PL153139B1 - Lymphokine production and purification. - Google Patents

Description

OPIS PATENTOWY

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 85 07 05 (P. 254400)

Int. Cl.^{* 1 2 * * 5} C12N 15/19

Pierwszeństwo: 84 07 06 dla zastrz.1,4,10, 11,13,18 Stany Zjednoczone Ameryki

09 19 dla zastrz.5,6,8,12, 14-17 Stany Zjednoczone Ameryki

Zgłoszenie ogłoszono: 86 06 17

Opis patentowy opublikowano: 1991 09 30

Twórca wynalazku Uprawniony z patentu: Sandoz AG., Bazylea (Szwajcaria)

SPOSÓB WYTWARZANIA CZYNNIKA STYMULUJĄCEGO KOLONIE GRANULOCYTÓW I MAKROFAGÓW NACZELNYCH

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów naczelnych (GM—CSF).

Wszystkie liczne, rozmaite typy komórek znajdowane'we krwi, pochodzą z wielopotencjalnych hemotopoetycznych komórek pnia. Komórki pnia pełnią dwie funkcje:

1) reprodukują sie same, utrzymując dzięki temu w organizmie populacje komórek pnia i

2) dostarczają komórek potomnych poddających sie różnicowaniu do' dojrzałych komórek krwi jakiegokolwiek typu.

Komórka poddająca sie różnicowaniu na jakimkolwiek szlaku hematopoetycznym nazywana jest komórką pierwotną. Komórki pierwotne limfocytów T, limfocytów B, granulocytów, krwinek czerwonych, płytek, eozynofilów, jak również wcześniejsze komórki pierwotne, które mogą indywidualnie dać kilka typów dojrzałych komórek, badano eksperymentalnie zarówno in vivo jak i in vitro /T.M. Dexter, J.Pathology, 141, 415-433 (1983 (J. In vitro ustalono, że proliferacja i/lub różnicowanie się każdego typu komórek pierwotnych zależy od specyficznych czynników, które otrzymano z różnych źródeł. Np. późne komórki pierwotne krwinek czerwonych wymagają czynnika zwanego erytropoetyną. Czynniki wymagane do przeżycia, proliferacji i różnicowania sie komórek pierwotnych serii szpikowej poddanych różnicowaniu do dojrzałych granulocytów obojetnochłonnych, monocytów i dojrzałych makrofagów, nazywane są czynnikami stymulującymi kolonizacje (CSF). ’ ·

Aktywność CSF badano ekstensywnie na myszach. Większość narządów dojrzałych myszy wykazuje aktywność CSF. Tym niemniej jednak, mieszaniny wykazujące aktywność CSF, otrzymane z różnych tkanek i rozmaitymi metodami, różnią sie miedzy sobą w swej charakterystyce biochemicznej. Strukturalna zależność miedzy różnymi czynnikami pozostaje nieznana. Dalej, okazuje sie, że aktywność CSF działa w wiecej niż jednym stadium rozwoju granulocyta lub makrofaga i nadal nie wiadomo, czy wszystkim obserwowanym rodzajom aktywności odpowiada pojedyrtczy czynnik, czy też w każdym stadium działa inny czynnik. /A. Burgess i D. Metcalf,

153 139

153 139

Blood, 56, 947-957 (1980 (J.

Substancje o aktywności ludzkiego CSF otrzymano z różnych tkanek płodu, makrofagów i stymulowanych komórek T. Linię komórek T (Mo) wytwarzających substancję (substancje) o silnej aktywności CSF otrzymano od pacjenta z wariantem T-komórkowym białaczki kosmatokomórkowej (siatkowica białaczkowa) /Golde i wsp., Blood, 52, 1068-1072 (1978),/.

Możliwość stymulowania przez aktywność CSF tworzenia granulocytów i makrofagów wskazuje, że kompozycje farmaceutyczne o aktywności CSF są klinicznie użyteczne w sytuacjach, gdy wymagane jest wzmożone tworzenie tych typów komórek (serii szpikowej). I rzeczywiście, wykazano, że indywidualni pacjenci z ekstremalnie wysokim poziomem granulocytów w krążeniu (wyraźnie normalnych) mieli nowotwory wykazujące nadprodukcję CSF. W jednym przypadku, po chirur- a gicznym usunięciu nowotworu, ilość granulocytów szybko opadła do poziomu normalnego, co w znacznym.stopniu . sugeruje, że CSF mogą być użyteczne w regulowaniu ilości granulocytów w krążeniu /W.Hocking, J.Goodman i D.Golde, Blood, 61, 600 (1983)^7. W szczególności kompozycje * zawierające CSF mogą być klinicznie użyteczne w leczeniu supresji szpikowej spowodowanej chemoterapeutycznym lub radiologicznym leczeniem raka. Oprócz tego, kompozycje zawierające CSF są użyteczne w leczeniu ciężkich zakażeń, ponieważ mogą spowodować zwiększenie ilości i/lub zaktywowanie granulocytów i/lub monocytów.

Istnieją różne rodzaje aktywności CSF, takie jak wykazywana przez CSF granulocytów (G-CSF),

CSF makrofagów (M-CSF), CSF granulocytów-makrofagów (GM-CSF) i wieloczynnościowy CSF. Sposób według wynalazku w szczególności dotyczy GM-CSF. Znane są białka CSF pochodzące z rozmaitych źródeł zwierzęcych. Tym niemniej 'wynalazek niniejszy dotyczy zwłaszcza CSF pochodzącego od naczelnych, bardziej szczegółowo dotyczy on ludzkiego CSF i małpiego CSF.

Biologiczne i biochemiczne charakteryzowanie mieszanin wykazujących aktywność CSF oraz kliniczne badanie tych mieszanin napotykało, jak dotychczas, na przeszkody wynikające z małej ilości i zanieczyszczeń mieszanin CSF ludzkich i/lub pochodzących od innych naczelnych. Można zdawać sobie sprawę z tego, że pożądane byłoby zidentyfikowanie białka lub białek odpowiedzialnych za aktywność CSF. Dalej, pożądane byłoby posiadanie źródła tej aktywności CSF pochodzącego do naczelnych, korzystnie ludzkiego, które mogłoby łatwo dostarczyć omawianych białek w takich ilościach i o takiej czystości., która wystarczałaby do scharakteryzowania pod względem bilogicznym i biochemicznym oraz do zastosowania jako czynniki terapeutyczne.

Rozwijane ostatnio techniki klonowania molekularnego umożliwiają klonowanie sekwencji nukleotydów kodującej białko i wytwarzanie tego białka w znacznej ilości przy zastosowaniu układu gospodarz-wektor (T.Maniatis, Molecular Cloning - A Laboratory Manuał Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982). Białko można następnie odzyskać znanymi metodami rozdziału i oczyszczania.Dotychczas stosowane metody klonowania można zgrupować w trzech ogólnych kategoriach: 1) metody oparte na znajomości struktury białka, np. jego sekwencji aminokwasów, 2) metody oparte na identyfikacji białka, będącego wynikiem ekspresji klonowanego genu, za pomocą przeciwciała specyficznego wobec tego białka, oraz 3) metody oparte na identyfikacji rodzaju RNA, który w wyniku translacji daje białko lub aktywność, kodowane przez gen, o który chodzi.

Zastosowanie każdej metody z tych trzech klas staje się trudne wtedy, kiedy białko * będące przedmiotem zainteresowania, takie jak białko CSF, dostępne jest w bardzo małej ilości. Tak więc, trudno jest otrzymać odpowiednią ilość oczyszczonego białka, a następnie ^tru^dn^{o j}es^t oznaczy^ć sekwenc^ję am^okwasów, ^lu^b nawet czę^ściowe se^kwencje ^dla dane^go ^bia^łka. *

Podobna sytuacja istnieje w przypadku identyfikacji białka, powstającego w wyniku ekspresji, przez przyłączenie przeciwciała, którą to identyfikację korzystnie prowadzi się przy zastosowaniu monospecyficznej poliklonalnej immunosurowicy o wysokim mianie. A immunosurowicy takiej nie można otrzymać bez dysponowania pewną ilością oczyszczonego białka (antygenu). Przeciwciało monoklonalne umożliwia alternatywne podejście do zagadnienia, ale otrzymanie żądanego przeciwciała może również okazać się trudne, bez odpowiedniego antygenu, przy czym tego rodzaju przeciwciało monoklonalne może nie reagować z białkiem w tej postaci, w jakiej ulega ono ekspresji w dostępnych układach gospodarz-wektor. Wreszcie, translacja określonego rodzaju RNA w celu uzyskania nadającego się do identyfikacji białka lub aktywności wymaga tego, aby RNA, będący przedmiotem zainteresowania obecny był w źródle RNA w

153 139 ilości wystarczającej do uzyskania pewnego sygnału tego białka lub aktywności. Względna ilość RNA kodującego określone białko ogólnie biorąc odpowiada ilości białka tak, że rzadkie białko zazwyczaj kodowane jest przez rzadki mRNA.

Linie komórkową Mo stosuje sie zarówno jako materiał wyjściowy do oczyszczania ludzkich CSF, jak i do identyfikacji odpowiednich mRNA. Tym niemniej, nawet przy zastosowaniu tego względnie dobrego źródła wykazującego aktywność CSF, jest bardzo trudno wyodrębnić białko w ilości dostatecznie dużej do badań struktury.

W celu opanowania problemów związanych z klonowaniem sekwencji nukleotydów kodującej rzadkie białko, takie jak CSF, metodami opisanymi w powyższej części niniejszego opisu, opracowano nowy sposób postępowania. Sposób ten wymaga tylko tego, żeby produkt genu lub jego aktywność mogła być mierzona w wiarygodny sposób. Odpowiednie metody badania CSF opisano w przykładzie II. Opracowano także sposób oczyszczania, który ułatwia wyodrębnianie białka CSF albo z rekombinantowych albo z naturalnych źródeł, z uzyskaniem poziomu czystości i aktywności znacznie wyższego aniżeli było to dotychczas możliwe. ,

Sposób według wynalazku umożliwia pokonanie problemów występujących w dotychczasowym stanie techniki. Zapewnia on dostępne źródło białka wykazującego aktywność CSF wykorzystując technologie rekombinantowego DNA. W sposobie według wynalazku stosuje się do klonowania cDNA kodującego białko wykazujące aktywność CSF, nową technikę klonowania, wymagającą jedynie oznaczenia aktywności CSF. Sposób według wynalazku polega na tymi, że hoduje sie odpowiednie eukariotyczne lub prokariotyczne komórki gospodarza zawierające wektor skonstruowany tak, by w warunkach umożliwiających ekspresje nastąpiła ekspresja genu kodującego GM-CSF, po czym wyodrębnia sie białko GM-CSF z hodowli komórek.

Sposób wytwarzania i wyodrębniania wektora transformującego zawierającego CSF/cDNA, składa sie z następujących etapów: otrzymywanie RNA z komórki, która wytwarza CSF, otrzymywanie poliadenylowanego informacyjnego RNA ze wspomnianego RNA, otrzymywanie jednoniciowego cDNA na matrycy informacyjnego RNA, przekształcanie jednoniciowego cDNA w dwuniciowy cDNA, wprowadzenie dwuniciowego CDNA do wektorów transformujących i dokonanie za pomocą wektora transformacji bakterii z utworzeniem kolonii, zebranie pul składających sie z 200 do 500 kolonii każda i wyodrębnienie plazmidowego DNA z każdej puli, przeprowadzenie za pomocą plazmidowego DNA transfekcji odpowiednich komórek gospodarza, w celu ekspresji białka CSF, prowadzenie hodowli komórek transfekowanych i badanie supernatantu pod wzglądem aktywności CSF oraz wykonanie selekcji pul pod wzglądem CSF i przeprowadzenie screeningu kolonii użytych do wytworzenia danej puli w celu identyfikacji kolonii wykazujących aktywność CSF.

Korzystnie wektor jest tak skonstruowany, że' zachodzi ekspresja genu kodującego ludzkie białko GM-CSF, którego sekwencja aminokwasów odpowiada sekwencji aminokwasów w naturalnie występującym białku GM-CSF, a korzystnie, którego sekwencja aminokwasów jest przedstawiona na fig. 1 dla CSF-Thr i zaczyna sią po strzałce, lub dla CSF-Ile i także zaczyna sią po strzałce. Korzystnie również konstrukcja wektora pozwala na ekspresje genu kodującego białko GM-CSF gibona, którego sekwencja korzystnie odpowiada sekwencji aminokwasów w naturalnie występującym białku i korzystnie jest taka, jak przedstawiona na fig. 1 dla CSF-G i zaczynająca sią po strzałce. Korzystnie także wektor może być tak skonstruowany, że pozwala na ekspresje genu kodującego białko GM-CSF, zarówno ludzkie, jak i gibona, którego sekwencja aminokwasów dodatkowo obejmuje aminokwas sygnalny przy N-końcu.

W przypadku ekspresji genu kodującego białko GM-CSF o sekwencji aminokwasów odpowiadającej sekwencji w naturalnym białku GM-CSF korzystnie wektor jest tak skonstruowany, że w sekwencji aminokwasów białka jeden lub wiącej aminokwasów występuję dodatkowo, bądź jest zastąpionych innymi aminokwasami lub jest usuniętych, przy czym korzystnie naturalna sekwencja aminokwasów jest poprzedzona przy N-końcu resztą metioniny. Korzystnie też wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF obejmujące sekwencje aminokwasów przedstawioną na fig. 1 dla CSF-Thr, CSF-Ile, CSF-G zaczynającą sią po strzałce i kończącą sią po aminokwasie w pozycji 127.

Korzystnie jako wektor stosuje sią plazmid p91023/B/ zdeponowany pod numerem ATCC 39754.

Jako komórki gospodarza korzystnie stosuje sią komórki E.coli, komórki jajnika chomika chińskiego lub komórki drożdży lub komórki owadzie.

153 139

Białka CSF, wytwarzane sposobem według wynalazku, są hormonami wzrostu i różnicowania się dla komórek serii szpikowej. Są one na przykład wskazane do użytku klinicznego w celu leczenia supresji szpikowej, w szczególności (objawowej) granulocytopenii spowodowanej chemoterapeutycznym lub radiologicznym leczeniem raka. Białko CSF, wytworzone sposobem według wynala^zk^u wykazuje akt^ywnośó wtaściwą wynoszącą co najmniej ¹ χ ^10<7 je^dnostak na m^{g bi}a^łka^{, k}orz^ystnie co najmniej 2 χ ¹0⁷, a jeszcze korzystniej co najmniej ⁴ χ ¹0⁷ je^dnostek na m^{g bi}a^łka, w próbie z ludzkimi komórkami szpiku kostnego·

Figura 1 przedstawia sekwencję DNA i kod dla białka CSF wytwarzanego sposobem według wynalazku. Sekwencja DNA przedstawiona w całości koduje jeden z wariantów ludzkiego CSF określany w niniejszym opisie jako /Thr/CSF. Inny allel koduje identyczny produkt, z tą różnicą, ż^e Thr w pozycjⁱ oznaczonej numerem ¹⁰⁰ zostaje zastą^pion^{y p}rzez ^Ile /il^-CSF. Zmⁱan^y w sekwencji ludzkiej, powyżej podane, przedstawiają różnice odpowiadające sekwencji DNA kodującej CSF gibona (CSF małpy-gibona) . Przedstawione są także wydedukowane sekwencje aminokwasów.

Figura 2 schematycznie przedstawia wytwarzanie plazmidu pTPL z plazmidu pAdD26SVpA/3/.

Figura 3 jest schematyczną kontynuacją Fig. 2 i przedstawia wytwarzanie plazmidu p91023 z plazmidu pTPL.

Figura 4 jest schematyczną kontynuacją Fig. 3 i przedstawia plazmid p91023/B/.

Figura 6 schematycznie przedstawia wektor pTALC-185R.

Figura 7 schematycznie przedstawia wektor AJ-14.

Następujące definicje zamieszczono w celu ułatwienia zrozumienia niniejszego opisu. W zakresie, w którym definicje te różnią się od znaczenia spotykanego w tej dziedzinie wiedzy, poniższe definicje służą do jego ograniczenia. Amplifikacja oznacza proces, w którym komórka tworzy powtórki genów w ramach swego chromosomalnego DNA. CSF odpowiada aktywności biologicznej zdefiniowanej badaniami przedstawionymi w niniejszym- opisie patentowym. Białko CSF jest białkiem ze źródła pochodzącego od naczelnych, wykazującym aktywność CSF. Dla celów niniejszego wynalazku termin białko CSF obejmuje zmodyfikowane białko CSF, alleliczne wariacje białka CSF oraz białko CSF poprzedzone resztą Met. W dół oznacza kierunek ku końcowi 3' sekwencji nukleotydów· Wzmacniacz stanowi sekwencję nukleotydów zdolną do nasilania transkrypcji genu niezależnie od pozycji wzmacniacza w stosunku do genu lub od orientacji sekwencji. Gen jest sekwencją dezoksyrybonukleotydów kodującą dane białka. Dla celów niniejszego opisu gen nie powinien obejmować flankujących regionów nie podlegających translacji, takich jak sygnały inicjacji transkrypcji RNA, dodatkowe miejsca poliadenylacji, promotory lub wzmacniacze. Działanie ligazą (ligowanie) jest procesem prowadzącym do utworzenia wiązania fosfodwuestrowego między końcami 5' i 3' dwóch nici DNA. Można tego dokonać za pomocą kilku dobrze znanych metod enzymatycznych, takich jak łączenie tępych końców przy użyciu ligazy T4. Orientacja odnosi się do uporządkowania nukleotydów w sekwencji DNA. Odwróconą orientacją sekwencji DNA jest taka orientaja, w której uporządkowanie sekwencji od 5' do 3' jest odwrócone w stosunku do innej sekwencji przy porównaniu do punktu odnośnikowego w DNA, z którego otrzymano sekwencję Tego rodzaju punkty odnośnikowe mogą obejmować kierunek transkrypcji innych określonych sekwencji DNA w źródle DNA albo początek replikacji zdolnych do replikacji wektorów zawierających sekwencję. Transkrypcja oznacza syntezę RNA na matrycy DNA. Transformacja oznacza zmianę genotypu komórki przez pobranie przez -nią egzogennego DNA. Transformację w pewnych przypadkach można wykryć przez zmianę fenotypu komórki. Komórki transformowane nazywają się transformantami. Komórki przed transformacją określane są w niniejszym opisie jako komórki macierzyste. Translacja oznacza syntezę polipeptydu w oparciu o informacyjny RNA.

Substancja wykazująca aktywność czynnika stymulującego kolonizację (CSF) może pochodzić z szeregu źródeł komórkowych, w tym ze środowiska jednojądrzastych komórek krwi obwodowej doprowadzonego do żądanego stanu, tkanki płuc i łożyska oraz szpiku kostnego, moczu od pacjentów z niedokrwistością, surowicy oraz normalnych i nowotworowych komórek pochodzących od limfocytów T i fagocytów jednojądrzastych. Jedną z linii komórkowych, która wytwarza CSF jest linia komórkowa Mo, zdeponowana i ogólnie dostępna w ATCC pod numerem kodowym CRL 8066.

CSF tworzony przez tę linię komórkową znany jest jako CSF granulocytów-makrofagów (albo GM-CSF) i jest oczywiście ludzkim CSF. Jednym ze źródeł CSF gibona jest linia komórek T oznaczona UCD MLA-144 i zdeponowana 29.września 1983 w ATTC, gdzie jest ogólnie dostępna pod numerem kodowym HB -8370.

153 139

W celu wyodrębnienia klonu CSF zgodnie z niniejszym wynalazkiem stosuje się nowy sposób postępowania, który wymaga jedynie posłużenia się metodą badania aktywności CSF. I tak, wpierw identyfikuje się komórki wykazujące aktywność CSF, takie jak limfocyty T (albo inne źródła, takie jak źródła przedstawione w powyższej części niniejszego opisu). Następnie otrzymuje się mRNA tych komórek. Korzystnie używa się limfocytów T. W tym przypadku oddziela się od wolnego mRNA komórek mRNA związany z błoną, zawierający mRNA dla limfokin. Uważa się, że takie oddzielenie wzbogaca zebrany mRNA 5-10-krotnie w sekwencji limfokin, a przez to zaoszczędza wysiłku związanego z identyfikacją żądanego klonu CSF. Następnie otrzymuje się poliadenylowany informacyjny RNA za pomocą chromatografii na oligo-dT-celulozie.

Zbiór cDNA otrzymuje się z mRNA za pomocą wektora nadającego się do transfekcji gospodarza w celu ekspresji żądanego białka wykazującego aktywńość CSF. Pierwszą nić cDNA wytwarza się standardowymi znanymi metodami z zastosowaniem mRNA otrzymanego jak wyżej. Następnie przeprowadza się hybrydę RNA/cDNA w postać dwuniciowego cDNA. Po tym można włączyć cDNA do odpowiedniego wektora.

Podstawą korzystnego układu gospodarz-wektor dla wyodrębniania klonu CSF, jest ekspresja cDNA CSF w odpowiednim wektorze transformującym. Polega to na tym, że odpowiedni wektor transformujący może szybko wprowadzać DNA do komórek ssaków /P.Mellon, V.Parker, Y.Gluzman i T. Maniatis, Celi, 27, 279-288 (1981)7· Dla wyodrębnienia pożądanych transformantów CSF nie jest wymagane, aby wszystkie komórki w populacji trwale zawierały egzogenne geny, wykazujące ekspresję pożądanego, stanowiącego produkt, CSF. Możliwe jest przejściowe wprowadzenie egzogennych genów do subpopulacji komórek, która ' przejawi ekspresję pożądanego produktu przez kilka dni. Ponieważ w wektorze transformującym przeznaczonym do układu transfekcji i ekspresji egzogennego DNA w sposobie według wynalazku nie jest wymagany marker selekcyjny, egzogenny DNA może zostać stracony po wzroście komórek w ciągu 1-2 tygodni. Tym niemniej jednak, po upływie 2-3 dni od transfekcji odpowiednich komórek ssaków można stwierdzić, że żądane produkty są syntetyzowane i dają się wykryć.

Podstawą układu gospodarz-wektor z wyboru jest wyprowadzenie linii małpich komórek CV-1 transformowanych cząsteczką DNA SV40 defektywną pod względem początku replikacji /Y.Gluzman, Celi, 23, 175-182 (1981)/. Transformowane komórki małpie CV-1 zawierają defektywny DNA SV40, oznaczone COS (CV-1, defektywne pod względem początku replikacji, SV40) nie zawierają całkowitej kopii genomu SV40, lecz wytwarzają na wysokim poziomie duży antygen T i są permisyjne pod względem replikacji DNA SV40. Także, podtrzymują one skutecznie replikację SV40 z delecjami we wczesnym regionie, oraz plazmidów bakteryjnych zawierających początek replikacji SV40 ZR.M. Myers i R. Tjan, PNAS, 77, 6491-6495 (1980).7. Tak więc układ ten zapewnia środki do amplifikacji transfekowanego egzogennego DNA na drodze replikacji DNA, w której pośredniczy SV40 w celu podniesienia poziomu mRNA i białka będącego wynikiem ekspresji egzogennego DNA.

Tym niemniej jednak, użyteczne są również i inne podobne układy. Wektory stosowane w celu ekspresji CSF zwykle zawierają rozmaite elementy, takie jak wzmacniacze, promotory, introny, miejsca poliadenylacji, niekodujące regiony 3' i aktywatory translacji, jak to przedstawiono w poniższej części niniejszego opisu.

Wektory stosowane w sposobie według wynalazku mogą zawierać wzmacniacze. Wzmacniacze różnią się od promotorów pod względem funkcji, ale okazuje się, że działają - one zgodnie z promotorami. Ich funkcja na poziomie komórkowym nie jest w pełni zrozumiała, ale są w unikalny sposób scharakteryzowane zdolnością do aktywowania lub nasilania transkrypcji niezależnie od ich pozycji lub orientacji. Promotory powinny być usytuowane w górę od genu podczas, gdy wzmacniacze mogą być obecne w górę (lub w kierunku 5' ) od promotora, w genie w postaci intronu, albo w dół od genu, między genem a miejscem poliadenylacji lub w kierunku 3' od miejsca poliadenylacji. Odwrócone promotory nie funkcjonują, ale odwrócone wzmacniacze funkcjonują. Typ działania wzmacniaczy określa się jako cis, to znaczy wywierają one wpływ na promotor tylko wtedy, gdy są obecne na tej samej nici DNA. Co do ogólnej dyskusji na temat wzmacniaczy, patrz: Khoury i wsp., Celi, 33, 313-314 (1983).

Korzystnymi wzmacniaczami do użycia w komórkach ssaków są wzmacniacze otrzymane ze zwierzęcych wirusów, takich jak małpi wirus 40, wirus polyoma, bydlęcy wirus brodawczaka, retrowirus lub adenowirus. W idealnym przypadku wzmacniacz powinien pochodzić z wirusa, dla którego

153 139 komórka gospodarza jest permisyjna, to znaczy takiego wirusa, który normalnie zakaża komórki typu komórki gospodarza. Wirusowe wzmacniacze można łatwo otrzymać z ogólnie dostępnych wirusów. Znane są dobrze regiony wzmacniające dla kilku wirusów, takich jak wirus mięsaka Rousa i małpi r

wirus 40. Patrz: Luciw i wsp., Celi, 33, 705-716 (1983). Do rutynowej biologii molekularnej należałoby dokonanie wycięcia tych regionów w oparciu o opublikowane mapy restrykcyjne wirusów będących przedmiotem zainteresowania oraz, jeżeli jest to niezbędne, zmodyfikowanie tych miejsc w celu umożliwienia włączenia do wektora według życzenia. Patrz np·: Kaufman i wsp., J. Mol.Biol. 159, 601-621 (1982) i Mol. Celi Biol., 2/11, 1304-1319 (1982). Alternatywnie, można zsyntetyzować wzmacniacz na podstawie danych dotyczących sekwencji, gdyż rozmiar wzmacniaczy wirusowych (ogólnie mniejszy od około 150 par zasad) jest wystarczająco mały, aby można to było wykonać w praktyce.

Innym elementem, który powinien być obecny przy montowaniu wirusa jest miejsce włączenia (lub dodania) poliadenylacji. Jest to sekwencja DNA zlokalizowana w dół od regionów genu ulegających translacji, krótko w dół od miejsca, w którym z kolei transkrypcja sie zatrzymuje i zostają dodane rybonukleotydy adeniowe w celu utworzenia poliadeninowego ogona nukleotydowego na zakończeniu 3' informacyjnego RNA. Poliadenylacja jest ważna jeśli chodzi o stabilizacją informacyjnego DNA przeciwdziałającą degradacji w komórce. W wyniku degradacji zostałby zmniejszony poziom informacyjnego RNA, a więc także obniżony poziom białka stanowiącego produkt.

Eukariotyczne miejsca poliadenylacji są dobrze znane. Wśród genów eukariotycznych istnieje zgodna sekwencja: heksanukleotyd 5'-AAUAAA-3' jest znajdowany w odległości 11-30 nukleotydów od punktu, w którym zaczyna sie poliadenylacja. Sekwencje DNA zawierające miejsca poliadenylacji można otrzymać z wirusów zgodnie z opublikowanymi doniesieniami. Przykładowe sekwencje miejsc poliadenylacji można otrzymać z genu mysiej y3-globiny lub z genów późnego względnie wczesnego regionu małpiego wirusa 40, korzystne są jednak wirusowe miejsca poliadenylacji.

Skoro sekwencje te są znane, mogą być one zsyntetyzowane in vitro i włączone do wektorów za pomocą działania ligazą w zwykły sposób.

Korzystną sekwencją oddzielającą miejsce poliadenylacji .od translacyjnego kodonu stop jest sekwencja DNA nie ulegająca translacji, taka jak gen eukariotyczny bezpromotoroiw/· Ponieważ sekwencje te i geny nie są wyposażone w promotory, nie będą one wykazywać ekspresji. Sekwencja taka powinna rozciągać się na znacznym odcinku, rządu do około 1000 zasad, od kodonu stop do miejsca poliadenylacji. Nie ulegająca translacji sekwencja 3' ogólnie podwyższa wydajność produktu. Wektor może wykazywać terminacje od około 30 par zasad ' w dół od zgodnego miejsca poliadenylacji, ale korzystne jest zachowanie sekwencji 3', których istnienie stwierdzono w kierunku w dół od miejsca poliadenylacji w jego otoczeniu typu dzikiego. Te sekwencje typowo rozciągają sie na odcinku od 200 do 600 par zasad w dół od miejsca poliadenylacji.

Obecność intronów w nie ulegającej translacji, natomiast transkrybowanej części wektora, może podwyższyć wydajność produktu. Introny te można . uzyskać ze źródeł innych niż komórka gospodarza lub źródła genu. I tak np., intron hybrydowy obejmujący miejsce złożenia 5' z drugiego intronu z trójczłonowego lidera adenowirusa i miejsce złożenia 3' z genu immunoglobuliny wprowadzony w dół od miejsca startu transkrypcji w głównym promotorze późnym adenowirusa daje w wyniku podwyższenie wydajności produktu.

W korzystnym zastosowaniu używa sie klonującego i ekspresyjnego wektora CSF zawierającego gen aktywator translacji. Aktywatory translacji są genami, w których zakodowany jest produkt (białko lub RNA), wpływającymi na translacje pożądanego mRNA. Najlepszym przykładem jest towarzyszący adenowirusowi (VA) gen (VAI), który transkrybowany jest do RNA w postaci krótkich odcinków, wykazujących oddziaływanie z sekwencjami z regionu 5' nie ulegającego translacji w głównych późnych informacyjnych RNA adenowirusa /Thimmappaya i wsp., Celi, 3, 543 (1982)J. Sekwencje niezbędne do aktywacji przez VA-RNA położone są w późnym trójczłonowym liderze mRNA adenowirusa. Trójczłonowy lider adenowirusa jest złożony z niezespolonych regionów genomu adenowirusa i jego obecny na końcu 5' głównych późnych transkryptów adenowirusa. VA-RNA może działać, w rezultacie aktywując translacje mRNA, zawierających sekwencje trójczłonowego lidera. Tak wiec, korzystny klonujący cDNA i ekspresyjny wektor zawiera trójczłonowy lider w postaci składanej i geny VA adenowirusa. Wektory te można syntetyzować metodami dobrze

153 139 znanymi fachowcom w tej dziedzinie wiedzy.

Komponenty wektorów, takie jak wzmacniacze, promotory itp, można otrzymać ze źródeł naturalnych lub syntetyzować, jak to przedstawiono w powyższej części niniejszego opisu. Zasadniczo jeżeli komponenty znajdowane są w DNA i dostępne w dużej ilości, np. komponenty związane z funkcją wirusa, albo też jeżeli mogą one być zsyntetyzowane, np. miejsca poliadenylacji, to wtedy, przy odpowiednim zastosowaniu enzymów restrykcyjnych, można otrzymać duże ilości wektora na drodze zwykłej hodowli organizmu stanowiącego źródło, a następnie strawienia jego DNA odpowiednią endonukleazą, wyodrębnienie fragmentów DNA, zidentyfikowania DNA zawierającego element będący przedmiotem zainteresowania i odzyskania go. Zwykle wektor montuje się w małej ilości, a następnie włącza przez działanie ligazą do odpowiedniego atonomicznie replikującego się wektora syntezowego, takiego jak prokariotyczny plazmid lub fag. W większości przypadków można użyć plazmidu pBR322. Patrz: Kaufman i wsp. (w cytowanej pracy).

Wektory syntezowe stosuje się do klonowania połączonych, przez działanie ligazą, wektorów transformacyjnych, w zwykły sposób, taki jak transfekcja permisyjnego organizmu prokariotycznego, replikacja wektorów syntezowych do dużej ilości kopii i odzyskanie wektora syntezowego za pomocą lizy komórek i wyodrębnienia go z komórkowego debris. Wektory zawierające cDNA otrzymany z komórek wykazujących aktywność CSF wprowadza się następnie na drodze transfekcji do E.coli i wysiewa“na płytki Petri'ego przy około 2000 kolonii na płytkę. Kolonie przenosi się na sączek nitrocelulozowy, po czym sączek przenosi się na nową płytkę, którą przetrzymuje się jako płytkę wzorcową. Po wzroście tych kolonii wykonuje się repliki i przetrzymuje równolegle z oryginalnymi przez staranne oznakowanie tak, że odcinki sączków z replikami można zidentyfikować z odpowiednią częścią płytki wzorcowej.

Każdy sączek z replikami tnie się na odcinki obejmujące uprzednio przewidzianą ilość kolonii/odcinek, korzystnie około 200-500 kolonii/odcinek. Kolonie z każdego odcinka zdrapuje się do podłoża takiego jak bulion L, po czym bakterie osadza się za pomocą wirowanie!, a następnie wyodrębnia się plazmidowy DNA. Plazmidowy DNA z każdego odcinka przenosi się do odpowiedniego gospodarza w celu ekspresji białka. Korzystnym wektorem syntezowym wytwarzanym sposobem według wynalazku jest mutant plazmidu E.coli pBR322, z którego usunięto sekwencje szkodliwe dla komórek eukariotycznych. Patrz: Kaufman i wsp. (w cytowanej pracy). Użycie tego mutanta pozwala uniknąć konieczności usuwania reszty plazmidowej przed transfekcją. Po wzroście komórek po transfekcji podłoże bada się pod względem aktywności CSF. Pozytywny wynik badania wskazuje na to, że kolonia zawierająca CSF/cDNA znajduje się na określonym odcinku sączka.

W celu określenići, która z kolonii na oryginalnym sączku wzorcowym zawiera CSF/cDNA, każdy klon z odcinka sączka pobiera się i hoduje. Następnie kultury umieszcza się na matrycy. Sporządza się pule z każdego rzędu poziomego i kolumny pionowej matrycy. Z każdej ze spulowanych kultur otrzymuje się próbki DNA, po czym dokonuje się transfekcji komórek gospodarza w celu ekspresji. Supernatanty z każdej puli bada się pod względem aktywności CSF. Jedna pula z pionowych kolumn i jedna pula z poziomych rzędów powinna wykazywać aktywność CSF. Klon wspólny dla tych pul będzie zawierać CSF/cDNA. W przypadku, gdy matryca zawiera więcej niż jeden klon pozytywny, pozytywna będzie więcej niż jedna kolumna i rząd. Wtedy może okazać się niezbędny dalszy screening małej ilości klonów.

Z klonów wycina się enzymami restrykcyjnymi CSF/cDNa. Można go poddać badaniu sekwencji metodami znanymi. Łatwo można ocenić, że sposobu opisanego w niniejszym opisie można użyć do otrzymania CSF/cDNA z każdego źródła. Całkowitą sekwencję DNA odpowiadającą CSF/cDNA wytworzonemu sposobem według wynalazku przedstawia Fig. 1 łącznie z przewidywaną sekwencją aminokwasów produktu stanowiącego białko CSF po translacji.

Sekwencję DNA kodującą białko wykazujące aktywność CSF według wynalazku, taką jak przedstawiona na Fig. 1, można zmodyfikować zwykłymi metodami w celu wytworzenia wariantów końcowego białka CSF, które ciągle wykazują aktywność CSF w badaniach testowych przedstawionych w niniejszym opisie. I tak np., jeden, dwa, trzy, cztery lub pięć aminokwasów można zastąpić innymi aminokwasami. W belgijskim opisie patentowym nr 890 016 włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik opisano jedną z takich typowych metod zastąpienia cysteiny przez np. serynę.

CSF/cDNA wytworzony sposobem według wynalazku obejmuje dojrzały gen CSF/cDNA poprzedzony kodonem ATG oraz CSF/cDNA kodujący alleliczne warianty białka CSF. Jeden z alleli przedstawia

Fig. 1. Inny allel, odkryty przez twórców niniejszego wynalazku zawiera w pozycji 365 resztę

153 139 tyminy zamiast reszty cytozyny, przedstawionej na Fig. 1. Białko CSF wytworzone sposobem według wynalazku obejmuje 1-metioninową pochodną białka CSF (Met-CSF) i alleliczne warianty biał ka CSF. Dojrzałe białko CSF przedstawione na Fig. 1 zaczyna sią sekwencją Ala.Pro.Ala.Arg..., której początek jest pokazany strzałką po nukleotydzie nr 66 na Fig. 1. Met-SCF powinno sią zaczynać sekwencją Met.Ala.Pro.Ala.Arg... Alleliczny wariant przedstawiony na Fig. 1 zawiera jako resztę aminokwasową nr 100 Thr (zaczynając od Ala po strzałce) i można go przedstawić dla potrzeb niniejszego opisu jako /Thr/CSF. Inny wariant ma w pozycji 100 resztą Ile i dla potrzeb niniejszego opisu można go przedstawić jako /Ile/CSF. Oczyszczone białko CSF wytworzo ne ^spo^sobem wedłu^g wynatazto wykazuje aktywność wtaśctaą co najmniej l⁰*⁷ je^dnos^te^k/m^{g bi}ałk:a, korz^ystnie co najmniej 4.^{10 7} je^dnoste^k/m^g, przy ^badaniu wo^bec ludzkich komóre^k sz^piku kostnego.

Układy gospodarz/wektor do ekspresji CSF mogą być prokariotyczne lub eukariotyczne, ale skomplikowany charakter CSF powoduje, że korzystnym układem ekspresyjnym jest układ pochodzący od ssaków. Ekspresją łatwo osiąga sią zapomocą transformowania komórek prokariotycznych lub eukariotycznych odpowiednim wektorem CSF. Sekwencja DNA wytworzona wyżej opisanym sposobem może w komórkach ssaków doprowadzić do bezpośredniej ekspresji pod kontrolą odpowiedniego promotora. Można użyć tu promotorów heterologicznych dobrze znanych fachowcom w tej dziedzinie wiedzy. W celu ekspresji CSF w komórkach prokariotycznych lub komórkach drożdży trzeba usunąć sekwencję liderową (lub sekwencją wydzielniczą). Pozycją kodonu dla N-końca dojrzałego białka CSF ' przedstawiono na Fig. 1.

Wspomnianego usunięcia można dokonać stosując standardowe metody znane fachowcom w tej dziedzinie wiedzy. Gdy już otrzyma sią żądany klon CSF/cDNA, stosuje sią znane, odpowiednie środki w celu uzyskania ekspresji białka CSF. I tak np., przeprowadza sią insercją do odpowiedniego wektora i transfekcją odpowiedniej komórki gospodarza tym wektorem, selekcją transformowanych komórek i hodowlą transformantów w celu ekspresji aktywności CSF. Do komórek, które nadają sią do wykorzystania jako gospodarze, należą komórki takie jak komórki bakterii, np. E.coli, drożdiży, ssaków, np. CHO, oraz owadów. Tak wytworzone białko CSF może zawierać grupą metioninową na N-końcu białka (w niniejszym opisie zwane Met-CSF). Dojrzałe białka wytworzone przez komórki prokariotyczne i eukariotyczne bądą skądinąd identyczne pod wzglądem sekwencji aminokwasów, ale produkt eukariotyczny może być glikozylowany w takim samym (lub różnym) zakresie jak produkt naturalny.

Rozmaite metody otrzymywania białka CSF zgodnie z konwencją objaśnione są przykładami w dalszej cząści niniejszego opisu. Inne metody lub materiały, np. wektory, staną sią łatwo oczywiste dla fachowców w tej dziedzinie wiedzy, na podstawie zamieszczonych w poniższej cząści niniejszego opisu przykładów oraz poprzedzającego je tekstu.

Białko CSF powstające w wyniku ekspresji w odpowiednich komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych można odzyskać metodami oczyszczania i wydzielania znanymi fachowcom w tej dziedzinie wiedzy. Można je też oczyszczać opracowanym przez nas sposobem, który umożliwia otrzymanie, ze źródeł zarówno rekombinantowych jak i naturalnych, białka CSF o wysokiej czystości aktywności. Sposób ten obejmuje: wytrącenie białka siarczanem amonowym przy 80% nasyceniu z utworzeniem osadu zawierającego białko CSF, rozpuszczenie osadu w buforowanym roztworze o pH mieszczącym sią w zakresie od około 6 do około 8, naniesienie buforowanego roztworu zawierającego CSF na kolumną Chromatograficzną, przeprowadzenie elucji przy użyciu buforowanego roztworu zawierającego chlorek sodowy oraz zebranie frakcji wykazujących aktywność CSF, spulowanie frakcji aktywnych, naniesienie ich na kolumną C4 z odwróconymi fazami i przeprowadzenie elucji w gradiencie acetonitrylu 0-9*0% w celu zebrania frakcji aktywnych.

Figura 5 przedstawia obraz analizy oczyszczonego białka CSF za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE) w obecności siarczanu sodowo-dodecylowego (SDS). Sposobem tym można oczyszczać CSF pochodzące z dowolnego źródła. Doprowadzone do żądanego stanu środowisko z dowolnego źródła białka CSF korzystnie zatąża sią za pomocą ultrafiltracji do stążenia białka co najmniej około 0,1 mg białka/ml. Następnie białko wytrąca sią przez dodanie siarczanu amonowego do 80% nasycenia. Powstały osad rozpuszcza sią ponownie w buforowanym wodnym roztworze o pH w zakresie od około 6 do około 8. Do przykładowych odpowiednich buforów należą takie bufory jak Tris-HCl, HEPES, cytrynian sodowy itp.

153 139

Buforowany roztwór frakcjonuje się za pomocą chromatografii kolumnowej. Do odpowiednich do użycia w kolumnie chromatograficznej materiałów należą: octyl-sepharose, DEAE-ultragel, AcA44-ultrogel, AcA-54 ultrogel itp. Dla uzyskania wyższej czystości można użyć kolejno jednego lub więcej z tych materiałów. Frakcje z każdej kolumny zbiera się i bada pod względem aktywności CSF. Frakcje aktywne puluje się i rozcieńcza kwasem trójfluorooctowym (TFA), sześciofluoromasłowym (HFBA) lub podobnym i nanosi się na kolumnę C4 z odwróconymi fazami. Następnie dokonuje się elucji substancji wykazujących aktywność CSF gradientem acetonitrylu 0-90% w TFA lub HFBA, korzystnie przy stężeniu, odpowiednio, 0.10% lub 0,15% (obj/obj), w zależności od rodzaju zastosowanego kwasu, użytego do naniesienia spulowanych frakcji na kolumnę.

Frakcję wykazujące aktywność CSF analizuje się za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym /Ϊ3,3% żel, jak to opisał U.Lammli, Naturę, 227, 680 (1970)/, w obecności SDS (SDS-PAGE). Dodatkowa obróbka z użyciem wyżej wspomnianych materiałów zastosowanych w kolumnie chromatograficznej pozwala na dalsze oczyszczenie białka CSF aż do uzyskania homogeniczności.

W oczyszczonym białku CSF rozdzielonym za pomocą SDS-PAGE ujawnia się heterogeniczne białko CSF o pozornej masie cząsteczkowej w zakresie od około 15000 daltonów do około 26000 daltonów. Ta pozorna heterogeniczność wielkości spowodowana jest- ekstensywną glikozylacją białka i stanowi pospolitą cechę glikoprotein. Frakcjonowanie próbek mniej oczyszczonych, z doprowadzonego do żądanego stanu środowiska -komórek Mo - za pomocą SDS-PAGE (w warunkach nieredukujących), oraz badanie białka wyeluowanego z żelu, ujawnia obecność drugiego białka wykazującego aktywność CSF, o pozornej masie cząsteczkowej wynoszącej około 28000 do 30000.

Substancja wykazująca aktywność CSF wiąże się z octyl-sepharose, DEAE-ultrogel oraz, w kolumnie C4 z odwróconymi fazami, skąd daje się wyeluować. W przybliżeniu 60% substancji wykazującej aktywność CSF wiąże się z Con-A sepharose (40% przepływni) i można ją wyekstrahować przy użyciu eć-metylomannozydu.

Badanie masy cząsteczkowej rekombinantowego CSF metodą sączenia molekularnego w niskim stężenu soli ujawnia, że około 30% substancji - aktywnej ulega elucji z oznaczoną masą cząsteczkową około 19000, jednakże 70% materiału zachowuje się jak dimery, ulegając elucji w pczycji odpowiadającej masie cząsteczkowej około 38000. W przypadku, gdy do układu kolumny włączy się 1 M NaCl, cała ilość substancji aktywnej ulega elucji jako szeroki szczyt odpowiadający około 19000 daltonów.

Oczyszczony CSF jest stabilny w ciągu co najmniej 16 godzin w warunkach inkubacji w temperaturze ⁴°^C /^{pH 7,4/} w ^{4 M} c^hlorowo^dorku ^guanicl^yn^{y, 10} m^{M E}DTA, ¹⁰ m^M ^mertaptaetanolu i 30% (obj/obj) etanolu. Substancja wykazująca aktywność CSF jest także stabilna w 0,1% kwasie trójfluorooctowym (TFA) /ph 2,0/ oraz w 0,1% TFA + 25% (obj/obj) acetonitryl.

Jak wspomniano w powyższej części niniejszego opisu, użycie białka CSF wytwarzanego sposobem według wynalazku, jest wskazane w przypadku leczenia supresji szpikowej, takiej jak (objawowa) granulocytopenia, np, granulocytopenia spowodowana chemoterapeutycznym lub radiologicznym leczeniem raka. Oprócz tego, białka CSF wytworzone sposobem według wynalazku wskazane są w użyciu w leczeniu ciężkich zakażeń. W tym zastosowaniu wskazane jest dawkowanie wynoszące od około 200 yug do około 1000 yug na pacjenta. Korzystnie białko CSF wstrzykiwane jest pacjentowi dożylnie w odpowiednim nośniku farmakologicznym. Do przykładowych nośników tego rodzaju należy fizjologiczny roztwór soli oraz ludzka albumina surowicza w roztworze soli.

Oprócz tego, białka CSF wytworzone sposobem według wynalazku wykazują także inne rodzaje aktywności i znajdują również inne zastosowanie. I tak, np. wykazano, że mysie -CSF aktywują neutrofile. Tak więc można byłoby oczekiwać, że*pochodzące od naczelnych CSF wytworzone sposobem według wynalazku także będą aktywować neutrofile. Zatem fizjologiczne funkcje CSF mogą być różnorakie. W szpiku kostnym limfokina ta może stymulować proliferację i różnicowanie się komórek efektorowych obrony gospodarza, podczas gdy na obwodzie mogą być aktywowane nowe i istniejące już komórki. W miejscowej odpowiedzi immunologicznej CSF może utrzymywać neutrofile z krążenia w miejscu zapalenia lub poza tym miejscem. Nieodpowiednia lokalizacja i/lub aktywacja neutrofilów może być związana ze stanami patofizjologicznymi w różnych zaburzeniach, w których pośredniczą reakcje odpornościowe, takich jak gościec przewlekły postępujący.

153 139

Wynalazek stanie sie bardziej zrozumiały przy odniesieniu się do następujących, podanych dla objaśnienia' zastosowań, które zamieszczono jedynie przykładowo i których nie należy przyjmowaó jako ograniczenia rzeczywistego zakresu wynalazku, jak to opisano w poniższych zastrzeżeniach.

W ^przy^kła^dac^h, jeteH te^go ⁱnaczej nie zaznaczono, wartości. tem^peratur^{y p}o^dano w °C.

Endonukleazy restrykcyjne stosuje się w warunkach i w sposób zalecany przez ich handlowych dostawców. Reakcje, w których wykorzystuje się działanie ligazy prowadzi się w sposób, jaki opisali Maniatis i wsp. (wyżej, str.245-246), których odkrycie włączono do niniejszego opisu jako odnośnik, z zastosowaniem buforu opisanego na str. 246 wymienionej pracy i z przyjęcⁱem stetente DNA ^1-100 yug^^ oraz temperatur^y · ²³°C ^dla DNA z tę^pymi końcam^1, a 16°C dla

DNA z lepkimi końcami. Elektroforezę prowadzi się w 0,5-1,5% żelu agarozowym zawierającym 32 mM Tris-boran i 10 mM EDTA. Cały promieniotwórczo znakowany DNA jest znakowany P, niezależnie od tego, jakiej metody znakowania użyto. .

Przez szybką prep. rozumie się szybkie, na małą skalę wytwarzanie bakteriofagowego lub plazmidowego DNA, np. sposobem opisanym przez Maniatisa i wsp. (wyżej, str.365-373).

Przykład I. Stadium 1. Hodowle komórek linii Mo.

Komórki Mo (ATCC CRL 8066) hoduje się rutynowo w płynie Alfa (6% CO2) lub Iscove'a (10% CO2) zawierającym 20% płodowej surowicy cielęcej (FCS) , 2 mM glutaminę, 100 jedn/ml streptomcycyny i 100 yig/ml penicyliny. Sobkultury komórek powinno się zakładać każdorazowo co 4-5 dni. Komórki liczy się i przesiewa do butli Falcon T-175, do 100-150 ml płynu, przy gęsto^ścⁱ 3-⁴.¹⁰^ fcomórekM. ^Ilo^{ść k}om^óre^{k p}odwaja sⁱę w ²⁰% FC^S co ⁴-⁷ dni. Sz^ybko^ść wzrostu nie jest stała i czasem może się okazać, że wzrost komórek ustaje, aby następnie przekształcić się we wzrost gwałtowny. Komórki Mo można hodować w płynie bez surowicy. Przeżycie jest znacznie lepsze, gdy komórek nie przemywa się przy przenoszeniu z płynu zawierającego FCS do ^płynu ^bez surowicy. ^Optyma^lna ^gęste^ść w ^płynie bez surowtey (^SF) w^ynosi 5x¹⁰^ komórek/ml. Komórki będą rosnąć słabo (albo co najmniej utrzymywać się będzie stała ich ilość) w płynie bez surowicy w ciągu 3 dni, a następnie hodowla powinna być zasilona 20% FCS na co najmnie j 4 dni. Ten schemat wzrostu (3 dni SF, 4 dni 20% FCS) można powtarzać co tydzień w ciągu kilku miesięcy, jeżeli wymagane jest użycie płynu SF, bez widocznej szkody dla komórek.

Stadium 2. Badania pod względem aktywności CSF.

A. Badanie wobec szpiku kostnego·

Otrzymuje się świeży szpik kostny (BM)· Oddziela się drzazgi kostne przeciągając przez igłę o rozmiarze 20, 22, a następnie 25. Rozcieńcza się w stosunku 1:1 jałowym, buforowanym fosforanami, roztworem soli (PBS) w temperaturze pokojowej i nawarstwia na Ficoll-Paque (około 30 ml BM-PBS na 6 ml Ficollu) . Odwirowuje się przy 1500 obr/min w ciągu 40 minut w temperaturze pokojowej. Usuwa się warstwę tłuszczu i PBS i odrzuca. Odpipetowuje się warstwę o niskiej gęstości. Przemywa się 2 razy przy użyciu PBS i liczy. Wysiewa się komórki na płytki w RPMI (otrzymano z GIPCO jako RPMI 1640) + 10% płodowa surowica cielęca inaktywowana termicznie (HIFCS), w ciągu 3 godzin, aby po upływie tego czasu usunąć komórki, które przylegają.

Podłoże do wysiewania (należy je przygotowywać na świeżo): 20% FCS? 0,3% agar rozpuszczon^y w wodzie i. oc^hło^dzon^{y d}o tem^peratury ⁴⁰°C; 2x ^Iscove (1:1 objóbj z a^garem)^{; 1}% P/S do ^ko^ńcowe^go stetenia stre^ptom^ycyn^{y 100} /ig/ml i ^penic^ylin^{y 100} je^dn/m^l; l⁰”^ M ^cC-tioglicero^l w 2x Iscove z l⁰’² M roztworu macterzystego.

^Agar oc^hła^dza się do ^tempera^tur^y o^koło ⁴⁰°C. ^Miesza sⁱę z knymi s^adn^and. Oc^hła^dza si^ę do temperatury ^37-38°C w łaźnⁱ wo^dnej ⁱ utrz^ymu^je w tej temperaturze. Po u^pływte wyżej wspomnianych 3 godzin od posiania odpipetowuje się komórki, które nie przylegają. Odwirowuje si^ę i ltezy. Dodaje się 2.¹⁰^ komóre^k/m^{l p}o^dło^ża do w^ysⁱewania i utrz^ymuje w ^łaźnⁱ wo^dnej o re^gu^lowanej temperaturze 3^7-38°C. Umteszcza sⁱę ba^dane pró^bki (np. ^śro^dowis^ko ^kom^óre^k po transfekcji, zazwyczaj objętość próbki wynosi 10 Aii) w pierwszym rzędzie dołków płytki do mikromiareczkowania, w duplikatach. W każdym dołku umieszcza się 100 /ii zawiesiny komórek:.

Do każdego dołka w pierwszym rzędzie wprowadza się dodatkowo 50 /ul zawiesiny komórek. Całość miesza się starannie i przenosi zawiesinę w ilości 50 /il z pierwszego rzędu do następnego

153 139 itd. i kontynuuje się rozcieńczanie 1:3 poprzez płytkę. Płytkę owija się parafilmem. Inkubację prowadzi sⁱę w ctagu ^10-14 dn^{i p}rzy ¹0% CO₂, w tem^peraturze 37°C, w całkowicie nawianej atmosferze i przeprowadza zapis dotyczący kolonii.

W celu dokonania zapisu dotyczącego kolonii, oblicza się całkowitą ilość kolonii rosnących w każdym dołku. W każdej próbie wysiewa się na płytki zawartość szeregu dołków nie włączywszy próbek badanych do dołków z próbkami ślepymi, dla otrzymania liczby kolonii stanowiących tło. Średnią ilość kolonii rosnących w dołkach z próbami ślepymi odejmuje się od ilości kolonii znalezionych w każdym dołku zawierającym próbki badane. Jedną jednostkę CSF stanowi. ta no^ść CSB, kt^óra symuluje utworzenta jednej kolonii ponad poziom tła na 10⁵ ludz^kic^{h k}om^órek szp^iku ^kostnego (wysⁱewan^yc^h na ^płytki ^prz^y st^ężeniu 10⁵ komórek/ml) ^gd^y st^ężenie CSF jest niższe od stężenia wysycającego. Stężenie niższe od stężenia wysycającego określa się na podstawie rozcieńczenia i porównanie ilości kolonii przy różnych rozcieńczeniach, w celu znalezienia wartości wartości stężenia znajdującej się tuż poniżej poziomu wysycenia.

W przypadku tego badania liczy się kolonie zawierające granulocyty, monocyty lub oba typy komórek. Typy komórek w koloniach określa się na podstawie pobierania kolonii i barwienia indywidualnych komórek. .

B. Badanie wobec komórek KG-1. .

Kom^ór^ki KG^-1 /Btaod, ^56/3 (¹⁹80)„7 ^ho^duje sⁱę w ^płynta ^Iscove'a + 10% FCS ^prz^y pasatach 2 raz^y na t^ydztań ^{i p}rzesiewaniu przy ^każdym pa^s_aż^u 2.1⁰^ komóre^k/ml. Do tatania przeznacza się te ' komórki tylko między pasażami 30-35. Badanie prowadzi się w taki sam sposób, jak wyżej opisano w przypadku szpiku kostnego, z tą różnicą, że komórki wysiewa się w mieszaninie z a^garem ^prz^{y 4}.10^ komóre^k/ml.

Określa się ilość kolonii rosnących w każdym dołku i odejmuje ilość stanowiącą tło, jak w badaniu wobec szpiku kostnego, opisanym w powyższej części niniejszego opisu. Stężenie stanowiące jedną jednostkę KG-1 CSF/ml jest to stężenie, które stymuluje do wzrostu połowę maksymalnej ilości (wysycenie) kolonii KG-1. Maksymalną ilość otrzymuje się przy włączeniu do szeregu dołków CSF na poziomie wysycającym.

Stadium ' 3. Konstrukcja wektora p91023/B/.

Wektorem transformacyjnym jest plazmid pAdD26SVpA/3/ opisany przez Kaufmana i wsp. w Mol. Celi Biol., 2/11/, 1304-1319 (1982). Jego strukturę przedstawia Fig. 2. Mówiąc krótko, plazmid ten zawiera cDNA odpowiadający mysiemu genowi reduktazy dwuhydrofolianowej (DHFR) pod transkrypcyjną kontrolą głównego promotora późnego adenowirusa 2 (Ad2). 5* miejsce złożenia znajduje się w DNA adenowirusa, a 3* miejsce założenia, otrzymane z genu immunoglobuliny, znajduje się między głównym promotorem późnym Ad2 i sekwencją kodującą DHFR. Wczesne miejsce poliadenylacji jest obecne w dół od sekwencji kodującej DHFR.

Odcinek pAdD26SVpA/3/ pochodzenia prokariotycznego pochodzi z pSVOd /P. Mellon, V. Parker, Y. Gluzman i T. Maniatis, Celi, 27, 279-288 (1981)7 nie zawiera sekwencji pBR322 znanej z tego, że hamuje replikację w komórkach ssaków /m. Lusky i M. Botchan, Naturę (London), 293,79-81 (1⁹⁸¹)⁷. ^pAdD26S^{VpA/3/ p}rzeksztaica sⁱę w ^plazm^{id p}CVSVL2 jak to ^pokazano na F^ig. ². pAdD26SVpA/3/ przekształca się w plazmid pAdD26SVpA/3/ /d/ przez . usunięcie jednego z dwóch miejsc Pstl w pAdD26SVpA/3/. Dokonuje się tego za pomocą częściowego strawienia przy użyciu Pstl (z zastosowaniem-niedoboru aktywnego enzymu tak, aby otrzymać subpopulację plazmidów liniowych, w których rozszczepione jest tylko jedno miejsce Pstl), działania fragmentem Klenowa, działania ligazą w celu recyrkularyzacji plazmidu, transformacji E. coli i screeningu pod względem delecji miejsca Pstl zlokalizowanego w 3' sekwencji poliadenylacji SV40.

Trójczłonowy lider adenowirusa i wirusowe geny towarzyszące (geny VA) wprowadza się do pAdD26SVpA/3/ /d/ jak to pokazano na Fig. 2. Najpierw rozszczepia się plazmid pAdD26SVpA/3/ /d/ przy użyciu PvuII z utworzeniem liniowej cząsteczki otwartej w części 3' pierwszego z trzech elementów składających się na lider trójczłonovwy· Następnie trawi się pJAW43 /Żain i wsp., Celi, 16, 851 (1979).7 za pomocą Xhol, po czym poddaje się działaniu fragmentu Klenowa, trawi za pomocą PvuII i wyodrębnia fragment o 140 parach zasad, zawierający drugi i część trzeciego lidera, na'drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym /6% w buforze Tris-boran? Maniatis i wsż., wyżej (1982)^. Fragment o 140 parach zasad przyłącza się następnie za pomocą

153 139 ligazy do pAdD26SVpA/3/ /d/ strawionego PvuII. Produktu działania ligazą używa się do transformowania E. coli z nadaniem odporności na tetracyklinę i dokonuje się screeningu kolonii metodą Grunsteina-Hognessa z zastosowaniem sondy znakowanej P, hybrydyzującej z fragmentem o 140 parach zasad. DNA otrzymuje się z pozytywnie hybrydyzujących kolonii w badaniu stwierdzającym, czy został włączony DNA o 140 parach zasad specyficzny dla drugiego i trzeciego z późnych liderów adenowirusa. Przy prawidłowej orientacji miejsc PVuII znajduje się po stronie 5* insertu o 140 parach zasad. Plazmid ten oznaczono na Fig. 2 jako pTPL.

Fragment AvaII D z SV40 zawierający sekwencję wzmacniającą z SV40 otrzymuje się za pomocą strawienia DNA SV40 przy użyciu AvaII, przekształceniu końców w końce tępe działaniem fragmentu Klenowa polimerazy I, przyłączenia (działaniem ligazy) łączników Xhol do fragmentów, strawienia za pomocą Xhol w celu otwarcia miejsca Xhol i wyodrębnienia czwartego największego (D) fragmentu za pomocą elektroforezy w żelu. Fragment przyłącza się następnie działaniem ligazy do pTPL przeciętego Xhol z uzyskaniem plazmidu pCVSVL2-TPL. Orientacja fragmentu SV40 D w pCVSVL2-TPL jest taka, że późny promotor SV40 znajduje się w tej samej orientacji co główny promotor późny adenowirusa.

W celu wprowadzenia wirusowych genów towarzyszących (VA) adenowirusa do pCVSVL2-TPL, najpierw konstruuje się plazmid pBR322, który zawiera fragment Hindlll B adenowirusa typu 2.

DNA adenowirusa typu 2 trawi się za pomocą Hindlll, po czym wyodrębnia się fragment B na drodze elektroforezy w żelu. Fragment ten wprowadza się następnie do pBR322 uprzednio strawionego przy użyciu Hindlll. Po trasnformacji E.coli z nadaniem oporności na ampicylinę rekombinanty poddaje się screeningowi pod względem wprowadzenia fragmentu Hindlll B i określa odwróconą orientację za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi. pBR322-Ad Hindlll B zawiera fragment Hindlll B adenowirusa typu 2 w orientacji przedstawionej na Fig. 3.

Jak to przedstawiono na Fig. 3, geny VA dogodnie otrzymuje się z plazmidu pBR322-Ad Hindlll B za pomocą trawienia przy użyciu Hpal, dodania łącznikąw EcoRl, trawienia z udziałem EcoRl i odzyskania fragmentu o 1,4 kilozasady. Fragment zawierający lepkie końce EcoRl przyłącza się następnie, działaniem ligazy, do miejsca EcoRl w pPTL, uprzednio strawionym za pomocą EcoRl. Po transfromacji E. coli HB101 i selekcji pod względem oporności na tetracyklinę kolonie poddaje się screeningowi na drodze hybrydyzacji na sączku z sondą DNA specyficzną wobec genów VA. Z klonów'pozytywnie hybrydyzujących otrzymuje się DNA i charakteryzuje przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi. Plazmid stanowiący produkt oznacza się jako p91023.

Usuwa się dwa miejsca EcoRl w p11023. p11023 tnie się całkowicie przy użyciu EcoRl, tworząc dwa fragemnty DNA, jeden zawierający około 7 kilozasad i drugi zawierający około 1,3 kilozasady, obejmujący geny VA. Końce obu fragmentów wypełnia się działając fragmentem Klenowa polimerazy I, po czym obydwa fragmenty, to znaczy fragment o 1,3 i fragment o 7 kilozasadach, łączy się ponownie razem działaniem ligazy. Plazmid p11023/A/ zawierający geny VA i podobny do £91023 lecz z usuniętymi dwoma miejscami EcoR I identyfikuje się z wykorzystaniem screeningu Grunsteina-Hognessa z fragmentem genu VA oraz zwykłej analizy miejsc restrykcyjnych.

Następnie usuwa się pojedyncze miejsce Pstl w p11023/A/ i zastępuje je miejscem EcoRl. p11023/A/ tnie się całkowicie za pomocą Pstl, a następnie działa się fragmentem Klenowa polimerazy I w celu utworzenia zrównanych końców. Łączniki EcoRl przyłącza się działaniem ligazy do przekształconego w tępe miejsce Pstl w p11023/A/. Liniowy p11023/A/ z łącznikami EcoRl przyłączonymi do przekształconego w tępe miejsca, Pstl oddziela się od łączników nie przyłączonych i trawi całkowicie za pomocą EcoRl, a następnie ponownie łączy działaniem ligazy. Odzyskuje się plazmid p11023/B/ i identyfikuje się go jako plazmid o strukturze podobnej do struktury p11023/A/, jednakże z miejscem EcoRl usytuowanym w miejscu poprzednio zajmowanym przez Pstl.

Stadium 4. Otrzymywanie zbioru cDNA.

Komórki Mo indukuje się w ciągu 16-20 godzin za pomocą PHA i PMA w celu wzmożenia tworzenia przez nⁱe lw^kiny. ^Komór^ki wysiewa si^ę na ^płyt^ki ^przy ⁵.^⁵ komórek/ml. w ^płynie ^Iscove'a z 20% FSC, 0,3% (obj/obj) PHA i 5 ^ig/ml TPA. Komórki osadza się za pomocą odwirowania. Osad komórek zawiesza się ponownie w 20 ml hipotonicznego buforu litycznego o temperaturze lodu (bufor RSB: 0,01 M Tris-HCL, pH 7,4, 0,01 M KC1, 0,0015 MgCl₂, 1 yug/ml cykloheksimid, 50 jedn/ml RNAzyny i 5 mM dwutiotreitol). Komórkom pozwala się napęcznieć na lodzie w ciągu 5 minut, a następnie rozbija się je mechanicznie 10 posunięciami w ciasno dopasowanym homogeniza153 139 torze szklanym. Homogenat wiruje się przy małej szybkości (2000 obr/min) przy użyciu wirówki Beckman J6 w celu usunięcia jąder i komórek, które nie uległy lizie. Supernatant przetrzymuje się na lodzie podczas, gdy osad jąder zawiesza się ponownie w 10 ml RSB i znowu odwirowuje przy małej szbkości.

Ten drugi supernatant puluje się z pierwszym i połączone supernatanty wiruje przy małej szybkości w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń w postaci jąder i komórek, które nie uległy lizie. Supernatant z tego wirowania doprowadza się za pomocą dodania 2 M KC1 do stężenia 0,15 M KC1, a następnie wiruje przy dużej szbkości (25000 obr/min) z użyciem wirnika Beckman Sw 28, w ciągu 30 minut, w celu osadzenia błon. Osad błon starannie przemywa się zimnym RSB i ponownie zawiesza w 12 ml RSB zawierającego 2 M sacharozę i 0,15 M KC1. W probówkach wirówkowych Beckman SW41 sporządza się nieciągłe gradienty za pomocą nawarstwienia 6 ml zawiesiny błon w 2 M sacharozie na 2 ml RSB z 2,5 M sacharozą i 0,15 M KC1. Probówki napełnia się do szczytu nawarstwiając 2,5 ml RSB zawierającego 1,3 M sacharozę i 0,15 M KC1. Gradienty te poddaje się wirowaniu w ciągu 4 godzin przy 27000 obr/min (Beckman, wirnik SW 41), w tem^pera^turze ⁴°C. ^Wars^twę z błonanri (na ^granic^y faz m^^dzy ^2,0 ^M sac^harozą ^{i 1,}3 M sac^haroz^ą) pobiera się starannie z boku przy użyciu igły o rozmiarze 18 i strzykawki. Frakcje z błonami z 2 probówek z gradientem puluje się i rozcieńcza 1 obojętością wody'destylowanej, po czym doprowadza się do stężenia 0,5% Tritonu Χ-100 i 0,5% dezoksycholanu sodowego, a następnie poddaje ekstrakcji przy użyciu takiej samej objętości fenolu. Warstwę wodną poddaje się ekstrakcji mieszaniną fenolu i chloroformu 1:1 ' i ostatecznie taką samą objętością chloroformu. Ostatecznie, RNA związany z błonami wytrąca się za pomocą dodania NaCl do stężenia 0,25 M, dodania ^2,5 o^bję^to^ścⁱ zimne^go etanol ⁱ całonocnej ⁱn^kubacji w tem^peraturze -²⁰°C.

Wytrącony RNA zbiera się za pomocą odwirowania przy 4000 obr/min w wirówce Beckman J-6,

Q w ciągu 10 minut, a następnie ponownie zawiesza w 1 ml wody destylowanej. Z 2.10 komórek otrzymuje się około 1 mg RNA. Informacyjny RNA (mRNA) wyodrębnia się z całkowitego RNA za pomocą chromatografii na 0,5 ml kolumnie z oligo-dT-celulozą. Krótko, RNA ogrzewa się do tem^peratur^{y 70}°C w cⁱą^gu ⁵ minuty sz^ybko ozi^a na lodz^ i nas^pnie rozcⁱe^ńcza sⁱę ⁵-^krotnⁱe buforem wiążącym o temperaturze pokojowej (0,5 M LiCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002 M EDTA i 0,1 SDS). RNA w buforze wiążącym przeprowadza się przez kolumnę z oligo-dT-celulozą zrównoważoną buforem wiążącym, w temperaturze pokojowej. Kolumnę przemywa się 5 ml buforu wiążącego, a następnie 5 yul 0,15 M LiCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002 M EDTA i 0,1% SDS. W końcu eluuje się mRNA przy użyciu 2 ml 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002 M EDTA i 0,1% SDS. mRNA wytrąca się w rezultacie dodania NaCl do stężenia 0,25 M, dodania 2,5 objętości etanolu i całonocnej ⁱn^kubacjⁱ w tem^peraturze ^-20°C. ^Wytrącon^y mRNA zriera sⁱę za ^pomocą o^dwⁱrowania w wyniku Beckman SW55jprzy 30000 obr/min, w ciągu 30 minut. Z próbówki starannie odsysa się płyn i osad mRNA ponownie zawiesza w 50 ml wody, po czym doprowadza się całość do 0,25 M NaCl. Następnie przeprowadza się ekstrakcję jeden raz mieszaniną fenolu i chloroformu 1:1 i 3 razy chloroformem. mRNA wytrąca się za pomocą dodania 2,5 objętości etanolu. Mieszaninę poddaje się kilkakrotnemu zamrożeniu i rozmrożeniu z użyciem łaźni suchy lód/etanol, po czym wiruje się ją w ciągu 15 minut w wirówce Eppendorfa. Z próbówki starannie odsysa się płyn i osad mRNA ponownie zawiesza w 20 yul wody.

Pierwszą nić cDNA otrzymuje się metodami standardowymi. Mówiąc krótko, 10 yug mRNA błon rozcieńcza się lOO^il mieszaniny reakcyjnej do syntezy cDNA zawierającej 300 mM Tris, pH 8,4, 140 mK KC1, 10 mM MgCl₂, 10 mM yS-merkaptoetanol, 500 yuM dATP, 500 yuM dGTP, 500 yM CTP, 500 yM TTP, ⁵ yu^g oli^go^-dl7^fos^for^ylowane^go, o ^średnj.ej wⁱelkośc^{i 12}-¹⁸ (jaJko ^primera, 5,⁵⁵.¹°⁶^ £^32pJ ^dCTP /l,⁴⁸.¹⁰^ ^Bq/ m^ilimo^l i ²⁰ je^dnoste^k RNAz^yn^y, inhibitora r^onuldeazy. Reakcję inicjuje się dodaniem 100 jednostek odwrotnej transkryptazy i przeprowadza się inkubację w cią^gu ³⁰ mirnrt, w tem^peraturze ⁴²°C. Rea^kcj^ę zatrzymuje s^ię za ^pomocą ^do^dania ^ED^{TA d}o stęże nia ⁴⁰ mM i RNA rozk^ła^da się na drodze in^ku^bacji w cⁱą^gu 20 mhut w temperaturze ⁶5°C w ^0,2 M NaOH. Zasadę zobojętnia się za pomocą dodania 20yl 2 M Tris, pH 7,4. Następnie mieszaninę reakcyjną poddaje się ekstracji mieszaniną fenolu i chloroformu i ponownie poddaje ekstrakcji 50 fil 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE), Fazy wodne puluje się. Pierwszą nić cDNA przepro^wadza sⁱę w dwunicowy cDNA za pomocą ¹²-to goclzinnej ⁱnku^bacjⁱ w temperaturze ¹⁶°C z 4⁰ jedn.

153 139 fragmentu Klenowa polimerazy I w 100 jil mieszaniny reakcyjnej zawierającej 50 mM fosforan potasowy, pH 7,4, 2,3 mM DTT, 2-merkaptoetanol, 10 mM MgCl₂, 150 jjM dATP, 150 pM dGTP.

¹⁵⁰ yM 150 yM TTP i 9^,25.10⁵ BqL³²p3dCTP. Reakcję zatrz^ymuje sⁱą przez e^ks^tra^kcją mie^- szaniną fenolu i chloroformu i nie włączone trifosforany usuwa się za pomocą przeprowadzenia fazy wodnej przez 1 ml kolumną i Sephadex G-50. Wydzielone frakcje puluje sią i wytrąca etanolem.

Osad cDNA przemywa sią zimnym etanolem i zawiesza ponownie w 200 yil 20mzM Tris, pH 8,0, mM EDTA, 80 um S-adenozylometioninie i z 300 jedn. metylazy EcoRI na 60 minut, w temperaturze ³⁷°C. ^Rea^kc^ją zatrzymuje sⁱą ^przez eks^akcją mⁱeszanⁱną ^fen_yo^lu i chloroformuj ^po ^cz^ym zbiera sią metylowany cDNA za pomocą wytrącenia etanolem. Osad cDNA przemywa sią 70% etanolem, zawiesza ponownie w 200 yul buforu'dla SI (Maniatis i wsp.) i inkubuje z 200 jedn. nukleazy SI w cią^gu ³⁰ ndnut, w ^tem^peraturze ³⁰°C. ^Reakcją zatrz^ymuje s^{ią p}rzez ekstrakcj^ą mi^eszanin^ą f^enolu i chloroformu, po czym zbiera sią cDNA za pomocą wytrącenia etanolem.

Końce dwuniciowego cDNA przeprowadza sią w końce tąpe za pomocą inkubacji w 100 yul 20 mM Tris, pH 7,4,50mzM'NaCl, 10 mM 2-merkaptoetanolu i 500 yM dATP, 500 yuM dGTP, 500 yM dCTP,

500 yM dTTP i z 25 jedn. fragmentu Klenowa, w ciągu 30 minut, w temperaturze pokojowej. Reakcją zatrzymuje sią przez ekstrakcją mieszaniną fenolu i chloroformu, po czym zbiera sią cDNA za pomocą wytrącenia etanolem.

cDNA łączy sią działaniem ligazy, w 50 yul buforu dla ligazy T4 (Maniatis i wsp.), z 500 pmolami łączników R1 otrzymanych z New England Biolabs (sekwencja: pCGGAATTCCG) przy użyciu 2000jedn. ligazy T4, przez noc, w temperaturze 16°C. Reakcją zatrzymuje sią przez inkubacją w ci^ągu 20 minut w tem^peraturze 70°C, a nastą^pnie ^do^konuje sią rozcie^ńczenⁱa ^do ^{300 pl t}ak,że ^ko^ń cowe stążenie soli wynosi: 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl^, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4. Nastąpnie trawi si^ą cDNA w cⁱą^gu ² mⁱnu^t w tem^peraturze 37°C ^prz^y zastosowani ⁷⁰⁰ jedn. EcoRI. Reakcj^ą zatrzymuje sią przez ekstrakcją mieszaniną fenolu i chloroformu, po czym zbiera sią cDNA za pomocą wytrącenia etanolem. Osad zawiesza sią ponownie w 50 yul TE i przeprowadza przez 5 ml kolumną C1-4B. Wydzielone frakcje puluje sią i wytrąca etanolem. Wytrącony cDNA poddaje sią elektroforezie w 1% żelu agarozowym w buforze Tris-octan w obecności 1 yg/ml bromku etydyny. cDNA owielkości w zakresie 500 -4000 par zasad wyodrąbnia sią z żelu stosując standardowy sposób postąpowania z użyciem proszku szklanego. Wyeluowany cDNA ekstrahuje sią mieszaniną fenolu i chloroformu, wytrąca etanolem i osad, po przemyciu etanolem, zawiesza ponownie w 50 yul TE. Końcowa wydajność wynosi 100-500 ng cDNA.

W powyższej cząści niniejszego opisu przedstawiono sposób wytwarzania wektora eksperyjnego p91023/B/.500 ng wektora strawionego EcoRI i potraktowanego fosfatazą łączy sią działaniem ligazy ze 100 ng cDNA w 100 jul mieszaniny reakcyjnej (standardowa mieszanina reakcyjna l^igaz^{y T4})^, przez moc, w tem^peraturze 1⁶°C. ^Rea^kcj^ą zatrzymuje si ^przez ekstrakcją miesza niną fenolu i chloroformu, a nastąpnie połączony cDNA zbiera sią za pomocą wytrącenia etanolem po dodaniu 5 yg tRNA jako nośnika.

Wytrącony etanolem DNA przemywa sią 70% etanolem i zawiesza ponownie w 100 yil TE. Tego DNA używa sią w postaci 4 jul próbek ’ do transformowania E. coli MC1061 (4 yil w 100 yul mieszaniny transformacyjnej). Każdą z 25 mieszanin transformujących rozprzestrzenia sią na 150 mm płytce Petri'ego z 1% agarem, bulionem L i tetracykliną w stążeniu 10 yg/ml (płytka Tet) i ikubuje ^przez moc w tem^peraturze ³⁷°C. ^Na ^ka^żdej ^płytce w^yras^ta o^ko^ło ^{2000 k}olonⁱⁱ, co ^daje w całości około 50000 kolonii. Po osiągniąciu średnicy około 0,5 mm kolonie przenosi sią na sączki nitrocelulozowe /137 mm/ za pomocą starannego -umieszczenia suchego sączka na powierzchni płytki, a nastąpnie równego zdjącia sączka. Wszystkie kolonie z płytki zostają przeniesione na sączek, który nastąpnie umieszcza sią (stroną, na której znajdują sią kolonie, do góry) na świeżej płytce Tet. Koloniom pozwala sią wzrastać w ciągu kilku godzin, po czym wykonuje sią po jednej replice z każdego sączka za pomocą umieszczenia świeżego zwilżonego sączka dokłanie na sączku stanowiącym oryginał, ściśniącia ich razem, a nastąpnie rozdzielenia i ponownego umieszczenia każdego sączka na świeżej płytce Tet, po czym nastąpuje inkubacja ^pł^ytek ^przez noc w temperaturze 37°C. Ka^żdą repMką oznacza si starannie ^tak, aby mo^gł^y one być traktowane równolegle z sączkiem-oryginałem.

Stadium 5. Otrzymywanie puli plazmidowego DNA:

153 139

Każdy z 25 .sączków z replikami starannie dzieli się na 8 części przy użyciu skalpelu, z zanotowaniem usytuowania każdego z 8 odcinków w stosunku do oryginalnego sączka wzorcowego.

Z każdego odcinka zdrapuje się kolonie do 10 ml bulionu L. Bakterie zbiera się za pomocą'odwirowania (3000 obr/min) , w wirówce Beckman J-6, w ciągu 10 minut, po czym zawiesza się je ponownie w 0,6 ml 25% sacharozy, 50 mM Tris-Hcl, pH 8,0 i przekształca w protoplastry za pomocą dodania 0,12 ml 5 mg/ml lizozymu i inkubowania na lodzie w ciągu 5-10 minut. Następnie protoplasty inkubuje się w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut:, po czym dodaje 0,125 ml 0,5 M EDTA i przeprowadza się lizę polegającą na dodaniu 0,12 ml 10% SDS w 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Lizat miesza się łagodnie, inkubuje w temperaturze pokojowej w ciągu 15 minut, po czym wytrąca się białko i chromosomalny DNA za pomocą dodania 0,3 ml 5 M NaCl. Po inkubacji na lodzie w ciągu 15 minut lizat wiruje się na wirówce Eppendorfa w ciągu 30 minut,przy oziębianiu. Supernatant ostrożnie oddziela się, z pozostawieniem lepkiego osadu DNA/białko, i rozcieńcza za pomocą dodania 2,5 ml wody. Mieszaninę poddaje się ekstrakcji 1 ml fenolu, warstwy rozdziela za pomocą odwirowania w wirniku Sorvall SS-34 przy 10000 obr/min w ciągu 10 minut i warstwę wodną przenosi się do świeżej probówki. DNA wytrąca się za pomocą dodania 0,5 ml 5 M NaCl i 7,5 ml zimnego etanolu, po czym zamraża się mieszaninę kilkakrotnie przy użyciu łaźni suchy lód/etanol. Osad zbiera się za pomocą odwirowania w wirniku Sovall SS-34, przy 10000 obr/min, w ciągu 15 minut:, a następnie zawiesza w 0,3 ml 0,3 M octanu sodowego i ponownie wytrąca (w probówce Eppendorfa) za pomocą dodania 1 ml etanolu. Po upływie 10-15 minut przetrzymywania w łaźni suchy lód/etanol wytrącony DNA zbiera się przez odwirowanie (5 minut, Eppendorf), po czym osad końcowy zawiesza się ponownie w 100 yul jałowego TE (10mM Tris, pH '8, 1 mM EDTA). Typowa preparatyka pozwala uzyskać 5-10 yug plazmidowego DNA. Każda preparatyka dotyczy DNA z 200-500 kolonii na sączku-oryginale. Ogółem z 25 sączków przygotowuje się 200 próbek DNA.

Stadium 6. Wyodrębnianie klonu CSF.

Każdej próbki DNA ze stadium 5 używa się do oddzielnej transfekcji małpich komórek M6 COS, jako opisano w poniższej części niniejszego opisu.

Komórki M6 hoduje się rutynowo w płynie Eagle*a w modyfikacji Dulbecco'a (DME dostępny z Gibco), zawierającym 10% termicznie inaktywowanej płodowej surowicy cielęcej (HIFCS), dzieląc dwa razy w tygodniu przy rozcieńczeniu 1:6. Po upływie 24 godzin od rozdzielenia 1:6 kop mórki gotowe są do transfekcji. Na 24 godziny przed transfekcją 1,2.10' komórek M6 (rozdzielenie 1:6) przesiewa się do Gell Factory (dostępnej z Nunc) w 1,5 litra DME + 10% HIFCS. Bezpośrednio przed transfekcją płytki aspiruje się i dwukrotnie przemywa 7 ml DME bez surowcy /SF/. DNA rozpuszcza się w 0,1 M Tris (pH 7,3) i dodaje do płynu DME zawierającego 2 mM glutaminę, 100 ^il/ml streptomycyny, 100 jedn/ml penicyliny i 25 mg/ml DEAE Dextran z uzupełnieniem do 4 ml roztworem Tris-DNA. Następnie 4 ml płynu zawierającego rozpuszczony DNA dodaje się do płytki zawierającej komórki M6 COS i prowadzi się inkubację w ciągu 12 godzin.

Po zakończeniu inkubacji, komórki przemywa się 1 raz lub 2 razy 7 ml DME SF. Następnie dodaje się 5 ml DME z 10% HIFCS, 100 jedn./ml penicyliny, 100 yug/ml streptomycyny, 2 mM glutaminą i 0,1 mM chlorochiną i komórki inkubuje się w ciągu 2 1/2 godziny. Po upływie tego czasu przemywa się 1 raz DME SF i dodaje 10 ml DME + 10% HIFCS/płytkę. Po upływie 30 godzin płyny aspiruje się i wprowadza 4 ml DME + 10% HIFCS/ płytkę. Po upływie dalszych 24-26 godzin inkubacji zbiera się przez usunięcie środowiskowo doprowadzone do żądanego stanu.

Doprowadzone do żądanego stanu środowisko z każdej transfekcji bada się pod względem aktywności CSF. Stosuje się tu badanie wobec komórek KG-1. Dla każdej próbki, pozytywnej pod względem aktywności CSF, identyfikuje się klon na oryginalnym sączku wzorcowym odpowiedzialny za aktywność CSF. I tak np., dla jednej transfekcji pozytywnej pod względem aktywności CSF, pobiera się wszystkie kolonie z odcinka oryginalnego sączka wzorcowego, z którego otrzymano próbkę transfekcyjnego DNA. Pewne kolonie, w ilości 320, pobiera się do 3 ml bulionu L+10 yig/ml tetracykliny. Pozwala się na wzrost hodowli przez całą noc i 320 kolonii umieszcza się na matry cy 18x18. Przygotowuje się pule z każdego poziomego rzędu i pionowej kolumny (36 całkowitych pul) , przy czym należy zauważyć, że ostatni poziomy rząd liczy tylko 14 klonów. Próbki DNA sporządza się z każdej spulowanej hodowli i stosuje do transfekcji komórek COS. Supernatanty z tych transfekcji poddaje się badaniu. Stosuje się badanie wobec komórek KG-1. W opisywanej

153 139 grupie transfekcji otrzymuje sie dwa wyniki pozytywne: jeden w pionowej kolumie, drugi w poziomym rzędzie. Hodowla wspólna dla tych pul zawiera klon CSF.

Z powyższej hodowli wyodrębnia się dwanaście indywidualnych klonów i przeprowadza się miniprep. DNA z 10 ml hodowli w bulionie L jak opisano w powyższej części niniejszego opisu.

1 próbki DNA z tych preparatyk trawi się EcoRI i powstałe fragmenty DNA analizuje się metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Dziewięć z dwunastu klonów ma wspólny insert o około 750 parach zasad. DNA z czterech spośród tych lonów i pozostałych trzech klonów wprowadza się do komórek M6 COS jak wyżej opisano. Supernatanty z tych transfekcji bada się pod względem CSF. Stosuje się tu badanie wobec komórek KG-1 jak i wobec komórek szpiku. Wszystkie cztery klony, przy czym każdy z nich zawiera fragment o 750 parach zasad, wykazały ekspresję na wysokim poziomie aktywności CSF w komórkach M6 COS, jak to znaleziono w obu omawianych badaniach, podczas gdy inne trzy klony nie wykazały ekspresji. Tak więc, region kodujący CSF musi być ulokowany w insercie o około 750 parach zasad.

Sekwencję DNA kodującą CSF usuwa się z wektora transformującego w klonie pozytywnym za pomocą strawienia.przy użyciu EcoRI. Zbadania sekwencji dokonuje się standardowymi metodami badania sekwencji (didezoksymetodami) po subklonowaniu fragmentów do wektorów M13, w wyniku czego otrzymuje się sekwencję przedstawioną na Fig. 1. Plazmid p91023/B/ - CSF, który pierwszy wykazywał bezpośrednią ekspresję w komórkach COS oznaczono pCSF-1. Plazmid ten zdeponowano 2 lipca 1984 r. w American Type Culture Collection w szczepie E. coli -MC1061, pod numerem depozytowym ATCC 39754.

Stadium 7. Ekspresja białka CSF.

Małpie komórki M6 COS transformowane wektorem p91023/B/, zawierające CSF/cDNA wyodrębniony sposobem opisanym w powyższym Stadium 6 hoduje się w sposób opisany w powyższym Stadium 6 w celu wytworzenia białka CSF w płynie hodowli.

I tak, 1 mg wspomnianego DNA /pCSF-1/ rozpuszcza się w 1 ml 0,1 M Tris, pH 7,3 po czym dodaje się 600 ml DME zawierającego 2 mM glutaminę, 100 jedn./ml streptomycyny, 100 ug/ml penicyliny /P/S/ i 0,25 mg/ml DEAE Dextran (masa cząsteczkowa 500000, produkcji Pharmacia). 600 ml roztworu DNA/DEAE Dextran dodaje się do komórek M6 COS w Celi Factory, po czym prowadzi się inkubację w 37°C w ciąg^u l² go^ta. Po taJcutacji kom^ór^ki ^przem^ywa sⁱę ¹ raz ⁹⁰⁰ ml DME SF, a następnie inkubuje w ciągu 2 1/2 godziny z 600 ml DME zawierającym 0,1 M chlorochinę, 10% HIFCS, 2 mM glutaminę i P/S. Po zaspirowaniu płynu zawierającego chlorochinę komórki przemywa się DME SF i zasila 1500 ml IME z 10% HIFCS. Po upływie 30 godzin komórki przemywa się DME SF, płyn zastępuje się 800 ml DME SF, po czym komórki po transfekcji pozostawia się na 24 godziny w tem^peraturze ³7°C w ceta ^do^prowa^dzenia ^śro^dowis^ka ^do żądnego stanu. Do^prowadzone do żą^dane go stanu środowisko aspiruje się i zastępuje nową porcją DME SF, o objętości 800 ml. Następnie komórki pozostawia się na 24 godziny w celu doprowadzenia środowiska do pożądanego stanu, po czym środowisko to zbiera się. Po zebraniu, tak szybko jak to tylko jest możliwe, próbkę środowisk doprowadzonych do żądanego stanu zagęszcza się 20-krotnie na drodze ultrafiltracji pod ciśnieniem, z zastosowaniem 2,5 litrowej komory Amicon z membraną YM5 (przerwanie przy masie cząsteczkowej 5000).

Stadium 8. Oczyszczanie rekombinantowego CSF.

200 ml zatężonego środowiska doprowadzonego do żądanego stanu (z 4 listrów materiału wyjściowego - Stadium 7) doprowadza się siarczanem amonowym do 30% nasycenia za pomocą dodania stałego siarczanu amonowego, po czym wytrącone białko usuwa się przez odwirowanie. Supernatant doprowadza się siarczanem amonowym do 80% nasycenia za pomocą dodania większej ilości stałego siarczanu . amonowego. Wytrócone białko zbiera 'się za pomocą odwirowania. Osad zawiesza się ponownie w 5 ml 20 mM cytrynianu sodowego. pH 6,1, zawierającego 1 mM NaCl. Rozpuszczone białko nanosi się na kolumnę (1,6 x 100 cm) z Ultrogel AcA 54 zrównoważoną tym samym buforem. Substancja o aktywności CSF eluowana jest z kolumny z pozorną masą.cząsteczkową 19 kilodaltonów, lub po około 90 ml. Obserwuje się, że jeżeli sączenia molekularnego dokonuje się przy niskim stężeniu soli, substancja o aktywności CSF eluowana jest z kolumny w dwóch pozycjach, z pozorną masą cząsteczkową około 19 kilodaltonów i 38.kilodaltonów, co sugeruje, że GM-CSF może z łatwością tworzyć dimery. Aktywne frakcje puluje się i doprowadza do stężenia 0,15% TFA

153 139 (za pomocą dodania 10% TFA), oraz nanosi na kolumnę (0,46 x 25 cm) z Vydac C4, zrównoważoną 0,1% TFA. Kolumnę rozwija się liniowym gradientem 0-90% acetonitrylu (lml/min, 340 ml ogółem) w 0,1% TFA.

Substancja o aktywności CSF eluowana jest między 39 a 43% acetonitrylu (frakcje 16-20).

ul próbkę frakcji 19 analizuje się za pomocą elektrofrezy w żelu poliakryloamidowym w obecnośc^{i SDS} /1^3,5% ^żel, ja^{k t}o opisa^ł Lammli., Naturę, ²²⁷ (l⁹⁷⁰)/. O^bserwuje się pojed^yncze szerokie pasmo białkowe z pozorną masą cząsteczkową 18-26 kilodaltonów. Ten raczej szeroki zazkres wielkości CSF stanowi zwyczajną właściwość glikoprotein i przyjmuje się, że jest on odbiciem ekstensywnego, tym niemniej zmiennego, uzupełnienia węglowodanami. Białko z frakcji 19 poddaje się degradacji Edmana z zastosowaniem mikrosekwentatora fazy gazowej Applied Biosystems. Przy użyciu około 20 jug nałożonego białka otrzymuje się sekwencję pierwszych 16 aminokwasów /A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H^ Wysoka wydajność tej* pojedyńczej sekwencji białkowej stanowi mocną sugestię, że białko CSF we frakcji 19 jest oczyszczone do stanu homogeniczności. Badanie bioiogiczne wy^kazuje we ^fra^kcji ¹⁹ ^¹°⁷ je^dnoste^k na jednostkę Α₂θθ (absorbancji). Ponⁱeważ typowe białka w roztworze wodnym wykazują współczynnik absorpcji w zakresie 0,8-1,2 A2gg/mg ^bia^łka, a^ktywno^ść wła^ścⁱwa ocz^yszczone^go CSF znajduje s^ię w zakresie od oko^ło 1.^{10 7} do oko^ło 4.¹°⁷ je^dn^/m^{g p}rz^y badanⁱu z zastosowaniem ba^dania wo^bec ^ludz^kich komóre^k sz^piku ^kostne^go.

Przykład II. Klonowanie CSF gibona.

Stadium 1. Otrzymywanie mRNA z komórek T gibona.

Próbkę linii komórek T gibona oznaczonych UCD-MLA 144 hoduje się.w ciągu kilku tygodni w

RPMI 1640 (Otrzymanym z Gibco) i 20% płodowej surowicy cielęcej /FSC/, aż do uzyskania ogółem g

1.10 komórek. Komórki indukuje się w celu osiągnięcia wysokiego poziomu CSF za pomocą aktywacji w ciągu 24 godzin w obecności 10 ng/ml 13-octanu 12-0-tetradekanoiloforbolu /TPA/ w RPMI 1640+1% FCS. Komórki zbiera się za pomocą odwirowania (1000 obr/min) w ciągu 5 minut, po czym przemywa 1 raz buforowanym fosforanami roztworem roli /PBS/ i w końcu zbiera się je za pomocą odwirowania. mRNA polisomów związanych z błonami /MBP/ otrzymuje się z tych komórek stosując taki sam sposób postępowania jaki opisano w powyższym przykładzie I, w celu otrzymania RNA z komórek Mo.

Stadium 2. Reakcja otrzymywania pierwszej nici cDNA.

^ig mRNA/MBP rozcieńcza się 50 yul mieszaniny reakcyjnej do syntezy cDNA (patrz przykład I, Stadium 4), po czym inicjuje się reakcją za pomocą dodania odwrotnej transkryptazy. Po inkubacjⁱ w ciągu ³0 minut w ^temperaturze ⁴²°C reakcję zatrz^ymuje sⁱę ^przez ^do^danⁱe ^EDTA do stę żenia 50mM i rozcieńczenie wodą do 100 ^il. Mieszaninę ekstrahuje się mieszaniną fenolu i chloroformu, po czym dalej ekstrahuje się chloroformem. Hybrydy cDNA/RNA oddziela się od trifosforanów, które nie zostały włączone, z wykorzystaniem chromatografii na 2 ml kolumnie z Sepharose CL-4B. Wydzielone frakcje puluje się i zbiera się hybrydy za pomocą wytrącenia etanolem.

Wydajność końcowa wynosi 570 ng.

Stadium 3. Reakcja otrzymywania drugiej nici cDNA.

Osad pierwszej nici cDNA (Stadium 2) zawiesza się ponownie w 50 ,^il wody i przeprowadza się syntezę drugiej nici w standardowej mieszaninie reakcyjnej z polimerazą I E. coli, ligazą i RNaz^ą H. Mⁱeszaninę rea^kc^yjną ⁱn^ku^buje się ^przez noc w UmperaUrze ¹⁶°C, a nas^tępnⁱe w cią^gu ^godzⁱn^y w temperaturze ³⁷°C. ^Reakcję zatrzymuje sⁱę ^przez ^dodanⁱe EDTA, ^po czym dokonuje się ekstrakcji mieszaniną fenolu i chloroformu. cDNA oddziela się od trifosforanów , które nie zostały włączone, za pomocą chromatografii na kolumnie z Sepharose CL-4B. Wydzielone frakcje puluje się, po czym zbiera się cDNA za pomocą wytrącenia etanolem.

Stadium 4. Otrzymywanie rekombinantowego cDNA.

Osad cDNA (ze Stadium 3) zawiesza się ponownie w 75 jal wody. Homopolimeryczne C ogony dołącza się do końców cDNA za pomocą dodania 10 jil roztworu cDNA do 25 /ii standardowej mieszanⁱn^y reakcyjnej z termina^lną ^trans^ferazą^, a nastę^pnie ⁱnku^bowanⁱa w tem^peraturze 30°C w cⁱą^gu 5 minut. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie EDTA do stężenia 40 mM i termiczną, inaktywację w ^tem^peraturze ⁶⁸°C w cⁱą^gu ¹⁰ m^ut. ^{- 10} n^{g t}e^go ogonowanego cDNA ^łącz^y s^ię z ⁵⁰ n^g G-o^gonowanego pBR322 (otrzymanego z NEN) w 10 ^il 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA i 100 mM NaCl. Mieszaninę rea^kc^yjn^ą do rea^kcjⁱ łączeni ⁱn^ku^buje się w ciągu ¹⁰ mⁱnut. w tem^peraturze 6⁸°C, a następnie

153 139 w ciągu 2 godzin w temperaturze 57°C.

Stadium 5. Transformacja bakteryjna.

E. coli szczep MC1061 hoduje sie w bulionie L, oziębia na lodzie, zbiera sie za pomocą odwirowania i poddaje działaniu CaC^ w celu'przygotowania bakterii do transformacji. Następnie 200 yul zawiesiny bakterii poddanych działaniu CaC^ inkubuje sie z 5 ul mieszaniny reakcyjnej do reakcji łączenia. Przeprowadza sie 15 takich transformacji, przy czym zużywa sie cały połączony cDNA i rozprzestrzenia na 15 cm płytkach z 1% agarem na buforze L zawierającym 10 /ig/ml tetracykliny. Na każdej płytce wyrasta około 1000 kolonii.

Stadium 6. Tworzenie replik.

Każdą z 10000 kolonii pochodzących z transformacji pobiera sie przy użyciu igły dentystycznej, przenosi na świeże płytki (po 500 na płytkę w postaci krzyżujących sie linii), po czym ^prowa^dzi się tedow]^ ^przez mo^ w tem^peraterze ³⁷°C. ^Na^stępnie ^ko^lonie ^po^dnosⁱ ste' z pł^yt^ki za pomocą przyciśnięcia suchego sączka nitrocelulozowego przylegającego ściśle do powierzchni płytki. Z _;każdego takiego sączka wzorcowego sporządza sie dwa sączki z replikami. Sączki wzorcowe ^przechowuje ste w temperaturze 4°^ a sączki, z rep^kand tra^ktuje zasadą ^{i p}o^ddaje ^dztete niu ciepła w celu przygotowania ich do hybrydyzacji.

Stadium 7. Przygotowanie sond do hybrydyzacji znakowanych 32p.

cDNA insertu z pCSF-1 wyodrębnia sie za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym EcoRI i elektroforezy w żelu agarozowym z Tris-octan i bromkiem etydyny. Pasmo zawierające fragment cDNA wycina sie z żelu i oczyszcza metodą z użyciem proszku szklanego. Następnie dodaje sie 300 ng fragmentu cDNA do 1 pal 10 x buforu dla polimerazy DNA T4 (0,33 M Tris-octan, pH 7,9,

0,66 M octan potasowy, 0,1 M octan magnezowy i 10 mM dwutiotreitol) oraz 3 jednostek polimerazy DNA T4 (New Engeland ' Biolabs), a następnie rozcieńcza sie wodą do objętości 10 yul. Po ⁱn^kubacjⁱ w temperaturze ³⁷°C w cią^gu ⁵ mteut mieszanteę ^te ^łącz^y ste z ¹yul ¹⁰ x ^bu^foru ^dla polimerazy DNA T4, 1 /ul 2 mM roztworu dCTP, 1 yul 2 mM roztworu dTTP, 1 /ul 2 mM roztworu dGTP, ¹⁰ yu^{] u32}p7 dA^{TP U3,}7.^105Bq^u yu^{1, 1,11.1}0^/4 Bq ^/m^ilimo^{lu i 3} je^osteamd ^po^limeraz^y D^NA Tr. Mteszaninę rea^kc^yjną in^kubuje sie w cią^gu ²⁰ minut w tem^peraturze 3⁷°C. Nast^ępnie dodaje ste ¹ yu^{1 2} mM dAIP, ^po czym mteszanteę reatoyjną ⁱn^ku^buje sie w tem^peraturze 3*7°C ^do^dat^kowo jeszcze w ciągu 10 minut.

Nie włączone trifosforany oddziela sie od znakowanego cDNA na drodze chromatografii na kolumnie z Sephadex'G100. Drugą sondę przygotowuje sie z syntetycznego oligonukleotydu o sekwencji: ATC TGG CTG CAC AG, która jest komplementarna do regionu kodującego aminowy koniec CSF.

Oligonukleotyd ten znakuje sie P na jego końcu 3 za ’ pomocą standardowej reakcji z udziałem kinazy polinukleotydowej.

Stadium 8. Wyodrębnianie klonów CSF cDNA.

Zgodnie ze standardową metodą screeningu hybrydyzacyjnego, jakieś 45 klonów hybrydyzuje ze zrakowanym za pomocą T4 cDNA pCSF-1. Z klonów tych około 20 hybrydyzuje także ze znakowaną sondą oligonukleotydową. Region kodujący jednego z nich poddaje sie analizie sekwencji i dane dotyczące sekwencji ujawniają pewną ilość podstawień zasad, z których pewne powodują zmianę aminokwasu w białku ulegającym ekspresji. Różnice te przedstawione są na Fig. 1, powyżej sekwencji DNA dla ludzkiego genu klonowanego jak w przykładzie I.

Przykład III. Klonowanie CSF w oparciu o mRNA z limfocytów krwi obwodowej.

Stadium 1. Otrzymywanie mRNA z limfocytów krwi obwodowej.

Limfocyty krwi obwodowej UPBLU przygotowuje sie z czterech produktów ubocznych plazmaferezy (otrzymanych z Czerwonego Krzyża) za pomocą frakcjonowania w gradiencie Ficoll-Hypaque. Stosuje sie niską gęstość w RPMI-1640 w obecności 5% płodowej surowicy cielącej 0,17% fito^hemag^lu^tyniny i ¹⁰ ng^^{1 12-}miryst^ynⁱanu ¹³-octanu ^for^bote UPMAU przy ^gęstości 2^0^{6 k}om^órekU ^um^] (ogóJ^m o-trzymuje sie ^6.109 ko^rek). ^Kom^ór^ki z^biera sie za pomoc^ą ' odwirowania w cte^gu 5 minut przy 100 obr/min, po czym przemywa 1 raz roztworem soli buforowanym fosforanami UPBSU i w końcu zbiera za pomocą odwirowania. Cytoplazmatyczny RNA otrzymuje sie sposobem postępowania polegającym na łagodnej lizie, przy ' czym komórki zawiesza sie ponownie w 50 ml zimnego buforu do lizy zawierającego ' Triton /140mM NaCl, 1,5 mM MgC^, lOmM Tris, PH 8,6, 0,5% Triton Χ-100/ z lOm M dwutiotreitolem /DTT/ i 50 jedn/ml RNAzyny (otrzymanej z Biotec)· Otrzymany

153 139 lizat dzieli się na 2 równe części i każdą z nich nawarstwia się na 10 ml buforu do lizy stanowiącego warstwę amortyzującą, zawierającą 20% sacharozy. Jądra komórek usuwa się za pomocą odwirowanta w nis^kie^j tamperatarze ^/4°C^ ^przy ⁴⁰⁰ otir/ndn, w cⁱą^gu ⁵ ndnut. Warstw^{ę g}órn^ą (ekstrakt cytoplazmatyczny) oddziela sie ostrożnie, po czym dodaje sie siarczan sodowo-dodecylowy /SDS/ do końcowego stężenia 1%. Otrzymany roztwór poddaje sie 2 razy ekstrakcji równą objętością mieszaniny fenolu i chloroformu 1:1 i RNA wytrąca sie za pomocą dodania 2,5 objętości zimnego, etanolu. Wytrącony RNA zbiera sie za pomocą odwirowania przy 4000 obr/min, w ciągu 15 minut i ponownie zawiesza w 0,01 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,25 M NaCl /bufor TE + 0,25 M NaCl/ i ponownie wytrąca za pomocą dodania 2,5 objętości zimnego etanolu. W końcu, RNA zbiera sie za pomocą odwirowania i ponownie zawiesza w 5 ml wody. Końcowa wydajność wynosi 7,5 mg.

Informacyjny RNA wyodrębnia sie z całkowitego RNA cytoplazmatycznego za pomocą selekcji na ^olig^o-dT-celulo^zie. ^{2,5 m}g ^łtowitago ^RNA ogrzewa sⁱe do· tempera^tur^y 65°^C przez 5 minut. Dodaje sie NaCl do stężenia 0,5 M i pozwala na ochłodzenie sie RNA do temperatury pokojowej. Otrzymany RNA przeprowadza sie przez 1 ml kolumnę z oligo-dT-celulozą zrównoważoną TE + 0,5 m NaCl. RNA, który nie uległ związaniu, usuwa sie za pomocą ekstensywnego przemycia kolumny buforem wiążącym. Informacyjny RNA związany eluuje sie 3 ml wody i wytrąca za pomocą dodania 0,2 ml 4 M NaCl i 2,5 objętości zimnego etanolu. Wytrącony mRNA zbiera sie za pomocą odwirowania.(30 minut, 25000 obr/min). Końcowy osad, w ilości 100 pg, zawiesza sie ponownie w 50 pl wody.

Stadium 2. Reakcja otrzymywania pierwszej nici cDNA.

yug mRNA z PBL rozcieńcza sie do objętości 50 ^ul mieszaniną do syntezy cDNA zawierającą 100 mM Tris, pH 8,4, 140mM KC1, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-męrkaptoętanol, 400 ^iM dATP, 400 ^uM dGTP, ⁴⁰⁰ ^04 ^{dCTp , 400} yuM ^dTTp, ⁵ yug o^ligo^-dT (średnia wielko^ K-¹⁸) ja^ko 9^,25.10⁵ Bq [^Pj ^{dCTp /1,48}.l⁰^^5Bq^/mi^lim^o^{l/ i 20} jednostak RNA-z^yny, in^hibitora rybonuktaazy. Reakcj^e inⁱcjuje sie za pomocą dotanta ⁶⁰ jednos^te^k obrotnej ^trans^kr^yptaz^y w temperaturze 3⁷°C i takutacje ^prowa^dzi sⁱe w ciągu ³⁰ ndnut . w tampraturze ⁴²°C. Reakcj^e zatrz^ymuje sⁱe przez dodanie EDTA do stężenia 40 mM i ekstrakcje taką samą objętością fenolu nasyconego wodą. Fazę fenolową poddaje sie ekstrakcji 50 ^ul buforu TE. Fazy wodne puluje sie. Hybrydy cDNA/RNA oddziela sie od nie włączonych trifosforanów za pomocą przeprowadzenia spulowanej fazy wodnej przez 5 ml kolumnę z Sepharose C1-4B (otrzymano z Sigma), zrównoważoną TE. Frakcje wydzielone z kolumny puluje sie, doprowadza do 250 mM NaCl i wytrąca sie kwasy nukleinowe za pomocą dodania 2,5 objętości zimnego etanolu. Hybrydy zbiera sie za pomocą odwirowania przy 40000 obr/min, w ciągu 30 minut. Końcowy osad, w ilości 2,5 yug cDNA. zawiesza sie ponownie w 50 jul wody.

Stadium 3. Reakcja otrzymywania drugiej nici cDNA.

Drugą nić cDNA syntetyzuje sie z wykorzystaniem połączonego działania enzymów: polimerazy DNA I E. coli, ligazy DNA E. coli, RNAazy Η E. coli. Mieszanina reakcyjna /50 ^ul/ zawiera 20 mM Tris, pH 8,0, 4 mM MgC^, 1,2 mM EDTA, 25 /M NAD, 100 ^UM dATP, 100 yuM dCTP, 100 ,ρΜ dGCP i 100 yuM TTP^, oraz 1,⁸⁵.¹⁰⁶^ ^f32P/ dC^TP /^1,11.¹0^14Bq/m^ilimol^/. Rea^kcje ^prowadzi. sⁱe ^prz^y dodaniu 3 jednostek polimerazy DNA I, 0,5 jednostki ligazy DNA i 0,75 jednostki RNAazy H, przy czym inku^bacje ^prowa^dzi sⁱe w cⁱą^gu ^{18 g}odzⁱn w temperaturze ¹⁶°C, a nast^ępnⁱe w cⁱą^gu ^go^dzⁱn^y w temperatorze ³⁷°C. Nastapnie rea^kcje za^trz^ymuje sie przez ^do^danie EDTA ^do st^ężenⁱa ⁴⁰ mM, po cz^ym ^dokonuje sie ekstrakcji fenolem użytym w równej objętości. Fazę fenolową ekstrahuje sie ponownie 50 yil TE, a następnie fazy wodne puluje sie i oddziela cDNA od nie włączonych trifosforanów za pomocą chromatografii na kolumnie z Sepharose CL-4B, jak to wyżej przedstawiono odnośnie do 32 pierwszej nici. Na podstawie włączenia P stwierdza sie, że pierwsza nić cDNA została całkowicie przeprowadzona w postać dwuniciową.

Stadium 4. Wytwarzanie rekombinantowego cDNA.

Homopolimeryczne C ogony dołącza sie do końców cDNA za pomocą łagodnego ogrzewania 400 ng cDNA w 50 yul mieszaniny rekacyjnej, zawierającej 1 mM 2-merkaptoetanol, 1 mM CoC^ i 9 jednostek ^termin^aln^ej ta^f^azy dezoksynukleotydylowej, w tamperatarze ³⁰°^ w cⁱą^gu 5 minu. ^Rea^kcje zatrzymuje s^ie za pomocą dotania EDIA do stożento ⁴⁰ m^{M i} ogrzewanta w tem^peraturze ⁶⁸°C w~ cⁱągu 10 minut. 200 ng tego ognonowego cDNA łączy sie z 500 ng G-ogonowanego pAT153 (otrzymanego z Amersham) w 100 yul 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA i 100 mM NaCl. Reakcje łączenia prowadzi sie, ^po ^preⁱnkubacjⁱ prowadzonej w temperaterze ⁶⁸°C w cⁱą^gu ⁵ mⁱnut^{, p}rzez ^{2 g}odzⁱny^, w ton^eratorze 57°C.

153 139

Stadium 5. Transformacja bakteryjna.

Produktu reakcji łączenia cDNA używa sie bezpośrednio do transformowania E. coli szczep MC1061. Świeżej kolonii komórek bakteryjnych używa się do inokulowania 50 ml ·bulionu L, po czym hodowle prowadzi się w ciągu kilku godzin, aż do osiągnięcia gęstości optycznej wynoszącej 0,25 przy 550. nm. Komórki oziębia sie na lodzie i zbiera za pomocą odwirowania przy 2000 obr/min, w ciągu 10 minut. Osad zawiesza sie ponownie w 10 ml zimnego 0,1 M CaCl? i pozostawia na lodzie do sedymentacji w ciągu 10 minut. Komórki zbiera sie za pomocą odwirowania przy 2000 obr/min, w ciągu 5 minut i ponownie zawiesza w 2,5 ml 0,1 M CaCj.lO yul mieszaniny reakcyjnej z reakcji łączenia cDNA inkubuje sie z 200 ul zawiesiny bakterii uprzednio poddanych działaniu CaCJ^, w c^iągu ³⁰ minut na lodzi, ^po czym w cią^gu ² minu^t w tom^raturze ³⁷°C, a następni dodaje sie 0,8 ml bulionu L i przeprowadza końcową inkubacje w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C.

Przeprowadza sie 20 takich transformacji, zużywając cały połączony cDNA. Każdą z mieszanin transformacyjnych rozprzestrzenia sie na płytkach (o średnicy 15 cm) z 1% agarem na bulionie L zawierającym 10 yig/ml tetracykliny. Z dwudziestu transformacji otrzymuje sie w sumie 20 takich płytek, na których rozprowadza sie materiał i inkubuje sie je przez noc w temperaturze 37°C. Na każdej ^płytce wyrasta ^średnio otoi 1⁵⁰° kolonii, łączni ³°000 ^klon^ów.

Stadium 6. Tworzenie replik.

Kolonie-oryginały rosnące na każdej płytce przenosi sie na 137 mm sączki nitrocelulozowe za pomocą przyciśnięcie suchego sączka do górnych części kolonii i podniesienia kolonii z płytki. Z-Tkaźdego sączka-oryginału wykonuje sie dwie identyczne repliki standadowymi metodami two rżenia replik, z których każdy sączek-oryginał starannie nakłada sie, stroną z koloniami do góry, na jałowy wycięty z bibuły (Whatman 3 MM) kwadrat, leżący na kwadratowym kawałku szkła. Nowy, uprzednio nawilżony sączek nitrocelulozowy układa sie ostrożnie na wierzchu sączka wzorcowego i przykrywa drugim jałowym kwadratem z bibuły, po czym tak utworzony kompletny przekładaniec ściska sie silnie drugim kawałkiem szkła. Poprzekładane tak sączki numeruje sie, po czym·przekłuwa szpilką asymetrycznie w trzech miejscach, tak aby w przyszłości można by je ponownie ułożyć na sobie w sposób dokładny. Następnie oddziela sie replikę od wzorca i ukfąda- ·'Stroną z koloniami do góry na nowej płytce z agarem na bulionie L zawierającym tetracyklln;;*W ten sam sposób przygotowuje sie bezzwłocznie drugą repliką. Każdy sączek wzorcowy Jdateie •sⁱe z ^powrotem na pł^ytkę ⁱ wsz^ys^tkie ^płyt^ki i^toje si w temperahrze ³⁷°C w cią^gu kilku godzin, aż do osiągnięcia przez kolonie bakteryjne średnicy około 1 mm. Sączki wzorcowe stanowiące or^ygina^ły ^przechowuje sie w ^tem^peraturze 4°^ a re^{pliki p}rz^ygo^towuje si ^do ^hybr^ydyzacji w sposób przedstawiony w poniższej części niniejszego opisu.

Stadium 7. Przygotowanie sączków do hybrydyzacji.

Każdy sączek-replike (Stadium 6) kładzie sie, stroną z koloniami do góry, na bibule (Whatman 3 MM) namoczonej w 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, na 7 minut. Sączki przenosi sie na zobojętniające kawałki bibuły, namoczone w 1 M Tris, pH 7,5 M NaCl, na 2 minuty, a następnie przenosi na drugi zestaw sączków zobojętniających na 5-10 minut. W końcu sączki umieszcza się na sączkach namoczonych w buforze SSC /0,015 M cytrynian sodowy, 0,15 M NaCl, pH 7,4/ na 5 minut suszy na powietrzu i poddaje działaniu ciepła, pod obniżonym ciśnieniem, w temperaturze ⁸0°C w cigu ¹-^{2 g}o^dzj.n.

Stadium 8. Wyodrębnianie klonów CSF/cDNA.

Podwójne sączki bada się z zastosowaniem, jako sondy, insertu stanowiącego promieniotwórczo znakowany pCSF-1 cDNA, przygotowany jak powyżej opisano w przykładzie II. Jakieś 20 kolonii hybrydyzuje z cDNA. Dwanaście z tych kolonii* pobiera się z sączka wzorcowego i hoduje przez noc w bulionie L w celu dalszej analizy. Próbki DNA (szybka prep.) z tych klonów strawione enzymem restrykcyjnym /Pstl/ wskazują, że 3 z nich są bliskie pełnej długości. Jedną z nich poddaje się analizie sekwencji. Sekwencja regionu kodującego tego klonu jest identyczna z odpowiadającą sekwencją pCSFl (to jest zawierającą T w pozycji 365- /ile/ CSF).

Przykład. IV. Oczyszczanie CSF z linii komórek Mo.

Doprowadzone do żądanego stanu środowisko Mo (bez surowicy) w ilości 40 litrów inkubuje się w ^tem^peraturze ⁵⁵°C w cią^gu ³⁰ nin^ w celu zⁱnaktywowanⁱa HTLV-II, wkusa towarz^yszące^go

153 139 tej linii komórkowej. Środowisko to zagęszcza się za pomocą ultrafiltracji pod ciśnieniem, z użyciem PeJ-Ucon Casette z membraną PTGC /^13,935 ^dcm^^/ (przerwanta ^prz^y masta cząsteczkowej 10000). Białko zagęszcza się dalej za pomocą wytrącenia siarczanem amonowym (80% nasycenia). Końcowy osad białkowy w ilości 800 . mg zawiesza się ponownie w 20 mM chlorowodorku trój/hydroksymetylo/-aminometanu /Tris-HCl/, pH 7,4, po czym dializuje wobec tego samego buforu (trzykrotnie, za każdym razem zmieniając 4 litry buforu)· Dializowane białko nanosi się na kolumnę /2,5 x 10 cm 'z DEAE (dwuetyloamino-etylo) -utrogel, zrównoważoną tym samym buforem. Kolumnę przemywa się 800 ml 20m M Tris-HCl, pH 7,4, eluując następnie substancję wykazującą aktywność CSF przy użyciu 800 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, zawierającego 0,12 M NaCl. zbiera się 10 ml frakcj i i bada je pod względem CSF.

Frakcje aktywne (3) puluje się i sześciokrotnie zatąża (do 5 ml) z zastosowaniem ultrafiltracji pod ciśnieniem (membrana Amicon YM5) (przerwanie przy masie cząsteczkowej 5000) . Zatężoną próbkę z kolumny DEAE nanosi się na kolumnę /1,6 x 100 cm/ z AcA44 ultrogel ' (akryloamidowoagarozowy ultrogel, frakcjonowanie 10-130 kilodltonąw) zrównoważoną 20 mM kwasem N-2-hydroksyetylopiperazyno-N- 2-etanosulfonowym /HEPES/, pH 7,4, 50 mM NaCl i 0,01% glikolem polietylenowym /PEG-8000/, Substancję wykazującą aktywność CSF eluuje się z kolumny z pozorną masą cząsteczkową 30 kilodaltonów. Frakcje aktywne puluje się, po czym doprowadza się za pomocą dodania 10% kwasu trójfluorooctowego (TFA) do stężenia 0,15% (obj/obj) TFA, po czym nanosi na kolumnę /1 x 25 cm/ Vydac C4 z odwróconymi fazami· Kolumnę rozwija się liniowym gradientem acetonitrylu 0-90% w 0,1% TFA (obj/obj) przy 4 ml/min (ogółem 1000 ml). Substancję wykazującą aktywność CSF eluuje się z kolumny przy około 47% (obj/obj) acetonitrylu. Spulowane frakcje aktywne doprowadza się, za pomocą dodania połowy objętości 0,15% (obj/obj) -kwasu siedmiofluoromasłowego /HFBA/, do stężenia 0,05% (obj/obj) HFBA, po czym nanosi na kolumnę Vyd£c C4 /o,46 x 25 cm/ zrównoważoną 0,15% (obj/obj) HFBA. Kolumnę rozwija się liniowym gradientem acetonitrylu 0-90% (obj/obj) w 0,15% (obj/obj) HFBA przy 1 ml/min (ogółem 340 ml). Substancję wykazującą aktywność CSF eluuje się przy 53% (obj/obj) acetonitrylu. Stwierdza się, że 1 ml frakcje 37-44 są aktywne. 0,15 ml frakcji 40 zatęża się czterokrotnie (przy użyciu SAVANT Speed Vac Concentrator), po czym dodaje się 40 fil x buforu SDS do próbki żelowej /0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% gliceryna i 0,004% błękit bromofenolowy/. Próbki te gotuje się w ciągu 2 minut, po czym nanosi na SDS-żel /13,5#, U, Lammli, Naturę, 227, 680(1970)7 /patrz Fig. 2/. Frakcja nr 40 wykazuje, jak oznaczono, 110000 szpikowych jednostek CSF/ml, Od^powiada to ^3,0.10? jednos^tek^/jednos^tkę M^orbancja/. ^Pontawa^{ż typ}owe btałta mają ws^pół- czynnika i absorpcji mieszczące się w zakresie 0,8-12A28_Qjedn/mg, aktywność właściwa oczyszczone^go CSF znajduje sta w zakresie od o^koło l^,10^{7 d}o otota ⁴.¹0^/ je^dn^/m^g w ^badanta wobec tonórek szpiku kostnego. 1 ug próbkę oczyszczonego GM-CSF poddaje się degradacji Edmana z zastosowaniem mikrosekwentatora fazy gazowej Applied Biosystems. Sekwencja reszt 3-5 stanowi, jak oznaczono, Ala-Arg-Ser.

Przykład V. W celu kotransformacji i amplifikacji sekwencji CSF w komórkach CHO, plazmid p91023/B/-CSF wprowadza się 'do komórek CHO defektywnych pod względem DHFR, DUKX-B11 /Chasin i Urlaub, PNAS, 77, 4216 (1980)7, na drodze fuzji protoplastów, sposobem opisanym przez Sandri-Goldin'a i wsp., Mol. Celi. ' Bio,. 1, 743-752 (1981), Wzrost i sposób utrzymywania 'komórek opisany został przez Kaufmana i Sharpa w J. Mol Bio,150, 601-621 (1981). W celu fuzji protoplastów, p91023/B/-CSF-l wprowadza się do E. coli HB101 i prowadzi się hodowlę bakterii w 50 ml soli m9 zawierających: 0,5% casamino acids, 0,4% glukozy,0,012% MgSO4, 5 ^ig/ml tiaminy i 10 ^g/ml tetracykliny do osiągnięcia absorbancji (przy 600 nm) 0,6, Następnie dodaje się chloramfentaol. ^do stężenta ²⁵⁰ ^g/m^1, po czym tofowdę inku^buje sta w ^tem^pera^turze ³⁷°C w ctagu ^do^datkowych 16, w celu amplifikacji ilości kopii plazmidu. Komórki wiruje się przy 3000 x g w ciągu ¹⁰ mtaut w tem^peraturze ⁴°C\ przy czym zaw^sza w ^2,5 m¹ oc^hłoclzonej ²0% sacharozy ^{i 50} m^M Tris-HCl o pH 8,0, Następnie dodaje się 0,5 ml roztworu lizozymu (5 mg/ml, w 0,25 M Tris-HCl, pH 8,0) i otrzymaną mieszaninę przetrzymuje się na lodzie w ciągu 5 minut. Następnie dodaje się 1 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0 z dodatkowym przetrzymaniem na lodzie w ciągu 5 minut, po czym powoli dodaje się 1,0 ml 0,05 M Tris-HcL, pH 8,0.

Otrz^ymaną zawtesi-nę takubuje sta w cta^gu ¹⁵ mtau^t w tem^peraturze 3⁷°^ aż do ^przeprowadzę^-

153 139 nia bakterii w protoplasty. Następnie mieszaninę powoli rozcieńcza się 20 ml uprzednio ogrzanego środowiska zawierającego 10% sacharozy i 10 mM MgCl? i całość utrzymuje sie w temperaturze o ^9

37°C w ciągu 15 minut. Następnie zawiesinę protoplastów (około 10 /ml) dodaje sie do komórek CHO defekt^ywn^yc^h po^d wz^glę^dem DHFR, DUKK-Bl¹ w 6-^do^łkowej ^płytce (oko^ło ^1.10θ ^kom^óre^k/do^łek), w stosunku około 1-2.10 protoplastów) komórkę i protoplasty osadza sie na komórkach za pomocą wirowania przy 200 obr/min, w ciągu 8 minut, z zastosowaniem wychylnego wirnika do naczyń do mikromiareczkowania, w wirówce IEC Model K. Po odwirowaniu, supernatant usuwa sie przez aspiracje i do każdego dołka 6-dołkowej płytce dodaje sie 2 ml roztworu glikolu polietylenowego /PEG/ /50 g PEG - 1450 (Baker Chem. Co.) w 50 ml środowiska/. Komórki ponownie odwirowuje sie przy 2000 obr/min w ciągu 90 sekund, po czym roztwór glikolu polietylenowego usuwa sie i przemywa sie płytki trzykrotnie z użyciem 4 ml środowiska/dełek. Następnie komórki trypsynuje sie, zawiesza w 10 nil porcjach płynu zawierającego 10% płodową surowice cielęcą, po czym wiruje w probówce stożkowej przy 500 obr/min w wirówce do badań klinicznych.

Osadzone komórki z 3 dołków puluje sie i wysiewa do 10 cm naczyń do hodowli tkanek. Do każdej płytki dodaje sie świeży płyn zawierający 100 yug/ml kanamycyny, tymidyny, adenozyny, dezoksyadenozyny, penicyliny i streptomycyny i 10% dializowaną płodową surowice cielęcą. Kanamycyną włącza sie w celu zapobieżenia wzrostowi jakichkolwiek bakterii, które uniknęły konwersji do protoplastów. Po upływie dwóch dni zakłada sie subkultury komórek 1:15 w płynie Alfa z 10% dializowaną płodową surowicą cielęcą, penicyliną i streptomycyną, ale bez nukleozydów. Następnie, po upływie 4-5 dni, komórki zasila sie ponownie tym samym selektywnym płynem (bez nukleozydów) . ~

Kolonie pojawiają sie po upływie 10-12 dni od założenia subkultur w porcjach selektywnego płynu. Postępuję sie zgodnie z dwoma schematami selekcji z udziałem methotrezate /ΜΤΧ/ i amplifikacji. Według pierwszego z tych schematów pojedyńcze, niezależnie klonowane transformaty wyodrębnia sie na podstawie ekspersji DHFR, a następnie każdy klon namnaża sie w warunkach służących amplifikacji ilości kopii obcego DNA, to znaczy prowadząc wzrost przy wzrastających stężeniach methotrezate. Według drugiego schematu wyodrębnia sie pule wielorakich niezależnych transformantów na podstawie ekspresji DHFR i namnaża sie je wspólnie w warunkach służących amplifikaji obcego DNA, to znaczy prowadząc wzrost przy wzrastających stężeniach methotraxate. Następnie z masy wyselekcjonowanej populacji wyodrębnia sie poszczególne klony i analizuje je pod wzglądem ekspersji GM-CSF. Te klony, które wykazują ekspersje GM-CSF na poziomie najwyższym hoduje sią powtórnie w warunkach służących dalszej amplifikacji obcego DNA, to znaczy prowadząc wzrost przy wzrastających stężeniach methotrexate w płynie hodowli.

W je^dn^ym e^perymenci^ pu^luje sⁱą siedem ^trans^formant^ów D^HFR+ w ^płynⁱe A^lfa bez nu^eczydów. Następnie prowadzi sią hodowlą tych komórek przy stopniowo wzrastających stężeniach ΜΤΧ, zaczynając przy 0,02 μΜ, z następującym stopniowaniem: do 0,1, 0,5 i 20yuM ΜΤΧ. Komórki te, przy badaniu wzglądem aktywności GM-CSF (w badaniu wobec komórek KG-1) wykazują aktywność od 3000 do 12000 jedn/mln. Wyselekcjonowaną populacje klonuje sią przy 0,5 yuM ΜΤΧ i 2,0 yuM ΜΤΧ.

Następnie, klony otrzymane przy 0,5 yuM ΜΤΧ /010,D2 i B6/ selekcjonuje sią pod wzglądem wzrostu przy 2,0 yuM ΜΤΧ. Klonowane linie komórkowe przy badaniu pod wzglądem aktywności GM-CSF (w dadaniu wobec komórek KG-1), wykazują aktywność GM-CSF od 15000 do 300000 jedn/ml. GM-CSF wytworzony sposobem opisanym w niniejszym przykładzie ma sekwencje aminokwasów przedstawioną jako'/Thr/ CSF na Fig. 1.

Przykład VI. Ekspresja GM-CSF w E. coli.

Ekspresji GM-CSF w E. coli dokonuje sią przy użyciu wektora pTALC-185R, którego diagramatyczny opis podaje Fig. 6. Sekwencja kodująca GM-CSF zaczyna sią syntetyczną sekwencją ATG,CCA.CCA. CCT.CCT. TCT.CCA,TCT,ACT, która determinuje 11 początkowych reszt aminokwasów dojrzałego GM-CSF. Pozostała sekwencja kodująca GM-CSF jest w pTALC-185R identyczna z sekwencją pCSF-1, nukleotydy 97-447, z następującą po tym sekwencją TAR.TAR.TAG. Bezpośrednio po potrójnym kodonie terminacyjnym występuje poliłącznik pUC-18. Gen oporności na tetracyklinę z pBR322 wprowadzony jest w orientacji odwróconej w stosunku do genu CSF, 100 par w dół od poliłącznika pUC-18. Gen oporności na tetracykliną ma swój własny promotor. Kontynuując kierunek przeciwny ruchowi wskazówek zegara, najbliżej znajduje sią gen ^3 -laktamazy z następującym po nim początkiem replikacji pUC-18 /CoLEl/.

153 139

Końcową cechą strukturalną plazmidu przed powrotem do sekwencji CSF jest promotor PL. Promotor ten jest, w zasadzie, taki, jak to opisali A, Skatzman i M. Rosenberg w Molecular cloning, a laboratory manuał”, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 419 (1982). Ekspresja CSF jest kierowana przez promotor PL po termicznej indukcji odpowiedniego szczepu E. coli jako gospodarza.

Szczepem macierzystym używanym do wszystkich tych konstrukcji szczepowych jest W3110 lacI°L8 ZR. Brent i M. Ptashne, PNAS, 78, 4204 - 4208 (1981)/,

Fragment DNA Λ/Λ -nukleotydy 34499-38214/ integruje się z chromosomem w locus LacZ /chromosom ^W3110 tacI^S/. ^Integ^rac^{ji dokonuj}e sⁱę stasując we^ktor inte^grac^yjny z^łożon^y z sekwencji pBR325 z genami oporności na chloramfenikol i ampicylinę, jak również początek replikacji pBR322 /F.Bolivar, Gene, 4, 121-136 (1978)/. Fragment DNA Λ jest włączony do genu lacZ, który sam jest w plazmidzie jako framgnet rozciągający się od miejsca BstEil w LacI do miejsca Tthilll w dół od lacZ. *

Integrację DNA Λ z chromosomalną kopią lacZ przeprowadza się na drodze homologicznej rekom^binacji^{, p}rz^y czym stwierdza sta kotanta ^lac+ wra^żliwe na amtaicyMn^ o^porne na c^hlorom^fenikol. Drugi wynik rekombinacji prowadzący do usunięcia wszystkich dodatkowych sekwencji plazmidowych, lecz pozostawiający zintegrowany fragment DNA Λ , stwierdza się na podstawie screeningu na płytkach MacConkey a z laktozą. Wyjściowy fenotyp lac , amp , cam zmienia się w fenotyp lac , s S amp , cam w przypadku drugiego czynnika rekombinacji. Powstający szczep zostaje nazwany GL400 ⁱ jest ^{λ R} w ³⁰% oraz A^s w ⁴²°. Fenot^yp tan w^ykazuje tatnienie ^funkc^jo^na'^lnej tapta c^hromo857 somowej allelu CI ··

GL400 nadaje się właściwość lon za pomocą transdukcji PL z lizatu po wzroście szczepu SG20252 /lac Aul69, ara Δ 139 rps 1 lon Δ 100: : TnlO/, TnlO wprowadza się przez screening c

pod względem Tet w podłożach selektywnych /S.Maloy, W, Nunn, J. Bacteriol., 145, 1110-1112 (1981)/.

Ko^ńcow^y szcze^p-^gospodarz zostaje nazwan^{y G}I⁴¹³ ^ac^L^8, Lac Z Δ ./ Λ CI, REX^, N/ ΙοηΔ 100/. · pTALC-185R transformuje się GI413. Całonocną hodowlę tego szczepu prowadzi się w temperaturze 3⁰°C w ⁵ m^{l p}o^dło^ża ⁱn^du^kc^yjne^go zawtarającego ⁷ /lęj/in¹ tetrac^yklin^y. Po^dłota in^du^kc^yjne ^zawiera (na tatr): 20 ^g Casamtao Acta^ ⁶ g ^^o^^O, ³g ^KHgPO₄ 0,5 ^g NaC^ 1 ^g NH⁴C1,

1% gliceryny, 2 mg witaminy BI, 2 mg · CaCl₂»2H20, 0,2 g MgCl₂*6H₂0, ml tego podłoża, zawierającego 7 yug/ml tetracykliny posiewa się 125 jil całonocnej hodow¹! ⁱ wstrz^ąsa sta w taźni. wo^dnej, w tem^peratarze ³⁰°C a^{ż d}o osiągntacia ^przez ^ho^dowta ^gęsta ści odpowiadającej Α^θΟ,δ. Następnie hodowlę przenosi się szybko do łaźni wodnej o temperaturze ⁴0°C i wstrząsa ^przez nastę^pne 2 godziny, pozwatając na s^yntezę G^M-C^SF. ^Kom^ór^ki z^biera się i sprawdza w nich zawartość CSF za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS. W tych warunkach GM-CSF nagromadza się do około 5% białka komórkowego ·

Przykład VII. Ekspresja GM-CSF w Saccharomyces cerevisiae.

A. Konstrukcja wektora.

Konstruuje się plazmid, zawierający gen enzymu z biosyntetycznego szlaku uracylu /URA3/ jako gen selekcyjny i 2ju-początek replikacji. Plazmid ten otrzymuje się z Ylp5 fotstein i wsp,. Gene, 8, str, 17-24(1979)/ , z dodaniem fragmentu zawierającego początek replikacji z plazmidu drożdży 2 ^u.

B. Wyodrębnianie genu dehydrogenazy aldehydu fosfoglicerynowego /GPDH/.

Z drożdży wyodrębnia się dwa geny GPDH /Holland and Holland Journal of Biological Chemistry, 255, 1596-2605 (1980)7· Sondy oligonukleotydowej zsyntetyzowanej na podstawie opublikowanej sekwencji używa się do wyodrębniania genu GPDH ze zbioru plazmidów drożdżowego genomowego DNA metodami standardowymi, Plazmid zawierający całkowity gen GAP491 został uprzednio zdeponowany /ATCC nr 39777/.

C. Otrzymywanie promotora dehydrogenazy aldehydu fosfoglicerynowego w celu ekspresji genu heterologicznego.

Konstruuje się plazmid pozwalający na wytworzenie się naturalnego odstępu między promotorem GPDH a początkiem żądanego heSertltgioznegt genu struktury. Dokonuje się tego za

153 139 pomocą wprowadzenia miejsca Κρηϊ bezpośrednio przylegającego do inicjatorowego kodonu metioniny genu struktury dla GPDH. Promotor jako cassette wprowadza się następnie do drożdźowego ekspresyjnego wektora YOpl.

D. Wyodrębnianie ganu czynnika .

Gen czynnika ^/feromon parzenia się/ wyodrębnia się z drożdży /Kurjan i Herskowitz, Celi 30, 933-943(1982)7.

Zsyntetyzowanej na podstawie tej sekwencji sondy oligonukleotydowej używa się do wyodrębniania genu ze zbioru plazmidów drożdżowego genomowego DNA metodami standardowymi.

E. Otrzymywanie ekspresyjnego plazmidu CSF.

Z wyżej opisanych elementów i ludzkiego genu CSF konstruuje się metodami standardowymi wektor ekspresyjny /AJ14, Fig. 1/. W wektorze tym naturalna sekwencja liderowa CSF jest usunięta i sekwencja kodująca dojrzały CSF wprowadza się jako sąsiadująca z preprosekwencją czynnika Połączenia między promotorem GPDH, preprosekwencją czynnika oC i sekwencją dojrzałego CSF są sprecyzowane poniżej i zostały one potwierdzone analizą sekwencyjną didezoksynukleotydów AAA-TAAACAAAATG.CGTTTTCCTTCA......AAA AGA GAG GCG GAA GCT.GCA CCC GCC TCG...

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów /GM-CSF/ naczelnych, znamienny tym, że hoduje się odpowiednie eukariotyczne lub prokariotyczne komórki gospodarza zawierające wektor skonstruowany tak, że w warunkach umożliwiających ekspresję zachodzi ekspresja genu kodującego GM-CSF i wyodrębnia się białko GM-CSF z hodowli komórek·
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że.wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego ludzkie białko GM-CSF.
3. 3. Sposób według zastrz. 2,znamienny tym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego.białko GM-CSF, którego .sekwencja aminokwasów odpowiada sekwencji aminokwasów w naturalnie występującym białku GM-CSF.
4. 4. Sposób według zastrz. 3,znamienny tym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 1 dla CSF-Thr, zaczynającej się po strzałce.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 1 dla CSF-Ile zaczynającej się po strzałce.
6. 6. Sposób według zastrz. 1,znamienny tym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF gibona.
7. 7. Sposób według zastrz. 6,znamienny t ym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF, którego sekwencja aminokwasów odpowiada sekwencji aminokwasów w naturalnie występującym białku.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 1 dla CSF-G, zaczynającej się po strzałce.
9. 9. Sposób według zastrz. 4 albo 5 albo 8, znamienny tym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF, którego sekwencja aminokwasów dodatkowo obejmuje aminokwas sygnalny przy N-końcu.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF, którego sekwencja aminokwasów odpowiada sekwencji aminokwasów w naturalnie występującym białku GM-CSF, z tą różnicą, że jeden lub więcej aminokwasów występuje dodatkowo, bądź jest zastąpionych innymi aminokwasami lub jest usuniętych.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że wektor jest tak skontruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF, którego sekwencja aminokwasów odpo153 139 wiada sekwencji w naturalnie występującym białku GM-CSF, z tą różnicą, że naturalna sekwencja aminokwasów jest poprzedzona przy N-końcu resztą metioniny.
12. 12. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny t^mm, że wektor jest tak skonstruowa ny, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF obejmujące sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 dla CSF-Thr, CSF-Ile, CSF-G zaczynającą się po strzałce i kończącą się po aminokwasie w pozycji 127.

    13. Sposób według zastrz. l, p91023/B/ zdeponowany pod numerem znamienny tym, że jako wektor stosuje się plazmid stosu- ATCC 39754. n y że jako komórki gospodarza 14. Sposób według zastrz. i, z n a mie n t y m, je się komórki E. coli, 15. Sposób według zastrz. i, z n a mie n n y t y m, że jako komórki gospodarza stosu- je się komórki jajnika chomika chińskiego. 16. Sposób według zastrz. i, z n a mie n ⁿ y t y m, że jako komórki gospodarza stosu- je się komórki drożdży. 17. Sposób według zastrz. lr z n a mie n n y t y m, że jako komórki gospodarza stosu-

    je się komórki owadzie.

    18. Sposób według zastrz. l, znamienny tym, że wektor jest tak skonstruowany, że zachodzi ekspresja genu kodującego białko GM-CSF o aktywności właściwej co najmniej 1 x ¹0⁷ jednostek na mg białka, oznaczonej w próbie z ludzkim szpikiem kostnym.

    153 139

    FIGURA 1

    GCT 6GAG6 ATG TGG CTG CAG AGC CT6 CTG CTC TTG GGC ACT GT6 GCC TGC RET Trp Lru Gin Str Ltu Ltu Ltu Ltu Gly Thr Vil Ali Cys ł Str CSF-G T 80 ^Arg G CSF-G AGC ATC TCT 6CA CCC GCC CGC TCG CCC AGC CCC AGC ACG CAG CCC T6G 6AG CAT CSF-thr S«r IU Ser AU Fro Ali Arg Str Fro Str Fro Str Thr Gin Fro Tri Glu Hit

    HO

    GTG AAT GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AAC CTG A6T AGA GAC ACT 6CT Vil Am AU IU Gin Glu Mi Ary ^Ary Ltu Ltu Atn Ltu Str Ary Asp Thr AU 200 lit Λ CSF- •G Vil CSF- •G GCT 6AG A ATG AAT GAA ACA GTA GAA GTC G ATC TCA GAA ATG TTT GAC CTC CAG 6A6 AU Glu RET Atn Glu Thr Vil Glu Vit nt Str Glu AET Fht A»P Ltu Gin Glu

    240

    Θ T

    CCG ACC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG GGC CTG CAG GGC AGC

    Fro Thr Cyt Ltu Gin Thr Ary Ltu Glu Ltu Tyr Ly* Gin Gly Ltu Ary Gly Str

    320

    CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATG ATG GCC AGC CAC TAC AAG CAG CAC Ltu Thr Ly» Ltu Lyt Gly Fro Ltu Thr RET RET AU Str Nt ^Tyr Ly» Gin Nt IU CSF- ile A G T TGC CCT CCA ACC CCG GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ACT ATC ACC TTT GAA A6T Cyt Fro Fro Thr Fro Glu Thr Str Cyt AU Thr Gin Thr IU Thr Fht Glu Str 100 380 Thr CSF-I TTC AAA 6A6 AAC CTG AA6 GAC TTT CTG CTT GTC C ATC CCC TTT 6AC T6C TGG 6AG Fht Ly» Glu Atn Ltu Ly» Asp Fht Ltu Ltu Vil lit Fro Fht Asp Cyt Trp 6lu 430 440 470 480 4 90 300

    Gly CSF-G

    G

    CCA GTC CAG GAG TGA GACCGGCCAG ATGAGGCTGG CCAAGCCGGG GAGCTG^CTC^T CTCATGAAAC

    Fro Oil Gin Glu .

    • 127

    310 A 520 530 540 350 340 570 AAGAGCTGGA AACTCAGGAT GGTCATCTTG Q CAGGGACCAA T6TGTGTGCC ACATCCATGG T66TAGTTTC 580 390 400 410 420 430 440 CGGGACCTGC CCTGGGCCAC ACTGACCCT6 ATACAGGCAT 66CAGAAGAA TGGGAATATT TTATACTGAC 430 440 470 480 490 700 710 A6AAATCA6T AATATTTATA TATTTATATT TTTAAAATAT TTATTTATTT ATTTATTTAA GTTCATATTC 720 730 740 750 740 770 780 CATATTTATT CAA6AT6TTT TACCGTAATA ΑΓΪΑΤΤΑΤΤΑ AAAATATGCT TCTAAAAAAA AAAAAAAAAA

    153 139

    Hindlll BamHI

    Sali

    Xhol

    EcoRI

    Hind II Bglll Pstl

    FiG. 2

    1. Trawienie Pstl (częściowe)

    2. Działanie fragmentem klenowa

    3. Działanie ligazą fp-JA' I 1. Ti

    JAW A3 rawienie Xhol

    2. Działanie fragmentem klenowa

    3. irawienie ΡνυΙΙ

    Λ.Wyodrębnianie fragmentu o UO parach zasad

    BamHI

    Uzupełnienie w miejscu ΡνυΙΙ

    Działanie

    Hindlll

    Bglll

    Pstl

    Sali

    BamHI

    Hindlll BamHI

    153 139

    Uzupełnienie p i PL w miejscu Xhol

    DNA SVZ.O

    1. Trawienie ΑναΙΙ

    2. Łącznik Xhol /trawienie Xhol

    3. Odzyskiwanie fragmentu D

    Działanie ligazą EcoRl

    Hind III

    Xhoi

    BamHI

    Sali

    EcoRl \ Z 31.7

    HirnddH

    6eny VA

    Hpal pBR322-AdHinddIIB

    17,1-HimJHI

    FiG. 3

    BamHI

    1. Trawienie Hpal

    2. Łącznik EcoRl/ traw ienie EcoRl

    3.Od zyskiwanie fragmentu o 1,4 kilozasady

    Xhol EcoRl geny VA

    EcoRl

    Hir^<dIII

    BamHI

    Sali

    DHFR

    SV 40

    A 1.1 kilozasady

    Działanie li gazą

    ΡνυΠ Lider trojczłonowy HindlU

    153 139 ρ 91023

    Τrawienie EcoRI / dziafanie fragmentem klenowa / działanie ligazą p 9102 3(A)

    Trawienie Pstl / działanie fragmentem klenowa / łącznik EcoRI Trawienie EcoRI/działanie ligazg

    Xhol

    Geny VA

    Hindlll

    BamHI

    Sali

    DHFR ·Δ1,1 kilozasady

    Xhol PvuH

    Lider trojczłonowy Hindlll

    A Ι5· -γ

    153 139 _ · Μ

    Ί &-ΑΑ

    SDS PAGE OF GM-CSF τετ

    Nsil

    FiG. 6

    153 139