JPH0767685A - 形質転換細胞を選択する方法 - Google Patents
形質転換細胞を選択する方法Info
- Publication number
- JPH0767685A JPH0767685A JP6118650A JP11865094A JPH0767685A JP H0767685 A JPH0767685 A JP H0767685A JP 6118650 A JP6118650 A JP 6118650A JP 11865094 A JP11865094 A JP 11865094A JP H0767685 A JPH0767685 A JP H0767685A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- plasmid
- fragment
- yeast
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
- C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 形質転換された細胞を選択する方法を提供
すること。 【構成】 (a) 複合培養基での正常な細胞成育に必要
な機能に欠陥を持つ宿主細胞を、上記欠陥を補う遺伝子
を含むＤＮＡ構成物の存在下で形質転換条件に付すこ
と、(b) 段階(a) からの細胞を栄養素培養基中で生育条
件に付し、もって形質転換した細胞を生育しうるまま保
ちかつ増殖させ、一方、形質転換しなかった細胞は上記
欠陥の故に増殖できないようにすることの段階を含む方
法。
すること。 【構成】 (a) 複合培養基での正常な細胞成育に必要
な機能に欠陥を持つ宿主細胞を、上記欠陥を補う遺伝子
を含むＤＮＡ構成物の存在下で形質転換条件に付すこ
と、(b) 段階(a) からの細胞を栄養素培養基中で生育条
件に付し、もって形質転換した細胞を生育しうるまま保
ちかつ増殖させ、一方、形質転換しなかった細胞は上記
欠陥の故に増殖できないようにすることの段階を含む方
法。
Description
【０００１】
【発明の背景】組換えＤＮＡ技術による有用なポリペプ
チド生成物の製造のために微生物を用いることは、産業
として確立されつつある。異種の遺伝子物質を微生物培
養物に導入することができ、適当な細胞内及び細胞外条
件を与えてやると望む蛋白質生成物が異種遺伝子から合
成されうる。このような遺伝子物質は一般にプラスミド
の形で微生物に導入され、これは染色体外遺伝要素を自
律的に複製する。軽質転換された細胞培養物内でプラス
ミドを維持することを保証するために、これら細胞を特
別の条件下で生育することが必要であった。このような
条件がないと、本質的に不安定であるプラスミドは維持
されず、細胞集団は非形質転換状態に戻るであろう。プ
ラスミドの安定性の増大及びコピー数の増大は、常に高
いレベルにプラスミドがコードする蛋白質の製造を維持
する手段として生物工学にとって重要である。プラスミ
ド安定性を増すための従来報告された試みは、実際の適
用のために最適ではないようである。ＡＲＳ保持プラス
ミドへの酵母動原体（セントロメア）の導入は、安定性
を高めるが、プラスミドコピー数をかなり減少すること
が判った（クラーケ（Clarke) 及びカーボン（Carbon)
、ネイチア（Nature）、２８７：５０４−５０９、１
９８０、及びスティンクコム（Stinchcomb）ら、ジェ
イ、モレキュラーバイオロジー（J. Molec. Biol.)、１
５８：１５７−１７９、１９８２）。線形の動原体酵母
プラスミドは同様に、安定性とコピー数の逆相関を示す
（マレイ（Murray) 及びスゾスタク（Szostak)、ネイチ
ア（Nature）、３０５：１８９−１９３、１９８３）。
チド生成物の製造のために微生物を用いることは、産業
として確立されつつある。異種の遺伝子物質を微生物培
養物に導入することができ、適当な細胞内及び細胞外条
件を与えてやると望む蛋白質生成物が異種遺伝子から合
成されうる。このような遺伝子物質は一般にプラスミド
の形で微生物に導入され、これは染色体外遺伝要素を自
律的に複製する。軽質転換された細胞培養物内でプラス
ミドを維持することを保証するために、これら細胞を特
別の条件下で生育することが必要であった。このような
条件がないと、本質的に不安定であるプラスミドは維持
されず、細胞集団は非形質転換状態に戻るであろう。プ
ラスミドの安定性の増大及びコピー数の増大は、常に高
いレベルにプラスミドがコードする蛋白質の製造を維持
する手段として生物工学にとって重要である。プラスミ
ド安定性を増すための従来報告された試みは、実際の適
用のために最適ではないようである。ＡＲＳ保持プラス
ミドへの酵母動原体（セントロメア）の導入は、安定性
を高めるが、プラスミドコピー数をかなり減少すること
が判った（クラーケ（Clarke) 及びカーボン（Carbon)
、ネイチア（Nature）、２８７：５０４−５０９、１
９８０、及びスティンクコム（Stinchcomb）ら、ジェ
イ、モレキュラーバイオロジー（J. Molec. Biol.)、１
５８：１５７−１７９、１９８２）。線形の動原体酵母
プラスミドは同様に、安定性とコピー数の逆相関を示す
（マレイ（Murray) 及びスゾスタク（Szostak)、ネイチ
ア（Nature）、３０５：１８９−１９３、１９８３）。
【０００２】プラスミドは典型的には、選択しうるマー
カーとして遺伝配列を含み、これは抗性物質抵抗性をコ
ードするか又は宿主細胞の栄養的要求を補う。プラスミ
ドの存在について選択するために、形質転換細胞は、選
択薬剤を含む又は特定の栄養素を除いた特別の培養基中
で生育させなければならない。これら培養基の要求は高
価でありかつ大規模醗酵プロセスの間の最適細胞生長速
度を妨げる。このようなプラスミドの多くは、文献で報
告されている。抗生物質抵抗遺伝子を含むものとして
は、ｐＢＲ３２２（ボリバー（Bolivar)ら、ジーン（Ge
ne) 、２：９５−１１３、１９７７）及びその誘導体た
とえばｐＵＣベクター（ビエイラ（Vieira）及びメシン
グ（Messing)、ジーン（Gene) 、１９：２５９−２６
８、１９８２）（アンピシリン抵抗のための遺伝子を持
つ）；及びｐＢＲ３２５（プレントキイ（Prentki)ら、
ジーン（Gene) 、１４：２８９、１９８１）（アンピシ
リン、テトラサイクリン、及びクロラムフェニコールに
対する抵抗遺伝子を持つ）が挙げられる。宿主の栄養的
要求を補うプラスミドとしては酵母ベクターＹＥｐ１３
（ブローチ（Broach) ら、ジーン（Gene) 、８：１２１
−１３３、１９７９）（これはＬＥＵ２遺伝子を持
つ）；及びＹＲｐ７’（スティンクコム（Stinchcomb)
ら、ネイチア（Nature）、２８２：３９、１９７９）
（これはＴＲＰ１遺伝子を持つ）が挙げられる。
カーとして遺伝配列を含み、これは抗性物質抵抗性をコ
ードするか又は宿主細胞の栄養的要求を補う。プラスミ
ドの存在について選択するために、形質転換細胞は、選
択薬剤を含む又は特定の栄養素を除いた特別の培養基中
で生育させなければならない。これら培養基の要求は高
価でありかつ大規模醗酵プロセスの間の最適細胞生長速
度を妨げる。このようなプラスミドの多くは、文献で報
告されている。抗生物質抵抗遺伝子を含むものとして
は、ｐＢＲ３２２（ボリバー（Bolivar)ら、ジーン（Ge
ne) 、２：９５−１１３、１９７７）及びその誘導体た
とえばｐＵＣベクター（ビエイラ（Vieira）及びメシン
グ（Messing)、ジーン（Gene) 、１９：２５９−２６
８、１９８２）（アンピシリン抵抗のための遺伝子を持
つ）；及びｐＢＲ３２５（プレントキイ（Prentki)ら、
ジーン（Gene) 、１４：２８９、１９８１）（アンピシ
リン、テトラサイクリン、及びクロラムフェニコールに
対する抵抗遺伝子を持つ）が挙げられる。宿主の栄養的
要求を補うプラスミドとしては酵母ベクターＹＥｐ１３
（ブローチ（Broach) ら、ジーン（Gene) 、８：１２１
−１３３、１９７９）（これはＬＥＵ２遺伝子を持
つ）；及びＹＲｐ７’（スティンクコム（Stinchcomb)
ら、ネイチア（Nature）、２８２：３９、１９７９）
（これはＴＲＰ１遺伝子を持つ）が挙げられる。
【０００３】従って本発明の目的は、選択しうるマーカ
ーとして、その生成物が複合培養基上での宿主細胞の生
育性又は正常生育のために必須であるところの遺伝子配
列を含むＤＮＡ構成物を提供することである。本発明の
別の目的は、複合培養基上での生育により選択しうるプ
ラスミドを含む微生物の形質転換体株を提供することで
ある。本発明のさらに別の目的は、本質的機能において
欠陥を持ち、この欠陥的本質的機能を補う遺伝子配列を
持つＤＮＡ構成物のための宿主として行動しうる微生物
の株を提供することである。本発明の別の目的は、形質
転換した微生物において異種蛋白質を作る方法におい
て、蛋白質が宿主微生物における必須遺伝子の欠陥を補
う遺伝子配列を選択マーカーとして含むＤＮＡ構成物上
に含まれる遺伝子の生成物であるところの方法を提供す
ることである。本発明の他の目的は当業者にとって明ら
かとなろう。
ーとして、その生成物が複合培養基上での宿主細胞の生
育性又は正常生育のために必須であるところの遺伝子配
列を含むＤＮＡ構成物を提供することである。本発明の
別の目的は、複合培養基上での生育により選択しうるプ
ラスミドを含む微生物の形質転換体株を提供することで
ある。本発明のさらに別の目的は、本質的機能において
欠陥を持ち、この欠陥的本質的機能を補う遺伝子配列を
持つＤＮＡ構成物のための宿主として行動しうる微生物
の株を提供することである。本発明の別の目的は、形質
転換した微生物において異種蛋白質を作る方法におい
て、蛋白質が宿主微生物における必須遺伝子の欠陥を補
う遺伝子配列を選択マーカーとして含むＤＮＡ構成物上
に含まれる遺伝子の生成物であるところの方法を提供す
ることである。本発明の他の目的は当業者にとって明ら
かとなろう。
【０００４】
【発明の構成】本発明に従い、ＤＮＡ構成物が特別に選
ばれた培養基を必要とせずに高いコピー数で維持される
ところのＤＮＡ構成物及び適当な宿主細胞が提供され
る。そのような条件における生育は、より速い細胞分
裂、より大きな細胞密度及び低減された生産コストをも
たらすであろう。本発明はさらに、複合培養基中での正
常細胞生育に必要な機能に欠陥を持つ宿主細胞において
蛋白質生成物を作る方法において、この欠陥を補う遺伝
子及び蛋白質生成物をコードする配列を含むＤＮＡ分子
で宿主細胞を形質転換する段階を含む方法を提供する。
本方法はまた、ＤＮＡ構成物、とくにプラスミド、及び
これら構成物を含む形質転換体株を提供する。本明細書
においてＤＮＡ構成物という言葉は、分子内のヌクレオ
チド配列が自然に作られる配列と同じでないような様式
で人工的に変性された任意のＤＮＡ分子を意味する。Ｄ
ＮＡ構成物という言葉はまた、そのように変性されたＤ
ＮＡ分子のクローンをも包含する。発現ベクターという
言葉は、複製の自律的部位、転写開始部位、及び宿主生
物中で発現されるべき蛋白質をコードする少なくとも一
つの構造遺伝子を含むＤＮＡ構成物として定義される。
発現ベクターは通常また、宿主生物中での蛋白質の発現
を制御するプロモーター及びターミネーターのような適
当な制御領域を含むであろう。本発明に従う発現ベクタ
ーはまた、本明細書で述べる必須遺伝子を含む選択マー
カーを含むであろう。プラスミドという言葉は、その一
般に認められている意味を持つ、すなわち自律的に複製
する通常閉じたループのＤＮＡを意味する。
ばれた培養基を必要とせずに高いコピー数で維持される
ところのＤＮＡ構成物及び適当な宿主細胞が提供され
る。そのような条件における生育は、より速い細胞分
裂、より大きな細胞密度及び低減された生産コストをも
たらすであろう。本発明はさらに、複合培養基中での正
常細胞生育に必要な機能に欠陥を持つ宿主細胞において
蛋白質生成物を作る方法において、この欠陥を補う遺伝
子及び蛋白質生成物をコードする配列を含むＤＮＡ分子
で宿主細胞を形質転換する段階を含む方法を提供する。
本方法はまた、ＤＮＡ構成物、とくにプラスミド、及び
これら構成物を含む形質転換体株を提供する。本明細書
においてＤＮＡ構成物という言葉は、分子内のヌクレオ
チド配列が自然に作られる配列と同じでないような様式
で人工的に変性された任意のＤＮＡ分子を意味する。Ｄ
ＮＡ構成物という言葉はまた、そのように変性されたＤ
ＮＡ分子のクローンをも包含する。発現ベクターという
言葉は、複製の自律的部位、転写開始部位、及び宿主生
物中で発現されるべき蛋白質をコードする少なくとも一
つの構造遺伝子を含むＤＮＡ構成物として定義される。
発現ベクターは通常また、宿主生物中での蛋白質の発現
を制御するプロモーター及びターミネーターのような適
当な制御領域を含むであろう。本発明に従う発現ベクタ
ーはまた、本明細書で述べる必須遺伝子を含む選択マー
カーを含むであろう。プラスミドという言葉は、その一
般に認められている意味を持つ、すなわち自律的に複製
する通常閉じたループのＤＮＡを意味する。
【０００５】添付した図面において図１はプラスミドｐ
Ｂ４の構築を示す。図２はプラスミドｐＢ５の構築を示
す。図３はプラスミドｐＢ１５Ｌの構築を示す。図４
は、プラスミドｐＢ５及びｐＢ１５Ｌで共形質転換され
たＳ．セレビシエ（cerevisiae）株Ａ２．７．ｃからＤ
ＮＡのサザンブロットを示す。このブロットは、ゲノム
ＣＤＣ４遺伝子座の破壊をテストするためにＣＤＣ４の
５’フランキング（flanking）領域からの2.５kb Bam H
I-Hind IIIフラグメントでプローブされた。レーンａ
は、ｐＢ５のみで形質転換された細胞からのＤＮＡを含
む；レーンｂは非形質転換細胞、レーンｃ〜ｈは共形質
転換体からのＤＮＡを含む。矢印はプローブにハイブリ
ダイゼーションするゲノムフラグメントを示す。図５〜
図８は、Ｓ．ポンベ（pombe)POT1及びＳ．セレビシエ
（cerevisiae)TPI1遺伝子の配列ならびに各々の推定さ
れた蛋白質配列を示す。全Ｓ．ポンベＴＰＩ蛋白質配列
が示されている。Ｓ．セレビシエ蛋白質の配列は、それ
がＳ．ポンベ配列と異る場所のみ示される。Ｓ．セレビ
シエ蛋白質配列における位置１のメチオニンは成熟蛋白
質には存在しない。図９はプラスミドｐＣＰＯＴの構築
を示す。図１０はプラスミドｐＦＡＴＰＯＴの構築を示
す。図１１はプラスミドｐＴＰＩ−ＬＥＵ２の構築を示
す。図１２はプラスミドｐＩＣ１９Ｒのポリリンカー配
列の一部を示す。図１３はプラスミドｐＭＰＯＴ２を示
す。
Ｂ４の構築を示す。図２はプラスミドｐＢ５の構築を示
す。図３はプラスミドｐＢ１５Ｌの構築を示す。図４
は、プラスミドｐＢ５及びｐＢ１５Ｌで共形質転換され
たＳ．セレビシエ（cerevisiae）株Ａ２．７．ｃからＤ
ＮＡのサザンブロットを示す。このブロットは、ゲノム
ＣＤＣ４遺伝子座の破壊をテストするためにＣＤＣ４の
５’フランキング（flanking）領域からの2.５kb Bam H
I-Hind IIIフラグメントでプローブされた。レーンａ
は、ｐＢ５のみで形質転換された細胞からのＤＮＡを含
む；レーンｂは非形質転換細胞、レーンｃ〜ｈは共形質
転換体からのＤＮＡを含む。矢印はプローブにハイブリ
ダイゼーションするゲノムフラグメントを示す。図５〜
図８は、Ｓ．ポンベ（pombe)POT1及びＳ．セレビシエ
（cerevisiae)TPI1遺伝子の配列ならびに各々の推定さ
れた蛋白質配列を示す。全Ｓ．ポンベＴＰＩ蛋白質配列
が示されている。Ｓ．セレビシエ蛋白質の配列は、それ
がＳ．ポンベ配列と異る場所のみ示される。Ｓ．セレビ
シエ蛋白質配列における位置１のメチオニンは成熟蛋白
質には存在しない。図９はプラスミドｐＣＰＯＴの構築
を示す。図１０はプラスミドｐＦＡＴＰＯＴの構築を示
す。図１１はプラスミドｐＴＰＩ−ＬＥＵ２の構築を示
す。図１２はプラスミドｐＩＣ１９Ｒのポリリンカー配
列の一部を示す。図１３はプラスミドｐＭＰＯＴ２を示
す。
【０００６】本発明は、必須遺伝子がプラスミドのよう
なＤＮＡ構成物上で選択マーカーとして用いられうると
いう発見に部分的に基づく。必須遺伝子という言葉は、
複合培養基上での細胞生育性又は正常生育のために必要
な機能をコードする任意の遺伝子と定義される。複合培
養基は、その組成が良く定義されない物質から栄養素が
導かれた培養基、たとえば粗細胞抽出物、肉抽出物、フ
ルーツジュース、血清、蛋白質加水分解物などである。
従って本発明に従う望む形質転換体を選別するために、
選別生育培養基は、単に慣用の複合生育培養基であり、
比較的高価な抗生物質、金属拮抗剤、又は非形質転換宿
主細胞に致命的な他の剤を含む、又は非形質転換宿主に
必要な一又は二以上の特定の栄養素を欠く特別の培養基
ではない。必須遺伝子としては、細胞分裂、膜生合成、
細胞壁生合成、細胞小器官生合成、蛋白質合成、炭素源
利用、ＲＮＡ転写及びＤＮＡ複製のための遺伝子が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。
なＤＮＡ構成物上で選択マーカーとして用いられうると
いう発見に部分的に基づく。必須遺伝子という言葉は、
複合培養基上での細胞生育性又は正常生育のために必要
な機能をコードする任意の遺伝子と定義される。複合培
養基は、その組成が良く定義されない物質から栄養素が
導かれた培養基、たとえば粗細胞抽出物、肉抽出物、フ
ルーツジュース、血清、蛋白質加水分解物などである。
従って本発明に従う望む形質転換体を選別するために、
選別生育培養基は、単に慣用の複合生育培養基であり、
比較的高価な抗生物質、金属拮抗剤、又は非形質転換宿
主細胞に致命的な他の剤を含む、又は非形質転換宿主に
必要な一又は二以上の特定の栄養素を欠く特別の培養基
ではない。必須遺伝子としては、細胞分裂、膜生合成、
細胞壁生合成、細胞小器官生合成、蛋白質合成、炭素源
利用、ＲＮＡ転写及びＤＮＡ複製のための遺伝子が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。
【０００７】プラスミドのようなＤＮＡ構成物上の選択
しうるマーカーとして必須遺伝子を用いるために、適当
な突然変異宿主細胞株を用意することが必要である。ロ
ススティン（Rothstein)、メス．インエンツィモロジイ
（Meth. in Enzymlogy）、１０１：２０２−２１０、１
９８３、の一段階遺伝子破壊（disruptiono)法又は本明
細書で記載する共形質転換法を用いて、ゲノム中で適当
な必須遺伝子を欠く適当な宿主株が構成されうる。その
ような欠除突然変異体は、突然変異がプラスミド担持遺
伝子物質でコードされる機能により捕われるとき生育す
る。宿主のゲノムの必須遺伝子（単数又は複数）の欠除
がコード領域及び／又はフランキング（flanking) 領域
の実質的セグメントを含むことが好ましい。もし必須遺
伝子における突然変異（単数又は複数）が単に点突然変
異を達成する様式で行われるなら、突然変異宿主細胞が
組換修復メカニズムにより野生型に先祖返りし、それに
よりプラスミド担持遺伝子の使用により達成できる選択
性を低減する又は除去することが起りうる。必須遺伝子
はしばしば複数のコピー（multiplecopies) 中に（たと
えばヒストン又はリボソームＲＮＡ遺伝子）及び／又は
複数の関連した遺伝子群と呼ばれる形（たとえば種々の
ヘキソキナーゼ遺伝子、又は種々のＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子）で存在する。そのような場合、これら冗長な機
能は配列的に突然変異されて、所定の必須機能を多重的
に欠く宿主細胞を作るかも知れない。しかし遺伝子の活
動性を増すために高コピー数プラスミドを用いることに
より、プラスミド上の単一の必須遺伝子が複数の宿主細
胞欠陥を補いうる。高コピー数プラスミドは、クローニ
ングされた異種遺伝子のコピー数の増加が該遺伝子でコ
ードされる蛋白質生成物の生産を増すので望ましい。
しうるマーカーとして必須遺伝子を用いるために、適当
な突然変異宿主細胞株を用意することが必要である。ロ
ススティン（Rothstein)、メス．インエンツィモロジイ
（Meth. in Enzymlogy）、１０１：２０２−２１０、１
９８３、の一段階遺伝子破壊（disruptiono)法又は本明
細書で記載する共形質転換法を用いて、ゲノム中で適当
な必須遺伝子を欠く適当な宿主株が構成されうる。その
ような欠除突然変異体は、突然変異がプラスミド担持遺
伝子物質でコードされる機能により捕われるとき生育す
る。宿主のゲノムの必須遺伝子（単数又は複数）の欠除
がコード領域及び／又はフランキング（flanking) 領域
の実質的セグメントを含むことが好ましい。もし必須遺
伝子における突然変異（単数又は複数）が単に点突然変
異を達成する様式で行われるなら、突然変異宿主細胞が
組換修復メカニズムにより野生型に先祖返りし、それに
よりプラスミド担持遺伝子の使用により達成できる選択
性を低減する又は除去することが起りうる。必須遺伝子
はしばしば複数のコピー（multiplecopies) 中に（たと
えばヒストン又はリボソームＲＮＡ遺伝子）及び／又は
複数の関連した遺伝子群と呼ばれる形（たとえば種々の
ヘキソキナーゼ遺伝子、又は種々のＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子）で存在する。そのような場合、これら冗長な機
能は配列的に突然変異されて、所定の必須機能を多重的
に欠く宿主細胞を作るかも知れない。しかし遺伝子の活
動性を増すために高コピー数プラスミドを用いることに
より、プラスミド上の単一の必須遺伝子が複数の宿主細
胞欠陥を補いうる。高コピー数プラスミドは、クローニ
ングされた異種遺伝子のコピー数の増加が該遺伝子でコ
ードされる蛋白質生成物の生産を増すので望ましい。
【０００８】必須遺伝子を持つプラスミドの高コピー数
を含む形質転換体の選択は、各プラスミド担持必須遺伝
子の発現レベルを下げることにより及び／又はプラスミ
ド担持選択マーカーによりコードされる遺伝子生産物の
活動性を下げることにより達成されうる。一つのアプロ
ーチは、必須遺伝子を突然変異させて、遺伝子の転写及
び／又は翻訳速度を下げる又は遺伝子生成物をより低い
特定の活動性を持つように変えることである。選択マー
カーとして用いられる必須遺伝子の発現レベルを低減さ
せる別の方法は、宿主細胞における欠陥を補うために別
の生物からの遺伝子を用いることである。そのような異
種遺伝子は、転写及び／又は翻訳のためのシグナルが異
る種において最適より下であるので宿主細胞における発
現について突然に欠陥的であるか、又は遺伝子生成物は
それが異種細胞環境中にあるので活動性を低減させる。
を含む形質転換体の選択は、各プラスミド担持必須遺伝
子の発現レベルを下げることにより及び／又はプラスミ
ド担持選択マーカーによりコードされる遺伝子生産物の
活動性を下げることにより達成されうる。一つのアプロ
ーチは、必須遺伝子を突然変異させて、遺伝子の転写及
び／又は翻訳速度を下げる又は遺伝子生成物をより低い
特定の活動性を持つように変えることである。選択マー
カーとして用いられる必須遺伝子の発現レベルを低減さ
せる別の方法は、宿主細胞における欠陥を補うために別
の生物からの遺伝子を用いることである。そのような異
種遺伝子は、転写及び／又は翻訳のためのシグナルが異
る種において最適より下であるので宿主細胞における発
現について突然に欠陥的であるか、又は遺伝子生成物は
それが異種細胞環境中にあるので活動性を低減させる。
【０００９】複合培養基上での細胞生育性又は正常生育
に必要な幅広い範囲の機能が存在する。必須遺伝子の欠
陥又は欠除は、致死、細胞分裂速度の減少、細胞分裂の
停止、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白合成の停止、膜合成の停
止、細胞壁合成の停止、細胞小器官合成の停止、糖代謝
の欠陥などをもたらす。必須遺伝子の例としては、酵母
サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）のＣＤＣ（細胞分裂サイクル）遺伝子（総説として
プリングル・アンド・ハートウェル（Pringle and Hart
well) 、ザ・サッカロミセス・セレビシエ・セル・サイ
クル（The Saccharomyces cerevisiae Cell Cycle)、ス
トラサーン（Strathern)ら編、ザ・モレキュラー・バイ
オロジイ・オブ・ザ・イースト・サッカロミセス・ライ
フ・サイクル・アンド・インヘリタンス（The Molecula
r Biology of tho Yeast Saccharomyces Life Cycle an
d Inheritance)、９７−１４２、コールド・スプリング
・ハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８１）、Ｓ．
セレビシエ及びＥ．コリ（coli解糖経路の機能をコード
する遺伝子、及びＳ．セレビシエのＳＥＣ（ノビック
（Novick) とセックマン(Schekman)、プロク．ナト．ア
カド．サイ．ユーエスエー（Proc. Nat. Acad. Sci. US
A)、７６：１８５６−１８６２、１９７９、及びノビッ
クら、セル（Cell) 、２１：２０５−２１５、１９８
０）、及びＩＮＯ（カルバートソン（Culbertson) とヘ
ンリー（Henry)、ジェネティックス（Genetics）、８
０：２３−４０、１９７５）遺伝子が挙げられる。
に必要な幅広い範囲の機能が存在する。必須遺伝子の欠
陥又は欠除は、致死、細胞分裂速度の減少、細胞分裂の
停止、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白合成の停止、膜合成の停
止、細胞壁合成の停止、細胞小器官合成の停止、糖代謝
の欠陥などをもたらす。必須遺伝子の例としては、酵母
サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）のＣＤＣ（細胞分裂サイクル）遺伝子（総説として
プリングル・アンド・ハートウェル（Pringle and Hart
well) 、ザ・サッカロミセス・セレビシエ・セル・サイ
クル（The Saccharomyces cerevisiae Cell Cycle)、ス
トラサーン（Strathern)ら編、ザ・モレキュラー・バイ
オロジイ・オブ・ザ・イースト・サッカロミセス・ライ
フ・サイクル・アンド・インヘリタンス（The Molecula
r Biology of tho Yeast Saccharomyces Life Cycle an
d Inheritance)、９７−１４２、コールド・スプリング
・ハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８１）、Ｓ．
セレビシエ及びＥ．コリ（coli解糖経路の機能をコード
する遺伝子、及びＳ．セレビシエのＳＥＣ（ノビック
（Novick) とセックマン(Schekman)、プロク．ナト．ア
カド．サイ．ユーエスエー（Proc. Nat. Acad. Sci. US
A)、７６：１８５６−１８６２、１９７９、及びノビッ
クら、セル（Cell) 、２１：２０５−２１５、１９８
０）、及びＩＮＯ（カルバートソン（Culbertson) とヘ
ンリー（Henry)、ジェネティックス（Genetics）、８
０：２３−４０、１９７５）遺伝子が挙げられる。
【００１０】必須遺伝子欠陥宿主細胞の一つの好ましい
類は、ｃｄｃ突然変異として知られるＣＤＣ遺伝子の欠
陥を含み、これは細胞分裂サイクルの段階特異的阻止を
もたらす。多くのｃｄｃ突然変異は、特定のＣＤＣ遺伝
子生成物の合成又は機能に影響することによって細胞サ
イクルに必須の事象の完全な妨害を生む。そのような突
然変異は、生化学的に又は形態学的にモニターできる事
象へのその作用により同定できる。最も知られたｃｄｃ
突然変異は条件により致命的な（すなわち温度感受性
の）突然変異であり、これは制限的条件下で生育する突
然変異細胞の正常発展の停止をもたらす。しかしｃｄｃ
突然変異からの主な欠陥は、段階特異的機能における欠
陥自体である必要はない。たとえば連続的に合成された
遺伝子生成物は、段階特異的機能を持ちうる；酵母解糖
遺伝子ＰＹＫ１における（酵素ピルビン酸キナーゼに対
する）欠陥は、細胞分裂サイクル突然変異ｃｄｃ１９に
対立的である（カワサキ、博士論文、ワシントン大学、
１９７９）。この突然変異は、典型的酵母複合培養基Ｙ
ＥＰＤ（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン及び２％
デキストロース）に接種された細胞のＧ１フェーズでの
細胞サイクル阻止をもたらす。すなわちｃｄｃ突然変異
が段階特異的機能における欠陥をもたらすかどうか又は
それが段階特異的機能を持つ遺伝子生成物の抑制又は不
能化突然変異を起すかどうかに拘らず、欠陥の影響はモ
ニターされうる。
類は、ｃｄｃ突然変異として知られるＣＤＣ遺伝子の欠
陥を含み、これは細胞分裂サイクルの段階特異的阻止を
もたらす。多くのｃｄｃ突然変異は、特定のＣＤＣ遺伝
子生成物の合成又は機能に影響することによって細胞サ
イクルに必須の事象の完全な妨害を生む。そのような突
然変異は、生化学的に又は形態学的にモニターできる事
象へのその作用により同定できる。最も知られたｃｄｃ
突然変異は条件により致命的な（すなわち温度感受性
の）突然変異であり、これは制限的条件下で生育する突
然変異細胞の正常発展の停止をもたらす。しかしｃｄｃ
突然変異からの主な欠陥は、段階特異的機能における欠
陥自体である必要はない。たとえば連続的に合成された
遺伝子生成物は、段階特異的機能を持ちうる；酵母解糖
遺伝子ＰＹＫ１における（酵素ピルビン酸キナーゼに対
する）欠陥は、細胞分裂サイクル突然変異ｃｄｃ１９に
対立的である（カワサキ、博士論文、ワシントン大学、
１９７９）。この突然変異は、典型的酵母複合培養基Ｙ
ＥＰＤ（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン及び２％
デキストロース）に接種された細胞のＧ１フェーズでの
細胞サイクル阻止をもたらす。すなわちｃｄｃ突然変異
が段階特異的機能における欠陥をもたらすかどうか又は
それが段階特異的機能を持つ遺伝子生成物の抑制又は不
能化突然変異を起すかどうかに拘らず、欠陥の影響はモ
ニターされうる。
【００１１】プリングルとハーウェル（前出）は、ある
５１のＣＤＣ遺伝子の機能を記述している。本発明の実
施に用いるためにそのような遺伝子は、望む突然変異を
持つ株における補足性（complementation)により遺伝子
ライブラリイから単離できる。遺伝子ライブラリイは、
一般に知られた方法で構成できる（たとえばナスミス
（Nasmyth)とリード(Reed)、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、７７：２１１９−２１２３、１９８０；及びナスミ
スとタトシェル（Tatchell) 、セル（Cell) 、１９：７
５３−７６４、１９８０）。望むｃｄｃ突然変異を持つ
株はここで記述するように作ることができ、又は一般に
入手できる寄託機関たとえばアメリカン・タイプ・カル
チア・コレクション・アンド・ザ・バークレイ・イース
ト・ストック・センターから得られる。
５１のＣＤＣ遺伝子の機能を記述している。本発明の実
施に用いるためにそのような遺伝子は、望む突然変異を
持つ株における補足性（complementation)により遺伝子
ライブラリイから単離できる。遺伝子ライブラリイは、
一般に知られた方法で構成できる（たとえばナスミス
（Nasmyth)とリード(Reed)、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、７７：２１１９−２１２３、１９８０；及びナスミ
スとタトシェル（Tatchell) 、セル（Cell) 、１９：７
５３−７６４、１９８０）。望むｃｄｃ突然変異を持つ
株はここで記述するように作ることができ、又は一般に
入手できる寄託機関たとえばアメリカン・タイプ・カル
チア・コレクション・アンド・ザ・バークレイ・イース
ト・ストック・センターから得られる。
【００１２】必須遺伝子の第二の好ましい類は、解糖経
路に関与する生成物をコードするもの、たとえば代謝酵
素及び調節機能をコードする遺伝子である。同定されて
いるＳ．セレビシエにおける解糖経路遺伝子の例は、解
糖調節遺伝子ＧＣＲ１及び酵素トリオースホスファート
イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、
ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホグリセラートキ
ナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、エノラーゼ、フルク
トース１、６−ビスホスファートデヒドロゲナーゼ、及
びグリセルアルデヒド３−ホスファートデヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子である。上述したように、ピルビ
ン酸キナーゼ遺伝子は、カワサキにより同定され記述さ
れている。酵母ホスホグリセラートキナーゼ遺伝子を含
みかつ調節シグナルを伴うプラスミドは、ヒッツェマン
（Hitzeman）ら（ジェイ・バイオロ・ケミ（J. Biol. C
hem.) 、２２５：１２０７３−１２０８０、１９８０）
により記述された。酵母トリオースホスファートイソメ
ラーゼ遺伝子ＴＰＩ１の単離及び配列化は、アルバー
（Alber)とカワサキ（ジェイ・モル・アプル・ジェネト
（J. Mol. Appl. Genet.）、１：４１９−４３４、１９
８２）及びカワサキとフレンケル（Fraenkel）（バイオ
ケム・バイオフィズ・リス・コム（Biochem. Biophys.
Res. Comm.）、１０８：１１０７−１１１２、１９８
２）により記述されている。
路に関与する生成物をコードするもの、たとえば代謝酵
素及び調節機能をコードする遺伝子である。同定されて
いるＳ．セレビシエにおける解糖経路遺伝子の例は、解
糖調節遺伝子ＧＣＲ１及び酵素トリオースホスファート
イソメラーゼ、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、
ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホグリセラートキ
ナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、エノラーゼ、フルク
トース１、６−ビスホスファートデヒドロゲナーゼ、及
びグリセルアルデヒド３−ホスファートデヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子である。上述したように、ピルビ
ン酸キナーゼ遺伝子は、カワサキにより同定され記述さ
れている。酵母ホスホグリセラートキナーゼ遺伝子を含
みかつ調節シグナルを伴うプラスミドは、ヒッツェマン
（Hitzeman）ら（ジェイ・バイオロ・ケミ（J. Biol. C
hem.) 、２２５：１２０７３−１２０８０、１９８０）
により記述された。酵母トリオースホスファートイソメ
ラーゼ遺伝子ＴＰＩ１の単離及び配列化は、アルバー
（Alber)とカワサキ（ジェイ・モル・アプル・ジェネト
（J. Mol. Appl. Genet.）、１：４１９−４３４、１９
８２）及びカワサキとフレンケル（Fraenkel）（バイオ
ケム・バイオフィズ・リス・コム（Biochem. Biophys.
Res. Comm.）、１０８：１１０７−１１１２、１９８
２）により記述されている。
【００１３】特に好ましい解糖遺伝子はＴＰＩ１であ
り、これは、グリセルアルデヒド−３−ホスファートと
ジヒドロキシアセトン−３−ホスファートの相互転化を
触媒し、従って解糖及び糖新生のために必須の酵素であ
る酵母トリオースホスファートイソメラーゼをコードす
る。Ｓ．セレビシエにおいて、単一の遺伝子座ＴＰＩ１
がこの機能をコードする。ＴＰＩ１における突然変異を
持つ細胞は、グルコースで生育せず、他の炭素源で少し
しか生育しない。Ｓ．セレビシエＴＰＩ１遺伝子は、ｔ
ｐｉ１突然変異の補足性により単離された（アルバーと
カワサキ、前出、及びカワサキとフレンケル、前出）。
分裂酵母シゾサッカロミセスポンベ（ＰＯＴ１）からの
トリオースホスファートイソメラーゼ遺伝子は、同じ
Ｓ．セレビシエ突然変異の補足性により単離され、図５
に示すように配列化された。Ｓ．ポンベ遺伝子（ＰＯＴ
１と記される）の配列化は、Ｓ．ポンベＴＰＩ蛋白質が
Ｓ．セレビシエのＴＰＩ蛋白質と相同であることを示し
た。
り、これは、グリセルアルデヒド−３−ホスファートと
ジヒドロキシアセトン−３−ホスファートの相互転化を
触媒し、従って解糖及び糖新生のために必須の酵素であ
る酵母トリオースホスファートイソメラーゼをコードす
る。Ｓ．セレビシエにおいて、単一の遺伝子座ＴＰＩ１
がこの機能をコードする。ＴＰＩ１における突然変異を
持つ細胞は、グルコースで生育せず、他の炭素源で少し
しか生育しない。Ｓ．セレビシエＴＰＩ１遺伝子は、ｔ
ｐｉ１突然変異の補足性により単離された（アルバーと
カワサキ、前出、及びカワサキとフレンケル、前出）。
分裂酵母シゾサッカロミセスポンベ（ＰＯＴ１）からの
トリオースホスファートイソメラーゼ遺伝子は、同じ
Ｓ．セレビシエ突然変異の補足性により単離され、図５
に示すように配列化された。Ｓ．ポンベ遺伝子（ＰＯＴ
１と記される）の配列化は、Ｓ．ポンベＴＰＩ蛋白質が
Ｓ．セレビシエのＴＰＩ蛋白質と相同であることを示し
た。
【００１４】通常の場合ではＤＮＡ構成物（プラスミ
ド）で用いられる必須遺伝子は宿主種からの野生型遺伝
子であろうが、ある場合では宿主細胞にとって異種（外
来）の必須遺伝子を用いることが好ましいであろう。な
ぜなら、異種遺伝子は当然に欠陥的であり、それにより
高プラスミドコピー数に対して選択しうるからである。
用いられるそのような異種必須遺伝子の例とし、本明細
書の実施例の１つは、Ｓ．ポンベＰＯＴ１遺伝子が、
Ｓ．セレビシエ宿主において選択マーカーとして有効に
用いられることを示す。選択マーカーとして必須遺伝子
を含む本発明に従うＤＮＡ構成物は、必須遺伝子の機能
に欠陥を持つ突然変異宿主細胞内に形質転換されるであ
ろう。適当に突然変異された宿主細胞が調製されなけれ
ばならず、又は公共寄託機関から容易に入手できる。適
当な突然変異体を得るための野生型細胞の突然変異は、
慣用の手順に従い達成できる。たとえば野生型細胞を、
慣用の突然変異化剤たとえばエタンメチルスルホネート
で処理し、補足性が起る群を同定するために、必須遺伝
子を含むプラスミドで形質転換することができる。ある
いはゲノムを破壊して特定の突然変異を作ることができ
る（ロススティン（Rothstein)、前出）。
ド）で用いられる必須遺伝子は宿主種からの野生型遺伝
子であろうが、ある場合では宿主細胞にとって異種（外
来）の必須遺伝子を用いることが好ましいであろう。な
ぜなら、異種遺伝子は当然に欠陥的であり、それにより
高プラスミドコピー数に対して選択しうるからである。
用いられるそのような異種必須遺伝子の例とし、本明細
書の実施例の１つは、Ｓ．ポンベＰＯＴ１遺伝子が、
Ｓ．セレビシエ宿主において選択マーカーとして有効に
用いられることを示す。選択マーカーとして必須遺伝子
を含む本発明に従うＤＮＡ構成物は、必須遺伝子の機能
に欠陥を持つ突然変異宿主細胞内に形質転換されるであ
ろう。適当に突然変異された宿主細胞が調製されなけれ
ばならず、又は公共寄託機関から容易に入手できる。適
当な突然変異体を得るための野生型細胞の突然変異は、
慣用の手順に従い達成できる。たとえば野生型細胞を、
慣用の突然変異化剤たとえばエタンメチルスルホネート
で処理し、補足性が起る群を同定するために、必須遺伝
子を含むプラスミドで形質転換することができる。ある
いはゲノムを破壊して特定の突然変異を作ることができ
る（ロススティン（Rothstein)、前出）。
【００１５】宿主細胞における必須遺伝子を含むプラス
ミドの安定性は、宿主細胞における相同の必須遺伝子配
列の不存在に依存しうる。宿主における遺伝的欠陥は、
プラスミドが維持されることを保証する。なぜなら、宿
主細胞の生育は、必須遺伝子機能の欠損により起らない
又は厳しく制限されるであろうからである。また、プラ
スミドの完全さ自体は、プラスミド担持必須遺伝子と宿
主ゲノムにおける対応する座の間の相同性の不存在に依
存しうる。なぜなら、プラスミドとゲノム遺伝子座の間
の組換が、突然変異とプラスミドの両者の細胞を治ゆす
るかも知れないからである。従って、ゲノム必須遺伝子
を不活性にする宿主細胞ゲノムにおける突然変異が実質
的性質である、すなわち欠除が染色体遺伝子のコーディ
ング部分及び／又はフランキング領域のＤＮＡ配列から
成ることが好ましい。これが達成されれば、組換えによ
る遺伝子突然変異の治ゆが起る可能性は少なくなる。本
発明のプラスミドは、適当な突然変異宿主細胞中に維持
されると、予期せざるほど安定である。好ましい宿主細
胞は酵母である。しかし他の真核細胞ならびに原核細胞
も用いうる。酵母細胞の場合、本発明のプラスミドの安
定性は、動原体を含む酵母プラスミドの安定性を越えさ
えするようである。環状動原体プラスミドは、酵母につ
いて従来報告された最も安定なプラスミドの一つである
が、極端に低いコピー数が欠点である（クラーケ（Clar
ke) とカーボン（Carbon) 、前出、及びスティンクコム
ら、１９８２、前出）。線形動原体酵母プラスミドは、
プラスミド長に依存して不安定であるか又は低コピー数
で存在する。（マレイ（Murray）とスゾスタク（Szosta
k)、前出）。従って、必須遺伝子を担持するプラスミド
の安定性の改善が達成されることは、予期せざる利点で
ある。
ミドの安定性は、宿主細胞における相同の必須遺伝子配
列の不存在に依存しうる。宿主における遺伝的欠陥は、
プラスミドが維持されることを保証する。なぜなら、宿
主細胞の生育は、必須遺伝子機能の欠損により起らない
又は厳しく制限されるであろうからである。また、プラ
スミドの完全さ自体は、プラスミド担持必須遺伝子と宿
主ゲノムにおける対応する座の間の相同性の不存在に依
存しうる。なぜなら、プラスミドとゲノム遺伝子座の間
の組換が、突然変異とプラスミドの両者の細胞を治ゆす
るかも知れないからである。従って、ゲノム必須遺伝子
を不活性にする宿主細胞ゲノムにおける突然変異が実質
的性質である、すなわち欠除が染色体遺伝子のコーディ
ング部分及び／又はフランキング領域のＤＮＡ配列から
成ることが好ましい。これが達成されれば、組換えによ
る遺伝子突然変異の治ゆが起る可能性は少なくなる。本
発明のプラスミドは、適当な突然変異宿主細胞中に維持
されると、予期せざるほど安定である。好ましい宿主細
胞は酵母である。しかし他の真核細胞ならびに原核細胞
も用いうる。酵母細胞の場合、本発明のプラスミドの安
定性は、動原体を含む酵母プラスミドの安定性を越えさ
えするようである。環状動原体プラスミドは、酵母につ
いて従来報告された最も安定なプラスミドの一つである
が、極端に低いコピー数が欠点である（クラーケ（Clar
ke) とカーボン（Carbon) 、前出、及びスティンクコム
ら、１９８２、前出）。線形動原体酵母プラスミドは、
プラスミド長に依存して不安定であるか又は低コピー数
で存在する。（マレイ（Murray）とスゾスタク（Szosta
k)、前出）。従って、必須遺伝子を担持するプラスミド
の安定性の改善が達成されることは、予期せざる利点で
ある。
【００１６】ＰＯＴ１及びＣＤＣ４遺伝子は、発現ベク
ター上の選択マーカーとしての必須遺伝子の使用の二つ
の例である。この二つの遺伝子は、複合培養基における
細胞増殖のために必要な幅広い種類の遺伝子に属する。
他の必須遺伝子の使用は、複雑な生育条件を含む植物又
は動物組織培養におけるプラスミド選択を可能とし、ま
た極端なばあいには血、血清又は生きている動物又は植
物の液汁から栄養を受ける細胞におけるプラスミドの維
持を可能とすることがある。本明細書で述べるプラスミ
ドを用いた実験から得られたデータは、ヒトα−１−抗
トリプシン（ＡＴ）生産が選択マーカーとしてＳ．ポン
ベＰＯＴ１遺伝子の使用により、従来の栄養要求型選択
マーカーＬＥＵ２を持つ類似のプラスミドで得られるＡ
Ｔ生産と比べて二倍にされることを示す。この結果は、
ＰＯＴ１含有プラスミドが、これが誘導されたもとの非
ＰＯＴ１プラスミドよりもコピー数において機能的に大
きいことを示す。サル肉腫ウイルスu-sis 遺伝子の発現
から得られたデータは、ＰＯＴ１含有プラスミドを用い
ると、ＹＥｐ１３誘導ベクターで得られた結果に比べて
発現レベルにおいて約５〜８倍の増加を示す。
ター上の選択マーカーとしての必須遺伝子の使用の二つ
の例である。この二つの遺伝子は、複合培養基における
細胞増殖のために必要な幅広い種類の遺伝子に属する。
他の必須遺伝子の使用は、複雑な生育条件を含む植物又
は動物組織培養におけるプラスミド選択を可能とし、ま
た極端なばあいには血、血清又は生きている動物又は植
物の液汁から栄養を受ける細胞におけるプラスミドの維
持を可能とすることがある。本明細書で述べるプラスミ
ドを用いた実験から得られたデータは、ヒトα−１−抗
トリプシン（ＡＴ）生産が選択マーカーとしてＳ．ポン
ベＰＯＴ１遺伝子の使用により、従来の栄養要求型選択
マーカーＬＥＵ２を持つ類似のプラスミドで得られるＡ
Ｔ生産と比べて二倍にされることを示す。この結果は、
ＰＯＴ１含有プラスミドが、これが誘導されたもとの非
ＰＯＴ１プラスミドよりもコピー数において機能的に大
きいことを示す。サル肉腫ウイルスu-sis 遺伝子の発現
から得られたデータは、ＰＯＴ１含有プラスミドを用い
ると、ＹＥｐ１３誘導ベクターで得られた結果に比べて
発現レベルにおいて約５〜８倍の増加を示す。
【００１７】本発明に従うＤＮＡ構成物すなわちとくに
プラスミドをつくるために用いられる手法は、慣用の方
法を含む。ＤＮＡ構成物において用いられるべき必須遺
伝子は、もし遺伝子構造が知られているなら標識したＤ
ＮＡプローベを用いてライブラリイから単離でき、又は
慣用のベクターにＤＮＡライブラリイのセグメントを結
合（リゲート）し、このベクターを特定の必須遺伝子の
欠陥の突然変異細胞に形質転換し、そして補足された群
を探すことにより同定できる。一度、必須遺伝子を含む
適当なＤＮＡフラグメントが同定されると、それは発現
されるであろう構造的蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
含むベクターに結合されるであろう。必須遺伝子は、宿
主生物内における発現に必要なそれ自体のプロモーター
及び他の制御体と共に用いうる、あるいは異質プロモー
ターを必須遺伝子の発現を増大又は減少するために用い
ることができる。
プラスミドをつくるために用いられる手法は、慣用の方
法を含む。ＤＮＡ構成物において用いられるべき必須遺
伝子は、もし遺伝子構造が知られているなら標識したＤ
ＮＡプローベを用いてライブラリイから単離でき、又は
慣用のベクターにＤＮＡライブラリイのセグメントを結
合（リゲート）し、このベクターを特定の必須遺伝子の
欠陥の突然変異細胞に形質転換し、そして補足された群
を探すことにより同定できる。一度、必須遺伝子を含む
適当なＤＮＡフラグメントが同定されると、それは発現
されるであろう構造的蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
含むベクターに結合されるであろう。必須遺伝子は、宿
主生物内における発現に必要なそれ自体のプロモーター
及び他の制御体と共に用いうる、あるいは異質プロモー
ターを必須遺伝子の発現を増大又は減少するために用い
ることができる。
【００１８】ＤＮＡフラグメントの結合の方法は、豊富
に記述されており、当業者が容易に実施できる。発現さ
れるべき蛋白質のＤＮＡコード配列は本質的に、任意の
蛋白質とくに産業的に重要な蛋白質たとえばインターフ
ェロン、インスリン、プロインスリン、α−１−抗トリ
プシン、及び組織プラスミノーゲンアクチベーターのも
のであることができる。ＤＮＡ構成物の調製後に、それ
は形質転換条件下で宿主生物中に形質転換されるであろ
う。原核細胞及び真核細胞（組織培養細胞を含む）を形
質転換する方法は文献で知られている。上述したよう
に、宿主生物は、プラスミド上の必須遺伝子の選択のた
めに本質的機能の欠陥を持たねばならない。突然変異宿
主株は通常の寄託機関から入手でき、又は野生型から突
然変異生成による慣用の手段及び適当な突然変異を持つ
突然変異体のスクリーニングによって作られる。形質転
換された宿主は次に、慣用の複合培養基での生育により
選択できる。酵母の場合、ＹＥＰＤ（１％酵母抽出物、
２％バクトペプトン及び２％デキストロース）のような
慣用の培養基を用いうる。本発明に従う必須遺伝子を含
む選択しうるマーカーは、何らかのＤＮＡ構成物におい
て適当である場合には常にマーカーとして使用できる。
すなわち、本発明に従う必須遺伝子選択マーカーを含む
構成物は多くの用途を持つ。以下の実施例は、そのよう
な用途の例示を与えるものであって、本発明に限定する
ものではない。
に記述されており、当業者が容易に実施できる。発現さ
れるべき蛋白質のＤＮＡコード配列は本質的に、任意の
蛋白質とくに産業的に重要な蛋白質たとえばインターフ
ェロン、インスリン、プロインスリン、α−１−抗トリ
プシン、及び組織プラスミノーゲンアクチベーターのも
のであることができる。ＤＮＡ構成物の調製後に、それ
は形質転換条件下で宿主生物中に形質転換されるであろ
う。原核細胞及び真核細胞（組織培養細胞を含む）を形
質転換する方法は文献で知られている。上述したよう
に、宿主生物は、プラスミド上の必須遺伝子の選択のた
めに本質的機能の欠陥を持たねばならない。突然変異宿
主株は通常の寄託機関から入手でき、又は野生型から突
然変異生成による慣用の手段及び適当な突然変異を持つ
突然変異体のスクリーニングによって作られる。形質転
換された宿主は次に、慣用の複合培養基での生育により
選択できる。酵母の場合、ＹＥＰＤ（１％酵母抽出物、
２％バクトペプトン及び２％デキストロース）のような
慣用の培養基を用いうる。本発明に従う必須遺伝子を含
む選択しうるマーカーは、何らかのＤＮＡ構成物におい
て適当である場合には常にマーカーとして使用できる。
すなわち、本発明に従う必須遺伝子選択マーカーを含む
構成物は多くの用途を持つ。以下の実施例は、そのよう
な用途の例示を与えるものであって、本発明に限定する
ものではない。
【００１９】特記なき限り、標準的な分子生物学手法が
用いられた。酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Bethesda Research Laboratories) 、ニューイング
ランド・バイオラブズ（New England Biolbs) 、及びボ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehring
er Mannheim Biochemicals) から得られ、製造者から指
示されたように又はマニアチス（Maniatis）ら（モレキ
ューラー・クローニング）（Molecular Cloning)：ラボ
ラトリイ・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリイ（Cold Spring Harber Laboratory)１
９８２）の記述のように用いられた。Ｅ．コリ（coli.)
株は、マニアチスら（前出）の開示のように塩化カルシ
ウム法により形質転換された。酵母培養物は、ベッグズ
（Beggs)（ネイチア（Nature) 、２７５：１０４−１０
８、１９７８）の方法を後記のような変更を加えて用い
て形質転換された。
用いられた。酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Bethesda Research Laboratories) 、ニューイング
ランド・バイオラブズ（New England Biolbs) 、及びボ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehring
er Mannheim Biochemicals) から得られ、製造者から指
示されたように又はマニアチス（Maniatis）ら（モレキ
ューラー・クローニング）（Molecular Cloning)：ラボ
ラトリイ・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリイ（Cold Spring Harber Laboratory)１
９８２）の記述のように用いられた。Ｅ．コリ（coli.)
株は、マニアチスら（前出）の開示のように塩化カルシ
ウム法により形質転換された。酵母培養物は、ベッグズ
（Beggs)（ネイチア（Nature) 、２７５：１０４−１０
８、１９７８）の方法を後記のような変更を加えて用い
て形質転換された。
【００２０】実施例１ 選択マーカーとしてのＳ．セレビシエＣＤＣ４遺伝子 Ａ．安定なＣＤＣ４含有プラスミドの構築 酵母ＤＮＡのSau3A による部分的消化、蔗糖勾配でのサ
イズ選択、及びBamHIにより消化された酵母ベクターＹ
Ｐｐ７への選択されたフラグメントの挿入により、酵母
ゲノムライブラリイが構成された（ナスミス（Nasmyth)
とリード（Reed）、Prco. Natl. Acad. Sci. USA．７
７：２１１９−２１２３、１９８０）。ＣＤＣ４遺伝子
を含む組換プラスミドは、酵母株ＧＥＢ５（MATa cdc4
-4 Ien2 trp1 Iys1 ura1）及びＧＥＢ７（MATa cd
c4-3 Ien2 trp1 Iys1）の上記ライブラリイでの形質
転換により単離された。これら株は、高頻度で形質転換
することが知られている株（Ｋ７９〔MATa Ien2 trp
1〕（ナスミスら、ネイチア、２８９：２４４−２５
０、１９８１；タトシェル（Tatchell）ら、セル、２
７：２５−３５、１９８１）との交配及び続いて高形質
転換性株（Ｋ７９及びＫ８０〔MATa Ien2 trp1 Iys
1〕）への戻し交配により望む遺伝子的バックグランド
（Ien2 trp1）で、cdc4-3及びcdc4-4突然変異を得るこ
とにより、Ａ３６４Ａcdc4-3及びＡ３６４Ａcdc4-4（ハ
ートウェル（Hartwell) ら、ジェネティクス（Genetic
s）、７４：２６７−２８６、１９７３）から誘導され
た。トリプトファン原栄養性及び制限的温度（３７°）
での生育能力についての形質転換体の選択は、ゲノムに
組込まれＣＤＣ４遺伝子座にマップされることを示され
たプラスミドの一つ（ｐＪＹ３５と記される）を同定し
た。自発的プラスミド組込体（integrants) は、その選
択的生育有利性に基いて固定された。この生育有利性
は、高コピー数で存在するとき（すなわちプラスミドが
宿主ゲノムに組込まれている）細胞生育に有害なＣＤＣ
４結合遺伝子の元のプラスミド上での存在による。組込
体において、ＴＲＰ１プラスミドマーカーは、染色体VI
（モルチマー（Mortimer) とシルド（Schild) 、“ジェ
ネティク・マップ・オブ サッカロミセス・セレビシエ
（Genetic Map of Saccharomyces cerevisiae)”ストラ
サーン（Strathern)ら編、ザ・モレキュラー・バイオロ
ジイ・オブ・ザ・イースト・サッカロミセス・セレビシ
エ・ライフ・サイクル・アンド・インヘリタンス（The
Malecular Biologyof the Yeast Saccharomyces cerevi
siae Life Cycle and Inheritance)、コールド・スプリ
ング・ハーバー、１９８１）上のＣＤＣ４に結合されて
いるＳＵＰ１１に遺伝子的に結合されることが示され
た。ｃｄｃ４−３相補（complementing)領域は、ｐＪＹ
３５から6.４kb BamHIフラグメントとして精製され、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて、 BamHIで解裂されたベクタ
ーＹＲｐ７（ストルール（Struhl) ら、 Proc. Natl. A
cad. Sic. USA 、７６：１０３５−１０３９、１９７
９）に結合された。この構成物はｐＪＹ５１として知ら
れ、図１に示されている。
イズ選択、及びBamHIにより消化された酵母ベクターＹ
Ｐｐ７への選択されたフラグメントの挿入により、酵母
ゲノムライブラリイが構成された（ナスミス（Nasmyth)
とリード（Reed）、Prco. Natl. Acad. Sci. USA．７
７：２１１９−２１２３、１９８０）。ＣＤＣ４遺伝子
を含む組換プラスミドは、酵母株ＧＥＢ５（MATa cdc4
-4 Ien2 trp1 Iys1 ura1）及びＧＥＢ７（MATa cd
c4-3 Ien2 trp1 Iys1）の上記ライブラリイでの形質
転換により単離された。これら株は、高頻度で形質転換
することが知られている株（Ｋ７９〔MATa Ien2 trp
1〕（ナスミスら、ネイチア、２８９：２４４−２５
０、１９８１；タトシェル（Tatchell）ら、セル、２
７：２５−３５、１９８１）との交配及び続いて高形質
転換性株（Ｋ７９及びＫ８０〔MATa Ien2 trp1 Iys
1〕）への戻し交配により望む遺伝子的バックグランド
（Ien2 trp1）で、cdc4-3及びcdc4-4突然変異を得るこ
とにより、Ａ３６４Ａcdc4-3及びＡ３６４Ａcdc4-4（ハ
ートウェル（Hartwell) ら、ジェネティクス（Genetic
s）、７４：２６７−２８６、１９７３）から誘導され
た。トリプトファン原栄養性及び制限的温度（３７°）
での生育能力についての形質転換体の選択は、ゲノムに
組込まれＣＤＣ４遺伝子座にマップされることを示され
たプラスミドの一つ（ｐＪＹ３５と記される）を同定し
た。自発的プラスミド組込体（integrants) は、その選
択的生育有利性に基いて固定された。この生育有利性
は、高コピー数で存在するとき（すなわちプラスミドが
宿主ゲノムに組込まれている）細胞生育に有害なＣＤＣ
４結合遺伝子の元のプラスミド上での存在による。組込
体において、ＴＲＰ１プラスミドマーカーは、染色体VI
（モルチマー（Mortimer) とシルド（Schild) 、“ジェ
ネティク・マップ・オブ サッカロミセス・セレビシエ
（Genetic Map of Saccharomyces cerevisiae)”ストラ
サーン（Strathern)ら編、ザ・モレキュラー・バイオロ
ジイ・オブ・ザ・イースト・サッカロミセス・セレビシ
エ・ライフ・サイクル・アンド・インヘリタンス（The
Malecular Biologyof the Yeast Saccharomyces cerevi
siae Life Cycle and Inheritance)、コールド・スプリ
ング・ハーバー、１９８１）上のＣＤＣ４に結合されて
いるＳＵＰ１１に遺伝子的に結合されることが示され
た。ｃｄｃ４−３相補（complementing)領域は、ｐＪＹ
３５から6.４kb BamHIフラグメントとして精製され、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて、 BamHIで解裂されたベクタ
ーＹＲｐ７（ストルール（Struhl) ら、 Proc. Natl. A
cad. Sic. USA 、７６：１０３５−１０３９、１９７
９）に結合された。この構成物はｐＪＹ５１として知ら
れ、図１に示されている。
【００２１】図１において、ＣＤＣ４コード領域は、下
記の方法でフランキングゲノムＤＮＡ配列から分けて精
製された。プラスミドｐＪＹ５１がHind IIIにより解裂
され、ＣＤＣ４領域を含む3.６kbフラグメントがバクテ
リアプラスミドｐＢＲ３２２においてサブクローニング
された。この構成物は BamHIで完全に消化され、HincII
で部分的に消化され、そして約2.３kbＣＤＣ４含有フ
ラグメントが精製された。Hinc II フラグメント末端は
リンカー配列（配列：５’CCGGATCC GG3')（コラボレイ
ティブ・リサーチ（Collaborative Research）から入
手）の付加及び過剰のリンカーの除去のために BamHIで
の続く消化により BamHI末端に転化された。ＣＤＣ４遺
伝子の約1.９kbを含む得たフラグメントはＹＲｐ７の B
amHI部位に挿入してプラスミドｐＪＹ７０を作った。こ
のプラスミドは、上述したようにｃｄｃ４−３突然変異
を補うことが示された。1.９kbフラグメントはＣＤＣ４
遺伝子の５’コード領域及び３’コード領域の両者の小
さな部分を欠くが、それは驚くべきことに温度感受性欠
陥を補う。たぶんＣＤＣ４配列の転写及び翻訳がプラス
ミドのｐＢＲ３２２領域に位置する配列により制御され
て、機能的遺伝子生成物の生産を可能にするであろう。
プラスミドｐＪＹ７０は、酵母ＴＲＰ１及びＡＲＳ１配
列を除去するためにEcoRI で解裂し、そして再結合し
て、ｐＢＲ３２２及びＣＤＣ４配列を含むハイブリッド
プラスミドを得た。このプラスミドは、ｐＪＹ７１とし
て知られ、図１に示されている。
記の方法でフランキングゲノムＤＮＡ配列から分けて精
製された。プラスミドｐＪＹ５１がHind IIIにより解裂
され、ＣＤＣ４領域を含む3.６kbフラグメントがバクテ
リアプラスミドｐＢＲ３２２においてサブクローニング
された。この構成物は BamHIで完全に消化され、HincII
で部分的に消化され、そして約2.３kbＣＤＣ４含有フ
ラグメントが精製された。Hinc II フラグメント末端は
リンカー配列（配列：５’CCGGATCC GG3')（コラボレイ
ティブ・リサーチ（Collaborative Research）から入
手）の付加及び過剰のリンカーの除去のために BamHIで
の続く消化により BamHI末端に転化された。ＣＤＣ４遺
伝子の約1.９kbを含む得たフラグメントはＹＲｐ７の B
amHI部位に挿入してプラスミドｐＪＹ７０を作った。こ
のプラスミドは、上述したようにｃｄｃ４−３突然変異
を補うことが示された。1.９kbフラグメントはＣＤＣ４
遺伝子の５’コード領域及び３’コード領域の両者の小
さな部分を欠くが、それは驚くべきことに温度感受性欠
陥を補う。たぶんＣＤＣ４配列の転写及び翻訳がプラス
ミドのｐＢＲ３２２領域に位置する配列により制御され
て、機能的遺伝子生成物の生産を可能にするであろう。
プラスミドｐＪＹ７０は、酵母ＴＲＰ１及びＡＲＳ１配
列を除去するためにEcoRI で解裂し、そして再結合し
て、ｐＢＲ３２２及びＣＤＣ４配列を含むハイブリッド
プラスミドを得た。このプラスミドは、ｐＪＹ７１とし
て知られ、図１に示されている。
【００２２】1.９kb酵母配列は、 BamHI−Hind IIIフラ
グメントとしてｐＪＹ７１から精製された。このフラグ
メントは BamHIとHind IIIでの消化により線状化された
ｐＢＲ３２２に結合されて、プラスミドｐＢ４を与え
た。これは図１に示されている。ＣＤＣ４領域は、高コ
ピー数酵母ベクターに挿入のためにｐＢ４から再単離さ
れた。そのようなベクターは、酵母２μプラスミドの複
製のオリジン及び興味ある異種遺伝子のためのクローニ
ング部位として働くであろう一又は二以上の制限酵素解
裂部位を含むであろう。好ましくはそのような部位は、
プラスミド上のユニーク部位であろう。好ましいベクタ
ーはＭＷ５であり、これは２μプラスミド複製オリジ
ン、及びユニークEcoRI 及び BamHIクローニング部位を
含む。図２において、プラスミドＭＷ５は、分子当り二
つのEcoRI 部位の平均として一つを解裂するためにEcoR
I での部分的消化によりプラスミドＹＲｐ７’（スティ
ンクコム（Stinchcomb) ら、ネイチア、２８２：３９−
４３、１９７９）から誘導された。線状分子の得られた
非対末端は、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ（klenow）
フラグメント）を用いてふさがれ、得られた対合二本鎖
末端（ブラント末端）はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて再
結合された。ＡＲＳ１配列近傍にEcoRI 部位を保持する
得られたプラスミドが次に選別された。ＡＲＳ１配列は
PstI及びEcoRI での消化により除かれ、酵母２μＤＮＡ
の複製オリジンを含むプラスミドＹＥｐ１３（ブローチ
（Broach) ら、ジーン（Gene) 、８：１２１−１３３、
１９７９）のPstI−EcoRI フラグメントで置換えられ
た。得られたプラスミド（ＭＷ５と記される）は図２に
示されている。
グメントとしてｐＪＹ７１から精製された。このフラグ
メントは BamHIとHind IIIでの消化により線状化された
ｐＢＲ３２２に結合されて、プラスミドｐＢ４を与え
た。これは図１に示されている。ＣＤＣ４領域は、高コ
ピー数酵母ベクターに挿入のためにｐＢ４から再単離さ
れた。そのようなベクターは、酵母２μプラスミドの複
製のオリジン及び興味ある異種遺伝子のためのクローニ
ング部位として働くであろう一又は二以上の制限酵素解
裂部位を含むであろう。好ましくはそのような部位は、
プラスミド上のユニーク部位であろう。好ましいベクタ
ーはＭＷ５であり、これは２μプラスミド複製オリジ
ン、及びユニークEcoRI 及び BamHIクローニング部位を
含む。図２において、プラスミドＭＷ５は、分子当り二
つのEcoRI 部位の平均として一つを解裂するためにEcoR
I での部分的消化によりプラスミドＹＲｐ７’（スティ
ンクコム（Stinchcomb) ら、ネイチア、２８２：３９−
４３、１９７９）から誘導された。線状分子の得られた
非対末端は、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ（klenow）
フラグメント）を用いてふさがれ、得られた対合二本鎖
末端（ブラント末端）はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて再
結合された。ＡＲＳ１配列近傍にEcoRI 部位を保持する
得られたプラスミドが次に選別された。ＡＲＳ１配列は
PstI及びEcoRI での消化により除かれ、酵母２μＤＮＡ
の複製オリジンを含むプラスミドＹＥｐ１３（ブローチ
（Broach) ら、ジーン（Gene) 、８：１２１−１３３、
１９７９）のPstI−EcoRI フラグメントで置換えられ
た。得られたプラスミド（ＭＷ５と記される）は図２に
示されている。
【００２３】最終的なＣＤＣ４を含有する安定なプラス
ミドを構築するためにＭＷ５をEcoRI と BamHIで解裂し
た。ＣＤＣ４フラグメントは、プラスミドを BamHIとEc
oRIで消化することによりプラスミドｐＢ４から精製さ
れた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて二つのフラグメント
を結合し、そのようにして作ったキメラ分子をE.coIi株
ＲＲＩ（ナスミスとリード、上述内に形質転換し、アン
ピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性のコロニーを
選択した。そのようなコロニーの一つから単離したプラ
スミドｐＢ５（図２に示す）は、酵母２μ複製オリジ
ン、ｐＢＲ３２２プラスミド配列、選択マーカーＴＲＰ
１、酵母ＣＤＣ４コード配列の1.９kb、及びユニークEc
oRI クローニング部位を含む。
ミドを構築するためにＭＷ５をEcoRI と BamHIで解裂し
た。ＣＤＣ４フラグメントは、プラスミドを BamHIとEc
oRIで消化することによりプラスミドｐＢ４から精製さ
れた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて二つのフラグメント
を結合し、そのようにして作ったキメラ分子をE.coIi株
ＲＲＩ（ナスミスとリード、上述内に形質転換し、アン
ピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性のコロニーを
選択した。そのようなコロニーの一つから単離したプラ
スミドｐＢ５（図２に示す）は、酵母２μ複製オリジ
ン、ｐＢＲ３２２プラスミド配列、選択マーカーＴＲＰ
１、酵母ＣＤＣ４コード配列の1.９kb、及びユニークEc
oRI クローニング部位を含む。
【００２４】Ｂ．宿主ＣＤＣ４遺伝子の破壊のためのプ
ラスミドの構築 本発明に従うＣＤＣ４含有プラスミドの、形質転換され
た宿主における安定性は、宿主における機能的ＣＤＣ４
遺伝子の欠乏に依存する。プラスミドと染色体ＤＮＡの
間の組換えを防ぐために、宿主ゲノムとＣＤＣ４含有の
安定なプラスミドの間に相同性がないことがまた好まし
い。適当に除去されたＣＤＣ４を有する酵母株を得るた
めに、野生型ＣＤＣ４遺伝子を含む酵母宿主は、“破壊
された”ＣＤＣ４遺伝子（ロススティン（Rothstin) 、
前出）を持つ線状化されたプラスミドフラグメントで形
質転換されうる。線状化されたプラスミドフラグメント
は、フラグメントの自由末端がＣＤＣ４領域内で組換を
高めるので、好ましい形質転換剤である。そのようなプ
ラスミドフラグメントは、完全なゲノムＣＤＣ４座との
組換えを促進するためにその末端に完全なＣＤＣ４フラ
ンキング領域を持つであろう。プラスミドフラグメント
のＣＤＣ４フランキング領域の間に挿入された遺伝子物
質は、形質転換された宿主において選択されうる表現型
特性（選択マーカーたとえばＴＲＰ１又はＬＷＵ２）を
コードするであろう。破壊プラスミドは好ましくはま
た、破壊されたＣＤＣ４選択マーカー配列の宿主ゲノム
への組込みについて選択するために、複製の酵母オリジ
ンを欠くであろう。線状化したプラスミドでの形質転換
に続いて遺伝子組換えは、宿主のゲノム配列の代りに破
壊された配列の置換をもたらす。ここでＣＤＣ４遺伝子
が除去された細胞は次に、破壊で用いられたマーカーに
従って選択される。
ラスミドの構築 本発明に従うＣＤＣ４含有プラスミドの、形質転換され
た宿主における安定性は、宿主における機能的ＣＤＣ４
遺伝子の欠乏に依存する。プラスミドと染色体ＤＮＡの
間の組換えを防ぐために、宿主ゲノムとＣＤＣ４含有の
安定なプラスミドの間に相同性がないことがまた好まし
い。適当に除去されたＣＤＣ４を有する酵母株を得るた
めに、野生型ＣＤＣ４遺伝子を含む酵母宿主は、“破壊
された”ＣＤＣ４遺伝子（ロススティン（Rothstin) 、
前出）を持つ線状化されたプラスミドフラグメントで形
質転換されうる。線状化されたプラスミドフラグメント
は、フラグメントの自由末端がＣＤＣ４領域内で組換を
高めるので、好ましい形質転換剤である。そのようなプ
ラスミドフラグメントは、完全なゲノムＣＤＣ４座との
組換えを促進するためにその末端に完全なＣＤＣ４フラ
ンキング領域を持つであろう。プラスミドフラグメント
のＣＤＣ４フランキング領域の間に挿入された遺伝子物
質は、形質転換された宿主において選択されうる表現型
特性（選択マーカーたとえばＴＲＰ１又はＬＷＵ２）を
コードするであろう。破壊プラスミドは好ましくはま
た、破壊されたＣＤＣ４選択マーカー配列の宿主ゲノム
への組込みについて選択するために、複製の酵母オリジ
ンを欠くであろう。線状化したプラスミドでの形質転換
に続いて遺伝子組換えは、宿主のゲノム配列の代りに破
壊された配列の置換をもたらす。ここでＣＤＣ４遺伝子
が除去された細胞は次に、破壊で用いられたマーカーに
従って選択される。
【００２５】宿主ゲノムの一段階破壊の方法はロスステ
イン（前出）により記述されている。上述したように破
壊は、宿主ゲノムの破壊を達成するに加えて安定なプラ
スミドでの宿主の形質転換も行われるように、完全な安
定なプラスミド及び線状化プラスミドで宿主株を共形質
転換する追加的改良により達成される。宿主ＣＤＣ４座
の破壊のための好ましいプラスミドは、図３に示すｐＢ
１５Ｌである。それは、ＣＤＣ４のフランキング領域の
間に挿入された酵母ＬＥＵ２遺伝子及びベクターｐＵＣ
１３（ビエイラ（Vieira) とメッシング（Messing)、ジ
ーン（Gene）、１９：２５９−２６８、１９８２、及び
メッシング、メス・イン・エンザイモロジイ（Meth. in
Enzymology)、１０１：２０−７７、１９８３）を含
む。酵母及びベクター配列の結合点で線状化され、適当
な酵母宿主株内に形質転換されるとき、プラスミドはＣ
ＤＣ４領域に代るＬＥＵ２配列の置換からもたらされる
ホストゲノムにおけるＣＤＣ４の除去をもたらす。宿主
株においてロイシンに対する栄養素要求型の破壊された
形質転換体が次に、ロイシン栄養要求性に基づいて選択
されうる。
イン（前出）により記述されている。上述したように破
壊は、宿主ゲノムの破壊を達成するに加えて安定なプラ
スミドでの宿主の形質転換も行われるように、完全な安
定なプラスミド及び線状化プラスミドで宿主株を共形質
転換する追加的改良により達成される。宿主ＣＤＣ４座
の破壊のための好ましいプラスミドは、図３に示すｐＢ
１５Ｌである。それは、ＣＤＣ４のフランキング領域の
間に挿入された酵母ＬＥＵ２遺伝子及びベクターｐＵＣ
１３（ビエイラ（Vieira) とメッシング（Messing)、ジ
ーン（Gene）、１９：２５９−２６８、１９８２、及び
メッシング、メス・イン・エンザイモロジイ（Meth. in
Enzymology)、１０１：２０−７７、１９８３）を含
む。酵母及びベクター配列の結合点で線状化され、適当
な酵母宿主株内に形質転換されるとき、プラスミドはＣ
ＤＣ４領域に代るＬＥＵ２配列の置換からもたらされる
ホストゲノムにおけるＣＤＣ４の除去をもたらす。宿主
株においてロイシンに対する栄養素要求型の破壊された
形質転換体が次に、ロイシン栄養要求性に基づいて選択
されうる。
【００２６】プラスミドｐＢ１５Ｌを構築するためにＣ
ＤＣ４及びその５’及び３’フランキング領域を含む6.
４kbフラグメントをｐＪＹ５１の BamHI消化物から精製
した。このフラグメントは、プラスミドｐＢ１４を作る
ために、 BamHI消化したｐＵＣ１３内に挿入された。Ｃ
ＤＣ４コード領域のほとんどが、ｐＢ１４をClaIで消化
しそしてｐＵＣ１３及びＣＤＣ４フランキング配列を含
む比較的大きなフラグメントを精製することにより除去
された。フラグメント末端は、XhoI（Ｂｇｌ II ）“ス
マート”リンカー（ワースイングトン・ダイアゴノスチ
ック（Worthington Diagonostic)）の付加により修飾さ
れ、得られた粘着末端にＹＥｐ１３のＢｇｌ II ＬＥＵ
２フラグメントの2.８kb（ブローチ（Broach) ら、ジー
ン、８：１２１−１３３、１９７９）が結合された。そ
のようにして作られたＤＮＡは、Ｅ．Coli株ＲＲＩを形
質転換するために用いられた。形質転換体は、酵母ＬＥ
Ｕ２配列がＥ．coli宿主における leuＢ欠陥を補うの
で、ロイシン栄養要求性に基づいて選択された。プラス
ミドｐＢ１５Ｌを、そのような形質転換されたコロニー
の一つから精製した。プラスミドｐＢ１５Ｌは、５’及
び３’フランキング配列に加えてＣＤＣ４コード配列の
５’末端の僅か約５０塩基対を含む。プラスミドｐＢ５
とｐＢ１５Ｌの地図の比較は、ｐＢ１５ＬのＣＤＣ４−
ＬＥＵ２遺伝子融合の結合点がｐＢ５中に存在するＣＤ
Ｃ４フラグメントの領域の外に位置しているので、各Ｃ
ＤＣ４配列の間の相同性の欠除を示す。この相同性の欠
除は、宿主細胞におけるｐＢ５と破壊されたＣＤＣ４座
の間の組換えを妨げる。
ＤＣ４及びその５’及び３’フランキング領域を含む6.
４kbフラグメントをｐＪＹ５１の BamHI消化物から精製
した。このフラグメントは、プラスミドｐＢ１４を作る
ために、 BamHI消化したｐＵＣ１３内に挿入された。Ｃ
ＤＣ４コード領域のほとんどが、ｐＢ１４をClaIで消化
しそしてｐＵＣ１３及びＣＤＣ４フランキング配列を含
む比較的大きなフラグメントを精製することにより除去
された。フラグメント末端は、XhoI（Ｂｇｌ II ）“ス
マート”リンカー（ワースイングトン・ダイアゴノスチ
ック（Worthington Diagonostic)）の付加により修飾さ
れ、得られた粘着末端にＹＥｐ１３のＢｇｌ II ＬＥＵ
２フラグメントの2.８kb（ブローチ（Broach) ら、ジー
ン、８：１２１−１３３、１９７９）が結合された。そ
のようにして作られたＤＮＡは、Ｅ．Coli株ＲＲＩを形
質転換するために用いられた。形質転換体は、酵母ＬＥ
Ｕ２配列がＥ．coli宿主における leuＢ欠陥を補うの
で、ロイシン栄養要求性に基づいて選択された。プラス
ミドｐＢ１５Ｌを、そのような形質転換されたコロニー
の一つから精製した。プラスミドｐＢ１５Ｌは、５’及
び３’フランキング配列に加えてＣＤＣ４コード配列の
５’末端の僅か約５０塩基対を含む。プラスミドｐＢ５
とｐＢ１５Ｌの地図の比較は、ｐＢ１５ＬのＣＤＣ４−
ＬＥＵ２遺伝子融合の結合点がｐＢ５中に存在するＣＤ
Ｃ４フラグメントの領域の外に位置しているので、各Ｃ
ＤＣ４配列の間の相同性の欠除を示す。この相同性の欠
除は、宿主細胞におけるｐＢ５と破壊されたＣＤＣ４座
の間の組換えを妨げる。
【００２７】Ｃ．Ｓ．セレビシエの共形質転換 ゲノムＣＤＣ４遺伝子の除去とプラスミドｐＢ５の導入
を同時に行うために、酵母細胞を BamHI解裂したｐＢ１
５Ｌ及び完全なプラスミドｐＢ５で共形質転換した。形
質転換で用いられる宿主株は、プラスミドｐＢ５及びゲ
ノムＣＤＣ４破壊について同時に選択するために、トリ
プトファン及びロイシンに対して栄養素要求形でなけれ
ばならない。株Ａ２（ＭＡＴα ｌｅｕ２−２，１１２
ｈｉｓ３−１１，１５ ｃａｎ１）（スゾスタク（Sz
ostak)、メス・イン・エンザイモロジイ（Meth. in Enz
ymology)１０１：２４５−２５２、１９８３参照）と株
ＧＥＢ７の交配から得られた株２．７．Ｃ（ＭＡＴα
ｃｄｃ４−３ ｔｒｐ１ｌｅｕ２−２，１１２ ｌｙｓ
１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｃａｎ１）（実施例１Ａ参
照）を用いた。典型的な共形質転換実験において、対数
増殖期にあるＳ．セレビシエＡ２．７．Ｃの培養物１０
mlを、約６μｇの BamHI消化したｐＢ１５Ｌ、１μｇの
ｐＢ５及び担体として１０μｇのウシ胸腺ＤＮＡで形質
転換した。形質転換条件は、ベッグズ（前出）の記述と
同じである。細胞は、ロイシン及びトリプトファンを欠
く培養基上にプレートされた。それを２２°で一夜生育
し、３７°に変えた。約３０個のコロニーが得られた。
ｐＢ５単独での形質転換及びトリプトファン要求性につ
いての選択の対照実験は、約1,０００の形質転換体を作
った。
を同時に行うために、酵母細胞を BamHI解裂したｐＢ１
５Ｌ及び完全なプラスミドｐＢ５で共形質転換した。形
質転換で用いられる宿主株は、プラスミドｐＢ５及びゲ
ノムＣＤＣ４破壊について同時に選択するために、トリ
プトファン及びロイシンに対して栄養素要求形でなけれ
ばならない。株Ａ２（ＭＡＴα ｌｅｕ２−２，１１２
ｈｉｓ３−１１，１５ ｃａｎ１）（スゾスタク（Sz
ostak)、メス・イン・エンザイモロジイ（Meth. in Enz
ymology)１０１：２４５−２５２、１９８３参照）と株
ＧＥＢ７の交配から得られた株２．７．Ｃ（ＭＡＴα
ｃｄｃ４−３ ｔｒｐ１ｌｅｕ２−２，１１２ ｌｙｓ
１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｃａｎ１）（実施例１Ａ参
照）を用いた。典型的な共形質転換実験において、対数
増殖期にあるＳ．セレビシエＡ２．７．Ｃの培養物１０
mlを、約６μｇの BamHI消化したｐＢ１５Ｌ、１μｇの
ｐＢ５及び担体として１０μｇのウシ胸腺ＤＮＡで形質
転換した。形質転換条件は、ベッグズ（前出）の記述と
同じである。細胞は、ロイシン及びトリプトファンを欠
く培養基上にプレートされた。それを２２°で一夜生育
し、３７°に変えた。約３０個のコロニーが得られた。
ｐＢ５単独での形質転換及びトリプトファン要求性につ
いての選択の対照実験は、約1,０００の形質転換体を作
った。
【００２８】６つの共形質転換コロニーを、ＣＤＣ４座
の破壊を検証し、そしてｐＢ５プラスミドの安定性をテ
ストするために分析した。ゲノムＤＮＡは、アブラハム
（Abraham)らコールド・スプリング・ハーバー、シンポ
ジウム・クオント・バイオロ（Gold Spring Harbor Sym
posium Quant. Biol.)、４７：９８９−９９８、１９８
３）の方法により共形質転換体から単離され、EcoRI 及
び BamHIで消化され、アガロースゲル上で電気泳動さ
れ、そしてニトロセルロースに移された（サザン（Sout
hern) 、J. Mol. Biol. ９８：５０３−５１７、１９７
５）。ブロットを、ｐＢ１５Ｌに存在ししかしｐＢ５不
存在のＣＤＣ４の５’フランキング領域からの2.５kb B
amHI−Hind IIIフラグメントでプローブした。図４は、
形質転換されなかった細胞からのＤＮＡの6.４kbフラグ
メントにハイブリダイゼーションされたプローブを示す
（レーンｂ）；この6.４kb BamHIフラグメント内にEcoR
I 部位はない。ＬＥＵ２配列がEcoRI 部位を含むので、
ＣＤＣ４座の破壊はハイブリダイジングバンド（図４で
矢印で示される）のサイズの減少をもたらすであろう。
これは、レーンｃ、ｄ、ｆ、ｇ及びｈにおいて示される
形質転換体の場合である。レーンｅはいく分異るパター
ンを示し、ゲノムサイズバンドを保持し、これはゲノム
ＣＤＣ４の除去が起こらなかったことを示す。（レーン
ｃ〜ｈで見られるより小さなバンドは、レーンａ及びｂ
における対照パターンにより判るように、ゲル精製され
たプローブの汚染による。）
の破壊を検証し、そしてｐＢ５プラスミドの安定性をテ
ストするために分析した。ゲノムＤＮＡは、アブラハム
（Abraham)らコールド・スプリング・ハーバー、シンポ
ジウム・クオント・バイオロ（Gold Spring Harbor Sym
posium Quant. Biol.)、４７：９８９−９９８、１９８
３）の方法により共形質転換体から単離され、EcoRI 及
び BamHIで消化され、アガロースゲル上で電気泳動さ
れ、そしてニトロセルロースに移された（サザン（Sout
hern) 、J. Mol. Biol. ９８：５０３−５１７、１９７
５）。ブロットを、ｐＢ１５Ｌに存在ししかしｐＢ５不
存在のＣＤＣ４の５’フランキング領域からの2.５kb B
amHI−Hind IIIフラグメントでプローブした。図４は、
形質転換されなかった細胞からのＤＮＡの6.４kbフラグ
メントにハイブリダイゼーションされたプローブを示す
（レーンｂ）；この6.４kb BamHIフラグメント内にEcoR
I 部位はない。ＬＥＵ２配列がEcoRI 部位を含むので、
ＣＤＣ４座の破壊はハイブリダイジングバンド（図４で
矢印で示される）のサイズの減少をもたらすであろう。
これは、レーンｃ、ｄ、ｆ、ｇ及びｈにおいて示される
形質転換体の場合である。レーンｅはいく分異るパター
ンを示し、ゲノムサイズバンドを保持し、これはゲノム
ＣＤＣ４の除去が起こらなかったことを示す。（レーン
ｃ〜ｈで見られるより小さなバンドは、レーンａ及びｂ
における対照パターンにより判るように、ゲル精製され
たプローブの汚染による。）
【００２９】６つの共形質転換体を、複合培養基（ＹＥ
ＰＤ）上で生育することにより、プラスミド安定性につ
いてテストした。細胞を２５°でＹＥＰＤ上にプレート
し、レプリカを３７°でＹＥＰＤに、トリプトファン欠
除培養基及びロイシン欠除培養基にプレートした。表１
にまとめた結果は、＃３を除く総ての共形質転換体が複
合培養基上でプラスミドマーカーについて１００％安定
であることを示す。（単離物 No.３は図４のレーンｅで
示される同じ形質転換体である。）別の安定性テスト
を、二つの共形質転換体、 No.１及び２について行っ
た。テストは、各々６６３及び６８１個のコロニーにつ
いて行われた。ＹＥＰＤ上で３０°で３０世代の生育後
に、総てのコロニーはトリプトファン及びロイシンに対
して栄養要求性であった。共形質転換体＃１は２２°で
生育速度についてテストされ、形質転換されていないＡ
２．７．Ｃ対照と同じ速度で生育することが判った。共
形質転換体＃１はＢＥＬＬ１と呼ばれる。これはＡＴＣ
Ｃ寄託番号２０６９８として寄託された。
ＰＤ）上で生育することにより、プラスミド安定性につ
いてテストした。細胞を２５°でＹＥＰＤ上にプレート
し、レプリカを３７°でＹＥＰＤに、トリプトファン欠
除培養基及びロイシン欠除培養基にプレートした。表１
にまとめた結果は、＃３を除く総ての共形質転換体が複
合培養基上でプラスミドマーカーについて１００％安定
であることを示す。（単離物 No.３は図４のレーンｅで
示される同じ形質転換体である。）別の安定性テスト
を、二つの共形質転換体、 No.１及び２について行っ
た。テストは、各々６６３及び６８１個のコロニーにつ
いて行われた。ＹＥＰＤ上で３０°で３０世代の生育後
に、総てのコロニーはトリプトファン及びロイシンに対
して栄養要求性であった。共形質転換体＃１は２２°で
生育速度についてテストされ、形質転換されていないＡ
２．７．Ｃ対照と同じ速度で生育することが判った。共
形質転換体＃１はＢＥＬＬ１と呼ばれる。これはＡＴＣ
Ｃ寄託番号２０６９８として寄託された。
【００３０】実施例２ シゾサッカロミセス・ポンベＰＯＴ１遺伝子 Ａ．選択しうるマーカーとしてのＳ．ポンベＰＯＴ１遺
伝子 サッカロミセス・セレビシエＴＰＩ１遺伝子は、トリオ
ースホスファートイソメラーゼ蛋白質をコードし、ｔｐ
ｉ１欠陥を補うことにより得られる（カワサキ及びフレ
ンケル、前出、アルバー及びカワサキ、前出）。驚くべ
きことに、Ｓ．ポンベからの相同的遺伝子が、Ｓ．セレ
ビシエｔｐｉ１突然変異を補うことにより単離された。
ＰＯＴ１と記される（ｐｏｍｂｅ ｔｒｉｏｓｅ ホス
ファートイソメラーゼに対して）Ｓ．ポンベＴＰＩ遺伝
子を、部分的にＳａｕ３Ａで消化されかつベクターＹＥ
ｐ１３に挿入されたゲノムＳ．ポンベＤＮＡを含むルシ
ェル（Russell)とホール(HaII)（J. Biol. chem.２５
８：１４３−１４９、１９８３）に記述されたライブラ
リイからクローニングした。予備的ＤＮＡ配列（マキサ
ム（Maxam)とギルバート（Gilbert)、メス・イン・エン
ザイモロジイ（Meth.in Enzymology)、６５：４９７−
５５９、１９８０）の方法による）は、ＰＯＴ１遺伝子
がＴＰＩ蛋白質をコードし、この蛋白質は他の生物から
のＴＰＩ蛋白質（アルバートとカワサキ、前出）と相同
であることを示した。このＰＯＴ１ＤＮＡ配列は、Ｓ．
セレビシエＴＰＩ１ＤＮＡ配列及び各蛋白質配列と共
に、図５〜図８に示される。
伝子 サッカロミセス・セレビシエＴＰＩ１遺伝子は、トリオ
ースホスファートイソメラーゼ蛋白質をコードし、ｔｐ
ｉ１欠陥を補うことにより得られる（カワサキ及びフレ
ンケル、前出、アルバー及びカワサキ、前出）。驚くべ
きことに、Ｓ．ポンベからの相同的遺伝子が、Ｓ．セレ
ビシエｔｐｉ１突然変異を補うことにより単離された。
ＰＯＴ１と記される（ｐｏｍｂｅ ｔｒｉｏｓｅ ホス
ファートイソメラーゼに対して）Ｓ．ポンベＴＰＩ遺伝
子を、部分的にＳａｕ３Ａで消化されかつベクターＹＥ
ｐ１３に挿入されたゲノムＳ．ポンベＤＮＡを含むルシ
ェル（Russell)とホール(HaII)（J. Biol. chem.２５
８：１４３−１４９、１９８３）に記述されたライブラ
リイからクローニングした。予備的ＤＮＡ配列（マキサ
ム（Maxam)とギルバート（Gilbert)、メス・イン・エン
ザイモロジイ（Meth.in Enzymology)、６５：４９７−
５５９、１９８０）の方法による）は、ＰＯＴ１遺伝子
がＴＰＩ蛋白質をコードし、この蛋白質は他の生物から
のＴＰＩ蛋白質（アルバートとカワサキ、前出）と相同
であることを示した。このＰＯＴ１ＤＮＡ配列は、Ｓ．
セレビシエＴＰＩ１ＤＮＡ配列及び各蛋白質配列と共
に、図５〜図８に示される。
【００３１】Ｓ．ポンベＰＯＴ１遺伝子はこの実施例に
おいてＳ．セレビシエにおける選択マーカーとしてＳ．
セレビシエＴＰＩ１遺伝子よりも好ましい。Ｓ．セレビ
シエにおけるＰＯＴ１のような異種遺伝子は、他種の宿
主中では十分に機能せず、従って宿主細胞欠陥を補うた
めにより高いコピー数を必要とするかも知れない。また
酵母プラスミド上の選択しうるＰＯＴ１遺伝子は、同じ
ベクター上の産業上重要な遺伝子の発現のために内生Ｔ
ＰＩ１プロモーター及びＴＰＩ１ターミネーター（ＰＯ
Ｉ１との相同性を示さない対照領域）の使用を可能にす
る。ＰＯＴ１とＴＰＩ１のフランキング領域は相同性を
示さないので、分子内組換え及びその結果としてのプラ
スミド不安定性が低減される。最後に、ＰＯＴ１遺伝子
はＳ．セレビシエ染色体ＤＮＡと組換えしそうもない。
なぜなら、それはＴＰＩ１配列とＤＮＡレベルにおいて
小さな相同性しか持たず、ＴＰＩ１遺伝子の大部分が宿
主株において除去されているからである。すなわち、Ｐ
ＯＴ１含有プラスミドは高コピー数のまま留り、これは
酵母において産業的に興味ある異種遺伝子の発現の向上
のために望ましい。
おいてＳ．セレビシエにおける選択マーカーとしてＳ．
セレビシエＴＰＩ１遺伝子よりも好ましい。Ｓ．セレビ
シエにおけるＰＯＴ１のような異種遺伝子は、他種の宿
主中では十分に機能せず、従って宿主細胞欠陥を補うた
めにより高いコピー数を必要とするかも知れない。また
酵母プラスミド上の選択しうるＰＯＴ１遺伝子は、同じ
ベクター上の産業上重要な遺伝子の発現のために内生Ｔ
ＰＩ１プロモーター及びＴＰＩ１ターミネーター（ＰＯ
Ｉ１との相同性を示さない対照領域）の使用を可能にす
る。ＰＯＴ１とＴＰＩ１のフランキング領域は相同性を
示さないので、分子内組換え及びその結果としてのプラ
スミド不安定性が低減される。最後に、ＰＯＴ１遺伝子
はＳ．セレビシエ染色体ＤＮＡと組換えしそうもない。
なぜなら、それはＴＰＩ１配列とＤＮＡレベルにおいて
小さな相同性しか持たず、ＴＰＩ１遺伝子の大部分が宿
主株において除去されているからである。すなわち、Ｐ
ＯＴ１含有プラスミドは高コピー数のまま留り、これは
酵母において産業的に興味ある異種遺伝子の発現の向上
のために望ましい。
【００３２】ＰＯＴ１遺伝子含有プラスミドは、Ｓ．セ
レビシエ株Ｎ５８７−２Ｄ（カワサキとフレンケル、前
出）におけるｔｐｉ１突然変異の補足によってマシェル
及びホール（前出）の S. pombe ライブラリイから同定
された。このプラスミドｐＰＯＴの制限地図は、図９に
示されている。ｐＰＯＴがベクターＹＥｐ１３を含むの
で、それは本質的に不安定である。なぜなら、それは酵
母内での２μプラスミドの維持に必要な複製機能を欠く
からである。従ってＰＯＴ１遺伝子は、Cl/lのようなよ
り有効なベクター及び全２μプラスミド配列を含む関連
するベクター内に移されうる。プラスミドCl/lはｐＪＤ
Ｂ２４８（ベッグズ（Beggs)、ネイチア(Nature)、２７
５：１０４−１０９、１９７８）及び本明細書実施例３
記載のｐＢＲ３２２から誘導された。それは、酵母２μ
プラスミドＤＮＡ、選択しうるＬＥＵ２遺伝子、及びｐ
ＢＲ３２２配列の総てを含む。ＰＯＴ１遺伝子は、約3,
４００の塩基対の BamHI−XbaI制限フラグメントとして
ｐＰＯＴから単離され、ｐＵＣ１３の対応するポリリン
カー部位に挿入された。得られたプラスミドはｐＵＣＰ
ＯＴであり、その部分的制限地図を図９に示す。
レビシエ株Ｎ５８７−２Ｄ（カワサキとフレンケル、前
出）におけるｔｐｉ１突然変異の補足によってマシェル
及びホール（前出）の S. pombe ライブラリイから同定
された。このプラスミドｐＰＯＴの制限地図は、図９に
示されている。ｐＰＯＴがベクターＹＥｐ１３を含むの
で、それは本質的に不安定である。なぜなら、それは酵
母内での２μプラスミドの維持に必要な複製機能を欠く
からである。従ってＰＯＴ１遺伝子は、Cl/lのようなよ
り有効なベクター及び全２μプラスミド配列を含む関連
するベクター内に移されうる。プラスミドCl/lはｐＪＤ
Ｂ２４８（ベッグズ（Beggs)、ネイチア(Nature)、２７
５：１０４−１０９、１９７８）及び本明細書実施例３
記載のｐＢＲ３２２から誘導された。それは、酵母２μ
プラスミドＤＮＡ、選択しうるＬＥＵ２遺伝子、及びｐ
ＢＲ３２２配列の総てを含む。ＰＯＴ１遺伝子は、約3,
４００の塩基対の BamHI−XbaI制限フラグメントとして
ｐＰＯＴから単離され、ｐＵＣ１３の対応するポリリン
カー部位に挿入された。得られたプラスミドはｐＵＣＰ
ＯＴであり、その部分的制限地図を図９に示す。
【００３３】ｐＵＣＰＯＴプラスミドは、Ｓ．ポンベ及
びＳ．セレビシエＤＮＡの約1,８００の塩基対を除去す
るためにＳａ１Ｉで切断されそして再結合された。この
得られたｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１プラスミドを図９に示
す。ＰＯＴ１遺伝子は下記の方法でCl/l内に入れられ
た。Cl/l及びｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１の両者はアンピシリ
ン耐性遺伝子内にＢｇｌI 部位及びある他の位置に唯一
の BamHI部位を持つので、ｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１のＰＯ
Ｔ１フラグメントはCl/lのｐＢＲ３２２領域の一部に代
って置換される。Cl/lはＢｇｌI 及び BamHIで切断され
て ampr 遺伝子の一部、全２μＤＮＡ、及びＬＥＵ２遺
伝子を含む約7,７００塩基対の大きなフラグメントを遊
離した。同様に、ｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１をＢｇｌI と B
amHIで切断して、 ampr 遺伝子の他の一部及びＰＯＴ１
遺伝子を含む約3,４００塩基対のフラグメントを遊離し
た。この二つのフラグメントはｐＣＰＯＴを形成するた
めに結合された。これは、“回復された”選択しうる a
mp r 遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、全２μ
ＤＮＡ、及びｐＵＣ１３からの複製領域のバクテリアオ
リジンを含む。（ｐＵＣ１３からのバクテリアオリジン
領域は、ｐＢＲ３２２のオリジン領域よりもE. coli に
おけるより高いプラスミドのコピー数を可能にする。）
ｐＣＰＯＴで形質転換されたE. coli 株ＨＢ−１０１は
ＡＴＣＣ寄託番号３９６８５として寄託された。
びＳ．セレビシエＤＮＡの約1,８００の塩基対を除去す
るためにＳａ１Ｉで切断されそして再結合された。この
得られたｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１プラスミドを図９に示
す。ＰＯＴ１遺伝子は下記の方法でCl/l内に入れられ
た。Cl/l及びｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１の両者はアンピシリ
ン耐性遺伝子内にＢｇｌI 部位及びある他の位置に唯一
の BamHI部位を持つので、ｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１のＰＯ
Ｔ１フラグメントはCl/lのｐＢＲ３２２領域の一部に代
って置換される。Cl/lはＢｇｌI 及び BamHIで切断され
て ampr 遺伝子の一部、全２μＤＮＡ、及びＬＥＵ２遺
伝子を含む約7,７００塩基対の大きなフラグメントを遊
離した。同様に、ｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１をＢｇｌI と B
amHIで切断して、 ampr 遺伝子の他の一部及びＰＯＴ１
遺伝子を含む約3,４００塩基対のフラグメントを遊離し
た。この二つのフラグメントはｐＣＰＯＴを形成するた
めに結合された。これは、“回復された”選択しうる a
mp r 遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、全２μ
ＤＮＡ、及びｐＵＣ１３からの複製領域のバクテリアオ
リジンを含む。（ｐＵＣ１３からのバクテリアオリジン
領域は、ｐＢＲ３２２のオリジン領域よりもE. coli に
おけるより高いプラスミドのコピー数を可能にする。）
ｐＣＰＯＴで形質転換されたE. coli 株ＨＢ−１０１は
ＡＴＣＣ寄託番号３９６８５として寄託された。
【００３４】ＰＯＴ１遺伝子はまた、同じ構成によって
Cl/lに由来ベクター中に挿入されうる。たとえばプラス
ミドｐＦＡＴ５（図１０）は、Cl/l挿入されたヒトα−
１−抗トリプシン（ＡＴ）の生産のための発現単位を含
んでいる。実施例４で記載されうるように作られるこの
発現単位は、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＴ ｃＤＮＡ配
列及びＴＰＩ１転写ターミネーターより成る。ｐＦＡＴ
５の制限地図を図１０に示す。ｐＦＡＴ５をＢｇｌI 及
び BamHIで切断して、ＡＴ遺伝子及びＴＰＩ１ターミネ
ーターを含むフラグメント（2,２００塩基対）を遊離し
た。また、上述のCl/lＢｇｌI − BamHIフラグメントと
同一の（ただしｐＦＡＴ５からのフラグメントはＴＰＩ
１プロモーターを含むさらに９００の塩基対を含む。）
ＢｇｌI − BamHIフラグメントが遊離される。この後者
のｐＦＡＴ５片及びｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１３４００bp
ＢｇｌI − BamHIフラグメント（上述した）が結合され
てプラスミドｐＦＰＯＴを形成する。これは図１０に示
す制限地図を持つ。ベクターｐＦＰＯＴが唯一つの Bam
HI部位で切断されて、2,２００塩基対ＡＴ遺伝子及びｐ
ＦＡＴ５からのＴＰＩ１ターミネーターフラグメントの
挿入を可能にした。ｐＦＰＯＴ内への適当な定位での2,
２００塩基対フラグメントのクローニングは、この酵素
ベクターにおけるヒトＡＴの発現を可能にする。適当に
結合された生成物はｐＦＡＴＰＯＴと名付けられ、その
制限地図を図１０に示す。
Cl/lに由来ベクター中に挿入されうる。たとえばプラス
ミドｐＦＡＴ５（図１０）は、Cl/l挿入されたヒトα−
１−抗トリプシン（ＡＴ）の生産のための発現単位を含
んでいる。実施例４で記載されうるように作られるこの
発現単位は、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＴ ｃＤＮＡ配
列及びＴＰＩ１転写ターミネーターより成る。ｐＦＡＴ
５の制限地図を図１０に示す。ｐＦＡＴ５をＢｇｌI 及
び BamHIで切断して、ＡＴ遺伝子及びＴＰＩ１ターミネ
ーターを含むフラグメント（2,２００塩基対）を遊離し
た。また、上述のCl/lＢｇｌI − BamHIフラグメントと
同一の（ただしｐＦＡＴ５からのフラグメントはＴＰＩ
１プロモーターを含むさらに９００の塩基対を含む。）
ＢｇｌI − BamHIフラグメントが遊離される。この後者
のｐＦＡＴ５片及びｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１３４００bp
ＢｇｌI − BamHIフラグメント（上述した）が結合され
てプラスミドｐＦＰＯＴを形成する。これは図１０に示
す制限地図を持つ。ベクターｐＦＰＯＴが唯一つの Bam
HI部位で切断されて、2,２００塩基対ＡＴ遺伝子及びｐ
ＦＡＴ５からのＴＰＩ１ターミネーターフラグメントの
挿入を可能にした。ｐＦＰＯＴ内への適当な定位での2,
２００塩基対フラグメントのクローニングは、この酵素
ベクターにおけるヒトＡＴの発現を可能にする。適当に
結合された生成物はｐＦＡＴＰＯＴと名付けられ、その
制限地図を図１０に示す。
【００３５】Ｂ．宿主ＴＰＩ遺伝子の破壊 サッカロミセス・セレビシエＴＰＩ１遺伝子がクローニ
ングされ、配列化された（カワサキとフランケル、前
出、及びアルバートとカワサキ、前出）ＴＰＩ蛋白質の
ための構成遺伝子を含むプラスミドｐＴＰＩＣ１０は、
アルバートとカワサキ（前出）に記述されている。一つ
のＢｇｌ II 部位は、ＴＰＩ１のコード領域中のＤＮＡ
位置２９５に存在し、他のＢｇｌ II 部位は５’フラン
キング領域中に約1,２００塩基対離れて位置する。これ
らのＢｇｌ II 部位は、ＴＰＩ１遺伝子の対を除去する
ため及び酵母ＬＥＵ２遺伝子のような他の遺伝子を挿入
するための慣用のクローニング部位である。そのような
構造物は、形質転換された宿主におけるゲノムＴＰＩ１
座の破壊を成すために用いうる。ＴＰＩ１の５’フラン
キング領域中の約−１８００にPstI部位がある。従って
ｐＴＰＩＣ１０において、ＴＰＩ１遺伝子は５’サイド
でPstI部位により及び３’サイドでＳａ１Ｉ部位（ tet
r 遺伝子中の）によりフランクされる。ＴＰＩ１を含む
このPstI−Ｓａ１ＩフラグメントがPstI及びＳａ１Ｉ部
位でｐＵＣ１３に挿入されて、ｐＵＣＴＰＩを作った。
PstI−Ｓａ１Ｉ挿入物（ｐＵＣ１３への）の制限地図を
図１１に示す。
ングされ、配列化された（カワサキとフランケル、前
出、及びアルバートとカワサキ、前出）ＴＰＩ蛋白質の
ための構成遺伝子を含むプラスミドｐＴＰＩＣ１０は、
アルバートとカワサキ（前出）に記述されている。一つ
のＢｇｌ II 部位は、ＴＰＩ１のコード領域中のＤＮＡ
位置２９５に存在し、他のＢｇｌ II 部位は５’フラン
キング領域中に約1,２００塩基対離れて位置する。これ
らのＢｇｌ II 部位は、ＴＰＩ１遺伝子の対を除去する
ため及び酵母ＬＥＵ２遺伝子のような他の遺伝子を挿入
するための慣用のクローニング部位である。そのような
構造物は、形質転換された宿主におけるゲノムＴＰＩ１
座の破壊を成すために用いうる。ＴＰＩ１の５’フラン
キング領域中の約−１８００にPstI部位がある。従って
ｐＴＰＩＣ１０において、ＴＰＩ１遺伝子は５’サイド
でPstI部位により及び３’サイドでＳａ１Ｉ部位（ tet
r 遺伝子中の）によりフランクされる。ＴＰＩ１を含む
このPstI−Ｓａ１ＩフラグメントがPstI及びＳａ１Ｉ部
位でｐＵＣ１３に挿入されて、ｐＵＣＴＰＩを作った。
PstI−Ｓａ１Ｉ挿入物（ｐＵＣ１３への）の制限地図を
図１１に示す。
【００３６】プラスミドｐＵＣＴＰＩは次にＢｇｌ II
で切断され、この二つのＤＮＡフラグメントは電気泳動
で分離された。大きい方のフラグメントは精製され、自
己結合を防ぐためにホスファターゼ処理された。このＤ
ＮＡのＢｇｌ II 部位に酵母ＬＥＵ２遺伝子（これはＢ
ｇｌ II フラグメントとしてプラスミドＹＥｐ１３（ブ
ローチ（Broach) ら、ジーン（Gene) 、８：１２１−１
３３、１９７９）から除去された。）が結合された。得
られたプラスミドはｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２であった。
これは、ＴＰＩ１の部分的除去及びＬＥＵ２の挿入を有
する。ｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２は図１１に示されてい
る。
で切断され、この二つのＤＮＡフラグメントは電気泳動
で分離された。大きい方のフラグメントは精製され、自
己結合を防ぐためにホスファターゼ処理された。このＤ
ＮＡのＢｇｌ II 部位に酵母ＬＥＵ２遺伝子（これはＢ
ｇｌ II フラグメントとしてプラスミドＹＥｐ１３（ブ
ローチ（Broach) ら、ジーン（Gene) 、８：１２１−１
３３、１９７９）から除去された。）が結合された。得
られたプラスミドはｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２であった。
これは、ＴＰＩ１の部分的除去及びＬＥＵ２の挿入を有
する。ｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２は図１１に示されてい
る。
【００３７】プラスミドｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２は、Ｄ
ＮＡを線状化するためにPstI及び BamHIで切断された。
この酵母配列は次に、電気泳動及びゲル精製によりｐＵ
Ｃ１３から単離された。図１１に示した酵母ＤＮＡ部分
は、ＴＰＩ１染色体遺伝子（ロスステイン、前出）を
“破壊”するために、ＬＥＵ２について欠陥的である
Ｓ．セレビシエ株Ｅ２−７Ｂ（ＡＴＣＣ No.２０６８
９）を形質転換するために用いられた。 Leu+ 形質転換
体が、３％グリセロール及び１％ラクテート（ pH ７に
中和された）、１Ｍソルビトールを含みロイシンを含ま
ない合成（修正ウィッカーハムの）培養基（モルチヤー
（Mortimer) とハウソーン（Hawthorne)著、ローズ（Ro
se) とハリソン（Harrison) 編、ザ・イースツ（The Ye
asts)vol. １、３８５−４６０、アカデミックプレス
（Academic Press）、１９６９）で選択された。形質転
換体は、ＹＥＰ−デキストロースで生育することの不能
によってＴＰＩ欠陥についてスクリーンされた。スクリ
ーンされた初めの９９の形質転換体のうち、一つの tpi
- 形質転換体が見い出された。この株はＥ２−７ＢΔ t
pi＃２９と名付けられた（以下ではΔ tpi＃２９と云
う）。Δ tpi＃２９はＹＥＰ−３％グリセロール−１％
ラクテートで生育したが、ＹＥＰ−デキストロールでは
生育しなかった。粗細胞抽出物について酵素評価（クリ
フトン（Clifton)ら、ジェネティクス（Genetics) 、８
８：１−１１、１９８０）が行われ、Δ tpi＃２９は検
知できるレベルのトリオースホスファート イソメラー
ゼ活性を欠くことを確認した。
ＮＡを線状化するためにPstI及び BamHIで切断された。
この酵母配列は次に、電気泳動及びゲル精製によりｐＵ
Ｃ１３から単離された。図１１に示した酵母ＤＮＡ部分
は、ＴＰＩ１染色体遺伝子（ロスステイン、前出）を
“破壊”するために、ＬＥＵ２について欠陥的である
Ｓ．セレビシエ株Ｅ２−７Ｂ（ＡＴＣＣ No.２０６８
９）を形質転換するために用いられた。 Leu+ 形質転換
体が、３％グリセロール及び１％ラクテート（ pH ７に
中和された）、１Ｍソルビトールを含みロイシンを含ま
ない合成（修正ウィッカーハムの）培養基（モルチヤー
（Mortimer) とハウソーン（Hawthorne)著、ローズ（Ro
se) とハリソン（Harrison) 編、ザ・イースツ（The Ye
asts)vol. １、３８５−４６０、アカデミックプレス
（Academic Press）、１９６９）で選択された。形質転
換体は、ＹＥＰ−デキストロースで生育することの不能
によってＴＰＩ欠陥についてスクリーンされた。スクリ
ーンされた初めの９９の形質転換体のうち、一つの tpi
- 形質転換体が見い出された。この株はＥ２−７ＢΔ t
pi＃２９と名付けられた（以下ではΔ tpi＃２９と云
う）。Δ tpi＃２９はＹＥＰ−３％グリセロール−１％
ラクテートで生育したが、ＹＥＰ−デキストロールでは
生育しなかった。粗細胞抽出物について酵素評価（クリ
フトン（Clifton)ら、ジェネティクス（Genetics) 、８
８：１−１１、１９８０）が行われ、Δ tpi＃２９は検
知できるレベルのトリオースホスファート イソメラー
ゼ活性を欠くことを確認した。
【００３８】Δ tpi＃２９は、 tpi- 除去のためにヘテ
ロ接合性である二倍体を形成するために他の酵母株に交
配することができる。そのような二倍体は、トリオース
ホスファート イソメラーゼに対して欠陥のある他の
株が発生されうるように、胞子形成されうる。たとえば
Δ tpi＃２９は、二倍体Ｅ１１を形成するためにＥ８−
１０Ａ（ＭＡＴα leu ２）（交配Ｅ２−７Ｂ〔ＡＴＣ
Ｃ ２０６８９〕ｘＧＫ１００〔ＡＴＣＣ ２０６６
９〕の胞子セグメント）に交配された。この二倍体は、
ゲノタイプＭＡＴαｐｅｐ４−３ ｔｐｉｌを持つ半数
体子孫Ｅ１１−３Ｃを発生するために、胞子形成され
た。Ｅ１１−３Ｃは、ｔｐｉｌ除去のためにホモ接合性
である二倍体Ｅ１８を形成するためにΔ tpi＃２９に戻
し交配された。Ｅ１８はプラスミドのための宿主株とし
てΔ tpi＃２９より好ましいかも知れない。なぜならそ
れはアミノ酸要求性を持たず、より大きな細胞を持ち、
より速く成長するからである。これら tpi-株は解糖機
能をコードする遺伝物質について除去され、従って先祖
返りしない（すなわち安定な）突然変異体であると思わ
れる。
ロ接合性である二倍体を形成するために他の酵母株に交
配することができる。そのような二倍体は、トリオース
ホスファート イソメラーゼに対して欠陥のある他の
株が発生されうるように、胞子形成されうる。たとえば
Δ tpi＃２９は、二倍体Ｅ１１を形成するためにＥ８−
１０Ａ（ＭＡＴα leu ２）（交配Ｅ２−７Ｂ〔ＡＴＣ
Ｃ ２０６８９〕ｘＧＫ１００〔ＡＴＣＣ ２０６６
９〕の胞子セグメント）に交配された。この二倍体は、
ゲノタイプＭＡＴαｐｅｐ４−３ ｔｐｉｌを持つ半数
体子孫Ｅ１１−３Ｃを発生するために、胞子形成され
た。Ｅ１１−３Ｃは、ｔｐｉｌ除去のためにホモ接合性
である二倍体Ｅ１８を形成するためにΔ tpi＃２９に戻
し交配された。Ｅ１８はプラスミドのための宿主株とし
てΔ tpi＃２９より好ましいかも知れない。なぜならそ
れはアミノ酸要求性を持たず、より大きな細胞を持ち、
より速く成長するからである。これら tpi-株は解糖機
能をコードする遺伝物質について除去され、従って先祖
返りしない（すなわち安定な）突然変異体であると思わ
れる。
【００３９】Ｃ．Ｓ．セレビシエ tpi- 除去株へのＰＯ
Ｔ１遺伝子の形質転換 プラスミドｐＦＰＯＴとｐＦＡＴＰＯＴを、Δ tpi＃２
９及び関連する tpi-除去株中に形質転換した。この酵
母突然変異体を、ＹＥＰ−２％ガラクトースで３０°で
対数増殖後期まで一夜好気的に生育させた。形質転換条
件はベッグズ（前出）の記述の通りであったが、但し細
胞は寒天上層に細胞をプレートする前にＹＥＰ−デキス
トロースの代りにＹＥＰ−３％グリセロール−１％ラク
テート又はＹＥＰ−２％ガラクトースを含む１Ｍソルビ
トール中で３０°で１〜２時間回復させた。寒天上層と
プレートは、１Ｍソルビトールと２％デキストロースを
有する合成の修正ウィッカーハムの培養基を含む。３０
°で３日後に形質転換体は目で見え、ＹＥＰＤ上に再プ
レートするために寒天培養基から取り出された。その
後、形質転換体はＹＥＰＤ又はデキストロースを含む他
の複合培養基で維持された。ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換
された株Ｅ１８は、ＺＹＭ−３と名付けられた。それ
は、ＡＴＣＣ寄託番号２０６９９として寄託されてい
る。
Ｔ１遺伝子の形質転換 プラスミドｐＦＰＯＴとｐＦＡＴＰＯＴを、Δ tpi＃２
９及び関連する tpi-除去株中に形質転換した。この酵
母突然変異体を、ＹＥＰ−２％ガラクトースで３０°で
対数増殖後期まで一夜好気的に生育させた。形質転換条
件はベッグズ（前出）の記述の通りであったが、但し細
胞は寒天上層に細胞をプレートする前にＹＥＰ−デキス
トロースの代りにＹＥＰ−３％グリセロール−１％ラク
テート又はＹＥＰ−２％ガラクトースを含む１Ｍソルビ
トール中で３０°で１〜２時間回復させた。寒天上層と
プレートは、１Ｍソルビトールと２％デキストロースを
有する合成の修正ウィッカーハムの培養基を含む。３０
°で３日後に形質転換体は目で見え、ＹＥＰＤ上に再プ
レートするために寒天培養基から取り出された。その
後、形質転換体はＹＥＰＤ又はデキストロースを含む他
の複合培養基で維持された。ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換
された株Ｅ１８は、ＺＹＭ−３と名付けられた。それ
は、ＡＴＣＣ寄託番号２０６９９として寄託されてい
る。
【００４０】複合培養基上でのｐＦＰＯＴとｐＦＡＴＰ
ＯＴの安定性 プラスミド安定性を研究するために、単一細胞からのク
ローンをＹＥＰＤを含む管に接種し、合計数１０9 細胞
（約３０回分裂）まで生育させた。酵母細胞は、凝集を
こわすために音波をあてられ、適当な数まで希釈され、
tpi- 細胞（ＰＯＴ１遺伝子を有するプラスミドを持つ
又は持たない）を生育させるＹＥＰ−２％ガラクトース
又はＹＥＰ−２％グリセロール−１％ラクテート上にプ
レートした。ＹＥＰ−ガラクトースで生育したコロニー
を次に、プラスミドの損失をスクリーンする（すなわち
ＰＯＴ１含有プラスミドを失った tpi- 細胞はデキスト
ロースで生育しないであろう）ために、ＹＥＰＤ上にレ
プレカプレートされた。表２にまとめた結果は、ｐＦＰ
ＯＴとｐＦＡＴＰＯＴプラスミドが酵母 tpi- 除去株に
おいて安定であることを示す。それらは驚くべきこと
に、動原体を含む酵母プラスミドよりはるかに安定であ
る。動原体含有プラスミド（コピー数が低い）は、酵母
について報告された最も安定なプラスミドに属し、一般
に複合培養基での分裂ごとに細胞の約１％が失われる
（動原体プラスミド安定性の総説のためにマレイ（Murr
ay）とスゾスタク（Szostak)、前出、参照）。表２に示
したように、本明細書で説明されるＰＯＴ１プラスミド
は、 tpi- 除去株において複合培養基で３０回分裂の後
に１％未満の確立で失われる。
ＯＴの安定性 プラスミド安定性を研究するために、単一細胞からのク
ローンをＹＥＰＤを含む管に接種し、合計数１０9 細胞
（約３０回分裂）まで生育させた。酵母細胞は、凝集を
こわすために音波をあてられ、適当な数まで希釈され、
tpi- 細胞（ＰＯＴ１遺伝子を有するプラスミドを持つ
又は持たない）を生育させるＹＥＰ−２％ガラクトース
又はＹＥＰ−２％グリセロール−１％ラクテート上にプ
レートした。ＹＥＰ−ガラクトースで生育したコロニー
を次に、プラスミドの損失をスクリーンする（すなわち
ＰＯＴ１含有プラスミドを失った tpi- 細胞はデキスト
ロースで生育しないであろう）ために、ＹＥＰＤ上にレ
プレカプレートされた。表２にまとめた結果は、ｐＦＰ
ＯＴとｐＦＡＴＰＯＴプラスミドが酵母 tpi- 除去株に
おいて安定であることを示す。それらは驚くべきこと
に、動原体を含む酵母プラスミドよりはるかに安定であ
る。動原体含有プラスミド（コピー数が低い）は、酵母
について報告された最も安定なプラスミドに属し、一般
に複合培養基での分裂ごとに細胞の約１％が失われる
（動原体プラスミド安定性の総説のためにマレイ（Murr
ay）とスゾスタク（Szostak)、前出、参照）。表２に示
したように、本明細書で説明されるＰＯＴ１プラスミド
は、 tpi- 除去株において複合培養基で３０回分裂の後
に１％未満の確立で失われる。
【００４１】Ｄ．ＰＯＴ１プラスミドを用いるＳ．セレ
ビシエにおけるヒトα−１−抗トリプシンの発現 形質転換された酵母における異種蛋白質の発現を高める
ためにＰＯＴ１プラスミドを用いることをテストするた
めに、プラスミドｐＦＡＴＰＯＴ及びｐＦＡＴ５がＳ．
セレビシエ株Δ tpi＃２９及びＥ２−７Ｂを各々形質転
換するために用いられた。形質転換された細胞は、デキ
ストロースを含みロイシンを含まない培養基中で選択さ
れた。培養物は３〜４のO.D.600 まで３０°で生育され
た。細胞抽出物が作られ、実施例５で述べるようにＡＴ
について評価された。ｐＦＡＴＰＯＴ／Δ tpi＃２９に
より作られたＡＴは、合計４〜６％の可溶性蛋白質を示
した。ｐＦＡＴ５／Ｅ２−７Ｂにより作られたＡＴは、
合計２〜３％の可溶性蛋白質を示した。プラスミドコピ
ー数は正確に測定するのは困難であり、平均数を示すも
のであるが、発現単位（プロモーター、興味ある遺伝
子、ターミネーター）が同じままであるとして遺伝子生
成物量の経験的観察は相対的なプラスミドレベルの表示
を与える。従ってｐＦＡＴＰＯＴは、ｐＦＡＴ５（これ
からそれが誘導された）よりも数において機能的により
大きいようである。二つの形質転換された株は遺伝的に
ほぼ同一であり（Δ tpi＃２９はプラスミド支配突然変
異生成によりＥ２−７Ｂから誘導される）、同じ条件下
で生育されたので、これらの結果は従来報告されたベク
ターより高い本明細書の安定なプラスミド発現の値を示
すものである。
ビシエにおけるヒトα−１−抗トリプシンの発現 形質転換された酵母における異種蛋白質の発現を高める
ためにＰＯＴ１プラスミドを用いることをテストするた
めに、プラスミドｐＦＡＴＰＯＴ及びｐＦＡＴ５がＳ．
セレビシエ株Δ tpi＃２９及びＥ２−７Ｂを各々形質転
換するために用いられた。形質転換された細胞は、デキ
ストロースを含みロイシンを含まない培養基中で選択さ
れた。培養物は３〜４のO.D.600 まで３０°で生育され
た。細胞抽出物が作られ、実施例５で述べるようにＡＴ
について評価された。ｐＦＡＴＰＯＴ／Δ tpi＃２９に
より作られたＡＴは、合計４〜６％の可溶性蛋白質を示
した。ｐＦＡＴ５／Ｅ２−７Ｂにより作られたＡＴは、
合計２〜３％の可溶性蛋白質を示した。プラスミドコピ
ー数は正確に測定するのは困難であり、平均数を示すも
のであるが、発現単位（プロモーター、興味ある遺伝
子、ターミネーター）が同じままであるとして遺伝子生
成物量の経験的観察は相対的なプラスミドレベルの表示
を与える。従ってｐＦＡＴＰＯＴは、ｐＦＡＴ５（これ
からそれが誘導された）よりも数において機能的により
大きいようである。二つの形質転換された株は遺伝的に
ほぼ同一であり（Δ tpi＃２９はプラスミド支配突然変
異生成によりＥ２−７Ｂから誘導される）、同じ条件下
で生育されたので、これらの結果は従来報告されたベク
ターより高い本明細書の安定なプラスミド発現の値を示
すものである。
【００４２】Ｅ．ｐＭＰＯＴ２ベクターの構成 酵母２μＤＮＡからのＲＥＰ１、ＲＥＰ２、ＲＥＰ３及
びori 配列及びＰＯＴ１遺伝子を含む第二の安定な発現
ベクターが構築された。ＰＯＴ１遺伝子は、プラスミド
をＳａ１Ｉ及び BamHIで消化してｐＦＡＴＰＯＴから得
られた。この１６００bpフラグメントは次に、初めにＳ
ａ１Ｉ及び BamHIでの消化により線状化されたｐＩＣ１
９Ｒ（ｐＵＣ１９〔ノーランダー（Norrander)ら、ジー
ン（Gene) 、２６：１０１−１０６、１９８３〕のHind
III部位に挿入された、図１２に示すポリリンカー配列
を含む）に結合された。得られたプラスミド中の BamH
I、PstI、及びＳａｌＩ部位は、プラスミドｐＩＣＰＯ
Ｔ* を作るために二段階で破壊された。PstI及びＳａｌ
Ｉ部位は、PstI及びＳａｌＩでの切断により除去され
た；末端は、PstI３’オーバーハンク（突出部）をＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノウ（Klenow）フラグメント）
で消化しそしてＳａｌＩ５’オーバーハングをクレノウ
フラグメントでふさぐことによってブラント（対合二本
鎖化）された。ブラント末端は次に結合された。 BamHI
部位は次に、プラスミドを BamHIで切断し、末端をＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）でふさぎそ
してブラント末端を再結合することにより除去された。
びori 配列及びＰＯＴ１遺伝子を含む第二の安定な発現
ベクターが構築された。ＰＯＴ１遺伝子は、プラスミド
をＳａ１Ｉ及び BamHIで消化してｐＦＡＴＰＯＴから得
られた。この１６００bpフラグメントは次に、初めにＳ
ａ１Ｉ及び BamHIでの消化により線状化されたｐＩＣ１
９Ｒ（ｐＵＣ１９〔ノーランダー（Norrander)ら、ジー
ン（Gene) 、２６：１０１−１０６、１９８３〕のHind
III部位に挿入された、図１２に示すポリリンカー配列
を含む）に結合された。得られたプラスミド中の BamH
I、PstI、及びＳａｌＩ部位は、プラスミドｐＩＣＰＯ
Ｔ* を作るために二段階で破壊された。PstI及びＳａｌ
Ｉ部位は、PstI及びＳａｌＩでの切断により除去され
た；末端は、PstI３’オーバーハンク（突出部）をＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノウ（Klenow）フラグメント）
で消化しそしてＳａｌＩ５’オーバーハングをクレノウ
フラグメントでふさぐことによってブラント（対合二本
鎖化）された。ブラント末端は次に結合された。 BamHI
部位は次に、プラスミドを BamHIで切断し、末端をＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）でふさぎそ
してブラント末端を再結合することにより除去された。
【００４３】２μ配列が、プラスミドＹＥｐ１３（ブロ
ーチら、ジーン、８：１２１−１３３、１９７９）及び
Cl/lから得られた。ＲＥＰ３及びori 配列は、PstI及び
XbaIでの消化及びゲル精製によりＹＥｐ１３から除去さ
れた。ＲＥＰ２は、XbaI及びＳｐｈＩでの消化及びゲル
精製によりCl/lから得られた。次に二つのフラグメント
は、PstI及びＳｐｈＩで線状化されたｐＵＣ１８（ノー
ランダーら、前出）に結合され、プラスミドｐＵＣＲＥ
Ｐ２，３を作った。ＲＥＰ１は、１７０４bpフラグメン
トのEcoRI 及びXbaIでの消化及びゲル精製によりCl/lか
ら得られた。EcoRI −XbaIフラグメントは、EcoRI とXb
aIで線状化されたｐＵＣ１３中にクローニングされた。
得られたプラスミドはｐＵＣ１３＋ＲＥＰ１と名付けら
れた。ｐＵＣ１３＋ＲＥＰ１プラスミドはHind II で切
断され、EcoRI リンカー（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズから入手）の存在下で結合された。ＲＥＰ１遺
伝子は次に、約１７２０bpのEcoRI フラグメントとして
除去された。このEcoRI フラグメントは、EcoRI で線状
化されたｐＩＣ７（ｐＵＣ８のHind III部位に挿入され
た図１２に示すポリリンカーを含む）中にクローニング
された。得られたプラスミドはｐＩＣＲＥＰ１＃９と名
付けられた。
ーチら、ジーン、８：１２１−１３３、１９７９）及び
Cl/lから得られた。ＲＥＰ３及びori 配列は、PstI及び
XbaIでの消化及びゲル精製によりＹＥｐ１３から除去さ
れた。ＲＥＰ２は、XbaI及びＳｐｈＩでの消化及びゲル
精製によりCl/lから得られた。次に二つのフラグメント
は、PstI及びＳｐｈＩで線状化されたｐＵＣ１８（ノー
ランダーら、前出）に結合され、プラスミドｐＵＣＲＥ
Ｐ２，３を作った。ＲＥＰ１は、１７０４bpフラグメン
トのEcoRI 及びXbaIでの消化及びゲル精製によりCl/lか
ら得られた。EcoRI −XbaIフラグメントは、EcoRI とXb
aIで線状化されたｐＵＣ１３中にクローニングされた。
得られたプラスミドはｐＵＣ１３＋ＲＥＰ１と名付けら
れた。ｐＵＣ１３＋ＲＥＰ１プラスミドはHind II で切
断され、EcoRI リンカー（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズから入手）の存在下で結合された。ＲＥＰ１遺
伝子は次に、約１７２０bpのEcoRI フラグメントとして
除去された。このEcoRI フラグメントは、EcoRI で線状
化されたｐＩＣ７（ｐＵＣ８のHind III部位に挿入され
た図１２に示すポリリンカーを含む）中にクローニング
された。得られたプラスミドはｐＩＣＲＥＰ１＃９と名
付けられた。
【００４４】最終の発現ベクターｐＭＰＯＴ２を構築す
るために、ｐＩＣＰＯＴ* が部分的Hind III消化及び完
全ＳｓｔＩ消化により線状化された。プラスミドｐＵＣ
ＲＥＰ２、３がHind III及びＳｓｔＩで切断され、ＲＥ
Ｐ２、ＲＥＰ３及びori 配列に含むフラグメントがゲル
精製され、線状化されたｐＩＣＰＯＴ* に結合された。
ＲＥＰ２、ＲＥＰ３、ori 、ＰＯＴ１及び ampr 配列を
含む得られたプラスミドはｐＭＰＯＴ１と名付けられ
た。ＲＥＰ１が次に、Ｂｇｌ II −ＮａｒＩフラグメン
トとしてｐＩＣＲＥＰｌ＃９から除去され、Ｂｇｌ II
とＮａｒＩで開裂されたｐＭＰＯＴ１に結合された。こ
の結合化の生成物はｐＭＰＯＴ２と名付けられた（図１
３）。このｐＭＰＯＴ２で形質転換されたＳ．セレビシ
エ株Δ tpi＃２９はＡＴＣＣ No.２０７４４として寄託
された。
るために、ｐＩＣＰＯＴ* が部分的Hind III消化及び完
全ＳｓｔＩ消化により線状化された。プラスミドｐＵＣ
ＲＥＰ２、３がHind III及びＳｓｔＩで切断され、ＲＥ
Ｐ２、ＲＥＰ３及びori 配列に含むフラグメントがゲル
精製され、線状化されたｐＩＣＰＯＴ* に結合された。
ＲＥＰ２、ＲＥＰ３、ori 、ＰＯＴ１及び ampr 配列を
含む得られたプラスミドはｐＭＰＯＴ１と名付けられ
た。ＲＥＰ１が次に、Ｂｇｌ II −ＮａｒＩフラグメン
トとしてｐＩＣＲＥＰｌ＃９から除去され、Ｂｇｌ II
とＮａｒＩで開裂されたｐＭＰＯＴ１に結合された。こ
の結合化の生成物はｐＭＰＯＴ２と名付けられた（図１
３）。このｐＭＰＯＴ２で形質転換されたＳ．セレビシ
エ株Δ tpi＃２９はＡＴＣＣ No.２０７４４として寄託
された。
【００４５】Ｆ．ＰＯＴ１プラスミドを用いるv-sis 配
列の発現 サル肉腫ビールス（ＳＳＶ）のv-sis 遺伝子は、ビール
スの形質転換蛋白質であると推定されるｐ２８sis と呼
ばれる蛋白質をコードする。ｐ２８sis 蛋白質は、血小
板由来成長因子（ＰＤＧＦ）と抗原的及び構造的に類似
であることが示されている。v-sis 遺伝子はクローニン
グされ、そのＤＮＡ配列が決定された（デバレ（Devar
e）ら、Proc. Natl. Acad. Sic. USA ７９：３１７
９、１９８２；デバレら、Proc. Natl. Acad. Sic. USA
８０：７３１、１９８３）。この遺伝子の部分は、Ｐ
ＯＴ１プラスミドを用いて酵母において発現された。Ｓ
ＳＶレトロウイルスゲノムが、ゲノム中にＳＳＶ組込ま
れた非生産的にＳＳＶ−１１感染された正常ラット腎臓
細胞からクローニングされた（デバレら、１９８２、前
出）。ＳＳＶ ＤＮＡは5.８kb EcoRI フラグメントと
して単離され、次にｐＢＲ３２２中に挿入されてプラス
ミドｐＳＳＶ−１１を作った。1.２kbv-sis フラグメン
トが次にｐＳＳＶ−１１のPstI消化物から精製され、ｐ
ＵＣ１３のPstI部位中に挿入された。得られたプラスミ
ドはｐＶＳＩＳ／Pst と名付けられた。
列の発現 サル肉腫ビールス（ＳＳＶ）のv-sis 遺伝子は、ビール
スの形質転換蛋白質であると推定されるｐ２８sis と呼
ばれる蛋白質をコードする。ｐ２８sis 蛋白質は、血小
板由来成長因子（ＰＤＧＦ）と抗原的及び構造的に類似
であることが示されている。v-sis 遺伝子はクローニン
グされ、そのＤＮＡ配列が決定された（デバレ（Devar
e）ら、Proc. Natl. Acad. Sic. USA ７９：３１７
９、１９８２；デバレら、Proc. Natl. Acad. Sic. USA
８０：７３１、１９８３）。この遺伝子の部分は、Ｐ
ＯＴ１プラスミドを用いて酵母において発現された。Ｓ
ＳＶレトロウイルスゲノムが、ゲノム中にＳＳＶ組込ま
れた非生産的にＳＳＶ−１１感染された正常ラット腎臓
細胞からクローニングされた（デバレら、１９８２、前
出）。ＳＳＶ ＤＮＡは5.８kb EcoRI フラグメントと
して単離され、次にｐＢＲ３２２中に挿入されてプラス
ミドｐＳＳＶ−１１を作った。1.２kbv-sis フラグメン
トが次にｐＳＳＶ−１１のPstI消化物から精製され、ｐ
ＵＣ１３のPstI部位中に挿入された。得られたプラスミ
ドはｐＶＳＩＳ／Pst と名付けられた。
【００４６】v-sis 配列は次に、分泌発現単位を作るた
めに酵母交配フェロモンアルファ因子（ＭＦα１）遺伝
子（クリャン（Kurjan) とヘルスコウィッツ（Herskowi
tz)、セル（Cell) 、３０：９３３−９４３、１９８
２）の一部に結合された。プラスミドｐＳＳＶ−１１は
BamHIとＰｖｕ II で消化され、消化生成物は1.１％ア
ガロースゲルを通して電気泳動され、抽出され、そして
エタノール沈殿された。このＤＮＡを再懸濁し、Ｈｐｈ
Ｉで消化し、そして３９６bp ＨｐｈＩ−ＰｖｕII フ
ラグメントを1.２５％アガロースゲル上で精製した。Ｈ
ｐｈＩ開裂部位をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラ
グメント）を用いてブラントした。ＤＮＡを次にＢｇｌ
II で消化し、２９６bp ＨｐｈＩ−Ｂｇｌ II フラグ
メント（５’v-sis フラグメント）をゲル精製した。
３’v-sis 配列を、７５６bp ＢｇｌII −XbaIフラグ
メントとしてプラスミドｐＶＳＩＳ／Pst から単離し
た。ｐＵＣ１３のEcoRI 部位に挿入されたＭＦα１遺伝
子を含む１７００bp EcoRI フラグメントを含むプラス
ミドｐ１９２をHind IIIで消化した。ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノウフラグメント）と４つのデオキシリボヌ
クレオチド総てを次に、反応混合物に加えた。次にＤＮ
Ａをフェノール／CHCl3 ／エーテルで抽出し、濃縮し、
そしてEcoRI で消化した。1.２kb EcoRI−Hind III（ブ
ラントされた）フラグメント（ＭＦα１遺伝子のプロモ
ーター及び分泌シグナル配列を含む）を次に0.９％アガ
ロースゲルで電気泳動して単離した。同モル量の５’v-
sis 、３’v-sis 、及びＭＦα１フラグメントプラスEc
oRI ＋XbaI消化ｐＵＣ１２（ビエイラとメッシング、前
出、及びメッシング、前出）を次に互に結合した。得ら
れたプラスミドをｐＶＳｄと名付けた。
めに酵母交配フェロモンアルファ因子（ＭＦα１）遺伝
子（クリャン（Kurjan) とヘルスコウィッツ（Herskowi
tz)、セル（Cell) 、３０：９３３−９４３、１９８
２）の一部に結合された。プラスミドｐＳＳＶ−１１は
BamHIとＰｖｕ II で消化され、消化生成物は1.１％ア
ガロースゲルを通して電気泳動され、抽出され、そして
エタノール沈殿された。このＤＮＡを再懸濁し、Ｈｐｈ
Ｉで消化し、そして３９６bp ＨｐｈＩ−ＰｖｕII フ
ラグメントを1.２５％アガロースゲル上で精製した。Ｈ
ｐｈＩ開裂部位をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラ
グメント）を用いてブラントした。ＤＮＡを次にＢｇｌ
II で消化し、２９６bp ＨｐｈＩ−Ｂｇｌ II フラグ
メント（５’v-sis フラグメント）をゲル精製した。
３’v-sis 配列を、７５６bp ＢｇｌII −XbaIフラグ
メントとしてプラスミドｐＶＳＩＳ／Pst から単離し
た。ｐＵＣ１３のEcoRI 部位に挿入されたＭＦα１遺伝
子を含む１７００bp EcoRI フラグメントを含むプラス
ミドｐ１９２をHind IIIで消化した。ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノウフラグメント）と４つのデオキシリボヌ
クレオチド総てを次に、反応混合物に加えた。次にＤＮ
Ａをフェノール／CHCl3 ／エーテルで抽出し、濃縮し、
そしてEcoRI で消化した。1.２kb EcoRI−Hind III（ブ
ラントされた）フラグメント（ＭＦα１遺伝子のプロモ
ーター及び分泌シグナル配列を含む）を次に0.９％アガ
ロースゲルで電気泳動して単離した。同モル量の５’v-
sis 、３’v-sis 、及びＭＦα１フラグメントプラスEc
oRI ＋XbaI消化ｐＵＣ１２（ビエイラとメッシング、前
出、及びメッシング、前出）を次に互に結合した。得ら
れたプラスミドをｐＶＳｄと名付けた。
【００４７】第二のＭＦα１／v-sis ハイブリッド遺伝
子を構築した。その中でv-sis 配列の最初の６６個のコ
ドンは、v-sis のコドン６７がプロアルファ因子のＬｙ
ｓ−Ａｒｇプロセシングシグナルのためのコドンに直接
続くように除去された。v-sis のコドン１〜６６を正確
に除くために、オリゴヌクレオチド支配突然変異は、ゾ
ラー（Zoller) とスミス(Smith）（マニュアル・フォー
・アドバンスド・テクニクズ・イン・モレキュラー・ク
ローニング・コース（Manual for Advanced Techniques
in Molecular Cloning Course) 、コールド スプリン
グ ハーバーラボラトリー、１９８３）の二プライマー
法にほとんど従って行われた。ｐＶＳαをXbaIで消化
し、2.２kb ＭＦα１−v-sis フラグメントを精製し、
それをXbaI消化されたＭ１３ｍｐ１１（複製形）に結合
し、そして形質転換されたE. coii ＪＭ１０１から正鎖
ＤＮＡを単離することにより鋳型が作られた。このクロ
ーンはｍｌｌＶＳαと名付けられた。
子を構築した。その中でv-sis 配列の最初の６６個のコ
ドンは、v-sis のコドン６７がプロアルファ因子のＬｙ
ｓ−Ａｒｇプロセシングシグナルのためのコドンに直接
続くように除去された。v-sis のコドン１〜６６を正確
に除くために、オリゴヌクレオチド支配突然変異は、ゾ
ラー（Zoller) とスミス(Smith）（マニュアル・フォー
・アドバンスド・テクニクズ・イン・モレキュラー・ク
ローニング・コース（Manual for Advanced Techniques
in Molecular Cloning Course) 、コールド スプリン
グ ハーバーラボラトリー、１９８３）の二プライマー
法にほとんど従って行われた。ｐＶＳαをXbaIで消化
し、2.２kb ＭＦα１−v-sis フラグメントを精製し、
それをXbaI消化されたＭ１３ｍｐ１１（複製形）に結合
し、そして形質転換されたE. coii ＪＭ１０１から正鎖
ＤＮＡを単離することにより鋳型が作られた。このクロ
ーンはｍｌｌＶＳαと名付けられた。
【００４８】ｍｌｌＶＳαの0.５ｐモルを、ゾラーとス
ミス（前出）の条件を用いてキナーゼ処理されたオリゴ
ヌクレオチドＺＣ１３０（3'ＡＧＡ ＡＡＣ ＣＴＡ
ＴＴＴ ＴＣＣ ＴＣＧ ＧＡＣ ＣＣＡ5'）の１ｐモ
ルとユニバーサル配列化プライマー（ＢＲＬ）の1.５ｐ
モルでアニールした。但し、アニーリング混合物は初め
に６５℃に１０分間加熱され、３７℃に変えて１０分間
加熱され、そして次に氷上で急速冷却された。次にアニ
ールされた混合物を、環状二重ＤＮＡを作るためにゾラ
ーとスミス（前出）記述のようにクレノウポリメラーゼ
で処理した。伸長混合物の一部を、E. coli Ｋ１２
ＪＭ１０１を形質転換するために用いた。得られたファ
ージプラークを、ニトロセルロースフィルターに移し次
に６５℃で32Ｐホスホリル化ＺＣ１３０とハイブリダイ
ゼーションすることにより適当な欠損についてスクリー
ンした。正しく近接された配列は、用いた緊縮ハイブリ
ダイゼーション温度において放射性プローブを用いて安
定な二重ラセンを形成する。スクリーンされた形質転換
体の約１％がオートラジオグラフィにより正のシグナル
を与えた。１０のクローンがプラーク精製され、複製形
ＤＮＡが制限酵素分析のために作られた。５つの単離物
が、予期された１４５０bp Hind III−Ｂｇｌ II フラ
グメントを示した。２つの単離物のＤＮＡ配列分析は、
正しい融合結合が行われたこと、すなわち適当な翻訳読
出しフレームの維持を確認した。これらファージの一つ
はｍｌｌＶＳ２αと名付けられた。
ミス（前出）の条件を用いてキナーゼ処理されたオリゴ
ヌクレオチドＺＣ１３０（3'ＡＧＡ ＡＡＣ ＣＴＡ
ＴＴＴ ＴＣＣ ＴＣＧ ＧＡＣ ＣＣＡ5'）の１ｐモ
ルとユニバーサル配列化プライマー（ＢＲＬ）の1.５ｐ
モルでアニールした。但し、アニーリング混合物は初め
に６５℃に１０分間加熱され、３７℃に変えて１０分間
加熱され、そして次に氷上で急速冷却された。次にアニ
ールされた混合物を、環状二重ＤＮＡを作るためにゾラ
ーとスミス（前出）記述のようにクレノウポリメラーゼ
で処理した。伸長混合物の一部を、E. coli Ｋ１２
ＪＭ１０１を形質転換するために用いた。得られたファ
ージプラークを、ニトロセルロースフィルターに移し次
に６５℃で32Ｐホスホリル化ＺＣ１３０とハイブリダイ
ゼーションすることにより適当な欠損についてスクリー
ンした。正しく近接された配列は、用いた緊縮ハイブリ
ダイゼーション温度において放射性プローブを用いて安
定な二重ラセンを形成する。スクリーンされた形質転換
体の約１％がオートラジオグラフィにより正のシグナル
を与えた。１０のクローンがプラーク精製され、複製形
ＤＮＡが制限酵素分析のために作られた。５つの単離物
が、予期された１４５０bp Hind III−Ｂｇｌ II フラ
グメントを示した。２つの単離物のＤＮＡ配列分析は、
正しい融合結合が行われたこと、すなわち適当な翻訳読
出しフレームの維持を確認した。これらファージの一つ
はｍｌｌＶＳ２αと名付けられた。
【００４９】酵母における発現のために、ＶＳα及びＶ
Ｓ２α発現単位（ＭＦα１及びv-sis 配列を含む）が次
に下記の方法で酵母ＴＰＩ１ターミネーターの近くに置
かれた。ＴＰＩ１ターミネーターフラグメントが、プラ
スミドｐＦＧ１（アルバートとカワサキ、前出）から得
られた。それは、ＴＰＩ１遺伝子のペヌルチメート（pe
nultimate)アミノ酸コドンから約７００塩基対下流のEc
oRI 部位までの領域を囲いこむ。初めにプラスミドをEc
oRI で切断し、次に末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレ
ノウフラグメント）でブラントし、合成 BamHIリンカー
（ＣＧＧＡＴＣＣＡ）を付加し、そしてプラスミドｐ１
３６を作るために再結合することにより、 BamHI部位が
ｐＦＧｌのこの唯一のEcoRI 部位に代って置換された。
次にＴＰＩ１ターミネーターがXbaI− BamHIフラグメン
トとしてｐ１３６から切除された。このフラグメント
を、XbaIと BamHIで線状化したＹＥｐ１３中に結合し
た。得たプラスミドはｐ２１３として知られる。次にプ
ラスミドをHind IIIで消化し、得られた末端をＤＮＡポ
リメラーゼＩ（クレノウフラグメント）でブラントし、
そしてＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて線状分子を再環化す
ることにより、Hind III部位をｐ２１３のＴＰＩ１ター
ミネーター領域から除去した。得られたプラスミドはｐ
２７０である。
Ｓ２α発現単位（ＭＦα１及びv-sis 配列を含む）が次
に下記の方法で酵母ＴＰＩ１ターミネーターの近くに置
かれた。ＴＰＩ１ターミネーターフラグメントが、プラ
スミドｐＦＧ１（アルバートとカワサキ、前出）から得
られた。それは、ＴＰＩ１遺伝子のペヌルチメート（pe
nultimate)アミノ酸コドンから約７００塩基対下流のEc
oRI 部位までの領域を囲いこむ。初めにプラスミドをEc
oRI で切断し、次に末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレ
ノウフラグメント）でブラントし、合成 BamHIリンカー
（ＣＧＧＡＴＣＣＡ）を付加し、そしてプラスミドｐ１
３６を作るために再結合することにより、 BamHI部位が
ｐＦＧｌのこの唯一のEcoRI 部位に代って置換された。
次にＴＰＩ１ターミネーターがXbaI− BamHIフラグメン
トとしてｐ１３６から切除された。このフラグメント
を、XbaIと BamHIで線状化したＹＥｐ１３中に結合し
た。得たプラスミドはｐ２１３として知られる。次にプ
ラスミドをHind IIIで消化し、得られた末端をＤＮＡポ
リメラーゼＩ（クレノウフラグメント）でブラントし、
そしてＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて線状分子を再環化す
ることにより、Hind III部位をｐ２１３のＴＰＩ１ター
ミネーター領域から除去した。得られたプラスミドはｐ
２７０である。
【００５０】プラスミドｐ２７０をXbaIで消化し、粘着
ベクター末端の再結合を防ぐためにウシアルカリ性ホス
ファターゼで消化した。ｐＶＳα及び１１ＶＳ２α（複
製形）のXbaI消化及びアガロースゲル精製により、各々
v-sis 発現単位ＶＳα及びＶＳ２αを作った。単離され
たフラグメントの各々を、４０単位Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
及びE.coliＲＲＩ中に形質転換された結合（リゲーショ
ン）混合物の存在下で、ほぼ等モル量のホスファターゼ
処理されたｐ２７０で結合した。アンピシリン耐性コロ
ニーからプラスミドＤＮＡが作られ、３’v-sis 配列近
傍にＴＰＩ１ターミネーターを持つクローンを同定する
ために制限酵素分析が行われた。ゲル電気泳動後の3.３
kb又は3.１kb Bgl II フラグメントの存在は、各々ＹＥ
ｐＶＳα及びＹＥｐＶＳ２αの正しい定位を示した。Ｖ
Ｓα及びＶＳ２α配列は次に、安定なベクターｐＣＰＯ
Ｔ及びｐＭＰＯＴ２中に挿入され、酵母ＴＰＩ１プロモ
ーターがＭＦα１プロモーターに代って置換された。Ｔ
ＰＩ１プロモーターはプラスミドｐＭ２２０から得られ
た。ｐＭ２２０で形質転換されたE.coliＲＲＩは、ＡＴ
ＣＣ No.３９８５３として寄託されている。
ベクター末端の再結合を防ぐためにウシアルカリ性ホス
ファターゼで消化した。ｐＶＳα及び１１ＶＳ２α（複
製形）のXbaI消化及びアガロースゲル精製により、各々
v-sis 発現単位ＶＳα及びＶＳ２αを作った。単離され
たフラグメントの各々を、４０単位Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
及びE.coliＲＲＩ中に形質転換された結合（リゲーショ
ン）混合物の存在下で、ほぼ等モル量のホスファターゼ
処理されたｐ２７０で結合した。アンピシリン耐性コロ
ニーからプラスミドＤＮＡが作られ、３’v-sis 配列近
傍にＴＰＩ１ターミネーターを持つクローンを同定する
ために制限酵素分析が行われた。ゲル電気泳動後の3.３
kb又は3.１kb Bgl II フラグメントの存在は、各々ＹＥ
ｐＶＳα及びＹＥｐＶＳ２αの正しい定位を示した。Ｖ
Ｓα及びＶＳ２α配列は次に、安定なベクターｐＣＰＯ
Ｔ及びｐＭＰＯＴ２中に挿入され、酵母ＴＰＩ１プロモ
ーターがＭＦα１プロモーターに代って置換された。Ｔ
ＰＩ１プロモーターはプラスミドｐＭ２２０から得られ
た。ｐＭ２２０で形質転換されたE.coliＲＲＩは、ＡＴ
ＣＣ No.３９８５３として寄託されている。
【００５１】プラスミドｐＭ２２０がＢｇｌ II 及び B
amHIで消化され、0.９％アガロースゲルで電気泳動さ
れ、2.２kb ＴＰＩ１プロモーター、ＭＦα１遺伝子フ
ラグメントが抽出された。精製されたフラグメントはPs
tIで消化され、得た１kbＢｇｌII −PstIフラグメント
は上述のようにアガロースゲル精製された。プラスミド
ＹＥｐＶＳ２αがPstI及び BamHIで消化され、1.８kb
ＭＦα１／v-sis ／ＴＰＩ１ターミネーター融合フラグ
メントがゲル単離された。プラスミドｐＣＰＯＴが Bam
HIで消化され、ウシアルカリ性ホスファターゼで処理さ
れ、フェノール／CHCl3抽出され、次にアガロース上の
電気泳動により精製され、ゲルから抽出され、EtOH沈澱
された。三つの単離したフラグメントの約等モル量を１
２℃で一夜結合し、結合混合物はE.coliＫ−１２株ＤＨ
１（ハナハン（Hanahan)、Ｄ．とメセレソン（Meseleso
n)、M., J. Mol. Biol. １６６：５７７、１９８３）を
アンピシリン耐性に形質転換するために用いられた。形
質転換体からプラスミドＤＮＡが作られ、望む〜１５０
０bp BamHI−ＳａｌＩフラグメント及び８００bpＳｐｈ
Ｉフラグメントの存在を検証するために制限消化分析が
用いられた。このプラスミドはｐ１１７−２と名付けら
れた。
amHIで消化され、0.９％アガロースゲルで電気泳動さ
れ、2.２kb ＴＰＩ１プロモーター、ＭＦα１遺伝子フ
ラグメントが抽出された。精製されたフラグメントはPs
tIで消化され、得た１kbＢｇｌII −PstIフラグメント
は上述のようにアガロースゲル精製された。プラスミド
ＹＥｐＶＳ２αがPstI及び BamHIで消化され、1.８kb
ＭＦα１／v-sis ／ＴＰＩ１ターミネーター融合フラグ
メントがゲル単離された。プラスミドｐＣＰＯＴが Bam
HIで消化され、ウシアルカリ性ホスファターゼで処理さ
れ、フェノール／CHCl3抽出され、次にアガロース上の
電気泳動により精製され、ゲルから抽出され、EtOH沈澱
された。三つの単離したフラグメントの約等モル量を１
２℃で一夜結合し、結合混合物はE.coliＫ−１２株ＤＨ
１（ハナハン（Hanahan)、Ｄ．とメセレソン（Meseleso
n)、M., J. Mol. Biol. １６６：５７７、１９８３）を
アンピシリン耐性に形質転換するために用いられた。形
質転換体からプラスミドＤＮＡが作られ、望む〜１５０
０bp BamHI−ＳａｌＩフラグメント及び８００bpＳｐｈ
Ｉフラグメントの存在を検証するために制限消化分析が
用いられた。このプラスミドはｐ１１７−２と名付けら
れた。
【００５２】プラスミドＹＥｐＶＳ２αがPstIと BamHI
で消化され、部分的ＭＦα１、v-sis 及びＴＰＩ１ター
ミネーター配列を含む1.８kbフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＩＣ１９Ｒ
はPstI及び BamHIで消化され、ベクターフラグメントが
ゲル精製され、プラスミドｐＶＳ２αＴを作るためにＹ
ＥｐＶＳ２αからの1.８kbフラグメントに結合された。
プラスミドｐＭ２２０がＢｇｌ II 及びPstIで消化さ
れ、ＴＰＩ１プロモーター及びＭＦα１配列の５’部分
を含む約１kbフラグメントが単離され、Ｂｇｌ II ＋Ps
tI消化されたｐＩＣ１９Ｒでクローニングされた。得ら
れたプラスミドはClaI 及びPstIで消化され、ＴＰＩ１
プロモーター−ＭＦα１フラグメントがゲル精製され
た。次にプラスミドｐＶＳ２αＴが Cla I及びPstIで切
断され、ＴＰＩ１プロモーター−ＭＦα１フラグメント
に結合された。2.６kb ClaI − BamHIフラグメントの存
在により正しい構成が同定され、ｐＴＶＳ２αＴと名付
けられた。
で消化され、部分的ＭＦα１、v-sis 及びＴＰＩ１ター
ミネーター配列を含む1.８kbフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＩＣ１９Ｒ
はPstI及び BamHIで消化され、ベクターフラグメントが
ゲル精製され、プラスミドｐＶＳ２αＴを作るためにＹ
ＥｐＶＳ２αからの1.８kbフラグメントに結合された。
プラスミドｐＭ２２０がＢｇｌ II 及びPstIで消化さ
れ、ＴＰＩ１プロモーター及びＭＦα１配列の５’部分
を含む約１kbフラグメントが単離され、Ｂｇｌ II ＋Ps
tI消化されたｐＩＣ１９Ｒでクローニングされた。得ら
れたプラスミドはClaI 及びPstIで消化され、ＴＰＩ１
プロモーター−ＭＦα１フラグメントがゲル精製され
た。次にプラスミドｐＶＳ２αＴが Cla I及びPstIで切
断され、ＴＰＩ１プロモーター−ＭＦα１フラグメント
に結合された。2.６kb ClaI − BamHIフラグメントの存
在により正しい構成が同定され、ｐＴＶＳ２αＴと名付
けられた。
【００５３】プラスミドｐＶＳαの約１０μｇを２０μ
ｌの体積でＢstＥ II で完全に消化した。PstIの５単位
を加え、混合物を３０分間インキュベートし、ＥＤＴＡ
の添加により反応を停止させた。停止させた反応混合物
を直ちに１％アガロースゲルで電気泳動し、約８００bp
の部分PstI−ＢstＥ II 帯（ＭＦα１プレプロ配列及び
v-sis の５’部分からほとんど成る）をカットし、ゲル
から抽出し、EtOH沈澱した。プラスミドｐＴＶＳ２αＴ
をPstI及びＢstＥ II で完全に消化し、アガロースゲル
電気泳動により精製した。得られた約4.８kbフラグメン
ト及びｐＶＳαからの８００bp PstI−ＢstＥ II フラ
グメントをＴ4 ＤＮＡリガーゼの存在下で室温で６時間
結合し、結合混合物をE.coli ＨＢ１０１をアンピシリ
ン耐性に形質転換するために用いた。約１４５０bp Ｂ
ｇｌ II フラグメントを含むプラスミドが同定された。
このことは挿入物の存在を示している。これはｐＴＶＳ
αと名付けられた。プラスミドｐＴＶＳαを ClaI 及び
BamHIで完全に消化し、ＶＳα配列を含む約2.９kbフラ
グメントをアガロースゲルでの電気泳動により単離し、
ゲルから抽出し、EtOH沈澱した。約2.９kb ClaI − Bam
HI ＶＳαフラグメントを、 ClaIと BamHIでｐＭＰＯ
Ｔ２で結合した。得られたベクターはｐＶＳαｍと名付
けられた。
ｌの体積でＢstＥ II で完全に消化した。PstIの５単位
を加え、混合物を３０分間インキュベートし、ＥＤＴＡ
の添加により反応を停止させた。停止させた反応混合物
を直ちに１％アガロースゲルで電気泳動し、約８００bp
の部分PstI−ＢstＥ II 帯（ＭＦα１プレプロ配列及び
v-sis の５’部分からほとんど成る）をカットし、ゲル
から抽出し、EtOH沈澱した。プラスミドｐＴＶＳ２αＴ
をPstI及びＢstＥ II で完全に消化し、アガロースゲル
電気泳動により精製した。得られた約4.８kbフラグメン
ト及びｐＶＳαからの８００bp PstI−ＢstＥ II フラ
グメントをＴ4 ＤＮＡリガーゼの存在下で室温で６時間
結合し、結合混合物をE.coli ＨＢ１０１をアンピシリ
ン耐性に形質転換するために用いた。約１４５０bp Ｂ
ｇｌ II フラグメントを含むプラスミドが同定された。
このことは挿入物の存在を示している。これはｐＴＶＳ
αと名付けられた。プラスミドｐＴＶＳαを ClaI 及び
BamHIで完全に消化し、ＶＳα配列を含む約2.９kbフラ
グメントをアガロースゲルでの電気泳動により単離し、
ゲルから抽出し、EtOH沈澱した。約2.９kb ClaI − Bam
HI ＶＳαフラグメントを、 ClaIと BamHIでｐＭＰＯ
Ｔ２で結合した。得られたベクターはｐＶＳαｍと名付
けられた。
【００５４】プラスミドｐＴＶＳ２αＴを ClaI 及び B
amHI緩衝液中で完全に消化した。緩衝液をハイソルト
（high salt ：マニアチス、前出) に調節した。このＤ
ＮＡをＰvu II で完全に消化した。これはベクター配列
を二度切断し、ＶＳ２α配列を含む2.７kb ClaI − Bam
HIフラグメントのアガロースゲル上での分離を可能にす
る。このフラグメントは0.９％アガロースで電気泳動さ
れ、抽出され、EtOH沈澱される。フラグメントは次に、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼの存在下で１３℃で２０時間、ClaI
−BamHI 消化されたｐＭＰＯＴ２で結合される。結合さ
れたＤＮＡは、E.coliＨＢ１０１をアンピシリン耐性に
形質転換するために用いられ、得られたコロニーからプ
ラスミドＤＮＡが調製された。2.７kb ClaI − BamHI
ＶＳ２αのフラグメントを含むプラスミドが同定され、
ｐＶＳ２αｍと名付けられた。v-sis 配列を含む発現ベ
クターは、適当な酵母宿主株中に形質転換され、培養物
基はエライサ（ＥＫＩＳＡ）によりＰＤＧＦ様物質の存
在について評価された。ＹＥｐ１３由来プラスミドは
Ｓ．セレビシエＥ８−１１ｃ（ＭＡＴα ｌｅｕ２ｐｅ
ｐ４）中に形質転換された。プラスミドｐ１１７−２、
ｐＶＳαｍ、及びｐＶＳ２αｍは、 tpi - 除去株中に形
質転換された。形質転換体は、２２０rpmの回転シェー
カーで適当な培養基中で３０℃で定常期まで生育され
た。培養物を回収し、細胞を遠心分離により除き、培養
基を実施例６記載のように評価した。結果を表３に示
す。ＰＯＴ１プラスミド上でのv-sis 配列の発現レベル
は、通常の酵母ベクター上でよりも５〜８倍大きい。
amHI緩衝液中で完全に消化した。緩衝液をハイソルト
（high salt ：マニアチス、前出) に調節した。このＤ
ＮＡをＰvu II で完全に消化した。これはベクター配列
を二度切断し、ＶＳ２α配列を含む2.７kb ClaI − Bam
HIフラグメントのアガロースゲル上での分離を可能にす
る。このフラグメントは0.９％アガロースで電気泳動さ
れ、抽出され、EtOH沈澱される。フラグメントは次に、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼの存在下で１３℃で２０時間、ClaI
−BamHI 消化されたｐＭＰＯＴ２で結合される。結合さ
れたＤＮＡは、E.coliＨＢ１０１をアンピシリン耐性に
形質転換するために用いられ、得られたコロニーからプ
ラスミドＤＮＡが調製された。2.７kb ClaI − BamHI
ＶＳ２αのフラグメントを含むプラスミドが同定され、
ｐＶＳ２αｍと名付けられた。v-sis 配列を含む発現ベ
クターは、適当な酵母宿主株中に形質転換され、培養物
基はエライサ（ＥＫＩＳＡ）によりＰＤＧＦ様物質の存
在について評価された。ＹＥｐ１３由来プラスミドは
Ｓ．セレビシエＥ８−１１ｃ（ＭＡＴα ｌｅｕ２ｐｅ
ｐ４）中に形質転換された。プラスミドｐ１１７−２、
ｐＶＳαｍ、及びｐＶＳ２αｍは、 tpi - 除去株中に形
質転換された。形質転換体は、２２０rpmの回転シェー
カーで適当な培養基中で３０℃で定常期まで生育され
た。培養物を回収し、細胞を遠心分離により除き、培養
基を実施例６記載のように評価した。結果を表３に示
す。ＰＯＴ１プラスミド上でのv-sis 配列の発現レベル
は、通常の酵母ベクター上でよりも５〜８倍大きい。
【００５５】
【表１】 表１ ＣＤＣ４プラスミドの安定性 単離物番号 全コロニー a ＣＤＣ４ +b Ｔrp +c Ｌeu +d 1（BELL 1) 123 123 123 123 2 80 80 80 80 3 83 80 80 83 4 96 96 96 96 5 88 88 88 88 6 115 115 115 115
【００５６】ａ：細胞を２５℃で複合培養基（ＹＥＰ
Ｄ）にプレートし、３０世代生育させた。 ｂ：細胞を３７°でＹＥＰＤにレプリカプレートし３０
世代生育させた。完全なＣＤＣ４遺伝子を欠く細胞はこ
の（制限的）温度で生育できなかった。 ｃ：細胞を、トリプトファンを欠く培養基にレプリカプ
レートし、３０世代後に数えた。 ｄ：細胞を、ロイシンを欠く培養基にレプリカプレート
し、３０世代後に数えた。
Ｄ）にプレートし、３０世代生育させた。 ｂ：細胞を３７°でＹＥＰＤにレプリカプレートし３０
世代生育させた。完全なＣＤＣ４遺伝子を欠く細胞はこ
の（制限的）温度で生育できなかった。 ｃ：細胞を、トリプトファンを欠く培養基にレプリカプ
レートし、３０世代後に数えた。 ｄ：細胞を、ロイシンを欠く培養基にレプリカプレート
し、３０世代後に数えた。
【００５７】
【表２】 表２ ＰＯＴ１プラスミド対ｐＴＰＩＣ１０の安定性実験 プラスミド／株 全コロニーa TPIb ％損失c 1 pTPIC10／Δtpi ＃２９ 234 163 30.0 pFPOT／Δtpi ＃２９ 308 308 0 3 pFATPOT／Δtpi ＃２９ 471 471 0 4 pFATPOT／E18(ZYM-3) 1104 1104 0 5 pFATPOT／E18(ZYM-3) 634 632 0.32 6 pFATPOT／Δtpi ＃２９ 426 426 0 2-6 一緒にしたデータ 2943 2941 0.07
【００５８】ａ：プラスミド／株組合せ物は、約１０4
〜１０5 の細胞の容易に見えるコロニーが見られるよう
になるまで、ＹＥＰＤプレート上で生育された。これら
コロニーは６mlのＹＥＰＤ液体培養基を接種するために
用いられた。培養物は１〜３×１０8 細胞／mlの細胞密
度まで好気的に一夜生育され、ＹＥＰ−２％グリセロー
ル−１％ラクテート又はＹＥＰ−２％ガラクトース上に
プレートされた。これら培養基の各々は tpi- 株を生育
させるが、得られる tpi- コロニーは tpi- コロニーよ
りもゆっくり生育した。各コロニー（ tpi- でも tpi+
でも）を数えることができるように、僅か１００〜３０
０の細胞を各プレートに分配した。 ｂ：コロニーは、２％最終濃度でデキストロースを含む
合成培養基上にレプリカプレートされた。プラスミド上
のトリオースホスファートイソメラーゼ遺伝子を失った
細胞は生育できなかった。 ｃ：％損失は、ＹＥＰＤで約３０回分裂後にプラスミド
を失った細胞の確率を示す。実験２〜６を一緒にしたデ
ータは、ＰＯＴ１プラスミドがこれら多数の分裂におい
て極めて安定であり、３０回の細胞増殖において１％よ
りはるかに小さい平均確率で失われることを示してい
る。
〜１０5 の細胞の容易に見えるコロニーが見られるよう
になるまで、ＹＥＰＤプレート上で生育された。これら
コロニーは６mlのＹＥＰＤ液体培養基を接種するために
用いられた。培養物は１〜３×１０8 細胞／mlの細胞密
度まで好気的に一夜生育され、ＹＥＰ−２％グリセロー
ル−１％ラクテート又はＹＥＰ−２％ガラクトース上に
プレートされた。これら培養基の各々は tpi- 株を生育
させるが、得られる tpi- コロニーは tpi- コロニーよ
りもゆっくり生育した。各コロニー（ tpi- でも tpi+
でも）を数えることができるように、僅か１００〜３０
０の細胞を各プレートに分配した。 ｂ：コロニーは、２％最終濃度でデキストロースを含む
合成培養基上にレプリカプレートされた。プラスミド上
のトリオースホスファートイソメラーゼ遺伝子を失った
細胞は生育できなかった。 ｃ：％損失は、ＹＥＰＤで約３０回分裂後にプラスミド
を失った細胞の確率を示す。実験２〜６を一緒にしたデ
ータは、ＰＯＴ１プラスミドがこれら多数の分裂におい
て極めて安定であり、３０回の細胞増殖において１％よ
りはるかに小さい平均確率で失われることを示してい
る。
【００５９】
【表３】 表３ ＰＯＴ１及びＹＥｐ１３由来ベクターを用いるv-sis の発現 プラスミド／株 ＰＤＧＦ（ｎｇ／ml） ＹＥｐＶＳα／Ｅ８−１１ｃ 0.５−1.５ ｐＶＳαｍ／Ｅ１８ ４−１０ ＹＥｐＶＳ２α／Ｅ８−１１ｃ 0.８−2.０ ｐ１１７−２／Ｅ１１−３ｃ ５−１０ ｐＶＳ２αｍ／Ｅ１８ ６−１４
【００６０】実施例３ プラスミドCl/lの調製 Cl/lがプラスミドｐＪＤＢ２４８（ベッグス、Ｊ．，ネ
イチア、２７５、１０４−１０９（１９７８））から構
築された。ｐＭＢ９配列がＥcoＲＩでの部分的消化によ
りｐＪＤＢ２４８から除去され、ＥcoＲＩで切断された
ｐＢＲ３２２ＤＮＡにより置換された。Cl/lの制限地図
を図９に示す。Cl/lプラスミドは、ＥcoＲＩ部位にｐＢ
Ｒ３２２挿入を持つ、酵母（Ｓ．セレビシエ）からの全
２μＤＮＡを含む。それはまたＬＥＵ２遺伝子を含む。
イチア、２７５、１０４−１０９（１９７８））から構
築された。ｐＭＢ９配列がＥcoＲＩでの部分的消化によ
りｐＪＤＢ２４８から除去され、ＥcoＲＩで切断された
ｐＢＲ３２２ＤＮＡにより置換された。Cl/lの制限地図
を図９に示す。Cl/lプラスミドは、ＥcoＲＩ部位にｐＢ
Ｒ３２２挿入を持つ、酵母（Ｓ．セレビシエ）からの全
２μＤＮＡを含む。それはまたＬＥＵ２遺伝子を含む。
【００６１】実施例４ プラスミドｐＦＡＴ５の調製 ヒトα−ａ−抗トリプシン（ＡＴ）の主たる形をコード
する遺伝子が、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ
としてヒヒ配列を用いる慣用の方法（クラチら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA，７８：６８２６−６８３０、１
９８０、及びチャンドラ（Chandra)ら、Biochem. Bioph
ys. Res. Comm. １０３：７５１−７５８、１９８１）
によりヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリイから単離された。
ライブラリイは、プラスミドｐＢＲ３２２（ボリバー
（Bolivar)ら、ジーン（Gene) 、２、９５−１１３、１
９７７）のPstI部位へヒト肝臓ｃＤＮＡを挿入すること
により構築された。ＡＴ遺伝子が、ライブラリイから１
５００塩基対（bp）PstIフラグメントとして単離され
た。このフラグメントは、プラスミドｐＵＣα１を作る
ためにｐＵＣβのPstI部位に挿入された。ｐＵＣα１に
おいてＡＴ配列がポリリンカーにおけるXbaI及びＥcoＲ
Ｉ部位により３’末端上にフランクされる。ＴＰＩター
ミネーターが約７００bpのXbaI−ＥcoＲＩフラグメント
としてプラスミドｐＦＧ１（アルバーとカワサキ、前
出）から精製され、XbaIとＥcoＲＩで開裂されたｐＵＣ
α１に挿入された。この構成物を次にＥcoＲＩで切断
し、ＴＰＩターミネーターの３’末端に BamHI部位を与
えるたそめに多重リンクされたコピーでオリゴヌクレオ
チドリンカー（配列：AATTCATGGAG GTACCTCCTAG ) が付
加された。得られるプラスミドはＢＡＴ５として知られ
る。
する遺伝子が、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ
としてヒヒ配列を用いる慣用の方法（クラチら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA，７８：６８２６−６８３０、１
９８０、及びチャンドラ（Chandra)ら、Biochem. Bioph
ys. Res. Comm. １０３：７５１−７５８、１９８１）
によりヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリイから単離された。
ライブラリイは、プラスミドｐＢＲ３２２（ボリバー
（Bolivar)ら、ジーン（Gene) 、２、９５−１１３、１
９７７）のPstI部位へヒト肝臓ｃＤＮＡを挿入すること
により構築された。ＡＴ遺伝子が、ライブラリイから１
５００塩基対（bp）PstIフラグメントとして単離され
た。このフラグメントは、プラスミドｐＵＣα１を作る
ためにｐＵＣβのPstI部位に挿入された。ｐＵＣα１に
おいてＡＴ配列がポリリンカーにおけるXbaI及びＥcoＲ
Ｉ部位により３’末端上にフランクされる。ＴＰＩター
ミネーターが約７００bpのXbaI−ＥcoＲＩフラグメント
としてプラスミドｐＦＧ１（アルバーとカワサキ、前
出）から精製され、XbaIとＥcoＲＩで開裂されたｐＵＣ
α１に挿入された。この構成物を次にＥcoＲＩで切断
し、ＴＰＩターミネーターの３’末端に BamHI部位を与
えるたそめに多重リンクされたコピーでオリゴヌクレオ
チドリンカー（配列：AATTCATGGAG GTACCTCCTAG ) が付
加された。得られるプラスミドはＢＡＴ５として知られ
る。
【００６２】ＴＰＩプロモーターフラグメントは、プラ
スミドｐＴＰＩＣ１０（アルバートとカワサキ、前出）
から得られた。このプラスミドは唯一のＫpnＩ部位で切
断され、ＴＰＩコード領域が Bal３１エキソヌクレアー
ゼで除去され、ＥcoＲＩリンカー（配列：ＧＧＡＡＴＴ
ＣＣ）がプロモーターの３’末端に付加された。Ｂｇｌ
II 及びＥcoＲＩでの消化は、Ｂａｌ II 及びＥcoＲＩ
粘着末端を持つＴＰＩプロモーターフラグメントを与え
た。このフラグメントは次に、Ｂｇｌ II 及びＥcoＲＩ
で切断されたプラスミドＹＲｐ７（スティンクコムら、
ネイチア、２８２：３９−４３、１９７９）に結合され
た。得られたプラスミドＴＥ３２は、テトラサイクリン
耐性遺伝子の部分を除去するためにＥcoＲＩ及び BamHI
で開裂された。線状化されたプラスミドは次に、プラス
ミドＴＥＡ３２を作るために、上述のＥcoＲＩ− BamHI
リンカーの付加により再環化された。次にＴＥＡ３２は
ＢＧｌII及び BamHIで開裂され、ＴＰＩプロモーターが
約９００bpのフラグメントとして精製された。プラスミ
ドｐＥＡＴ５を構築するために、プラスミドCl/lが Bam
HIで線状化され、ＴＥＡ３２からの９００bpＴＰＩプロ
モーターフラグメントに結合された。プラスミドＦとし
て知られる得た構成物は、ＴＰＩプロモーターの３’末
端に位置される唯一の BamHI部位を持つ。このプラスミ
ド BamHIで切断し、ＡＴコーディング配列及びＴＰＩタ
ーミネーターを含む２２００bp BamHIフラグメントをＢ
ＡＴ５から精製し、 BamHI部位に挿入した。ｐＦＡＴ５
として知られる得られたプラスミドを図１０に示す。
スミドｐＴＰＩＣ１０（アルバートとカワサキ、前出）
から得られた。このプラスミドは唯一のＫpnＩ部位で切
断され、ＴＰＩコード領域が Bal３１エキソヌクレアー
ゼで除去され、ＥcoＲＩリンカー（配列：ＧＧＡＡＴＴ
ＣＣ）がプロモーターの３’末端に付加された。Ｂｇｌ
II 及びＥcoＲＩでの消化は、Ｂａｌ II 及びＥcoＲＩ
粘着末端を持つＴＰＩプロモーターフラグメントを与え
た。このフラグメントは次に、Ｂｇｌ II 及びＥcoＲＩ
で切断されたプラスミドＹＲｐ７（スティンクコムら、
ネイチア、２８２：３９−４３、１９７９）に結合され
た。得られたプラスミドＴＥ３２は、テトラサイクリン
耐性遺伝子の部分を除去するためにＥcoＲＩ及び BamHI
で開裂された。線状化されたプラスミドは次に、プラス
ミドＴＥＡ３２を作るために、上述のＥcoＲＩ− BamHI
リンカーの付加により再環化された。次にＴＥＡ３２は
ＢＧｌII及び BamHIで開裂され、ＴＰＩプロモーターが
約９００bpのフラグメントとして精製された。プラスミ
ドｐＥＡＴ５を構築するために、プラスミドCl/lが Bam
HIで線状化され、ＴＥＡ３２からの９００bpＴＰＩプロ
モーターフラグメントに結合された。プラスミドＦとし
て知られる得た構成物は、ＴＰＩプロモーターの３’末
端に位置される唯一の BamHI部位を持つ。このプラスミ
ド BamHIで切断し、ＡＴコーディング配列及びＴＰＩタ
ーミネーターを含む２２００bp BamHIフラグメントをＢ
ＡＴ５から精製し、 BamHI部位に挿入した。ｐＦＡＴ５
として知られる得られたプラスミドを図１０に示す。
【００６３】実施例５ α−１−抗トリプトシンについての評価 対照として、１００μｇ／mlのトリプシンの溶液の１０
μｌ（１μｇ）、１００μｇ（１００μｌ）の子牛血清
アルブミン及び１００μｌの0.０５ＭのＴＰＩＳ、１mM
ベンゾイルアルギニノイル−ｐ−ニトロアニリドを含む
pH ８緩衝液を混合し、４０５nmでの吸収の増加を分光
光度計で経時計測した。この溶液の吸光度は、１００％
トリプシン活動度に対する標準として用いられた。総て
の評価されたサンプルは、同濃度の基本及び子牛血清ア
ルブミンを含む。
μｌ（１μｇ）、１００μｇ（１００μｌ）の子牛血清
アルブミン及び１００μｌの0.０５ＭのＴＰＩＳ、１mM
ベンゾイルアルギニノイル−ｐ−ニトロアニリドを含む
pH ８緩衝液を混合し、４０５nmでの吸収の増加を分光
光度計で経時計測した。この溶液の吸光度は、１００％
トリプシン活動度に対する標準として用いられた。総て
の評価されたサンプルは、同濃度の基本及び子牛血清ア
ルブミンを含む。
【００６４】実施例６ エライサ（ＥＬＩＳＡ）によるＰＤＧＦ様物質の検出 酵母形質転換体によるＰＤＧＦ様物質の発現は、ＥＬＩ
ＳＡ検査され、精製ヒトＰＤＧＦ（レイネス（Raines）
とローズ（Ross）、 J. Biol．Chem. ２５７：５１５
４、１９８２）で作られた標準カーブとの比較により定
量された。典型的標準カーブは次のようにして作られ
た。ＰＢＳ中の2.５ng／mlの精製ヒトＰＤＧＦをイミュ
ロンII（Immulon II：商標）（ダイナテック・ラボラト
リーズ社（Dynatecn Laboratories, Inc.)で９６個のく
ぼみの微量滴定プレート（１００μｌ／くぼみ）で４℃
で一夜インキュベートした。この塗布液を除去し、ＰＢ
Ｓ中の0.１％ラビットアルブミンの１００μｌ／くぼみ
を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートし
た。精製ＰＤＧＦの複数のサンプル（0.１〜４０ng／m
l）を別々に、0.０５％Tween ２０（商標）及び１mg／m
lラビットアルブミン（ＲＳＡ）を含むＰＢＳ中でヤギ
抗ＰＤＧＦ ＩｇＧ（５μｇ／ml）と共にインキュベー
トした。微小滴定プレートを0.９％NaCl、0.５％Tween
２０（商標）で５回洗い、液を切り、各テスト溶液の１
００μｌを微小滴定くぼみに加え、３７℃で２時間イン
キュベートした。プレートを先と同様に洗い、0.０５％
Tween ２０及び１μｇ／mlＲＳＡを含むＰＢＳ中の１：
１０００希釈されたパーオキシダーゼ接合ブタ抗ヤギＩ
ｇＧ（タゴ（Tago）社）を加え３７℃で２時間おいた。
プレートを先のように洗い、0.０１２％過酸化水素を含
む新規に調製した0.０４％ｏ−フェニレンジアミン（１
００μｇ／くぼみ）を加え室温で５０分間おき、５０分
時点で４Ｎ H2SO4の添加（５０μｌ／くぼみ）により反
応を止めた。４９２nmでの吸光度を、ダイナテック（Dy
natech）プレートスキャナーを用いて測定した。各テス
ト点は３度測定された。
ＳＡ検査され、精製ヒトＰＤＧＦ（レイネス（Raines）
とローズ（Ross）、 J. Biol．Chem. ２５７：５１５
４、１９８２）で作られた標準カーブとの比較により定
量された。典型的標準カーブは次のようにして作られ
た。ＰＢＳ中の2.５ng／mlの精製ヒトＰＤＧＦをイミュ
ロンII（Immulon II：商標）（ダイナテック・ラボラト
リーズ社（Dynatecn Laboratories, Inc.)で９６個のく
ぼみの微量滴定プレート（１００μｌ／くぼみ）で４℃
で一夜インキュベートした。この塗布液を除去し、ＰＢ
Ｓ中の0.１％ラビットアルブミンの１００μｌ／くぼみ
を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートし
た。精製ＰＤＧＦの複数のサンプル（0.１〜４０ng／m
l）を別々に、0.０５％Tween ２０（商標）及び１mg／m
lラビットアルブミン（ＲＳＡ）を含むＰＢＳ中でヤギ
抗ＰＤＧＦ ＩｇＧ（５μｇ／ml）と共にインキュベー
トした。微小滴定プレートを0.９％NaCl、0.５％Tween
２０（商標）で５回洗い、液を切り、各テスト溶液の１
００μｌを微小滴定くぼみに加え、３７℃で２時間イン
キュベートした。プレートを先と同様に洗い、0.０５％
Tween ２０及び１μｇ／mlＲＳＡを含むＰＢＳ中の１：
１０００希釈されたパーオキシダーゼ接合ブタ抗ヤギＩ
ｇＧ（タゴ（Tago）社）を加え３７℃で２時間おいた。
プレートを先のように洗い、0.０１２％過酸化水素を含
む新規に調製した0.０４％ｏ−フェニレンジアミン（１
００μｇ／くぼみ）を加え室温で５０分間おき、５０分
時点で４Ｎ H2SO4の添加（５０μｌ／くぼみ）により反
応を止めた。４９２nmでの吸光度を、ダイナテック（Dy
natech）プレートスキャナーを用いて測定した。各テス
ト点は３度測定された。
【００６５】酵母培養基サンプルをＰＢＳで希釈し、上
述したように評価し、ＰＤＧＦ標準カーブと比較した。
表３は実験の代表的シリーズの評価結果のまとめであ
る。
述したように評価し、ＰＤＧＦ標準カーブと比較した。
表３は実験の代表的シリーズの評価結果のまとめであ
る。
【図１】プラスミドｐＢ４、ｐＢ５及びｐＢ１５Ｌの構
築を示す。
築を示す。
【図２】プラスミドｐＢ４、ｐＢ５及びｐＢ１５Ｌの構
築を示す。
築を示す。
【図３】プラスミドｐＢ４、ｐＢ５及びｐＢ１５Ｌの構
築を示す。
築を示す。
【図４】ＤＮＡのサザンプロットを示す。
【図５】配列を示す。
【図６】プラスミドｐＣＰＯＴ、ｐＦＡＰＯＴ、ｐＴＰ
Ｉ−ＬＥＵ２の構築を示す。
Ｉ−ＬＥＵ２の構築を示す。
【図７】プラスミドｐＣＰＯＴ、ｐＦＡＰＯＴ、ｐＴＰ
Ｉ−ＬＥＵ２の構築を示す。
Ｉ−ＬＥＵ２の構築を示す。
【図８】プラスミドｐＣＰＯＴ、ｐＦＡＰＯＴ、ｐＴＰ
Ｉ−ＬＥＵ２の構築を示す。
Ｉ−ＬＥＵ２の構築を示す。
【図９】プラスミドｐＣＰＯＴ、ｐＦＡＰＯＴ、ｐＴＰ
Ｉ−ＬＥＵ２の構築を示す。
Ｉ−ＬＥＵ２の構築を示す。
【図１０】プラスミドｐＣＰＯＴ、ｐＦＡＰＯＴ、ｐＴ
ＰＩ−ＬＥＵ２の構築を示す。
ＰＩ−ＬＥＵ２の構築を示す。
【図１１】プラスミドｐＣＰＯＴ、ｐＦＡＰＯＴ、ｐＴ
ＰＩ−ＬＥＵ２の構築を示す。
ＰＩ−ＬＥＵ２の構築を示す。
【図１２】プラスミドｐＩＣ１９Ｒのポリリンカー配列
の一部を示す。
の一部を示す。
【図１３】プラスミドｐＭＰＯＴ２を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 レスリー ベル アメリカ合衆国 ワシントン州 98102 シアトル イースト ボーイアー アベニ ュー 2518
Claims (6)
- 【請求項１】 形質転換された細胞を選択する方法にお
いて、 (a) 複合培養基での正常な細胞成育に必要な機能に欠
陥を持つ宿主細胞を、上記欠陥を補う遺伝子を含むＤＮ
Ａ構成物の存在下で形質転換条件に付すこと、 (b) 段階(a) からの細胞を栄養素培養基中で生育条件
に付し、もって形質転換した細胞を生育しうるまま保ち
かつ増殖させ、一方、形質転換しなかった細胞は上記欠
陥の故に増殖できないようにする、ことの段階を含む方
法。 - 【請求項２】 遺伝子が宿主細胞分裂、細胞壁生合成、
細胞小器官合成、蛋白質合成、炭素源利用、転写又は複
製のために必要な遺伝子である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 遺伝子が酵母細胞分裂サイクルの遺伝子
及び酵母解糖経路の遺伝子より成る群から選ばれる請求
項２記載の方法。 - 【請求項４】 遺伝子が酵母ＣＤＣ４遺伝子である請求
項３記載の方法。 - 【請求項５】 遺伝子がシゾサッカロミセス・ポンベ
トリオース ホスファート イソメラーゼ遺伝子である
請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ
細胞であり、遺伝子が酵素ピバリン酸キナーゼ、トリオ
ース ホスファート イソメラーゼ、ホスホグルコース
イソメラーゼ、ホスホグリセラート ムターゼ、ホス
ホグリセラート キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
ヘキソキナーゼ、及びグルコキナーゼをコードする遺伝
子及び調節遺伝子ＧＣＲ１より成る群から選ばれたサッ
カロミセス セレビシエ遺伝子である請求項３記載の方
法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61473484A | 1984-05-25 | 1984-05-25 | |
| US614734 | 1984-05-25 | ||
| US73411985A | 1985-05-15 | 1985-05-15 | |
| US734119 | 1985-05-15 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60111975A Division JP2543497B2 (ja) | 1984-05-25 | 1985-05-24 | 蛋白質生成物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767685A true JPH0767685A (ja) | 1995-03-14 |
| JP2704115B2 JP2704115B2 (ja) | 1998-01-26 |
Family
ID=27087316
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60111975A Expired - Lifetime JP2543497B2 (ja) | 1984-05-25 | 1985-05-24 | 蛋白質生成物の製造方法 |
| JP6118650A Expired - Lifetime JP2704115B2 (ja) | 1984-05-25 | 1994-05-31 | 形質転換細胞を選択する方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60111975A Expired - Lifetime JP2543497B2 (ja) | 1984-05-25 | 1985-05-24 | 蛋白質生成物の製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5527668A (ja) |
| EP (1) | EP0171142B2 (ja) |
| JP (2) | JP2543497B2 (ja) |
| AT (1) | ATE78055T1 (ja) |
| AU (1) | AU600885B2 (ja) |
| CA (1) | CA1285505C (ja) |
| DE (1) | DE3586304T3 (ja) |
| DK (1) | DK175105B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006067883A (ja) * | 2004-09-01 | 2006-03-16 | Kao Corp | 組換えバチルス属細菌 |
Families Citing this family (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU600885B2 (en) * | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
| US5723292A (en) * | 1984-05-25 | 1998-03-03 | Zymogenetics, Inc. | Stable DNA constructs |
| US4801542A (en) * | 1984-10-12 | 1989-01-31 | Zymogenetics, Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| EP0487116B1 (en) * | 1984-10-12 | 1999-12-29 | ZymoGenetics, Inc. | Biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| DK594084A (da) * | 1984-12-12 | 1986-06-13 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning |
| US4935349A (en) * | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
| EP0251579A3 (en) * | 1986-06-24 | 1989-03-22 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Non-antibiotic marker system |
| ATE131532T1 (de) * | 1986-08-13 | 1995-12-15 | Zymogenetics Inc | Expression von biologisch-aktiven pdgf-analogen in eukaryotischen zellen |
| US5474982A (en) * | 1986-08-13 | 1995-12-12 | Zymogenetics, Inc. | PDGF analogs and methods of use |
| DK175243B1 (da) * | 1987-03-23 | 2004-07-19 | Zymogenetics Inc | Ekspressionsvektor, der er i stand til at styre ekspression af heterologe gener eller cDNA i gær, gærværtscelle samt fremgangsmåde til öget produktion af proteiner i gærværtsceller |
| IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
| US5135854A (en) * | 1987-10-29 | 1992-08-04 | Zymogenetics, Inc. | Methods of regulating protein glycosylation |
| WO1989006694A1 (en) * | 1988-01-15 | 1989-07-27 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules |
| JP3273609B2 (ja) * | 1989-07-07 | 2002-04-08 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 発現ベクターのマルチコピー組込みにより形質転換した真菌による蛋白質の製法 |
| US6004776A (en) * | 1989-07-07 | 1999-12-21 | Unilever Patent Holdings, B.V. | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector |
| US5759833A (en) * | 1994-05-27 | 1998-06-02 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Human isoleucyl-tRNA synthetase proteins, nucleic acids and tester strains comprising same |
| GB2318732A (en) | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Johnson & Johnson Medical | Wound healing compositions containing alpha-1-antitrypsin |
| US20020119579A1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-08-29 | Peter Wagner | Arrays devices and methods of use thereof |
| US6576478B1 (en) * | 1998-07-14 | 2003-06-10 | Zyomyx, Inc. | Microdevices for high-throughput screening of biomolecules |
| US6406921B1 (en) | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
| US6897073B2 (en) * | 1998-07-14 | 2005-05-24 | Zyomyx, Inc. | Non-specific binding resistant protein arrays and methods for making the same |
| DE60044728D1 (de) | 1999-12-29 | 2010-09-02 | Novo Nordisk As | VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON INSULINVORLäUFERN UND ANALOGEN VON INSULINVORLÄUFERN MIT VERBESSERTER FERMENTATIONSAUSBEUTE IN HEFE |
| US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
| JP3966819B2 (ja) | 2001-05-24 | 2007-08-29 | キム，スーギョン | 毛嚢に存在する新規の第２ケラチノサイト成長因子類似体 |
| US7176278B2 (en) | 2001-08-30 | 2007-02-13 | Biorexis Technology, Inc. | Modified transferrin fusion proteins |
| EP2314629B2 (en) | 2002-07-18 | 2022-11-16 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
| USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
| US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
| CA2527694C (en) | 2003-05-30 | 2015-07-14 | Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom | Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs |
| EP1687428A1 (en) | 2003-11-14 | 2006-08-09 | Novo Nordisk A/S | Processes for making acylated insulin |
| EP1692168B1 (en) | 2003-12-03 | 2011-07-20 | Novo Nordisk A/S | Single-chain insulin |
| IL165484A0 (en) * | 2004-11-30 | 2006-01-15 | Applied Research Systems | Production of proteins |
| EP1831375B1 (en) | 2004-12-23 | 2014-07-16 | Novozymes Biopharma DK A/S | Gene expression technique |
| ES2368500T3 (es) | 2005-08-16 | 2011-11-17 | Novo Nordisk A/S | Método para producir polipéptidos de insulina maduros. |
| ATE482977T1 (de) | 2006-02-27 | 2010-10-15 | Novo Nordisk As | Insulinderivate |
| AU2007278994B2 (en) | 2006-07-24 | 2013-08-15 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Exendin fusion proteins |
| JP5503968B2 (ja) | 2006-09-27 | 2014-05-28 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | 成熟インスリンポリペプチドの作製方法 |
| AU2007331195A1 (en) | 2006-12-12 | 2008-06-19 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Transferrin fusion protein libraries |
| US8575096B2 (en) | 2007-08-13 | 2013-11-05 | Novo Nordisk A/S | Rapid acting insulin analogues |
| EP2178910B1 (en) | 2007-08-15 | 2014-10-08 | Novo Nordisk A/S | Insulins with an acyl moiety comprising repeating units of alkylene glycol containing amino acids |
| JP5730569B2 (ja) | 2007-08-15 | 2015-06-10 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | アシル及びアルキレングリコール部分を有するインスリンアナログ |
| WO2011089170A2 (en) | 2010-01-22 | 2011-07-28 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing fgf-21 with low degree of o-glycosylation |
| US8815541B2 (en) | 2009-11-25 | 2014-08-26 | Novo Nordisk A/S | Method for making polypeptides |
| JP6393255B2 (ja) | 2012-04-20 | 2018-09-19 | メルス ナムローゼ フェンノートシャップ | ヘテロ二量体のＩｇＧ様分子を生産する方法、ヘテロ二量体のＩｇＧ様分子、ヘテロ二量体の抗体、組み換え宿主細胞、医薬組成物、宿主細胞を作成する方法、および培養物 |
| WO2014195452A1 (en) | 2013-06-07 | 2014-12-11 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| KR102277898B1 (ko) * | 2014-07-03 | 2021-07-15 | 삼성전자주식회사 | 산물 생산능이 향상된 효모 및 그를 이용한 산물을 생산하는 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5741909A (en) * | 1980-08-25 | 1982-03-09 | Matsushita Electric Works Ltd | Extrusion molding method for cement system inorganic material |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| JPS55156591A (en) * | 1979-05-23 | 1980-12-05 | Ajinomoto Co Inc | Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid |
| US4506013A (en) * | 1980-10-03 | 1985-03-19 | Eli Lilly And Company | Stabilizing and selecting recombinant DNA host cells |
| DE3279270D1 (en) * | 1981-09-02 | 1989-01-12 | Biogen Nv | Amplified expression of dna sequences |
| CA1198069A (en) * | 1982-06-08 | 1985-12-17 | David H. Gelfand | Temperature sensitive multicopy plasmids |
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| CA1209501A (en) * | 1982-09-16 | 1986-08-12 | Nikos Panayotatos | Expression vector |
| GB8407498D0 (en) * | 1984-03-22 | 1984-05-02 | Biogen Nv | High copy number expression vectors |
| AU600885B2 (en) * | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
| US4931373A (en) * | 1984-05-25 | 1990-06-05 | Zymogenetics, Inc. | Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin |
-
1985
- 1985-05-23 AU AU42794/85A patent/AU600885B2/en not_active Ceased
- 1985-05-24 JP JP60111975A patent/JP2543497B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 AT AT85303702T patent/ATE78055T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-24 EP EP85303702A patent/EP0171142B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 CA CA000482272A patent/CA1285505C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-24 DK DK198502350A patent/DK175105B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-24 DE DE3586304T patent/DE3586304T3/de not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-10-12 US US08/134,480 patent/US5527668A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-05-31 JP JP6118650A patent/JP2704115B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-06 US US08/473,012 patent/US5700643A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5741909A (en) * | 1980-08-25 | 1982-03-09 | Matsushita Electric Works Ltd | Extrusion molding method for cement system inorganic material |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006067883A (ja) * | 2004-09-01 | 2006-03-16 | Kao Corp | 組換えバチルス属細菌 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4279485A (en) | 1985-11-28 |
| US5527668A (en) | 1996-06-18 |
| JP2543497B2 (ja) | 1996-10-16 |
| DK235085D0 (da) | 1985-05-24 |
| US5700643A (en) | 1997-12-23 |
| JP2704115B2 (ja) | 1998-01-26 |
| AU600885B2 (en) | 1990-08-30 |
| DE3586304T2 (de) | 1992-12-10 |
| DK235085A (da) | 1985-11-26 |
| DE3586304T3 (de) | 2005-02-17 |
| EP0171142B1 (en) | 1992-07-08 |
| EP0171142A1 (en) | 1986-02-12 |
| ATE78055T1 (de) | 1992-07-15 |
| CA1285505C (en) | 1991-07-02 |
| DK175105B1 (da) | 2004-06-01 |
| JPS6156092A (ja) | 1986-03-20 |
| DE3586304D1 (de) | 1992-08-13 |
| EP0171142B2 (en) | 2004-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2704115B2 (ja) | 形質転換細胞を選択する方法 | |
| US4931373A (en) | Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin | |
| JP2509163B2 (ja) | 発現ベクタ−及び該発現ベクタ−を含む酵母細胞 | |
| JP2837407B2 (ja) | 生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現 | |
| JP2793215B2 (ja) | 先端を切断したα―因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパクの改良された発現および分泌 | |
| PH27171A (en) | Expression and secretion of heterologous proteins by yarrowia lipolytica transformants | |
| JPH0757190B2 (ja) | 酵母中でのポリペプチドの発現 | |
| JP2000300277A (ja) | 酵母におけるタンパク質の高レベル発現 | |
| JPH0824565B2 (ja) | ポリペプチドの製造における改良 | |
| JPH07503137A (ja) | 血清ヒトアルブミン，製剤及び利用 | |
| US5013652A (en) | Composite yeast vectors | |
| EP0316444B1 (en) | Yeast expression vector | |
| JP2710470B2 (ja) | 突然変異菌株の検出法 | |
| US5871957A (en) | Stable DNA constructs | |
| JPH0213377A (ja) | デスルファトヒルジン化合物の製造方法 | |
| US5723292A (en) | Stable DNA constructs | |
| JP3949734B2 (ja) | プロテアーゼ阻害剤の生産方法 | |
| AU594650B2 (en) | Stable DNA constructs for expression of alpha-1-antitrypsin | |
| JPS6170981A (ja) | 組換型サツカロミセス | |
| KR970005584B1 (ko) | 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법 | |
| CA2089752A1 (en) | Production of human lysozyme in methylotrophic yeast cells and efficient secretion therefrom | |
| US5541084A (en) | Hybrid yeast promoter comprising an ENO2 UAS and TATA region and an additional UAS located between said ENO2 UAS and TATA region | |
| JPH05292972A (ja) | 改良された酵母発現系 | |
| KR0185980B1 (ko) | 알부민 유전자-함유 플라스미드, 이를 함유하는 형질전환체, 이러한 형질전환체의 생산방법 및 알부민의 생산방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |