DE69832504T2

DE69832504T2 - Verfahren zur Veränderung eines chrmosomalen Locus von Pichia methanolica-Zellen

Info

Publication number: DE69832504T2
Application number: DE69832504T
Authority: DE
Inventors: K. Christopher RAYMOND
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1997-09-15
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2018-09-12
Also published as: ATE310815T1; CA2303408A1; EP1015577B8; DK1015577T3; AU9396498A; EP1015577A1; WO1999014320A1; CA2303408C; DE69832504D1; EP1015577B1; JP2001516577A; AU752578B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Methylotrophe Hefen sind diejenigen Hefen, die in der Lage sind, Methanol als eine einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie zu verwenden. Hefearten, die die biochemischen Stoffwechselwege aufweisen, die notwendig für die Methanolverwertung sind, werden in vier Gattungen eingeteilt, Hansenula, Pichia, Candida und Torulopsis. Diese Gattungen sind in gewisser Weise künstlich, da sie auf Zellmorphologie und Wachstumscharakteristiken basieren und keine engen genetischen Verwandtschaften reflektieren (Billon-Grand, Mycotaxon 35: 201–204, 1989; Kurtzman, Mycologia 84: 72–76, 1992). Darüber hinaus sind nicht alle Arten innerhalb dieser Gattungen in der Lage, Methanol als eine Quelle für Kohlenstoff und Energie zu nutzen. Als eine Konsequenz aus dieser Klassifikation gibt es große Unterschiede in der Physiologie und dem Metabolismus zwischen individuellen Arten einer Gattung.
Methylotrophe Hefen sind attraktive Kandidaten für die Verwendung bei rekombinanten Proteinproduktionssystemen. Von einigen methylotrophen Hefen wurde gezeigt, dass sie schnell zu einer großen Biomasse auf definierten Minimal-Medien wachsen. Bestimmte Gene von methylotrophen Hefen sind unter induzierten oder dereprimierten Bedingungen dicht reguliert und werden hoch exprimiert, was nahe legt, dass Promotoren dieser Gene nützlich für die Herstellung von Polypeptiden mit gewerblichem Wert sein könnten. Siehe zum Beispiel Faber et al., Yeast 11: 1331, 1995; Romanos et al., Yeast 8: 423, 1992 und Cregg et al., Bio/Technology 11: 905, 1993.
Die Entwicklung von methylotrophen Hefen als Wirte für die Verwendung bei rekombinanten Proteinproduktionssystemen war langsam, was zum Teil darauf zurückzuführen war, dass ein Mangel an geeigneten Materialien (z.B. Promotoren, selektierbaren Markern und mutierten Wirtszellen) und Verfahren (z.B. Transformationstechniken) bestand. Die am weitesten entwickelten methylotrophen Wirtsysteme verwenden Pichia pastoris und Hansenula polymorpha (Faber et al., Curr. Genet. 25: 305–310, 1994; Cregg et al., ibid.; Romanos et al., ibid.; US-Patent Nr. 4,855,242; US-Patent Nr. 4,857,467; US-Patent Nr. 4,879,231 und US-Patent Nr. 4,929,555).
In letzter Zeit wurden Materialien und Techniken, die für die Herstellung fremder Proteine in Pichia methanolica nützlich sind, entwickelt (WIPO-Veröffentlichung WO 9717450). Es bleibt jedoch auf dem Fachgebiet ein Bedarf an zusätzlichen Techniken bestehen, die verwendet werden können, um das Genom von P. methanolica zu manipulieren, um unser Verständnis für diesen Organismus zu erweitern und Stämme herzustellen, die bei Proteinproduktionssystemen in einem großen Maßstab verwendet werden können.
Ein solches benötigtes Werkzeug ist eine Technik für die ortsgerichtete Mutagenese von P. methanolica. Ortsgerichtete Mutagenese erlaubt die Einführung von Mutationen in vorbestimmte Genorte, was die selektive Änderung der Genaktivität erlaubt. Nützliche Änderungen beinhalten zum Beispiel Mutation von Promotorsequenzen, um die Genexpression zu steigern, Einführung von heterologen Genen an bestimmten Orten und Erzeugung von Proteasedefizienzen und Auxotrophien. Techniken, die für die knospende Hefe Saccaromyces cerevisiae entwickelt wurden, sind für P. methanolica ungeeignet. Zum Beispiel erfordert das "pop-in/pop-out"-Verfahren, entwickelt von Scherer und Davis (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035, 1979) und zusammengefasst von Rothstein (Methods Enzymol. 194: 281, 1991), eine Selektion gegen die Gegenwart des URA3-Markers, wie durch die Zugabe von 5-FOA (5-Fluororotsäure) zu dem Kulturmedium. Dieses Verfahren ist für P. methanolica ungeeignet, da die Zellen gegen 5-Fluororotsäure (5-FOA) resistent sind und kein P. methanolica-URA-Marker erhältlich ist. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Herstellung ortsgerichteter Mutationen in dem Genom von P. methanolica, Zellen, die solche Mutationen besitzen, und andere verwandte Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Änderung eines chromosomalen Ortes von Pichia methanolica-Zellen bereit, umfassend die Schritte: (a) Auswahl eines chromosomalen Zielortes der Zellen; (b) Bereitstellung einer Population von P. methanolica-Zellen, die jeweils eine chromosomale Kopie des ausgewählten Zielortes umfassen, wobei die Zellen auxotroph für Adenin sind; (c) Einführung eines linearen DNA-Konstruktes in die Zellen, umfassend (i) ein Segment, das einen Teil des chromosomalen Zielortes umfasst, in dem mindestens ein Nukleotidpaar geändert wurde, und (ii) einen selektierbaren Marker, der Adeninauxotrophie komplementiert; (d) Kultivierung der Zellen aus Schritt (c) unter Bedingungen, die selektiv für die Gegenwart des selektierbaren Markers in den Zellen sind; (e) Identifizierung einer Untergruppe der kultivierten Zellen, in die das Segment des DNA-Konstruktes und der selektierbare Marker durch homologe Rekombination chromosomal integriert wurde, was in der Tandem-Duplikation des chromosomalen Zielortes resultiert; (f) Kultivierung der identifizierten Untergruppe von Zellen unter Bedingungen, bei denen die Zellen, die prototroph für Adenin sind, wachsen und einen ersten Phänotyp aufweisen, und die Zellen, die auxotroph für Adenin sind, wachsen und einen zweiten Phänotyp aufweisen; (g) Gewinnung der Zellen, die auxotroph für Adenin sind, und (h) Identifizierung einer Untergruppe der auxotrophen Zellen, in die das Segment des DNA-Konstruktes chromosomal integriert wurde, wodurch der chromosomale Zielort geändert wird. Bei einer Ausführungsart der Erfindung wird eine Vielzahl von Nukleotidpaaren von dem Teil des chromosomalen Ortes geändert. Bei einer verwandten Ausführungsart wird von 1 kbp bis 2 kbp des Teiles des chromosomalen Ortes geändert. Bei einer anderen Ausführungsart ist die Änderung eine Deletion von mindestens einem Nukleotidpaar. Bei weiteren Ausführungsarten codiert der chromosomale Zielort eine Protease, wie Proteinase A oder Proteinase B, eine Alkoholoxidase oder einen Ernährungsmarker.
Bei dem Verfahren, das oben offenbart wird, können die Schritte (a) bis (h) wiederholt werden, wodurch zwei oder mehr chromosomale Orte verändert werden. Bei bestimmten Ausführungsarten der Erfindung wird ein chromosomaler Ort, der eine Protease codiert, und ein zweiter chromosomaler Ort, der eine Alkoholoxidase codiert, verändert.
Die Erfindung stellt auch eine Pichia methanolica-Zelle bereit, die durch das oben offenbarte Verfahren hergestellt wird.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die anhängenden Zeichnungen offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht eine Ausführungsart der Erfindung, wodurch eine Gendeletion in einen chromosomalen Ort eingeführt wird.
2 zeigt eine partielle Restriktionskarte eines P. methanolica-Alkoholoxidase (AUG1)-Gens. Der offene Pfeil weist auf den offenen Leserahmen hin. Es werden die Lokalisierungen des ursprünglichen PCR-Produktes, des sequenzierten Bereiches und der Gendeletion gezeigt.
3 zeigt eine partielle Restriktionskarte eines genomischen Klons, der ein P. methanolica PEP4-Gen umfasst. Das PCR-Produkt, das verwendet wird, um das Gen zu identifizieren, wird als komplementäre Halbpfeile gezeigt. Ein 420 bp-Fragment links von dem Asp718-Ort wurde sequenziert. Das pep4Δ-Allel wurde durch Deletion des angezeigten Bereiches zwischen den BamHI- und NCoI-Orten geschaffen.
4 zeigt eine partielle Restriktionskarte eines genomischen Klons, der ein P. methanolica PRB1-Gen umfasst. Das PCR-Produkt, das verwendet wurde, um das Gen zu identifizieren, wird als komplementäre Halbpfeile gezeigt. Das prb1Δ-Allel wurde durch Deletion des angezeigten Bereiches zwischen den NcoI- und EcoRV-Orten erzeugt.
5 veranschaulicht eine partielle Restriktionskarte eines zweiten P. methanolica-Alkoholoxidase (AUG2)-Gens. Der offene Pfeil weist auf den offenen Leserahmen hin. Die Position des Stopp-Codons wurde basierend auf den Längen anderer bekannter Alkoholoxidase-codierender Bereiche geschätzt. Die Lokalisierungen des ursprünglichen PCR-Produktes, des sequenzierten Bereiches und der Gendeletion werden gezeigt.
6 veranschaulicht das Plasmid pCZR134.
7 veranschaulicht das Plasmid pCZR140-6.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein "chromosomaler Ort" ist ein Bereich der DNA, der in dem Genom einer Zelle gefunden wird. Ein chromosomaler Ort kann, aber muss nicht, ein oder mehrere Gene umfassen.
Ein "DNA-Konstrukt" ist ein DNA-Molekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, das durch eine menschliche Intervention modifiziert wurde, um Segmente von DNA zu enthalten, die in einer Anordnung kombiniert und nebeneinander gestellt werden, die in der Natur nicht existiert.
"Homologe Rekombination" ist eine genetische Rekombination zwischen Paaren von DNA-Molekülen, die Bereiche von Sequenzidentität aufweisen.
"Lineare DNA" bezeichnet DNA-Moleküle mit freien 5'- und 3'-Enden, das heißt nicht-zirkuläre DNA-Moleküle. Lineare DNA kann aus geschlossenen zirkulären DNA-Molekülen, wie Plasmiden, durch enzymatischen Verdau oder physikalische Unterbrechung hergestellt werden.
Ein "Ernährungsmarker" ist ein Gen, das ein Protein codiert, das für die Biosynthese eines notwendigen Nährstoffes erforderlich ist. Ernährungsmarker beinhalten Gene, die Enzyme codieren, die für die Aminosäure- und Nukleotidbiosynthese erforderlich sind. Der Begriff "operabel gebunden" weist darauf hin, dass DNA-Segmente so angeordnet sind, dass sie für ihre beabsichtigten Zwecke zusammenwirken, zum Beispiel, dass die Transkription bei dem Promotor beginnt und durch das Codierungssegment bis zu dem Terminator voranschreitet.
"Selektive" Kulturbedingungen sind diejenigen Bedingungen, die für bevorzugtes Wachstum der Zellen mit einem vorbestimmten Phänotyp sorgen. Dieser Phänotyp ist im Allgemeinen das Resultat der Expression eines Genes, das in die Zelle eingeführt wurde (oder in eine Elternzelle eingeführt wurde), um eine Mutation zu komplementieren.
"Tandem-Duplikation" eines chromosomalen Ortes bezeichnet die Einführung einer zweiten Kopie von einem existierenden Ort in ein Chromosom, wodurch die zweite Kopie in die ursprüngliche Kopie durch homologe Rekombination zwischen dem chromosomalen Ort und dem komplementären Ort auf einem exogen bereitgestellten DNA-Molekül eingefügt wird. Verdoppelung kann zu Veränderungen der ursprünglichen Kopie des Ortes führen, zum Beispiel wenn eine veränderte Form des Ortes in die Zelle eingeführt und in das Chromosom aufgenommen wird. Die resultierende Konfiguration des verdoppelten Ortes wird durch die Natur jeder eingeführten Änderung/Änderungen und die Gegenwart oder Abwesenheit von zusätzlicher DNA, die an die eingeführte Kopie des Ortes gebunden ist, bestimmt. Innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Tandem-Duplikation eines Zielortes im Allgemeinen eine unterbrochene Kopie in den Ort einführen und einen selektierbaren Marker und andere Vektorsequenzen zwischen die zwei Kopien des Ortes einfügen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Einführung von Veränderungen (Mutationen) in chromosomale Orte von Pichia methanolica bereit. Stämme von Pichia methanolica für die Verwendung innerhalb der Erfindung kann man von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) und anderen Quellen erhalten. Diese Stämme können als Elternstämme für die Herstellung von Stämmen mit einer gewünschten chromosomalen Mutation verwendet werden. Diejenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, werden erkennen, dass sowohl Eltern- wie auch mutierte Stämme weiter gemäß bekannten Techniken mutagenisiert werden können, um Stämme mit den gewünschten Genotypen (z.B. ade^–) zu erhalten. Man kann dadurch Stämme mit definierten Nahrungsansprüchen, metabolischen Defekten etc. erhalten. Es ist so möglich, Stämme von P. methanolica für die Verwendung bei zum Beispiel groß angelegter Fermentierung für die Proteinproduktion zu entwickeln.
Von besonderem Interesse für Proteinproduktionssysteme sind Stämme von P. methanolica, denen es an vakuolärer Proteaseaktivität mangelt. Bei Hefen ist der Hauptspeicher proteolytischer Aktivität innerhalb des Lumens des vakuolären Kompartiments lokalisiert (Jones, Methods Enzymol. 194: 428–453, 1991). Diese Proteasen werden in die Fermentierungsbrühe durch spontane und unvermeidliche Zelllyse freigesetzt und weiter durch Zellaufbruch, der erforderlich ist, um intrazellulär hergestellte Proteine bei Labor- oder industrieller Produktion freizusetzen, befreit, wodurch die Gewinnung von intaktem Protein begrenzt wird. Es ist daher wünschenswert, vakuoläre Proteaseaktivität bei Produktionsstämmen zu reduzieren oder eliminieren. Vakuoläre Proteasegene von besonderem Interesse in dieser Hinsicht beinhalten das PEP4-Gen, das Proteinase A codiert, und das PRB1-Gen, das Proteinase B codiert. Den Bezeichnungen dieser Gene wurde eine funktionelle Äquivalenz zu den Saccharomyces cerevisiae-Genen der gleichen Namen und eine hochgradige Sequenzidentität (70%) zwischen den codierten P. methanolica- und S. cerevisiae-Proteinen zu Grunde gelegt. Obwohl andere vakuoläre Proteasen (z.B. Carboxypeptidase Y) in P. methanolica vorliegen, aktivieren die PEP4- und PRB1-Genprodukte die anderen vakuolären Proteasen, so dass die Aufhebung von PEP4- und PRB1-Funktionen in einem Stamm resultiert, der effektiv für vakuoläre Protease negativ ist.
Die Bereitung von für vakuoläre Protease defizienten Stämmen von P. methanolica, wie sie hier offenbart wird, dient dazu, die Verfahren der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen. Diejenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, werden erkennen, dass die offenbarten Verfahren, einfach auf die Veränderung anderer chromosomaler Orte von P. methanolica angewendet werden können. Andere Orte von Interesse in dieser Hinsicht beinhalten ohne Begrenzung Gene, die Alkoholoxidase (AUG1- und AUG2-Gene), Golgiendoprotease (Orthologe von S. cerevisiae KEX2- und YAP3-Gene), Ernährungsmarker (z.B. HIS3, LEU2), β-1,3-Glucanase und Paarungspheromone kodieren; das HO-Gen und andere Gene, die Proteine des Methanolverwertungs-Stoffwechselweges codieren (z.B. Gene, die Dihydroxyacetonsynthase, Formatdehydrogenase und Katalase codieren).
Innerhalb der vorliegenden Erfindung wird eine Veränderung innerhalb eines ausgewählten chromosomalen Zielortes durch einen Prozess der Loop-in/Loop-out-Mutagenese erzeugt, wodurch eine veränderte Kopie des chromosomalen Zielortes verwendet wird, um die endogene Kopie innerhalb des Genoms zu ersetzen. Ein Beispiel für dieses Verfahren wird in 1 veranschaulicht. Ein lineares DNA-Konstrukt, umfassend (1) einen Teil des ausgewählten chromosomalen Zielortes, bei dem mindestens ein Nukleotidpaar verändert ist (angezeigt durch "Δ" in 1), und (2) wird ein selektierbarer Marker (ADE2 in 1) in die Zellen eingeführt. Die Zellen werden unter selektiven Bedingungen kultiviert, dann wird eine Untergruppe der Zellen identifiziert, in die der veränderte chromosomale Ortsanteil und der selektierbare Marker chromosomal durch homologe Rekombination integriert wurde. Das Rekombinationsereignis resultiert in Tandem-Duplikation des chromosomalen Zielortes. In der 1 wird die eingeführte DNA als ein zirkuläres Molekül gezeigt, weil P. methanolica die lineare DNA nach Transformation wieder zirkularisiert. Wie in 1 gezeigt wird, resultiert die Rekombination zwischen den eingeführten und chromosomalen Kopien des Zielortes in der Verdoppelung des Zielortes, wobei der selektierbare Marker zwischen den zwei Kopien eingefügt wird. Die Zellen werden dann unter Bedingungen kultiviert, bei denen Zellen, die ein spontanes Loop-out-Ereignis durchmachen, identifiziert werden können. Dieses Loop-out-Ereignis resultiert aus einer zweiten homologen Rekombination zwischen den zwei Kopien des Zielortes. Zwei Resultate sind möglich: das Looping-out der Wildtyp-Kopie des Ortes, veranschaulicht in 1; und das Looping-out der veränderten Kopie (nicht gezeigt), das den Elternstatus regeneriert.
Eine Veränderung bei einem geklonten chromosomalen Ort oder einem Teil davon, zum Beispiel einem geklonten vakuoläre Proteasegens, wird durch konventionelle Verfahren der DNA-Manipulation wie Restriktionsendonukleaseverdau und erneute Ligation, insertionelle Mutagenese, Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Mullis, US-Patent Nr. 4,683,202), ortsgerichtete Mutagenese (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 15.3-15.113) oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren geschaffen. Die veränderte Kopie des Ortes wird dann in die Zelle als ein lineares DNA-Konstrukt eingeführt, das weiter einen selektierbaren Marker, der eine auxotrophe Mutation in der Zelle komplementiert, umfasst. Es wird vorgezogen, dass die Zelle für Adenin auxotroph ist, und dass der selektierbare Marker Adeninauxotrophie komplementiert. Ein solch bevorzugter Marker ist das P. methanolica ADE2-Gen, von dem eine repräsentative Sequenz in SEQ ID NR.: 1 gezeigt wird, oder ein funktioneller Teil davon.
Eine Population von P. methanolica-Zellen, jede umfassend eine chromosomale Kopie des Zielortes, wird hergestellt. Stämme von P. methanolica sind von öffentlich zugängigen Quellen, wie der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, erhältlich. Zellen werden in einem geeigneten Medium wie YEPD kultiviert. Wenn notwendig, können die Zellen mutagenisiert werden, um die erwünschte Auxotrophie zu erhalten. Um auxotrophe Mutanten von P. methanolica herzustellen, werden die Zellen zuerst mutagenisierenden Bedingungen, sprich Umgebungsbedingungen, die genetische Mutationen in den Zellen hervorrufen, ausgesetzt. Die Verfahren für die Mutagenisierung von Zellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und beinhalten chemische Behandlung, Aussetzen gegenüber ultraviolettem Licht, Aussetzen gegenüber Röntgenstrahlen und retrovirale Insertionsmutagenese. Chemische Mutagene beinhalten Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, 2-Methoxy-6-chlor-9-[3-(ethyl-2-chlorethyl)aminopropylamino]acridin·2HCl, 5-Bromuracil, Acridin und Aflatoxin. Siehe Lawrence, Methods Enzymol. 194: 273–281, 1991. Der Anteil der erhaltenen mutagenisierten Zellen ist eine Funktion der Stärke oder der Menge eines mutagenisierenden Wirkstoffes, gegenüber dem die Zellen ausgesetzt werden. Ein niedriger Spiegel an Mutagen erzeugt einen kleinen Anteil von mutierten Zellen. Höhere Spiegel an Mutagen erzeugen einen höheren Anteil mutierter Zellen, aber mutagenisieren auch mehr Orte und töten mehr Zellen. Es ist daher notwendig, diese Resultate so auszubalancieren, dass eine vernünftige Anzahl von einfach mutierten Zellen erhalten wird. Die Ausbalancierung wird im Allgemeinen empirisch durchgeführt, indem die Zellen verschiedenen Bedingungen ausgesetzt werden, um eine Tötungskurve festzulegen. Im Allgemeinen werden die Zellen mutagenisierenden Bedingungen ausgesetzt und für einen Tag kultiviert, wonach sie gemäß Standard-Assayverfahren auf Lebensfähigkeit getestet werden. Im allgemeinen wird es vorgezogen, einen Grad an Mutagenese zu verwenden, der in 10–20%iger Mortalität resultiert, obwohl ein Fachmann auf dem Gebiet erkennen wird, dass dieser Wert je nach Notwendigkeit angepasst werden kann, zum Beispiel wenn mit einer großen Anzahl von Zellen gearbeitet wird.
Mutagenisierte Zellen werden dann in einem reichen Medium kultiviert, um den Mutationen zu erlauben, etabliert und zumindest in einem Teil der Zellpopulation repliziert zu werden. Dieser Schritt erlaubt Zellen, in denen das Genom verändert worden ist, die Mutation zu replizieren und auf ihre Nachkommen weiterzugeben, wodurch die Mutation innerhalb der Population etabliert wird.
Die Zellen werden dann auf ein Kulturmedium, in dem es an assimilierbaren Stickstoff mangelt, transferiert, so dass die zellulären Stickstoffspeicher aufgebraucht werden. Mit "an assimilierbarem Stickstoff mangelnd" ist gemeint, dass es dem Medium an einer Menge von Stickstoff mangelt, die ausreicht, um das Wachstum der Zellen zu unterstützen. Die Erschöpfung zellulärer Stickstoffspeicher wird im Allgemeinen ungefähr 12 bis 24 Stunden Inkubation erfordern, wobei 16 Stunden unter gewöhnlichen Bedingungen ausreichen. Nach Erschöpfung der Stickstoffspeicher werden die Zellen in einem definierten Kulturmedium, das eine anorganische Stickstoffquelle und eine Menge an antifungalem Antibiotikum enthält, die ausreicht, um wachsende P. methanolica-Zellen zu töten, kultiviert. Das Antibiotikum Nystatin (Mycostatin) wird vorgezogen. Bevorzugte anorganische Stickstoffquellen sind diejenigen, die Ammoniumionen wie Ammoniumsulfat umfassen. Im Allgemeinen wird das Medium 10–200 mMol Ammonium, vorzugsweise ungefähr 60 mMol Ammonium, enthalten. Nystatin wird in einer Konzentration von 0,1 bis 100 mg/l, vorzugsweise 0,5 bis 20 mg/l, mehr vorzuziehen ungefähr 2 mg/l (10 Einheiten/l) eingeschlossen. Die Behandlung mit Nystatin wird für 10 Minuten bis sechs Stunden, vorzugsweise ungefähr 1 Stunde, durchgeführt. Diejenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, werden erkennen, dass die tatsächliche Antibiotikakonzentration und Aussetzungszeit, die erforderlich ist, um prototrophe Zellen zu töten, einfach empirisch bestimmt werden kann und bestimmte Angleichungen notwendig sein können, um Variationen in der spezifischen Aktivität zwischen einzelnen Chargen von Antibiotikum zu kompensieren. Durch Erschöpfung der zellulären Stickstoffspeicher und dann Kultivierung der Zellen in einem definierten Medium, das eine anorganische Stickstoffquelle und ein Antibiotikum enthält, bleiben Zellen, die auxotroph für Aminosäure oder Nukleotidbiosynthese sind, am Leben, da sie in dem definierten Medium nicht wachsen können. Wachsende Zellen werden durch das Antibiotikum getötet. Nach der antibiotischen Behandlung werden die Zellen auf ein reiches Kulturmedium übertragen.
Ein signifikanter Anteil der Zellen, die die Nystatinbehandlung überleben, sind Prototrophe. Auxotrophe Mutanten innerhalb der überlebenden Population werden identifiziert und durch Bestimmung der Nährstoffanforderungen der Zellen charakterisiert. Für diese Bestimmung wird im Allgemeinen Replika-Plattierung verwendet. Die Zellen werden sowohl auf reiches Medium wie auch auf Medien, denen spezifische Nährstoffe fehlen, plattiert. Zellen, die auf bestimmten Platten nicht wachsen, sind auxotroph für den fehlenden Nährstoff. Für die weitere Charakterisierung kann Komplementationsanalyse verwendet werden.
Die Änderung eines chromosomalen Ortes in den Wirtszellen wird durch homologe Rekombination zwischen dem zellulären chromosomalen Ort und einem homologen DNA-Segment, das in die Zelle eingeführt wird, erreicht. Das homologe Segment umfasst mindestens einen Teil des Zielortes, der in einem DNA-Konstrukt geklont wurde, typischerweise ein Plasmid. Mindestens ein Nukleotidpaar in dem geklonten Anteil des Ortes wird durch Deletion, Substitution oder Insertion verändert, wobei die Deletion vorgezogen wird. Es können auch Kombinationen der Änderungen vorgenommen werden, was zum Beispiel in einem geklonten Ort resultiert, von dem ein erster Bereich deletiert und ein zweiter Bereich durch Insertion unterbrochen wurde. Solche Änderungen werden vorzugsweise ein oder mehrere Aminosäurereste des aktiven Zentrums des Proteinproduktes des Zielortes eliminieren, wodurch Proteinaktivität zerstört wird. Rasterverschiebungsmutationen können zum Beispiel durch Deletion eines partiellen Codons erzeugt werden, so dass die Deletion eines einzelnen Nukleotids und vorzugsweise von mindestens vier Nukleotiden die erwünschte inaktivierende Mutation hervorrufen kann. Es wird vorgezogen, mindestens das meiste des offenen Leserahmens (ORF) des geklonten Ortes zu deletieren oder anders zu verändern. Veränderungen können sich über den ORF hinaus in den Promotor oder Terminator oder beide erstrecken, aber es wird vorgezogen, benachbarte Gensequenzen nicht zu stören. In der Praxis wird das tatsächliche Ausmaß von jeder Deletion normalerweise auf die Lokalisierungen von geeigneten Restriktionsenzyms-Erkennungsorten basiert. Die Veränderung wird an jedem Ende durch ausreichend Sequenz flankiert, um homologe Rekombination mit dem Zielort zu erleichtern. Obwohl berichtet wurde, dass so wenig wie zwei Basenpaare mit Sequenzidentität adäquat seien (Mezard et al., Cell 70: 659–670, 1992), wird es vorgezogen, mindestens zehn Basenpaare unveränderter Zielortsequenz an jedem Ende der Veränderung bereitzustellen. Es wird vorgezogen, dass die Veränderung von mindestens 100 Basenpaaren bis zu so viel wie 10 Kilobasenpaaren an unveränderter Sequenz an jedem Ende flankiert wird. Auf jeden Fall muss das DNA-Konstrukt ausreichende Mengen an Sequenz enthalten, die homolog zu dem Zielzellgenom sind, um homologe Rekombination an dem Zielort zu erlauben. In der Praxis werden Deletionen oder andere Veränderungen im Allgemeinen von ungefähr 1 kb bis ungefähr 2 kb des Ortes von Interesse abdecken, obwohl größere Bereiche bis zu 10 kb oder mehr, abhängig von der Größe des Zielortes, verändert werden können. Bei einer Ausführungsart der Erfindung ist die Aufgabe der Veränderung, effektiv die Aktivität des Zielortes zu eliminieren und es wird vorgezogen, es auf eine Weise zu tun, die die Möglichkeit von Reversionen oder anderen kompensierenden Mutationen minimiert oder eliminiert. Bei einer anderen Ausführungsart ist die Aufgabe der Veränderung, ein Gen oder Gene, die eine neue Funktion codieren, zu inserieren. Die Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung auf spezifische Zielorte liegt innerhalb des Niveaus normalen Fachwissens auf dem Fachgebiet.
Wie oben angemerkt wurde, wird das DNA-Konstrukt, das in die Zelle eingeführt werden soll, zusätzlich zu dem veränderten Ortsanteil einen selektierbaren Marker umfassen. Die Gegenwart des selektierbaren Markers erleichtert die Identifikation und Selektion integrativer Transformanten, indem sie es den Zellen, die den Marker exprimieren, erlaubt, unter Bedingungen zu wachsen, bei denen die Zellen, denen es an dem Marker fehlt, sich nicht vermehren können. Die allgemeinen Prinzipien der Selektion sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Allgemein verwendete selektierbare Marker sind Gene, die Enzyme codieren, die für die Synthese von Aminosäuren oder Nukleotiden erforderlich sind. Zellen mit Mutationen in diesen Genen können nicht auf Medien wachsen, denen es an der spezifischen Aminosäure oder dem Nukleotid fehlt, außer die Mutation wird durch den selektierbaren Marker komplementiert. Die Verwendung von solchen "selektiven" Kulturmedien sichert die stabile Erhaltung der heterologen DNA innerhalb der Wirtszelle. Ein bevorzugter selektierbarer Marker diesen Typs für die Verwendung in Pichia methanolica ist P. methanolica ADE2-Gen, das Phosphoribosyl-5-aminoimidazolcarboxylase (AIRC; EC 4.1.1.21) codiert. Wenn es in eine ADE2-Wirtszelle transformiert wird, erlaubt das ADE2-Gen der Zelle, in der Abwesenheit von Adenin zu wachsen. Der codierende Strang einer repräsentativen P. methanolica ADE2-Gensequenz wird in SEQ ID NR.: 1 gezeigt. Die dargestellte Sequenz beinhaltet 1006 Nukleotide von 5' nicht-codierender Sequenz und 442 Nukleotide von 3' nicht-codierender Sequenz, wobei das Start-ATG-Codon bei den Nukleotiden 1007–1009 liegt. Bei einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung wird ein DNA-Segment, das die Nukleotide 407–2851 umfasst, als ein selektierbarer Marker verwendet, obwohl längere oder kürzere Segmente verwendet werden können, solange der codierende Anteil operabel an Promotor- und Terminatorsequenzen gebunden ist. Diejenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, werden erkennen, dass diese und andere Sequenzen, die hier bereitgestellt werden, einzelne Allele der jeweiligen Gene darstellen und dass erwartet wird, dass allele Variation existiert. Jedes funktionelle ADE2-Allel kann als ein selektierbarer Marker verwendet werden. Andere Ernährungsmarker, die innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten die P. methanolica ADE1-, HIS3- und LEU2-Gene, die die Selektion in der Abwesenheit von Adenin, Histidin bzw. Leucin erlauben. P. methanolica-Gene können auf der Basis von Homologie mit ihren komplementären Saccharomyces cerevisiae-Genen geklont werden. Heterologe Gene, so wie Gene von anderen Pilzen, können auch als selektierbare Marker verwendet werden.
DNA, die in P. methanolica eingeführt werden soll, wird zuerst linearisiert, wie durch Verdau mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen. Linearisierung steigert die Effizienz der Transformation. Die Linearisierung durch Verdau mit frequenzspezifischen Endonukleasen erlaubt auch die spezifische Entfernung von exogenen Sequenzen, so dass nur die erwünschten DNA-Sequenzen in die Zelle eingeführt werden.
DNA kann in die P. methanolica-Zellen durch irgendeines von verschiedenen bekannten Verfahren eingeführt werden, einschließlich Lithiumtransformation (Hiep et al., Yeast 9: 1189–1197, 1993; Tarutina und Tolstorukov, Abst. of the 15th International Specialized Symposium on Yeasts, Riga (USSR), 1991, 137; Ito et al., J. Bacteriol. 153: 163, 1983; Bogdanova et al., Yeast 11: 343, 1995), Spheroblastransformation (Beggs, Nature 275: 104, 1978; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3376, 1985), Gefrier-/Auftau-Polyethylenglykol-Transformation (Pichia Expression Kit Instruction Manual, Invitrogen Corp., San Diego, CA, Cat. No. K1710-01) oder Elektroporation, wobei die Letztere vorgezogen wird. Elektroporation ist der Vorgang der Verwendung eines gepulsten elektrischen Feldes, um transient Zellmembranen durchlässig zu machen, was es Makromolekülen wie DNA erlaubt, in die Zellen zu passieren. Elektroporation wurde für die Verwendung mit Säugetier- (z.B. Neumann et al., EMBO J. 1: 841–845, 1982) und Pilz- (z.B. Meilhoc et al., Bio/Technology 8: 223–227, 1990) -Wirtszellen beschrieben. Der tatsächliche Mechanismus, durch den die DNA in die Zellen transferiert wird, wird jedoch nicht genau verstanden. Für die Transformation von P. methanolica wurde herausgefunden, dass Elektroporation überraschend effizient ist, wenn die Zellen einem exponentiell abfallenden pulsierten elektrischen Feld mit einer Feldstärke von 2,5 bis 4,5 kV/cm und einer Zeitkonstante (τ) von ungefähr 1 bis 40 Millisekunden ausgesetzt werden. Die Zeitkonstante τ wird als die Zeit definiert, die erforderlich ist, damit die anfängliche Spitzenspannung V₀ auf einen Wert von V₀/e fällt. Die Zeitkonstante kann als das Produkt des Gesamtwiderstandes und der Kapazität des Pulskreises, sprich τ = R × C, berechnet werden. Typischerweise sind Widerstand und Kapazität entweder voreingestellt oder sie können durch den Anwender ausgewählt werden, abhängig von der Elektroporationsausrüstung, die ausgewählt wird. Auf jeden Fall wird die Ausrüstung in Übereinstimmung mit der Anleitung des Herstellers konfiguriert, um Feldstärke und Abfallparameter bereitzustellen, wie oben offenbart wird. Elektroporationsausrüstung ist von kommerziellen Anbietern erhältlich (z.B. BioRad Laboratories, Hercules, CA).
Zellen, in die der veränderte Ort eingeführt wurde, werden unter Bedingungen kultiviert, die selektiv für die Anwesenheit des selektierbaren Markers, wie oben offenbart wird, sind.
Zellen, die man nach der Kultivierung unter selektiven Bedingungen erhält, werden dann analysiert, um eine Untergruppe der Zellen zu identifizieren, in die der geänderte Ort und der selektierbare Marker chromosomal durch homologe Rekombination integriert wurde. Tandem-Duplikation des chromosomalen Zielortes, die aus homologer Rekombination resultiert, kann durch strukturelle Änderungen des Zielortes nachgewiesen werden. Transformanten, die das erwünschte homologe Rekombinationsereignis vollzogen haben, werden durch bekannte Verfahren identifiziert, wie Southern Blotting (siehe z.B. Strathern und Higgins, Methods Enzymol. 194: 319–329, 1991) oder Polymerase-Kettenreaktion. Für Southern Blotting wird genomische DNA von Transformanten und Kontrollzellen präpariert, mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut, auf einen Blot transferiert und sondiert, um eine Änderung in dem Restriktionsmuster nach der Transformation nachzuweisen.
Reagenzien, Materialien, Ausrüstung und Protokolle für die Vorbereitung und Sondierung von Blots sind von kommerziellen Anbietern erhältlich. Alternativ kann der Zielbereich durch PCR amplifiziert und durch Gelelektrophorese analysiert werden, um eine Größenänderung nachzuweisen.
Wie ausführlicher in Beispiel 3 unten offenbart wird, ließ die Selektion für den Ade⁺-Phänotyp zwei Klassen von Transformanten wachsen. Eine Klasse wuchs schnell als weiße Kolonien auf der primären Translationsplatte. Die zweite Klasse wurde als schnell wachsende weiße Papillen an den Rändern von instabilen rosafarbenen Transformanten offensichtlich. Analyse durch Southern Blotting zeigte, dass 19% der ersten Klasse von Transformanten homologer Rekombination unterworfen war, während 89% der Zellen von den weißen Papillen homologe Rekombinanten waren.
Zellen mit der erwünschten Tandem-Duplikation werden dann unter Bedingungen kultiviert, unter denen prototrophe Zellen wachsen und einen ersten Phänotyp zeigen und auxotrophe Zellen wachsen und einen zweiten Phänotyp zeigen. Die Kulturbedingungen sind nicht selektiv, um spontanes Looping-out des integrierten selektierbaren Markers und der Wildtyp-Kopie des Zielortes zu erlauben, wie in 1 gezeigt wird. Diese phänotypische Differenzierung wird zum Beispiel durch Kultivierung der Zellen in reichen Medien, die begrenzende Mengen von Adenin enthalten, so dass Ade^–-Zellen wachsen können, aber die Ade^–-Kolonien rosafarbig sind, erreicht.
Auxotrophe (Ade^–)-Zellen werden dann gewonnen. Eine Untergruppe der auxotrophen Zellen, in die der veränderte Ort chromosomal integriert wurde, wird dann unter Verwendung von konventionellen analytischen Verfahren identifiziert, wie durch PCR oder Restriktionsenzymverdau und Southern Blotting, wie oben offenbart wird. Mitotische Rekombination kann in dem Looping-out von jeder Kopie des Tandemverdoppelten Ortes resultieren. Die erwünschten Zellen sind diejenigen, in denen der selektierbare Marker und die Wildtyp-chromosomalen Sequenzen Looping-out durchgeführt haben, was eine einzelne, unterbrochene Kopie des chromosomalen Zielortes hinterlässt (1).
Die Gegenwart einer Änderung in dem chromosomalen Zielort kann weiter durch Assays, einschließlich Aktivitäts-Assays, Endonukleaseverdau und Southern Blot-Analyse, und Wachstumsphänotyp-Assays bestätigt werden. Unter bestimmten Umständen kann es notwendig sein, eine Vielzahl von Orten zu ändern, um den erwünschten Phänotyp zu erhalten. Zum Beispiel kann vakuoläre Proteasedefizienz durch Eliminierung von Proteinase A- und Proteinase B-Aktivitäten erhalten werden. Vakuoläre Proteaseaktivität (und dadurch vakuoläre Proteasedefizienz) wird unter Verwendung von verschiedenen bekannten Assays gemessen. Bevorzugte Assays sind diejenigen, die für Saccharomyces cerevisiae entwickelt wurden und durch Jones, Methods Enzymol. 194: 428–453, 1991, offenbart werden. Ein solcher bevorzugter Assay ist der APE-Overlay-Assay, der die Aktivität von Carboxypeptidase Y (CpY) nachweist. Kurz gefasst weist der Assay die Carboxypeptidase Y-vermittelte Freisetzung von β-Naphthol aus einem Ester nach, was in der Bildung eines unlöslichen roten Farbstoffes durch die Reaktion des β-Naphthols mit dem Diazoniumsalz Fast Garnet GBC resultiert. Die Kolonien werden mit einer 0,6%igen Agarlösung von N-Acetyl-DL-phenylalanin-β-naphthylester, die 1 mg/ml Dimethylformamid enthält, überschichtet. Nachdem sich der Überzug verhärtet hat, werden die Platten mit einer Lösung von Fast Garnet GBC (5 mg/ml in 0,1 Mol Tris-HCl, pH 7,3–7,5) überflutet. Innerhalb weniger Minuten werden Cpy⁺-Kolonien rot. Carboxypeptidase Y-Aktivität kann auch durch den Vertiefungstest nachgewiesen werden, bei dem Zellen in Vertiefungen einer Mikrotiter-Testplatte verteilt werden und in der Gegenwart von N-Benzoyl-L-tyrosin-p-nitroanilid (BTPNA) und Dimethylformamid inkubiert werden. Die Zellen werden durch das Dimethylformamid durchlässig gemacht und CpY in den Zellen spaltet die Amidbindung in dem BTPNA, um ein gelbes Produkt p-Nitroanilin zu ergeben. Assays für CpY werden auch jede Mutation nachweisen, die Proteaseaktivität reduziert, so lang wie diese Aktivität letztendlich in der Reduktion von CpY-Aktivität resultiert. Proteinase B-Aktivität kann unter Verwendung eines HPA-Overlay-Testes nachgewiesen werden, der die Solubilisierung von Hide Powder Azure durch Proteinase B nachweist. Kolonien, die das Enzym produzieren, sind von einem klaren Halo umgeben, während Mangelmutanten bedeckt bleiben. Carboxypeptidase S kann unter Verwendung eines Vertiefungstests beurteilt werden, der die Freisetzung von Leucin aus Carbobenzoxyglycyl-L-leucin nachweist. In der Gegenwart von L-Aminosäureoxidase wird H₂O₂ durch die Oxidation des freien Leucins produziert. Das H₂O₂ reagiert mit o-Dianisidin-dihydrochlorid in der Gegenwart von Peroxidase, um oxidiertes Dianisidin zu produzieren, das dunkelbraun ist. Es sind zusätzliche Assays bekannt und ihre Ausführung liegt innerhalb des Niveaus normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet.
Stämme mit veränderten Zielorten sind als Wirte für die Expression von heterologen Genen nützlich. Verfahren für die Einführung heterologer DNAs in P. methanolica, Kultivierung der Zellen und Expression heterologer Gene werden in WIPO-Veröffentlichung WO 9717450 offenbart. Zellen, die mit heterologer DNA transformiert werden sollen, werden eine Mutation aufweisen, die durch einen selektierbaren Marker auf dem heterologen DNA-Molekül komplementiert werden kann. Da der selektierbare Marker aus dem Chromosom in dem Loop-out-Schritt, der oben offenbart wird, exzidiert wird, ist es bequem, den selben Marker bei der Einführung eines Genes, das ein Protein von Interesse codiert, zu verwenden. Diejenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, werden jedoch erkennen, dass auch ein unterschiedlicher Marker verwendet werden kann. Selektion bestimmter Zell- und Markerkombinationen liegt innerhalb des Niveaus normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet.
Proteine, die in P. methanolica hergestellt werden können, beinhalten Proteine von gewerblichem und pharmazeutischem Interesse. Solche Proteine beinhalten höhere eukaryote Proteine von Pflanzen und Tieren, insbesondere von Wirbeltieren wie Säugetieren, obwohl bestimmte Proteine von Mikroorganismen auch von großem Wert sind. Beispiele für Proteine, die hergestellt werden können, beinhalten Enzyme wie Lipasen, Cellulasen und Proteasen; Enzyminhibitoren, einschließlich Proteaseinhibitoren; Wachstumsfaktoren wie Thrombozyten-Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und epidermalem Wachstumsfaktor; Cytokine wie Erythropoetin und Thrombopoetin und Hormone wie Insulin, Leptin und Glucagon.
DNA-Moleküle für die Verwendung bei der Transformation von P. methanolica werden im Allgemeinen als doppelsträngige zirkuläre Plasmide, die vorzugsweise vor der Transformation linearisiert werden, hergestellt. Für Polypeptid- oder Proteinproduktion werden die DNA-Moleküle, zusätzlich zu dem oben offenbarten selektierbaren Marker, eine Expressionskassette, die einen Transkriptionspromotorumfasst, ein DNA-Segment (z.B. eine cDNA), die das Polypeptid oder ein Protein von Interesse codiert, und einen Transkriptionsterminator mit einschließen. Diese Elemente sind operabel gebunden, um für die Transkription des DNA-Segmentes von Interesse zu sorgen. Es wird bevorzugt, dass der Promotor und Terminator von einem P. methanolica-Gen stammt. Nützliche Promotoren beinhalten diejenigen von konstitutiven und Methanolinduzierbaren Promotoren. Promotorsequenzen sind im Allgemeinen innerhalb 1,5 kb stromaufwärts der Codierungssequenz eines Genes enthalten, oft innerhalb 1 kb oder weniger. Im Allgemeinen sind regulierte Promotoren größer als konstitutive Promotoren aufgrund der Gegenwart von regulatorischen Elementen. Methanol-induzierbare Promotoren, die sowohl positive wie auch negative regulatorische Elemente beinhalten, können sich über mehr als 1 kb stromaufwärts von dem Start-ATG erstrecken. Promotoren werden durch Funktion identifiziert und können gemäß bekannten Verfahren geklont werden.
Ein besonders bevorzugter Methanol-induzierbarer Promotor ist derjenige eines P. methanolica-Alkohol-Verwertungsgens. Eine repräsentative Codierungsstrang-Sequenz eines solchen Genes, AUG1, wird in SEQ ID NR.: 2 gezeigt. Innerhalb SEQ ID NR.: 2 liegt das Start-ATG-Codon bei den Nukleotiden 1355–1357. Die Nukleotide 1–23 von SEQ ID NR.: 2 sind non-AUG1-Polylinkersequenz. Es wird besonders bevorzugt, als einen Promotor ein Segment zu verwenden, das die Nukleotide 24–1354 von SEQ ID NR.: 2 umfasst, obwohl zusätzliche stromaufwärts gelegene Sequenz eingeschlossen werden kann. P. methanolica enthält ein zweites Alkohol-Verwertungsgen, AUG2, dessen Promotor bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Eine partielle DNA-Sequenz eines AUG2-Klons wird in SEQ ID NR.: 3 gezeigt. AUG2-Promotorsegmente, die innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden im Allgemeinen die Nukleotide 91–169 von SEQ ID NR.: 3 umfassen, obwohl von kleineren Verkürzungen an dem 3'-Ende nicht erwartet wird, dass sie die Promotorfunktion aufheben. Andere nützliche Promotoren beinhalten diejenigen der Dihydroxyacetonsynthase (DHAS)-, Formatdehydrogenase (FMD)- und Katalase (CAT)-Gene. Gene, die diese Enzyme von anderen Arten codieren, wurden beschrieben und ihre Sequenzen sind erhältlich (z.B. Janowicz et al., Nuc. Acids Res. 13: 2043, 1985; Hollenberg und Janowicz, EPO-Veröffentlichung 0 299 108; Didion und Roggenkamp, FEBS Lett. 303: 113, 1992). Gene, die diese Proteine codieren, können unter Verwendung der bekannten Sequenzen als Sonden oder durch vergleichende Anordnung bekannter Sequenzen, Entwicklung von Primern, die auf der Anordnung basieren und Amplifizierung von P. methanolica-DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion geklont werden.
Konstitutive Promotoren sind diejenigen, die nicht durch Umgebungsbedingungen aktiviert oder inaktiviert werden; sie sind immer transkriptionell aktiv. Bevorzugte konstitutive Promotoren für die Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung beinhalten diejenigen von Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-, Triosephosphat-Isomerase- und Phosphoglycerat-Kinasegenen von P. methanolica. Diese Gene können, wie oben offenbart oder durch Komplementierung in einer Wirtszelle, wie einer Saccharomyces cerevisiae-Zelle, mit einer Mutation in dem komplementären Gen geklont werden. Mutanten dieser Art sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe zum Beispiel Kawasaki und Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108: 1107–1112, 1982; McKnight et al., Cell 46: 143–147, 1986; Aguilera und Zimmermann, Mol. Gen. Genet. 202: 83–89, 1986.
Die DNA-Konstrukte, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können weiter zusätzliche Elemente wie einen Ursprung der Replikation und einen selektierbaren Marker enthalten, die Amplifizierung und Erhaltung der DNA in einem wechselnden Wirt (z.B. E. coli) erlauben. Um die Integration der DNA in das Wirtschromosom zu erleichtern, wird es bevorzugt, dass das gesamte Expressionssegment, umfassend das Promotorgen von Interesse, Terminator plus selektierbarem Marker, an beiden Enden durch Wirts-DNA-Sequenzen flankiert wird. Dies wird bequem durch Einschluss einer 3'-untranslatierten DNA-Sequenz an dem Stromabwärtsende des Expressionssegmentes und sich Verlassen auf die Promotorsequenz an dem 5'-Ende erreicht. Wenn lineare DNA verwendet wird, wird das Expressionssegment durch Spaltungsorte flankiert werden, um die Linearisierung des Moleküls und Trennung des Expressionssegmentes von anderen Sequenzen (z.B. ein bakterieller Ursprung der Replikation und des selektierbaren Markers) zu erlauben. Solch bevorzugte Spaltungsorte sind diejenigen, die durch Restriktionsendonukleasen, die selten innerhalb einer DNA-Sequenz schneiden, wie diejenigen, die Acht-Basen-Zielsequenzen erkennen (z.B. Not I), erkannt werden.
Heterologe DNA wird in P. methanolica-Zellen wie oben offenbart eingeführt. Ein bevorzugtes Verfahren ist Elektroporation. Elektroporation von P. methanolica wird bevorzugt bei Zellen in frühem Logphasenwachstum durchgeführt. Die Zellen werden typischerweise durch Inkubation bei ungefähr 30°C für ungefähr 5 bis 30 Minuten in einer gepufferten Lösung bei pH 6–8, die einen reduzierenden Wirkstoff wie Dithiothreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol (BME) enthält, um Zellwandproteine zu reduzieren, um die darauf folgende Aufnahme von DNA zu erleichtern, elektrokompetent gemacht. Die Zellen werden dann geerntet und in einem geeigneten Elektroporationspuffer gewaschen, der eiskalt verwendet wird. Geeignete Puffer in dieser Hinsicht beinhalten pH 6–8-Lösungen, die einen schwachen Puffer, divalente Kationen (z.B. Mg⁺⁺, Ca⁺⁺) und einen osmotischen Stabilisator (z.B. einen Zucker) enthalten. Ein bevorzugter Elektroporationspuffer ist STM (270 mMol Saccharose, 10 mMol Tris, pH 7,5, 1 mMol MgCl₂). Bei einem bevorzugten Protokoll werden die Zellen zwei Waschungen unterworfen, zuerst in dem ursprünglichen Kulturvolumen von eiskaltem Puffer, dann in einer Hälfte des ursprünglichen Volumens. Nach der zweiten Waschung werden die Zellen geerntet und erneut suspendiert, wobei typischerweise ungefähr 3–5 ml Puffer für ein ursprüngliches Kulturvolumen von 200 ml verwendet wird.
Elektroporation wird unter Verwendung eines kleinen Volumens an elektrokompetenten Zellen (typischerweise ungefähr 100 μl) und bis zu einem zehntel Volumen linearer DNA-Moleküle durchgeführt. Zum Beispiel werden 0,1 ml einer Zellsuspension in einem Puffer, der 50 mMol an ionischer Stärke nicht übersteigt, mit 0,1–10 mg DNA (Volumen ≤ 10 ml) kombiniert. Diese Mischung wird in eine eiskalte Elektroporationsküvette platziert und einem gepulsten elektrischen Feld von 2,5 bis 4,5 kV/cm, vorzugsweise ungefähr 3,75 kV/cm, und einer Zeitkonstante von ungefähr 20 Millisekunden, mit einem exponentiellen Abfall unterworfen. Nachdem sie gepulst wurden, werden die Zellen ungefähr 10 × in 1 ml von YEPD-Brühe verdünnt und bei 30°C für eine Stunde inkubiert.
Die Zellen werden dann geerntet und auf selektive Medien plattiert. Zellen mit einer ade2-Mutation, die mit einem ADE2-selektierbaren Marker transformiert wurden, können auf ein Minimalmedium plattiert werden, dem es an Adenin mangelt, wie ADE D (Tabelle 1) oder ADE DS (Tabelle 1). Bei einer typischen Vorgehensweise werden 250 ml Aliquots von Zellen auf 4 getrennte ADE D- oder ADE DS-Platten plattiert, um Ade⁺-Zellen zu selektieren.
Für die Proteinproduktion werden P. methanolica-Zellen in einem Medium, das angemessene Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelemente umfasst, bei einer Temperatur von ungefähr 25°C bis 35°C kultiviert. Flüssige Kulturen werden mit ausreichender Belüftung durch konventionelle Mittel wie Schütteln kleiner Kolben oder Anschwänzen von Fermentoren versorgt. Ein bevorzugtes Kulturmedium ist YEPD (Tabelle 1). Die Zellen können durch Verdünnung in frisches Kulturmedium überführt werden oder für kurze Zeiträume auf Platten unter Tiefgefrierung gelagert werden. Für langfristige Lagerung werden die Zellen vorzugsweise in einer 50%igen Glyzerollösung bei –70°C gehalten.
Tabelle 1
YEPD

2% D-Glucose
2% Bacto^TM-Pepton (Difco Laboratories, Detroit, MI)
1% Bacto^TM-Hefeextrakt (Difco Laboratories)
0,004% Adenin
0,006% L-Leucin

ADE D

0,056% -Ade-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung

ADE DS

0,056% -Ade-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung
18,22% D-Sorbitol

LEU D

0,052% -Leu-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung

HIS D

0,052% -His-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung

URA D

0,056% -Ura-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung

URA DS

0,056% -Ura-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung
18,22% D-Sorbitol

-Leu-Trp-Thr-Pulver

Pulver, hergestellt durch Kombination von 4,0 g Adenin, 3,0 g Arginin, 5,0 g Asparaginsäure, 2,0 g Histidin, 6,0 g Isoleucin, 4,0 g Lysin, 2,0 g Methionin, 6,0 g Phenylalanin, 5,0 g Serin, 5,0 g Tyrosin, 4,0 g Uracil und 6,0 g Valin (alles L-Aminosäuren)

-His-Trp-Thr-Pulver

Pulver, hergestellt durch Kombination von 4,0 g Adenin, 3,0 g Arginin, 5,0 g Asparaginsäure, 6,0 g Isoleucin, 8,0 g Leucin, 4,0 g Lysin, 2,0 g Methionin, 6,0 g Phenylalanin, 5,0 g Serin, 5,0 g Tyrosin, 4,0 g Uracil und 6,0 g Valin (alles L-Aminosäuren)

-Ura-Trp-Thr-Pulver

Pulver, hergestellt durch Kombination von 4,0 g Adenin, 3,0 g Arginin, 5,0 g Asparaginsäure, 2,0 g Histidin, 6,0 g Isoleucin, 8,0 g Leucin, 4,0 g Lysin, 2,0 g Methionin, 6,0 g Phenylalanin, 5,0 g Serin, 5,0 g Tyrosin und 6,0 g Valin (alles L-Aminosäuren)

-Ade-Trp-Thr-Pulver

Pulver, hergestellt durch Kombination von 3,0 g Arginin, 5,0 g Asparaginsäure, 2,0 g Histidin, 6,0 g Isoleucin, 8,0 g Leucin, 4,0 g Lysin, 2,0 g Methionin, 6,0 g Phenylalanin, 5,0 g Serin, 5,0 g Tyrosin, 4,0 g Uracil und 6,0 g Valin (alles L-Aminosäuren)

200X Tryptophan, Threoninlösung

3,0% L-Threonin, 0,8% L-Tryptophan in H₂O Für Platten, Zugabe von 1,8% Bacto^TM Agar (Difco Laboratories)

P. methanolica erkennt bestimmte selten auftretende Sequenzen, bezeichnet als autonom replizierende Sequenzen (ARS), als Ursprünge von DNA-Replikation und diese Sequenzen können zufällig innerhalb eines DNA-Moleküls, das für die Transformation verwendet wird, auftreten, was es ermöglicht, die transformierende DNA extrachromosomal zu halten. Integrative Transformanten werden jedoch im Allgemeinen für die Verwendung bei Proteinproduktionssystemen bevorzugt. Solche Zellen können ohne kontinuierlichen selektiven Druck vermehrt werden, da DNA selten von dem Genom verloren geht. Die Integration von DNA in das Wirtschromosom kann durch Southern Blot-Analyse bestätigt werden. Kurz gefasst wird transformierte und untransformierte Wirts-DNA mit Restriktionsendonukleasen verdaut, durch Elektrophorese getrennt, auf eine Trägermembran geblottet und mit geeigneten Wirts-DNA-Segementen sondiert. Unterschiede in den Mustern der Fragmente, die in untransformierten und transformierten Zellen gesehen werden, lassen auf integrative Transformation schließen. Restriktionsenzyme und Sonden können ausgewählt werden, um transformierende DNA-Segmente (z.B. Promotor, Terminator, heterologe DNA und selektierbare Markersequenzen) zwischen den Genomfragmenten zu identifizieren.
Unterschiede in den Expressionsspiegeln von heterologen Proteinen können aus solchen Faktoren wie dem Ort der Integration und der Kopienanzahl der Expressionskassette und Unterschieden in der Promotoraktivität zwischen einzelnen Isolaten resultieren. Es ist daher vorteilhaft, eine Anzahl von Isolaten auf den Expressionslevel vor der Auswahl eines Produktionsstammes zu screenen. Eine Vielzahl geeigneter Screening-Verfahren ist erhältlich. Zum Beispiel lässt man Transformantkolonien auf Platten wachsen, die mit Membranen (z.B. Nitrocellulose) überschichtet sind, die Protein binden. Proteine werden aus den Zellen durch Sekretion oder nach Lyse freigesetzt und binden an die Membran. Gebundenes Protein kann dann unter Verwendung bekannter Verfahren, einschließlich Immunoassays, untersucht werden. Eine genauere Analyse von Expressionsspiegeln kann durch Kultivierung von Zellen in Flüssigmedien und Analysierung von konditionierten Medien oder Zell-Lysaten, wie angebracht ist, erhalten werden. Verfahren für die Konzentration und Reinigung von Proteinen aus Medien und Lysaten werden zum Teil durch das Protein von Interesse bestimmt. Solche Verfahren werden durch den geübten Anwender einfach ausgewählt und durchgeführt.
Für die Proteinproduktion in kleinem Maßstab (z.B. Platten- oder Schüttelkolbenproduktion) lässt man P. methanolica-Transformanten, die eine Expressionskassette tragen, die einen Methanol-regulierten Promotor (wie den AUG1-Promotor) umfasst, in der Gegenwart von Methanol und der Abwesenheit von beeinflussenden Mengen anderer Kohlenstoffquellen (z.B. Glucose) wachsen. Für Experimente im kleinen Maßstab, einschließlich vorläufigem Screening auf Expressionsspiegel, kann man Transformanten bei 30°C auf festen Medien wachsen lassen, die zum Beispiel 20 g/l Bacto-Agar (Difco), 6,7 g/l Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (Difco), 10 g/l Methanol, 0,4 mg/l Biotin und 0,56 g/l -Ade-Thr-Trp-Pulver enthalten. Da Methanol eine flüchtige Kohlenstoffquelle ist, geht es bei längerer Inkubation einfach verloren. Ein kontinuierlicher Nachschub an Methanol kann durch Platzierung einer Lösung von 50% Methanol in Wasser in die Deckel der umgedrehten Platten bereitgestellt werden, wodurch das Methanol durch Verdunstungstransfer auf die wachsenden Zellen übertragen wird. Im Allgemeinen wird nicht mehr als 1 ml Methanol pro 100 mm Platte verwendet. Experimente in etwas größerem Maßstab können unter Verwendung von Kulturen, die in Schüttelkolben wachsen, durchgeführt werden. Bei einem typischen Vorgehen werden die Zellen für zwei Tage auf Minimal-Methanol-Platten, wie oben offenbart wird, bei 30°C kultiviert, dann werden die Kolonien verwendet, um ein kleines Volumen von Minimal-Methanol-Medien (6,7 g/l Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 10 g/l Methanol, 0,4 mg/l Biotin) mit einer Zelldichte von ungefähr 1 × 10⁶ Zellen/ml zu beimpfen. Man lässt die Zellen bei 30°C wachsen. Zellen, die auf Methanol wachsen, weisen einen hohen Sauerstoffbedarf auf, was heftiges Schütteln während der Kultivierung erforderlich macht. Methanol wird täglich aufgefüllt (typischerweise 1/100 Volumen von 50% Methanol pro Tag).
Für die Kultivierung im Produktionsmaßstab werden frische Kulturen von Hochleistungsklonen in Schüttelkolben vorbereitet. Die resultierenden Kulturen werden dann verwendet, um Kulturmedium in einen Fermentor zu impfen. Typischerweise wird eine 500 ml-Kultur in YEPD, gewachsen bei 30°C für 1–2 Tage mit heftiger Bewegung, verwendet, um einen 5-Liter-Fermentor zu beimpfen. Man lässt die Zellen in einem geeigneten Medium, das Salze, Glucose, Biotin und Spurenelemente bei 28°C, pH 5,0 und über 30% gelöstes O₂ enthält, wachsen. Nachdem die Anfangscharge an Glucose aufgebraucht ist (wie durch eine Abnahme beim Sauerstoffverbrauch angezeigt wird), wird eine Glucose-Methanolnahrung an das Gefäß abgegeben, um die Produktion des Proteins von Interesse zu induzieren. Da Fermentation in großem Maßstab unter Bedingungen der Begrenzung von Kohlenstoff durchgeführt wird, unterdrückt die Gegenwart von Glucose in der Nahrung nicht den Methanol-induzierbaren Promotor. Die Verwendung von Glucose in Kombination mit Methanol unter Glucose-begrenzten Bedingungen ruft schnelles Wachstum, effiziente Konversion von Kohlenstoff zu Biomasse und schnelle Änderungen in den physiologischen Wachstumsstadien hervor, während dennoch die vollständige Induktion von Methanol-induzierbaren Genpromotoren bereitgestellt wird. Bei einem typischen Fermentierungsdurchlauf erhält man eine Zelldichte von ungefähr 80 bis ungefähr 400 Gramm feuchter Zellpaste pro Liter. "Feuchte Zellpaste" bezieht sich auf die Masse von Zellen, die man durch Ernten der Zellen aus dem Fermentor, typischerweise durch Zentrifugation der Kultur, erhält.
Für industrielle Prozesse im großen Maßstab, bei denen es erwünscht ist, die Verwendung von Methanol zu minimieren, wird es bevorzugt, Wirtszellen mit einem genetischen Defekt in einem Gen, das für die Methanolverwertung erforderlich ist, zu verwenden. Solche Gene beinhalten die Alkoholoxidasegene AUG1 und AUG2, wie auch Gene, die Katalase, Formaldehyd, Dehydrogenase, Formatdehydrogenase, Dihydroxyacetonsynthase, Dihydroxyacetonkinase, Fructose-1,6-bisphosphat-aldolase und Fructose-1,6-bisphosphatase codieren. Es wird besonders bevorzugt, Zellen zu verwenden, bei denen beide Alkoholoxidasegene (AUG1 und AUG2) deletiert oder anders verändert sind, um ihre Aktivität zu eliminieren. Solche Veränderungen können durch das Loop-in-/Loop-out-Verfahren der vorliegenden Erfindung oder durch gerichteten Genersatz erreicht werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1
P. methanolica-Zellen (Stamm CBS6515 von American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden durch UV-Aussetzung mutagenisiert. Eine Tötungskurve wurde zuerst durch Plattierung von Zellen auf verschiedene Platten mit ungefähr 200–250 Zellen/Platte erzeugt. Die Platten wurden dann UV-Bestrahlung unter Verwendung einer germiziden G8T5 Lampe (Sylvania), die 25 cm über der Oberfläche der Platten hing, für Zeiträume, wie in Tabelle 2 gezeigt wird, ausgesetzt. Die Platten wurden dann vor sichtbaren Lichtquellen geschützt und bei 30°C für zwei Tage inkubiert.
Tabelle 2 Lebensfähige Zellen
Es wurde dann Mutagenese in großem Maßstab unter Verwendung einer 2 Sekunden langen UV-Aussetzung, um ungefähr 20% Tötung bereitzustellen, durchgeführt. Zellen wurden mit ungefähr 10⁴ Zellen/Platte auf acht YEPD-Platten plattiert, denen jeweils 100 mg/l Uracil, Adenin und Leucin, die zugegeben wurden, um das Wachstum potentieller Auxotropher mit den zugehörigen Defiziten zu ergänzen, zugesetzt wurde. Nach der UV-Aussetzung wurden die Platten in Folie eingewickelt und über Nacht bei 30°C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Kolonien auf den Platten (~10⁵ gesamt) in Wasser erneut suspendiert und einmal mit Wasser gewaschen. Es wurde eine Menge an Zellsuspension, die ausreichte, um eine OD₆₀₀ von 0,1–0,2 zu ergeben, verwendet, um 500 ml Minimal-Brühe, die mit Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren oder Ammoniak, ergänzt mit 1% Glucose und 400 μg/l Biotin, hergestellt wurde, zu beimpfen. Die Kultur wurde in einen 2,8 l Bell-Schikanenkolben platziert und über Nacht heftig bei 30°C geschüttelt. Am folgenden Tag hatten die Zellen einen OD₆₀₀ von –1,0–2,0 erreicht. Die Zellen wurden pelletiert und in 500 ml Minimal-Brühe, die mit 5 g/l Ammoniumsulfat ergänzt war, erneut suspendiert. Die Zellsuspension wurde in einen 2,8 l Bell-Schikanenkolben platziert und bei 30°C für 6 Stunden heftig geschüttelt. 50 ml der Kultur wurden in einem 250 ml Kolben als eine Kontrolle zur Seite gestellt und zu dem Rest der Kultur wurde 1 mg Nystatin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zugeben, um auxotrophe Mutanten zu selektieren (Snow, Nature 211: 206–207, 1966). Die Kulturen wurden mit Schütteln für eine zusätzliche Stunde inkubiert. Die Kontroll- und mit Nystatin behandelten Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und dreimal mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden auf eine OD₆₀₀ von 1,0 in 50% Glyzerol erneut suspendiert und gefroren. Die Titrierung von mit Nystatin behandelten Zellen gegen die Kontrollzellen auf Kolonie-bildende Einheiten zeigte, dass Nystatinanreichung die Anzahl überlebensfähiger Zellen um einen Faktor von 10⁴ verringert hatte.
10^–2-Verdünnungen von mit Nystatin behandelten Zellen wurden auf 15 YEPD-Platten plattiert. Die Kolonien wurden auf Minimalplatten (2% Agar, 1 × YNB, 2% Glucose, 400 μg/l Biotin) replikaplattiert. Die Frequenz von Auxotrophen lag bei ungefähr 2–4%. Ungefähr 180 auxotrophe Kolonien wurden für YEPD + Ade, Leu, Ura-Platten ausgewählt und auf verschiedene Dropout-Platten replikaplattiert. Alle Auxotrophen waren Ade^–. Von diesen waren 30 auf den Dropout-Platten wahrnehmbar rosa (LEU D, HIS D, etc.; siehe Tabelle 1). Von den 30 rosafarbenen Mutanten wurden 21 für weitere Untersuchungen ausgewählt; die übrigen waren entweder durchlässig für Wachstum auf ADE D-Platten oder mit Wildtyp-Zellen kontaminiert.
Die Ade^–-Mutanten wurden dann Komplementierungsanalyse und phänotypischer Testung unterworfen. Um die Anzahl von Orten, die durch die Mutanten definiert werden, zu bestimmen, wurden alle 21 Mutanten mit einem einzelnen rosafarbenen Ade^–-Testerstamm (Stamm #2) gepaart. Die Paarung wurde durch Mischung der Zellsuspensionen (OD₆₀₀ = 1) und Plattierung der Mischungen in 10 μl Aliquots auf YEPD-Platten durchgeführt. Die Zellen wurden dann auf SPOR-Medien (0,5% Natriumacetat, 1% Kaliumchlorid, 1% Glucose, 1% Agar) repliziert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden dann auf ADE D-Platten für die Auszählung des Phänotyps replikaplattiert. Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, schafften es einige Kombinationen von Mutanten nicht, ADE⁺-Kolonien zu ergeben (möglicherweise den gleichen genetischen Ort definierend wie in Stamm #2), während andere zahlreiche Ade⁺-Kolonien erzeugten (möglicherweise einen separaten Genort definierend). Da Mutant #3 Ade⁺-Kolonien ergab, wenn er mit #2 gepaart wurde, wurde die Komplementierungstestung mit Mutant #3 wiederholt. Wenn die Gruppe von Mutanten zwei Genorte definierte, dann sollten alle Mutanten, die es nicht schafften, Ade⁺-Kolonien zu ergeben, wenn sie mit Stamm #2 gepaart wurden, Ade⁺-Kolonien ergeben, wenn sie mit #3 gepaart würden. Ergebnisse der Kreuzungen werden in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, fielen die meisten Mutanten in eine der beiden Gruppen, was mit der Idee konsistent ist, dass es zwei Adenin-biosynthetische Gene gibt, die wenn sie fehlen, in rosafarbenen Kolonien auf limitierenden Adenin-Medien resultieren. Drei Kolonien (#4, #12 und #16) können entweder einen dritten Ort definieren oder intragenetische Komplementierung aufweisen. Es wurden zwei intensiv pigmentierte Mutanten von jeder der zwei Komplementierungsgruppen (#3 und #10; #6 und #11) für weitere Charakterisierung ausgewählt. Zusätzliche Analyse zeigte an, dass Ade^– die einzige Auxotrophie war, die in diesen Stämmen vorlag.
Eine P. methanotica-Klonbank wurde in dem Vektor pRS426 konstruiert, einem Shuttle-Vektor, der 2 μ und S. cerevisiae URA3-Sequenzen umfasst, was ihm erlaubt, in S. cerevisiae vermehrt zu werden. Genomische DNA wurde aus Stamm CBS6515 gemäß Standardvorgehensweisen hergestellt. Kurz gefasst wurden Zellen über Nacht in reichen Medien kultiviert, mit Zymolyase sphäroblastiert und mit SDS lysiert. DNA wurde aus dem Lysat mit Ethanol ausgefällt und mit einer Phenol/Chloroform-Mischung extrahiert, dann mit Ammoniumacetat und Ethanol ausgefällt. Die Gelelektrophorese des DNA-Präparates zeigte die Anwesenheit von intakter DNA mit hohem Molekulargewicht und beträchtliche Mengen von RNA. Die DNA wurde mit Sau 3A durch Inkubation der DNA in der Gegenwart einer Verdünnungsreihe des Enzyms teilweise verdaut. Proben des Verdauten wurden durch Elektrophorese analysiert, um die Größenverteilung der Fragmente zu bestimmen. DNA, die zwischen 4 und 12 kb wanderte, wurde aus dem Gel geschnitten und aus der Gelscheibe extrahiert. Die größenfraktionierte DNA wurde dann an pRS426 legiert, das mit Bam HI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Aliquots der Reaktionsmischung wurden in E. coli MC1061-Zellen unter Verwendung einer BioRad Gene Pulser^TM-Vorrichtung, wie durch den Hersteller empfohlen, elektroporiert.
Die Genombibliothek wurde verwendet, um S. cerevisiae-Stamm HBY21A (ade2 ura3) durch Elektroporation zu transformieren (Becker und Guarente, Methods Enzymol. 194: 182–187, 1991). Die Zellen wurden in 1,2 Mol Sorbitol erneut suspendiert und sechs 300 μl-Aliquots wurden auf ADE D, ADE DS, URA D und URA DS-Platten plattiert (Tabelle 1). Die Platten wurden bei 30°C für 4–5 Tage inkubiert. Auf den ADE D oder ADE DS-Platten wurden keine Ade⁺-Kolonien gewonnen. Kolonien von den URA D und URA DS-Platten wurden auf ADE D-Platten replikaplattiert und zwei dicht aneinander gelegene, weiße Kolonien wurden erhalten. Diese Kolonien wurden erneut ausgestrichen und darin bestätigt, dass sie Ura⁺ und Ade⁺ waren. Diese zwei Stämme, bezeichnet als Ade1 und Ade6, wurden auf Medien ausgestrichen, die 5 FOA (5 Fluororotsäure; Sikorski und Boeke, Methods Enzymol. 194: 302–318) enthielten. Man erhielt Ura^–-Kolonien, von denen bei Replikaplattierung herausgefunden wurde, dass sie Ade^– waren. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Ade⁺-komplementierende Aktivität genetisch an den Plasmid-gebildeten URA3-Marker gebunden ist. Von Hefestämmen Ade1 und Ade6 erhaltene Plasmide schienen durch Restriktionskartierung wie unten beschrieben identisch zu sein. Diese genomischen Klone wurden als pADE1-1 bzw. pADE1-6 bezeichnet.
Gesamt-DNA wurde von den NBY21A-Transformanten Ade1 und Ade6 isoliert und verwendet, um E. coli-Stamm MC1061 zu Amp^R zu transformieren. Es wurde DNA von zwei Amp^R-Kolonien von Ade1 und 3 Amp^R-Kolonien von Ade6 bereitet. Die DNA wurde mit Pst I, Sca I und Pst I + Sca I verdaut und durch Gelelektrophorese analysiert. Alle fünf Isolate produzierten das gleiche Restriktionsmuster.
PCR-Primer wurden aus der veröffentlichten Sequenz des P. methanolica ADE2-Gens (auch bekannt als ADE1; Hiep et al., Yeast 9: 1251–1258, 1993) entwickelt. Primer ZC9080 (SEQ ID NR.: 4) wurde entwickelt, um an den Basen 406–429 der ADE2-DNA (SEQ ID NR.: 1) zu starten, und Primer ZC9079 (SEQ ID NR.: 5) wurde entwickelt, um an den Basen 2852–2829 zu starten. Beide Primer beinhalten Enden, um Avr II- und Spe I-Orte an jedem Ende der amplifizierten Sequenz einzuführen. Die vorhergesagte Größe des resultierenden PCR-Fragmentes betrug 2450 bp.
PCR wurde unter Verwendung von Plasmid-DNA von den fünf mutmaßlichen ADE2-Klonen als Matrizen-DNA durchgeführt. Die 100 ml Reaktionsmischungen enthielten 1 × Taq PCR-Puffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 10–100 ng Plasmid-DNA, 0,25 mMol dNTPs, 100 pMol von jedem Primer und 1 μl Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim). Man ließ die PCR über 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 60 Sekunden bei 50°C und 120 Sekunden bei 72°C durchlaufen. Jeder der fünf mutmaßlichen ADE2-genomischen Klone ergab ein PCR-Produkt der erwarteten Größe (2,4 kb). Die Restriktionskartierung des DNA-Fragmentes von einer Reaktion ergab die erwarteten Größenfragmente, wenn es mit Bgl II oder Sal I verdaut wurden.
Die positiven PCR-Reaktionen wurden gepoolt und mit Spe I verdaut. Vektor pRS426 wurde mit Spe I verdaut und mit intestinaler Phosphatase vom Kalb behandelt. Vier μl PCR-Fragment und 1 μl Vektor-DNA wurden in einer 10 μl Reaktionsmischung unter Verwendung konventioneller Bindungsbedingungen verbunden. Die verbundene DNA wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Spe I-Verdautes wurde analysiert, um Plasmide, die einen Subklon des ADE2-Gens innerhalb von pRS426 trugen, zu identifizieren. Das korrekte Plasmid wurde als pCZR118 bezeichnet.
Da das ADE2-Gen in pCZR118 durch PCR amplifiziert worden war, war es möglich, dass Mutationen, die den funktionellen Charakter des Gens behinderten, erzeugt worden sein könnten. Um auf solche Mutationen zu testen, wurden Subklone mit der erwünschten Insertion einzeln in Saccharomyces cerevisiae-Stamm HBY21A transformiert. Zellen wurden elektrokompetent gemacht und gemäß den Standardvorgehensweisen transformiert. Transformanten wurden auf URA D- und ADE D-Platten plattiert. Es wurden drei phänotypische Gruppen identifiziert. Die Klone 1, 2, 11 und 12 ergaben robustes Wachstum von vielen Transformanten auf ADE D. Die Transformationsfrequenz war mit der Frequenz von URA⁺-Transformanten vergleichbar. Die Klone 6; 8, 10 und 14 ergaben ebenfalls eine hohe Transformationseffizienz zu sowohl Ura⁺ wie auch Ade⁺, aber die Ade⁺-Kolonien waren etwas kleiner als diejenigen in der ersten Gruppe. Klon 3 ergab viele Ura⁺-Kolonien, aber keine Ade⁺-Kolonien, was nahe legt, dass es eine nicht-funktionelle ade2-Mutation trug. Die Klone 1, 2, 11 und 12 wurden gepoolt.
Um die P. methanolica ade2-Komplementierungsgruppe zu identifizieren, wurden zwei repräsentative Mutanten von jeder Komplementierungsgruppe (#3 und #10; #6 und #11), die auf der Basis tiefroter Pigmentierung, wenn sie auf limitierendem Adenin gezüchtet wurden, ausgewählt wurden, mit dem geklonten ADE-Gen transformiert. Zweihundert ml Kulturen von frühen Logphasezellen wurden durch Zentrifugierung bei 3000 × g für 3 Minuten geerntet und in 20 ml frischem KD-Puffer (50 mMol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 25 mMol DTT) erneut suspendiert. Die Zellen wurden in diesem Puffer bei 30°C für 15 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet und in 200 ml eiskalter STM (270 mMol Saccharose, 10 mMol Tris, pH 7,5, 1 mMol MgCl₂) erneut suspendiert. Die Zellen wurden geerntet und in 100 ml eiskalter STM erneut suspendiert. Die Zellen wurden erneut geerntet und in 3–5 ml eiskalter STM erneut suspendiert. 100 μl Aliquots von elektrokompetenten Zellen von jeder Kultur wurden dann mit Not I-verdauter pADE1-1-DNA gemischt. Die Zell/DNA-Mischung wurde in eine 2 mm Elektroporationsküvette platziert und einem gepulsten elektrischen Feld von 5 kV/cm unter Verwendung eines BioRad Gene Pulser^TM, eingestellt auf 1000 Ω Widerstand und 25 μF Kapazität, unterworfen. Nachdem sie gepulst wurden, wurden die Zellen durch Zugabe von 1 ml YEPD verdünnt und bei 30°C für eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden dann durch sanfte Zentrifugation geerntet und in 400 μl minimalselektiven Medien, denen Adenin fehlte (ADE D), erneut suspendiert. Die erneut suspendierten Proben wurden in 200 μl Aliquots aufgetrennt und auf ADE D- und ADE DS-Platten plattiert. Die Platten wurden bei 30°C für 4–5 Tage inkubiert. Die Mutanten #6 und #11 ergaben Ade⁺-Transformanten. Es wurden keine Ade⁺-Transformanten beobachtet, wenn DNA weggelassen wurde, daher schien es, dass die zwei Isolate die ade2-Komplementierungsgruppe definieren. Die ADE2-Sequenz wird in SEQ ID NR.: 1 gezeigt.
Beispiel 2
Die P. methanolica-Klonbank, die in Beispiel 1 offenbart wird, wurde als eine Quelle für die Klonierung des Alcohol Utilization Gene (AUG1) verwendet. Die Klonbank wurde als unabhängige Pools gelagert, wovon jeder ungefähr 200–250 individuelle genomische Klone darstellt. 0,1 ml von "Miniprep"-DNA von jedem Pool wurde als eine Matrize in einer Polymerase-Kettenreaktion mit PCR-Primern (ZC8784, SEQ ID NR.: 6; ZC8787, SEQ ID NR.: 7) verwendet, die aus einer Anordnung von konservierten Sequenzen in Alkoholoxidasegenen von Hansenula polymorpha, Candida boidini und Pichia pastoris entwickelt worden waren. Man ließ die Amplifikationsreaktion für 30 Zyklen von 94°C, 30 Sekunden; 50°C, 30 Sekunden; 72°C, 60 Sekunden laufen, gefolgt von einer 7-minütigen Inkubation bei 72°C. Ein Pool (#5) ergab eine ~ 600 bp-Bande (2). Die DNA-Sequenzierung dieses PCR-Produktes enthüllte, dass es eine Aminosäuresequenz mit ~ 70%iger Sequenzidentität mit der Pichia pastoris-Alkoholoxidase, codiert durch das AOX1-Gen, und ungefähr 85%ige Sequenzidentität mit der Hansenula polymorpha-Alkoholoxidase, codiert durch das MOX1-Gen, codierte. Die Sequenz des geklonten AUG1-Gens wird in SEQ ID NR.: 2 gezeigt.
Unterpools von Pool #5 wurden durch PCR unter Verwendung der gleichen Primer, die bei der anfänglichen Amplifikation verwendet wurden, analysiert. Ein positiver Unterpool wurde weiter heruntergebrochen, um eine positive Kolonie zu identifizieren. Diese positive Kolonie wurde auf Platten ausgestrichen und DNA wurde von individuellen Kolonien hergestellt. Drei Kolonien ergaben identische Muster nach Verdau mit Cla I.
Restriktionskartierung des genomischen Klons und des PCR-Produktes enthüllte, dass das AUG1-Gen auf einem 7,5 kb genomischen Insert lag und dass Orte innerhalb des PCR-Fragmentes innerhalb des genomischen Inserts einheitlich identifiziert werden konnten (2). Da die Orientierung des Gens innerhalb des PCR-Fragmentes bekannt war, stellte die letztere Information die ungefähre Lokalisierung und Richtung der Transkription des AUG1-Gens innerhalb des genomischen Inserts bereit. DNA- Sequenzierung innerhalb dieses Bereiches enthüllte ein Gen mit sehr hoher Sequenzähnlichkeit auf der Aminosäureebene mit anderen bekannten Alkoholoxidasegenen.
Beispiel 3
Um einen P. methanolica-Stamm zu erzeugen, dem vakuoläre Proteasen fehlen, wurden die PEP4- und PR81-Gene identifiziert und unterbrochen. PEP4 und PRB1-Sequenzen wurden durch PCR in Reaktionsmischungen, die 100 pMol Primer-DNA, 1 × Puffer, wie bereitgestellt (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 250 mMol dNTPs, 1–100 pMol Matrizen-DNA und 1 Einheit Taq-Polymerase in einem Reaktionsvolumen von 100 ml enthielten, amplifiziert. Die DNA wurde über 30 Zyklen von 94°C, 30 Sekunden; 50°C, 60 Sekunden und 72°C, 60 Sekunden amplifiziert.
Unter Verwendung einer Anordnung von PEP4-Sequenzen, die von S. cerevisiae (Ammerer et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2490–2499, 1986; Woolford et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2500–2510, 1986) und P. pastoris (Gleeson et al., US-Patent Nr. 5,324,660) stammten, wurden verschiedene Sinn- und Gegensinn-Primer, die zu konservierten Bereichen korrespondierten, entwickelt. Ein Primer-Set, ZC9118 (SEQ ID NR.: 8) und ZC9464 (SEQ ID NR.: 9) produzierte ein PCR-Produkt der erwarteten Größe von genomischer DNA und dieses Set wurde verwendet, um einen genomischen Klon, der zu der amplifizierten Region korrespondierte, zu identifizieren. Die DNA-Sequenzierung eines Teiles dieses genomischen Klons (gezeigt in SEQ ID NR.: 10) enthüllte einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid mit 70%iger Aminosäureidentität mit Proteinase A von S. cerevisiae codiert (SEQ ID NR.: 11).
Es wurden Primer für die Identifizierung von P. methanolica PRB1 auf der Basis von Anordnungen zwischen den PRB1-Genen von S. cerevisiae (Moehle et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4390–4399, 1987), P. pastoris (Gleeson et al., US-Patent Nr. 5,324,660) und Kluyveromyces lactis (Fleer et al., WIPO-Veröffentlichung WO 94/00579) entwickelt. Ein Primer-Set, ZC9126 (SEQ ID NR.: 12) und ZC9741 (SEQ ID NR.: 13) amplifizierte ein ca. 400 bp-Fragment von genomischer DNA (SEQ ID NR.: 14). Dieses Produkt wurde sequenziert und man fand heraus, dass es ein Polypeptid mit 70%iger Aminosäureidentität mit Proteinase B von S. cerevisiae codiert (SEQ ID NR.: 15). Das PRB-Primerset wurde dann verwendet, um einen genomischen Klon, der das P. methanolica PRB 1-Gen umfasst, zu identifizieren.
Deletionsmutationen in den P. methanolica PEP4- und PRB1-Genen wurden unter Verwendung erhältlicher Restriktionsenzymorte erzeugt. Die geklonten Gene wurden restriktionskartiert. Das pep4Δ-Allel wurde durch Deletion eines Bereiches von ungefähr 500 bp zwischen BamHI und NcoI-Orten (3) und Einschluss der Nukleotide 1 bis 393 der Sequenz, die in SEQ ID NR.: 10 gezeigt wird, geschaffen. Das prb1Δ-Allel wurde durch Deletion eines Bereiches von ungefähr 1 kbp zwischen NcoI und EcoRV-Orten (4) und Einschluss der Sequenz, die in SEQ ID NR.: 14 gezeigt wird, erzeugt. Die geklonten PEP4- und PRB1-Gene wurden in pCZR139, einem Phagemidvektor (pBluescript^® II KS(+), Stratagene, La Jolla, CA), der ein 2,4 kb SpeI ADE2-Insert trug, subkloniert, um die Deletionen zu schaffen. In dem Fall des PEP4-Gens wurde der nur einmal vorhandene BamHI-Ort in pCZR139 durch Verdau, Auffüllung und erneute Ligation eliminiert. Der Vektor wurde dann durch Verdau mit EcoRI und HindIII linearisiert und ein ca. 4 kb EcoRI-HindIII-Fragment, das das PEP4-Gen umspannt, wurde an den linearisierten Vektor gebunden, um Plasmid pCZR142 herzustellen. Es wurde dann eine ca. 500 bp-Deletion durch Verdau von pCZR142 mit BamHI und NcoI, Auffüllung an den Enden und erneute Ligation der DNA hergestellt, um Plasmid pCZR143 herzustellen. Das PRB1-Gen (~ 5 kb XhoI-BamHI-Fragment) wurde in pCZR139 subkloniert und ein inneres EcoRV-NcoI-Fragment, das die Sequenz, die in SEQ ID NR.: 14 gezeigt wird, umfasst, wurde deletiert, um Plasmid pCZR153 herzustellen.
Plasmid pCZR143 wurde mit Asp718 linearisiert, das an einem einmalig vorhandenen Ort schnitt. Das linearisierte Plasmid wurde in den P. methanolica PMAD11-Stamm (eine ade2-Mutante, erzeugt wie in Beispiel 1 offenbart) eingeführt. Transformanten wurden auf ADE DS (Tabelle 1) gezüchtet, um Ade⁺-Transformanten zu identifizieren. Zwei Klassen von weißen Ade⁺-Transformanten wurden analysiert. Eine Klasse wuchs direkt auf der primären Transformationsplatte; die zweite wurde als schnell wachsende weiße Papillen an den Rändern von instabilen, rosafarbenen Transformantenkolonien offenbar.
Es wurde Southern Blotting verwendet, um Transformanten zu identifizieren, die sich dem erwünschten homologen Integrationsereignis unterzogen hatten. 100 ml Zellpaste wurde von einer 24–48 Stunden YEPD-Platte gekratzt und in 1 ml Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 400 ml Spheroblast-Puffer (1,2 Mol Sorbitol, 10 mMol Natriumcitrat pH 7,5, 10 mMol EDTA, 10 mMol DTT, 1 mg/ml Zymolyase 100T) erneut suspendiert und bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Es wurden 400 ml 1%ige SDS zugegeben, die Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur gemischt bis sie klar war, 300 ml 5 M Kaliumacetat wurde hineingemischt und die Mischung wurde durch Mikrozentrifugation für 5 Minuten geklärt. 750 ml des geklärten Lysats wurden mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, 600 ml wurden auf ein frisches Röhrchen übertragen, 2 Volumen 100% Ethanol wurden zugegeben und die DNA wurde durch Mikrozentrifugation für 15 Minuten bei 4°C präzipitiert. Das Pellet wurde in 50 ml TE (10 mMol Tris pH 8,0, 1 mMol EDTA), enthaltend 100 mg/ml RNAase A, erneut suspendiert. Zehn ml DNA (ungefähr 100 ng) wurden in 100 ml Gesamtvolumen mit geeigneten Enzymen verdaut, mit 200 ml Ethanol präzipitiert und in 10 ml DNA-Ladefarbstoff erneut suspendiert. Die DNA wurde in 0,7% Agarosegelen getrennt und auf Nylonmembranen (Nytran N⁺, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) in einen halbtrockenen Blottingapparat (BioRad Laboratories, Richmond, CA), wie durch den Hersteller empfohlen, transferiert. Die transferierte DNA wurde denaturiert, neutralisiert und mit der Membran mit UV-Licht unter Verwendung eines Stratalinkers (Stragene, La Jolla, CA) quervernetzt. Um Stämme mit einer Tandemintegration an PEP4 zu identifizieren, wurden zwei Sonden verwendet. Eine war ein 1400 bp EcoRI-HindIII-Fragment von dem 3'-Ende von PEP4. Die zweite war ein 2000 bp BamHI-EcoRI-Fragment von dem 5'-Ende von PEP4. Die Fragmente wurden unter Verwendung von Chemilumineszenzreagenzien (ECL^TM Direct Labelling Kit; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) nachgewiesen.
Man züchtete Elternstämme, die eine Tandem-Duplikation des Wildtyps und Deletionsallele des Gens beherbergten, in YEPD-Brühe über Nacht, um die Erzeugung von Looped-out-Ade^–-Stämmen zu erlauben. Diese Zellen wurden dann in einer Dichte von 2000–5000 Kolonien pro Platte auf Adenin-limitierte YEPD-Platten plattiert, für 3 Tage bei 30°C und 3 Tage bei Raumtemperatur gezüchtet. Der Wechsel zu Raumtemperatur verstärkte die Pigmentierung von seltenen rosafarbenen Ade^–-Kolonien. Loop-out-Stämme wurden einheitlich mit einer Frequenz von ungefähr einer rosafarbenen Ade^–-Kolonie pro 10.000 gescreenten Kolonien nachgewiesen. Diese Stämme wurden auf Retention der Wildtyp- oder Mutantgene durch Southern Blotting oder durch PCR unter Verwendung von Primern, die den Ort der Deletion umspannten, gescreent. Ein ade2-11 pep4Δ-Stamm wurde als PMAD15 bezeichnet.
Das PRB1-Gen wurde dann von PMAD15 im Wesentlichen wie oben beschrieben durch Transformation mit Plasmid pCZR153 deletiert. Die Blots wurden mit PCR-generierten Sonden für innere Anteile der PRB1- und ADE2-Gene sondiert. Die PRB1-Sonde wurde durch Subklonierung eines 2,6 kb ClaI-SpeI-Fragmentes von PRB1 in den Phagemidvektor pBluescript^® II KS(+), um pCZR150 herzustellen, und Amplifizierung der erwünschten Region durch PCR unter Verwendung der Primer ZC447 (SEQ ID NR.: 16) und ZC976 (SEQ ID NR.: 17) erzeugt. Die ADE2-Sonde wurde durch Amplifizierung des ADE2-Gens in pCZR139 mit den Primern ZC9079 (SEQ ID NR.: 5) und ZC9080 (SEQ ID NR.: 4) erzeugt. Der resultierende ade2-11 pep4Δprb1Δ-Stamm wurde als PMAD16 bezeichnet.
Die Effekte der pep4Δ und pep4Δprb1Δ-Mutationen auf die vakuoläre Proteaseaktivität wurde unter Verwendung des APNE-Overlayassays bestimmt (Wolf und Fink, J. Bacteriol. 123: 1150–1156, 1975; Jones, Methods Enzymol. 194: 428–453, 1991). Proteasebefähigte Kolonien wurden bei der Zugabe des Overlays rot, während Mutanten, denen es an vakuolärer Proteaseaktivität mangelte, weiß blieben. PMAD11- und PMAD15-Kolonien produzierten eine leuchtend rote Farbe. Im Gegensatz dazu blieben Kolonien von PMAD16 weiß. Obgleich nicht gewünscht wird, durch Theorie gebunden zu werden, kann der Pep⁺-Phänotyp der pep4Δ-Mutante eine Konsequenz phänotypischer Verzögerung oder der Fähigkeit der P. methanolica-Proteinase B zur Autoaktivierung gewesen sein. Der pep4Δprb1Δ-Stamm besaß jedoch den erwünschten Proteasemangel-Phänotyp.
Beispiel 4
Eine aug1Δ-Mutation wurde in P. methanolica-Stamm PMAD11 erzeugt. Ein genomischer AUG1-Klon wird in 2 und SEQ ID NR.: 2 gezeigt. Ein Deletionsallel wurde durch Verbindung des 1350 bp AUG1-Promotors mit dem 1600 bp AUG1-Terminator und 3'-untranslatierter Sequenz, wie in 2 gezeigt wird, hergestellt. Ein lineares DNA-Konstrukt, das das Deletionsallel und einen ADE2-selektierbaren Marker umfasst, wurde in PMAD11 elektroporiert und es wurden Ade⁺-Transformanten, im Wesentlichen wie in Beispiel 3 offenbart, ausgewählt. Homologe Rekombinanten wurden durch Southern Blotting identifiziert. Es wurden Ade⁺-Auxotrophe, in denen der AUG1-Ort verdoppelt worden war, in YEPD-Brühe über Nacht kultiviert, dann auf YEPD-Platten übertragen. Rosa Kolonien wurden aufgenommen und auf Looping-out des Wildtyp-Ortes durch Southern Blotting und PCR gescreent.
Der aug1Δ-Mutantstamm, bezeichnet PMAD12, wuchs in Minimal-Methanolbrühe schwach. Auf Minimal-Methanol-Platten wies PMAD12 einen schwachen Wachstumsdefekt relativ zu den Wildtyp-Zellen auf. Diese Daten legen nahe, dass das Aug1-Protein eine wichtige Rolle bei der Methanolassimilierung, insbesondere in flüssigen Medien, spielt, aber dass P. methanolica eine zweite Alkoholoxidaseaktivität besitzt.
Beispiel 5
Ein zweites Alkoholoxidasegen wurde in P. methanolica unter Verwendung von Alkoholoxidase-spezifischen PCR-Primern identifiziert, um genomische DNA von einem aug1Δ-Mutantstamm zu amplifizieren. Ein schwaches 600 bp-Signal wurde nachgewiesen, das reamplifiziert und DNA-Sequenzierung unterworfen wurde (SEQ ID NR.: 3). Translation dieser Sequenz und Anordnung mit der Aug1-Sequenz zeigte eine 83%ige Identität mit der korrespondierenden Region des Aug1-Proteins. Das PCR- Fragment wurde dann als eine Sonde verwendet, um einen Klon in voller Länge für dieses zweite Alkoholoxidasegen, das als AUG2 bezeichnet wurde, zu identifizieren (5).
Ein unterbrochenes Allel des AUG2-Gens wurde wie in 5 gezeigt durch Deletion der zwei BglII-Fragmente innerhalb des offenen Leserahmens konstruiert.
Das aug2Δ-Mutantallel wurde mit dem ADE2-selektierbaren Marker kombiniert und das resultierende lineare Konstrukt wurde in die P. methanolica-Stämme PMAD11, PMAD12 und (aug1Δ) eingeführt. Die resultierenden Deletionsmutanten PMAD13 (aug2Δ) und PMAD14 (aug1Δaug2Δ) wurden selektiert und im Wesentlichen wie in den Beispielen 3 und 4 offenbart, identifiziert. Diese isogenen Stämme wurden auf Minimal-Methanolbrühe und Minimal-Methanol-Platten kultiviert. Die Doppelmutante war nicht in der Lage, auf Minimal-Methanol-Medien irgendeiner Art zu wachsen, was anzeigt, dass die AUG1- und AUG2-Gene die einzigen Alkoholoxidasegene in P. methanolica sind. Während der aug1Δ-Stamm auf Minimal-Methanolbrühe schwach wuchs, war die aug2Δ-Mutante vergleichbar mit Wildtyp-Zellen. Diese Daten legen nahe, dass das Aug1-Protein eine Hauptrolle in der Verwertung von Methanol während des Wachstums in flüssigen Kulturen spielt. Wenn sie auf Platten gezüchtet wurden, war der Wachstumsunterschied zwischen aug1Δ- und aug2Δ-Mutanten viel weniger ausgeprägt. Die Untersuchung von Gesamtzellextrakten durch SDS-PAGE zeigte, dass AUG2-Protein in aug1Δ-Zellen, die auf Platten gezüchtet wurden, stark induziert war, aber es wurde in Schüttelkolbenkulturen oder in Zellen, die unter Methanol-induzierten Fermentationsbedingungen gezüchtet wurden, schwach exprimiert.
Beispiel 6
Ein menschlicher Glutaminsäuredecarboxylase (GAD₆₅)-Expressionsvektor wurde durch Insertion der cDNA-codierenden menschlichen GAD₆₅ (Karlsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8337–8341, 1991) als ein EcoRI-XbaI-Fragment in die EcoRI-SpeI-Orte von Plasmid pCZR134 konstruiert (6). Der resultierende Expressionsvektor, pCZR137, umfasste den AUG1-Promotor und Terminator und ADE2-selektierbaren Marker.
Plasmid pCZR137 wurde mit NotI verdaut und verwendet, um PMAD16 zu Ade⁺ zu transformieren. Es wurden eintausend stabile Ade⁺-Transformanten auf GAD₆₅-Expression auf Minimal-Methanol-Platten unter Verwendung eines Nitrocelluloseoverlays, einer Kolonielyse und Western Blot-Technik gescreent, im Wesentlichen wie durch Wuestehube et al., Genetics 142: 393–406, 1996, offenbart. Transformanten wurden in Gitter von 50 auf Minimalplatten mit Mangel an Adenin fleckförmig aufgetragen, für 24 Stunden bei 30°C gezüchtet, auf Minimal-Methanol-Platten replikaplattiert, mit Nitrocellulose überschichtet und für mindestens 48 Stunden bei 30°C inkubiert. Die Filter wurden von den Platten entfernt und mit der Kolonieseite nach oben für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf Filterpapier, das mit Lysepuffer getränkt war (0,1% SDS, 0,2 N NaOH, 35 mMol DTT) platziert. Bruchstücke wurden von den Filtern unter einem Strom destillierten Wassers abgewaschen und die Filter wurden durch eine 5-minütige Inkubation in 0,1 Mol Essigsäure neutralisiert. Die Filter wurden dann in TTBS-NFM (20 mMol Tris pH 7,4, 160 mMol NaCl, 0,1% Tween 20, 5% fettfreie Milch) blockiert und in TTBS-NFM, das den menschlichen GAD₆₅-spezifischen monoklonalen Antikörper GAD6 enthielt, inkubiert (Chang und Gottlieb, J. Neurosci. 8: 2123–2130, 1988). Merrettichperoxidase-konjugierter Ziegen-Antimaus-Antikörper wurde verwendet, um GAD65-spezifische Immunkomplexe nachzuweisen, die mit kommerziell erhältlichen Chemilumineszenzreagenzien (ECL^TM; Amersham Inc., Arlington Heights, IL) gemäß konventioneller Techniken sichtbar gemacht wurden.
Bei 90% der Transformanten fand man, dass sie GAD₆₅ exprimieren. Sechsundvierzig Stämme, die die höchsten Spiegel von GAD₆₅ zu exprimieren schienen, wurden durch SDS-PAGE/Western-Analyse erneut untersucht. Vierundvierzig dieser Stämme schienen identische Spiegel von GAD₆₅ zu erzeugen. Southern Blot-Analyse (im Wesentlichen wie in Beispiel 3 offenbart) zeigte an, dass diese Stämme eine einzelne Kopie der GAD₆₅-Expressionskassette trugen. Zwei Stämme schienen erhöhte Spiegel an GAD₆₅ zu erzeugen. Diese beiden Stämme zeigten verzögertes Wachstum in Minimal-Methanolbrühe und die Analyse genomischer DNA von diesen Stämmen durch PCR unter Verwendung von Primern, die spezifisch für AUG1 sind, enthüllte, dass diese Stämme aug1Δ waren, was anzeigt, dass die Übertragung des Wildtyp AUG1-Gens durch die GAD₆₅-Expressionskassette aufgetreten war. Der aug1Δ-Stamm, der die höchsten offensichtlichen Spiegel von GAD₆₅ erzeugte, PGAD4-2, wurde unter Hochzelldichte-Fermentationsbedingungen in einem BioFlow 3000-Fermentor (New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ) kultiviert. Durch Suspendierung von Zellen von einer 2 Tage-YEPD-Platte in 250 ml YEPD-Brühe wurde eine Impfkultur erzeugt und die Kultur wurde heftig über Nacht in einem 1 Liter-Schikanenkolben bei 30°C geschüttelt. Das Fermentationsgefäß wurde mit 2,5 Litern Medien, die 57,8 g (NH₄)₂SO₄, 46,6 g KCl, 30,8 g MgSO₄·7 H₂O, 8,6 g CaSO₄·2 H₂O, 2,0 g NaCl und 10 ml Entschäumer enthielten, bestückt. Nach Autoklavierung und Abkühlung des Gefäßes auf eine Arbeitstemperatur von 29°C, wurden 350 ml 50% Glucose, 210 ml 30% Natriumhexametaphosphat (Phosphatglas) und 250 ml Spurenelemente (pro Liter enthaltend 27,8 g FeSO₄·7 H₂O, 0,5 g CuSO₄·5 H₂O, 1,09 g ZnCl₂, 1,35 g MnSO₄ H₂O, 0,48 g CoCl₂·6 H₂O, 0,24 g Na₂MoO₄·2 H₂O, 0,5 g H₃BO₃, 0,08 g Kl, 5 mg Biotin, 0,5 g Thiamin und 2,5 ml H₂SO₄) zugegeben. Der pH des Fermentors wurde auf 5,0 eingestellt und automatisch mit 10% Na₄OH und 10% H₃PO₄ kontrolliert. Belüftung wurde anfänglich als komprimierte Luft, die in einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 Litern/Minute und einer Impellerrührrate von 300 Upm bereitgestellt wurde, bereitgestellt. Nachdem gelöster Sauerstoff auf 100% eingestellt wurde, wurde das Zellimpfmaterial zugegeben. Die gelöste Sauerstoffkontrolle wurde so eingestellt, dass sie bei 30% innerer Sättigung und einem Rührbereich von 300–800 Upm erhalten wurde. Sauerstoffbedarf über 800 Upm aktivierte automatische Ergänzung mit reinem Sauerstoff. Die Batch-Phase des Wachstums wurde durch einen stetigen Anstieg im Bedarf über einen 24–36 Stundenzeitraum charakterisiert. Nach Erschöpfung von Glucose fiel der Sauerstoffbedarf schnell und eine Glucosenahrung (pro 1,5 Liter 750 g Glucose, 110 g (NH₄)₂SO₄ und 278 ml Spurenelemente enthaltend) wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,4% Glucose/Stunde begonnen. Nach 25 Stunden wurde der Übergang zur Methanolinduktion des AUG1-Promotors mit einer gemischten Nahrung aus Glucose (0,2%/Stunde) und Methanol (0,2%/Stunde) für 5 Stunden vorgenommen. Eine endgültige gemischte Methanolnahrung (0,1% Glucose/Stunde, 0,4% Methanol/Stunde) ließ man für 25 Stunden laufen. Eine kräftige GAD₆₅-Expression wurde durch die Zugabe von Methanol induziert. Der Expressionsspiegel von GAD₆₅ wurde bei ungefähr 500 mg/l in einer endgültigen Zellmasse von 170 Gramm feuchter Zellpaste/l berechnet.
Beispiel 5
Ein vakuoläre Protease-Mangel-(pep4Δprb1Δ) P. methanolica-Stamm, der genetisch für die Hauptalkoholoxidase deletiert ist (aug1Δ), wurde aus Stamm PMAD16 (ade2-11 pep4Δ prb1Δ) hergestellt. Dieser Stamm wurde mit dem AUG1-Unterbrechungsplasmid pCZR140-6, das mit dem Restriktionsenzym Asp718I linearisiert wurde, zu Ade⁺ transformiert. Plasmid pCZR140-6 ist ein Bluescript^® (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)-basierter Vektor, der das P. methanolica ADE2-Gen und eine Mutante von AUG1 enthält, in der der gesamte offene Leserahmen zwischen den Promotor- und Terminatorregionen deletiert wurde (7). Instabile Ade⁺-Transformanten, (die durch Rezirkularisierung der transformierenden DNA und darauf folgende episomale Vermehrung des Plasmids aufgrund der Gegenwart von ARS in dem ADE2-Marker auftreten,) wurden durch langsames Wachstum und rosa Farbe auf ADE DS-Medium identifiziert. Zellen, die das zirkuläre Episom durch homologe Rekombination integriert hatten, produzierten rasch wachsende, weiße Papillen an den Rändern langsam wachsender, rosa Kolonien.
Stabile Ade⁺-Papillen von PMAD16-Zellen, die mit dem pCZR140-6-Plasmid transformiert wurden, wurden isoliert und genomische DNA wurde vorbereitet. Die DNA wurde mit EcoRI verdaut und Southern Blot-Analyse unterworfen. Es wurde eine Sonde, die zu der AUG1-Promotorregion korrespondierte, durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer ZC9081 (SEQ ID NR.: 18) und ZC9084 (SEQ ID NR.: 19) und eines Plasmides als Primer, das das AUG1-Promotorfragment von pCZR134 enthielt, erzeugt. Sondierung des Blots enthüllte, dass 4 von 10 stabilen Ade⁺-Papillen, die untersucht wurden, eine homologe Rekombination des AUG1-Unterbrechungsplasmids in den AUG1-Promotorbereich durchgemacht hatten. Diese vier Kolonien wurden auf zahlreiche Platten eines nicht-selektiven Mediums (YEPD) ausgestrichen, um das Wachstum von sowohl Ade⁺- wie auch Ade^–-Kolonien zu erlauben. (Auf YEPD entwickelten Ade^–-Kolonien wegen des Adeninmangels und der darauf folgenden Expression des ade2(rosafarbenen)-Phänotyps eine rosa Farbe. Das integrierte AUG1-Unterbrechungsplasmid macht spontan mitotische homologe Rekombination durch, wodurch das Plasmid effektiv einem Looping-out aus dem Genom unterworfen wird. Diese "Loop-out"-Zellen können nachgewiesen werden, da sie sich zu rosafarbenen Kolonien auf nicht-selektiven Medien entwickeln. Das Looping-out des aug1Δ-Unterbrechungsplasmids stellt entweder das Wildtyp AUG1-Allel wieder her oder belässt das aug1Δ-Unterbrechungsallel in dem AUG1-Ort, abhängig von dem Ort der Rekombination.) Ade^–-Loop-out-Kolonien wurden durch PCR unter Verwendung von den Primern ZG10,635 (SEQ ID NR.: 20) und ZG14,199 (SEQ ID NR.: 21) für aug1Δ-unterbrochene Stämme gescreent. Zehn von fünfzehn gescreenten Stämmen ergaben ein 600-Basen-Paar-PCR-Produkt, was anzeigt, dass sie das aug1Δ-Allel zurückbehalten hatten. Die übrigen 5 gescreenten Stämme ergaben ein 2,1 kb AUG1-Wildtyp-PCR-Produkt. Darauf folgende Testung auf Wachstum auf Minimal-Methanolbrühe enthüllte, dass die 10 mutmaßlichen aug1Δ-Stämme in diesem Medium langsam wuchsen, während die 5 mutmaßlichen AUG1-Zellen auf diesem Medium gut wuchsen. Dieser Phänotyp ist für aug1Δ-Mutanten charakteristisch. Einer dieser Kolonien, dem Isolat #3, wurde die Stammbezeichnung PMAD18 verliehen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Veränderung eines chromosomalen Locus von Pichia methanolica-Zellen, umfassend: (a) Selektion eines Ziel-Chromosomen-Locus der Zellen; (b) Bereitstellung einer Population von P. methanolica Zellen, jeweils umfassend eine chromosomale Kopie des Locus, wobei die Zellen für Adenin auxotroph sind; (c) Einführung eines linearen DNA Konstrukts in die bereit gestellten Zellen, umfassend (i) ein Segment, umfassend einen Teil des Ziel-Chromosomen-Locus, in dem mindestens ein Nukleotid-Paar verändert ist und (ii) einen selektierbaren Marker, der die Adenin-Auxotrophie komplementiert; (d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c) unter Bedingungen, die für die Gegenwart des selektierbaren Markers in den Zellen selektiv sind; (e) Identifikation einer Untergruppe der kultivierten Zellen, worin das Segment des DNA Konstrukts und der selektierbare Marker chromosomal durch homologe Rekombination integriert wurden, wobei die Rekombination zu einer Tandem-Duplikation des Ziel-Chromosomen-Locus führt; (f) Kultivieren der identifizierten Untergruppe von Zellen unter Bedingungen, wobei die Zellen, die für Adenin prototroph sind, wachsen und einen ersten Phänotyp zeigen und die Zellen, die für Adenin auxotroph sind, wachsen und einen zweiten Phänotyp zeigen; (g) Gewinnen von Zellen, die für Adenin auxotroph sind und (h) Identifikation einer Untergruppe der auxotrophen Zellen, worin das Segment des DNA Konstrukts chromosomal integriert wurde, wodurch der Ziel-Chromosomen-Locus verändert wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei eine Vielzahl von Nukleotidpaaren des Teils des Chromosomen Locus in dem Segment verändert sind, optional wobei von 1 kbp bis 2 kbp des Teils des Chromosomen Locus in dem Segment verändert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das mindestens eine Nukleotidpaar durch Deletion verändert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei der Ziel-Chromosomen Locus eine Protease oder eine Alkohol-Oxidase kodiert, optional wobei die Protease Proteinase A oder Proteinase B ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei die Schritte (a) bis (h) wiederholt werden, wodurch zwei Chromosomen Loci verändert werden, optional wobei einer der beiden Chromosomen Loci eine Protease kodiert und ein zweiter der zwei Chromosomen Loci eine Alkohol Oxidase kodiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei der Ziel-Chromosomen Locus ein Ernährungs-Marker ist oder gemäß Anspruch 5, wobei einer der Chromosomen Loci ein Ernährungsmarker ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–6, wobei der selektierbare Marker die Nukleotide 407–2851 von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4 oder 7, wobei der Ziel-Chromosomen Locus ein Gen ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus PEP4, PRB1, AUG1 und AUG2 Genen oder gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei einer der Chromosomen Loci ein Gen ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus PEP4, PRB1, AUG1 oder AUG2 Genen.