DE60013829T2

DE60013829T2 - Pichia methanolica glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-1-promoter und -terminator

Info

Publication number: DE60013829T2
Application number: DE60013829T
Authority: DE
Inventors: G. Brady MILLER; S. James SLOAN; K. Christopher RAYMOND; Erica Vanaja
Original assignee: University of Washington; Zymogenetics Inc
Current assignee: University of Washington; Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-06-24
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2020-06-17
Also published as: DE60013829D1; AU5876300A; MXPA02000160A; WO2000078978A1; CA2397494A1; ATE276372T1; EP1192263B1; EP1192263A1; US6613547B1; ES2231217T3; JP2003503030A; DK1192263T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Methylotrophische Hefen sind diejenigen Hefen, die in der Lage sind, Methanol als eine einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie zu verwenden. Hefearten, die die biochemischen Wege aufweisen, die erforderlich sind, um Methanol zu verwenden, sind in vier Arten unterteilt, Hansenula, Pichia, Candida und Troulopsis. Diese Arten sind in gewisser Weise künstlich, da sie auf der Zellenmorphologie und den Wachstumscharakteristika basieren und nicht die enge genetische Verwandtschaft widerspiegeln (Billion-Grand, Mycotaxon 35:201–204, 1989; Kurtzmann, Mycologia 84:72–76, 1992). Weiterhin sind nicht alle Spezies innerhalb dieser Arten in der Lage, Methanol als eine Quelle für Kohlenstoff und Energie zu verwenden. Als eine Konsequenz dieser Klassifizierung gibt es große Unterschiede in der Physiologie und im Metabolismus zwischen den individuellen Arten eines Genus.
Methylotrophische Hefen sind aus verschiedenen Gründen attraktive Kandidaten für die Verwendung bei rekombinanten Proteinproduktionssystemen. Zunächst wurde gezeigt, daß methylotrophische Hefen schnell zu einer großen Biomasse auf einem minimal definierten Medium heranwachsen. Zweitens sind rekombinante Expressionskassetten genomisch integriert und daher mitotisch stabil. Drittens sind diese Hefen in der Lage, große Mengen rekombinanten Proteins auszuscheiden. Siehe Beispiel 2 , Faber et al., Yeast 11:1331, 1995; Romanos et al., Yeast 8:423; 1992: Cregg et al., Bio/Technology 11:905, 1993; U.S. Patent No. 4,855,242; U.S. Patent No. 4,857, 467; U.S. Patent No 4,879,231; und U.S. Patent No, 4,929,555; und Raymond, U.S. Patent Nos. 5,716,808, 5,736,383, 5,854,039. und 5,888,768.
WO-A-99/14347 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von Proteinen, die zu Pichia methanolica heterolog sind, in einer proteasedefizienten Pichia methanolica-Zelle.
WO-A-97/17450 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von Proteinen, die zu P. methanolica heterolog sind, durch Verwenden eines Methanol-induzierbaren Promoters (Alkoholverwendungsgen 1, SEQ ID Nr.2) in einer P. methanolica-Zelle.
EP-A-0374913 offenbart das Pichia patoris Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Gen.
EP-A-0438200 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von Proteine, die zu P. pastoris heterolog sind, durch Verwenden eines endogenen Alkohol-Oxidase (AOX₁) Promoters in einer P. pastoris-Zelle.
Genbankzugangsnummer U95625 offenbart die Sequenz des P. angusta Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Gens.
Vorher beschriebene Expressionssysteme für methylotrophische Hefen hängen zu einem großen Teil von der Verwendung von Methanol-induzierbaren Transkriptionspromotoren ab. Die Verwendung von Methanolinduzierbaren Promotoren ist jedoch problematisch, wenn die Produktion auf kommerzielle Niveaus hochskaliert wird. Das Gesamtvolumen an Methanol, das während des Fermentationsverfahrens verwendet wird, kann bis zu 40% des finalen Fermentationsvolumens betragen, und bei einer 1000-Liter Fermentationsskala und darüber sind die Methanolvolumina, die für die Induktion erforderlich sind, so hoch, daß sie komplizierte und potentiell teure Erwägungen erforderlich machen.
Es verbleibt ein Bedarf im Stand der Technik für zusätzliche Materialien und Verfahren, um die Verwendung von methylotrophischen Hefen für die Produktion von Polypeptiden von wirtschaftlicher Wichtigkeit zu ermöglichen, einschließlich industriellen Enzymen und pharmazeutischen Proteinen. Die vorliegende Erfindung stellt solche Materialien und Verfahren ebenso wie andere, dazu in Bezug stehende Vorteile zur Verfügung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül mit einer Länge von bis zu 1500 Nukleotiden zur Verfügung, das Nukleotide 810 bis 1724 von SEQ ID Nr. 1 umfaßt.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein DANN-Konstrukt zur Verfügung gestellt, daß die folgenden operabel verbundenen Elemente umfaßt: ein erstes DANN-Segment umfassend wenigstens einen Teil der Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 von Nukleotid 733 bis zu Nukleotid 1732, wobei der Teil ein funktionaler Transkriptionspromoter ist; ein zweites DNA-Segment kodierend für ein Protein von Interesse, außer Picha methanolica Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase; und ein drittes DNA-Segment umfassend einen Transkriptionsterminator. In einer Ausführungsform hat das erste DNA-Segment eine Länge von 900 bis zu 1500 Nukleotiden. In einer weiteren Ausführungsform hat das erste DNA-Segment eine Länge von 900 bis zu 1000 Nukleotiden. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das erste DNA-Segment Nukleotid 810 bis zu Nukleotid 1724 von SEQ ID Nr.1. In einer zusätzlichen Ausführungsform ist das erste DNA-Segment im Wesentlichen frei von DNA, die für P. methanolica Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase kodiert. Das DNA-Konstrukt kann weiterhin einen auswählbaren Marker umfassen, so wie ein P. methanolica Gen, beispielsweise ein P. methanolica ADE2 Gen. Das DNA-Konstrukt kann ein geschlossenes zirkuläres Molekül oder ein lineares Molekül sein. In anderen Ausführungsformen umfaßt das DNA-Konstrukt weiterhin eine Sekretionssignalsequenz, so wie eine Saccharomyces cerevisiae alpha-factor pre-pro-Sequenz, operabel verbunden mit den ersten und zweiten DANN-Segmenten. In zusätzlichen Ausführungsformen umfaßt das dritte DNA-Segment einen Transkriptionsterminator eines P. methanolica AUG1 oder GAP1 Gens.
In einem dritten Aspekt der Erfindung wird eine P. methanolica Zelle zur Verfügung gestellt, die ein DNA-Konstrukt enthält, wie oben beschrieben. In einer Ausführungsform ist das DNA-Konstrukt genomisch integriert. In einer verwandten Ausführungsform ist das DNA-Konstrukt genomisch in multiplen Kopien integriert. In einer weiteren Ausführungsform ist die P. methanolica Zelle funktional bezüglich der vakuolären Proteasen Proteinase A und Proteinase B defizient.
In einem vierten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Produzieren eines Proteins von Interesse zur Verfügung gestellt, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Kultivieren einer P. methanolica Zelle wie oben offenbart, wobei das zweite DNA-Segment expremiert wird und das Protein von Interesse produziert wird, und (b) Rückgewinnen des Proteins von Interesse.
In einem fünften Aspekt der Erfindung wird ein DNA-Konstrukt zur Verfügung gestellt, was die folgenden operabel verbundenen Elemente umfaßt: ein erstes DNA- Segment umfassend ein P. methanolica Gen Transkriptionpromoter; ein zweites DNA-Segment kodierend für ein Protein von Interesse (außer eines P. methanolica Proteins; und ein drittes DNA-Segment, daß die Nukleotide 2735 bis 2795 von SEQ ID Nr.1 umfaßt.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und der damit verbundenen Zeichnung augenscheinlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 illustriert den Vektor PBM-GAP, umfassend den P. methanolica GAP1 Promoter.
2 illustriert den Vektor pTAP76.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Begriff "allelische Variante" wird hierin verwendet, um eine alternative Form eines Gens zu bezeichnen. Es ist bekannt, daß allelische Variationen in Populationen existieren und durch Mutation auftreten.
Ein "DNA-Konstrukt" ist ein DNA-Molekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, daß durch humanen Eingriff modifiziert wurde um DNA-Segmente zu enthalten, die in einer Anordnung kombiniert und gegenübergestellt sind, die in der Natur nicht existiert.
Ein "DNA-Segment" ist ein Teil eines größeren DNA-Moleküls mit bestimmten Eigenschaften. Beispielsweise ist ein DNA-Segment, das für ein spezifisches Polypeptid kodiert, ein Teil eines längeren DNA-Moleküls, so wie eines Plasmids oder eines Plasmidfragmentes, das, wenn es in der 5'- zur 3'-Richtung gelesen wird, für die Aminosäuresequenz des spezifischen Polypeptids kodiert.
Der Begriff "funktional defizient" bezeichnet die Expression einer Aktivität in einer Zelle von weniger als 10%, verglichen mit dem Niveau dieser Aktivität in einem Wildtyp-Gegenstück. Oft wird das Expressionsniveau geringer als 1% der Aktivität des Wildtyp-Gegenstücks sein, häufig weniger als 0,01, wie bestimmt durch entsprechende Assays. In einigen Fällen ist es wünschenswert, daß die Aktivität im Wesentlichen nicht detektierbar ist (d. h. nicht wesentlich über dem Rauschen). Funktionale Defizienz in Genen kann durch Mutationen entweder in kodierenden oder in nicht kodierenden Bereichen generiert werden.
Der Begriff "Gen" wird hierin verwendet, um ein DNA-Segment zu bezeichnen, daß für ein Polypeptid kodiert. Wenn der Kontext es erlaubt, beinhaltet der Begriff genomische DNA (mit oder ohne unterbrechende Sequenzen), cDNA und synthetische DNA. Gene können nicht kodierende Sequenzen, einschließlich Promoterelemente enthalten.
Der Begriff "isoliert" bedeutet, wenn er auf ein Polynukleotid angewendet wird, daß das Polynukleotid aus seinem natürlichen genetischen Milieu entfernt wurde und somit frei von anderen fremden oder nicht gewollten kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form vorliegt, die für die Verwendung innerhalb genetisch hergestellter Proteinsysteme geeignet ist. Solche isolierten Moleküle sind diejenigen, die aus deren natürlicher Umgebung abgetrennt wurden und cDNA und genomische Klone enthalten.
"Operabel verbunden" meint, wenn auf DNA-Segmente Bezug genommen wird, daß die Segmente so angeordnet sind, daß sie gemeinsam zu ihrem vorgesehenen Zweck funktionieren, z. B. die Transkription wird in dem Promoter initiiert und schreitet durch das kodierende Segment zu dem Terminator fort.
Ein "Polynukleotid" ist ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer aus Deoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen gelesen vom 5'- zum 3'-Ende. Polynukleotide beinhalten RNA und DNA und können aus natürlichen Quellen isoliert werden, in vitro synthetisiert werden oder aus einer Kombination aus natürlichen und synthetischen Molekülen hergestellt werden. Die Größen der Polynukleotide werden als Basenpaare (abgekürzt "bp"), Nukleotide ("nt") oder Kilobasen ("kb") ausgedrückt. Wo immer der Kontext es erlaubt, können die letzten zwei Begriffe Polynukleotide beschreiben, die einzelsträngig oder doppelsträngig sind. Wenn diese Begriffe auf doppelsträngige Moleküle angewendet werden, werden sie verwendet, um die Gesamtlänge zu bezeichnen, und werden als äquivalent zu dem Begriff "Basenpaare" verstanden. Es wird durch Fachleute erkannt werden, daß die zwei Stränge eines doppelsträngigen Polynukleotids leicht in ihrer Länge differieren können, und daß deren Enden als ein Ergebnis einer enzymatischen Spaltung abgestuft sein können; somit könnte es sein, daß nicht alle Nukleotide innerhalb eines doppelsträngigen Polynukleotidmoleküls gepaart sind. Solche nichtgepaarten Enden werden im allgemeinen eine Länge von 20 nt nicht übersteigen.
Ein "Polypeptid" ist ein Polymer aus Aminosäureresten, verbunden durch Peptidbindungen, die entweder natürlich oder synthetisch produziert worden sind. Polypeptide mit weniger als 10 Aminosäureresten werden gewöhnlich "Peptide" genannt.
Der Begriff "Promoter" wird hierin in seiner Bedeutung verwendet, die im Stand der Technik bekannt ist, um einen Teil eines Gens zu bezeichnen, der DNA-Sequenzen enthält, die für das Binden der RNA-Polymerase und für die Initiierung der Transkription sorgt. Promotersequenzen werden gewöhnlich, aber nicht immer, in dem 5'-nicht-kodierenden Bereich des Gens gefunden. Sequenzen innerhalb von Promotoren, die bei der Initiierung der Transkription wirken, werden oft durch konsense Nukleotidsequenzen gekennzeichnet. Diese Promoterelemente beinhalten RNA-Polymerasebinderorte, TATA-Sequenzen und Transkriptionsfaktorbindeorte. Von besonderem Interesse innerhalb der vorliegenden Erfindung sind Gcrlp-Bindeorte, gekennzeichnet durch die konsensen Sequenzen CTTCC oder GGAAG, und Raplp-Bindeorte. Siehe im allgemeinen Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. Menlo Park, Ca, 1987.
Eine "Pro-Sequenz" ist eine DNA-Sequenz, die gewöhnlich direkt 5' zu der reifen kodierenden Sequenz eines Gens, das für ein Sekretionsprotein kodiert, auftritt. Die Prosequenz kodiert für ein Propeptid, das als cisagierendes Chaperon dient, während das Protein durch den Sekretionsweg hindurch schreitet.
Ein "Protein" ist ein Makromolekül, das ein oder mehrere Polypeptidketten umfaßt. Ein Protein kann ebenso nicht-peptidische Bestandteile umfassen, so – wie Kohlenhydratgruppen. Kohlenhydrate und andere nichtpeptidische Substituenten können zu einem Protein durch die Zelle hinzugefügt werden, in welcher das Protein produziert wird, und werden mit der Art der Zelle variieren. Proteine werden gewöhnlich unter Bezugnahme auf deren Aminosäuregerüststruktur definiert; Substituenten, so wie Kohlenhydratgruppen werden im allgemeinen nicht spezifiziert, können aber nichtsdestotrotz vorhanden sein.
Der Begriff "Sekretionssignalsequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert (ein "Sekretionspeptid"), das, als ein Bestandteil eines größeren Polypeptids, das größere Polypeptid durch einen Sekretionsweg einer Zelle steuert, in welcher es hergestellt wird. Das größere Polypeptid wird für gewöhnlich während des Transits durch den Sekretionsweg gespalten, um das Sekretionspeptid zu entfernen. Ein Sekretionspeptid und ein Polypeptid können kollektiv Prä-Propeptid genannt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte DNA-Moleküle zur Verfügung, die einen Pichia methanolica Glycerinaldehyd-3-phoshatdehydrogenase (GAPDH)-Gen-Promoter umfassen. Die Erfindung stellt ebenso isolierte DNA-Moleküle zur Verfügung, die einen P. methanolica GAPDH-Gen-Terminator umfassen. Der Promoter und der Terminator kann bei von Verfahren zum Herstellen von Proteinen von Interesse verwendet werden, einschließlich Proteine mit pharmazeutischem oder industriellem Wert.
Die Sequenz eines DNA-Moleküls, das einen P. methanolica Glycerinaldehyd-3-phoshatdehydrogenase (GAPDH)-Gen-Promoter, eine kodierende Region und einen Terminator umfaßt, ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Das Gen wurde GAP1 genannt. Fachleute werden erkennen, daß SEQ ID Nr. 1 ein einzelnes Allel des P. methanolica (GAPDH)-Gens repräsentiert, und daß andere funktionale Allele (Allelvarianten) wahrscheinlich existieren und daß die allelische Variation Nukleotidveränderungen in dem Promoterbereich, in der kodierenden Region oder in der Terminatorregion umfassen können.
Innerhalb von SEQ ID Nr. 1 beginnt der GAPDH-offene Leserahmen mit dem Methionin-Codon (ATG) bei den Nukleotiden 1733 – 1735. Der Transkriptionspromoter ist upstream von dem ATG angeordnet. Die Genexpressionsexperimente zeigen, daß ein funktionaler Promoter innerhalb der ca. 900 Nukleotid-5'-flankierenden Region des GAP1-Gens enthalten ist. Die Analyse dieser Promotersequenz ergab die Gegenwart einer Anzahl von Sequenzen, die zu Saccharomyces cerevisiae Promoterelementen homolog waren. Diese Sequenzen beinhalten eine konsente TATAAA-Box bei Nukleotiden 1584 bis 1591, einen konsenten Rap1-Binderort (Graham and Chambers, Nuc. Acids Res. 22:124–130, 1994) bei Nukleotiden 1355 bis 1367 und potenzielle Gcr1-Bindeorte (Shore, Trends Genet. 10:408–412, 1994) bei Nukleotiden 1225 bis 1229, 1286 bis 1290, 1295 bis 1299, 1313 bis 1317, 1351 bis 1354, 1370 bis 1374, 1389 bis 1393 und 1457 bis 1461. Während die Autoren nicht an diese Theorie gebunden sein wollen, wird dennoch vermutet, daß diese Sequenzen Funktionen ausführen können, die ähnlich zu denen ihrer Gegenstücke in dem S. Cerevisae TDH3-Promoter sind (Bitter et al., Mol. Gen. Genet. 231:22–32, 1991), d.h. sie können an homologe Transkriptionsregulationselemente binden. Die Mutation der Region um den konsensen Gcr1-Bindeort in dem P. methanolica GAP1-Promoter zerstört die Promoteraktivität, wie herausgefunden wurde.
Bevorzugte Teile der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt sind, für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung als Transkriptionspromotoren beinhalten Segmente umfassend wenigstens 900 kontinuierliche Nukleotide der 5'-nicht-kodierenden Region von SEQ ID Nr. 1, und vorzugsweise umfassen sie Nukleotid 810 bis Nukleotid 1724 der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
Fachleute werden erkennen, daß längere Bereiche der 5'-nicht-kodierenden Region des P. methanolica GAP1 ebenso verwendet werden können. Promotersequenzen der vorliegenden Erfindung können somit die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 bis zu Nukleotid 1732 in der 3'-Richtung beinhalten und können sich bis zu Nukleotid 232 in der 5'-Richtung oder darüber hinaus erstrecken. Aus Bequemlichkeitsgründen und zur Vereinfachung der Manipulation wird der Promoter, der innerhalb eines Expressions-DNA-Konstruktes verwendet wird, im allgemeinen eine Länge von 1,5 kb nicht übersteigen, und wird oft eine Länge von 1,0 kb nicht übersteigen.
Wie es genauer in den folgenden Beispielen ausgeführt ist, stellt die Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 von Nukleotid 810 bis zu 1724 einen funktionalen Transkriptionspromoter zur Verfügung. Jedoch können zusätzliche Nukleotide von entweder einem oder von beiden Enden dieser Sequenz entfernt werden, und die resultierende Sequenz, wurde positiv für dessen Promoterfunktion durch Verbinden mit einer Sequenz, die für, ein Protein kodiert, vorzugsweise ein Protein, für welches ein bequemer Assay leicht erhältlich ist, getestet.
Innerhalb der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß der GAP1-Promoter im wesentlichen frei von GAPI-Gen-kodierenden Sequenzen ist, welche mit Nukleotid 1733 in SEQ ID Nr. 1 beginnt. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "im wesentlichen frei von GAP1-Gen-kodierender Sequenz", daß die Promoter-DNR nicht mehr als 15 Nukleotide der GAP1-kodierenden Sequenz, vorzugsweise nicht mehr als 10 Nukleotide und am meisten bevorzugt nicht mehr als 3 Nukleotide davon enthält. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der GSP1-Promoter frei von kodierender Sequenz des P. methanolica GAP1-Gens zur Verfügung gestellt.
Jedoch werden Fachleute erkennen, daß ein GAP1-Genfragment, das das Initiierungs-ATG (Nukleotide 1733 bis 1735) von SEQ ID Nr. 1 enthält, operabel mit einer heterologen kodierenden Sequenz verbunden sein kann, der ein ATG fehlt, wobei das GAP1-ATG für die Initiierung der Translation der heterologen Sequenz sorgt. Fachleute werden weiter erkennen, daß zusätzliche GAP1-kodierende Sequenzen ebenso beinhaltet sein können, wobei ein Fusionsprotein umfassend GAP1 und heterologe Aminosäuresequenzen produziert wird. Solch ein Fusionsprotein kann einen Spaltort umfassen, um die Trennung von GAP1 und der heterologen Sequenz anschließend an die Translation zu vereinfachen. Zusätzlich zu der GAP1-Promotersequenz stellt die vorliegende Erfindung ebenso Transkriptionsterminatorsequenzen zur Verfügung, die von dem 3'-nicht-kodierenden Bereich des P. methanolica GAP1-Gens abgeleitet sind. Eine konsense Transkriptionsterminierungssequenz (Chen and Moore, Mol. Cell. Biol. 12:3470–3481, 1992) ist bei den Nukleotiden 2774 bis 2787 von SEQ ID Nr. 1 angeordnet. In der vorliegenden Erfindung werden somit Transkriptionsterminatorgensegmente mit wenigstens etwa 60 bp Länge zur Verfügung gestellt. Längere Segmente, beispielsweise mit wenigstens 90 bp Länge oder mit wenigstens 200 bp Länge werden oft verwendet werden. Diese Segmente umfassen die Terminierungssequenz, die oben offenbart ist, und können als ihren 5' Terminus Nukleotid 2735 von SEQ ID Nr. 1 aufweisen. Fachleute werden jedoch erkennen, daß das Transskriptionsterminatorsegment, das in einem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt wird, an seinem 5' Terminus das TAA-Translationsterminierungscodon bei Nukleotid 2732–2734 von SEQ ID Nr. 1 beinhalten kann, um die Einfügung von kodierenden Sequenzen zu ermöglichen, denen ein Terminierungscodon fehlt.
Techniken zum Manipulieren von clonierten DNA-Molekülen und zum Einfügen von exogener DNA in eine Vielzahl von Wirtszellen sind im Stand der Technik gut bekannt, und sind beispielsweise durch Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Murray, ed., Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Clifton, NJ, 1991; Glick und Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994; Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1995; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, New York 1997 bekannt. DNA-Vektoren, einschließlich Expressionsvektoren enthalten gewöhnlich einen auswählbaren Marker und einen Ursprung der Replikation, die in einem bakteriellen Wirt (z. B. E. coli) funktionieren, um die Replikation und die Amplifikation des Vektors in einem prokaryontischen Wirt zu erlauben. Wenn gewünscht, können diese prokaryontischen Elemente aus dem Vektor entfernt werden, bevor er in einen alternativen Wirt eingefügt wird. Beispielsweise können solche prokaryontischen Sequenzen durch Linearisierung des Vektors vor dessen Einführung in eine P. methanolica-Wirtszelle entfernt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Expressionsvektoren zur Verfügung gestellt, die ein erstes DNA-Segment umfassen, das wenigstens einen Teil der Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 umfaßt, das ein funktionaler Transkriptionspromoter ist, der operabel mit einem zweiten DNA-Segment verbunden ist, das für ein Protein von Interesse kodiert. Wenn es gewünscht ist, das Protein von Interesse auszuscheiden, wird der Vektor weiterhin eine Sekretionssignalsequenz umfassen, die operabel mit den ersten und zweiten DNA-Segmenten verbunden ist. Die Sekretionssignalsequenz kann die des Proteins von Interesse sein, oder kann von einem anderen ausgeschiedenen Protein abgeleitet sein, vorzugsweise einem ausgeschiedenen Hefeprotein. Eine solche bevorzugte Hefesekretionssignalsequenz ist die S. cerevisiae-Alpha-Faktor-(MFα1)-Pre-Pro-Sequenz (offenbart durch Kurjan et al., US-Patent Nr. 4,546,082 und Brake, US-Patent Nr. 4,870,008.)
In anderen Ausführungsformen der Erfindung werden Expressionsvektoren zur Verfügung gestellt, die ein DNA-Segment umfassen, das einen Teil von SEQ ID Nr. 1 umfaßt, der ein funktionaler Transkriptionspromoter ist, der operabel mit einem zusätzlichen DNA-Segment verbunden ist, das für ein Protein von Interesse kodiert. In einer Ausführungsform werden die P. methanolica-GAP1-Promote- und Terminator-Sequenzen kombiniert verwendet, wobei beide operabel mit einem DNA-Segment verbunden sind, das für ein Protein von Interesse innerhalb eines Expressionsvektors kodiert.
Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung umfassen weiterhin einen auswählbaren Marker, um die Identifizierung und Selektion von P. methanolica-Zellen zu erlauben, die den Vektor enthalten. Auswählbare Marker sorgen für einen Wachstumsvorteil von Zellen, die sie enthalten. Die allgemeinen Prinzipien der Auswahl sind in der Technik bekannt. Der auswählbare Marker ist vorzugsweise ein P. methanolica-Gen. Gewöhnlich verwendete auswählbare Marker sind Gene, die für Enzyme kodieren, die für die Synthese von Aminosäuren oder Nukleotiden erforderlich sind. Zellen mit Mutationen in diesen Genen können in Medien. nicht wachsen, denen die spezifische Aminosäure oder das spezifische Nukleotid fehlt, es sei denn, die Mutation wird durch den auswählbaren Marker komplementiert. Die Verwendung solcher "selektiver" Kulturmedien stellt die stabile Aufrechterhaltung der heterologen DNA innerhalb der Wirtszelle sicher. Ein beispielhafter auswählbarer Marker dieses Typs für die Verwendung in P. methanolica ist ein P. methanolica-ADE2-Gen, welches für Phosphoribosyl-5-aminoimidazolcarboxylase kodiert (AIRC; EC 4.1.1.21). Siehe Raymond, US-Patent Nr. 5,736,383. Das ADE2-Gen erlaubt es der Zelle, in der Abwesenheit von Adenin zu wachsen, wenn es in eine ade2-Wirtszelle transformiert wird. Der kodierende Strang einer repräsentativen P. methanolica-ADE2-Gen-Sequenz ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Die dargestellte Sequenz beinhaltet 1006 Nukleotide von einer 5' nicht-kodierenden Sequenz und 442 Nukleotide einer 3' nicht-kodierenden Sequenz mit dem Initiierungs-ATG-Codon bei den Nukleotiden 1007–1009. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein DNA-Segment umfassend die Nukleotide 407–2851 als ein auswählbarer Marker verwendet, auch wenn längere oder kürzere Segmente verwendet werden könnten, solange wie der kodierende Teil operabel mit Promoter- und Terminator-Sequenzen verbunden ist. Alternativ kann ein dominanter auswählbarer Marker, welcher einen Wachstumsvorteil gegenüber Wildtyp-Zellen zur Verfügung stellt, verwendet werden. Typische dominante auswählbare Marker sind Gene, die Resistenz gegenüber Antibiotika zur Verfügung stellen, so wie Neomycin-artige Antibiotika (z. B. G418), Hygromycin B, und Bleomycin/Phleomycin-artige Antibiotika (z. B. Zeocin^TM; erhältlich von der Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Ein beispielhafter dominanter auswählbarer Marker für die Verwendung in P. methanolica ist das Sh bla-Gen, welches die Aktivität von Zeocin^TM inhibiert.
Die Verwendung von P. methanolica-Zellen als Wirt für die Herstellung von rekombinanten Proteinen ist in den WIPO-Publikationen WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 und WO 98/02565; und US-Patenten Nr. 5,716,808, 5,736,383, 5,854,039 und 5,888,768 offenbart. Expressionsvektoren für die Verwendung beim Transformieren von P. methanolica werden gewöhnlich als doppelsträngige, zirkuläre Plasmide hergestellt, welche vorzugsweise vor der Transformierung linearisiert werden. Um die Integration der DNA des Expressionsvektors in das Wirtschromosom zu vereinfachen, kann das gesamte Expressionssegment des Plasmids an beiden Enden durch Wirts-DNA-Sequenzen flankiert sein (z. B. AUG1 3' Sequenzen). Elektroporation wird verwendet, um die Einführung eines Plasmids, das DNA enthält, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, in P. methanolica-Zellen zu erleichtern. Es ist bevorzugt, P. methanolica-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung eines exponentiell abnehmenden, gepulsten elektrischen Feldes mit einer Feldstärke von 2,5 bis 4,5 kV/cm, vorzugsweise 3,75 kV/cm und mit einer Zeitkonstante (τ) von 1 bis zu 40 Millisekunden, besonders bevorzugt etwa 20 Millisekunden zu transformieren.
Integrative Transformanten werden für die Verwendung bei Proteinproduktionsverfahren bevorzugt. Solche Zellen können ohne kontinuierlichen selektiven Druck propagiert werden, da DNA selten aus dem Genom verloren wird. Die Integration von DNA in das Wirtschromosom kann durch Southern-Blot-Analyse bestätigt werden. Kurz gesagt, transformierte und nicht transformierte Wirts-DNA wird mit Restriktionsendonukleasen verdaut, aufgetrennt durch Elektrophorese, geblottet auf eine Trägermembran und mit entsprechenden Wirts-DNA-Segmenten detektiert. Unterschiede in den Fragmentmustern, die zwischen untransformierten und transformierten Zellen gesehen werden, sind für eine integrative Transformation indikativ. Restriktionsenzyme und Sonden können ausgewählt werden, um transformierende DNA-Segmente unter den genomischen Fragmenten zu identifizieren (z. B. Promoter, Terminator, heterologe DNA und auswählbare Markersequenzen).
Unterschiede der Expressionsniveaus von heterologen Proteinen können aus solchen Faktoren wie dem Ort der Integration und der Copy-Number der Expressionskassette unter den individuellen Isolaten resultieren. Es ist daher vorteilhaft, eine Anzahl von Isolaten hinsichtlich des Expressionsniveaus vor der Auswahl eines Produktionsstammes zu screenen. Isolate, die ein hohes Expressionsniveau aufzeigen, werden normalerweise mehrere Kopien der gewünschten Expressionskassette enthalten. Eine Vielzahl von geeigneten Screenverfahren sind erhältlich. Beispielsweise werden Transformantenkolonien auf Platten wachsen gelassen, die mit Membranen (z. B. Nitrocellulose) überlagert sind, die Protein binden. Proteine werden aus den Zellen durch Sekretion oder folgend auf die Lysis freigesetzt und binden an die Membran. Gebundenes Protein kann dann unter Verwendung von bekannten Verfahren einem Assay, einschließlich Immunoassays, unterzogen werden. Eine genauere Analyse der Expressionsniveaus kann durch Kultivieren von Zellen in flüssigem Medium und durch Analyse der entsprechenden Medien oder Zell-Lysate, wie angemessen, analysiert werden. Verfahren zum Konzentrieren und zum Auf reinigen von Proteinen aus Medien und Lysaten werden teilweise durch das Protein von Interesse bestimmt. Solche Verfahren werden leicht durch den begabten Praktiker ausgewählt und ausgeführt.
Zur Produktion von ausgeschiedenen Proteinen können Wirtszellen mit funktionaler Defizienz bei den vacuolären Proteasen Proteinase A, für welche das PEP4-Gen kodiert und Proteinase B, für welche das PRB1-Gen kodiert, verwendet werden, um spurenhafte Proteolyse zu minimieren. Vacuoläre Proteasenaktivität (und daher vacuolere Proteasendeffizienz) wird unter Verwendung von irgendeinem der verschiedenen bekannten Assays gemessen, sowie diejenigen, die für S. cerevisiae entwickelt wurden und durch Jones, Methods Enzymol. 194: 428–453, 1991 offenbart sind. Ein solcher Assay ist der APNE-Overlay-Assay, welcher die Aktivität von Carboxypeptidase Y (CpY) detektiert. Siehe Wolf und Fink, J. Bact. 123: 1150–1156, 1975. Da das Zymogen (pro)CpY durch Proteinase A und Proteinase B aktiviert wird, ist der APNE-Assay indikativ für vacuoläre Proteasenaktivität im Allgemeinen. Der APNE-Overlay-Assay detektiert die Carboxypeptidase Y-vermittelte Freisetzung von β-naphthol aus N-acetylphenylalanin-β-naphthyl-ester (APNE), welches in der Bildung eines unlöslichen roten Farbstoffs durch die Umsetzung des β-Naphthols mit dem Diazoniumsalz Fast Garnet GBC resultiert. Zellen, die auf den Assayplatten bei Raumtemperatur wachsen (z. B. YEPD-Platten) werden mit 8 ml R×M überschichtet. R×M wird hergestellt durch Kombinieren von 0,175 g Agar, 17,5 ml H₂O und 5 ml 1 M Tris-HCl pH 7,4, Behandeln in der Mikrowelle, um den Agar zu Lösen, Abkühlen auf ungefähr 55°C, Hinzufügen von 2,5 mm frisch hergestellter APNE (2 mg/ml in Dimethylformamid) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), und direkt vor dem Assay 20 mg Fast Garnet GBC-Salz (Sigma Chemical Co.). Der Überlagerung wird es erlaubt, sich zu verfestigen und eine Farbentwicklung wird beobachtet. Wildtyp-Kolonien sind rot, wohingegen CPY-Deletionsstämme weiß sind. Carboxypeptidase-Y-Aktivität kann ebenso durch den Well-Test detektiert werden, in welchem Zellen in Wells einer Microtitertestplatte verteilt werden und in der Gegenwart von N-Benzoyl-L-tyrosine-p-nitroanilid (BTPNA) und Dimethylformamid inkubiert werden. Die Zellen werden durch das Dimethylformamid permeabilisiert, und das CpY in den Zellen spaltet die Amidbindung in dem BTPNA, um das gelbe Produkt p-Nitroanilin zu ergeben. Assays für CpY werden jegliche Mutation detektieren, die Proteaseaktivität reduziert, solange, wie die Aktivität schließlich in der Reduktion der CpY-Aktivität resultiert.
P. methanolica-Zellen werden in einem Medium kultiviert, das adäquate Kohlenstoff quellen, Stickstoff und Spurennährstoffe bei einer Temperatur von etwa 25°C bis 35°C enthält. Flüssige Kulturen werden mit ausreichender Belüftung durch konventionelle Mittel, so wie Schütteln der kleinen Flaschen oder durch Perlen der Fermentatoren zur Verfügung gestellt. Ein geeignetes Kulturmedium für P. methanolica ist YEPD (2% D-glucose, 2% Bacto^TM Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto^TM Hefeextrakt (Difco Laboratories), 0,004% Adenin, 0,006% L-leucin).
Für Kulturen im großen Maßstab können ein oder zwei Kolonien eines P. methanolica-Stammes aus einer frischen Agarplatte (z. B. YEPD-Agar) gepickt werden und in 250 ml von YEPD-Nährlösung suspendiert werden, die in einer 2-Liter-Schikanenschüttelflasche enthalten ist. Die Kultur wird für 16 bis zu 24 Stunden bei 30°C und mit 250 rpm Schüttelgeschwindigkeit wachsen gelassen. Ungefähr 50 bis 80 ml Inocolum werden pro Liter Ausgangsfermentorvolumen verwendet (5 – 8% v/v Inoculum).
Ein bevorzugtes Fermentationsmedium ist ein lösliches Medium umfassend Glukose als Kohlenstoffquelle, anorganischen Ammoniak, Kalium, Phosphat, Eisen und Zitronensäure. Wie hierin verwendet ist ein "lösliches" Medium ein Medium, das keine sichtbare Präzipitation enthält. Vorzugsweise fehlt dem Medium Phosphatglas (Natriumhexametaphosphat). Ein bevorzugtes Medium wird in entionisiertem Wasser hergestellt und enthält kein Calciumsulfat. Als ein Minimalmedium ist bevorzugt, daß das Medium keine Polypeptide oder Peptide, so wie Hefeextrakte enthält. Jedoch kann Säure-hydroliniertes Casein (z. B. Casaminosäuren oder Amicase) zu dem Medium hinzugefügt werden, wenn gewünscht. Ein illustratives Fermentationsmedium wird hergestellt durch Vermischen der folgenden Verbindungen: (NH₄)₂SO₄ (11,5 g/l), K₂HPO₄ (2,6 g/l), KH₂PO₄ (9,5 g/l), FeSO₄ · 7H₂O (0,4 g/l) und Zitronensäure (1 g/l). Nach dem Hinzufügen von destilliertem entionisierten Wasser auf einen Liter wird die Lösung durch Autoklavieren sterilisiert, abgekühlt und dann mit den folgenden Zusätzen versetzt: 60% (w/v) Glukoselösung (47,5 ml/l), 10× Spurenmetallösung (20,0 ml/l), 1 M MgSO₄ (20,0 ml/l) und Vitaminstammlösung (2,0 ml/l). Die 10× Spurenmetallösung enthält FeSO₄ · 7H₂O (100 mM), CuSO₄ · 5H₂O (2 mM), ZnSO₄ · 7H₂O (8 mM), MnSO₄ · H₂O (8 mM), CoCl₂ · 6H₂O (2 mM), Na₂MoO₄ · H₂O (1 mM), H₃BO₃ (8 mM), KI (0,5 mM), NiSO₄ · 6H₂O (1 mM), Thiamin (0,5 g/l) und Biotin (5,00 mg/l). Die Vitaminstammlösung enthält Inositol (47,00 g/l), Pantothensäure (23,00 g/l), Pyrodoxin (1,20 g/l), Thiamin (5,00 g/l) und Biotin (0,10 g/l). Fachleute können diese bestimmten Inhaltsstoffe und Mengen variieren. Beispielsweise kann Ammoniumsulfat durch Ammoniumchlorid ersetzt werden, oder die Menge an Ammoniumsulfat kann variiert werden, beispielsweise von etwa 11 bis auf etwa 22 g/l.
Nach der Hinzufügung von Spurenmetallen und Vitaminen wird der pH des Mediums typischerweise auf 4,5 durch die Hinzufügung von 10%iger H₃PO₄ angepaßt. Im Allgemeinen werden etwa 10 ml/l hinzugefügt, und keine zusätzliche Salzhinzufügung ist erforderlich. Während der Fermentation wird der pH durch die Hinzufügung von 5 N NH₄OH zwischen etwa 3,5 und etwa 5,5, oder etwa 4,0 bis etwa 5,0 behalten, abhängig von dem Protein, das hergestellt wird.
Ein illustrativer Fermentor ist ein BIOFLO 3000 Fermentorsystem (New Brunswick Scientific Company, Inc. Edison, NJ). Dieses Fermentorsystem kann entweder einen 6-Liter- oder einen 14-Liter-Fermentorkessel verwenden. Fermentationen, die mit dem 6-Liter-Gefäß ausgeführt werden, werden mit drei Litern Medium präpariert, wohingegen Fermentationen, die mit dem 14-Liter-Gefäß ausgeführt werden, mit sechs Litern Medium präpariert werden. Die Fermenterkesseloperationstemperatur wird typischerweise auf 30°C für den Verlauf der Fermentation eingestellt, auch wenn die Temperatur zwischen 27°C und 31°C abhängig von dem expremierten Protein variieren kann. Die Fermentation wird in einem Chargenmodus initiiert. Die Glukose, die initial vorhanden ist, wird häufig durch etwa 10 Stunden verstrichene Fermentationszeit (EFT) aufgebraucht, zu welchem Zeitpunkt eine Glukosezufuhr initiiert werden kann, um die Zellmasse zu erhöhen. Eine illustrative Glukosezufuhr enthält 900 ml 60%ige (w/v) Glukose, 60 ml 50% (w/v) (NH₄)₂SO₄, 60 ml einer 10× Spurenmetallösung und 30 ml 1 M MgSO₄. Die P. methanolica-Fermentation ist robust und erfordert hohes Rühren, Belüftung und Sauerstoffeinperlung, um die Prozentzahl der Sättigung des gelösten Sauerstoffs über 30% zu behalten. Die Prozentzahl an gelöstem Sauerstoff sollte nicht unter 15% zur optimalen Expression und zum optimalen Wachstum fallen. Die Biomasse erreicht typischerweise etwa 30 bis zu etwa 80 g Trockenzellgewicht pro Liter bei 48 Stunden EFT.
Proteine, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, werden aus den Wirtszellen unter Verwendung von konventionellen Verfahren zurückgewonnen. Wenn das Protein intrazellulär produziert wird, werden die Zellen geerntet (z. B. durch Zentrifugation) und lysiert, um den cytoplasmatischen Gehalt freizusetzen. Lysisverfahren beinhalten enzymatische und mechanische Zellzerstörung. Der Rohextrakt wird dann gemäß bekannten Verfahren fraktioniert, wobei die spezifischen Eigenheiten durch das bestimmte Protein von Interesse bestimmt werden. Ausgeschiedene Proteine werden aus dem behandelten Kulturmedium unter Verwendung von Standardverfahren zurückgewonnen, die ebenso für das bestimmte Protein ausgewählt werden. Siehe im Allgemeinen Scopes, Protein Purification Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994.
Die Materialien und Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Proteine zu produzieren, die in der Forschung, in der Industrie oder in der Pharmazie von Interesse sind. Solche Proteine enthalten Enzyme, sowie Lipasen, Cellulasen und Proteasen; Enzyminhibitoren, einschließlich Proteaseinhibitoren; Wachstumsfaktoren, so wie Plättchen-abgeteiteter-Wachstumsfaktor (PDGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), epidermale Wachstumsfaktoren (EGF), vaskuläre Endothelial-Wachstumsfaktoren (VEGFs); Glutaminsäuredecarboxylase (GAD); Cytokine, so wie Erythropoietin, Thrombopoietin, Kolonie-stimulierende Faktoren, Interleukine und Interleukin-Antagonisten; Hormone, so wie Insulin, Proinsutin, Leptin und Glucagon; und Rezeptoren, einschließlich Wachstumsfaktorrezeptoren, welche in einer trunkierten Form ("lösliche Rezeptoren") oder als Fusionsproteine mit beispielsweise Sequenzen der konstanten Bereiche des Immunoglobins expremiert werden. DNAs, die für diese und andere Proteine kodieren, sind im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise US-Patente Nr. 4,889,919; 5,219,759; 4,868,119; 4,968,607; 4,599,311; 4,784,950; 5,792,850; 5,827,734; 4,703,008; 4,431,740 und 4,762,791 und WIPO-Veröffentlichungen WO 95/21920 und WO 96/22308.
Die Materialien und Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um nicht-glykolisierte pharmazeutische Proteine herzustellen. Hefezellen, einschließlich P. methanolica-Zellen, produzieren Glykoproteine mit Kohlenhydratketten, die sich von deren Säugetier-Gegenstücken unterscheiden. Säugetierglykoproteine, die in Hefezellen produziert werden, können somit als "fremd" angesehen werden, wenn sie in ein Säugetier eingefügt werden, und können beispielsweise unterschiedliche Pharmakokinetika aufzeigen, wie ihre natürlich glykolisierten Gegenstücke.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden, nicht limitierenden Beispiele illustriert:
BEISPIELE
Beispiel 1
Um das P. methanolica GAP1-Gen zu clonieren, wurden Sense (ZC11, 356; SEQ ID Nr. 3) und Antisense (ZC11, 357; SEQ ID Nr. 4) PCR-Primer aus einem Alignment mit den kodierenden Bereichen der GAPDH-Gene von Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis und der Maus entworfen. Die Primer wurden dann verwendet, um P. methanolica genomische DNA zu amplifizieren. Eine amplifizierte Sequenz, die 608 bp lang war, wurde zurückgewonnen, und es wurde gefunden, daß sie 78,1% Homologie mit der entsprechenden S. cerevisiae GAPDH-Gensequenz aufweist.
Eine P. methanolica genomische Library wurde in dem Vektor pRS426 (Christianson et al., Gene 110:119–122, 1992) konstruiert; ein Shuttlevektor umfassend 2μ und S. cerevisiae URA3 Sequenzen erlaubt es, daß die library in S. cerevisiae propagiert wurde. Genomische DNA wurde aus dem Stamm CBS6515 gemäß Standardverfahren präpariert. Kurz gesagt, wurden Zellen über Nacht in reichem Medium kultiviert, mit Zymolyase spheroplastiert und mit SDS lysiert. DNA wurde aus dem Lysat mit Ethanol präzipitiert und mit einer Phenol/Chloroformmischung extrahiert, dann mit Ammoniumazetat und Ethanol präzipitiert. Eine Gelelektrophorese der DNA-Präparation zeigte die Gegenwart einer intakten hochmolekulargewichtigen DNA und bemerkenswerte Mengen an RNA. Die DNA wurde teilweise mit Sau 3A durch Inkubieren der DNA in der Gegenwart einer Verdünnungsserie des Enzyms verdaut. Proben der Verdauung wurden durch Elektrophorese analysiert, um die Größenverteilung der Fragmente zu bestimmen. DNA, die zwischen 4 und 12 kb migrierte, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und aus der Gelscheibe extrahiert. Die größenfraktionierte DNA wurde dann in pRS426 legiert, das mit Bam HI verdaut wurde und mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde. Aliquots der Reaktionsmischung wurden in E. coli MC1061-Zellen unter Verwendung eines Elektroporators (Gene Pulser^TM, BioRad Laboratories; Hercules, CA), wie durch den Hersteller empfohlen, elektroporiert.
Die Library wurde durch PCR unter Verwendung von Sense- (ZC11,733; SEQ ID NO:5) und Antisense- (ZC11,734; SEQ ID No:6) Primern gescreent, die aus dem sequenzierten Bereich des P. methanolica GAPDH Genfragmentes entworfen worden sind. Die PCR Umsetzungsmischung wurde eine Minute bei 94°C inkubiert, gefolgt durch 34 Zyklen bei 94°C für eine Minute, 52°C für 45 Sekunden, 72°C für 2 Minuten; und einem Terminierungszyklus von 94°C für eine Minute, 54°C für eine Minute und 72°C für 11 Minuten. Ausgehend von 43 Library Pools wurden positive Pools identifiziert und in individuelle Kolonien eingeteilt. Eine einzelne Kolonie mit einem pRS426 Plasmid enthaltend das P. methanolica GAPDH-Gen als Insert wurde isoliert. Die Orientierung des GAPDH-Gens und die Länge der 5' und 3' flankierenden Sequenzen in dem Insert wurden durch DNA-Sequenzieren (SEQ ID NR.1) abgeleitet. Dieses Gen wurde GAP1 genannt.
Ein Plasmid enthaltend das GAP1-Gen, bezeichnet als pGAPDH, wurde als ein E. coli Stamm MC1061 Transformant bei der American Type Culture Collection, Manassas, VA gemäß dem Budapestfrieden hinterlegt. Dem hinterlegten Stamm wurde die Bezeichnung PTA-3 und das Hinterlegungsdatum vom 4. Mai 1999 zugewiesen.
Beispiel 2
Der klonierte P. methanolica GAP1 Promoter wurde verwendet, um durch Ersetzen des AUG1 Promoters in dem Vektor pCZR133 (offenbart in US Patent Nr. 5,736,383) eine Expressionskassette zu konstruieren. Plasmid pCZR133 umfaßt den P. methanolica AUG1 Promoter und -Terminator, die einen multiplen Cloningort flankieren und einen P. methanolica ADE2 auswählbaren Marker. Der GAP1 Promoter (Nukleotide 810 bis 1724 von SEQ ID NR.1) wurde durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die einen Not I Ort am 5' Ende (SEQ ID Nr.7; ZC12, 586) und Eco RI und Bam HI Orte an dem 3' Ende (SEQ ID Nr.8; ZC12,565) einführten. Die Umsetzungsmischung wurde eine Minute bei 94°C inkubiert, gefolgt durch 34 Zyklen bei 94°C, eine Minute, 52°C eine Minute, 72°C 3 Minuten; und einen Terminierungszyklus von 94°C, eine Minute, 54°C 7 Minuten, 72°C, 23 Minuten. Der amplifizierte Promoter wurde dann in einen Phagemid-Vektor (pBluescript^®; Statagene, La Jolla, CA) blunt-end-ligiert. Die Orientierung des Promoters in dem Vektor wurde durch Restriktionsanalyse bestimmt. Der Promoter wurde als ein Not I-Bam HI-Fragment isoliert. Plasmid pCRZ133 wurde mit Not I und mit Bam HI verdaut, und der Verdau wurde auf einem Gel elektrophoretisch behandelt. Zwei Fragmente, das Ade2/Terminierungsfragment und das pUC-Fragment wurden zurückgewonnen. Das pUC-Fragment war dephosphoryliert. Die zwei Vektorfragmente und der Promoter wurden in einer dreiteiligen Ligation miteinander verbunden. Das resultierende Plasmid wurde pBM/GAP (1) genannt.
Ein zweiter Vektor, pTAP76 (2) wurde konstruiert. Dieser Vektor umfaßt den GAP1-Promotor, eine α-Faktor Prepro-Sequenz, einen SmaI-Spaltort, den AUG1-Terminator, den ADE2 auswählbaren Marker und eine AUG1 3' nicht-kodierende Sequenz, die in ein pRS316 (Sikorski und Hieter, Genetics 122:19–27, 1989)-Gerüst kloniert wurde. Der pTAP76-Vektor wird am dem SmaI-Ort linearisiert und mit einem DNA-Fragment von Interesse und mit doppelsträngigen Rekombinationslinkern in S. cerevisiae kombiniert, wobei das Fragment von Interesse mit dem Vektor durch homologe Rekombination, wie durch Raymond et al., BioTechniques 26:134–141, 1999 offenbart ist, verbunden wird.
Beispiel 3
Die Expression von heterologen Genen aus dem GAP1-Promotor wurde unter Verwendung von LacZ und GFP (green fluorescent protein) Reportergenen getestet. Diese Gene wurden als Eco RI-Bam HI-Fragmente hergestellt und wurden individuell an Eco RI, Bam HI-verdauten pBM/GAP ligiert. Die resultierenden Plasmide wurden in P. methanolica Wirtszellen transformiert, und die Zellen wurden sowohl in Glucose- als auch in Methanol-Fermentationsbedingungen wachsen gelassen. Beide Reportergene wurden unter beiden Bedingungen expremiert, was zeigte, daß der klonierte GAP1-Promotor verwendet werden kann, um konstitutiv heterologe Gene in P. methanolica Zellen zu expremieren.
Beispiel 4
Um einen P. methanolica Stamm zu generieren, der defizient für vacuoläre Proteasen ist, wurden die PEP4 und PRB1 Gene identifiziert und unterbrochen. PEP4 und PRB1 Sequenzen wurden durch PCR in Umsetzungsmischungen enthaltend 100 pmol Primer-DNA, 1X-Puffer, wie zur Verfügung gestellt, (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 250 μM dNTPs, 1–100 pmol Template-DNA und einer Einheit Taq-Polymerase in einem Umsetzungsvolumen von 100 μl amplifiziert. Die DNA wurde über 30 Zyklen bei 94°C, 30 Sekunden; 50°C, 60 Sekunden; und 72°C, 60 Sekunden amplifiziert.
Unter Verwendung eines Alignments von PEP4-Sequenzen abgeleitet von S. cerevisiae (Ammerer et al. Mol. Cell. Biol. 6:2490–2499, 1986; Woolford et al., Mol. Cell. Biol. 6:2500–2510, 1986) und P. pastoris (Gleeson et al., U.S. Patent Nr. 5,324,660) wurden verschiedene Sense- und Antisense-Primer entsprechend der konservierten Regionen entworfen. Ein Primerset ZC9118 (SEQ ID Nr.9) und ZC9464 (SEQ ID No:10) produzierte ein PCR-Produkt mit der erwarteten Größe aus der genomischen DNA, und dieser Satz Primer wurde verwendet, um einen genomischen Klon zu identifizieren, der der amplifizierten Region entsprach. DNA-Sequenzieren eines Teils dieses genomischen Klons (gezeigt in SEQ ID Nr.11) ergab einen offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid (SEQ ID Nr.12) kodierte, mit 70%iger Aminosäureidentität zu Proteinase A von S. cerevisiae.
Primer für die Identifizierung von P. methonolica PRB1 wurden auf der Basis von Alignments zwischen den PRB1- Genen von S. cerevisiae (Moehle et al. Mol. Cell. Biol. 7:4390–4399), P. pastoris (Gleeson et al., US Patent Nr. 5,324,660) und Kluyveromyces lactis (Fleer et al., WIPO Publication WO 94/00579) entworfen. Ein Primersatz, ZC9126 (SEQ ID Nr.13) und ZC9741 (SEQ ID Nr.14) amplifizierte ein ca. 400 bp Fragment aus genomischer DNA (SEQ ID Nr.15). Dieses Produkt wurde sequenziert, und es wurde gefunden, daß es für ein Polypeptid (SEQ ID Nr.16) mit 70%iger Aminosäureidentität zu Proteinase B von S. cerevisiae kodiert. Der PRB-Primersatz wurde dann verwendet, um einen genomischen Klon zu identifizieren, der das P. methanolica PRB1-Gen umfaßt.
Deletionsmutanten in den P. methanolica PEP4- und PRB1-Genen wurden unter Verwendung von erhältlichen Restriktionsenzymorten generiert. Die klonierten Gene wurden restriktionsgemappt. Das PEP4Δ-Allel wurde durch des Deletieren eines Bereichs von ungefähr 500 bp zwischen den BamHI und NcoI Orten und einschließlich der Nukleotide 1 bis 393 der Sequenz, die in SEQ ID Nr.11 gezeigt ist, kreiert. Das prb1Δ-Allel wurde durch Deletieren eines Bereichs von ungefähr 1 kbp zwischen den NcoI- und EcoRV-Orten und einschließlich der Sequenz, die in SEQ ID Nr.15 gezeigt ist, generiert. Die klonierten PEP4- und PRB1- Gene wurden in pCZR139 subkloniert, ein Phagemid-Vektor (pBluescript^® II KS(+), Stratagene, La Jolla, CA) der ein 2,5 SpeI ADE2 Insert trug, um Deletionen herzustellen. In dem Falle des PEP4-Gens wurde der einzige BamHI-Ort in pCZR139 durch Verdau, Einfüllen und Religation eliminiert. Der Vektor wurde dann durch Verdau mit EcoRI und HindIII linearisiert, und ein ca. 4 kb EcoRI-HindIII Fragment, das das PEP4-Gen überspannte, wurde in den linearisierten Vektor hinein ligiert, um Plasmid pCZR142 herzustellen. Eine ca. 500 bp Deletion wurde dann durch Verdau von pCZR142 mit BamHI und NcoI, Einfüllen der Enden und Religieren der DNA, um Plasmid pCZR143 zu produzieren, produziert. Das PRBI-Gen (~5 kb XhoI-BamHI-Fragment) wurde in pCZR139 subkloniert und ein internes EcoRV-NcoI-Fragment umfassend die Sequenz, die in SEQ ID Nr.15 gezeigt ist, wurde deletiert, um Plasmid pCZR153 herzustellen.
Plasmid pCZR143 wurde mit Asp718 linearisiert, was an einem einzigen Ort schneidet. Das linearisierte Plasmid wurde in den P. methanolica PMAD11 Stamm eingeführt (ein ade2-Mutant generiert, wie in US Patent Nr. 5,736,383 offenbart). Transformanten wurden auf ADE DS (Tabelle 1) wachsen gelassen, um Ade⁺-Transformanden zu identifizieren. Zwei Klassen von weißen Ade⁺-Transformanten wurden analysiert. Eine Klasse entstand direkt aus der primären Transformationsplatte; die zweite wurde erkennbar als schnell wachsende weiße Papillae an den Rändern von nicht stabilen, pinken transformierten Kolonien.
Tabelle 1

ADE DS 0,056%-Ade-Trp-Thr Pulver 0,67 Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren 2% D-Glucose 0,5% 200X Tryptophan, Threoninlösung 18,22% D-Sorbitol
-Ade-Trp-Thr Pulver Pulver hergestellt durch Komibinieren von 3,0g Arginin, 5,0g Asparginsäure; 2,0g Histidin, 6,0g Isoleucin, 8,0g Leucin, 4,0g Lysin, 2,0g Methionin, 6,0g Phenylalanin, 5,0g Serin, 5,0g Tyrosin, 4,0g Uracil und 6,0g Valin (alles L-Aminosäuren)
200X Tryptophan, Threoninlösung 3,0% L-Threonin, 0,8% L-Tryptophan in H₂O Vier Platten, Hinzufügen von 1,8% Bacto^TM Agar (Difco Laboratories)

Southern blotting wurde verwendet, um Transformanten zu identifizieren, die das gewünschte homologe Integrationsereignis unterlaufen hatten. 100 μl Zellpaste wurde von einer 24 bis 48 Stunden YEPD Platte abgeschabt und in einem Milliliter Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 400 μl Spheroblastenpuffer (1,2 M Sorbitol, 10 mM Natriumcitrat, pH 7,5, 10 mM EDTR, 10 mM DTT, 1 mg/ml Zymolase 100T) präsuspendiert und bei 37°C 10 Minuten inkubiert. 400 μl 1%iges SDS wurde hinzugefügt, die Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur gemischt, bis sie klar war, 300 μl 5 M Kaliumacetat wurde untergemischt, und die Mischung wurde durch Mikrozentrifugation für 5 Minuten geklärt. 740 μl des geklärten Lysats wurde mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, 600 μl wurden in ein frisches Röhrchen transferiert, 2 Volumen 100%iges Ethanol wurde hinzugefügt, und die DNA wurde durch Mikrozentrifigation für 15 Minuten bei 4°C präzipiziert. Das Pellet wurde in 50 μl TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) enthaltend 100 μg/ml RNAse A resuspendiert. 10 μl DNA (ungefähr 100 ng) wurden in einem 100 μl Gesamtvolumen mit entsprechenden Enzymen verdaut, mit 200 μl Ethanol präzipitiert und in 10 μl DNA Ladepuffer resuspendiert. Die DNA wurde auf 0,7% Agarosegelen aufgetrennt und auf Nylonmembranen (Nytran N⁺, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) in einem halbtrockenen Blottgerät (BioRad Laboratories, Richmond, CA), wie durch den Hersteller empfohlen, transferiert. Die transferierte DNA wurde denaturiert, neutralisiert und mit der Membran mit UV-Licht, unter Verwendung eines Stratalinkers (Stratagene, La Jolla, CA) quervernetzt. Um die Stämme mit Tandemintegration bei PEP4 zu identifizieren, wurden zwei Sonden verwendet. Eine war ein 1400 bp EcoRI-HindIII-Fragment von dem 3'-Ende des PEP4. Die zweite war ein 2000 bp BamHI-EcoRI-Fragment von dem 5'-Ende des PEP4. Die Fragmente wurden unter Verwendung von Chemiluminescense-Reagenzien (ECL^TM direct labelling kit; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) detektiert.
Parentale Stämme, die eine Tandemduplikation des Wild-Typs und der Deletionsallelen des Gens enthielten, wurden in YEPD Nährlösung über Nacht wachsen gelassen, um die Bildung von looped-out, Ade^–-Stämmen zu erlauben. Diese Zellen wurden dann in einer Dichte von 2000 bis 5000 Kolonien pro Platte auf Adenin-limitierte YEPD-Platten ausplattiert, 3 Tage lang bei, 30°C und 3 Tage bei Raumtemperatur wachsen gelassen. Die Verschiebung zur Raumtemperatur verstärkte die Pigmentierung von seltenen, pinken Ade^–-Kolonien. Loop-out Stämme wurden konsistent mit einer Häufigkeit von ungefähr einer pinken, Ade^–-Kolonie pro 10000 gescreenten Kolonien detektiert. Diese Stämme wurden für den Erhalt der Wild-Typ- oder der Mutanten-Gene durch Southern blotting oder durch PCR unter Verwendung von Primern gescreent, die den Ort der Deletion überspannten. Ein ade2-11-pep4Δ-Stamm wurde PMAD15 genannt.
Das PRB1-Gen wurde dann aus PMAD15 deletiert, im wesentlichen, wie oben beschrieben durch Transformation mit Plasmid pCZR153. Die Blots wurden mit einer Sonde unter Verwendung von PCR-hergestellten Sonden für interne Bereiche der PRB1 und ADE2 Gene behandelt. Die PRB1-Sonde wurde durch Subklonieren eines 2,6 kb ClaI-SpeI-Fragmentes aus PRB1 in den Phagemid-Vektor pBluescript^® II KS(+) gebildet, um pCZR150 zu produzieren, und durch Amplifizieren der gewünschten Region durch PCR unter Verwendung der Primer ZC447 (SEQ ID Nr.17) und ZC976 (SEQ ID Nr.18). Die ADE2-Sonde wurde durch Amplifizieren des ADE2-Gens in PCZR139 mit den Primern ZC9079 (SEQ ID Nr.19) und ZC9080 (SEQ ID Nr.20) gebildet. Der resultierende ade2-11-pep4Δ-prb1Δ-Stamm wurde PMAD16 genannt.
Aus dem vorangegangenen wird anerkannt werden, daß obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hierin zum Zwecke der Illustration beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen daran gemacht werden können, ohne dabei vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Dementsprechend ist die Erfindung außer durch die angehängten Ansprüche nicht limitiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Konstrukt, das die folgenden funktionsfähig miteinander verknüpften Elemente umfaßt: ein erstes DNA-Segment, das wenigstens einen Teil der Sequenz der SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 733 bis Nucleotid 1732 umfaßt, wobei dieser Teil ein funktionsfähiger Transkriptionspromotor ist; ein zweites DNA-Segment, das für ein gewünschtes Protein codiert, das keine Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase von Pichia methanolica ist; ein drittes DNA-Segment, das einen Transkriptionsterminator umfaßt; und eine Sequenz für ein Sekretionssignal, die funktionsfähig mit dem ersten und zweiten DNA-Segment verknüpft ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die Sequenz für das Sekretionssignal eine Prepro-Sequenz des alpha-Faktors von Saccharomyces cerevisiae ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das dritte DNA-Segment einen Transkriptionsterminator eines Alcohol Utilisation-Gens 1 oder Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasegens von Pichia methanolica umfaßt.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 3, wobei der Terminator die Nucleotide 2735 bis 2795 von SEQ ID NO: 1 umfaßt.
DNA-Konstrukt, das die folgenden funktionsfähig miteinander verknüpften Elemente umfaßt: ein erstes DNA-Segment, das einen ersten Gentranskriptionspromotor von Pichia methanolica umfaßt; ein zweites DNA-Segment, das für ein gewünschtes Protein codiert, das kein Pichia methanolica-Protein ist; und ein drittes DNA-Segment, das die Nucleotide 2735 bis 2795 von SEQ ID NO: 1 umfaßt.