NO314941B1 - Fremgangsmåte for å rense et protein - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å rense et primat GM-CSF protein fra en blanding av proteiner suspendert i et vandig medium.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å rense et primat GM-CSF-protein fra en blanding av proteiner suspendert i et vandig medium.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

De mange forskjellige celletyper som finnes i blod er alle kommet fra puripotente hematopoietiske startceller. Slike celler har to funksjoner: (1) de reproduserer seg selv, for dermed å opprettholde en stamcellepopulasjon i kroppen og (2) de tilveiebringer celleavkom som vil differensiere til hvilke som helst av de fullt utviklede blodcellety-pene. Den cellen som skal differensieres i en spesiell hematopoietisk retning betegner en progenitor-celle. Progenitor-celler for T-lymfocytter, B-lymfocytter, granulocytter, røde blodlegemer, plater og eosinofiler, så vel som tidligere progenitorer som individu-elt kan fremkalle en rekke fullt utviklede celle-typer, er blitt gransket eksperimentelt både in vivo og in vitro (Dexter, T.M. 1983, J. Pathology 141 (415-433)). Man har funnet at formering og/eller differensiering in vitro av hver progenitor-celletype avhenger av spesifikke faktorer som er avledet fra ulike kilder. F.eks. krever de senere progenitorene for røde blodlegemer en faktor kalt erytropoietin. Faktorene som kreves for overle-velse, formering og differensiering av de myeloide progenitorene som skal danne fullt utviklede neutrofile granulocytter, monocytter og fullt utviklede makrofager betegnes kolonisirkulerende faktorer (CSFs).

CSF-aktiviteten er blitt omfattende undersøkt i mus. De fleste voksne museorganer fremstiller CSF-aktivitet. Men blandinger som inneholder CSF-aktivitet som er oppnådd fra forskjellige vev og ved hjelp av forskjellige metoder synes å avvike med hensyn til deres biokjemiske egenskaper. Men, struktur-slektskapene mellom de forskjellige faktorene forblir ukjent. Videre synes CSF-aktiviteten å virke ved mer enn ett trinn i utviklingen av granulocytter og makrofager, og igjen er det usikkert om en eneste faktor er ansvarlig for alle de målte aktivitetene eller om forskjellige faktorer virker ved hvert ut-viklingstrinn. (Burgess, A. and Metcalf, D. 1980 Blood 56 (947-5957)).

Det er oppnådd human CSF-aktivitet fra placenta, visse føtale vev, makrofager og sti-mulerte T-celler. En linje T-celler (Mo) som fremstiller én eller flere sterkt virkende CSF-aktiviteter blir tilveiebragt fra en pasient med en T-celletype fra hårcelle-leukemi (leukaemic reticuloendotheliosis) (Golde et al 1978 Blood 52 (1068-1072)).

CS-aktivitetens evne til å stimulere fremstillingen av granulocytter og makrofager indikerer at farmasøytiske preparater med CSF-aktivitet er klinisk nyttige i tilfeller hvor en øket fremstilling av disse (myeloid) celletyper kreves. Flere pasienter med ekstremt høye nivåer av tilsynelatende normale sirkulerende granulocytter har vist seg å ha tumo-rer som danner unormale mengder med CSF. I et tilfelle, ved operativ fjerning av tumo-ren sank granulocytt-antallet raskt til et normalt nivå, noe som sterkt tyder på at CSF kan være anvendelig ved regulering av antall sirkulerende granulocytter. Hocking, W., Goodman, J., and Golde, D. Blood 61 600 (1983)). Spesielt er CSF-preparater klinisk nyttige ved behandling av myelo-undertrykkelse forårsaket av kjemoterapeutisk eller strålebehandling av cancer. I tillegg er CSF-preparatene nyttige ved behandling av alvorlige infeksjoner, da CSF kan øke og/eller aktivere granulocytter og/eller monocytter.

Man har forskjellige ulike typer av kjente CSF-aktiviteter, inkluderende granulocytt-CSF (G-CSF), makrofag-CSF (M-CSF), granulocytt-makrofag-CSF (GM-CSF) og multi-CSF. Den foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt GM-CSF. CSF-proteinene er kjent fra forskjellige dyrekilder. Men den foreliggende oppfinnelse omhandler spesielt primat-CSF, og i særdeleshet human-CSF og ape-CSF.

Biologisk og biokjemisk karakterisering av preparater med CSF-aktivitet, og under-søkelse av disse preparatene klinisk, er blitt vanskeliggjort til dags dato på grunn av mangelen på og forurensningene av humane og/eller andre primate CSF-preparater. Det er tydelig at dett er ønskelig å identifisere proteinet eller proteinene som er ansvarlig for CSF-aktiviteten. Videre er det ønskelig å ha en primat, foretrukket human kilde av slik CSF som raskt kan tilføres disse proteinene i mengder og med en renhet som er tilstrekkelig for en biologisk og biokjemisk karakterisering og for anvendelse som terapeutiske midler.

Nylig utviklede teknikker for molekyær kloning gjør det mulig å klone en nukleotid-sekvens som koder for et protein og å fremstille en mengde av dette proteinet ved anvendelse av et passende vert-vektor-system (Maniatis, T. Molecular Cloning - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)). Proteinet kan gjenvinnes ved hjelp av kjente separasjons- og renselses-teknikker. De metodene for kloning som til nå er anvendt kan deles inn i tre generelle kategorier: (1) metoder som bygger på kunnskap angående proteinstrukturer, f.eks. dets aminosyresek-vens, (2) metoder som bygger på identifikasjon av proteinet uttrykt ved hjelp av det klonede genet ved anvendelse av et antistoff som er spesifikt for det ovennevnte proteinet, og (3) metoder som bygger på identifikasjon av RNA-specier som kan oversettes til å utvikle proteinet eller aktiviteten kodet av det genet som er av interesse.

Hver av disse metodeklassene blir vanskelige å anvende da proteinet av interesse, slik

som CSF-proteinet, er tilgjengelig i svært små mengder. Dersom det er vanskelig å oppnå en adekvat mengde renset protein, er det vanskelig å bestemme aminosyresekvensen eller til og med delvise sekvenser i proteinet. Likeledes er en identifikasjon av et uttrykt protein ved hjelp av antistoffbinding foretrukket utført ved anvendelse av et høytiter monospesifikt polyklonalt antiserum. Et slik antiserum kan ikke oppnås i fravær av mengder av det rene proteinet (antigen). Et monoklonalt antistoff muliggjør en alterna-tiv metode, men det nødvendige antistoffet kan også være vanskelig å oppnå i fravær av et passende antigen, og et slikt monoklonalt antistoff vil muligens ikke reagere med proteinet i den formen hvori proteinet er uttrykt ved hjelp av tilgjengelig rekombinant vert-vektorsystemer. Endelig vil en oversetting av RNA-speciene for A gi et identifiserbart protein eller aktivitet kreve at det aktuelle RNA er tilstede i RNA-kilden i tilstrekkelig mengde til å gi et pålitelig protein- eller aktivitetssignal. Den relative mengden av et RNA som koder for et spesielt protein kan generelt sammenlignes med mengden av proteinet, slik at et sjeldent protein vanligvis kodes ved hjelp av et sjeldent mRNA.

Mo-cellelinjen har vært anvendt både som et utgangsmateriale for rensing av humant CSFs og for identifikasjon av tilsvarende budbringer RNAs. Men til og med med disse relativt gode kildene for CSF-aktivitet, har det vist seg å være ekstremt vanskelig å isolere nok av proteinet for anvendelse ved strukturundersøkelser.

For å overvinne problemene som er forbundet med kloning av nukleotid-sekvensen som koder for et sjeldent protein slik som CSF ved hjelp av metodene som er beskrevet over, ble det utviklet en ny metode. Denne metoden krever bare at gen-produktet eller dets aktivitet kan måles pålitelig. Passende metoder for CSF-målinger er beskrevet i det et-terfølgende eksempel 2. Sett fra et annet synspunkt, har man utviklet en rensemetode som muliggjør isolering og rensing av CSF-proteinet enten for en rekombinant eller naturlig kilde med en renhetsgrad og en aktivitet som er mye høyere enn det som tidligere var mulig.

Sammendrag av rekombinant DNA- prosessen i henhold til oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse overvinner for det første problemene i tidligere kjente teknikker og tilveiebringer en ferdig proteinkilde med CSF-aktivitet ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi. I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, benyttes en ny kloneteknikk som bare krever en test for CSF-aktivitet for å klone cDNA som kode for et protein med CSF-aktivitet. Derfor tilveiebringer den foreliggende opp finnelsen et cDNA som koder for et protein med CSF-aktivitet (i.e. CSF/cDNA), en mikroorganisme eller cellelinje transformert med en rekombinant vektor inneholdende slik CSF/cDNA, og en metode for fremstilling av CSF-protein ved at ovennevnte CSF/cDNA uttrykkes ved at en mikroorganisme eller cellelinje dyrkes. Fordi CSF-proteinet er fremstilt fra et klon i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, kan man være sikker på at det er et protein som har CSF-aktivitet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for å rense et primat GM-CSF-protein fra. en blanding av proteiner suspendert i et vandig medium, kjennetegnet ved at proteinet felles med ammoniumsulfat ved 80% metning til å danne en pellet inneholdende primat GM-CSF-proteinet, pelleten resuspenderes i en bufret løsning ved en pH i området 6 til omtrent 8, den bufrede løsning inneholdende primat GM-CSF-proteinet føres inn på en kromatografisk kolonne, primat GM-CSF-aktiviteten elueres med den bufrede løsning inneholdende natriumklorid og fraksjonene med primat GM-CSF-aktivitet samles og de aktive fraksjoner slås sammen, de sammenslåtte fraksjoner føres inn på en C4 revers fase kolonne og primat GM-CSF-aktiviteten elueres med en 0 til 90% acetonitirlgradient for å samle fraksjonene inneholdende CSF-aktiviteten.

CSF-proteinene i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er vekst- og dif-ferensierings-hormoner for cellene i det myeloide system. De er f.eks. indikert for klinisk anvendelse for behandling av myelo-undertrykkelse og spesielt (symptomatisk) granulocyto-penia som en følge av kjemoterapeutisk eller strålebehandling av cancer.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser DNA-sekvenser som koder for et CSF-protein i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen. DNAsekvensen som er satt opp i sitt hele, koder for en variasjon av humant CSF, betegnes som CSF-Thr. Et annet allel koder for et identisk produkt med unntak av at Thr i posisjon nr. 100 er byttet ut med Ile (CSF-Ile). Forandrin-gene som er illustrert over for den humane sekvensen er for forskjeller i DNA-sekvensen kodende for Gibbon CSF (CSF fra Gibbon-ape) (CSF-G). Deducerte aminosyresek-venser er også illustrert. Fig. 2 illustrerer skjematisk fremstillingen av plasmid pTPL fra plasmid pAdD26SVpA(3). Fig. 3 er en skjematisk fortsettelse fra fig. 2 og illustrerer fremstillingen av plasmidet p91023 fra plasmidet pTPL.

Fig. 4 er en skjematisk fortsettelse fra fig. 3 og illustrerer plasmidet p91023(B).

Fig. 5 illustrerer SDS-PAGE-analyser av det rensede CSF-proteinet.

Fig. 6 er en skjematisk fremstilling av vektor pTALC-185R.

Fig. 7 er en skjematisk fremstilling av vektor AJ-14.

Detaljert beskrivelse av fremgangsmåten

De følgende definisjonene er tilført for å forenkle forståelsen av denne saken. I den ut-strekning at definisjoner varierer fra det som er vanlig på området, er definisjonene under for kontroll.

Med ampiifikasjon menes prosessen hvori cellene produserer gen-gjentagelser innen sine kromosomale DNA.

CSF er en biologisk aktivitet som er bestemt ved hjelp av testene som er beskrevet heri.

CSF-protein er et protein fra en primat kilde som utvikler CSF-aktivitet. Med hensyn til den foreliggende oppfinnelsen inkluderer betegnelsen CSF-protein modifisert CSF-protein, alleliske variasjoner av CSF-protein, og CSF-protein som forestås av en MET-rest.

Nedstrøms betyr retningen mot 3' enden av en nukleotid sekvens.

En "forsterker" er en nukleotid-sekvens som kan fremme transkripsjonen av et gen uav-hengig av forsterkerens posisjon i forhold til genet eller sekvensens orientering.

Et gen er en deoksyribonukleotid-sekvens som koder for et protein. For dette formålet skal et gen ikke inkludere ikke-oversatte sideregioner slik som RNA-transkripsjonsiniti-erende signaler, polyadenylering addisjonssteder, promotere eller forsterkere.

Ligering er prosessen for dannelse av en fosfordiesterbinding mellom 5' og 3' endene av to DNA-kjeder. Dette kan gjennomføres ved hjelp av flere velkjente enzymatiske teknikker, inkluderende butt-ende-ligering ved hjelp av T4 ligase.

Orientering viser til rekkefølgene av nukleotidene i en DNA-sekvens. En omvendt orientering av en DNA-sekvens er en sekvens hvori 5' til 3' rekkefølgen av sekvensen i

forholdet til en annen sekvens er reversert sammenlignet med et referansepunkt i DNA, hvorfra sekvensen ble oppnådd. Slike referansepunkter kan inkludere transkripsjonsret-ningen av andre spesifiserte DNA-sekvenser i DNA-kilden eller utgangspunktet for replikering av replikerbare vektorer inneholdende sekvensen.

Transkripsjon betyr syntesen av RNA fra et DNA-templat.

Transformasjon betyr forandring av en celles gentype ved cellulært opptak av eksogent DNA. Transformasjon kan i noen tilfeller bli oppdaget ved en forandring i cellens fenotype. Transformerte celler kalles transformanter. Pretransformerings-celler omtales som parenteral-celler.

Translasjon betyr syntesen av et polypeptid fra budbringer-RNA.

Kolonistimulerende faktoraktivitet (CSF) kan avledes fra en rekke cellulære kilder som inkluderer kondisjonert medium fra perifere blod-mononukleære celler, lunge- og placenta-vev, og benmarg, urin fra anemiske pasienter, serum, og normale og neoplas-tiske celler av T-lymfocytt og mononukleære fagocyttstammer. En cellelinje som danner CSF er Mo-cellelinjen deponert med og tilgjengelig fra ATCC under kodenummeret CRL8066. CSF som dannes av denne cellelinjen er kjent som granulocytt-makrofag CSF (eller GM-CSF) og er selvfølgelig et humant CSF. En kilde for Gibbon-CSF er T-cellelinjen betegnet som UCD MLA-144 og deponert med og tilgjengelig fra ATCC med kodenummer HB 9370, deponert 29 september, 1983.

For å isolere et SF-klon i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, ble det anvendt en ny fremgangsmåte som bare krever en måleteknikk med hensyn til CSF-aktiviteten. Først identifiseres en celle som fremstiller CSF-aktivitet slik som T-lymfocytt-celler (eller andre kilder som nevnt over). Cellens mRNA blir deretter høstet. Foretrukket anvendes T-lymfocytt-eller. I et slikt tilfelle separeres den membranbundne mRNA, som inneholder mRNA for lymfokiner, fra fritt mRNA i cellene. Denne separasjonen antas å anrike det oppsamlede mRNA 5-10 ganger med hensyn til lymfokin-sekvenser og således redusere anstrengelsen med hensyn til identifisering av det ønskede CSF-klon. Polydenylert budbringer-RNA fremstilles deretter ved hjelp av kromatografering på oligo dT-cellulose.

En cDNA-bank fremstilles fra mRNA ved anvendelse av en vektor som er passende for transfeksjon inn i vert for å uttrykke det ønskede protein med CSF-aktivitet. Første cDNA-kjede fremstilles ved anvendelse av standard metoder, idet man anvender det mRNA som er fremstilt over. RNA/cDNA-hybridet er deretter omdannet til en dobbelt-kjedet cDNA-form. cDNA kan deretter innføres i en passende vektor.

Det foretrukne vert-vektorsystem for isolering av en CSF-klon baseres på å uttrykke CSF cDNA i en passende transformasjonsvektor. En passende transformasjons-vektor kan bero på den kortvarige introduksjonen av DNA inn i mammalske celler (Mellom, P., V. Parker, Y. Gluzman, T. Maniatis 1981 Cell 27 279-288). For å isolere de ønskede CSF-transformantene er det ikke påkrevet at alle cellene i populasjonen stabilt inneholder eksogene gener som uttrykker det ønskede CSF-produkt. Det er mulig å forbigående introdusere eksogene gener inn i subpopulasjonen av cellene slik at subpopulasjonen vil uttrykke det ønskede produkt over en periode på flere dager. Fordi en utvelgbar markør ikke er påkrevet i transformasjons-vektoren for DNA-transfeksjonen og ekspresjons-system i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, kan det eksogene DNA tapes under veksten av cellene og over en 1-2 ukers periode. Men 2-3 dager etter transfeksjonen av passende mammalske celler, synes de ønskede produkter å være syntetisert og kan oppdages.

Det vert-vektorsystemet som velges er basert på utviklingen av CV-1 ape-cellelinjer som er transformert med et replikasjons-oppirnnelses-defektivt SV40 DNA-molekyl (Gluzman, y:, Cell 23 175-182,1981). De transformerte ape-CV-1-cellene inneholdende defekt SV40 DNA, betegnet COS (CV-1, opprinnelig defekt, SV40), inneholder ikke en fullstendig kopi av SV40-genomet, men danner store mengder av T-antigen og er tilgjengelig for SV40 DNA-replikering. De understøtter også effektivt replikeringen av SV40 inneholdende delering i begynnelsesområdet og bakterieplasmider som inneholder SV40 replikasjons-kilden (Myers, R.M. & Tjian, R. 1980 PNAS 77, 6491-6495). Dette systemet tilveiebringer således et middel for økning av transfektert eksogent DNA via SV40 mediert DNA-replikering for å øke nivået av mRNA og protein uttrykt fra et eksogent DNA. Andre lignende systemer er imidlertid også effektive.

Vektorer som anvendes for CSF-ekspresjon inneholder typisk forskjellige elementer slik som forsterkere, promotere, introner, polyadenylerings-steder, 3' -ikke-kodende områder og translasjonsmessige aktivatorer som vil bli beskrevet under.

Vektorene heri kan inkludere forsterkere. Forsterkerne er funksjonelt forskjellige fra promotere, men synes å virke sammen med promotere. Deres funksjon på celle-nivået er ikke helt forstått, men deres enestående egenskap er evnen til å aktivere eller forsterke transkripsjonen uten å være stillings- eller orienteringsavhengig. Promotorene må være motstrøms av genet, mens forsterkerne kan vare tilstede motstrøms eller 5' fra promoteren, inne i genet som en intron, eller motstrøms fra genet mellom genet og et poly-adenyleringssted eller 3' fra polyadenyleirngs-stedet.

Tilstedeværelsen av introner i den ikke-translaterte, transkriberte delen av vektoren kan øke produktutbyttet. Slike introner kan oppnås fra andre kilder enn både vertscellene og gen-kildene. F.eks. kan et hybrid-intron omfattende et 5' sammenkoblingssted ha det andre intronet av adenoviruset tripartite leder og et 3' sammenkoblingssted fra et immu-noglobulin-gen som er innført nedstrøms fra transkripsjons-startstedet i adeno-virusets senere hovedpromoter, resultere i økt produktutbytte.

I CSF-kloningen og ekspresjons-vektoren er der et translasjonsmessig aktivator-gen. Translasjonsmessige aktivatorer er gener som koder for både protein og RNAprodukter som påvirker translasjon av et ønsket mRNA.

CSF/cDNA inkluderer det opprinnelige CSF/cDNA-genet som foregås av et ATG-kon-don og CSF/cDNA som koder for alleliske variasjoner av CSF-protein. Ett allel er vist i fig. 1. Et annet allel som man har oppdaget har en timidin-rest i posisjon 365 i stedet for cytosin-resten som er vist i fig. 1. CSF-proteinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen inkluderer 1-metionin-derivatet av CSF-protein (Met-CSF) og alleliske variasjoner av CSF-protein. Det ferdige CSF-proteinet som er vist ved hjelp av sekvensen i fig. 1, begynner med sekvensen ala-Pro-Ala-Arg- hvis start er vist ved hjelp av en pil etter nukleotid nr. 59 i fig. 1. Met-CSF vil starte med sekvensen Met-Ala-Pro-Ala-Arg... Allel-vairasjonen som er vist i fig. 1 har en Thr ved aminosyrerest nr. 100 (som begynner ved Ala etter pilen) og kan omtales som CSF(Thr). En annen variasjon har en Ue-rest ved posisjon 100 og kan omtales som CSF(Ile). Renset CSF-protein i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen utviser en spesifikk aktivitet på minst IO<7>enheter/mg protein og foretrukket minst 4 x 10<7>enheter/mg når det måles med humane benmargsceller.

Vert-vektor-systemer for ekspresjon av CSF kan være prokaryote eller eukaryote, men kompleksiteten av CSF vil gjøre at det foretrukne ekspresjonssystemet er et mammalsk system. Ekspresjonen gjennomføres lett ved transformering av prokaryote eller eukaryote celler med en passende CSF-vektor. DNA-sekvensen som er oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet over og kan uttrykkes direkte i mammalske celler under kontroll av en passende promotor. Heterologe promotere, som er velkjente for de fagkyndige på området, kan anvendes. For å uttrykke CSF i prokaryote- eller gjær-celler, må ledersekvensen (eller utskillingssekvensen) fjernes. Stillingen av kodonet for den N-terminale enden av det oppnådde CSF-protein er vist i fig. 1. Dette kan utføres ved å anvende standard teknikker som er kjent av den fagkyndige. Når man har oppnådd det ønskede CSF/cDNA-klonet, er kjente og hensiktsmessige midler utnyttet for å uttrykke CSF-proteinet, dvs. innføying i en hensiktsmessig vektor, og transfeksjon av vektoren inn i en hensiktsmessig vertscelle, utvelging av transformerte celler, og dyrking av disse transformerte cellene for å uttrykke CSF-aktivitet. Passende vertsceller omfatter bakterier, dvs. E. coli, gjær, mammalske celler, dvs. CHO, og insektceller. Det sådant dannede CSF-protein kan ha en metionin-gruppe på den N-terminale enden av proteinet (her kalt Met-CSF). Det oppnådde protein fremstilt ved hjelp av prokaryote og eukaryote celler vil forøvrig være identiske med hensyn til aminosyre-sekvens, men det eukaryote produkt kan være glykosylert i samme eller ulik grad som i det naturlige produkt. Ulike metoder for oppnåelse av CSF-protein i overensstemmelse med oppfinnelsen er illustrert i de påfølgende eksemplene. Andre metoder eller materialer, dvs. vektorer, vil være åpenbare for de fagkyndige på grunnlag av eksemplene og beskrivelsen foran

CSF-protein uttrykt i hensiktsmessig prokaryote eller eukaryote celler kan gjenvinnes ved hjelp av rense- og separeringsteknikker som er kjent av den fagkyndige. Men, som vist i det foregående tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte med hensyn til rensing som muliggjor oppnåelse av CSF-protein med høy renhet og aktivitet, både fra rekombinante og naturlige kilder.

O ppsummering av renseprosedyren i henhold til oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse overvinner tidligere kjente problemer og tilveiebringer en metode for rensing av protein med CSF-aktivitet. CSF-protein i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, har en spesifikk aktivitet på 1 x IO<7>enheter/mg protein, foretrukket minst 2x10 enheter/mg protein og mer foretrukket minst 4x10 enheter/- mg protein når den måles med humane benmargsceller.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen omfatter en prosedyre for rensing av CSF-protein: rensing av proteinet med ammonium-sulfat ved 80% metning for å danne en pellet inneholdende CSF-proteinet; ny oppslemming av pelleten i en pH i en bufret løsning med en pH i området fra omkring 6 til omkring 8; tilføring av den bufrede løsningen inneholdende CSF til en kromatograif-kolonne, eluering med den bufrede løsningen inneholdende natriumklorid og oppsamling av fraksjonene med CSF-aktivitet; kombinering av de aktive fraksjonene, tilføring av dem til en C4 revers fase-kolonne og eluering med en 0 til 90% acetonitril-gradient for å oppsamle den aktive fraksjonen.

Kort beskrivelse av tegningene i samsvar med renseprosedvren

Fig. 5 illustrerer SDS-PAGE-analyser av det rensede CSF-proteinet.

Detaljert beskrivelse av renseprosedvren i henhold til oppfinnelsen

CSF-proteinet som skal renses i overensstemmelse med prosedyren i henhold til oppfinnelsen kan utvinnes fra hvilken som heist av de naturlige kildene som er beskrevet over som startkilder for rekombinant DNA-prosedyre, f.eks. Mo-cellelinjen eller UCD-MLA-144 Gibbon-celle-linjen.

Alternativt kan CSF-proteinet fremstilles ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikk-kene i overensstemmelse med oppfinnelsen.

CSF fra hvilken som helst kilde kan renses ved hjelp av prosedyren i den foreliggende oppfinnelse. Det kondisjonerte medium fra hvilken som helst CSF-proteinkilde er foretrukket oppkonsentrert ved hjelp av ultrafiltrering til en proteinkonsentrasjon på minst ca. 0.1 mg protein pr. ml. Proteinet utfelles deretter ved tilsetning av ammoniumsulfat til en 80% metning. Den oppnådde pelleten oppslemmes på nytt i en vandig løsning bufret til en pH i området på ca. 6 til ca. 8. Eksempler på passende buffere omfatter Tris-HCl, HEPES, natriumsitrat o.l.

Den bufrede løsningen fraksjoneres ved hjelp av kolonnekromatografi. Passende materialer for anvendelse i kromatograferingskolonnen er oktylsefarose, DEtE-ultrogel, AcA44-ultrogel, AcA-54-ultrogel og lignende. Ett eller flere av disse materialene kan anvendes etter hverandre for å oppnå høyere renhet.

Fraksjoner fra hver kolonne samles og måles for CSF-aktivitet. De aktive fraksjonene kombineres og fortynnes med trifluoreddiksyre (TFA), heptafluorsmørsyre (HFBA), eller lignende, og anbringes i en C4 revers fasekolonne. CSF-aktiviteten elueres deretter ved anvendelse av en 0-90% acetonitrilgradient i TFA eller HFBA, foretrukket ved en konsentrasjon på 0,10% eller 0,15% (volum/volum) respektivt, avhengig av hvilken syre som ble anvendt for å anbringe de kombinerte fraksjonene i kolonnen.

Fraksjonene med CSF-aktivitet analyseres ved hjelp av SDS-polyakrylamid-gel elektroforese (13,5% gel som beskrevet hos Lammli, U. Nature 227,680 (1970)). Ytterligere behandlinger ved anvendelse av de ovennevnte kromatograferings-kolonne-materialene kan videre rense CSF-proteinet til homogenitet.

Renset CSF-protein fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE viste et heterogent CSF-protein med en tilsynelatende molekylvekt i området fra omkring 15.000 til omkring 26.000 daltons. Denne tilsynelatende størrelsesheterogenitet skyldes utstrakt glykosyle-ring av proteinet og er et vanlig trekk hos glykoproteiner. Fraksjonering av prøver som er mindre renset fra et Morcelle kondisjonert medium ved hjelp av SDS-PAGE (ved ikke-reduserende betingelser) og måling av protein eluert fra gelen, viste tilstedeværelsen av et annet protein med CSF-aktivitet med en tilsynelatende molekylvekt på omkring 28.000 til 30.000.

CSF-aktivitet binder seg til og kan elueres fra oktylsefarose, DEAF-ultrogel og C4 revers fase-kolonne. Omtrent 60% av CSF-aktiviteten binder seg til en Con-A-sefarose (40% passerer gjennom) og kan elueres med alfa-metylmannosid.

Molekylvektanalyser av rekombinant CSF ved hjelp av gelfiltrering med lav salt-konsentrasjon viste at omkring 30% av aktiviteten eluerte med en anslått molekylvekt på omkring 19.000, men 70% av materialet oppførte seg som dimerer, og eluerte ved en posisjon som svarer til en molekylvekt på omkring 38.000. Dersom IM NaCl er innbe-fattet i denne kolonnen, eluerer all aktiviteten i en bred topp ved omkring 19.000 dalton.

Det rensede CSF er stabilt i minst 16 timer når det inkuberes ved 40°C (pH 7,4) i 4M guanidin-hydroklorid; i 10 mM EDTA; 10 mM 2-merkaptoetanol; og i 30% (v/v) eta- noi. CSF-aktiviteten er også stabil i 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) (pH 2,0) og 0,1% TFA pluss 25% (v/v) acetonitril.

Som nevnt foran, er CSF-proteinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse indikert for anvendelse i behandlingen av myelo-undertrykkelse slik som (symptomatisk) granulocytopenia, som f.eks. skyldes kjemoterapeutisk eller strålebehandling av cancer. I tillegg er CSFproteinene i overensstemmelse med oppfinnelsen indikert for anvendelse i behandling av alvorlige infeksjoner. For slik anvendelse, er en typisk indikert dose på omkring 200 til 1000 ug pr. pasient. CSF-proteinet er foretrukket tilført pasien-ten intravenøst i en passende farmakologisk bærer. Eksempler på slike bærere omfatter farmakologisk saltvann og humant serum-albumin i saltvann.

I tillegg har CSF-proteinene i overensstemmelse med oppfinnelsen andre aktiviteter og anvendelser. Det er f.eks. vist at murin CSF aktiverer neutrofiler. Man vil derfor vente at primat CSF i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen også vil aktivere neutrofiler. Derfor kan fysiologiske funksjoner av CSF være mangfoldige. I benmargen kan dette lymfokinet stimulere formering og differensiering av sektorcellene for verts-forsvar, mens periferisk kan nye og allerede eksisterende celler aktiveres. I en lokalisert immunologisk respons kan CSF holde sirkulerende neutrofiler i eller borte fra betennel-sesområdet. Deke hensiktsmessig lokalisering og/eller aktivering av neutrofiler kan være involvert i patofysiologien av en rekke indirekte immunforstyrrelser slik som reumatoid artritt.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere forstått ved henvisning til de følgende illustrative utfø-relsesformer, som er eksempler, og bør ikke tas som begrensning i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen, som beskrevet i kravene.

I eksemplene er temperaturene angitt i °C, dersom ikke annet er angitt.

Restriksjons-endonukleaser kan benyttes under de forhold og på en slik måte som anbefalt av distributøren. Ligeringsreaksjoner utføres som beskrevet hos Maniatis et al., supra på s.245-6, redegjørelsen som er tatt med her som referanse, ved anvendelse av bufferen som er beskrevet på side 246 og anvendelse av en DNA-konsentrasjon på 1-100 ug/ml, ved en temperatur på 23°C for buttendet DNA og 160°C for "sticky ended" DNA. Elektroforese utføres i en 0,5-1,5% av agarose-gel inneholdende 90 mM tris-borat, 10 mM EDTA. Alt radioaktivt merket DNA er merket med 32p, uansett hvilken merketeknikk som ble anvendt.

Ved "rapid prep" menes en hurtig fremstilling av bakteriofag- eller plasmid-DNA i liten skala, som beskrevet hos Maniatis et al., supra, på side 365-373.

EKSEMPELA

Mo- cellelinie- kulturer

Mo-celler (ATCC CRL 8066) ble rutinemessig dyrket i alfa- (6% C02) eller Iscove (10% C02) -medium inneholdende 20% føtalt kalveserum (FCS), 2 mM glutamin, 100 U/ml streptomycin og 100 ug/ml penicillin. Cellene bør predyrkes hvert 4. til 5. døgn. Cellene telles og føres inn i Falcon T-175-flasker i 100-150 ml medium ved en tetthet på 3-4 x 10<5>celler/ml. Antall celler vil fordobles i 20% FCS hvert 4. - 7. døgn. Vekst-hastigheten er ikke konstant og det kan noen ganger se ut som om cellene stopper å vokse for deretter å gjennomgå en kraftig vekst. Mo-cellene kan dyrkes i et serumfritt medium. Overlevelsen er mye bedre når cellene ikke vaskes når de overføres fra FCS til et i serumfritt medium. Optimal tetthet i serumfritt medium (SF) er 5 x 10<5>celler/ml. Cellene vil vokse forsiktig (eller i det minste være konstant i antall) i 3 døgn i et serumfritt mediuim, og bør deretter tilsettes 20% FSC i minst 4 døgn. Denne planmessige veksten (3 døgn SF, 4 døgn 20% FCS) kan repeteres ukentlig dersom SF-medium er på-krevd, uten at cellene tilsynelatende skades i løpet av flere måneder.

Tester for CSF- aktivitet

A. Benmargs-test.

Fremskaff frisk benmarg. Benmarg-klumper brytes ned ved at den dras gjennom standard kanyler (20, 22, deretter 25 ganger). Fortynn 1:1 med steril fosfatbufret saltvann-oppløsning (PBS) (romtemperatur) og legg denne over Ficoll-Paque (omkring 30 ml BM-PBS over 6 ml Ficoll). Sentrifuger ved 1500 omdr. i 40 minutter ved romtemperatur. Fjern og kast fett- og PBS-laget. Pipetter av laget med lav tetthet. Vask 2 ganger med PBS og tell. Cellene plates ut i RPMI (innkjøpt fra GIBCO som RPMI1640) pluss 10% HIFCS (varmeinaktivert FCS) i 3 timer for å fjerne sammenklebede celler.

Utplatingsmedium (frisklaget):

20% FCS

0,3% agar oppløst i H20 og avkjølt til 40°C

2x Iscoves (1:1 v/v med agar)

1% P/S med endelig konsentrasjon på lOOU/ml streptomycin,

100 ug/ml penicillin

10^M alfa-tioglycerol i 2x iscoves fra 10"<2>M stamlesning Avkjøl agaren til omkring 40°C. Bland med de andre komponentene.

Avkjøl i vannbad til 37-38°C og hold temperaturen konstant.

Etter 3 timer pipetteres de ikke-sammenklebede cellene av. Sentrifuger og tell. Tilsett 2 x IO<5>celler/ml av utplatings-medium og hold temperaturen konstant ved hjelp av et vannbad på 37-38°C. Tilsett prøvene (dvs. medium fra transfekterte celler; vanligvis 10 jil prøve) til en første rad av brønner i en mikrotiter-plate i duplikat. Tilsett 100 ul cellesuspensjon til hver brønn. Tilsett i tillegg 50 ul cellesuspensjon til hver brønn i den første raden.

Bland godt og overfør 50 ul av løsningen fra den første raden til den neste raden, etc. og fortsett med fortynningene 1:3 gjennom hele platen. Pakk platen inn i parafilm. Inku-ber i 10-14 døgn ved 10% CO2, ved 37°C i en fullstendig fuktig atmosfære og merk koloniene.

For å merke koloniene, telles det totale antall kolonier som vokser i hver brønn. Ved hver maling, plates en rekke brønner ut, uten å inkubere en prove (blindprøve) for å oppnå en bakgrunnskolonitelling. Gjennomsnitt antall kolonier som vokser i blindprø-vebrønnene subtraheres fra antall kolonier funnet i hver av brønnene som inneholder prøvene. En enhet CSF er mengden som vil stimulere dannelsen av en koloni over bakgrunnsnivået pr. 10<5>humane benmarg celler (platet ut med 10<5>celler pr. ml) når CSF-konsentrasjonen nesten har nådd metningspunktet. Denne konsentrasjonen er bestemt ved hjelp av fortynning og ved sammenligning av antall kolonier ved forskjellige fortynninger, for å finne den konsentrasjonen som ligger like under metningsnivået.

For denne testen, telles koloniene som inneholder granulocytter, monocytter eller begge typer celler. Celletypene i koloniene er bestemt ved at man plukker ut kolonier og farge-legger individuelle celler.

B. KG-1 Cellemåling.

KG-l-celler (Blood, Vol. 56, No. 3 (1980)) dyrkes i Iscoves medium +10% FCS tilsatt 2x pr. uke, og som ved hver tilsetning er podet med 2x10<5>celler/ml. Cellene anvendes for måling bare mellom tilsetning 30-35. Målingen er den samme som for benmarg som beskrevet over, med unntak av at KG-1-cellene er utplatet i agarblanding med 4xl0<3>celler/ml.

Antallet kolonier som vokser i hver brønn bestemmes og bakgrunnstallet subtraheres fra som i benmargmålingen som beskrevet over. En KG-1-CSF enhet/ml er den konsentrasjonen av CSF som vil stimulere halvparten av det maksimale antall (metning) av KG-1-koloniene som dyrkes. Det maksimale antall oppnås ved å inkubere et metningsnivå av CSF i en rekke brønner.

Fremstillin<g>av vektor p91023( B^

Transformasjonsvektoren var pAdD26SVpA(3) beskrevet hos (Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 2(11):1304-1319 (1982)). Den har en struktur som vist i fig. 2. Dette plasmidet inneholder et muse-dihydrofolat-reduktase (DHFE) cDNA-gen som er under tran-skripsjonskontroll av adeno viruset 2 (Ad2) sene hoved-promotor. Et 5' sammenkoblingssted er inkludert i adenovirusets DNA og et 3' sammenkoblingssted, stammer fra et immunoglobulingen, er tilstede mellom Ad2 sene hovedpromoter og DHFR-kodesek-vens. SV40 begynnelsespolyadenylerings-stedet er tilstede nedstrøms fra DHFRkode-sekvensen. Den prokaryotisk-avledede delen av pAdD26SVpA(3) er fra pSVCd (Mellon, P. Parker, V., Gluzman, Y. og Maniatis, T. 1981, Cell 27:279-288) og inneholder ikke pBR322-sekvenser som er kjent for å inhibere replikering i mammalske celler (Lusky, M. og Botchan, M. 1981, Nature (London) 293:79-81).

pAdD26SVpA(3) omdannes til plasmidet pCVSVL2 som vist i fig. 2. pAdD26SVpA(3) omdannes til plasmid pAdD26SVpA(3)(d) ved delering av et av de to Pstl-stedene i pAdD26SVpA(3). Dette oppnås ved delvis behandling med Pstl (ved anvendelse av et underskudd av enzymaktivitet slik at en subpopulasjon av lineariserte plasmider kan oppnås hvori bare et Pstl-sted er delt), deretter behandling med Klenow, (ved ligering for å resirkulere plasmidet, transformering av E. coli og screening for delering av Pstl-stedet lokalisert 3' av SV40 polyadenylerings-sekvensen.

Adenoviruset tripartite leder og virusassosierte gener (VA-gener) ble innført i pAdD26SVpA(3)(d) som vist i fig. 2. pAdD26SVpA(3)(d) ble først delt med PvuII for å fremstille et lineært molekyl som er åpnet innen 3'-delen av det første av de tre elementene som omfatter den tripartite leder.

Deretter ble pJAW 43 (Zain et al. 1979, Cell 16 851) behandlet med XHo 1, behandlet med Klenow, behandlet med PvuII, og de 140 bas ep ar fragmentene som inneholder den andre og delvis de tredje lederne ble isolert ved hjelp av elektroforese på en akrylamid-gel (6% i tris-borat-buffer; Maniatis et al. (1982) supra). De 140 bp-fragmentene ble deretter ligert til den PvuII-behandlede pAdD26SVpA(3)(d). Det ligerte produkt ble anvendt for å transformere E. coli til tetracyklin-resistens og koloniene ble screenet under anvendelse av Grunstein-Hogness-prosedyren ved anvendelse av en<32>P-merket prøve som hybridiseres til baseparfragment 140. DNA ble fremstilt fra positive hybridiserende kolonier for å prøve om det rekonstruerte PvuII-stedet var 5' eller 3' av det innførte base-par DNA 140 spesifikk for det 2. og 3. adenovirusets sene ledere. Den riktige orientering av PvuII-stedet er på 5' siden av det innførte basebar 140. Dette plasmidet ble kalt pTPL i fig. 2.

Ava II D-fragmentet av SV40 inneholdende SV40 forsterkersekvensen ble oppnådd ved at SV40 DNA ble behandlet med Ava II, avbutting av endene med Klenow-fragment av Pol I, ligering av Xho 1 bindere til fragmentene, behandling med Xho 1 for å åpne Xho 1-stedet, og isolering av det fjerde største (D) fragment ved hjelp av gel-elektroforese. Dette fragmentet ble deretter ligert til pTPL avdelt ved Xho 1, idet plasmidet pCVSVL2-TPL ble oppnådd. Orienteringen av SV40 D-fragmentet i pCVSVL2-TPL var slik at SV40 sene promoteren har samme orientering som det sene adenovirusets hovedpromoter.

For å innføre adenovirusets virusassosierte (VA) gener inn i pCVSVL2-TPL, ble det først fremstilt et plasmid pBR322 som inneholder adenovirusets type 2 Hind III B-fragment. Adenovirus type 2 DNA behandles med Hind III og B-fragmentet isoleres etter gel-elektroforesen. Dette fragmentet innføres i pBR322 som tidligere har vært behandlet med Hind III. Etter transformasjon av E. coli til ampicillin-resistens, screenes rekombi-nanter for innføringen av Hind III B fragmentet og det innførte fragments orientering bestemmes ved behandling med restriksjonsemzym. pBR322 - Ad Hind III B inneholder adenovirus type 2 Hind III B fragment slik som vist i fig. 3.

Som vist i fig. 3, oppnås VA-genene lettest fra plasmid pBR322-Ad Hind III B ved behandling med Hpa I, tilsetning av EcoRl-bindere og behandling med EcoRl, og gjenvin-ning av 1.4kb fragmenter. Fragmentet med EcoRl kleberike ender ligeres deretter inn i pTPL ved EcoRl-stedet (som tidligere er blitt behandlet med EcoRl). Etter transformering av E. coli HB 101 og utvelging for tetracyklin-resistens, screenes koloniene ved hjelp av filterhybridisering for en DNA-prøve som er spesifikk for VA-genene. DNA fremstilles fra positive hybridiserende kloner og karakteriseres ved hjelp av behandling med restriksjons-endonuklease. Det oppnådde plasmidet betegnes p91023. 2 EcoRl-områdene i p91023 fjernes. p91023 ferdigdeles med EcoRl, med frembringelse av to DNA-fragmenter, et omkring 7 Kb og det andre omkring et 1.3 kb-fragment inneholdende VA-genene. Endene i begge fragmentene fylles ut ved anvendelse av Klenow-fragmentet av Poll, og deretter re-ligeres begge fragmentene, dvs. 1.3Kb, 7Kb, sammen. Et plasmid p91023(A) inneholdende VA-genene, som er lik p91023, men mangler 2 EcoRl-sekvensene, identifiseres ved hjelp av Grunstein-Hogness screening med VA-gen-fragmentet og ved hjelp av vanlige restriksjons-steel-analyser.

Deretter ble den ene Pstl-sekvensen i p91023(A) fjernet og erstattet med en EcoRl-sekvens. p91023(A) oppdeles ved hjelp av Pstl, og behandles deretter med et Klenow-fragment av Poll for å danne glatte ender. EcoRl-bindere ligeres til det buttede Pstl-stedet på p91023(A). Det lineære p91023(A), med EcoRl-bindere festet ved det buttede Pstl-stedet, separeres fra ikke-ligerte bindere og behandles fullstendig med EcoRl, og re-ligeres deretter. Et plasmid p91023(B) gjenvinnes og identifiseres idet plasmidet har en struktur som ligner på p91023(A), men med en EcoRl-sekvens anbragt på det tidligere Pstl-setet

Ekspresjon av CSF- protein

M6 COS ape-celler som er transformert med vektor p91023(B) inneholdende CSF/cDNA for å fremstille CSF-protein i kulturmediet.

Ett mg av dette DNA (pCSF-1) ble oppløst i 1 ml 0,1 M tris, pH 7,3 og tilsatt til 600 ml DME inneholdende 2 mm glutamin, 100 U/ml streptomycin, 100 ug/ml penicillin (P/S) og 0,25 mg/ml DEAE Dextran (molekylvekt 500.000 fra Pharmacia). De 600 ml av DNA DEAE Dextran-løsningen tilsettes til M6 COS-cellene i celleproduksjonsanlegget og inkuberes ved 37°C i 12 timer. Etter inkubering, vaskes cellene én gang med 900 ml SF DME og inkuberes deretter i 2,5 timer med 600 ml DME inneholdende 0,1 mM kloroquin, 10% HIFCS, 2 mM glutamin og P/S. Etter aspirering av det kloroquin-inneholdende medium, vaskes cellene med SF DME og tilføres 1500 ml DME med 10% HIFCS. Etter 30 timer vaskes cellene med SF DME, mediet byttes ut med 800 ml SF DME og de transfekterte cellene tillates å kondisjonere mediet i 24 timer ved 37°C. Det kondisjonerte medium aspireres og byttes med nye 800 ml SF DME. Cellene tillates å kondisjonere dette medium i 24 timer, deretter samles det kondisjonerte medium. Så snart som mulig etter høsting, oppkonsentreres prøvene fra det kondisjonerte medium 20 ganger ved ultrafiltrering under trykk ved anvendelse av Amicon 2,5 liter kammer med YM5 membran (5.000 MW avskjæring).

Rensing av rekombinant CSF

200 ml konsentrert kondisjonert medium (fra 4 liter begynnelsesmateriale - trinn 7) ble mettet med ammoniumsulfat til 30% ved tilsetting av fast ammoniumsulfat og det utfelle proteinet ble kjernet ved sentrifugering. Supernatanten ble mettet med ammonium-sulfat til 80% ved tilsetning av mer fast ammoniumsulfat og det utfelte proteinet ble samlet ved sentrifugering. Pelleten ble oppslemmet på ny i 5 ml 20 mM natriumsitrat, pH 6,1, inneholdende IM NaCl. Det oppløste protein ble anbragt i en 1,6 x 100 cm kolonne av Ultrogel AcA54, innstilt til likevekt med den samme bufferen. CSF-aktiviteten eluert fra kolonnen etter omkring 90 ml har en tilsynelatende molekylvekt på 19 k Dalton. Man har observert at dersom gelfiltreringen utføres ved lav ionestyrke, elueres CSF-aktiviteten fra kolonnen på to steder med tilsynelatende molekylvekt på omkring 19 k Dalton og 38 k Dalton, noe som tyder på at GM-CSF lett kan danne dimerer. De aktive fraksjonene ble kombinert og tilsatt 10% TFA til en konsentrasjon på 0,15% TFA og tilført til en Vydac C4~kolonne (0,46 c 25 cm) som er innstilt til likevekt med 0,1% TFA. Kolonnen ble utviklet med en lineær gradient på 0-90% acetonitril (1 ml/min., totalt 340 ml) i 0,1% TFA. CSF-aktiviteten eluerte mellom 39 og 43% acetonitril (fraksjonene 16-20). En 20 ul prøve fra fraksjon 19 ble analysert ved hjelp av SDS polyakrylamid-gel-elektroforese (13,5% gel som beskrevet hos Lammli, Nature 227, 680 (1970)). Ett eneste bredt proteinbånd med en tilsynelatende MW på 18-26 k Dalton ble observert. Den nokså store spredningen hos CSF er et vanlig trekk hos glykoproteiner og synes å gjenspeile et omfattende, men variabelt karbohydratinnhold. Protein fra fraksjon 19 ble underkastet Edman-degradering ved anvendelse av "the Applied Biosystems" gass-fase-mikrosekvenser. Fra omtrent 20 ug påført protein, ble sekvensen av de første

16 aminosyrer oppnådd (A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-PW-E-H). Det høye utbyttet av denne ene proteinsekvensen tyder sterkt på at CSF-proteinet i fraksjon 19 er blitt renset til homogenitet. Biomålinger indikerer at fraksjon 19 hadde 3 x 10 enheter pr. Azgoab sorpsjonsenheter. Da typiske proteiner i vanlig løsning utviser en rekke ekstinksjonskoeffisienter fra 0,8 til 1,2 A2soabsorpsjonsenheter pr. mg protein, er den spesifikke aktiviteten av det rensede CSF mellom omkring 1 x 10<7>enheter/mg, når aktiviteten er målt ved anvendelse av human benmargcellemåling.

Rensing av CSF fra Mo- cellelinje

Mo-serumfri kondisjonert medium (40 liter) ble inkubert ved 55°C i 30 minutter for å inaktivere HTLV-II viruset som er forbundet med cellelinjen. Dette mediet ble oppkonsentrert ved ultrafiltrering under trykk ved anvendelse av Pellicon Casette med membran PTGC (0,139 m<z>) som har en molekylvektgrense på 10.000. Proteinet ble videre oppkonsentrert ved ammoniumsulfat-utfelling (80% mettet). Den endelige pro-teinpelleten (800 mg) ble oppslemmet på nytt i 100 ml 20 mM tris(hydroksymetyl)ami-nometan-hydroklorid (tris-HCl), pH 7,4, og dialysert mot den samme bufferen (3 ganger med 4 liter hver gang). Det dialyserte proteinet ble overført til en 2,5 x 10 cm kolonne av DEAE (dietylaminoetyl)ultrogel som var innstilt til likevekt med den samme bufferen. Kolonnen ble vasket med 800 ml tris-HCl, pH 7,4, deretter ble CSF-aktiviteten eluert med 800 ml 10 mM tris-HCl, pH 7,4, inneholdende 0,12 M NaCl. Fraksjoner på 10 ml ble samlet og testet for CSF. De aktive fraksjonene (3) ble kombinert, og oppkonsentrert 6 ganger (til 5 ml) ved hjelp av ultrafiltrering under trykk (Amicon YM5 membran med molekylvektsgrense på 5.000). Den oppkonsentrerte prøven fra DEAE-kolonnen ble overført til en 1,6 x 100 cm AcA44 ultrogel (en akrylamid-agarose-ultrogel med 10 til 130 k Dalton fraksjonering) kolonne som var innstilt til likevekt med 20 mM N-2-hydroksyetylpiperazin-N-2-etan-sulfonsyre (HEPES), pH 7,4, 50 mM NaCl og 0,01% polyetylenglykol (PEG-8000). CSF-aktiviteten eluerte fra kolonnen med en tilsynelatende molekylvekt på 30 k Dalton. De aktive fraksjonene ble kombinert og tilsatt 10% trifluoreddiksyre (TFA) til en konsentrasjon på 0,15% (v/v) og overført til en Vydac C4revers fasekolonne (1 x 25 cm). Kolonnen ble utviklet med en lineær gradient på 0-90% acetonitril i 0,1% TFA (v/v) med 4 ml/min. (1.000 ml totalt). CSF-aktiviteten eluerte ved omtrent 47% (v/v) acetonitril. De kombinerte aktive fraksjonene ble tilsatt en halv volumdel 0,15% (v/v) heptafiuormaursyre (HFBA) til en konsentrasjon på 0,05% (v/v) og overført til en Vydac C4 kolonne (0,46 c 25 cm) som var innstilt til likevekt med 0,15% (v/v) HFBA. Kolonnen ble utviklet med en lineær gradient på 0-90%

(v/v) acetonitril i 0,15% (v/v) HFBA med 1 ml/min. (340 ml totalt). CSF-aktiviteten eluerte ved omkring 53% (v/v) acetonitril. Fraksjonene 37-44 (1 ml hver) ble funnet å være aktive. 0,15 ml av fraksjonen 40 ble konsentrert til det firedobbelte (ved anvendelse av SAV ANT Speed Vac Concentrator) og 40 ul av 2 x SDS gelprøve-buffer ble

tilsatt (0,125 M tris-HCl, pH 6,8,4% SDS, 20% glycerol og 0,004% bromfenolblått). Disse prøvene ble kokt i 2 minutter og overført til en 13,5% Lammli, U. Nature 227, 680 (1970) SDS-gel (se fig. 2). Fraksjon (40) ble bestemt å ha 110.000 benmargs-CSF-enheter/ml. Dette svarer til omtrent 3,0 x IO<7>enheter pr. A28oabsorpsjonsenheter. Siden typiske proteiner har ekstinksjonskoeffisienter i området mellom 0,8 og 1,2 A28oenheter per mg, hadde det rensede CSF en spesifikk aktivitet i området omkring 1 x IO<7>til omkring 4 x IO<7>enheter pr. mg i benmargprøven. Det ble utført Edman-degradering på 1 fig av en prøve av renset GM-CSF ved anvendelse av "Applied Biosystems Gas Phase Microsequenator". Sekvensen av restene 3 til 5 ble bestemt å være Ala Arg Ser.

EKSEMPEL C

Ko-transformasjon og amplifikasjon av CSF-sekvens i CHO-celler. Plasmid p91023(B)-CSF ble innført i CHO-DHFR-manglende celler DUKX-B11 (Chasin & Urlaub PNAS 77:4216, 1980) ved protoplast-fusjon som beskrevet (Sandri-Goldin et al. Mol. Cell. Bio. 1 743-752,1981). Dyrkingen og vedlikeholdet av CHO-cellene har blitt beskrevet (Kaufmann & Sharp, J. Mol. Bio. 150 601-621,1981). p9l023(B)-CSF-l ble innført i E. coli HB101 med protoplast-fusjon, og bakteriene ble dyrket i 50 ml m9 salter inneholdende 0,5% kasainino-syrer, 0,4% glukose, 0,012% MgSO^, 5 ug/ml tiamin og 10 ug/ml tetracyklin, til absorbansen var 0,6 ved 600 nm. Man tilsatte kloramfenikol til en konsentrasjon på 250 ug/ml og kulturen ble inkubert ved 37°C i 16 timer for å øke antall plasmidkopier. Cellene ble sentrifugert ved 3.000 g i 10 minutter ved 4°C og oppslemmet i 2,5 ml avkjølt 20% sukkrose i 50 mM tris-Cl, pH 8,0. Man tilsatte lysozym (0,5 ml av en 5 mg/ml løsning i 0,25 M tris-Cl, pH 8,0) og blandingen ble avkjølt på is i 5 minutter. EDTA (1 ml av 0,25 M EDTA, pH 8,0) ble tilsatt og blandingen sto ytterligere 5 minutter på is, og deretter ble 1,0 ml av 0,05 M tris-Cl, pH 8,0 tilsatt sakte. Suspensjonen ble inkubert i 15 minutter ved 37°C inntil bakteriene var omdannet til protoplaster. Suspensjonen ble deretter sakte fortynnet med 20 ml forvarmet medium inneholdende 10% sukkrose og 10 mm MgCl2og inkubert i 15 min. ved 37°C. Løsningen av protoplaster (omtrent 10<9>/ml) ble tilsatt til CHO, DHFR-manglende DUKX-B11-celler, i en plate med 6 brønner (omtrent 1 x 10<6>celler/brønn) i et forhold på omtrent 1-2 x 10<4>protoplaster/celler og protoplastene ble liggende som et lag oppå cellene etter sentrifugering ved 2000 omdr. i 8 min. i en mikrotiter skiverotor ved en IEC-modell K sentrifuge. Etter sentrifugering ble supematanten fjernet ved bortsuging. 2 ml av en polyetylen-glykolløsning, 50 g PEO - 1450 (Baker Chem. Co.) i 50 ml medium ble tilsatt hver brønn i 6-brønnsplaten. Cellene på nytt sentrifugert ved 2000 omdr. i 90 sek. Polyety-lenglykolløsningen ble fjernet, og platene ble vasket i 3 timer med 4 ml medium pr. brønn. Cellene ble deretter behandlet med trypsin, løst i 10 ml medium inneholdende 10% føtalt kalveserum, og sentrifugert i et konisk sentrifugerør ved 500 omdr. i en klinisk sentrifuge. Cellene fra pelletene i 3 brønner ble kombinert og utplatet på en 10 cm vevskultur-skål. Friskt medium inneholdende 100 ug/ml kanamycin, thymidin, adenok-sin, deoksyadenosin, penicillin, streptomycin og 10% dialysert føtalt kalveserum ble tilsatt hver plate. Kanamycin var inkludert for å hindre vekst av bakterier som ikke var omdannet til protoplaster.

To dager senere ble cellene i forholdet 1:15 dyrket på nytt i alfa-medium med 10% dialysert føtalt kalveserum, penicillin og streptomycin, men uten nukleosider. Cellene ble på nytt tilført det samme selektive medium etter 4-5 dager (uten nukleosider).

Koloniene vokste opp 10 til 12 dager etter den nye dyrkingen i selektivt medium. To systemer for metotreksat (MTX) utvelging og amplifisering ble fulgt. I det første systemet, ble uavhengige enslige klonede transformanter isolert på grunnlag av DHFR-ekspresjon og deretter fikk hver klon formere seg for å øke antall kopier av det fremmede DNA, dvs. vekst i økende konsentrasjoner av metotreksat. I det andre systemet ble adskillige uavhengige transformanter kombinert og isolert på grunnlag av DHFR-ekspresjon og formert sammen ved forhold som fører til økning av det fremmede DNA, dvs. vekst i økende konsentrasjoner av metotreksat. Deretter ble individuelle kloner isolert fra utvalgte populasjoner og analysert med hensyn til GM-CSF-ekspresjon. De klonene som viste de høyeste nivåene av GM-CSF-ekspresjon ble dyrket på nytt under forhold som førte til en videre økning av det fremmede DNA (dvs. dyrking ved økende konsentrasjon av metotreksat i dyrkingsmediet).

I ett eksperiment, ble syv DHFR<+->transformanter kombinert i et alfa-medium uten nuk-lesider. Disse cellene ble deretter dyrket i trinnvis økende konsentrasjoner av MTX, idet begynnelseskonsentrasjonen av 0,02 uM, hvorpå konsentrasjonen deretter ble øket til 0,1, 0,5 og 2.0 uM-MTX. Når GM-CSF-aktiviteten ble målt i KG-l-celle-målingen, fremstilte disse cellene fra 3.000 til 12.000 enheter pr. ml. Den utvalgte populasjonen ble klonet i 0,5 uM-MTX og 2,0 uM-MTX. Kloner som ble oppnådd i 0,5 uM-MTX (010, D2 og B6) ble deretter utvalgt for dyrking i 2,0 uM-MTX. Når man målte GM-CSF-aktiviteten ved hjelp av KG-l-celle-måleren, dannet de klonede cellelinjene fra 15.000 til 300.000 enheter pr. ml GM-CSF-aktivitet. Det fremstilte GM-CSF i overensstemmelse med dette eksempel har aminosyresekvensen gitt for CSF-Thr som vist i fig. 1.

EKSEMPEL D

EKSPRESJON AV GM- CSF IE. COLI

GM-CSF ble uttrykt i E. coli fra vektor pTALC.185R, som er vist skjematisk i fig. 6.

Sekvensen som koder for GM-CSF starter med syntesesekvensen ATG.CCA.CCA.CCT.CCT-TCT.CCA. TCT.CCA.TCT.ACT, som bestemmer de inn-ledende 1 aminosyrerestene i ferdig GM-CSF. Resten av sekvensen som koder for GM-SCF i pTALC-185R er identisk med sekvensen i pCSF-1, nukleotidene 97-447, etterfulgt av sekvensen TARTAR.TAG. Umiddelbart etter trippel-terminatoren følger en pUC-18 polybinder. Det tetracyklinresistente gen fra pBR322 er innført, orientert i mot-art retning av CSF-genet, 100 baser nedstrøms fra pUC-18 polybinderen. Det tetracyklinresistente genet har sin egen promoter. Fortsetter man i retning mot urviseren kom-mer man til genet for beta-laktamase etterfulgt av begynnelsespunktet for replikering av pUC-18(CoLEl).

Det endelige strukturelle særtrekket for plasmidet for tilbakevending til CSF-sekvensene, er PL-promoteren. Denne promoteren er vesentlig, som beskrevet hos A. Skatzman og M. Rosenberg (i "Molecular cloning, a laboratory manual" (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, side 419). CSF-ekspresjon drives av PL-promoteren etter termal induksjon i en passende E. coli vertsstamme.

Den opprinnelige stammen som ble anvendt for alle stammekonstruksjonene var W3110 lacI°L8 (R. Brent og M. Ptashne PNAs 78 (1981) 4204-4208.)

Et fragment fra ^-DNA (X.-nukleotider 34499 til 38214) ble integrert inn i kromosomer fra W3110 lac!°L8 ved lacZ-stedet. Integreringen ble utført ved anvendelse av en inte-greringsvektor bestående av pBR322-sekvenser med genene som koder for kloramfenikol og ampicillinresistens og vel som utgangspunkter for replikering av pBR322.(F. Bolivar Gene 4 (1978) 121-136). X-DNA-fragmentet innføres i lacZ-genet, som selv er tilstede på plasmidet som et fragment utstrakt fra BstEil-siden i lad til en Tthilll-side nedstrøms for lacZ.

Integrering av DNA inn i kromosomkopien av lacZ ble oppnådd ved homolog rekombinering og lac<+>, og det ble funnet ampicillinsensitive og kloramfenikolresistente kolonier. En annen rekombinering som førte til fjerning av alle ekstra plasmidsekvenser, men som lot det integrerte ?L-DNA-rfagmentet være igjen, ble screenet på laktose-Mac- Conkey-plater. De opprinnelige lac<+>, amp<s>, cam<R->fenotyper forandret seg til lac", amp<s>, cam<R->fenotyper etter den andre rekombineringen. Resultantstammen ble kalt GL400 og var X ved 30°C og X ved 42°C. Denne fenotype viser tilstedeværelsen av en funksjo-nell kromosomkopi av CI 857 allelet.

GL400 ble gjort lon ved PL-transduksjon fra et lysat dyrket på stamme SG20252 (lacAul69, ara 139 rpsl lon l00:TnlO). TnlO ble fjernet ved hjelp av screening etter Tet<s>på selektivt medium (S. Maloy, W. Nunn J. Bacteriol. 145 (1981) 1110-1112).

Den endelige vertstammen ble kalt G1413 (lacl°L8, LacZA. (ACI, REX, N), lonA 100).

pTALC-185R ble transformert inn i GI413. En ett døgn gammel kultur av denne stammen ble dyrket ved 30°C i 5 ml induksjonsmedium inneholdende 7 ugml"1 tetracyklin. Induksjonsmedium inneholder pr. liter:

20 g Casainino-syrer

6gNa2HP047H20

3gKH2P04

0,5 g NaCl

IgNlLiCl

1% glyserol

2 mg vitamin Bl

2 mg CaCl2«2H20

0,2gMgCl2.6H2O

Mediet (25 ml) inneholdende 7 ugml"<1>tetracyklin, ble inokulert med 125 ul av den pre-inkuberte kulturen og rystet ved 30°C i et vannbad inntil det ble oppnådd en celletetthet på A55o0,5. Kulturen ble deretter raskt flyttet til et vannbad med temperatur 40°C og rystet ytterligere 2 timer under syntesen av GM-CSF. Cellene ble høstet og undersøkt med hensyn til innholdet av CSF ved hjelp av SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese. Under disse forholdene akkumulerer GM-CSF til omtrent 5% av celle-proteinet.

EKSEMPEL E

Ekspresjon av GM- CSF i Saccharomyces Cerevisiae

A. Vektor- dannelse

Et plasmid ble dannet som inneholdt genet for et enzym i uracil biosyntese-sporet (URA3) som et utvelgelsesgen og 2 u replikasjonsutgangspunkt. Dette plasmidet var avledet fra Ylp5 ((Botstein et al., Gene 8, sidene 17-24 1,1979)) med tillegg av et fragment inneholdende replikasjonsutgangspunktet fra 2 mikron plasmidet i gjær.

B. Isolering av genet for elvceraldehvd- fosfat

Dehvdrogenese fGPDH

To gener for GPDH er blitt isolert fra gjær (Holland og Holland Journal of Biological Chemistry 255 sidene 2596-2605 (1980)). Et oligonukleotid som var syntetisert fra den kjente sekvensen ble anvendt for å isolere et GPDH-gen fra en plasmidsamling av genom-DNA fra gjær ved hjelp av standard metoder. Et plasmid som inneholder hele GAP491-genet er tidligere deponert (ATCC nr. 39777)

C. Fremstilling av glyceraldehyd- fosfat- dehydrogenasepromoter for heterolo<g>

genekspresjon

Et plasmid ble dannet som tillater naturlig avstand for GPDH-promoteren fra starten av det ønskede heterologe strukturgenet. Dette ble gjennomført med innforing av et Kpnl-sted i umiddelbar nærhet av initiator-metionin-kodonet av GPDH-struktur-genet. Pro-motoren "cassette" ble deretter innført i gjærekspresjonsvektoren i YOpl.

D. Isolering av genet for cc- faktor

Et gen for a-faktoren som går sammen med feromon er isolert fra gjær (Kurjan og Herskowitz Cell., Vol. 30, sidene 933-943 (1982)). Et oligonukleotid syntetisert fra denne sekvensen ble anvendt for å isolere genet fra en plasmidsamling av genom-DNA fra gjær ved hjelp av standard metoder.

E. Fremstilling av CSF- ekspresjonsplasmidet

Fra elementene beskrevet over, og det humane CSF-genet, ble det dannet en ekspre-sjonsvektor (AJ14, fig. 7) ved hjelp av standard metoder. I denne vektoren, er den naturlige CSF-lederfrekvensen fjernet og sekvensen som koder for fullt utviklet CSF er innført ved siden av a-faktorens pre-pro-sekvens. Forbindelsespunktet mellom GPDH-promotoren, a-faktoren pre-pro-sekvens og den fullt utviklede CSF-sekvensen er presi-sert (under) og er blitt bekreftet ved hjelp av dideoksynukleotid-sekvensbestemmelse. AAATAAAXAAAATGCGTTTTCCTTCA AAA AGA GAG GCG GAA GCT. GCA CCC GCC CGC TCG...

F. Ekspresjon av GM- CSF

Plasmidet av AG 14 ble transformert inn i en stamme av Saccharomyces Cerevisiae. Cellene ble dyrket for fremstilling av CSF.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte for å rense et primat GM-CSF-protein fra. en blanding av proteiner suspendert i et vandig medium,karakterisert vedat proteinet felles med ammoniumsulfat ved 80% metning til å danne en pellet inneholdende primat GM-CSF-proteinet, pelleten resuspenderes i en bufret løsning ved en pH i området 6 til omtrent 8, den bufrede løsning inneholdende primat GM-CSF-proteinet føress inn på en kromatografisk kolonne, primat GM-CSF-aktiviteten elueres med den bufrede løsning inneholdende natriumklorid og fraksjonene med primat GM-CSF-aktivitet samles og de aktive fraksjoner slås sammen, de sammenslåtte fraksjoner føres inn på en C4 revers fasekolonne og primat GM-CSF-aktiviteten elueres med en 0 til 90% acetonitrilgradient for å samle fraksjonene inneholdende CSF-aktiviteten.
2. 2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat bufferen velges fra tris(hydroksymetyl)aminometan-hydroklorid, N-2-hydroksyetyl-piperazin-N-2-etan-sulfonsyre og natriumsitrat.
3. 3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisertv e d at den kromatografiske kolonne er fylt med oktyl-sefarose, dietylamino-etylultrogel eller akrylamid-agarose-ultrogel.
4. 4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat før de sammenslåtte fraksjoner innføres på C4-kolonnen, behandles de med acetoni-trilgradienten i en trifluoroeddiksyreløsning eller heptafluorsmørsyreløsning.
5. 5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4,karakterisert vedat konsentrasjonen av trifluoreddiksyren eller heptafluorsmørsyren i den eluerende løsning er 0,10% eller 0,15% (volum/volum).
6. 6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det vandige medium inneholdende GM-CSF-proteinet først behandles med ammoni umsulfat ved 30% løsning for å utfelle protein og supematanten anvendes for de reste-rende trinn.
7. 7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat etter trinnet med å utfelle proteinet med ammoniumsulfat for å danne en pellet, omfatter fremgangsmåten: pelleten resirkuleres i en løsning av tris-HCl og den resulterende løsning dialy-seres, den dialyserte løsning føres inn på en kolonne av DEAE-ultrogel, kolonnen elueres med en løsning av tris-HCl inneholdende minst 0,1M NaCl og fraksjonene inneholdende GM-CSFaktiviteten samles, de aktive fraksjoner slås sammen og føres inn på en kolonne inneholdende AcA44-ultrogel ekvilibrert med en løsning av HEPES inneholdende NaCl og polyetylenglykol, kolonnen elueres med en løsning av HEPES med NaCl og polyetylenglykol og fraksjonene inneholdende GM-CSF-aktiviteten samles, fraksjonene inneholdende GM-CSF-aktiviteten slås sammen og behandles med tri fluoreddiksyre, de sammenslåtte fraksjoner behandlet med trifluoreddiksyre innføres på en C4 revers fase kolonne, elueres med en 0 til 90% acetonitirlgradient i en trifluor-eddiksyreløsning og fraksjoner inneholdende GM-CSF-aktiviteten samles, fraksjonene inneholdende GM-SCF-aktiviteten slås sammen, de sammenslåtte fraksjoner behandles med heptafluorsmørsyre og den behandlede løsning føres inn på en annen C4 revers fase kolonne, og den andre C4 revers fase kolonnen med en 0 til 90% acetonitrilgradient i en heptafluorsmørsyreløsning for å samle fraksjonene med GM-CSF-aktivitet.
8. 8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat etter trinnet med å utfelle proteinet med ammoniumsulfat for å danne en pellet, omfatter fremgangsmåten: pelleten resuspenderes i en natriumsitratløsning inneholdende NaCl og oppløs-ningen føres inn på en kolonne inneholdende akrylamid-agarose-ultrogel ekvilibrert i den samme buffer, kolonnen elueres med en losning av natriumcitrat og NaCl og fraksjonene med GM-CSF-aktivitet samles, fraksjonene med GM-CSF-aktivitet slås sammen, behandles med trifluoreddiksyre og den behandlede løsning fares inn på en C4 revers fase kolonne, og kolonnen elueres med en 0 til 90% acetonitrilgradient i en trifluoreddiksyreløs-ning for å samle fraksjonene med GM-CSF-aktivitet.
9. 9. Fremgangsmåte som angitt i et eller flere av kravene 1-8,karakterisert vedat GM-CSF renses fra et Mo-celle-kondisjonert medium.
10. 10. Fremgangsmåte som angitt i et eller flere av kravene 1-8,karakterisert vedat GM-CSF renses fra et medium oppnådd ved å dyrke celler transformert med en rekombinant vektor inneholdende et uttrykkbart GM-CSF-gen.
11. 11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10,karakterisertved at cellene er eukaryote celler.
12. 12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11,karakterisertved at cellene er mammalske celter eller insektceller.
13. 13. Fremgangsmåte som angitt i krav 10,karakterisertved at cellene er prokaryote celler.
14. 14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13,karakterisertv e d at cellene er £. coli celler.
15. 15. Fremgangsmåte som angitt i krav 10,karakterisertv e d at GM-CSF renses fra et medium oppnådd ved å dyrke COS-celler transformert med p91023 (B) -CSF.
16. 16. Fremgangsmåte som angitt i et eller flere av kravene 1-15, for fremstilling av et GM-CSF-protein.