DE69735369T2

DE69735369T2 - Herstellung von auxotrophen mutanten von pichia methanolica

Info

Publication number: DE69735369T2
Application number: DE69735369T
Authority: DE
Inventors: K. Christopher Seattle RAYMOND
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-14
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2017-07-15
Also published as: ATE318918T1; DE69735369D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Methylotrophe Hefen sind diejenigen Hefen, die in der Lage sind, Methanol als einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie zu verwenden. Hefearten, die die biochemischen Stoffwechselwege aufweisen, die notwendig für die Methanolverwertung sind, werden in vier Gattungen eingeteilt, Hansenula, Pichia, Candida und Torulopsis. Diese Gattungen sind in gewisser Weise künstlich, da ihnen Zellmorphologie und Wachstumscharakteristiken zu Grunde gelegt wurden und sie keine engen genetischen Beziehungen reflektieren (Billon-Grand, Mycotaxon 35: 201-204, 1989; Kurtzman, Mycologia 84: 72-76, 1992). Darüber hinaus sind nicht alle Arten innerhalb dieser Gattungen in der Lage, Methanol als eine Quelle für Kohlenstoff und Energie zu nutzen. Als eine Konsequenz aus dieser Klassifikation gibt es große Unterschiede in der Physiologie und dem Metabolismus zwischen individuellen Arten einer Gattung.
Methylotrophe Hefen sind attraktive Kandidaten für die Verwendung bei rekombinanten Proteinproduktionssystemen. Von einigen methylotrophen Hefen wurde gezeigt, dass sie schnell zu einer großen Biomasse auf definierten Minimal-Medien wachsen. Bestimmte Gene von methylotrophen Hefen werden unter induzierten oder dereprimierten Bedingungen dicht reguliert und hoch exprimiert, was nahe legt, dass Promotoren dieser Gene nützlich für die Herstellung von Polypeptiden mit kommerziellem Wert sein könnten. Siehe zum Beispiel Faber et al., Yeast 11: 1331, 1995; Romanos et al., Yeast 8: 423, 1992 und Cregg et al., Bio/Technoloav 11: 905, 1993.
Die Entwicklung von methylotrophen Hefen als Wirte für die Verwendung bei rekombinanten Produktionssystemen war langsam, was zum Teil darauf zurückzuführen war, dass ein Mangel an geeigneten Materialien (z.B. Promotoren, selektierbaren Markern und mutierten Wirtszellen) und Verfahren (z.B. Transformationstechniken) vorlag. Die am weitesten entwickelten methylotrophen Wirtsysteme verwenden Pichia pastoris und Hansenula polymorpha (Faber et al., Curr. Genet. 25: 305-310, 1994; Cregg et al., ibid.; Romanos et al., ibid.; US-Patent Nr. 4,855,242; US-Patent Nr. 4,857,467; US-Patent Nr. 4,879,231 und US-Patent Nr. 4,929,555).
Es bleibt ein Bedarf auf dem Fachgebiet an Verfahren für die Transformation zusätzlicher Arten methylotropher Hefen und für die Verwendung transformierter Zellen, um Polypeptide von wirtschaftlicher Bedeutung, einschließlich kommerzieller Enzyme und pharmazeutischer Proteine, herzustellen. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren, die bei diesen Prozessen nützlich sind, wie auch andere, verwandte Vorteile bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Herstellung von Pichia methanolica-Zellen, die auxotroph für Adenin sind, bereit. Die Verfahren umfassen die Schritte der (a) (Exposition der P. methanolica-Zellen gegenüber mutagenisierenden Bedingungen; (b) Kultivierung der Zellen aus Schritt (a) in einem reichen Medium, um die Etablierung und die Replikation von Mutationen in zumindest einem Teil der Zellen zu ermöglichen; (c) Kultivierung der Zellen aus Schritt (b) in einem Kulturmedium, dem es an assimilierbarem Stickstoff mangelt, um zelluläre Stickstoffspeicher aufzubrauchen; (d) Kultivierung der Zellen aus Schritt (c) in einem definierten Kulturmedium, das eine anorganische Stickstoffquelle und eine Menge an Nystatin umfasst, die ausreicht, um wachsende P. methanolica-Zellen zu töten, um Zellen, die auxotroph für Adenin sind, zu selektieren und (e) Kultivierung der selektierten Zellen aus Schritt (d) in einem reichen Kulturmedium. Bei einer Ausführungsart der Erfindung werden die selektierten Zellen aus Schritt (e) auf ein definiertes Medium replikaplattiert und kultiviert, um die Gegenwart einer auxotrophen Mutation zu bestätigen. Die selektierten Zellen sind für Adenin auxotroph. Bei einer verwandten Ausführungsart weisen die selektierten Zellen einen Mangel an Phosphoribosyl-5-aminoimidazolcarboxylase auf. Bei zusätzlichen Ausführungsarten umfassen die mutagenisierenden Bedingungen die Exposition gegenüber ultraviolettem Licht oder die Exposition gegenüber einem chemischen Mutagen. Bei einer weiteren Ausführungsart umfasst die anorganische Stickstoffquelle Ammoniumionen.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht die Effekte der Feldstärke und Pulsdauer auf die Elektroporationseffizienz von P. methanolica.
2 ist ein schematisches Diagramm eines Rekombinationsereignisses zwischen Plasmid pCZR140 und genomischer P. methanolica-DNA.
3 ist ein schematisches Diagramm eines Rekombinationsereignisses zwischen Plasmid pCZR137 und genomischer P. methanolica-DNA.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Vor der ausführlicheren Darlegung der Erfindung wird es nützlich sein, bestimmte, hier verwendete Begriffe zu definieren:
Ein "DNA-Konstrukt" ist ein DNA-Molekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, das durch eine menschliche Intervention modifiziert wurde, um Segmente von DNA zu enthalten, die in einer Anordnung kombiniert und nebeneinander gestellt werden, die in der Natur nicht existiert.
„Frühes Log-Phasen-Wachstum" ist diejenige Phase des Zellwachstums in Kultur, wenn die Zellkonzentration bei 2 × 10⁶ Zellen/ml bis 8 × 10⁶ Zellen/ml liegt.
„Heterologe DNA" bezeichnet ein DNA-Molekül oder eine Population von DNA-Molekülen, die in einer gegebenen Wirtszelle nicht vorkommen. DNA-Moleküle, die heterolog zu einer bestimmten Wirtszelle sind, können von den Wirtszellarten stammende DNA umfassen, so lange diese Wirts-DNA mit nicht vom Wirt stammender DNA kombiniert ist. Zum Beispiel wird ein DNA-Molekül, das ein nicht vom Wirt stammendes DNA-Segment enthält, das ein Polypeptid kodiert, das operabel an ein Wirts-DNA-Segment gebunden ist, umfassend einen Transkriptionspromotor, als ein heterologes DNA-Molekül betrachtet.
Ein „höherer eukaryoter" Organismus ist ein multizellulärer eukaryoter Organismus. Die Bezeichnung umfasst sowohl Pflanzen wie auch Tiere.
„Integrative Transformanten" sind Zellen, in die heterologe DNA eingeführt wurde, wobei die heterologe DNA in die genomische DNA der Zellen integriert wurde.
„Lineare DNA" bezeichnet DNA-Moleküle mit freien 5'- und 3'-Enden, das heißt nicht-zirkuläre DNA-Moleküle. Lineare DNA kann aus geschlossenen zirkulären DNA-Molekülen, wie Plasmiden, durch enzymatischen Verdau oder physikalische Unterbrechung hergestellt werden.
Der Begriff "operabel gebunden" weist darauf hin, dass DNA-Segmente so angeordnet sind, dass sie für ihre beabsichtigten Zwecke zusammenwirken, zum Beispiel, dass die Transkription bei dem Promotor beginnt und durch das Kodierungssegment bis zu dem Terminator voranschreitet.
Der Begriff „Promotor" wird hier im Sinne seiner auf dem Fachgebiet bekannten Bedeutung verwendet, um einen Teil eines Genes zu bezeichnen, das DNA-Sequenzen beinhaltet, die für die Bindung von RNA-Polymerase und den Start der Transkription sorgen. Promotor-Sequenzen werden gewöhnlich, aber nicht immer, in den nichtkodierenden 5'-Regionen von Genen gefunden. Sequenzelemente innerhalb von Promotoren, die bei dem Start der Transkription wirken, werden häufig durch Consensus-Nukleotidsequenzen charakterisiert. Diese Promotorbindungselemente beinhalten RNA-Polymerasebindungsorte; TATA-Sequenzen; CAAT-Sequenzen; differenzierungsspezifische Elemente (DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7: 551-560, 1993); zyklische AMP-Reaktionselemente (CREs); Serum-Reaktionselemente (SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol. I:47-58, 1990); Glukokorticoid-Reaktionselemente (GREs) und Bindungsorte für Transkriptionsfaktoren, wie CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938-19943, 1992), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269: 25728-25734, 1994), SP1, cAMP-Reaktions-Bindungsprotein (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253-264, 1993) und Octamerfaktoren. Siehe im Allgemeinen Watson et al., Hrsg., Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA 1987 und Lemaigre und Rousseau, Biochem J. 303:1-14,1994.
Eine „reprimierende Kohlenstoffquelle" ist eine metabolisierbare, Kohlenstoff enthaltende Verbindung, die, wenn sie nicht limitiert ist, die Expression in einem Organismus von Genen, die für den Katabolismus anderer Kohlenstoffquellen benötigt werden, unterdrückt. Mit „limitiert" meint man, dass die Kohlenstoffquelle nicht verfügbar ist oder in einer solchen Geschwindigkeit verfügbar wird, dass sie sofort konsumiert wird, und daher die vorherrschende Konzentration der Kohlenstoffquelle in einem Organismus effektiv null ist.
Reprimierende Kohlenstoffquellen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten Hexosen und Ethanol. Glucose wird besonders bevorzugt.
„Reiche" Kulturmedien sind solche Kulturmedien, die auf komplexen Nährstoffquellen basieren, typischerweise Gewebeextrakten oder Proteinhydrolysaten. Reiche Medien variieren in der Zusammensetzung von Charge zu Charge aufgrund von Variationen in der Zusammensetzung der Nährstoffquellen.
Wie oben bemerkt, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Herstellung von Pichia methanolica-Zellen, die für Adenin auxotroph sind, bereit. Auxotrophe Adenin-Mutanten von P. methanolica können sowohl mit homologer DNA (DNA von den Wirtsarten) wie auch mit heterologer DNA transformiert werden und die resultierenden Transformanten können in einer großen Zahl verschiedener biologischer Anwendungen verwendet werden. Die mutierten Zellen der vorliegenden Erfindung sind besonders gut für die Transformation mit heterologer DNA geeignet, deren transformierte Zellen für die Produktion von Polypeptiden und Proteinen, einschließlich Polypeptiden und Proteinen höherer Organismen, einschließlich Menschen, verwendet werden können. P. methanolica-Zellen, die für Adenin auxotroph sind, können mit anderen DNA-Molekülen, einschließlich DNA-Bibliotheken und synthetischen DNA-Molekülen, transformiert werden. Die Erfindung stellt so Wirtszellen bereit, die verwendet werden können, um genetisch unterschiedliche Bibliotheken zu exprimieren, um Produkte herzustellen, die auf neuartige biologische Aktivitäten gescreent werden, die als Ziele für das Screening von Verbindungsbibliotheken gestaltet werden können und die genetisch modifiziert werden können, um ihre Nützlichkeit bei anderen Prozessen zu steigern.
Zellen, die mit heterologer DNA transformiert werden sollen, besitzen gewöhnlich eine Mutation, die mit einem Gen (einem „selektierbaren Marker") auf dem heterologen DNA-Molekül komplementiert werden kann. Dieser selektierbare Marker erlaubt es den transformierten Zellen, unter Bedingungen zu wachsen, unter denen untransformierte Zellen sich nicht vermehren können („selektive Bedingungen"). Die allgemeinen Prinzipien der Selektion sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Häufig verwendete selektierbare Marker sind Gene, die Enzyme kodieren, die für die Synthese von Aminosäuren oder Nukleotiden notwendig sind. Zellen, die Mutationen in diesen Genen aufweisen (auxotrophe Mutanten), können in Medien, denen es an der spezifischen Aminosäure oder dem Nukleotid mangelt, nicht wachsen, außer die Mutation wird durch den selektierbaren Marker komplementiert. Die Verwendung von solchen „selektiven" Kulturmedien sichert die stabile Erhaltung der heterologen DNA in der Wirtszelle. Ein bevorzugter selektierbarer Marker von diesem Typ für die Verwendung bei Pichia methanolica ist ein P. methanolica ADE2-Gen, das Phosphoribosyl-5-aminoimidazolcarboxylase kodiert (AIRC; EC 4.1.1.21). Das ADE2-Gen erlaubt es der Zelle in Abwesenheit von Adenin zu wachsen, wenn es in eine ADE2-Wirtszelle transformiert wird. Der Kodierungsstrang einer repräsentativen P. methanolica ADE2-Gensequenz wird in SEQ ID NO:1 gezeigt. Die dargestellte Sequenz beinhaltet 1006 Nukleotide von nicht-kodierender 5'-Sequenz und 442 Nukleotide von nicht-kodierender 3'-Sequenz, mit dem Start-ATG-Codon bei den Nukleotiden 1007-1009. Ein DNA-Segment, das die Nukleotide 407-2851 umfasst, kann als ein selektierbarer Marker verwendet werden, obwohl längere oder kürzere Segmente verwendet werden können, solange der Kodierungsteil an Promotor- oder Terminator-Sequenzen operabel gebunden ist. Die Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass diese oder andere Sequenzen, die hier bereitgestellt werden, einzelne Allele der zugehörigen Gene darstellen und dass man erwartet, dass es allele Variation gibt. Es kann jedes funktionelle ADE2-Allel verwendet werden. Andere Ernährungsmarker, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten die P. methanolica ADE1-, HIS3- und LEU2-Gene, die die Selektion in der Abwesenheit von Adenin, Histidin bzw. Leucin ermöglichen. Heterologe Gene, wie Gene von anderen Pilzen, können auch als selektierbare Marker verwendet werden. Für industrielle Anwendungen in großem Maßstab, wo es erwünscht ist, die Verwendung von Methanol zu minimieren, wird es bevorzugt, Wirtszellen zu verwenden, in denen beide Methanolverwertungsgene (AUG1 und AUG2) deletiert sind. Für die Herstellung sezernierter Proteine werden Wirtszellen, denen es an vakuolären Protease-Genen (PEP4 und PR81) mangelt, bevorzugt. Genmangel-Mutanten können durch bekannte Verfahren, wie ortsgerichtete Mutagenese, hergestellt werden. P. methanolica-Gene können auf der Grundlage von Homologie zu ihren Saccaromyces cerevisiae-Gegenstückgenen geklont werden. Dem hier offenbarten ADE2-Gen wurde seine Bezeichnung auf der Grundlage solcher Homologie gegeben.
Stämme von Pichia methanolica sind von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) und anderen Quellen erhältlich und können als Ausgangsmaterialien bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Um Mutanten von P. methanolica, die auxotroph für Adenin sind, herzustellen, werden die Zellen zuerst mutagenisierenden Bedingungen, sprich Umgebungsbedingungen, die genetische Mutationen in den Zellen hervorrufen, ausgesetzt. Die Verfahren für die Mutagenisierung von Zellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und beinhalten chemische Behandlung, Aussetzen gegenüber ultraviolettem Licht, Aussetzen gegenüber Röntgenstrahlen und retrovirale Insertionsmutagenese. Chemische Mutagene beinhalten Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, 2-Methoxy-6-chlor-9-[3-(ethyl-2-chlorethyl)aminopropylamino]acridin·2HCl, 5-Bromuracil, Acridin und Aflatoxin. Siehe Lawrence, Methods Enzymol. 194: 273-281, 1991. Der Anteil der erhaltenen mutagenisierten Zellen ist eine Funktion der Stärke oder der Menge eines mutagenisierenden Wirkstoffes, dem die Zellen ausgesetzt werden. Ein niedriger Spiegel an Mutagen erzeugt einen kleinen Anteil mutierter Zellen: Höhere Spiegel an Mutagen erzeugen einen höheren Anteil mutierter Zellen, aber töten auch mehr Zellen. Es ist daher notwendig, die Mutagene und das Absterben so auszubalancieren, dass eine vernünftige Anzahl von mutierten Zellen erhalten wird. Die Ausbalancierung wird im Allgemeinen empirisch durchgeführt, indem die Zellen verschiedenen Bedingungen ausgesetzt werden, um eine Absterbekurve festzulegen. Im Allgemeinen werden die Zellen mutagenisierenden Bedingungen ausgesetzt und für einen Tag kultiviert, wonach sie gemäß Standard-Assayverfahren auf Lebensfähigkeit getestet werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird es vorgezogen, einen Grad an Mutagenese zu verwenden, der in 10-20%iger Mortalität resultiert, obwohl ein Fachmann auf dem Gebiet erkennen wird, dass dieser Wert je nach Notwendigkeit angepasst werden kann, zum Beispiel wenn mit einer großen Anzahl von Zellen gearbeitet wird.
Mutagenisierte Zellen werden dann in einem reichen Medium kultiviert, um den Mutationen zu erlauben, etabliert und zumindest in einem Teil der Zellpopulation repliziert zu werden. Dieser Schritt erlaubt Zellen, in denen das Genom verändert worden ist, die Mutation zu replizieren und auf ihre Nachkommen weiterzugeben, wodurch die Mutation innerhalb der Population etabliert wird.
Die Zellen werden dann auf ein Kulturmedium, dem es an assimilierbaren Stickstoff mangelt, transferiert, so dass die zellulären Stickstoffspeicher aufgebraucht werden. Mit "an assimilierbarem Stickstoff mangelnd" ist gemeint, dass es dem Medium an einer Menge von Stickstoff mangelt, die ausreicht, um das Wachstum der Zellen zu unterstützen. Die Erschöpfung zellulärer Stickstoffspeicher wird im Allgemeinen ungefähr 12 bis 24 Stunden Inkubation erfordern, wobei 16 Stunden unter gewöhnlichen Bedingungen ausreichen. Nach Erschöpfung der Stickstoffspeicher werden die Zellen in einem definierten Kulturmedium, das eine anorganische Stickstoffquelle und eine Menge an Nystatin (Mycostatin) umfasst, die ausreicht, um wachsende P. methanolica-Zellen zu töten, kultiviert. Bevorzugte anorganische Stickstoffquellen sind diejenigen, die Ammoniumionen, wie Ammoniumsulfat, umfassen. Im Allgemeinen wird das Medium 10-200 mMol Ammonium, vorzugsweise ungefähr 60 mMol Ammonium, enthalten. Nystatin wird in einer Konzentration von 0,1 bis 100 mg/l, vorzugsweise 0,5 bis 20 mg/l, besser ungefähr 2 mg/l (10 Einheiten/l) eingeschlossen. Die Behandlung mit Nystatin wird für 10 Minuten bis sechs Stunden, vorzugsweise ungefähr 1 Stunde, durchgeführt. Diejenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, werden erkennen, dass die tatsächliche Antibiotikakonzentration und Expositionszeit, die erforderlich ist, um prototrophe Zellen zu töten, einfach empirisch bestimmt werden kann und bestimmte Anpassungen notwendig sein können, um Variationen in der spezifischen Aktivität zwischen einzelnen Chargen von Antibiotikum zu kompensieren. Durch Erschöpfung der zellulären Stickstoffspeicher und dann Kultivierung der Zellen in einem definierten Medium, das eine anorganische Stickstoffquelle und Nystatin enthält, bleiben Zellen, die auxotroph für Adeninbiosynthese sind, am Leben, da sie in dem definierten Medium nicht wachsen können. Wachsende Zellen werden durch Nystatin getötet. Nach der antibiotischen Behandlung werden die Zellen auf ein reiches Kulturmedium übertragen.
Auxotrophe Adeninmutationen werden durch Bestimmung der Nahrungsansprüche der behandelten Zellen bestätigt und charakterisiert. Allgemein wird Replikaplattierung für diese Bestimmung verwendet. Die Zellen werden sowohl auf reiches wie auch auf Medien, denen es an bestimmten Nährstoffen mangelt, plattiert. Zellen, die auf bestimmten Platten nicht wachsen, sind auxotroph für Adenin. Komplementierungsanalyse kann für die weitere Charakterisierung verwendet werden.
Heterologe DNA kann in die P. methanolica-Zellen durch irgendeines von verschiedenen bekannten Verfahren eingeführt werden, einschließlich Lithiumtransformation (Hiep et al., Yeast 9: 1189-1197, 1993; Tarutina und Tolstorukov, Abst. of the 15th International Specialized Symposium on Yeasts, Riga (USSR), 1991, 137; Ito et al., J. Bacteriol. 153: 163, 1983; Bogdanova et al., Yeast 11: 343, 1995), Sphäroblasttransformation (Beggs, Nature 275: 104, 1978; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3376, 1985), Gefrier-/Auftau-Polyethylenglykol-Transformation (Pichia Expression Kit Instruction Manual, Invitrogen Corp., San Diego, CA, Cat. No. K1710-01) oder Elektroporation, wobei das letztere Verfahren vorgezogen wird. Elektroporation ist der Vorgang der Verwendung eines gepulsten elektrischen Feldes, um transient Zellmembranen durchlässig zu machen, was es Makromolekülen wie DNA erlaubt, in die Zellen zu passieren. Elektroporation wurde für die Verwendung mit Säugetier- (z.B. Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982) und Pilz- (z.B. Meilhoc et al., Bio/Technoloay 8: 223-227, 1990) -Wirtszellen beschrieben. Der tatsächliche Mechanismus, durch den die DNA in die Zellen transferiert wird, wird jedoch nicht genau verstanden. Für die Transformation von P. methanolica wurde herausgefunden, dass Elektroporation überraschend effizient ist, wenn die Zellen einem exponentiell abfallenden, gepulsten elektrischen Feld mit einer Feldstärke von 2,5 bis 4,5 kV/cm und einer Zeitkonstante (τ) von ungefähr 1 bis 40 Millisekunden ausgesetzt werden. Die Zeitkonstante τ wird als die Zeit definiert, die erforderlich ist, damit die anfängliche Spitzenspannung V₀ auf einen Wert von V₀/e fällt. Die Zeitkonstante kann als das Produkt des Gesamtwiderstandes und der Kapazität des Pulskreises, sprich τ = R × C, berechnet werden. Typischerweise sind Widerstand und Kapazität entweder voreingestellt oder sie können durch den Anwender ausgewählt werden, abhängig von den Elektroporationsgeräten, die ausgewählt werden. Auf jeden Fall werden die Geräte in Übereinstimmung mit der Anleitung des Herstellers konfiguriert, um Feldstärke und Abfallparameter, wie oben offenbart wird, bereitzustellen. Elektroporationsgeräte sind von kommerziellen Anbietern erhältlich (z.B. BioRad Laboratories, Hercules, CA).
DNA-Moleküle für die Verwendung bei der Transformation von P. methanolica werden im Allgemeinen als doppelsträngige zirkuläre Plasmide, die vorzugsweise vor der Transformation linearisiert werden, hergestellt. Für Polypeptid- oder Proteinproduktion werden die DNA-Moleküle, zusätzlich zu dem oben offenbarten selektierbaren Marker, eine Expressionskassette, die einen Transkriptionspromotor umfasst, ein DNA-Segment (z.B. eine cDNA), die das Polypeptid oder Protein von Interesse codiert, und einen Transkriptionsterminator mit einschließen. Diese Elemente sind operabel gebunden, um für die Transkription des DNA-Segmentes von Interesse zu sorgen. Es wird bevorzugt, dass der Promotor und Terminator von einem P. methanolica-Gen stammt. Nützliche Promotoren beinhalten diejenigen von konstitutiven und Methanol-induzierbaren Promotoren. Promotorsequenzen sind im Allgemeinen innerhalb 1,5 kb stromaufwärts der Codierungssequenz eines Genes enthalten, oft innerhalb 1 kb oder weniger. Im Allgemeinen sind regulierte Promotoren, aufgrund der Gegenwart von regulatorischen Elementen, größer als konstitutive Promotoren. Methanol-induzierbare Promotoren, die sowohl positive wie auch negative regulatorische Elemente beinhalten, können sich über mehr als 1 kb stromaufwärts von dem Start-ATG erstrecken. Promotoren werden durch Funktion identifiziert und können gemäß bekannten Verfahren geklont werden.
Ein besonders bevorzugter Methanol-induzierbarer Promotor ist derjenige eines P. methanolica-Alkohol-Verwertungsgens. Eine repräsentative Codierungsstrang-Sequenz eines solchen Genes, AUG1, wird in SEQ ID NR:2 gezeigt. Innerhalb SEQ ID NR:2 liegt das Start-ATG-Codon bei den Nukleotiden 1355-1357. Die Nukleotide 1-23 von SEQ ID NR:2 sind non-AUG1-Polylinkersequenz. Es wird besonders bevorzugt, als einen Promotor ein Segment zu verwenden, das die Nukleotide 24-1354 von SEQ ID NR:2 umfasst, obwohl zusätzliche stromaufwärts gelegene Sequenz eingeschlossen werden kann. P. methanolica enthält ein zweites Alkohol-Verwertungsgen, AUG2, dessen Promotor verwendet werden kann. Eine partielle DNA-Sequenz eines AUG2-Klons wird in SEQ ID NR:9 gezeigt. AUG2-Promotorsegmente, die verwendet werden, werden im Allgemeinen die Nukleotide 91-169 von SEQ ID NR:9 umfassen, obwohl von kleineren Verkürzungen an dem 3'-Ende nicht erwartet wird, dass sie die Promotorfunktion aufheben. Andere nützliche Promotoren beinhalten diejenigen der Dihydroxyacetonsynthase (DHAS)-, Formatdehydrogenase (FMD)- und Katalase (CAT)- Gene. Gene, die diese Enzyme von anderen Arten codieren, wurden beschrieben und ihre Sequenzen sind erhältlich (z.B. Janowicz et al., Nuc. Acids Res. 13: 2043, 1985; Hollenberg und Janowicz, EPO-Veröffentlichung 0 299 108; Didion und Roggenkamp, FEBS Lett. 303: 113, 1992). Gene, die diese Proteine codieren, können unter Verwendung der bekannten Sequenzen als Sonden oder durch vergleichende Anordnung bekannter Sequenzen, Entwicklung von Primern, die auf der Anordnung basieren, und Amplifizierung von P. methanolica-DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geklont werden.
Konstitutive Promotoren sind diejenigen, die nicht durch Umgebungsbedingungen aktiviert oder inaktiviert werden; sie sind immer transkriptionell aktiv. Bevorzugte konstitutive Promotoren beinhalten diejenigen von Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-, Triosephosphatisomerase- und Phosphoglyceratkinase-Genen von P. methanolica. Diese Gene können durch Komplementierung in einer Wirtszelle, wie einer Saccharomyces cerevisiae-Zelle, mit einer Mutation in dem Gegenstückgen geklont werden. Mutanten dieser Art sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe zum Beispiel Kawasaki und Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108: 1107-1112, 1982; McKnight et al., Cell 46: 143-147, 1986; Aguilera und Zimmermann, Mol. Gen. Genet. 202: 83-89, 1986.
Die DNA-Moleküle werden weiter einen selektierbaren Marker enthalten, um die Identifikation, Selektion und Erhaltung von Transformanten zu ermöglichen. Die DNA-Moleküle können weiter zusätzliche Elemente, wie einen Ursprung der Replikation und einen selektierbaren Marker, enthalten, die die Amplifikation und Erhaltung der DNA in einem wechselnden Wirt (z.B. E. coli) erlauben. Um die Integration der DNA in das Wirtschromosom zu erleichtern, wird es bevorzugt, dass das gesamte Expressionssegment, umfassend das Promotor-Gen von Interesse – Terminator plus selektierbarem Marker, an beiden Enden durch Wirts-DNA-Sequenzen flankiert wird. Dies wird bequem durch Einschluss einer 3'-untranslatierten DNA-Sequenz an dem stromabwärts gelegenem Ende des Expressionssegmentes und sich Verlassen auf die Promotorsequenz an dem 5'-Ende erreicht. Wenn lineare DNA verwendet wird, wird das Expressionssegment durch Spaltungsorte flankiert werden, um die Linearisierung des Moleküls und Trennung des Expressionssegmentes von anderen Sequenzen (z.B. einem bakteriellen Ursprung der Replikation und selektierbaren Marker) zu erlauben. Solch bevorzugte Spaltungsorte sind diejenigen, die durch Restriktionsendonukleasen, die selten innerhalb einer DNA-Sequenz schneiden, wie diejenigen, die Acht-Basen-Zielsequenzen erkennen (z.B. Not I), erkannt werden.
Proteine, die in P. methanolica hergestellt werden können, beinhalten Proteine von gewerblichem und pharmazeutischem Interesse. Solche Proteine beinhalten höhere eukaryote Proteine von Pflanzen und Tieren, insbesondere von Wirbeltieren wie Säugetieren, obwohl bestimmte Proteine von Mikroorganismen auch von großem Wert sind. Proteine, die unter Verwendung der auxotrophen Mutanten, die bei der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, hergestellt werden können, beinhalten Enzyme wie Lipasen, Cellulasen und Proteasen; Enzyminhibitoren, einschließlich Proteaseinhibitoren; Wachstumsfaktoren wie Thrombozyten-Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und epidermalem Wachstumsfaktor; Cytokine wie Erythropoetin und Thrombopoetin und Hormone wie Insulin, Leptin und Glucagon.
Für die Polypeptidproduktion werden P. methanolica-Zellen in einem Medium, das angemessene Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelemente umfasst, bei einer Temperatur von ungefähr 25°C bis 35°C kultiviert. Flüssige Kulturen werden mit ausreichender Belüftung durch konventionelle Mittel, wie Schütteln kleiner Kolben oder Anschwänzen von Fermentoren, versorgt. Ein bevorzugtes Kulturmedium ist YEPD (Tabelle 1). Die Zellen können durch Verdünnung in frisches Kulturmedium überführt werden oder für kurze Zeiträume auf Platten unter Tiefgefrierung gelagert werden. Für langfristige Lagerung werden die Zellen vorzugsweise in einer 50%igen Glycerollösung bei –70°C aufbewahrt.
Tabelle 1
YEPD

2% D-Glucose
2% Bacto^TM-Pepton (Difco Laboratories, Detroit, MI)
1 % Bacto^TM-Hefeextrakt (Difco Laboratories)
0,004% Adenin
0,006% L-Leucin

ADE D

0,056% -Ade-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung

ADE DS

0,056% -Ade-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung
18,22% D-Sorbitol

LEU D

0,052% -Leu-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung

HIS D

0,052% -His-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung

URA D

0,056% -Ura-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung

URA DS

0,056% -Ura-Trp-Thr-Pulver
0,67% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren
2% D-Glucose
0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung
18,22% D-Sorbitol

-Leu-Trp-Thr-Pulver

Pulver, hergestellt durch Kombination von 4,0 g Adenin, 3,0 g Arginin, 5,0 g Asparaginsäure, 2,0 g Histidin, 6,0 g Isoleucin, 4,0 g Lysin, 2,0 g Methionin, 6,0 g Phenylalanin, 5,0 g Serin, 5,0 g Tyrosin, 4,0 g Uracil und 6,0 g Valin (alles L-Aminosäuren)

-His-Trp-Thr-Pulver

Pulver, hergestellt durch Kombination von 4,0 g Adenin, 3,0 g Arginin, 5,0 g Asparaginsäure, 6,0 g Isoleucin, 8,0 g Leucin, 4,0 g Lysin, 2,0 g Methionin, 6,0 g Phenylalanin, 5,0 g Serin, 5,0 g Tyrosin, 4,0 g Uracil und 6,0 g Valin (alles L-Aminosäuren)

-Ura-Trp-Thr-Pulver

Pulver, hergestellt durch Kombination von 4,0 g Adenin, 3,0 g Arginin, 5,0 g Asparaginsäure, 2,0 g Histidin, 6,0 g Isoleucin, 8,0 g Leucin, 4,0 g Lysin, 2,0 g Methionin, 6,0 g Phenylalanin, 5,0 g Serin, 5,0 g Tyrosin und 6,0 g Valin (alles L-Aminosäuren)

-Ade-Trp-Thr-Pulver

Pulver, hergestellt durch Kombination von 3,0 g Arginin, 5,0 g Asparaginsäure, 2,0 g Histidin, 6,0 g Isoleucin, 8,0 g Leucin, 4,0 g Lysin, 2,0 g Methionin, 6,0 g Phenylalanin, 5,0 g Serin, 5,0 g Tyrosin, 4,0 g Uracil und 6,0 g Valin (alles L-Aminosäuren)

200X Tryptophan, Threoninlösung

3,0% L-Threonin, 0,8% L-Tryptophan in H₂O
Für Platten, Zugabe von 1,8% Bacto^TM Agar (Difco Laboratories)

Elektroporation von P. methanolica wird bevorzugt bei Zellen in frühem Log-Phasenwachstum durchgeführt. Die Zellen werden zu einzelnen Kolonien auf festen Medien, vorzugsweise festem YEPD, ausgestrichen. Nach ungefähr zweitägigem Wachstum bei 30°C, werden einzelne Kolonien von einer frischen Platte verwendet, um das gewünschte Volumen von reichem Kulturmedium (z.B. YEPD) auf eine Zelldichte von ungefähr 5-10 × 10⁵ Zellen/ml zu beimpfen. Die Zellen werden bei ungefähr 25-35°C, vorzugsweise 30°C, mit heftigem Schütteln inkubiert, bis sie in der frühen Log-Phase sind. Die Zellen werden dann, beispielsweise durch Zentrifugation mit 3000 × g für 2-3 Minuten, geerntet und erneut suspendiert. Die Zellen werden durch Reduktion von Disulfidbindungen in den Zellwänden, Äquilibrierung in einer Ionenlösung, die mit den Elektroporationsbedingungen kompatibel ist und Kühlung, elektrokompetent gemacht. Die Zellen werden typischerweise durch Inkubation in einer gepufferten Lösung bei pH 6-8, die einen reduzierenden Wirkstoff wie Dithiothreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol (BME) enthält, um Zellwandproteine zu reduzieren, um die darauf folgende Aufnahme von DNA zu erleichtern, elektrokompetent gemacht. Ein bevorzugter Inkubationspuffer in dieser Hinsicht ist eine frische Lösung aus 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, der 25 mM DTT enthält. Die Zellen werden in diesem Puffer (typischerweise unter Verwendung eines Fünftels des ursprünglichen Kulturvolumens) bei ca. 30°C für ungefähr 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise ungefähr 15 Minuten, inkubiert. Die Zellen werden dann geerntet und in einem geeigneten Elektroporationspuffer gewaschen, der eiskalt verwendet wird. Geeignete Puffer in dieser Hinsicht schliessen pH 6-8-Lösungen, die einen schwachen Puffer, divalente Kationen (z.B. Mg⁺⁺, Ca⁺⁺) und einen osmotischen Stabilisator (z.B. einen Zucker) enthalten, mit ein. Nach dem Waschen werden die Zellen in einem kleinen Volumen des Puffers erneut suspendiert, zu welchem Zeitpunkt sie elektrokompetent sind und direkt verwendet oder aliquotiert und gefroren (vorzugsweise bei –70°C) gelagert werden können. Ein bevorzugter Elektroporationspuffer ist STM (270 mMol Saccharose, 10 mMol Tris, pH 7,5, 1 mMol MgCl₂). Bei einem bevorzugten Protokoll werden die Zellen zwei Waschungen unterzogen, zuerst in dem ursprünglichen Kulturvolumen an eiskaltem Puffer, dann in einer Hälfte des ursprünglichen Volumens. Nach der zweiten Waschung werden die Zellen geerntet und erneut suspendiert, wobei typischerweise ungefähr 3-5 ml Puffer für ein ursprüngliches Kulturvolumen von 200 ml verwendet werden.
Elektroporation wird unter Verwendung eines kleinen Volumens an elektrokompetenten Zellen (typischerweise ungefähr 100 μl) und bis zu einem zehntel Volumen linearer DNA-Moleküle durchgeführt. Zum Beispiel werden 0,1 ml einer Zellsuspension in einem Puffer, der 50 mMol an ionischer Stärke nicht übersteigt, mit 0,1-10 μg DNA (Volumen ≤ 10 μl) kombiniert. Diese Mischung wird in eine eiskalte Elektroporationsküvette platziert und einem gepulsten elektrischen Feld von 2,5 bis 4,5 kV/cm, vorzugsweise ungefähr 3,75 kV/cm, und einer Zeitkonstante von 1-40 Millisekunden, vorzugsweise 10-30 Millisekunden, besser 15-25 Millisekunden, am besten ungefähr 20 Millisekunden, mit einem exponentiellen Abfall ausgesetzt. Die tatsächlichen Einstellungen der Ausrüstung, die verwendet wird, um die erwünschten Pulsparameter zu erreichen, werden durch die verwendete Ausrüstung bestimmt. Wenn ein BioRad (Hercules, CA) Gene Pulser^TM Elektroporator mit einer 2 mm-Elektroporationsküvette verwendet wird, wird der Widerstand auf 600 Ohm oder mehr, vorzugsweise „unendlichen" Widerstand, eingestellt und die Kapazität wird auf 25 μF eingestellt, um die erwünschten Feldcharakteristiken zu erhalten. Nachdem sie gepulst wurden, werden die Zellen ungefähr 10 × in 1 ml YEPD-Brühe verdünnt und bei 30°C für eine Stunde inkubiert.
Die Zellen werden dann geerntet und auf selektive Medien plattiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsart werden die Zellen einmal mit einem kleinen Volumen (gleich dem verdünnten Volumen der elektroporierten Zellen) von IX Hefestickstoffbasis (6,7 g/l Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren; Difco Laboratories, Detroit, MI) gewaschen und auf minimal selektive Medien plattiert. Zellen mit einer ade2-Mutation, die mit einem ADE2-selektierbaren Marker transformiert wurden, können auf ein Minimalmedium plattiert werden, dem es an Adenin mangelt, wie ADE D (Tabelle 1) oder ADE DS (Tabelle 1). Bei einer typischen Vorgehensweise werden 250 ml Aliquots von Zellen auf 4 getrennte ADE D- oder ADE DS-Platten plattiert, um Ade⁺-Zellen zu selektieren.
P. methanolica erkennt bestimmte selten auftretende Sequenzen, bezeichnet als autonom replizierende Sequenzen (ARS), als Ursprünge von DNA-Replikation und diese Sequenzen können zufällig innerhalb eines DNA-Moleküls, das für die Transformation verwendet wird, auftreten, was es ermöglicht, die transformierende DNA extrachromosomal zu erhalten. Integrative Transformanten werden jedoch im Allgemeinen für die Verwendung bei Proteinproduktionssystemen bevorzugt. Integrative Transformanten besitzen einen ausgeprägten Wachstumsvorteil gegenüber ARS-Transformanten auf selektiven Medien, die Sorbitol als eine Kohlenstoffquelle enthalten, wodurch ein Verfahren für die Selektion integrativer Transformanten aus einer Population transformierter Zellen bereitgestellt wird. Es wurde herausgefunden, dass ARS-Sequenzen in dem ADE2-Gen und möglicherweise in dem AUG1-Gen von P. methanolica auftreten. Ade1-Wirtszellen von Pichia methanolica, die mit einem ADE2-Gen transformiert wurden, können so auf mindestens zwei verschiedene Arten ade⁺ werden. Die ARS innerhalb des ADE2-Gens erlauben die instabile extrachromosomale Erhaltung der transformierenden DNA (Hiep et al., Yeast 9:1189-1197, 1993). Kolonien solcher Transformanten werden durch geringere Wachstumsraten und rosa Farbe aufgrund proliferativer Erzeugung von Nachkommen, die Ade^– sind, charakterisiert. Transformierende DNA kann sich auch in das Wirtsgenom integrieren, was stabile Transformanten hervorbringt, die schnell wachsen, weiß sind und es nicht schaffen, nachweisbare Mengen an Ade^–-Nachkommen hervorzubringen. ADE D-Platten erlauben das schnellste Wachstum transformierter Zellen und instabile und stabile Transformanten wachsen mit ungefähr der gleichen Geschwindigkeit. Nach 3-5 Inkubationstagen auf ADE D-Platten bei 30°C sind stabile Transformantkolonien weiß und ungefähr zweimal so groß wie instabile, rosafarbene Transformanten. ADE DS-Platten sind selektiver für stabile Transformanten, die große (≈ 5 mm) Kolonien in 5-7 Tagen bilden, während instabile (ARS-erhaltene) Kolonien viel kleiner (≈ 1 mm) sind. Die selektiveren ADE DS-Medien werden daher für die Identifikation und Selektion stabiler Transformanten bevorzugt. Für einige Anwendungen, wie das Screening genetisch diverser Bibliotheken auf seltene Kombinationen genetischer Elemente, ist es manchmal erwünscht, eine große Zahl instabiler Transformanten zu screenen, von denen beobachtet wurde, dass sie die stabilen Transformanten an Zahl um einen Faktor von ungefähr 100 übertreffen. In solchen Fällen werden die Fachleute auf dem Gebiet den Nutzen der Plattierung von Transformantzellen auf weniger selektive Medien, wie ADE D, erkennen.
Integrative Transformanten werden für die Verwendung bei Proteinproduktionsprozessen bevorzugt. Solche Zellen können ohne kontinuierlichen selektiven Druck vermehrt werden, da DNA selten aus dem Genom verloren geht. Die Integration von DNA in das Wirtschromosom kann durch Southern Blot-Analyse bestätigt werden. Kurz gefasst wird transformierte und untransformierte Wirts-DNA mit Restriktionsendonukleasen verdaut, durch Elektrophorese getrennt, auf eine Trägermembran geblottet und mit geeigneten Wirts-DNA-Segementen sondiert. Unterschiede in den Mustern der Fragmente, die in untransformierten und transformierten Zellen gesehen werden, lassen auf integrative Transformation schließen. Restriktionsenzyme und Sonden können ausgewählt werden, um transformierende DNA-Segmente (z.B. Promotor, Terminator, heterologe DNA und selektierbare Markersequenzen) unter den Genomfragmenten zu identifizieren.
Unterschiede in den Expressionsleveln von heterologen Proteinen können aus solchen Faktoren wie dem Ort der Integration und der Kopienanzahl der Expressionskassette und Unterschieden in der Promotoraktivität zwischen einzelnen Isolaten resultieren. Es ist daher vorteilhaft, eine Anzahl von Isolaten vor der Auswahl eines Produktionsstammes auf den Expressionslevel zu screenen. Eine Vielzahl geeigneter Screening-Verfahren ist erhältlich. Zum Beispiel lässt man Transformantkolonien auf Platten wachsen, die mit Membranen (z.B. Nitrocellulose) überschichtet sind, die Protein binden. Proteine werden aus den Zellen durch Sekretion oder nach Lyse freigesetzt und binden an die Membran. Gebundenes Protein kann dann unter Verwendung bekannter Verfahren, einschließlich Immunoassays, untersucht werden. Eine genauere Analyse von Expressionsleveln kann durch Kultivierung von Zellen in Flüssigmedien und Analysierung von konditionierten Medien oder Zell-Lysaten, wie es geeignet ist, erhalten werden. Verfahren für die Konzentration und Reinigung von Proteinen aus Medien und Lysaten werden zum Teil durch das Protein von Interesse bestimmt. Solche Verfahren werden durch den geübten Anwender einfach ausgewählt und durchgeführt.
Für die Proteinproduktion in kleinem Maßstab (z.B. Platten- oder Schüttelkolbenproduktion) züchtet man P. methanolica-Transformanten, die eine Expressionskassette tragen, die einen Methanol-regulierten Promotor (wie den AUG1-Promotor) umfasst, in der Gegenwart von Methanol und der Abwesenheit von beeinflussenden Mengen anderer Kohlenstoffquellen (z.B. Glucose). Für Experimente im kleinen Maßstab, einschließlich vorläufigem Screening auf Expressionslevel, kann man Transformanten bei 30°C auf festen Medien wachsen lassen, die zum Beispiel 20 g/l Bacto-Agar (Difco), 6,7 g/l Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (Difco), 10 g/l Methanol, 0,4 μg/l Biotin und 0,56 g/l -Ade-Thr-Trp-Pulver enthalten. Da Methanol eine flüchtige Kohlenstoffquelle ist, geht es bei längerer Inkubation leicht verloren. Ein kontinuierlicher Nachschub an Methanol kann durch Platzierung einer Lösung aus 50%igem Methanol in Wasser in die Deckel der umgedrehten Platten bereitgestellt werden, wodurch das Methanol durch Verdunstungstransfer auf die wachsenden Zellen übertragen wird. Im Allgemeinen wird nicht mehr als 1 ml Methanol pro 100 mm-Platte verwendet. Experimente in etwas größerem Maßstab können unter Verwendung von Kulturen, die in Schüttelkolben gezüchtet werden, durchgeführt werden. Bei einem typischen Vorgehen werden die Zellen für zwei Tage auf Minimal-Methanol-Platten, wie oben offenbart wird, bei 30°C kultiviert, dann werden die Kolonien verwendet, um ein kleines Volumen von Minimal-Methanol-Medien (6,7 g/l Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 10 g/l Methanol, 0,4 μg/l Biotin) mit einer Zelldichte von ungefähr 1 × 10⁶ Zellen/ml zu beimpfen. Man lässt die Zellen bei 30°C wachsen. Zellen, die auf Methanol wachsen, weisen einen hohen Sauerstoffbedarf auf, was heftiges Schütteln während der Kultivierung erforderlich macht. Methanol wird täglich aufgefüllt (typischerweise 1/100 Volumen 50%iges Methanol pro Tag).
Für die Kultivierung im Produktionsmaßstab werden frische Kulturen von Hochleistungsklonen in Schüttelkolben vorbereitet. Die resultierenden Kulturen werden dann verwendet, um Kulturmedium in einem Fermentor zu beimpfen. Typischerweise wird eine 500 ml-Kultur in YEPD, gezüchtet bei 30°C für 1-2 Tage mit heftiger Bewegung, verwendet, um einen 5-Liter-Fermentor zu beimpfen. Man züchtet die Zellen in einem geeigneten Medium, das Salze, Glucose, Biotin und Spurenelemente bei 28°C, pH 5,0 und über 30% gelöstem O₂ enthält. Nachdem die anfängliche Charge an Glucose aufgebraucht ist (wie durch eine Abnahme beim Sauerstoffverbrauch angezeigt wird), wird eine Glucose-Methanolnahrung in das Gefäß gegeben, um die Produktion des Proteins von Interesse zu induzieren. Da Fermentation in großem Maßstab unter Bedingungen der Limitierung von Kohlenstoff durchgeführt wird, unterdrückt die Gegenwart von Glucose in der Nahrung nicht den durch Methanol induzierbaren Promotor. Die Verwendung von Glucose in Kombination mit Methanol unter Glucose-limitierten Bedingungen ruft schnelles Wachstum, effiziente Konversion von Kohlenstoff zu Biomasse und schnelle Änderungen in den physiologischen Wachstumsstadien hervor, während dennoch die vollständige Induktion von durch Methanol induzierbaren Genpromotoren bereitgestellt wird. Bei einem typischen Fermentationsdurchlauf erhält man eine Zelldichte von ungefähr 80 bis ungefähr 400 Gramm feuchter Zellpaste pro Liter. "Feuchte Zellpaste" bezieht sich auf die Masse an Zellen, die man durch Ernten der Zellen aus dem Fermentor, typischerweise durch Zentrifugation der Kultur, erhält.
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Beispiele
Beispiel 1
P. methanolica-Zellen (Stamm CBS6515 von American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden durch UV-Exposition mutagenisiert. Eine Absterbekurve wurde zuerst durch Plattierung von Zellen auf verschiedene Platten mit ungefähr 200-250 Zellen/Platte erzeugt. Die Platten wurden dann UV-Bestrahlung unter Verwendung einer germiziden G8T5 Lampe (Sylvania), die 25 cm über der Oberfläche der Platten aufgehängt wurde, für Zeiträume, wie sie in Tabelle 2 gezeigt werdend, ausgesetzt. Die Platten wurden dann vor sichtbaren Lichtquellen geschützt und bei 30°C für zwei Tage inkubiert.
Tabelle 2 Lebensfähige Zellen
Es wurde dann Mutagenese in großem Maßstab unter Verwendung einer 2 Sekunden langen UV-Exposition, um ungefähr 20% Tötung bereitzustellen, durchgeführt. Zellen wurden mit ungefähr 10⁴ Zellen/Platte auf acht YEPD-Platten plattiert, denen jeweils 100 mg/l Uracil, Adenin und Leucin, die zugegeben wurden, um das Wachstum potentieller Auxotropher mit den zugehörigen Defiziten zu ergänzen, zugesetzt wurde. Nach der UV-Exposition wurden die Platten in Folie eingewickelt und über Nacht bei 30°C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Kolonien auf den Platten (~ 10⁵ gesamt) in Wasser erneut suspendiert und einmal mit Wasser gewaschen. Es wurde eine Menge an Zellsuspension, die ausreichte, um eine OD₆₀₀ von 0,1–0,2 zu ergeben, verwendet, um 500 ml Minimal-Brühe, die mit Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren oder Ammoniak, ergänzt mit 1% Glucose und 400 μg/l Biotin, hergestellt wurde, zu beimpfen. Die Kultur wurde in einen 2,8 l Bell-Schikanenkolben platziert und über Nacht heftig bei 30°C geschüttelt. Am folgenden Tag hatten die Zellen eine OD₆₀₀ von ~ 1,0–2,0 erreicht. Die Zellen wurden pelletiert und in 500 ml Minimal-Brühe, die mit 5 g/l Ammoniumsulfat ergänzt war, erneut suspendiert. Die Zellsuspension wurde in einen 2,8 l Bell-Schikanenkolben platziert und bei 30°C für 6 Stunden heftig geschüttelt. 50 ml der Kultur wurden in einem 250 ml Kolben als eine Kontrolle zur Seite gestellt und zu dem Rest der Kultur wurde 1 mg Nystatin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zugeben, um auxotrophe Mutanten zu selektieren (Snow, Nature 211: 206-207, 1966). Die Kulturen wurden mit Schütteln für eine zusätzliche Stunde inkubiert. Die Kontroll- und mit Nystatin behandelten Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und dreimal mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden auf eine OD₆₀₀ von 1,0 in 50% Glycerol erneut suspendiert und gefroren. Die Titrierung von mit Nystatin behandelten Zellen gegen die Kontrollzellen auf Koloniebildende Einheiten enthüllte, dass die Nystatinanreichung die Anzahl überlebensfähiger Zellen um einen Faktor von 10⁴ verringert hatte.
10^–2-Verdünnungen von mit Nystatin behandelten Zellen wurden auf 15 YEPD-Platten plattiert. Die Kolonien wurden auf Minimalplatten (2% Agar, 1 × YNB, 2% Glucose, 400 μg/l Biotin) replikaplattiert. Die Frequenz von Auxotrophen lag bei ungefähr 2–4%. Ungefähr 180 auxotrophe Kolonien wurden für YEPD + Ade, Leu, Ura-Platten ausgewählt und auf verschiedene Dropout-Platten replikaplattiert. Alle Auxotrophen waren Ade^–. Von diesen waren 30 auf den Dropout-Platten wahrnehmbar rosa (LEU D, HIS D, etc.; siehe Tabelle 1). Von den 30 rosafarbenen Mutanten wurden 21 für die weitere Untersuchung ausgewählt; die übrigen waren entweder durchlässig für Wachstum auf ADE D-Platten oder mit Wildtyp-Zellen kontaminiert.
Die Ade^–-Mutanten wurden dann Komplementierungsanalyse und phänotypischer Testung unterworfen. Um die Anzahl von Loci, die durch die Mutanten definiert werden, zu bestimmen, wurden alle 21 Mutanten mit einem einzelnen rosafarbenen Ade^–-Testerstamm (Stamm #2) gepaart. Die Paarung wurde durch Mischung der Zellsuspensionen (OD₆₀₀ = 1) und Plattierung der Mischungen in 10 μl Aliquots auf YEPD-Platten durchgeführt. Die Zellen wurden dann auf SPOR-Medien (0,5% Natriumacetat, 1 KCl, 1 % Glucose, 1 % Agar) repliziert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden dann auf ADE D-Platten für die Auszählung des Phänotyps replikaplattiert. Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, schafften es einige Kombinationen von Mutanten nicht, ADE⁺-Kolonien zu ergeben (möglicherweise den gleichen genetischen Ort definierend wie in Stamm #2), während andere zahlreiche Ade⁺-Kolonien erzeugten (möglicherweise einen separaten Genort definierend). Da die Mutante #3 Ade⁺-Kolonien ergab, wenn sie mit #2 gepaart wurde, wurde die Komplementierungstestung mit Mutante #3 wiederholt. Wenn die Gruppe von Mutanten zwei Genorte definierte, dann sollten alle Mutanten, die es nicht schafften, Ade⁺-Kolonien zu ergeben, wenn sie mit Stamm #2 gepaart wurden, Ade⁺-Kolonien ergeben, wenn sie mit #3 gepaart würden. Ergebnisse der Kreuzungen werden in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, fielen die meisten Mutanten in eine der beiden Gruppen, was mit der Idee übereinstimmt, dass es zwei biosynthetische Adenin-Gene gibt, die wenn sie fehlen, in rosafarbenen Kolonien auf limitierenden Adenin-Medien resultieren. Drei Kolonien (#4, #12 und #16) können entweder einen dritten Locus definieren oder intragenetische Komplementierung aufweisen. Es wurden zwei intensiv pigmentierte Mutanten von jeder der zwei Komplementierungsgruppen (#3 und #10; #6 und #11) für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Zusätzliche Analyse zeigte an, dass Ade die einzige Auxotrophie war, die in diesen Stämmen vorlag.
Eine P. methanolica-Klonbank wurde in dem Vektor pRS426 konstruiert, einem Shuttle-Vektor, der 2 μ und S. cerevisiae URA3-Sequenzen umfasst, was ihm erlaubt, in S. cerevisiae vermehrt zu werden. Genomische DNA wurde aus Stamm CBS6515 gemäß Standardvorgehensweisen hergestellt. Kurz gefasst wurden Zellen über Nacht in reichen Medien kultiviert, mit Zymolyase sphäroblastiert und mit SDS lysiert. DNA wurde aus dem Lysat mit Ethanol ausgefällt und mit einer Phenol/Chloroform-Mischung extrahiert, dann mit Ammoniumacetat und Ethanol ausgefällt. Die Gelelektrophorese des DNA-Präparates zeigte die Anwesenheit von intakter DNA mit hohem Molekulargewicht und beträchtliche Mengen von RNA. Die DNA wurde mit Sau 3A durch Inkubation der DNA in der Gegenwart einer Verdünnungsreihe des Enzyms teilweise verdaut. Proben des Verdauten wurden durch Elektrophorese analysiert, um die Größenverteilung der Fragmente zu bestimmen. DNA, die zwischen 4 und 12 kb wanderte, wurde aus dem Gel geschnitten und aus der Gelscheibe extrahiert. Die größenfraktionierte DNA wurde dann an pRS426 legiert, das mit Bam HI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Aliquots der Reaktionsmischung wurden in E. coli MC1061-Zellen unter Verwendung einer BioRad Gene Pulser^TM-Vorrichtung, wie durch den Hersteller empfohlen, elektroporiert.
Die Genombibliothek wurde verwendet, um S. cerevisiae-Stamm HBY21A (ade2 ura3) durch Elektroporation zu transformieren (Becker und Guarente, Methods Enzymol. 194: 182-187, 1991). Die Zellen wurden in 1,2 Mol Sorbitol erneut suspendiert und sechs 300 μl-Aliquots wurden auf ADE D, ADE DS, URA D und URA DS-Platten plattiert (Tabelle 1). Die Platten wurden bei 30°C für 4-5 Tage inkubiert. Auf den ADE D oder ADE DS-Platten wurden keine Ade⁺-Kolonien gewonnen. Kolonien von den URA D und URA DS-Platten wurden auf ADE D-Platten replikaplattiert und zwei dicht aneinander gelegene, weiße Kolonien wurden erhalten. Diese Kolonien wurden erneut ausgestrichen und es wurde bestätigt, dass sie Ura⁺ und Ade⁺ waren. Diese zwei Stämme, bezeichnet als Ade1 und Ade6, wurden auf Medien ausgestrichen, die 5-FOA (5-Fluororotsäure; Sikorski und Boeke, Methods Enzymol. 194: 302-318) enthielten. Man erhielt Ura^–-Kolonien, von denen bei Replikaplattierung herausgefunden wurde, dass sie Ade waren. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Ade⁺-komplementierende Aktivität genetisch an den Plasmid-entstandenen URA3-Marker gebunden ist. Von den Hefestämmen Ade1 und Ade6 erhaltene Plasmide schienen durch Restriktionskartierung, wie unten beschrieben wird, identisch zu sein. Diese genomischen Klone wurden als pADE1-1 bzw. pADE1-6 bezeichnet.
Gesamt-DNA wurde von den HBY21A-Transformanten Ade1 und Ade6 isoliert und verwendet, um E. coli-Stamm MC1061 zu Amp^R zu transformieren. Es wurde DNA von zwei Amp^R-Kolonien von Ade1 und 3 Amp^R-Kolonien von Ade6 hergestellt. Die DNA wurde mit Pst I, Sca I und Pst I + Sca I verdaut und durch Gelelektrophorese analysiert. Alle fünf Isolate produzierten das gleiche Restriktionsmuster.
PCR-Primer wurden aus der veröffentlichten Sequenz des P. methanolica ADE2-Gens (auch bekannt als ADE1; Hiep et al., Yeast 9: 1251-1258, 1993) entwickelt. Primer 9080 (SEQ ID NR:3) wurde entwickelt, um an den Basen 406-429 der ADE2-DNA (SEQ ID NR:1) als Primer zu wirken, und Primer 9079 (SEQ ID NR:4) wurde entwickelt, um an den Basen 2852-2829 als Primer zu wirken. Beide Primer beinhalten Schwänze („tails"), um Avr II- und Spe I-Orte an jedem Ende der amplifizierten Sequenz einzuführen. Die vorhergesagte Größe des resultierenden PCR-Fragmentes betrug 2450 bp.
PCR wurde unter Verwendung von Plasmid-DNA von den fünf mutmaßlichen ADE2-Klonen als Matrizen-DNA durchgeführt. Die 100 μl Reaktionsmischungen enthielten 1 × Taq PCR-Puffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 10-100 ng Plasmid-DNA, 0,25 mMol dNTPs, 100 pMol von jedem Primer und 1 μl Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim). Man ließ die PCR über 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 60 Sekunden bei 50°C und 120 Sekunden bei 72°C laufen. Jeder der fünf mutmaßlichen ADE2-genomischen Klone ergab ein PCR-Produkt der erwarteten Größe (2,4 kb). Die Restriktionskartierung des DNA-Fragmentes von einer Reaktion ergab die erwarteten Größenfragmente, wenn es mit Bgl II oder Sal I verdaut wurden.
Die positiven PCR-Reaktionen wurden gepoolt und mit Spe I verdaut. Vektor pRS426 wurde mit Spe I verdaut und mit intestinaler Phosphatase vom Kalb behandelt. Vier μl PCR-Fragment und 1 μl Vektor-DNA wurden in einer 10 μl Reaktionsmischung unter Verwendung konventioneller Bindungsbedingungen verbunden. Die verbundene DNA wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Spe I-Verdautes wurde analysiert, um Plasmide, die einen Subklon des ADE2-Gens innerhalb von pRS426 trugen, zu identifizieren. Das korrekte Plasmid wurde als pCZR118 bezeichnet.
Da das ADE2-Gen in pCZR118 durch PCR amplifiziert worden war, war es möglich, dass Mutationen, die den funktionellen Charakter des Gens behinderten, erzeugt worden sein könnten. Um auf solche Mutationen zu testen, wurden Subklone mit dem erwünschten Insert einzeln in Saccharomyces cerevisiae-Stamm HBY21A transformiert. Zellen wurden elektrokompetent gemacht und gemäß den Standardvorgehensweisen transformiert. Transformanten wurden auf URA D- und ADE D-Platten plattiert. Es wurden drei phänotypische Gruppen identifiziert. Die Klone 1, 2, 11 und 12 ergaben robustes Wachstum von vielen Transformanten auf ADE D. Die Transformationsfrequenz war mit der Frequenz von URA⁺-Transformanten vergleichbar. Die Klone 6, 8, 10 und 14 ergaben ebenfalls eine hohe Transformationseffizienz zu sowohl Ura⁺ wie auch Ade⁺, aber die Ade⁺-Kolonien waren etwas kleiner als diejenigen in der ersten Gruppe. Klon 3 ergab viele Ura⁺-Kolonien, aber keine Ade⁺-Kolonien, was nahe legt, dass es eine nicht-funktionelle ade2-Mutation trug. Die Klone 1, 2, 11 und 12 wurden gepoolt.
Um die P. methanolica ade2-Komplementierungsgruppe zu identifizieren, wurden zwei repräsentative Mutanten von jeder Komplementierungsgruppe (#3 und #10; #6 und #11), die auf der Basis tiefroter Pigmentierung, wenn sie auf limitierendem Adenin gezüchtet wurden, ausgewählt wurden, mit dem geklonten ADE-Gen transformiert. Zweihundert ml-Kulturen von frühen Log-Phase-Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3000 × g für 3 Minuten geerntet und in 20 ml frischem KD-Puffer (50 mMol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 25 mMol DTT) erneut suspendiert. Die Zellen wurden in diesem Puffer bei 30°C für 15 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet und in 200 ml eiskalter STM (270 mMol Saccharose, 10 mMol Tris, pH 7,5, 1 mMol MgCl₂) erneut suspendiert. Die Zellen wurden geerntet und in 100 ml eiskalter STM erneut suspendiert. Die Zellen wurden wieder geerntet und in 3-5 ml eiskalter STM erneut suspendiert. 100 μl-Aliquots elektrokompetenter Zellen von jeder Kultur wurden dann mit Not I-verdauter pADE1-1-DNA gemischt. Die Zell/DNA-Mischung wurde in eine 2 mm Elektroporationsküvette platziert und einem gepulsten elektrischen Feld von 5 kV/cm unter Verwendung eines BioRad Gene Pulser^TM, eingestellt auf 1000 Ω Widerstand und 25 μF Kapazität, ausgesetzt. Nachdem sie gepulst wurden, wurden die Zellen durch Zugabe von 1 ml YEPD verdünnt und bei 30°C für eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden dann durch sanfte Zentrifugation geerntet und in 400 μl minimal selektiven Medien, denen Adenin fehlte (ADE D), erneut suspendiert. Die erneut suspendierten Proben wurden in 200 μl-Aliquots aufgetrennt und auf ADE D- und ADE DS-Platten plattiert. Die Platten wurden bei 30°C für 4-5 Tage inkubiert. Die Mutanten #6 und #11 ergaben Ade⁺-Transformanten. Es wurden keine Ade⁺-Transformanten beobachtet, wenn DNA weggelassen wurde, daher schien es, dass die zwei Isolate die ade2-Komplementierungsgruppe definieren. Die ADE2-Sequenz wird in SEQ ID NR:1 gezeigt.
Beispiel 2
Die P. methanolica-Klonbank, die in Beispiel 1 offenbart wird, wurde als eine Quelle für die Klonierung des Alcohol Utilization Gene (AUG1) verwendet. Die Klonbank wurde als unabhängige Pools gelagert, wovon jeder ungefähr 200-250 individuelle genomische Klone darstellt. 0,1 μl von "Miniprep"-DNA von jedem Pool wurde als eine Matrize in einer Polymerase-Kettenreaktion mit PCR-Primern (8784, SEQ ID NR:5; 8787, SEQ ID NR:6) verwendet, die aus einer Anordnung von konservierten Sequenzen in Alkoholoxidasegenen von Hansenula polymorpha, Candida boidini und Pichia pastoris entwickelt worden waren. Man ließ die Amplifikationsreaktion für 30 Zyklen bei 94°C, 30 Sekunden; 50°C, 30 Sekunden; 72°C, 60 Sekunden laufen, gefolgt von einer 7-minütigen Inkubation bei 72°C. Ein Pool (#5) ergab eine ~ 600 bp-Bande. Die DNA-Sequenzierung dieses PCR-Produktes enthüllte, dass es eine Aminosäuresequenz mit ~ 70%iger Sequenzidentität mit der Pichia pastoris-Alkoholoxidase, codiert durch das AOX1-Gen, und ungefähr 85%ige Sequenzidentität mit der Hansenula polymorpha-Alkoholoxidase, codiert durch das MOX1-Gen, codierte. Die Sequenz des geklonten AUG1-Gens wird in SEQ ID NR:2 gezeigt.
Unterpools von Pool #5 wurden durch PCR unter Verwendung der gleichen Primer, die bei der anfänglichen Amplifikation verwendet wurden, analysiert. Ein positiver Unterpool wurde weiter heruntergebrochen, um eine positive Kolonie zu identifizieren. Diese positive Kolonie wurde auf Platten ausgestrichen und DNA wurde von individuellen Kolonien hergestellt. Drei Kolonien ergaben identische Muster nach Verdau mit Cla I.
Restriktionskartierung des genomischen Klons und des PCR-Produktes enthüllte, dass das AUG1-Gen auf einem 7,5 kb genomischen Insert lag und dass Orte innerhalb des PCR-Fragmentes innerhalb des genomischen Inserts einheitlich identifiziert werden konnten. Da die Orientierung des Gens innerhalb des PCR-Fragmentes bekannt war, stellte die letztere Information die ungefähre Lokalisierung und Richtung der Transkription des AUG1-Gens innerhalb des genomischen Inserts bereit. DNA-Sequenzierung innerhalb dieser Region enthüllte ein Gen mit sehr hoher Sequenzähnlichkeit auf der Aminosäureebene mit anderen bekannten Alkoholoxidasegenen.
Beispiel 3
Ade2-mutierte P. methanolica-Zellen werden durch Elektroporation, im Wesentlichen wie oben offenbart, mit einem Expressionsvektor, der AUG1-Promotor und -Terminator, menschliche GAD65-DNA (Karlsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8337-8341, 1991) und ADE2-selektierbaren Marker umfasst, transformiert. Die Kolonien werden auf Minimal-Methanol-Agar-Platten fleckförmig aufgetragen (10 bis 100 Kolonien pro 100 mm-Platte), die 20 g/l Bacto^TM-Agar (Difco), 6,7 g/l Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren (Difco), 10 g/l Methanol und 0,4 μg/l Biotin enthalten. Der Agar wird mit Nitrocellulose überschichtet und die Platten werden über Deckeln umgedreht, die 1 ml 50%iges Methanol in Wasser enthalten, und für 3 bis 5 Tage bei 30°C inkubiert. Die Membran wird dann auf einen Filter übertragen, der in 0,2 M NaOH, 0,1 % SDS, 35 mM Dithiothreitol eingeweicht wird, um die adhärenten Zellen zu lysieren. Nach 30 Minuten werden die Zellbruchstücke von dem Filter mit destilliertem Wasser abgespült und der Filter wird durch Spülung in 0,1 M Essigsäure für 30 Minuten neutralisiert.
Die Filter werden dann auf adhärentes Protein untersucht. Unbesetzte Bindungsstellen werden durch Spülung in TTBS-NFM (20 mM Tris pH 7,4, 0,1 % Tween 20, 160 mM NaCl, 5% fettfreies Milchpulver) für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Die Filter werden dann zu einer Lösung transferiert, die monoklonalen GAD6-Antikörper (Chang und Gottlieb, J. Neurosci. 8:2123-2130, 1988), verdünnt 1:1000 in TTBS-NFM, enthält. Die Filter werden in der Antikörperlösung mit sanfter Bewegung für mindestens 1 Stunde inkubiert, dann mit TTBS (20 mM Tris pH 7,4, 0,1 % Tween 20, 160 mM NaCl) zweimal für jeweils fünf Minuten gewaschen. Die Filter werden dann in Ziegen-anti-Maus-Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase (1 μg/ml in TTBS-NFM), für mindestens eine Stunde inkubiert, dann dreimal gewaschen, 5 Minuten pro Waschung mit TTBS. Die Filter werden dann kommerziell erhältlichen chemilumineszierenden Reagenzien (ECL^TM, Amersham Inc., Arlington Heights, IL) ausgesetzt. Licht, das von positiven Patches erzeugt wird, wird auf Röntgenfilm nachgewiesen.
Um den Level der GAD₆₅-Expression genauer nachzuweisen, werden Kandidatklone in Schüttelkolbenkulturen kultiviert. Man lässt die Kolonien für zwei Tage auf Minimal- Methanol-Platten bei 30°C, wie oben offenbart, wachsen. Die Kolonien werden verwendet, um 20 ml Minimal-Methanol-Medien (6,7 g/l Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 10 g/l Methanol, 0,4 μg/l Biotin) mit einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml zu beimpfen. Man lässt die Kulturen für 1-2 Tage bei 30°C mit heftigem Schütteln wachsen. 0,2 ml 50%iges Methanol werden täglich zu jeder Kultur zugegeben. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in eiskaltem Lysepuffer (20 mM Tris pH 8,0, 40 mM NaCl, 2 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin, 1 μg/ml Aprotinin) mit 10 ml endgültigem Volumen pro 1 g Zellpaste suspendiert. 2,5 ml der resultierenden Suspension wird zu 2,5 ml 400-600 μm, eiskalten, säuregewaschenen Glasskügelchen in einem 15 ml-Gefäß zugegeben und die Mischung wird heftig für eine Minute bewegt, dann auf Eis für eine Minute inkubiert. Das Vorgehen wird wiederholt bis die Zellen für insgesamt fünf Minuten bewegt worden sind. Große Bruchstücke und unaufgebrochene Zellen werden durch Zentrifugation bei 1000 × g für 5 Minuten entfernt. Das geklärte Lysat wird dann in einen sauberen Behälter dekantiert. Das geklärte Lysat wird in Probenpuffer (5 % SDS, 8 M Harnstoff, 100 mM Tris pH 6,8, 10% Glycerol, 2 mM EDTA, 0,01 % Bromphenolblau) verdünnt und auf einem 4-20% Acrylamidgradient-Gel (Novex, San Diego, CA) der Elektrophorese unterworfen. Proteine werden auf Nitrozellulose geblottet und mit GAD6-Antikörper, wie oben offenbart, nachgewiesen.
Klone, die die höchsten Level an Methanol-induzierter Expression von fremdem Protein in Schüttelkolbenkultur zeigen, werden ausführlicher unter Fermentationsbedingungen mit hoher Zelldichte analysiert. Die Zellen werden zuerst in 0,5 Litern YEPD-Brühe bei 30°C für 1-2 Tage mit heftiger Bewegung kultiviert, dann verwendet, um einen 5-Liter-Fermentationsapparat (z.B. BioFlow III; New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ) zu beimpfen. Das Fermentationsgefäß wird zuerst mit Mineralsalzen durch die Zugabe von 57,8 g (NH₄)₂SO₄, 68 g KH₂PO₄, 30,8 g MgSO₄·7 H₂O, 8,6 g CaSO₄·2 H₂O, 2,0 g NaCl und 10 ml Entschäumer (PPG) beschickt. H₂O wird zugegeben, um das Volumen auf 2,5 l zu bringen und die Lösung wird 40 Minuten autoklaviert. Nach Abkühlung werden 350 ml 50%ige Glucose, 250 ml 10 × Spurenelemente (Tabelle 4), 25 ml 200 μg/ml Biotip und 250 ml Zellimpfmaterial zugegeben. Tabelle 4

Zugabe von 1-2 ml H₂SO₄ pro Liter, um die Verbindungen in Lösung zu bringen.

Das Fermentationsgefäß wird so eingestellt, dass es bei 28°C, pH 5,0 und >30% gelöstem O₂ läuft. Die Zellen werden die erste Charge an Glucose konsumieren, wie durch einen deutlichen Bedarf an Sauerstoff während des Glucoseverbrauchs, gefolgt von einer Abnahme im Sauerstoffverbrauch, nachdem die Glucose aufgebraucht ist, angezeigt wird. Nach der Erschöpfung der anfänglichen Glucosecharge wird eine Glucose-Methanol-Nahrung, ergänzt mit NH₄ ⁺ und Spurenelementen, an das Gefäß bei 0,2% (G/V) Glucose, 0,2% (G/V) Methanol für 5 Stunden, gefolgt von 0,1 % (G/V) Glucose, 0,4% (G/V) Methanol für 25 Stunden, verabreicht. Eine Gesamtmenge von 550 Gramm Methanol wird durch eine (Öffnung des Gefäßes als reines Methanol unter Verwendung einer anfänglichen Abgabegeschwindigkeit von 12,5 ml/h und einer endgültigen Geschwindigkeit von 25 ml/h geliefert. Glucose wird durch eine zweite Öffnung unter Verwendung einer 700 ml Lösung, die 175 Gramm Glucose, 250 ml 10X Spurenelemente und 99 g (NH₄)₂SO₄ enthält, geliefert. Unter diesen Bedingungen werden die Glucose und das Methanol simultan verwertet, mit der Induktion der GAD₆₅-Expression zu Beginn der Glucose-Methanol-Ernährung. Die Zellen aus dem Fermentationsgefäß werden auf GAD₆₅-Expression analysiert, wie es oben für die Schüttelkolbenkulturen beschrieben wurde.
Die Zellen werden in bestimmten Zeitintervallen aus dem Fermentationsgefäß entfernt und darauf folgend analysiert. Während des Wachstums auf Glucose wird geringe GAD₆₅- Expression beobachtet. Die Erschöpfung von Glucose führt zu Expression des GAD₆₅-Proteins auf niedrigem Niveau; die Expression wird durch die Zugabe von MeOH während der Fütterung der Fermentationskultur gesteigert. Die Zugabe von Methanol weist einen klar stimulierenden Effekt auf die Expression von menschlichem GAD₆₅ auf, angetrieben durch den auf Methanol reagierenden AUG1-Promotor.
Beispiel 4
Es werden die Transformationsbedingungen untersucht, um die Bedingungen des elektrischen Feldes, DNA-Topologie und DNA-Konzentration, die optimal für die effiziente Transformation von P. methanolica waren, zu bestimmen. Alle Experimente verwendeten P. methanolica ade2 Stamm #11. Kompetente Zellen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Elektroporation wurde unter Verwendung eines BioRad Gene Pulser^TM durchgeführt.
Drei Feldparameter beeinflussen die Transformationseffizienz durch Elektroporation: Kapazität, Feldstärke und Pulsdauer. Die Feldstärke wird durch die Spannung des elektrischen Pulses bestimmt, während die Pulsdauer durch die Widerstandseinstellung des Instrumentes bestimmt wird. Bei diesem Satz an Experimenten wurde eine Matrix von Feldstärkeneinstellungen bei verschiedenen Widerständen untersucht. Bei allen Experimenten wurde die höchste Kapazitätseinstellung (25 μF) des Instrumentes verwendet. 100 μl-Aliquots von elektrokompetenten Zellen wurden auf Eis mit 10 μl DNA gemischt, die ungefähr 1 μg des ADE2-Plasmids pCZR133, das mit dem Restriktionsenzym Not I linearisiert worden war, enthielt. Die Zellen und DNA wurden auf 2 mm Elektroporationsküvetten (BTX Corp., San Diego, CA) übertragen und mit einer Feldstärke von 0,5 kV (2,5 kV/cm), 0,75 kV (3,75 kV/cm), 1,0 kV (5,0 kV/cm), 1,25 kV (6,25 kV/cm) und 1,5 kV (7,5 kV/cm) elektrogepulst. Diese Feldstärkenbedingungen wurden bei verschiedenen Pulsdauern untersucht. Die Pulsdauer wurde durch Variation der Instrumenteneinstellungswiderstände auf 200 Ohm, 600 Ohm oder „unendliche" Ohm beeinflusst. Gepulste Zellen wurden in YEPD suspendiert und für eine Stunde bei 30°C inkubiert, geerntet, erneut suspendiert und plattiert. Es wurden drei getrennte Sätze an Experimenten durchgeführt. Bei jedem Satz wurde herausgefunden, dass die Elektroporationsbedingugnen von 0,75 kV (3,75 kV/cm) bei einem Widerstand von „unendlichen" Ohm eine dramatisch höhere Transformationseffizienz ergab als die anderen getesteten Bedingungen (siehe 1).
Nachdem die optimalen Pulsbedingungen ermittelt worden waren, wurde der Einfluss der DNA-Topologie auf die Transformationseffizienz untersucht. Elektrokompetente Zellen wurden mit 1 μg ungeschnittenem, zirkulärem pCZR133 oder mit 1 μg Not I-verdautem pCZR133 gemischt. Bei drei getrennten Experimenten wurde ein Durchschnitt von annährend 25 Transformanten bei zirkulärer DNA gewonnen, während lineare DNA einen Durchschnitt von fast 1 × 10⁴ Transformanten erbrachte. Diese Daten weisen darauf hin, dass lineare DNA P. methanolica mit deutlich größerer Effizienz transformiert als zirkuläre DNA.
Schließlich wurde das Verhältnis zwischen DNA-Konzentration und Transformationseffizienz untersucht. Aliquots von linearer pCZR133-DNA (1 ng, 100 ng und 1 μg in 10 μl H₂O) wurden mit 100 μl elektrokompetenten Zellen gemischt und Elektroporation wurde bei 3,75 kV/cm und „unendlichen" Ohm durchgeführt. Die Anzahl an Transformanten variierte zwischen ungefähr 10 (1 ng DNA) bis 10⁴ (1 μg DNA) und es wurde herausgefunden, dass sie zu der DNA-Konzentration proportional ist.
Beispiel 5
Die Integration transformierender DNA in das Genom von P. methanolica wurde durch Vergleich mit DNA von Wildtyp-Zellen und stabilen weißen Transformantenkolonien nachgewiesen. Es wurden zwei Klassen integrativer Transformanten identifiziert. In der ersten wurde festgestellt, dass sich die transformierende DNA an einem homologen Ort integriert hatte. In der zweiten Klasse wurde festgestellt, dass die transformierende DNA den endogenen offenen AUG1-Leserahmen ersetzt hatte. Während es nicht erwünscht ist, durch diese Theorie gebunden zu sein, glaubt man von dieser zweiten Transformante, dass sie durch ein „Verlagerungs-Rekombinations-Ereignis" (Rothstein, Methods Enzymol. 194:281-301, 1991) entstanden ist, mit dessen Hilfe die transformierende DNA die endogene DNA durch ein doppeltes Rekombinationsereignis ersetzt.
P. methanolica ade2-Stamm #11 wurde mit Asp I-verdautem pCZR140, einem auf Bluescript^® (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) basierendem Vektor, der das P. methanolica ADE2-Gen und eine Mutante von AUG1 enthält, in der der gesamte offene Leserahmen zwischen den Promotor- und Terminatorregionen deletiert wurde (2), zu Ade⁺ transformiert. Genomische DNA wurde von Wildtyp- und Transformantzellen, die für zwei Tage auf YEPD-Platten bei 30°C gezüchtet wurden, hergestellt. Ungefähr 100-200 μl Zellen wurden in 1 ml H₂O suspendiert, dann in einer Mikrozentrifuge für 30 Sekunden zentrifugiert. Das Zellpellet wurde gewonnen und in 400 μl SCE + DTT + Zymolase (1,2 M Sorbitol, 10 mM Natriumcitrat, 10 mM EDTA, 10 mM DTT, 1-2 mg/ml Zymolase 100T) erneut suspendiert und bei 37°C für 10-15 Minuten inkubiert. 400 μl 1 % SDS wurde zugegeben und die Lösung wurde gemischt bis sie klar war. 300 μl 5 M Kaliumacetat, pH 8,9 wurde zugegeben und die Lösung wurde gemischt und mit Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten zentrifugiert. 750 μl des Überstandes wurden auf ein neues Röhrchen übertragen und mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform extrahiert. 600 μl des resultierenden Überstandes wurden gewonnen und DNA wurde durch Zugabe von zwei Volumen Ethanol und Zentrifugation für 15 Minuten in der Kälte präzipitiert. Das DNA-Pellet wurde in 50 ml TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA) + 100 μg/ml RNAse für ungefähr 1 Stunde bei 65°C erneut suspendiert. 10 μl-DNA-Proben wurden mit Eco RI (5 μl) in einem 100 μl Reaktionsvolumen bei 37°C übernacht verdaut. DNA wurde mit Ethanol präzipitiert, durch Zentrifugation zurück gewonnen und in 7,5 μl TE + 2,5 μl 5X Ladefarbstoff erneut suspendiert. Das gesamte 10 ml Volumen wurde auf eine Bahn eines 0,7% Agarose-in-0,5 × TBE (10 × TBE ist 108 g/l Tris-Base 7-9, 55 g/l Borsäure, 8,3 g/l Dinatrium EDTA)-Gels aufgebracht. Man ließ das Gel bei 100 V in 0,5 × TBE, das Ethidiumbromid enthielt, laufen. Das Gel wurde photographiert und die DNA wurde elektrophoretisch auf eine positiv derivatisierte Nylonmembran (Nytran^® N+, Schleicher & Schuell, Keene, NH) bei 400 mA, 20 mV für 30 Minuten übertragen. Die Membran wurde dann in 2 × SSC gespült, für 5 Minuten auf Denaturierungslösung geblottet, in 2 × SSC neutralisiert, dann feucht in einem UV-Quervernetzer (Stratalinker^®, Stratagene Cloning Systems) bei automatischer Einstellung quervernetzt. Der Blot wurde an eine durch PCR erzeugte AUG1-Promotorsonde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (ECL^TM Kit, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) hybridisiert. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die transformierende DNA die Struktur der AUG1-Promotor-DNA in Übereinstimmung mit einem homologen Integrationsereignis änderte (2).
Bei einem zweiten Experiment wurde P. methanolica ade2-Stamm #11 mit Not I-verdautem pCZR137, einem Vektor, der eine menschliche GAD65 cDNA zwischen dem AUG1-Promotor und -Terminator enthält (3), zu Ade⁺ transformiert. Genomische DNA wurde wie oben beschrieben aus Wildtyp-Zellen und einer stabilen, weißen Ade⁺-Transformante hergestellt und mit Eco RI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Elektrophorese aufgetrennt und auf eine Membran geblottet. Der Blot wurde mit einer PCR-erzeugten Sonde, korrespondierend zu entweder dem offenen AUG1-Leserahmen oder dem AUG1-Promotor, sondiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die offene Leserahmen- AUG1-DNA bei dem Transformantstamm nicht vorlag und dass sich die AUG1-Promotorregion einer signifikanten Umordnung unterzogen hatte. Diese Ergebnisse stimmen mit einem doppelten Rekombinationsereignis (Verlagerung) zwischen der transformierenden DNA und dem Wirtsgenom überein (3).
Beispiel 6
Ein AUG1-Stamm von P. methanolica wird unter Hochdichte-Fermantationsbedingungen gezüchtet. Das Fermentationsgefäß wird zuerst mit Mineralsalzen durch die Zugabe von 57,8 g (NH₄)₂SO₄, 46,6 g KCl, 30,8 g MgSO₄·7 H₂O, 8,6 g CaSO₄·2 H₂O, 2,0 g NaCl und 10 ml Entschäumer (PPG) beschickt. H₂O wird zugegeben, um das Volumen auf 2,5 l zu bringen und die Lösung wird 40 Minuten autoklaviert. Nach Abkühlung werden 350 ml 50%ige Glucose, 250 ml 10 × Spurenelemente (Tabelle 4), 210 ml 30% NaPhosphat, 25 ml 200 μg/ml Biotin und 250 ml Zellimpfmaterial zugegeben. Die Zellen werden mit Glucose oder mit Glucose/Methanol im Batch-Fed-Verfahren in drei Phasen gefüttert. In Phase I erhalten die Zellen 0,4%/l/h Glucose (G/V endgültiges Fermentationsvolumen) für 25 Stunden unter Verwendung von 750 g Glucose, 110 g (NH₄)₂SO₄ und 278 10 × Spurenelementen pro 1,5 Liter. Den Zellen wird dann eine Übergangsnahrung von 0,2% Glucose, 0,2% Methanol/l/h für 5 Stunden gegeben. Die endgültige mit Glucose ergänzte Methanolnahrung enthält 0,1% Glucose, 0,4% Methanol/l/h für 25 Stunden. Die endgültige Biomasse beträgt ungefähr 300 g/l Zellpaste.
Beispiel 7
Für die Fermentation eines P. methanolica aug1Δ-Stammes wird das Fermentationsgefäß anfänglich mit Mineralsalzen, Glucose, Phosphat, Spurenelementen und Biotin beschickt, wie es in Beispiel 6 offenbart wird. 250 ml Zellimpfmaterial wird zugegeben. Es wird eine Glucosenahrung unter Verwendung von 600 g Glucose, 108 g (NH₄)₂SO₄ und 273 ml 10 × Spurenelementen pro 1,2 Liter hergestellt. Die Zellen werden im Batch-Fed-Verfahren in drei Phasen gefüttert. In der ersten Phase erhalten die Zellen Glucose für 12 bis 25 Stunden mit 0,4%/l/Stunde. Die Zellen werden dann mit einer Boluszugabe von 1 Gewichtsprozent Methanol induziert und zur Methanolverwertung mit einer gemischten 0,2% Glucose/0,1 % Methanol-Nahrung für 10 Stunden überführt. In der dritten Phase wird eine gemischte Nahrung aus 0,2% Glucose, 0,2% Methanol für 15 Stunden verabreicht.
Beispiel 8
P. methanolica-Zellen, in denen das AUG1-Gen durch Insertion eines GAD65-Expressionskonstruktes unterbrochen wurde, behielten die Fähigkeit auf Methanol zu wachsen, was darauf hin deutete, dass ein zweites Alkoholoxidase-Gen vorlag. Das zweite Gen, bezeichnet als AUG2, wurde durch PCR identifiziert. Die Sequenzanalyse der 5'-Kodierungsregion des Gens zeigte, dass der N-Terminus des kodierten Proteins denjenigen bekannter Alkoholoxidase-Gene ähnlich war.
Stamm MC GAD8, eine Transformante, die auf Minimal-Methanol-Brühe sehr schwach wuchs, wurde als eine Quelle für das Klonen des AUG2-Gens verwendet. Genomische DNA wurde aus MC GAD8 hergestellt und mit Sinn- und Gegensinn-Primern, die spezifisch für den offenen AUG1-Leserahmen sind (8784, SEQ ID NO:5; 8787, SEQ ID NO:6), amplifiziert. Man erhielt ein Produkt, dass in der Größe identisch mit dem AUG1-Produkt war, aber nur eine sehr geringe Intensität auf einem analytischen Gel zeigte.
Das mutmaßliche AUG2-PCR-Produkt wurde mit einer Batterie von Restriktionsenzymen verdaut. Der teilweise Verdau durch Eco RI und Pvu I und die Gegenwart verschiedener Bgl II-Orte legten nahe, dass die DNA mit kleinen Mengen AUG1 kontaminiert war. Um die kontaminierende AUG1-DNA zu entfernen, wurde die PCR-Mischung mit Eco RI geschnitten und gelgereinigt. Da das MC GAD 8-Produkt keinen Eco RI-Ort zu haben schien, wurde es nicht beeinträchtigt. Die resultierende gelgereinigte DNA wurde erneut amplifiziert und wieder durch Restriktionsverdau analysiert. Die DNA ergab eine Restriktionskarte, die sich von der des AUG1-PCR-Produktes unterschied.
Southern Blot-Analyse wurde auf genomische DNA von MC GAD8 und Wildtyp-Zellen unter Verwendung von entweder AUG1- oder AUG2-offenen Leserahmen PCR-Fragmenten als Sonden durchgeführt. Die AUG2-Sonde hybridisierte an den AUG1-Locus mit geringer Stringenz und mit sowohl niedriger wie hoher Stringenz an einen zweiten Locus. Die AUG1-Sonde band an beide Loci mit geringer Stringenz, aber band vorherrschend an den AUG1-Locus mit hoher Stringenz. Diese Daten wiesen darauf hin, dass das neue PCR-Produkt von MC GAD8 ähnlich, aber unterschiedlich zu AUG1 war. Die Sequenzanalyse zeigte eine 83%ige Identität zwischen AUG1- und AUG2-Genprodukten.
Um den AUG2-Genomlocus zu klonen, wurden PCR-Primer aus dem ursprünglichen AUG2-PCR-Fragment entwickelt. Die Primer 9885 (SEQ ID NO:7) und 9883 (SEQ ID NO:8) wurden verwendet, um eine P. methanolica-Genombibliothek zu screenen. Ein positiver Klonbankpool wurde dann mit dem ursprünglichen MC GAD8 PCR-Produkt gescreent. Die Zellen wurden auf 10 Platten mit ungefähr 5000 Kolonien/Platte plattiert und über Nacht gezüchtet, dann wurden die Platten mit Filterscheiben (Hybond-N, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) überschichtet. Die Kolonien wurden denaturiert, neutralisiert und mit UV quervernetzt. Bakterielle Bruchstücke wurden von den Filtern mit 5X SSC gewaschen und die Filter wurden wieder quervernetzt. Die Blots wurden in Paaren bei 42°C für eine Stunde in 25 ml Hybridisierungspuffer vorhybridisiert. Es wurden dann ungefähr 250 ng Sonde zu jedem Filterpaar zugegeben. Die Hybridisierung wurde bei 42°C für vier Stunden durchgeführt. Die Blots wurden dann in 500 ml 0,1 × SSC, 6 M Harnstoff, 0,4% SDS bei 42°C für 10 Minuten viermal gewaschen. Die Blots wurden dann mit 500 ml 2 × SSC bei Raumtemperatur für 5 Minuten, 2 Spülungen, neutralisiert. Die Blots wurden dann in 100 ml Entwicklungsreagens (ECL, Amersham Corp.) eingetaucht.
Positive Kolonien wurden aufgenommen und unter Verwendung der PCR-Primer 9885 (SEQ ID NO:7) und 9883 (SEQ ID NO:8) amplifiziert, um ihre Identität zu bestätigen. Positive Pools wurden auf Platten ausgestrichen und einzelne Kolonien wurden durch PCR erneut gescreent. Eine Kolonie wurde zur weiteren Analyse (Restriktionskartierung und Sequenzierung) ausgewählt. Eine partielle Sequenz des AUG2-Gens wird in SEQ ID NO:9 gezeigt. Wie in SEQ ID NO:9 gezeigt wird, beginnt die AUG2-Sequenz an dem HindIII-Ort bei Nukleotid 91. Nukleotide, die stromaufwärts von dieser Position liegen, sind Vektorsequenz. Die Codierungssequenz beginnt an Nukleotid 170.
Die Unterbrechung des AUG2-Gens besaß geringe Wirkung auf das Zellwachstum auf Methanol. Zellen, denen es sowohl an funktionellen AUG1- wie AUG2-Genprodukten fehlte, wuchsen nicht auf Methanol. Darauf folgende Analyse zeigte, dass das AUG1-Genprodukt die einzige nachweisbare Alkoholoxidase in Zellen, die in einem Fermentor gezüchtet werden, ist.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung von Pichia methanolica-Zellen, die für Adenin auxotroph sind, umfassend: (a) Exposition der P. methanolica-Zellen gegenüber mutagenisierenden Bedingungen; (b) Kultivierung der Zellen aus Schritt (a) in einem energiereichen Medium, um die Etablierung und die Replikation von Mutationen in zumindest einem Teil der Zellen zu ermöglichen; (c) Kultivierung der Zellen aus Schritt (b) in einem Kulturmedium, dem es an assimilierbarem Stickstoff mangelt, um zelluläre Stickstoffspeicher aufzubrauchen; (d) Kultivierung der Zellen aus Schritt (c) in einem definierten Kulturmedium, das eine anorganische Stickstoffquelle und eine Menge an Nystatin umfasst, die ausreicht, um wachsende P. methanolica-Zellen zu töten, um Zellen, die auxotroph für Adenin sind, zu selektieren und (e) Kultivierung der selektierten Zellen aus Schritt (d) in einem energiereichen Kulturmedium.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die selektierten Zellen aus Schritt (e) auf ein definiertes Medium, dem Adenin fehlt, im Replika-Plattierungsverfahren plattiert und kultiviert werden, um die Gegenwart einer auxotrophen Mutation für Adenin zu bestätigen.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die selektierten Zellen einen Mangel an Phosphoribosyl-5-aminoimidazolcarboxylase aufweisen.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das definierte Kulturmedium 2 mg/l Nystatin enthält.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die mutagenisierenden Bedingungen die Exposition gegenüber ultraviolettem Licht oder die Exposition gegenüber einem chemischen Mutigen umfassen.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die anorganische Stickstoffquelle Ammoniumionen, z. S. Ammoniumsulfat, umfasst.