JPS6170981A - 組換型サツカロミセス - Google Patents

組換型サツカロミセス

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JPS6170981A
JPS6170981A JP60193014A JP19301485A JPS6170981A JP S6170981 A JPS6170981 A JP S6170981A JP 60193014 A JP60193014 A JP 60193014A JP 19301485 A JP19301485 A JP 19301485A JP S6170981 A JPS6170981 A JP S6170981A
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JP
Japan
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candida
gene
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satucharomyces
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JP60193014A
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ジエシカ・アンジエル・ゴーマン
イーガル・コルチン
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SmithKline Beecham Corp
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0101—Oligo-1,6-glucosidase (3.2.1.10), i.e. sucrase

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は組換型サツカロミセス、さらに詳しくは、サツ
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）における
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）からのＤＮＡ配列のクロ
ーニングおよび発現に関する。
発明の背景 カンジダ症はカンジダ属の酵母のい（つカッ種のいずれ
かに原因する感染症である。これらの微生物は皮膚、粘
膜および胃腸管の正常な微生物相の一員である。したが
って、明らかに、内因性感染の危険性が常に存在する。
大部分のカンジダ感染はカンジダ・アルビカ７　ス（Ｃ
ａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）によって起こされ、
これはヒトの通常の病原性真菌で、表在性および全身性
真菌症の両方を起こす。
カンジダ・アルビカンス感染症は免疫の弱体化した患者
にもつともよく起こる。このような患者においては、該
感染症は生命をおびやかすことがある。したがって、抗
カンジダ剤が非常に要求されている。カンジダ遺伝子の
単離および発現は有効な抗カンジダ剤の発現を可能にし
うる。
カンジダの生化学および遺伝学の理解は容易に取扱うこ
とのできる遺伝系の欠如により妨げられてきた。カンジ
ダの変異株を調製し、単離することは困難で、カンジダ
では有性段階は全く記載されていない。適当な変異株の
ないことから、カンジダの生化学的および発生学的過程
を分析することは困難である。すなわち、有効な抗カン
ジダ剤の開発は遅々としている。
サツカロミセスｒス・セレビシｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）は非病原性で、組
換型ＤＮＡのクローニングおよび発現用の好適な微生物
と考えられている。ストロール、ネーチャー（５ｔｒｕ
ｈｌ　。
Ｎａｔｕｒｅ）３０５　：３９１〜３９７　（１９８３
）はサツカロミセスにおけるクローニングを論評してい
る。
ヘニコフら、ネーチャー（Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ　ｅｔ　ａ
ｌ　、。
Ｎａｔｕｒｅ　）　２８９　：　３３〜３７　（１９８
１）は、酵母における相補によるショウジヨウバエ（Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からのアデニン−８遺伝子の単離
を報告している。ディクソン、ジー７　（Ｄｉｃｋｓｏ
ｎ、　Ｇｅｎｅ　）　Ｉ　Ｑ：３４７〜３５６　（１９
８０）　は、サツカロミセス・セレビシエにおけるクル
イベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
　１ａｃｔｉｓ　）から誘導されたβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の発現を報告している。
ラッセルおよびハル、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル−ケミストリー（Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ
。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５８　：　１４３〜１４
９（１９８３）は、サツカロミセス・セレビシエにおけ
るシゾサツカロミセス・ポア　ヘ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ　）からのアルコール
・デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングを報告してい
る。イエリングハウスら、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジカル ）１５９　：　６２３〜６３６　（１９８２）は、エシ
ェリヒア　−：ｌ　Ｕ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ　）−酵母ベクター中でクローンしたジクチオス
テリウム（Ｄｉｃｔｙｏ−ｓｔｅｌｉｕｍ）遺伝子の酵
母における転写を報告している。
発明の概要 本発明の１つの態様は、カンジダから由来した機能性Ｄ
ＮＡ配列を含有するサツカロミセス属の形質転換宿主微
生物である。
本発明のもう１つの態様は、レプリケータ−領域および
カンジダから由来した機能性ＤＮＡ配列からなる組換型
プラスミドである。
また、本発明は、サツカロミセス属の宿主微生物を該機
能性ＤＮＡ配列で形質転換し、該機能性ＤＮＡ配列が発
現される適当な条件下に該形質転換宿主を培養すること
からなるカンジダから由来した機能性ＤＮＡ配列の発現
法にも関する。
さらに、本発明のもう１つの態様は、（ａ）サツカロミ
セス属の、公知の機能を欠く宿主微生物を、カンジダか
ら由来したＤＮＡ配列により、該カンジダＤＮＡで宿主
微生物を相補できるように形質転換し、（ｂ）形質転換
宿主微生物における該機能の存在を検定することからな
る、その機能によるカンジダから由来するＤＮＡ配列の
特徴づけ方法である。
本発明はまた、適当な培地中でサツカロミセス属の形質
転換宿主微生物を培養することからなり、該宿主微生物
が、ポリペプチドをコードする構造遺伝子に、直接また
は間接的に、同位相で適正な方向で融合したカンジダ由
来のプロモーターを含む、サツカロミセスにおける該ポ
リペプチドの製法にも関する。
発明の詳説 本発明の形質転換宿主微生物は、カンジダから由来した
機能性ＤＮＡ配列を導入したサツカロミセス属のものい
ずれでもよい。この属の中でもつとも良く研究されてお
り、組換型ＤＮＡのためにもつともよく用いられている
種であるので、サツカロミセス・セレビシエが好ましい
。
本発明の組換型プラスミドはカンジダ属のいずれの種か
ら由来する機能性ＤＮＡ配列からなるものでもよい。こ
の属のもつともカンジダ症を起こしやすいものから由来
しているので、本発明でまず第１に用いるべきＤＮＡで
あるところから、カンジダ・アルビカンス由来のＤＮＡ
がもつとも好ましい。カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎ
ｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ　）、カンジダ・ステラ
トイデア（Ｃａｎｄｉｄａ　５ｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ
　）、カンジダ・シウドトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ
　ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ　）、カンジダ・
パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏ
ｓｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ
　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、カンジダ・ウティリ
ス（Ｃ：ａｎｄｉｄａ　ｕｔ、１ｌｉｓ　）、およびカ
ンジダ・クルイシ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｉｓｉｉ　
）のような他のカンジダ種のいずれから由来するＤＮＡ
も使用できる。
「機能性ＤＮＡ配列」なる語は、カンジダにおいて完全
な遺伝子発現ユニット、構造遺伝子、プロモーターまた
は調節領域として機能する、カンジダから直接または間
接的に由来するＤＮＡのいずれかの分離された領域を意
味する。「完全な遺伝子発現ユニット」なる語は、構造
遺伝子と、その転写および翻訳に要求されるプロモータ
ーおよび調節領域を意味する。「プロモーター」なる語
は、構造遺伝子の上流の、ＲＮＡポリメラーゼの結合お
よび転写を可能にするいずれかの領域を意味する。「調
節領域」なる語は、遺伝子の転写を調節するいずれかの
領域を意味する。「構造遺伝子」なる語は、ｍλＮＡ合
成の鋳型として働く、ポリペプチドをコードする配列を
意味する。
本発明の組換型プラスミドは、レプリケータ−領域、好
ましくは、サツカロミセスまたはカンジダ・レプリケー
タ−領域も含り。「レプリケータ−領域」なる語は、宿
主サツカロミセス微生物中でカンジダから由来した機能
性ＤＮＡ配列を染色体外的に維持するために使用できる
、好ましくは、サツカロミセスまたはカンジダのような
酵母から直接または間接的に由来したいずれかのＤＮＡ
フラグメントを意味する。特に好ましいプラスミドは、
ブローチら、ジー７　（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ　、
’、　Ｇｅｎｅ　）８　：１２１〜１３３　（１９７９
）　　に記載されているようなサツカロミセス−エシエ
リヒア・コリ・シャトル・ベクターからなるものである
。カンジダから由来する機能性ＤＮＡ配列をその中にク
ローニングすることにより、本発明で使用することので
きるベクターの例は、例えば、アメリカン・タイプ・カ
ルチュアー・コレクション、米国、メリーランド州、ロ
ツクビ／Ｌ／　（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　。
Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）から一般に入手可
能なつぎのプラスミドである（カッコ内はＡＴＣＣ寄託
番号）。ｐＢＴＩ−１（３７０８７）、ｐＢＴＩ−７（
３７０８８）、ｐＢＴｌ−９（３７０８９）、ｐＢＴｌ
−１０（３７０９０）、ｐＬＣ５４４（３７０１３）、
ｐＲＢ３（３７０５９）、ｐＲＢ４（３７０５８）、ｐ
ＲＢ５（３７０５１）、Ｐ艮Ｂ８（３７１０９）、Ｐλ
Ｂ９（３７０５７）、ｐＲＢｌｏ（３７０５６）、ＰＲ
Ｂ１８（３７０９２）、ＰＲＢ２０（３７０５４）、Ｐ
ＲＢ２１（３７０５５）、ｐＲＢ２２（３７，０ｓ３）
、ＰＲＢ１２（３７０６１）、ＰＲＢ１４（３７０６３
）、ｐＲＢ１５（３７０６２、）、ｐＲＢ１６（３７０
６０）、ｐＲＢ１９（３７０６４）、ＹＥｐ２（３７０
７６）、ＹＲｐ１７（３７０７８）、ＹＥｐ、１３（３
７１１５）。
カンジダＤＮＡ配列はリグスベイら、モレキュラー・セ
ルラー・バイオロジー（Ｒｉｇｓｂｙ　ｅｔ　ａｌ、。
Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　）　２　：　８５
３〜８６２　（１９８２）に記載されるような公知の技
術によって調製できる。単離されたカンジダＤＮＡは、
ついで、１種以上の制限酵素で処理してさらにフラグメ
ント化される。
機能性カンジダＤＮＡ配列を含有し、かつ、エシェリヒ
ア・コリ・レプリケータ−領域を含有する組換型ＤＮＡ
はエシェリヒア・コリを形質転換し、プラスミドを増幅
させるために用いることができる。かかる形質転換およ
び増幅は公知の技術で行なうことができる。ついで、組
換型プラスミドは公知の技術でイー・コリから回収され
る。
回収した組換型プラスミドは、ついで、サツカロミセス
属の宿主微生物の形質転換に使用できる。
このような形質転換は、組換型ＤＮＡフラグメントを、
共有的に閉じた環状酵母プラスミドに無作為的に挿入し
、（ａ）ハイホンら、プロシーディンゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミイ・アンド・サイエンス・オブ・ニー
・ニス・エイ（Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　７５　：
ｌ　９２９〜１９３３（１９７８）　　に記載される方
法によるごとくしてスフ二〇プラストをそれで形質転換
するか、（ｂ）イト−ら、ジャーナル・オブ・バタテリ
オロジ−（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　）　１５３：１６３（１９８３）に記載され
るような酵母形質転換の酢酸リチウムまたは塩化リチウ
ム法を用いることにより行なうことができる。カンジダ
からのＤＮＡはカンジダおよびサツカロミセス・プロト
プラストの融合により、サツカロミセス微生物中に形質
転換させることもできる。カンジダＤＮＡ導入は宿主サ
ツカロミセス微生物の染色体ＤＮＡ中に、組換えによる
ごとく、一体化させることができ、また、条体外に残し
ておくこともできる。したがって、もう１つの方法の例
は、所望により、宿主染色体ＤＮＡ中の隣接配列と相同
するフランキング配列を有し、それにより、宿主の染色
体ＤＮＡとの組換えを可能にするカンジダＤＮＡによる
宿主サツカロミセス微生物の直接形質転換である。
本発明の方法によるカンジダから由来したプロモーター
領域は形質転換サツカロミセス宿主において、カンジダ
、サツカロミセスまたは他の生物、ウィルスまたは細胞
からのコード配列を発現するために使用できる。このよ
うなプロモーターは、インシュリン、インターフェロン
、生長ホルモン等をコードする配列のような構造を遺伝
子と、そのプロモーターの生来のヌクレオチドの全部ま
たは一部と該所望のポリペプチドをコードする配列との
融合により融合することができ、ハイブリッド遺伝　　
　　　。　　　　−゛　− 子を生じる。そのようなハイブリッド遺伝子を含有する
プラスミドで形質転換されたサツカロミセス宿主微生物
を適当な培地中で培養すると、それらはポリペプチドを
産生ずる。ここに開示したこれらのカンジダ・プロモー
ターに加え、プロモーターの選択用に設計されたサツカ
ロミセス・プラー゛スミド中で、カンジダＤＮＡの任意
のフラグメントをクローニングすることにより、さらに
イ也のプロモーターを見つけることができる。このよう
なプラスミドは、カサダバンら、メソッド・イン・エン
ザイモロジ−（Ｃａ５ａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　１０
０　：　２９３〜３０８　（１９８３）により記載され
ているような公知の技術で設計できる。
カンジダから由来する構造遺伝子は、その生来のカンジ
ダ・プロモーターから、カンジダまたはサツカロミセス
が由来する非相同プロモーターから、あるいは、他の生
物から由来する、または合成オリゴヌクレオチドから調
製される、サツカロミセス中で機能する他の機能性非相
同プロモーターからサツカロミセス中で発現させること
ができる。
多くの公知のサツカロミセス変異株は、ロイシンまたは
ヒスチジンの生合成の特定の過程のようなある定められ
た機能を欠損している。この機能は、そのような機能を
コードする遺伝子を含有するカンジダから由来するＤＮ
Ａ配列でそのような変異株を形質転換すれば補うことが
できる。入手しうるサツカロミセス株中に特徴づけるべ
き欠損がない場合、変異株は、紫外線照射、化学的変異
誘発または遺伝子操作のごとき公知の方法で誘導できる
。いくつかの場合、形質転換した宿主微生物によって示
される機能はサツカロミセスに生来存在しないものとな
る。例えば、宿主サツカロミセス・セレビシエ微生物は
、本発明の方法による機能１ＤＮＡ配列により形質転換
して、ソルビトール利用、α−１，６−グルコシド結合
のインメラーゼ触媒開裂によるマルトース利用（α−メ
チル−〇−グルコピラノシド加水分解）、α−１，４−
グルコシド結合のグルコアミラーゼ触媒開裂による可溶
性殿粉の利用または抗真菌剤に対する耐性のような生来
存在しない機能を示させることができる。
カンジダの全ゲノムをカバーするゲノム・ライブラリー
の開発はカンジダから由来するＤＮＡの機能の特徴づけ
を可能にする。これにより、この無性病原体の遺伝学を
以前よりも、より厳密に分析することができ、抗カンジ
ダ剤の開発を容易にする。カンジダから由来するＤＮＡ
の機能の特徴っけの好ましい方法は、よく特徴つけられ
た真核生物の背景中でカンジダ遺伝子が研究できるよう
に、サツカロミセス・セレビシエ中でカンジダ・アルビ
カンスから由来するＤＮＡを発現することである。した
がって、カンジダ・アルビカンスの遺伝学は、形質転換
サツカロミセス・セレビシエにより示される構造の相補
を介する遺伝子の単離により研究することができる。サ
ツカロミセス・セレビシエ変異株の豊富なことは、さら
に変異株の選択が可能なことと相まって、そのような相
補を可能にしている。したがって、定められた生化学反
応をともなうもの、あるいは細胞分裂または細胞構造を
含むものであるような多数の機能のいずれかをともなう
カンジダ・アルビカンス遺伝子の選択が可能になる。ゲ
ノム・ライブラリーおよび選択した遺伝子の同定系を利
用できることは、ある生物が経済的に有用であり、他の
生物が非常に病原性であることの基本的な区別のいくつ
かを解く、新らしい手段を提供する。
本発明の方法を用いることにより、サツカロミセス変異
を相補し、あるいは、形質転換されたサツカロミセス株
に新たな特性を与える１種またはそれ以上の機能性カン
ジダ・アルビカンス遺伝子を担持するプラスミドを単離
し、特徴づけすることができる。このような機能性カン
ジダ・アルビカンス遺伝子はサツカロミセス・セレビシ
エｔｒｐ１変異を相補する遺伝子、サツカロミセス・セ
レビシエｈｉｓ　３変異を相補する遺伝子、抗真菌剤ベ
ノミルに対する高レベルの耐性を与える遺伝子、ソルビ
トールで生長できるようにする遺伝子、イソマルトース
で生長できるようにする遺伝子、可溶性殿粉で生長でき
るようにする遺伝子（グルコアミラーゼ遺伝子）および
サツカロミセス・セレビシエｇａｌ　１変異を相補する
、酵素ガラクトキナーゼをコードする遺伝子を包含する
。カンジダ・アルビカンス−ソルビトール、イソマルト
ースおよび可溶性殿粉利用遺伝子のプロモーターの各々
−゛も、そのようなプロモーターを含有するプラスミド
で形質転換したサツカロミセス微生物の調節可能なプロ
モーターとして有用である。カンジダ。
アルビカンス機能性ＤＮＡ配列含有プラスミドはサツカ
ロミセスにおける医薬、ワクチン用抗原およびホルモン
のような遺伝子生産物の製造に有用である。
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例Ｉ Ａ、カンジダ・アルビカンスからのＤＮＡの単離リグス
ビーら、モレキュラー・セ、ルラー・バイオロジー（Ｒ
ｉｇｓｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ。
Ｂｉｏｌ　、）２　：　８５３〜８６２　（１９８２）
に記載の操作により、カンジダ・アルビカンス株７９２
−１〔米国ナショナル・インステイテユート・オブ・ヘ
ルス、’；エイ・りｔ　７−　ｆ”ｖ　７　（Ｊ、Ｋｗ
ｏｎ−Ｃｈｕｎｇ。
Ｎａｃｌ、Ｉｎ５ｔ、Ｈｅａｌｔｈ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）　
（ｙ）好意による゛）からＤＮＡを単離した。この方法
で精製されたＤＮＡは平均１００キロベース・ペア（Ｋ
ｂｐ）の長′さ上にあった。
Ｂ、カンジダ・アルビカンスのゲノム・ライブラリーの
作成 ゲノム・ライブラリーを、ブローチら、ジーン（Ｂｒｏ
ａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ）　８　：　１２１〜
１３３　（１９’７９）に記載されるサツカロミセス−
エシエリヒア・コリ・シャトルベクターｙＥＰ１３　中
で作成した。前記のりゲスビーらによって与えられたデ
ータに基くカンジダ・アルビカンスのゲノムの太きさの
計算はカンジダ・アルビカンスのゲノム・サイズが約２
　ｘ　１０４Ｋｂｐであることを示唆した。したがって
、カンジダ・アルビカンス配列の各々が少なくとも１回
このライブラリー中で表わされる確率９９惣でゲノム・
ライブラリーを得るために、１ＱＫｂｐのインサートを
担持する約８０００の形質転換体が必要である。これは
、マニアチスら、「モレキュラー・クローニングーア・
ラボラトリ−・マニュアル」、コールド・スフリング・
ハーバ−ｑラボラトリ−（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ　、、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、”ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１
９８２）により開示される方法によって計算した。
ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａで部分的に
消化し、５〜２０％ショ糖グラジェントで遠心分離した
。１ＱＫｂｐの範囲内にＤＮＡフラグメントを含有する
フラクションをため、結’ｌ　ｉｃ　用いた。プラスミ
ドＹＥＰ１３ＤＮＡを独特のＢａｍＨ１部位で開裂し、
アルカリホスファターゼで処理して自己績’ｉを防止し
た。カンジダ・アルビカンスの等濃度（１０μ！反応混
合物中、２００ｎｇ）およびＹＥｐ　１３ＤＮＡを結紮
した。
イー・コリ株ＭＣ１０６１［カサダバンら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｃａｓａｄ４ｂ
ａｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）　１３
１ｊ　：　１７９〜２０７（１９８０））およびＨＢｌ
ｏｌ［ポリバーら、ジー７　（Ｂｏｌ　１ｖａｒ　ｅｔ
　ａｌ　、、Ｇｅｎｅ　）　２　：　９５〜１１３］を
、ＬＢ〔ルリア・ブｏ　ス（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）
〕中、３７℃における発現時間を４５分とする以外はレ
デルベルグおよびコーヘン、ジャーナル・オブ、　ハク
テリオロジ−（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ　ａｎｄＣｏｈｅｎ
、Ｊ、Ｂａｃ’ｔｅｒｉｏｌ、）１１　ｇ　；　１０７
２〜１０７４（１９７４）に従って結懺混合物で形質転
換した。
独立した形質転換体の数の算定は５０μｇ／ｍｔのアン
ピシリンを含有するＬＢ平板上で少量の試料を平板培養
して行なった。同時に、残りの試料を５０μｇ／ｒｎｔ
のアンピシリンを含有するＬＢグロスに接種し、−夜イ
ンキユベーションしてＤＮＡのａｌ離に用いた。得られ
た平板は、約１６０００個の独立したクローンか得られ
たことを示した。インチ−トを含有する形質転換体の割
合を算定するため、１００ｆｌＷの形質転換体のアンピ
シリンおよびテトラサイクリンに対する耐性をテストし
た。ＢａｍＨ１部位がテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔ
ｅｔ、　）中にあるので、挿入したＤＮＡを育するプラ
スミドを含有する形質転換体はテトラサイクリンに感受
性−゛で、アンピシリンに耐性であるはずで、一方、イ
ンサートを有しないプラスミドを含有する形質転換体は
両方の抗生物質ｔこ対して耐性のはずである。
得られた結果は、全ての形質転換体がテトラサイクリン
に感受性で、アンピシリン）こ耐性であり、形質転換体
の少な（とも９９％が挿入したカンジダ・アルビカンス
のＤＮＡを含有するプラスミドを担持していることを示
した。
この最初の培養物の一部を接種物として用い、前記のマ
ニアチスらの方法により、小規模または大規模でイー・
コリの一夜ＬＢ−アンピシリン培養物からＤＮＡを調製
した。
Ｃ，カンジダ・アルビカンス遺伝子のサツカロミセス・
セレビシエ中における発現 （１）一般的方法 サツカロミセス・セレビシエ中での発現によりカンジダ
・アルビカンスのクローンＤＮＡ配列ヲ単離するため、
サツカロミセス・セレビシエの遺伝的に定まった半数体
株をＤＮＡ介在形質転換用の宿主として用いた。形質転
換は、（ａｌ前記ジャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）により
記載されたようなスフェロプラスト法あるいはｆｂｌイ
ト−ら、ジャーナル・オブ伽バクテリオロジ−（ｌｔｏ
　ｅｔ　ａｉ、、Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１５３：１６３（１９８３）に
記載された塩化リチウムまたは酢酸リチウム法により行
なった。酵母を、１つを除いて全ての必要な補足物を含
有する最小培地（酵母窒素ベース−ディフコ（Ｄｉｆｃ
ｏ）　ＹＮＢ　）上で平板培養した。
定められたサツカロミセス・セレビシエ変異株の、特定
の変異の野生型対立遺伝子を含有するプラスミドでの形
質転換は、非形質転換変異株に対して制限的な条件下で
の形質転換宿主の増殖を可能にする。以下の実施例中、
ＬＥＵ２を第１の検出マーカーとして用いた。ついで、
形質転換酵母を別の型の培地上で継代し、サツカロミセ
ス・セレビシエ宿主株中で最初欠けていた他の機能を発
現する形質転換体を選択する。
前記ジャーマンらの方法を用いて所望の形質転換体のＤ
ＮＡ調製物を作り、このＤＮＡを用いてイー・コリを形
質転換することにより、サツカロミセス・セレビシエか
ら回収した。シャトルベクターがアンピシリン耐性遺伝
子を担持しているので、形質転換イー・コリはＬＢ−ア
ンピシリン平板上で回収された。ついで、イー・コリか
ら公知の方法でプラスミドＤＮＡを単離し、さらに分析
に用いた。そのような、さらに行なった研究には、ｔａ
＋最初の形質転換酵母細胞中に見出されたと同じ表現型
を与える遺伝子の存在を確認するための酵母の形質転換
、“ （ｂｌハイブリッド・プラスミド中でのカンジダ・アル
ビカンスのＤＮＡ存在を確認するためのハイブリッド形
成分析、および、 （Ｃ１構造的および機能的両面からのカンジダ・アルビ
カンスＤＮＡをさ′らに分析すること、が包含された。
（２）サツカロミセス・セレビシエのｔｒｐｌｆｆ異ヲ
相補するカンジダ・アルビカンス遺伝Ｐの単離サツカロ
ミセス・セレビシエ株Ｄｎｙ７４．ｓのスフェロプラス
ト（α・、ｈｉｓ３−１．１ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１
１２、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐｌ−２８９）をカンジダ
・アルビカンス・ライブラリーから単離したＤＮＡで形
質転換した。サツカロミセス・セレビシエ株ＤＢＹ　７
４５は米国、カリフォルニア州、バークレー、ユニバー
シティ・オブ・カリフォルニア、≠パートメント・オブ
・バイオフイジクス・アンド・メディカル・フイジクス
、イースト・ジエネテイツク・ストック・センター（Ｙ
ｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、
　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＢｉ　　ｈ　　ｉｃｓａ
ｎｄＭｅｄｉｃａｌ　Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙｐ　ｙｓ ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃ
ａｌ　ｉ　ｆｏｒｎｉａ　、Ｕ、Ｓ　、Ａ、　）から得
た。菌体を、ロイシン以外の全ての必要な補足物を含有
する最小培地（ディフコ酵母窒素ベース）上で平板培養
した。この形質転換細胞はＬＥＵ２遺伝子をコードする
プラスミドを発現した。このＬｅｕ　　細胞をこれらの
平板から採集し、ロイシンおよびトリプトファンの両方
を欠く最小培地上で平板培養した。検査した５００個の
形質転換体のうち、２回がこれらの平板上で増殖した。
これらの２つの形質転換体がロイシンおよびトリプトフ
ァンを欠く培地上で増殖するか否かのチー゛ストは、ｔ
ｒｐｌ変異の復帰変異によるよりも、カンジダ・アルビ
カンスＤＮＡの存在によるもので、形質転換体は、１０
代にわたって非選択性酵母エキス・ヘフトン・デキスト
ロース（ＹＥＰＤ）　中で増殖させ、ついで、全ての補
足物を含有する最小培地上で平板培養した。ついで、コ
ロニーを、トリプトファンのみ、あるいはロイシンのみ
を欠く最小培地上でレプリカ平板培養した。
いずれの場合も、該プラスミドを失なった細胞、すなわ
ち、Ｌｅｕ　　からのコロニーは、トリプトファンも必
要とし、ＬＥＵ２およびＴＲＰ　１対立遺伝子の共分離
を示した。ニ プラスミドは、ジャーマンら、「メンツズ・イン・イー
スト・ジエネテイツクス・ラボラトリ−・マニュアル」
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｓ
ｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ　、　、”Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ　Ｙｅａｓ　ｔ　Ｇｅｎｅｔ　ｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　（１９８２
）の方法によって調製されたアンピシリン耐性形質転換
体選択用の小さい酵母ＤＮＡ調製物によるイー・コＩＪ
ＨＢＩＯＩの形ｆｌＦ、換により２つの形質転換単離物
から回収した。形質転換したイー・コリ細胞はテトラサ
イクリン感受性であり、プラスミドがｔｅｔＲ遺伝子中
にインサートを含有していることを示した。２つのプラ
スミドはｐＡＲ８４−１およびｐＡＲ８４２と命名され
た。
各々のプラスミドＤＮＡは前記マニアチスらの方法によ
り調製され、サツカロミセス・セレビシ寥株ＤＢＹ７４
６（イースト・ジエネテイツク・ストック・センターか
ら入手）の形質転換に用いた。形質転換細胞の選択は、
ロイシンを欠くが、補足物のヒスチジン、トリプトファ
ンおよびウラシルを含有する培地上で行なった。Ｌｅｕ
　　形質転換細胞のトリプトファンに対するプロトトロ
フについてテストした。８８〜１００％の形質転換体が
非選択マーカーＴＲＰ　　を発現し、ｐＡＲ８４−１お
よびｐＡＲ８４−２の両方がサツカロミセス・セレビシ
エｔｒＰｌ変異を相補する遺伝子を含有することを確認
し、カンジダから由来した機能性ＤＮＡ配列がサツカロ
ミセス中で発現できることを示した。
Ｄ、プラスミドのさらに特徴づけ 組換型プラスミドにおけるカンジダ・アルビカンスのゲ
ノムＤＮＡに対するＤＮＡインサートの特異的ハイブリ
ッド形成をテストするため、非形質転換および形質転換
サツカロミセス・セレビシエ株ＤＢＹ７４５からのＤＮ
Ａを、前記ジャーマンらの小規模開裂物についての操作
に従って単離した。プラスミドを有するまたは有しない
イー・コリのＤＮＡも前記マニアチスらの方法により調
製した。
ＤＮＡ試料を制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＢｇｌｌ
）で消化した。消化したカンジダ・アルビカンス株７９
２−１のＤＮＡ、サツカロミセス・セレビシエ株ＤＢＹ
７４５、プラスミドＹＥｐｌ　３およびプラスミドｐＡ
Ｒ８４−２をアガロース・ゲル上で電気泳動し、サザー
ン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（
５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ　、　）９
８：５０３〜５１７（１９７５）の操作によりニトロセ
ルロース・フィルターに転移させた。このフィルターを
、順次、まず３２ＰラベルＹＥＰ１３ＤＮＡハイブリツ
ド形成させ、用いたベクターがカンジダ・アルビカンス
のゲノムＤＮＡとハイブリッドを形成するか否かをテス
トし、ついで、３２　ｐラベルＰＡＲ８４−２ＤＮＡと
ハイブリッド形成させて新しいプラスミドがカンジダ・
アルビカンスのゲノムＤＮＡとハイブリッドを形成する
か否かをテストした。
ニトロセルロース・フィルターは、前記マニアチスらの
方法に従って、６ＸＳＳＣおよび３×デンハート（ｌｘ
デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　）はフィコール（Ｆｉ
ｃｏｌ）４００　０．０２％、ポリビニルピロリドン３
６００．０２　　％およびウシ血清アルブミン０゜０２
％である〕を含有する溶液を６５℃で３時間、予備ハイ
ブリッド形成させた。ハイブリッド形成溶液はニックト
ランスレーション（前記マ子アチ予らの方法に従って）
により調製した　ＰラベルＤＮＡプローブを加えた以外
は同じであった。／−イブリッド形成は６５℃で１８時
間行なった。ハイブリッド形成後、フィルターを６５℃
にて２ＸＳ−５Ｃで洗浄した。フィルターはついで、Ｘ
−線フイルムにさらした。
ＹＥＰ１３ＤＮＡ　はサツカロミセス・セレビシエのゲ
ノムＤＮＡのみとハイブリッド形成し、一方、ｐＡＲ８
４−２ＤＮＡはカンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡ
ともハイブリッド形成する。ｐＡＲ８４−２のサツカロ
ミセス・セレビシエ・ゲノムＤＮＡとのハイブリッド形
成は該プラスミドの一部であるサツカロミセス・セレビ
シエＬＥＵ２遺伝子に基く。カンジダ・アルビカンスの
ハイブリッド形成はカンジダ・インサートとカンジダ・
ゲノム配列の相同性による。
各プラスミドにおけるインサートの大きさはアガロース
・ゲル上での制限消化物の電気泳動によって算定される
ＪｐＡＲ８４−１はカンジダ・アルビカンスＤＮＡのｌ
　５　Ｋｂｐフラグメントを含有し、ｐＡＲ８４−２は
１０．４Ｋｂｐフラグメントを含有する。。
Ｅ、他の特異例 サツカロミセス・セレビシエｔｒＰ１変異ヲ相補するカ
ンジダ−アルビカンスＤＮＡフラグメントの単離に用い
たと同様な方法を用いて、他の機能性カンジダ・アルビ
カンス遺伝子を担持するプラスミドを単離し、特徴づけ
した。これらには、ｆｌｌｈｉｓ３変異を相補する遺伝
子、（２）抗真菌剤ベノミル（メチル　１−（ブチルカ
ルバモイル）−２−ペンズイミタソールー力ルバメート
）に対する高レベルの抵抗性を与える遺伝子（カンジダ
・アルビカンス株はサツカロミセス・セレビシエよりも
ベノミルに対してより耐性で、この遺伝子は形質転換サ
ツカロミセス・セレビシエ株に新しい特性を与える）、 （３）炭素源ソルビトールで増殖できるようにする遺伝
Ｔ−（カンジダ−アルビカンス株はソルビトールで増殖
できるが、サツカロミセス・セレビシエおよびサツカロ
ミセス属の他の種はこの糖を利用できず、この遺伝子は
形質転換テツ力ロミセス・セレビシェ株に新しい特性を
与える）、（４）炭素原α−メチル−Ｄ−グルコピラノ
シド（イソマルトース）で増殖できるようにする遺伝子
（カンジダ・アルビカンス株はこの基質で増殖でき−る
が、サツカロミセス・セレビシエの大部分の味は生来こ
の糖を利用できない。この酵素はサツカロミセス属の他
の種に見出されている。すなわち、このカンジダ・アル
ビカンス遺伝）はイソマルターゼ（α−１，６グリコシ
ド結合を開裂）をコードＬ、形５ｉ＆換サツカロミセス
・セレビシエ宿主に新たな特性を与える）、 （５）可溶性澱粉で増殖できるようにする酵素をコード
する遺伝子（カンジダ・アルビカンス株は可溶性澱粉を
基質として利用できるが、サツカロミセス・セレビシエ
は生来この炭素源を利用できない。この酵素、グルコア
ミラーゼはサツカロミセス属の他のものに見出されてい
る。すなわち、グルコアミラーゼ（α−１，４グリコシ
ド結合を開裂）をコードするこのカンジダ・アルビカン
ス遺伝子は形質転換サツカロミセス・セレビシエ宿主に
新しい特性を与える。さらに、カンジダ・アルビカンス
・グルコアミラーゼ遺伝子は、カンジダ・アルビカンス
によって、あるいは、それによって形質転換されたサツ
カロミセス・セレビシエ宿ｔによって産生されると、酵
素が培地中に分泌されるので非常に有用である。すなわ
ち、該グルコアミラーゼ遺伝子は蛋白質分泌を機能する
シグナル・ペプチド用のＤＮＡ配列を与えることができ
る。
このようなシグナル・ペプチドを細胞質蛋白の分泌に用
いることは公知であり、例えば、１９８２年６月２２日
発行されたシ、レバビーら（Ｓｉｌｈａｖｙｅｔａｌ、
）の米国特許第４３３５３３６号参照。このグルコアミ
ラーゼ遺伝子シグナル・ペプチドはサツカロミセスまた
はそれにより形質転換された他の酵母による天然または
非相同蛋白の分泌系発達に用いることができる）、 （６１サツカロミセス・セレビシエｇａｌｌ変異を相補
する、酵素がラクトキナーゼをコードする遺伝Ｐ、を包
含する。
実施例２ サツカロミセス・セレビシエｈｉｓ３遺伝子のカンジダ
・アルビカンスＤＮＡによる相補Ａ、サツカロミセス・
セレビシエのｈｉｓ３変異を相補するカンジダ・アルビ
カンス遺伝子の単離　−サツカロミセス・セレビシエの
ｈｉｓ３座はイミダゾール−グリセロール・ホスフェー
ト・デヒドロゲナーゼをコードする。サツカロミセス・
セレビンレのｈｉｓ３変異を相補するカンジダ・アルビ
カンス遺伝子の単離は実施例１の方法で行なった。
Ｌｅｕ＋酵母形質転換体をロイシンおよびヒスチジンを
欠く培地上で平板培養した。生じたコロニーを選択した
。
Ｂ、サツカロミセス・セレビシエのｈ　ｉ　ｓ　３　変
異全相補するカンジダ・アルビカンス遺伝子を含有する
プラスミドの回収 実施例１の方法に従って、イー・コＩＪＨＢＩＯ１の形
質転換により、前記の選択したコロニーからプラスミド
を回収した。実施例１の方法に従つて、イー・コリ形質
転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ｐＡＲ８４−３
と命名した。
Ｃ，サツカロミセス・セレビシエのｈｉｓ３変異を相補
するカンジダ・アルビカンス遺伝）を含有するプラスミ
ドによるサツカロミセス・セレビシエ株ＤＢＹ７４５の
形質転換 実施例１の方法に従って、前記で得られたプラスミＩ”
ｐＡＲ８４−３をサツカロミセス・セレビシエ株［）Ｂ
Ｙ７４６中に形質転換した。
Ｄ、形質転換体の選択および形質転換体中におけるカン
ジダ・アルビカンスＤＮＡ存在の確認前記の方法に従っ
て、プラスミドｐＡＲ８４−３で形質転換した宿主サツ
カロミセス・セレビシエ微生物を前記の方法に従って選
択し、ｈｉｓ３遺伝子の発現についてテストした。
実施例３ Ａ、サツカロミセス・セレビシエにおけるカンジダ・ア
ルビカンス・ベノミル耐性遺伝子の発現宿主としてサツ
カロミセス・セレビシエ株ＪＷａ２−２ｃ（α、Ｉｅｕ
２−３、Ｉｅｕ２−１１２）を用いる以外は実施例１の
方法と同様にして、カンジダ・アルビカンス・ベノミル
耐性遺伝子の単離を行なった。サツカロミセス・セレビ
シエ株ＪＷＧ２−２Ｃは、サツカロミセス・セレビシエ
株ＤＣ５（ｌｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３
、ｇａｌ　２、ｃａｎｌ−１１）と、サツカロミセス・
セレビシエ株ＹＭ１４６（α、ｇａ％△１５２、ｔｒｐ
　ｌ−２８９、ｕｒａ３　１−−５２、ｒｈｏ二）との
交差から誘導した。サツカロミセス・セレビシエ株ＤＣ
５は米国、ニューヨーク州、スト二一ブルーク、ニス・
ニー・ニス・ワイのジェームス・アール・ブローチ（Ｊ
ａｍｅｓ　Ｒ。
Ｂｒｏａｃｈ　、　Ｓ、　Ｕ、Ｎ、　ＹｌＳ　ｔｏｎｙ
ｂｒｏｏｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、　Ｓ、Ａ、）
から得た。サツカロミセス・セレビシエ株ＹＭ１４６は
米国、ワシントン州、プルマン、ワシントン・ステーツ
・ユニバーシティのマーク・ジョンン７　（Ｍａｒｋ　
Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　５ｔａｔｅ
　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。
Ｐｕｌｌｍａｎ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｕ、　Ｓ
、Ａ、）から得た。ＬＣｕ＋形質転換細胞を、ロイシン
以外の全ての必要な補足物およびベノミル５０μｇ／ｍ
ｌを含有する最少培地（ディフコ酵母窒素ベース）で平
板培養した。
いくつかのベノミル耐性コロニーを得た。
Ｂ、カンジダ・アルビカンス・ベノミル耐性遺伝子含有
プラスミドの回収 ベノミル耐性を与える酵素をコードするカンジダ・アル
ビカンス遺伝子を含有するプラスミドを実施例１の方法
に従って回収した。前記ジャーマンらの小規模方法に従
って、各イー・コリ形質転換体からプラスミドＤＮＡを
単離した。回収したプラスミド中のカンジダ・アルビカ
ンス・インサートの大きさを、アガロース・ゲル電気泳
動で算定した。
Ｃ，サツカロミセス・セレビシエ株ＪＷＧ２−１１Ｄの
カンジダ・アルビカンス・ベノミル耐性遺伝子含有プラ
スミドによる形質転換 実施例１の方法に従って、イー・コリ形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡ７ｉ−単離し、サツカロミセス・セＬ／
ビシエ株ＪＷＧ２−１１Ｄ（α、ｈｉｓ３、ｔｒｐｌ−
２８９，１ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２、ｇａｌｌ、
△１５２）の形質転換に用いた。サツカロミセス・セレ
ビシエ株ＪＷＧ２−ＬＩＤはサツカロミセス・セレビシ
エ株ＪＷＧ２−２Ｇと同様な方法で誘導した。
Ｄ、形質転換体の選択および形質転換体におけるカンジ
ダ・アルビカンスＤＮＡの存在の確認前記の方法による
、カンジダ・アルビカンス・ベノミル耐性遺伝子を含有
するプラスミドで形質−転換した宿主サツカロミセス・
セレビシエ微生物を前記と同様に選択し、ベノミル含有
培地上で平板培養することにより、実施例１の方法に従
って、形質転換宿主中のプラスミドの存在を確認した。
ｐＣＡ　ｂｅｎ　１７、ｐＣＡｂｅｎ３およびｐＣＡ　
ｂｅｎ　１５と称する３つの独立した単離物を制限地図
によりさらに分析し、全てがカンジダ・アルビカンスか
らの同じ５．８　ＫｂｐＤＮＡフラグメントを含むこと
が判明した。
実施例４ カンジダ・アルビカンスのソルビトール利用の発現 Ａ、カンジダ・アルビカンス・ソルビトール利用遺伝子
の単離 カンジダ・アルビカンス・ソルビトール利用遺伝子の単
離は、宿主としてサツカロミセス・セレビシエ株ＪＷＧ
２−２Ｇを用いる以外、実施例１の方法に従って行なっ
た。Ｌｅｕ　　形質転換体を、ロイシンおよびグルコー
ス以外の全ての必要な補足物および２％ンルビトールを
含有する最小培地（ディフコ酵母窒素ベース）上で平板
培養した。
Ｂ、カンジダ・アルビカンス−ソルビトール利用遺伝子
含有プラスミドの回収 ンルビトール利用能を与える酵素をコードするカンジダ
・アルビカンス遺伝子含有プラスミドを実施例１の方法
に従って単離した。プラスミドＤＮＡを前記ジャーマン
らの小規模法に従い、各イ〜・コリ形質転換体から単離
し、回収したプラスミドのカンジダ・アルビカンス・イ
ンサートの大きさをアガロース・ゲル電気泳動で評価し
た。
Ｃ，カンジダ・アルビカンス・ソルビトール利用遺伝子
含有プラスミドによるサツカロミセス・セレビシエ株Ｊ
ＷＣ，２−１１，Ｄの形質転換前記のイー・コリ形質転
換体からプラスミドＤＮＡを単離し、実施例１の方法に
従って、サツカロミセス・セレビシエ株ＪＷＧ２−１１
Ｄの形質転換に用いた。
Ｄ、形質転換体の選択および形質転換体におけるカンジ
ダ・アルビカンスＤＮＡの存在確認前記の方法による、
カンジダ・アルビカンス・ソルビトール利用遺伝子含有
プラスミドで形質転換したサツカロミセス・セレビシエ
の宿主細胞を前記のようにして選択し、形質転換宿主中
における該プラスミドの存在を実洲例１の方法により確
認した。ｐｃＡ　ｓｏｒ　２およびｐＣＡｓｏｒ９と称
する２つの独立した単離物のＤＮＡをさらに制限地図に
より分析した。ｐｃＡｓｏｒ２はカンジダ・アルビカン
スからの４．５ＫｂｐＤＮＡインサートを含有すること
が判明し、一方、ｐＣＡｓｏｒ９は、該ｐＣＡｓｏｒ２
のカンジダ・アルビカンスＤＮＡインサートに対して相
同性をほとんど示さないカンジダ・アルビカンスからの
４，８　ＫｂｐＤＮＡを含有することが判明した。
実施例５ サツカロミセス・セレビシエにおけるカンジダ・アルビ
カンス・グルコアミラーゼ遺伝子の発現ＡＪンジダ・ア
ルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子の単離 カンジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子の単
離を、宿主としてサツカロミセス・セレビシエ株ＪＷＧ
２−２Ｃを用いる以外は実施例１の方法に従って行なっ
た。Ｌｅｕ　　形質転換体を、ロイシンおよびグルコー
ス以外の全ての必要な補足物と、２％可溶性澱粉を含有
する最小培地（ディフコ酵母窒素ペース）上で平板培養
した。イー・コリ形質転換体は、最初の大コロニーに隣
接してサテライト・コロニーが増殖しはじめたので、多
分、グルコアミラーゼを分泌している。
ＢＪンジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子を
含有するプラスミドの回収″　　　　□グルコアミラー
ゼをコードするカンジダ・アルビカンス遺伝子を含有す
るプラスミドを実施例１の方法に従ってイー・コリ中で
回収した。プラスミドＤＮＡを実施例１の方法に従って
、各イー・コリ形質転換体から単離した。
Ｃ，カンジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼ遺伝子
含有プラスミドでのサツカロミセス・セレビシエ株ＪＷ
Ｇ２−１１Ｄの形質転換 前記のごとくしてイー・コリ転換体から単離し−゛たプ
ラスミドＤＮＡを、実施例１の方法により、サツカロミ
セス・セレビシエ株Ｊｗｃ　２−１１　Ｄの形質転換に
用いた。
Ｄ、形質転換体の選択および形質転換体中でのカンジダ
・アルビカンスＤＮＡ存在の確認前記の方法でプラスミ
ドにより形質転換した宿主サツカロミセス・セレビシエ
微生物を前記のごとく選択し、形質転換宿主中における
プラスミドの存在を実施例１の方法で確認した。ＰＳＴ
Ａ２７−１、ｐｓＴＡｌ−３およびｐｓＴＡｌ５−１と
称する独立した３つの単離物を、さらに制限地図で分析
し、ｐＳＴＡ２７−１およびｐｓＴＡ’ｌ　−３が同じ
カンジダ・アルビカンスＤＮＡインサートを含み、ＰＳ
ＴＡ１５−１が、多分具ｄるカンジダ・アルビカンスＤ
ＮＡインサートを含有することが判明した。
プラスミドｐｓｆＡ’２７−１を、形質転換により〔イ
ト−ら、ジャーナル・オブ・バクテリオログ−（Ｉｔｏ
　　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　
１５３　：　１６３（１９８３’））、３′つの異なる
サツカロ“ミセス・セレビシェ株、Ｊ　ＣＣ４’−’ｌ
　Ｉ　Ｃａ、　Ｉｅｕ　２ミｈｉ＠ｌ−）、ＪＣＣ４−
２８（（”、１ｅｕ２、ｈｉａｌ）およびＪＣＣ４−２
９（α、Ｉｅｕ　２、ｈｉｉｌ）ニ誘導シタ。１“た、
同じ３株を、カンジダ・アルビカンス配列のいずれもを
入＜、親ベクター・プラスミドＹＥｐ１３で形質転換し
た。全６個の形質転換体の増殖を、唯一の炭素源として
０．５％マルト−オリゴ糖類（Ｍｏり（ファンステイー
ルーラボラドリース・インコーホレーテッド（Ｐｆａｎ
ｓｔｉｅＬ　−ＬａｂｏｒａｔｒｉｅｓＩｎｃ、））を
含有する完全（ＹＥＰ）培地上でテストした。この化合
物、Ｍｏｓはα−１，４グルコシド結合で結合したグル
コース重合体の混合物からなる。こレバ、クルコース、
マルトースおよびマルトトリオースを入き、したがって
、サツ力口ミセス・セレビシェ株によって炭素源として
利用されえない高次のオリゴマーからなる。これは、（
１）これらの多糖類がサツカロミセス・セレビシエ菌体
中に入らないこと、および（２）サツカロミセス・セレ
ビシエ株がＭｏｓを菌体外で分解できる酵素（アミラー
ゼまたはグルコアミラーゼ）活性分泌しないことという
事実による。プラスミドＹＥｐ１３で形質転換された全
３個の株はＭｏｗ含有培地上で増殖しないが、プラスミ
ドＰＳＴＡ　２７−１を含有する同じ３つの株ならびに
カンジダ・アルビカンス味７９２−１（米国ナショナル
・インステイテユート・オブ・ヘルス、ジエイ・クオン
ーチャンの好意による）゛はこの培地上でよく増殖する
。この結果は、ＰＳＴＡ　２７−１中でクローンされた
カンジダ・アルビカンスＤＮＡフラグメントはＭｏｓを
利用可能な炭素源へ分解する能力のある酵素をコードす
る遺伝子を有すること、この遺伝子がサツカロミセス・
セレビシエ中で発現されていること、およびその生産物
が培地中に分泌されていることを示している。この形質
転換されたサツカロミセス・セレビシエ宿主によるカン
ジダ・アルビカンス・グルコアミラーゼの発現および分
泌を確認すルタメ、全６個の形質転換サツカロミセス・
セレビシエ株ならびにカンジダ・アルビカンス味７９２
−１の培養培地におけるグルコアミラーゼ活性の存在ヲ
、セアールら、エフ着イー・エム・ニス・マイクロバイ
オロジー・レターズ（５ｅａｒｌｅ　ｅｔａ（、、ＦＥ
ＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ［ｏｇｙ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　
）　ｉｌｌ：２１１〜２１２（１９８１）によって記載
された方法に従ってテストした。その結果、ＹＥｐ１３
で形質転換されたサツカロミセス・セレビシエ株の培養
培地は全く検知できるグルコアミラーゼ活性を入いたが
、カンジダ・アルビカンス味７９２−１およびＰＳＴＡ
　２７−１を含有するサツカロミセス・セレビシエの培
養培地はかなりの僅のグルコアミラーゼを含有していた
。事実、プラスミドｐ、５ＴＡ２７−１を含むサツカロ
ミセス・セレビシエ株はその培養培地中に、カンジダ・
アルビカンス味７９２−１が分泌するよりも１５〜３０
倍ものグルコアミラーゼ活性を分泌したことが判明した
。
ｐｓＴＡ　２７−１で形質転換されたサツカロミセス・
セレビシエ株によって分泌されるグルコアミラーゼ活性
を、つぎのようにしてさらに特徴づけし、カンジダ・ア
ルビカンス味７９２−１により分泌きれる活性と比較し
た。
Ｔａ）　サツカロミセス・セレビシエによって分泌さ−
れる酵素の至適ｐＨが４．５〜６．０の間にあることが
判明した。これはカンジダ・アルビカンスにより分泌さ
れる酵素と同じである。
（ｂ）サツカロミセス・セレビシエ分泌酵素の至適温度
が６０℃であることが判明した。これはカンジダ・アル
ビカンス分泌酵素と同じである。
（ｃ）　ＹＥｐ　１３またはｐｓＴＡ　２７−１のいず
れかで形質転換された前記サツカロミセス・セレビシエ
株ＪＣＣ４−１１をＳＤＳ、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分析した。ＪＣＣ４−１１（ＰＳＴＡ２７−１
）培地には９４キロダルトンより大きい分子量の拡散蛋
白バンドが存在したが、ＪＣＣ４−１１（ＹＥｐ１３）
の培地にはなかった。非常に少量ではあるが、カンジダ
・アルビカンス味７９２−１からの培地中、類似の蛋白
バンドが検出される。− これらの結果゛は、ｐｓＴＡ　２７−１中でクローンさ
れたカンジダ・アルビカンスの７ラグメントがグルコア
ミラーゼをコードするカンジダ・アルビカンス遺伝子を
有し、この遺伝子が酵母サツカロミセス・セレビシエ中
で発現されること、この遺伝子の生産物がサラ□力ロミ
セス・セレビシェ菌体の培養培地中へ分泌されることを
示している。
実施例６ サツカロミセス・セレビシエ中でのカンジダ・アルビカ
ンス遺伝子の発現 Ａ、カンジダ・アルビカンス・ガラクトキナーゼ遺伝子
の単離 カンジダ・アルビカンス・ガラクトキナーゼの単ｂｉｔ
　ヲ、サツカロミセス・セレビシエ株ＪＷＧ２−１１Ｄ
を宿主として用いる以外は実施例１の方法に従って行な
った。Ｌｅｕ　　形質転換体を、ロイシンおよびグルコ
ース以外の全ての必要な補足物および２多ガラクトース
を含有する最小培地（デイフコ酵素窒素ベース）上で平
板培養した。
Ｂ、カンジダ・アルビカンス・ガラクトキナーゼ遺伝子
含有プラスミドの回収 ガラクトキナーゼをコードするカンジダ・アルビカンス
遺伝子含有プラスミドを実施例１の方法によりイー・コ
リ中で回収する。実施例１の方法に従って、各イークリ
形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離した。
Ｃ，カンジダ・アルビカンス・ガラクトキナーゼ遺伝子
を含有するプラスミドによるサツカロミセス・セレビシ
エ株ＪＷＧ２−１１Ｄの形質転換プラスミドＤＮＡを前
記と同様にイー・コリ形質転換体から単離し、実施例１
の方法に従ってサツカロミセス・セレビシエ株ＪＷＧ２
−１１ｏの形質転換に用いた。
Ｄ、形質転換体の選択および形質転換体におけるカンジ
ダ・アルビカンスＤＮＡ存在のｆｆｆ［前記の方法によ
り、カンジダ・アルビカンス・ガラクトキナーゼ遺伝子
を含有するプラスミドで形質転換した宿主サツカロセス
・セレビシェ微生物を、前記と同様に選択し、形質転換
宿主におけるプラスミドの存在を実施例１の方法に従っ
て確Ｊ忍した。ｐｃＡｇａｌ　ｌ　−１およびｐｃＡｇ
ａｌ　１−４と称する２つの独立した単離物をさらに制
限地図で分析し、ｐｃＡｇａｌ　１−１中の７ＫｂＰカ
ンシタ・アルビカンスＤＮＡインサートがｐｃＡｇａｌ
　１−４の１３　Ｋｂｐインサートの内部部分と同じで
あることが判明した。
サツカロミセス・セレビシエ形質転換体におけるガラク
トキナーゼをコードするカンジダ・アルビカンスＤＮＡ
配列の存在は、プラスミドｐＣＡｇａ１１−４を有する
、または有しない株ＪＷＧ２−１１Ｄにおけるガラクト
キナーゼのレベルを測定することによっても決定される
。プツトら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブー？イエンス・オプ・ニー畳ニス・ニ
ー（Ｂｕｔｔｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ−ＵＳＡ　）　
８１　：　３３３２−３３３６（１９８４）の方法によ
って測定される酵素測定は、ｐｃＡｇａｌ　ｌ　−４を
含有するガラクトース導入培地でのみ検知された。
カンジダ・アルビカンス・ガラクトキナーゼ遺伝子のプ
ロモーターは、サツカロミセス・セ芝ビシエ陽性レギュ
レーター、ＧＡＬ−４遺伝子生産物により、つぎのとお
り、陽性に活性化されることが示された。ｐｃＡｇａｌ
　ｌ　−４を含有する株ＪＷＧ２−１１Ｄをプラスミド
ｐＣＤ　２１−４　（サツカロ−ミセス・セレビシェＧ
ＡＬ−４遺伝子を含有する２μｍ　Ｌｅｕ　２シヤトル
・ベクター）含有株ＪＷＧ２−２２Ｂ（α−ｔｒｐｌ−
２８９、Ｉｅｕ　２−３、Ｉｅｕ　２−１１２、ｇａｌ
　ｌ　−１５２、ｕｒａ　３−５２）と交配させた。得
られた二倍体を、ロイシンとトリプトファンの両方を入
く培地上で維持した。ガラクトキナーゼの誘導レベルは
、ＧＡＬ−４遺伝子を発現するプラスミドの存在下、著
しく高くなった。この結果はｐｃＡｇａｌ　１−４中の
カンジダ・アルビカンス配列が、サツカロミセス・セレ
ビシエ調節蛋白の原因となるガラクトース調節プロモー
ターを含有することを示している。
実施例７ サツカロ汁ス・セレビシェにおけるカンジダ・アルビカ
ンス・イソマルターゼ遺伝子の発ＩＪＫ氏カンジダ・ア
ルビカンス・イソマルターゼ遺伝子の単離 イソマルターゼはα−１，６グルコシドＭ　合を開裂し
、それを発現する微生物のα−メチル−〇−グルコピラ
ノシドとして知られる炭素源による増殖を可能にする。
カンジダ・アルビカンス・イソマルターゼ遺伝子の単離
を実施例１の方法に従って行なった。
＋ Ｌｅｕ　　形質転換体を、ロイシン以外の全ての必要な
補足物および２％ａ・−メチル−〇−グルコピラノシド
を含有する最小培地（ディフコ酵母窒素ベース）上で平
板培養した。
Ｂ、カンジダ・アルビカンス・イソマルターゼ、遺伝子
含有プラスミドの回収 イソマルターゼをコードするカンジダ・アルビカンス遺
伝子含有プラスミドを実施例１の方法に従って回収した
。実施例１の方法に従い、各イー・コリ形質転換体から
プラスミドＤＮＡを単離した。
Ｃ，カンジダ・アルビカンス・イ゛ｌマルターゼ遺転子
含有プラスミドによるサツカロミセス・セレビシエ株Ｊ
ＷＧ２−１１Ｄの形質転換−前記と同様にイー・コリ形
質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、実施例１の方
法により、サツカロミセス・セレビシエ株ＪＷＧ２−１
１Ｄの形質転換に用いた。
Ｄ、形質転換体の選択および形質転換体中のカンジダ・
アルビカンスＤＮＡの存在の確認前記の方法により、カ
ンジダ・アルビカンス金イソマルターゼ遺伝子を含有す
るプラスミドで形質転換した宿主サツカロミセス・セレ
ビシエ微生物を前記のごとく選択し、形質転換宿主中の
プラスミドの存在を実施例１の方法により確認した。
実施例８ カンジダ・アルビカンス・レプリケータ−煩域含有組換
型プラスミドによるサツカロミセス・セレビシエの形質
転換 この実施例は、非相同宿主サツカロミセス・セレビシエ
微生物における組換型プラスミドの自律複製ヲ支持する
いくつかのカンジダ・アルビカンス・レプリケータ−領
域の単離を報告する。
Ａ、材料および方法 （１）株および培地 エシェリヒア・コリ味５Ｆ８（Ｃ６００、ＩｅｕＢ、　
　ｔｈｒ、　ｐｒｏ、Ｂ１、ｒｋ−１ｍｋ−１ｒｅｃＢ
Ｃ−１１ｏｐ　ｌ　ｌ、ｊｉｇ＋）　Ｃカメロンら、プ
ロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス・・オブ・ニー・ニス・エイ（Ｃａｍｅ
ｒｏｎｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　、ＵＳＡ）　７２　
：　３４）６〜３４２０　（１９７５））を細菌形質転
換およびプラスミドの増殖に用いた。細菌は必要により
補足したＬＢ（富培地）またはＭ　９　（最小培地）〔
ミラー、「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジ
エネテイツクス」、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−、ニス’　−−Ｅ＋−り（Ｍｉ　ｌ１ｅｒ
　、”　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓＩｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｇｅｎｅ（ｉｃｓ”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｉ−ｈｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ　）　４３１〜４３３　（１９７２））上で増殖さ
せた。サツカロミセス・セレビシエ株４８３（ａ、Ｉｅ
ｕ２−３、Ｉｅｕ　２−１１２、ｈｉｓ４）を酵母形質
転換用の宿主として用いた。酵母培養物を、必要により
、ヒスチジン２μグ／−およびロイシン２４／−で補足
したＹＰＧ（富培地、１％酵母エキス、１％ペプトン、
２％グルコース）またはＹＮＢ（最小培地、ディフコ酵
母窒素ペース）上で増殖させた。
プラスミドＭ８５１（：ゴーマンらモレキュ５−’−ア
ンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（Ｇｏｒｍａｎｅ
ｔ　　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　１８
３　、３０６〜３１３（１９８１））を用いた。カンジ
ダ・アルビカンス株７９２−１をゲノムＤＮＡ源として
用いた・ （２）　Ｄ　Ｎ　Ａ調製 クロラムフェニコールで増幅したＭ９−グルコース増殖
イー・コリ培養から、共有的閉じた環状プラスミドＤＮ
Ａを調製した。ＤＮＡはクリユーウェル、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（Ｃｌｅｗｅｌｌ　、　Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、）ｌ　’１０　：　６６７〜６７６
　（１９７２）により実質的に記載された清澄溶解質技
術によって抽出し、精製した。
酵母形質転換および予備ゲル分析に用いた祖イー・コリ
・プラスミドはバーンポンおよびドリー、ニュークレイ
ツクｅアンズ拳リサーチ（Ｂｉ　ｒｎｂｏｈｍａｎｄ　
Ｄｏｌｙ　、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）
　７　：　１５１３〜１５２３（１９７９）の方法を用
いて調製した。細菌培養物１０ｒｎｌ（２Ｘ１０１０菌
体）は１〜２μノの粗プラスミドＤＮＡを生じた。プラ
スミド存在についての細菌形質転換体の迅速スクリーニ
ングのため、同じ方法で調製した単一コロニー・ミニ溶
解質を用いた。
サツカロミセス・セレビシエからの全ＤＮＡの回収のた
め、前記ジャーマンらの小規模法を用いた・ カンジダ・アルビカンスＤＮＡはリーバイら、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｒｉｇｂｙ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　　）　１１３
　：２３７〜２５１　（１９７７）の方法により調製し
た。
（３）プラスミド構成 全カンジダＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ　Ｉ
で完全に消化した。ＤＮＡを、ドウガイチェクら、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｄｕｇａ
ｉｃｚｙｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、）９６：１７１〜１８４（１９７５）の方法により、
カンジダ・インサートを含有するプラスミドの最大回収
を与えると考えられる濃度でＰｉｔ　Ｉ切断Ｍ８５１プ
ラスミドＤＮＡと混合し、Ｔ４ポリヌクレオチド・リガ
ーゼで結紮した。この結紮混合物を用いてイー・コリ株
ＳＦ８をロイシン・プロトトロフに形質転換した。Ｌｅ
ｕ＋形質転換体を、ついで、アンピシリン感受性につい
てスクリーニングした。カンジダ・インサートを含有す
ると考えられるＡｍｐ　　コロニー（Ｌｅｕ＋形質転換
体の５．８％）を保持した。このハイブリッドをｐＣＡ
の接頭語、そのつぎに単離番号を付して命名した。
（４）ゲル分析およびハ・イブリッド形成操作用いた全
てのゲル分析およびハイブリッド形成操作は前記マニア
チスらの方法によった。
（５）形質転換 ダガートおよびエールリッヒ、ジーン（Ｄａｇｅｒｔａ
ｎｄ　Ｅｈｒｌｉｃｈ　、　Ｇｅｎｅ　）　６　：　２
３〜２８　（Ｉ１７９）の変法によるカルシウム−ヒー
ト・ショック法を用いてイー・コリを形質転換した。酵
母形質転換に用いた操作は、β−グルクロニダーゼース
ルファターゼ（シグマ）ヲスフ二ロプラスト形に用いる
、実質的にベッグス、ネーチャー（Ｂｅｇｇｓ。
Ｎａｔｕｒｅ　）２７５：１０４〜１０９（１９７８）
に記載された方法で、ただし、プラスミドＤＮＡの低濃
度（０，５〜１．０μＦ／１０９　スフ上口プラスト）
を用いた。
Ｂ、結果 （１）プラスミド構成 制限エンドヌクレアーゼＰｉｔ　Ｉで完全に消化された
カンジダＤＮＡを結紮により、Ｍ８５１の独特のＰｓｔ
１部位に挿入した。挿入フラグメントにするａｍｐ　　
遺伝子の中断は薬剤耐性の欠損を生じ、かくして、ａｍ
ｐ５Ｌｅｕｌ”細菌形質転換体をカンジダからの配列（
ｐＣＡと命名）を含有するバーバーリング（ｈａｒｂｏ
ｒｉｎｇ　）・プラスミドとして選択した。
（２）酵母の形質転換 酵母レプリケータ−配列を含有するプラスミドは高頻度
で酵母を形質転換し、真核生物細胞におけるプラスミド
の自律複製を反映している。プラスミドが機能性レプリ
ケータ−を入く場合も形質転換するが、頻度は低い。多
分、この低頻度安定形質転換は相同性組換えによるプラ
スミドｌＣｕ２＋の染色体ＤＮＡへの組み込みを反映し
ている。カンジダ染色体レプリケータ−が酵母中で機能
性で−あると、それらを含有するハイブリッド・プラス
ミドは高頻度の酵母形質転換能力により特徴づけられう
る。
４）個のｐＣＡプラスミドの、１ｅｕ２−サツカロミセ
ス・セレビシエをＬｅｕ＋に形質転換する能力を個々に
テストした。テストした４）個のｐＣＡプラスミドのう
ち５個が高頻度形質転換を示した。これらの結果は、そ
のようなプラスミドがサツカロミセス・セレビシエ中で
自律的に複製できることを示している。
（３）サツカロミセス・セレビシエにおけるプラスミド
ＤＮＡの検出 高頻度形質転換が自律プラスミド複製を可能にするカン
ジダ配列の存在を示す場合、ｐＣＡプラスミドからのＤ
ＮＡで形質転換された不安定なＬｅｕ＋□ 酵母から、共有的に閉じた環状分子の回収が可能となる
。全酵母ＤＮＡを親および形質転換酵母株から抽出し、
１．０％ア、ガロース・ゲル中で電気法　　　　　　、
ケブリツド形成させた。このプローブは酵母染色体　　
　　　ト動させ、ニトロセルロース紙に移した。ついで
、ＤＮＡをＰ３２−ラベルｐＢＲ３２２プ。−ブと２、
イＤＮＡと全く相同性を有しない。形質転換培養物カラ
のＤＮＡをニトロセルローズ会フィルターに移し、Ｐ３
２−ラベルｐＢＲ３２２とノ・イブリッド形成させた。
このプローブとハイブリッド形成するＤＮＡ配列が高頻
度形質転換を与える５個のｐＣＡプラスミドの１つ、な
らびに対照プラスミドｐＹＰ４２（前記ゴーマンら）で
形質転換されたサツカロミセス・セレビシエの抽出物中
に検出された。
（４）酵母プラスミドＤＮＡによるイー・コリの形質転
換 ハイブリッド形成技術により分析された酵母プラスミド
調製物のＩｅｕＢ−イー・コリヲＬｅｕ　　への形質転
換能力も試験した。ロイシン欠失培地上で選択した細菌
コロニーのプラスミド存在について、ミニ溶解質のアガ
ロース・ゲル電気泳動によリスクリーニングした。ハイ
ブリッド形成によりプラスミドの含有が示された５つの
酵母抽出物はプラスミドＤＮＡを含有するＬｅｕ＋イー
・コリを生じた。５個の高頻度形質転換ｐＣＡプラスミ
ドの１個のプラスミドＤＮＡは、サツカロミセス・セレ
ビシエ宿主を介する転移後、イー・コリから単離された
プラスミドに匹敵する。４．　Ｑ　Ｋｂｐカンジダ・ア
ルビカンス・インサートを含有するプラスミドは同じで
あることが判明した。
サツカロミセスの形質転換に用いるプラスミドの自律維
持に有用なカンジダの他のレプリケータ−領域は、カワ
ムラら、ジーン（Ｋａｗａｍｕｒａ　ｅｔａｌ、Ｇｅｎ
ｅ　）２４　：１５７〜１６２（１９８３）、ヒスら、
ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｈｓｕ　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｃｅｒｉｏｌ、）１５４　：　
１０３３〜１０３９　（１９８３）またはチコミロワら
、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツク
ス（Ｔｉｋｈｏｍｉｒｏｖａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１
．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　、）１８９：４７９〜４８５（
１９８３）の方法に従って単離できる。そのようなレプ
リケーター領域を含有するプラスミドはこの実施例で記
載した方法により調製できる。
実施例９ カンジダ・アルビカンス・レプリケータ−およびカンジ
ダ・アルビカンス・フード配列を含有するプラスミドに
よるサツカロミセス・セレビシエの形質転換 カンジダ・アルビカンス・レプリケータ−領域およびカ
ンジダ・アルビカンス・コード配列を含有スルプラスミ
ドは実施例１および８の方法を組合せて調製できる。そ
のようなプラスミドを用い、実施例１の方法により、サ
ツカロミセス・セレビシエを形質転換でき、形質転換サ
ツカロミセス・セレビシエ宿主によるカンジダ・アルビ
カンス・コード配列の発現を実施例１の方法に従って検
知できる。
以上、本発明の好ましい具体例を説明したが、これらに
限定されるものではない。
さらに、本発明は前記実施例に挙げた遺伝子およびプロ
モーターに限定されるものではない。むしろ、本発明は
カンジダ遺伝子発現ユニット、プロモーター、調節領域
および構造遺伝子の位置決めの一般的方法ならびにその
ような機能性ＤＮＡ配列のサツカロミセスにおける発現
の一般的方法一。
を提供するものである。
特肝出頗人　スミスクライン・ベックマン・コーポレイ
ション

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）から由来する機能性
    ＤＮＡ配列を含有することを特徴とするサツカロミセス
    （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の形質転換宿主微生
    物。
  2. （２）該機能性ＤＮＡ配列がカンジダ・アルビカンス（
    Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロ
    ピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、
    カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｔｅｌ
    ｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・シウドトロピカリス（
    Ｃａｎｄｉｄａ　ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）
    、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒ
    ａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンジ（Ｃ
    ａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、カンジ
    ダ・ウテイリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）また
    はカンジダ・クルイシ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｉｓｉ
    ｉ）から由来する前記第（１）項の微生物。
  3. （３）該機能性ＤＮＡ配列がカンジダ・アルビカンスか
    ら由来する前記第（２）項の微生物。
  4. （４）機能性ＤＮＡ配列が完全遺伝子発現ユニット、構
    造遺伝子、プロモーターまたは調節領域からなる前記第
    （１）項の微生物。
  5. （５）機能性ＤＮＡ配列がをｔｒｐ１遺伝子、ｈｉｓ３
    遺伝子、抗真菌剤ベノミルに対する耐性を与える遺伝子
    、ソルビトール炭素源での増殖を可能とする機能性ＤＮ
    Ａ配列、可溶性殿粉での増殖を可能とする機能性ＤＮＡ
    配列、イソマルトースでの増殖を可能とする機能性ＤＮ
    Ａ配列またはガラクトキナーゼ遺伝子から由来する前記
    第（４）項の微生物。
  6. （６）サツカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
    ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属する前記第
    （１）項の微生物。
  7. （７）組換型プラスミドを含み、該プラスミドがレプリ
    ケーター領域およびカンジダから由来する該機能性ＤＮ
    Ａ配列を含む前記第（１）項の微生物。
  8. （８）該レプリケーター領域がサツカロミセスまたはカ
    ンジダから由来する前記第（７）項の微生物。
  9. （９）該組換型プラスミドがサツカロミセス−エシエリ
    ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）・シ
    ャトルベクターである前記第（７）項の微生物。
  10. （１０）シャトルベクターがＹＥｐ１３誘導体である前
    記第（９）項の微生物。
  11. （１１）レプリケーター領域およびカンジダから由来す
    る機能性ＤＮＡ配列からなる組換型プラスミド。
  12. （１２）レプリケーター領域がサツカロミセスまたはカ
    ンジダから由来する前記第（１１）項のプラスミド。
  13. （１３）機能性ＤＮＡ配列がカンジダ・アルビカンス、
    カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ステラトイデア、
    カンジダ・シウドトロピカリス、カンジダ・パラプシロ
    シス、カンジダ・ギリエルモンジ、カンジダ・ウテイリ
    スまたはカンジダ・クルイシから由来する前記第（１１
    ）項のプラスミド。
  14. （１４）機能性ＤＮＡ配列がカンジダ・アルビカンスか
    ら由来する前記第（１３）項のプラスミド。
  15. （１５）機能性ＤＮＡ配列が完全遺伝子発現ユニット、
    構造遺伝子、プロモーターまたは調節領域からなる前記
    第（１１）項のプラスミド。
  16. （１６）機能性ＤＮＡ配列がｔｒｐ１遺伝子、ｈｉｓ３
    遺伝子、抗真菌剤ベノミルに対する耐性を与える遺伝子
    、ソルビトール炭素源での増殖を可能とする遺伝子、グ
    ルコアミラーゼ遺伝子、イソマルターゼ遺伝子またはガ
    ラクトキナーゼ遺伝子から由来する前記第（１５）項の
    プラスミド。
  17. （１７）サツカロミセス−エシエリヒア・コリ−シャト
    ルベクターである前記第（１１）項の遺伝子。
  18. （１８）シャトルベクターがＹＥｐ１３誘導体である前
    記第（１７）項のプラスミド。
  19. （１９）サツカロミセス属の宿主微生物をカンジダから
    由来する機能性ＤＮＡ配列で形質転換し、該機能性ＤＮ
    Ａ配列が発現される適当な条件下、形質転換宿主を培養
    することを特徴とする該機能性ＤＮＡ配列の発現方法。
  20. （２０）機能性ＤＮＡがカンジダ・アルビカンス、カン
    ジダ・トロピカリス、カンジダ・ステラトイデア、カン
    ジダ・シウドトロピカリス、カンジダ・パラプシロシス
    、カンジダ・ギリエルモンジ、カンジダ・ウテイリスま
    たはカンジダ・クルイシから由来する前記第（１９）項
    の方法。
  21. （２１）機能性ＤＮＡ配列がカンジダ・アルビカンスか
    ら由来する前記第（２０）項の方法。
  22. （２２）機能性ＤＮＡ配列が完全遺伝子発現ユニット、
    構造遺伝子、プロモーターまたは調節領域からなる前記
    第（１９）項の方法。
  23. （２３）機能性ＤＮＡ配列がｔｒｐ１遺伝子、ｈｉｓ３
    遺伝子、抗真菌剤ベノミルに対する耐性を与える遺伝子
    、ソルビトール炭素源で増殖を可能にする遺伝子、グル
    コアミラーゼ遺伝子、イソマルターゼ遺伝子またはガラ
    クトキナーゼ遺伝子から由来する前記第（２２）項の方
    法。
  24. （２４）宿主微生物がサツカロミセス・セレビシエ種に
    属する前記第（１９）項の方法。
  25. （２５）さらに、レプリケーター領域およびカンジダか
    ら由来した機能性ＤＮＡ配列からなる組換型プラスミド
    で形質転換を行なう前記第（１９）項の方法。
  26. （２６）レプリケーター領域がサツカロミセスまたはカ
    ンジダ由来である前記第（２５）項の方法。
  27. （２７）組換型プラスミドがサツカロミセス−エシエリ
    ヒア−コリ・シャトルベクターである前記第（２５）項
    の方法。
  28. （２８）シャトルベクターがＹＥｐ１３誘導体である前
    記第（２７）項の方法。
  29. （２９）（ａ）公知の機能を欠損しているサツカロミセ
    ス属の宿主微生物をカンジダから由来するＤＮＡ配列で
    形質転換して、該カンジダＤＮＡが宿主微生物のＤＮＡ
    を相補できるようにし、 （ｂ）形質転換宿主微生物中での該機能の存在を検定す
    ることを特徴とするカンジダ由来のＤＮＡ配列をその機
    能で特徴づける方法。
  30. （３０）ポリペプチドをコードする構造遺伝子に対し、
    位相を一致させ、適正な方向で直接または間接的に融合
    したカンジダ由来のプロモーターを含有するサツカロミ
    セス属の形質転換宿主微生物を培養することを特徴とす
    るサツカロミセスにおけるポリペプチドの製造方法。
JP60193014A 1984-08-31 1985-08-30 組換型サツカロミセス Pending JPS6170981A (ja)

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