FI85987B - Foerfarande foer transformering av yarrow lipolytica. - Google Patents

Foerfarande foer transformering av yarrow lipolytica. Download PDF

Info

Publication number
FI85987B
FI85987B FI843932A FI843932A FI85987B FI 85987 B FI85987 B FI 85987B FI 843932 A FI843932 A FI 843932A FI 843932 A FI843932 A FI 843932A FI 85987 B FI85987 B FI 85987B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
lipolytica
dna
coli
plasmid
gene
Prior art date
Application number
FI843932A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI843932L (fi
FI85987C (fi
FI843932A0 (fi
Inventor
Lance Steven Davidow
John Robert Dezeeuw
Original Assignee
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of FI843932A0 publication Critical patent/FI843932A0/fi
Publication of FI843932L publication Critical patent/FI843932L/fi
Publication of FI85987B publication Critical patent/FI85987B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI85987C publication Critical patent/FI85987C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Magnetic Ceramics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
  • Treatment Of Sludge (AREA)
  • Protection Of Transformers (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Blow-Moulding Or Thermoforming Of Plastics Or The Like (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Air-Conditioning For Vehicles (AREA)

Description

1 85987
Menetelmä Yarrowia lipolytican transformoimiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää Yarrowia lipolytican transformoimiseksi sen hyväksikäytön parantamiseksi 5 teollisiin tarkoituksiin; tähän käytettäviksi sopivia vektoreita ja subklooneja, ja erityisesti vektoreita, jotka replikoituvat itsenäisesti Escherichia colissa ja integroituvat Yarrowia lipolyticaan, mutta eivät replikoidu siinä itsenäisesti; E. colin ja Y. lipolytican transfor-10 mänttejä, jotka sisältävät mainittuja vektoreita, ja niiden käyttöä proteiinien tuottamiseen.
Molekyylikloonaus on ollut painottunut pääasiassa prokaryootteihin, erityisesti E. coliin ja viime aikoina Bacillus subtilikseen, isäntäorganismeina. On tunnettua, 15 että E. coliin, huolimatta sen laajasta käytöstä isäntäor-ganismina heterologisen DNA:n kloonaukseen ja ilmentymiseen, liittyy tiettyjä ongelmia, kuten esimerkiksi kykenemättömyys erittää proteiineja kasvualustaan, josta ne olisi sitten helppo eristää. Nämä lntrasellulaarlsesti tuote-20 tut proteiinit eivät ole tavallisesti natiivissa tilassa, Ja esiintyvät liukenemattomina aggregaatteina, joita kutsutaan nimellä inkluusiokappaleet. Se, että solut on mahdollisesti tuhottava proteiinien talteenottamiseksi, tuo mukanaan mahdollisuuden, että nämä kontaminoituvat toksi-25 silla aineilla.
Näiden vaikutusten johdosta on B. subtiliksesta muodostunut vaihtoehtoinen isäntäorganismi, koska se erit--· tää proteiinia, eikä tuota toksiineja. B. subtilikseen liittyy kuitenkin isäntäorganismina tiettyjä rajoituksia: ; 30 transformoitujen kantojen epästabiilisuus, joka johtaa •j heterologisen DNA:n häviämiseen, ja säännöllinen heikkene minen sisääntulleen DNA:n kyvyssä esiintyä yhdessä isäntä-DNA:n kanssa.
Kun oli tunnistettu yllämainitut vaikeudet prokary-::: 35 oottien ollessa isäntäorganismeina, huomio kohdistui euka-ryootteihin ja erityisesti hiivoihin isäntäorganismeina.
2 85987
Teollisesti tärkeät hiivat eivät ole toksisia ja niitä voidaan kasvattaa hyvin korkeisiin pitoisuuksiin. Muutamat lajit ovat geneettisesti hyvin analysoituja ja muutamat lajit voivat erittää proteiineja.
5 Ensimmäisen transformaation hiivalla, Saccharomyces cerevisiae'lla, esittivät Hinnen et al.[Proc. Natl. Acad. Sei., 75, ss. 1 929 - 1 933 (1978)], jotka osoittivat, että LEU2-lokusta koodittavat hiivan kloonatut DNA-segmentit pystyvät transformoimaan hiivan ei-revertoituvan leu2-10 mutantin Leu-f-fenotyypiksi. Tämän transformaation osoitettiin johtuvan DNA:n LEU2-segmentin sisältävän plasmidin integroitumisesta kromosomiin. Integroituminen sisälsi re-kombinaation homologisten DNA-segmenttien välillä.
Hinnen et ai. [Overproduction of Microbial Products; 15 toimittaneet Krumphanzl et ai.; Academic Press, N.Y., Ch. 30 (1982)] esittävät katsauksen hiivan transformointimene-telmiin. Edellytyksen hiivan transformoimiseksi esittivät Ratzkin et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. 74, ss. 487 - 491 (1977)] kloonaamalla hiivan (Saccharomyces cerevisiae) 20 LEU2 E. colin leuB-mutaation komplemetoinnin avulla. Sjo-stak et ai. [Plasmid 2, ss. 536 - 554 (1979)] esittävät hiivan LEU2-geenin ja rDNA-fragmentteja sisältävien plas-midien konstruktion sekä plasmidien integraation rDNA-lo-kukseen hiivan transformoinnin jälkeen. Heidän tutkimuk-25 sensa perusajatus sisälsi insertoituneen rDNA-lokukseen geneettisen markkerin, LEU2-geenin, integraation geneettiseksi markkeriksi rDNA:n kartoitusta varten. Yksi esitetyistä plasmideista, pSZ20, joka sisältää rDNA:n Bglll-B-fragmentin ja SalI-XhoI-LEU2-fragmentin, todettiin sopi-30 vaksi hiivan DNA-fragmenttien kloonaukseen hiivassa.
Orr-Weawer et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei., 78, ss. 6 354 - 6 358 (1981)] esittävät pBR322:sta saatujen lineaaristen plasmidien, jotka kaikki ovat hiivassa replikoi-tumattomia ja transformoituvat ainoastaan integroitumalla, 35 suurifrekvenssisen integroitumisen Saccharomyces cerevi- siae'een, kun plasmidit katkaistaan hiivan kromosomille 3 85987 homologisilta DNA-sekvenssialueilta.
Yarrowia lipolyticaa, teollisesti tärkeää hiivala-jia, käytetään sitruunahapon sekä yksisoluproteiinin tuottamiseen. Sitä voidaan käyttää myös erytritolin, mannito-5 Iin ja isopropyyliomenahapon tuottamiseen. Y. lipolytica kärsii tietyistä luontaisista puutteista, kuten esimerkiksi käyttökelpoisten hiililähteiden rajoitetusta valikoimasta. Y. lipolytican kokonaisarvoa voitaisiin nostaa poistamalla tällainen puute esimerkiksi tuomalla siihen 10 korjaavaa DNA:ta toisesta lajista. Y. lipolytica on erityisen kiinnostava ja arvokas, koska se pystyy erittämään proteiineja (alkalista proteaasia, hapanta proteaasia ja RNAasia) kasvualustaansa, mikä tekee mahdolliseksi hetero-logisten proteiinien talteenottamisen natiivissa tilassa 15 ilman, että tuotantosolut täytyy rikkoa.
Beggs [Nature 275, ss. 104 - 109 (1978)] esittää hyvin tehokkaan järjestelmän S. cerevisiaen transformoi-miseksi, johon kuuluu replikoituva hybridiplasmidi, S. cereviciae - E. coli -hybridiplasmidi, joka voidaan selek-20 toida sekä E. colissa että S. cerevisiaessa ja eristää näistä molemmista. Beach et ai. [Nature 290, ss. 140 - 142 (1981) ] ja Das et ai. [Current Genetics 6, ss- 123 - 128 (1982) ] esittävät suuri frekvenssisen transformointi järjestelmän Schizosaccharomyces pompe'lle ja Kluyveromyces lac- 25 tis'ille, vastaavasti.
Nyt on keksitty menetelmä Y. lipolytican transfor-moimiseksi, jossa soluun viedään DNA:ta, joka sisältää mainitulle Y. lipolyticalle homologisen alueen ja detek-toitavan geneettisen markkerin. Erityisen kiinnostava on 30 menetelmä, jossa mainittuun Y. lipolyticaan viedään Y.
lipolytican DNA-fragmentti tai vaihtoehtoisesti ja mieluummin vektori, joka sisältää Y. lipolytican DNA-fragmentin, ja joka mainittu DNA tai vektori on detektoitavissa mainitussa Y. lipolyticassa, ja johon menetelmään kuuluu : 35 tähän käytettävät vektorit ja mainittuja vektoreita sisäl-tävät mikrobitransformantit. Yleisesti sanoen tässä trans- * 85987 formointimenetelmässä mainittu Y. lipolytican DNA-frag-mentti sisältää selektoitavan markkerin, joka toimii Y. lipolyticassa, jossa on mutaatio mainittua selektoitavaa markkeria vastaavassa geenissä.
5 Tälle keksinnölle on tunnusomaista käyttää Y. lipo lytican DNA-fragmenttia, jossa on biosynteettistä tai me-tabolista entsyymiä koodittava LEU2-geeni (koodittaa entsyymiä beta-isopropyylimalaattidehydrogenaasi, EC1.1.1.85) tai HISl-geeni (koodittaa entsyymiä ATP-fosforibosyyli-10 transferääsi, EC2.4.2.17) tai URA3-geeni (koodittaa entsyymiä orotidiini-51-fosfaattidekarboksylaasi, EC4.1.1.23), ja Y. lipolytica-kantoja, joissa on leu2', hisl" tai ura3‘ -mutaatio, vastaavasti.
Tässä kuvatuilla uusilla plasmideilla (tai vekto-15 reillä; termejä käytetään tässä molemminpuolisesti) on useita yhteisiä ominaisuuksia: bakteerireplikoni, joka tekee mahdolliseksi monistumisen E. colissa; E. colissa de-tektoitavan ja toimivan selektoitavan geneettisen markkerin läsnäolo; Y. lipolyticassa ja usein E. colissa fysio-20 logisesti toimivan rakennegeenin läsnäolo; ja Y. lipolytican DNA-fragmenttien, jotka mahdollistavat integroitumisen Y. lipolytican genomiin, läsnäolo. Sopivien vektoreiden tuottaminen tämän keksinnön tarkoituksiin perustuu yleisesti ottaen hybridivektoreiden valmistamiseen, eli vekto-25 reiden, jotka toimivat fysiologisesti heterologisessa mikro-organismissa (eli jossain muussa lajissa kuin Y. lipolyticassa), edullisesti bakteerissa ja edullisimmin E. colissa ja myös Y. lipolyticassa. Tällaiset vektorit sisältävät mikrobi-DNA:ta ja Y. lipolytican kromosomaalisen 30 DNA:n fragmentteja, jotka fragmentit sisältävät ainakin yhden selektoitavan geneettisen markkerin eli geenin, joka toimii Y. lipolyticassa ja on siinä detektoitavissa. Täten konstruoidut vektorit toimivat Y. lipolytican homologisten kromosomaalisten sekvenssien kanssa vuorovaikutuksessa ja : : · 35 integroituvat tämän kromosomiin, jolloin on tapahtunut transformaatio.
s 85987
Kuten alan ammattilaiset tietävät, enemmän kuin yhden hiivasta saadun geenin sisältämien vektoreiden muodostuminen suurentaa todennäköisyyttä, että mainituista vektoreista muodostuu integraatteja eli mainittuja vektoreita 5 sisältäviä transformantteja ja erityisesti integraatteja, joissa on enemmän kuin yksi geeni. Multippeligeenien läsnäolo suurentaa ja parantaa luonnollisesti vektorin detek-toitavuutta hiivassa.
Integroituminen saadaan aikaan mainittujen vekto-10 reiden rengasmaisilla, lineaarisilla ja katkolineaarisilla (gapped-linear) muodoilla. Lineaariset ja katkolineaariset vektorit integroituvat tehokkaammin kuin rengasmaiset vektorit. Vektoreissa on sen vuoksi mielellään uniikki re-striktiokohta eli kohta, jota ei ole alkuperäisessä mikro-15 bi-DNA-vektorissa tai muualla vektorin Y. lipolytica-frag- menttiosassa. Vektorin linearisointi tällaisesta kohdasta saa aikaan kaksijuosteista DNA:ta, jonka päät ovat erittäin rekombinogeeniset ja pystyvät transformoimaan Y. li-polytican integroitumalla homologisiin kromosomaalisiin 20 sekvensseihin. Kuten Orr-Weawer et ai. (loc. cit.) ovat osoittaneet S. cerevisiae'ssa, pustyvät katkolineaariset plasmidit myös integroitumaan. Tällaisia plasmideja valmistetaan suorittamalla kaksi restriktioentsyymikatkaisua vektorin Y. lipolytican kromosomaalisen DNA-segmentin 25 alueella. Jäljempänä kuvatun pLD25:n tapauksessa tekee kahden Bglll-kohdan läsnäolo mahdolliseksi valmistaa helposti katkolineaarisia plasmideja.
Tämän keksinnön mukaisten vektoreiden arvo perustuu siihen, että niissä on selektoitava geneettinen markkeri, 30 joka on detektoitava ja toimiva Y. lipolyticassa ja joka siten on detektoitava markkeri. Markkerit ovat seuraavat Y. lipolytica-geenit: LEU2, URA3 ja HIS1. Erityisen arvokas on LEU2-geeni kokonaisena tai osa siitä. Mainittu geeni tai sen osa saadaan Y. lipolyticasta Y. lipolytican : : 35 kromosomaalisen DNA:n osittaisella pilkkomisella sopivan restriktioendonukleaasin, esimerkiksi Sau3A:n avulla. Mai- 6 85987 nitut vektorit tai näiden subkloonit tekevät mahdolliseksi Y. lipolytican kloonausvektoreiden valmistamisen siten, että niihin lisätään DNA:n umpimähkäisiä segmenttejä tunnettuja menetelmiä käyttäen. Saatuja vektoreita käytetään 5 sitten transformoimaan Y. lipolytica-kantoja, joissa on mutaatio selektoitavaa markkeria vastaavassa kohdassa. Tällaisen Y. lipolytica-markkerin sisältävän transformoivan DNA:n avulla voidaan resipienttiin saada selektiivinen kasvuetu tai resipientti voidaan korjata auksotrofisen mu-10 taation suhteen.
On yleisesti edullista käyttää Y. lipolytican DNA-fragmenttia, joka sisältää koko LEU2-geenin, koska mainittu fragmentti tekee mahdolliseksi sekä E. colissa että Y. lipolyticassa fysiologisesti toimivan vektorin valmistami-15 sen. Koko LEU2-geenin sisältävän Y. lipolytican DNA-frag-mentin käyttäminen ei kuitenkaan ole välttämätöntä, jotta tämän keksinnön mukainen menetelmä voitaisiin suorittaa onnistuneesti. Välttämätöntä on ainoastaan se, että käytetään sellaista DNA-fragmenttia, joka sisältää riittävän 20 määrän villi-tyypin sekvenssiä, jotta integroinnilla resi pienttiin saataisiin villi-tyypin geeni. Mainittu fragmentti on detektoitava Y. lipolyticassa, vaikka se ei ole toimiva E. colissa.
Tähän keksintöön soveltuvien vektoreiden valmista-25 misessa ovat arvokkaita myös Y. lipolytican DNA:n fragmentit, jotka on saatu pilkkomalla Y. lipolytican kromosomaa-linen DNA täydellisesti BamHI:llä ja jotka sisältävät HISl-geenin tai pilkkomalla Y. lipolytican kromosomaalinen DNA osittain Sau3A:lla ja jotka sisältävät URA3-geenin.
30 Mainituissa fragmenteissa on ligatoituvat päät ja kun ne ligatoidaan linearisoidun, eli BamHl:n avulla katkaistun YEp24:n, E. coli - S. cerevisiae -vektorin kanssa [Bot-stein et ai.. Gene 8, ss. 17 - 24 (1979)] saadaan aikaan HISl-geenin tai URA3-geenin sisältäviä hybridivektoreita. 35 Tässä kuvattuja uusia vektoreita käyttämällä voi daan Y. lipolytican umpimähkäisiä segmenttejä insertoida 7 85987 niihin "shotgun"-menetelmällä. Tuloksena saatuja vektoreita voidaan käyttää transformoimaan erilaisia mutantteja ja transformantteja, jotka on selektoitu standardimenetelmillä. LEU2:n sisältäviä vektoreita voidaan esimerkiksi käyt-5 tää muiden Y. lipolytica-geenien, kuten esimerkiksi URA3:n kloonaamiseen. Tuloksena saatu kloonattu URA3-geeni missä tahansa selektoidussa transformantissa voidaan sitten sub-kloonata erilleen LEU2-geenistä ja käyttää tehokkaana Y. lipolytieä-vektorina.
10 Yleisesti sanoen, yhdistetään alunperin bakteeris sa, esim. E. colissa replikoituva plasmidi ja mainitulle bakteerille selektiivinen geneettinen markkeri tunnetuilla menetelmillä kokonaisen Y. lipolytican geenin tai sen osan kanssa, joka voidaan selektoida ja detektoida Y. lipolyti-15 cassa. E. coli-kloonausjärjestelmä on erityisen sopiva, koska sillä saadaan helposti suuria määriä (bulkki) plas-midi-DNA:ta E. colissa tapahtuvan kasvun ja monistumisen avulla, ja koska sen avulla on mahdollista konstruoida vektoreita ja geenipankkeja E. colissa.
20 Tässä kuvatut plasmidit ovat sopivia vektoreiksi rekombinantti-DNA-tekniikassa. Erilaisia geenejä voidaan insertoida niihin esimerkiksi pilkkomalla ne sopivalla restriktioendonukleaasilla, jolloin saadaan ligatoituvat päät sisältävää lineaarista DNA:ta, ja sen jälkeen anta-25 maila mainitun lineaarisen DNA:n reagoida ligatoituvat päät sisältävän eksogeenisen geenin kanssa. Saadut plasmidit transformoidaan sitten sopivaan isäntämikro-organis-miin, esim. hiivaan, kuten Y. lipolyticaan, joka tuottaa haluttua tuotetta, kun sitä viljellään sopivissa olosuh-30 teissä. Plasmidit pLD25 ja pLD28, jotka kumpikin sisältävät Y. lipolyticasta saadun LEU2-geenin, voidaan selektoida ja detektoida Y. lipolytica-resipientissä. Niitä voidaan siten käyttää Y. lipolytican kloonausvektoreiden val-mistamiseen.
• 35 Tässä kuvattujen plasmidien avulla on lisäksi mah dollista parantaa mikro-organismien, erityisesti Y. lipo- • · β 85987 lytican fermentointiominaisuuksia, jolloin niiden teollinen hyväksikäytettävyys paranee, kun niissä olevat luontaiset puutteet poistetaan. Niihin voidaan esimerkiksi tuoda erilaisten hiililähteiden hyväksikäyttöä koodittavia 5 geenejä, ja tuloksena saadut plasmidit voidaan transformoida sopivaan isäntään, kuten esimerkiksi Y. lipolyticaan mainitun isännän ravitsemuksellisten ominaisuuksien modi-fioimiseksi, ja täten voidaan laajentaa Y. lipolytican hyväksikäyttämien hiililähteiden valikoimaa.
10 Tähän tarkoitukseen tarvittavat vektorit, esim.
plasmidit ja kosmidit voidaan konstruoida menetelmillä, jotka ovat tunnettuja rekombinantti-DNA-teknologian ammattilaisille. Tiettyä periplasmista entsyymiä koodittava Y. lipolytican DNA-sekvenssi eristetään tunnetuilla menetel-15 millä ja insertoidaan esimerkiksi pLD25:een tai sen johdannaiseen. Periplasmisen entsyymin DNA-sekvenssiin voidaan tarpeen mukaan liittää haluttu rakennegeeni, esimerkiksi maltaasigeeni, ja tuloksena saatu plasmidi voidaan transformoida Y. lipolyticaan ja integroida johonkin Y.
20 lipolytican kromosomiin tämän keksinnön mukaisella menetelmällä. Tällä tavoin valmistetut transformantit kykenevät viljeltäessä hydrolysoimaan maltoosin glukoosiksi, mitä haluttua ominaisuutta lähtökannalla ei ole.
Plasmidi pLD25 replikoituu itsenäisesti E. colissa 25 ja integroituu Y. lipolyticaan, mutta ei replikoidu siinä. Se valmistetaan insertoimalla E. colissa replikoituvaan plasmidiin pBR322:een. Y. lipolytican DNA-fragmentti, joka sisältää mielellään kaksi erillistä ominaisuutta: ensiksi siinä on rakennegeeni, joka toimii fysiologisesti Y. lipo-30 lyticassa ja mielellään myös E. colissa ja joka on detek-toitava Y. lipolyticassa; toiseksi siinä on uniikki re-striktiokohta (kohta, jota ei ole alkuperäisessä E. coli-plasmidissa tai missään muualla Y. lipolytican isäntäfrag-mentissa) alueella, joka on sen DNA-sekvenssin vieressä, • 35 joka tuodaan Y. lipolytica-isäntäkantaan mainitun isännän rakennegeenissä olevien puutteiden korjaamiseksi. Uniikin 9 85987 restriktiokohdan olemassaolo on välttämätön, jotta saataisiin suurifrekvenssinen transformaatio.
Jäljempänä kuvatut plasmidit pLD21 ja pLD23, joissa kummassakin on Y. lipolytican HISl-geeni, valmistetaan 5 insertoimalla YEp24:ään ja pBR322:een, vastaavasti, fragmentti, joka on saatu pilkkomalla Y. lipolytican kromoso-maalinen DNA täydellisesti BamHI:n avulla.
Plasmidi pLD25 sisältää Y. lipolytican DNA-fragmen-tin, joka komplementoi E. colin leuB‘-mutaatioita, ja plas-10 midit pLD21 ja pLD23 sisältävät fragmentin, joka komplementoi E. colin hisG'-mutaatioita.
Myös plasmidi pLD28 replikoituu itsenäisesti E. colissa ja integroituu Y. lipolyticaan, mutta ei replikoi-du siinä itsenäisesti. Se konstruoidaan insertoimalla Y. 15 lipolytica LEU2-geenin sisältävä Sali-fragmentti YEp24:n Sali-kohtaan. Se on Y. lipolyticassa integroiva vektori, kuten on mainittu, joka on selektoitava leu2-mutantissa, monikopioplasmidi S. cerevisiae'ssa, joka on selektoituva ura3- tai leu2-mutantissa; ja monikopioplasmidi E. colis-20 sa, joka on selektoituva ampisilliiniresistenssin avulla tai S. cerevisiaen URA3-geenin sopivalla toiminnalla pyrF-mutantissa tai tehottomimmin Y. lipolytican LEU2-geenin heikon, vaikkakin detektoitavan toiminnan avulla leuB-mutantissa.
25 Plasmidit pLD25 ja pLD28 ovat sukkulavektoreita E.
colille ja Y. lipolyticalle. Ne sisältävät sekä bakteriaa-lisia sekvenssejä, jotka mahdollistavat DNA:n replikaation E. colissa, että sekvenssejä, jotka mahdollistavat integroitumisen hiivaan, eli niissä on E. colista saatu repli-30 kaatio ja Y. lipolyticalle homologinen alue. Termiä "shuttle”, sukkula, käytetään osoittamaan, että mainitut E. colissa konsentroidut vektorit voidaan integroida Y. lipolytican kromosomeihin ja tuoda takaisin E. coliin, jotta sykli olisi täydellinen. Plasmidi pLD28 on myös - 35 shuttle-vektori S. cerevisiae'lie. Nämä shuttle-vektorit tekevät mahdolliseksi Y. lipolytican geenien kloonauksen 10 85987 mutaatioiden komplementaatiolla S. cerevisiae'een tai Y. lipolyticaan. Nämä ilmiöt osoittavat, että toimivan LEU2-geenin tuote muodostuu molemmissa heterologisissa järjestelmissä. Se, että Y. lipolyticaan voidaan komplementoida 5 suoraan, tekee mahdollisesti kloonata mikä tahansa geeni, jossa tapahtunut mutaatio voidaan tunnistaa.
Plasmidi pLD40 (kuvattu jäljempänä) konstruoitiin insertoimalla pBR322:n EcoRI-kohtaan pieni segmentti, joka sisälsi Y. lipolytican LEU2-alueen ja joka segmentti oli 10 saatu pilkkomalla pLD25 osittain EcoRIrn avulla. Plasmidi pLD55, URA3:n sisältävä plasmidi, saatiin insertoimalla pLD40:n BamHI-kohtaan Y. lipolytican URA3-geeni.
Kuvio 1 Y. lipolytican Sau2A:n avulla suoritetulla osittai-15 sella pilkkomisella muodostettu geenipankki pBR322:ssa Tämä agaroosigeeli osoittaa sen, että kirjasto (merkitty LIB) sisältää jonkin verran pBR322 superkierty-nyttä plasmidia, jossa ei ole insertti-DNA:ta ja joka on 20 liikkunut juuri hieman 2,3 kb:n lambda-HindlII-standardin (merkitty STD) yläpuolelle; ja kaikki muut molekyylit sisältävät erilaisia (4 - 10 kb) koon perusteella fraktioi-tuneita Y. lipolytica-DNA:n inserttejä, jotka ovat liikkuneet melkein jatkuvaksi alueeksi 4,3 kb:n standardin ylä-25 puolelle. Välillä oleva kaista sisältää pilkkomattoman plasmidin (pLD21) ja siinä näkyy kaksi erillistä vyöhykettä.
Kuvio 2
EcoRI:llä pilkotun Y. lipolytican bulkki-DNA:n ja 30 pLD25:n Southern-hybridisaatio radioaktiivisen pLD25-koettimen kanssa pLD25:n kolme sisintä vyöhykettä, jotka on merkitty b, c ja d, ovat homologisia samankokoisten Y. lipolytican kokonais-DNA:n pätkien kanssa. Kaksi muuta, heikompaa vyö-35 hykettä (merkitty 1 ja 2) Y. lipolytican kaistalla ovat : mahdollisesti homologisia plasmidin vyöhykkeiden a ja e il 85987 pienten Y. lipolytica-osien kanssa. Kaista, joka on merkitty "STD", sisältää lambda-Hindlll-kokostandardin. "P":llä merkitty kaista sisältää noin 2 ng EcoRI:llä pilkottua pLD25:ä. "Yl":llä merkitty kaista sisältää noin 1 5 mikrogramman Y. lipolytican kokonais-DNA:ta.
Samanlaisessa Southern-kokeessa, jossa käytettiin koettimena pBR322:a, vain vyöhykkeet a ja e pLD25:stä hyb-ridisoituivat.
Kuvio 3 10 pLD25:n restriktiokartta
Kuviossa on esitetty osittainen restriktiokartta, joka perustuu yksinkertaiseen (single) ja jonkin verran kaksinkertaiseen (double) restriktioon. Suluissa olevat kohdat eivät ole järjestyksessä toistensa suhteen. Kaikki 15 esitetyt koot ovat agaroosigeelihavaintoihin perustuvia noin-arvoja. Ohut viiva esittää pBR322-DNA:ta (standardi-koossa ja EcoRI-kohdan ollessa kello 12 asemassa) ja paksu viiva esittää Y. lipolyticasta peräisin olevaa insertti-DNA:ta. Insertissä on 3 EcoRV (RV), 8 Aval (A; mutta vain 20 yksi on esitetty kartassa), 1 SpHI (sp), 1 Kpnl (K), 2
Sali (S), 4 EcoRI (Rl), 2XhoI (X) ja 2 toisiaan lähellä olevaa Bglll (B) -kohtaa. Insertissä ei ole Hindlll, Clal, BamHI eikä NruI -kohtia. 2,3 kb:n subklooni, jossa on EcoRI—päät (merkitty leu2), on toimiva E. colissa vain 1 25 suunnassa pBR322:n EcoRI-kohdassa.
Kuvio 4
Hindlll:11a pilkotun Y. lipolytica-transformanttien bulkki-DNA:n Southern-hybridisaatio radioaktiivisen pBR322-koettimen kanssa 30 Hindlll:11a pilkottu kokonais-DNA, joka oli eris tetty neljästä eri transformantista ja lähtökannasta, ajettiin agaroosigeelillä, käsiteltiin ja testattiin leimatulla pBR322:lla. Y. lipolytica-transformantti #6 valit-! tiin umpäimähkään viljelmästä, joka oli transformoitu kos- 35 kemattomalla, rengasmaisella pLD25:llä. Transformantit 11, 12 ja 15 olivat peräisin viljelmästä, joka oli transfor- i2 85987 moitu KpnI-linearisoidulla pLD25:llä. Kaikki Y. lipolyti-ca-transformantit muodostivat kaksi hybridisaatiovyöhyket-tä: vahvemman (1), joka oli pituudeltaan yli 23 kb, ja heikomman (2), jonka koko oli sama kuin 9,3 kb:n lambda-5 HindiII-standardin. PC:llä merkitty kaista sisälsi lähtö-kannan (PC-30827; ATCC 20688) DNA:ta, joka ei hybridisoi-tunut merkittävästi koettimen kanssa.
Kuvio 5 pLD23:n ja pLD24:n restriktiivinen pilkkominen 10 Tämä agaroosigeeli sisältää lambda-HindlII-koko- standardin ulommassa vasemmassa kaistassa ja pLD23:n (komplementoi E. coli hisG-mutantteja) ja pLD24:n (ei komplementoi), joka on a) käsitelty EcoRI:llä 15 b) käsitelty BamHI:llä ja c) ei käsitelty.
Kumpikin kaista b sisältää kaksi toisiaan lähellä olevaa BamHI-vyöhykettä; suurempi vastaa pBR322:ta ja hieman pienempi vyöhyke (noin 4 kb) edustaa Y. lipolytican 20 BamHI-inserttiä. EcoRI:llä suoritettu pilkkominen osoittaa, että Y. lipolytica-pala on vastakkaisissa suunnissa näissä kahdessa plasmidissa.
Kuvio 6 pLD238:n restriktiokartta 25 Tämä plasmidi sisältää LEU2-alueen sisältävän 5,3 kb:n Y. lipolytican Sali-palan lisäksi 2,2 kb:n EcoRI-pa- lan, jossa on hiivan kahden mikronin plasmidista peräisin oleva replikaatio, sekä 1,1 kb:n HindiII-palan, jossa on pBR322:n vastaaviin kohtiin insertoitunut S. cerevisiaen 30 URA3-geeni.
Kuvio 7 pLD40:n restriktiokartta
Restriktiokohtien lyhennykset ovat samat kuin edellisissä kuvioissa. Karttaan on lisäksi merkitty Ncol (N), 35 Apal (Ap) ja BstXI (Bs) -kohdat. Y. lipolytican LEU2:n sisältävä segmentti on 2,3 - 2,4 kb pitkä ja se oli inser- i3 85987 toitunut pBR322:n EcoRI-kohtaan. pBR322:n restriktiokohtia ei ole esitetty kuvassa.
Kuvio 8 pLD50:n restriktiivinen pilkkominen verrattuna 5 pLD40:een Tämän geelin kaistat (lambda-Hindlll-kokostandardin lisäksi) ovat a) pilkkomaton pLD40 b) Apalrllä pilkottu pLD40 10 c) EcoRI:llä pilkottu pLD40 d) EcoRI:llä pilkottu pLD55 e) Apalrllä pilkottu pLD55 ja f) pilkkomaton pLD55.
Nämä pilkkomiset osoittavat, että kloonatun URA3:n 15 sisältävällä alueella on kaksi EcoRI-kohtaa ja että se on noin 4 kb pitkä.
Kuvio 9 pLD55:n restriktiokartta
Restriktiokohtalyhennykset ovat samat kuin edelli-20 sissä kuvioissa. Y. lipolytican URA3:n sisältävä segmentti, joka on esitetty tummana alueena, on noin 4,3 kb ja se insertoitiin pLD40:n BamHI:n kohtaan Sau3AI:n osittaisena pilkkomisena.
Plasmidit 25 Plasmidi PLD25 sisältää selektoitavan geneettisen markkerin E. colia ja Y. lipolyticaa varten ja on peräisin E. colissa replikoituvasta plasmidista pBR322:sta, moniko-pioplasmidista. Se konstruoitiin insertoimalla pBR322:n BamHI-kohtaan noin 6,6 kb:n fragmentti, joka on saatu Y. 30 lipolytican kromosomaalisesta DNArsta osittaisella pilkkomisella Sau3A:n avulla. Plasmidi pLD28, pLD25:n subklooni, sisältää myös selektoitavat geneettiset markkerit E. colia ja Y. lipolyticaa varten sekä myös S. cerevisiae'ta varten ja on peräisin Yep24:stä. Se konstruoitiin insertoimalla 35 Yep24:n Sali-kohtaan noin 5,3 kb:n Sali-fragmentti, joka sisältää Y. lipolytican LEU2-geenin.
i4 85987
Plasmidi pLD40, joka myös on pLD25:n subklooni, konstruoitiin insertoimalla pBR322:n EcoRI-kohtaan 2,3 - 2,4 kb:n pLD25:stä EcoRI:llä osittain pilkkomalla saatu fragmentti.
5 Mikro-organismit Käytetyt mikro-organismit olivat E. coli-kanta ja Y. lipolytica-kanta, jotka kannat on identifioitu Pfizer Inc.:n kantakokoelmassa kantoina E. coli JC-355 [Clark et ai., Molec. Gen. Genet. 105, 1 (1969); saatu kantana n:o 10 869 E. coli Genetic Stock Center'istä, Yalen yliopistosta] ja Y. lipolytica PC-30827, vastaavasti. Mainittu Y. lipo-lytica on J. R, Dezeeuw'in hakemuksen n:o 539 363 (jätetty 6. lokakuuta 1983) kohteena. Casadaban et ai. [J. Mol. Biol. 138, ss. 179 - 207 (1980)] esittävät toisen mikro-15 organismin, E. coli MC1061:n, jota on käytetty Y. lipoly-tican geenikirjaston valmistamiseen vektorissa pBR322. Se on erityisen sopiva tähän tarkoitukseen, koska sillä voidaan päästä suureen transformaatiofrekvenssiin. Mainitun E. coli MC1061:n asemesta voidaan käyttää muita mikro-or-20 ganismeja. Sopivien mikro-organismien edustajia ovat E.
coli-kannat, jotka ovat restriktio-miinus, kuten esimerkiksi E. coli HB101 (NRRLB 11371), joka on saatavissa myös ATCC 33694:nä ja joka voidaan tehdä kompententiksi transformaatiota varten.
25 E. coli-kanta, jolla on defektiiviset leusiini- ja urasiiligeenit (DB-6507, ATCC 35673, HB101:n Tn5-insertio-mutantti D. Botstein'ilta) on leuB pyrF74:Tn5 hsdR'M" ja vaatii myös proliinia.
Seuraavat mikro-organismit on talletettu American 30 Type Culture Collection'in, Rockville, Maryland, USA, pysyvään kokoelmaan: ATCC 20688 Yarrowia lipolytica PC-30827 ATCC 20687 Yarrowia lipolytica PC-30827 transformantti pLD25:n kanssa 35 ATCC 39464 Escherichia coli JC-355 transformantti pLD25:n kanssa is 85987 ATCC 20718 Yarrowia lipolytica PC-30827 transformantti pLD55:n kanssa Ne on talletettu Budapestin sopimuksen ehdoilla American Type Culture Collection'iin, Rockville, Maryland, 5 USA, joka on hyväksytty talletuslaitos ja joka tarjoaa talletteiden pysyvyyden ja helpon julkisen saatavuuden, jos patentti hyväksytään tälle hakemukselle. Tämän hakemuksen hakemusaikana talletteita saa Yhdysvaltain Patentti- ja Tavaramerkkiviraston valtuutetun määrittämä henkilö lö, joka on ilmoitettava sinne 37 CFR 1.14:n ja USC 122:n nojalla, ja ulkomaisten patenttilakien mukaisesti niissä maissa, joissa vastaava hakemus tai siitä peräisin oleva hakemus on jätetty. Kaikki talletettujen mikro-organismien julkista saatavuutta koskevat rajoitukset poistuvat pe-15 ruuttamattomasti patentin tultua myönnetyksi.
Y. lipolytican taksonomisen tutkimisen suoritti Dr.
L. H. LuHuang, jolta on saatu alla esitetty kuvaus. Käytetyt alustat ja menetelmät ovat J. Lodder'in teoksessa "The Yeasts", toinen painos, N. Holland Publishing Company, 20 Amsterdam, 1970, suosittelemia.
Vertailun vuoksi käytettiin kantaa CBS-599, joka on tyyppiviljelmä Candida lipolytica-lajille [tunnettu myös Saccharomyces lipolyticana; nykyään Van Der Walt'in ja von Arx'in; Antonie van Leeuwenhoek 46, ss. 517 - 521 (1980) 25 Yarrowia lipolyticaksi (Wickerham et al.) luokittelema].
Koska kanta PC-30827 vaatii leusiinia ja urasiilia (J. R. DeZeeuw), lisättiin sekä leusiinietyyliesteriä että urasiilia pitoisuuksissa 149 mg/1 ja 20 mg/1, vastaavasti, seuraaviin tunnettuihin alustoihin: 30 perusalusta hiiliyhdisteiden assimiloitumista varten; liemialusta kaliumnitraatin assimiloitumista varten; vitamiiniton liemialusta kasvua varten; sekä liemialusta, jolla testattiin vitamiinien vaikutusta kasvun stimulaatiossa.
35 Leusiinisetyyliesteriä leusiiniin verrattuna käytetään hitaasti hiilenlähteenä. Muut alustat olivat luonteeltaan 16 85987 orgaanisia ja ylläpitivät kasvua ilman lisäravinteita. Edellä mainittuja tunnettuja alustoja käytettiin kannalle GBS-599 myös lisäravinteiden kera ja sekä ilman niitä.
Kuten jäljempänä seuraavissa kuvauksissa on osoi-5 tettu, olivat useimmat viljelmä- ja morfologiset ominaisuudet viljelmille yhteisiä. Muutamia poikkeuksia havaittiin: esimerkiksi kannan CBS-599 viljely vetämällä glukoo-si-hiivauute-peptoni-agarille oli hieman karkeapintainen tai hieman poimuttunut, ja kannan PC-30827 viljely hienos-10 ti poimuttunut. Kanta PC-30827 kasvoi huonosti maissijau-hoagarilla ja tuotti vähemmän todellista myseeliä kantaan CBS-599 verrattuna.
Kannalla CBS-599 olivat tulokset, jotka oli saatu tunnetun alustan ollessa täydennetty leusiinietyylieste-15 rillä ja urasiililla, samat kuin ilman täydennyksiä saadut, lukuunottamatta sitä, että sitruunahappo käytettiin hyväksi kun alustaa ei ollut täydennetty, mutta ei silloin kun alusta oli täydennetty. Tämä osoittaa sen, että lisäravinteita ei käytetty hiilen- tai typenlähteiksi; niiden 20 lisääminen kannan PC-30827 tunnettuun alustaan on siten hyväksyttävissä.
Kantaan CBS-599 verrattuna osoitti kanta PC-30827 pikemminkin olemattomasta heikkoon kuin hyvää kasvua meri-pihkahapolla, D-glusitolilla ja glyserolilla; 25 pikemminkin olematonta kuin heikkoa kasvua vitamiinitto-malla alustalla ja salisiinilla; sekä pikemminkin olemattomasta heikkoon kuin hyvää kasvua tiamiinin ollessa kasvun stimulanttina.
Kanta PC-30827 ei kasvanut lainkaan L-sorboosilla, kun 30 taas kannalla CBS-599 tapahtui päinvastoin.
Monet eroavaisuudet biokemiallisissa testeissä kan-: tojen PC-30827 ja CBS-599 välillä olivat luonteeltaan kvantitatiivisia. Mutanttikanta PC-30827 oli useimmissa biokemiallisissa testeissä samanlainen kuin tyyppiviljelmä 35 CBS-599. Kun tuloksia käytettiin Uden'in ja Buckley'n teoksessa "The Yeasts", J. Lodder, (1970), esittämään Can- i7 85987 dida-lajien ratkaisuoppaaseen, luokiteltiin kumpikin kanta Candida lipolytleaksi, joka on Yarrowia lipolytican vaillinainen tila.
Kanta CBS-599 5 Kasvu glukoosi-hilvauute-peptoni-liuoksessa 3 vuorokauden kuluttua 28 °C:ssa solut ovat munanmuotoisia, pidentyneen munanmuotoisista pitkulaisiin, ja niissä on 1-3 tytärsolua. Munanmuotoisten solujen mitat ovat 5 - 1 x 3 - 7 pm; pitkulaiset solut ovat pituudeltaan 10 korkeintaan 30 pm. Pseudomyseeliä on läsnä; pellikkeli on läsnä; sedimenttiä.
Kasvu glukoosi-hiivauute-peptoni-agarilla Kuukauden kuluttua 28 °C:ssa viljelmä on kermamai-nen, kohonnut, hieman karkeapintainen tai hieman poimuttu-15 nut, pinnaltaan himmeä tai kostea.
Dalmau-maljaviljelmät maissijauho-agarilla Kasvu kohtalainen, likaisen valkoinen. Pseudomyseeliä ja todellista septaattimyseeliä on läsnä. Yksi, kaksi tai kolme munanmuotoista blastoporia on muodostunut termi-20 naalisesti tai pleuraalisesti hyyfiin tai pseudohyyfiin, joskus vertikillaattisella tavalla.
Fermentointi
Negatiivinen glukoosilla, galaktoosilla, sakkaroosilla, maltoosilla, trehaloosilla ja laktoosilla.
- 25 Hilllyhdisteiden assimilaatio
Perusalusta (perusalusta sekä leusiinietyyliesteri ja urasiili) glukoosi glukoosi +(+) sitruunahappo +(-) ribitoli -(-) - 30 galaktoosi -(-) liukonen galakti- tärkkelys -(-) toli -(-) L-sorboosi +(+) D-manni- toli +(+) ·.: sakkaroosi -(-) D-ksyloosi -(-) D-glusi- 35 toli + ( + ) maltoosi -(-) L-arabinoosi -(-) salisiini - heikko (- heikko) .···. sellobioosi -(-) D-arabinoosi -(-) DL-maitohappo ·;· 40 heikko ( + ) ie 85987 trehaloosi -(-) D-riboosi heikko (heikko) laktoosi -(-) L-ramnoosi -(-) Alfa-metyyli-D- glykosidi -(-) 5 melibioosi -(-) etanoli +(+) raffinoosi -(-) glyseroli + ( + ) meripihka- happo + (+) meletsitoosi -(-) erytritoli +(+) inositoli -(-) 10
Kallumnitraatin assimilaatio (leusiinietyyliesterin ja urasiilin kera tai ilman niitä): negatiivinen.
Kasvu vitamllnlttomalla alustalla 15 (leusiinietyyliesterin ja urasiilin kera tai ilman niitä): heikko kasvu.
Vitamiinien stimuloima kasvu
Tiamiinialustoissa, joissa on tai ei ole leusiinietyylies-teriä ja urasiilia: stimuloi kasvua.
20 Natriumklorldln sieto: 11 - 12 %.
Kasvun maksimilämpötila: välillä 37 - 45 °C.
Kanta PC-30827
Kasvu glukoosi-hiivauute-peptoni-liuoksessa 3 vuorokauden kuluttua 28 °C:ssa solut ovat munan-25 muotoisia, pidetyneen munanmuotoisia, pitkulaisia, harvoin soikeita, ja niissä on kolme tytärsolua. Munanmuotoisten solujen mitat ovat 5 - 14 x 3 - 6 pm; pitkulaiset solut ovat pituudeltaan korkeintaan 25 pm. Pseudomyseeliä on läsnä; pellikkeli on läsnä; sedimenttiä.
30 Kasvu glukoosi-hiivauute-peptoni-agarilla
Kuukauden kuluttua 28 °C:ssa vetämällä tehty viljelmä on kermamainen, kohonnut, hienosti poimuttunut, pinnaltaan himmeä.
Dalmau-maljaviljelmät maissijauho-agarilla : 35 Kasvu heikko, likaisen valkoinen. Pseudomyseeliä on läsnä; harvassa ja lyhyttä. Todellista septaattimyseeliä on harvoin läsnä. Yksi tai kaksi munanmuotoisesta pallomaiseen blastoporia on muodostunut terminaalisesti tai pleuraalisesti, joskus ryhmissä.
i9 85987
Fermentointi
Negatiivinen glukoosilla, galaktoosilla, sakkaroosilla, maltoosilla, trehaloosilla ja laktoosilla. Hiiliyhdisteiden assimilaatio 5 (perusalusta leusiinietyyliesterin ja urasiilin kera) glukoosi heikkoliukoinen ribitoli galaktoosi - tärkkelys - galaktitoli L-sorboosi - D-ksyloosi - D-mannitoli 10 sakkaroosi - L-arabinoosi - D-glusitoli - heikko maltoosi - D-arabinoosi - salisiini sellobioosi - D-riboosi heikko DL-maitohappo heikko 15 trehaloosi - L-ramnoosi - alfa-metyyli-D- glukosidi laktoosi - etanoli heikko melibioosi - glyseroli - heikko meripihkahappo - heikko 20 raffinoosi - erytritoli + sitruunahappo - meletsitoosi - inositoli
Kaliumnitraatin assimilaatio 25 (leusiinietyyliesterin ja urasiilin kera): negatiivinen. Kasvu vitamiinittomalla alustalla (leusiinietyyliesterin ja urasiilin kera): negatiivinen. Vitamiinien stimuloima kasvu
Tiamiini liemialustassa, jossa on leusiinietyylies-... 30 teriä ja urasiilia, stimuloi heikon kasvun tai ei stimuloi lainkaan kasvua.
Natriumkloridin sieto: 11 - 12 %.
Kasvun maksimilämpötila: välillä 37 - 45 °C.
Y. lipolytica PC-30827 sisältää harvoin revertoi-35 tuvan mutaation leu2-35. Y. lipolytican LEU2-geeni koodit-taa entsyymiä beta-isopropyylimalaattidehydrogenaasi (EC1.1.1.85), jota koodittaa E. colissa leuB-geeni ja S. cerevisiae’ssa LEU2-geeni. pLD25:n insertio sekä E. coli JC-355:een että Y. lipolytica ATCC 20688:aan tuotti trans-’. 40 formantteja, jotka sisälsivät pLD25:n E. coli JC-355:ssä ja Y. lipolytica ATCC 20688:ssa, vastaavasti. Ne on iden-tifioitu Pfizer Inc.:n kantakokoelmassa F.D. 27534:nä ja 20 85987 F.D. 27533:na, vastaavasti. Kumpikin transformantti on talletettu ATCC:hen samanlaisin saatavuusehdoin kuin edellä on esitetty, ja niillä on ATCC:n talletusnumerot ATCC 39464 ja ATCC 20687, vastaavasti.
5 Y. lipolytica-kannasta NRRL Y-1094, villi-tyypin kannasta (eli kannasta, jota alan ammattilaiset tavallisesti käyttävät mikrobiologisissa menetelmissä) peräisin oleva kromosomaalinen DNA saatiin Hereoford et ai.:n [Cell, 18, ss. 1 261 - 1 271 (1979)] menetelmän mukaises-10 ti.
Tämän keksinnön mukainen uusi plasmidi konstruoitiin ligatoimalla linearisoitu pBR322 Sau3A:lla osittain pilkotun Y. lipolytican kromosomaalisen DNA:n kanssa T4-ligaasin avulla. pBR322 eristettiin sentrifugoimalla CsCl-15 etidiumbromidi-gradienteissa kovalenttisesti sulkeutuneen superkiertyneen pBR322:n erottamiseksi bakteeri-DNA:sta. pBR322 linearisoitiin katkaisemalla tetrasykliiniresis-tenssigeenin (TcR) alueelta restriktioendonukleaasilla BamHI, jolloin saatiin lineaarinen fragmentti, jossa oli 20 kohesiiviset (sticky) päät ja johon oli jäänyt ampisillii- niresistenssi (AmpR) fenotyypin piirteenä. Vektorin geeli-(agaroosi-)elektroforeesi osoitti sen olevan pääasiallisesti vapaa bakteeri-DNA:sta. Täten valmistettu linearisoitu pBR322 käsitellään sitten mielellään alkalisella 25 fosfataasilla myöhemmin seuraavan itseligatoitumisen (self-ligation) estämiseksi, eli sen estämiseksi, että vektori-DNA sulkeutuu uudelleen renkaaksi tai muodostaa dimeerin.
pLD25:n toinen komponentti saadaan pilkkomalla Y. 30 lipolytica-kannan NRRL-1094, villi-tyypin kannan kromoso maalinen DNA osittain restriktioendonukleaasi Sau3A:lla, jolla saadaan kohesiiviset päät sisältäviä, melkein umpimähkäisiä fragmentteja, jotka ovat komplementaarisia BamHI:llä pilkotuille pBR322-fragmenteille. Alueen 4-10 35 kb DNA, joka oli otettu talteen agaroosigeeleistä, puhdistettiin tunnetuin menetelmin ennen ligatoimista BamHI:llä 2i 85987 pilkottuun, alkalisella fosfataasilla käsiteltyyn vektoriin pBR322.
DNA-fragmenttien koko ei ole kriittinen tämän keksinnön mukaisille menetelmille. Mainituissa DNA-fragmen-5 teissä on kriittistä se, että ne sisältävät kokonaisen detektoituvan markkerin, esim. LEU2-geenin tai riittävän osan siitä. Niiden täytyy lisäksi sisältää kohesiiviset päät, jotka ovat komplementaarisia niille fragmenteille, jotka on saatu pilkkomalla restriktioendonukleaasilla E. 10 coli-plasmidi, tässä tapauksessa pBR322.
Vektori-DNA ja Sau3A:lla osittain pilkottu Y. lipo-lytican kromosomaalinen DNA ligatoidaan T4-ligaasin avulla adenosiinitrifosfaatin (ATP) ollessa läsnä kofaktorina.
Ligaatioseos transformoidaan ensiksi E. coli MC 15 1061:een [Casbadan et ai., J. Mol. Biol. 138, ss. 179 - 207 (1980)], E. coli-kantaan, jolla saadaan erittäin suuri transformaatiofrekvenssi ja joka on hsdR" hsdM+, ja tuloksena saadaan Y. lipolytican geenipankki mainitussa E. co-lissa. E. coli MC-1061:n kaikki, mahdollisesti erilaiset 20 ampisilliiniresistentit transformantit kasvatettiin yhdessä L-agarmaljoilla, joissa oli ampisilliinia, ja otettiin talteen. Talteen otettua viljelmää kasvatettiin 1 litrassa ampisilliiniä sisältävää alustaa. Seoksen plasmidit eris-. . tettiin standardimenetelmin geenipankin valmistamista var- • 25 ten. Näyte mainitusta pankista transformoitiin E. coli JC-355:een. Transformantit valikoitiin ampisilliiniresis-tenssin perusteella. Nämä transformantit replika-maljättiin seuraavaksi synteettiselle alustalle, jossa ei ollut leusiinia. Transformointiseos voitiin vaihtoehtoisesti :: 30 maljata suoraan synteettiselle alustalle, jossa ei ollut leusiinia ja joka sisälsi ampisilliiniä. Useat täten valitut transformantit olivat leusiiniprototrofisia. Mainituissa transformanteissa oleva plasmidi eristettiin standardimenetelmin, ja siitä käytetään nimitystä pLD25.
35 Plasmidien minipreparaattien, jotka oli valmistettu harvinaisista leusiini-prototrofisistä transformanteista 22 85987 ja jotka oli analysoitu pilkkomalla HindIII:lla ja Sall:llä, havaittiin sisältävän odotetun 3,7 kb:n, pBR322:sta peräisin olevan fragmentin ja 2 suurta fragmenttia, jotka osoittavat insertin kokoa noin 6,6 kb. Li-5 säksi löydettiin pieni fragmentti [pBR322:n Sali-kohdasta insertin lähimpään Sali-kohtaan (katso kuvio 3)]. Plasmidi pLD25:n Southern blot-hybridisaatioiden [J. Southern, Mol. Biol. 98, ss. 503 - 517 (1975)] vertailu Y. lipolytican EcoRI:llä pilkotun kromosomaalisen DNA:n hybridisaatioihin 10 osoitti kloonatun insertin sisällä olevien kolmen fragmentin olevan identtisiä kromosomaalisessa DNArssa.
Y. lipolytican transformantit koskemattoman pLD25:n kanssa ja Kpnl:llä pilkotun pLD25:n kanssa testattiin sen määrittämiseksi, sisältävätkö ne integroitunutta vai itse-15 näisesti replikoituvaa pLD25:ttä (LEU2:a sisältävä plasmidi). Kromosomaalinen DNA valmistettiin leusiini-prototro-fisistä transformanteista ja lähtökannasta Y. lipolytica ATCC 20688. DNA-näytteet pilkottiin HindIII:lla, ajettiin 0,5-%:isella agaroosigeelillä ja analysoitiin Southern 20 blot-menetelmällä käyttämällä radioaktiivista pBR322:a plasmidi pLD25:n läsnäolon mittaamiseksi näytteissä.
Y. lipolytica-lähtökannan ja koettimen välillä ei havaittu homologiaa. Koska pLD25:ssä on yksi HindiII-kohta (pBR322-segmentin alueella) ja Y. lipolytica-segmentissä ei ole 25 yhtään, nähtäisiin yksi pLD25:n koon vyöhyke (noin 11 kb), jos pLD25 replikoituisi itsenäisesti transformanteissa. Tällaisen vyöhykkeen puuttuminen johtaa päätelmään, että transformantit ovat kaikki integrantteja. Rengasmaiset, linearisoidut ja katkolinearisoidut plasmidit voivat : 30 transformoida Y. lipolytican rekombinoitumalla homologisten kromosomaalisten sekvenssien kanssa. Transformanttien frekvenssi oli kuitenkin paljon suurempi Kpnlrllä pilkotulla plasmidilla käsitellyissä soluissa kuin koskemattomalla plasmidilla käsitellyissä soluissa, mikä osoittaa 35 edelleen sen, että integroiva transformaatio, kuten Orr-Weawer et ai. ovat kuvanneet S. cerevisiae'lie [Proc.
23 85987
Natl. Sei. 78, ss. 6 354 - 6 358 (1981)], tapahtui myös Y. lipolyticalle. Edellä mainitut Southern blot-tulokset osoittavat, että lineaarisista molekyyleistä peräisin olevien integroituneiden transformanttien rakenne käyttäytyy 5 samalla tavalla kuin rengasmaisista molekyyleistä (eli plasmideista) peräisin olevien. Muut Southern blot-kokeet ovat osoittaneet, että joiltakin harvinaisilta transfor-manteilta, jotka on saatu käsittelyistä koskemattomalla plasmidilla, puuttuu pBR322-hybridisoituva aines ja että 10 ne muodostuvat mahdollisesti geenikonversion tai kaksois-rekombinaation seurauksena.
Tässä esitetyn transformointijärjestelmän käyttökelpoisuutta osoittaa mainitussa transformointijärjestel-mässä kuvattujen integroivien plasmidien sukkulointi Y.
15 lipolyticasta E. coliin syklin täyttymiseksi. Integroivat sukkulavektorit tekevät lisäksi mahdolliseksi haluttujen Y. lipolytica-geenien kloonauksen geenipankkien konstruoinnilla ja sen jälkeisellä selektiolla tai skreenauksella Y. lipolytica-resipientissä.
20 Materiaalit ja menetelmät
Useimmat restriktioentsyymit, joihin kuuluvat BamHI, Sali, Bglll, Hindlll ja Sau3A, sekä myös T4-DNA-ligaasi ja E. coli-polymeraasi I oli saatu New England . . Biolabs'ilta (NEB). Apal oli saatu Boehringer-Mann- 25 heim'lta. Kaikkia entsyymejä käytettiin vastaavien valmistajien esittämissä käyttöolosuhteissa. Sali oli myös saatu Betsheda Research Laboratories'lta (BRL), josta oli saatu myös bakteriaalinen alkalinen fosfataasi, Kpnl ja Xhol. Bakteriaalista alkalista fosfataasia käytettiin noin 100 30 yksikköä per mikrogramma linearisoitua plasmidi-DBA:ta 65 °C:ssa BamHI:n määrityspuskurissa, vaikutusajan ollessa 2 tuntia. Restriktioentsyymeillä saadut pilkkoutumistuotteet analysoitiin elektroforeettisesti nesteessä olevissa 0,8-%:isissä agaroosigeeleissä käyttäen Tris-boraatti-EDTA-35 puskuria [Maniatis et ai., "Molecular Cloning", Gold Spring Harbor Laboratory, N. Y., USA (1982)].
24 85987
Kasvatusalustat E. colin rikas alusta oli L-liemi, joka sisälsi litraa kohden 10 g Bacto-tryptonia, 5 g Bacto-hiivauutet-ta ja 5 g NaCl:a, ja jonka pH oli säädetty arvoon 7,5. E.
5 colin minimialussa oli 56 suolaa ja 0,33 % glukoosia [Low; J. Bacteriol. 113, ss. 798 - 812 (19739]. Tarvittaessa lisättiin aminohappoja tai emäksiä 50 pg/ml. Bakteerit kasvatettiin 37 °C:ssa.
Hiivan rikas alusta oli YPD, joka sisälsi 1 % Bac-10 to-hiivauutetta, 2 % Bacto-peptonia ja 2 % glukoosia. Hiivan minimialusta, SD, sisälsi 0,67 % Bacto-hiivan typpi-emästä ilman aminohappoja ja 2 % glukoosia. Synteettinen täydellinen alusta sisälsi 870 mg/1 jauhettua kantaseosta, joka oli valmistettu hienontamalla huhmareessa yhteen seu-15 raavat aineet: adeniinisulfaattia, urasiilia, tryptofaa-nia, histidiini-HCl:a, arginiini-HCl:a ja metioniinia 2 g kutakin, 3 g tyrosiinia, 6 g leusiinia, 5 g fenyylialanii-nia, 20 g treoniinia ja 3 g lysiiniä. Ravinnetestiä tai selektiota varten jätettiin kyseessä oleva aine pois täy-20 dellisestä alustasta. Y. lipolytica kasvatettiin 28 °C:ssa.
Y. lipolytican kromosomaalisen DNA:n eristäminen
a) Kloonauslaatuinen DNA
Villi-tyypin kantaa NRRL Y-1094 kasvatettiin 28 °C:ssa solutiheyteen 1 - 2 x 10® solua per ml 4 x 300 25 ml:ssa YPD:ä Fernbach'in ravistelupulloissa ymppäämällä tuoretta stationäärivaiheen viljelmää 15 mikrolitraa. Kaikki seuraavat solujen käsittelyt suoritettiin 28 °C:ssa tai huoneen lämpötilassa. Solut otettiin talteen sentrifu-goimalla, pestiin 50 ml:lla 1 M NaCl:a ja sentrifugoitiin 30 uudelleen. Tämän jälkeen suoritettiin 15 minuutin inku-bointi ennen sferoplastien muodostumista 50 ml:ssa liuosta, jossa oli 0,2 M tris(hydroksimetyyli)aminometaani-HC1:a (Tris-HCl) (pH 8,5), 0,02 M etyleenidiamiinitetra-etikkahappoa (EDTA), 1 M NaCl:a ja 0,1 M 2-merkaptoetano-35 lia, minkä jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimal-la. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 40 ml:aan 1 M
25 85987
NaCl:a, jossa oli 1 mg/ml Zymoaasi 5 000:ta (Kirin Breweries, Japani), ja inkuboitiin 45 minuuttia. Tässä ajassa yli 90 % soluista muuttui sferoplasteiksi, mikä havaittiin mikroskoopin avulla, kun solut laimennettiin vedellä.
5 Sferoplastit erotettiin sentrifugoimalla ja suspen- doitiin uudelleen 4:ään putkeen 16 ml:n kokonaismäärään 1 M NaClra. 40 ml lyysis-puskuria [50 mM Tris (pH 6,8), 100 mM NaCl, 100 mM EDTA ja 0,5 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS), jossa oli 0,1 mg/ml proteinaasi K:ta] lisättiin ja 10 lysaattia inkuboitiin 37 °C:ssa 1,5 tuntia. Lysaatti uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenoli/kloroformia (1:1). Faasit erotettiin sentrifugoimalla 9 000 rpm:n kierrosno-peudella, jonka jälkeen vesifaasi uutettiin uudelleen fe-noli/kloroformilla. Viimeinen vesifaasi sekoitettiin 2 ti-15 lavuusosaan etanolia, jolloin saatiin DNA:n suuria saostumia. Neste kaadettiin pois ja pelletti huuhdeltiin 70-%:isella ja 10-%:isella etanolilla ennen tyhjökuivausta. Kuivattu pelletti liuotettiin uudelleen 8 ml:aan TE:tä [10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA] 65 °C:ssa ja pilkottiin sit-20 ten RNA:silla käyttäen 300 mikrolitraa RNAasi A:ta (1 mg/-ml, keitetty 5 minuuttia) 1 tunti 37 °C:ssa. Materiaali uutettiin kahdesti fenoli/kloroformilla ja seostettiin etanolilla, kuten edellä on esitetty. Viimeinen saostuma huuhdeltiin eetterillä ennen tyhjökuivausta.
25 DNA-pelletti liuotettiin uudelleen TE:hen kuten edellä ja lisättiin 200 ml 100 x TE:tä ja sen jälkeen vettä, jonka jälkeen paino oli 29,04 g. Liuos lisättiin 37,67 graan CsCl:a, siirrettiin sentrifugiputkiin ja sentrifu-goitiin 17 tuntia kierrosnopeudella 40 000 rpm 15 °C:ssa 30 Beckam 18-70 ultrasentrifuugissa Vti 50-roottorilla. Gra-dientti otettiin talteen valuttamalla fraktiot, joissa oli noin 1,25 ml, putken pohjan kautta, johon oli ensin tehty neulalla reikä. Fraktioiden DNA määritettiin ajamalla näytteet agaroosigeelillä, jossa oli 0,5 pg/ml etidiumbro-35 midia, ja fraktiot 16, 17 ja 18 (26:sta fraktiosta) säästettiin. Nämä DNA:ta sisältävät fraktiot yhdistettiin, 26 85987 dialysoitiin 4 kertaa vaihdettua 1 x TE:tä vastaan ja seostettiin etanolilla. DNA liuotettiin uudelleen 0,6 ml:aan 1 x TE:tä ja preparaation arvioitiin sisältävän 129 mikrogrammaa DNA:ta, mittaamalla absorbanssi aallonpituu-5 della 260 nm.
b) DNA Southern blot-kokelta varten
Havaittiin, että SDS-sferoplastilyysi ja kalium-asetaattikäsittely S. cerevisiaen mini-prep-menetelmästä [esitetty teoksessa Sherman et ai., "Methods in Yeast Ge-10 netics", Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., USA (1981)] oli sopiva Y. lipolytican DNA:n saamiseksi.
Plasmldi-DNA:n valmistaminen
Bakteriaalinen plasmidi-DNA preparoitiin Holmes et ai.:n [Anal. Biochem. 114, ss. 193 - 197 (1981)] nopea 15 kiehutus-menetelmällä. Tätä seuraava sentrifugointi CsCl- etidiumbromidigradienteissa suoritettiin vain suuressa preparointimittakaavassa. DNA-preparaatit säilytettiin 4 °C:ssa steriilissä TE-puskurissa.
E. colin transformaatio 20 Käytettiin Dagert et al.:n [Gene 6, ss. 23 - 28 (1979)] CaCl2-menetelmää. Sekä yön yli CaCl2:lla käsitellyt että lyhyesti käsitellyt solut käytettiin transformaatioihin.
Southern blot-kokeet 25 Nitroselluloosaan siirretty DNA (Southern 1975) hybridisoitiin 32P-leimattuihin nick-translatoituihin koet-timiin 6 x SCP-puskurissa (20 x SCP-kantaliuos sisältää 2,0 M NaCl, 0,6 M Na2HP04 ja 0,2 M EDTA, pH 6,2), jossa oli 1 % sakkarolyysiä ja 40 pg/ml denaturoitua vasikan kateen-30 korvan tai E. colin DNA:ta. Maniatis et ai.:n nick-trans-laatiomenetelmää käytettiin E. coli polymeraasi I:n kanssa.
Y. lipolytican DNA:n osittainen pilkkominen
Sau3A:lla 35 Noin 15 mikrogrammaa tätä DNA:ta pilkottiin osit tain restriktioentsyymillä Sau3A (New England Biolabs) 27 8 5987 neljässä putkessa, joissa oli 0,05, 0,1, 0,2 ja 0,4 ent-syymiyksikköä per mikrogramma DNA:ta, 0,5 tuntia 37 °C:ssa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaktiot pysäytettiin kuumentamalla 65 °C:ssa 10 minuuttia, jonka jälkeen näyt-5 teet siirrettiin 0,8-%:iselle preparatiiviselle agaroosi-geelille. DNA, jonka kokoalue oli 4-10 kiloemästä (verrattuna HindIII:lla pilkottuihin lambda-kokostandardeihin, saatu Betsheda Researh Laboratories'1ta), otettiin geelistä talteen, elektroeluoitiin, puhdistettiin DE52-pylväissä 10 [Yang et ai., Methods in Enzymology 68, s. 176 (1979)] ja saostettiin etanolilla ennen ligatoimista BamHIrllä pilkotun, alkalisella fosfataasilla käsitellyn vektorin pBR322 kanssa.
Y. lipolytican geenipankin konstruointi vektorissa 15 pBR322
Ligaatioseosta, joka sisälsi noin 1 pg DNA:ta, käytettiin E. coli-kannan MC-1061 [Casabada et ai, J. Mol. Biol. 138, ss. 179 - 207 (1980)] transformointiin Y. lipolytican geenipankin valmistamiseksi. Transformointiseok-20 sella saatiin noin 1,4 x 104 pesäkettä 10 mg/ml ampisillii-niä sekä L-agaria sisältävillä maljoilla. Viisikymmentä pesäkettä siirrostettiin yhdelle maljalle ja replika-mal-jattiin resistenssin määrittämiseksi 5 mg/ml tetrasykliini suhteen. Neljäkymmentäneljä (88 %) oli sensitiivistä, ; 25 mikä osoittaa sen, että ne mitä todennäköisimmin sisälsivät pBR322:n tetR-geenin keskeyttävän insertin BamHI-kohdassa. 18 umpimähkään valitusta ampR-pesäkkeestä saadut miniskaalan plasmidipreparaatit tutkittiin pilkkomalla restriktioentsyymillä kahden restriktioentsyymin, 30 HindIII:n ja Sali:n järjestelmää sekä BamHI:ä käyttäen. Plasmideista kymmenen sisälsi inserttejä, joiden koko oli keskimäärin 7 kiloemästä.
Neljäkymmentäneljä ampisilliinimaljaa, jotka sisälsivät keskimäärin 1,4 x 104 E. coli-transformanttipesäket-- 35 tä, replika-maljattiin LB ja 10 pg/ml ampisilliini-alus-talle. Replikat pestiin kukin 5 ml:11a 0,85-%:ista NaCl:a.
28 85987
Yhdistetyt solut sentrifugoitiin pelleteiksi ja suspendoi-tiin uudelleen 11 ml:aan LB:tä ja 2,5 ml:aan 80-%:ista glyserolia. Kaksi viljelmää, joissa oli 1 litra LB:tä ja 10 pg/ml ampisilliinia Fernbach'in pulloissa, kasvatettiin 5 siirrostamalla kumpikin 4 ml:11a yhdistettyä bakteeriseos-ta, ja loput bakteerit säilytettiin -70 °C:ssa. Viljelmiä käytettiin plasmidi-DNA:n valmistamiseen ja tämä plasmidi-DNA muodosti Y. lipolytican Sau3A:lla osittain pilkkomalla saatujen fragmenttien geenipankin pBR322:ssa.
10 Geenipankin seulonta E. coll-mutantelssa
Useita E. coli-kantoja, jotka olivat mutantteja erilaisille geneettisille markkereille, transformoitiin geenipankilla. Geneettisen komplementaarion saavuttamiseksi on kaksi tekijää välttämätöntä: 15 (1) vastaavan Y. lipolytican geenin täytyy sisältyä koske mattomana vähintään yhteen pankissa olevaan plasmidiin; (2) Y. lipolytican geenin on toimittava riittävässä määrin E. coli-soluissa.
Pankki seulottiin sekä suoraan selektoimalla kunkin 20 markkerin suhteen sopivalla alustalla että myös selektoimalla aluksi ampisilliiniresistenssin suhteen ja seuraa-vaksi replika-maljäämällä selektiiviselle alustalle. Kullekin tutkitulle geneettiselle markkerille tutkittiin vähintään 105 transformanttia. Kantaa JC355 käytettiin menes-25 tyksekkäästi LEU2-geenin kloonaukseen.
Jokainen selektiivisellä alustalla kasvava E. coli-pesäke tutkittiin edelleen "retransformaatio"-kokeella. Tätä testiä varten valmistettiin plasmidi 5 ml:sta selektiivisellä alustalla kasvavan kannan viljelmästä. Plasmi-30 din minipreparaattia käytettiin sitten transformoimaan tämä mutantti-E. coli-lähtökanta. Se seikka, että useita ampisilliiniresistenttejä transformantteja, mutta vain muutamia tai ei yhtään pesäkkeitä oli selektiivisellä alustalla, johti päätelmään, että alkuperäinen pesäke ei 35 sisältänyt haluttua Y. lipolytica-geeniä ja että kasvu ···. johtui todennäköisemmin mutatoitumisesta prototrofiseksi.
29 8 5 987
Mikäli kaikki ampisilliiniresistentit pesäkkeet kasvoivat myös testattavalle geenille selektiivisellä alustalla, pääteltiin, että alkuperäisestä pesäkkeestä saatu plasmidi sisälsi E. coli-mutaation kanssa komplementoituvan inser-5 tin. Kaiken kaikkiaan löydettiin 7 JC-355:n leusiinista riippumatonta transformanttia (leuB6), jotka sisälsivät pBR322:lle identtisen insertin. Näistä pesäkkeistä valmistetuilla plasmidin minipreparaateilla kahdesta saatiin 100-%:isen (37/37 ja 31/31) ampisilliiniresistenttejä leu-10 siini-prototrofisia transformantteja retransformaatioko-keessa. Plasmidi nimettiin pLD25:ksi.
Sen varmistaminen, että E. coli leuB6:tta komple-mentoiva DNA on peräisin Y. lipolyticasta Southern blot-koe (Southern 1975) suoritettiin sen 15 varmistamiseksi, että pLD25:stä saatu insertti DNA oli peräisin Y. lipolyticasta. Tehtiin uusi Y. lipolytican ko-konais-DNA-preparaatti, mutta viimeinen CsCl-gradientti-vaihe jätettiin pois. Y. lipolytica-DNA:n pilkkoutumismal-li EcoRI:llä paljasti samanlaisuuden pLD25:ssä olevan in-20 sertin sisällä olevien kolmen vyöhykkeen kanssa (kuvio 2).
pLD25:ssä olevan Insertin muut karakterisoinnit pLD25:n osittainen restriktiokartta saatiin käyttämällä useita tavallisia entsyymejä (kuvio 3). Plasmidissa olevan Y. lipolytican DNA:n kokonaismäärän arvioitiin ole-25 van noin 6,6 kb.
Transformaatiomenetelmä Y. lipolytican transformointiin sovellettiin modifioitua litiumasetaattimenetelmää [Ito et ai., J. Bacte-riol. 153, ss. 163 - 168 (1983)], jossa käytettiin S. ce-30 reviciae'n transformointiin käytettyä ultraäänikäsiteltyä kantaja-DNA:ta. Myöhäisen log-vaiheen viljelmistä (3-10 x 107 solua/ml) saatiin tavallisesti enemmän transformantteja kuin log-vaiheen viljelmistä (1 x 107 solua/ml). 50 ml YPD-viljelmiä sentrifugoitiin pelleteiksi ja suspendoi-35 tiin uudelleen sitten 10 ml:aan liuosta, jossa oli 10 mM Tris:ä ja 1 mM EDTA:a (pH 7,5). Ne sentrifugoitiin uudel- 3o 85987 leen pelleteiksi ja suspendoitiin uudelleen 2-3 tila-vuusosaan yllä esitettyä puskuria, jossa oli 0,1 M litiura-asetaattia, ja sekoitettiin varovasti New Brunswick'in roller drum-sekoittimella 28 °C:ssa 1 tunti. Li-käsitellyt 5 solut erotettiin useisiin transformointiputkiin, joissa oli välillä 0,1 ja 1,0 ml soluja, 1 pg transformoivaa plasmidia ja 50 pg ultraäänikäsiteltyä heterologista kanta ja-DNA: ta (kokoalue oli 0,5 - 9 kb agaroosigeelillä). Transformointiputkien annettiin olla 28 °C:ssa 30 minuuttia 10 ja sen jälkeen lisättiin 7 tilavuusosaa PEG-reagenssia (40 % polyetyleeniglykoli 4 000:tta, 0,1 M LiAc:a, 10 mM Trisrä ja 1 mM EDTA, pH 7,5, steriloitu suodattamalla). Pidettiin vielä 1 tunti 28 °C:ssa, jonka jälkeen annettiin kuumennusisku (tavallisesti 37 °C, 5 minuuttia). Solut 15 sentrifugoitiin lopuksi kierrosnopeudella 3 000 rpm 2 minuuttia, suspendoitiin uudelleen veteen ja maljättiin sopivalle alustalle.
pLD28:n konstruointi
Seosta, jossa oli pLD25:ttä ja YEp24:ä (ATCC 20 37051) 2 pg kumpaakin, inkuboitiin 37 °C:ssa 1,5 tuntia
6,25 yksikön Sall:ä 50 pl:ssa Sali-puskuria kanssa. Pilkottu seos uutettiin sitten yhtä suurella tilavuudella fenolia ja sen sen jälkeen 3 kertaa eetterillä (1,5 ml). DNA saostettiin lisäämällä riittävästi natriumkloridia ja 25 absoluuttista etanolia, jotta saatiin pitoisuudet 0,1 M
natriumkloridia ja 70 % etanolia. DNA eristettiin ja liuotettiin samansuuruiseen tilavuuteen TE-puskuria. 10 pl DNA-liuosta käsiteltiin sitten T4-DNA-ligaasilla 20 pl:n reaktiotilavuudessa 1 tunti 14 °C:ssa. Halutun rekombinant-30 tiplasmidin selektio suoritettiin transformoimalla E. coli DB-6507 seuraavien menetelmien mukaisesti.
Transformaatioseos maljattiin 11:lie E. colin synteettisen alustan maljalle, joka sisälsi treoliinia, pro-liinia ja leusiinia, mutta josta puuttui urasiili. Saatiin 35 100 pesäkettä per malja. Tuloksena saadut transformantit replika-maljättiin leusiinittomille maljoille Y. lipolyti- 3i 85987 can LEU2-geenin läsnäolon testaamiseksi kussakin plasmi-dissa. Ne pesäkkeet, jotka kasvoivat hitaasti ilman lisättyä leusiinia, hajotettiin yksittäispesäkkeiksi vetämällä ampisilliinimaljoille ja testattiin tetrasykliiniherkkyy-5 den suhteen. Kaksikymmentäneljä pesäkettä, jotka olivat ampisilliiniresistenttejä, tetrasykliiniherkkiä, käytettiin miniplasmidipreparaatteihin. Plasmidi-DNA-preparaatit analysoitiin pilkkomalla Sällillä kahden odotetun vyöhykkeen (7,5 kb YEp24:stä ja 5,3 kb LEU2:sta) saamiseksi ja 10 EcoRI:llä 5:n odotetun vyöhykkeen saamiseksi (kuvio 6).
Kahdella plasmidilla oli sopiva pilkkoutumismalli. Ensimmäinen plasmidi otettiin talteen ja nimettiin pLD28:ksi.
Pienemmän LEU2-geenin segmentin kuin joko pLD25;ssä tai pLD28:ssa sisältävän pLD40-plasmidin konst-15 ruointi pLD25:n osittainen pilkkominen EcoRI:llä suoritettiin käsittelemällä noin 25 mikrogrammaa pLD25:tä 20 yksiköllä restriktioentsyymiä 200 mikrolitrassa ja ottamalla 9, 12, 15, 18 ja 21 minuutin liuosnäytteet. Kunakin ajan-20 kohtana asetettiin 20 % kokonaistilavuudesta geelin näyte-puskuriin, joka sisälsi 33 mM EDTA:a (laimennuksen jälkeen) reaktion pysäyttämiseksi. Aikanäytteet ajettiin geelissä, ja haluttu vyöhyke (joka liikkui hieman hitaammin kuin 2,3 kb:n lambda-Hindlll-kokostandardi) irrotettiin 25 partakoneen terällä. Vyöhyke elektroeluoitiin dialyysipus-sissa ja puhdistettiin minipylväässä (Schleicher ja Schilll, Elutip-D) valmistajan ohjeiden mukaisesti. LEU2:n sisältävän vyöhykkeen kloonaukseen käytetty vektori oli EcoRI:llä pilkottu ja bakteriaalisella alkalisella fosfa-30 taasilla käsitelty pBR322. Vektori ja insertti-DNA liitettiin yhteen T4-DNA-ligaasilla ja saatua seosta käytettiin E. coli-kannan MC-1061 transformoimiseksi ampisilliinire-sistentiksi. Plasmidin minipreparaatit tutkittiin pilkkomalla EcoRI-restriktioendonukleaasilla. Neljä 34:stä en-35 simmäisestä preparaatista sisälsi halutun insertin. In-serttien orientoituminen oli kuten pLD40:ssä (kuvio 7), ja 32 85987 yhdessä oli käänteinen orientoituminen. Tämä nimettiin pLD41:ksi. Nämä kaksi plasmidia transformoitiin E. coli JC-355:een (sen jälkeen, kun suuren mittakaavan preparaatit oli tehty MC1061:ssä) Y. lipolytican LEU2-geenin il-5 mentymisen testaamiseksi. pLD40:ä sisältävä transformantti kasvoi yllättävästi erittäin hyvin alustalla, josta puuttui leusiini (paremmin kuin pLD25:n tai pLD28:n sisältävät transformantit), mutta pLD41:tä sisältävä transformantti ei kasvanut ilman lisättyä leusiinia. Tässä kokeessa käy-10 tetty täydellinen bakteerin alusta sisälsi 56/2:ta sekä Bl-vitamiinia, glukoosia, histidiiniä, arginiinia, metio-niinia, leusiinia ja 20 mikrogrammaa/ml ampisilliiniä. Pääteltiin, että LEU2-geenin transkriptiossa pLD40:ssä toimi promoottorina vastapäivään toimiva promoottori Pl, 15 jonka ovat kuvanneet D. Stuber ja H. Bujard [(1981), Proc. Natl. Acad. Sei, 78, ss. 167 - 171]. On mahdollista, että Y. lipolytican LEU2-geenin bakteriaalisen ilmenemisen alhaisempi taso pLD25:ssä ja pLD28:ssa (verrattuna pLD40:een) johtuu heikkona bakteriaalisena promoottorina 20 toimivasta Y. lipolytican DNA-segmentistä.
Y. lipolytica leu2-mutantin transformointl pLD25:n kanssa J. R. DeZeeuw'in konstruoimaa Y. lipolytica-kantaa PC-30827 (MATA leu2-35 ura3-ll) ATCC 20688, käytettiin 25 pLD25:ssä kloonatun LEU2-geenin resipienttinä. Havaittiin, että kasvun myöhemmissä vaiheissa olevista viljelmistä saatiin enemmän transformantteja kuin varhaisen log-vai-heen soluista. Tämä havainto piti paikkansa jopa silloin, kun noin yhtä suuret lukumäärät varhaisen vs. myöhäisen 30 log-vaiheen soluja käsiteltiin DNA:11a ja maljattiin leusiini ttomille maljoille. Plasmideilla, jotka oli lineari-soitu joko uniikista resktriktiokohdasta tai jättämällä pieni väli (BglII-katkaisu) Y. lipolytican DNA:han, saatiin paljon enemmän transformantteja kuin koskemattomalla 35 pLD25:llä tai plasmidilla, joka oli linearisoitu katkaisemalla HindiII-restriktiokohdasta pBR322:ssa. Nämä jälkim- 33 8 5 9 8 7 mäiset tulokset ovat samanlaisia kuin Orr-Weawer et ai.:n (loc. cit.) kehittämällä integroituvalla transformointi-järjestelmällä S. cerevisiae'ssa. Ultraäänikäsitellyn E. coli-DNA:n lisääminen transformoimassa käytettyyn 5 pLD25:een tuotti tuloksena useampia transformantteja kuin joko suurimolekyylistä kantaja-DNA:ta lisättäessä tai kun sitä ei lisätä lainkaan. Solujen inkubointia DNA:n ja po-lyetyleeniglykolin kanssa seuraavan kuumennusiskun kestossa ja lämpötilassa tapahtuneilla vähäisillä muutoksilla 10 näyttää olevan vain pieni vaikutus transformanttisaantoon.
Transformanttien stabiilisuus pLD25:n Y. lipolytica ATCC 20687:ssä sisältävän transformantin, jota tässä kutsutaan DL10:ksi, pesäke, joka oli kasvanut ei-selektiivisesti YPD-maljalla, levi-15 tettiin vetämällä YPD-maljalle erillispesäkkeiden saamiseksi. Saatu YPD-viljelymalja replika-maljättiin leusii-nittomalle synteettiselle alustalle. Kaikki noin 50 hyvin erillään olevaa pesäkettä olivat leusiinista riippumattomia, mikä osoittaa transformanttien stabiilisuutta.
20 Southern blot-koe pLD25:n intergoitumisen detektoi- miseksi Y. lipolytica-transformantit olivat pysyviä ja transformaatiofrakvenssi suureni huomattavasti, kun dono-riplasmidin DNA linearisoitiin. Tämä osoitti sen, että ' 25 transformantit olivat muodostuneet plasmidin integroidut tua kromosomaaliseen DNA:hän donori-DNA:n päille homologiseen kohtaan, kuten on havaittu Orr-Weawer et ai.:n (loc. cit.) mukaisessa S. cerevisiae-järjestelmässä. HindIII:lla pilkotulle Y. lipolytican DNA:lie suoritettu Southern V 30 blot-koe osoitti samat kaksi pBR322:lle homologista vyöhykettä transformanteissa, jotka oli saatu joko koskemattomasta tai linearisoidusta plasmidista. Havainto, että yksi vyöhyke oli suurempi kuin 23 kiloemäksen lambda-kokostan-dardi, osoittaa plasmidin intergoituneen kromosomaaliseen 35 DNA:hän.
34 8 5 9 8 7 Y. lipolytican HIS-geenin kloonaus
Geenipankin konstruointi
Vektori YEp24 [Botstein et ai., Gene 8, ss. 17 - 24 (1979)] pilkottiin BamHI:llä ja käsiteltiin alkalisella 5 fosfataasilla kuten edellä on kuvattu pBR322:lle. Ligatoi-tumisreaktioon käytetty insertti-DNA oli saatu pilkkomalla Y. lipolytican kromosomaalinen DNA, joka oli saatu Y. li-polytica NRRL Y-1094:stä kuten edellä on kuvattu, täydellisesti BamHI:llä. Pilkottua kromosomaalista DNA:ta ei 10 fraktioitu koon perusteella ennen ligatointia, se uutettiin vain fenolilla. Ligaatiotuotteita käyttäen saatiin kaiken kaikkiaan noin 27 000 E. coli-kannan MC-1061 ampi-silliiniresistenttiä transformanttipesäkettä. Näistä yhdistetyistä transformanttipesäkkeiden viljelmistä saatu 15 plasmidi-DNA nimettiin Y. lipolytican BamHI-fragmenttien pankiksi YEp24:ssä. Inserttifrakvenssiksi arvioitiin 94 % (19/20 transformanttia oli tetrasykliiniherkkiä) ja in-sertin keskimääräiseksi kooksi 4,2 kb.
HISl-geenin eristäminen 20 BamHI-pankkia käytettiin transformoimaan monia eri laisia E. colin auksotrofeja pyrittäessä löytämään sellainen Y. lipolytican geeni, joka komplementoituisi mutantti E. coli-geenin kanssa. Kaksi E. coli hisCl-mutantin AT2535 (saatu # 4517:nä E. coli Genetic Stock Center'istä, Yalen 25 yliopistosta) transformointipesäkettä eristettiin synteet tiseltä alustalta, josta puuttui histidiini ja joka sisälsi ampisilliiniä. Kumpikin pesäke sisälsi saman plasmidin pLD21, joka koostui noin 4 kb:n insertistä vektorissa. Retransformaatiokoe oli positiivinen 419/419 ampisilliini-30 resitentillä AT2535-transformantilla pLD21:n kanssa, jotka osoitettiin histidiinistä riippumattomiksi replika-mal-jauksella. Southern-hybridisaatiokoe osoitti, että BamHI-insertti pLD21:ssä samoin kuin kahdella entsyymillä, BamHI:llä ja EcoRl:llä kaksoispilkkomalla saadut kaksi - 35 inserttifragmenttia liikkuivat yhdessä samalla tavalla pilkottujen Y. lipolytican kromosomaalisen DNA:n frag- 35 85987 menttien kanssa.
Sen testaamiseksi, voitaisiinko muita HisG:n allee-leja komplementoida pLD21:llä, transformoitiin E. coli kanta NK-5526 (E. coli Genetic Stock Center # 6416), jossa 5 on TnlO-insertio HISG-geenissä, plasmidin kanssa. Kaikki ampisilliiniresistentit transformaatiopesäkkeet pystyivät kasvamaan hitaasti sen jälkeen, kun ne oli replika-maljat-tu histidiinittömälle alustalle, kuten osattiin odottaa TnlO:n polaarisuusvaikutuksen perusteella histidiiniopero-10 nissa jäljemänä oleviin geeneihin. Transformanttien suora selektio tunnetulla alustalla, josta puuttui histidiini ja joka sisälsi ampisilliiniä, ei ollut mahdollista, mikä johtui oletettavasti vahvasta polaarisuusvaikutuksesta. Koska Y. lipolytican DNA-insertio pLD21:ssä pystyi komple-15 mentoimaan hisG-mutaatioita E. colissa, pääteltiin, että se sisälsi E. colissa toimivassa muodossa olevan Y. lipolytican HISl-geenin.
Orientoitumisen vaikutuksen ilmenemiseen
Sen testaamiseksi, toimiiko Y. lipolytican DNA-in-20 sertti riippumattomasti vektorista YEp24, subkloonattiin BamHI-pala PBR322:een. Molempiin suuntiin orientoituneet insertit määritettiin EcoRI:n pilkkomismallin (kuvio 5) perusteella. Plasmidi pLD23, jonka insertin EcoRI-kohta on kauempana pBR322:n EcoRI-kohdasta, komplementoi aiemmin 25 käytettyjä kahta hisG-E. coli-mutanttia, kun taas pLD24, toinen orientoitumistapa, ei kyennyt komplementoimaan mutaatioita. Plasmidissa on siten tarpeellista olla sekvenssi Y. lipolytican HISl-geenin tehokkaalle ilmenemiselle tässä E. coli-järjestelmässä. Uskotaan, että pBR3322:n 30 tetR-promoottori on tämä tarpeellinen komponentti.
Transformaatio kromosomaalisen DNA:n pidennettyjen segmenttien kanssa Y. lipolytican DNA:n noin 5,3 - 5,4 kb pitkän Sali-palasen, joka sisälsi LEU2-geenin (puhdistettu geelillä • 35 pilkostusta plasmidista), havaittiin pystyvän transformoimaan Y. lipolytica leu2-mutanttiresipientti prototrofisek- 36 85987 si suurella frekvenssillä (suuremmalla kuin 1 000 trans-formanttia per mikrogramma). Tämä integroitumistapahtuma edustaa toisenlaista rekombinaatiotapaa verrattuna transformaatioon linearisoidulla plasmidilla. Se tekee mahdol-5 liseksi halutun sekvenssin insertoimisen Y. lipolytican DNA.n alueelle ja halutun sekvenssin integroitumisen ilman bakteriaalisen vektorin samanaikaista integroitumista isäntään. E. coli Genetic Stock Center # 6416 on kehittänyt tätä järjestelmää S. cerevisiae'ssa. Y. lipolytican 10 kromosomaalisen DNA:n preparaatteja, sekä suurimolekyyli-siä että jonkin verran pilkottuja, käytettiin myös LEU2-transformanttien saamiseksi.
URA3-geenin kloonaus
Ensimmäinen vaihe käsitti Sau3A:lla osittain pilko-15 tun Y. lipolytican DNA.n geenipankin konstruoimisen pLD40:n BamHI-kohtaan edellä kuvatun pBR322:ssa olevan geenipankin konstruointimenettelyn mukaisesti. Suuren transformaatiofrekvenssin saamiseksi ja pankissa olevien molekyylien ohjaamiseksi integroitumaan LEU2-lokukseen, 20 pilkottiin pankin DNA-entsyymillä Apal, joka katkaisee lähtövektorin pLD40 yhdestä kohtaa LEU2-geenin alueelta. (Koska ei tiedetty, sisältääkö tuntematon URA3-geeni itsessään Apal-kohdan, suoritettiin myös pankin DNA-näyt-teelle osittainen pilkkominen Apal:llä sen varmistamisek-25 si, että jotkut siten saadut molekyylit ovat katkenneet vain yhdestä kohdasta. Osittainen pilkkominen ei ollut kuitenkaan tarpeellinen).
Y. lipolytican URA3-mutantin transformaatio pLD40-pankilla 30 50 ml Y. lipolytica-kannan PC-30827 (ATCC 20688) resipientin viljelmää YPD-liemessä kasvatettiin solutihey-teen OD = 4,9 aallonpituudella 600 nm. Tämä vastasi solujen tiivistä tilavuutta 0,9 ml soluja TE-puskurilla (pH 7,5) suoritetun pesuvaiheen jälkeen, edellä esitetyn •35 transformaatiomenettelyn mukaisesti. Solut suspendoitiin sitten kahteen tilavuusosaan litiumasetaattia TE:ssä, se- 37 85987 koitettiin varovasti roller drum-sekoittimella 30 °C:ssa 1 tunti ja jaettiin sitten kolmeen transformaatioputkeen. Kussakin putkessa (15 ml Gorning'in polystyreeniset sent-rifuugiputket) oli 0,9 ml solususpensiota, 300 pg (100 μΐ) 5 sonikoitua heterologista E. coli-kantaja-DNA:ta ja 6 pg Apal:llä käsiteltyä pankin DNA:ta. Transformaatioputkia inkuboitiin 30 °C:ssa 30 minuuttia ja sekoitettiin sen jälkeen 7 ml:n kanssa PEG-reagenssia (esitetty edellä), ja inkuboitiin vielä tunti. Putkille annettiin sitten 37 °C:n 10 kuumennus!sku 10 minuuttia, jonka jälkeen solut erotettiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella 3 000 rpm 2 minuuttia. Kunkin putken solut suspendoitiin uudelleen 0,6 ml:aan steriiliä vettä ja maljattiin 12 maljalle, joissa oli leu-siiniton synteettinen täydellinen alusta.
15 3 vuorokauden kuluttua leusiinittomalla alustalla kasvoin noin 10 000 pesäkettä. Transformaatiokokeen kanssa samanaikaisesti tehty negatiivinen kontrollimalja (näihin soluihin ei käytetty DNA:ta, mutta ne käsiteltiin muutoin samalla tavalla kuin transformoidut solut) ei sisältänyt 20 kasvavia leusiinista riippumattomia pesäkkeitä.
36 transformaatiomaljaa replika-maljattiin urasii-littomalle synteettiselle alustalle. Seuraavana päivänä löytyi vain yksi pesäke, joka oli urasiilista riippumaton. Tämä pesäke käsiteltiin edelleen URA3-geenin saamiseksi 25 kuten alla on esitetty.
Toinen transformaatiokoe suoritettiin sen määrittämiseksi, onko suora selektio urasiili-riippumattomuuden suhteen mahdollinen mieluummin kuin ensimmäinen selektio plasmidin vastaanottaneiden solujen suhteen (eli leusiini-30 riippumattomuuden suhteen) ja sitä seuraava seulonta halutun ominaisuuden suhteen. Tämä toinen koe oli samanlainen kuin ensimmäinen, mutta sillä päästiin suurempaan trans-formaatiofrakvensiin, välille 5 000 ja 10 000 transfor-manttia per mikrogramma transformoivaa DNA:ta. Tässä ko-35 keessa saatiin kolme muuta URA3-transformanttia suoralla selektiolla urasiilittomalle maljalle sekä vielä yksi leu- 38 85987 siiniselektiolla ja sen jälkeisellä seulonnalla.
URA3;n sisältävän plasmidin pLD55 talteenotto 50 ml ensimmäisen urasiili-riippumattoman transfor-mantin YPD-viljelmää kasvatettiin yön yli, ja solut ero-5 tettiin DNA-preparaattia varten käyttäen fenoli/klorofor-mia ja proteaasi-menetelmää, joka on esitetty edellä. Noin 3 mikrogrammaa (7 %) tätä kromosomaalista DNA-preparaattia pilkottiin kokonaan entsyymillä Apal ja uutettiin sitten fenolilla, fenoli/kloroformilla ja kloroformi/isoamyylial-10 koholilla ja seostettiin sen jälkeen etanolilla. Tämä DNA ligatoitiin T4-DNA-ligaasilla 80 mikrolitran kokonaistilavuudessa. 10 mikrolitraa tätä reaktioseosta käytettiin transformoimaan 100 mikrolitraa kompetenttistä E. coli-kantaa MC-1061 ampisilliiniresistentiksi. E. colin mini-15 plasmidipreparaatit tehtiin 9:stä transformantista ja niitä käytettiin restriktioanalyysiin. Kaikki 7 preparaattia, joilla saatiin pilkkoituvaa DNA:ta sisälsivät entsyymeillä Apal ja EcoRI saadut identtiset liikkuvat reaktiomallit (kuvio 8). 2 preparaattia, jotka eivät mahdollisesti ol-20 leet riittävän puhtaita entsymaattiseen pilkkomiseen, sisälsi identtisesti liikkuvat superkiertyneet plasmidit kuten muutkin 7. Talteenotettu plasmidi sisälsi kaksi EcoRI-vyöhykettä, jotka ovat ominaisia LEU2-insertille pLD40:ssä kolmen muun vyöhykkeen lisäksi. Osoitetun geelin 25 tarkkuudella (noin 5 - 10 kb) URA3:n sisältävä insertti pLD40:ssä ei sisältänyt Apal-kohtaa ja sisälsi kaksi EcoRI-kohtaa.
Sen varmistamiseksi, että plasmidi todella sisälsi URA3-geenin, suoritettiin retransformaatiokoe. Mini-prep-30 Apal:n pilkkomistuotetta käytettiin transformoimaan Y.
lipolytica-resipientti. Osa tästä transformaatioseoksesta maljattiin urasiilittomalla alustalle ja osa leusiinitto-malle alustalle. Maljat, joilla oli noin 100 transformant-tia kullakin alustatyypillä, valittiin replika-maljatta-. 35 viksi toiselle alustalle. Kaikki leusiinin suhteen selek- toidut pesäkkeet olivat myös urasiilista riippumattomia.
39 8 5 9 8 7
Yllättävästi vain noin puolet urasiilittomalla alustalla selektoiduista pesäkkeistä oli myös leusiinista riippumattomia. Tämä jälkimmäinen tulos voidaan selittää tietyillä transformoivan DNA:n degradointia ja korjausta kohde-5 alueella koskevilla hypoteeseilla [Orr-Weawer et ai., Methods in Enzymology 101:228 (1983)]. Koska kaikki leusiinista riippumattomat transformantit olivat myös urasiilis-ta riippumattomia, on pääteltävissä, että plasmidin integroituminen LEU2-alueelle komplementoi URA3-mutaatiota ja 10 että plasmidi, joka nimettiin pLD55:ksi, sisälsi Y. lipo-lytican URA3-geenin.
Sukkuloinnin osoittaminen DNA valmistettiin Y. lipolytican transformantista pLD25:n (ATCC 20687) kanssa edellä esitetyllä fenoli/klo-15 roformi-proteaasimenetelmällä, mutta suorittamatta sitä seuraavaa cesiumkloridigradienttikäsittelyä.
Muutama mikrogramma täten eristettyä DNA:ta pilkottiin entsyymillä Kpnl (samaa entsyymiä käytettiin trans-formantin valmistamiseen), uutettiin fenolilla, puhdistet-20 tiin Schleicher'in ja Schiill'in Elutip-D-minipylväässä (valmistajan ohjeiden mukaisesti) ja ligatoitiin sitten T4-DNA-ligaasin avulla. Molemmissa alustoissa (yli 50 mik-rogrammaa/ml) suoritetut ligatoinnit olivat onnistuneita seuraavaa bakteriaalista transformaatiota ajatellen. Liga-25 tointiseosta käytettiin transformoimaan E. coli-kanta MC-1061 ampisilliiniresistenssin suhteen, kuten edellä on esitetty. Talteen otettiin yli 10 E. coli-transformanttia, ja mini-plasmidi-preparaatit tehtiin. Suurin osa näistä sisälsi plasmideja, joiden restriktiomalli oli identtinen 30 pLD25:lle. Muutamat sisälsivät erilaisten DNA-pätkien näennäisiä inserttejä pLD25:n Kpnl-kohdassa. Nämä ylimääräiset pätkät olivat oletettavasti Y. lipolytican erilaisia Kpnl-fragmentteja, jotka insertoituivat linearisoituun vektoriin ligaation aikana.
35 Toinen esimerkki koskee plasmidi pLD28:aa ja osoit taa Y. lipolytican ja S. cerevisiaen välillä olevat ge- 40 85987 neettis-funktionaaliset eroavaisuudet. Y. lipolytica-kan-ta ATCC 20688 transformoitiin Bglllrlla pilkotulla pLD28:lla, minkä tuloksena saatiin kanta DL-11, joka se-lektoitiin leusiinittomalla synteettisellä alustalla. Kun 5 tämä replika-maljättiin urasiilittomalle synteettiselle alustalle, ei kasvua ollut havaittavissa, mikä osoittaa sen (koska entsyymin määritystestit osoittavat, että Y. lipolytican URA3-geeni koodittaa samaa entsyymiä kuin S. cerevisiaen URA3-geeni), että S. cerevisiaen geeni ei 10 komplementoinut vastaavaa Y. lipolytican mutaatiota. Plas-midi eristettiin Y. lipolyticasta kuten edellä, sillä poikkeuksella, että käytettiin entsyymiä Bglll, joten eristetystä plasmidista puuttui pieni Bglll-fragmentti.
Sen testaamiseksi, toimisiko Y. lipolytican LEU2-15 geeni S. cerevisiae'ssa, transformoitiin kanta DB-745 (leu2-3, 112 ura3-52 adel-100), joka on konstruoitu D. Botstein'in laboratoriossa ja jota käytetään paljon plas-midien isäntänä [katso esimerkiksi Guarente ja Ptashne (1981), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, s. 2 199; samalai-20 siä kantoja on saatavissa nimillä ATCC 44773 ja ATCC
44774] pLD28:n kanssa ja selektoitiin urasiilittomalla alustalla. S. cerevisiae-transformantit replika-maljättiin leusiinittomalle alustalle ja niiden havaittiin kasvavan . . hitaasti ilman lisättyä leusiinia. Oli mahdollista selek- 25 toida suoraan pLD28:n suhteen S. cerevisiae'ssa sen perusteella, että se pystyy komplementoimaan heikosti leu2:n, vaikka transformantit ilmestyivät 24 - 28 tuntia myöhemmin leusiinittomille maljoille kuin urasiilittomille maljoille ja vaikka saatiin hieman pienempi transformaatiofrekvens-30 si. Y. lipolytican LEU2-geeni voi siten toimia, vaikkakin heikosti, ollessaan tässä monikopioplasmidissa S. cerevi-siae'ssa.
Tässä kuvatun menetelmän yleisyyden Y. lipolytican geenien saamiseksi pankeista etsimällä mainittuja geenejä, 35 jotka toimisivat Y. lipolyticassa, osoitti myös Y. lipolytican proteaasigeenin ja Y. lipolytican adeniinigeenin on- 4i 85987 nistunut transformaatio.
Edellä esitettyä pLD40-perusteista pankkia ja tämän keksinnön mukaista sukkulointijärjestelmää käyttämällä on Y. lipolytican proteaasigeeni (XPR2) kloonattu onnistu-5 neesti. Käytetty menettely oli samanlainen kuin edellä kuvattu URA3-geenin kloonaukseen käytetty. XPR2 on rakenne-geeni esitetylle alkaliselle proteaasille [Sims ja Ogryd-zlak, J. Bacteriol. 145, s. 404 (1981)]. Y. lipolytican resipienttikannat, jotka sisältävät geneettiset markkerit 10 leu2, adel ja xpr2, konstruoitiin geenitekniikan standardimenetelmin [Ogrydziak et ai., Mol. Gen. Genetics, 163, s. 229 (1978)]. Leu2-mutaatio esitetään tässä, ja erilaisia xpr2-alleeleja sekä adel-alleelia on saatavissa ATCC:sta numeroilla 46026 - 46028 ja 46067 - 46070, jotka 15 Ogrydziak on tallettanut (Sims ja Ogrydziak, loc. cit.).
Pankki käsiteltiin R. Parker et ai.:n [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, s. 851 (1977) etidiumbromidi-osittainen pilkkominen-menetelmän mukaisesti ja entsyymiä Bglll käyttäen. Bglll-entsyymin, etidiumbromidin ja DNA:n sopivien 20 käyttömäärien määrittämiseksi käytettiin etidiumbromidipi-toisuuksia alueella 0,005 - mikrogrammaa per mikrolitra ja noin 1 mikrogrammaa pankin DNA:ta 10 mikrolitrassa, jossa oli 4 entsyymiyksikköä per putki. Inkubointiaika oli 1 tunti 37 °C:ssa. Etidiumbromidia noin 0,05 mikrogrammaa per 25 mikrolitra sisältävä putki näytti tuottavan paljon pankin plasmidien linearisoitumista tuottamatta yhtään pienempiä fragmentteja, jotka ovat osoituksena enemmän kuin yhdestä katkoksesta per molekyyli. Tämä komponenttien suhde korotettiin asteikossa pankin DNA:n preparoimiseksi transfor-30 maatiotarkoituksiin. Tällä pankin DNA:n käsittelyllä vältetään ongelmat, jotka voisivat muutoin ilmaantua, mikäli sekä suunnatun integraation kohdalla (LEU2-alue) että halutulla tuntemattomalla geenillä (XPR2) olisi kohdat li-nearisointiin käytettävälle entsyymille (Bglll). Tällä 35 tavalla käsitellystä DNA:sta saadut transformantit voivat olla integrantteja joko genomin LEU2 tai XPR2-alueella.
42 85987 Käyttämällä samaa transformaatiomenetelmää kuin aikaisemmin, saatiin yli 80 000 pesäkettä leusiinittomalla synteettisellä alustalla. Nämä replika-maljättiin skim milk (kuorittu maito)-indikaattorimaljoille [D. Ogrydziak et 5 ai., Genetics 87, s. 621 (1977)]; proteaasiaktiiviset transformantit tunnistettiin sillä perusteella, että niiden ympärillä oli kirkas alue skim milk-maljoilla.
Edelleen myös Y. lipolytican adeniinigeeni on kloonattu komplementoimalla. Kaksoismutanttiresipientti (leu2 10 adel) transformoitiin kuten edellä on esitetty, ja leusii-nista riippumattomat pesäkkeet replika-maljättiin ADE1:n suhteen selektoivalle alustalla. ADE1;n sisältävät plasmi-dit eristetään transformanteista ja varmistetaan retrans-formaation avulla.

Claims (16)

43 85987
1. Menetelmä Yarrowia lipolytican transformoimisek-si, tunnettu siitä, että Y. lipolyticaan viedään
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA on Y. lipolytican DNA- 10 fragmentin sisältävä vektori.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on itsenäisesti rep-likoituva Escherichia coli-plasmidi, joka sisältää Y. lipolytican DNA-fragmentin.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y. lipolytica on kannan ATCC 20688 identifiointiominaisuudet omaava Y. lipolytica.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geenejä kloonataan mutanttien 20 komplementaatiolla Y. lipolyticassa.
5 DNA:ta, joka sisältää Y. lipolyticalle homologisen alueen ja detektoitavan geneettisen markkerin, joka on LEU2-, HISl- tai URA3-geeni.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y. lipolyticassa on mutaatio selektoitavaa markkeria vastaavassa geenissä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, -25 tunnettu siitä, että mutantissa on mutaatio Y. lipolytican LEU2- tai URA3-geenissä.
8. Vektori, joka sopii käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä ja joka replikoituu itsenäisesti E. colissa, tunnettu siitä, että se si- 30 sältää DNA:ta, joka sisältää Y. lipolytican kromosomaali-selle DNA:lie homologisen alueen ja detektoitavan geneettisen markkerin, joka on LEU2-, HISl- tai URA3-geeni.
9. Itsenäisesti replikoituva E. coli-vektori, joka sopii käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisessa mene- 35 telmässä, tunnettu siitä, että se sisältää E. ** 85987 coli-plasmidin DNA:ta ja Y. lipolytican kromosomaalista DNA:ta, jossa kromosomaalisessa DNA:ssa on Y. lipolyticas-sa detektoitavissa oleva selektoltava geneettinen markke-ri, joka on LEU2-, HIS1- tai URA3-geeni.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen vektori, tunnettu siitä, että Y. lipolytican DNA sisältää sekä E. colissa että Y. lipolyticassa toimivan geenin sisältävän Y. lipolytican DNA-fragmentin.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen vektori, 10 tunnettu siitä, että E. coli-plasmidi sisältää E. colissa replikoituvan plasmidin pBR322.
12. Plasmidi pLD25, joka sopii käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä, tunnet-t u siitä, että se käsittää E. colin replikaation aloi- 15 tuskohdan ja Y. lipolytican DNA-fragmentin, joka on komplementaarinen E. coli leuB'mutaatioille ja että sen re-striktioendonukleaasin restriktiokartta on kuten kuviossa 3 on esitetty.
13. Plasmidi pLD28, joka sopii käytettäväksi pa- 20 tenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä, tunnet- t u siitä, että se käsittää E. colin replikaation aloituskohdan ja Y. lipolytican LEU2-geenin ja että sen re-striktioendonukleaasin restriktiokartta on kuten kuviossa 6 on esitetty.
14. Plasmidi pLD55, joka sopii käytettäväksi pa tenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä, tunnet-t u siitä, että se käsittää E. colin replikaation aloituskohdan ja Y. lipolytican URA3-geenin ja että sen re-striktiokaavio on kuten kuviossa 9 on esitetty.
15. Plasmidi pLD40, joka sopii käytettäväksi pa tenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä, tunnet-; t u siitä, että se käsittää E. colin replikaation aloi tuskohdan ja Y. lipolytican LEU2-geenialueen ja että sen restriktioendonukleaasin kartta on kuten kuviossa 7 on 35 esitetty. 45 85987
16. Menetelmä Y. lipolytican transformointivektorin valmistamiseksi, joka sopii käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu 5 a) plasmidin pBR322 linearisointi restriktioentsyy- millä; b) linearisoidun pBR322:n ligatointi DNA:n kanssa, joka sisältää Y. lipolyticalle homologisen alueen ja de-tektoitavan geneettisen markkerin, joka on LEU2-, HIS1- 10 tai URA3-geeni; ja c) E. coli-mutanttien transformointi vaiheen b) tuotteella toimivien Y. lipolytica-geenien detektoimisek-si. *6 85987
FI843932A 1983-10-06 1984-10-05 Foerfarande foer transformering av yarrow lipolytica. FI85987C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53959183A 1983-10-06 1983-10-06
US53959183 1983-10-06

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI843932A0 FI843932A0 (fi) 1984-10-05
FI843932L FI843932L (fi) 1985-04-07
FI85987B true FI85987B (fi) 1992-03-13
FI85987C FI85987C (fi) 1992-06-25

Family

ID=24151875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI843932A FI85987C (fi) 1983-10-06 1984-10-05 Foerfarande foer transformering av yarrow lipolytica.

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0138508B1 (fi)
JP (2) JP2559689B2 (fi)
KR (1) KR870000239B1 (fi)
AT (1) ATE73848T1 (fi)
AU (1) AU554118B2 (fi)
BR (1) BR8404984A (fi)
DE (1) DE3485589D1 (fi)
DK (2) DK171878B1 (fi)
ES (3) ES8605038A1 (fi)
FI (1) FI85987C (fi)
IE (1) IE57685B1 (fi)
IL (1) IL73119A (fi)
IN (1) IN163393B (fi)
NO (1) NO173743C (fi)
NZ (1) NZ209794A (fi)
PH (1) PH25363A (fi)
ZA (1) ZA847824B (fi)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2579617B2 (fr) * 1985-04-02 1987-06-26 Agronomique Inst Nat Rech Vecteurs de transformation de la levure yarrowia lipolytica, procede de transformation et levure transformee
EP0166659B1 (fr) * 1984-06-26 1989-08-30 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Vecteurs de transformation de la levure yarrowia lipolytica, procédé de transformation et levure transformée
US4937189A (en) * 1985-10-18 1990-06-26 Pfizer Inc. Expression and secretion of heterologous proteins by Yarrowia lipolytica transformants
GB8529275D0 (en) * 1985-11-28 1986-01-02 Whitbread & Co Plc Dna recombination
JPH082304B2 (ja) * 1987-12-17 1996-01-17 オリエンタル酵母工業株式会社 プラスミドとその製造方法
FR2626584B1 (fr) * 1988-01-28 1990-07-13 Agronomique Inst Nat Rech Sequence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procede pour sa preparation
FR2734843A1 (fr) * 1995-06-02 1996-12-06 Centre Nat Rech Scient Nouveau procede de bioconversion microbienne.
EP0747484A1 (en) 1995-06-08 1996-12-11 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Upstream activator sequences and recombinant promoter sequences functional in yarrowia and vectors containing them
GB9715905D0 (en) * 1997-07-28 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Plant phosphoribosyl transferase and DNA coding thereof
FR2782733B1 (fr) * 1998-09-01 2002-02-08 Agronomique Inst Nat Rech Procede de transformation non-homologue de yarrowia lipolytica
ATE496134T1 (de) * 2002-03-29 2011-02-15 Xoma Technology Ltd Multigene vectoren und methoden für eine erhöhte expression von rekombinanten polypeptiden
EP1866428A2 (en) 2005-03-18 2007-12-19 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US8691555B2 (en) 2006-09-28 2014-04-08 Dsm Ip Assests B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
KR20090058077A (ko) * 2007-12-04 2009-06-09 충북대학교 산학협력단 생물체 정보의 염색체 내 표지 방법 및 그 정보가 표지된생물체
FR2927089B1 (fr) * 2008-02-05 2011-03-25 Inst Nat De La Rech Agronomique Inra Procede d'integration ciblee de multicopies d'un gene d'interet dans une souche de yarrowia
US10100334B2 (en) * 2008-05-23 2018-10-16 Nucelis Inc. Production of squalene using yeast
WO2010135624A2 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Codexis, Inc. Engineered biosynthesis of fatty alcohols

Also Published As

Publication number Publication date
JPS60199386A (ja) 1985-10-08
IN163393B (fi) 1988-09-17
PH25363A (en) 1991-05-13
IE842535L (en) 1985-04-06
IL73119A (en) 1990-01-18
FI843932L (fi) 1985-04-07
JP2718659B2 (ja) 1998-02-25
DK148195A (da) 1995-12-28
ES548941A0 (es) 1989-05-01
NZ209794A (en) 1989-01-27
AU3387684A (en) 1985-04-18
ZA847824B (en) 1986-05-28
NO173743C (no) 1994-01-26
JPH09131176A (ja) 1997-05-20
KR850003167A (ko) 1985-06-13
DK171879B1 (da) 1997-07-28
ES8900255A1 (es) 1989-05-01
ES8802399A1 (es) 1988-05-16
KR870000239B1 (ko) 1987-02-18
ATE73848T1 (de) 1992-04-15
IL73119A0 (en) 1984-12-31
IE57685B1 (en) 1993-02-24
BR8404984A (pt) 1985-08-20
EP0138508B1 (en) 1992-03-18
ES536546A0 (es) 1986-02-16
AU554118B2 (en) 1986-08-07
FI85987C (fi) 1992-06-25
DK171878B1 (da) 1997-07-28
EP0138508A1 (en) 1985-04-24
DE3485589D1 (de) 1992-04-23
FI843932A0 (fi) 1984-10-05
ES548940A0 (es) 1988-05-16
ES8605038A1 (es) 1986-02-16
NO844001L (no) 1985-04-09
JP2559689B2 (ja) 1996-12-04
DK477084A (da) 1985-05-15
NO173743B (no) 1993-10-18
DK477084D0 (da) 1984-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4880741A (en) Process for transformation of Yarrowia lipolytica
US5071764A (en) Process for integrative transformation of yarrowia lipolytica
FI85987B (fi) Foerfarande foer transformering av yarrow lipolytica.
Kurtz et al. Integrative transformation of Candida albicans, using a cloned Candida ADE2 gene
Davidow et al. Integrative transformation of the yeast Yarrowia lipolytica
US4855231A (en) Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
JPS62104585A (ja) ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾
JPH09168388A (ja) 機能遺伝子を含むｄｎａ断片
US5212087A (en) Ars sequence which is efficacious in yarrowia lipolytica
Loison et al. Plasmid–transformed ura3 fur1 double-mutants of S. cerevisiae: an autoselection system applicable to the production of foreign proteins
Cohen et al. Organization of the MAL loci of Saccharomyces: physical identification and functional characterization of three genes at the MAL6 locus
Richard Dickinson et al. A mutation affecting lipoamide dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase and 2-oxoglutarate dehydrogenase activities in Saccharomyces cerevisiae
US4628033A (en) Novel host strain for transformation of Yarrowia lipolytica
Myers et al. Use of URA3 as a reporter of gene expression in C. albicans
Erratt et al. Cloning and expression of a Saccharomyces diastaticus glucoamylase gene in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe
AU614267B2 (en) Penicillium transformants and methods for their production
Cooper et al. Allantoin transport in Saccharomyces cerevisiae is regulated by two induction systems
CA2017176A1 (en) Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin
EP0457852A1 (en) Candida tropicalis transformation system
EP0173668B1 (en) Recombinant saccharomyces
Sanglard et al. DNA transformations of Candida tropicalis with replicating and integrative vectors
Weber et al. Nonconventional yeasts: their genetics and biotechnological applications
Fantes Studies on the β-galactosidase system in Aspergillus nidulans
Whittington Identification and location of the QUT genes in Aspergillus nidulans using DNA-mediated transformation
Forrest Maltose fermentation in MAL6 strains of Saccharomyces

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: PFIZER INC.

MA Patent expired