JPH0213377A - デスルファトヒルジン化合物の製造方法 - Google Patents

デスルファトヒルジン化合物の製造方法

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JPH0213377A
JPH0213377A JP10477289A JP10477289A JPH0213377A JP H0213377 A JPH0213377 A JP H0213377A JP 10477289 A JP10477289 A JP 10477289A JP 10477289 A JP10477289 A JP 10477289A JP H0213377 A JPH0213377 A JP H0213377A
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yeast
dna
desulfatohirudin
gene
plasmid
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JP10477289A
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Bernd Dr Meyhack
ベルンド　メヤック
Raymond Dr Pridmore
レイモンド　プリドモア
Hugo Dr Grossenbacher
フゴー　グローゼンバッヒャー
Jutta Heim
ハイム ユッタ
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UCP Gen Pharma AG
Novartis AG
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Ciba Geigy AG
UCP Gen Pharma AG
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換ＤＮＡ技法に関し、そして抗凝固作用を有
するポリペプチドの製造方法に関し、そしてさらに詳し
くは遺伝子操作された酵母細胞によるデスルファトヒル
ジンの製造方法、この遺伝子操作された酵母細胞、該デ
スルファトヒルジンの遺伝子を担持するハイブリドベク
ター、並びに該酵母細胞及びハイブリドベクターの製造
方法に関する。
〔従来の技術〕
ヒルジンはヒル〔ヒルド・メディシナリス（ｌｌｉｒｕ
ｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）中に自然に存在する抗
凝固物質である。ヒルジンは単一のポリペプチド種では
なく、ヒルジン変形体１（ＨＶ１）、ヒルジン変形体２
　（ｌ（ν２）（ヨーロッパ特許出願Ｎα１５８，５６
４を参照のこと）、ヒルジン変形体Ｐ　Ａ　（ＰＣＴ出
願Ｎα８６１０３４９３を参照のこと）及びｄｅｓ　−
（Ｖａｊりｚ　−ヒルジン（ヨーロッパ特許出願Ｎα１
５Ｂ９８６を参照のこと）と称する少なくとも４種類の
代表から成る同様な作用を有するポリペプチドの類であ
る。これらの変形体はアミノ酸の数により相互に構造を
異にする（具体的には、ＨＶＩのＮ−末端配列はＶａｆ
−ＶａＪ−Ｔｙｒであり、ＨＶ２及びＰＡのそれはｌ１
ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒであり、そしてｄｅｓ−（Ｖａｊ！
Ｌ−ヒルジンのそれはＴｈｒ　−Ｔｙｒである）が、し
かしながらＮ−末端における疎水性アミノ酸の蓄積、Ｃ
−末端における極性アミノ酸の蓄積、硫酸モノエステル
として存在する千ロジン残基（Ｔｙｒ６３）、３個のジ
スルフィド橋及び抗凝固活性を共通に有する。
ヒルジンは知られている最も強いトロンビン阻害物質で
あり、そしてトロンビンに対する特異的親和性により特
徴付けられる。血液凝固カスケードの他の酵素はヒルジ
ンにより阻害されない。従来の抗凝固療法における好ま
しい抗凝固物質であるヘパリンと異り、ヒルジンはその
阻害作用を直接トロンビンに対して発揮し、そしてヘパ
リンとは異りアンチトロンビン■を介して作用しない。
精製されたヒルジンの薬理学的に検出可能な効果は血液
凝固の阻害と血栓症の予防である。イヌにヒルジンを静
脈内投与した後、心拍数、呼吸、血圧、栓球数、フィブ
リノーゲン及びヘモグロビンに対する効果は、高投与量
においてさえ存在しない。ラット、ブタ及びイヌに対す
る試験において、ヒルジンは実験血栓症（血行静止又は
トロンビンの注射により誘導される）、エンドトキシン
ショック、そしてさらにＤＩＣ（管内伝染性凝固（ｄｉ
ｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　１ｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　
ｃｏａｇｕｌａｔ１０ｎ））において有効であることが
証明されている。直接比較試験が行われる場合はいつで
も、ヒルジンはヘパリンに卓越することが証明されてい
る。さらに、ヒルジンは顕しく低い毒性を有し、非抗原
性であり、そして生物学的に活性な形で腎臓を通しての
ほとんど完全なりリアランスを示す。
最近、ヒルジン変形体をコードするｃＤＮへ及び合成遺
伝子がクローン化されそして微生物宿主中で発現されて
いる。発現生成物はＴｙｒ＆：１の硫酸モノエステルを
欠き、・・・そしてそれ故に「デスルファトヒルジン」
と称される・・・が、これらは天然の硫酸基を有するヒ
ルジンとおよそ同じ生物学的活性を示す。デスルファト
ヒルジン変形体ＨＶＩば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）（ヨーロッパ特許出＠Ｎα１５８．５６
４及びＮα１６８，３４２）において、及びサッカロミ
セス・セレビシエー（伽ＣＣ１１ｆ史邊匹競ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）　（ヨーロッパ特許出願Ｎα１６８，３４
２　、　Ｎｏ。
２００．６５５　、　Ｎα２２５，６３３、及びＮα２
５２，８５４）において発現されている。同様に、デス
ルファトヒルジン１ＩＶ２は大腸菌において（ヨーロッ
パ特許出願Ｎｏ。
１５８．５６４）　、及びサッカロミセス・セレビシエ
ーにおいて（ヨーロッパ特許出願Ｎα２００　、６５５
、及びＰＣＴ出願Ｎα８６１０１２２４）発現されてお
り、そしてｄｅｓ　　（Ｖａｆ）ｚ−デスルファトヒル
ジンは大腸菌′において（ヨーロッパ特許出願Ｎα１５
８．９８６）発現されている。
［発明が解決しようとする課題］ 一般に、ヒルジン化合物の発現効率及び収量は宿主微生
物としてＳ、セレビシェ−が使用される場合に一層高い
。しかしながら、Ｓ、セレビシェ−のために開発された
入手可能な発現系を用いてさえ、収量は比較的低い。こ
の観点から、デスルファトヒルジンの大規模な経済的製
造を可能にする改良された方法の必要性が存在する。本
発明はこの様な方法を提供することを目的とする。
サッカロミセス・セレビシエーのほとんどの株は２ミク
ロンプラスミドと称する高コピー数自律複製染色体外Ｄ
ＮＡ要素を有する。この２ミクロンプラスミドの最も顕
著な構造的特徴は、該プラスミドを異る長さの２つのＤ
ＮＡ領域に分けるそれぞれ５９９ｂｐの２個の逆方向反
復配列（ＩＲＩ及びＩＲ２）である。これらの２個の同
一のＩＲ配列間の相同性組換が２種類の分子異性体（人
形及びＢ形）の形成をもたらす。これらのＩ　Ｒ’１ｉ
ｆｆ域とは別に、２ミクロンプラスミドは１個の複製起
点（ＯＲ１）、４個のオープンリーディングフレーム（
ＲＥＰＩ。
ＲＥＰ２．　ＦＬＰ、　Ｄ）及びＳＴＢ　（又はＲＥＰ
３　）部位を含有する。ＦＬＰ遺伝子生成物はＩＲ槽構
造対して作用する部位特異的リコンビナーゼ（ｒｅｃｏ
ｍｂ　ｔｎａｓｅ）であり、そしてＲＥＰＩ　、　ＲＥ
Ｐ２及びＤ遺伝子産物により制御される。ＲＥＰＩ及び
ＲＥＰ２遺伝子産物及びＳＴＢ部位は母細胞から娘細胞
への２ミクロンプラスミドの安定な分配のために必須で
ある。
酵母での異種遺伝子の発現のために考案されたハイブリ
ドベクターは最もしばしば２ミクロンＤＮＡを含有する
。一般に、この２ミクロンＤＮＡは複製起点を含有する
が、このことは安定な形質転換のための基本的な条件で
はない。なぜなら、２ミクロンＤＮＡを含有するハイブ
リドベクターはＩＲ配列を介して内因性（ｅｎｄｏｇｅ
ｎｏｕｓ）　２ミクロンプラスミドと組み換わることが
できるからである。ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、　１６８
，３４２、Ｎα２００．６５５、Ｎｏ、　２２５，６３
３、及びＮ（１２５２，８５４中に開示されている酵母
ヒルジン発現ベクターは、複製起点、ＩＲ配列及び幾つ
かの場合にはＳＴＢ部位を含有する２ミクロンＤＮＡ断
片を含んでいる。
〔課題を解決するための手段〕
驚くべきことに、発現ベクターが完全な２ミクロンＤＮ
Ａを含有しそして宿主酵母株が内因性２ミクロンプラス
ミドを欠く場合に、形質転換体の安定性及びデスルファ
トヒルジン化合物の収量が顕著に増加することが見出さ
れた。
従って本発明はデスルファトヒルジンの製造方法に関し
、この方法は、 内因性の２ミクロンＤＮＡを欠き、そして次のプロモー
ター、すなわち（１）構成的酵母プロモーター、該プロ
モーターが作用可能に連結されているシグナルペプチド
をコードする第一ＤＮＡ配列、該第一ＤＮＡ配列と適切
なリーディングフレーム内に連結されているデスルファ
トヒルジンをコードする第二ＤＮＡ配列、及び酵母転写
停止シグナルを含有するＤＮＡ配列、から成るデスルフ
ァトヒルジン発現カセット、並びに（２）無傷のＲＥＰ
Ｉ　、　ＲＥＰ２及びＦＬＰ遺伝子並びに無傷のＯＩ？
Ｉ。
ＳＴＢ、　ＩＲＩ及びＩＲ２部位、並びに場合によって
は無傷のＤ遺伝子を含有する完全な２ミクロンＤＮＡＮ
を含んで成る酵母ハイブリドベクターにより形質転換さ
れている酵母株を培養し；そして前記デスルファトヒル
ジンを単離し、そして所望により、得られたデスルファ
トヒルジン化合物の混合物を個々の成分に分離する； ことを特徴とする。
［デスルファトヒルジン（ｄｅｓｕｌｐｈａｔｏｈｉｒ
ｕｄｉｎ）　Ｊなる用語は、文献に記載されているすべ
てのデスルファトヒルジン化合物及びデスルファトヒル
ジンをコードする遺伝子を含有する形質転換された微生
物株から得られるすべてのデスルファトヒルジン化合物
を包含する意味に用いられる。この様なデスルファトヒ
ルジンは、例えばデスルファトヒルジン変形体（ｖａｒ
ｉａｎｔ）　ＨＶ　１　、　ＨＶ２　、　ＨＶ２　（修
飾形）、ＰＡ及びｄｅｓ　−（Ｖａｆ）ｚ−デスルファ
トヒルジンである。ヒルジン活性（すなわちトロンビン
阻害活性）を有する誘導体も「デスルファトヒルジン」
に包含されるものと理解すべきである。
この様な誘導体は特に、Ｃ−末端が短縮されたデスルフ
ァトヒルジン、すなわちＣ−末端において１〜７個、好
ましくは１〜４個のアミノ酸を欠くデスルファトヒルジ
ンである。
好ましいデスルファトヒルジンは、次の式（■）：Ｘ　
Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＡｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　
Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　
Ａｓｎ　　ＶａｌＣｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌ
ｙ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｌｅ
ｕ　　ＧｌｙＳｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ
　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉ
ｎ　Ｓａｒ　Ｈ４５Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｉｅ　Ｐｒｏ　ＧｌｕＧｌ
ｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ （ｒ） で表わされ、式中、Ｘがジペプチド残基νａｌ　−Ｖａ
ｆ−である変形体ＨＶ　１　、及びＸがＴｈｒであるｄ
ｅｓ（Ｖａｌｅｔ−ヒルジン、並びにＣ−末端アミノ酸
−Ｇｉｎ、　Ｃ−末端ジペプチド−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ、、
Ｃ−末端トリペプチド−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ
又はＣ−末端テトラペプチド−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
−Ｇｉｎを欠くその誘導体： 次の式（■）： Ｙ＋　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　
Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖ
ａｌＣｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ
　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ
Ｓｅｒ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｉ
ｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　
Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｙ、　　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ｔ
ｌｉｓＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｔｙｒ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｎ （ｎ） で表わされ、Ｙ、がＮ−末端ジペプチドｌ１ｅ−Ｔｈｒ
−でありそしてＹ２がＡｓｎである変形体ＨＶ２、又は
Ｌｙｓである変形体、並びにＹｌがＶａｊ２−Ｖａｆで
ありそしてＹ２がＡｓｎであるか、又はＬｙｓである）
ＩＶ２（修飾形）；並びに 次の式（■）： ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＧｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ
　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　
ＡｓｎＶａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓ
ｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ｌｉｅ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｓｅｒ　
Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃ
ｙｓ　ＶａｔＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ
　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　５ｅｒＨｉｓ　Ａ
ｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒ
ｏ　Ｉｌｅ　Ｐｒ。
Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ（Ｉ
Ｉ１） で表わされるＰＡである。最も好ましいデスルファトヒ
ルジン化合物は、Ｘがジペプチド残基Ｖａｎ−Ｖａｉ、
−である式（１）のそれである。
酵母宿主株及びハイブリドベクターの構成成分は後に詳
細に記載する。
形質転換された酵母株は当業界において知られている方
法を用いて培養される。
すなわち、本発明の形質転換された酵母株は、資化性炭
素源、窒素源及び無機塩を含有する液体培地中で培養さ
れる。
種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素源
の例として、資化性炭水化物、例えばグルコース、マル
トース、マンニトール、フラストースもしくはラクトー
ス、又は酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムが挙げられ、こ
れらは単独で、又は適当に混合して使用される。適当な
窒素源には、例えばアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプ
チド及び蛋白質並びにそれらの分解生成物、例えばトリ
プトン、ペプトン又は肉エキス、さらに酵母エキス、マ
ルトエキス、コーンスチーブリカー、並ヒにアンモニウ
ム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は
硝酸アンモニウムが含まれ、これらは単独で又は適当に
混合して使用される。
使用することができる無機塩には、例えばナトリウム、
カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化
物、リン酸塩及び炭酸塩が含まれる。
さらに、栄養培地はまた増殖促進物質を含有することが
できる。増殖促進物質には、例えば微量因子、例えば鉄
、亜鉛、マンガン等、又は個々のアミノ酸が含まれる。
完全２ミクロンＤＮＡ　（機能的複製起点を含む）は内
因性２ミクロンプラスミドを欠くサッカロミセス・セレ
ビシエーの株（いわゆるｃｉｒ’株）中に安定に維持さ
れ、非選択条件下、すなわち完全培地中、で培養を行う
ことができる。
培養は常法により行われる。培養条件、例えば温度、培
地のｐＨ及び発酵時間は、最高レベルのデスルファトヒ
ルジンが生産されるように選択される。選択された酵母
株は、好ましくは、振とう又は撹拌を伴う液深培養にお
いて、好気的条件下で、約２５°Ｃ〜３５°Ｃ１好まし
くは約２８°Ｃの温度で、ｐＨ４〜７、例えばおよそｐ
Ｈ５において、少なくとも１時間から３日間、好ましく
は満足すべき量のデスルファトヒルジンが得られるまで
培養する。
使用される酵母株、プロモーター及びシグナルペプチド
に関係なく、生産されたデスルファトヒルジンのほとん
どが培地中に分泌され、わずかな部分のみが細胞に結合
したまま残る。分泌される化合物と細胞に細胞した化合
物との正確な比率は発酵条件、及び適用される回収方法
に依存する。
一般に、これは８：１以上となる。従って、分泌される
デスルファトヒルジンが常に支配的である。
デスルファトヒルジンは培地から常用手段によって単離
することができる。例えば、第一段階は一般に、培養液
から遠心分離により細胞を分離することから成る。得ら
れる上清をポリエチレンイミンで処理してほとんどの非
−蛋白質性物質を除去しそして硫酸アンモニウムにより
液を飽和して蛋白質を沈澱せしめることにより、デスル
ファトヒルジンを濃縮することができる。宿主の蛋白質
は、もし存在すれば、酢酸による酸性化（例えば、０．
１％、ｐＨ４〜５）により沈澱せしめることができる。
デスルファトヒルジンの更なる濃縮は、該酢酸上清をｎ
−ブタノールで抽出することにより達成することができ
る。他の精製段階は、例えば脱塩、クロマトグラフ法、
例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、分配クロマトグラフィー、逆相１１ＰＬ
Ｃ等を包含する。
混合物の構成成分の分離はまた、透析により、ゲル電気
泳動もしくはキャリヤー−フリー電気泳動により電荷に
従って、適当なセファデックスカラムにより分子サイズ
に従って、アフィニティークロマトグラフィーにより、
例えば抗体、特にモノクローナル抗体を用いるアフィニ
ティークロマトグラフィーにより、又はアフィニティー
クロマトグラフィーのために適当なキャリヤーに結合し
たトロンビンを用いて、あるいは他の方法、特に文献に
記載されている方法により、行われる。
細胞に結合している追加のデスルファトヒルジン、すな
わち細胞内又はペリプラズム空間に蓄積しているデスル
ファトヒルジンを単離することが望ましい場合、幾つか
の補完的精製段階が必要である。すなわち、デスルファ
トヒルジンが細胞内に蓄積されている場合、その回収の
第一段階はそれを細胞内から遊離せしめることから成る
。はとんどの方法において、まずグルコシダーゼ（後記
）消化によって細胞壁が除去される。次に、生ずるスフ
ェロプラストがトリトンのごとき洗剤により処理される
。あるいは、細胞を破壊するために機械的力、例えば剪
断力（例えば、メープレス、フレンチプレス）、又はガ
ラスピーズとの振とうが適当である。デスルファトヒル
ジンが酵母宿主によりペリプラズム空間に分泌される場
合、単純化された方法を用いることができる。すなわち
、デスルファトヒルジンは細胞溶解を伴わないで、細胞
壁の酵素的除去により、又は細胞壁を損傷して生成分の
放出を可能にする化学物質、例えばチオール試薬又はＥ
ＤＴＡでの処理により、回収される。
得られたデスルファトヒルジンの混合物は、常用手段、
例えばクロマトグラフ法、例えば逆相クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー、を
適用することにより分離され得る。
ヒルジン活性を検出するために、抗−ヒルジン抗体又は
抗−デスルファトヒルジン抗体（例えば、ハイブリドー
マ細胞からのモノクローナル抗体）を用いる試験、トロ
ンビン試験（Ｍ、ＩＪ、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ繁集、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ、　Ｖｏｌ　Ｕ　＊３１４−３１６頁、Ｖｅｒｌａ
ｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（西独）１９８
３）　、又は血液凝固試験（Ｆ、Ｍａｒｋｗａｒｄｔ等
、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、　４７．２２６（１
９８２）　）を用いることができる。
本発明の形質転換された酵母宿主細胞は、（ａ）構成的
酵母プロモーター、該プロモーターが作用可能に連結さ
れているシグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列
、該第一ＤＮＡ配列と適切なリーディングフレーム内に
連結されているデスルファトヒルジンをコードする第二
ＤＮＡ配列、及び酵母転写停止シグナルを含有するＤＮ
Ａ配列、から成るデスルファトヒルジン発現カセット、
並びに（２）無傷のＲＥＰＩ　、　Ｒ１１！Ｐ２及びＦ
ＬＰ遺伝子並びに無傷のＯＲ１、　ＳＴＢ、　ＩＲＩ及
びＩＲ２部位、並びに場合によっては無傷のＤ遺伝子を
含有する完全な２ミクロンＤＮＡＮを含んで成る酵母ハ
イブリドベクターを用意し； 内因性２ミクロンＤＮＡを欠く酵母宿主を用意し； このｃｉｒ”株を前記ハイブリドベクターにより形質転
換し：そして 未形質転換酵母細胞から形質転換された酵母細胞を選択
する； 段階を含んで成る、組換ＤＮＡ技法により製造すること
ができる。
本発明は、（１）構成的酵母プロモーター、該プロモー
ターが作用可能に連結されているシグナルペプチドをコ
ードする第一ＤＮＡ配列、該第一ＤＮＡ配列と適切なリ
ーディングフレーム内に連結されているデスルファトヒ
ルジンをコードする第二ＤＮＡ配列、及び酵母転写停止
シグナルを含有するＤＮＡ配列、から成るデスルファト
ヒルジン発現カセット、並びに（２）無傷のＲＥＰＩ　
、　ＲＥＰ２及びＦＬＰ遺伝子並びに無傷のＯＲ１、　
ＳＴＢ、　ＩＲＩ及びＩＲ２部位を含有する完全な２ミ
クロンＤＮＡＮを含んで成る酵母ハイブリドベクターに
関し、さらにその製造方法に関する。
構成的酵母プロモーターは好ましくは、高度に発現され
る酵母遺伝子、例えば解糖系酵素をコードする遺伝子に
由来し、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ［ｌＩ＋）
　、３−ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）　、
ヘキソキナーゼ、ピルベート・デヒドロゲナーゼ、ホス
ホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・
イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピ
ルベート・キナーゼ、トリオースホスフェート・イソメ
ラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼの各々の遺伝子のプロモーター、さらには旦１又
はＴＲＰ　Ｉプロモーター、及び上流活性化部位が除去
された短縮された酸性ホスファターゼＰＨ０５プロモー
ターである。特に好ましいプロモーターは、ＧＡＰＤＨ
プロモーター、及びＧＡＰＤＨ遺伝子の−５５０と−１
８０との間のヌクレオチド、特にヌクレオチド−５４０
、−２６３又は−１９８から始まりそしてヌクレオチド
−５で終るその機能的断片、並びに鷹遺伝子の−２００
と−１５０との間のヌクレオチド、特に−１７３のヌク
レオチドから始まりそしてヌクレオチド−９で終る短縮
された構成的Ｐ　１１０５プロモーターである。
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（「シグナル
配列」）は好ましくは、通常分泌されるポリペプチドを
コードする酵母遺伝子に由来するものである。ヒルのゲ
ノムＤＮＡから得られるヒルジン・シグナル配列も選択
され得る。酵母シグナル配列は例えば酵母インベルター
ゼ、且−フアクタ−、フェロモンペプチダーゼ（ＫＥＸ
１）、「キラートキシン（ｋｉｌｌｅｒ　ｔｏｘｉｎ）
　Ｊ及び抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＬＱＭ）の各遺
伝子シグナル配列及びプレプロ配列、並びにアスペルギ
ルス・アワモリ（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｅｕｓ　ａｗａｍｏ
ｒｉ）からのグルコアミラーゼシグナル配列である。あ
るいは、使用されるプロモーターに天然にリンクしてい
る遺伝子（例えばＰＨ０５’）のシグナル配列（もし存
在すれば）の部分とヒルジンシグナル配列の部分との連
絡により融合シグナル配列を構成することができる。
シグナル配列とデスルファトヒルジンのアミノ酸配列と
の間の正確な開裂を可能にする組み合わせが好ましい。
特異的なプロセシングシグナルを担持しているか又は担
持していないプロ配列又はスペーサー配列のごとき追加
の配列を構成物中に含めることにより前駆体分子の正確
なプロセシングを促進することもできる。あるいは、生
体内又は生体外で適正な成熟を可能にする内部プロセシ
ングシグナルを含有する融合蛋白質を生じさせることも
できる。例えば、プロセシングシグナルは、ゴルジ（Ｇ
ｏｌｇｉ）膜中に存在する酵母エンドペプチダーゼによ
り認識されるＬｙｓ−Ａｒｇ残基を含有する。
本発明の好ましいシグナル配列は、次の式：％式％ で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母ＰＨ０
５遺伝子のシグナル配列、及び次の式：％式％ で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列である。
デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列はヒルの
ゲノムＤＮＡから単離することができ、あるいはデスル
ファトヒルジンｎ＋ＲＮＡに相補的な二本鎖デスルファ
トヒルジンＤＮＡ　（デスルファトヒルジンｄｓ　ｃＤ
ＮＡ）を調製することができ、あるいはデスルファトヒ
ルジンのアミノ酸配列をコードする遺伝子をそれ自体既
知の方法により、化学的方法及び酵素的方法で調製する
ことができる。
酵母転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列は好ましく
は、転写停止及びポリアゾニレ−ジョンのための適切な
シグナルを含有する酵母遺伝子の３′フランキング配列
である。適当な３′フランキング配列は例えば使用され
るプロモーターに天然にリンクしている酵母遺伝子のそ
れである。好ましいフランキング配列は酵母Ｐ　Ｉ＋　
０５遺伝子のそれである。
酵母プロモーター、シグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列、デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列
及び酵母転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列が作用
可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結される。すなわち、こ
れらがその正常な機能を維持する態様で並置（ｊｕｘｔ
ａｐｏｓｅ）される。この並びは、プロモーターがシグ
ナル配列−デスルファトヒルジン遺伝子複合体の適切な
発現を行い、転写停止シグナルが転写及びポリアゾニレ
−ジョンの適切な停止を行い、そしてシグナル配列が適
当なリーディングフレーム内でデスルファトヒルジン遺
伝子に連結していて該シグナル配列の最終コドンがデス
ルファトヒルジンの遺伝子の第一コドンに直接に結合し
ており、そしてデスルファトヒルジンの分泌が起こる、
こととなる様な並びである。プロモーター及びシグナル
配列が異る遺伝子に由来する場合、プロモーターは好ま
しくは、主要ｍＲＮＡ開始（ｍｏｊｏｒ　ｍＲＮＡ　５
ｔａｒｔ）と該プロモーターに天然にリンクしている遺
伝子のＡＴＣとの間でシグナル配列に連結される。シグ
ナル配列は翻訳開始のためにそれ自身のＡＴＣ有すべき
である。これらの配列の連結は、エンドヌクレアーゼの
認識配列を担持する合成オリゴヌクレオチドリンカーに
より行うことができる。
本発明のハイブリドベクターは中断されない形の完全な
２ミクロンＤＮＡを含有する。すなわち、２ミクロンＤ
ＮＡは制限エンドヌクレアーゼにより一度開裂され、こ
の線状化されたＤＮＡがベクターの他の成分と連結され
た後に再還化される。
ＲＥＰＩ　、　ＲＥＰ２及びＦＬＰ遺伝子並びにＯＲ１
、　ＳＴＢ。
ＩＲＩ及びＩＲ２部位の正常な機能が維持される様に当
該制限部位が選択される。場合によっては、該制限部位
はＤ遺伝子も無傷のまま維持されるように選択される。
好ましい制限部位は、Ｄ遺伝子内に位置するユニークＰ
ｓｔ　１、並びに前記すべての遺伝子及び部位の外側に
位置するユニークＨｐａ　　Ｉ部位及び５ｎａＢ　Ｉ部
位である。
好ましくは、本発明のハイブリドベクターは、１個又は
複数個の、特に１個又は２個の酵母用選択遺伝子マーカ
ー並びに細菌宿主、特に大腸菌用の選択遺伝子マーカー
及び複製起点を含有する。
酵母用選択遺伝子マーカーについては、マーカー遺伝子
の表現型発現に基いて形質転換体の選択を容易にする任
意のマーカー遺伝子を使用することができる。酵母のた
めの適当なマーカーは例えば、抗生物質耐性を発現する
もの、又は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の障害
を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は例えば抗生
物質Ｇ４１８、ハイグロマイシンもしくはプレオマイシ
ンに対する耐性を付与し、又は栄養要求性酵母変異株に
原栄養性、例えば■門、■皿２皿又は二遺伝子を提供す
る。
ハイブリドベクターの増幅が大腸菌中で便利に行われる
ように、大腸菌遺伝子マーカー及び大腸菌複製起点を含
めるのが有利である。これらは、大腸菌複製起点及びア
ンピシリンのごとき抗生物質に対する耐性を付与する大
腸菌遺伝子マーカーの両者を含有する、大腸菌プラスミ
ド、例えばｐＢＲ３２２、又はｐｕｃプラスミド、例え
ばｐＵｃｌＢもしくはｐＵｃ１９から得ることができる
。
本発明のハイブリドベクターは当業界において知られて
いる方法により調製することができる。
この方法においては、ＲＥＰＩ　、　ＲＥＰ２及びＦＬ
Ｐの各遺伝子並びにＯＲ１、　ＳＴＢ、　ＩＲＩ及びＩ
Ｒ２の各部位の正常な機能が維持されるような態様で２
ミクロンプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼに
よって開裂せしめ、こうして得られた線状化されたプラ
スミドをデスルファトヒルジン発現カセットに、及び場
合によってはさらにｌ又は複数の酵母用選択遺伝子マー
カー並びに細凹宿主用の複製起点及び選択遺伝子マーカ
ーを含有するＤＮＡセグメントに連結し、そしてこうし
て得られたハイブリドベクターを再環化する。
２ミクロンブースミ゛　１　　ない　　　の１゜１１２
ミクロンプラスミドの安定性は、プラスミドによりコー
ドされた３つの機能により与えられる。
ＲＥＰＩ遺伝子産物及びＲＥＰ２遺伝子産物は２ミクロ
ンプラスミドの安定な分配のために要求されるトランス
−作用（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）蛋白質である。分
配の効率がＲＥＰＩ遺伝子生成物の遺伝子量に依存する
（Ａ、Ｃａ５ｔ＋ｍｏｒｅ等、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ、２０３．１５４（１９８６）点において、上記２
つの内ＲＥＰＩが一層重要であろう。これら２種類の蛋
白質は、プラスミド上の重要なシス−作用（ｃｉｓ−ａ
ｃｔｉｎｇ）要素であるＳＴＢ　（ＲＥＰ３）に作用す
る（　Ｍ、Ｊａｙａｒａｍ等、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ１
０ｌ。
（１９８５）２４６６　；　Ｂ、Ｖｉｅｔ等、　Ｍｏ１
．Ｃｅ１１．Ｂ１０ｌ、（１９８５）２１９０）。下記
の方法は、第二のプラスミドによる２ミクロンプラスミ
ドのキユアリング（ｃｕｒｉｎｇ）がＳＴＢ部位の増加
に関与してＲＥＰＩ蛋白質及びＲＥＰ２蛋白質を消耗（
ｔｉｔｒａｔｅ　ｏｕｔ）するという仮定に基いている
。ＲＥＰＩ蛋白質及びＲＥＰ２蛋白質の相対的減少が内
因性２ミクロンプラスミドの不安定性を導くであろう。
好ましくは、使用される第ニブラスミドはＲＥＰ２遺伝
子に欠陥を有するか該遺伝子を欠くものである。この様
なプラスミドの例として、ＲＥＰＩ遺伝子とは別に逆方
向反復配列（ＩＲ２）を欠＜　ｐＤＰ３８が挙げられる
。これはその高コピー数発現を内因性２ミクロンプラス
ミドによるＲＥＰＩ蛋白質の補完に依存せしめる。この
ものは、２個の酵母遺伝子マーカー、すなわち、高コピ
ー数状態及び低コピー数状態の両方において用いられる
ＵＲＡ３、並びに高コピ数状態においてのみ用いられる
ｄＬＥＵ　２を含有する（Ｅ、Ｅｒｈａｒｔ等、Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒ１０ｌ、　（１９６３）６２５）。
［１ｒａ−及びＬｅｕ−である酵母株をプラスミドｐＤ
Ｐ３８により形質転換し、そしてυｒａ”コロニーを選
択する。ウラシル不含有プレート上での選択（ｌｉｒａ
選択）が、ロイシン不含有プレート上での選択（Ｌｅｕ
選択）に比べて非常に良好な形質転換頻度を与える。ｔ
ｌＲＡ３遺伝子は欠陥ｄＬＥＵ　２遺伝子よりも非常に
良好に発現されるからである。単一コロニーを選択し、
そしてＬｅｕ選択プレート上にストリークする。これに
より種々のサイズ及び形態のコロニーが生ずる。最も小
さいコロニーの幾つかをＵｒａ選択プレート上に再スト
リークし、そしてＬｅｕ選択プレート上にレプリカプレ
ートする。
Ｌｌｒａ選択のもとで増殖することができるがしかしＬ
ｅｕ選択のもとでは非常に緩慢にのみ増殖することがで
きるコロニーを選択する。Ｕｒａ選択プレート上での増
殖はプラスミドｐＤＰ３８がなお存在すること、及びＬ
ｅｕ選択のもとでの緩慢な増殖がこのプラスミドの喪失
に基くものではないことを示しており、そしてＬｅｕ選
択のもとての増殖の失敗はｐＤＰ３８がこのマーカーを
補完できないことを意味する。後者の事実は二様に説明
することができる。
Ａ　：　　ｐＤＰ３８上のＬＥＵ２遺伝子が変異してい
る；又はＢ：このプラスミドはそのコピー数を上昇せし
めることができないためにＬｅｕ２を補完することがで
きず、ＲＥＰＩ遺伝子産物を補完するために２ミクロン
プラスミドが利用されない（すなわち失われている）こ
とを意味する。
これら２つの可能性は非常に容易に区別することができ
る。第一の場合、前記コロニーに見られる最小の増殖（
ｐＤＰ３８を有しない細胞が全く増殖しないのに対して
）は、幾らかのＬＥｔ１２の発現が存在することを示す
。第二の点は直接に試験することができる。なぜなら、
２ミクロンプラスミドの非存在下においてはｐＤＰ３８
はＡＲＳタイプのプラスミドとしてのみ機能する、すな
わちそれは非常に不安定であって少数世代の後はとんど
のコロニーはそれを失うからである。従って、単一コロ
ニーをＹＰＤプレート上にストリークし、単一コロニー
を取り、そしてウラシル不含有プレート上にレプリカプ
レートした場合、少数のみがＵｒａ選択のもとで増殖す
るであろう。増殖しないコロニーをｐｔｌｃ及び２ミク
ロン配列についてのハイブリダイゼーションによりチエ
ツクする。ハイブリダイゼーシゴンシグナルを示さない
コロニーはプラスミドｐＤＰ３８及び内因性２ミクロン
プラスミドを含有しない（ｃｉｒ’株）。
本発明のｃｉｒ″株はまた、あまり好ましくはないが、
既知の方法により調製することもできる〔例えば、Ｃ，
Ｐ、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉ
ｃｒｏｂ１０ｌ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、９６．１１９（１９８２）を参照のこ
と〕。
ノ　−　　れた 本発明はさらに、内因性の２ミクロンＤＮＡを欠いてお
り、そして次のハイブリドベクター、すなわち（１）構
成的酵母プロモーター、該プロモーターが作用可能に連
結されているシグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ
配列、該第一ＤＮＡ配列と適切なリーディングフレーム
内に連結されているデスルファトヒルジンをコードする
第二ＤＮＡ配列、及び酵母転写停止シグナルを含有する
ＤＮＡ配列、から成るデスルファトヒルジン発現カセッ
ト、並びに（２）無傷のＲＥＰＩ　、　ＲＥＰ２及びＦ
ＬＰ遺伝子並びに無傷のＯＲ１、　ＳＴＢ、　ＩＲＩ及
びＩＲ２部位を含有する完全な２ミクロンＤＮＡＮを含
んで成る酵母ハイブリドベクターにより形質転換された
酵母株に関する。本発明はさらに該形質転換された酵母
株の製造方法に関する。
適当な酵母宿主株には内因性２ミクロンプラスミドが除
去されたサッカロミセス・セレビシエーが含まれる（前
記参照のこと）。
前記の形質転換された酵母株の製造方法は、内因性２ミ
クロンプラスミドを欠く酵母株を前記ノ１イブリドベク
ターにより形質転換することを含む。
本発明のハイブリドベクターによる酵母の形質転換は、
旧ｎｎｅｎ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ　７５＋１９２９　（１９７Ｂ）　）により
記載されている方法により行うことができる。この方法
は次の３つの段階に分けることができる。
（１）グルコシダーゼの種々の調製物、例えばカタツム
リの腸液（例えば、グルスラーゼ（Ｇｌｕｓｕｌａｓｅ
）又はヘリカーゼ（ｌｌｅｌｉｃａｓｅ）　）又は微生
物からの酵素混合物〔例えばチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌ
ｙａｓｅ）　）を浸透圧的に安定な溶液中で用いて酵母
細胞壁又はその部分を除去する。
（２）「裸の」酵母細胞（スフェロプラスト）をＰＥＧ
　（ポリエチレングリコール）及びＣａ〜ミルイオン在
下でＤＮＡベクターにより処理する。
（３）寒天の固層中で、細胞壁を再生しそして形質転換
された細胞を選択する。この再生は便利にはスフェロプ
ラストを寒天中に包埋することにより行われる。例えば
、溶融した寒天（約５０°Ｃ）をスフェロプラストと混
合する。この溶液を酵母増殖温度（約３０°Ｃ）に冷却
した後固層が得られる。この固層は、スフェロプラスト
からの必須巨大分子の急速な拡散及び喪失を防止し、そ
してこれによって細胞壁の再生を促進するためのもので
ある。しかしながら、あらかじめ形成された寒天層の表
面にスフェロプラストをプレートすることによっても（
効率は低いが）細胞壁の再生を行うことができる。
好ましくは、再生寒天は、再生及び形質転換された細胞
の選択が同時に可能なように調製される。
アミノ酸又は核酸生合成経路の酵素をコードする酵母遺
伝子が一般に選択マーカー（前記）として使用されるか
ら、再生は好ましくは酵母最小寒天中で行われる。非常
に高効率の再生が必要な場合、次の二段階法、すなわち
、（１）富複合培地中での細胞壁の再生、及び（２）選
択寒天プレート上への細胞層のレプリカによる形質転換
された細胞の選択、を用いる方法が有利である。
本発明はまた、本発明の方法により得られる新規なデス
ルファトヒルジン化合物に関する。
本発明の方法により得られるデスルファトヒルジン化合
物は、ヨーロッパ特許出願ｋ　１６８．３４２に記載さ
れているように、天然ヒルジンと同様に、血栓症の治療
及び予防のため、急性ショック療法のため、消費凝結皿
状症の療法等のために使用することができる。
本発明はさらに、例に記載されているような、ハイブリ
ドベクター、形質転換された酵母株、該ハイブリドベク
ター及び該形質転換された酵母株の製造方法、並びにデ
スルファトヒルジン化合物の製造方法に関する。
次の実験の部において、本発明の種々の態様を図面に言
及しながら説明する。
ｌ１し１皿 ヒルジンｍＲＮＡの最適の翻訳を保証するため、ヒルジ
ン発現カセットのコード配列は好ましい酵母コドン（Ｂ
、Ｈａｌｌ、　Ｊ、Ｂ１０ｌ、Ｃｈｅｍ、２５７（１９
Ｂ２）３０２６）を用いて設計される。このコード配列
は、デスルファトヒルジンＨＶＩのコード配列にインフ
レーム融合したＰ　）＋　０５シグナル配列を含有する
。合成りＮＡの５′−末端はＥｃｏＲＩ制限部位の接着
末端を含有する。３′末端において、終止コドンＴＡＧ
のすぐ後にＢａｍＨＩ部位の接着末端が存在する。２５
７ｂｐのＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片の配
列を第１図に示す。
第１図はまた、二本８ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片の生体外合成
のための方法を示す。アプライド・バイオシステムズ・
モデル３８０Ｂ合成機上でホスホルアミダイト法（Ｍ２
）１．ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎ
ｄ　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇ
ｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｈ，Ｇ、Ｇａ５５ｅｎ及
びＡ、Ｌａｎｇ＆ｌＷ集）を用いて２１種類のオリゴヌ
クレオチドを合成する。個々のオリゴヌクレオチドの配
列を第１図に示す。オーバーラツプはユニークである。
凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを５０ｍＭＴｒｉｓ
−１１ｃｊ！　　（ｐＨ８，０）中に１０ｐｍｏｌ／ｌ
ｄの濃度で溶解する。２１種類のオリゴヌクレオチドは
２つのグループ、すなわち（Ａ）ＤＮＡ断片の５′−側
半分を代表するＮαｌ−１１、及び（Ｂ）３’　−側半
分のためのＮＯ，１２〜２１、に配分される。２つのグ
ループを別々に処理する。１つのグループの１０μｍｏ
ｌずつのオリゴヌクレオチドを混合する。
オリゴヌクレオチドを２０１１１の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　−ＨＣｊ２（ｐＨ８，０）　、　１０ｍＭ　ＭｇＣｊ
！ｚ　、　１０ｍＭ　ＮａＣ１、３ｍＭ　ＤＴＴ。
０、４　ｍＭ　ＡＴＰ及び８ユニツトのポリヌクレオチ
ドキナーゼ（ベーリンガー）中で３７°Ｃにて１時間リ
ン酸化する。室温にて３０分間装いた後、両温合物（Ａ
及びＢ）をそれぞれ水浴中で９５゛Ｃにて５分間加熱す
る。サンプルを水浴中に一装置いて室温まで徐々に放冷
する。次に、アニールされたオリゴヌクレオチド混合物
Ａ及びＢを氷上に貯蔵する。
プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲ１及びＢａｍ）ｌ　
Ｉにより完全に切断する。４ｋｂの大断片を分取用０．
６％アガロースゲル上で単離する。ＤＮＡを電気溶出に
より回収し、ＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィーに
より精製し、そして例２に記載するようにしてエタノー
ル沈澱する。ＤＮＡを０．４ｐ惜ｏｌ／Ｊｔｌの濃度で
水に再溶解する。
１０Ｊ！１のアニールされたオリゴヌクレオチドＡ（５
ｐｍｏｌずつのオリゴヌクレオチド１〜１１）、９、５
　ｄの混合物Ｂ（５ｐｍｏｌずつのオリゴヌクレオチド
１２〜２１）　、０．４　ｐｍｏｌの４　ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ　−Ｂａｍ）Ｉ　ＩｐＢＲ３２２断片及び４００ユ
ニツトの７４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）を１５
°Ｃにて１６時間インキュベートする。
１０１１１のアリコートを用いてコンピテント大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ　Ｃａ”株を形質転換する。１２個の形質転換
されたアンピシリン耐性コロニーを別々に、１００ｇ／
ｍｆｆ１のアンピシリンを含有するＬＢ培地中で増殖せ
しめる。プラスミドＤＮＡをＨｏｌｍｅｓ等（Ａｎａｌ
、Ｂ１０ｃｈｅｍ、　１１４（１９８１）　１９３）の
方法により調製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制
限消化により分析する。２５７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ａｎ＋Ｈ１挿入部を有するプラスミドＤＮＡを両鎖につ
いてのＤＮＡ配列決定によりさらに分析する。オリゴヌ
クレオチド３゜１１　、１２　、１４及び２０（第１図
を参照のこと）を配列決定プライマーとして用いる。両
ＤＮＡ鎖について正しい配列を有する１個のクローンを
選択し、そしてｐＢＲ３２２／　Ｙ）ｌ　ＩＲと称する
。
ｌ　　ブースミ゛　ＪＰＤ２０７　　ＧＡＰＦＬ−Ｙ）
ＩＩＲの　１ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲは
、酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒド
ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の短い構成的プロモーターの
制御のもとにデスルファトヒルジン変形体１１ｖ１を発
現するための酵母プラスミドである。デスルファトヒル
ジンのコード配列は好ましい酵母コドンから成る。
１０躍のプラスミドｐＢＲ３２２／ＹＨＩＲを制限エン
ドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化す
る。
２５７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨ１断片を１．２％
分取用アガロースゲル上で他のＤＮＡ断片から分離する
。　ＤＮＡのバンドを臭化エチジウムにより染色し、そ
して３６０ｎｍのＵＶ光のもとで可視化する。２５７ｂ
ｐ　ＤＮＡバンドをゲルから切り取り、そして０．２　
Ｘ　ｒＢＥ緩衝液（ＴＢＥ　：　９０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩
基、９０ｎ＋Ｍ硼酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ　、　ｐＨ８
，３）中に１００ｍＡにて４５分間電気溶出する。４５
秒間極性を変えた後、ＤＮＡ溶液を集め、そして０．１
５Ｍ　ＮａＣｌ１に三周製する。このＤＮＡをＤＥ５２
イオン交換体（ワットマン）のベツド１００４に吸着せ
しめ、そして４００ｐｌの高温緩衝液（１０ｍＭ↑ｒｔ
ｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ８，０）　　、　１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　、　１．５　ＭＮａＣｌ　）中で溶出する。ＤＮＡ
をエタノール沈澱せしめそして０．１　ｐｍｏｌ　／　
ｐｉの濃度で水に再懸濁する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ（ヨー
ロッパ特許出願Ｎ（１２２５，６３３）は、酵母酸性ホ
スファターゼ（劇的）のシグナル配列にインフレーム融
合したデスルファトヒルジンの合成遺伝子（大腸菌のコ
ドンの使用に基（）を含有する。この遺伝子は、シャト
ルベクターｐＪＤＢ２０７上の酵母の短い構成的グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（
ＧＡＰＦＬ）プロモーターの制御のもとに発現される。
１０ｍのプラスミドｐＪ［１Ｂ２０７／ＧＡＰＦＬ−Ｈ
ＩＲをＳａｊ！Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化する。４７８ｂ
ｐ　Ｓａｌ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片はＳａ　ｌ　−Ｂａａ
＋　ｐＢＲ３２２部分及びＧＡＰＦＬプロモーターを含
有する。このＤＮＡ断片を０．８％分取用アガロースゲ
ル上で単離し、電気溶出し、そしてＤＥ５２クロマトグ
ラフィー及びエタノール沈澱により精製する。ＤＮＡを
０．１ｐｍｏｌ／ｌ１１の濃度で水中に再懸濁する。５
Ｉ４のｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲを５ａｆｆ
ｉｌ及びＢａｍＨＩにより消化する。大６．７ｋｂベク
ター断片を上記のようにして単離する。
０、２　ｐａ＋ｏｌの４７８ｂｐ　Ｓａｄ　Ｉ　−Ｂｃ
ｏＲＩプロモーター断片、ＰＨ０５シグナル配列及び合
成ヒルジン遺伝子（酵母コドン）を含有する２５７ｂｐ
　ＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍｔｌ　Ｉ断片０．２　ｐｍｏｌ
、並びに０．１　ｐｍｏｌの６．７ｋｂベクタ一断片を
１０４の６０＋＊Ｍ　Ｔｒｔｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７
，５）　　、　１０℃ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、　５　ｎ＋
Ｍ　ＤＴＴ　、　１　ｍＭ　ＡＴＰ及び２００ユニツト
の７４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）中で１５℃に
て６時間連結せしめる。連結混合物の１１１１のアリコ
ートを用いてコンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞を形質
転換する。
１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを別
々に、１１０ＯＲ／１１のアンピシリンを含有するＬＢ
培地中で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡをｔｌｏｌｍ
ｅｓ等（前掲）の方法により調製し、そしてＳａ　ｌ　
Ｉ　／　Ｈ３ｎｄ　ｍ二重消化により分析する。予想通
りの制限パターンを有する単一クローンをｐＪＤＢ２０
７／ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲと称する。
同様にして、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−
ＨＩＲ（ヨーロッパ特許出願Ｎα２２５．６３３　）の
５４３ｂｐＳａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩプロモーター断片
を用いて作製を行うことができる。生ずる新しいプラス
ミドをｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−ＹＩＩＩＲと称す
る。
ｐＪＤＢ２０７／飢匹（−１７３）　−Ｉｆ　ＩＲは、
短い■旺プロモーターの制御のもとにデスルファトヒル
ジン変形体）ＩＶＩを発現せしめるための酵母プラスミ
ドである。皿０５　（−１７３）プロモーター要素は酵
母ニプロモーターの一９位から一１７３位（ＢｓｔＥＩ
Ｉ制限部位）のヌクレオチド配列を含有するがしかし上
流制御配列（ＵＡＳ）を有しない。従ってＰＩＩ０５（
−１７３）プロモーターは構成的プロモーターのように
挙動する。
プラスミドｐＪＤＢ２０？／ＰＩ（亜（Ｅｃｏ）−１１
１Ｒ（ＨＰ　２２５　。
６３３）は、皿シグナル配列のＡＴＧに対して一８位に
ＥｃｏＲ１部位が導入されている完全な長さの制御され
る２プロモーター、デスルファトヒルジンのためのコー
ド配列、及びこれに続＜　ＰＨ０５転写停転写停止台有
する。この例は、短いＰ）１０５　（−１７３）プロモ
ーター要素による制御されるＰＨ０５プロモーターの置
換を記載する。
２０ｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ｐＨ０５（Ｅｃｏ
）−ＨＩＲをＢｓｔＥＩＩにより消化する。制限断片の
接着末端を、２００ｔｌ！の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ”ＨＣ
Ｊ　　（ｐＨ７，５）　、　１０ｍＭ　ＭｇＣｆ　ｚ　
。
０．１ｍＭずつのｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴ
Ｐ及びＴＴＰ中で室温にて３０分間、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（１ユニット／ｇｏＮａ）と反応せし
めることによりフィルインする。フェノール抽出の後、
ＤＮＡをエタノール沈澱せしめる。４．１６ＡｒのＢａ
ｍ４１１リンカ−（５′−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’　　
；バイオラプス）を、１００１１１の６０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　　（ｐ）ＩＴ、　５　）　　、　１０ｍＭ
　ＭｇＣｊ！　２　、５ｍＭＤＴＴ　、　０．５　ｍＭ
　ＡＴＰ及び１８ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（ベーリンガー）中で３７°Ｃにて４５分間リン酸
化する。７５°Ｃにて１５分間の後、反応混合物を室温
まで徐々に冷却する。アニールされたオリゴヌクレオチ
ドリンカーを一２０°Ｃにて貯蔵する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ皿（Ｅｃｏ）−ＨＩＲ
の（Ｂｓｔｌｌｉ　ｆｌ　）／平滑末端断片４ｐｍｏ１
を１５°Ｃにて１６時間、１００倍過剰のリン酸化され
そしてアニールされたＢａｍＨＩリンカ−と共に、２０
８Ｉｔ１の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ？　（ｐＨ７，
５）。
１０＋ａＭ　Ｍｇ（、ｅｚ　、　５ｍＭ　ＤＴＴ　、　
３．５＋ｓＭ　ＡＴＰ及び８００ユニツトの７４　ＤＮ
Ａリガーゼ（バイオラプス）中でインキュベートする。
８５゛Ｃにて１０分間リガーゼを不活性化した後、１０
ｍＭＥＤＴＡ　、　　３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
６，０）及び０．５４容量のイソプロパツールの存在下
でのＤＮＡの沈澱により過剰のリンカ−を除去する。Ｄ
ＮＡをＢａｍＨｌ及びＥｃｏＲＩにより消化する。ＤＮ
Ａ断片を０．８％分取用アガロースゲル上で分離する。
　　１７２ｂｐのＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩプロモータ
ー断片を電気溶出及びエタノール沈澱によりゲルから回
収する。このＤＮＡを０．１　ｐｍｏｌ／　ｔｌの濃度
に再懸濁する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／皿匹（Ｅｃｏ）−ＨＩＲを
ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩＩＩにより消化する。６４３ｂ
ｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄ■断片を前記の様にして単
離する。このＤＮＡ断片はデスルファトヒルジンのコー
ド配列にインフレーム融合したＰＨ０５シグナル配列及
びＰＨ０５転写停止断片を含有する。該プラスミドをま
た１ｌｉｎｄＩＩＩ及びＢａｎ１ＨＩで切断する。６．
６ｋｂベクタ一断片を単離する。
０、２　ｐｎ＋ｏｌずつの１７２ｂｐ　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ
　−ＥｃｏＲＩ断片及び６４３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ
ｌｎｄ　ｍ断片並びに０．１　ｐｍｏｌの６．６ｋｂベ
クタ一断片を、１０ｍの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ’
（ｐｔ１７．５　）　　、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、
　５ｍＭ　ＤＴＴ、　１　ｍＭ　ＡＴＰ及び４００ユニ
ツトの７４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）中で１５
°Ｃにて６時間連結する。この連結混合物の１１１１の
アリコートを１００Ｊ１１のカルシウム処理された形質
転換コンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞に加える。
１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを、
１００ｇ／−のアンピシリンを含有するＬＢ培地中で増
殖せしめる。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＢａｗ
ｌ　Ｉ及びＳａ　ｌ　Ｉ　／　）ｆｉｎｄ　ｍ消化によ
り分析する。予想通りの断片断片を有する１つのクロー
ンを選択し、そしてｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５（−１７
３）　−ＨＩＲと称する。
ｋ　　　−ス（ＤＰ　　の　−１ 酵母２ミクロンの共有結合で閉環されたＤＮＡをサッカ
ロミセス・セレビシエー５２８８Ｃ株から単離する。細
胞を５躍／戚のチモリアーゼ（１００，０００ユニツト
／ｎ）と共に３７°Ｃにて２０分間インキュベートして
細胞壁を消化する。スフ二ロプラストを２％ＳＤＳによ
り溶解する。次にＥＤＴＡを２５ｍＭに加え、臭化エチ
ジウムを１■／ｉ、に加え、そして塩化セシウムを１．
５５ｇ／ｄの最終密度に加える。プラスミドＤＮＡを、
４２．００Ｏｒｐｍ　、　１５°Ｃにて４２時間の遠心
分離により染色体ＤＮＡから分離する。２ミクロンプラ
スミドをシリンジにより勾配から切り出す。ＮａＣｊ！
　飽和イソプロパツールによる抽出によって臭化エチジ
ウムを除去し、そしてプラスミドＤＮＡを最終的にエタ
ノール沈澱せしめる。次に、精製された２ミクロンプラ
スミドＤＮＡをＰｓｔ　Ｉにより線状化し、そしてｐＵ
ｃ１９（Ｊ、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ等、Ｇｅｎｅ　１（１
９８３）、　１０１）のＰｓｔ１部位にクローニングし
てプラスミドｐＤＰ３１を得る。
プラスミドρＪＤＢ２０７を制限酵素にｐｎｌ及びＨｐ
ａ　Ｉにより消化する。生ずる０、５５ｋｂ　Ｈｐａ　
Ｉ−Ｋｐｎ　Ｉ断片は２ミクロン配列とｄＬＥ［Ｉ　２
遺伝子の欠陥プロモーターとの間の連結部を含有する。
プラスミドｐＵｃ７／ＬＥＵ２は、プラスミドｐＵｃ７
　（Ｊ。
Ｖｉｅｉｒａ等、Ｇｅｎｅ　１９（１９８２）、　２５
９）のＳａｌ、１部位にクローン化されたＬＥＵ２遺伝
子（Ａ、Ａｎｄｒｅａｄｉｓ等、Ｃｅ１ｌ、　３０１９
８２）、　３１９）の酵母ゲノム性２．２ｋｂＸｈｏ　
Ｉ　−３ａｆ　Ｉ断片を含有する。プラスミドｐｔｌｃ
７／ＬＥＵ２をＫｐｎ　Ｉ及びＨｐａ　Ｉにより切断す
る。　４．２５ｋｂ　Ｋｐｎ　ｉ　−）１ｐａ　Ｉ断片
をｐＪＤＢ２０７の０．５５ｋｂ　）Ｉｐａ　Ｉ−Ｋｐ
ｎＩ断片に連結する。これによりプラスミドｐＤＰ３０
が生じ、このプラスミドにおいては、プラスミドｐＪＤ
Ｂ２０７中のもとの２ミクロン／ｄＬＥＵ　２融合が、
完全なターミネータ−を有するＬＥＵ２遺伝子の前に置
かれている。ｐＤＰ３０を１ｌｐａＩ及び５ａｊ２１に
より消化し、そして完全なＬＥＩＪ２遺伝子を含有する
１、８５ｋｂ断片を精製し、そしてプラスミドｐＤＰ３
１の８．７ｋｂ　Ｓａｆ　Ｉ　−Ｈｐａ　Ｉ断片にクロ
ーニングする。生ずるプラスミドｐＤＰ３３　（第２図
を参照のこと）を、５０ｎ／ｄの臭化エチジウムの存在
下での旧ｎｄＩＩ［による部分消化（Ｍ、０ｅｓｔｅｒ
ｌｕｎｄ等、Ｇｅｎｅ別（１９８２）１２１　）により
線状化し、そしてυＩ？Ａ３遺伝子（Ｍ、Ｒｏｓｅ等、
Ｇｅｎｅ　２９（１９８４）、　１１３）を含有する１
、１７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ断片と連結する。ｔｌＲＡ
３遺伝子の挿入は大腸菌株ｐｙｒＦ　（Ｍ、Ｒｏｓｅ等
、前掲）への形質転換により選択される。陽性クローン
をプラスミドｐＤＰ３４　（第３図を参照のこと）と称
する。
ｐＤＰ３４は、大腸菌用のアンピシリン耐性マーカー並
びにＵＲＡ３及びｄＬＥＵ　２酵母選択マーカーを有す
る酵母−大腸菌シャトルベクターである。このプラスミ
ドはＡ形において完全な２ミクロン配列を含有し、そし
てＲＥＰＩ　、　ＲＥＰ２及びＦＬＰプロフィシエンド
（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）である。
■五ＤＰ３へのヒルジン　　カセ・・　の　ローブラス
ミドｐＤＰ３４をＢａｍＨＩにより消化する。制限部位
の接着末端をＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼとの反
応によりフィルインする（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ、Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）　
、　ＤＮＡをＳａｉ■によりさらに切断し、そして１１
．８ｋｂベクタ一断片を分取用０．６％アガロースゲル
上で単離する。ＤＮＡを電気溶出及びエタノール沈澱に
より回収する。種々の発現カセットをｐＤＰ３４ベクタ
ー断片の５ａｊ１１部位と（Ｒａｍ）ｌ　Ｉ　）　／平
滑末端部位との間にクローニングする。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／　ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲを
ＨｉｎｄＩ［［により消化する。接着末端をＫｌｅｎｏ
ｗ　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端に転換する。Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱せしめ、そして５ａｉＩによりさ
らに消化する。
１、１　ｋｂ　Ｓａｊ！　Ｉ　−（ＨｉｎｄＩ［Ｉ　）
　／平滑末端断片は、ｐＢＲ３２２配列、ＧＡＰＦＬプ
ロモーター、デスルファトヒルジンのコード配列（好ま
しい酵母コドン）にインフレーム融合したＰＨ０５シグ
ナル配列及びＰＨ０５転写停転写停止音する完全な発現
カセットを含有する。ｉ、ｉｋｂ断片を分取用０．８％
アガロースゲル上で単離し、電気溶出によりゲルから回
収し、そしてＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィー及
びエタノール沈澱により精製する。０．２　ｐｍｏｌの
１．１ｋｂ断片及び０．１　ｐｍｏｌの１１．８ｋｂベ
クタ一断片を１０１１！の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃ
ｌ（ｐＨ７，５）　　、　１０１Ｍ　Ｍｇ（ｆ！ｚ　、
　５ｍＭＤＴＴ　、　３．５　ｍＭ＾ＴＰ及び４００ユ
ニツトの７４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）中で１
５°Ｃにて１６時間連結する。１１１１のアリコートを
用いて大腸菌ＨＢＩＯＩＣａ＄４細胞を形質転換する。
５個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを分析
する。プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＳａ　Ｉ　Ｉ
　／　ＢａｍＨＩにより消化する。正しい制限断片を有
する１つのクローンを選択し、そしてｐＤＰ３４／　Ｇ
ＡＰＦＬ−ＹＨＩＲ（第４図を参照のこと）と称する。
同様にして、ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−ＹＩＩＩＲ
（例２を参照のこと）の１．２ｋｂ　Ｓａｄ　Ｉ−（Ｈ
ｉｎｄｌ［Ｉ：ｌ　／平滑末端断片をｐＤＰ３４ベクタ
ーにクローニングしプラスミドｐＤＰ３４／ＧＡＰＥＬ
−Ｙ［Ｒを得る。
プラスミドｐ、ｒｏｓ２０７／　ＰＨ匹（−１７３）−
ＨＩＲを５ａｆＩ及びＥｃｏＲＩで消化する。前記のよ
うにして４４８ｂｐ　Ｓａ　Ｉ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片
を単離する。このＤＮＡ断片はｐＢＲ３２２のＳａｌ　
Ｉ　−ＢａｍＨ１部分及び短い構成的ＰＨ匹（−１７３
）−プロモーターを含有する。
（例３を参照のこと）。プラスミドｐＪＤＢ２０？／Ｇ
ＡＰＦＬ−ＹＨＩＲを旧ｎｄｌＩＩにより消化する。接
着末端をＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑
末端に転換する。このＤＮＡをｔ！ｃｏＲＩによりさら
に消化する。
６４２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−（ＨｉｎｄＩ［Ｉ　）　／
平滑末端断片を単離する。このものはＰＨ０５クグナル
配列、デスルファトヒルジンのコード配列（好ましい酵
母コドンを有する）及びＰＨ０５転写停転写停止音有す
る。０．２ｐｎ＋ｏ　ｌずつの４４８ｂｐ　Ｓａｉ　Ｉ
　−ＥｃｏＲＩ断片及び６４２ｂｐＥｃｏＲＩ−平滑末
端断片並びに０．１　ｐｍｏｌの１１．８ｋｂＳａｆ　
Ｉ　−（ＢａｍＨＩ　）　／平滑末端ベクター断片を連
結する。連結混合物のアリコートを用いて大腸菌１１Ｂ
ＩＯＩ　Ｃａ”細胞を形質転換する。１２個の形質転換
体のプラスミドＤＮＡをＨａｍＨＩ及び５ａｆｆｉＩ／
ＢａｍＨＩ消化により分析する。正しいプラスミドのク
ローンを選択し、そしてｐＤＰ３４／皿匹（−１７３）
−ＹＨＩＲと称する（第５図を参照のこと）。
大腸菌コドンの使用に基くデスルファトヒルジン変形体
ＨＶＩの合成遺伝子を含有する発現プラスミドを例５に
記載したのと同様にして作製する。
ｐＪＤＰ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ（ヨーロッパ特許
出願Ｎα２２５．６３３）の１．１ｋｂ　Ｓａｌ　！　
　（旧ｎｄｌＩ［：ｌ／平滑末端断片を単離し、そして
ベクターｐＤＰ３４にクローニングする。生ずる発現プ
ラスミドは、構成的ＧＡＰＦＬプロモーターの制御のも
とに発現される好ましい大腸菌コドンに基くデスルファ
トヒルジンの合成遺伝子を含有するｐＤＰ３４／ＧＡＰ
ＦＬ−ＨＩＲである。
同様にして、ｐＪＤＢ２０７／耶（−１７３）　−）１
１Ｒ（例３を参照のこと）の１．１　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ
　−（ＨｉｎｄＩ［）／平滑末端断片をｐＤＰ３４にク
ローニングする。生ずるプラスミドｐＤＰ３４／厘匹（
−１７３）−）１１Ｒは、短い構成的ｍ　（−１７３）
プロモーターの制御のもとにデスルファトヒルジンの合
成遺伝子（大腸菌コドン）を含有する。
班１　ブースミ゛　ＤＰ　　　のヒルジン　　カセ・・
上 完全な２ミクロン配列を含有するベクターが真正な酵母
２ミクロン環のすべての機能を発現するとは限らない。
クローニングによりオーブンリーディングフレームが破
壊される場合がある。今まで、「ＤＪソリ−ィングフレ
ームの遺伝子産物の機能は知られていないので、この遺
伝子中のユニークＰｓｔ１部位を用いてｄＬＥＵ　２遺
伝子（Ｂｅｇｇｓ＋Ｊ、Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５
（１９７８）１０４−１０９）がクローニングされ、又
はプラスミドｐＤＰ３１　（例４を参照のこと）におけ
るようにｐＵｃ１９ベクタ一部分を挿入された。
やっと最近になって、Ｄ遺伝子産物がＦＬＰ遺伝子産物
の発現を制御することが示唆された（Ｊ、＾。
Ｈ，Ｍｕｒｒａｙ等、ＥＭＢＯＪ、　　６．４２０５（
１９８７））。２ミクロン環のすべての利点を得るため
、Ｄ遺伝子産物を含むすべての既知２ミクロン機能につ
いて堪能な（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ベクターを作製す
る。
プラスミドｐＤＰ３１　（例４）をＰｓｔＩ及びＨｐａ
　Ｉで消化して３つの断片を生じさせる。プラスミドｐ
Ｋ１９　［カナマイシン耐性を付与する；　Ｐｒｔｄｍ
ｏｒｅ。
Ｒ，Ｄ、Ｇｅｎｅ　５６（１９８７）３０９−３１２３
をＳｍａ　Ｉにより線状化する０両消化物のＤＮＡ断片
をフェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱せしめる
。ＤＮＡ断片を混合し、そして連結する。連結混合物を
用いてコンピテント大腸菌ＪＭ１０９株細胞（Ｙａｎｉ
ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｇ、等、Ｇｅｎｅ　３３（１
９８５）１０３−１１９）を形質転換しくＨａｎｅｈａ
ｎ、　Ｄ、Ｊ、、　Ｍｏ１．Ｂ１０ｌ、１６６（１９８
３）５５７−５８０）、ＬＢ培地中で３７°Ｃにて２時
間発現せしめ、そして５０ｎ／ｄのカナマイシン、３０
趨／−のＸＧａ　ｌ及び７河／戚のＩＰＴＧが補充され
たＬＢ寒天プレート上にプレートする。
１２個の白色のカナマイシン耐性コロニーを増殖せしめ
る。プラスミドをＸｂａ　Ｉ消化及びＢａｍＨＩ／Ｋｐ
ｎｌ消化により分析する。ｐＤＰ３２のｐｌＪｃ１９ヘ
クタ一部分を喪失しており、Ｐｓｔ１部位の再連結によ
り２ミクロンＤリーディングフレームを再生しており、
そしてＨｐａ　１部位に挿入されたｐに１９プラスミド
平滑末端を有する単一クローンをｐＤＰ９１を称する。
このプラスミドは、ｐＫ１９のＳｍａ　Ｉ部位にクロー
ニングされた２ミクロンプラスミドの大Ｈｐａ　Ｉ　−
Ｐｓｔ断片及び小Ｐｓｔ　１−　Ｈｐａ　Ｉ断片を含有
する。Ｐｓ口部位の再連結によりＤリーディングフレー
ムが再構成されている。
ＵＲＡ３遺伝子をプラスミドρＤＰ３４　（例４を参照
のこと）からの１．１７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｎ断片上に単
離し、そしてプラスミドｐＵｃ１２のユニーク１Ｉｉｎ
ｄｌＩＩ部位にクローニングする。アンピシリン耐性遺
伝子と同じ方向に挿入されたＵＲＡ３遺伝子を有するク
ローンをｐＵｃ１２／ＵＲＡ３と称する。ブーｙスミド
ｐＤＰ９３及びｐＵｃ１２／ＵＲＡ３の両者をＳａｃ　
Ｉ及びＢａｍＨＩにより消化してそれぞれ２断片を生じ
させる。ＤＮＡ断片を混合連結し、そしてそれを用いて
コンピテント大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換する。こ
の細胞を、１００ｘ／−のアンピシリン、３０ｔｔｇ／
１ｒｔｌのＸＧａＪ及び７　ｎ　／　ｍｌのＩＰＴＧが
補充されたＬＢ天然プレート上にプレートする。
１２個の白色のアンピシリン耐性コロニー１０個せしめ
る。プラスミドＤＮＡを旧ｎｄＩ［ｎ消化及びＰｖａ　
ｎ消化により分析する。すべての既知機能について堪能
な完全な２ミクロン配列及びｐＨｃベクター中にクロー
ニングされたＵＲＡ３遺伝子を含んで成る単一クローン
をｐＤＰ９２と称する。
ｂ）ＤＰ９へのヒルジン　　カセ・・　の　ローニング 例５と同様にして、ｐＤＰ９２をＢａｍＨＩで消化する
。
接着末端をＸｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼとの反応
によりフィルインする。ＤＮＡをさらに５ａｌｌで切断
する。１０．２ｋｂベクタ一断片を単離する。プラスミ
ドｐＪＤＢ２０７／　ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲの１．１ｋ
ｂ　５ａｌＩ　−（Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　）　／平滑末端断
片を単離し、そしてベクター断片に連結する。
６個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを分析
する。プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ。
Ｐｓｔ１、及びＳａ　ｌ　Ｉ　／　Ｂａｍ１ｌ　Ｉで消
化する。予想通りの制限断片を有する１つのクローンを
選択し、そしてｐＤＰ９２　／　ＧＡＰＥＬ−ＹＨＩＲ
と称する。同様にして、ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−
ＹＨＩＲ（例２を参照のこと）の１、２ｋｂ　Ｓａｌ　
Ｉ　−（Ｈｔｎｄｌｌ［）　／平滑末端断片を用いてプ
ラスミドｐＤＰ９２／ＧＡＰＥＬ−ＹＨＩＲを得る。
１０．２ｋｂ　５ａｌｌ　Ｉ　−（ＢａｍＨＩ　：ｌ　
／平滑末端ｐＤＰ９２ベクター断片（上記参照のこと）
を用いて、例５に記載したようにしてプラスミドｐＤＰ
９２／ＰＨ０５（−１７３）　−Ｙ）ｌ　ＩＲを作製す
る。
内因性２ミクロンプラスミドを除去するため、第一段階
において８７２４６株（ＤＳＭ　４０８４　；α、■２
−３．　ｌｅｕ　２−１１２．　ｐｒｂ）のＵＲＡ３遺
伝子に欠失を導入してこの株をウラシルについて栄養要
求性にする。
Ｈｉｎｎｅｎ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｃｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、　ＬＩＳＡ　７５．１９２９（１９７Ｂ）　）によ
り記載された形質転換法を用いて、ＨＴ２４６を１Ｎの
プラスミドＹＥｐ１３　（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ。
５ｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｊ、Ｎ、、　）ｌｉｃｋｓ、　
Ｊ、Ｂ、（１９７９）　Ｇｅｎｅ　８＋１２１−１２３
３により形質転換する。ＵＲＡ３遺伝子中に欠失を有す
るプラスミドｐＵｃ１２ｕｒａ３Δ（Ｓｅｎｇｓｔａｇ
。
Ｃｈ、、　）ｌｉｎｎｅｎ＋＾、ｌ　Ｎｕｃｌｅｃｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５Ｌ＋２３３−２
４６（１９８７）　］　１０　ｎをプラスミドＹＥｐ１
３と共に加える。約３０００個のロイシン原栄養性形質
転換体を、小振とうスラスコ中の５ｄの最少培地（アミ
ノ酸を含有しないデイフコのイースト・ニトロゲン・ベ
ースに２％グルコース、０．１％ロイシン、０．１％ウ
ラシル及び０．２５％フルオロオロシン酸を添加したも
の）に再懸濁し、そして３０℃、　１８０ｒｐｍにて６
０時間インキエベートする。増殖する形質転換体は毒性
類似体フルオロオロチン酸に対して耐性であり、そして
それ故に染色体υＲＡ３遺伝子中にｕｒａ３Δによる置
換を有する。増殖した細胞を、ペプトン２０　ｇ／ｌ、
酵母エキス１０　ｇ／ｌ及びグルコース２０ｇ／ｌを含
む、完全培地上にプレートシ、そして３０°Ｃにて４８
時間の増殖の後、アミノ酸を含有しない最少培地（デイ
フコ・イースト・ニトロゲン・ベース、２％グルコース
及び０．１％ロイシンが補充されたもの）にレプリカし
てウラシル栄養要求株を検出する。幾つかの栄養要求株
を拾い上げ、そしてロイシン栄養要求性を付与するプラ
スミドＹＢｐ１３の喪失について試験する。ロイシン及
びウラシルを要求する１つのコロニーを拾い、そしてそ
の後の実験に使用する。
Ｔｒ８８９を、マーカー遺伝子ＬＥＵ２及びＵＲＡ３の
両者を有するプラスミド１）ＤＰ３８　Ｃプラスミドｐ
ＤＰ３４から、Ｓｐｈ　Ｉによる消化及び生ずる８、４
ｋｂ断片の再連結により得られる；第３図を参照のこと
〕により形質転換する（形質転換法は前記）。形質転換
された酵母細胞をまず、ウラシルを欠きそしてロイシン
が補充された酵母最少培地プレート上で選択し、そして
次に、ロイシンを欠きそしてウラシルが補充された最少
培地上にレプリカプレートする。１０個の１週間培養し
たコロニーを拾い上げ、そして別々に液体完全培地（前
記）中で約１００世代増殖せしめる。こうすることによ
り、細胞はｐＤＰ３８プラスミドを失い、そして−ある
比率で一同時に内因性２ミクロンプラスミドをも失う。
ウラシル及びロイシンを要求するコロニー１０個を拾い
、ＤＮＡを調製し、このＤＮＡをＰｓｔｌにより完全消
化し、そしてサザンプロット上で３２ｐ−ラベル化酵母
２ミクロンＤＮＡでプローブする。
ハイブリダイゼーションシグナルを全く示さない１個の
単離体をＨ４４９（ａ　、　Ｉｅｕ　２−３．　ｌｅｕ
　２−１１２＋盟１３Δ、　ｐｒｂ、　ｃｉｒ’　）と
称し、これは酵母株ＨＴ２４６に相同な（ｉｓｏｇｅｎ
ｉｃ）　２ミクロン不含有（ｃｉｒ’　）誘導体である
。
■天　ブースミド　ＤＰ９６　　のヒルジン　　カセ・
・上 ｐＤＰ９２に代るものとしてｐＤＰ９６を作製した。
ｐＤＰ９６の作製における本質的差異は、ｐＤＰ９にお
けるＨｐａ　１部位とは異りクローニングのために２ミ
クロン環中のユニーク５ｎａＢ　１部位を使用すること
である。ｐＤＰ９６においては、Ｄリーディングフレー
ムを含む２ミクロン環のすべての既知オープンリーディ
ングフレームは無傷である。従って、ベクターはすべて
の既知２ミクロン機能について堪能である（ｐｒｏｆｉ
ｃｉｅｎｔ）はずである。
ａ）ブースミド　ＤＰ９６の　１ プラスミドｐＤ３１　（例４）をＰｓｔｌ及び５ｎａＢ
　Ｉにより消化して３個の断片を生じさせる。プラスミ
ドｐＫ１９　（カナマイシン耐性を付与する；　Ｐｒｉ
ｄｍｏｒｅ＋Ｒ，Ｄ、、　Ｇｅｎｅ　５６（１９８７）
３０９−３１２）をＳｍａ　Ｉにより線状化する。画情
化物のＤＮＡ断片をフェノール抽出し、そしてエタノー
ルで沈澱せしめる。
ＤＮＡ断片を混合し、そして連結する。この連結混合物
を用いてコンピテント大腸菌ＪＭ１０９細胞（Ｙａｎｉ
ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，等、　Ｇｅｎｅ　３３（
１９８５）１０３−１１９）を形質転換しくｌ１ａｎａ
ｈａｎ、　Ｄ、Ｊ、、　Ｍｏ１．Ｂ１０ｌ、１６６（１
９８３）５５７−５８０）　、Ｌ　Ｂ培地中で３７°Ｃ
にて２時間発現せしめ、そして次に５０４／−のカナマ
イシン、３０ｔｔｇ／ｍｌのＸｇａ　ｒ及び７題／戚の
ＩＰＴＧを補充したＬＢ寒天プレート上にプレートする
。
１２個の白色のカナマイシン耐性コロニーを増殖せしめ
る。プラスミドＤＮＡを、Ｘｂａ　Ｉ消化及びＢａｎ＋
ＨＩ　／　Ｋｐｎ　Ｉ消化により分析する。ｐＤＰ３１
のｐＵｃ１９ベクタ一部分を失い、Ｐｓｔ１部位の再連
結により２ミクロンＤリーディングフレームを回復し、
そして５ｎａ８１部位に挿入されたｐＫ１９プラスミド
平滑末端を有する単一クローンをｐＤＰ９５と称する。
このプラスミドはｐＫ１９のＳｍａ　ｒ部位にクローニ
ングされた２ミクロンプラスミドの大５ｎａＢ　Ｉ−Ｐ
ｓｔｌ断片及び小Ｐｓｔ　Ｉ　−５ｎａＢ　Ｉ断片を含
有する。
Ｐｓｔｌの再連結によりＤリーディングフレームが再構
成されている。
プラスミドｐＵｃ１８／ＵＲＡ３は大腸菌ベクターｐＵ
ｃ１８の旧ｎｄＩ［１部位にクローン化された酵母１．
１７ｋｂ　ＵＲＡ３遺伝子（Ｈｉｎｄ　ｍ断）から成り
、該ＵＲＡ３遺伝子はアンピシリン耐性遺伝子とは逆の
方向に挿入されている。ｐＬｌｃ１８　／　ｔ！ＲＡ３
を５０ｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下で制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩ［Ｉにより３７°Ｃにて１時間部分消化する。
消化への臭化エチジウムの添加が旧ｎｄｌｌｌによる第
一部位の消化を可能にするが、線状化されたＤＮＡへの
臭化エチジウムのその後の導入が第二部位の消化を妨害
し、こうして線状化されたプラスミドＤＮＡが富化され
る。２回の逐次的フェノール抽出により制限酵素及び臭
化エチジウムを除去し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱
せしめる。次に、このＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ大断
片（Ｋｌｅｎｏ−酵素）で処理して、旧ｎｄＩ［１部位
の５′オーバーハングをフィルインする。この末端が修
復されたＤＮＡをアガロースゲル上で泳動せしめること
により、富化され末端が修復された線状化ＤＮＡを含む
種々の断片を分離する。
３．３５ｋｂ　ｐＵｃ１８／１ｌＲＡ３線状化ＤＮＡを
ゲルから切り出しそして電気溶出する。次に、このＤＮ
ＡをＴ４　ＤＮＡリガーゼにより自己連結し、コンピテ
ント大腸菌ＪＭ１０９細胞に形質転換し、そして５０河
／−アンピシリンを補充したＹＴプレート上にプレート
する。コロニーを前記のようにしてスクリーニングし、
ＵＲＡ３遺伝子のｐＵｃリンカ−列側のＨｉｎｄｌ１１
部位が末端修復されて新たなユニークＮｈｅ　Ｉ制限部
位が形成されているプラスミド“Ｄｏを同定する。プラ
スミド“Ｄｏを制限酵素１１ｉｎｄＩ［［により完全消
化し、そして５′オーバーハングをＫｌｅｎｏｗ　ＤＮ
Ａポリメラーゼとの反応でフィルインする。次に、この
ＤＮＡを大過剰のＮｏｔＩリンカ−（ＧＣＧＧＣＣＧＣ
）と混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより連結し、コン
ピテントＪＭ１０９株細胞に形質転換し、そして５０ｑ
／ｒｄアンピシリンを補充したＴＹプレ−ト上にプレー
トする。コロニーを前記のようにしてスクリーニングし
、そして１ｌｔｎｄＩ［［部位が末端修復されておりそ
してＮｏｔＩリンカ−が付加されているプラスミド“Ｅ
゛を同定する。プラスミドｌ　Ｅ　Ｉを制限酵素Ｓａｃ
　Ｉで消化し、そして３′オーバーハングを７４　ＤＮ
Ａポリメラーゼにより修復する。次に、このＤＮＡを大
過剰のＮｏｔｌリンカ−と混合し、そしてＴ４　ＤＮ＾
リガーゼにより連結する１この連結混合物をコンピテン
ト大腸菌ＪＭ１０９細胞に形質転換し、そして５０ｎ／
ｍｌアンピシリンを補充したＹＴプレート上にプレート
する。この連結混合物をコンピテント大腸菌ＪＭ１０９
細胞に形質転換し、そして５０■／戚アンピシリンを補
充したＹＴプレート上にプレートする。コロニーを前記
の様にしてスクリーニングし、そしてｐＵｃ１８配列が
Ｎｏｔｌ制御部位により挟まれているプラスミドｐＵｃ
１Ｂ／　ＵＲＡ３−Ｎを同定する（プラスミド゛Ｄ′及
び“Ｅ′は、ｐＵｃ１８　／　ＵＲＡ３−　Ｎの作製の
ための単なる中間体である）。
プラスミドｐＤＰ９５及びｐＵｃ１８　／　ＵＲＡ３−
Ｎの両者をにｐｎｌ及びＢａｍＨＩにより消化してそれ
ぞれ２断片を生じさせる。ＤＮＡ断片を混合一連結し、
そしてこれを用いてコンピテント大腸菌ＪＭ１０９細胞
を形質転換する。細胞を、１００ｎ／ｎＴｉのアンピシ
リン、３０ｎ／ｍｌのＸＧａ１及び７　ｔｔｇ　／　ｒ
ｎｌの■ＰＴＧを補充したＬＢ寒天プレート上にプレー
トする。
１２個の白色のアンピシリン耐性コロニーを増、　　殖
せしめる。プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄ　ｍ消化及びＰ
ｖｕ　ｍ消化により分析する。すべての既知機能につい
て堪能な完全な２ミクロン配列及び１）［ＩＣベクター
にクローン化されたＩＩｌ？Ａ３遺伝子を含有する単一
クローンをｐＤＰ９６と称する（第７図）。
ｂ）ＤＰ９６へのヒルジン　　カセ・・トのクローニン
グ 例５と同様にして、ｐＤＰ９６をＢａｍＨＩにより消化
する。接着末端をにｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼを
用いる反応によりフィルインする。ＤＮＡを５ａｆｌに
よりさらに切断する。１０．２ｋｂベクタ一断片を単離
する。プラスミドＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−Ｙ）Ｉ１
）ｌの１．１ｋｂＳａｌ　Ｉ　−（Ｈｉｎｄｌｌ１）　
／平滑末端断片を単離し、そして前記ベクター断片に連
絡する。
６個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを分析
する。プラスミドＤＮＡをＢａｎ＋ＨＩ　、　Ｐｓｔ　
Ｉ及びＳａ　ｉｔ　Ｉ　／　ＢａｍＨｆで消化する。予
想通りの制限断片を有する１個のクローンを選択し、そ
してｐＤＰ９６／ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲと称する。同様
にして、ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−Ｙ）ＩＩＲ（例
２を参照のこと）の１．２ｋｂＳａｌｌ　　Ｉ：Ｈｉｎ
ｄｌＩ［）／平滑末端断片を用いてプラスミドｐＤＰ９
６／ＧＡＰＥＬ−ＹＩＩＩＲを得る。
例５に記載したようにして、１０．２ｋｂ　Ｓａｉ　Ｉ
　−（ＢａｍＨＩ　）　／平滑末端ｐＤＰ９６ベクター
断片（前記参照のこと）を用いてプラスミドｐＤＰＱ６
　／　ＰＨ０５（−１７３）−Ｙｌ（ＩＲを作製する。
進、Ｓ、セレビシェ−Ｈ４４９の）　−サッカロミセス
・セレビシエー（錘ｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）　）１４４９株を、次のプラスミド：ｐＤ
Ｐ３４／…匹（−１７３）　−ＨＩＲｐＤＰ３４／ＧＡ
ＰＦＬ−ＨＩＲ ｐＤＰ３４／ＧＡＰＥＬ−１１１Ｒ ｐｏｐ３４／ＰＨ亜（−１７３）　−ＹＨＩＲｐＤＰ３
４／ＧＡＰＦＬ−ＹＨＩＲ ｐＤＰ３４／ＧＡＰＥＬ−ＹＨＩＲ ｐＤＰ９２／二（−１７３）−Ｙ）ＩＩＲｐＤＰ９２／
ＧＡＰＦＬ−ＹＩＩＩＲ ｐＤＰ９２／ＧＡＰＥＬ−ＹＨＩＲ ｐＤＰ９６　／　ＧＡＰＦＬ　−ＹＨＩＲｐＤＰ９６／
　ＧＡＰＥＬ　−ＹＨＩＲｐＤＰ９６／拐（０５（−１
７３）　−ＹＩＩＴＲを用いて、旧ｎｎｅｎ等（前掲）
により記載された形質転換法により形質転換する。形質
転換された酵母細胞を、ロイシンが補充されておりそし
てウラシルを欠いている酵母最少培地プレート上で選択
する。単一形質転換細胞を単離し、そして次のように命
名する。
Ｈ４４９／ｐＤＰ３４／　　　ＰＩＩＯｂ（−１ｒ：３
）−ＹＨＩＫ■ サッカロミセス・セレビシエー８４４９／　ｐＤＰ３４
／ＰＨ０５（−１７３）−ＹＨＩＲ及びサッカロミセス
・セレビシエーＨ４４９／　ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−
ＹＨＩＲの細胞をそれぞれ、次の組成（ｇ／ｉり　： デイフコ　イースト・ニトロゲン・ベース　６．７アス
パラギン　　　　　　　　　　　　　　１０ロイシン　
　　　　　　　　　　　　　　　　１グルコース　　　
　　　　　　　　　　　　　２０を有する最少培地１０
ＩＲ１中で２回前培養する。最初の前培養は２８°Ｃ、
１８０ｒ、ｐ、ａ＋にて６０時間行う。
第２前培養は２％の第一前培養物を接種して、２８”Ｃ
、１８０ｒ、ｐ、ｍにて２４時間行う。
主培養培地は次の組成を有する。
酵母エキス　　　　４９ グルコース　　　　　５ スラクトース　　　５７ ＮＨ４ＮＯ３０，５ Ｍｇ５Ｏｎ　Ｘ　７　ＨｚＯ１，０ ＣａＣＯｚ　　　　　　　　５．０ Ｃａｚ（ＰＯ４）ｚ　　　　　　２．０主培養に約２Ｘ
１０ｂ細胞／ｄを接種し、そして２８°Ｃ、１ＢＯｒ、
ｐ、ａ＋にて７２時間培養を行う。発酵の終りにおいて
約ｌＸｌ０”細胞／ｌｌｌ１．が得られる。発酵中の幾
つかの時点で培養物のサンプルを取り、遠心分離により
細胞を除去し、そして細胞上清のデスルファトヒルジン
をＨＰＬＣ（後記）により分析する。
５０！規模でのデスルファトヒルジンの製造のための接
種源として２ミクロンプラスミドを含有しないサッカロ
ミセス・セレビシエー１１４４９／　ｐＤＰ３４／ＧＡ
ＰＦＬ−ＹＨＩＲの貯蔵細胞を用いた。
貯蔵細胞のアンプルを液体窒素容器の蒸気相に貯蔵する
。アンプルの内容物を、次の組成（ｇ／ｌ）： イースト・ニトロゲン・ベース　　　　　８．４Ｌ−ア
スパラギン・−水和物　　　　　１１．４Ｌ−ヒスチジ
ン　　　　　　　　　　　　１．ＯＬ−ロイシン　　　
　　　　　　　　　　０・ＩＤ−グルコース−水和物　
　　　　　　２０．０を有する選択培地を収容する振と
うフラスコに接種する。　　５００ｄのフラスコは１０
０ｍ１の培養を含み、これを１８０回／分の振とう速度
の回転振とう機上で２８°Ｃにて４８時間培養する。
第二振とうフラスコ培養では、４個のバッフルを有する
２１フラスコ中で前記と同じ組成の培地６００ｄを用い
る。第一培養からの接種レベルは５％（３０ｄ）であり
、そして１２０回／分の速度の回転振とう機上で２８°
Ｃにて４８時間培養する。
第三前培養物は、４枚のバッフルを有しそして直径１１
５ｍｍの単一ディスクタービン撹拌機を有する５０１の
ステンレス鋼製バイオリアクター中で発酵せしめる。こ
の培養のためにも前記培地を用い、始発容量を３０ｆと
する。　　６００ｍの培養物を含む２１フラスコ１本を
用いて５０！リアクターに接種する（２％）。２８°Ｃ
の温度において発酵を４２時間続ける。撹拌速度は６０
０ｒ、ｐ、＠であり、通気量は１　ｒｒｍであり、そし
て０．３バールの上圧をかける。
フィード−パッチ法のための装置をさらに備えた類似の
５０！バイオリアクターを用いてデスルファトヒルジン
の生産を行う。培地は次の成分（ｇ／ｉ！２）を含有す
る。
肉ペプトン（メルク）５．Ｏ 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　３０．０硫酸ア
ンモニウム　　　　　　　　　　　６．０硫酸マグネシ
ウム・五水和物　　　　　１．０塩化ナトリウム　　　
　　　　　　　　　０．１リン酸二水素カリウム　　　
　　　　　１．ＯＤ−グルコース−水和物　　　　　　
　１０．０第三前培養段階からの接種量は任意に２％で
ある。２８°Ｃの温度及び７５０ｒ、ｐ、ｍの撹拌速度
で発酵を４８時間続ける。上圧は最初０．３バールに設
定するが、２０％飽和以上の溶存酸素を維持するために
発酵中に１．０バールに上げることができる。
最初の通気量は０．２５ｒｒｒａであるが、適切な酸素
の供給を保証するため９時間後に１　ｒｒｍに上げる。
ｐＨ値は発酵の初期において５．０に低下し、水酸化ア
ンモニウムの自動供給によりこのｐＨを保持する。
単純な回分式培養においては、達成される菌体量、及び
従ってデスルファトヒルシンカ価は最初に発酵槽に導入
された炭素源の量に依存する。今度はこの炭素源の量は
バイオリアクターの酸素移送容量及び増殖する酵母によ
るエタノールの過剰生産を回避する必要性により限定さ
れる。このような限界はフィード−バッチ法により克服
することができる。すなわち、始発培地にはグルコース
をほとんど導入せず、かなり高い最終バイオマス濃度及
び回分培養において達成されるのよりも約３倍高いデス
ルファトヒルシンカ価を支持するためにグルコースのフ
ィードを行う。実際には、−定間隔で段階的に、１７５
　ｇ　／時のグルコース−水和物の最終供給速度にまで
上げる。
必要な場合には、発泡を抑制するためにシリコーン性消
泡剤を少量添加する。発酵槽からの排気の一部分を分析
して、酸素の取り込み及び二酸化炭素の発生についての
情報を得る。溶存酸素は殺菌可能な電極を用いてオンラ
イン測定される。
サンプルを全工程を通して６時間間隔で採取してグルコ
ース及びエタノール濃度、バイオアッセイ及び）ＩＰＬ
Ｃによるデスルファトヒルジンの力価、のモニターがで
きるようにし、そしてさらに無菌性をチエツクする。発
酵過程の終りにおいて、培養上清からデスルファトヒル
ジンを回収することができる。
発酵液（例１１及び例１２を参照のこと）の上清を）Ｉ
ＰＬＣ分析（実験条件Ｎｏ、１；下記参照のこと）にか
ける。精製された生成物は更なる方法、例えばＭｏｎｏ
−Ｑカラムでのイオン交換クロマトグラフィー（実験条
件Ｎα２）、及び高速ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＧＦＣ）　（実験条件Ｎｏ、　３　）により分析する
。
ス１し８１組上 方　法　　　　グラジェント溶出による逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＲＰ−）ＩＰＬＣ）カラム型　　　
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　１００−５　Ｃ＋ｓ（Ｍａｃｈｅ
ｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、　Ｄｉ；ｒｅｍ、西独） 粒子サイズ　５− 寸法　４．ＯＸ　１２０ｍｍ サンプル容量　５０Ｉｌ！ 蛋白質負荷／注入 ２．５〜１０河（５０〜２００硝／戚）流速　　１．５
戚／分 逆　圧　　　　約１２０〜１５０バール検　出　　　　
２１５ｎｍ　　（アテヌエーション二６）溶離剤Ａ　　
　０．１％（ｖ／ｖ））リフルオロ酢酸（ＴＰＡ　）を
含む水（分析用ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ試薬、ＢＡＫＥＲＣｈ
ｅｍｉｃａｌｓ　、デベンター、オランダ） 溶離剤Ｂ　　　　Ｏ，０７％（Ｖ／Ｖ）　　トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリル （ＨＰＬＣ−グレード、　Ｆｌｕｋａ）実１」ｌｕ蚊１ 方　法　　　　強イオン交換固定相上でのイオン交換ク
ロマトグラフィー（ＩＥＣ）　（ｐＨ−グラジェント？
容出） カラム型　　　Ｍｏｎｏ−Ｑ　（ファルマシア、ウプサ
ラ、スエーデン） 寸法　５．ＯＸ５０．Ｏｍｍ サンプル容量　１００μ！ 蛋白質負荷／注入 ２５〜１０（ｂｒｇ　（２５０〜１１０００ｕ／ＩＲ１
）流速　　２．０ｍ１／分 逆　圧　　　　約３０〜３５バール 検　出　　　　２８０ｎｍ　　（アテヌエーション５）
溶離剤Ａ　　　　５０ｍＭ　ｌｌＣＯＯＮＨ４、ｐｔｌ
　４．５溶離剤Ｂ　　　　５０ｍＭ　）ＩＣＯＯＮＬ　
、　ｐｌ＋、３．５１５．１　　　　　　　　１００ １７．５　　　　　　　　１００ １７．６　　　　　　　　　２０ 方　法　　　　高速ゲル濾過クロマトグラフィー（ＨＰ
ＧＦＣ） カラム型　　　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２（ファルマシア
、ウプサラ、スエーデン） 寸法　１０．ＯＸ３００ｃｍ サンプル容量／注入 蛋白質負荷／注入 ２５〜１００Ｉ１１００Ｉ１〜２０００ｉ／ｄ）流速　
　０．５ｄ／分 逆　圧　　　約９バール 検　出　　　　２８０ｎｍ　　（アテヌエーシジン５）
溶離剤　　　　０．　Ｉ　Ｍ　ＮＨａＣＯＯＣ）Ｉｔ　
、　ｐＨ５，０４０，１０ ５０１０Ｏ 組換デスルファトヒルジン（ピーク１）、デスルファト
ヒルジン（１−６４）（ピーク２）、デスルファトヒル
ジン（１−６３）（ピーク３）、デスルファトヒルジン
変形体Ｂ６ａ　（ピーク４）、Ｂ６ｂ（ピーク５）、及
びＢ７（ピーク６）ヒルド・メディシナリス（Ｉｌｉｒ
ｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）からの真正なヒルジ
ン（ピーク７）、並びに真正なデスルファトヒルジン〔
ピーク８；天然ヒルジン（ピーク７）と酵素アリールス
ルファターゼとの反応により得られる〕を集め、そして
トロンビン阻害試験（発色基質としてＣｈｒｏｍｏｚｙ
ｍ　ＴＨを用いる）及び１又は複数の分析法（前記実質
条件を参照のこと）にかける。結果を次の第１表にまと
める。
１、　３　　セレビシェ−Ｈ４４９ＤＰ３４　　ＧＡＰ
ＦＬ−３，セレビシェ−株Ｈ４４９／　ｐＤＰ３４／Ｇ
ＡＰＦＬ−ＹＨＩＲの発酵からの組換酵母デスルファト
ヒルジン（ピーク１）（例１３を参照のこと）を特徴付
け、そしてヒルジン誘導体であるデスルファトヒルジン
（１−６４）（ビーク２）、デスルファトヒルジン（１
−６３）（ビーク３）、デスルファトヒルジン変形体Ｂ
６ａ　（ビーク４）、Ｂ６ｂ　（ピーク５）、及びＢ７
（ピーク６）ヒルド・メディシナリス（ひる）からの真
正なヒルジン（ピーク７）、並びに真正なデスルファト
ヒルジン（ビーク８）と比較する。
Ａ−分ヱユニ次定 ａ）目かけ分子量 ヒルジン化合物を標準的５ＯＳ−ＰＡＧＥ　（１０ｐｇ
蛋白質、１０１０Ｘ１５ゲルサイズ、１５％重合）によ
り、又はＰｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ファルマシア、
ウプサラ、ス工−デン）上で製造者の指示（１羅蛋白質
、２゜％均一５ＯＳ−ＰＡＧＥ）に従って分析する。３
％（Ｖ／Ｖ）β−メルカプトエタノールにより４０分間
固定した後にクマッシープル（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂ
ｌｕｅ）染色を行う。
慧−来 すべての化合物について単一バンドが観察され、約７０
００ダルトンの目かけ分子量に相当する。相対移動度（
Ｒｒ値）を次の第２表にまとめる。
ｂ　）　ＦＡＢ−ＭＳによる化学的分子量測定ヒルジン
化合物をファスト・アトム・ボンバードメント・ポジテ
ィブ・イオン（ｆａｓｔ　ａｔｏｍ　ｂｏｍ−ｂａｒｄ
ｍｅｎｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｔｏｎ）質量分析（ＦＡ
Ｂ−ＭＳ）にかける。装置：　ＶＧ−Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａ１社、マンチェスター、のＺＡＢ−１１Ｆマス・スペ
クトロメーター；マトリクス：チオグリセロール；キセ
ノン・ボンバードメント；イオンエネルギー１０にｅν
；外部標準：　Ｃ５ｚＪｚｓ（分子ｆｌ　：　６８８７
．９）及びＣ３ｚａ）１ｚ７（７１４７，７６）。
猪−来 次の第３表に結果を要約しそして計算値と比較する。
遇−」し−表 ０、１〜２．０　ｔｒｉの純ヒルジン化合物を６ＮＨＣ
Ａにより１１０　”Ｃにて２４時間加水分解し、そして
次にＣｈａｎｇ等（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｉｎｚｙｍｏｌ
、９１（１９８３）４１−４８　；Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒ、　２９５（１９８４）１９３−２００）により
記載されているようにして分析する（ＤＡＢＳ−Ｃ１法
）。
猪−来 第４表にまとめた結果を計算値と比較する。予想通りで
あった。
】−一り一表 ４′ Ｃ１鳶ノむ辷梶 Ｎ−末端アミノ酸配列分析のため、Ｉ　Ｌｑｒ　（２〜
３ｎモル）の純ヒルジン化合物（又はトリプシン消化断
片）を、気相蛋白質シーケンサ−（モデル４７０Ａ、ア
プライド、バイオシステムス）上でＥｄｍａｎ及びＢａ
ｇｇ　（Ｅｕｒｏｐ、　Ｊ、Ｂ１０ｃｈｅｍ、　８０（
１９６７））に従う常用の配列分析にかけ、そしてＮ−
末端フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸を
ＲＰ−１１Ｐ　Ｌ　Ｃにより決定する。Ｃ−末端分析の
ため、ヒルジン化合物をカルボキシペプチダーゼＹで消
化し、そして遊離したアミノ酸をアミノ酸アナライザー
（ＤＡＢＳ−ＣＩ法、上記を参照のこと）で決定する。
桔ニー隈 Ｉｎ−Ａｓｎ− −Ａｓｎ−Ａｓｐ−６１ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−（ｉｌｕ
−［１１ｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｄ、３−占（ＩＥＰ　　
の ヒルジン化合物を等電点電気泳動（ＩＥＦ）法（２５０
〜５００ｇ、５ｅｒｖａｌｙｔｅゲル、ｐｌ＋３〜１０
）　、滴定曲線（ｔｉ　ｔｒａｔ１０ｎ−ｃｕｒｖｅ）
分析（３，０■／　９．３　ｃ＋ｍ、５ｅｒｖａｌｙｔ
ｅゲル、ｐＨ３〜１０）及び等電点クロマトグラフィ（
ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）　（実験条件Ｎ
ｏ、４を参照のこと）にかける。
裏験条作工 方　法　　　　強陽イオン交換固相上でのイオン交換ク
ロマトグラフィー（ＩＥＣ）　（ｐＨ−グラジェント溶
出） カラム型　　　Ｍｏｎｏ−Ｐ　（ファルマシア、ウプサ
ラ、スエーデン） 直径　５．　ＯＸ２００ｍｍ サンプル容量　５０ｕ１ 蛋白質負荷／注入 ２５０〜５００　ｎ　（５、０００〜１０，０００羅／
−）流速　　１．０　ｍ１７分 逆　圧　　　　約１５〜２０バール 検　出　　　　２８０ｎｍ　　（アテヌレータ−６）溶
離剤Ａ　　　　０．０２５Ｍ　Ｂ１５−Ｔｒｉｓ（ｐＨ
６，３）溶離剤Ｂ　　　水／Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ２．
２〜５　（ファルマシア２５〜５　（ファルマシア）〜 ５０　：　１　、　ｐＨ２，４８゜ 溶出 ６．１　　　　　１００ ３６．１　　　　　　０ 等電点の決定ピークを集めそして各両分のｐＨ値を標準
的ｐｎメーターにより決定する。
持−来 得られたＩＥＰを第５表にまとめる。コンピュータープ
ログラムにより計算された理論的に予想される値と比較
する。
男−」Ｌ−表 ｎ、ａ、　：測定せず。
猪−輪 上記のデータに基いて下記のことが結論される。
◎　生合成の主生成物を示すピーク１の化合物はデスル
ファトヒルジンである。このものは、ヒルド・メディシ
ナリス（ひる）からのヒルジン（ピーク７）から調製さ
れた真正なデスルファトヒルジン（ピーク８）と同一で
ある。
◎　ピーク２，３，４．５及び６の化合物は、組換デス
ルファトヒルジンの生合成中に生成する変形されたヒル
ジン化合物（ピーク２及び３）、及び精製中に生成する
変形されたヒルジン化合物（ピーク２〜６）である。
◎　ピーク２の化合物は、Ｃ−末端の１個のアミノ酸を
欠くデスルファトヒルジン（１−６４）である。
◎　ピーク３の化合物は、Ｃ−末端の２個のアミノ酸を
欠くデスルファトヒルジン（１−６３）である。
◎　ピーク４，５及び６の化合物は、同じアミノ酸組成
、Ｎ−末端配列（アミノ酸１〜１２）及びＣ−末端（ア
ミノ酸６ｌ−６５）を有するデスルファトヒルジンの生
物学的に十分に活性な類似体である。
ｌｆｉ、　　５０　ｆｆｉ　Ｊ　　で土　　　たＳ　セ
レビシェ−培養液をアンバーライトＸＡＤ−７と混合し
、そして２５°Ｃにて約４時間吸着にかける。細胞をカ
ラム中の樹脂から分離する。Ｉ　Ｍ　ＮａＣβにより洗
浄した後、樹脂をＴｒｔｓ緩衝液（５０ｍＭ　、　ｐＨ
７，０〜８．５）により溶出する。主画分（３０４１り
をｐＨ２，９に調製し、そして２１のベツドボリウムを
有するＳ−セファロースカラム（２５ｍＭ蟻酸アンモニ
ウム緩衝液ｐＨ２，９により平衡化されたアミコンＰＡ
）に通用する。蟻酸アンモニウム緩衝液（４０ｍＭ、ｐ
Ｈ３，６）で洗浄した後、蟻酸アンモニウム緩衝液（５
０ｍＭ　、　ｐＨ３，６）で溶出を行った。主溶出画分
（１０ｆ）を、Ω３に膜を装着したフィルトロン・ミニ
セント（Ｆｉｌｔｒｏｎ　Ｍｉｎｉｓｅｔｔ）限外濾過
により濃縮する。生ずる透明な蛋白質溶液の０．５１部
分を、１．５１のベツドボリウムを有するＢｌｏ−Ｇｅ
１　Ｐ−６フアインカラム（０，５％酢酸により平衡化
されたアミコンＧＦ）に適用する。０．５％酢酸により
溶出を行う。主たる溶出画分（１）を限外濾過により溶
出し、そして次に、２１のベツドボリウムを有するＱ−
セファロース・ファスト・フロー・カラム（２５ｍＭ蟻
酸アンモニウム緩衝液ｐＨ２，９により平衡化したアミ
コンＰＡ）に適用する。蟻酸アンモニウム緩衝液（５０
ｎａＭ　、　ｐＨ４，２）により溶出を行う。主たる溶
出画分を限外濾過により濃縮し、そして次に水に対して
ダイアフィルトレージョンする。生ずる透明な水溶液を
凍結乾燥する。この固体は純粋なデスルファトヒルジン
から成る。
違滋Ｊυ（社）１匝 次の微生物がＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖ
ｏｎ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）　
、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ｌｈ、　Ｄ−３３
００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託された（寄託日、
及び受託番号）。
サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｈ４４９：　１９８８
年２月１８日：　ＤＳＮ　４４１３　；大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）ＪＭ１０９／ｐＤＰ３８
　：１９８８年２月１９日：　ＤＳＭ４４１４　ｉ大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／
ｐＤＰ３４　：１９８８年３月１４日：　０３Ｍ４４７
３゜
【図面の簡単な説明】
第１図は、好ましい酵母コドンを有するＰＨＯシグナル
配列を含有するヒルジンＩＩＶＩ遺伝子の生体外合成を
示す模式図である。使用される２１オリゴデオキシヌク
レオチドは、それぞれ番号を付した線及び点線により示
される。 第２図は、プラスミドｐＤＰ３３の作製方法を模式第３
図は、プラスミドｐＤＰ３４及びｐＤＰ３８の作製方法
を模式的に示す。 第４図は、発現プラスミドｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−Ｙ
ＨＩＲの作製方法を模式的に示す。 第５図は、発現プラスミドｐＤＰ３４／ＰＩ（０５（−
１７３）−ＹＨＩＲの作製方法を模式的に示す。 第６図は、プラスミドｐＤＰ９２の作製方法を模式第７
図は、プラスミドｐＤＰ９６の構造を模式的に示す。 ニｈｉ！ ΣｃｏＲＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ＰＨ０５５Ｓ−−一→ＹＨＩＲ ＴＧＣＡＡＴＡＧ　　　　　３’ ＡＣＧＴＴＡＴＣＣＴＡＧ　５’ ＢａｍＨに Ｔ万ｒ２： 二り４１条 二Ｔ万ｒ５：

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（１）構成的酵母プロモーター、該プロモーターが
    作用可能に連結されているシグナルペプチドをコードす
    る第一ＤＮＡ配列、該第一ＤＮＡ配列と適切なリーディ
    ングフレーム内に連結されているデスルファトヒルジン
    をコードする第二ＤＮＡ配列、及び酵母転写停止シグナ
    ルを含有するＤＮＡ配列、から成るデスルファトヒルジ
    ン発現カセット、並びに（２）無傷のＲＥＰ１、ＲＥＰ
    ２及びＦＬＰ遺伝子並びに無傷のＯＲＩ、ＳＴＢ、ＩＲ
    １及びＩＲ２部位を含有する完全な２ミクロンＤＮＡ、
    を含んで成る酵母ハイブリドベクター。 ２、前記２ミクロンＤＮＡが無傷のＤ遺伝子をさらに含
    有している、請求項１に記載の酵母ハイブリドベクター
    。 ３、前記構成的酵母プロモーターが解糖系酵素をコード
    する遺伝子のプロモーター、ＡＤＨＩプロモーター、Ｔ
    ＲＰＩプロモーター、及び上流活性化部位が除去された
    ￥ＰＨＯ５￥プロモーターから成る群から選択されたも
    のである請求項１に記載の酵母ハイブリドベクター。 ４、前記第一ＤＮＡ配列が、ヒルジンシグナル配列；そ
    れぞれ酵母インベルターゼ遺伝子、１−ファクター遺伝
    子、フェロモンペプチダーゼ（ＫＥＸ１）遺伝子、「キ
    ラー・トキシン」遺伝子及び抑制性酸性ホスファターゼ
    （￥ＰＨＯ５￥）遺伝子のシグナル配列及びプレプロ配
    列；並びにアスペルギルス・アワモリ（￥Ａｓｐｅｒｇ
    ｉｌｌｕｓ￥￥ａｗａｎｏｒｉ￥）からのグルコアミラ
    ーゼシグナル配列から成る群から選択されたものである
    、請求項１に記載の酵母ハイブリドベクター。 ５、前記第二ＤＮＡ配列が、デスルファトヒルジン変形
    体ＨＶ１、ＨＶ２、ＨＶ２（修飾されたもの）、ＰＡ及
    びｄｅｓ（Ｖａｌ＿２）−デスルファトヒルジンから成
    る群から選択されたデスルファトヒルジンをコードして
    いる、請求項１に記載の酵母ハイブリドベクター。 ６、酵母用の１個又は複数個の選択遺伝子マーカーを含
    んで成る、請求項１に記載の酵母ハイブリドベクター。 ７、細菌宿主用の選択遺伝子マーカー及び複製起点を含
    んで成る、請求項１に記載の酵母ハイブリドベクター。 ８、請求項１に記載の酵母ハイブリドベクターの製造方
    法であって、ＲＥＰ１、ＲＥＰ２及びＦＬＰ遺伝子並び
    にＯＲＩ、ＳＴＢ、ＩＲ１及びＩＲ２部位の正常な機能
    が維持されるように２ミクロンプラスミドＤＮＡを制限
    エンドヌクレアーゼにより開裂せしめ、こうして得られ
    た線状化されたプラスミドをデスルファトヒルジン発現
    カセットに、並びに場合によっては酵母用の１又は複数
    の選択遺伝マーカー並びに細菌宿主用の選択遺伝マーカ
    ー及び複製起点を含有するＤＮＡセグメントに連結し、
    そして得られたハイブリドベクターを再環化する、こと
    を含んで成る方法。 ９、内因性の２ミクロンＤＮＡを欠いており、そして（
    １）構成的酵母プロモーター、該プロモーターが作用可
    能に連結されているシグナルペプチドをコードする第一
    ＤＮＡ配列、該第一ＤＮＡ配列と適切なリーディングフ
    レーム内に連結されているデスルファトヒルジンをコー
    ドする第二ＤＮＡ配列、及び酵母転写停止シグナルを含
    有するＤＮＡ配列、から成るデスルファトヒルジン発現
    カセット、並びに（２）無傷のＲＥＰ１、ＲＥＰ２及び
    ＦＬＰ遺伝子並びに無傷のＯＲＩ、ＳＴＢ、ＩＲ１及び
    ＩＲ２部位を含有する完全な２ミクロンＤＮＡ、を含ん
    で成る酵母ハイブリドベクターにより形質転換されてい
    る酵母株。１０、サッカロミセス・セレビシエー（￥Ｓ
    ａｃｃｈａｒｏ−￥￥ｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉｓｉ
    ａｅ￥）の株である請求項９に記載の酵母株。 １１、請求項９に記載の形質転換された酵母株の製造方
    法であって、内因性２ミクロンプラスミドを欠く酵母株
    を前記ハイブリドベクターにより形質転換することを含
    んで成る方法。 １２、デスルファトヒルジン化合物の製造方法であって
    、内因性の２ミクロンＤＮＡを欠き、そして次のハイブ
    リドベクター、すなわち（１）構成的酵母プロモーター
    、該プロモーターが作用可能に連結されているシグナル
    ペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列、該第一ＤＮＡ配
    列と適切なリーディングフレーム内に連結されているデ
    スルファトヒルジンをコードする第二ＤＮＡ配列、及び
    酵母転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列、から成る
    デスルファトヒルジン発現カセット、並びに（２）無傷
    のＲＥＰ１、ＲＥＰ２及びＦＬＰ遺伝子並びに無傷のＯ
    ＲＩ、ＳＴＢ、ＩＲ１及びＩＲ２部位を含有する完全な
    ２ミクロンＤＮＡＮを含んで成る酵母ハイブリドベクタ
    ーにより形質転換されている酵母株を培養し；そして 前記デスルファトヒルジンを単離し、そして所望により
    、得られたデスルファトヒルジン化合物の混合物を個々
    の成分に分離する； ことを含んで成る方法。 １３、デスルファトヒルジン変形体ＨＶ１、ＨＶ２、Ｈ
    Ｖ２（修飾形）、ＰＡ及びｄｅｓ（Ｖａｌ＿２）−デス
    ルファトヒルジンから成る群から選ばれたデスルファト
    ヒルジンを製造するための、請求項１２に記載の方法。 １４、デスルファトヒルジン変形体ＨＶ１の製造のため
    の請求項１２に記載の方法。
JP10477289A 1988-04-26 1989-04-26 デスルファトヒルジン化合物の製造方法 Pending JPH0213377A (ja)

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