクターのコピー数を増加させるプロモーターをいう。
後記実施例によれば、その5’側を削り取ることによって短縮化したプロモーター配列により発現するマーカー遺伝子を有するベクターは、通常の長さのプロモーターにより発現するマーカー遺伝子を連結したベクターと比較して、マーカー遺伝子の発現量を低下させることによりベクターの形質転換頻度をより減少させるが、形質転換された宿主においてより高コピー数で存在するという特徴を有する。
本発明において、短縮化プロモーターは、キャンディダ・ユティリスにおいて使用可能なマーカー遺伝子に作動可能に連結させうるものから選択できる。
選択されうるプロモーターとしては、例えば、キャンディダ・ユティリスのL41遺伝子、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子、グリセロアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP)遺伝子、または原形質膜プロトンATPase(PMA)遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
プロモーターがL41遺伝子由来である場合には、その短縮化プロモーター配列は、配列番号1のX〜192番のDNA配列を含む。ここで、Xは1〜111のいずれかの整数を表す。配列番号2および3のDNA配列は、配列番号1のDNA配列の5′末端配列を削り取ることにより得られたDNA配列である。
L41遺伝子由来の短縮化プロモーター配列は、新規なDNA配列である。従って、本発明の別の面によれば、配列番号1のX〜192番のDNA配列(ここで、Xは1〜111の整数を表す)並びに配列番号2のDNA配列および配列番号3のDNA配列が提供される。これらの配列は、染色体組み込みベクターの選択マーカー遺伝子のプロモーター配列として有用である。
本発明において、短縮化プロモーターはマーカー遺伝子に作動可能に連結される。場合によってはマーカー遺伝子の下流側にターミネーター配列を連結してもよい。
相同DNA配列
本発明によるベクターは、宿主染色体への相同組み換えのための相同DNA配列を有する。
本発明において、相同DNA配列としては、rDNA配列(ribosomal DNA配列)、URA3遺伝子配列、L41遺伝子配列、PGK遺伝子配列、GAP遺伝子配列、およびPMA遺伝子配列並びにこれらのこれらの一部のDNA配列が挙げられ、キャンディダ・ユティリスの染色体由来であることが好ましい。上記以外のキャンディダ・ユティリスの遺伝子も同様に用いることができる。用いる配列に依存して染色体上の任意の位置に異種遺伝子を組み込むことが可能である。なお、rDNA配列とは、一連のrRNA遺伝子を含む意味で用いられる。
本発明においては、rDNA配列以外のキャンディダ・ユティリスの遺伝子配列を、相同DNA配列として用いることが好ましい。rDNA配列以外の遺伝子配列を用いた場合、ベクターのコピー数が増加するのみならず、染色体上における安定性が著しく向上するため有利である。具体的には、キャンディダ・ユティリス由来のURA3遺伝子配列、L41遺伝子配列、PGK遺伝子配列、GAP遺伝子配列、およびPMA遺伝子配列並びにこれらのこれらの一部のDNA配列が挙げられ、rDNA配列以外のキャンディダ・ユティリスの遺伝子も同様に用いることができる。
このベクターは、例えば、ベクター内の相同DNA配列内の適当な制限酵素サイトでの分解によりベクター(プラスミドDNA)を直鎖状として使用される。その結果、プラスミドDNA断片はキャンディダ・ユティリス染色体に相同組換えにより組み込まれる。
本発明の好ましい態様によれば、このベクター中で、マーカー遺伝子および異種遺伝子を含むDNA配列は、その両端において前記相同DNA配列に挟まれてなる。この態様では、このベクターDNAを相同DNA配列の両端において制限酵素切断し、相同DNA配列をその両端に有するマーカー遺伝子および異種遺伝子を含むDNA断片を得る。こうして得たDNA断片も、また、相同組換えによりキャンディダ・ユティリス染色体DNAに相同組換えにより組み込まれ得るものである。このように相同配列の両端に相当する制限酵素サイトでの分解によってベクターを直鎖状として同様に使用する場合には、プラスミド由来のDNAが染色体に組み込まれない(すなわち、細菌由来の未知の遺伝子産物を生産する可能性がなくなる)ため、安全面から有利である。
なお、本明細書において、「DNA断片(または配列)が、キャンディダ・ユティリス染色体に相同組換えにより組み込まれる」とは、DNA断片がキャンディダ・ユティリス染色体に組み込まれる限りにおいて、その組み込みの態様は限定されないが、少なくとも次の二つの態様を含む意味に用いることとする。
すなわち、(1)キャンディダ・ユティリス染色体のDNA配列と、DNA断片の両端にある相同DNA配列部分とが相同組換えを生じ、開裂部分にDNA断片が”挿入”されて染色体DNAに組み込まれる態様、および(2)キャンディダ・ユティリス染色体のDNA配列と、DNA断片の両端にある相同DNA配列との相同組換えによって、ベクターDNA断片がキャンディダ・ユティリス染色体の一部と”置換”されて染色体DNAに組み込まれる態様のいずれかを少なくとも意味するものとする。(2)の態様においては、挿入されたDNA断片の前後に、ターゲット配列の反復配列が形成されないため、組み込まれたDNA断片が更に安定に染色体に存在することが期待される。
マーカー遺伝子
本発明においてマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であることができる。薬剤耐性遺伝子としては、シクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子(例えば、シクロヘキシミド耐性型改変L41遺伝子)、抗生物質G418耐性を付与する遺伝子(例えば、バクテリアトランスポゾンTn903由来のアミノグリコシド−3’−ホスホトランスフェラーゼ(APT)遺伝子)、抗生物質ハイグロマイシンB耐性を付与する遺伝子(例えば、大腸菌プラスミド由来のハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子)等のようなキャンディダ・ユティリス形質転換株を選択することができる薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
L41遺伝子は、シクロヘキシミド感受性であるリボソームタンパク質L41をコードする。シクロヘキシミド耐性型改変L41は、L41のアミノ酸配列の56番目のProがGlnに置換されたものである。この置換によりL41シクロヘキシミド耐性が付与される(WO/95/32289号)。
さらに、形質転換体の選択マーカーとして利用可能な細菌由来の薬剤耐性遺伝子としては、前記したG418耐性遺伝子およびハイグロマイシンBホスフォトランスフェラーゼ遺伝子のほかに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(クロラムフェニコール耐性)(Hadfield, C. et.al. Gene, 45,149-158(1986))、ブラストサイジンデアミナーゼ(ブラストサイジン耐性)(Izumi, M. et. al. Exp. Cell Res., 197, 229-233(1991))、フレオマイシン耐性遺伝子(Wenzel, T.J.et. al. Yeast, 8, 667-668(1992))などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。この他に、デハイドロフォレートレダクターゼ遺伝子(メトトレキセート耐性)(Miyajima, A. et. al. Mol. Cell Biol. 4, 407-414(1984))や、酵母由来の優性遺伝子スルホメツロンメチル耐性遺伝子(Casey, G.P. et. al. J. Inst. Brew.94, 93-97(1988))、CUP1遺伝子(銅耐性)(Henderson,R.C.A. et. al. Current Genet. 9, 133-138(1985))、CYH2遺伝子(シクロヘキシミド耐性)(Delgado, M. et. al. EBC congress, 23, 281-288(1991))など、公知の薬剤耐性遺伝子も利用できる。
異種遺伝子およびキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子
本発明の一の態様においては、本発明によるベクターに異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子(以下、「構造遺伝子」ということがある)を連結して、この遺伝子等を保持したベクターとすることができる。このベクターによってキャンディダ・ユティリスを形質転換すると、それらの構造遺伝子をキャンディダ・ユティリス染色体に安定に組み込むことが可能である。こうして得られた形質転換体を適当な培地中で培養し、該培養物から構造遺伝子の発現産物を、その発現産物に適した方法で単離、精製することによって、構造遺伝子がコードするタンパク質をキャンディダ・ユティリスで製造することができる。すなわち、キャンディダ・ユティリスにおける構造遺伝子の発現法が提供される。ここで、異種遺伝子とは通常は宿主のキャンディダ・ユティリス染色体上に本来存在しない遺伝子またはその一部のDNAを意味する。
構造遺伝子は、好ましくは、その遺伝子の発現を独立して制御する調節領域と組み合わせるか、または、形質転換の過程で破壊された遺伝子自身の調節領域の影響下にその遺伝子を発現させる。そのような配列はキャンディダ・ユティリスで機能する必要があり、その好ましい具体例としては後記する本発明によるPGK遺伝子、GAP遺伝子、およびPMA遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列が挙げられる。
後記する実施例から明らかなように、本発明により、GAP遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列を用いて、一本鎖モネリン遺伝子、GIF遺伝子、およびアミラーゼ遺伝子のような異種遺伝子の発現に成功した。
また、さらにホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列、グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列、ならびに原形質膜プロトンATPase遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列を用いて、構造遺伝子(例えば、アルブミン、α-またはβグロブリン、ファクターVIII、ファクターIX、フィブロネクチン、α-1−アンチトリプシン、インターロイキン、インターフェロン、G−CSF、GM−CSF、PDGF、EGF、FGF、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インシュリン、ワクチン生産のためのウイルス由来抗原ポリペプチド、免疫抑制活性を有するタンパク質(例えば、グリコシル化阻害タンパク質(GIF))、キモシン、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、およびペクチナーゼ)の発現が行えることは当業者に自明であろう。また、キャンディダ・ユティリスで構造遺伝子を発現することによってキャンディダ・ユティリスの性質を改変できることも当業者に自明であろう。
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子は、キャンディダ・ユティリスで高発現するように改変することもできる。キャンディダ・ユティリスで高発現するような改変は、キャンディダ・ユティリスで最もよく使用されるコドンに合わせて遺伝子配列を最適化することによって行うことができる。例えば、キャンディダ・ユティリスで高発現する遺伝子で用いられるコドンに従って最適化を行うことができる。
改変される遺伝子は、そのコードするアミノ酸の配列を全く変化させることなく、それぞれのアミノ酸をコードするコドンの種類だけを変化させるように合成する。より具体的にはそれぞれの遺伝子に含まれるメチオニン、およびトリプトファンを除いた18アミノ酸について、それらをコードするコドンがキャンディダ・ユティリス由来のグリセルアルデヒド−3リン酸−脱水素酵素(GAP)など発現量の高い遺伝子において高頻度で使用されるコドンを使って合成する。この際、構造遺伝子を数個のセグメントに分割して合成できるように、適切な制限酵素認識部位が構造遺伝子中に約250〜300bpおきに生じるように設計を行なうことが望ましい。
合成遺伝子の作製は、例えば下記のようにして行うことができる。
構造遺伝子を数個のセグメントに分割して合成した後、制限酵素切断部位を利用したライゲーションが可能なように、適切な制限酵素部位が構造遺伝子の中に約180−320bpおきに生じるように塩基配列の設計を行う。設計した遺伝子の塩基配列に従って、2対の50〜100塩基程度の1本鎖オリゴヌクレオチドを常法で合成し、これを鋳型とするPCR法を行い、2本鎖のセグメントを合成する。より具体的には、180bpの2本鎖DNAを合成する場合、2本の100塩基のオリゴヌクレオチドをそれぞれの3’末端側で約20bpの相補鎖を形成するように合成し、これらのオリゴヌクレオチドを鋳型として標準的な条件によりPCR反応を行なうことにより目的の2本鎖DNAが得られる。また、約340bpの2本鎖DNAを合成する場合、上述のようにして得られた2本鎖DNAとそれぞれ3’末端側で約20bpの相補鎖を形成するように合成した100塩基の2本のオリゴヌクレオチドを用いて2回目のPCR反応を行ない、目的とする2本鎖DNAを得る。なお、この最終的に合成された2本鎖DNAの両末端には、特異的な制限酵素部位が存在するように設計しており、さらに制限酵素の消化が容易なように両末端の制限酵素認識部位の外側に2ヌクレオチド程度余分な配列を付加しておくことが好ましい。
改変された異種遺伝子としては、配列番号13のアミラーゼ遺伝子が挙げられる。配列番号13のDNA配列は新規な配列である。従って、本発明の他の面によれば、配列番号13のDNA配列からなるアミラーゼ遺伝子が提供される。このアミラーゼ遺伝子はキャンディダ・ユティリスのような酵母において高発現させることができる(後記実施例参照)。
さらに、本発明によるベクターは、キャンディダ・ユティリス以外の細胞の形質転換に利用することも可能である。キャンディダ・ユティリス以外の細胞を宿主とする場合、形質転換の実施に際して適当なDNA断片を選択するのが好ましい。そのようなDNA断片としては、大腸菌の場合、例えばpBluescriptやpUC19のような細菌のプラスミドDNAが挙げられる。また、サッカロマイセス属酵母の場合、例えばYEp13、YCp50(Methods in Enzymology, 194, p195-230, Academic Press(1991))などの酵母−大腸菌シャトルベクターが挙げられる。
本発明によるベクターの好ましい例としては、
シクロヘキシミド耐性を与えるマーカー遺伝子と、マーカー遺伝子に作動可能に連結された配列番号1のX〜192番(ここでXは1〜111の整数を表す)のDNA配列からなる短縮化プロモーターと、rDNA配列以外のキャンディダ・ユティリスの染色体DNAと相同な配列(「相同DNA配列」)と、異種遺伝子(例えば、キャンディダ・ユティリスにおいて高発現するように改変されていてもよい一本鎖モネリン遺伝子、アミラーゼ遺伝子、およびグリコシル化阻害タンパク質遺伝子)またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合により異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子に作動可能に連結されたキャンディダ・ユティリス由来のプロモーター配列およびターミネーター配列とを含むベクターであって、
相同DNA配列内または相同DNA配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体DNAに組み込むことができるベクターが挙げられる。
更に好ましくは、マーカー遺伝子と、短縮化プロモーターと、異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合によりプロモーターおよびターミネーターとを含むDNA配列が、その両端においてURA3遺伝子に挟まれて存在することができる。
相同DNA配列は、好ましくは、URA3遺伝子配列またはその一部のDNA配列であることができる。
本発明のもう一つの面によれば、
シクロヘキシミド耐性を与える遺伝子と、異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合により異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列およびターミネーター配列とを含むベクターであって、
シクロヘキシミド耐性を有する遺伝子配列内または該遺伝子配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体DNAに組み込むことができるベクターが提供される。
異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子と、場合によってはプロモーターおよびターミネーターとを含むDNA配列は、その両端においてシクロヘキシミド耐性を有する遺伝子の5’末端部分および3’末端部分に挟まれて存在する。このようなベクターがキャンディダ・ユティリスの染色体DNAにタンデムで組み込まれた場合、5’末端部分および3’末端部分に分断されていたシクロヘキシミド耐性を有する遺伝子はその染色体上において一続きとなる。結果としてその形質転換体はシクロヘキシミド耐性を獲得し、形質転換体を選択培地において選抜することができる。上記ベクターのシクロヘキシミド耐性を有する遺伝子は、染色体への組み込みのための「相同DNA配列」として働くだけでなく、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子としても働く。
なお、本発明において「ベクター」とは、細菌由来のプラスミドを含む意味で用いられるものとする。
形質転換
本発明による形質転換体は、キャンディダ・ユティリスのような宿主にベクターDNA(プラスミドDNA)を導入し、そして薬剤耐性となった形質転換体を選択することによって得ることができる。
宿主細胞を細胞外DNAを取り込み可能な状態にする処理方法としては、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびそれらの改変法などの、サッカロマイセス・セレビシエの形質転換に従来用いられている方法が挙げられる。
電気パルス法による場合、菌体を対数増殖期にまで増殖させた後、洗浄して1Mソルビトールに懸濁する。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値(電圧が最大値の約37%にまで減衰するまでの時間)が約10から20ミリ秒であり、パルス後の生菌率が約10−40%となる条件であれば良い。例えば、電気容量が25μF、抵抗値が600〜1000オーム、電圧が3.75〜5KV/cmの条件で、上記のタイムコンスタント値と生菌率が得られ、1μgDNAあたり約500〜1400個の形質転換体が得られる。
また、電気パルスを加えた後、菌液に1Mソルビトールを含むYPD培地を加え30℃で振盪培養することが好ましく、培養せずに菌を直接シクロヘキシミドを含む選択プレートに塗布するとコロニーが得られない場合があることが見出だされた。また、培養時間は4〜6時間程度が適当であり、その後は形質転換体の増殖が無視できなくなる。このほか、DNAと菌体を接触する際にサーモンスパームDNAなどのキャリアDNAを添加することやポリエチレングリコールを添加することなどによって形質転換頻度を高めることも本発明による形質転換系にあっても好ましい。
また、酢酸リチウム法(Ito et al. J. Bacteriol. 153, 163-168(1983))はその簡便さから広くサッカロミセス属酵母の形質転換に用いられており、さまざまな改良法が報告されている。これらの方法を用いてもキャンディダ・ユティリスの形質転換が可能であることが確認された(WO/95/32289号)。特に、エタノールを添加するリチウム法変法(Soni et. al. Current Genet.24,455-459 1993)によってキャンディダ・ユティリスの形質転換が可能である。また、集菌時の菌体密度、リチウムの濃度、ポリエチレングリコールの種類と濃度、キャリアDNAの種類、形態、量など異なる条件を試みることにより、酢酸リチウム法によるキャンディダ・ユティリスの形質転換の至適条件を決定して、形質転換頻度を高めることが可能である。
本発明によるベクターにより形質転換される宿主としては、キャンディダ・ユティリスを含む酵母が挙げられる。キャンディダ・ユティリスの具体的菌株としては、例えばATCC9256(IFO 0626)、ATCC9226(IFO 1086)、ATCC9950(IFO 0988)、IFO 0396、IFO 0619、IFO 0639、KP−2059P株などが挙げられる。
なお、上記のうちATCC9256、ATCC9226、およびATCC9950の3株についてはそれぞれ染色体多型(Stoltenburg et. al. Curr.Genet.22 441-446(1992))が認められたものの、いずれについても形質転換体が得られること、および異種遺伝子が発現されることが確認されている(WO/95/32289号)。このことから、本発明によるベクターがキャンディダ・ユティリス全般について適用可能であることは、当業者にとって容易に推測できるであろう。
タンパク質の製造法
本発明の別の態様によれば、本発明によるベクターによって形質転換されたキャンディダ・ユティリスを培養し、該培養物から構造遺伝子の発現産物を単離、精製することによって、タンパク質を製造することができる。
本発明の更なる態様において、異種遺伝子として一本鎖モネリン遺伝子またはアミラーゼ遺伝子を有する本発明によるベクターによって形質転換されたキャンディダ・ユティリスを培養し、該培養物から一本鎖モネリンやアミラーゼを単離、精製することによって、これらのタンパク質を製造することができる。これら遺伝子は、宿主において高発現されるように改変されていてもよい。
組み込み標的配列をrDNAとした場合、ベクター単独では安定であったが、タンパク質を高発現することによって、約50世代継代培養後には発現量が低下した。一方、URA3遺伝子やL41遺伝子のようなrDNA以外の配列を組み込みの標的としたベクターを導入した宿主は、約50世代培養後においてもベクターの保持率は高く、発現量も高く保持される(後記実施例参照)。
すなわち、URA3遺伝子やL41遺伝子を組み込みターゲットとしたベクターを用いることによって、コピー数のみならず、染色体上に組み込まれた遺伝子の安定性が著しく改善されることが示された。
本発明で高発現に成功した一本鎖モネリンは、天然モネリンと同等の甘味を有し、かつ低pH領域での耐熱性が著しく向上していることが明らかにされている(特開平5-70494号)。この分子においては天然型モネリンのA鎖とB鎖がリンカーとしてのグリシンを介して結合されている。すなわち、一本鎖モネリンは、天然モネリンのサブユニットAのN末端に、共有結合リンカーによって、自らのC末端を通じて天然モネリンのサブユニットBが連結されたものから主としてなり、具体的には配列番号5のアミノ酸配列を含む。
タンパク質の特性がその構成アミノ酸の一部の欠失あるいは置換、別種アミノ酸の付加があっても実質的に保存されることはよく知られており、1本鎖モネリンにおいてもそのような事実が確認されている(特公平2-504028号、特開平5-70494号)。
従って、本発明において「一本鎖モネリン」とは、一本鎖モネリン分子と実質的に等価なアミノ酸配列を有するモネリンを含むものとする。ここで、「実質的に等価なアミノ酸配列」とは、置換、欠失、またはアミノ酸の付加等が生じても、天然モネリンと同等の甘味を有するペプチドを意味する。従って、例えば、配列番号5の50番のGluがAsnに、51番のAsnがGluに、それぞれ置換されたアミノ酸配列(配列番号4のアミノ酸配列)も「実質的に等価なアミノ酸配列」であり、これを含むタンパク質も「一本鎖モネリン」である。なお、本明細書において用語としての「ペプチド」と「タンパク質」は同様の意味において用いられる。
タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、そのアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を選択することができる。従って、「一本鎖モネリン遺伝子」とは、配列番号4に記載のDNA配列や配列番号5に記載のアミノ酸配列をコードするDNA配列に加え、一本鎖モネリンのアミノ酸配列(実質的に等価なアミノ酸配列を含む)をコードするDNA配列であって、縮重関係にあるコドンをDNA配列として有する配列をも意味するものとする。
更に、一本鎖モネリンをコードするDNA配列は、当該酵母での至適アミノ酸コドンを使用すれば、さらなる高発現が可能であることは当業者であれば容易に推測できるであろう。
キャンディダ・ユティリスを含む酵母菌体内で可溶性タンパク質として発現された一本鎖モネリンは、加熱処理または酸処理することによって、簡便に精製することができる。
加熱処理は、他の夾雑タンパク質を効率的に沈殿させるためには、50〜70℃、好ましくは60℃付近で行うことができる。また、酸処理は、他の夾雑タンパク質を効率的に沈殿させるためには、pH5以下、好ましくはpH4〜5の間で行うことができる。上記処理法を実施することによって、モネリンの純度をそれぞれ80%以上にまで高めることができる。
また、上記加熱処理と酸処理とを組み合わせることによってモネリン純度をほぼ100%にまで高めることができる。処理の順序は特に限定されない。
更に、陽イオン交換クロマトグラフィーのような公知の精製手段を単独でまたは上記処理と組み合わせて実施することは当業者に自明のことであろう。
更にまた、一本鎖モネリンの共沈を防止するためには、抽出液のタンパク濃度を10mg/ml以下(好ましくは3mg/ml以下)にすることが好ましい。
可溶性タンパク質を抽出した後、単に熱処理あるいは酸処理、またはそれらの処理を組み合わせることによって、粗精製したモネリンをそのまま食用または飼料用に用いることができる。また、菌体を破砕した後、適切な熱処理を加えるだけで、各種ビタミンや食物繊維に富みそれ自身が優れた食品である酵母菌体と共にモネリンを使用することもできる。
上記方法によればタンパク質の精製工程の時間と費用を節約することができ、とりわけ、動物用飼料として使用する場合において有利である。
実 施 例
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
なお、各種遺伝子の制限酵素地図における制限酵素サイトについては以下の略号で示してある。
Af;Af1II、Ap;ApaI、Asp;Asp718、B;BamHI、Bg;BglII、C;ClaI、E;EcoRI、RV;EcoRV、H;HindIII、Hp;HpaI、K;KpnI、P;PstI、Pv;PvuII、S;SalI、Se;SpeI、Sm;SmaI、Sc;SacI、ScII;SacII、Sp;SphI、X;XbaI、およびXh;XhoIである。
実施例1 キャンディダ・ユティリス染色体DNAの調製
キャンディダ・ユティリス(Candida utilis)の染色体DNA抽出は、以下に示す方法で行った。30mlのYPD培地に、キャンディダ・ユティリスATCC9950株を植菌し、30℃で定常期初期になるまで培養した。遠心分離により菌体を集めて滅菌水で洗浄した後、再度遠心分離により集菌した。菌体は3mlのザイモリアーゼバッファー(0.9Mソルビトール、0.1M EDTA、50mM DTT、pH7.5)に懸濁した後、25mg/mlのザイモリアーゼ100Tを含む0.9Mソルビトールを200μlを加え、37℃で振とう保温した。顕微鏡下でプロトプラスト化を確認した後、遠心分離してプロトプラスト化した菌を回収した。3mlの溶菌バッファー(50mM Tris−HCl、50mM EDTA、pH8.0)を加え、穏やかに、かつ十分に懸濁してから0.3mlの10%SDSを混合し、65℃で一夜保温した。続いて1mlの5M酢酸カリウム液を加え、氷上で1時間放置した。その後遠心分離により凝集物を除き、4mlの冷却したエタノールを加え、遠心分離してDNA等を沈殿させた。沈殿は50%のエタノールで洗浄し、乾燥した後、3mlのRNase A バッファー(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、50μg/ml RNase A、pH7.5)に溶解して、37℃で30分保温した。最後に3mlの2−プロパノールを加え、遠心分離して上清を除いた後、沈殿を50%の2−プロパノールで洗浄し、乾燥させた。この沈殿を0.5mlのTEバッファーに溶解したものをキャンディダ・ユティリス染色体DNA試料とした。
キャンディダ・ユティリス染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した後、0.8M NaCl、20mM Tris−HCl、10mM EDTA(pH8.0)を含む10−50%ショ糖密度勾配に重層して、120,000xg、14時間の遠心分離によりDNA断片を分画した。このうち10〜20kbの染色体DNA断片と、BamHI消化した後脱リン酸化したλファージベクターDASHTMII(Stratagene Cloning Systems)とを、T4DNAリガーゼにより一晩連結した。続いてGigapackII Gold Packaging Extract(Stratagene Cloning Systems)を用いてインビトロパッケージングし、キャンディダ・ユティリス染色体DNAライブラリーを構築した。
実施例2 rRNA遺伝子の単離
実施例1に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られた、キャンディダ・ユティリスATCC9950のゲノムDNAのSau3AI部分消化断片のうち、5〜10kbの分画のDNA断片400ngと、BamHI消化した後脱リン酸化したベクタープラスミドpBR322、200ngとを、T4DNAリガーゼにより一晩連結した。このDNA溶液を用いて大腸菌DH5を形質転換して、キャンディダ・ユティリス染色体DNAライブラリーを完成した。
このうち約10,000コロニーについて、Molecular Cloning 2nd edition Sambrook et. al. p12.21-23, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に従ってフィルターを作製し、サッカロミセス・セレビシエの18S rRNA遺伝子を含む1.8kbのHindIII−EcoRI断片を32P標識し、これをプローブとしてスクリーニングを行った。このプローブとして用いたrDNA断片は、サッカロマイセス・セレビシエS288C[α,suc2,mal,gal2,CUP1]より作製した染色体DNAライブラリーから、5.8S rRNA遺伝子の5′末端の4〜32番目の塩基に対応するオリゴマーを32P標識したものをプローブとして取得したものである(曽根ら、特公平6−14865号公報)。
その結果、200個以上のポジティブクローンが得られた。このうち7個のクローンpCR1、pCR4、pCR5、pCR6、pCR7、pCR8、およびpCR9についてプラスミドの制限酵素地図を作製し、整列させ比較したところ、両端の制限酵素地図が一致した(図1)。このことから、キャンディダ・ユティリスのrRNA遺伝子を含む領域が、約13kbからなる繰り返し構造をとっていることが明らかとなった。
これらのプラスミドより、EcoRIまたはXbaI消化により切り出される断片をpBluescriptSK-にサブクローン化して、プラスミドpCRE1、pCRE2、pCRE3、pCRX1、pCRX2、pCRX3、およびpCRX4を構築した(図2(a))。さらに、これらのプラスミドをさまざまな制限酵素により消化した後、再環状化することにより、各種の欠失プラスミドを構築した。これらプラスミドの挿入断片について図2に矢印で示した領域について塩基配列を決定したところ、18S、5.8S、および25S rRNA遺伝子に高いホモロジーを示す領域が認められ、これによって3つのrRNA遺伝子の存在位置、転写方向などが明らかとなった(図2(b))。
実施例3 オルチジン−5′−フォスフェート デカルボキシラーゼ遺伝子(URA3遺伝子)の単離
実施例1に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られた、キャンディダ・ユティリスATCC9950のゲノムDNAのSau3AI部分消化断片の内、5〜10kbの分画のDNA断片100ngと、BamHI消化した後脱リン酸化したベクタープラスミドYEp13(Methods in Enzymol. 194, 195-230, 1991)100ngとを、T4DNAリガーゼにより一晩連結した。このDNA溶液を用いて大腸菌DH5を形質転換して、染色体DNAライブラリーを作製した。形質転換体よりプラスミド混合物を抽出後、得られたDNAでura3−株であるサッカロマイセス・セレビシエYPH500(αhis3,trp1,leu2,ade2,lys2,ura3)(Stratagene Cloning Systems)を形質転換し、最少培地で生育するウラシル非要求性の形質転換株を選択した。サッカロマイセス・セレビシエ株の形質転換はMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P122 - 123 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY(1990)記載のリチウム法に従った。
この方法により10μgのDNAから、5株のUra+株が得られた。これら形質転換株より、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P130 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY(1990)記載の方法に従いプラスミドDNAを調製した。これで大腸菌を形質転換してプラスミドDNAを回収した。これらのプラスミドDNAのうち、YEp13のBamHI部位に6.1kbのインサートを含むプラスミドpCURA3−3と、8.1kbのインサートを含むpCURA3−5とについて、制限酵素地図を作製した。その地図は図3に示される通りである。
実施例4 URA3遺伝子領域の特定化と塩基配列の決定
URA3遺伝子領域を特定化するために、プラスミドpCURA3−3とpCURA3−5に共通する領域を含む5kbのEcoRI断片を、プラスミドpCURA3−5より切り出し、プラスミドpRS314(Stratagene Cloning Systems)のEcoRI部位に連結して、プラスミドpURAE1を作製した(図3)。このプラスミドでYPH500株をリチウム法により形質転換したところ、高頻度でURA+の形質転換体が得られた。これより、この5kbのEcoRI断片中にURA3遺伝子が存在し、1コピーでサッカロマイセス・セレビシエのura3-変異を相補することが明らかにされた。
次に、プラスミドpURAE1をXhoI、またはPstI消化して、再びT4リガーゼ反応により再環状化することにより、プラスミドpURAE1ΔXho、およびpURAE1ΔPstを得た。
さらにプラスミドpURAE1より切り出された3.5kbのEcoRI−ClaI断片、および2.3kbのHindIII断片を、それぞれプラスミドpRS314のEcoRI−ClaI間、およびHindIII部位に挿入して、プラスミドpURAEC1、およびpURAH1を作製した(図3)。
以上、5種類のプラスミドを用いてYPH500株をリチウム法により形質転換し、ura3-変異の相補能を調べることにより、これらの断片がURA3遺伝子を含むかどうかを調べた。その結果は、図3に示される通りであった。これより、URA3遺伝子をEcoRI−HindIII間の2.3kbに限定することができた。
さらにURA3遺伝子を含む2.3kbのHindIII断片を、プラスミドpBluescript SK-のHindIII部位に連結して、プラスミドpURAH2を作製した。つぎに挿入断片の両側からExoIIIヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、塩基配列を決定した。そのシークエンスストラテジーと塩基配列の解析から明らかにされた制限酵素地図は、図4に示される通りであった。また、得られた2330bpからなるDNA配列は図5に、また推定される267アミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列は図6および図7に示される通りである。
推定されたポリペプチドのアミノ酸配列を他の酵母のURA3蛋白質と比較したところ、サッカロマイセス・セレビシエとでは73.4%、クルイベロマイセス・ラクティスとでは76.3%、キャンディダ・アルビカンスでは75.1%と、高い相同性を示した。
実施例5 L41遺伝子のクローニングとL41遺伝子を含むDNA断片の塩基配列決定
実施例2で作製したライブラリーの約30,000コロニーについて、Molecular Cloning 2nd edition p12.21-23,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に従ってフィルターを作製し、32P標識したキャンディダ・マルトーサのL41遺伝子RIM−Cを含む、1.1kbのXbaI−Sau3AI断片(KAWAI et. al.,J.Bacteriol.,174, 254-262(1992))をプローブとしてスクリーニングを行った。
その結果、5個のポジティブクローンが得られ、このうち3個のクローンpCL41−1、pCL41−2、およびpCL41−5について制限酵素地図を作製し、それを比較したところ、これらのクローンが4kbのEcoRI断片を共有することが示された(図8)。さらにこれらプラスミドDNAのサザンハイブリダイゼーション解析により、キャンディダ・マルトーサのL41遺伝子に相同性を示す領域が、この4kbのEcoRI断片内の1.4kbClaI−PstI断片内にあることが示された。
そこで4kbのEcoRI断片を、pBluescript SK-のEcoRIサイトに挿入し、挿入断片が互いに逆向きのプラスミドpCLE1、およびpCLE2を作製した。この2種のプラスミドについてEcoRI断片内にサイトをもつHindIII、XhoI、ClaIなどによる欠失変異体の作製や、ExoIIIヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体の作製により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、BamHIサイトからSacIサイトまでの2086bpからなるDNA配列を決定した(図9)。
この配列を解析すると、サザン解析によりL41造遺伝子が存在すると推定された領域に367bpのイントロンで分断された318bpからなるオープンリーディングフレームが存在した(図8および図10)。イントロンと推定された領域の5′と3′端および3′端近傍にはイントロンに共通する配列GTATGT--TACTAAC--AGが認められた。また、その位置も報告されている他の酵母由来の6種類のL41遺伝子(KAWAI et. al,J.Bacteriol. 174,254-262(1992)、POZO et. al.,Eur. J. Biochem. 213, 849-857(1993))と同様、開始コドンの直後に存在していた。キャンディダ・ユティリスL41ポリペプチドの推定されるアミノ酸配列を他のいくつかのL41蛋白質と比較したところ、サッカロマイセス・セレビシエL41aとの間では93.4%、キャンディダ・トロピカリスL41との間では89.6%、キャンディダ・マルトーサのL41との間では85.8%と、高い相同性を示した。
実施例6 部位特異的変異法によるシクロヘキシミド耐性型L41遺伝子の作製
シクロヘキシミド耐性を示す酵母のL41蛋白質の56番目のアミノ酸はグルタミンであり、一方、シクロヘキシミド感受性酵母のL41蛋白質においてはこの位置のアミノ酸はプロリンである。そしてこのアミノ酸残基がそのL41蛋白質をもつ酵母のシクロヘキシミドに対する感受性を決定していると報告されている(KAWAI et. al.,J.Bacteriol. 174,254-262(1992))。ここで、シクロヘキシミド感受性であるキャンディダ・ユティリスのL41蛋白質の56番目のアミノ酸はシクロヘキシミド感受性のサッカロマイセスセレビシエと同様にプロリンであった。そこで、部位特異的突然変異導入によりL41遺伝子の56番目のプロリンをコードするコドンをグルタミンコドンに変更することによって、この遺伝子がコードするL41蛋白質をシクロヘキシミド耐性型へと変換し、形質転換の選択マーカーとして利用した。まず、プラスミドpCLE1から得られる2.1kbのBamHI−SacI断片をpUC18のBamHI−SacIサイト間に挿入して、プラスミドpCLBS1を作製した(図11)。
また、プラスミドpCLE1をAflII消化し、クレノウ酵素処理により平滑化した後、さらにXhoI消化することによって得られる0.6kbの断片を、pBluescript SK-のSmaIとXhoI間に挿入して、pCLAX1を作製した。このプラスミドにおいては、0.6kb断片の平滑化されたAflII末端とベクターのSmaI末端とのライゲーションにより、AflII切断部位が再生される。ヘルパーファージを用いてpCLXA1から一本鎖DNAを調製し、合成した変異用オリゴヌクレオチド5′TG TGG AAA ACT TGC TTG GTT TGA3′を用いて、Sculptorインビトロミュータジェネシスキット(Amersham)により、変異プラスミドを作製した。得られた候補プラスミドについて0.6kb挿入断片の全塩基配列を決定し、56番目のプロリンをコードするコドンCCAがグルタミンのコドンCAAに変異され、その他の配列に変異のないプラスミドpCLAX20を得た。
pCLAX20から0.6kbの挿入断片をClaI−AflII断片として切り出し、これと、プラスミドpCLBS1をClaIとAflIIと消化して得られる4.4kbの断片とライゲーションして、変異型L41遺伝子を含むプラスミドpCLBS10を構築した。
また、プラスミドpCLBS10をBamHIとSphIとで消化して、T4DNAポリメラーゼ処理により平滑末端とした後、NotIリンカー(5′AGCGGCCGCT3′)を挿入して、プラスミドpCLBS12を構築した(図11)。
次に、作成した変異型L41遺伝子が酵母にシクロヘキシミド耐性を付与するかどうかを調べた。YEp型ベクターであるYEp13K(Sone et. al.,Appl.Environ. Microbiol. 54, 38-42(1988))のBamHI−SacIサイト間に、プラスミドpCLBS10から得られる2.1kbの変異型L41遺伝子を含むBamHI−SacI断片を挿入して、プラスミドpYECL10を作製した。一方、コントロールとしてpCLBS1から得られる2.1kbの野生型L41遺伝子を含むBamHI−SacI断片をYEp13Kにクローン化したプラスミドpYECL1を作製した。
これらのプラスミドを用いてサッカロミセス酵母YPH500株をMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P122-123 Co1d Spring Harbor Laboratory Press NY(1990)記載の酢酸リチウム法に従って形質転換した。形質転換体として、ロイシン非要求性になった株を選択した。これらの形質転換体についてシクロヘキシミドを含むYPDプレートでの生育を調べたところ、pYECL10を保持する株は、50および100μg/mlのシクロヘキシミドを含むYPDプレートで増殖することが示された。一方、pYECL1を保持する株は同濃度のシクロヘキシミドを含むプレート上ではまったく増殖しなかった。これによって、作成した変異型L41遺伝子がシクロヘキシミド感受性酵母に耐性を付与することが示された。
実施例7 L41遺伝子プロモーターの削り込みによるベクターの多コピー組み込み
(1)プロモーター欠失変異体の取得
実施例6記載のプラスミドpCLBS10(図11)のEcoRIサイトとXbaIサイトに、実施例2で示したプラスミドpCRE2、pCRE3、pCRX1、およびpCRX2(図2)からそれぞれEcoRIまたはXbaIにより切り出される4種類のrDNA断片を挿入して、プラスミドpCLRE2、pCLRE3、pCLRX1、およびpCLRX2を構築した(図12)。部位特異的変異を導入することによってシクロヘキシミド耐性型としたキャンディダ・ユティリスL41遺伝子とキャンディダ・ユティリスribosomal DNA断片とを含むプラスミドpCLRE2の構造を図13aに示す。
このプラスミド5μgをPstIとBamHIによって分解した後、フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりDNAを回収した。DNAを100μlのExoIII緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.0),100mM NaCl,5mM MgCl2,10mM 2−メルカプトエタノール)に溶解し、180ユニットのExoIIIヌクレアーゼを加え、37℃で保温した。1分ごとに10μlをサンプリングし、10μlのMBバッファー(40mM 酢酸ナトリウム,100mM NaCl,2mM ZnCl2,10%グリセロール(pH4.5))の入った氷冷したチューブに移した。得られた10本のチューブを65℃で10分間保温して酵素を失活させた後、5ユニットのマングビーンヌクレアーゼを加えて、37℃で30分間反応した。反応後にアガロースゲル電気泳動により欠失の程度を確認した後、このうち5つの反応液からDNA断片を回収した。回収したDNAはクレノウ酵素で末端を平滑化し、16℃で一晩ライゲーション反応した後、大腸菌を形質転換した。
(2)形質転換と形質転換体の解析
−411のXhoIから+976のSacIまでを含む改変型L41遺伝子を含んだプラスミドと、−1110のBamHIから+976のSacOまでを含む改変型L41遺伝子を含んだプラスミドとを用いて形質転換を行ったところ、形質転換頻度はほとんど同じであった。このことから、L41遺伝子の発現にはプロモーター領域として−411のXhoIサイト(開始コドンATGのAを+1とする)から下流の領域で十分であった。従って、欠失がXhoIサイト付近またはその3’側下流翻訳開始コドン付近にまで及んだ10種類のプラスミドpCLRE11−20を選び、それぞれ約10μgについて、BglIIで分解した後、キャンディダ・ユティリスATCC9950株を形質転換した。pCLRE11−20はpCLRE2の構築に準じて調製された。形質転換は電気パルス法(WO/95/32289号参照)により行った。パルス条件は電気容量を25μF、抵抗値を1000オーム、電圧を5KV/cmとして行った。この結果、シクロヘキシミド耐性L41遺伝子のプロモーター領域の欠失の程度が大きくなることに従って、形質転換頻度が低下することが観察された。具体的には、欠失の程度がほとんど同じpCLRE11、12、13に関しては同程度の形質転換頻度が得られ、pCLRE14ではその約30%、pCLRE15、pCLRE16においては約15%、pCLRE17においては約0.3%に低下することが示され、pCLRE18、19、20に関しては形質転換体は得られなかった。これらのプラスミドのうちpCLRE11、15、16、17、18、19についてL41遺伝子プロモーター領域の5’側末端位置を図13bに矢印で示した。
次に、このうちpCLRE15、16、17とpCLRE11とによって得られた形質転換体、それぞれ4クローンずつに関してDNAを調製してサザン解析を行った。染色体DNAの調製は、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P131-132 Cold Spring Harbor Laboratory Press NYに記載の方法に従った。調製したDNAはHindIIIにより分解し、アガロースゲル電気泳動した後、ハイボンドN+フィルター(Amersham社)にトランスファーして、サザンハイブリダイゼーション用のフィルターを作製した。DNAが固定化されたフィルターは、ハイブリダイゼーション溶液(6×SSC,5×Denhardt溶液,0.2% SDS)中で65℃、2時間プレハイブリダイゼーションを行った。
次に、Megaprime DNA labelling systems(Amersham社)と[α−32P]dCTP(110TBq/mmol)とを用いて標識化したL41遺伝子を含む0.6kbのClaI−HindIII断片をプローブDNAとし、65℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターは1×SSC,0.1%SDS中で、65℃、2時間洗浄した後、オートラジオグラフィーに供してシグナルを検出した。その結果、内在性のL41遺伝子に由来するバンドの他に組み込まれたベクター由来の濃いバンドが認められた。キャンディダ・ユティリスL41遺伝子のコピー数は1細胞あたり2であることは既に示されているので、内在性のL41遺伝子に由来するバンドが2コピーのL41遺伝子に対応するものとして、バンドの強さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザーBAS 2000(FUJI FILM社)を用いて測定した。サザン解析の結果及びコピー数を示したグラフは図14に示した。プロモーター領域を−420まで有するプラスミドpCLRE11のコピー数は、9コピーから14コピーであるのに対し、プロモーター領域が−190(pCLRE15)、−180(pCLRE16)、あるいは−80(pCLRE17)まで削り込まれたプラスミドによる形質転換体それぞれのコピー数は14コピーから30コピー(pCLRE15)、17コピーから42コピー(pCLRE16)、35コピーから90コピー(pCLRE17)であった。以上のようにマーカー遺伝子であるシクロヘキシミド耐性型L41遺伝子のプロモーター領域が短縮化されたいくつかのベクターにおいては形質転換の際に染色体に組み込まれるコピー数が高くなることが示された。
実施例8 染色体多コピー組み込み型ベクターの構築
(1)rRNA遺伝子座をターゲットとしたベクターの構築
プラスミドpCLRE2からApaI分解により得られるribosomal DNAを含む約1.2kbの断片をpBluescriptSK−(Stratagene社)のApaIサイトにクローン化してプラスミドpCRA1を構築した。次にpCRA1をXhoIで分解した後、クレノウ酵素処理により平滑末端とし、SphIリンカー(5’GGCATGCC3’)を付加してpCRA2を作製した。このプラスミドのSphI部位とEcoRI部位との間に、プラスミドpCLRE15、16、17から切り出したL41遺伝子を含むSphI−EcoRI断片をクローン化して、プラスミドpCLR215、216、217を構築した(図15)。
また、pCRA1をAsp718で分解した後、クレノウ処理により平滑末端とし、NotIリンカー(5’AGCGGCCGCT3’)を付加してpCRA3を作製した。このプラスミドをNotIとBglIIで分解することにより、0.5kbと0.7kbのNotI−BglII断片を回収した。一方、pUC19(宝酒造)をHindIIIとEcoRIとで分解した後、クレノウ処理によりそれぞれを平滑末端とした後BglIIリンカー(5’CAGATCTG3’)を連結して構築したプラスミドpUCBglをBglII分解した後、2種類のNotI−BglII断片をクローニングしてpCRA10を構築した(図16)。また、マーカー遺伝子とするシクロヘキシミド耐性型L41遺伝子に関しては、染色体に組み込まれるベクターのコピー数をコントロールするために、プロモーターの長さの異なる2種類の断片をPCRにより取得した。すなわち、−405から+974までの断片と−184から+974までの断片の2種類を取得した(開始コドンATGのAを+1とする)。これらの断片はそれぞれ、10コピー前後の組み込みが得られたpCLRE11と、20〜40コピー程度の組み込みが得られたプラスミドpCLRE16におけるL41遺伝子断片にほぼ一致する。この際、遺伝子の5’側プライマー末端にはPstIサイトを付加し、3’側プライマー末端にはSalIサイトをもつ様にデザインした。PCRに用いたプライマーの配列は、L41遺伝子の5’側プライマーとして、
3’側プライマーとして、
である。
また、鋳型としてはpCLRE2を用いた。2つの増幅断片はTAクローニングキット(Invitrogen社)を用いてプラスミドpT7Blueにクローニングした。構築したそれぞれのプラスミドからこれら2種類の断片をPstI−SalI断片として切り出してpCRA10に連結することにより、長いL41遺伝子断片を含むプラスミドpCRAL10と短いL41遺伝子断片を含むプラスミドpCRAL11とを構築した。
これらのプラスミドpCRAL10とpCRAL11においては組み込みのターゲット配列となるrDNA断片が2分割され、その間にAmp耐性遺伝子を含むpUCプラスミド由来の配列を組み込んだ構造となっている。このベクターは、BglIIサイトで分解してから形質転換に用いるため、形質転換体にはターゲットDNA配列とその間のマーカー遺伝子が組み込まれるが、pUCプラスミド由来のDNA配列は組み込まれない。
(2)URA3遺伝子座をターゲットとしたベクターの構築
キャンディダ・ユティリスのURA3遺伝子配列(実施例4参照)を元にプライマーをデザインし、URA3遺伝子の5’側及び3’側を含む2種類の断片をそれぞれPCRにより取得した。
URA3遺伝子5’側断片としては+4から+354までの断片(開始コドンATGのAを+1とする)を取得した。その際、その5’側プライマー末端にはSalIサイトを付加し、3’側プライマー末端にはBglIIサイトをもつ様にデザインして合成した。プライマーの配列は、
である。
また、URA3遺伝子3’側断片としては+356から+685までの断片を取得した。その際、5’側プライマー末端にはBglIIサイトをもつ様にデザインし、3’側プライマー末端にはAsp718(KpnI)サイトをもつ様にデザインして合成した。プライマーの配列は、
である。
得られた2つの増幅断片はTAクローニングキット(Invitrogen社)を用いてプラスミドpT7Blueにクローニングした。構築した2種類のプラスミドから、URA3遺伝子5’側断片をSalI−BglII断片、URA3遺伝子3’側断片をBglII−Asp718断片としてそれぞれ切り出し、pUC19(宝酒造)のSalIサイトとAsp718サイトとの間に連結してプラスミドpURA1を構築した。このプラスミドにおいては、URA3遺伝子オープンリーディングフレーム内部+355の位置の塩基AがCに変わったことによってBglIIサイトが形成されており、このプラスミドをBglII分解することによってプラスミドを染色体上のURA3遺伝子内に組み込むことが可能になっている。また、pURA1のURA3遺伝子はオープンリーディングフレームの5’側と3’側末端をそれぞれ一部欠失した構造としている。
pURA1をAsp718で分解し、クレノウ酵素処理することにより平滑末端とした後、NotIリンカー(5’AGCGGCCGCT3’)を連結してプラスミドpURA2を構築した。また、pURA1をHindIIIで分解し、クレノウ酵素処理することにより平滑末端とした後、NotIリンカー(5’AGCGGCCGCT3’)を連結してプラスミドpURA3を構築した。さらにpURA2及びpURA3をNotIとBglII分解することにより、それぞれから2種類の約0.35kbのNotI−BglII断片を得て、これらをBglII分解したpUCBglにクローン化してpURA10を構築した(図17)。
さらに、(1)でPCRにより取得したシクロヘキシミド耐性型L41遺伝子を含む長さの異なる2種類のPstI−SalI断片を、pURA10に連結することによって、長いL41遺伝子断片を含むプラスミドpURAL10と短いL41遺伝子断片を含むプラスミドpURAL11とを構築した。
これらのプラスミドpURAL10とpURAL11においては組み込みのターゲット配列となるURA3断片が2分割され、その間にAmp耐性遺伝子を含むpUCプラスミド由来の配列を組み込んだ構造となっている。このベクターは、BglIIサイトで分解してから形質転換に用いるため、形質転換体にはpUCプラスミド由来のDNA配列が組み込まれない。
(3)L41遺伝子座をターゲットとしたベクターの構築
(シクロヘキシミド耐性型)L41遺伝子をターゲットとしたベクターは、以下の様に構築した。(シクロヘキシミド耐性型)L41遺伝子に関しては、−85から+292までの断片約380bpと、+288から+971までの約680bpの2つの断片をPCRにより取得した。5’側断片の5’末端の位置は、pCLRE17における(シクロヘキシミド耐性型)L41遺伝子プロモーターの5’末端とほぼ一致する。この際、−85から+292までの断片については、その5’側にPstIサイトを付加し、3’側については+289のTをGに変更することにより、BglIIサイトを構築した。PCRに用いたプライマーは、
ある。また、+288から+971までの断片については、その3’側にPstIとNotIサイトを付加し、5’側については+289のTをGに変更することにより、BglIIサイトを構築した。PCRに用いたプライマーは、
である。
また、鋳型としてはpCLRE2を用いた。2つの増幅断片はTAクローニングキット(Invitrogen社)を用いてプラスミドpT7Blueにクローニングした。構築したそれぞれのプラスミドからこれら2つの断片をそれぞれ、PstI−BglII断片として切り出した後、BglII分解したpUCBglにクローニングしてpCL12を構築した(図18)。
このプラスミドpCL12においては組み込みのターゲット配列となるL41遺伝子断片が2分割され、その間にAmp耐性遺伝子を含むpUCプラスミド由来の配列を組み込んだ構造となっている。このベクターは、BglIIサイトで分解してから形質転換に用いるため、形質転換体にはターゲットDNA配列とその間の異種遺伝子が組み込まれるが、pUCプラスミド由来のDNA配列は組み込まれないという特徴を有する。また、マーカー遺伝子は、ベクター上でpUCプラスミド由来の配列により分割されているため、このプラスミドが、染色体上にタンデムに組み込まれた場合にのみ、シクロヘキシミド耐性の形質転換体が得られる。
実施例9 モネリン発現プラスミドの構築
(1)グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP)遺伝子のクローニング
キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP)遺伝子のクローニングは、遺伝子ライブラリーとして実施例1で構築したキャンディダ・ユティリス染色体DNAライブラリーを用い、他生物の既知のGAP遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。Molecular Cloning 2nd edition p2. 95-121,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載された方法に従い、上記の遺伝子ライブラリーの約20,000プラークのファージDNAを吸着させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セレビシエのGAP遺伝子を含む2.1kbのHindIII断片を保持するpUC18プラスミド(Yamano et al. Journal of Biotechnology 32, 165- 171(1994))から、GAP遺伝子の大部分を占めるDNA断片として約1kbのAsuII-AflII断片を切り出した。この断片を32P標識して、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果3つの陽性プラークが分離できた。更にこれらプラークの1つのファージDNAについてサブクローニングを行い、このファージDNAに含まれていた6.5kbEcoRI断片を単離し、プラスミドベクターpBluescriptIISK+のEcoRIサイトに組込み、プラスミドpGAP1および2を構築した(図19)。
(2)GAP遺伝子プロモーター/ターミネーターを含むプラスミドの構築
キャンディダ・ユティリスのグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP)遺伝子のプロモーター、ターミネーター断片は、それぞれプラスミドpGAP1を鋳型としてPCRにより取得した。プロモーターとしては、開始コドン上流−976から開始コドン直前−1までの974bpの断片(開始コドンAを+1とする)を以下のプライマーを用いて取得した。
これらプライマーにおいては5’側プライマー末端にNotIサイト、3’側開始コドン直前にXbaIとBamHIサイトをそれぞれ付加して合成した。また、ターミネーターとしては、終止コドン直後+1006から+1728までの723bpの断片を取得した。プライマーとしては、
を用い、5’側終止コドン直後にはBamHIサイト、3’側にPstIサイトを付加して合成した。
得られた2つの増幅断片はTAクローニングキット(Invitrogen社)を用いてpT7Blueにクローニングした。これら2つの断片はそれぞれ、NotI−BamHI断片と、BamHI−PstI断片として取得した後、pBluescriptSK−のNotIとPstI間にクローニングして、プラスミドpGAPPT10を構築した(図20)。
(3)モネリン遺伝子発現プラスミドの構築と形質転換
配列番号4に示したアミノ酸配列に対応する合成DNA配列を含むプラスミドpMNY1から、モネリン遺伝子をDraI−BglII断片として切り出した。pMNY1は、概略すると、配列番号4のアミノ酸配列に対応するDNA断片を化学合成し、pUC18(ファルマシア社)のEcoRIサイトとHindIIIサイトの間に挿入することによって得ることができる(特開平5−70494号公報参照)。また、プラスミドpGAPPT10をXbaIで分解し、クレノウ酵素処理によって平滑末端とした後、さらにBamHIで分解した。この断片と、モネリン遺伝子を含むDraI−BglII断片を連結してプラスミドpGAPM3を構築した(図20)。さらに、実施例2記載のプラスミドpCLR215、216、217、及びpCRAL10、pCRAL11、pURAL10、pURAL11のPstIサイトとNotIサイトの間に、pGAPM3から切り出したNotI−PstI断片を連結してプラスミドpCLRM215、216、217、及びpRM10、pRM11、pUM10、pUM11を構築した(図20)。これら構築したプラスミド7種類をBglIIで分解した後、実施例1に示した電気パルス法によりキャンディダ・ユティリスATCC9950株を形質転換した。その結果、pCLRM215と216、pRM10、pRM11、pUM10、pUM11について形質転換体が得られた。pCLRM217については形質転換体は得られなかった。
実施例10 酵母形質転換体におけるモネリンの発現
pCLRM215と216、pRM10、pRM11、pUM10とpUM11による形質転換体をそれぞれ4株ずつを10mlのYPD培地で24時間振盪培養した。菌体を遠心して集めた後、50mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、1mM DTT、1mM PMSFに懸濁し、グラスビーズで菌体を破砕、15,000×gで10分間遠心することにより菌体と不溶性沈殿を除去することにより、可溶性タンパク質を調製した。調製した可溶性タンパク質は15/25%SDS−PAGEにかけてその発現を調べた。この結果、いずれのプラスミドによってもモネリンに相当する分子量約1万の位置にバンドが認められた。また、低コピー型のpRM10とpUM10による形質転換体での発現量に比較して、高コピー型のpCLRM215と216、pRM11、pUM11による形質転換体での発現量が顕著に高くなっていることが示された。このうちpCLRM216、pRM11、pUM11によるキャンディダ・ユティリス形質転換体2株ずつの全可溶性タンパク質を15/25% SDS−PAGEにより泳動した結果を図21(1)に示した。
また、対照としてrDNA断片とシクロヘキシミド耐性L41遺伝子を含むプラスミドpCLRE4による形質転換体も同様に処理した。pCLRE4は実施例6に記載のプラスミドpCLBS12(図11)のEcoRIサイトに、実施例2に記載のpCRE2(図2)から得られる3.5kbのEcoRI断片を挿入することにより構築した。ゲルは泳動後クマシー染色し、デンシトメーターで乾燥したゲルをスキャンすることにより、全可溶性タンパク質に占めるモネリンの割合を算出した。その結果、pCLRM216、pRM11、pUM11で形質転換されたキャンディダ・ユティリス株においてはいずれも、モネリンが菌体可溶性タンパク質の50%程度蓄積するとともに、バクテリア由来の配列を除去したpUM11やpRM11による形質転換体においてその発現量が高まる傾向が認められた。
一方、酵母サッカロマイセス・セレビシエでのモネリンの発現を調べるために、「GAPプロモーター+モネリン遺伝子+PGKターミネーター」という構成の発現カセットを含み、マーカーとしてTRP1遺伝子、さらに酵母2μmDNA全長をもつプラスミドpCTMNYIにより形質転換された酵母TD4(Saccharomyces cerevisiae S288C(ATCC 26108)の変異株(a,his,ura,leu,trp))(特開平5−70494号参照)を用いた。この形質転換体2株は、ヒスチジン、ウラシル、ロイシンをそれぞれ20μg/ml含んでいるSD培地(0.67% 酵母ナイトロジェンベース(除アミノ酸)、2% ブドウ糖)10ml中、30℃で24時間振盪培養した。また、親株であるTD4は上記培養液にトリプトファンを添加した培地で同様に培養し、可溶性タンパク質を調製後15/25% SDS−PAGEにより泳動した結果を図21(2)に示した。デンシトメーターによる定量により、モネリンは全可溶性タンパク質の約5%発現していると算出された。CTMNYIによるサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体においては、強力なGAPプロモーターを用いて、細胞内に50コピー以上存在するとされるYEp型プラスミドで発現させているにもかかわらず、キャンディダ・ユティリスにおける発現量に比較して圧倒的にモネリンの発現量は低いことが示された。また、大腸菌でTRP遺伝子プロモーター制御下でモネリン遺伝子を発現させた場合、発現量が菌体タンパク質の10%程度であった(特開平5−70494号参照)。以上から、異種タンパク質の発現にとってキャンディダ・ユティリスは好適な宿主であることが明らかにされた。
次に、pCLRM216、pRM11、pUM11によって得られた形質転換体、それぞれ4クローンずつについてDNAを調製してサザン解析を行った。これは、pCLRM216、pRM11によるDNAはPstI+EcoRI、pUM11によるDNAはHindIIIにより分解して、0.6kbのClaI−HindIII L41遺伝子断片をプローブとして解析した。内在性のL41遺伝子由来のバンドが2コピーに対応するものとして、バンドの強さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザーBAS2000(FUJI FILM社)を用いて測定した。その結果、組み込まれたベクターのコピー数は、pCLRM216による形質転換体では10から19コピー、pRM11による形質転換体では12から18コピー、pUM11による形質転換体では17から27コピーと計算された。
また、同じフィルターに対してpUC19をプローブとしてサザン解析を行った結果、pRM11とpUM11による形質転換体においてはバクテリア由来のDNA配列は染色体上に組み込まれていないことが明らかにされた。
また、プラスミドpCLRM216、pRM11、pUM11による形質転換体において組み込まれた遺伝子の安定性を調べるために、それぞれ4株ずつについてYPD液体培地で継代培養を行った。まず、シクロヘキシミドを含むYPDプレート上に生育した菌体を10mlのYPD液体培地に植菌して定常期まで培養した。次に、このうち10μlを10mlのYPD液体培地に植菌して定常期まで培養した。この植え継ぎ操作を4回繰り返すことにより非選択培地で約50世代継代培養を行った。最後の培養液から菌体を集菌後、50mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、1mM DTT、2mM PMSFに懸濁し、グラスビーズで菌体を破砕することにより可溶性タンパク質を調製した。pCLRM216、pRM11、pUM11による形質転換体4株ずつの全可溶性タンパク質を15/25%SDS−PAGEにかけた結果を図22に示した。
この結果から、pCLRM216とpRM11で形質転換された株においては、ばらつきがあるもののいずれもモネリンの発現量が低下していたのに対し、pUM11による形質転換体4株においては顕著な発現量の低下は認められなかった。さらに、50世代培養した培養液を希釈後、YPDプレートと40μg/mlのシクロヘキシミドを含むYPDプレートとにそれぞれ塗布して、30℃で2日間培養後に生じたコロニー数を調べてその比を求めた。この値は、pCLRM216による形質転換体4株ではそれぞれ、0、2.0、2.3、4.0%、pRM11による形質転換体では1.0、1.0、4.7、7.2%、pUM11による形質転換体では97.0、100、40.2、43.5%という結果になり、pUM11の安定性がその他の2つのプラスミドに比較して非常に高いということが示された。染色体上に組み込まれたプラスミドの一部分が脱落しても、シクロヘキシミド感受性となると考えられるため、この比はプラスミド保持率を正確に反映するものではないが、開発したベクターのうち特にpUM11が期待されるコピー数、安定性ともに優れていることが明らかにされた。
実施例11 モネリンの精製
pUM11による形質転換体をYPD培地中30℃で一晩振盪培養し、遠心分離を行い集菌した。湿重量約10gの同菌体(乾燥重量で2gに相当)に0.9M ソルビトール17mlを加え懸濁した後、ザイモリエース100T(生化学工業)6mgを加え37度30分攪拌しながら反応させた。これをフレンチプレスにて処理(1000psi、3回)して菌体を破砕した。遠心分離(10000g 20分)を行ない上清画分を集めた。さらに沈殿画分についてもリン酸ナトリウム緩衝液(10mM リン酸ナトリウム(pH7.0)、100mM NaCl)で3回洗浄し、上清画分を集め、先のものと合わせた。これをフレンチプレス処理試料とした。同様に破砕効果を調べる目的で、湿重量約10gの前記菌体についてリン酸ナトリウム緩衝液(10mM リン酸ナトリウム(pH7.0)、100mM NaCl)40ml、およびグラスビーズ(425〜600microns Sigma社)60mlをダイノミルで冷却しながら15分間粉砕した。この粉砕物から上清を集め、さらに前記緩衝液でグラスビーズをタンパクが抽出されなくなるまで洗い込み、先のものと合わせた。これをダイノミル処理試料とした。フレンチプレス処理とダイノミル処理による試料の両方についてSDS−PAGEでモネリンの抽出効率を比較したところ両者に大きな違いは観察されなかった。
次にモネリンの精製のため、酸処理、熱処理の予備実験を行なった。ダイノミル処理試料はタンパク量濃度1.5mg/mlに希釈した(以下タンパク量の測定は全てBio−Rad社のプロテインアッセイキットを用いてBSAを標準として行なった)。40mM酢酸ナトリウム緩衝液を加えて試料のpHを4、4.5、5.5に調整して4℃約12時間放置することにより酸処理を、あるい試料を50℃、60℃、70℃で10分間保温することにより熱処理を行なった。その結果、pH4および4.5の酸処理、または60℃で10分間の熱処理によってモネリン以外の酵母由来夾雑タンパクが大幅に沈殿することが明らかになった。
また、熱処理は、50℃で10分間では効果がなく、70℃で10分間ではモネリンも他のタンパク質とともに沈殿することが明らかにされた。さらに60℃で10分間の熱処理とpH4の酸処理を組み合わせることにより夾雑タンパクがほぼ100%近く除くことが可能であることが明らかにされた。SDS−PAGEの結果を図23に示す。
以上の実験結果を基にフレンチプレス処理試料を用いてモネリンの精製を行なった。フレンチプレス処理試料についてリン酸ナトリウム緩衝液(10mM リン酸ナトリウム(pH7.0)、100mM NaCl)でタンパク量が約2.0mg/mlとなるように希釈し、60℃で10分間ウォーターバスで熱処理を行なった。沈殿を遠心分離によって除いた後、200mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)を加えて攪拌しながらpH4.5になるように調整し、冷却しながら酸処理を行なった。約1時間処理した後、再度200mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を用いてpH6.0に戻るまでpH調節を行なった。沈殿を遠心分離によって除いた後、上清画分について限外濾過(分子量3000カット)によって濃縮したのち10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で一晩透析した。不溶性画分を遠心分離と0.2ミクロンのフィルター(ミリポア社)によって除去し、同緩衝液で平衡化したCM−Sepharose(ファルマシア社)を充填したカラム(50ml)に吸着させた。非吸着画分を同緩衝液で溶出させた後、NaClの線形勾配(0〜0.4M/150ml)で標的タンパクを得た。この標的タンパクをSDS−PAGEで泳動したところ単一バンドにまで精製されていることが確認された(図23参照)。
また、天然型モネリンの円二色性スペクトル(波長領域190nmから260nm)は、212nm付近に強い負のスペクトル、236nm付近に正のスペクトルを示すが、精製した組換えモネリンは、天然体の円二色性スペクトルとよく一致したスペクトルを示した。
精製1本鎖化モネリン並びに天然モネリン標品を、純水に0.3μg/μl,0.2μg/μl,0.1μg/μl,0.05μg/μl,0.02μg/μlの各濃度になるように溶解し、それぞれ10μlを舌にのせて味わうことにより、甘味活性を評価した。天然体、組換え体ともに、甘味閾値濃度は0.05−0.1μg/μlであり(即ち0.5−1μgタンパク)酵母で生産したモネリンは天然体と同等の比活性を有していた。
実施例12 アミラーゼ遺伝子の合成
スルホロバス・ソルファタリカスKM1株由来アミラーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列(Kobayashi,K et al.,Biosci. Biotech Biochem., 60(10)1720-1723(1996))について、メチオニンとトリプトファン以外のコドンについて、キャンディダ・ユティリスのグリセルアルデヒド−3リン酸脱水素酵素遺伝子のコドンで特に使用頻度の高いコドンを用いてDNA配列に変換した。その際それぞれの遺伝子に含まれる各アミノ酸についてのコドンのばらつきが極力GAPと近いものに、且つ約180〜320塩基ごとに特異的な制限酵素部位が形成され、各遺伝子が数個のセグメントによって構成されるように設計した。形成される制限酵素部位の都合上、マイナーなコドンも一部使用した。さらに構造遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)より1塩基はさんで5’上流側にXbaI認識部位を、また翻訳終止コドンより1塩基はさんで3’下流側にBglII認識部位が形成されるように設計した。以上の点を考慮してスルホロバス・ソルファタリカスKM1株由来アミラーゼ遺伝子はセグメントA-1〜7の7セグメント(配列番号6〜12)によって構成されるように設計した。各セグメントの両端には特異的な制限酵素認識部位が形成されるようにし、また、同制限酵素によって各セグメントが直接消化されるように、末端の制限酵素認識部位の両端にさらに2ヌクレオチドずつ無意味な配列を付加した。各セグメントの合成に用いたプライマーを図24〜26に示す。
各セグメントA−1〜A−7の合成は、以下に示す方法により行った。PCRプロセスはExTaqポリメラーゼ(宝酒造)を用い、dNTPの量をマニュアルの1/10量(dA,dG,dC,dT各20μM)で行ない、94℃ 30秒、72℃90秒25サイクル、あるいは94℃30秒、55〜65℃60秒、72℃60秒25サイクルで行なった。以下遺伝子合成における2本鎖DNA化のPCR反応は全てプライマーの種類と鋳型DNAが異なる以外は同様の条件で行なった。
セグメントA−1(配列番号6)は両端にXbaI、StyI部位を持つ282bpの断片で、これは4本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーA−1−2、A−1C−2を用いてPCRを行なった。このPCRで得られた反応液を鋳型としてプライマーA−1−1、A−1C−1を用いてPCRを行ない282bpの2本鎖DNAを得た。
セグメントA−2(配列番号7)は両端にStyI、AccI部位を有する312bpの断片で、これも4本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーA−2−2、A−2C−2を用いてPCRを行なった。合成された2本鎖DNAを鋳型としてプライマーA−2−1、A−2C−1でPCRを行ない312bpの断片を得た。
セグメントA−3(配列番号8)は両端にAccI、XhoI部位を有する241bpの断片で、これも4本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーA−3−2、A−3C−2を用いてPCRを行なった。合成された2本鎖DNAを鋳型としてプライマーA−3−1、A−3C−1でPCRを行ない214bpの断片を得た。
セグメントA−4(配列番号9)は両端にXhoI、EcoRV部位を有する214bpの断片で、これも4本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーA−4−2、A−4C−2を用いてPCRを行なった。合成された2本鎖DNAを鋳型としてプライマーA−4−1、A−4C−1でPCRを行ない214bpの断片を得た。
セグメントA−5(配列番号10)は両端にEcoRV、SalI部位を有する184bpの断片で、これは2本のオリゴヌクレオチドから作られた。プライマーA−5−1、A−5C−1を用いてPCRを行ない184bpの断片を得た。
セグメントA−6(配列番号11)は両端にSalI、CClaI部位を有する241bpの断片で、これも4本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーA−6−2、A−6C−2を用いてPCRを行なった。合成された2本鎖DNAを鋳型としてプライマーA−6−1、A−6C−1でPCRを行ない241bpの断片を得た。
セグメントA−7(配列番号12)は両端にClaI、BglII部位を有する284bpの断片で、これも4本のオリゴヌクレオチドから作られた。まずプライマーA−7−2、A−7C−2を用いてPCRを行なった。合成された2本鎖DNAを鋳型としてプライマーA−7−1、A−7C−1でPCRを行ない284bpの断片を得た。
以上の増幅された7断片についてpT7Blueベクター(Invitrogen社)、またはクレノウ処理およびリン酸化処理を行なったpUC118 HincIIサイトにクローニングした。同7断片について塩基配列を決定して、設計したものと同一であることを確認した。これらの断片についてそれぞれの末端を認識する制限酵素で消化したのち、低融点アガロースゲル(FMC BioProducts社)を用いて回収を行い、β-Agarase-I(日本ジーン社)を用いて精製を行なった。
これら7断片の接続は以下のように行なった。セグメントA−1、A−2、A−3の3断片についてはpBSIIKS+のXbaI、XhoI部位に同時に挿入した。このプラスミドをpAmy123と命名した。このプラスミドよりセグメントA−1〜A−3を含むXbaI、XhoI断片を回収しセグメントA−4であるXhoI−EcoRV断片とともにpBSIIKS+のXbaI、EcoRV部位に挿入した。このプラスミドをpAmy1234と命名した。このプラスミドよりセグメントA−1〜A−4を含むXbaI−EcoRVフラグメントを回収し、セグメントA−5を含むEcoRV−SalI断片と共にpBSIIKS+のXbaI、SalI部位に挿入した。このプラスミドをpAmy12345と命名した。pBSIIKS+のSmaI部位にBglIIリンカー(CAGATCTG)を挿入したベクター(pBSBglと呼ぶ)を準備した。このベクターのBglII、SalI部位にセグメントA−6、A−7を挿入した。このプラスミドをpAmy67と命名した。pUC12のHindIII、PstIサイトをクレノウ処理したのちBglIIリンカー(CAGATCTG)を挿入したベクター(pUC12BglIIと呼ぶ)についてXbaI、BglIIで消化をした。このプラスミドに先のpAmy12345よりセグメントA−1〜A−5を含むXbaI−SalI領域、およびpAmy67よりセグメントA−6およびA−7を含むSalI−BglII領域を同時に挿入し、スルホロバス・ソルファタリカスKM1株由来アミラーゼ遺伝子(配列番号13)の合成を完了した。
実施例13 アミラーゼ発現カセットの作製と形質転換
スルホロバス・ソルファタリカスKM1株由来アミラーゼ遺伝子のXbaI−BglII断片を、pGAPPT10のXbaI、BamHI部位に挿入した。このプラスミドをpGAPUAと命名した。その後GAPプロモーターとGAPターミネーターの間にアミラーゼ遺伝子を含む約3.4kbの発現カセットをNotI−PstI断片として回収した。実施例8で得られたpURAL11、pCRAL11、およびpCL12のPstI/NotI部位にpGAPUA由来の約3.4kbのPstI−NotI断片を挿入し、プラスミドpURAL11UA、pCRAL11UA、およびpCL12UAを作製した(図27)。これらのプラスミドについて制限酵素BglIIで分解した後、キャンディダ・ユティリスATCC9950株を実施例7に記載した電気パルス法に従って形質転換を行なった。パルス条件は電気容量を25μF、抵抗値を1000オーム、電圧を5KV/cmとして行なった。
実施例14 酵母形質転換体におけるアミラーゼの発現
プラスミドpURAL11UA、pCRAL11UA、およびpCL12UAによる形質転換体をYPD液体培地で一日培養した後、集菌した菌体について実施例10の方法に従って可溶性タンパク質を抽出し、SDS−PAGEに供したところ、いずれの株においてもアミラーゼは可溶性タンパク質の50%以上蓄積することが示された。これらのうち、pURAL11UA由来の株3株、およびシクロヘキシミド耐性遺伝子のみを含むプラスミド(pCLRE2)で形質転換した株1株から抽出した可溶性タンパク質を4/20% SDS−PAGEに供した。またさらに、本アミラーゼは耐熱性を有するため、可溶性タンパク質を70℃30分処理したサンプルについても、同様に4/20% SDS−PAGEに供した。その結果を図28に示す。熱処理した試料に関して活性を調べたところ、スルホロバス・ソルファタリカスKM1株由来アミラーゼの特異的なアミラーゼ活性が認められた。本酵素精製標品の比活性を基に得られた活性から求めた生産量とSDS−PAGEの結果から推定された生産量との間に大きな差が認められなかったことから、酵母で生産したアミラーゼは、活性型であることが示された。
さらにpCRAL11UA、pURAL11UA、およびpCL12UAによる形質転換体をそれぞれ、実施例10の方法に従い、非選択培地で約50世代培養した後の組み込んだ遺伝子の安定性をみた。その結果、rDNAをターゲットとして組み込んだpCRAL11UA由来の株においては、5株中3株において生産量の顕著な低下が認められたが、URA3遺伝子座をターゲットとしたpURAL11UAおよびL41遺伝子座をターゲットとしたpCL12UA由来の株においては、生産量に大きな変化は認められなかった。このことから、L41遺伝子座をターゲットとしたプラスミドもURA3遺伝子座をターゲットとしたプラスミド同様、多コピー導入による遺伝子の高発現とその安定性に優れていることが明らかにされた。
実施例15 GIFの発現
ヒトGlycosylation Inhibiting Factor(GIF)はT細胞で主に生産されるアミノ酸115個からなる分子量12,500の蛋白質であり、免疫抑制活性を有することが知られている(Mikayama et al.,Proc. Narl. Acad. Sci. USA,90,10056-10060(1993))。このアミノ酸配列をもとにキャンディダ・ユティリスのコドン使用頻度に合わせた348bpからなるDNAを合成した。この際、その5’末端にはNheIサイト、3’側末端にはBglIIサイトを付加した。この350bpからなる断片をXbaIとBamHIとで分解したプラスミドpGAPPT10(実施例3)に連結してpGAPGIF1を構築した(図29)。
一方、実施例2に記載した1.2kb PstI−SalIシクロヘキシミド耐性型L41遺伝子断片を、プラスミドpCRA1のXhoIとPstIサイトの間に連結してプラスミドpCRAL2を構築した。このプラスミドpCRAL2のNotIとPstLとの間にプラスミドpGAPGIF1からNotI−PstI断片として切り出したGAPプロモーター+GIF遺伝子+GAPターミネーター断片を連結してプラスミドpRALGIF2を構築した(図29)。
このプラスミドをrDNA断片内部のBglIIサイトで分解した後、実施例7に示した電気パルス法により、キャンディダ・ユティリスATCC9950株を形質転換した。得られた形質転換体のうち8株を10mlのYPD培地で24時間振盪培養した。菌体は遠心集菌後、50mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、1mMDTT、1mMPMSFに懸濁し、グラスビーズで菌体を破砕、15,000×gで10分間遠心することにより菌体と不溶性沈殿を除去することにより、可溶性蛋白質を調製した。調製した可溶性蛋白質は15−25%SDS PAGEにより泳動してGIFの発現を調べた。この結果、GIFに相当する分子量約1.2万の位置にバンドが認められた。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:192
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源:
微生物名:キャンディダ・ユティリス
株名:ATCC 9950
配列
配列番号:2
配列の長さ:184
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源:
微生物名:キャンディダ・ユティリス
株名:ATCC 9950
配列
配列番号:3
配列の長さ:82
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源:
微生物名:キャンディダ・ユティリス
株名:ATCC 9950
配列
配列番号:4
配列の長さ:291
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列
配列番号:5
配列の長さ:97
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
配列番号:6
配列の長さ:282
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列の特徴
他の情報:セグメントA−1
配列
配列番号:7
配列の長さ:312
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列の特徴
他の情報:セグメントA−2
配列
配列番号:8
配列の長さ:241
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列の特徴
他の情報:セグメントA−3
配列
配列番号:9
配列の長さ:214
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列の特徴
他の情報:セグメントA−4
配列
配列番号:10
配列の長さ:184
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列の特徴
他の情報:セグメントA−5
配列
配列番号:11
配列の長さ:241
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列の特徴
他の情報:セグメントA−6
配列
配列番号:12
配列の長さ:284
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列の特徴
他の情報:セグメントA−7
配列
配列番号:13
配列の長さ:1680
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列の特徴
他の情報:アミラーゼ遺伝子
配列
Claims (44)
- 形質転換体選択のためのマーカー遺伝子と、マーカー遺伝子に作動可能に連結された配列番号1のX〜192番のDNA配列(ここで、Xは1〜111の整数を表す)からなる短縮化プロモーター配列と、URA3遺伝子配列およびL41遺伝子配列並びにこれらの一部のDNA配列からなる群から選択されるキャンディダ・ユティリスの染色体DNAと相同な配列(「相同DNA配列」)とを含むベクターであって、前記相同DNA配列内または相同DNA配列の両端において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体DNAに組み込むことができる、ベクター。
- 異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子を更に含んでなる、請求項1に記載のベクター。
- マーカー遺伝子と、短縮化プロモーター配列と、異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子とを含んだDNA配列が、その両端において相同DNA配列に挟まれている、請求項1に記載のベクター。
- 短縮化プロモーター配列が、配列番号1、2、および3からなる群から選択される、請求項1に記載のベクター。
- 相同DNA配列が、URA3遺伝子配列またはその一部のDNA配列である、請求項1に記載のベクター。
- 相同DNA配列が、L41遺伝子配列またはその一部のDNA配列である、請求項1に記載のベクター。
- マーカー遺伝子が薬剤耐性マーカー遺伝子である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のベクター。
- 薬剤耐性マーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子である、請求項7に記載のベクター。
- シクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子がシクロヘキシミド耐性型L41改変遺伝子である、請求項8に記載のベクター。
- 薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生物質G418耐性を付与する遺伝子である、請求項7に記載のベクター。
- 抗生物質G418耐性を付与する遺伝子が、バクテリアトランスポゾンTn903由来のアミノグリコシド−3’−ホスホトランスフェラーゼ(APT)遺伝子である、請求項10に記載のベクター。
- 薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生物質ハイグロマイシンB耐性を付与する遺伝子である、請求項7に記載のベクター。
- 抗生物質ハイグロマイシンB耐性を付与する遺伝子が、大腸菌プラスミド由来のハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子である、請求項12に記載のベクター。
- 異種遺伝子が、一本鎖モネリン、グリコシル化阻害タンパク質(GIF)、血清アルブミン、α-またはβ-グロブリン、ファクターVIII、ファクターIX、フィブロネクチン、α-1−アンチトリプシン、インターロイキン、インターフェロン、G−CSF、GM−CSF、PDGF、EGF、FGF、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インシュリン、ワクチン生産のためのウイルス由来抗原ポリペプチド、免疫抑制活性を有するタンパク質、キモシン、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、およびペクチナーゼからなる群から選択されるタンパク質またはペプチドの遺伝子である、請求項2〜13のいずれか一項に記載のベクター。
- 異種遺伝子が一本鎖モネリン遺伝子である、請求項14に記載のベクター。
- 一本鎖モネリン遺伝子が配列番号4のアミノ酸配列または配列番号5のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む、請求項15に記載のベクター。
- 異種遺伝子がグリコシル化阻害タンパク質(GIF)遺伝子である、請求項14に記載のベクター。
- 異種遺伝子がアミラーゼ遺伝子である、請求項14に記載のベクター。
- 異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子が、キャンディダ・ユティリスにおいて発現するように改変された遺伝子である、請求項14に記載のベクター。
- 異種遺伝子が、キャンディダ・ユティリスにおいて発現するように改変されたアミラーゼ遺伝子である、請求項14に記載のベクター。
- 改変されたアミラーゼ遺伝子が、配列番号13のDNA配列からなる、請求項20に記載のベクター。
- 異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子の発現のためのプロモーター配列を更に含む、請求項2〜21のいずれか一項に記載のベクター。
- ターミネーター配列を更に含む、請求項22に記載のベクター。
- 異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子の発現のためのプロモーター配列および/またはターミネーター配列が、キャンディダ・ユティリス由来である、請求項22または23に記載のベクター。
- 異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子の発現のためのプロモーター配列および/またはターミネーター配列が、キャンディダ・ユティリスのGAP遺伝子由来である、請求項22または23に記載のベクター。
- 請求項1または24に記載のベクターでキャンディダ・ユティリスを形質転換し、そして薬剤耐性となった形質転換体を選択することを含む、キャンディダ・ユティリスの形質転換方法。
- ベクターDNA配列がキャンディダ・ユティリスの染色体に導入され、かつ安定して保持される、請求項26に記載の形質転換方法。
- 相同配列が、キャンディダ・ユティリスの染色体に導入され、かつ安定して保持される、請求項26または27に記載の形質転換方法。
- 相同配列と、その両端を相同配列に挟まれたDNA配列とが、キャンディダ・ユティリスの染色体に導入され、かつ安定して保持される、請求項26に記載の形質転換方法。
- ベクターのマーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性型改変L41遺伝子であるベクターを用いる、請求項26に記載の形質転換方法。
- キャンディダ・ユティリスがATCC9256、ATCC9226、およびATCC9950からなる群から選択される、請求項26に記載の形質転換方法。
- 請求項1または24に記載のベクターで形質転換された、キャンディダ・ユティリス形質転換体。
- キャンディダ・ユティリスがATCC9256、ATCC9226、およびATCC9950からなる群から選択される、請求項32に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
- 異種遺伝子またはキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子によりコードされるタンパク質の製造法であって、請求項32に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体を培養し、そして該培養物から遺伝子の発現産物を単離、精製することを含む、方法。
- 一本鎖モネリンの製造法である、請求項34に記載の方法。
- アミラーゼの製造法である、請求項34に記載の方法。
- 菌体抽出タンパク質を加熱処理して宿主由来の夾雑タンパク質を変性沈殿する工程を含む、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 加熱処理が50〜70℃において行われる、請求項37に記載の方法。
- 菌体抽出タンパク質を酸処理して宿主由来の夾雑タンパク質を変性沈殿する工程を含む、請求項37または38に記載の方法。
- 酸処理がpH4〜5において行われる、請求項39に記載の方法。
- 配列番号1のX〜192番のDNA配列(ここで、Xは1〜111の整数を表す)からなるDNA。
- 配列番号1のDNA配列からなるDNA。
- 配列番号2のDNA配列からなるDNA。
- 配列番号3のDNA配列からなるDNA。
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