JP2543497B2 - 蛋白質生成物の製造方法 - Google Patents

蛋白質生成物の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 組換えDNA技術による有用なポリペプチド生成物の製
造のために微生物を用いることは、産業として確立され
つつある。異種の遺伝子物質を微生物培養物に導入する
ことができ、適当な細胞内及び細胞外条件を与えてやる
と望む蛋白質生成物が異種遺伝子から合成されうる。こ
のような遺伝子物質は一般にプラスミドの形で微生物に
導入され、これは染色体外遺伝要素を自律的に複製す
る。形質転換された細胞培養物内でプラスミドを維持す
ることを保証するために、これら細胞を特別の条件下で
生育することが必要であった。このような条件がない
と、本質的に不安定であるプラスミドは維持されず、細
胞集団は非形質転換状態に戻るであろう。
プラスミドの安定性の増大及びコピー数の増大は、常
に高いレベルにプラスミドがコードする蛋白質の製造を
維持する手段として生物工学にとって重要である。プラ
スミド安定性を増すための従来報告された試みは、実際
の適用のために最適ではないようである。ARS保持プラ
スミドへの酵母動原体（セントロメア）の導入は、安定
性を高めるが、プラスミドコピー数をかなり減少するこ
とが判った（クラーケ（Clarke）及びカーボン（Carbo
n）、ネィチア（Nature）、287:504−509、1980、及び
スティンクコム（Stinchcomb）ら、ジェイ、モレキュラ
ーバイオロジー（J.Molec.Biol.）、158:157−179、198
2）。線形の動原体酵母プラスミドは同様に、安定性と
コピー数の逆相関を示す（マレイ（Murray）及びスゾス
タク（Szostak）、ネイチア（Nature）、305:189−19
3、1983）。
プラスミドは典型的には、選択しうるマーカーとして
遺伝配列を含み、これは抗性物質抵抗性をコードするか
又は宿主細胞の栄養的要件を補う。プラスミドの存在に
ついて選択するために、形質転換細胞は、選択薬剤を含
む又は特定の栄養素を除いた特別の培養基中で生育され
なければならない。これら培養基の要件あ高価でありか
つ大規模醗酵プロセスの間の最適細胞生長速度を妨げ
る。このようなプラスミドの多くは、文献で報告されて
いる。抗生物質抵抗遺伝子を含むものとしては、pBR322
（ボリバー（Bolivar）ら、ジーン（Gene）、２:95−11
3、1977）及びその誘導体たとえばpUCベクター（ビエイ
ラ（Vieira）及びメシング（Messing）、ジーン（Gen
e）19:259−268、1982）（アンピシリン抵抗のための遺
伝子を持つ）；及びpBR325（プレントキイ（Prentki）
ら、ジーン（Gene）、14:289、1981）（アンピシリン、
テトラサイクリン、及びクロラムフェニコールに対する
抵抗遺伝子を持つ）が挙げられる。宿主の栄養的要件を
補うプラスミドとしては酵母ベクターYEp13（ブローチ
（Broach）ら、ジーン（Gene）、８:121−133、1979）
（これはLEU2遺伝子を持つ）；及びYRp7′（スティンク
コム（Stinchcomb）ら、ネイチア（Nature）、282:39、
1979）（これはTRP1遺伝子を持つ）が挙げられる。
従って本発明の目的は、選択しうるマーカーとして、
その生成物が複合培養基上での宿主細胞の生育性又は正
常生育のために必須であるところの遺伝子配列を含むDN
A構成物を提供することである。
本発明の別の目的は、複合培養基上での生育により選
択しうるプラスミドを含む微生物の形質転換体株を提供
することである。
本発明のさらに別の目的は、本質的機能において欠陥
を持ち、この欠陥的本質的機能を補う遺伝子配列を持つ
DNA構成物のための宿主として行動しうる微生物の株を
提供することである。
本発明の別の目的は、形質転換した微生物において異
種蛋白質を作る方法において、蛋白質が宿主微生物にお
ける必須遺伝子の欠陥を補う遺伝子配列を選択マーカー
として含むDNA構成物上に含まれる遺伝子の生成物であ
るところの方法を提供することである。
本発明の他の目的は当業者にとって明らかとなろう。
〔発明の構成〕
本発明に従い、DNA構成物が特別に選ばれた培養基を
必要とせずに高いコピー数で維持されるところのDNA構
成物及び適当な宿主細胞が提供される。そのような条件
における生育は、より速い細胞分裂、より多きな細胞密
度及び低減された生産コストをもたらすであろう。
本発明はさらに、複合培養基中での正常細胞生育に必
要な機能に欠陥を持つ宿主細胞において蛋白質生成物を
作る方法において、この欠陥を補う遺伝子及び蛋白質生
成物をコードする配列を含むDNA分子で宿主細胞を形質
転換する段階を含む方法を提供する。本方法はまた、DN
A構成物、とくにプラスミド、及びこれら構成物を含む
形質転換体株を提供する。
本明細書においてDNA構成物という言葉は、分子内の
ヌクレオチド配列が自然に作られる配列と同じでないよ
うな様式で人工的に変性された任意のDNA分子を意味す
る。DNA構成物という言葉はまた、そのように変性され
たDNA分子のクローンをも包含する。発現ベクターとい
う言葉は、複製の自律的部位、転写開始部位、及び宿主
生物中で発現されるべき蛋白質をコードする少なくとも
一つの構成遺伝子を含むDNA構成物として定義される。
発現ベクターは通常また、宿主生物中での蛋白質の発
現を制御するプロモーター及びターミネーターのような
適当な制御領域を含むであろう。本発明に従う発現ベク
ターはまた、本明細書で述べる必須遺伝子を含む選択マ
ーカーを含むであろう。
プラスミドという言葉は、その一般に認められている
意味を持つ、すなわち自律的に複製うる通常閉じたルー
プのDNAを意味する。
添付した図面において第１図はプラスミドpB4の構成
を示す。
第２図はプラスミドpB5の構成を示す。
第３図はプラスミドpB15Lの構成を示す。
第４図は、プラスミドpB5及びpB15Lで共形質転換され
たS.セレビシエ（cerevisiae）株A2.7.cからDNAのサザ
ンブロットを示す。このブロットは、ゲノムCDC4遺伝子
座の破壊をテストするためにCDC4の５′フランキング
（flanking）領域からの2.5kb Bam H I−Hind IIIフラ
グメントでプローブされた。レーンａは、pB5のみで形
質転換された細胞からのDNAを含む；レーンｂは非形質
転換細胞、レーンｃ〜ｈは共形質転換体からのDNAを含
む。矢印はプローブにハイブリダイゼーションするゲノ
ムフラグメントを示す。
第５図は、S.ポンベ（pombe）POT1及びS.セレビシエ
（cerevisiae）TPI1遺伝子の配列ならびに各々の推定さ
れた蛋白質配列を示す。全S.ポンベTPI蛋白質配列が示
されている。S.セレビシエ蛋白質の配列は、それがS.ポ
ンベ配列と異なる場所のみ示される。S.セレビシエ蛋白
質配列における位置１のメチオニンは成熟蛋白質には存
在しない。
第６図はプラスミドpCPOTの構成を示す。
第７図はプラスミドpFATPOTの構成を示す。
第８図はプラスミドpTPI−LEU2の構成を示す。
第９図はプラスミドpIC19Rのポリリンが配列の一部を
示す。
第10図はプラスミドpMPOT2を示す。
本発明は、必須遺伝子がプラスミドのようなDNA構成
物上で選択マーカーとして用いられうるという発見に部
分的に基づく。必須遺伝子という言葉は、複合培養基上
での細胞生育性又は正常生育のために必要な機能をコー
ドする任意の遺伝子と定義される。複合培養基は、その
組成が良く定義されない物質から栄養素が導かれた培養
基、たとえば粗細胞抽出物、肉抽出物、フルーツジュー
ス、血清、蛋白質加水分解物などである。従って本発明
に従う望む形質転換体を選別するために、選別生育培養
基は、単に慣用の複合生育培養基であり、比較的高価な
抗生物質、金属拮抗剤、又は非形質転換宿主細胞に致命
的な他の剤を含む、又は非形質転換宿主に必要な一又は
二以上の特定の栄養素を欠く特別の培養基ではない。必
須遺伝子としては、細胞分裂、膜生合成、細胞壁生合
成、細胞小器官生合成、蛋白質合成、炭素源利用、RNA
転写及びDNA複製のための遺伝子が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。
プラスミドのようなDNA構成物上の選択しうるマーカ
ーとして必須遺伝子を用いるために、適当な突然変異宿
主細胞株を用意することが必要である。ロススティン
（Rothstein）、メス．インエンツィモロジイ（Meth.in
Enzymology）、101:202−210、1983、の一段階遺伝子
破壊（disruptiono）法又は本明細書で記載する共形質
転換法を用いて、ゲノム中で適当な必須遺伝子を欠く適
当な宿主株が構成されうる。そのような欠除突然変異体
は、突然変異がプラスミド担持遺伝子物質でコードされ
る機能により補われるとき生育する。宿主のゲノムの必
須遺伝子（単数又は複数）の欠除がコード領域及び／又
はフランキング（flanking）領域の実質的セグメントを
含むことが好ましい。もし必須遺伝子における突然変異
（単数又は複数）が単に点突然変異を達成する様式で行
われるなら、突然変異宿主細胞が組換修復メカニズムに
より野生型に先祖返りし、それによりプラスミド担持遺
伝子の使用により達成できる選択性を低減する又は除去
することが起りうる。必須遺伝子はしばしば複数のコピ
ー（multiplecopies）中に（たとえばヒストン又はリボ
ソームRNA遺伝子）及び／又は複数の関連した遺伝子群
と呼ばれる形（たとえば種々のヘキソキナーゼ遺伝子、
又は種々のDNAポリメラーゼ遺伝子）で存在する。その
ような場合、これら冗長な機能は配列的に突然変異され
て、所定の必須機能を多重的に欠く宿主細胞を作るかも
知れない。しかし遺伝子の活動的を増すために高コピー
数プラスミドを用いることにより、プラスミド上の単一
の必須遺伝子が複数の宿主細胞欠陥を補いうる。高コピ
ー数プラスミドは、クローニングされた異種遺伝子のコ
ピー数の増加が該遺伝子でコードされる蛋白質生成物の
生産を増すので望ましい。
必須遺伝子を持つプラスミドの高いコピー数を含む形
質転換体の選択は、各プラスミド担持必須遺伝子の発現
レベルを下げることにより及び／又はプラスミド担持選
択マーカーによりコードされる遺伝子生産物の活動性を
下げることにより達成されうる。一つのアプローチは、
必須遺伝子を突然変異させて、遺伝子の転写及び／又は
翻訳速度を下げる又は遺伝子生成物をより低い特定の活
動性を持つように変えることである。選択マーカーとし
て用いられる必須遺伝子の発現レベルを低減させる別の
方法は、宿主細胞における欠陥を補うために別の生物か
らの遺伝子を用いることである。そのような異種遺伝子
は、転写及び／又は翻訳のためのシグナルが異なる種に
おいて最適より下げあるので宿主細胞における発現につ
いて突然に欠陥的であるか、又は遺伝子生成物はそれが
異種細胞環境中にあるので活動性を低減させる。
複合培養基上での細胞生育性又は正常生育に必要な幅
広い範囲の機能が存在する。必須遺伝子の欠陥又は欠除
は、致死、細胞分裂速度の減少、細胞分裂の停止、DN
A、RNA又は蛋白合成の停止、膜合成の停止、細胞壁合成
の停止、細胞小器官合成の停止、糖代謝の欠陥などをも
たらす。必須遺伝子の例としては、酵母サッカロミセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のCDC（細胞
分裂サイクル）遺伝子（総説としてプリングル・アンド
・ハートウェル（Pringle and Hartwell）、ザ・サッカ
ロミセス・セレビシエ・セル・サイクル（The Saccharo
myces cerevisiae Cell Cycle）、ストラサーン（Strat
hern）ら編、ザ・モレキュラー・バイオロジイ・オブ・
ザ・イースト・サッカロミセス・ライフ・サイクル・ア
ンド・インヘリタンス（The Molecular Biology of tho
Yeast Saccharomyces Life Cycle and Inheritanc
e）、97−142、コールド・スプリング・ハーバー（Cold
Spring Harbor）、1981）、S.セレビシエ及びE.コリ
（coli）解糖経路の機能をコードする遺伝子、及びS.セ
レビシエのSEC（ノビック（Novick）とセックマン（Sch
ekman）、プロク．ナト．アカド．サイ．ユーエスエー
（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）、76:1856−1862、1979、及
びノビックら、セル（Cell）、21:205−215、1980）、
及びINO（カルバートソン（Culbertson）とヘンリー（H
enry）、ジェネティックス（Genetics）、80:23−40、1
975）遺伝子が挙げられる。
必須遺伝子欠陥宿主細胞の一つの好ましい類は、cdc
突然変異として知られるCDC遺伝子の欠陥を含み、これ
は細胞分裂サイクルの段階特異的阻止をもたらす。多く
のcdc突然変異は、特定のCDC遺伝子生成物の合成又は機
能に影響することによって細胞サイクルに必須の事象の
完全な妨害を生む。そのような突然変異は、生化学的に
又は形態学的にモニターできる事象へその作用により同
定できる。最も知られたcdc突然変異は条件により致命
的な（すなわち温度感受性の）突然変異であり、これは
制限的条件下で生育する突然変異細胞の正常発展の停止
をもたらす。しかしcdc突然変異からの主な欠陥は、段
階特異的機能における欠陥自体である必要はない。たと
えば連続的に合成された遺伝子生成物は、段階特異的機
能をもちうる；酵母解糖遺伝子PYK1における（酵母ピル
ビン酸キナーゼに対する）欠陥は、細胞分裂サイクル突
然変異cdc19に対立的である（カワサキ、博士論文、ワ
シントン大学、1979）。この突然変異は、典型的酵母複
合培養基YEPD（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン及
び２％デキストロース）に接種された細胞のG1フェーズ
での細胞サイクル阻止をもたらす。すなわちcdc突然変
異が段階特異的機能における欠陥をもたらすかどうか又
はそれが段階特異的機能を持つ遺伝子生成物の抑制又は
不能化突然変異を起すかどうかに拘らず、欠陥の影響は
モニターされうる。
プリングルとハートウェル（前出）は、ある51のCDC
遺伝子の機能を記述している。本発明の実施に用いるた
めにそのような遺伝子は、望む突然変異を持つ株におけ
る補足性（complementation）により遺伝子ライブラリ
イから単離できる。遺伝子ライブラリイは、一般に知ら
れた方法で構成できる（たとえばナスミス（Nasmyth）
とリード（Reed）、Proc.Natl.Acad.sci.USA、77:2119
−2123、1980;及びナスミスとタトシェル（Tatchel
l）、セル（Cellf、19:753−764、1980）。望むcdc突然
変異を持つ株はここで記述するように作ることができ、
又は一般に入手できる寄託機関たとえばアメリカン・タ
イプ・カルチア・コレクション・アンド・ザ・バークレ
イ・イースト・ストック・センターから得られる。
必須遺伝子の第二の好ましい類は、解糖経路に関与す
る生成物をコードするもの、たとえば代謝酵素及び調節
機能をコードする遺伝子である。同定されているS.セレ
ビシエにおける解糖経路遺伝子の例は、解糖調節遺伝子
GCR1及び酵素トリオースホスファートイソメラーゼ、ヘ
キソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、ホスホグルコース
イソメラーゼ、ホスホグリセラートキナーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、エノラーゼ、フルクトース１、６−ビ
スホスファートデヒドロゲナーゼ、及びグリセルアルデ
ヒド３−ホスファートデヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子である。上述したように、ピルビン酸キナーゼ遺伝
子は、カワサキにより同定され記述されている。酵母ホ
スホグリセラートキナーゼ遺伝子を含みかつ調節シグナ
ルを伴うプラスミドは、ヒッツェマン（Hitzeman）ら
（ジェイ・バイオロ・ケミ（J.Biol.Chem.）、225:1207
3−12080、1980）により記述された。酵母トリオースホ
スファートイソメラーゼ遺伝子TPI1の単離及び配列化
は、アルバー（Alber）とカワサキ（ジェイ・モル・ア
プル・ジェネト（J.Mol.Appl.Genet.）、１:419−434、
1982）及びカワサキとフレンケル（Fraenkel）（バイオ
ケム・バイオフィズ・リス・コム（Biochem.Biophys.Re
s.Comm.）、108:1107−1112、1982）により記述されて
いる。
特に好ましい解糖遺伝子はTPI1であり、これは、グリ
セルアルデヒド−３ホスファートとジヒドロキシアセト
ン−３−ホスファートの相互転化を触媒し、従って解糖
及び糖新生のために必須の酵素である酵母トリオースホ
スファートイソメラーゼをコードする。S.セレビシエに
おいて、単一の遺伝子座TPI1がこの機能をコードする。
TPI1における突然変異を持つ細胞は、グルコースで生育
せず、他の炭素源で少ししか生育しない。
S.セレビシエTPI1遺伝子は、tpi1突然変異の補足性に
より単離された（アルバーとカワサキ、前出、及びカワ
サキとフレンケル、前出）。分裂酵母シゾサッカロミセ
スポンベ（POT1）からのトリオースホスファートイソメ
ラーゼ遺伝子は、同じS.セレビシエ突然変異の補足性に
より単離され、第５図に示すように配列化された。S.ポ
ンベ遺伝子（POT1と記される）の配列化は、S.ポンベTP
I蛋白質がS.セレビシエのTPI蛋白質と相同であることを
示した。
通常の場合ではDNA構成物（プラスミド）で用いられ
る必須遺伝子は宿主種からの野生型遺伝子であろうが、
ある場合では宿主細胞にとって異種（外来）の必須遺伝
子を用いることが好ましいであろう。なぜなら、異種遺
伝子は当然に欠陥的であり、それにより、高プラスミド
コピー数に対して選択しうるからである。用いられるそ
のような異種必須遺伝子の例とし、本明細書の実施例の
１つは、S.ポンベPOT1遺伝子が、S.セレビシエ宿主にお
いて選択マーカーとして有効に用いられることを示す。
選択マーカーとして必須遺伝子を含む本発明に従うDN
A構成物は、必須遺伝子の機能に欠陥を持つ突然変異宿
主細胞内に形質転換されるであろう。適当に突然変異さ
れた宿主細胞が調製されなければならず、又は公共寄託
機関から容易に入手できる。適当な突然変異体を得るた
めの野生型細胞の突然変異は、慣用の手順に従い達成で
きる。たとえば野生型細胞を、慣用の突然変異化剤たと
えばエタンメチルスルホネートで処理し、補足性が起る
群を同定するために、必須遺伝子を含むプラスミドで形
質転換することができる。あるいはゲノムを破壊して特
定の突然変異を作ることができる（ロススティン（Roth
stein）、前出）。
宿主細胞における必須遺伝子を含むプラスミドの安定
性は、宿主細胞における相同の必須遺伝子配列の不存在
に依存しうる。宿主における遺伝的欠陥は、プラスミド
が維持されることを保証する。なぜなら、宿主細胞の生
育は、必須遺伝子機能の欠損により起らない又は厳しく
制限されるであろうからである。また、プラスミドの完
全さ自体は、プラスミド担持必須遺伝子と宿主ゲノムに
おける対応する座の間の相同性の不存在に依存しうる。
なぜなら、プラスミドとゲノム遺伝子座の間の組換が、
突然変異とプラスミドの両者の細胞を治ゆするかも知れ
ないからである。従って、ゲノム必須遺伝子を不活性に
する宿主細胞ゲノムにおける突然変異が実質的性質であ
る、すなわち欠除が染色体遺伝子のコーディング部分及
び／又はフランキング領域のDNA配列から成ることが好
ましい。これが達成されれば、組換えによる遺伝子突然
変異の治ゆが起る可能性は少なくなる。
本発明のプラスミドは、適当な突然変異宿主細胞中に
維持されると、予期せざるほど安定である。好ましい宿
主細胞は酵母である。しかし他の真核細胞ならびに原核
細胞も用いうる。酵母細胞の場合、本発明のプラスミド
の安定性は、動原体を含む酵母プラスミドの安定性を越
えさえするようである。環状動原体プラスミドは、酵母
について従来報告された最も安定なプラスミドの一つで
あるが、極端に低いコピー数が欠点である（クラーケ
（Clarke）とカーボン（Carbon）、前出、及びスティン
クコムら、1982、前出）。線形動原体酵母プラスミド
は、プラスミド長に依存して不安定であるか又は低コビ
ー数で存在する（マレイ（Murray）とスゾスタク（Szos
tak）、前出）。従って、必須遺伝子を担持するプラス
ミドの安定性の改善が達成されることは、予期せざる利
点である。
POT1及びCDC4遺伝子は、発現ベクター上の選択マーカ
ーとしての必須遺伝子の使用の二つの例である。この二
つの遺伝子は、複合培養基における細胞増殖のために必
要な幅広い種類の遺伝子に属する。他の必須遺伝子の使
用は、複雑な生育条件を含む植物又は動物組織培養にお
けるプラスミド選択を可能とし、また極端なばあいには
血、血清又は生きている動物又は植物の液汁から栄養を
受ける細胞におけプラスミドの維持を可能とすることが
ある。
本明細書で述べるプラスミドを用いた実験から得られ
たデータは、ヒトα−１−抗トリプシン（AT）生産が選
択マーカーとしてS.ポンベPOT1遺伝子の使用により、従
来の栄養要求型選択マーカーLEU2を持つ類似のプラスミ
ドで得られるAT生産と比べて二倍にされることを示す。
この結果は、POT1含有プラスミドが、これが誘導された
ものとの非POT1プラスミドよりもコピー数において機能
的に大きいことを示す。
サル肉種ウイルスｕ−sis遺伝子の発現から得られた
データは、POT1含有プラスミドを用いると、YEp13誘導
ベクターで得られた結果に比べて発現レベルにおいて約
５〜８倍の増加を示す。
本発明に従うDNA構成物すなわちとくにプラスミドを
つくるために用いられる手法は、慣用の方法を含む。DN
A構成物において用いられるべき必須遺伝子は、もし遺
伝子構造が知られているなら識別したDNAプローベを用
いてライブラリイから単離でき、又は慣用のベクターに
DNAライブラリイのセグメントを結合（リゲート）し、
このベクターを特定の必須遺伝子の欠陥を突然変異細胞
に形質転換し、そして補足された群を探すことにより同
定できる。一度、必須遺伝子を含む適当なDNAフラグメ
ントが同定されると、それは発現されるであろう構造的
蛋白質をコードするDNA配列を含むベクターに結合され
るであろう。
必須遺伝子は、宿主生物内における発現に必要なそれ
自体のプロモーター及び他の制御体と共に用いうる、あ
るいは異質プロモーターを必須遺伝子の発現を増大又は
減少するために用いることができる。
DNAフラグメントの結合の方法は、豊富に記述されて
おり、当業者が容易に実施できる。発現されるべき蛋白
質のDNAコード配列は本質的に、任意の蛋白質とくに産
業的に重要な蛋白質たとえばインターフェロン、インス
リン、プロインスリン、α−１−抗トリプシン、及び組
織プラスミノ−ゲンアクチベーターのものであることが
できる。
DNA構成物の調製後に、それは形質転換条件下で宿主
生物中に形質転換されるであろう。原核細胞及び真核細
胞（組織培養細胞を含む）を形質転換する方法は文献で
知られている。
上述したように、宿主生物は、プラスミド上の必須遺
伝子の選択のために本質的機能の欠陥を持たねばならな
い。突然変異宿主株は通常の寄託機関から入手でき、又
は野生型から突然変異生成による慣用の手段及び適当な
当然変異を持つ突然変異体のスクリーニングによって作
られる。
形質転換された宿主は次に、慣用の複合培養基での生
育により選択できる。酵母の場合、YEPD（１％酵母抽出
物、２％バクトペプトン及び２％デキストロース）のよ
うな慣用の培養基を用いうる。本発明に従う必須遺伝子
を含む選択しうるマーカーは、何らかのDNA構成物にお
いて適当である場合には常にマーカーとして使用でき
る。すすなわち、本発明に従う必須遺伝子選択マーカー
を含む構成物は多くの用途を持つ。以下の実施例は、そ
のような用途の例示を与えるものであって、本発明に限
定するものではない。
特記なき限り、標準的な分子生物学手法が用いられ
た。酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Beth
esda Research Laboratories）、ニューイングランド・
バイオラブズ（New England Biolbs）、及びボーリンガ
ー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehringer Mannh
eim Biochemicals）から得られ、製造者から指示された
ように又はマニアチス（Maniatis）ら（モレキューラー
・クローニング（Molecular Cloning）：ラボラトリイ
・マニュアル・コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリイ（Cold Spring Harber Laboratory）1982）の
記述のように用いられた。E.コリ（coli.）株は、マニ
アチスら（前出）の開示のように塩化カルシウム法によ
り形質転換された。酵母培養物は、ベッグズ（Beggs）
（ネイチア（Nature）、275:104−108、1978）の方法を
後記のような変更を加えて用いて形質転換された。
実施例１ 選択マーカーとしてのS.セレビシエCDC4遺伝子 A.安定なCDC4含有プラスミドの構築 酵母DNAのSau3Aによる部分的消化、蔗糖勾配でのサイ
ズ選択、及びBamH Iにより消化された酵母ベクターYPp7
への選択されたフラグメントの挿入により、酵母ゲノム
ライブラリイが構成された（ナスミス（Nasmyth）とリ
ード（Reed）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77:2119−212
3、1980）。
CDC4遺伝子を含む組換プラスミドは、酵母株GEB5（MA
Ta cdc4−４ len2 trp1 lys1 ural）及びGEB7（MA
Ta cdc4−３ len2 trp1 ilys1）の上記ライブラリ
イでの形質転換により単離された。これら株は、高頻度
で形質転換することが知られている株（K7〔MATa len2
trp1〕（ナスミスら、ネイチア、289:244−250、198
1;タトシェル（Tatchell）ら、セル、27:25−35、198
1）との交配及び続いて高形質転換性株（K79及びK80〔M
ATa 1en2 trp1 lys1〕）への戻し交配により望む遺
伝子的バックグランド（len2 trp1）で、cdc4−３及び
cdc4−４突然変異を得ることにより、A364Acdc−４−３
及びA364Acdc4−４（ハートウェル（Hartwell）ら、ジ
ェネティクス（Genetics）、74:267−286、1973）から
誘導された。トリプトファン原栄養性及び制限的温度
（37゜）での生育能力についての形質転換体の選択は、
ゲノムに組込まれCDC4遺伝子座にマップされることを示
されたプラスミドの一つ（pJY35と記される）を同定し
た。自発的プラスミド組込体（integrants）は、その選
択的生育有利性に基いて固定された。この生育有利性
は、高コピー数で存在するとき（すなわちプラスミドが
宿主ゲノムに組込まれてないとき）細胞生育に有害なCD
C4結合遺伝子の元のプラスミド上での存在による。組込
体において、TRP1プラスミドマーカーは、染色体VI（モ
ルチマー（Mortimer）とシルド（Schild）、“ジェネテ
ィク・マップ・オブ サッカロミセス・セレビシエ（Ge
netic Map of Saccharomyces cerevisiae）”ストラサ
ーン（Strathern）ら編、ザ・モレキュラー・バイオロ
ジイ・オブ・ザ・イースト・サッカロミセス・セレビシ
エ・ライフ・サイクル・アンド・インヘリタンス（The
Malecular Biologyof the Yeast Saccharomyces cerevi
siae Life Cycle and Inheritance）、コールド・スプ
リング・ハーバー、1981）上のCDC4に結合されているSU
P11に遺伝子的に結合されることが示された。cdc4−３
相補（complementing）領域は、pJY35から6.4kb BamH I
フラグメントとして精製され、T4 DNAリガーゼを用い
て、BamH Iで解裂されたベクターYRp7（ストルール（st
ruhl）ら、Proc.Natl.Acad.Sic.USA、76:1035−1039、1
979）に結合された。この構成物はpJY51として知られ、
第１図に示されている。
第１図において、CDC4コード領域は、下記の方法でフ
ランキングゲノムDNA配列から分けて精製された。プラ
スミドpJY51がHind IIIにより解裂され、CDC4領域を含
む3.6kbフラグメントがバクテリアプラスミドpBR322に
おいてサブクローニングされた。この構成物はBamH Iで
完全に消化され、Hinc IIで部分的に消化され、そして
約2.3kbCDC4含有フラグメントが精製された。Hinc IIフ
ラグメント末端はリンカー配列（配列:5′CCGGATCC GG
3′）（コラボレイティブ・リサーチ（Collaborative R
esearch）から入手）の付加及び過剰のリンカーの除去
のためにBamH Iでの続く消化によりBam H I末端に転化
された。CDC4遺伝子の約1.9kbを含む得たフラグメント
はYRp7のBam H I部位に挿入してプラスミドpJY70を作っ
た。このプラスミドは、上述したようにcdc4−３突然変
異を補うことが示された。1.9kbフラグメントはCDC4遺
伝子の５′コード領域及び３′コード領域の両者の小さ
な部分を欠くが、それは驚くべきことに温度感受性欠陥
を補う。たぶんCDC4配列の転写及び翻訳がプラスミドの
pBR322領域に位置する配列により制御されて、機能的遺
伝子生成物の生産を可能にするであろう。
プラスミドpJY70は、酵母TRP1及びARS1配列を除去す
るためにEco R Iで解裂し、そして再結合して、pBR322
及びCDC4配列を含むハイブリッドプラスミドを得た。こ
のプラスミドは、pJY71として知られ、第１図に示され
ている。
1.9kb酵母配列は、Bam H I−Hind IIIフラグメントと
してpJY71から精製された。このフラグメントは、Bam H
IとHind IIIでの消化により線状化されたpBR322に結合
されて、プラスミドpB4を与えた。これは第１図に示さ
れている。
CDC4領域は、高コピー数酵母ベクターに挿入のために
pB4から再単離された。そのようなベクターは、酵母２
μプラスミドの精製のオリジン及び興味ある異種遺伝子
のためのクローニング部位として働くであろう一又は二
以上の制限酵素解裂部位を含むであろう。好ましくはそ
のような部位は、プラスミド上のユニーク部位であろ
う。好ましいベクターはMW5であり、これは２μプラス
ミド複製オリジン、及びユニークEco R I及びBam H Iク
ローニング部位を含む。第２図において、プラスミドMW
5は、分子当り二つのEco R I部位の平均として一つを解
裂するためにEco R Iでの部分的消化によりプラスミドY
Rp7′（スティンクコム（Stinchcomb）ら、ネイチア、2
82:39−43、1979）から誘導された。線状分子の得られ
た非対末端は、DNAポリメラーゼ（クレノウ（Klenow）
フラグメント）を用いてふさがれ、得られた対合二本鎖
末端（プラント末端）はT4DNAリガーゼを用いて再結合
された。ARS1配列近傍にEco R I部位を保持する得られ
たプラスミドが次に選別された。ARS1配列はPst I及びE
co R Iでの消化により除かれ、酵母２μDNAの複製オリ
ジンを含むプラスミドYEp13（ブローチ（Broach）ら、
ジーン（Gene）、８:121−133、1979）のPst I−Eco R
Iフラグメントで置換えられた。得られたプラスミド（M
W5と記される）は第２図に示されている。
最終的なCDC4を含有する安定なプラスミドを構築する
ためにMW5をEco R IとBam H Iで解裂した。CDC4フラグ
メントは、プラスミドをBam H IとEco R Iで消化するこ
とによりプラスミドpB4から精製された。T4DNAリガーゼ
を用いて二つのフラグメントを結合し、そのようにして
作ったキメラ分子をE.coli株RRI（ナスミスとリード、
上述内に形質転換し、アンピシリン抵抗性、テトラサイ
クリン感受性のコロニーを選択した。そのようなコロニ
ーの一つから単離したプラスミドpB5（第２図に示す）
は、酵母２μ複製オリジン、pBR322プラスミド配列、選
択マーカーTRP1、酵母CDC4コード配列の1.9kb、及びユ
ニークEco R Iクローニング部位を含む。
B.宿主CDC4遺伝子の破壊のためのプラスミドの構築 本発明に従うCDC4含有プラスミドの、形質転換された
宿主における安定性は、宿主における機能的CDC4遺伝子
の欠乏に依存する。プラスミドと染色体DNAの間の組換
えを防ぐために、宿主ゲノムとCDC4含有の安定なプラス
ミドの間に相同性がないことがまた好ましい。適当に除
去されたCDC4座を有する酵母株を得るために、野生型CD
C4遺伝子を含む酵母宿主は、“破壊された”CDC4遺伝子
（ロススティン（Rothstin）、前出）を持つ線状化され
たプラスミドフラグメントで形質転換されうる。線状化
されたプラスミドフラグメントは、フラグメントの自由
末端がCDC4領域内で組換を高めるので、好ましい形質転
換剤である。そのようなプラスミドフラグメントは、完
全なゲノムCDC4座との組換えを促進するためにその末端
に完全なCDC4フランキング領域を持つであろう。プラス
ミドフラグメントのCDC4フランキング領域の間に挿入さ
れた遺伝子物質は、形質転換された宿主において選択さ
れうる表現型特性（選択マーカーたとえばTRP1又はLEU
2）をコードするであろう。破壊プラスミドは好ましく
はまた、破壊されたCDC4選択マーカー配列の宿主ゲノム
への組込みについて選択するために、複製の酵母オリジ
ンを欠くであろう。線状化したプラスミドでの形質転換
に続いて遺伝子組換えは、宿主のゲノム配列の代りに破
壊された配列の置換をもたらす。ここでCDC4遺伝子が除
去された細胞は次に、破壊で用いられたマーカーに従っ
て選択される。
宿主ゲノムの一段階破壊の方法はロスステイン（前
出）により記述されている。上述したように破壊は、宿
主ゲノムの破壊を達成するに加えて安定なプラスミドで
の宿主の形質転換も行われるように、完全な安定なプラ
スミド及び線状化プラスミドで宿主株を共形質転換する
追加的改良により達成される。
宿主CDC4座の破壊のための好ましいプラスミドは、第
３図に示すpB15Lである。それは、CDC4のフランキング
領域の間に挿入された酵母LEU2遺伝子及びベクターpUC1
3（ビエイラ（Vieira）とメッシング（Messing）、ジー
ン（Gene）、19:259−268、1982、及びメッシング、メ
ス・イン・エンザイモロジイ（Meth.in Enzymology）、
101:20−77、1983）を含む。酵母及びベクター配列の結
合点で線状化され、適当な酵母宿主株内に形質転換され
るとき、プラスミドはCDC4領域に代るLEU2配列の置換か
らもたらされるホストゲノムにおけるCDC4の除去をもた
らす。宿主株においてロイシンに対する栄養素要求型の
破壊された形質転換体が次に、ロイシン栄養要求性に基
づいて選択されうる。
プラスミドpB15Lを構築するためにCDC4及びその５′
及び３′フランキング領域を含む6.4kbフラグメントをp
JY51のBam H I消化物から精製した。このフラグメント
は、プラスミドpB14を作るために、Bam H I消化したpUC
13内に挿入された。CDC4コード領域のほとんどが、pB14
をCla Iで消化しそしてpUC13及びCDC4フランキング配列
を含む比較的大きなフラグメントを精製することにより
除去された。フラグメント末端は、Xho I（Bgl II）
“スマート”リンカー（ワースイングトン・ダイアゴノ
スチック（Worthington Diagonostic））の付加により
修飾され、得られた粘着末端にYEp13のBil IILEU2フラ
グメントの2.8kb（ブローチ（Broach）ら、ジーン、８:
121−133、1979）が結合された。そのようにして作られ
たDNAは、Ｅ．coli株RRIを形質転換するために用いられ
た。該質転換体は、酵母LEU2配列がＥ．coli宿主におけ
るleuB欠陥を補うので、ロイシン栄養要求性に基づいて
選択された。プラスミドpB15Lを、そのような形質転換
されたコロニーの一つから精製した。
プラスミドpB15Lは、５′及び３′フランキング配列
に加えてCDC4コード配列の５′末端の僅か約50塩基対を
含む。プラスミドpB5とpB15Lの地図の比較は、pB15LのC
DC4−LEU2遺伝子融合の結合点がpB5中に存在するCDC4フ
ラグメントの領域の外に位置しているので、各CDC4配列
の間の相同性の欠除を示す。この相同性の欠除は、宿主
細胞におけるpB5と破壊されたCDC4座の間の組換えを妨
げる。
C.S.セレビシエの共形質転換 ゲノムCDC4遺伝子の除去とプラスミドpB5の導入を同
時に行うために、該酵母細胞をBam H I解裂したpB15L及
び完全なプラスミドpB5で共形質転換した。形質転換で
用いられる宿主株は、プラスミドpB5及びゲノムCDC4破
壊について同時に選択するために、トリプトファン及び
ロイシンに対して栄養素要求形でなければならない。株
A2（ＭATα leu2−2,112 his3−11,15 can1）（スゾ
スタク（Szostak）、メス・イン・エンザイモロジイ（M
eth.in Enzymology）101:245−252、1983参照）と株GEB
7の交配から得らてた株A2.7.C（MATα cdc4−３ trp1
leu2−2,112 lys1 his3−11,15 can1）（実施例1A
参照）を用いた。
典型的な共形質転換実験において、対数増殖期にある
S.セレビシエA2.7.Cの培養物10mlを、約６μｇのBam H
I消化したpB15L、１μｇのpB5及び担体として10μｇの
ウシ胸線DNAで形質転換した。形質転換条件は、ベッグ
ズ（前出）の記述と同じである。細胞は、ロイシン及び
トリプトファンを欠く培養基上にプレートされた。それ
を22゜で一夜生育し、37゜に変えた。約30個のコロニー
が得られた。pB5単独での形質転換及びトリプトファン
要求性についての選択の対照実験は、約1,000の形質転
換を作った。
６つの共形質転換コロニーを、CDC4座の破壊を検証
し、そしてpB5プラスミドの安定性をテストするために
分析した。ゲノムDNAは、アブラハム（Abraham）ら（コ
ールド・スプリング・ハーバー、シンポジウム・クオン
ト・バイオロ（Gold Spring Harbor Symposium Quant.B
iol.）、47:989−998、1983）の方法により共形質転換
体から単離され、Eco R I及びBam H Iで消化され、アガ
ロースゲル上で電気泳動され、そしてニトロセルロース
に移された（サザン（Southern）、J.Mol.Biol.98:503
−517、1975）。ブロットを、pB15Lに存在ししかしpB5
不存在のCDC4の５′フランキング領域からの2.5kbBam H
I−Hind IIIフラグメントでプローベした。第４図は、
形質転換されなかった細胞からのDNAの6.4kbフラグメン
トにハイブリダイゼーションされたプローベを示す（レ
ーンｂ）；この6.4kbBam H Iフラグメント内にEco R I
部位はない。LEU2配列がEco R I部位を含むので、CDC4
座の破壊はハイブリダイジングバンド（第４図で矢印で
示される）のサイズの減少をもたらすであろう。これ
は、レーンｃ、ｄ、ｆ、ｇ及びｈにおいて示される形質
転換体の場合である。レーンｅはいく分異るパターンを
示し、ゲノムサイズバンドを保持し、これはゲノムCDC4
の除去が起こらなかったことを示す。（レーンｃ〜ｈで
見られるより小さなバンドは、レーンａ及びｂにおける
対照パターンにより判るように、ゲル精製されたプロー
ベの汚染による。） ６つの共形質転換体を、複合培養基（YEPD）上で生育
することにより、プラスミド安定性についてテストし
た。細胞を25゜でYEPD上にプレートし、レプリカを37゜
でYEPDに、トリプトファン欠除培養基及びロイシン欠除
培養基にプレートした。表１にまとめた結果は、＃３を
除く総ての共形質転換体が複合培養基上でプラスミドマ
ーカーについて100％安定であることを示す。（単離物N
o.3は第４図のレーンｅで示される同じ形質転換体であ
る。） 別の安定性テストを、二つの共形質転換体、No.1及び
２について行った。テストは、各々663及び681個のコロ
ニーについて行われた。YEPD上で30゜で30世代の生育後
に、総てのコロニーはトリプトファン及びロイシンに対
して栄養要求性であった。
共形質転換体＃１は22゜で生育速度についてテストさ
れ、形質転換されていないA2.7.C対照と同じ速度で生育
することが判った。
共形質転換体＃１はBELL1と呼ばれる。これはATCC寄
託番号20698として寄託された。
実施例２ シゾサッカロミセス・ポンベPOT1遺伝子 A.選択しうるマーカーとしてのS.ポンベPOT1遺伝子 サッカロミセス・セレビシエTPI1遺伝子は、トリオー
スホフファートイソメラーゼ蛋白質をコードし、tpi1欠
陥を補うことにより得られる（カワサキ及びフレンケ
ル、前出、アルバー及びカワサキ、前出）。驚くべきこ
とに、S.ポンベからの相同的遺伝子が、S.セレビシエtp
i1突然変異を補うことにより単離された。POT1と記され
る（pombe ｔriose ホスファートイソメラーゼに対し
て）S.ポンベTPI遺伝子を、部分的にSau3Aで消化されか
つベクターYEp13に挿入されたゲノムS.ポンベDNAを含む
ルシェル（Russell）とホール（Hall）（J.Biol.chem.2
58:143−149、1983）に記述されたライブラリイからク
ローニングした。予備的DNA配列（マキサム（Maxam）と
ギルバート（Gilbert）、メス・イン・エンザイモロジ
イ（Meth.in Enzymology）、65:497−559、1980）の方
法による）は、POT1遺伝子がTPI蛋白質をコードし、こ
の蛋白質は他の生物からのTPI蛋白質（アルバートとカ
ワサキ、前出）と相同であることを示した。このPOT1DN
A配列は、S.セレビシエTPI1DNA配列及び各蛋白質配列と
共に、第５図に示される。
S.ポンベPOT1遺伝子はこの実施例においてS.セレビシ
エにおける選択マーカーとしてS.セレビシエTPI1遺伝子
よりも好ましい。S.セレビシエにおけるPOT1のような異
種遺伝子は、他種の宿主中では十分に機能せず、従って
宿主細胞欠陥を補うためにより高いコピー数を必要とす
るかも知れない。また酵母プラスミド上の選択しうるPO
T1遺伝子は、同じベクター上の産業上重要な遺伝子の発
現のために内主TPI1プロモーター及びTPI1ターミネータ
ー（POT1と相同性を示さない対照領域）の使用を可能に
する。POT1との相同性を示さない対照領域）の使用を可
能にする。POT1とTPI１のフランキング領域は相同性を
示さないので、分子内組換え及びその結果としてのプラ
スミド不安定性が低減される。最後に、POT１遺伝子は
S.セレビシエ染色体DNAと組換えしそうもない。なぜな
ら、それはTPI1配列とDNAレベルにおいて小さな相同性
しか持たず、TPI1遺伝子の大部分が宿主株において除去
されているからである。すなわち、POT１含有プラスミ
ドは高コピー数のまま留り、これは酵母において産業的
に興味ある異種遺伝子の発現の向上のために望ましい。
POT１遺伝子含有プラスミドは、S.セレビシエ株N587
−2D（カワサキとフレンケル、前出）におけるtpi１突
然変異の補足によってルシェル及びホール（前出）のS.
pombeライブラリイから同定された。
このプラスミドpPOTの制限地図は、第６図に示されて
いる。pPOTがベクターYEp13を含むので、それは本質的
に不安定である。なぜなら、それは酵母内での２μプラ
スミドの維持に必要な複製機能を欠くからである。従っ
てPOT１遺伝子は、C1/1のようなより有効なベクター及
び全２μプラスミド配列を含む関連するベクター内に移
されうる。プラスミドC1/1はpJDB248（ベッグズ（Begg
s）、ネイチア（Nature）、275:104−109、1978）及び
本明細書実施例３記載のpBR322から誘導された。それ
は、酵母２μプラスミドDNA、選択しうるLEU２遺伝子、
及びpBR322配列の総てを含む。
POT１遺伝子は、約3,400の塩基対のBam H I−Xba I制
限フラグメントとしてpPOTから単離され、pUC13の対応
するポリリンカー部位に挿入された。得られたプラスミ
ドはpUCPOTであり、その部分的制限地図を第６図に示
す。
pUCPOTプラスミドは、S.ポンベ及びS.セレビシエDNA
の約1,800の塩基対を除去するためにSal Iで切断されそ
して再結合された。この得られたpUCPOT−Salプラスミ
ドを第６図に示す。
POT１遺伝子は下記の方法でC1/1内に入れられた。C1/
1及びpUCPOT−Salの両者はアンピリシン耐性遺伝子内に
Bgl I部位及びある他の位置に唯一のBam H I部位を持つ
ので、pUCPOT−SalのPOT１フラグメントはC1/1のpBR322
領域の一部に代って置換される。C1/1はBal I及びBam H
Iで切断されてampr遺伝子の一部、全２μDNA、及びLEU
2遺伝子を含む約7,700塩基対の大きなフラグメントを遊
離した。同様に、pUCPOT−SalをBgl IとBam H Iで切断
して、ampr遺伝子の他の一部及びPOT1遺伝子を含む約3,
400塩基対のフラグメントを遊離した。この二つのフラ
グメントはpCPOTを形成するために結合された。これ
は、“回復された“選択しうるampr遺伝子、POT1遺伝
子、LEU2遺伝子、全２μDNA、及びpUC13からの複製領域
のバクテリアオリジンを含む。（pUC13からのバクテリ
アオリジン領域は、pBR322のオリジン領域よりもE.coli
におけるより高いプラスミドのコピー数を可能にす
る。） pCPOTで形質転換されたE.coli株HB−101はATCC寄託番
号39685として寄託された。
POT1遺伝子はまた、同じ構成によってC1/1由来ベクタ
ー中に挿入されうる。たとえばプラスミドpFAT5（代７
図）は、C1/1に挿入されたヒトα−１−抗トリプシン
（AT）の生産のための発現単位を含んでいる。実施例４
で記載されうるように作られるこの発現単位は、TPI1プ
ロモーター、AT cDNA配列及びTPI1転写ターミネーター
より成る。pFAT5の制限地図を第７図に示す。
pFAT5をBal I及びBam H Iで切断して、AT遺伝子及びT
PI1ターミネーターを含むフラグメント（2,200塩基対）
を遊離した。また、上述のC1/1Bal−Bam H Iフラグメン
トと同一の（ただしpFAT5からのフラグメントはTPI1プ
ロモーターを含むさらに900の塩基対を含む。）Bgl I−
Bam H Iフラグメントが遊離される。この後者のpFAT5片
及びpUCPOT−Sal3400bp Bgl I−Bam H Iフラグメント
（上述した）が結合されてプラスミドpFPOTを形成す
る。これは第７図に示す制限地図を持つ。
ベクターpFPOTが唯一つのBam H I部位で切断されて、
2,200塩基対AT遺伝子及びpFAT5からのTPI1ターミネータ
ーフラグメントの挿入を可能にした。pFPOT内への適当
な定位での2,200塩基対フラグメントのクローニング
は、この酵素ベクターにおけるヒトATの発現を可能にす
る。適当に結合された生成物はpFATPOTと名付けられ、
その制限地図を第７図に示す。
B.宿主TPI遺伝子の破壊 サッカロミセス・セレビシエTPI1遺伝子がクローニン
グされ、配列化された（カワサキとフランケル、前出、
及びアルバートとカワサキ、前出）。TPI蛋白質のため
の構成遺伝子を含むプラスミドpTPIC10は、アルバート
とカワサキ（前出）に記述されている。一つのBgl II部
位は、TPI１のコード領域中のDNA位置295に存在し、他
のBgl II部位は５′フランキング領域中に約1,200塩基
対離れて位置する。これらのBgl II部位は、TPI1遺伝子
の対を除去するため及び酵母LEU2遺伝子のような他の遺
伝子を挿入するための慣用のクローニング部位である。
そのような構造物は、形質転換された宿主におけるゲノ
ムTPI1座の破壊を成すために用いうる。
TPI1の５′フランキング領域中の約−1800にPst1部位
がある。従ってpTPIC10において、TPI1遺伝子は５′サ
イドでPst I部位により及び３′サイドでSal I部位（te
rr遺伝子中の）によりフランクされる。TPI1を含むこの
Pst I−Sal IフラグメントがPst I及びSal I部位でpUC1
3に挿入されて、pUCTP Iを作った。Pst I−Sal I挿入物
（pUC13への）の制限地図を第８図に示す。
プラスミドpUCTP Iは次にBgl IIで切断され、この二
つのDNAフラグメントは電気泳動で分離された。大きい
方のフラグメントは精製され、自己結合を防ぐためにホ
スファターゼ処理された。このDNAのBgl II部位に酵母L
EU2遺伝子（これはBgl IIフラグメントとしてプラスミ
ドYEp13（ブローチ（Broach）ら、ジーン（Gene）、８:
121−133、1979）から除去された。）が結合された。得
られたプラスミドはpUCTP ILEU2であった。これは、TPI
1の部分的除去及びLEU2の挿入を有する。pUCTP I−LEU2
は第８図に示されている。
プラスミドpUCTP I−LEU2は、DNAを線状化するために
Pst I及びBam H Iで切断された。この酵母配列は次に、
電気泳動及びゲル精製によりpUC13から単離された。第
８図に示した酵母DNA部分は、TPI1染色体遺伝子（ロス
ステイン、前出）を“破壊”するために、LEU2について
欠陥的であるS.セレビシエ株E2−7B（ATCC No.20689）
を形質転換するために用いられた。Leu+形質転換体が、
３％グリセロール及び１％ラクテート（pH7に中和され
た）、1Mソルビトールを含みロイシンを含まない合成
（修正ウィッカーハムの）培養基（モルチャー（Mortim
er）とハウソーン（Hawthorne）著、ローズ（Rose）と
ハリソン（Harrison）編、ザ・イースツ（The Yeasts）
vol.1、385−460、アカデミックプレス（Academic Pres
s）、1969）で選択された。形質転換体は、YEP−デキス
トロースで生育することの不能によってTPI欠陥につい
てスクリーンされた。スクリーンされた初めの99の形質
転換体のうち、一つのtpi-形質転換体が見い出された。
この株はE2−7BΔTPI＃29と名付けられた（以下ではΔt
pi＃29と云う）。
Δtpi＃29はYEP−３％グリセロール−１％ラクテート
で生育したが、VEP−デキストロースでは生育しなかっ
た。粗細胞抽出物について酵素評価（クリフトン（Clif
ton）ら、ジェネティクス（Genetics）、88:1−11、198
0）が行われ、Δtpi＃29は検知できるレベルのトリオー
スホスファート イソメラーゼ活性を欠くことを確認し
た。
Δtpi＃29は、tpi-除去のためにヘテロ接合性である
二倍体を形成するために他の酵母株に交配することがで
きる。そのような二倍体は、トリオース ホスファート
イソメラーゼに対して欠陥のある他の株が発生されう
るように、胞子形成されうる。たとえばΔtpi＃29は、
二倍体E11を形成するためにE8−10A（MATα leu2）
（交配E2−7B〔ATCC20689〕xGK100〔ATCC20669〕の胞子
セグメント）に交配された。この二倍体は、ゲノタイプ
MATαpep4−３ tpi1を持つ半数体子孫E11−3Cを発生す
るために、胞子形成された。
EI1−3Cは、tpi1除去のためにホモ接合性である二倍
体E18を形成するためにΔtpi＃29に戻し交配された。E1
8はプラスミドのための宿主株としてΔtpi＃29より好ま
しいかも知れない。なぜならそれはアミノ酸要求性を持
たず、より大きな細胞を持ち、より速く成長するからで
ある。これらtpi-株は解糖機能をコードする遺伝物質に
ついて除去され、従って先祖返りしない（すなわち安定
な）突然変異体であると思われる。
C.S.セレビシエtpi-除去株へのPOT1遺伝子の形質転換 プラスミドpFPOTとpFATPOTを、Δtpi＃29及び関連す
るtpi-除去株中に形質転換した。この酵母突然変異体
を、YEP−２％ガラクトースで30゜で対数増殖後期まで
一夜好気的生育させた。形質転換条件はベッグズ（前
出）の記述の通りであったが、但し細胞は寒天上層に細
胞をプレートする前にYEP−デキストロースの代りにYEP
−３％グリセロール−１％ラクテート又はYEP−２％ガ
ラクトースを含む1Mソルビトール中で30゜で１〜２時間
回復させた。寒天上層とプレートは、1Mソルビトールと
２％デキストロースを有する合成の修正ウィッカーハム
の培養基を含む。30゜で３日後に形質転換体は目で見
え、YEPD上に再プレートするために寒天培養基から取り
出された。その後、形質転換体はYEPD又はデキストロー
スを含む他の複合培養基で維持された。
pFATPOTで形質転換された株E18は、ZYM−３と名付け
られた。それは、ATCC寄託番号20699として寄託されて
いる。
複合培養基上でのpFPOTとpFATPOTの安定性 プラスミド安定性を研究するために、単一細胞からの
クローンをYEPDを含む管に接種し、合計数109細胞（約3
0回分裂）まで生育させた。酵母細胞は、凝集をこわす
ために音波をあてられ、適当な数まで希釈され、tpi-細
胞（POT1遺伝子を有するプラスミドを持つ又は持たな
い）を生育させるYEP−２％ガラクトース又はYEP−２％
グリセロール−１％ラクテート上にプレートした。YEP
−ガラクトースで生育したコロニーを次に、プラスミド
の損失をスクリーンする（すなわちPOT1含有プラスミド
を失ったtpi-細胞はデキストロースで生育しないであろ
う）ために、YEPD上にレプレカプレートされた。表２に
まとめた結果は、pFPOTとpFATPOTプラスミドが酵母tpi-
除去株において安定であることを示す。それらは驚くべ
きことに、動原体を含む酵母プラスミドよりはるかに安
定である。動原体含有プラスミド（コピー数が低い）
は、酵母について報告された最も安定なプラスミドに属
し、一般に複合培養基での分裂ごとに細胞の約１％が失
われる（動原体プラスミド安定性の総説のためにマレイ
（Murray）とスゾスタク（Szostak）、前出、参照）。
表２に示したように、本明細書で説明されるPOT1プラス
ミドは、tpi-除去株において複合培養基での30回分裂の
後に１％未満の確率で失われる。
D.POT1プラスミドを用いるS.セレビシエにおけるヒトα
−１−抗トリプシンの発現 形質転換された酵母における異種蛋白質の発現を高め
るためにPOT1プラスミドを用いることをテストするため
に、プラスミドpFATPOT及びpFAT5がS.セレビシエ株Δtp
i＃29及びE2−7Bを各々形質転換するために用いられ
た。形質転換された細胞は、デキストロースを含みロイ
シンを含まない培養基中で選択された。培養物は３〜４
のO.D.600まで30゜で生育された。細胞抽出物が作ら
れ、実施例５で述べるようにATについて評価された。
pFATPOT/Δtpi＃29により作られたATは、合計４〜６
％の可溶性蛋白質を示した。
pFAT5/E2−7Bにより作られたATは、合計２〜３％の可
溶性蛋白質を示した。
プラスミドコピー数は正確に測定するのは困難であ
り、平均数を示すものであるが、発現単位（プロモータ
ー、興味ある遺伝子、ターミネーター）が同じままであ
るとして遺伝子生成物料の経験的観察は相対的なプラス
ミドレベルの表示を与える。従ってpFATPOTは、pFAT5
（これからそれが誘導された）よりも数において機能的
により大きいようである。二つの形質転換された株は遺
伝的にほぼ同一であり（Δtpi＃29はプラスミド支配突
然変異生成によりE2−7Bから誘導される）、同じ条件下
で生育されたので、これらの結果は従来報告されたベク
ターより高い本明細書の安定なプラスミド発現の値を示
すものである。
E.pMPOT2ベクターの構成 酵母２μDNAからのREP1、REP2、REP3及びori配列及び
POT1遺伝子を含む第二の安定な発現ベクターが構築され
た。POT1遺伝子は、プラスミドをSal I及びBam H Iで消
化してpFATPOTから得られた。この1600bpフラグメント
は次に、初めにSal I及びBam H Iでの消化により線状化
されたpIC19R（pUC19〔ノーランダー（Norrander）ら、
ジーン（Gene）、26:101−106、1983〕のHind III部位
に挿入された、第９図に示すポリリンカー配列を含む）
に結合された。得られたプラスミド中のBam H I、Pst
I、及びSal I部位は、プラスミドpICPOT＊を作るために
二段階で破壊された。Pst I及びSal I部位は、Pst I及
びSal Iでの切断により除去された；末端は、Pst I3′
オーバーハンク（突出部）をDNAポリメラーゼＩ（クレ
ノウ（Klenow）フラグメント）で消化しそしてSal I5′
オーバーハングをクレノウフラグメントでふさぐことに
よってブラント（対合二本鎖化）された。ブラント末端
は次に結合された。Bam H I部位は次に、プラスミドをB
am H Iで切断し、末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノウ
フラグメント）でふさぎそしてブラント末端を再結合す
ることにより除去された。
２μ配列が、プラスミドYEp13（ブローチら、ジー
ン、８:121−133、1979）及びC1/1から得られた。REP3
及びori配列は、Pst I及びXba Iでの消化及びゲル精製
によりYep13から除去された。REP2は、Xba I及びSph I
での消化及びゲル精製によりC1/1から得られた。次に二
つのフラグメントは、Pst I及びSph Iで線状化されたpU
C18（ノーランダーら、前出）に結合され、プラスミドp
UCREP2、３を作った。REP1は、1704bpフラグメントのEc
oR I及びXba Iでの消化及びゲル精製によりC1/1から得
られた。EcoR I−Xba Iフラグメントは、EcoR IとXba I
で線状化されたpUC13中にクローニングされた。得られ
たプラスミドはpUC13＋REP1と名付けられた。pUC13＋RE
P1プラスミドはHind IIで切断され、EcoR Iリンカー
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから入手）の存
在下で結合された。REP1遺伝子は次に、約1720bpのEcoR
Iフラグメントとして除去された。このEcoR Iフラグメ
ントは、EcoR Iで線状化されたpIC7（pUC8のHind III部
位に挿入された第９図に示すポリリンカーを含む）中に
クローニングされた。得られたプラスミドはpICREP1＃
９と名付けられた。
最終の発現ベクターpMPOT2を構築するために、pICPOT
＊が部分的Hind III消化及び完全Sst I消化により線状
化された。プラスミドpUCREP2,3がHind III及びSst Iで
切断され、REP2、REP3及びori配列を含むフラグメント
がゲル精製され、線状化されたpICPOT＊に結合された。
REP2、REP3、ori、POT1及びampr配列を含む得られたプ
ラスミドはpMPOT1と名付けられた。REP1が次に、Bgl II
−Nar IフラグメントとしてpICREP1＃９から除去され、
Bgl IIとNar Iで開裂されたpMPOT1に結合された。この
結合化の生成物はpMPOT2と名付けられた（第10図）のpM
POT2で形質転換されたS.セレビシエ株Δtpi＃29はATCC
No.20744として寄託された。
F.POT1プラスミドを用いるｖ−sis配列の発現 サル肉種ビールス（SSV）のｖ−sis遺伝子は、ビール
スの形質転換蛋白質であると推定されるp28sisと呼ばれ
る蛋白質をコードする。p28sis蛋白質は、血小板由来成
長因子（pDGF）と抗原的及び構造的に類似であることが
示されている。ｕ−sis遺伝子はクローニングされ、そ
のDNA配列が決定された（デバレ（Devare）ら、Proc.Na
tl.Acad.Sic.USA79:3179、1982;デバレら、Proc.Natl.A
cad.Sic.USA80:731、1983）。この遺伝子の部分は、POT
1プラスミドを用いて酵母において発現された。
SSVレトロウイルスゲノムが、ゲノム中にSSV組込まれ
た非生産的に感染された正常ラット腎臓細胞SSV−11か
らクローニングされた（デバレら、1982、前出）。SSV
DNAは5.8kbEcoR Iフラグメントとして単離され、次に
pBR322中に挿入されてプラスミドpSSV−11を作った。1.
2kb v−sisフラグメントが次にpSSV−11のPst I消化物
から精製され、pUC13のPst I部位中に挿入された。得ら
れたプラスミドはpVSIS/Pstと名付けられた。
ｖ−sis配列は次に、分泌発現単位を作るために酵母
交配フェロモンアルファ因子（MFα１）遺伝子（クリャ
ン（Kurjan）とヘルスコウィッツ（Herskowitz）、セル
（Cell）、30:933−943、1982）の一部に結合された。
プラスミドpSSV−11はBam H IとPvu IIで消化され、消
化生成物は1.1％アガロースゲルを通して電気泳動さ
れ、抽出され、そしてエタノール沈澱された。このDNA
を再懸濁し、Hph Iで消化し、そして396bp Hph I−Pvu
IIフラグメントを1.25％アガロースゲル上で精製した。
Hph I開裂部位をDNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメ
ント）を用いてブラントした。DNAを次にBgl IIで消化
し、296bp Hph I−Bgl IIフラグメント（５′ｖ−sisフ
ラグメント）をゲル精製した。３′ｖ−sis配列を、756
bp Bgl II−Xba IフラグメントとしてプラスミドpVSIS/
Pstから単離した。pUC13おEcoR I部位に挿入されたMFα
１遺伝子を含む1700bp EcoR Iフラグメントを含むプラ
スミドp192をHind IIIで消化した。DNAポリメラーゼＩ
（クレノウフラグメント）と４つのデオキシリボヌクレ
オチド総てを次に、反応混合物に加えた。次にDNAをフ
ェノール/CHCl3/エーテルで抽出し、濃縮し、そしてEco
R Iで消化した。1.2kbEcoR I−Hind III（ブラントされ
た）フラグメント（MFα１遺伝子のプロモーター及び分
泌シグナル配列を含む）を次に0.9％アガロースゲルで
電気泳動して単離した。同モル量の５′ｖ−sis、３′
ｖ−sis、及びMFα１フラグメントプラスEcoR I＋Xba I
消化pUC12（ビエイラとメッシング、前出、及びメッシ
ング、前出）を次に互に結合した。得られたプラスミド
をpVSαと名付けた。
第二のMFα1/v−sisハイブリッド遺伝子を構築した。
その中でｖ−sis配列の最初の66個のコドンは、ｖ−sis
のコドン67がプロアルファ因子のLys−Argプロセシング
シグナルのためのコドンに直接続くように除去された。
ｖ−sisのコドン１〜66を正確に除くために、オリゴヌ
クレオチド支配突然変異は、ゾラー（Zoller）とスミス
（Smith）（マニュアル・フォー・アドバンスド・テク
ニクズ・イン・モレキュラー・クローニング・コース
（Manual for Advanced Techniques in Molecular Clon
ing Course）、コールド スプリング ハーバー ラボ
ラトリー、1983）の二プライマー法にほとんど従って行
われた。
pVSαをXba Iで消化し、2.2kbMFα１−ｖ−sisフラグ
メントを精製し、それをXba I消化されたM13mp11（複製
形）に結合し、そして形質転換されたE.coli JM101から
正鎖DNAを単離することにより鋳型が作られた。このク
ローンはm11VSαと名付けられた。
m11VSαの0.5pモルを、ゾラートスミス（前出）の条
件を用いてキナーゼ処理されたオリゴヌクレオチドZC13
0（３′AGA AAC CTA TTT TCC TCG GAC CCA5′）
の1pモルとユニバーサル配列化プライマー（BRL）の1.5
pモルでアニールした。但し、アニーリング混合物は初
めに65℃に10分間加熱され、37℃に変えて10分間加熱さ
れ、そして次に氷上で急速冷却された。次にアニールさ
れた混合物を、環状二重DNAを作るためにゾラーとスミ
ス（前出）記述のようにクレノウポリメラーゼで処理し
た。伸長混合物の一部を、E.coli K12 JM101を形質転
換するために用いた。得られたファージプラークを、ニ
トロセルロースフィルターに移し次に65℃で32Pホスホ
リル化ZC130とハイブリダイゼーションすることにより
適当な欠損についてスクリーンした。正しく近接された
配列は、用いた緊縮ハイブリダイゼーション温度におい
て放射性プローベを用いて安定な二重ラセンを形成す
る。スクリーンされた形質転換体の約１％がオートラジ
オグラフィにより正のシグナルを与えた。10のクローン
がプラーク精製され、複製形DNAが制限酵素分析のため
に作られた。５つの単離物が、予期された1450bp Hind
III−Bgl IIフラグメントを示した。２つの単離物のDNA
配列分析は、正しい融合結合が行われたこと、すなわち
適当な翻訳読出しフレームの維持を確認した。これらフ
ァージの一つはm11VS2αと名付けられた。
酵母における発現のために、VSα及びVS2α発現単位
（MFα１及びｖ−sis配列を含む）が次に下記の方法で
酵母TPI1ターミネーターの近くに置かれた。TPI1ターミ
ネーターフラグメントが、プラスミドpFG1（アルバート
とカワサキ、前出）から得られた。
それは、TPI1遺伝子のペヌルチメート（penultimat
e）アミノ酸コドンから約700塩基対下流のEcoR I部位ま
での領域を囲むこむ。初めにプラスミドをEcoR Iで切断
し、次に末端をDNAポリメラーゼ I（クレノウフラグメ
ント）でブラントし、合成Bam H Iリンカー（CGGATCC
A）を付加し、そしてプラスミドp136を作るために再結
合することにより、Bam H I部位がpFG1のこの唯一のEco
R I部位に代って置換された。次にTPI1ターミネーター
がXba I−Bam H Iフラグメントとしてp136から切除され
た。このフラグメントを、Xba IとBam H Iで線状化した
YEp13中に結合した。得たプラスミドはp213として知ら
れる。次にプラスミドをHind IIIで消化し、得られた末
端をDNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）でブ
ラントし、そしてT4DNAリガーゼを用いて線状分子を再
環化することにより、Hind III部位をp213のTPI1ターミ
ネーター領域から除去した。得られたプラスミドはp270
である。
プラスミドp270をXba Iで消化し、粘着ベクター末端
の再結合を防ぐためにウシアルカリ性ホスファターゼで
消化した。pVSα及び11VS2α（複製形）のXba I消化及
びアガロースゲル精製により、各々ｖ−sis発現単位VS
α及びVS2αを作った。単離されたフラグメントの各々
を、40単位T4DNAリガーゼ及びE.coliRRI中に形質転換さ
れた結合（リゲーション）混合物の存在下で、ほぼ等モ
ル量のホスファターゼ処理されたp270で結合した。アン
ピシリン耐性コロニーからプラスミドDNAが作られ、
３′ｖ−sis配列近傍にTPI1ターミネーターを持つクロ
ーンを同定するために制限酵素分析が行われた。ゲル電
気泳動後の3.3kb又は3.1kb Bgl IIフラグメントの存在
は、各々YEpVSα及びYEpVS2αの正しい定位を示した。
VSα及びVS2α配列は次に、安定なベクターpCPOT及び
pMPOT2中に挿入され、酵母TPI1プロモーターがMFα１プ
ロモーターに代って置換された。TPI1プロモーターはプ
ラスミドpM220から得られた。pM220で形質転換されたE.
coliRRIは、ATCC No.39853として寄託されている。
プラスミドpM220がBgl II及びBam H Iで消化され、0.
9％アガロースゲルで電気泳動され、2.2kb TPI1プロモ
ーター、MFα１遺伝子フラグメントが抽出された。精製
されたフラグメントはPst Iで消化され、得た1kbBgl II
−Pst Iフラグメントは上述のようにアガロースゲル精
製された。プラスミドYEpVS2αがPst I及びBgl IIで消
化され、1.8kbMFα1/v−sis/TPI1１ターミネーター融合
フラグメントがゲル単離された。プラスミドpCPOTがBam
H Iで消化され、ウシアルカリ性ホスファターゼで処理
され、フェノール/CHCl3抽出され、次にアガロース上の
電気泳動により精製され、ゲルから抽出され、EtOH沈澱
された。
三つの単離したフラグメントの約等モル量を12℃で一
夜結合し、結合混合物はE.coli K−12株DH1（ハナハン
（Hanahan）、D.メセレソン（Meseieson）、M.,J.Mol.B
iol.166:577、1983）をアンピシリン耐性に形質転換す
るために用いられた。形質転換体からプラスミドDNAが
作られ、望む〜1500bpBam H I−Sal Iフラグメント及び
800bpSph Iフラグメントの存在を検証するために制限消
化分析が用いられた。このプラスミドはp117−２と名付
けられた。
プラスミドYEpVS2αがPst IとBam H Iで消化され、部
分的MFα１、ｖ−sis及びTPI１ターミネーター配列を含
む1.8kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動により
精製した。プラスミドpIC19RはPst I及びBam H Iで消化
され、ベクターフラグメントがゲル精製され、プラスミ
ドpVS2αＴを作るためにYEpVS2αからの1.8kbフラグメ
ントに結合された。
プラスミドpM220がBgl II及びPst Iで消化され、TPI
１プロモーター及びMFα１配列の５′部分を含む約1kb
フラグメントが単離され、Bgl II＋Pst I消化されたpIC
19Rでクローニングされた。得られたプラスミドはCla I
及びPst Iで消化され、TPI１プロモーター−MFα１フラ
グメントがゲル精製された。次にプラスミドpVS2αＴが
cla I及びPst Iで切断され、TPI１プロモーター−MFα
１フラグメントに結合された。2.6kbCla I−Bam H Iフ
ラグメントの存在により正しい構成が同定され、pTVS2
αＴと名付けられた。
プラスミドpVSαの約10μｇを20μの体積でBstE II
で完全に消化した。Pst Iの５単位を加え、混合物を30
分間インキュベートし、EDTAの添加により反応を停止さ
せた。停止させた反応混合物を直ちに１％アガロースゲ
ルで電気泳動し、約800bpの部分Pst I−BstE II帯（MF
α１プレプロ配列及びｖ−sisの５′部分からほとんど
成る）をカットし、ゲルから抽出し、EtoH沈澱した。
プラスミドpTVS2αＴをPst I及びBstE IIで完全に消
化し、アガロースゲル電気泳動により精製した。得られ
た約4.8kbフラグメント及びpVSαからの800bp Pst I−B
stE IIフラグメントをT4DNAリガーゼの存在下で室温で
６時間結合し、結合混合物をE.coli HB101をアンピシ
リン耐性に形質転換するために用いた。約1450bp Bgl I
Iフラグメントを含むプラスミドが同定された。このこ
とは挿入物の存在を示している。これはpTVSαと名付け
られた。
プラスミドpTVSαをCla I及びBam H Iで完全に消化
し、VSα配列を含む約2.9kbフラグメントをアガロース
ゲルでの電気泳動により単離し、ゲルから抽出し、EtOH
沈澱した。約2.9kbCla I−Bam H I VSαフラグメント
を、Cla IとBam H Iで消化したpMPOT2で結合した。得ら
れたベクターはpVSαｍと名付けられた。
プラスミドpTVS2αＴをCla I及びBam H IでBamH I緩
衝液中で完全に消化した。緩衝液をハイソルト（high s
alt:マニアチス、前出）に調節した。このDNAをPvu Iで
完全に消化した。これはベクター配列を二度切断し、VS
2α配列を含む2.7kbCla I−Bam H Iフラグメントのアガ
ロースゲル上での分離を可能にする。このフラグメント
は0.9％アガロースで電気泳動され、抽出され、EtOH沈
澱される。フラグメントは次に、T4DNAリガーゼの存在
下で13℃で20時間、Cla I−Bam H I消化されたpMPOT2で
結合される。結合されたDNAは、E.coliHB101をアンピシ
リン耐性に形質転換するために用いられ、得られたコロ
ニーからプラスミドDNAが調製された。2.7kbCla I−Bam
H I VS2αのフラグメントを含むプラスミドが同定さ
れ、pVS2αｍと名付けられた。
ｖ−sis配列を含む発現ベクターは、適当な酵母宿主
株中に形質転換され、培養物基はエライサ（EKISA）に
よりPDGF様物質の存在について評価された。YEp13由来
プラスミドはS.セレビシエE8−11c（MATα leu２pep
４）中に形質転換された。プラスミドp117−２、pVSα
ｍ、及びpVS2αｍは、tpi −除去株中に形質転換され
た。形質転換体は、220rpmの回転シェーカーで適当な培
養基中で30℃で定常期まで生育された。培養物を回収
し、細胞を遠心分離により除き、培養基を実施例６記載
のように評価した。結果を表３に示す。POT１プラスミ
ド上でのｖ−sis配列の発現レベルは、通常の酵母ベク
ター上でよりも５〜８倍大きい。
a:細胞を25℃で複合培養基（YEPD）にプレートし、30世
代生育させた。
b:細胞を37゜でYEPDにレプリカプレートし30世代生育さ
せた。完全なCDC4遺伝子を欠く細胞はこの（制限約）温
度で生育できなかった。
c:細胞を、トリプトファンを欠く培養基にレプリカプレ
ートし、30世代後に数えた。
d:細胞を、ロイシンを欠く培養基にレプリカプレート
し、30世代後に数えた。
a:プラスミド／株組合せ物は、約104〜105の細胞の容易
に見えるコロニーが見えるようになるまで、YEPDプレー
ト上で生育された。これらコロニーは6mlのYEPD液体培
養基を接種するために用いられた。培養物は１〜３×10
8細胞/mlの細胞密度まで好気的に一夜生育され、YEP−
２％グリセロール−１％ラクテート又はYEP−２％ガラ
クトース上にプレートされた。これら培養基の各々はtp
i-株を生育させるが、得られるtpi-コロニーはtpi+コロ
ニーよりもゆっくり生育した。各コロニー（tpi-でもtp
i+でも）を数えることができるように、僅か100〜300の
細胞を各プレートに分配した。
b:コロニーは、２％最終濃度でデキストロースを含む合
成培養基上にレプリカプレートされた。プラスミド上の
トリオースホスファートイソメラーゼ遺伝子を失った細
胞は生育できなかった。
c:％損失は、YEPDで約30回分裂後にプラスミドを失った
細胞の確率を示す。実験２〜６を一緒にしたデータは、
POT1プラスミドがこれら多数の分裂において極めて安定
であり、30回の細胞増殖において１％よりはるかに小さ
い平均確率で失われることを示している。
実施例３ プラスミドC1/C1の調製 C1/1がプラスミドpJDB248（ベッグス、J.,ネイチア、
275、104−109（1978））から構築された。pMB9配列がE
coR Iでの部分的消化によりpJDB248から除去され、EcoR
Iで切断されたpBR322DNAにより置換された。C1/1の制
限地図を第６図に示す。C1/1プラスミドは、EcoR I部位
にpBR322挿入を持つ、酵母（S.セレビシエ）からの全２
μDNAを含む。それはまたLEU２遺伝子を含む。
実施例４ プラスミドpFAT5の調製 ヒトα−ａ−抗トリプシン（AT）の主たる形をコード
する遺伝子が、DNAハイブリダイゼーションプローベと
してヒヒ配列を用いる慣用の方法（クラチら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,78:6826−6830、1980、及びチャンドラ
（Chandra）ら、Biochem.Biophys.Res.Comm.103:751−7
58、1981）によりヒト肝臓cDNAライブラリイから単離さ
れた。
ライブラリイは、プラスミドpBR322（ボリバー（Boli
var）ら、ジーン（Gene）、２、95−113、1977）のPst
I部位へヒト肝臓cDNAを挿入することにより構築され
た。AT遺伝子が、ライブラリイから1500塩基対（bp）Ps
t Iフラグメントとして単離された。このフラグメント
は、プラスミドpUCα１を作るためにpUC13のPst I部位
に挿入された。pUCα１においてAT配列がポリリンカー
におけるXba I及びEcoR I部位により３′末端上にフラ
ンクされる。
TPIターミネーターが約700bpのXba I−EcoR Iフラグ
メントとしてプラスミドpFG1｛アルバーとカワサキ、前
出）から精製され、Xba IとEcoR Iで開裂されたpUCα１
に挿入された。この構成物を次にEcoR Iで切断し、TPI
ターミネーターの３′末端にBam H I部位を与えるため
に多量リンクされたコピーでオリゴヌクレオチドリンカ
ー（配列:AATTCATGGAG GTACCTCCTAG）が付加された。得
られるプラスミドはBAT5として知られる。
TPIプロモーターフラグメントは、プラスミドpTPIC10
（アルバートとカワサキ、前出）から得られた。このプ
ラスミドは唯一のKpn I部位で切断され、TPIコード領域
がBa131エキソヌクレアーゼで除去され、EcoR Iリンカ
ー（配列:GGAATTCC）がプロモーターの３′末端に付加
された。Bgl II及びEcoR Iでの消化は、Bgl II及びEcoR
I粘着末端を持つTPIプロモーターフラグメントを与え
た。このフラグメントは次に、Bgl II及びEcoR Iで切断
されたプラスミドYRp7′（スティンクコムら、ネイチ
ア、282:39−43、1979）に結合された。得られたプラス
ミドTE32は、テトラサイクリン耐性遺伝子の部分を除去
するためにEcoR I及びBam H Iで開裂された。線状化さ
れたプラスミドは次に、プラスミドTEA32を作るため
に、上述のEcoR I−Bam H Iリンカーの付加により再環
化された。次にTEA32はBGl II及びBam H Iで開裂され、
TPIプロモーターが約900bpのフラグメントとして精製さ
れた。
プラスミドpFAT5を構築するために、プラスミドC1/1
がBam H Iで線状化され、TEA32からの900pTPIプロモー
ターフラグメントに結合された。プラスミドＦとして知
られる得た構成物は、TPIプロモーターの３′末端に位
置される唯一のBam H I部位を持つ。このプラスミドをB
am H Iで切断し、ATコーディング配列及びTPIターミネ
ーターを含む2200bp Bam H IフラグメントをBAT5から精
製し、Bam H I部位に挿入した。pFAT5として知られる得
られたプラスミドを第７図に示す。
実施例５ α−１−抗トリプトシンについての評価 対照として、100μg/mlのトリプシンの溶液の10μ
（１μｇ）、100μｇ（100μ）の子牛血清アルブミン
及び100μの0.05MのTRIS、1mMベンゾイルアルギニノ
イル−ｐ−ニトロアニリドを含むpH8緩衝液を混合し、4
05nmでの吸収の増加を分光光度計で経時計測した。この
溶液の吸光度は、100％トリプシン活動度に対する標準
として用いられた。総ての評価されたサンプルは、同濃
度の基本及び子牛血清アルブミンを含む。
実施例６ エライサ（ELISA）によるPDGF様物質の検出 酵母形質転換体によるPDGF様物質の発現は、ELISA検
査され、精製ヒトPDGF（レイネス（Raines）とローズ
（Ross）、J.Biol.Chem.257:5154、1982）で作られた標
準カーブとの比較により定量された。典型的標準カーブ
は次のようにして作られた。PBS中の2.5ng/mlの精製ヒ
トPDGFをイミュロンII（Immulon II:商標）（ダイナテ
ック・ラボラトリーズ社（Dynatech Laboratories,In
c.）で96個のくぼみの微量滴定プレート（100μ／く
ぼみ）で４℃で一夜インキュベートした。この塗布液を
除去し、PBS中の0.1％ラビットアルブミンの100μ／
くぼみを加え、プレートを37℃で１時間インキュベート
した。精製PDGFの複数のサンプル（0.1〜40ng/ml）を別
々に、0.05％Tween20（商標）及び1mg/mlラビットアル
ブミン（RSA）を含むPBS中でヤギ抗PDGF IgG（５μg/m
l）と共にインキュベートした。微小滴定プレートを0.9
％NaCl、0.5％Tween20（商標）で５回洗い、液を切り、
各テスト溶液の100μを微小滴定くぼみに加え、37℃
で２時間インキュベートした。プレートを先と同様に洗
い、0.05％Tween20及び1mg/ml RSAを含むPBS中の1:1000
希釈されたパーオキシダーゼ接合ブタ抗ヤギIgG（タゴ
（Tago）社）を加え37℃で２時間おいた。プレートを先
のように洗い、0.012％過酸化水素を含む新規に調製し
た0.04％ｏ−フェニレンジアミン（100μ／くぼみ）
を加え室温で50分間おき、50分時点で4N H2SO4の添加
（50μ／くぼみ）により反応を止めた。492nmでの吸
光度を、ダイナテック（Dynatech）プレートスキャナー
を用いて測定した。各テスト点は３度測定された。
酵母培養物基サンプルをPBSで希釈し、上述したよう
に評価し、PDGF標準カーブと比較した。表３は実験の代
表的シリーズの評価結果のまとめである。
【図面の簡単な説明】
第１図、第２図及び第３図は各々、プラスミドpB4、pB5
及びpB15Lの構成を示す。 第４図はDNAのサザンブロットを示す。第５図は配列を
示す。第６図〜第８図は各、プラスミドpCPOT、pFATPO
T、pTPI−LEU2の構成を示す。 第９図はプラスミドpIC19Rのポリリンカー配列の一部、
第10図はプラスミドpMPOT2を示す。
フロントページの続き (72)発明者 レスリー ベル アメリカ合衆国 ワシントン州 98102 シアトル イースト ボーイアー ア ベニユー 2518 (56)参考文献 特公 昭57−41909（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】複合培養基での正常な細胞生育にその発現
    が必要である遺伝子であって、細胞分裂サイクルの遺伝
    子及び該培養基における炭素源利用のために必要な遺伝
    子からなる群から選択された遺伝子に欠陥を有する宿主
    細胞において蛋白質生成物を製造する方法において、 （ａ） 発現の際に該欠陥を補う遺伝子と、該蛋白質生
    成物をコードする配列とを含むDNA分子で宿主細胞を形
    質転換する工程、及び （ｂ） 工程（ａ）からの形質転換体を、抗生物質又は
    重金属を含む必要がなく、且つ特定の栄養素を除かれる
    必要がない生育培養基中で培養し、該遺伝子が該形質転
    換体の選択マーカーとして機能し、該蛋白質生成物をコ
    ードする配列が発現する工程 を含む方法。
  2. 【請求項２】蛋白質生成物がα−１−抗トリプシンであ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】宿主細胞が酵母宿主細胞である特許請求の
    範囲第１項又は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ細
    胞であり、遺伝子が酵素ピルビン酸キナーゼ、トリオー
    スホスファートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメ
    ラーゼ、ホスホグリセラートムターゼ、ホスホグリセラ
    ートキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ヘキソキナー
    ゼ、及びグルコキナーゼをコードする遺伝子及び調節遺
    伝子GCR1からなる群から選ばれたサッカロミセスセレビ
    シエ遺伝子である特許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】遺伝子が酵母CDC4遺伝子である特許請求の
    範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】遺伝子がシゾサッカロミセ・ポンベ トリ
    オースホスファートイソメラーゼ遺伝子である特許請求
    の範囲第４項記載の方法。
  7. 【請求項７】遺伝子が宿主細胞と異なる細胞種からのも
    のである特許請求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】複合培養基での正常な細胞生育にその発現
    が必要である遺伝子であって、細胞分裂サイクルの遺伝
    子及び該培養基における炭素源利用のために必要な遺伝
    子からなる群から選択された遺伝子に欠陥を有する宿主
    細胞において蛋白質生成物を製造する方法において、 （ａ） 発現の際に該欠陥を補う遺伝子と、該蛋白質生
    成物をコードする配列とを含むDNA分子で宿主細胞を形
    質転換する工程、及び （ｂ） 工程（ａ）からの形質転換体を、抗生物質又は
    重金属を含む必要がなく、且つ特定の栄養素を除かれる
    必要がない生育培養基中で培養し、該遺伝子が該形質転
    換体の選択マーカーとして機能する工程 を含む方法。
  9. 【請求項９】蛋白質生成物がα−１−抗トリプシンであ
    る特許請求の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】宿主細胞が酵母宿主細胞である特許請求
    の範囲第８項又は第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ
    細胞であり、遺伝子が酵素ピルビン酸キナーゼ、トリオ
    ースホスファートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
    メラーゼ、ホスホグリセラートムターゼ、ホスホグリセ
    ラートキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ヘキソキナ
    ーゼ、及びグルコキナーゼをコードする遺伝子及び調節
    遺伝子GCR1からなる群から選ばれたサッカロミセスセレ
    ビシエ遺伝子である特許請求の範囲第10項記載の方法。
  12. 【請求項１２】遺伝子が酵母CDC4遺伝子である特許請求
    の範囲第11項記載の方法。
  13. 【請求項１３】遺伝子がシゾサッカロミセス・ポンベ
    トリオースホスファートイソメラーゼ遺伝子である特許
    請求の範囲第12項記載の方法。
  14. 【請求項１４】遺伝子が宿主細胞と異なる細胞種からの
    ものである特許請求の範囲第８項記載の方法。
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