JPH05292972A - 改良された酵母発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 プロモーターとその下流に融合した特定の蛋
白質をコードするＤＮＡを含んで成る複数の発現カセッ
トが同一の宿主中の異る染色体又は同一の染色体の異る
部位に組込まれている、該蛋白質を発現することができ
る宿主、並びにその宿主を用いての該蛋白質の製造方
法。宿主として酵母を、特定の蛋白質としてヒト血清ア
ルブミンを、プロモーターとして酵母グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの一部を
含む改変プロモーター、及び酵母アルコールデヒドロゲ
ナーゼＩプロモーターを用いる場合を例示する。 【効果】 上記具体例において、発現量が約４倍に増加
した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定の蛋白質を効率よ
く産生することができる発現宿主、及び該宿主を用いた
特定の蛋白質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵母を宿主として外来遺伝子産物を高効
率で産生させるために、外来遺伝子を発現する遺伝子数
を増加させるなどの方法が試みられている。しかしなが
ら、外来遺伝子産物は酵母にとり異物であるため、それ
を発現遺伝子の数を増加させることにより高効率で発現
させようとすると、酵母にストレスがかかり、酵母の生
育が阻害される、例えば液胞が肥大化するような酵母の
細胞内器官が異常になる、酵母が死滅、破裂しやすくな
るなどの問題が生じる。

【０００３】また目的物である遺伝子産物を容易に精製
して得るためには、それを菌体外に効率良く分泌させる
ことが必要であるが、上記のような方法をとるならば、
上記の問題点に加え、菌体外に分泌されず菌体内に蓄積
する、分泌された蛋白質が分解されやすくなるなどの問
題が生じる。一方異種蛋白質を大量に生産するために
は、その蛋白質を生産する酵母を大量に培養することが
好ましい。その際、もっとも短時間でかつ高い対糖収率
で増殖させるためには、酵母を嫌気的呼吸（醗酵）で生
育させるのでなく、酸素吸収により生育させる必要があ
り、そのための増殖制御方法も多数開発されている。し
かしながら酵母のなかには、ミトコンドリアＤＮＡの変
異により酸素呼吸が不可能な菌株も多く知られており、
実験室株として著名なＡＨ22株もミトコンドリアＤＮＡ
に変異を持つ呼吸欠損株である。このような株を用いた
場合にはたとえ菌体当りの異種蛋白質産生量が高いとし
ても、短時間でかつ高い対糖収率で菌体を生育させるこ
とは困難であり、そのため高い対糖収率で異種蛋白質を
生産することは困難となる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって本発明は、
同一の宿主の染色体に複数の発現カセットを組み込み、
組み込んだ場合に、異種蛋白質産生に伴う弊害が生じ
ず、また高密度大量培養化を目的とした培養に供するこ
とが出来、且つ外来蛋白質を効率良く発現させることを
目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って本発明は、プロモ
ーターとその下流に融合した特定の蛋白質をコードする
ＤＮＡを含んで成る複数の発現カセットが、同一の宿主
中の異なる染色体、あるいは同一の染色体の異なる部位
に組み込まれており、該特定の蛋白質を障害なく効率良
く分泌発現することができ、酸素呼吸能を持つ宿主、並
びにこの宿主を用いて分解されることなく該蛋白質を製
造する方法に関する。

【０００６】

【具体的な説明】本発明において好ましい宿主は酵母で
あり、宿主として酵母を用いる場合について具体的に説
明する。本発明において用いるプロモーターは、選択さ
れた宿主細胞中で機能することができるものであり、宿
主が酵母の場合、例えばＰＧＫプロモーター、 ADH２プ
ロモーター、 GAL１−10プロモーター、PH05プロモータ
ーや、人工ＤＮＡ配列又は異種ＤＮＡ断片由来の酵母で
プロモーター機能を持つ断片等が使用できる。好ましく
は発現カセットごとに異るプロモーターを使用する。本
発明においては、具体例として、一方のプロモーターが
酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ADHI）プロモータ
ーであり、他方のプロモーターが酵母グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(TDH３）プロモーター
の一部分を含む改変プロモーターを使用する。

【０００７】本発明の特定の蛋白質としては、プロテイ
ンジスルフィドイソメラーゼなどの酵素インターロイキ
ン２、ヒトインターフェロンなどのリンホカイン、肝細
胞増殖因子などの各種増殖因子、成長ホルモンなどのポ
リペプチドホルモン等、種々の蛋白質を挙げることがで
きる。具体例としてヒト血清アルブミンについて記載す
る。

【０００８】１）高発現ベクターの作成 酵母に外来遺伝子を導入し、発現させるには、酵母にお
いて高い転写能力を持つプロモーターの下流に、目的の
外来遺伝子を連結させ、導入するのが望ましい。そのた
め本発明においては、まず、強力なプロモーターの制限
のもとにあるヒト血清アルブミン遺伝子が染色体に組込
まれている酵母宿主を用意し、次にこれに第二の発現カ
セットを挿入する。

【０００９】このようなプロモーターとして、酵母のGA
PDH の遺伝子の一つである TDH３遺伝子の上流活性化配
列（UAS)と、同遺伝子のTATA配列、CAAT配列などから構
成される転写開始領域から成り立ち、強力な転写能力を
持つプロモーターUAS1−N7（特願平３−106600号）を用
いる。また新たに導入するＨＳＡ遺伝子としては、酵母
に適したコドンから成り立つリーダー配列を付加するこ
とによって改変したＨＳＡ遺伝子である HSA−Ａ遺伝子
（特開平２−117384号）を用いる。また転写終了配列と
しては、酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ADHI）遺
伝子の転写終了配列を用いる。

【００１０】また新たに酵母に導入する発現遺伝子は、
染色体と遊離したプラスミドの形にして導入すると、そ
の形質転換体を培養している間にプラスミドが脱落して
しまい、安定にＨＳＡを産生し続けることができなくな
ることが考えられるため、導入する遺伝子は、染色体に
組み込ませることが望ましい。そのため、これらのプロ
モーター、ＨＳＡ遺伝子及びADHI遺伝子の転写終了配列
を連結させたものを、酵母組み込み型ベクターpRS305に
導入することにより、酵母の leu２遺伝子座に組み込む
ことが可能なＨＳＡ発現プラスミドpRG-UAS1-N7-TLY1-3
05を作成する。このＨＳＡ発現プラスミド作成の詳細に
ついては実施例１に記載する。

【００１１】 ２）高分泌株へのＨＳＡ高発現プラスミドの導入 pRG-UAS1-N7-TLY1-305をClaIで切断したものを用いて、
ＨＳＡ高分泌変異株である 222株（特願平３−110775
号；微工研菌寄第 12186号）を形質転換することによ
り、 222株の leu２遺伝子座にこの発現プラスミドを組
み込ませることができる。ここで用いた変異株、 222株
は、ＡＨ22株の his４遺伝子座に酵母 ADH１遺伝子のプ
ロモーターを利用したＨＳＡ発現プラスミドを導入して
得られたHIS23株にＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）
を用いた変異処理を施すことにより得られたＨＳＡを高
分泌するようになった株である（特願平３−110775）。

【００１２】形質転換株は、ロイシンの非要求性を指標
に選択する。得られた形質転換体のＨＳＡ生産能は、Ｙ
ＰＤ培地中に分泌されたＨＳＡをSDS-PAGEにより分析す
ることにより調べる。この新たな発現ベクターの導入に
より得られた株、U1N7TLY1／222 株は、元の 222株の倍
以上の量のＨＳＡを培地に分泌する能力を持っていた。
これらの実験の詳細は実施例２に記載した。

【００１３】３）接合による株の創製 ＡＨ22由来の 222株は、ミトコンドリアＤＮＡに変異を
持つρ^- 株であるため、エタノール資化能などを持たな
い所謂呼吸欠損株である。そのため、菌体の高密度培養
に適した株ではない。故に 222株の形質転換体であるU1
N7TLY1／222 株も同様に高密度培養に適した株とはいえ
ない。この性質を補うためには、例えば接合により、正
常なミトコンドリアＤＮＡを持つミトコンドリアを導入
する必要がある。

【００１４】しかしながら、接合を行なうことにより、
呼吸欠損が補われるのみでなく、接合に供する相手株の
好ましくない形質も導入される可能性があるため、供す
る株を選ぶ必要がある。そのような株の候補としては、
以下のような形質を持つことが好ましい。高密度化を図
るためには、増殖能力が高い株が望ましく、またＨＳＡ
の生産を行なうためには、例えばプロテアーゼなどが分
泌されにくい株が好ましい。また当然呼吸欠損でない株
であることは必須である。このような株として本発明に
おいては A8207BNK1株（ATCC.52299）を用いる。

【００１５】UAS1＋N7／222 株と A8207BNK1株を接合さ
せ、２倍体を得る。これを胞子形成培地に移すことによ
り胞子を作らせ、得られた胞子を持つ20個の子嚢から80
個の胞子を単離する。これらの胞子由来株から、ＨＳＡ
を多く生産し、且つヒスチジンの要求性を持たない株を
ニトロセルロース膜を用いたＨＳＡの検出方法と、SDS-
PAGEを用いた分泌ＨＳＡの定量方法を用いて評価するこ
とにより、 222株の形質である高いＨＳＡ産生能を持
ち、かつ呼吸能を持つ株を選択する。

【００１６】これらの操作の結果、本発明の提供する
株、ＹＹ９Ｃ株とＹＹ12Ａ株を得た。なおこれ等の実験
の詳細については、実施例３，４，５に記載したが、Ｙ
Ｙ９Ｃ株、及びＹＹ12Ａ株は元の 222株の３倍以上のＨ
ＳＡを培地に分泌する能力を持っていた。また、 222株
が利用することのできなかった非発酵性の炭素源である
グリセロール、乳酸、エタノールを利用し増殖すること
が可能であり、くわえて、これらの炭素源を利用してＨ
ＳＡを生産することもできる。

【００１７】なお、これらの酵母株、Saccharomyces
cerevisiae ＹＹ９Ｃは工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第１２３６９号として寄託されており、
Saccharomyces cerevisiae ＹＹ12Ａは同様に微工研
菌寄第１２３７０号として寄託されている。

【００１８】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。実施例１ ．ＨＳＡ発現ベクターpRG-UAS1-N7-TLY1-305の
作成 制限酵素処理方法の詳細、制限酵素断片の調整方法の詳
細、T4 DNAリガーゼを用いた連結、環状化反応の詳細、
大腸菌の形質転換、形質転換体の選択、形質転換体の持
つプラスミドＤＮＡの検定などについては、一般的な実
験としてまとめて最後に記載した。

【００１９】TDH３の欠失変異プロモーターを有する pX
X05から単離された約0.６kbのHindIII-XhoI断片を、プ
ロモーター検定ベクターpJDB-NeoC-ATE のHindII-XhoI
サイトに挿入したプラスミド（詳細は特願平３−106000
に記載済み）、pXX05-NeoC-ATEをHindIII とSalIで切断
し、 TDH３遺伝子のプロモーター断片とネオマイシン耐
性遺伝子とADHI遺伝子のターミネーターを含む２kbの断
片を調整した。

【００２０】この断片をHindIII とXhoIで切断したpRS3
05（SikorskiとHieter, Genetics,122, p19−27, 198
9）とT4 DNAリガーゼを用いて連結・環状化させ、その
反応液を用いて大腸菌XL1-Blue（Stratagene社）を形質
転換させ、アンピシリン耐性コロニーを選択することに
より目的とするプラスミドpXX05-NeoC-305を含むクロー
ンを得た。次にＨＳＡ発現プラスミドであるpJDB-ADH-n
HSA-A(特開平３−22984)をXhoIとBamHI で切断し、ＨＳ
ＡのcDNAを含む２kbの断片を単離した。この断片とXhoI
とBamHI で切断したpXX05-NeoC-305の大断片とをT4 DNA
リガーゼを用いて連結・環状化させた。

【００２１】この反応液を用いて大腸菌XL1-Blueを形質
転換させ、アンピシリン耐性コロニーを選択することに
より目的とするプラスミドpXX05-LyO-305 を含むクロー
ンを得た。次に、ＵＡＳ検定ベクターpRG-N7L-LacZC の
HindII, BglII サイトに、 TDH３遺伝子のＵＡＳ領域を
持つプラスミドpUAS１から単離した約 150bpのHindIII-
BglII 断片を挿入することによって作成した TDH３遺伝
子の改変プロモーター断片UAS1-N7 を持つプラスミド
（詳細は特願平３−106600に記載済み）、pRG-UAS1-N7-
LacZC をNotIとXhoIで切断し、1.５kbの断片を単離し
た。

【００２２】一方pXX05-LyO-305 をNotIとXhoIで切断し
10kbの断片を単離し、上記1.５kbの断片とT4 DNAリガー
ゼを用いて連結・環状化させた。この反応液を用いて大
腸菌XL1-Blueを形質転換させ、アンピシリン耐性コロニ
ーを選択することにより目的とするプラスミドpRG-UAS1
-N7-LyO-305 を含むクローンを得た。

【００２３】改変リーダー配列を持つＨＳＡ遺伝子発現
ベクター、pJDB-ADH-HSA-A（特開平２−117384）をXhoI
とBamHI で切断し、２kbの断片を単離した。この断片を
XhoIとBamHI で切断したベクターpT3T7-U19X（特開平２
−222689）とT4 DNAリガーゼを用いて連結・環状化さ
せ、この反応液を用いて大腸菌XL1-Blueを形質転換さ
せ、アンピシリン耐性コロニーを選択することにより目
的とするプラスミドpLY1−37を含むクローンを得た。pL
Y1−37をEcoRI で切断し、フェノール抽出、エタノール
沈殿法によりＤＮＡを純化した後、XhoIリンカー（５′
−AATTGCTCGAGC）とT4 DNAリガーゼを用いて連結・環状
化させた。この反応液に１／10反応液分の0.５Ｍ NaCl
を加え、68℃、10分処理した後、EcoRI で再切断した。

【００２４】この反応液を用いて大腸菌XL1-Blueを形質
転換させ、アンピシリン耐性コロニーを選択することに
より目的とするプラスミドpLY1X-37を含むクローンを得
た。このプラスミドをHindIII で切断した後、68℃、10
分処理し、ヌクレオチド混合液（１mM ATP, １mM TTP，
１mM GTP，１mM CTP）を１／10容、２ＵのＤＮＡポリメ
ラーゼ（クレノー断片）を加え、37℃、15分間処理する
ことにより、HindIII切断末端を平滑末端化させた。

【００２５】フェノール抽出、エタノール沈殿法により
ＤＮＡを純化した後、XhoIで切断し、２kbの断片を単離
した。この断片をSmaIとXhoIで切断したpT3T7-U18X（特
開平２−222689）とT4 DNAリガーゼを用いて連結・環状
化させ、この反応液を用いて大腸菌XL1-Blueを形質転換
し、アンピシリン耐性コロニーを選択することにより目
的とするプラスミドpTLY１を含むクローン得た。

【００２６】次にこのプラスミドをXhoIとBamHI で切断
し、1.８Kbの断片を単離した。またpRG-UAS1-N7-LyO-30
5 をXhoIとBamHI で切断し８Kbの断片を単離した。これ
らの断片をT4 DNAリガーゼを用いて連結・環状化させ、
この反応液を用いて大腸菌XL1-Blueを形質転換させ、ア
ンピシリン耐性コロニーを選択することにより目的とす
るプラスミドpRG-UAS1-N7-TLY1-305を含むクローンを得
た。

【００２７】実施例２． 222株の改良 ＨＳＡ高分泌変異株、 222株（特願平３−110775）をＹ
ＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコ
ース）で１夜培養し、そのうちの0.１mlを５mlのＹＰＤ
培地に接種した。ＯＤ600 が1.０に達するまで培養した
後、遠心により菌体を集め、集めた菌体を0.５mlの0.１
Ｍ酢酸リチウム液（0.１Ｍ酢酸リチウム、10mMトリス塩
酸〔pH7.５〕、１mM EDTA)にて１回洗った。再度遠心に
より菌体を集め、70μｌの0.１Ｍ酢酸リチウム液に再懸
濁し、30℃、１時間保温した。

【００２８】ClaIで切断することによって直鎖状にした
発現プラスミドpRG-UAS1-N7-TLY1-305のＤＮＡを５μｇ
加えた後、30℃、30分保温した。 500μｌのＰＥＧ溶液
（40％ポリエチレングリコール〔平均分子量4,000 〕を
含む0.１Ｍ酢酸リチウム液）を加え、ピペットマンを用
いてよく混合した後、45分、30℃で保温した。

【００２９】この細胞懸濁液を42℃、５分熱処理し、 5
00μｌの滅菌水を加えた後、遠心により菌体を集め、 1
00μｌの滅菌蒸留水に再懸濁した後、ＳＤ（−Leu)寒天
培地（20μｇ／mlアデニン硫酸塩、20μｇ／mlアルギニ
ン塩酸塩、20μｇ／mlメチオニン、20μｇ／mlヒスチジ
ン硫酸塩、20μｇ／mlトリプトファン、20μｇ／mlウラ
シル、30μｇ／mlイソロイシン、30μｇ／ml塩酸塩リジ
ン、30μｇ／mlチロシン、50μｇ／mlフェニルアラニ
ン、 150μｇ／mlバリン、0.67％アミノ酸不含イースト
ニトロゲンベース、２％デキストロース、２％寒天）に
ひろげ、30℃におき３日間培養することによりコロニー
を形成させた。

【００３０】コロニーを形成した株から分泌されるＨＳ
Ａの量の定量を、下に示したSDS-PAGEによるＨＳＡの定
量方法によって行ない、 222株よりも大量のＨＳＡを分
泌する株、U1N7TLY1／222 株を得た。U1N7TLY1／222 株
の培地中に分泌するＨＳＡ量を定量した結果を表１に示
す。また比較のために、 222株についてもＨＳＡ分泌量
を定量した結果を示した。

【００３１】 表１ 菌 株 ＨＳＡ分泌量 ＨＳＡ分泌量 （24時間培養)(mg／ｌ） （48時間培養)(mg／ｌ） 222株 2.48 2.92 U1N7TLY1／222 株 5.88 6.66

【００３２】実施例３．U1N7TLY1／222 株の改良 ＹＰＤ寒天培地（２％寒天を含むＹＰＤ培地）に形成さ
せたU1N7TLY1／222 株のコロニーを白金耳でかきとり、
同じくＹＰＤ寒天培地に形成させたA8207BNK1株（ATCC.
52299）の白金耳でかきとったコロニーを、ＹＰＤ寒天
培地上で混合した後、30℃、４時間培養することにより
接合させた。培養終了後、白金耳で寒天培地上にコロニ
ーを形成するように広げ、30℃、２日間増殖させた。

【００３３】形成したコロニーの菌体を位相差顕微鏡で
観察し、倍数体の形態を持つ菌体からなるコロニーを選
択した。この倍数体コロニーを前胞子形成寒天培地（0.
８％酵母エキス、0.３％ペプトン、10％グルコース、２
％寒天）上に移し、30℃、24時間培養した。さらにこれ
らの菌体を胞子形成寒天培地（２％酢酸カリウム、２％
寒天）上に広げ、30℃、２日間培養することにより、胞
子を形成させた。

【００３４】胞子形成した子嚢、20個から、ミクロマニ
ピュレーターを用いて80個の胞子をＹＰＤ寒天培地上に
分離し、30℃、２日間培養することによりコロニーを形
成させた。これらのコロニーのうち、ＳＤ（−His)寒天
培地（20μｇ／mlアデニン硫酸塩、20μｇ／mlアルギニ
ン塩酸塩、20μｇ／mlメチオニン、30μｇ／mlロイシ
ン、20μｇ／mlトリプトファン、20μｇ／mlウラシル、
30μｇ／mlイソロイシン、30μｇ／ml塩酸塩リジン、30
μｇ／mlチロシン、50μｇ／mlフェニルアラニン、 150
μｇ／mlバリン、0.67％アミノ酸不含イーストニトロゲ
ンベース、２％デキストロース、２％寒天）上で成育す
るものを選択した。

【００３５】成育するコロニーを、ＹＰＤ寒天培地上に
のせたニトロセルロース膜の上に移して、30℃で24時間
培養し、コロニーから分泌された蛋白質をニトロセルロ
ース膜に吸着させた。このニトロセルロース膜から付着
した菌体を蒸留水で洗浄して除去した後、膜を80℃で２
時間乾燥させた。この膜上のＨＳＡを下に示した抗体を
用いたＨＳＡの検出方法によって検出し、比較的大量の
ＨＳＡが検出された株をさらに選択した。

【００３６】これらの株から分泌されるＨＳＡの量の定
量を下に示した、SDS-PAGEによるＨＳＡの定量方法によ
って行ない、そのうち大量のＨＳＡを分泌生産している
ＹＹ12Ａ株、ＹＹ９Ｃ株を選択した。ＹＹ９Ｃ株、ＹＹ
12Ａ株の培地中に分泌するＨＳＡ量を定量した結果を表
２、表３、表４に示す。また比較のために、 222株、U1
N7TLY1／222 株についてもＨＳＡ分泌量を定量した結果
を示した。

【００３７】 表２ ＹＤＰ培地におけるＨＳＡ発現量 菌 株 ＨＳＡ発現量 ＨＳＡ発現量 （24時間培養)(mg／ｌ） （48時間培養)(mg／ｌ） 222株 2.48 2.92 U1N7TLY1／222 株 5.88 6.66 ＹＹ９Ｃ株 7.62 5.32 ＹＹ12Ａ株 6.41 12.68

【００３８】

【００３９】

【００４０】なお、前記ニトロセルロース膜上のＨＳＡ
の検出は次のようにして行った。ニトロセルロース膜上
のＨＳＡの検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗ＨＳＡ抗体を用いて以下のように行なった。まず、
ＨＳＡを吸着したニトロセルロース膜を３％ゼラチンを
含むＴＢＳ液（0.５Ｍ塩化ナトリウム、20mMトリス−塩
酸緩衝液〔pH7.５〕）中で30分処理した。次にこの膜を
TTBS液（0.05％のTween20 を含むＴＢＳ液）で５分間処
理し、さらに同じ操作をもう一度行なった後に、１％の
ゼラチンを含むTTBS液で西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識ヤギ抗ＨＳＡ抗体を1000倍に希釈した溶液中に膜を移
して、８分間振盪した。

【００４１】膜をTTBS液で２回、ＴＢＳ液で１回、それ
ぞれ５分間洗浄した後、 0.015％過酸化水素、0.05％Ｈ
ＲＰ−カラーデベロップメント試薬（バイオラド社）、
20％メタノールを含むＴＢＳ液に膜を移して発色反応さ
せた。反応終了後は、膜を蒸留水で洗浄した。

【００４２】また、前記SDS-PAGEによるＨＳＡ分泌量の
定量は次のようにして行った。ＨＳＡ分泌酵母株から分
泌されるＨＳＡ量をSDS-PAGEによって測定する方法は、
以下にしたがって行なった。まずＨＳＡ分泌酵母株を５
mlのＹＰＤ培地に懸濁し、30℃で24時間培養した。培養
液50μｌを新しい５mlの培地（ＹＰＤ培地、YPGL培地
〔１％酵母エキス、２％ペプトン、１％グリセリン、１
％乳酸〕、ＹＰＥ培地〔１％酵母エキス、２％ペプト
ン、１％エタノール〕）に接種し、さらに30℃で培養し
た。培養液を10,000rpm で40秒遠心して得られた培養上
清を 125μｌ分取し、エタノール 125μｌを加えよく混
合した後、氷中に１時間静置した。

【００４３】これを15,000rpm で５分間遠心し、得られ
た沈殿を減圧乾燥させた後、10μｌのサンプル液（２％
SDS 、５％２−メルカプトエタノール、10％グリセリ
ン、0.0625％ブロモフェノールブルー、0.0625Ｍトリス
塩酸緩衝液〔pH6.８〕）に溶解し、 100℃中、５分間処
理した。この溶液を４％から20％の勾配ゲル濃度のＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルにより電気泳動（Laemmli, N
ature, 277, p680-685,1970）した後、クマシーブリリ
アントブルーＲ250 で蛋白質を染色した。ゲルを脱色し
た後、ＨＳＡに対応するバンドをデンシトメーター(TEF
CO社、TIAS−100)により測定し、標準ＨＳＡ試料と比較
定量した。

【００４４】なお、本発明の実施例において一般的実験
方法は次の通りであった。ＤＮＡは以下のような条件で
制限酵素処理した。例えば１μｇのＤＮＡを10μｌの反
応液中（反応後はメーカーの推奨する条件のものを用い
た）、５ユニットの制限酵素を加え、37℃に１時間保温
した。制限酵素断片を調製するためには、例えば反応終
了した反応液に１／10容のＢＰＢ液（50％グリセリン、
0.01％ブロモフェノールブルー、50mM EDTA)を加えた
後、0.７％アガロースゲルにのせ電気泳動を行なった。
電気泳動はＴＡＥ緩衝液（40mMトリス、20mM酢酸ナトリ
ウム、10mM EDTA 、酢酸を用いてpHを8.０に調整したも
の）を用いて行った。

【００４５】電気泳動終了後、必要なバンドを切り出
し、GENECLEAN Kit(BIO101社）を用いてゲルからＤＮＡ
を回収した。T4 DNAリガーゼを用いた連結反応は、例え
ばゲルから回収したＤＮＡ、 100ngと10ngのプラスミド
を10μｌの反応液（50mMトリス塩酸〔pH7.５〕、10mM M
gCl₂、10mMヂチオスレイトール、１mM ATP）で17ユニッ
トのT4 DNAリガーゼを加え、16℃、１時間保温した。大
腸菌の形質転換はHanahan の方法（p109−135 In D.M.G
lover(ed.), DNA cloning: a plactical approach, vo
l.1.IRL Press, Oxford, England,1985）で行った。

【００４６】大腸菌はＬ培地（0.５％酵母エキス、１％
トリプトン、0.５％塩化ナトリウム）を用いて培養し
た。また大腸菌形質転換体はLamp寒天培地（50μｇ／ml
アンピシリン、1.５％寒天を含むＬ培地）によって選択
した。大腸菌形質転換体のプラスミドＤＮＡをミニプレ
パレーション法（例えば、Manatis 等、Molecular clon
ing.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laborat
ory, 1982)を用いて調製し、回収したＤＮＡを適当な制
限酵素によって切断し、その切断パターンをアガロース
電気泳動などによって調べることにより、目的とするプ
ラスミドを持つ形質転換体を選択した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はプラスミドpXX05-NeoC-ATE及びpRS305か
らプラスミドpXX05-NeoC-305の作製過程を示す。

【図２】図２はプラスミドpXX05-NeoC-305及びpJDB-ADH
-nHSA-A からプラスミドpXX05-LyO-305 の作製過程を示
す。

【図３】図３はプラスミドpJDB-ADH-nHSA-A 及びPT3T7-
O19XからプラスミドpLY1−37の作製過程を示す。

【図４】図４はプラスミドpLY1−37及びpT3T7-O18Xから
プラスミドpTLY１の作製過程を示す。

【図５】図５はプラスミドpXX05-LyO-305 及びpRG-USA1
-N7-LacZC からプラスミドpRG-UAS1-N7-LyO-305 の作製
過程を示す。

【図６】図６はプラスミドpTLY１及びpRG-UAS1-N7-LyO-
305 からプラスミドpRG-UAS1-N7-TLY1-305の作製過程を
示す。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロモーターとその下流に融合した特定
   の蛋白質をコードするＤＮＡを含んで成る複数の発現カ
   セットが同一の宿主中の異る染色体又は同一の染色体の
   異る部位に組込まれている、該特定の蛋白質を発現する
   ことができる宿主。
2. 【請求項２】 前記宿主が酵母菌である、請求項１に記
   載の宿主。
3. 【請求項３】 前記プロモーターが酵母アルコールデヒ
   ドロゲナーゼＩプロモーター、及び酵母グリセルアルデ
   ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの一部
   を含む改変プロモーターであり、これらが異る発現カセ
   ット中に存在する、請求項１又は２に記載の宿主。
4. 【請求項４】 前記蛋白質がヒト血清アルブミンであ
   る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の宿主。
5. 【請求項５】 前記発現カセットが組込まれている部位
   が酵母染色体上の leu２座又は his４座である、請求項
   １〜４のいずれか１項に記載の宿主。
6. 【請求項６】 第二の発現カセットがヒト血清アルブミ
   ン高発現プラスミドpRGU−N7−TLy1を用いて導入された
   ものである、請求項１に記載の宿主。
7. 【請求項７】 酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモ
   ーターとプレプロヒト血清アルブミンcDNAとが融合され
   た第一の発現カセットを his４座位に含む酵母菌に、請
   求項６に記載の発現プラスミドにより第二の発現カセッ
   トが導入されている、宿主。
8. 【請求項８】 前記第一の発現カセットを含む酵母菌
   が、突然変異によりヒト血清アルブミンを効率よく産生
   するようになったものである、請求項７に記載の宿主。
9. 【請求項９】 前記第一の発現カセットを含む酵母変異
   株が 222株である、請求項８に記載の宿主。
10. 【請求項10】 呼吸能欠損株である、請求項７〜９のい
    ずれか１項に記載の宿主。
11. 【請求項11】 請求項10に記載の呼吸能欠損株と、呼吸
    活性が高く且つ増殖能の高い酵母株との接合により得ら
    れる、呼吸能が高く且つヒト血清アルブミンの生産能が
    高い宿主。
12. 【請求項12】 請求項１〜11のいずれか１項に記載の宿
    主を培養し、そして培養物から特定の蛋白質を採取する
    ことを特徴とする、特定の蛋白質の製造方法。
13. 【請求項13】 前記特定の蛋白質がヒト血清アルブミン
    である、請求項12に記載の方法。