DE69628738T2

DE69628738T2 - Identifikation und klonierung eines mobilen aspergillus transposons

Info

Publication number: DE69628738T2
Application number: DE69628738T
Authority: DE
Inventors: Maria Amutan; S. Nigel DUNN-COLEMAN; M. Eini NYYSSONEN
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1995-03-21
Filing date: 1996-03-19
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-03-20
Also published as: WO1996029414A1; EP0815241B1; DE69628738D1; EP0815241A1; JP2007215545A; CA2215799A1; DK0815241T3; ATE243257T1; JPH11502408A; CA2215799C; JP4128619B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifikation, Klonierung und Sequenzierung eines mobilen Transposons oder transponierbaren Elements des Aspergillus niger var. awamori. Das transponierbare Element, bezeichnet als Vader, ist ein etwa 440 Basenpaare (bp) großes Element, das durch eine invertierte repetitive Sequenz aus etwa 44 Basenpaaren begrenzt ist. Das transponierbare Element zielt während der Insertion auf eine "TA"-Sequenz in Ziel-DNA ab. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Identifikation, Klonierung und Sequenzierung von einem oder mehreren transponierbaren Elementen) von anderen Fadenpilzen, wobei als Sonde DNA verwendet wird, die die 44 bp große invertierte Wiederholungssequenz umfasst, die aus Aspergillus niger var. awamori isoliert wurde. Darüber hinaus werden Verfahren zur Herstellung von Mutanten unter Einsatz des/der transponierbaren Elements/Elemente der vorliegenden Erfindung durch Inaktivierung von Genen durch Insertion des/der transponierbaren Elements/ Elemente in ein Zielgen und, als Alternative dazu, zur Aktivierung oder zum Einschalten von Genen unter Einsatz des/der hierin beschriebenen transponierbaren Elements/Elemente.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist allgemein bekannt, dass DNA-Segmente, sogenannte Transposons, in viele Stellen im Genom ihres Wirtsorganismus insertiert werden können. Transposons sind sowohl in Prokaryoten, wie beispielsweise Bakterien, als auch in Eukaryoten bekannt, obwohl nur wenige Transposons aus Fadenpilzen isoliert worden sind.
Verschiedene Gruppen haben Transposons in Fadenpilzen gesucht. Das Element pogo, das in Mehrfachkopien und an verschiedenen Stellen in verschiedenen Stämmen der Neurospora crassa vorkommt, wurde von Schectman (1) beschrieben, und es wird angenommen, dass es sich hierbei um ein Transposon handelt. Bisher ist das am besten charakterisierte Transposon in Fadenpilzen Tad gewesen. Tad wurde als spontane Mutante im am- (Glutamat-Dehydrogenase-) Gen in einem Adiopodoume-Stamm von N. crasso von der Elfenbeinküste isoliert. Um durch Insertion ausgelöste Mutationen eines transponierbaren Elements zu detektieren, isolierten Kinsey und Helber (2) genomische DNA von 33 am-Mutantenstämmen, die dann mithilfe einer Southern-Analyse auf Änderungen der Größe von Restriktionsfragmenten gescreent wurden. Bei zwei der Mutantenstämme zeigte sich, dass die Mutation durch die Insertion eines 7-kb-Elements (Tad) in das am-Gen ausgelöst worden war. Anschließend zeigte Kinsey (3), das Tad fähig war, zwischen Kernen von Heterokaryonen zu transponieren, was bestätigte, dass Tad ein Retrotransposon war, und dass eine zytoplasmatische Phase in die Retrotranspositionsvorgänge involviert war. Vor kurzem zeigten Cambareri et al., dass Tad ein LINE-ähnliches DNA-Element mit zwei größeren offenen Leserahmen (ORFs) auf dem Plusstrang ist. Wie es für LINE-ähnliche Elemente typisch ist, wies Tad keine terminalen Wiederholungen auf. Versuche, mobile Transposons in Laborstämmen von N. crassa zu isolieren, schlugen fehl.
Ein zweites Retrotransposon wurde von McHale et al. (5) kloniert, die über die Isolierung von CfT-1, einem LTR-Retrotransposon des Cladosporium fulvum, berichteten. Dieses Transposon wies eine Länge von 6968 bp auf und war durch identisch große terminale Wiederholungen aus 427 bp, eine 5 bp große Zielstellenduplikation, begrenzt. Virusähnliche Teilchen wurden detektiert, die mit reverser Transkriptase-Aktivität in Homogenaten dieses Pilzes cosedimentieren.
Daboussi et al. (6) waren die ersten, die das niaD- (Nitrat-Reductase-) Gen erfolgreich als Transposonsfalle einsetzten. Die niaD-Mutanten können durch eine direkte Selektion auf Chloratbeständigkeit (7) isoliert werden. Die angewandte Strategie bestand in der Isolierung von niaD-Mutanten aus sechs Isolaten, die zu verschiedenen Rassen des Pilzes Fusarium oxysporum gehörten. Mehr als 100 niaD-Mutanten wurden aus jedem Isolat isoliert und auf Instabilität untersucht. Ein Stamm, F24, ergab bis zu 10% instabile niaD-Mutanten. Unter der Annahme, dass die genetische Instabilität der niaD-Mutanten durch transponierbare Elemente verursacht wird, schien es plausibel, dass dieses Isolat mobile Transposons enthielt. Eine stabile niaD-Mutante im F24 wurde mit dem klonierten niaD-Gen von A. nidulans transformiert, weil das F. oxysporum-niaD-Gen nicht kloniert worden war. Instabile niaD-Mutanten wurden in Transformanten isoliert, welche das A.nidulans-niaD-Gen enthielten. In einer Southern-Blot-Analyse zeigte sich, dass zwei instabile niaD-Mutanten eine Insertion mit einer Größe von 1,9 kb aufwiesen. Eine Analyse dieses Elements, Fot1, ergab, dass es 1928 bp groß war, 44 bp große, terminale, invers wiederholte Sequenzen aufwies, einen großen offenen Leserahmen enthielt und von einer 2 bp großen (TA-) Zielstellenduplikation flankiert war. Kürzlich haben Daboussi et al. (8) über die Klonierung eines neuen transponierbaren Elements aus einer instabilen niaD-Mutante berichtet. Dieses Element, FML (Fusarium-mariner-ähnlich) ist 1280 bp groß und weist invertierte Wiederholungen von 27 bp auf. Das FML-Element insertiert in eine TA-Stelle und exzidiert ungenau.
Unter Anwendung der Strategie der Charakterisierung von instabilen niaD-Mutanten konnten Lebrun et al. (9) ein Transposon aus der Magnaporthe grisea isolieren. In diesem Fall wurde jedoch das A.nidulans-niaD-Gen, das durch Transformation in M. grisea transformiert wurde, als Transposonfalle eingesetzt. Es zeigte sich, dass das in das niaD-Gen invertiere Element zu einer Familie der M. grisea-LTR-Retrotransposons, Fos1 (Schull und Hamer, unveröffentlicht) und Mag1 (Farman und Leong, unveröffentlicht), gehörte. Das klonierte Retroelement war 5,6 kb groß und die Zielstelle (ATATT) war dupliziert. Bei allen untersuchten Revertanten dieser Mutante war eine Kopie der LTR am Insertionspunkt verblieben. Ein zweites Transposon, Pot2, von M. grisea wurde vor kurzem von Kachroo et al. (10) kloniert. Die zur Klonierung von Pot2 angewandte Strategie bestand in der Analyse der Fingerprint-Muster repetitiver DNAs, die vom M. grisea-Genom kloniert wurden. Eine repetitive Familie, die sowohl in Reis- als auch Nicht-Reis-Pathogenen der M. grisea in hoher Kopienzahl vorhanden war, wurde kloniert. Das Element, das eine Größe von 1857 bp besaß, wies 43 bp große, perfekte, terminale, invers wiederholte Sequenzen (TIR) und 1 b bp große direkte -Wiederholungen innerhalb der TIRs auf. Ein offener Leserahmen zeigt umfassende Gleichheit mit dem von Fot1 des F. oxysporum. Wie Fot1 dupliziert das Pot2-Element die Dinucleotid-TA an der Zielinser tionsstelle. Es zeigte sich, dass Pot2 in einer Kopienzahl von etwa 100 pro haploidem Genom vorhanden war.
Verschiedene Gruppen haben über ihre erfolglose Suche nach Transposons in Laborstämmen des A. nidulans berichtet (persönliche Mitteilung von Kinghorn, 5). Eine Erklärung für den Mangel an Transposons in Laborstämmen ist, dass die gewünschten Merkmale in Bezug auf Stammstabilität, die für genetische Analysen erforderlich sind, Stämme mit mobilen Transposons ausschließen können. Unter Einsatz des niaD-Gens als Transposonfalle haben die Erfinder ein transponierbares Element des industriell bedeutenden Pilzes A. niger var. awamori identifiziert und isoliert. Dieses Element, Vader, ist in etwa 15 Kopien im A. niger und A. niger var. awamori vorhanden. Eine Southern-Analyse von A. nidulans mit diesem Element zeigt, dass dieses transponierbare Element in einem Laborstamm fehlte und in einem zweiten Laborstamm nur als einfache Kopie vorhanden war. Diese Ergebnisse stützen die Ansicht, dass Laborstämme des A. nidulans sehr wenige Transposons enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein neues eukaryotisches, transponierbares Element von Aspergillus niger var. awamori bereitgestellt. Das neue transponierbare Element ist ein etwa 440 bp großes Element, das eine 44 bp große invertierte Wiederholungssequenz an einem Ende des transponierbaren Elements aufweist. Das Ziel der Insertion dieses neuen transponierbaren Elements ist eine "TA"-Sequenz in der Ziel-DNA zur Insertion. Die "TA"-Sequenz wird bei Insertion des transponierbaren Elements in die Ziel-DNA an einem Ende des Transposons wiederholt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Fragment des transponierbaren Elements, das eine 44 bp große invertierte Wiederholungssequenz umfasst, die an einem Terminus des transponierbaren Elements des A. niger var. awamori vorhanden ist, sowie die Verwendung dieses 44 bp großen Fragments als DNA-Sonde, die zur Isolierung und/oder Klonierung von transponierbaren Elementen von anderen Fadenpilzen nützlich ist. Unter Verwendung der invertierten Wiederholung von Vader wurde ein Transposon des A. niger var. awamori (Tan) kloniert.
In einem Verfahren als Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Gen-Tagging bereitgestellt, welche die Verwendung des transponierbaren Elements der vorliegenden Erfindung zur Inaktivierung von Genen durch Insertion des Elements in ein gegebenes Gen umfasst, wodurch die Genexpression unterbrochen oder inaktiviert wird. Alternativ dazu kann das transponierbare Element anstatt zur Genzerstörung auch beim Aktivierungstagging (zum Aktivieren oder Einschalten von Genen) eingesetzt werden. Beispielsweise kann durch Insertion von DNA, die für einen Promotor kodiert, in das transponierbare Element und die Ermöglichung der Insertion solch eines transponierbaren Elements an der 5'-Stelle eines gewünschten Gens der Promotor aktiviert werden, so dass er die Expression des gewünschten Genprodukts steuert.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Southern-Blot-Analyse von instabilen niaD-Mutanten. Genomische Pilz-DNA von vier niaD-Mutanten und UVK143 wurden mit BgIII verdaut (jeweils 3' von den Inserts). Ein Blot ist dargestellt, der mit einem 500 bp großen Fragment eines Sauverdauten PCR-Produkts von niaD1 und niaD2 erhalten wurde. Die Konzentration einer DIG-markierten Sonde betrug 20 mg/ml Prähybridisierungslösung. Die Wildtypbande hybridisiert bei 2,5 kb, während ein Gen mit Insertion bei 2,9 kb hybridisiert. Spuren: 1 = niaD392; 2 = niaD587; 3 = niaD436; 4 = niaD410; 5 = UKV143; 6 = MG-Marken III (Boehringer Mannheim).
2 zeigt die Kartierung von Vader-Insertionen innerhalb des niaD-Gens. Die Positionen der Vader-Insertionen 1–4 sind in Bezug auf die sechs Introns der kodierenden Strukturgen-Region dargestellt. Da die genaue Insertionsstelle für Vader-4 noch immer unbekannt ist, wurde hierin der ungefähre Bereich seiner Insertion dargestellt. Relevante Restriktionsstellen sind mit den folgenden Buchstaben bezeichnet: E = EcoRI, S = SalI, Sp = SphI, K = KpnI und B = BglII.
3 zeigt die Stelle von Vader 2 im niaD-Gen. Die hier dargestellte Sequenz beginnt bei +0,730 kb von niaD. Die 2 bp große TA-Duplikation ist fett hervorgehoben, und die 44 bp großen invertierten Wiederholungen von Vader sind eingerahmt. Die flankierenden Regionen der DNA-Sequenz des niaD-Gens sind auf beiden Seiten des Vader-Inserts dargestellt. Seq.-ID Nr. 1, umfassend flankierende DNA vom niaD-Gen, ist auf der linken Seite (5') des Vader-Inserts dargestellt und endet mit der Zielsequenz "TA". Seq.-ID Nr. 2, umfassend flankierende DNA vom niaD-Gen, ist auf der rechten Seite (3') des Vader-Inserts, beginnend mit der zusammen mit dem Vader-Insert zu erkennenden Duplikation der Zielsequenz "TA", dargestellt.
4 zeigt eine Southern-Blot-Analyse zur Bestimmung der Genom-Kopienzahl von Vader. Vier A.niger-var.awamari-niaD-Mutanten und UVK143 wurden mit EcoRV vollständig verdaut. EcoRV schneidet die Vader-Sequenz ein Mal. Hybridisierung zeigt, dass Vader im Genom in mehr als 14 Kopien vorhanden ist. Die Hybridisierungsbanden von niaD392, die sich von anderen Mutanten und UVK143 unterscheiden, lassen vermuten, dass die Sequenz mobil ist. Spuren: 1 = MG-Marken III, 2 = UKV143, 3 = niaD410, 4 = niaD436, 5 = niaD587, 6 = niaD392.
5 zeigt einen Southern-Blot zur Nachweis der Gegenwart einer Vader-Sequenz in anderen Pilzen. Andere Fadenpilze, ein industrieller Produktionsstamm und die niaD-Mutante 392 wurden mit EcoRV vollständig verdaut. Hybridisierung mit geringer Stringenz zeigt, dass im A. nidulans (FGSC A691), A. cinnamomeus, A. phoenicis, A. foetidus und in einem industriellen A.niger-Stamm zu Vader homologe Sequenzen vorhanden sind. Spuren: 1 = MG-Marken III, 2 = A. nidulans (FGSC A691), 3 = A. cinnamomeus (ATCC# 1027), 4 = A. versicolor; 5 = A. wentii (ATCC# 10593), 6 = A. nidulans (FGSC A237), 7 = A. phoenicis (ATCC# 11362), 8 = A. foetidus, 9 = ein industrieller Glucoamy lase-Produktionsstamm von A. niger (ETC# 2663), 10 = A.niger var.awamori-niaD-Mutante 392.
6 zeigt einen Southern-Blot zur Bestimmung der genomischen Kopienzahl von Tan (Transposon des A. niger). Vier niaD-Mutanten von A.niger-var.awamori-Mutanten und UVK143 wurden mit EcoR1 vollständig verdaut. EcoR1 schneidet die Tan-Sequenz ein Mal. Eine Hybridisierung zeigt, dass Tan in einer einfachen Kopie im Genom vorhanden ist. Spuren: 1 = MG-Marker III, 2 = UKV143, 3 = niaD410, 4 = niaD436; 5 niaD587, 6 = niaD392.
7 zeigt Southern-Blots zur Bestimmung, ob die invertierten Wiederholungen der transponierbaren Elemente Fot1 und Pot2 an Elemente im A. niger var. awamori hybridisieren. Vier niaD-Mutanten von A.niger-var.awamori-Mutanten wurden mit EcoR1 vollständig verdaut. EcoR1 schneidet die Tan-Sequenz ein Mal. Invertierten Wiederholungssonden von Tan (Seq.-ID Nr. 5), Fot1, Pot2 wurde unter Einsatz von Digoxigenin (Boehringer Mannheim, 1992) ein Oligo-Schwanz verliehen. Spuren: 1 = MG-Marker III, 2 = niaD436, 3 = niaD587. Die Blots A, B und C wurden mit den markierten invertierten Wiederholungssonden von Tan, Fot1 und Pot2 sondiert.
8 ist eine graphische Darstellung der Tan-Organisation, worin das 2,4 kb große Element 4 invertierte Wiederholungssequenzen sowie die etwa 440 bp große Vader-Insertionssequenz umfasst. Aufgrund einer vermeintlichen Stammschleifenstruktur ist die komplette Sequenz von Tan im gestrichelten Bereich zwischen dem größeren Fragment und Vader unbekannt (in der Figur und in entsprechenden Sequenzen mit "N" bezeichnet).
9 zeigt die Sequenz der Vader-Insertion (Seq.-ID Nr. 3). Die Länge von Vader wurde mit 437 bp bestimmt. Die 44 bp großen invertierten Wiederholungen des Vader-Inserts vom 5'-Ende zum 3'-Ende von Vader, die Seq.-ID Nr. 4 bzw. Seq.-ID Nr. 5 entsprechen, sind unterstrichen, wobei die einzige Fehlübereinstimmung, die in den invertierten Wie derholungen auftritt, fett hervorgehoben ist und die 2 bp große TA-Duplikation ebenfalls fett dargestellt ist. Das Element flankierende niaD-Sequenzen sind mit Kleinbuchstaben bezeichnet.
10 zeigt die gesamte DNA-Sequenz des Tan-Elements (Seq.-ID Nr. 6) sowie die vermeintliche Aminosäuresequenz der Transposase, für die Tan kodiert (Seq.-ID Nr. 7). Tan weist eine Länge von 2320 bp und einen großen offenen Leserahmen mit 1668 bp auf, der für 555 Aminosäuren kodiert (Seq.-ID Nr. 7). Tan umfasst die Sequenzen von vier invertierten Wiederholungen (unterstrichen), die den in Vader gefundenen ähnlich sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Während die Ansprüche den Gegenstand der vorliegenden Erfindung erläutern und genau spezifizieren, wird das Verständnis der vorliegenden Erfindung wohl durch die folgende detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen gefördert werden.
Hierin wird biochemische Standardterminologie verwendet, worin die Nucleotidbasen als Adenin (A); Thymin (T); Guanin (G); und Cytosin (C) bezeichnet sind. N steht für ein beliebiges dieser Nucleotide. Wie aus praktischen Gründen bei der Strukturdarstellung einer DNA-Nucleotidsequenz üblich, wird normalerweise nur ein Strang gezeigt, wobei A auf einem Strang gleichzeitig T auf dessen Komplement bedeutet und G gleichzeitig C bedeutet.
EXPERIMENTELLER TEIL
Die Anmelden haben gezeigt, dass im A. niger var. awamori mobile transponierbare Elemente vorhanden sind. Das Klonelement Vader ist in etwa fünfzehn Kopien in den beiden untersuchten A.niger-Stämmen vorhanden. Im Gegensatz dazu ist das Vader-Ele ment in nur einem der beiden untersuchten A.nidulans-Stämme in einer Kopie vorhanden. Diese Ergebnisse erklären, warum verschiedene Gruppen keinen Erfolg bei der Isolierung von aktiven Transposons in A.nidulans-Laborstämmen hatten. Eine plausible Erklärung ist, dass "domestizierte" Stämme des A. nidulans ihre Transposons aufgrund wiederholter Manipulation solcher Stämme verloren haben, sowie die mögliche Aussonderung von fehlerhaften A.nidulans-Stämmen, die genetische Instabilität aufweisen. Es ist schwieriger, zu erklären, warum in den anderen untersuchten Aspergillus-Spezies sehr weniger Vader-Sequenzen vorhanden sind.
Das Vader-Element weist Ähnlichkeiten zu transponierbaren Elementen auf, die von den Pflanzenpathogenen Pot1 der M. grisea (12) und Fot1 des F. oxysporum (8) kloniert wurden. Die Zielstelle zur Duplikation in allen drei Pilzen ist eine 2 bp große TA-Sequenz. Im Falle von Fot1 exzidiert dieses Transposon nicht genau. Bei zwei untersuchten niaD-Revertanten behielten die Exzisionsprodukte in Bezug auf das Gen vom Wildtyp eine 4 bp große Insertion bei (TAATTA gegenüber TA). Die untersuchte Insertion wurde in ein Intron integriert, und daher wirkte sich die ungenaue Exzision von Fot1 nicht auf die Funktionalität des niaD-Genprodukts aus. Bisher wurde kein Beweis dafür, dass Pot2 ein funktionales Element ist, veröffentlicht.
In einem Versuch, zu bestimmen, ob Transposons vorhanden sind, die denen für F. oxysporum und M. grisea berichteten ähneln, wurden den invertierten Wiederholungen von sowohl Fot1 (7) als auch Pot2 (10) entsprechenden synthetische Oligomere hergestellt. Als unter Einsatz der 44 bp großen invertierten Vader-Wiederholung (Seq.-ID Nr. 5) als Kontrolle eine Southern-Analyse des A. niger var. awamori durchgeführt wurde, konnte weder mit der Fot1- noch mit der Pot2-Oligomersonde endgültige Hybridisierungen detektiert werden. Dieser Ergebnisse lassen vermuten, dass das Vader-Element mit den oben beschriebenen Fot1- und Pot2-Transposons nicht eng verwandt ist (siehe 7).
In Bezug auf die Struktur des Vader-Elements, sind Elemente, die direkt durch DNA-Kopien transponieren, durch das Vorhandensein von terminalen invers wiederholten Sequenzen typisiert. Elemente, die durch die Reinsertion des Produkts von reverser Transkription einer RNA-Kopie des Elements (Retroelemente) ohne große terminate Wiederholungen, wie z. B. das Drosphilia-I-Element, transponieren. Andererseits können Retrotransposons große terminate Wiederholungen, wie z. B. das Drosphilia-copia-Element aufweisen. Vader weist eine 44 bp große terminate invers wiederholte Sequenz auf, was zeigt, dass Vader wahrscheinlich durch DNA-Kopie transponiert. Die in 9 dargestellten Vader-invertierten Wiederholungen Seq.-ID Nr. 4 und 5 weisen jeweils eine einzige Fehlübereinstimmung auf. Elemente, die durch DNA-Kopien transponieren, weisen typischerweise einen oder mehrere offene Leserahmen auf, die für eine Transposaseaktivität kodieren. Das Fot1-Element weist eine Länge von 1,9 kb und das Pot1-Element eine Länge von 1,8 kb auf. Sowohl das Fot1 als auch das Pot1-Element weisen ORFs auf, die für ein vermeintliches Transposase-ähnliches Protein kodieren. Das Vader-Element ist, obwohl es mobil ist, zu klein (etwa 440 bp), um für ein Transposase-Protein zu kodieren. Defekte Elemente, die keine Transposase-Aktivität aufweisen, können in Gegenwart einer Transposase transponieren, die durch ein komplettes Element an anderer Stelle im Genom kodiert wird.
Beispielsweise kodiert das Mais-Ac-Transposon für eine voll funktionsfähige Transposase. Mais-Ds-Elemente können jedoch, obwohl sie zur Exzision fähig sind, nicht exzidieren, wenn kein funktionelles Ac-Element vorhanden ist (17). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass, damit das Vader-Element transponiert, eine Transposaseaktivität im Genom eines größeren Transposons vorhanden sein muss. Kürzliche Versuche der Verwendung der 44 bp großen invertierten Vader-Wiederholung (Seq.-ID Nr. 5) zur Durchführung einer PCR unter Einsatz von genomischer DNA von A. niger var. awamori resultierten in der Bildung von zwei amplifizierten DNA-Sequenzen, wobei eine Sequenz eine Länge von 1,8 bp und die zweite Sequenz eine Länge von etwa 2,2 bp aufwies. Diese zweite Sequenz, Tan (Seq.-ID Nr. 6) genannt, umfasst vier invertierte Wiederholungen, die jenen in Vader ähneln. Tan weist eine Länge von 2322 bp und einen großen offenen Leserahmen (1668 bp) auf, der für eine vermeintliche Transposase kodiert, die 555 Aminosäuren umfasst (dargestellt in Seq.-ID Nr. 7).
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Stämme: Spontane chloratresistente Mutanten des Aspergillus niger var. awamori UVK-143, Northern Regional Research Laboratories (NRRL# 3112) wurden verwendet. Die folgenden Aspergillus-Stämme wurden von der ATCC erhalten: A. cinnamomoneus (ATCC# 1027), A. wentii (ATCC# 10593) und A. phoenicis (ATCC# 11362). A. nidulans (FGSC# A237), eine Nitrat-Reduktase-Strukturgen-Mutante (niaD15) und A. nidulans (FGSC# A691), eine Tryptophan erfordernde Mutante (trpC801), wurden vom Fungal Genetics Stock Center (FGSC) erhalten. A. versicolor, A. foetidus und ein geschützter A. niger-Glucoamylase-Stamm stammen von der Kultursammlung von Genencor International Inc. Die Escherichia coli-Stämme JM101 (15) und MM294 (16) wurden wie beschrieben zur Amplifikation von Plasmiden eingesetzt (12).
Mutantenselektion: Sporensuspensionen (1 × 10⁸) von UVK143 wurden auf 600 mM KClO₃ und 10 mM Glutaminsäure enthaltendes CM-Agar (11) plattiert. Chlorat (KClO₃), ein toxisches Analog von Nitrat, ermöglicht die Selektion von Mutanten im Nitratassimilationsweg durch Chloratresistenz. Die kleine Menge Glutaminsäure im Medium reduziert die räumliche Konkurrenz zwischen Mutanten und Sporen vom Wildtyp durch Induktion des Nitratassimilationsweges und somit der Aufnahme der toxischen Chemikalie (Chlorat) durch Sporen vom Wildtyp. Platten wurden bei 37°C inkubiert, bis einzelne Kolonien von spontanen Mutanten identifiziert werden konnten. Einzelne Mutanten, die gegen KClO₃ resistent waren, wurden auf CM-Platten sporulieren gelassen, und Sporen von diesen Platten wurden dann mit verschiedenen reinen Stickstoffquellen (10 mM) auf Minimalmedien (11) aufgetragen: NaNO₃ (Nitrat), NaNO₂ (Nitrit), Hypoxanthin, Harnsäure oder NH₄Cl (Ammoniumchlorid). Jede dieser Verbindungen ist ein Zwischenprodukt des Nitratassimilationsweges. niaD-Mutanten wurden als jene identifi ziert, die gegen KClO₃ resistent waren und in Gegenwart aller Wegintermediate außer NaNO₃ wachsen konnten.
PCR-Amplifikation: Genomische DNA der niaD-Mutante von A. niger var. awamori und von UVK143 wurde als Templat verwendet (siehe Southern-Analyse). Primer (50 pMol, die zur Amplifikation des niaD-Gens eingesetzt wurden, waren NiaD1 (Position 142–165 relativ zur Initiationsstelle von niaD): 5'-CCAACCGAGTCCTCAGTATAGAC-3' (Seq.-ID Nr. 8) und NiaD2 (Position 2738–2715): 5'-CAACGCTTCATAGGCGTCCAGATC-3' (Seq.-ID Nr. 9). Deep Vent (exo) DNA-Polymerase (New England Biolabs) wurde mit den vom Hersteller bereitgestellten Puffer und DNTPs verwendet. Für eine optimale Amplifikation des niaD-Gens enthielt das Reaktionsgemisch 4 mM MgSO₄. Denaturierung der Templat-DNA, 2 min bei 94°C, wurde von 30 Denaturierungszyklen (30 s bei 94°C), Annelierung von Primern (45 s bei 55°C) und Verlängerung (4 min bei 72°C) gefolgt. PCR-Fragmente wurden unter Verwendung des Qiaex-DNA-Gelextraktionssets (Qiagen) von Gel gereinigt, verdaut und für eine Restriktionsenzymanalyse durch Standardverfahren verwendet (12).
Um zu bestimmen, ob andere Sequenzen vorhanden sind, welche die invertierten Wiederholungen von Vader erkennen, wurde ein einzelner Primer (IR1) zur Verwendung mit genomischer DNA des A. niger synthetisiert. Die Sequenz von IR1 ist 5'-ATA-TGA-ATT-CAC-GTA-ATC-AAC-GGT-CGG-ACG-GGC-CAC-ACG-GTC-AGG-CGG-GCC-ATC-3' (Seq.-ID Nr. 10). Das Reaktionsgemisch umfasste: Vader-Mutanten und genomische UVK143-Pilz-DNA, Vent- (exo)- DNA-Polymerasepuffer, 100 pMol IR1-Primer, je 250 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, DMSO und 4 Einheiten Taq-DNA-Poylmerase. Die Amplifikationen wurden wie folgt durchgeführt: 1 Zyklus von 10 min bei 94°C, 30 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 55°C, 1 min bei 72°C und ein Zyklus von 15 min bei 72°C. Die Reaktionen wurden gepoolt, laufen gelassen und wie in den niaD-Reaktionen extrahiert.
Die Templat-DNA von niaD436, die von einer in Gegenwart von KClO₃ gezüchteten, gereinigten Kolonie stammte, wurde in einer PCR-Reaktion verwendet, in einem Versuch, sowohl die größere niaD-Sequenz mit einem Insert als auch das kürzere niaD-Fragment, das von einer Exzision des Vader-Elements stammt, zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Primer MA003 (Positionen 359–378): 5'-ATATGAATTCCTTCTTGACTTCCCCGGAAC-3' (Seq.-ID Nr. 11) und NiaD5 (Position 1125–1144): 5'-ATATAAGCTTGTCACTGGACG-ACATTTCAG-3' (Seq.-ID Nr. 12) eingesetzt wurden. Das aus der Exzision resultierende gelgereinigte Fragment (ca. 800 bp) wurde einer Sequenzierung unterzogen.
Bestimmung der niaD-Mutantenreversionshäufigkeit: Sporen von den niaD-Mutanten niaD392, niaD410, niaD436 und niaD587 wurden auf NaNO₃ als einzige Stickstoffquelle enthaltende Minimalmedien aufgetragen. Nicht Nitrat nutzende Kolonien von niaD-Mutanten, die spinnenartig aussahen und nicht sporulierten, wurden auf 600 mM Kaliumchlorat (KClO₃) enthaltendes CM aufgestrichen und bei 37°C bis zur Konfluenz inkubiert. Zehnfach-Verdünnungsreihen von Sporensuspensionen (in 0,8% NaCl-0,25 Tween 80) von niaD392-, niaD410-, niaD436-, niaD587- und UVK143-Sporen vom Wildtyp wurden auf Minimalmedien mit Nitrat (10 mM), um die Reversionshäufigkeit zu bestimmen, sowie auf CM, um die Lebensfähigkeit zu bestimmmen, plattiert.
Southern-Analyse: Genomische DNA für PCR und Southern-Analyse wurde aus in CSL (13) gezüchteten Myzelien isoliert (13), die 600 mM KClO₃ enthielten, um die Reversion von niaD zurück zum Wildtyp während der Kultivierung zu reduzieren. DNA (10 μg) wurde mit entweder BGIII, das die Insertion in das niaD-Gen intakt lässt, oder mit EcoRV, welches das Insertionselement (Vader) ein Mal schneidet, verdaut, wodurch die Bestimmung ihrer Kopienzahl im Gen ermöglicht wurde. Genomische DNA (etwa 10 μg) von A. nidulans, A. cinnamomeus, A. versicolor, A. wentii, A. phoenicis, A. Foetidus und von einem industriellen A.niger-Stamm wurden mit EcoRV verdaut, um eine Bestimmung der Vader-Kopienzahl in diesen Pilzgenomen zu erhalten. Die verdaute und gelabgetrennte DNA wurde durch Kapillarwirkung auf eine positiv geladene Nylonmembran (Boehringer Mannheim) transferiert.
Die DNA-Sonde für das niaD-Gen stammte vom PCR-Produkt (UVK143-DNA-Templat, amplifiziert mit den Primern NiaD1 (Seq.-ID Nr. 8) und NiaD2 (Seq.-ID Nr. 9)), das mit SalI verdaut wurde, was in einem 528 bp großen Sondenfragment resultierte. Die Sonde für das Insertionselement Vader stammte aus einer PCR-Reaktion, bei der niaD436-DNA als Templat eingesetzt wurde. Dieses PCR-Produkt wurde gereinigt und mit SalI und SphI verdaut und in den Vektor pUC19 subkloniert. Dieses Subklon wurde mit ScaI und XbaI verdaut, um ein 236 bp großes Fragment zu erhalten, das zur Bestimmung der Kopienzahl von Vader-Sequenzen in den Genomen von verschiedenen Pilzen verwendet wurde.
Ein DNA-Marker- und Detektionsset (Genius1, Boehringer Mannheim) wurde zur zufallsgeprimten Markierung einer Sonden-DNA mit Digoxigenin und zur Detektion mit einem mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörper für Digoxigenin verwendet.
Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen für homologe Sonden wurden wie vom Hersteller empfohlen eingehalten, wobei ein Hybridisierungspuffer mit Formamid bei 68°C (Boehringer Mannheim) verwendet wurde. Die Hybridisierungen für eine heterologe Southern-Analyse (d. h. Analyse von DNA von einer anderen Aspergillus-Spezies) wurde unter Verwendung eines Hybridisierungspuffers mit 25% Formamid bei 37°C durchgeführt. Waschungen wurden wie bei einer stringenten Waschvorschrift durchgeführt.
Nitrat-Reduktase-Tests: Nitrat-Reduktase-Tests wurden wie bei Dunn-Coleman et al. (18) beschrieben durchgeführt.
DNA-Analyse und Sequenzbestimmung: Sequenzen wurden unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Desoxy-Kettenabbruchsequezen und Taq-Zyklus-Sequenzierung auf dem 373A-Sequenator (ABI) bestimmt. Im Handel erhältliche universelle und reverse (New England Biolabs) Primer wurden eingesetzt. Die Anordnung von Sequenzen und die Vorhersage der Aminosäuresequenzen wurden unter Einsatz von DNASTAR (DNASTAR, Inc.) durchgeführt. Die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden analysiert und mit jenen von GenBank, EMBL und Prot-Swiss unter Einsatz des Software-Pakets der Genetics Computer Group, Inc. (Madison, WI, USA) verglichen.
Beispiel 1
Isolierung von spontanen, häufig revertierenden niaD-Mutanten von A. niger var. awamori
Unter der Annahme, dass niaD-Mutanten, die durch die Insertion eines transponierbaren Elements entstehen, instabil wären, wurden insgesamt 152 niaD-Mutanten, die auf der Basis von spontanem Widerstand gegen Chlorat isoliert wurden, charakterisiert. Um zu bestimmen, ob die niaD-Mutation instabil war, wurden Sporen von 43 niaD-Mutanten auf ein Medium mit Nitrat als einzige Stickstoffquelle plattiert. Vierzehn der Mutanten revertierten zum Wildtyp-Phänotyp mit einer Häufigkeit von mehr als 1 × 10⁵. Tabelle 1 fasst die niaD-Mutanten-Reversionsuntersuchungen zusammen.
Tabelle 1
Es scheint zwei Klassen von niaD-Mutanten zu geben, die mit hoher Häufigkeit revertierten. Die niaD-Mutanten niaD436 und niaD392 revertierten mit hoher Häufigkeit, während die Mutanten niaD410 und niaD587 eine geringere Anzahl an Revertantenkolonien ergaben.
Der Grad der Nitrat-Reduktase-Aktivität wurde bestimmt, indem Revertantenkolonien von zwei niaD-Mutanten isoliert wurden. Bei allen sechs niaD410-Mutanten wurden Nitrat-Reduktase-Aktivität detektiert. Im Falle von niaD436-Mutanten, konnten in 3 von 6 analysierten Revertanten Nitrat-Reduktase-Aktivität detektiert werden.
Beispiel 2
Klonierung eines Vader-Elements
Um zu bestimmen, ob eine Insertionssequenz sich im niaD-Gen befindet, wurden zwei Primer synthetisiert. Der erste Primer, niaD1 (Seq.-ID Nr. 8), entsprach der Position 142-165 des niaD-Gens, und niaD2 (Seq.-ID Nr. 9) entsprach der Position 2738–2715 des niaD-Gens. Aus 14 instabilen niaD-Mutanten wurde genomische DNA isoliert. Diese genomische DNA diente als Templat für die PCR-Primer. PRC-Reaktionsprodukte mit 4 niaD-Mutanten (410, 436, 587 und 392) deckten eine etwa 440 bp große Insertion (Vader) im niaD-Gen auf.
Für eine Southern-ßlot-Analyse wurde genomische DNA, die aus dem Wildtyp und vier niaD-Mutanten (410, 436, 587 und 392) isoliert wurden war, mit BglII verdaut. Die eingesetzte Sonde war ein Sal1-Verdaufragment des 500 bp großen PCR-Produkts, das unter Verwendung der niaD1- (Seq.-ID Nr. 8) und niaD2- (Seq.-ID Nr. 9) Oligomersonden hergestellt wurde (siehe 1). Die Sonde hybridisierte an ein 2,5 kb großes Fragment mit DNA vom Wildtyp (Spur 5). Im Falle der niaD-Mutanten 410 (Spur 1), 436 (Spur 3) und 392 (Spur 4), hybridisierte die Sonde an ein 2,9 kb großes Fragment. Diese Ergebnisse lassen erkennen, dass diese drei niaD-Mutanten eine etwa 440 bp große Insertion enthielten. Interessanterweise hybridisierte die Sonde Beispiele der Mutante niaD587 an sowohl ein 2,5 kb als auch ein 2,9 kb großes Fragment. Obwohl beim Versuch ein My cel in Gegenwart von KClO₃ gezüchtet worden war, um das Wachstum der niaD-Mutante und nicht von reverenten Zellen zu fördern, wies die Detektion von zwei hybridisierbaren Sequenzen darauf hin, dass in manchen Zellen Vader aus dem niaD-Gen exzidiert worden war.
Bei jedem der vier instabilen niaD-Mutanten wurde die ungefähre Position der Insertion durch Restriktionskartierungsanalyse bestimmt. Die Position der Insertionen in den vier untersuchten Mutanten ist in 2 dargestellt. Alle vier Mutanten wiesen eine etwa 440 bp große Insertion an unterschiedlichen Stellen im niaD-Gen auf.
Beispiel 3
Bestimmung der Vader-Kopienzahl
Um die Vader-Kopienzahl zu bestimmen, wurde ein 236 bp großes internes ScaI-XbaI-Fragment von Vader-2 (kloniert aus der Mutante niaD436) an EcoRV-gespaltene genomische DNA hybridisiert. Es gibt nur eine EcoRV-Stelle im Vader-Transposon (2). Southern-Blot-Analyse zeigte, dass es etwa fünfzehn Kopien von Vader-Sequenzen im Genom des A. niger var. awamori gab (4). Die Vader-Sequenzen wurden in drei niaD-Mutanten, 410, 436, und 587, an identischen genomischen Positionen integriert. Bei der niaD392-Mutante befanden sich Vader-Sequenzen, im Vergleich zu den drei untersuchten niaD-Mutanten, jedoch an fünf verschiedenen Stellen. Dieses Ergebnis war etwas überraschend in Anbetracht der Tatsache, dass alle vier niaD-Mutanten aus demselben Stamm isoliert wurden, belegt jedoch die hohe Mobilität des Vader-Elements in diesem Stamm. Als auch ein geschützter A.niger-Glucoamylase-Produktionsstamm (ETC# 2663) untersucht wurde, konnten etwa 15 Hybrdisierungssignale detektiert werden. Obwohl mache der Hybridisierungsmuster ident schienen, konnten doch klare Unterschiede zwischen A. niger var. awamori und A. niger erkannt werden.
Beispiel 4
Isolierung von Vader in anderen Pilzarten
In einem Versuch, zu bestimmen, ob dieses transponierbare Element auch in anderen Fadenpilzen vorhanden ist, wurde unter Einsatz des 236 bp großen Fragments (XbaI-ScaI) einer Vader-Sequenz wie in Beispiel 3 als Sonde eine genomische Southern-Blot-Analyse durchgeführt (5). Zwei Stämme des A. nidulans wurden vom Fungal Genetics Stock Center (FGSC), FGSC#A691 erhalten, eine Nitrat-Reduktase-Strukturgen-Mutante (niaD15) und FGSC# A237, eine Tryptophan erfordernde Mutante (trpC801). Bei Stamm A691 konnten keine Hybridisierungssignale visualisiert werden, und ein einzelnes starkes Hybridisierungssignal konnte bei Stamm A691 visualisiert werden. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass der Mangel an Erfolg beim Klonieren von transponierbaren Elementen von Laborstämmen des A. nidulans auf ihre geringe Kopienzahl oder gänzliches Fehlen zurückzuführen ist. Auf ähnliche Weise konnten in A. foetidus und A. phoenicis nur 2 Hybridisierungssignale und in A. cinnamomeus 1 Hybridisierungssignal detektiert werden. In A. wentii und A. versicolor konnten keine Hybridisierungen detektiert werden. Außerdem konnten bei Humicola grisea var. thermoidea, Neurospora crassa und Trichodema raesei keine Hybridisierungssignale detektiert werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Diese Ergebnisse lasse erkennen, dass das Vader-Element am häufigsten im A. niger var. awamori und A. niger vorhanden ist.
Beispiel 5
Exzision des Vader-Elements
Ein Teil des niaD-Gens vom niaD436, welcher das Vader-Element enthielt, wurde unter Einsatz von PCR amplifiziert. Die PCR-Amplifikation resultierte im erwarteten 1.200 bp großen Fragment des Vader-Elements, flankiert von niaD-Sequenzen, und in einem kürzeren 800 bp großen Fragment, das aus dem Exzisionsvorgang resultierte. Sequenzierung des kürzeren Fragments zeigte, dass das Vader-Element genau exzidiert hatte. Als jedoch verschiedene Revertanten von niaD436 und niaD410 auf ihre Nitrat-Reduktase-Aktivität untersucht wurden (18), wurde ein Spektrum von Aktivitäten detektiert (Ergebnisse nicht dargestellt).
Beispiel 6
Insertionsinaktivierung/Gen-Tagging
Vader wurde durch Insertionsinaktivierung des Zielgens niaD kloniert, welches für Nitrat-Reduktase kodierte. Die Zielsequenz zur Integration von Vader ist TA, eine Sequenz, die im Genom von Pilzen sehr häufig sein muss. Nitrat-Reduktase-Mutanten können nicht auf Nitrat wachsen und sind daher resistent gegenüber dem toxischen Analog von Nitrat, KClO₃.
Es ist möglich, dass einer der Gründe dafür ist, warum unter Einsatz desselben Promotors die heterologe Proteinproduktion in Pilzen geringer ist als jene von homolog produzierten Proteinen, dass das heterologe Protein durch die Zelle abgebaut wird. Wenn Gene vorhanden sind, deren Produkte für den Abbau bzw. die Maskierung eines fremden Proteins verantwortlich sind, wäre es von Vorteil, diese Gene zu inaktivieren. Um dies zu erreichen, wird ein Stamm unter Einsatz von Genzerstörung gebildet, der kein Tan-Gen aufweist. Solch ein Stamm wird dann verwendet, um ein heterologes Protein, wie z. B. das Säugetier-Chymosin-Protein, zu transformieren und exprimieren. Es wäre von Vorteil, wenn die Aktivität von solchen Genen auf Petri-Schalen visualisiert oder selektiert werden könnte. Chymosin, das in A. niger produziert wird, resultiert beispielsweise in einem freien Halo rund um eine Kolonie, die auf Magermilch gezüchtet wurde (siehe US-Patent 5.364.770, deren Offenbarung hiermit durch Verweis aufgenommen ist). Nachdem der Stamm mit einem Konstrukt transformiert wurde, welches das gewünschte heterologe Protein oder Polypeptid umfasst, würde der Stamm normalerweise ein zweites Mal mit dem Transposon Tan, das sich auf dem Replikationsvektor pHELP befindet (20) (wie in Schema 1 unten), transformiert werden. Sobald der Stamm ein zweites Mal transformiert worden ist, wird eine Sporensuspension aus Transformaten gemacht. Genencor International, Inc. hat gezeigt, dass das pHELP-Plasmid in Sporen nicht vorkommt (d. h. wenn Sporen gebildet werden, wird das pHELP-Plasmid aus der Spore exkludiert) (unveröffentlicht). Durch die Herstellung eines Sporensuspension wird das Transposon im Genom "eingefroren", d. h. es kann sich nach der Sporenisolierungsphase nicht wieder bewegen, weil die zur Exzision erforderliche Transposase nun nicht mehr in der Zelle vorhanden ist.
Die Transformanten werden dann auf einem Medium ausplattiert, das verwendet werden kann, um heterologe Proteinproduktion zu visualisieren, wie z. B. Magermilchplatten im Falle von Chymosin.
Die Platten werden dann auf eine gesteigerte Halogröße gescreent, die das Ergebnis der Inaktivierung eines Gens ist, dessen Produkt fremde Proteinprodukte einschränkt.
Das inaktivierte Gen kann unter Einsatz der Transposonsequenz als Marken für Klonierungsstrategien kloniert werden (siehe allgemein (19)).
Schema 1 Beim Gen-Tagging nützliche Vektoren
Schema 1: Die Vader-Komponente in diesen beiden Vektoren weist eine einzigartige DNA-Sequenz auf, die zwischen den invertierten Wiederholungen insertiert ist, so dass die Klonierung von Stämmen möglich ist, die schon Kopien von Vader enthalten.
Beispiel 7
Förderung der Genexpression unter Verwendung von Transposons
Ein Grund dafür, dass heterologe Protein-Produktion in Pilzen schwächer ist als erwartet, ist wahrscheinlich, dass Gene, die für fremde (heterologe) Genproduktion wichtig sind, in den Pilzen NICHT in ausreichendem Maße exprimiert werden.
Um dieses Problem unter Einsatz des/der transportierbaren Elements/Elemente gemäß vorliegender Erfindung zu lösen, wird ein Stamm gebildet, in dem das native Tan-Gen durch Genzerstörung inaktiviert wird.
Der Stamm wird eingesetzt, um ein heterologes Protein zu exprimieren, dessen Expression leicht visualisiert werden kann, wie z. B. Chymosin (US-Patent 5.364.770), wobei der folgenden Vektor verwendet wird:
Einer der vielen möglichen Integrationsvorgänge ist die Integration des Vader-Elements 5' in ein Gen, das, wenn seine Aktivität unter Einsatz eines sehr starken Promotors, wie z. B. Glucoamylase, gesteigert wird, die Sekretion des heterologen Proteins (z. B. Chymosin) fördert. Sie z. B. Schema 2 unten.
Sporensuspensionen werden aus Transformanten isoliert. Wie oben erwähnt resultiert der Sporenisolierungsschritt in der Eliminierung des pHELP-Vektors (20) aus dem Stamm und "friert" das in das Genom integrierte Transposon ein. Die Sporen werden dann ausplattiert, und Transformanten, die mehr Chymosin produzieren, werden charakterisiert. Danach kann das Gen 3' unter Einsatz herkömmlicher Klonierungsstrategien an Vader kloniert werden (siehe allgemein (19), hiermit durch Verweis aufgenommen).
Literatur:

1. Schectman, M. G., Mol. Cell. Biol. 7, 3168–3177 (1987).
2. Kinsey, J. A., & Hebler, J., Proc. Natl. Acad. Scis USA 86, 1929–1933 (1989).
3. Kinsey, J. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9384-9387 (1993).
4. Cambareri, E. B., Helber, J., & Kinsey, J. A., Mol. Gen. Genet. 242, 658–665 (1994).
5. McHale, M. T., Roberts, I. N., Noble, S. M., Beaumont, C., Whitehead, M. P., Seth, D., & Oliver, R. P., Mol. Gen. Genet. 233, 337–347 (1992).
6. Daboussi, M. J., Langin, T., & Brygoo, Y., Mol. Gen. Genet. 232, 12–16 (1992).
7. Cove, D. J., Heredity 36, 191–203 (1976).
8. Daboussi, M. J., Langin, T., Genetica 93, 49–59 (1994).
9. Lebrum, M. -H., Chumley, F., & Valent, B., Fungal Genentics News Letter 41A, 52 (1994).
10. Kachroo, P., Leong, S. A., & Chatoo, B. B., Mol. Gen. Genet. 245, 339–348 (1994).
11. Rowlands, R. T., & Turner, G., Mol. Gen. Genet. 126, 201–216 (1973).
12. Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 1.11–1.85, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, USA (1989).
13. Timberlake, W. E., & Barnard, E. C., Cell 26, 29–37 (1981).
14. Yanisch-Peron, C., Vieira, J., & Messing, J., Gene 33, 103–119 (1985).
15. Meseselson, M., & Yuan, R., Nature 217, 1110–1114 (1968).
16. Charlesworth, B., Snlegowski, P., & Stephan, W., Nature 371, 215–220 (1994).
17. Fedoroff, N. V., Furek, D. B., & Nelson, O. E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3829–3835 (1984).
18. Dunn-Coleman, N. S., Tomsch, A. D., & Garrett, R. H., Molec. Gen. Getet. 182, 234–239 (1981).
19. Walden, R., & Schell, J., Agro-Food-Industry-Hi-Tech, Nov./Dez., 9–12 (1994).
20. Gems, D. H., Johnstone, I. L., & Clutterbuck, A. J., Gene 98, 61–67 (1991).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transponierbares Element, umfassend eine repetitive Sequenz wie in Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5 oder einer der unterstrichenen Sequenzen in 10 dargelegt.
Transponierbares Element nach Anspruch 1, das eine Wiederholung einer jeden von Seq.-ID Nr. 4 und Seq.-ID Nr. 5 umfasst.
Transponierbares Element nach Anspruch 1 oder 2, worin das transponierbare Element eine Länge von 440 bp aufweist.
Transponierbares Element nach Anspruch 3, das die Sequenz von Seq.-ID Nr. 3 aufweist.
Transponierbares Element nach Anspruch 1, worin das transponierbare Element eine Länge von 2,2 kb oder 2,4 kb aufweist.
Transponierbares Element nach Anspruch 5, das die Sequenz von Seq.-ID Nr. 6 aufweist.
Transposase, für die ein transponierbares Element nach Anspruch 5 oder 6 kodiert.
Transposase nach Anspruch 7, welche die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 7 umfasst.
Verfahren zum Isolieren eines transponierbaren Elements aus einem Fadenpilz, umfassend die Schritte des Hybridisierens einer Sonde, die die Sequenz von Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5 oder einer der unterstrichenen Sequenzen in 10 umfasst, an Pilz-DNA, und das Isolieren von DNA, die an die Sonde hybridisiert.
Verfahren zum Isolieren eines transponierbaren Elements von einer Fadenpilz-Genombank, umfassend die Schritte des Sondierens der Bank mit einer Sonde, die dem offenen Tan-Leseraster mit der in Seq.-ID Nr. 6 dargelegten Nucleinsäuresequenz entspricht.
Verfahren zum Isolieren eines transponierbaren Elements aus einem Fadenpilz, umfassend die Schritte der Verwendung eines DNA-Fragments mit der Sequenz von Seq.-ID Nr. 4 oder Seq.-ID Nr. 5 als Primer in einer Polymerase-Kettenreaktions-Amplifizierung von Pilz-DNA, des Erzeugens amplifizierter DNA-Sequenzen und gegebenenfalls des Charakterisierens der amplifizierten DNA.
Verfahren zum Inaktivieren eines Gens, umfassend die Schritte des Transformierens einer transponierbaren Elements nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in eine Zelle, die das Gen enthält, wobei das Element in das Gen insertiert wird, wodurch die Expression des Gens unterbrochen wird.
Verfahren zum Aktivieren eines Gens, umfassend die Schritte des Transformierens eines transponierbaren Elements nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in eine Zelle, die das Gen enthält, wobei im transponierbaren Element eine DNA-Sequenz insertiert ist, die zum Regulieren der Expression des Gens fähig ist, worin das transponierbare Element in das Genom der Zelle insertiert wird, um die Expression des Gens zu regulieren.