DE3586304T3 - Verfahren zur Herstellung von Proteinen und transformierten Zellen und DNA-Konstruktionen zur Korrektur von Mankos und Wirtszellen sowie deren Herstellung und Verwendung. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Proteinen und transformierten Zellen und DNA-Konstruktionen zur Korrektur von Mankos und Wirtszellen sowie deren Herstellung und Verwendung. Download PDF

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Description

  • Die Verwendung von Mikroorganismen für die Herstellung nützlicher Polypeptid-Produkte durch rekombinante DNA-Technologie ist dabei, sich als eine Industrie zu etablieren. Fremdes genetisches Material kann in eine Kultur von Mikroorganismen eingebracht werden, und die richtigen intrazellulären und extrazellulären Bedingungen vorausgesetzt, kann (können) das (die) gewünschte(n) Protein-Produkt(e) aus dem (den) fremden Gen(en) synthetisiert werden. Solches genetisches Material wird üblicherweise in Form von Plasmiden, die autonom replizierende extrachromosomale Elemente sind, in Mikroorganismen eingebracht. Um die Erhaltung von Plasmiden in einer Kultur transformierter Zellen sicherzustellen, ist es notwendig gewesen, diese Zellen unter speziellen Bedingungen zu züchten. Bei Nicht-Vorhandensein solcher Bedingungen werden Plasmide, die inhärent instabil sein können, nicht erhalten, und die Zellpopulation wird zum nicht-transformierten Zustand zurückkehren.
  • Erhöhte Plasmidstabilität und Kopienzahl sind für die Biotechnologie-Industrie als ein Mittel zum Halten der Produktion von plasmidkodierten Proteinen auf einem konstant hohen Niveau wichtig. Früher mitgeteilte Versuche, Plasmidstabilität zu erhöhen, scheinen für kommerzielle Anwendung nicht optimal zu sein. Es hat sich gezeigt, daß die Einführung von Hefe-Centromeren in ARS-tragende Plasmide, obgleich dies die Stabilität erhöht, die Plasmid-Kopienzahl merkbar senkt (Clarke und Carbon, Nature 287: 504–509, 1980 und Stinchcomb, et al., J. Molec. Biol. 158; 157–179, 1982). Lineare centromere Hefeplasmide zeigen in ähnlicher Weise eine inverse Beziehung zwischen Stabilität und Kopienzahl (Murray und Szostak, Nature 305: 189–193, 1983).
  • Plasmide enthalten typischerweise Gensequenzen, bekannt als selektionierbare Marker, die Antibiotika-Resistenz kodieren oder Nährstoffanforderungen der Wirtszelle komplementieren. Um auf das Vorhandensein solcher Plasmide zu selektionieren, müssen transformierte Zellen somit in speziellen Medien gezüchtet werden, die eine selektive Droge enthalten oder die an spezifischen Nährstoffen abgereichert sind. Diese Medienanforderungen können sowohl teuer sein als auch optimalen Zellwachstumsgeschwindigkeiten während des Fermentationsprozesses im Großmaßstab entgegenstehen. Über viele solcher Plasmide ist in der Literatur berichtet worden. Diejenigen, die Antibiotika-Resistenz-Gene umfassen, schließen pBR322 (Bolivar, et al., Gene 2: 95–113, 1977) und seine Derivate, wie etwa die pUC-Vektoren (Vieira und Messing, Gene 19: 259–-268, 1982), die ein Gen für Ampicillin-Resistenz tragen; und pBR325 (Prentki, et al., Gerte 14: 289, 1981), das Resistenz-Gene für Ampicillin, Tetracyclin und Chloramphenicol trägt, ein. Plasmide, die Nährstoffanforderungen des Wirtes komplementieren, schließen die Hefevektoren YEp13 (Broach, et al., Gene 8: 121–133, 1979), das das LEU2-Gen trägt; und YRp7' (Stinchcomb, et al., Nature 282: 39, 1979), das das TRP1-Gen trägt, ein.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Bereitstellung von DNA-Konstruktionen zum Herstellen eines fremden Proteinproduktes in einer eukaryotischen Wirtszelle, die, als selektionierbare Marker, Gen-Sequenzen enthalten, deren Produkte für die Lebensfähigkeit oder das normale Wachstum der Wirtszelle auf Komplexmedien wesentlich sind.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Bereitstellung von transformanten eukaryotischen Mikroorganismenstämmen, die Plasmide enthalten, die durch Wachstum auf Komplexmedien selektionierbar sind.
  • Außerdem ermöglicht die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von eukaryotischen Mikroorganismenstämmen, denen wesentliche Funktionen fehlen und die als Wirte für DNA-Konstruktionen dienen können, die Gen-Sequenzen tragen, die diese fehlenden wesentlichen Funktionen komplementieren.
  • Zusätzlich ermöglicht die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung fremder Proteine in transformierten eukaryotischen Mikroorganismen, wobei die Proteine die Produkte von Genen sind, die auf DNA-Konstruktionen liegen, die, als selektionierbare Marker, Gen-Sequenzen enthalten, die ein Manko in einem wesentlichen Gen in den Wirtsmikroorganismen komplementieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden DNA-Konstruktionen und geeignete eukaryotische Wirtszellen zur Verfügung gestellt, so daß die Konstruktionen bei hoher Kopienzahl ohne die Notwendigkeit spezieller selektiver Medien erhalten werden. Wachstum unter solchen Bedingungen kann zu schnellerer Zellteilung, größerer Zelldichte und verringerten Herstellungskosten führen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Herstellen eines fremden Proteinproduktes in einer eukaryotischen Wirtszelle zur Verfügung, umfaßend die Schritte:
    • a) Transformieren der Wirtszelle mit einem DNA-Molekül und
    • b) Selektieren des Transformanden aus Schritt a) durch Kultivieren der Wirtszelle auf einem Selektions-Nährmedium
    dadurch gekennzeichnet, daß
    in Schritt a) die Wirtszelle ein Manko in einem Gen aufweist, dessen Expression für normales Zellwachstum auf einem Komplexmedium wesentlich ist, und das DNA-Molekül ein Gen als selektierbaren Marker, das, wenn exprimiert, besagtes Manko komplementiert, und eine Sequenz, die für das fremde Proteinprodukt kodiert, umfaßt, und
    in Schritt b) das Selektions-Nährmedium ein Komplex-Nährmedium ist, welches Antibiotika oder Schwermetalle nicht zu enthalten braucht und nicht um spezifische Nährstoffe abgereichert zu sein braucht,
    wobei dieses Verfahren keine weitere Selektion auf einem speziellen Medium erfordert, das Antibiotika oder Schwermetalle enthält oder um spezifische Nährstoffe abgereichert ist.
  • Das vorliegende Verfahren stellt auch DNA-Konstruktionen, insbesondere Plasmide, und transformante Stämme, die diese Konstruktionen enthalten, zur Verfügung.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "DNA-Konstruktion" jedes DNA-Molekül, das vom Menschen in einer Weise modifiziert worden ist, daß die Nukleotidsequenzen im Molekül nicht identisch mit einer Sequenz sind, die natürlicherweise produziert wird. Der Ausdruck "DNA-Konstruktion" schließt auch Klone von DNA-Molekülen ein, die so modifiziert worden sind. Der Ausdruck "Expressionsvektor" ist als eine DNA-Konstruktion definiert, die eine autonome Replikationsstelle, eine Transkriptionsinitiationsstelle und wenigstens ein Strukturgen, das für ein Protein kodiert, das im Wirtsorganismus exprimiert werden soll, einschließt. Der Expressionsvektor wird üblicherweise auch geeignete Kontrollregionen enthalten, wie etwa einen Promotor und Terminator, die die Expression des Proteins im Wirtsorganismus kontrollieren. Expressionsvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung werden auch einen Selektionsmarker enthalten, der ein essentielles Gen, wie es hier beschrieben ist, umfaßt.
  • Der Ausdruck "Plasmid" wird seine allgemein akzeptierte Bedeutung haben, d.h. autonom replizierende DNA mit üblicherweise geschlossener Schleife.
  • In den beiliegenden Zeichnungen:
  • 1 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pB4.
  • 2 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pB5.
  • 3 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pB15L.
  • 4 zeigt einen Southern-Transfer von DNA aus S. cerevisiae-Stamm A2.7.c, co-transfomiert mit den Plasmiden pB5 und pB15L. Der Transfer wurde mit einem 2,5 kb BamHI- HindIII-Fragment aus der 5'-Flankenregion von CDC4 gesondet, um auf Bruch des genomischen CDC4-Locus zu testen. Spur a enthält DNA aus Zellen, die allein mit pB5 transformiert sind; Spur b nicht-transformierte Zellen; Spuren c–h Co-Transformanden. Pfeile zeigen die an die Sonde hybridisierenden genomischen Fragmente.
  • 5 zeigt die Sequenzen von S. pombe-POT1- und S. cerevisiae-TPI1-Genen zusammen mit den entsprechenden abgeleiteten Proteinsequenzen. Die gesamte S. pombe-TPI-Proteinsequenz ist angegeben. Die Sequenz des S. cerevisiae-Proteins ist nur dort angegeben, wo sie sich von der S. pombe-Sequenz unterscheidet. Das Methionin an Position 1 in der S. cerevisiae-Proteinsequenz ist im reifen Protein nicht vorhanden.
  • 6 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids pCPOT.
  • 7 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids pFATPOT.
  • 8 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids pUCTPILEU2.
  • 9 zeigt einen Teil der Polylinker-Sequenz von Plasmid pIC19R.
  • 10 veranschaulicht Plasmid pMPOT2.
  • Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, daß essentielle Gene als selektionierbare Marker auf DNA-Konstruktionen, wie etwa Plasmiden, verwendet werden können. Ein "essentielles Gen" ist definiert als jedes Gen, das für eine für die Zell-Lebensfähigkeit oder das normale Wachstum auf Komplexmedien notwendige Funktion kodiert.
  • Komplexmedien sind diejenigen Medien, in denen die Nährstoffe aus Produkten abgeleitet sind, deren Zusammensetzung nicht wohldefiniert ist, wie etwa rohe Zellextrakte, Fleischextrakte, Fruchtsaft, Serum, Proteinhydrolysate, etc. Um daher auf einen gewünschten Transformanden gemäß der vorliegenden Erfindung zu selektionieren, wird das Selektions-Nährmedium lediglich ein konventionelles Komplex-Nährmedium sein, nicht ein Spezialmedium, das ein relativ teures Antibiotikum, einen Metallantagonisten oder ein anderes, für die nichttransformierte Wirtszelle letales Mittel enthält oder dem ein oder mehrere spezifische Nährstoffe fehlen, die der nichttransformierte Wirt benötigt. Essentielle Gene schließen Gene ein, die für Zellteilung, Membranbiosynthese, Zellwandbiosynthese, Organellenbiosynthese, Proteinsynthese, Kohlenstoffquellennutzung, RNA-Transkription und DNA-Replikation erforderlich sind, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Um ein essentielles Gen als einen selektionierbaren Marker auf einer DNA-Konstruktion, wie etwa einem Plasmid, zu verwenden, ist es notwendig, einen geeigneten mutanten Wirtszellstamm bereitzustellen. Unter Verwendung der einstufigen Methode von Rothstein zum Aufbrechen von Genen (Meth. in Enzymology 101: 202–210, 1983) oder des hier beschriebenen Co-Transformationsverfahrens können geeignete Wirtsstämme konstruiert werden, die Deletionen in einem geeigneten essentiellen Gen im Genom tragen. Solche Deletionsmutanten wachsen, wenn die Mutation durch eine Funktion komplementiert wird, die von plasmid-getragenem genetischen Material kodiert ist. Es ist bevorzugt, daß die Deletionen in dem (den) essentiellen Gen(en) des Genoms des Wirtes substantielle Segmente der Kodierungsregion und/oder der Flankenregionen umfassen. Wenn die Mutation oder die Mutationen im essentiellen Gen auf eine Weise erreicht werden, daß nur Punktmutationen erzielt werden, besteht eine Wahrscheinlichkeit, daß die mutante Wirtszelle durch einen Rekombinations- Reparaturmechanismus zum Wildtyp zurückkehren wird, wodurch die durch Verwendung des plasmidgetragenen Gens erreichbare Selektivität verringert oder beseitigt wird.
  • Essentielle Gene existieren oft in multiplen Kopien (wie etwa Histon- oder ribosomale RNA-Gene) und/oder in multiplen, verwandten Formen, genannt Genfamilien (wie etwa verschiedene Hexokinase-Gene oder verschiedene DNA-Polymerase-Gene). In solchen Fällen können diese redundanten Funktionen sequentiell mutiert werden, um eine Wirtszelle herzustellen, der es mehrfach an einer gegebenen wesentlichen Funktion fehlt. Durch Verwendung eines High-Copy-Number-Plasmids, um die Aktivität des Gens zu erhöhen, kann jedoch ein einzelnes essentielles Gen auf einem Plasmid multiple Wirtszell-Mankos komplementieren. Ein High-Copy-Number-Plasmid ist wünschenswert, weil ein Anstieg in der Kopienzahl eines klonierten fremden Gens zu einem Anstieg in der Produktion des Proteinproduktes, das von besagtem Gen kodiert wird, führen kann.
  • Die Selektion auf Transformanden, die eine hohe Kopienzahl von Plasmiden mit essentiellen Genen enthalten, kann durch Reduzieren der Expressionsniveaus jeden plasmidgetragenen essentiellen Gens und/oder durch Reduzieren der Aktivitäten der Genprodukte, die von den plasmidgetragenen selektionierbaren Markern kodiert werden, erreicht werden. Ein Ansatz besteht darin, die essentiellen Gene so zu mutieren, daß die Transkriptions- und/oder Translationsraten der Gene reduziert werden oder daß die Genprodukte so verändert werden, daß sie niedrigere spezifische Aktivitäten besitzen. Eine andere Methode zum Absenken der Expressionniveaus von essentiellen Genen, die als selektionierbare Marker verwendet werden, besteht darin, ein Gen aus einem anderen Organismus zu verwenden, um Defekte in der Wirtszelle zu komplementieren. Solche fremden Gene können natürlicherweise einen Defekt für die Expression in einer Wirtszelle aufweisen, weil die Sig nale für Transkription und/oder Translation in verschiedenen Spezies suboptimal sein können oder das Genprodukt kann verringerte Aktivität besitzen, weil es sich in einem fremden Zellmilieu befindet.
  • Es existiert ein weiter Bereich von Funktionen, die für die Zell-Lebensfähigkeit oder das normale Wachstum auf Komplexmedien notwendig sind. Ein Defekt oder eine Deletion in einem essentiellen Gen kann zu Letalität, einer Abnahme in der Zellteilungsrate, Stillstand von Zellteilung, Abbruch von DNA-, RNA- oder Proteinsynthese, Abbruch von Membransynthese, Abbruch von Zellwandsynthese, Abbruch von Organellensynthese, Defekten im Zuckermetabolismus, etc. führen. Beispiele von essentiellen Genen schließen die CDC (Zellteilungszyklus)-Gene der Hefe Saccharomyces cerevisiae (für einen Überblick s. Pringle und Hartwell, "The Saccharomyces cerevisiae Cell Cycle", in Strathern, et al., Hrg., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomvces Life Cycle and Inheritance, 97–142, Cold Spring Harbor, 1981), die Gene, die für Funktionen des Glycolyseweges von S. cerevisiae kodieren, und die SEC-(Novick und Schekman, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76: 1856–1862, 1979 und Novick, et al., Cell 21: 205–215, 1980) und INO- (Culbertson und Henry, Genetics 80: 23–40, 1975)-Gene von S. cerevisiae ein.
  • Eine bevorzugte Klasse von Wirtszellen mit einem Manko an einem essentiellen Gen enthält Defekte in den CDC-Genen, bekannt als cdc-Mutationen, was zu stufenspezifischen Hemmungen des Zellteilungszyklus führt. Die meisten cdc-Mutationen bewirken die vollständige Blockierung von Ereignissen, die für den Zellzyklus wesentlich sind, indem sie entweder die Synthese oder die Funktion der besonderen CDC-Genprodukte beeinflussen. Solche Mutationen können durch ihre Wirkungen auf Ereignisse identifiziert werden, die biochemisch oder morphologisch überwacht werden können. Die meisten bekannten cdc-Mutationen sind konditionell letale (d.h., temperaturempfindliche) Mutationen, was zum Stillstand der normalen Entwicklung von unter restriktiven Bedingungen gezüchteten mutanten Zellen führt. Der aus einer cdc-Mutation resultierende primäre Defekt muß jedoch nicht ein Defekt in einer stufenspezifischen Funktion per se sein. Zum Beispiel können kontinuierlich synthetisierte Genprodukte stufenspezifische Funktionen besitzen; ein Defekt im Hefe-Glycolyse-Gen PYK1 (für das Enzympyruvat-Kinase) ist allelisch zur Zellteilungszyklus-Mutation cdc19 (Kawasaki, Ph.D. Thesis, University of Washington, 1979). Diese Mutation führt zum Zellzyklus-Stillstand in der G1-Phase von Zellen, die im typischen Hefe-Komplexmedium YEPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Baktopepton und 2 % Dextrose) inkubiert werden. Ob also die cdc-Mutation zu einem Defekt in einer stufenspezifischen Funktion führt oder ob sie eine Hemmung oder eine unbrauchbarmachende Mutation eines Genprodukts mit einer stufenspezifischen Funktion bewirkt, kann die Wirkung des Defekts kann überwacht werden.
  • Pringle und Hartwell (ebd.) beschreiben die Funktion von ungefähr 51 CDC-Genen. Zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung können solche Gene aus Genbibliotheken durch Komplementation in einem Stamm, der die gewünschte Mutation trägt, isoliert werden. Genbibliotheken können mit allgemein bekannten Verfahren konstruiert werden (z.B. Nasmyth und Reed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2119–-2123, 1980; und Nasmyth und Tatchell, Cell 19: 753–764, 1980). Stämme, die die gewünschte cdc-Mutation tragen, können, wie hier beschrieben, hergestellt werden oder können von der Öffentlichkeit zugänglichen Hinterlegungsstellen erhalten werden, wie etwa der American Type Culture Collection und dem Berkeley Yeast Stock Center.
  • Eine zweite bevorzugte Klasse von essentiellen Genen sind diejenigen, die Produkte kodieren, die in den Glykolyse-Weg einbezogen sind, einschließlich Genen, die für Stoffwechselenzyme und für Steuerfunktionen kodieren. Beispiele von Glykolyse-Weg-Genen in S. cerevisiae, die identifiziert worden sind, sind das Glykolyse-Steuerungs-Gen GCR1 und die. Gene, die für die Enzyme Triose-Phosphat-Isomerase, Hexo- kinase 1, Hexokinase 2, Phosphoglucose-Isomerase, Phosphogly-cerat-Isomerase, Phosphorfructo-Kinase-Endolase, Fructose 1, 6-Bisphosphat-Dehydrogenase und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodieren. Wie oben angegeben, ist das Pyruvat-Kinase-Gen von Kawasaki identifiziert und beschrieben worden. Ein Plasmid, das ein Hefe-Phosphoglycerat-Kinase-Gen und begleitende Steuerungssignale enthält, ist von Hitzeman, et al. (J. Biol. Chem. 225: 12073–12080, 1980) beschrieben worden. Isolierung und Sequenzierung des Hefe-Triose-Phosphat-Isomerase-Gens TPI1 ist von Alber und Kawasaki (J. Mol. Appl. Genet. 1: 419–434, 1982) und von Kawasaki und Fraenkel (Biochem. Biophys. Res. Comm. 108: 1107–1112, 1982) beschrieben worden.
  • Ein besonders bevorzugtes Glykolyse-Gen ist TPI1, das für die Hefe-Triose-Phosphat-Isomerase kodiert, ein Enzym, das die gegenseitige Umwandlung von Glyceraldehyd-3-phosphat und Dihydroxyaceton-3-phosphat katalysiert und daher für Glykolyse und Gluconeogenese wesentlich ist. In S. cerevisiae kodiert der einzelne genetische Locus, TPI1, für diese Funktion. Zellen, die Mutationen in TPI1 tragen, wachsen auf Glukose überhaupt nicht und auf anderen Kohlenstoffquellen schlecht.
  • Das S. cerevisiae-TPI1-Gen wurde durch Komplementation der tpi1-Mutation isoliert (Alber und Kawasaki, ebd., und Kawasaki und Fraenkel, ebd.). Das Triose-Phosphat-Isomerase-Gen aus der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (POT1) ist durch Komplementation derselben S. cerevisiae-Mutation isoliert und, wie in 5 dargestellt, sequenziert worden.
  • Sequenzierung des S. pombe-Gens, als POT1 bezeichnet, hat bewiesen, daß das S, pombe-TPI-Protein zum TPI-Protein von S. cerevisiae homolog ist.
  • Während im Normalfall das essentielle Gen, das in der DNA-Konstruktion (Plasmid) eingesetzt wird, ein Wildtyp-Gen aus der Wirtsspezies sein wird, wird es in einigen Fällen bevorzugt sein, ein essentielles Gen zu verwenden, das zur Wirtszelle fremd ist, weil das fremde Gen natürlicherweise fehlerhaft sein kann und dadurch auf hohe Plasmid-Kopienzahl selektionierbar. Als ein Beispiel eines solchen fremden essentiellen Gens, das verwendet wird, zeigt eines der Beispiele hierin, daß das S. pombe-POT1-Gen effektiv als ein selektionierbarer Marker in einem S. cerevisiae-Wirt verwendet werden kann.
  • Die DNA- Konstruktionen gemäß der vorliegenden Erfindung, die essentielle Gene als selektionierbare Marker enthalten, werden in mutante Wirtszellen transformiert werden, die in der Funktion des essentiellen Gens fehlerhaft sind. Richtig mutierte Wirtszellen müssen entweder hergestellt werden oder können ohne weiteres von einer öffentlichen Hinterlegungsstelle erhältlich sein. Mutation der Wildtyp-Zelle, um einen richtigen Mutanten zu erhalten, kann gemäß herkömmlichen Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel können Wildtyp-Zellen mit herkömmlichen mutationsauslösenden Mitteln, wie etwa Ethanmethylsulfonat, behandelt und mit einem Plasmid transformiert werden, das ein essentielles Gen enthält, um die Kolonien zu identifizieren, in denen Komplementation auftritt. Alternativ dazu kann das Genom aufgebrochen werden, um eine spezifische Mutation zu schaffen (Rothstein, ebd.).
  • Die Stabilität des Plasmids, das das essentielle Gen enthält, in der Wirtszelle kann von dem Nicht-Vorhandensein von Sequenzen homologer essentieller Gene in der Wirtszelle abhän gen. Die genetischen Defekte im Wirt stellen sicher, daß das Plasmid erhalten, da Wachstum der Wirtszelle nicht auftreten wird oder durch das Fehlen der essentiellen Genfunktion stark eingeschränkt sein wird. Zusätzlich kann die Integrität des Plasmids selbst vom Nicht-Vorhandensein von Homologie zwischen dem plasmidgetragenen essentiellen Gen und dem entsprechenden Locus im Wirtsgenom abhängen sein, weil Rekombination zwischen entsprechendem Plasmid und genomischen Loci die Zelle sowohl von der Mutation als auch vom Plasmid heilen kann. Es ist somit bevorzugt, daß die Mutation im Wirtszellgenom, das das genomische essentielle Gen inaktiviert, von substantieller Natur ist, d.h., daß Deletionen von den DNA-Sequenzen der Kodierungssektion und/oder der Flankenregionen des chromosomalen Gens hergestellt werden. Wenn dies erst einmal erreicht ist, ist es weniger wahrscheinlich, daß Heilung der genomischen Mutation durch Rekombination auftritt.
  • Die Plasmide der vorliegenden Erfindung sind unerwartet stabil, wenn sie in den geeigneten mutanten Wirtszellen gehalten werden. Eine bevorzugte Wirtszelle ist Hefe; andere eukaryontische Zellen können jedoch verwendet werden.
  • Im Fall von Hefezellen scheint die Stabilität der Plasmide gemäß der vorliegenden Erfindung sogar diejenige von Hefeplasmiden, die Centromere enthalten, zu übersteigen. Zirkuläre Centromer-Plasmide sind unter den stabilsten Plasmiden, von denen für Hefe früher berichtet worden ist, leiden aber an einer extrem niedrigen Kopienzahl (Clarke und Carbon, ebd. und Stinchcomb et al., 1982, ebd.). Lineare Centromer-Hefeplasmide sind entweder instabil oder liegen mit niedriger Kopienzahl vor, abhängig von der Plasmidlänge (Murray und Szostak, ebd.). Es ist daher ein unerwarteter Vorteil, daß verbesserte Stabilität von Plasmiden, die ein essentielles Gen tragen, erreicht wird.
  • Die POT1- und CDC4-Gene sind zwei Beispiele für die Nützlichkeit von essentiellen Genen als selektionierbare Marker auf Expressionsvektoren. Diese zwei Gene gehören zu einer breiten Klasse von Genen, die für Zellwucherung auf Komplexmedien erforderlich sind. Die Verwendung anderer essentieller Gene kann Plasmidselektion in Pflanzen- oder Tier-Gewebekulturen ermöglichen, die komplexe Wachstumsbedingungen aufweisen, und kann im Extremfall die Erhaltung von Plasmiden in Zellen ermöglichen, die Nahrung aus Blut, Serum oder Saft von lebenden Tieren oder Pflanzen erhalten.
  • Daten, die aus Experimenten erhalten wurden, in denen die hierin beschriebene Plasmide verwendet wurden, zeigen, daß die Produktion von humanem α1-Antitrypsin (AT) durch die Verwendung des S. pombe-POT1-Gens als selektionierbarem Marker verdoppelt wird, verglichen mit der AT-Produktion, die mit ähnlichen Plasmiden erhalten wird, die einen traditionellen auxotrophen selektionierbaren Marker, LEU2, tragen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß POT1 enthaltende Plasmide funktionell größer in der Kopienzahl sind als die Nicht-POT1-Plasmide, von denen sie abgeleitet sind.
  • Daten, die für die Expression des Affen-Sarcomavirus-v-sis-Gens erhalten wurden, zeigen einen etwa fünffachen bis achtfachen Anstieg in den Expressionsniveaus bei Verwendung von POT1 enthaltenden Plasmiden, verglichen mit Ergebnissen, die mit von YEp13 abgeleiteten Vektoren erhalten wurden.
  • Die Techniken, die verwendet wurden, um die DNA-Konstruktionen, d.h. insbesondere die Plasmide, gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, umfassen herkömmliche Methoden. Das essentielle Gen, das in der DNA-Konstruktion verwendet werden soll, kann durch Verwendung einer markierten DNA-Sonde aus einer Bibliothek isoliert werden, wenn die Struktur des Gens bekannt ist, oder durch Ligieren von Seg menten der DNA-Bibliothek an herkömmliche Vektoren, Transformieren der Vektoren in eine mutante Zelle mit einem Manko im besonderen essentiellen Gen und Suchen nach Kolonien, die komplementiert sind, identifiziert werden. Wenn erst einmal ein geeignetes DNA-Fragment, das das essentielle Gen enthält, identifiziert ist, wird es an einen Vektor ligiert, der eine DNA-Sequenz enthält, die für das Strukturprotein kodiert, das exprimiert werden wird. Das essentielle Gen kann zusammen mit seinem eigenen Promotor und anderen Kontrollen, die für die Expression im Wirtsorganismus notwendig sind, verwendet werden. Alternativ dazu kann ein heterologer Promotor verwendet werden; um die Expression des essentiellen Gens zu steigern oder zu verringern. Methoden für die Ligation von DNA-Fragmenten sind reichlich beschrieben und ihre Durchführung liegt sehr wohl im Bereich der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns auf diesem Gebiet. Die DNA-Kodierungssequenz des zu exprimierenden Proteins kann im wesentlichen diejenige von irgendeinem Protein sein, insbesondere von Proteinen mit kommerzieller Bedeutung, wie etwa Interferonen, Insulin, Proinsulin, α1-Antitrypsin und Gewebe-Plasminogen-Aktivator.
  • Nach Herstellung der DNA-Konstruktion wird sie unter Transformationsbedingungen in den Wirtsorganismus transformiert. Techniken zum Transformieren von Eukaryonten (einschließlich Gewebekulturzellen) sind in der Literatur bekannt.
  • Wie oben beschrieben, muß der Wirtsorganismus für die Selektion des essentiellen Gens auf einem Plasmid ein Manko in der essentiellen Funktion aufweisen. Mutante Wirtsstämme sind von herkömmlichen Hinterlegungsstellen erhältlich oder können mit herkömmlichen Mitteln aus Wildtypen durch Mutagenese und Screenen auf den Mutanten, der die richtige Mutation trägt, hergestellt werden.
  • Der transformierte Wirt kann dann durch Wachstum auf konventionellem Komplexmedium selektioniert werden. Im Fall von Hefe kann ein konventionelles Medium, wie etwa YEPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Bactopepton und 2 % Dextrose) verwendet werden. Die selektionierbaren Marker, die essentielle Gene gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, können als Marker verwendet werden, wo immer sie in irgendeiner DNA-Konstruktion geeignet sind, und es wird daher anerkannt werden, daß Konstruktionen, die ein essentielles Gen enthaltende Selektionsmarker gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, viele Anwendungszwecke haben. Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung solcher Anwendungszwecke angeboten, nicht zur Beschränkung.
  • Wenn nicht anders angegeben, wurden Standardmethoden aus der Molekularbiologie verwendet. Enzyme wurden von Bethesda Research Laboratories, New England BioLabs und Hoehringer Mannheim Biochemicals erhalten und verwendet, wie vom Hersteller angegeben oder wie von Maniatis et al. beschrieben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). E. coli-Kulturen wurden mit der Calciumchlorid-Methode transformiert, ebenfalls bei Maniatis et al. (ebd.) offenbart. Hefekulturen wurden mit der Methode von Beggs (Nature 275: 104–108, 1978) transformiert, mit hierin beschriebenen Modifikationen.
  • Beispiel 1
  • Das S. cerevisiae CDC4-Gen als selektionierbarer Marker
  • A. Konstruktion eines stabilen CDC4 enthaltenden Plasmids
  • Eine Hefegenom-Bibliothek wurde durch partielle Verdauung von Hefe-DNA mit Sau3A, Größeselektion auf Saccharose-Gradienten und Insertion der selektionierten Fragmente in den Hefevektor YRp7, der mit BamHI verdaut worden war, konstruiert (Nasmyth und Reed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 2119–2123, 1980). Ein rekombinantes Plasmid, das das CDC4-Gen enthält, wurde durch Transformation von Hefestämmen GEB5 (MATa cdc4-4 leu2 trp1 lys1 ura1) und GEB7 (MATa cdc4-3 leu2 trp1 lys1) mit der Bibliothek isoliert. Diese Stämme wurden abgeleitet von den Stämmen A364A cdc4-3 und A364A cdc4-4 (Hartwell, et al., Genetics 74: 267–286, 1973) durch Kreuzen mit einem Stamm, von dem bekannt ist, daß er mit großer Häufigkeit transformiert (k79 [MATα leu2 trp1] Nasmyth, et al., Nature 289: 244–-250, 1981; Tatchell, et al., Cell 27:25–35, 1981), gefolgt von Rückkreuzung zu hochtransformierenden Stämmen (K79 und K80 [MATα leu2 trp1 lys1] um cdc4-3- und cdc4-4-Mutationen im gewünschten genetischen Hintergrund (leu2 trp1) zu erhalten. Selektion von Transformanden auf Tryptophan-Prototrophie und die Fähigkeit, bei der restriktiven Temperatur (37°) zu wachsen, identifizierte ein solches Plasmid (als pJY35 bezeichnet), von dem sich zeigte, daß es sich in das Genom integrierte und zum CDC4-Locus kartierte. Spontane Plasmid-Integranden wurden auf der Grundlage ihres selektiven Wachstumsvorteils identifiziert. Dieser Wachstumsvorteil beruht auf dem Vorhandensein, auf dem ursprünglichen Plasmid, eines mit CDC4 verknüpften Gens, das für Zellwachstum schädlich ist, wenn es in hoher Kopienzahl vorliegt (d.h. wenn das Plasmid nicht in das Wirtsgenom integriert ist). ES wurde gezeigt, daß der TRP1-Plasmidmarker in den Integranden genetisch an SUP11 gebunden ist, der auf Chromosom VI an CDC4 gebunden ist (Mortimer und Schild, "Genetic Map of Saccharomyces cerevisiae" in Strathern, et al., Hrg., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae Life Cycle and Inheritance, 641–651, Cold Spring Harbor, 1981). Die cdc4-3-Komplementierungsregion wurde als ein 6,4 kb BamHI-Fragment aus pJY35 gereinigt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit dem Vektor YRp7 verknüpft (Struhl, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035–1039, 1979), der mit BamHI geschnitten worden war. Diese Konstruktion ist bekannt als pJY51 und ist in 1 dargestellt.
  • Bezugnehmend auf 1, wurde die CDC4-Kodierungsregion von den flankierenden genomischen DNA-Sequenzen abgetrennt in der folgenden Weise gereinigt. Plasmid pJY51 wurde mit HindIII geschnitten und das 3,6 kb Fragment, das die CDC4-Region umfaßt, wurde im bakteriellen Plasmid pBR322 subkloniert. Diese Konstruktion wurde vollständig mit BamHI verdaut, partiell mit HincII verdaut und das ca. 2,3 kb CDC4 enthaltende Fragment wurde gereinigt. Das HincII-Fragmentende wurde durch Zugabe von Linker-Sequenzen (Sequenz: 5'CCGGATCCGG3') (erhalten von Collaborative Research) und anschließende Verdauung mit BamHI, um überschüssige Linker zu entfernen, zu einem BamHI-Ende umgewandelt. Das resultierende Fragment, das etwa 1,9 kb des CDC4-Gens umfaßt, wurde in die BamHI-Stelle von yRP7 inseriert, um Plasmid pJY70 herzustellen. Es wurde gezeigt, daß dieses Plasmid die cdc4-3-Mutation, wie oben beschrieben, komplementiert. Obgleich in dem 1,9 kb Fragment kleine Teile sowohl der 5'- als auch der 3'-Kodierungsregionen des CDC4-Gens fehlen, komplementiert es überraschenderweise den temperaturempfindlichen Defekt. Vermutlich wird Transkription und Translation der CDC4-Sequenz von Sequenzen kontrolliert, die in den pBR322-Regionen des Plasmids angesiedelt sind, was die Produktion eines funktionellen Genproduktes ermöglicht.
  • Plasmid pJY70 wurde mit EcoRI geschnitten, um die Hefe-TRP1- und ARS1-Sequenzen zu entfernen, und wurde re-ligiert, was ein hybrides Plasmid ergab, das pBR322- und CDC4-Sequenzen umfaßte. Dieses Plasmid ist bekannt als pJY71 und ist in 1 dargestellt.
  • Die 1,9 kb Hefe-Sequenz wurde als ein BamHI-HindIII-Fragment aus pJY71 gereinigt. Dieses Fragment wurde mit pBR322 verknüpft, das durch Verdauung mit BamHI und HindIII linearisiert worden war, um das Plasmid pB4 herzustellen, und ist in 1 dargestellt.
  • Die CDC4-Region wurde zur Insertion in einen High-Copy-Number-Hefevektor aus pB4 re-isoliert. Solch ein Vektor wird einen Replikationsursprung des Hefe-2μ-Plasmids enthalten und eine oder mehrere Restriktionsenzym-Schnittstellen, die als Klonierungsstellen für fremde Gene von Interesse dienen werden. Vorzugsweise werden solche Stellen im Plasmid nur einmal auftreten. Ein bevorzugter Vektor ist MW5, der den Hefe-2μ-Plasmid-Replikationsursprung und einmal auftretende EcoRI- und BamHI-Klonierungsstellen umfaßt. Bezugnehmend auf 2, wurde Plasmid MW5 von Plasmid YRp7'(Stinchcomb, et al., Nature 282: 39–43, 1979) durch partielle Verdauung mit EcoRI, um im Durchschnitt eine der zwei EcoRI-Stellen pro Molekül zu spalten, abgeleitet. Die resultierenden ungepaarten Enden der linearen Moleküle wurden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt und die resultierenden glatten Enden wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase wieder miteinander verknüpft. Das resultierende Plasmid, das die EcoRI-Stelle benachbart zur ARS1-Sequenz zurückbehielt, wurde dann selektiert. Die ARS1-Sequenz wurde durch Verdauung mit PstI und EcoRI entfernt und durch das PstI-EcoRI-Fragment von Plasmid YEp13 (Broach, et al., Gene 8: 121–133, 1979), das den Replikationsursprung von Hefe-2μ-DNA umfaßt, ersetzt. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als MW5, ist in 2 dargestellt.
  • Um das endgültige CDC4 enthaltende stabile Plasmid zu konstruieren, wurde MW5 mit EcoRI und BamHI geschnitten. Das CDC4-Fragment wurde durch Verdauen des Plasmids mit BamHI und EcoRI aus Plasmid pB4 gereinigt. Die zwei Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase verknüpft und die so her gestellten chimären Moleküle wurden in den E. coli-Stamm RRI (Nasmyth und Reed, ebd.) mit Selektion auf ampicilinresistente, tetracyclinempfindliche Kolonien transformiert. Plasmid pB5 (dargestellt in 2), isoliert aus einer solchen Kolonie, umfaßte den Hefe-2μ-Replikationsursprung, pBR322-Plasmidsequenzen, den selektionierbaren Marker TRP1, 1,9 kb der Hefe-CDC4-Kodierungssequenz und eine einzige EcoRI-Klonierungsstelle.
  • B. Konstruktion eines Plasmids zum Aufbrechen eines Wirts-CDC4-Gens
  • Die Stabilität, in einem transformierten Wirt, des CDC4 enthaltenden Plasmids gemäß der vorliegenden Erfindung hängt von dem Fehlen eines funktionellen CDC4-Gens im Wirt ab. Es ist außerdem wünschenswert, daß zwischen dem Wirtsgenom und dem CDC4 enthaltenden stabilen Plasmid keine Homologie besteht, um Rekombination zwischen Plasmid und chromosomalen DNAs zu verhindern. Um einen Hefestamm zu erhalten, der einen in geeigneter Weise deletierten CDC4-Locus aufweist, kann ein Hefewirt, der das Wildtyp-CDC4-Gen enthält, mit einem linearisierten Plasmidfragment transformiert werden, das ein "aufgebrochenes" CDC4-Gen aufweist (Rothstein, ebd.). Das linearisierte Plasmidfragment ist ein bevorzugtes Transformierungsmittel, weil die freien Enden des Fragmentes Rekombination in der CDC4-Region steigern können. Solch ein Plasmidfragment wird intakte CDC4-Flankenregionen an seinen Enden aufweisen, um Rekombination mit dem intakten genomischen CDC4-Locus zu erleichtern. Das zwischen die CDC4-Flankenregionen des Plasmidfragmentes inserierte genetische Material wird für ein phänotypisches Merkmal kodieren, das im transformierten Wirt selektioniert werden kann (ein selektionierbarer Marker, wie etwa TRP1 oder LEU2). Dem aufbrechenden Plasmid wird vorzugsweise auch ein Hefe-Replikationsursprung fehlen, um auf die Integration der aufgebrochenen CDC4- selektionierbaren Markersequenz in das Wirtsgenom zu selektionieren. Im Anschluß an die Transformation mit dem linearisierten Plasmid führt genetische Rekombination zur Substitution der genomischen Sequenz des Wirts durch die aufgebrochene Sequenz. Zellen, in denen das CDC4-Gen nunmehr deletiert worden ist, werden dann entsprechend des beim Aufbrechen verwendeten Markers selektionierbar sein.
  • Ein Verfahren für einstufiges Aufbrechen eines Wirtsgenoms ist bei Rothstein (ebd.) beschrieben. Wie oben beschrieben, wird das Aufbrechen mit der zugesetzten Verbesserung der Co-Transformation eines Wirtsstammes in einem intakten stabilen Plasmid und einem linearisierten Plasmid durchgeführt, so daß zusätzlich zur Erzielung des Aufbrechens des Wirtsgenoms auch Transformation des Wirts mit dem stabilen Plasmid bewirkt wird.
  • Ein bevorzugtes Plasmid zum Aufbrechen des Wirts-CDC4-Locus ist pB15L, dargestellt in 3. Es umfaßt das Hefe-LEU2-Gen, inseriert zwischen die Flankenregionen von CDC4 und den Vektor pUC13 (Vieira und Messing, Gene 19: 259–268, 1982 und Messing, Meth. in Enzymology 101: 20–77, 1983). Wenn an den Verknüpfungsstellen von Hefe- und Vektorsequenzen linearisiert und in einen geeigneten Hefe-Wirtsstamm transformiert, produziert das Plasmid eine Deletion von CDC4 im Wirtsgenom, was zur Substitution der CDC4-Region durch die LEU2-Sequenz führt. In einem auf Leucin auxotrophen Wirtsstamm können aufgebrochene Transformanden dann auf der Basis von Leucin-Prototrophie selektioniert werden.
  • Um Plasmid pB15L zu konstruieren, wurde ein 6,4 kb Fragment, das das CDC4-Gen und seine 5'- und 3'-Flankenregion umfaßt, aus einem BamHI-Verdauungsgemisch von pJY51 gereinigt. Dieses Fragment wurde in mit BamHI verdauten pUC13 inseriert, um das Plasmid pB14 herzustellen. Der größte Teil der CDC4-Ko dierungsregion wurde durch Verdauen von pB14 mit ClaI und Reinigen des größeren Fragmentes, das die pUC13- und CDC4-Flankensequenzen umfaßt, entfernt. Die Fragmentenden wurden durch Zugabe von XhoI (BglII)-"smart"-Linkern (Worthington Diagnostic) gereinigt, und das 2,8 kb BglII-LEU2-Fragment von YEp13 (Broach, et al., Gene 8:121–133, 1979) wurde mit den resultierenden kohäsiven Termini verknüpft. So hergestellte DNA wurde verwendet, um den E. coli-Stamm RRI zu transformieren. Transformanden wurden auf der Basis von Leucin-Prototrophie selektioniert, da die Hefe-LEU2-Sequenz den leuB-Defekt im E. coli-Wirt komplementiert. Plasmid pB15L wurde aus einer solchen transformierten Kolonie gereinigt.
  • Plasmid pB15L umfaßt nur etwa 50 Basenpaare des 5'-Endes der CDC4-Kodierungssequenz zusätzlich zu den 5'- und 3'-Flankensequenzen. Ein Vergleich der Karten der Plasmide pB5 und pB15L zeigt ein Fehlen von Homologie zwischen deren entsprechenden CDC4-Sequenzen, da die Verknüpfungspunkte der CDC4-LEU2-Genfusion von pB15L außerhalb der Region des in pB5 vorliegenden CDC4-Fragmentes angesiedelt sind. Dieses Fehlen von Homologie verhindert Rekombination zwischen pB5 und dem aufgebrochenen CDC4-Locus in der Wirtszelle.
  • C. Co-Transformation von S. cerevisiae
  • Um gleichzeitig das genomische CDC4-Gen zu deletieren und Plasmid pB5 einzuführen, wurden Hefezellen mit mit BamHI geschnittenem pB15L und intaktem Plasmid pB5 co-transformiert. Der Wirtsstamm, der bei der Transformation verwendet werden soll, sollte auf Tryptophan und Leucin auxotroph sein, um gleichzeitig auf Plasmid pB5 und den genomischen CDC4-Bruch zu selektionieren, Stamm A2.7.c (MATa cdc4-3 trpl leu2-2, 112 lvs1 his3-11, 15) can1, erhalten aus einer Kreuzung von Stamm A2 (MATa leu2-2, 112 his3-11, 15 can1; s. Szostak, Meth, in Enzymology 101: 245–252, 1983) mit Stamm GEB7 (s. Beispiel 1A) wurde verwendet.
  • In einem typischen Co-Transformations-Experiment wurden 10 ml einer Kultur von S. cerevisiae A2.7.c in logarithmischem Phasenwachstum mit etwa 6 μg mit BamHI verdautem pB15L, 1 μg pB5 und 10 μg Kalbsthymus-DNA als Trägersubstanz transformiert. Die Transformationsbedingungen waren, wie bei Beggs (ebd.) beschrieben. Die Zellen wurden auf ein Medium aufgebracht, dem Leucin und Tryptophan fehlte. Sie wurden über Nacht bei 22° gezüchtet und auf 37° verschoben. Etwa 30 Kolonien wurden erhalten. Die Kontrolltransformation mit pB5 allein und Selektion auf Tryptophan-Prototrophie erbrachte etwa 1000 Transformanden.
  • Sechs co-transformierte Kolonien wurden analysiert, um den Bruch des CDC4-Locus zu verifizieren und die Stabilität des pB5-Plasmids zu testen. Genomische DNA wurde aus den Cotransformanden mit der Methode von Abraham, et al. (Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol. 47: 989–998, 1983) isoliert und wurden mit EcoRI und BamHI verdaut, auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen und auf Nitrozellulose überführt (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503–517), 1975). Der Transfer wurde mit dem 2,5 kb BamHI-HindIII-Fragment aus der 5'-Flankenregion von CDC4, das in pB15L, aber nicht in pB5 vorliegt, gesondet. 4 zeigt, daß die Sonde an ein 6,4 kb Fragment von DNA aus nicht-transformierten Zellen hybridisierte (Spur b); es gibt keine EcoRI-Stelle innerhalb dieses 6,4 kb BamHI-Fragmentes. Da die LEU2-Sequenz eine EcoRI-Stelle enthält, wird der Bruch des CDC4-Lotus zu einer Verringerung in der Größe des Hybridisierungsbandes führen (angedeutet durch die Pfeile in 4). Dies ist der Fall für die Transformanden, die in den Spuren c, d, f, g und h dargestellt sind. Spur e zeigt ein etwa anderes Muster und behält das Band in Genomgröße bei, was darauf hinweist, daß Deletion des genomischen CDC4 nicht auftrat. (Die kleineren Bänder, die in den Spuren c bis h zu sehen sind, beruhen auf Kontamination der gelgereinigten Sonde, wie durch die Muster der Kontrollen in den Spuren a und b gezeigt.)
  • Die sechs Co-Transformanden wurden durch Züchten auf Komplexmedium (YEPD) auf Plasmidstabilität getestet. Zellen wurden bei 25° auf YEPD plattiert und bei 37° auf YEPD, tryptophanloses Medium und leucinloses Medium replikaplattiert. Die in Tabelle 1 zusammengefaßten Ergebnisse weisen daraufhin, daß alle Co-Transformanden mit Ausnahme von #3 auf Komplexmedien für die Plasmidmarker 100 stabil waren. (Isolat Nr. 3 ist derselbe Co-Transformand, der in Spur e von 4 dargestellt ist).
  • Weitere Stabilitätstests wurden auf der zwei Co-Transformanden mit den Nummern 1 und 2 durchgeführt. Der Test wurde auf 663 bzw. 681 Kolonien durchgeführt. Nach Wachstum über 30 Generationen auf YEPD bei 30° waren alle Kolonien für Tryptophan und Leucin prototroph.
  • Co-Transformand #1 wurde bei 22° auf seine Wachstumsgeschwindigkeit getestet, und es wurde festgestellt, daß er mit derselben Geschwindigkeit wie eine nicht-transformierte A2.7.c-Kontrolle wuchs.
  • Co-Transformand #1 ist als BELL1 bezeichnet worden. Er ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer 20698 hinterlegt worden.
  • Beispiel 2
  • Schizosaccharomyces pombe-POT1-Gen
  • A. S. pombe-POT1-Gen als ein selektionierbarer Marker
  • Das Saccharomyces cerevisiae-TPI1-Gen kodiert für das Triose- Phosphat-Isomerase-Protein und ist durch Komplementieren des tpi1-Mankos erhalten worden (Kawasaki und Fraenkel, ebd.; Alber und Kawasaki, ebd.). Überraschenderweise ist das homologe Gen aus S. pombe durch Komplementieren derselben S. cerevisiae-tpi1-Mutation isoliert worden. Das S. pombe-TPI-Gen, bezeichnet als POT1 (für Pombe-Triose-Phosphat-Isomerase), ist aus einer von Russel und Hall (J. Biol. Chem. 258: 143–149, 1983) beschriebenen Bibliothek kloniert worden, die genomische S. pombe-DNA enthält, die partiell mit Sau3A verdaut und in den Vektor YEp13 inseriert worden ist. Eine vorläufige DNA-Sequenz (mit der Methode von Maxam und Gilbert, Meth. in Enzymology 65: 497–559, 1980) hat bewiesen, daß das POT1-Gen für das TPI-Protein kodiert, und besagtes Protein ist mit TPI-Proteinen aus anderen Organismen homolog (s. Alber und Kawasaki, ebd.). Diese POT1-DNA-Sequenz ist in 5 angegeben, zusammen mit der S. cerevisiae-TPI1-DNA-Sequenz und den entsprechenden Proteinsequenzen.
  • Das S. pombe-POT1-Gen ist gegenüber dem S. cerevisiae-TPI1-Gen in diesem Beispiel als ein selektionierbarer Marker in S. cerevisiae bevorzugt. Fremde Gene, wie etwa POT1 in S. cerevisiae, könnten in einer fremden Wirtszelle nicht gut funktionieren und daher eine höhere Kopienzahl erfordern, um einen Wirtszelldefekt zu komplementieren. Das selektionierbare POT1-Gen auf einem Hefeplasmid ermöglicht auch die Verwendung des endogenen TPI1-Promotors und TPI1-Terminators (Kontrollregionen, die keine Homologie mit POT1 zeigen) zur Expression von kommerziell wichtigen Genen auf demselben Vektor. Weil POT1 und die Flankenregionen von TPI1 keine Homologie zeigen, sind intramolekulare Rekombination und anschließende Plasmidinstabilität reduziert. Schließlich ist es nicht wahrscheinlich, daß das POT1-Gen mit der chromosomalen DNA von S. cerevisiae rekombiniert, weil es auf dem DNA-Niveau nur wenig Homologie mit der TPI1-Sequenz teilt und ein Großteil des TPI1-Gens in den Wirtsstämmen deletiert worden ist. POT1 enthaltende Plasmide können somit bei hohen Kopienzahlen gehalten werden, die für die gesteigerte Expression fremder Gene von kommerziellem Interesse in Hefe wünschenswert sind.
  • Ein Plasmid, das das POT1-Gen umfaßt, wurde aus der S. pombe-Bibliothek von Russel und Hall (ebd.) durch Komplementation der tpi1-Mutation im S. cerevisiae-Stamm N587-2D (Kawasaki und Fraenkel, ebd.) identifiziert.
  • Eine Restriktionskarte dieses Plasmids, pPOT, ist in 6 dargestellt. Weil pPOT den Vektor YEp13 enthält, ist es inhärent instabil, da ihm die für die Erhaltung von 2-Mikron-Plasmiden in Hefe notwendigen Replikationsfunktionen fehlen. Das POT1-Gen kann daher in kompetentere Vektoren überführt werden, wie etwa C1/1 und verwandte Vektoren, die die vollständigen 2-Mikro-Plasmidsequenzen enthalten. Plasmid C1/1 wurde von pJDB248 (Beggs, Nature 275: 104–109, 1978) und pBR322, wie in Beispiel 3 hierin beschrieben, abgeleitet. Es enthält die gesamte Hefe-2-Mikron-Plasmid-DNA, ein selektionierbares LEU2-Gen und pBR322-Sequenzen.
  • Das POT1-Gen wurde aus pPOT als ein BamHI-XbaI-Restriktionsfragment mit nahezu 3400 Basenpaaren isoliert und wurde in die entsprechenden Polylinkerstellen von pUC13 inseriert. Das resultierende Plasmid ist pUCPOT, von dem eine partielle Restriktionskarte in 6 dargestellt ist.
  • Das pUCPOT-Plasmid wurde mit SalI geschnitten und re-ligiert, um etwa 1800 Basenpaare von S. pombe- und S. cerevisiae-DNA zu deletieren. Dieses resultierende pUCPOT-Sal-Plasmid ist in 6 dargestellt.
  • Das POT1-Gen wurde in der folgenden Art und Weise in C1/1 eingebracht. Da sowohl C1/1 als auch pUCPOT-Sal eine BglI- Stelle im Ampicilinresistenz-Gen und eine einzige BamHI-Stelle an irgendeiner anderen Stelle besitzen, kann ein Teil der pBR322-Region von C1/1 durch das POT1-Fragment von pUCPOT-Sal ersetzt werden. C1/1 wurde mit BglI und BamHI geschnitten, um ein großes Fragment von nahezu 7700 Basenpaaren freizusetzen, daß einen Teil des ampr-Gens, die gesamte 2-Mikron-DNA und das LEU2-Gen enthielt. In ähnlicher Weise wurde pUCPOT-sal mit BglI und BamHI geschnitten, um ein Fragment von nahezu 3400 Basenpaaren freizusetzen, das den anderen Teil des ampr-Gens und das POT1-Gen enthielt. Diese zwei Fragmente wurden ligiert, um pCPOT zu bilden, das ein "wiederhergestelltes" selektionierbares ampr-Gen, das POT1-Gen, das LEU2-Gen, die gesamte 2-Mikron-DNA und die bakterielle Replikationsursprungsregion aus pUC13 enthält (die bakterielle Ursprungsregion aus pUC13 ermöglicht eine höhere Kopienzahl von Plasmiden in E. coli, als dies die Ur- sprungsregion von pBR322 tut).
  • E. coli-Stamm HB-101, transformiert mit pCPOT, ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer 39685 hinterlegt worden.
  • Das POT1-Gen kann mit einer ähnlichen Konstruktion auch in von C1/1 abgeleitete Vektoren inseriert werden. Zum Beispiel enthält das Plasmid pFAT5 (7) eine Expressionseinheit für die Produktion von humanem α1-Antitrypsin (AT), inseriert in C1/1. Diese Expressionseinheit, hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben, besteht aus dem TPI1-Promotor, der AT-cDNA-Sequenz und dem TPI1-Transkriptionsterminator. Eine Restriktionskarte von pFAT5 ist in 7 angegeben.
  • pFAT5 wurde mit BglI und BamHI geschnitten, um ein Fragment (2200 Basenpaare) freizusetzen, das das AT-Gen und den TPI1-Terminator enthielt. Auch freigesetzt wird ein Bg1I-BamHI-Fragment, das mit dem oben beschriebenen C1/1-BglI-BamHI-Fragment identisch ist, mit der Ausnahme, daß das Fragment auf pFAT5 zusätzliche 900 Basenpaare enthält, die den TPI-Promotor umfassen. Dieses letztere pFAT5-Stück und das 3400 by BglI-BamHI-Fragment von pUCPOT-Sal (oben beschrieben) werden ligiert, um das Plasmid pFPOT zu bilden, das die in 7 gezeigte Restriktionskarte besitzt.
  • Der Vektor pFPOT wurde an der einzigen BamHI-Stelle geschnitten, um die Insertion des 2200 Basenpaare langen AT-Gens und des TPI1-Terminatorfragments aus pFAT5 zu ermöglichen. Das Klonieren des 2200 Basenpaare langen Fragments in der richtigen Orientierung in pFPOT ermöglicht die Expression von humanem AT in diesem Hefevektor. Das richtig ligierte Produkt wird als pFATPOT bezeichnet, dessen Restriktionskarte in 7 angegeben ist.
  • B. Bruch des Wirts-TPI-Gens
  • Das Saccharomyces cerevisiae-TPI1-Gen ist kloniert und sequenziert worden (Kawasaki und Fraenkel, ebd., und Alber und Kawasaki ebd.). Das Plasmid pTPIC10, das das Strukturgen für das TPI-Protein umfaßt, ist bei Alber und Kawasaki (ebd.) beschrieben worden. Eine BglII-Stelle existiert an der DNA-Position 295 in der Kodierungsregion von TPI1 und eine andere BglII-Stelle ist etwa 1200 Basenpaare entfernt in der 5'-Flankenregion angesiedelt. Diese BglII-Stellen sind geeignete Klonierungsstellen zum Deletieren eines Teils des TPI1-Gens und zum Inserieren eines anderen Gens, wie etwa des Hefe-LEU2-Gens. Solch eine Konstruktion kann verwendet werden, um einen Bruch des genomischen TPI1-Locus in einem transformierten Wirt zu bewirken.
  • Bei etwa –1800 in der 5'-Flankenregion von TPI1 befindet sich eine PstI-Stelle. In pTPIC10 ist daher das TPI1-Gen von einer PstI-Stelle auf der 5'-Seite und von einer SalI-Stelle (im tetr-Gen) auf der 3'-Seite flankiert. Dieses PstI-SalI- Fragment, das TPI1 enthält, wurde in pUC13 an den PstI- und SalI-Stellen inseriert, um pUCTPI zu produzieren. Eine Restriktionskarte des PstI-SalI-Inserts (in pUC13) ist in 8 angegeben.
  • Das Plasmid pUCTPI wurde dann mit BglII geschnitten und die zwei DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese getrennt. Das größere Fragment wurde gereinigt und phosphatasiert, um Selbst-Ligierung zu verhindern. In die BglII-Stellen dieser DNA wurde das Hefe-LEU2-Gen ligiert, das aus dem Plasmid YEp13 (Broach, et al., Gene 8: 121–133, 1979) als ein BglII-Fragment entnommen wurde. Das resultierende Plasmid war pUCPTI-LEU2, das eine partielle Deletion von TPI1 und eine Insertion von LEU2 trägt. pUCPTI-LEU2 ist in 8 dargestellt.
  • Das Plasmid pUCTPI-LEU2 wurde mit PstI und BamHI geschnitten, um die DNA zu linearisieren. Die Hefesequenzen wurden dann durch Elektrophorese und Gelreinigung aus den pUC13-Sequenzen isoliert. Der Hefe-DNA-Teil, der in 8 dargestellt ist, wurde verwendet, um den S. cerevisiae-Stamm E2-7B (ATCC Nr. 20689), dem LEU2 fehlt, zu transformieren, um das chromosomale TPI1-Gen aufzubrechen (Rothstein, ebd.). Leu+-Transformanden wurden auf einem synthetischen (modifizierten Wickerham's) Medium (Mortimer und Hawthorne, in Rose und Harrison, Hrg., The Yeasts, Bd. 1, 385–460, Academic Press, 1969), das 3 % Glycerin und 1 % Lactat (neutralisiert auf pH 7), 1M Sorbit und kein Leucin enthielt, selektioniert. Die Transformanden wurden über ihre Unfähigkeit, auf YEP-Dextrose zu wachsen, auf ein TPI-Manko gescreent. Ein tpi-Transformand wurde unter den ersten 99 gescreenten Transformanden gefunden. Dieser Stamm wurde als E2-7BΔtpi#29 (im weiteren Δtpi#29) bezeichnet. Δtpi#29 wuchs auf YEP-3% Glycerin-1% Lactat, aber nicht auf YEP-Dextrose. Enzymtests (Clifton, et al., Genetics 88: 1–11, 1980) wurden auf rohen Zellextrakten durchgeführt und bestätigten, daß Δtpi#29 nachweisbare Niveaus von Triose-Phosphat-Isomerase-Aktivität fehlte.
  • Δtpi#29 kann mit anderen Hefestämmen gekreuzt werden, um Di- ploide zu bilden, die für die tpi -Deletion heterozygot sind. Solche Diploide können sporuliert werden, so daß andere Stämme mit einem Manko für Triose-Phosphat-Isomerase erzeugt werden können. Zum Beispiel ist Δtpi#29 mit E8-10A (MATα leu2) (einem Sporen-Segreganden der Kreuzung E2-7B[ATCC 2068]xGK100[ATCC 20669]) gekreuzt worden, um das Diploid E11 zu bilden. Dieser Diploid ist sporuliert worden, um den haploiden Abkömmling, E11-3C, zu erzeugen, der den folgenden Genotyp besitzt: MATa pep4-3 tpi1. E11-3C ist mit Δtpi#29 rückgekreuzt worden, um ein Diploid, E18, zu bilden, das Homozygot für die tpi1-Deletion ist. E18 kann gegenüber Δtpi#29 als Wirtsstamm für ein Plasmid bevorzugt sein, weil er keine Aminosäuren erfordert, größere Zellen besitzt und schneller wächst. Diese tpi -Stämme werden auf das genetische Material deletiert, das für die Glykolyse-Funktion kodiert, und man erwartet daher, daß sie nicht-zurückschlagende (d.h. stabile) Mutanten sind.
  • C. Transformation des POT1-Gens in S. cerevisiae-Stämme mit tpi -Deletion.
  • Die Plasmide pFPOT und pFATPOT wurden in Δtpi#29 und verwandte Stämme mit tpi -Deletion transformiert. Die Hefe-Mutanten ließ man aerob über Nacht bis zu später logarithmischer Phase in YEP-2% Galactose bei 30° wachsen. Die Transformationsbedingungen waren, wie bei Beggs (ebd.) beschrieben, mit der Ausnahme, daß man die Zellen sich bei 30° für 1–2 Stunden in 1M Sorbit, das YEP-3% Glycerin-1% Lactat oder YEP-2% Galactose enthielt, anstelle von YEP-Dextrose, regenerieren ließ, bevor die Zellen in Top-Agar plattiert wurden. Der Top-Agar und die Platten enthielten synthetisches, modifiziertes Wickerham's-Medium mit 1% Sorbit und 2% Dextrose. Nach 3 Tagen bei 30° waren Transformanden sichtbar und wurden zum Replattieren auf YEPD aus dem Agar entnommen. Danach wurden die Transformanden auf YEPD oder anderen dextrosehaltigen Komplexmedien gehalten.
  • Stamm E18, transformiert mit pFATPOT, wurde als ZYM-3 bezeichnet. Er wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer 20699 hinterlegt.
  • Stabilität von pFPOT und pFATPOT auf Komplexmedien. Um Plasmidstabilität zu untersuchen, wurden Kolonien aus einer Einzelzelle in Röhrchen eingeimpft, die YEPD enthielten, und man ließ sie bis zu einer Gesamtpopulation von 109 Zellen (etwa 30 Teilungen) wachsen. Die Hefezellen wurden beschallt, um Klumpen aufzubrechen, auf angemessene Anzahl verdünnt und auf YEP-2% Galactose oder YEP-2% Glycerin-1% Lactat plattiert, was das Wachstum von tpi–-Zellen ermöglicht (mit oder ohne die Plasmide, die das POT1-Gen tragen). Die Kolonien, die auf YEP-Galactose entstehen, wurden dann auf YEPD replikaplattiert, um auf den Verlust des Plasmids zu screenen (d.h. tpi -Zellen, die das POT1 enthaltende Plasmid verloren haben, werden nicht auf Dextrose wachsen). Die Ergebnisse, zusammengefaßt in Tabelle 2, weisen daraufhin, daß die pFPOT- und pFATPOT-Plasmide in Hefestämmen mit tpi -Deletion stabil sind. Sie sind überraschenderweise weit stabiler als Hefeplasmide, die Centromere enthalten. Centromertragende Plasmide (die niedrig in der Kopienzahl sind) zählen zu den stabilsten Plasmiden, über die für Hefe berichtet worden ist, und gehen im allgemeinen mit einer Häufigkeit von um 1% Zellen pro Teilung auf Komplexmedien verloren (s. Murray und Szostak, ebd., für einen Überblick zur centromer-Plasmidstabilität). Wie Tabelle 2 zeigt, gehen die hier beschriebenen POT1-Plasmide mit einer Häufigkeit von weniger als 1 % nach 30 Teilungen auf Komplexmedien in Stämmen mit tpi -Deletion verloren.
  • D. Expression von humanem α1-Antitrypsin in S. cerevisiae unter Verwendung von POT1-Plasmiden
  • Um die Nützlichkeit der POT1-Plasmide zur Erhöhung der Expression fremder Proteine in einer transformierten Hefe zu untersuchen, wurden die Plasmide pFATPOT und pFAT5 verwendet, um die S. cerevisiae-Stämme Δtpi#29 bzw. E2-7B zu transformieren. Transformierte Zellen wurden in leucinlosen Medien, die Dextrose enthielten, selektioniert. Kulturen wurden bei 30° auf einen O.D.600 von 3–4 gezüchtet. Zellextrakte wurden hergestellt und, wie in Beispiel 5 beschrieben, auf AT untersucht.
  • Von pFATPOT/Δtpi#29 produziertes AT stellte 4–6% des gesamten löslichen Proteins dar. Von pFAT5/E2-7B produziertes AT stellte 2–3% des gesamten löslichen Proteins dar.
  • Obgleich Plasmid-Kopienzahlen schwer exakt zu messen sind und einen Populationsdurchschnitt darstellen, stellen empirische Beobachtungen von Quantitäten des Genprodukts einen Hinweis auf relative Plasmidniveaus zur Verfügung, vorausgesetzt, daß die Expressionseinheit (Promotor, Gen von Interesse, Terminator) dieselbe bleibt. pFATPOT scheint daher funktionell größer in der Anzahl zu sein als pFAT5, aus dem es abgeleitet wurde. Weil die zwei transformierten Stämme genetisch nahezu identisch sind (Δtpi#29 wurde durch plasmidgesteuerte Mutagenese von E2-7B abgeleitet) und unter denselben Bedingungen gezüchtet wurden, stellt dieses Ergebnis einen Hinweis auf den Wert des hier beschriebenen stabilen Plasmid-Expressionssystems gegenüber früher beschriebenen Vektoren dar.
  • E. Konstruktion des pMPOT2-Vektors
  • Ein zweiter stabiler Expressionsvektor, der die REP1-, REP2-, REP3- und ori-Sequenzen aus Hefe-2-Mikron-DNA und das POT1-Gen umfaßt, wurde konstruiert. Das POT1-Gen wurde aus pFATPOT durch Verdauung des Produkts mit SalI und BamHI erhalten. Dieses 1600 by Fragment wurde dann an pIC19R ligiert (das die in 9 dargestellte Polylinker-Sequenz umfallt, inseriert in die HindIII-Stelle von pUC19 (Norrander et al., Gene 26: 101–106, 19830 , das zunächst durch Verdauung mit SalI und BamHI linearisiert worden war. Die BamHI-, PstI- und SalI-Stellen im resultierenden Plasmid wurden in zwei Schritten zerstört, um Plasmid pICPOT* herzustellen. Die PstI- und SalI-Stellen wurden durch Schneiden mit PstI und SalI entfernt; die Enden wurden durch Verdauen des PstI-3'-Überhangs mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Einfüllen des SalI-5'-Überhanges mit Klenow-Fragment geglättet. Die glatten Enden wurden dann ligiert. Die BamHI-Stelle wurde dann durch Schneiden des Plasmids mit BamHI, Einfüllen der Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Re-Ligieren der glatten Enden entfernt.
  • Die 2μ-Sequenzen wurden aus den Plasmiden YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121 133, 1979) und C1/1 erhalten. Die REP3- und ori-Sequenzen wurden durch Verdauung mit Pst I und Xba I und Gelreinigung aus YEp13 entfernt. REP2 wurde durch Verdauung mit Xba I und Sph I und Gelreinigung aus C1/1 erhalten. Die zwei Fragmente wurden dann mit pUC18 (Norrander et al., ebd.) verknüpft, das mit Pst I und Sph I linearisiert worden war, um Plasmid pUCREP2,3 herzustellen. REP1 wurde durch Verdauung mit Eco RI und Xba I und Gelreinigung des 1704 bp Fragments aus C1/1 erhalten. Das EcoRI-XbaI-Fragment wurde in pUC13 kloniert, das mit Eco RI und Xba I linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pUC13 + REP1 bezeichnet. Das pUC13 + REP1-Plasmid wurde mit HindII geschnitten und in Gegenwart von EcoRI-Linkern (erhalten von Bethesda Research Laboratories) ligiert. Das REP1-Gen wurde dann als ein Eco RI-Fragment von etwa 1720 by entfernt, Dieses EcoRI-Fragment wurde in pIC7 kloniert (das die in 9 dargestellte Polylinker-Sequenz umfaßt, inseriert in die HindIII-Stelle von pUC8), das mit Eco RI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pICREP1#9 bezeichnet.
  • Um den endgültigen Expressionsvektor pMPOT2 zu konstruieren, wurde pICPOT* durch partielle HindIII-Verdauung und vollständige SstI-Verdauung linearisiert. Plasmid pUCREP2,3 wurde mit Hind III und Sst I geschnitten, und das Fragment, das REP2-, REP3- und ori-Sequenzen umfaßt, wurde gelgereinigt und mit linearisiertem pICPOT* verknüpft. Das resultierende Plasmid, das REP2-, REP3-, ori-, POT1- und ampr-Sequenzen umfaßt wurde als pMPOT1 bezeichnet. REP1 wurde dann als ein BglII-NarI-Fragment aus pICREP1#9 entfernt und mit pMPOT1 ligiert, das mit Bgl II und Nar I gespalten worden war. Das Produkt dieser Ligation wurde als pMPOT2 bezeichnet (10. 101. Der S. cerevisiae-Stamm
    Figure 00330001
    , transformiert mit pMPOT2, ist bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 20744 hinterlegt worden.
  • F. Expression von v-sis-Sequenzen unter Verwendung von POT1-Plasmiden
  • Das v-sis-Gen von Affen-Sarcomavirus (SSV) kodiert ein als p28sis bezeichnetes Protein, das als das transformierende Protein des Virus impliziert worden ist. Es hat sich gezeigt, daß das p28sis-Protein antigenisch und strukturell ähnlich zu von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF) ist. Das v-sis-Gen ist kloniert und seine DNA-Sequenz bestimmt worden (Devare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3179, 1982; Devare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 731, 1983). Teile dieses Gens wurden in Hefe unter Verwendung von POT1-Plasmiden exprimiert.
  • Das SSV-Retrovirus-Genom wurde aus nicht-produktiv infizierten normalen SSV-11-Ratten-Nierenzellen kloniert, die SSV integriert in das Genom. aufwiesen (Devare et al., 1982 ebd.). Die SSV-DNA wurde als 5,8 kb EcoRI-Fragment isoliert und anschließend in pBR322 inseriert, um Plasmid pSSV-11 herzustellen. Ein 1,2 kb v-sis-Fragment wurde dann aus einer Pst I-Verdauungsmischung von pSSV-11 gereinigt und in die PstI-Stelle von pUC13 inseriert. Das resultierende Plasmid wurde als pVSIS/Pst bezeichnet.
  • Die v-sis-Sequenzen wurden dann mit einem Teil aus dem Hefe-Reife-Pheromon-Alpha-Faktor(MFα1)-Gen (Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933–943, 1982) verknüpft, um eine sekretorische Expressionseinheit herzustellen. Plasmid pSSV-11 wurde mit Bam HI und Pvu II verdaut und die Verdauungsprodukte wurden einer Elektrophorese durch ein 1,1 % Agarosegel unterworfen, extrahiert und ethanolgefällt. Die DNA wurde resuspendiert, mit Hph I verdaut, und das 396 by HphI-PvuII-Fragment wurde auf einem 1,25 % Agarosegel gereinigt. Die HphI-Spaltungsstelle wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) geglättet. Die DNA wurde dann mit Bgl II verdaut und das 296 by HphI-BglII-Fragment (5'-v-sis-Fragment) wurde gelgereinigt. Die 3'-v-sis-Sequenz wurde aus Plasmid pVSIS/Pst als ein 756 by BglII-XbaI-Fragment isoliert. Plasmid p192, das ein 1700 by EcoRI-Fragment enthält, welches das MFα1-Gen, inseriert in die EcoRI-Stelle von pUC13, umfaßt, wurde mit HindIII verdaut. DNA-Polymerase 2 (Klenow-Fragment) und alle vier Desoxyribonukleotide wurden dann zur Reaktionsmischung zugegeben. Die DNA wurde dann mit Phenol/CHCl3/Ether extrahiert, konzentriert und mit Eco RI verdaut. Das 1,2 kb EcoRI-HindIII-Fragment (geglättet), das die Promotor- und die sekretorischen Signalsequenzen des MFα1-Gens umfaßt, wurde dann durch Elektrophorese auf einem 0,9 % Agarosegel isoliert. Äquimolare Mengen der 5'-v-sis-, 3'-v-sis- und MFα1-Fragmente plus mit Eco RI + Xba I verdautem pUC12 (Vieira und Messing, ebd., und Messing, ebd.) wurden dann zusammen ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pVSα bezeichnet.
  • Ein zweites MFα1/v-sis-Hybridgen wurde konstruiert, indem die ersten 66 Codon der v-sis-Sequenz deletiert wurden, so daß Codons 67 von v-sis unmittelbar auf die Codons für das Lys-Arg-Verarbeitungssignal von Pro-Alpha-Faktor folgen würde. Um präzise die Codons 1–66 von v-sis zu entfernen, wurde eine oligonukleotidgesteuerte Mutagenese im wesentlichen gemäß der Zwei-Starter-Methode von Zoller und Smith durchgeführt (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983). Eine Matrize wurde durch Verdauen von pVSα mit Xba I, Reinigen des 2,2 kb MFα1-v-sis-Fragmentes, Ligieren desselben mit mit Xba I verdautem. M13mp11 (replikative Form) und Isolieren der Positivstrang-DNA aus transfiziertem E. coli JM101 hergestellt. Dieser Klon als m11VSα bezeichnet.
  • Ein halbes pmol m11VSα wurde mit 1 pmol kinasiertem Oligonukleotid ZC130 (3' AGA AAC CTA TTT TCC TCG GAC CCA5') und 1,5 pmol universellem Sequenzierungsstarter (BRL) unter Anwendung beschriebener Bedingungen (Zoller und Smith, ebd.) hybridisiert, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungsmischung zunächst für 10 Minuten auf 65°C erhitzt, für 10 Minuten auf 37°C heruntergefahren und dann schnell auf Eis abgeschreckt wurde. Die hybridisierte Mischung wurde dann mit Klenow-Polymerase, wie bei Zoller und Smith (ebd.) beschrieben, behandelt, um zirkuläre Duplex-DNA herzustellen. Teile der Verlängerungsmischung wurden verwendet, um E. coli K12 JM101 zu transformieren. Die resultierende Phagen-Plaques wurden durch Transfer auf Nitrozellulosefilter und anschließende Hybridisierung mit 32P-phosphoryliertem ZC130 bei 65°C auf richtige Deletion gescreent. Richtig gegenüber liegende Sequenzen bildeten mit der radioaktiven Sonde bei der verwendeten scharfen Hybridisierungstemperatur stabile Duplizes. Etwa 1 % der gescreenten Transformanden gaben bei Audioradiographie positive Signale. Zehn Klone wurden plaquegereinigt und DNA in replikativer Form wurde für Restriktionsenzym-Analyse hergestellt. Fünf Isolate zeigten das erwartete 1450 by HindIII-BglII-Fragment. DNA-Sequenzanalyse von zwei Isolaten bestätigte, daß die richtige Fusionsverknüpfung hergestellt worden war, wodurch der richtige Translations-Leserahmen beibehalten wurde. Eine dieser Phagen wurde als m11VS2α bezeichnet.
  • Zur Expression in Hefe wurden die VSα- und VS2α-Expressionseinheiten (die die MFα1- und v-sis-Sequenzen umfassen) in der folgenden Art und Weise benachbart zur Hefe-TPI1-Terminator angeordnet. Das TPI1-Terminatorfragment wurde aus Plasmid pFG1 (Alber und Kawasaki, ebd.) erhalten. Es umfallt die Region vom vorletzten Aminosäurecodon des TPI1-Gens bis zur EcoRI-Stelle etwa 700 Basenpaare flußabwärts. Diese einzige EcoRI-Stelle von pFG1 wurde durch eine BamHI-Stelle ersetzt, indem das Plasmid zunächst mit Eco RI geschnitten wurde, die Enden dann mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) geglättet wurden, synthetische BAm HI-Linker (CGGATCCA) zugesetzt wurden und re-ligiert wurde, um Plasmid p136 herzustellen. Der TPI1-Terminator wurde dann als ein XbaI-BamHI-Fragment aus p136 herausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in YEp13 ligiert, das mit XbaI und Bam HI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid ist als p213 bekannt. Die HindIII-Stelle wurde dann aus der TPI1-Terminatorregion von p213 entfernt, indem das Plasmid mit Hind III verdaut wurde, die resultierenden Termini mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) geglättet wurden und das lineare Molekül unter Verwendung von T4-DNA-Ligase rezirkularisiert wurde. Das resultierende Plas- mid ist p270.
  • Plasmid p270 wurde mit Xba I verdaut und mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt, um Re-Ligation der kohäsiven Vektorenden zu verhindern. v-sis-Expressionseinheiten VSα und VS2α wurden durch XbaI-Verdauung und Agarosegel-Reinigung von pVSα bzw. m11VS2α (replikative Form) hergestellt. Jedes der isolierten Fragmente wurde mit einer etwa äquimolaren Menge des phosphatasierten p270-Vektors in Gegenwart von 40 Einheiten T4-DNA-Ligase ligiert und die Ligierungsmischungen in E. coli RR1 transformiert. Plasmid-DNA wurde aus ampicillin-resistenten Kolonien hergestellt und Restriktionsenzym-Analyse durchgeführt, um Klone zu identifizieren, die den TPI-Terminator benachbart zu 3'-v-sis-Sequenzen besaßen. Das Vorhandensein von 3,3 kb oder 3,1 kb BglII-Fragmenten nach Gelelektrophorese deutet auf die richtige Orientierung von YEpVSα bzw. YEpVS2α hin.
  • Die VSα- und VS2α-Sequenzen wurden dann in die stabilen Vektoren pCPOT und pMPOT2 inseriert und der MFα1-Promotor wurde durch den Hefe-TPI1-Promotor ersetzt. Der TPI1-Promotor wurde aus Plasmid pM220 erhalten. E. coli RR1, transformiert mit pM220, ist bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 39853 hinterlegt worden.
  • Plasmid pM220 wurde mit Bgl II und Bam HI verdaut, einer Elektrophorese durch ein 0,9 % Agarosegel unterworfen und das 2,2 kb TPI1-Promotor, MFα1-Gen-Fragment extrahiert. Das gereinigte Fragment wurde mit Pst I verdaut und das resultierende 1 kb BglII-PstI-Fragment wie oben auf Agarosegel gereinigt. Plasmid YEpVS2α wurde mit Pst I und Bam HI verdaut und das 1,8 kb MFα1/v-sis/TPI1-Terminator-Fusionsfragment gelisoliert. Plasmid pCPOT wurde mit Bam HI verdaut, mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt, mit Phenol/CHCl3 extrahiert, dann mit Elektrophorese durch Agarose gereinigt, aus dem Gel extrahiert und EtOH-gefällt.
  • Etwa äquimolare Mengen der drei isolierten Fragmente wurden über Nacht bei 12°C ligiert und die Ligationsmischung verwendet, um E. coli-K-12-Stamm DH1 (Hanahan, D. und Meseleson, M., J. Mol. Biol. 166: 577, 1983) auf Ampicillinresistenz zu transformieren. Plasmid-DNA wurde aus Transformanden gewonnen und Restriktions-Verdauungsanalyse verwendet, um das Vorhandensein des gewünschten ~1500 bp BamHI-SalI-Fragmentes und 800 by SphI-Fragmentes zu verifizieren. Dieses Plasmid wurde mit p117-2 bezeichnt.
  • Plasmid YEpVS2α wurde mit Pst I und Bam HI verdaut und das 1,8 kb Fragment, das die partiellen MFα1-, v-sis-, und TPI1-Terminatorsequenzen umfaßt, wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Plasmid pIC19R wurde mit Pst I und Bam HI verdaut, und das Vektorfragment wurde gelgereinigt und mit dem 1,8 kb Fragment aus YEpVS2α verknüpft, um Plasmid pVS2αT herzustellen.
  • Plasmid pM220 wurde mit Bgl II und Pst 2 verdaut, und das ca. 1 kb Fragment, das den TPI1-Promotor und den 5'-Teil der MFα1-Sequenz umfaßt, wurde isoliert und in mit Bgl II + Pst I verdautem pIC19R kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit Cla I und Pst I verdaut, und das TPI1-Promotor-MFα1-Fragment wurde gelgereinigt. Plasmid pVS2αT wurde dann mit Cla I und Pst I geschnitten und mit dem TPI1-Promotor-MFα1-Fragment verknüpft. Die richtige Konstruktion wurde durch das Vorhandensein eines 2,6 kb ClaI-BamHI-Fragmentes identifiziert und als pTVS2αT bezeichnet.
  • Etwa 10 μg Plasmid pVSα wurden mit Bst EII bis zur Vervollständigung in einem Volumen von 20 μl verdaut. 5 Einheiten Pst I wurden zugegeben, die Mischung wurde 30 Minuten inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von EDTA abgebrochen. Die gelöschte Reaktionsmischung wurde sofort einer Elektrophorese durch 1 % Agarosegel unterworfen, und das ca. 800 bp partielle PstI-BstEII-Band (das den größten Teil der MFα1-Präpro-Sequenz und den 5'-Teil von v-sis umfaßt) wurde herausgeschnitten, aus dem Gel extrahiert und EtOH-gefällt.
  • Plasmid pTVS2αT wurde bis zur Vervollständigung mit Pst I und Bst EII verdaut und durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Das resultierende ca. 4,8 kb Fragment und das 800 by PstI-BStEII-Fragment aus pVSα wurden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase für 6 Stunden bei Raumtemperatur ligiert, und die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli HB101 auf Ampicillinresistenz zu transformieren. Ein Plasmid wurde identifiziert, das ein ca. 1450 bp BglII-Fragment enthielt, was auf das Vorhandensein des Inserts hinwies. Es wurde als pTVSα bezeichnet.
  • Plasmid pTVSα wurde bis zur Vervollständigung mit Cla I und Bam HI verdaut und das ca. 2,9 kb Fragment, das die VSα-Sequenzen enthält, wurde mit Elektrophorese durch Agarose, Extraktion aus dem Gel und EtOH-Fällung isoliert. Das ca. 2,9 kb ClaI-BamHI-VSα-Fragment wurde mit mit Cla I und Bam HI verdautem pMPOT2 ligiert. Der resultierende Vektor wurde als pVSαm bezeichnet.
  • Plasmid pTVS2αT wurde bis zur Vervollständigung mit Cla I und Bam HI in BamHI-Puffer verdaut. Der Puffer wurde auf hohen Salzgehalt eingestellt (Maniatis et al., ebd.) und die DNA wurde bis zur Vervollständigung mit Pvu I verdaut, das die Vektorsequenzen zweimal schneidet und Auflösung des ca. 2,7 kb ClaI-BamHI-Fragmentes, das die VS2α-Sequenzen enthält, auf einem Agarosegel ermöglicht. Dieses Fragment wurde einer Elektrophorese durch 0,9 % Agarose unterworfen, extrahiert und EtOH-gefällt. Das Fragment wurde dann mit ClaI-Bam H1 verdautem pMOT2 in Gegenwart von T4-DNA-Ligase für 20 Stunden bei 13°C ligiert. Die ligierte DNA wurde verwendet, um E. coli HB101 auf Ampicilinresistenz zu transformieren, und Plasmid-DNA wurde aus den resultierenden Kolonien gewonnen. Ein Plasmid, das das 2,7 kb Cla I-Bam HI-VS2α-Fragment enthielt, wurde identifiziert und als pVS2αm bezeichnet.
  • Expressiansvektoren, die v-sis-Sequenzen enthalten, wurden in geeignete Hefe-Wirtstämme transformiert und die Kulturmedien auf das Vorhandensein von PDGF-ähnlichem Material durch enzymverknüpften immunsorbierenden Test (ELISA) untersucht. Von YEP13-abgeleitete Plasmide wurden in S. cerevisiae E8-11c (MATα leu2 pep4) transformiert. Plasmide p117-2, pVSαm und pVS2αm wurden in Stämme mit tpi–-Deletion transformiert. Transformanden wurden in geeigneten Medien bei 30°C bis zu stationärer Phase in einem Drehrüttler bei 220 UPM gezüchtet. Kulturen wurden geerntet, die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die Medien, wie in Beispiel 6 beschrieben, untersucht. Resultate sind in Tabelle 3 angegeben. Expressionsniveaus von v-sis-Sequenzen auf POT1-Plasmiden sind 5–8mal größer als auf herkömmlichen Hefevektoren. TABELLE 1 STABILITÄT VON CDC4-PLASMIDEN
    Figure 00410001
  • TABELLE 2 STABILITÄT VON POT1-PLASMIDEN GEGENÜBER pTPIC10
    Figure 00420001
  • die POT1-Plasmide über diese vielen Teilungen hinweg extrem stabil sind und mit einer kombinierten Häufigkeit deutlich unter 1 % in 30 Zellverdoppelungen verloren gehen. TABELLE 3 EXPRESSION VON v-sis UNTER VERWENDUNG VON POT1 UND VON YEPD13 ABGELEITETEN VEKTOREN
    Plasmid/Stamm PDGF ng/ml
    YEpVSα/E8-11c 0,5–1,5
    pVSαm/E18 4–10
    YEpVS2α/E8-11c 0,8–2,0
    p117-2/E11-3c 5–10
    pVS2αm/E18 6–14
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Plasmid C1/1
  • C1/1 wurde aus Plasmid pJDB248 (Beggs, J., Nature 275, 194–-109 (1978)) konstruiert. Die pMB9-Sequenzen wurden durch partielle Verdauung mit Eco RI aus pJDB248 entfernt und durch pBR322-DNA ersetzt, die mit Eco RI geschnitten wurde. Die Restriktionskarte von C1/1 ist in 6 angegeben. Das C1/1-Plasmid enthält die gesamte 2-Mikron-DNA aus Hefe (S. cerevisiae), mit einer pBR322-Insertion an einer EcoRI-Stelle. Es enthält auch das LEU2-Gen.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von Plasmid pFAT5
  • Das Gen, das für die vorherrschende Form von humanem α1-Antitrypsin (AT) kodiert, wurde aus einer humanen Leber-cDNA-Bibliothek mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung der Pavian-Sequenz (Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78: 6826–6830, 1980; und Chandra et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 103: 751–758, 1981) als einer DNA-Hybridisierungssonde isoliert. Die Bibliothek wurde durch Inserieren humaner Leber-cDNA in die PstI-Stelle des Plasmids PBR322 (Bolivar et al., Gene 2: 95–113, 1977) konstruiert. Das AT-Gen wurde aus der Bibliothek als ein 1500 Basenpaare (bp) langes PstI-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in die PstI-Stelle von pUC13 inseriert, um das Plasmid pUCαl herzustellen. In pUCα1 ist die AT-Sequenz auf dem 3'-Ende durch XbaI- und EcoRI-Stellen im Polylinker flankiert.
  • Der TPI-Terminator wurde aus Plasmid pFG1 (Alber und Kawasaki, ebd.) als ein XbaI-EcoRI-Fragment von etwa 700 bp gereinigt und in pUCα1 inseriert, das mit XbaI und EcoRI gespalten worden war. Diese Konstruktion wurde dann mit EcoRI geschnitten und die Oligonukleotidlinker (Sequenz: AATTCATGGAG GTACCTCCTAG) wurden zugegeben, in multiplen verknüpften Kopien, um eine BamHI-Stelle am 3'-Ende des TPI-Terminators zur Verfügung zu stellen. Das resultierende Plasmid ist als BAT5 bekannt.
  • Das TPI-Promotorfragment wurde aus Plasmid pTPIC10 (Alber und Kawasaki, ebd.) erhalten. Dieses Plasmid wurde an der einzigen KpnI-Stelle geschnitten, die TPI-Kodierungsregion wurde mit Bal31-Exonuklease entfernt und ein EcoRI-Linker (Sequenz: GGAATTCC) wurde am 3'-Ende des Promotors zugefügt. Verdauung mit BglII- und EcoRI lieferte ein TPI-Promotorfragment mit kohäsiven BglII und EcoRI-Enden. Dieses Fragment wurde dann mit Plasmid YRp7'(Stinchcomb, et al. Nature 282: 39–43, 1979) verknüpft, das mit BglII und EcoRI geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid, TE32, wurde mit EcoRI und BamHI gespalten, um einen Teil des Tetracyclinresistenzgens zu entfernen. Das linearisierte Plasmid wurde dann durch die Zugabe des oben beschrieben EcoRI-BamHI-Linkers rezirkularisiert, um Plasmid TEA32 zu produzieren. TEA32 wurde dann mit BglII und BamHI gespalten und der TPI-Promotor als ein Fragment von etwa 900 bp gereinigt.
  • Um Plasmid pFAT5 zu konstruieren, wurde Plasmid C1/1 mit BamHI linearisiert und mit dem 900 bp TPI-Promotorfragment aus TEA32 verknüpft. Die resultierende Konstruktion, bekannt als Plasmid F, hat eine einzige BamHI-Stelle, die am 3'-Ende des TPI-Promotors angesiedelt ist. Dieses Plasmid wurde BamHI geschnitten und ein 2200 bp BamHI-Fragment, das die AT kodierende Sequenz und den TPI-Terminator umfaßt, wurde aus BAT5 gereinigt und in die BamHI-Stelle inseriert. Das resultierende Plasmid, bekannt als pFAT5, ist in 7 dargestellt.
  • Beispiel 5
  • Test auf α1-Antitrypsin
  • Als Kontrolle wurden 10 Mikroliter (1 Mikrogramm) einer Lösung von 100 Mikrogramm/ml Trypsin, 100 Mikrogramm (100 Mikroliter) Rinderserum-Albumin und 100 μl 0,05 molarer TRIS-Puffer, pH 8,0, enthaltend 1 mM Benzoylargininoyl-p-nitroanilid, vermischt, und der Anstieg in der Extinktion bei 405 nm wurde in einem Spektrophotometer über die Zeit gemessen. Der Extinktionswert dieser Lösung wurde als Standard für 100 % Trypsinaktivität verwendet. Alle untersuchten Proben enthielten gleiche Konzentrationen an Substrat und Rinderserum-Albumin.
  • Beispiel 6
  • Nachweis von PDGF-ähnlichem Material durch enzymverknüpften immunsorbierenden Test (ELISA)
  • Die Expression von PDGF-ähnlichen Molekülen durch die Hefe-Transformanden wurde mit ELISA untersucht und durch Vergleich mit einer Standardkurve quantifiziert, die mit gereinigtem humanen PDGF entwickelt worden war (Raines und Ross, J. Biol. Chem. 257: 5154). Eine typische Standardkurve wurde wie folgt hergestellt. Gereinigtes humanes PDGF, 2,5 ng/ml in PBS, wurde über Nacht mit Immulon II (Dynatech Laboratories, Inc.) auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (100 μl/Vertiefung) bei 4°C inkubiert. Diese Beschichtung wurde entfernt und 100 μl/Vertiefung 0,1 % Kaninchen-Albumin in PBS wurden zugegeben und die Platten für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Proben von gereinigtem PDGF (0,1–40 ng/ml) wurden separat mit Ziegen-anti-PDGF-IgG (5 μg/ml) in PBS, das 0,05 % Tween 20 und 1 mg/ml Kaninchen-Albumin (RSA) enthielt, inkubiert. Die Mikrotiterplatten wurden 5mal mit 0,9 % NaCl, 0,05 % Tween 20 gewaschen, entleert und 100 μl von jeder Testlösung wurden zu den Mikrotitervertiefungen zugegeben und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen und peroxidasekonjugiertes Schweine-anti-Ziegen-IgG (Tago, Inc.), verdünnt 1:1000 in PBS, das 0,05 % Tween 20 und 1 mg/ml RSA enthielt, wurde für 2 Stunden bei 37°C zugegeben. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen und frisch hergestelltes 0,04 % o-Phenylendiamin, das 0,012 % Wasserstoffperoxid enthielt, (100 μl/Vertiefung), wurde für 50 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und die Reaktion nach 50 Minuten durch Zugabe von 4N H2SO4 (50 μl/Vertiefung) abgebrochen. Extinktion bei 492 nm wurde unter Verwendung eines Dynatech-Plattenscanners bestimmt. Jeder Testpunkt wurde dreifach gemessen.
  • Hefekultur-Medienproben wurden in PBS verdünnt, wie beschrieben untersucht und mit der PDGF-Standardkurve verglichen. Tabelle 3 ist eine Zusammenfassung von Testergebnissen für eine repräsentative Reihe von Experimenten.

Claims (16)

  1. Verfahren zum Herstellen eines fremden Proteinproduktes in einer eukaryotischen Wirtszelle, umfassend die Schritte: a) Transformieren der Wirtszelle mit einem DNA-Molekül und b) Selektieren des Transformanden aus Schritt a) durch Kultivieren der Wirtszelle auf einem Selektions-Nährmedium dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die Wirtszelle ein Manko in einem Gen aufweist, dessen Expression für normales Zellwachstum auf einem Komplexmedium wesentlich ist, und das DNA-Molekül ein Gen als selektierbaren Marken, das, wenn exprimiert, besagtes Manko komplementiert, und eine Sequenz, die für das fremde Proteinprodukt kodiert, umfasst, und in Schritt b) das Selektions-Nährmedium ein Komplex-Nährmedium ist, welches Antibiotika oder Schwermetalle nicht zu enthalten braucht und nicht um spezifische Nährstoffe abgereichert zu sein braucht, wobei dieses Verfahren keine weitere Selektion auf einem speziellen Medium erfordert, das Antibiotika oder Schwermetalle enthält oder um spezifische Nährstoffe abgereichert ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das fremde Protein kodiert, in Schritt b) exprimiert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das fremde Proteinprodukt α-1-Antitrypsin ist.
  4. Verfahren zum Herstellen von transformierten eukaryotischen Zellen, umfassend die Schritte: a) Unterwerfen von Wirtszellen unter transformierende Bedingungen in Gegenwart einer DNA-Konstruktion und b) Unterwerfen der Zellen aus Schritt a) unter ein Wachstum in einem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die Wirtszellen ein Manko in einem Gen aufweisen, dessen Expression für normales Zellwachstum auf Komplexmedien wesentlich ist, und die DNA-Konstruktion ein Gen als selektierbaren Macker umfasst, welches, wenn exprimiert, besagtes Manko komplementiert, und in Schritt b) das Nährmedium ein Komplexmedium ist, welches Antibiotika oder Schwermetalle nicht zu enthalten braucht und nicht um spezifische Nährstoffe abgereichert zu sein braucht, wodurch transformierte Zellen lebensfähig bleiben und sich vermehren, während nicht transformierte Zellen sich wegen gesagten Mankos nicht vermehren, und wobei dieses Verfahren keine weitere Selektion auf einem speziellen Medium erfordert, das Antibiotika oder Schwermetalle enthält oder um spezifische Nährstoffe abgereichert ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen, das als selektierbarer Marken funktioniert, ein Gen ist, das für Wirtszellteilung, Zellwandbiosynthese, Membranbiosynthese, Organellenbiosynthese, Proteinsynthese, Kohlenstoffquellennutzung, RNA-Transkription oder DNA-Replikation erforderlich ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Gen ein Gen des Hefezellteilungszyklus oder ein Gen des Glycolyse-Weges ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Wirtszelle eine Saccharomyces cerevisiae-Zelle ist und besagtes Gen ein Saccharomyces cerevisiae-Gen ist, ausgewählt aus Genen, die die Enzyme Pyruvat-Kinase, Triose-Phosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase, Phosphoglycerat-Mutase, Phosphoglycerat-Kinase, Phospho-Fructokinase, Hexokinase oder Glucokinase kodieren, und dem Regulator-Gen GCR1.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Gen ein Hefe-CDC4-Gen ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Gen, das als selektierbarer Marker funktioniert, ein Schizosaccharomyces pombe-Triose-Phosphat-Isomerase-Gen ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Gen, das als selektierbarer Marken funktioniert, aus einer Zellspezies ist, die von besagter Wirtszelle verschieden ist.
  11. DNA-Konstruktion zum Herstellen eines fremden Proteinproduktes in einem eukaryotischen Wirt, welches als selektierbaren Marken, welcher die Selektion auf einem Komplexmedium gestattet, ein Gen, welches, wenn exprimiert, ein Manko in einer Wirtszelle komplementiert, wobei besagtes Manko in einem Gen vorliegt, das für Wirtszellteilung, Zellwandbiosynthese, Membranbiosynthese, Organellenbiosynthese, Proteinsynthese, Kohlenstoffquellennutzung, RNA-Transkription oder DNA-Replikation erforderlich ist, und eine DNA-Sequenz, die für ein fremdes Proteinprodukt kodiert, welches in der Wirtszelle exprimiert wird, umfasst, wobei diese DNA-Sequenz nicht als selektierbaren Marker in der Wirtszelle funktioniert, wobei besagtes Proteinprodukt ausgewählt ist aus α-1-Antitrypsin, Interferonen, Insulin, Proinsulin und Gewebeplasminogenaktivator.
  12. DNA-Konstruktion nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen, das als selektierbarer Marken funktioniert, ein Gen wie in einem der Ansprüche 6 bis 9 angegeben ist.
  13. DNA-Konstruktion nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Plasmid umfasst, das aus der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 20699 erhältlich ist.
  14. Transformierter Stamm, dadurch gekennzeichnet, dass er eine DNA-Konstruktion enthält, die ausgewählt ist aus den Konstruktionen nach einem der Ansprüche 11 bis 13, und das fremde Protein exprimiert.
  15. Verfahren zum Herstellen der DNA-Konstruktion nach Anspruch 11, umfassend das Einführen des Gens, das als selektierbarer Macker funktioniert, in einen Vektor, der in der Lage ist, besagten Wirt zu transformieren, so dass besagtes Gen nach einer solchen Transformation in besagtem Wirt phänotypisch exprimierbar ist.
  16. Verwendung der DNA-Konstruktion nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zum Herstellen eines fremden Proteins in einem eukaryotischen Wirt.
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